JPH09507680A

JPH09507680A - 赤血球代用剤

Info

Publication number: JPH09507680A
Application number: JP7527805A
Authority: JP
Inventors: ニールコッソフスキー; アンドリューイー．ゲルマン; エイチ．ジェイムズナティスジン
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1994-04-25
Filing date: 1995-04-21
Publication date: 1997-08-05
Anticipated expiration: 2014-08-25
Also published as: AU2361695A; JP2939341B2; EP0758226A4; EP0758226A1; US5464634A; CA2177066A1; WO1995028915A1

Abstract

(57)【要約】ヘモグロビンなどの酸素担体が結合されているナノ結晶コア粒子で構成されている赤血球代用剤。酸素担体を変性させることなくまたは酸素担体の酸素輸送性能を破壊することなく、酸素担体をナノ結晶コア粒子に結合させるため、ナノ結晶コア粒子と酸素担体の間に酸素担体アンカーコーティングを設ける。酸素担体を結合されたナノ結晶コア粒子は、脂質の層でコートされ、次いで糖またはアロステリックエフェクターの外面層が塗布される。

Description

【発明の詳細な説明】赤血球代用剤本願は、米国特許出願第０７／５４２，２５５号（現在、米国特許第５，２１９，５７７号）の一部継続出願である米国特許出願第０７／６９０，６０１号（現在、米国特許第５，１７８，８８２号）の一部継続出願である１９９３年１月４日出願の米国特許出願第０８／０００，１９９号の一部継続出願である１９９３年３月３日出願の同時係属中の米国特許出願第０８／０２９，７７３号の一部継続出願である。発明の背景１．発明の分野本発明は、概しては、赤血球および赤血球に代わりまたは補充するのに用いることができる化合物の開発に関する。さらに詳しくは、本発明は、赤血球と同じ酸素運搬性能を有しかつ赤血球代用剤として生体内および生体外で使用できる合成化合物に関する。２．関連技術の説明適切な血液代用剤の開発に対しては、引続き多くの関心がもたれている。研究の一方法として遊離ヘモグロビン溶液（free hemoglobin solutions）を用いるものがある。しかし、遊離のモノマーおよびポリマーのヘモグロビンならびに架橋ヘモグロビン（cross-linked hemoglobin）の溶液は、通常の血液より著しく高い容積モル浸透圧濃度を呈する。容積モル浸透圧濃度が高いと、血管容積と潅流圧の併発症を起こす傾向がある。その他の問題は、未修飾ヘモグロビンが糸球体で自由に濾過されかつ腎毒性であるということである。血液代用剤に遊離ヘモグロビンを使用すると、ヘモグロビン源中に存在していかも知れない汚染物または製造工程で入るかも知れない汚染物によって事態はますます複雑になる。内毒素類とリン脂質類は、ヘモグロビン溶液を血液代用剤として利用する場合に問題になるかも知れない汚染物の代表例である。そのうえ、異種のヘモグロビン源は、ラットに著しい抗体価を生成することが分かっている。また、ヒトの試験で免疫原性合併症も報告されている。血液代用剤への別のアプローチとして、ペルフルオロカーボン類を使用する方法がある。これらの血液代用剤は、典型的に、１０〜２０重量％のペルフルオロカーボンを含有し、粒径が約１５０ｎｍである。ペルフルオロカーボンタイプの血液代用剤は、充分な酸素送達容量を有していると報告されている。しかし、ベルフルオロカーボン類は、直線的な酸素解離曲線を示し、最適の酸素運搬を行うには望ましくない。そのうえ、ペルフルオロカーボン類にはいくつかの臨床上の難点がある。ペルフルオロカーボン類は、血液濾過臓器に容易にトラップされ、その結果数週間から数箇月間にわたって、デパトマーガリ（ｄｅｐａｔｏｍｅｒｇａｌｙ）および脾臓器肥大になる。さらに、ペルフルオロカーボンは、細胞障害作用を呈するし、赤血球によって容易に吸着される。この吸着によって、赤血球が毛細血管床を通過しにくくなる細胞の可撓性低下をもたらす。ヘモグロビンをリポソームで被包したものは、従来研究されている別の種類の血液代用品である。ヘモグロビンのリポソーム被包体は、約４０年前に血液代用品として初めて使用に成功した。そのとき、ヘモグロビンは、コロジオン膜で被包された。リポソームによる被包によって、生物学的薬剤の毒性を低下させ、かつその循環時間を増大するのに成功した。コレステロール、ホスファチジルコリンその他の脂質を用いて、直径が２００〜５００マイクロメートルのオーダの被包ヘモグロビンカプセルが製造されている。リポソームで被包されたヘモグロビンは、ペルフルオロカーボン類および遊離ヘモグロビンを使用することによってもたらされる多くの難点を克服するように見える。しかし、いくつかの臨床上の難点が依然として存在している。例えば、細綱内皮系摂取、血小板凝集および細綱内皮系の抑圧を伴う問題が経験されている。赤血球の代用剤として有効に機能できる新しい合成組成物を提供することが現在引続き要求されていることは、明らかである。その合成組成物は、望ましくない副作用を起こすことなく、許容可能なレベルの酸素運搬を行うことができなければならない。また、その合成物質は、容易に貯蔵され、そして妥当な貯蔵寿命をもっていなければならない。血液代用剤は、大量失血後の野外での外傷の救急蘇生または外科手術中の血液置換をはじめとする広範囲の事態で容易に使用できなければならない。さらに、血液代用剤は、輸送中および移植中に心臓、肝臓および腎臓のような臓器を潅流するのに生体外で容易に使用できなければならない。発明の概要本発明により、広範囲の事態において血液代用品として使用することができる赤血球代用剤が提供される。本発明の赤血球代用剤は、セラミック金属またはポリマー材料で構成されているナノ結晶コアを有している。その粒子の表面は、酸素担体アンカー物質でコートされている。酸素担体が上記アンカーコーティングに結合され、次に脂質の外側層が施されて赤血球代用剤が完成する。本発明の特徴として、酸素担体アンカー物質が、ナノ結晶粒子の表面を実質的に被覆して、これに結合される酸素担体を変性することなく、酸素担体をコア粒子に固定するのに充分なしきい表面エネルギーを有するガラス状被膜を形成している。このことにより、広範囲のコア粒子物質がそれぞれの表面エネルギーの如何に拘わらず使用できる。そのアンカー物質は、塩基性糖類（basic sugars）およびアロステリックエフェクター類である。本発明の他の特徴として、ヘモグロビンが好ましい酸素担体であることである。ヘモグロビンは、変性されることなく、ナノ結晶コアを囲むガラス状被膜に固定できることが発見されたのである。固定されたヘモグロビンは、天然に存在する赤血球に見られるヘモグロビンと同じ要領で酸素運搬を行う。本発明の別の特徴として、その赤血球代用剤の外側面が脂質の層でコートされ、構造と機能を天然に存在する赤血球に一層よく似せた赤血球代用剤が得られることである。その脂質層は、赤血球の外膜に似せて設計される。本発明の追加の特徴として、糖またはアロステリックエフェクターの外面層を上記脂質層のカバーとして設けてもよいことである。この外面層は、凝固の活性化およびその結果の血管内血栓の形成を防止する働きがある。本発明の赤血球代用剤は、生体内または生体外で組織に酸素を送達する必要があるあらゆる場合に使用するのに好適である。本発明の赤血球代用剤は、大量失血の後の野外外傷における蘇生にまたは外科手術における失血に対する血液置換に、生体内で使用できる。さらに、本発明の赤血球代用剤は、ある種の疾病過程のため赤血球を産生できない患者に使用できる。本発明の赤血球代用剤の生体外での使用としては、移植を行う前の運搬と貯蔵中に行う心臓、肝臓および腎臓のような臓器の潅流がある。さらに、本発明の赤血球代用剤は、随意選択の酸素送達系として細胞培養系に使用できる。本発明の、先に考察した特徴および他の多くの特徴ならびにそれに伴う利点は、以下の詳細な説明によって一層よく理解されるであろう。好ましい実施態様の詳細な説明本発明による赤血球代用剤は、酸素担体アンカーコーティングでコートされたナノ結晶コア粒子（直径は、１，０００ｎｍ末満）に基づいている。酸素担体、例えばヘモグロビンは、上記酸素担体アンカーコーティングに結合される。酸素担体が結合しているナノ結晶コア粒子は、次いで脂質の外側層でコートされる。次いで、糖の最終外面コーティングを塗布して上記脂質層を被覆する。本発明の赤血球代用剤は、酸素運搬性能が天然に存在する赤血球に類似しており、赤血球と同じ要領で生体外および生体内の両方において、酸素を運搬するのに有用であることが見出されたのである。本発明の赤血球代用剤は、１９９３年１月１２日に発行され、本願と同じ譲受人が所有している米国特許第５，１７８，８８２号に開示されているウイルスデコイワクチンに、いくつかの点で類似している。米国特許第５，１７８，８８２号には、各種のウイルスフラグメントまたはウイルスタンパク質コーティングが結合しているナノ結晶コア粒子でできたデコイウイルスが開示されている。そのコア粒子は、ウイルス粒子を変性することなくアンカリングするのを促進する表面改変剤でコートされている。本発明は、ヘモグロビンまたは他の酸素担体が表面エネルギー改変層（すなわち、酸素担体アンカーコーティング）に結合され、そして脂質の外側コーティングが設けられていることを除いて、上記の同じ原理に基づいている。米国特許第５，１７８，８８２号の内容を、本明細書に援用する。本発明の赤血球代用剤のコアを形成するナノ結晶粒子は、金属、イオン性固体またはセラミックをはじめとして、多種類の無機物質で作られる。このコアの材料は、ポリマーでもよい。これら粒子は、粒径が約１０００ｎｍまでの範囲内であってもよい。好ましい粒径は、約１０〜２００ｎｍのオーダである。好ましい金属としては、クロム、ルビジウム、鉄、亜鉛、セレン、ニッケル、金、銀および白金がある。好ましいセラミック物質としては、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、二酸化チタン、酸化アルミニウム、酸化ルテニウムおよび酸化スズが拳げられる。これらコア粒子は、例えば、ダイヤモンド、水酸化カルシウム、酸化カルシウム、アセチルサリチル酸カルシウム、アスコルビン酸カルシウム、炭酸カルシウム、クエン酸カルシウム、シクラミン酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、次リン酸カルシウム、ヨウ素酸カルシウム、乳酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、リン酸塩、ピロリン酸カルシウム、Ｄ−サッカリン酸カルシウム、ステアリン酸カルシウム、コハク酸カルシウム、亜硫酸カルシウム、酒石酸カルシウムおよびリン酸カルシウムの組成物のような物質で作ることができる。好ましいポリマーとしては、ポリスチレン、ナイロンおよびニトロセルロースがある。酸化スズ、二酸化チタン、酸化カルシウム、水酸化カルシウム、またはリン酸カルシウムダイヤモンドで作った粒子が特に好ましい。直径が１０００ナノメートル未満の上記材料で製造された粒子は、市販されているが、または溶液中での漸進核生成法（progressive nucleation）（コロイド反応）もしくは各種の物理的および化学的堆積法、例えばスパッタデポジシヨン法（Ｈａｙａｓｈｉ，Ｃ．、Ｊ．Ｖａｃ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．、Ａ５（４）巻、１９８７年７月／８月、１３７５〜１３８４頁；Ｈａｙａｓｈｉ，Ｃ．、ＰｈｙｓｉｃｓＴｏｄａｙ、１９８７年１２月、４４〜６０頁；ＭＲＳＢｕｌｌｅｔｉｎ、１９９０年１月、１６〜４７頁）で製造することができる。水中に分散された凝集体の粒径が約１４０ナノメートルの酸化スズがＶａｃｕｕｍＭｅｔａｌｌｕｒｇｉｃａｌＣｏ．社（日本）から市販されている。所望の組成と粒径範囲を有する他の市販粒子がＡｄｖａｎｃｅｄＲｅｆｒａｃｔｏｒｙＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．社（米国ニューヨーク州バッファロー所在）から入手できる。プラズマ利用化学蒸着法（ＰＡＣＶＤ）は、適切な微細粒子を製造するのに使用できるいくつかの技術の内の一つである。ＰＡＣＶＤは、比較的高い気圧中（１トル以上のオーダ）で行われ、直径が１０００ナノメートルまでの粒子を製造するのに有用である。例えば、直径が１０００ナノメートル未満の窒化アルミニウム粒子は、反応物としてＡｌ（ＣＨ₃）₃とＮＨ₃を用いてＰＡＣＶＤで合成することができる。ＰＡＣＶＤ装置は、典型的には、水平に取り付けられた石英管とそれに連係したポンピングおよびガス供給システムを含んでいる。サセプタが該石英管の中央に配置され、６０ｋＨｚの無線周波源を用いて加熱すれる。合成された窒化アルミニウム粒子は、該石英管の壁上に集められる。Ａｌ（ＣＨ₃）₃ の担体として窒素ガスが用いられる。反応室におけるＡｌ（ＣＨ₃）₃：ＮＨ₃の比率は、Ｎ₂Ａｌ（ＣＨ₃）₃とＮＨ₃ガスの反応室への流量を変えることによって制御される。反応室内の圧力は、一般に１０トルに一定に維持して、超微細ナノ結晶窒化アルミニウム粒子の堆積および形成が行われる。ＰＡＣＶＤ法は、各種の他の適切なナノ結晶粒子を製造するのに使用することができる。ナノ結晶水酸化カルシウムは、カップホーン中１５分間（４℃）４００Ｗの超音波処理をしながら、１０ｍｌの１００ｍＭクエン酸ナトリウム中に、０．７５Ｍの塩化カルシウムと１．５Ｎの水酸化ナトリウムを互いに向き合わせて５０ｍｌずつ流すことによって調製することができる。生成した白色不透明の固体をＨＰＬＣグレードの滅菌水で２回洗浄し、さらに１時間４５０Ｗ（４℃）で超音波処理を行い、１５０ｍｇ／ｍｌに調整して、下記のようにコートすることができるナノ結晶粒子の分散液が得られる。ヘモグロビンなどの酸素担体をコア粒子に結合させるため、まず第一に、ヘモグロビンを変性することなしに結合させるのに充分なしきい表面エネルギーを粒子に付与する物質でコア粒子をコートしなければならない。コア粒子は、これを、分散された表面改変剤を含有する溶液中に懸濁させることによりコートすることが好ましい。そのコーティングによって粒子の表面にヘモグロビンなどの酸素担体が一層容易に付着できるようになることが必要である。本発明による適切なコーティング物質は、塩基性糖類（basic sugars）であり、セロビオース、トレハロース、イソマルトース、ニストースソルビトール（nystose sorbitol）、ラクチトール（lactitol）、マルトースおよびスクロースがある。さらに、ピリドキサール−５−リン酸、２，３−ホスホグリセレートおよびクエン酸ナトリウムなどのアロステリックエフェクターが使用できる。所望により、表面改変コーティング（すなわち、酸素担体アンカーコーティング）を塩基性糖とアロステリックエフェクタを組み合わせて作ることができる。必要なのは、このコーティングが、ヘモグロビンなどの酸素担体をその関連酸素輸送部位を変性することなく結合させるのに充分なしきいエネルギーをナノ結晶粒子の表面に付与することだけである。本発明に必要な分子安定化作用を呈する糖類は、本質的に多数のヒドロキシ基を有するもので、かつ比較的分子量が低いものであって、そのガラス状態において最大の回転自由度を与える。したがって、ヒドロキシ基が豊富な二糖類と類縁アルコール類を含む低分子量分子は、古典的に水と関連があるエネルギー論に合致しながら、しかも本発明に必要な分子安定化をもたらす機能性ガラスを製造するのに充分な小分子量であることが期待される。コア粒子が懸濁されるコーティング溶液には、例えば、１〜３０ｗ／ｖ％のコーティング材料が含有されている。溶質は、２回蒸留した水（ｄｄＨ₂Ｏ）が好ましい。コーティング溶液に懸濁されるコア粒子の量は、粒子の種類と粒径によって変わる。典型的には、粒子密度が約１００ｍｇ／ｍｌ以上の溶液が、赤血球代用剤を合成するのに適している。コア粒子は、粒子の均一なコーティングがもたらされるのに充分な時間のあいだ、コーティング溶液中に分散状態で維持される。超音波処理が、分散状態を維持するのに好ましい方法である。室温で３０分間〜数時間の範囲の分散時間で、適切なコーティングを粒子に付与するのに通常充分である。コーティングの厚みは、５ナノメートル未満が好ましい。コーティングの厚みは、最終コア粒子が、粒子の実質的全表面に均一な酸素担体アンカーコーティングを有している限り、種々変えてもよい。先に述べた水酸化カルシウムのナノ結晶粒子は、以下のようにしてクエン酸ナトリウムでコートすることができる。１００ｍＭクエン酸ナトリウム溶液５０ｍｌを、新たに超音波で処理した水酸化カルシウムナノ結晶粒子分散液（１５０ｍｇ／ｍｌ）５０ｍｌに添加し、次に低熱下で一夜凍結乾燥する。翌朝、得られた固体に水を加えて５０ｍｌにし、４５０Ｗで５分間超音波で処理し、次にＨＰＬＣグレードの水で３回洗する。得られた製剤は、下記に述べるように、さらにヘモグロビン担体を合成するため、３００ｍｇ／ｍｌに調節する。水酸化カルシウムナノ結晶粒子の他の実例的なコーティング法は、次のとおりである。５００ｍＭのセロビオース溶液１０ｍｌを、新たに超音波で処理した水酸化カルシウムナノ結晶粒子分散液（１５０ｍｇ／ｍｌ）５０ｍｌに添加し、次に低熱下で一夜凍結乾燥する。翌朝、得られた固体に水を加えて５０ｍｌにし、４５０Ｗで５分間超音波処理を行い、次いでＨＰＬＣグレードの水で３回洗浄する。得られた製剤は、下記に述べるように、さらにヘモグロビン担体を合成するため、３００ｍｇ／ｍｌに調節する。水酸化カルシウムナノ結晶粒子のさらに別の実例的なコーティング法は次のとおりである。１００ｍｇ／ｍｌピリドキサール−５−リン酸溶液の１０ｍｌを、新たに超音波で処理した水酸化カルシウムナノ結晶粒子分散液（１５０ｍｇ／ｍｌ）５０ｍｌに添加し、次に低熱下で一夜凍結乾燥する。翌朝、得られた固体に水を加えて５０ｍｌにし、４５０Ｗで５分間超音波処理を行い、次いでＨＰＬＣグレードの水で３回洗浄する。得られた製剤は、下記に述べるように、さらにヘモグロビン担体を合成するため、３００ｍｇ／ｍｌに調節する。コートされたナノ結晶コア粒子に結合される酸素担体は、ヘモグロビンが好ましい。ヘモグロビンは、ヒト、ウシまたはヒッジを含めて多数の起源から誘導することができる。精製ヘモグロビンは、多くの異なる供給者から市販されている。そのうえに、血液からヘモグロビンを単離し精製する公知の方法のいずれをも使用できる。ヘモグロビンは、好ましい酸素担体であるが、所望により他の酸素運搬巨大分子も使用できる。ヘモグロビンは、組換え工学の技術またはブタなどのトランスジェニック動物によって製造することができる。ヘモグロビンは、広範囲な方法によって、コートされたナノ結晶コア粒子に結合させることができる。好ましくは、精製ヘモグロビンの溶液を、コートされたナノ結晶コア粒子の溶液に添加し、コートされた粒子にヘモグロビンを結合させるのに充分な時間攪拌する。コートされたコア粒子へのヘモグロビンの結合は、溶液中で起こさせることが好ましいが、精製されたヘモグロビンとコートされたコア粒子とが充分に接触しているならば、他の多くの方法も使用できる。コートされたナノ結晶粒子に結合させるヘモグロビンの量は、赤血球代用剤として意図された用途によって大幅に変わり得る。各ナノ結晶粒子に結合させるヘモグロビンの量は、その代用剤の酸素輸送特性に悪影響を与えることなく、できるだけ多く最大化することが好ましい。酸素を最高に輸送したい場合は、ナノ結晶粒子にヘモグロビンを最大量結合させることが望ましい。しかし、より少なくてもよい場合は、コートされたナノ結晶粒子に結合させるヘモグロビンの程度が減少されてもよい。好ましくは、コートされたナノ結晶粒子に過剰のヘモグロビンを組み合わせて、ヘモグロビンの最大量の結合を保証するのがよい。本発明の赤血球代用剤を製造する次のステップは、上記ナノ結晶粒子に脂質をコートステップである。ナノ結晶粒子および結合させたヘモグロビンをコートのに用いる脂質は、リポソームを製造するのに通常用いるのと同じ脂質である。適切な脂質としては、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびホスファチジルセリンなどのリン脂質類がある。この脂質層は、前記アンカーコーティングおよびヘモグロビンと同じ要領でナノ結晶粒子および結合させたヘモグロビンに塗布する（付着させる）。コア粒子および結合させたヘモグロビンを脂質層で完全に被覆することが必要であるかどうかは明らかでない。好ましくは、コア粒子および結合させたヘモグロビンをコートのに使用される脂質の量は、粒子の完全な相互作用とコーティングを保証するために、過剰であるのがよい。本発明の赤血球代用剤を形成する場合の最終ステップは、上記脂質層を外面コーティングでコートステップである。この外面コーティングは、アンカーコーティングを形成するのに使用するのと同じ糖類およびアロステリックエフェクターで作ってもよい。この外面コーティングは、糖またはアロステリックエフェクターの存在下で粒子を凍結乾燥することによって塗布するのが好ましい。セロビオースは、好ましい外面コーティングである。また、この外面コーティングは、従来のコーティング法のいずれを用いてでも塗布することができる。この外面コーティングによって、本発明の赤血球代用剤の実質的に全表面を被覆することが好ましいこの外面コーティングは、数ナノメートルのオーダの厚みが好ましい。この外面安定化層は、生体内での血液凝固機構の活性化を防止して、血管内血栓症の可能性を低下させるように設計される。本発明の赤血球代用剤は、各種の形態で貯蔵することができる。好ましくは、この赤血球代用剤は、凍結乾燥し、乾燥形態で貯蔵するのがよい。しかし、所望により、本発明の赤血球代用剤は、溶液の形態で貯蔵してもよい。本発明の赤血球代用剤は、単独でまたは他のいくつの代用血液とでも組み合わせて使用してもよい。本発明の赤血球代用剤は、凍結乾燥の形態の場合、いかなる公知の水性医薬担体ででも再構成することができる。これらの医薬担体としては、アロステリックエフェクターを含有しているかまたは含有していない緩衡食塩水、血漿および全血がある。リン酸緩衡食塩水（ＰＢＳ）とアルブミンで構成された溶液が好ましい担体である。本発明の赤血球代用剤は、濃縮懸濁液または希釈懸濁液として生体内に注射することができる。また、本発明の赤血球代用剤を生体外で用いる場合、凍結乾燥代用剤を直接添加することから濃縮または希釈した代用剤懸濁液を添加することまで多岐にわたって使用される。一般に、本発明の赤血球代用剤は、天然に存在する赤血球と同じ要領で使用できる。さらに、本発明の赤血球代用剤は、他の合成代用血液と同じ要領で使用することもできる。実施例は、次のとおりである。実施例１下記の実施例は、本発明の赤血球代用剤の調製法を実証するものである。その製造工程は、超微細ナノ結晶ダイヤモンド粒子を二糖類のガラス状被膜でコートし、次いで精製ヘモグロビンを物理的に吸着させることを含んでいる。得られた集成体を単純なリポソームで被包する。酸で洗浄した市販の超微細合成ダイヤモンド粒子（ＧＥシリーズ３００、米国オハイオ州ワージングトン）１．００ｇを、１００ｍＭセロビオース（Ｓｉｇｍａ）溶液５．０ｍｌ中に１７５ワットの超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ）を１０分間行うことによって分散させた。得られたコロイドを１０ｋＤのスターセル（st ir cell）中で４．０℃で一夜インキュベートした。翌日、このコロイドを２４時間凍結乾燥し、１．０ｍｌのｄｄＨ₂Ｏで再構成した。未吸収のセロビオースを、２０ｍＭリン酸緩衡液（ｐＨ７．４）（ＰＲＢ）１００ｍｌに対して１０ｋＤスターセル限外濾過（ＵＦ）（Ｆｉｌｔｒｏｎ）を行うことによって除去し、２．０ｍｌに調整した。５００ｍｇのヒトヘモグロビンタイプＡ_o（Ｓｉｇｍａ）を５．０ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ６．８）（Ｇｉｂｃｏ）に溶解し、５０ｋＤスター中で４．０℃の１５０ｍｌのＰＲＢに対し３０ｐｓｉＮ２を用いて限外濾過を行った。得られた濾液を３．０ｍｌに調整した。上記の表面修飾ダイヤモンド分散液（２．０ｍＬ）を上記５０ＫＤ限外濾液セル中に添加し、ゆっくり攪拌しながら（５ｐｓｉＮ₂）一夜インキュベートした。濾液を３．０ｍｌに調整した。表面修飾（改変）ダイヤモンド分散液（２．０ｍＬ）を５０ｋＤ限外濾過セルに加え、ゆっくり攪拌しながら（５ｐｓｉＮ₂、４．０℃）一夜インキュベートした。翌朝、ホスファチジルジパルミトイルセリン（６．０ｍＭのＮａＯＨ中に１０ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ）の３５μＬ、ホスファチジルジパルミトイルコリン（６．８ｍＭストック）（Ｓｉｇｍａ）の５０μＬおよびコレステロール（３．９ｍＭストック）（Ｓｉｇｍａ）の８．７μＬを添加して攪拌し、そして約６時間インキュベートした。得られた最終生成物を再び５０ｋＤの限外濾過セルで、３０ｐｓｉＮ₂を用い２０ｍｌのＰＢＳに対して濾過した（ｐＨ７．４、４．０℃、そしてヘモグロビンの推定濃度が１０ｇ／ｄＬになるよう５．０ｍｌに調節した）。実施例２この実施例では、酸素担体アンカーコーティングとしてセロビオースの代わりにピリドキサール−５−リン酸を用いたことを除いて、実施例１と同じ要領で赤血球代用剤を作った。酸で洗浄した市販の超微細合成ダイヤモンド粒子（ＧＥシリーズ３０、米国オハイオ州ワージングトン）の５０ｍｇを、１０分間１７５ワットで超音波処理（Ｂｒａｎｓｏｎ）することによりピリドキサール−５−リン酸（Ｓｉｇｍａ）の７５．０ｍｇと混合して分散させ、次いで脱イオン水で１０．０ｍｌに調節した。得られた混合物を一夜スパン凍結乾燥を行い（spun lyophilize）し、４〜１０ｍｌずつの脱イオン水で洗浄し、次いでｐＨ７．４０、２０ｍＭのリン酸緩衡液で、２５ｍｇ／ｍｌの濃度に再構成した。ナノ結晶コア粒子４．０ｍｌ（２５ｍｇ／ｍｌ）を、血液溶解液の回収ヘモグロビン１．０ｍｌ（２６．１０ｇ／ｄＬ）に添加した。得られた混合物を、１０ｋＤの限外濾過セルを通じて２０ｐｓｉの窒素によって４．０℃で一夜、０．５ＸＰＲＢ１００ｍｌ中にゆっくり透析した。翌朝、ホスファチジルセリン（６．０ｍＭＮａＯＨ中１０ｍＭ）（Ｓｉｇｍａ）３４μＬ、コレステロール（３．９ｍＭストック）（Ｓｉｇｍａ）５０μＬを添加して攪拌し、約６．０時間インキュベートした。最終製晶を再び、５０ｋＤ限外濾過セルを用い、３０ｐｓｉのＮ₂で２００ｍｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４、４．０℃）に対して濾過して遊離ヘモグロビンを除き、次いで１．０〜２．５ｍｌまで、または推定ヘモグロビン濃度１０ｇ／ｄＬまで、調節した。上記手順を、ピリドキサール−５−リン酸の濃度を変えて繰返した。その結果、１ｍＭのピリドキサール−５−リン酸を含有する溶液および３０ｍＭのピリドキサール−５−リン酸を含有する溶液中でナノ結晶粒子をコートして赤血球代用剤を調製した。実施例１と２で調製した赤血球代用剤を、酸素解離特性、粒径分布、電気泳動移動度および保持されている分子立体配座について分析した。セロビオースでコートした赤血球代用剤（実施例１）は、２６〜３０ｍｍＨｇという酸素解離（Ｐ５０）を示した。ピリドキサール−５−リン酸のコーティングを有する赤血球代用剤の酸素解離（Ｐ５０）は、３７ｍｍＨｇであった。この値は、ヒト全血の酸素解離３１ｍｍＨｇに充分匹敵する値である。さらに、脂質のコーティングを除いたこと以外は、実施例２と同じ要領でヘモグロビン結合ナノ結晶粒子を製造した。この脂質なしのヘモグロビン結合ナノ結晶粒子の酸素解離は、１２ｍｍＨｇであった。実施例１と２で製造した赤血球代用剤の電気泳動移動度は、ドップラー電気泳動光散乱分析法（Doppler electrophoretic light scatter analysis）（ＤＥＬＳＡ４４０、ＣｏｕｌｔｅｒＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，Ｉｎｃ．社、米国フロリダ州ハイアリーア）で測定した。その電気泳動移動度は、ｐＨ７．４のＰＲＧＢ緩衡液において２５℃で−１．７μｍｃｍ／Ｖｓであった。実施例１と２で製造した赤血球代用剤の粒径分布は、ＰＲＢ緩衡液において２２．５℃で９０°の角度で行う光子相関分光法（photon correlation spectrosc opy）（Ｎ４ＭＤ、Ｃｏｕｌｔｅｒ）および透過顕微鏡法（ＴＥＭ、Ｚｅｉｓｓ１９０）によって測定した。本発明の赤血球代用剤は、光子相関法で、１８７±３７ｎｍと測定された。電子顕微鏡法の場合、粒子を含有する溶液の１０マイクロリットルの一滴を、その液滴の頂部に浮遊させたカーボン安定化ＦＯＲＭＶＡＲＧＲＩＤ（ＴｅｄＰｅｌｌａ，Ｉｎｃ．社、米国カリフォルニア州レディング）を含むパラフィン表面上に置いた。ＴＥＭＧＲＩＤの高い表面電荷のため、赤血球代用剤がグリッドに吸収され、注意深く吸い取ることによって過剰溶液を除去できる。類似の方法を用いて粒子を２％のリンタングステン酸で染色した。その染色されたグリッドを乾燥し、その赤血球代用剤は粒径が５０〜１００ナノメートルの範囲内にあることが確認された。この赤血球代用剤の配座の完全性を、免疫金抗体アフィニティ強度（immunogo ld antibody affinity intensity）で確認した。上記タンパク質結合粒子を、１ナノメートルＴＥＭ銅グリッド上に堆積させた後、ポリクローナルウサギ抗ヒトヘモグロビン抗体（Ｄａｋｏ）および二次ヤギ抗ウサギ３０ナノメートル金標識抗体（ＺｙｍｅｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、米国カルフォルニア州サンフランシスコ）とともに２７℃で１時間インキユベートした。この金標識抗体は、この赤血球代用剤中に存在するヘモグロビンに貪欲に取り付くことが観察された。実施例３下記の実施例では、ブルッシャイトのコア、セロビオースの酸素担体アンカーコーティングおよびヘモグロビン酸素担体を有する赤血球代用剤を調製した。脂質層は、Ｌ−α−ホスファチジルコリン、Ｌ−α−ホスファチジルセリンおよびコレステロールから作った。外面コーティングは、セロビオースであった。この赤血球代用剤を調製するのに用いた手順は、次のとおりであった。リン酸カルシウム二水和物（ブルッシャイト）ナノ結晶粒子の製造試薬類０．７５ＭのＣａＣｌ₂：５５．１３ｇのＣａＣｌ₂・２Ｈ₂ＯをＨＰＬＣグレードの水に溶解し、メスフラスコで０．５００Ｌにする。０．２μｍ滅菌濾過装置で滅菌濾過し、次いで滅菌５００ｍｌ培地フラスコに入れる。室温で貯蔵する。０．２５ＭのＮａ₂ＨＰＯ₄：１７．７５ｇの無水Ｎａ₂ＨＰＯ₄をＨＰＬＣグレードの水に溶解し、メスフラスコで０．５００Ｌにする。０．２μｍ滅菌濾過装置で滅菌濾過し、次いで滅菌５００ｍｌ培地フラスコに入れる。やはり、室温で貯蔵する。ブルッシャイトの合成合成を行う約３０分前に、カップホーンを冷却することによって超音波処理器を準備する。これは、水冷却器上の低温サーモスタットを４℃に調節し、ペリスタ循環器を設定“４”に回すことによって達成される。一旦４℃のマークに到達したならば、０．７５ＭのＣａＣｌ₂を５０．０ｍｌと０．２５ＭのＮａ₂Ｈ₂ＰＯ₄を５０．０ｍｌとを準備して、それぞれ５０ｍｌの注射器に入れる。これらの注射器を三方ルアーロックコネクタ（3-way luer loc k connector）に直径方向の反対位置ポートに取付けて接続し、残りのルアーポートは生成物を放出するため空けておく。混合装置が設定されたならば、滅菌１２０ｍｌ超音波処理フラスコをカップホーンに入れ、超音波処理器を徐々に１００％までパワーアップする。空けておいたルアーポートが超音波処理フラスコの真上にくるように、混合装置を配置する。各注射器がほぼ同時に空になるように、注射器の内容物をできるだけ迅速かつ均一にフラスコ中に放出する。次に、超音波処理フラスコ上にポリプロピレンライナーを迅速に固定し、さらに１５分間超音波処理を行う。ブルッシャイトの洗浄調製物（prep）を２本の５０ｍｌブルートップポリプロピレン管に概略分割し、次いで２０００ｒｐｍで１０分間（室温）かけてペレット化する。各ペレットを滅菌ＨＰＬＣグレード水とともにボルテックス（渦巻き洗い）して５０ｍｌ（または管の容量）に再構成し、次いで２０００ｒｐｍで１０分間かけてペレット化する。この洗浄をさらに３回繰返し、最後のペレットを５０．０ｍｌに再構成する。その分散液を、ポリプロピレンライナー付きの滅菌１２０ｍｌ超音波処理フラスコに移す。そのフラスコを、１℃に予め冷却した超音波処理器のカップホーン中に配置する。１００％パワーで６０分間、超音波処理を行う。ブルッシャイトナノ粒子のセロビオースによるコーティングインキュベーション／凍結乾燥１．上記のようにして調製したブルッシャイト（水分散液）を、２５℃で３０分間全パワー（１７５ワット）で超音波処理する。２．次に、小容積に対して卓上微小遠心分離器（３０秒、全回転速度１４，０００ｒｐｍ）を用いるかまたは大容積に対して床上形遠心分離器（モデル２１Ｋ、５０ｍｌ遠心分離管中、最高の２分間８０００ＲＰＭ）を用いて、懸濁媒体をできるだけ迅速に水（ストック）から５００ｍＭセロビオース溶液に交換する。ペレット化したカーボンを５００ｍＭセロビオースで懸濁させ、超音波処理を行って分散を促進し（２５℃で約５分間全パワー（１７５ワット）で）、次いで最後にその混合物を冷室（４℃）内で一夜、揺動プレート上に置く。３．翌日、混合物を適当な大きさの容器に分取して一夜凍結乾燥する。４．キャップをかぶせた管のキャップのまわりにパラフィン層をつけ、その管を洗浄ステップを行うまで冷凍器内に置く。５．用途によって、適切な緩衡液で、ブルッシャイト／セロビオースを再構成する。適切な緩衡液は、低イオン強度のリン酸緩衡液（ＰＲＢ）、水または重炭酸塩緩衡液である。緩衡液中での再構成は、渦巻き洗浄および５分間超音波処理（１７５ワット／２５℃）によって達成される。６．遠心分離（小容積に対して卓上微小遠心分離器［３０秒間、全回転速度１４，０００ＲＰＭ］を用いるかまたは大容積に対して床上形遠心分離器［モデル２１Ｋ、５０ｍｌ遠心分離管中、最高２分間８，０００ＲＰＭ］を用いて）および緩衡液中への再懸濁を繰り返すことによって洗浄する。７．上記懸濁液１ｍｌを取り出し、予め秤量した１．７ｍ１のエッペンドルフ管内における凍結乾燥器内で脱水し、塊にすることによって、濃度測定を行う。８．濃度を１ｍｇ／ｍｌにするのに必要な最終容積を計算する。ブルッシャイト／セロビオース製剤の濃度を１ｍｇ／ｍｌにするのに充分な緩衡液を添加する。血球代用剤の最終的調製セロビオースでコートたブルッシャイトを、次いで実施例１に記載したようにして、ヘモグロビンでコートした。脂質のコーティングとセロビオースの外面コーティングは、以下のようにして行った。試薬は、特にことわらない限り、全てＳｉｇｍａＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社（米国ミズーリ州セントルイス）から入手した。１００ｍｌのブルッシャイトヘモグロビン担体を合成するため、６．６０ｇの卵黄Ｌ−α−ホスファチジルコリン、０．６６０ｇのウシ脳Ｌ−α−ホスファチジルセリン、および３．１０ｇのコレステロールを１３２ｍｌのクロロホルム中で混合した。Ｓａｖａｎｔ（米国ニューヨーク州ウェストベリー）スピードバック（ｓｐｅｅｄｖａｃ）を用い、５０ｍｌのＣｏｒｅｘ管中、低温下、少なくとも１８時間凍結乾燥を行って、クロロホルムを除去した。凍結乾燥を行った後直ちに、セロビオースの５００ｍＭ溶液１７ｍｌを上記リン脂質に添加し、次に滅菌水で１００ｍｌに調整した。得られた混合物を、ＡＥＳ２０００Ｂｒａｎｓｏｎ（米国コネティカット州ウェストベリー）ソニファイヤ（ｓｏｎｉｆｉｅｒ）を用い、約４００ワットで、４．０℃で１時間超音波処理を行い、そして滅菌５００ｍｌ水ジャケット付き反応フラスコに入れた。その内容物を、類似の条件下で一夜凍結乾燥した。上記のようにして製造した赤血球代用剤は、実施例１と２の場合と同じ要領で試験した結果、赤血球代用剤として有効であることが見出された。実施例４酸素担体アンカーコーティングとしてピリドキサル−５−リン酸（Ｐ−５−Ｐ）をセロビオースの代わりに用いることを除いて、実施例３と同じ要領で赤血球代用剤を作る。Ｐ−５−Ｐのコーティングは、以下のようにして行う。全内容物を５０ｍｌのコニカル管に移せるように、実施例３で調製された分散液１００ｍｌをペレット化する。コニカル管の内容物の容積を４０．０ｍｌに調節する。内容物を１０ｍｌずつ４個の１５ｍｌコニカル管に移す。１０００ｍｇのピリドキサル−５−リン酸を８００μｌの１０ＮＮａＯＨで溶解し、水で１０ｍｌに調整する。この透明で黄色の溶液を０．２μｍのアクロディスク（acro disc）で滅菌濾過し、そして２．５ｍｌずつを、予め調製した４本のブルッシャイト入り管の各々に添加する。各管を数秒間、渦巻き運動させて（ボルテックスして）確実に内容物を充分分散させる。低い乾燥速度設定で一夜（約１６時間）凍結乾燥する。翌朝、５０ｍｌずつの滅菌ＨＰＬＣグレード水中にさらに５回再懸濁させる。もう一回ペレット化し、そのペレットを４本の１５ｍｌコニカル管に移し、そして最終製剤の容積を水で調節して４０．０ｍｌにする。別の選択として、外面コーティングとしてＰ−５−Ｐをセロビオースの代わりに用いてもよい。実施例５酸素担体アンカーコーティングとして、クエン酸塩をセロビオースの代わりに用いること以外、実施例３と同じ要領で赤血球代用剤を作る。クエン酸塩のコーティングは、以下のようにして行う。ブルッシャイト／クエン酸塩全内容物を５０ｍｌコニカル管に移せるように、実施例３で調製した分散液１００ｍｌをペレット化する。該コニカル管内容物の容積を４０．０ｍｌに調節する。その内容物を１０ｍｌずつ４本の１５ｍｌコニカル管に移す。これら１５ｍｌコニカル管の各々に１０ｍＭクエン酸塩溶液１０ｍｌを添加し、そして室温で３０分間傾斜回転振盪を行なう（ｎｕｔａｔｅ）。低い乾燥速度設定で一夜（約１６時間）凍結乾燥する。翌朝、５０ｍｌずつの滅菌ＨＰＬＣグレード水にさらに５回再懸濁させる。もう一回ペレット化し、そのペレットを４本の１５ｍｌコニカル管に移し、そして最終製剤の容積を水で調節して４０．０ｍｌにする。上記実施例は、本発明による赤血球代用剤が効果的なな酸素輸送粒子であり、生体外および生体内の両方で赤血球の代用剤として使用できることを実証している。本発明の模範的実施態様を説明してきたが、開示されているのは模範的な例示に過ぎず、各種の他の代替案、適合変形および改変を本発明の範囲内で実施できるということを、当該技術分野の当業者であれば理解するであろう。したがって、本発明は、本明細書に示されている特定の実施態様に限定されず、後記の特許請求の範囲にのみ限定されるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ゲルマンアンドリューイー. アメリカ合衆国カリフォルニア州 90036 ロサンジェルスノーススタンレーアベニュー 418 (72)発明者ナティスジンエイチ．ジェイムズアメリカ合衆国カリフォルニア州 90024 ロサンジェルスケルトンアベニュー 1350 ナンバー303

Claims

【特許請求の範囲】１．表面を有するナノ結晶コア粒子と、前記ナノ結晶コア粒子の表面に位置づけられた酸素担体アンカーコーティングと、前記酸素担体アンカーコーティングに結合させた酸素担体と、前記酸素担体を囲む脂質層と、外面層と、を含んでなる赤血球代用剤。２．請求項１に記載の赤血球代用剤であって、前記ナノ結晶粒子がセラミック、金属またはポリマーで構成されていることを特徴とするもの。３．請求項１に記載の赤血球代用剤であって、前記酸素担体アンカーコーティングが、前記ナノ結晶コア粒子の表面を実質的に被覆するガラス状被膜で構成され、前記ガラス状被膜が、前記酸素担体を変性することなく、前記酸素担体を前記コア粒子にアンカーするのに充分なしきい表面エネルギーを持っていることを特徴とするもの。４．請求項３に記載の赤血球代用剤であって、前記ガラス状被膜が、セロビオース、トレハロース、イソマルトース、ニストースソルビトール、ラクチトール、マルトースおよびスクロースからなる塩基性糖類の群から選択された糖を含んでなることを特徴とするもの。５．請求項３に記載の赤血球代用剤であって、前記ガラス状被膜が、ピリドキサル−５−リン酸、２，３−ホスホグリセレートおよびクエン酸ナトリウムからなる群から選択されるアロステリックエフェクタを含んでなることを特徴とするもの。６．請求項３に記載の赤血球代用剤であって、前記ガラス状被膜が、塩基性糖とアロステリックモディファイアを含んでなることを特徴とするもの。７．請求項１に記載の赤血球代用剤であって、前記酸素担体がヘモグロビンを含んでなることを特徴とするもの。８．請求項７に記載の赤血球代用剤であって、前記酸素担体がヒトヘモグロビンを含んでなることを特徴とするもの。９．請求項１に記載の赤血球代用剤であって、脂質の前記外側層がリン脂質を含んでなることを特徴とするもの。１０．請求項９に記載の赤血球代用剤であって、前記リン脂質が、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびホスファチジルセリンからなる群から選択されることを特徴とするもの。１１．請求項１に記載の赤血球代用剤であって、前記外面層が、糖またはアロステリックエフェクターを含んでなることを特徴とするもの。１２．請求項１１に記載の赤血球代用剤であって、前記外面層の糖が、セロビオース、トレハロース、イソマルトース、ニストースソルビトール、ラクチトール、マルトースおよびスクロースからなる群から選択されることを特徴とするもの。１３．請求項１１に記載の赤血球代用剤であって、前記外面層のアロステリックエフェクターが、ピリドキサル−５−リン酸、２，３−ホスホグリセレートおよびクエン酸ナトリウムからなる群から選択されることを特徴とするもの。１４．Ａ．表面を有するナノ結晶コア粒子と、前記ナノ結晶コア粒子の表面に位置付けられた酸素担体アンカーコーティングと、前記酸素担体アンカーコーティングに結合させた酸素担体と、前記酸素担体を囲む脂質の層と、外面層と、を含んでなる赤血球代用剤、ならびにＢ．前記赤血球代用剤のための生理的に許容される担体と、を含んでなる組成物。１５．細胞に酸素を送達する方法であって、表面を有するナノ結晶コア粒子と、前記ナノ結晶コア粒子の表面に位置付けられた酸素担体アンカーコーティングと、前記酸素担体アンカーコーティングに結合させた酸素担体と、前記酸素担体を囲む脂質の層と、外面層と、を含んでなる赤血球代用剤で前記細胞を処理するステップを含んでなる方法。１６．請求項１５に記載の細胞に酸素を送達する方法であって、前記ナノ結晶粒子が、セラミック、金属またはポリマーで構成されていることを特徴とするもの。１７．請求項１５に記載の細胞に酸素を送達する方法であって、前記酸素担体アンカーコーティングが、前記ナノ結晶コア粒子の表面を実質的に被覆するガラス状被膜で構成され、前記ガラス状被膜が、前記酸素担体を変性することなく、前記酸素担体を前記コア粒子にアンカーするのに充分なしきい表面エネルギをもっていることを特徴とする方法。１８．請求項１７に記載の細胞に酸素を送達する方法であって、前記ガラス状被膜が、セロビオース、トレハロース、イソマルトース、ニストースソルビトール、ラクチトール、マルトースおよびスクロースからなる塩基性糖類の群から選択される糖を含んでなることを特徴とする方法。１９．請求項１７に記載の細胞に酸素を送達する方法であって、前記ガラス状被膜が、ピリドキサル−５−リン酸、２，３−ホスホグリセレートおよびクエン酸ナトリウムからなる群から選択されたアロステリックエフェクターを含んでなることを特徴とする方法。２０．請求項１７に記載の細胞に酸素を送達する方法であって、前記ガラス状被膜が、塩基性糖とアロステリックモディファイヤを含んでなることを特徴とする方法。２１．請求項１５に記載の細胞に酸素を送達する方法であって、前記酸素担体が、ヒトヘモグロビンを含んでなることを特徴とする方法。２２．請求項１５に記載の細胞に酸素を送達する方法であって、脂質の前記外側層が、リン脂質を含んでなることを特徴とする方法。２３．請求項１５に記載の細胞に酸素を送達する方法、脂質の前記外側層が、リン脂質を含んでいる。２４．請求項２３に記載の細胞に酸素を送達する方法であって、前記リン脂質が、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびホスファチジルセリンからなる群から選択されることを特徴とする方法。２５．請求項１５に記載の細胞に酸素を送達する方法であって、前記細胞が生体内に位置していることを特徴とする方法。２６．請求項１５に記載の細胞に酸素を送達する方法であって、前記細胞が生体外に位置していることを特徴とする方法。２７．請求項１５に記載の細胞に酸素を送達する方法であって、前記外面層が、糖またはアロステリックエフェクターを含んでなることを特徴とする方法。２８．請求項１５に記載の細胞に酸素を送達する方法であって、前記外面層の糖が、セロビオース、トレハロース、イソマルトース、ニストースソルビトール、ラクチトール、マルトースおよびスクロースからなる群から選択されることを特徴とする方法。２９．請求項１５に記載の細胞に酸素を送達する方法であって、前記外面層のアロステリックエフェクターが、ピリドキサル−５−リン酸、２，３−ホスホグリセレートおよびクエン酸ナトリウムからなる群から選択されることを特徴とする方法。