KR960014870B1 - 나노 입자형 단백질의 분산성 교질상 시스템의 제조방법 - Google Patents

나노 입자형 단백질의 분산성 교질상 시스템의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용없음.

Description

나노 입자형 단백질의 분산성 교질상 시스템의 제조방법
본 발명은 크기가 500nm 미만인 매트릭스 형태의 구형 입자(나노 입자 : nanoparticles)형 단백질의 분산성 교질상 시스템의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은, 필수적으로 물 또는 수성 혼합물중의 단백질 및, 임의로, 생물학적 활성 물질의 용액으로 이루어져 있고 여기에 하나 이상의 계면활성제가 첨가될 수 있는 액체 상을 단백질의 응결온도보다 낮은 온도에서 제조하는 단계 (1), 생물학적 활성 물질을 함유할 수 있으며, 하나 이상의 계면활성제가 첨가될 수 있는 필수적으로 물 또는 수성 혼합물로 이루어진 제2액체 상을 단백질의 응결온도보다 높은 온도에서 제조하는 단계(2), 단계(1) 또는 단계(2)에서 수득한 액체 상중의 하나를 단백질의 등전점과는 다른 pH 조건하에서 완만하게 교반하면서 다른 하나에 가하여, 단백질 및 임의의 생물학적 활성 물질의 나노 입자 교질상 현탁액을 거의 순간적으로 형성시키는 단계(3) 및, 경우에 따라, 물 또는 수성 혼합물의 전부 또는 일부를 제거하여 목적하는 농도의 나노 입자 교질상 현탁액을 생성시키거나 나노 입자 분말을 형성시키는 단계(4)를 포함한다.
단백질은 특히 혈청 알부민(예 : 사람 또는 소의 혈청 알부민) 또는 엘라스틴(소 등의 엘라스틴)과 같은 천연 단백질이다. 생물학적 활성 물질은 약물의 활성성분 또는 약물 전구체, 생물학적 시약 또는 미용 성분일 수 있다. 본 발명을 통하여, 단백질 단독(그 자체로 사용될 수 있는) 또는 생물학적 활성 물질과 결합된 상태의 나노 입자를 수득할 수 있게 되었다. 또한, 열적으로 불안정한 경우, 생물학적 활성 물질은 이미 생성된 단백질 나노 입자와 결합시킬 수 있으며, 이렇게 결합시키는 것이 심지어 바람직하다고까지 할 수 있다.
물 또는 수성 혼합물(예를 들어, 산성화 또는 염기성화된 물)인 용매상(1)의 온도는 특히 0℃ 내지 50℃, 예를 들어 약 실온일 수 있다.
물 또는 수성 혼합물(예를 들어, 산성화 또는 염기성화된 물)인 상(2)중의 단백질용 비-용매의 온도는 특히 80℃ 내지 100℃(대기압하에서), 예를 들어, 약 비점이다.
상기(1) 및 (2) 혼합물의 pH의 단백질의 응결을 방지하기 위해 단백질의 등전점과는 다른 것이어야 한다. pH 차이가 2 내지 3 정도인 것이 바람직하다. 천연 단백질의 pH는 주로 5 내지 6 정도이기 때문에, 최종 용액의 pH가 약 3 또는 약 9인 것이 바람직하다. 이러한 목적을 위해, 산 또는 염기를 적합하게는 상(1) 또는 (2)에 가할 수 있다. "완만하게 교반시키는"이라는 용어는 500rpm 이하(예 : 100rpm)로 교반(예 : 자기교반)하는 것을 의미한다.
상(1)의 단백질 농도는 0.1 내지 10%, 바람직하게는 0.5 내지 4%일 수 있다.
상(1)/상(2)의 용적비는 0.1 내지 1, 바람직하게는 0.2 내지 0.6일 수 있다.
최종적으로, 나노 입자의 교질상 용액을 목적하는 바에 따라 농축, 멸균, 완충화(예 : 생리적 pH에서), 동결 건조 또는 가교결합시킬 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것이다.
[실시예 1]
사람의 혈청 알부민(HSA) 나노 입자의 제조
상(1)
HSA 1.0g
N 염산 0.3g
탈염수 또는 증류수(실온) 100.0g
상(2)
가열하여 비등시킨 탈염수 또는 증류수 180.0g
상(1)을 자기교반하면서 상(2)에 가한다. 혼합물은 HSA 나노 입자를 형성하므로써 즉시 단백광을 형성하게 된다. 레이저 빔 회절 분석기(Coultronics사의 제품 Nanosizer
Figure kpo00001
)로 측정한 나노 입자의 평균크기는 평균분산지수 0.5에서 190nm였다.
현탁액은 감압하에서 목적하는 용적, 예를 들어 100㎤까지 농축시킬 수 있다.
[실시예 2]
멸균 사람 혈청 알부민 나노 입자의 제조
방법을 실시예 1에서와 동일하게 수행한 다음, 현탁액을 135℃하에 오토클레이브에서 15분간 멸균시킨다. 입자의 평균 크기는 멸균 후에도 거의 그대로 유지된다.
[실시예 3]
동결건조된 사람 혈청 알부민 나노 입자의 제조
방법을 실시예 2에서와 동일하게 수행한 다음, 멸균 현탁액을 동결 건조시킨다.
냉동보호제(말토즈, 트레할로즈 등)를 첨가하는 것이 필수적이지는 않으나, 동결건조물의 재현탁을 촉진시킨다. 입자의 평균 크기는 동결건조후에도 그대로 유지된다.
[실시예 4]
가교결합된 사람 혈청 알부민 나노 입자의 제조
글루타르알데하이드의 25%(w/v) 수용액을 0.06g을 상(1)에 가하는 점을 제외하고는, 실시예 1에서와 동일하게 수행한다. 입자의 평균크기는 가교결합후에도 변함없이 유지된다.
[실시예 5]
소의 혈청 알부민 나노 입자(BSA)의 제조
HSA 대신 BSA를 사용하고, 보통 염산을 동량의 0.01N 수산화나트륨으로 대체하는 점을 제외하고는 실시예 1에서와 동일하게 수행한다. 나노 입자의 평균 크기는 평균분산지수 0.5에서 150nm이다. BSA 나노 입자는 HSA와 마찬가지로 가교결합, 오토클레이브에서의 멸균 및 동결 건조가 가능하다.
[실시예 6]
엘라스틴 나노 입자의 제조
HSA 대신 엘라스틴을 사용하는 점을 제외하고는 실시예 1에서와 동일하게 수행한다. 나노 입자의 평균 크기는 평균분산지수 1에서 280nm이다. 엘라스틴 나노 입자는 HSA와 마찬가지로 가교결합, 오토클레이브에서의 멸균 및 동결건조가 가능하다.
[실시예 7]
활성성분을 단백질 나노 입자에 흡착시키는 방법
실시예 1(HSA) 또는 실시예 5(BSA)에 따라 제조된 나노 입자에 살리실산나트륨을 증가량(0.25g 내지 2.50g) 가한다. 초원심분리후 측정된, 살리실산나트륨과 나노 입자와의 결합율은 사용된 활성성분의 양과는 관계없이 사용된 양의 60%이다.
[실시예 8]
활성성분 존재하에서의 나노 입자의 제조
상(1)에 용해된 살리실산나트륨 0.5g의 존재하에서 수행하는 점을 제외하고는 실시예 1(HSA 1g) 또는 실시예 5(BSA 1g)에서와 동일한 방법으로 수행한다. 나노 입자의 평균크기는 평균분산지수 0.5에서 200nm이다. 초원심분리후 측정된 살리실산나트륨과 나노 입자와의 결합율은 사용된 양의 60%이다.
[실시예 9]
실시예 8의 변형방법
살리실산나트륨을 상(2)에 용해시키는 점을 제외하고는 실시예 8에서와 동일한 방법을 수행한다. 수득된 나노 입자는 실시예 8에서 수득한 것과 동일한 특성을 지닌다.
[실시예 10]
독소루비신 단백질 나노 입자의 제조
독소루비신 염산염 50mg을 실시예 1(HSA) 또는 실시예 5(BSA)에서 수득된 나노 입자에 가한다. 초원심분리후 측정된, 독소루비신과 나노 입자의 결합율은 사용된 양의 90%이다.

Claims (16)

  1. 물 또는 수성 혼합물중의 단백질 용액을 포함하고 하나 이상의 계면활성제가 첨가될 수 있는 액체 상을 단백질의 응결온도보다 낮은 온도에서 제조하는 단계(1), 물 또는 수성 혼합물을 포함하고 하나 이상의 계면활성제가 첨가될 수 있는 제2액체 상을 단백질의 응결온도보다 높은 온도에서 제조하는 단계(2) 및 단계(1) 및 단계(2)에서 수득한 액체 상중의 하나를 단백질의 등전점과는 다른 pH 조건하에서 완만하게 교반하면서 다른 하나에 가하여, 단백질의 나노 입자 교질상 현탁액을 거의 순간적으로 형성시키는 단계(3)를 포함하는, 매트릭스 형태의 크기가 500nm 미만인 구형 입자(나노 입자 ; nanoparticles)형 단백질의 분산성 교질상 시스템의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 단백질이 혈청 알부민인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단백질이 엘라스틴인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항중의 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 물질이 단계(3)에서 미리 형성된 단백질의 나노 입자에 추가로 부가되고 결합되는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항중의 어느 한 항에 있어서, 상(1)의 물 또는 수성 혼합물의 온도가 0℃ 내지 50℃인 방법.
  6. 제1항 내지 제3항중의 어느 한 항에 있어서, 상(2)이 물 또는 수성 혼합물의 온도가 80℃ 내지 100℃인 방법.
  7. 제1항 내지 제3항중의 어느 한 항에 있어서, 상(1)과 상(2)의 혼합물의 pH가 단백질의 등전점과 2 내지 3단위 차이가 나는 방법.
  8. 제1항 내지 제3항중의 어느 한 항에 있어서, 상(1)중의 단백질 농도가 0.1 내지 10%인 방법.
  9. 제1항 내지 제3항중의 어느 한 항에 있어서, 상(1)/상(2)의 용적비가 0.1 내지 1인 방법.
  10. 제1항 내지 제3항중의 어느 한 항에 있어서, 나노 입자의 크기가 약 150 내지 300nm인 방법.
  11. 제1항 내지 제3항중의 어느 한 항에 있어서, 생물학적 활성 물질이 단계(1)에서 형성된 액체 상, 단계(2)에서 형성된 제2액체 상 또는 이들 둘다에 추가로 포함되는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 생물학적 활성 물질이 약물의 활성성분 또는 약물 전구체, 생물학적 시약 또는 미용 성분인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 물 또는 수성 혼합물의 전부 또는 일부를 제고하여 목적하는 농도의 나노 입자 교질상의 현탁액을 생성시키거나 나노 입자 분말을 형성시키는 단계(4)가 추가로 포함되는 방법.
  14. 제8항에 있어서, 상(1)중의 단백질 농도가 0.5 내지 4%인 방법.
  15. 제9항에 있어서, 상(1)/상(2)의 용적비가 0.1 내지 0.6인 방법.
  16. 제13항에 있어서, 물 전체가 동결 건조법에 의해 제거되는 방법.
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