JP2002515739A

JP2002515739A - ラットｏｂレセプター及びそれらをコードするヌクレオチド

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Publication number: JP2002515739A
Application number: JP53025497A
Authority: JP
Inventors: ヘス，ジヨン・ダブリユ; キヤスキイ，シー・トーマス; リユー，キンユン; フイリツプス，マイケル・エス
Original assignee: メルクエンドカンパニーインコーポレーテッド
Priority date: 1996-02-22
Filing date: 1997-02-18
Publication date: 2002-05-28
Also published as: CA2246226A1; WO1997031015A1; EP0922052A4; EP0922052A1

Abstract

(57)【要約】ラットｏｂレセプター遺伝子を単離し、クローン化した。２種の異なるアレレ、即ち野生型及び唯一の塩基対で野生型とは異なるｆａ−アレレを同定した。しかし、その塩基対の変化により、ＤＮＡ配列にＭｓｐＩ制限部位が導入され、またアミノ酸変化が起る。新規レセプター、該レセプターをコードする核酸を含むベクター、この遺伝子で形質転換された宿主細胞、及び該遺伝子又はタンパク質を用い、新規リガンドを同定するアッセイも本発明の一部である。

Description

【発明の詳細な説明】ラットＯＢレセプター及びそれらをコードするヌクレオチド発明の分野本発明は、ラットｏｂレセプタータンパク質、それらをコードするＤＮＡ配列とＲＮＡ配列、及びラットレセプタータンパク質を用いるアッセイに関する。発明の背景最近、齧歯類における肥満の発症に関与する幾つかの遺伝子の突然変異が同定された。特に興味深いのは、体重を調節する新規のシグナル伝達経路の一成分であるペプチドホルモンであるレプチンにおいて発見された突然変異である(Zhang ら,1994，Nature 372:425-432；Chenら，1996，Cell 84:491-495)。レプチンは最初は、マウスの肥満遺伝子ｏｂのポジショナルクローニングで発見された。２種の異なるｏｂアレレが同定された。一つの突然変異は、レプチンペプチドの未成熟終止を引起し、短縮タンパク質を産生し、他の突然変異は肥満（ｏｂ）遺伝子の転写活性を変化させ、循環しているレプチンの量を減少させる。ｏｂ／ｏｂマウスで観察される生物活性レプチンのレベルの減少と外に現われる肥満表現形質の間に相関がある。組換えレプチンは、ｏｂ／０ｂマウスの体重減少を誘起するが、糖尿病表現形質ｄｂ／ｄｂマウスでは誘起しないことが報告された（Campfieldら,1995,Science 269:546-549；Halaasら,1995，Science 26 9:543-546；Pellymounterら，1995，Science 269:540-543；Rentschら，1995,B iochem.Biophys.Res.Comm．214:131-136；及びWeigleら，1995，J．Clin．Inves t．96:2065-2070）。レプチンは脂肪細胞で合成されるが、食物摂取を減少させ、代謝速度を増加させるレプチンの能力は、視床下部によって中枢的に媒介されると考えられる。組換えレプチンの第３脳室への注入によって、レプチンの末梢投与と同様の反応が起る。更に、レプチンのヒトレセプター、ｏｂ−レセプター（ＯＢ−Ｒ）の最近のクローニングは、ＯＢ−Ｒは視床下部で転写されることを示す（Tartagliaら，1995，Cell 83:1263-1271；Stephensら，1995，Nature 377:530-532）。更に、マウスＯＢ−Ｒの長型の未成熟終止が起る突然変異は視床下部で優先的に発現されるが、それはｄｂ／ｄｂマウスの肥満表現形質の原因であるようである（Leeら，1996，Nature 379:632-635；Chuaら,1996，Science 271:994 −996；及びChenら，1996，Cell 84:491-495）。ｆａ突然変異は劣性アレレであり、１３Ｍラット株で自然発生し、1961年に最初に報告された(Zuckerら,1961，J.Heredity 52:275-278)。ｆａ／ｆａ Zucker ラットにおける肥満は５〜７週齢で起り、齢と共に進行する。成熟肥満ラットの体重は痩せて小さいラットの約２倍であり、その体重の４０％超が脂肪組織である（Zuckerら，1962，Proc．Soc．Exp．Biol．Med．110:165-171；Zuckerら，19 63，J.Nutrition 80:6-19）。ｆａ／ｆａ Zuckerラットは、高コレステロール血症、高脂血症、及び高血糖を有し、ヒト心臓血管系疾患及び糖尿病の動物モデルとして広範に用いられてきた。肥満Zuckerラットコロニーの大部分は、できるだけ多くの遺伝子座でヘテロ接合性を維持するために、異系交配で維持されてきた。しかし、ある保存系統を同系交配させ、異系交配ｆａ／ｆａ Zuckerラットより大なる糖尿病表現形質を有するZucker糖尿病肥満（ＺＤＦ）ラットのような動物を産生させた（Clarkら，1983，Proc．Soc．Exp．Biol．Med．173:68-75）。ｆａ突然変異は、マウス第４染色体上でｄｂアレレとシンテニックである領域でラット第５染色体にマップされる（Truettら，1991,Proc.Na tl.Acad.Sci.88:7806-7809）。この観察を、ｆａ／ｆａラットとｄｂ／ｄｂマウスの同様の表現形質と考え合わせ、ｆａ遺伝子はｄｂ遺伝子のラット相同体であるという提案がなされた。より高分解能遺伝子マッピングは、ｆａ遺伝子は、ラットＯＢ−Ｒをコードする遺伝子に局在しているという主張を支持する（Chuaら，Science 271:994）。肥満のための齧歯類モデル系を用い更に実験し、ラットｏｂレセプターをクローンし、精製ラットｏｂレセプターを産生でき、肥満を理解するのに有用で、その予防と治療に有用でありうるリガンドの同定のためのアッセイで使用できることは望ましいであろう。図面の簡単な説明図１はラットＯＢ−レセプターのアミノ酸配列である。図２はラットＯＢ−レセプターのｃＤＮＡ配列である。図３は実施例で詳述したＰＣＲ反応のために用いたプライマーの表である。図４は、痩身ラット及びｆａ／ｆａラットから得られた視床下部ｃＤＮＡとゲノムＤＮＡからのＯＢ−レセプターで同定されたＡ⁸⁸⁰からＣへの突然変異の分析を示すゲルを示す。図５は、ヒトサイトカインレセプターｇｐ１３０（Ｈｕｍｇｐ１３０）、マウスＯＢ−Ｒ（ＭｏｕｓＯＢＲ）、ヒトＯＢ−Ｒ（ＨｕｍＯＢＲ）、及び痩身ラットＯＢ−Ｒ（ＲａｔＯＢＲ）の間でアミノ酸配列を比較する。番号付けはタンパク質における位置を指す。サイトカインモチーフＧＸＷＳＸＷＳが見られる。本明細書及び請求の範囲で使用する場合、以下の定義を適用する： “同伴ラット膜タンパク質を実質的に含まない”ということは、ラットレセプタータンパク質が如何なるラット膜タンパク質とも物理的接触をしていないということを意味する。 “実質的に精製されたラットＯＢ−レセプター”ということは、ラットレセプタータンパク質が少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％純粋であることを意味する。 “野生型”は、遺伝子又はタンパク質が、その遺伝子又はタンパク質の突然変異を有しないと考えられるラットにおいて見出されるものと実質的に同一であることを意味する。それは、本明細書及び請求の範囲で“痩身”とも言われる。 “ｆａ”は、遺伝子又はタンパク質が、肥満(fatty)突然変異のために相同なラットで見出されるものと実質的に同一であることを意味する。核酸配列又はアミノ酸配列を指すときに“実質的に同一”ということは、それが参照配列と同一であるか、又は正確に同一ではなくとも生物活性又は機能に影響しない変化を含むことを意味する。ｆａと野生型ラットＯＢ−Ｒ遺伝子はたった１個のヌクレオチドだけ異なるけれども、コードされるタンパク質の生物活性と機能が非常に異なるので、それらは“実質的に同一”とは考えられない。ラットＯＢ−Ｒはサイトカインレセプターファミリーの一員である。モチーフＷＳＸＷＳ（Ｗはアミノ酸残基トリプトファン、Ｓはアミノ酸残基セリン、Ｘは任意のアミノ酸）のようなサイトカインレセプターに特徴的なモチーフが、ラットＯＢ−Ｒで保存されていることは知見されていた。本発明の一面は、ラットＯＢ−Ｒの分子クローニングである。痩身ラットとｆａ／ｆａラットの視床下部ｃＤＮＡの両方からのラットＯＢ−Ｒのヌクレオチド配列を決定し、比較した。ｆａ／ｆａラットで、１個のヌクレオチド変化、即ちヌクレオチド８８０でのＡからＣへの変化があり、そのためグルタミン２６９でのプロリンへのアミノ酸変化があった。この突然変異により、ＭｓｐＩ部位（ＣＣＧＧ）が導入され、それを用いて幾つかの痩身の対照と肥満動物の遺伝子型解析を行った。その結果によると、突然変異はｆａアレレと密接に関連する。即ち、ｆａ突然変異はＯＢ−ＲレセプターｃＤＮＡに存在し、塩基対８８０でのＡからＣへのトランスバーションは肥満表現形質の原因であるように考えられる。ラットＯＢ−Ｒアレレの両方、即ちグルタミン２６９を含むＯＢ−Ｒとプロリン２６９を含むアレレは本発明の一部であり、それらをコードできる全ての核酸も本発明の一部である。図２に示すように、本発明により得られた野生型ラットＯＢ−ＲｃＤＮＡのヌクレオチド配列は３６５０個のヌクレオチドを有する。このＤＮＡ配列は、ヌクレオチド７５〜３６５３の読取り枠を含み、それは１１６２個のアミノ酸のタンパク質をコードする。ヌクレオチド７５〜３６５３の読取り枠は本発明の一面を構成する。野生型とｆａレセプタータンパク質は１個の細胞外ドメインと１個の膜貫通ドメインを含む。細胞外ドメインはアミノ酸１〜８３０であり、膜貫通ドメインはアミノ酸８３９〜８６０であり、細胞質ドメインはアミノ酸８６０〜１１６２である。本発明はまた、これらのドメインの一つ以上を欠くタンパク質を含む。このような欠失タンパク質は、リガンド同定とリガンドの結合活性のアッセイに有用である。別のスプライシングがレセプター遺伝子プロセシングで起りうることも知見された。これは塩基対２７４２（リシン⁸⁸⁹）で起りうる。その別の配列（野生型及びｆａの両方）遺伝子及びレセプターを以下に示すか、これは本発明の別の面を形成する： AGA GCG GAC ACT CTT TGA ATA TCT R A D T L終止アミノ酸１〜２８はシグナル配列を形成する。即ち、成熟タンパク質はアミノ酸２８〜１１６２である。成熟タンパク質は本発明の更に別の面を構成する。これは、マウスとヒトＯＢ−ｒで報告された１〜２２のシグナル配列とは異なる。これは、別の解析プログラムを用いて説明できる。異なる種の公知のＯＢ−Ｒレセプターとの野生型ラットＯＢ−Ｒの比較は類似性を示した。例えば、ラットＯＢ−Ｒヌクレオチド配列はマウスＯＢ−Ｒと９３％同一であり、ヒトＯＢ−Ｒ配列と８１％同一である。ラットＯＢレセプターの演繹アミノ酸配列はマウスと９３％同一であり、ヒトＯＢ−Ｒと７６％同一である。本発明のラットＯＢレセプターの読取り枠の大きさ（１１６２アミノ酸）は、 Toriagllaら，1995，Cell 83:1-20によって報告されたヒトＯＢ−Ｒ（１１６５アミノ酸）の大きさと同様である。本発明のラットＯＢ−ＲとヒトＯＢ−Ｒの両方は大きな細胞質ドメインを含む。対照的に、８９４アミノ酸のマウスＯＢレセプターは比較的短い細胞質ドメインを有する。本発明の最も注目すべきであり最も驚くべき面の一つは、ＯＢ−Ｒの野生型ラットｃＤＮＡとｆａ／ｆａラットｃＤＮＡの間に唯一のヌクレオチドの違いだけがあることである。ｆａ／ｆａｃＤＮＡから得られたＰＣＲフラグメントを配列決定した。痩身ラットのｃＤＮＡ配列と比較して唯一のヌクレオチド変化が視床下部で観察された。ｂｐ８８０でのＡからＣへのトランスバーションにより、アミノ酸残基２６８でグルタミンからプロリンへのアミノ酸変化が起る。ｆａ／ｆａラットで検査した組織の全てで、ヌクレオチド８８０でのこのＡからＣへの突然変異についてホモ接合であることが知見された。配列におけるＡからＣへの変化によって、配列にＭｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＣＧＧ）が導入され、これは、突然変異の存在についてのアッセイの基礎となる。本発明の別の面は、ｂｐ８８０でのＡからＣへの突然変異を有する可能性のあるＯＢ−ＲＤＮＡの遺伝子型を決定するアッセイであって、ＯＢ−ＲＤＮＡをＭｓｐＩで消化し、そのように産生された制限産物を比較することを特徴とする該アッセイである。一好適実施態様では、アッセイは、ＯＢ−ＲＤＮＡのＰＣＲ産物を産生させ、そのＰＣＲ産物をＭｓｐＩで消化し、そのように産生された制限産物を、野生型ＯＢ−Ｒ遺伝子を含有するラットから得られたものと比較することを特徴とする。野生型ＯＢ−Ｒを有するラットからの遺伝子は、長さが１７７４と２８９ｂｐの２個の制限産物を産生させるであろう。ｆａラットからの遺伝子は、長さが７４７、１０２７及び２８９ｂｐの３個の制限産物を有するであろう。これらのことは、標準的ゲル技術を用いて容易に観察される。ＯＢ−Ｒ遺伝子は、公知のベクターを用いて実際上任意の宿主細胞に導入できる。好適な宿主細胞は、E.coli並びに哺乳動物細胞系及び酵母細胞系などである。当業者ならば、所定の宿主細胞に適した公知のベクターを選択できる。一般的に、プラスミド又はウイルスベクターが好ましい。ＯＢ−Ｒ遺伝子は天然形態でベクター中に存在できる。あるいは異種プロモーター、及び所望ならば、１個以上のエンハンサー、又は転写もしくは翻訳を制御することが知られている他の配列の制御下に置くことができる。ＯＢ−Ｒ遺伝子を含む宿主細胞を培養し、ＯＢ −Ｒ遺伝子を発現させる。適当な時間後、通常の分離技術を用いて細胞からＯＢ −Ｒタンパク質を取得できる。本発明の更なる面は、ＯＢ−Ｒリガンドを同定するアッセイでのラットＯＢ− Ｒの使用である。リガンドがＯＢ−Ｒに結合しても、インビボでレセプターの活性化が起ることも起らないこともありうる。リガンドはレセプターのアゴニスト（即ちその活性を刺激する）、アンタゴニスト（その活性を阻害する）でありうるし、あるいはリガンドは、レセプター活性に対し殆ど又は全く影響を与えずに結合しうる。リガンドのアッセイにおいて、本発明のラットＯＢ−Ｒを、推定上のリガンドに接触させ、結合量を測定する。結合量は多くの方法で測定できる。例えば、検査されるリガンド又はＯＢ−Ｒを、通常の標識（放射活性標識又は蛍光標識など）で標識し、次に結合条件下ＯＢ−Ｒと接触させることができる。適当な時間後、非結合リガンドをＯＢ−Ｒから分離し、結合したリガンドの量を測定できる。このことは、本発明の野生型ＯＢ−Ｒ又はｆａＯＢ−Ｒで行うことができる。あるいは、２個のアレレへの結合量を比較できる。競合アッセイでは、推定上のリガンドと公知のリガンドの両方が存在し、推定上のリガンドの結合量を公知のリガンドの結合量と比較する。あるいは、前に結合した公知のリガンドを置換する推定上のリガンドの能力（又は逆）を測定できる。更に別の実施態様では、アッセイは、ＯＢ−Ｒが表面に結合し、推定上のリガンドと接触できることを特徴とする不均一アッセイでありうる。結合の検出は、標識、抗体との反応及び発色団などの種々の方法によって行える。発明の詳細な説明本発明は、結合したラット膜タンパク質を実質的に含まないラットｏｂレセプターに関する。本発明は、実質的に精製されたラットｏｂレセプター（“ラットＯＢ−Ｒ”又は“ラットＯＢ−レセプター”タンパク質にも関する。本発明のラットＯＢ− Ｒの一つは野生型ＯＢ−Ｒを有するラットから得られる。本発明の別のラットＯＢ−Ｒはｆａ突然変異を有するラットから得られる。本発明の別の面は、ラットＯＢレセプターをコードする核酸である。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又は種々の形態のＲＮＡの任意のもののような、タンパク質をコードできる任意の核酸でありうる。好ましくは核酸はｃＤＮＡである。本発明はまた、ラットＯＢ−Ｒ遺伝子を含むベクター、それらのベクターを含む宿主細胞、及びラットＯＢ−Ｒ遺伝子を含むベクターを宿主細胞に導入し、ラットＯＢ−Ｒが産生される適当な条件下宿主細胞を培養する工程を含むラットＯＢ−Ｒタンパク質を実質的に純粋にする方法をも包含する。そのように産生されたラットＯＢ−Ｒは、通常の方法で宿主細胞から取得できる。本発明の更に別の面は、ラットＯＢ−Ｒを用いるアッセイである。これらのアッセイでは、ラットＯＢ−Ｒリガンドである可能性のある種々の分子をラットＯＢ−Ｒと接触させ、結合を検出する。この方法によって、アゴニスト、アンタゴニスト及びリガンド擬似物を同定できる。本発明の更なる面はそのように同定されたリガンドである。本発明をより良く説明するために、以下の非限定実施例を記載する。実施例１ラット組織からのｍＲＮＡとｃＤＮＡの調製痩身及びｆａ／ｆａ Zuckerラットから組織を集め、液体窒素中で急速冷凍した。集めた組織は、視床下部、脳下垂体、肺、肝臓、腎臓、心臓、副腎、平滑筋、骨格筋、及び脂肪組織を含んでいた。グアニジウムイソチオシアネート存在下、Brinkmannポリトロンホモジナイザーで、組織をホモジナイズした。メッセンジャーＲＮＡ単離キット(Stratagene，La Jolla，CA)付属の指示書に従い、ｍＲＮＡを、視床下部、肺、及び腎臓から調製した。SuperScript^TM選択システム(Gi bco/BRL Gaithersburg，MD)を用いて、ｍＲＮＡ約２μｇから、ｃＤＮＡを調製した。オリゴ（ｄＴ）_12-18プライマー１μｇと反応当りランダムヘキサマー２５ｎｇを用いて、第１鎖ｃＤＮＡ合成を開始させた。第２鎖ｃＤＮＡ合成は、製造業者の指示に従い行った。［α−³²Ｐ］ｄＣＴＰ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）約１μＣｉによる、第２鎖反応のアリコート（１／１０）の標識によって、ｃＤＮＡの品質を評価した。標識産物をアガロースゲルで分離し、オートラジオグラフィーで検出した。実施例２ＰＣＲを用いる、痩身ラットのＯＢ−レセプターｃＤＮＡの増幅マウスとヒトＯＢ−レセプターアミノ酸配列に基づく縮重プライマーを用いるＰＣＲによって、ラットＯＢレセプターの最初の部分を得た。９種のオリゴヌクレオチドプライマーの１セットである、図３に示すＲＯＢＲ１−９を、コドン低縮重度の領域に対し設計した。マウスアミノ酸配列ＨＷＥＦＬＹＶ及びＥＣＷＭＫＧに対応する正方向プライマーＲＯＢＲ２(5’-CAYTGG GAR TTY CTI TAY GT-3 ’)及びＲＯＢＲ３（5’-GAR TGY TGG ATG AAY GG-3’）の、マウスアミノ酸配列ＧＹＴＭＷＩ、ＶＹＷＳＮＷＳ及びＷＰＭＳＫＶを表す逆方向プライマーＲＯＢＲ６（5’-ATC CAC ATI GTR TAI CC-3’）、７（5’-CTC CAR TTR CTC CAR TA I CC-3’）及び８（5’-ACY TTR CTC ATI GGC CA-3’）との対形成により、適当な大きさの産物が良好な収率で得られた。問題のフラグメントは、Barnesの方法（1994，Proc.Natl.Acad.Sci．91:2216-2220［引用により本明細書に含まれるものとする］）の改変によりポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）長鎖産物として増幅した。必要な長鎖ＰＣＲフラグメントを得るために、Taq Extender(Stratagene，La Jolla CA)とthe Expand Long Template PCR システム(Boehringer Mannheim，indianapolis，IN)を組合せて用いた。標準ＰＣＲ反応混合液は、最終容量２０μＬ中に、鋳型５ｎｇ（痩身ラットのｃＤＮＡ）、プライマー１００ｎｇ、５００μＭｄＮＴＰ、Expandキットからの１×緩衝液３、TaqポリメラーゼとTaq Expander各０．１μＬを含んでいた。反応物は薄壁反応チューブ中に加えた。増幅プロトコルは、Perkin-Elmer(Norwalk,CT)96 00温度サイクラーを用いて、９２℃３０秒の１サイクル、続いて９２℃３０秒、４５℃１分、及び６８℃３分の３２サイクルであった。この戦略により、一連のＰＣＲ産物が産生され、最大のものは、プライマーＲＯＢＲ２とＲＯＢＲ８から増幅された約２．２Ｋｂｐであった。これらの産物は、下記のようにＤＮＡ配列解析のためにサブクローンした。実施例３ＰＣＲ産物のサブクローニングアガロースゲルでの分離、バンドの切出し、及びPrep-A-gene(BioRad，Richmo nd，CA)を用いるＤＮＡ抽出によって、適当な大きさのＰＣＲ産物をサブクローニングのために調製した。製造業者の指示に従い、ＰＣＲ産物をｐＣＲ^TMII(Invitrogen，San Diego，CA)に連結させた。連結体でＩＮＶａＦ’細胞を形質転換し、１００μｇ／ｍＬアンピシリンとＸ− Ｇａｌ（５０ｍｇ／ｍＬＸ−Ｇａｌ(Promega,Madison,WI)３２μＬ)を含むLuri a-Bertaniプレートに播いた。白色コロニーを拾い上げ、Luria-Bertaniブロス＋１００μｇ／ｍＬアンピシリン中で一晩生育させた。プラスミドＤＮＡを、Wiza rd miniprepキット(Promega，madison，WI)を用いて調製した。プラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲル上で制限エンドヌクレアーゼ消化産物を分離して、挿入体を解析した。エタノール沈殿及び最終ＤＮＡ濃度１００μｇ／ｍＬになるように水への懸濁によって、プラスミドＤＮＡをＤＮＡ配列決定のために調製した。ＤＮＡ配列解析は、AmpliTaq ＤＮＡポリメラーゼ，ＦＳにより、ABI PRISM^TM色素ターミネーターサイクル配列決定レディ(ready)反応キットを用いて行った。最初のＤＮＡ配列解析はＭ１３正方向プライマーと逆方向プライマーを用いて行い、次にラットＯＢ−Ｒ配列に基づくプライマーを用いた。Perkin-Elmer 9600での増幅後、伸長産物を精製し、 ABI PRISM 377自動配列決定機（Perkin Elmer，Norwalk，CT）で解析した。ＤＮＡ配列データはSequencherプログラムで解析した。ｆａアレレ（（＋／＋）又は（＋／ｆａ））のための痩身Zuckerラットの未知の遺伝子型のために、各フラグメントの多数のサブクローンのＤＮＡ配列を解析し、痩身ラットのＯＢ−ＲのｃＤＮＡ配列を決定した。実施例４プライマーＲＯＢＲ１０と１７による痩身とｆａ／ｆａの増幅とＤＮＡ配列解析特定の痩身ラットの配列がＲＯＢＲ２−８ＰＣＲフラグメントから得られると、ラット特異的プライマーＲＯＢＲ１０（5’-CTG CAC TTA ACC TGG CCT ATC-3 ’）とＲＯＢＲ１７（5’-GGC CAG AAC TGT AAC AGT GTG-3’）を合成した。プライマー１０と１７を用いて、ＰＣＲ産物を、痩身ラットの視床下部、痩身ラットの肺、ｆａ／ｆａ視床下部、及びｆａ／ｆａ腎臓ｃＤＮＡから増幅した。この反応で使用したＰＣＲ条件は、鋳型（上記の種々のラットｃＤＮＡ）５ｎｇ、プライマー２００ｎｇ、５００μＭｄＮＴＰ、Expandキットからの１×緩衝液３、TaqポリメラーゼとTaqExpander各０．２５μｌを含む総容量５０ μＬのＰＣＲ反応混合液であった。反応物を薄壁チューブ中に加えた。増幅プロトコルは、Perkin Elmer 9600温度サイクラーを用いて、９２℃３０秒の１サイクル、続いて９２℃３０秒、６０℃１分及び６８℃４分の３２サイクルであった。実施例５セミ−ネステッドＰＣＲを用いるラットＯＢ−ＲｃＤＮＡの３’部分の増幅ヒトＯＢ−レセプターの細胞質ドメインに対応する縮重プライマー又はヒトもしくはマウス配列の３’ＵＴＲと対になるラット特異的５’プライマーを用いて、ラットｃＤＮＡの最初の増幅によるＰＣＲによって、痩身ラットとｆａ／ｆａラットＯＢ−レセプターの両方の３’末端を得た。この後、最初の増幅フラグメント内に位置するネステッドプライマーと対になる最初のプライマーの一つ、又は２個のネステッドプライマーを用いて、第２の短いラウンドの増幅を行った。アミノ酸ＷＫＮＫＤＥＭＭ、ＭＰＱＦＱＴ及びＭＥＮＫＭＣＤにそれぞれ対応する、ヒトＯＢレセプターの細胞質ドメインに位置するヒト縮重プライマー；ＨＯＢＲ５(5’-CAT CAT YTC RTC YTT RTT YTT CCA-3’)、ＨＯＢＲ６(5’-GTY TG R AAY TGI GGC AT-3’)及びＨＯＢＲ７(5’-TCR CAC ATY TTR TTY TCC AT-3’)と異なる組合せで、ラット特異的プライマーＲＯＢＲ１５(5’-TCA CCT TGC TTT GGA AGC C-3’ )、ＲＯＢＲ１６(5’-GAC ATG GTC ACA AGA TGT GGG-3’)及びＲＯＢＴ２３(5’ -CCT GGA CAC TGT CAC CTG ATG-3’)を対にした。ヒトＯＢレセプターの３’末端からのプライマーであるＨＯＢＲ１Ｒ(5’-TCT CTC CCA CCC ACA ACT AT-3’) 及びマウスの３’末端からのプライマーであるＭＯＢＲ１Ｒ(5’-TGG GTT CAT C TG TAG TGG TC-3’)もラット特異的プライマーと対にした。鋳型（痩身ラットとｆａ／ｆａラットの視床下部ｃＤＮＡ）５ｎｇ、プライマー１００ｎｇ、５００μＭｄＮＴＰ、Expandキットからの１×緩衝液３、TaqポリメラーゼとTaq Expander各０．１μＬを含む総容量２０μＬ中で、上記プライマーセットの種々の組合せで、ＰＣＲ反応を行った。反応物をPerkin Elmer温度サイクラーのために薄壁チューブ中に加えた。増幅プロトコルは、Perkin Elmer 9600温度サイクラーを用いて、９２℃３０秒の１サイクル、続いて９２℃３０秒、４５℃１分及び６８℃４分の３２サイクルであった。製造業者の特定のプロトコルに従い、ＱＩＡクイックＰＣＲ精製キットを用いて、全てのヌクレオチドとプライマーを除去して、産物を精製し、水３０μＬに再懸濁した。次に、鋳型として第１ＰＣＲ反応物及び上記最初の３’プライマーと対になるネステッドラット特異的プライマーを用い、第２ＰＣＲ工程を行った。反応条件は、鋳型（精製ＰＣＲ産物から）５μＬ、プライマー２００ｎｇ、５００μＭｄＮＴＰ、Expandキットからの１×緩衝液３、TaqポリメラーゼとTaq Expander各０．２５μＬを含む反応液５０μＬであった。反応物は、Perkin Elmer 9600温度サイクラーのために薄壁チューブ中に加えた。増幅プロトコルは、Perkin Elmer 9600温度サイクラーを用いて、９２℃３０秒の１サイクル、続いて９２℃３０秒、４５℃１分及び６８℃４分の２５サイクルであった。この戦略を用いて産生した最大のフラグメントは、長さが約１５００ｂｐの、ＲＯＢＲ１６とＨＯＢＲ１Ｒから産生されたフラグメントであった。オールターナティブスプライシングによって産生されるより小さいイソ型を恐らくコードするマウス３’ＵＴＲは、長さが約６５０ｂｐのフラグメントを産生した。実施例６ラットＯＢレセプターの５’末端の増幅ラットＯＢレセプターの５’末端は、３’末端のための上記の方法と同様の方法でセミーネステッドＰＣＲを用いて得た。この場合に、ラット特異的プライマーは、ヒトＯＢ−レセプターの５’ＵＴＲからのプライマーと組合せた３’プライマーである。使用したプライマーは、ＲＯＢＲ１１(5’-GAT AGG CCA GGT TAA GTG CAG-3’)又はＲＯＢＲ１２(5’-GAG TGC GGA GCA GTT TTG AC-3’)と対になったＨＯＢＲ１Ｆ(5’-CTT ATG CTG GGA TGT GCC-3’)とＨＯＢＲ１Ｆ−２(5 ’-TCG TGG CAT TAT CCT TCA G-3’)であった。ＨＯＢＲ１Ｆ−２とＲＯＢＲ１１からの最大の産物は、領域をカバーし、イニシェーターメチオニンコドンを含む５００ｂｐのフラグメントを与えた。実施例７ｆａ／ｆａｃＤＮＡの１ヌクレオチド変化の同定ｆａ／ｆａｃＤＮＡから得られたＰＣＲフラグメントは、アガロースゲルでのＰＣＲ産物の分離、問題のバンドの切出し、及びPrep-A-Gene(BioRad)を用いるＤＮＡの抽出によって、ＤＮＡ配列解析のために調製された。ｆａ／ｆａ視床下部ｃＤＮＡから産生されたＰＣＲ産物の配列決定の結果から、痩身ラットからのｃＤＮＡ配列と比較して唯一のヌクレオチド変化が同定された。ｂｐ８８０でのＡからＣへのトランスバーションにより、アミノ酸残基２６８でのグルタミンからプロリンへのアミノ酸変化が起る。配列中でのＡからＣへの変化により、配列中にＭｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（ＣＣＧＧ）が導入される。プライマーペアＲＯＢＲ１０と１７を用いて、痩身ラットとｆａ／ｆａラットの組織からの視床下部、肺、及び腎臓ｃＤＮＡから、幾つかの独立のＰＣＲ産物を増幅した。この産物はヌクレオチド１９０７で唯一の内因性ＭｓｐＩ部位を含む。ＰＣＲ反応液５μｌ、水４μｌ及び制限エンドヌクレアーゼＭｓｐＩ１μＬからなる反応液中のＰＣＲ産物の制限消化を行った。これらを混合し、３７℃で１時間インキュベートし、１％アガロースゲルで分析した。痩身ラットのｃＤＮＡからのＰＣＲ産物は唯一の内因性ＭｓｐＩ部位を含み、１７７４と２８９ｂｐの産物を産生した。対照的に、ｆａ／ｆａｃＤＮＡからのＰＣＲ産物は、ＲＯＢＲ１０／１７の配列決定の間に同定された更なるＭｓｐＩ部位を含み、７４７、１０２７及び２８９ｂｐの産物を産生した。即ち、ｆａ／ｆａラットで検査したあらゆる組識は、ヌクレオチド８８０でＡからＣへの突然変異に関しホモ接合であった。実施例８痩身ラットとｆａ／ｆａラットの遺伝子型解析ゲノムＤＮＡを、１０匹の痩身及び１０匹のｆａ／ｆａZuckerラット、並びに２匹の痩身及び５匹のｆａ／ｆａＺＤＦラットの尾の２ｃｍ部分から調製した。５０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ８．０、１００ｍＭＥＤＴＡ、及び０．５％ＳＤＳを含む緩衝液０．７ｍＬ中のプロテイナーゼＫ０．３μｇを用いて、組織を５５℃で一晩消化した。ＤＮＡをフェノール／クロロホルムで２度、クロロホルムで１度抽出した。濃度０．３ＭまでＮａＣｌを加え、次に等量の１００％エタノールを加えて、ＤＮＡを沈殿させた。ＤＮＡを７０％洗浄液に移し、次に１０ｍＭＴｒｉｓ、１ｍＭＥＤＴＡ中に再懸濁した。種々の源から上記のように得られたゲノムＤＮＡを、水で希釈し、最終濃度約１００ｎｇ／μＬにした。この実験で、反応条件は、ゲノムＤＮＡ鋳型１μＬ、プライマー１００ｎｇ、５００μＭｄＮＴＰ、Expandキットからの１×緩衝液３、Taq ポリメラーゼとTaq Expander各０．２５μＬを含む反応液２０μＬであった。反応物はPerkin Elmer ０．５ｍＬ薄璧チューブ中に加えた。Perkin Elmer 480温度サイクラーのための増幅プロトコルは、９２℃３０秒、５４℃１分、及び６８ ℃５分の３２サイクルであった。プライマーＲＯＢＲ２７(5’-GTT TGC GTA TGG AAG TCA CAG-3’)とＲＯＢＲ２８(5’-ACC AGC AGA GAT GTA TCC GAG-3’)を用い、約１．６５ｋｂｐのイントロン配列を含むに違いない１.８ｋｂｐのフラグメントを増幅した。これらのプライマーは、ｃＤＮＡを増幅するときには１５６ｂｐのＰＣＲフラグメントを産生するだけであるからである。ＰＣＲ増幅後、産物のＭｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ消化を行った。反応液は、ＰＣＲ反応液５μＬ、水４μＬ及び制限エンドヌクレアーゼＭｓｐＩ１μ Ｌを含んでいた。これらを混合し、３７℃で１時間インキュベートした。次に、産物を１％アガロースゲルで分析した。ＰＣＲ産物は、イントロンのどこかでフラグメントを切断する内因性ＭｓｐＩ部位を含んでおり、７００ｂｐのフラグメントを産生する。即ち、ホモ接合痩身ラットからの１８００ｂｐのＲＯＢＲ２７／２８ＰＣＲ産物のＭｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ消化により、１１００ｂｐの２個のフラグメントと内因性の７００ｂｐのフラグメントを得る。対照的に、ＡからＣへの突然変異を含む、ｆａ／ｆａＲＯＢＲ２７／２８ＰＣＲ増幅からのＰＣＲ産物のＭｓｐＩ消化により、更なるＭｓｐＩ部位が導入され、１１００ｂｐバンドを切断し、９５０ｂｐと１３０ｂｐの小フラグメントが産生される。痩身のZucker及びＺＤＦラットのゲノム解析はまた、Ｆａ／ｆａヘテロ接合体は、これらのラットが１１００ｂｐのフラグメント並びに９５０ｂｐの突然変異フラグメントを有することを示すＭｓｐＩ制限エンドヌクレアーゼ消化パターンによって示されるように存在していることも示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/68 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｒ 1:19） //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｒ 1:19） 5/00 Ｂ (31)優先権主張番号９６０８４７３．６ (32)優先日平成８年４月25日(1996．4．25) (33)優先権主張国イギリス（ＧＢ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＣＡ，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者キヤスキイ，シー・トーマスアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者リユー，キンユンアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126 (72)発明者フイリツプス，マイケル・エスアメリカ合衆国、ニユー・ジヤージー・ 07065、ローウエイ、イースト・リンカーン・アベニユー・126

Claims

【特許請求の範囲】１．同伴ラットタンパク質を実質的に含まないことを特徴とするラットｏｂ− レセプター（ＯＢ−Ｒ）。２．実質的に純粋であることを特徴とする請求項１に記載のラットＯＢ−Ｒ。３．野生型ＯＢ−Ｒを有するラット由来であることを特徴とする請求項１に記載のラットＯＢ−Ｒ。４．ｆａＯＢ−Ｒを有するラット由来であることを特徴とする請求項１に記載のラットＯＢ−Ｒ。５．図１に示される請求項３に記載のＯＢ−Ｒ。６．請求項１に記載のラットＯＢ−Ｒをコードすることを特徴とする核酸。７．ＤＮＡであることを特徴とする請求項６に記載の核酸。８．図２に示される請求項７に記載の核酸。９．図１に示されるヌクレオチド７５ないし３６５３のＯＲＦをコードすることを特徴とする請求項７に記載の核酸。１０．実質的に精製されたｆａＯＢ−Ｒをコードすることを特徴とするＤＮＡ。１１．ラットＯＢ−Ｒをコードする核酸を含むことを特徴とするベクター。１２．プラスミドであることを特徴とする請求項１１に記載のベクター。１３．ウイルスベクターであることを特徴とする請求項１２に記載のベクター。１４．請求項１１に記載のベクターを含むことを特徴とする宿主細胞。１５． E.coli、哺乳動物細胞又は酵母細胞であることを特徴とする請求項１４に記載の宿主細胞。１６．ラットＯＢ−Ｒ遺伝子が野生型であるか、又はｆａアレレであるかを決定するアッセイであって、遺伝子からＰＣＲプライマーを複製し、ＭｓｐＩ制限酵素でプライマーを切断し、得られたフラグメントの長さを測定することを特徴とする該アッセイ。１７．推定上のリガンドがラットＯＢ−Ｒに結合するかを決定し、推定上のリガンドをｆａ−ＯＢ−Ｒに結合させるためのアッセイであって、その推定上のリガンドをラットＯＢ−Ｒと接触させ、結合が起ったかどうかを測定することを特徴とする該アッセイ。１８．リガンドが標識されていることを特徴とする請求項１７に記載のアッセイ。１９．ラットＯＢ−Ｒが標識されていることを特徴とする請求項１７に記載のアッセイ。２０．請求項１７に記載のアッセイによって同定されることを特徴とするリガンド。