KR20240063706A - 연어 핑크 거미 펩타이드 함유 피부 개선용 외용제 조성물 - Google Patents
연어 핑크 거미 펩타이드 함유 피부 개선용 외용제 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 연어 핑크 거미 펩타이드 함유 피부 개선용 외용제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 연어 핑크 거미 펩타이드 함유 피부 개선용 조성물은 항산화, 피부 장벽 강화, 항노화, 피부 주름 개선 또는 예방, 피부 재생 또는 창상 치유 등의 피부 개선 효과를 가지는 바, 연어 핑크 거미 펩타이드를 함유하는 외용제 조성물은 화장료, 의약 등의 피부 개선용 소재로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 연어 핑크 거미 펩타이드 함유 피부 개선용 조성물은 항산화, 피부 장벽 강화, 항노화, 피부 주름 개선 또는 예방, 피부 재생 또는 창상 치유 등의 피부 개선 효과를 가지는 바, 연어 핑크 거미 펩타이드를 함유하는 외용제 조성물은 화장료, 의약 등의 피부 개선용 소재로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 연어 핑크 거미(Salmon Pink Spider) 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항산화, 피부 장벽 강화, 창상치유, 피부 재생, 주름 개선과 같은 피부 노화 방지를 위한 외용제 조성물에 관한 것이다.
피부는 무게를 기준으로 몸에서 가장 큰 기관이며 각질화된 바깥쪽 표피와 혈관이 풍부하게 발단된 내부 결합조직인 진피, 그리고 가장 안쪽의 피하조직의 3 층으로 되어 있으며, 피부와 연관된 여러 부속기구 (털, 손발톱, 감각수용기, 분비샘)와 함께 피부계 (integumentary system)를 이룬다. 피부는 몸 안의 여러 기관의 주요한 기능 수행을 위해 몸의 안과 밖의 경계를 이룬다.
피부는 항상성 (homeostasis) 유지에 필수적이며 보호기능 외에도 체온조절, 수분손실 억제, 감각수용기 함유, 다양한 생화학물질 합성 및 소량의 노폐물 배출 등 다양한 기능을 수행하는 중요한 기관이다.
그러나 다른 기관과 비교하여 피부는 외부로부터의 자극이나 여러 병원체와 직접 접촉하는 기회가 많으며, 특히 피부에 자외선이 흡수될 경우 광화학 반응을 일으킴으로써 피부 병변을 야기하게 된다. 뿐만 아니라 정신적인 스트레스, 비만, 술, 담배 등 현대사회에서 일반적으로 발생하는 요소들에 의한 피부질환 환자가 급격히 늘고 있는 추세이다.
이에 따라 피부 손상을 억제하고 피부세포를 보호하기 위한 다양한 피부 보호제에 대한 개발이 활발히 이루어지고 있으나, 개발된 피부 보호제는 주로 합성 화합물을 유효성분으로 하고 있어, 피부에 손상을 유발시키거나 가려움 및 반점 등 부작용이 발생한다는 단점이 있다. 따라서, 피부에 부작용이 없으면서도 피부 손상 억제 및 피부 강화 기능이 우수한 새로운 천연물 소재의 개발이 필요한 실정이다.
한편, Lasiandra 속(genus)의 거미들은 Theraphosidae 과(family)에 속하는데 이들은 보통 tarantulas, bird-eating spiders, baboon spiders, gorse spiders, whistling spiders, 등으로 불린다. 이들은 큰 크기, 큰 협각(chelicerae), 털이 나 있는 몸과 같이 무서운 외형으로 인해 보통 위험한 거미로 여겨진다. 그럼에도 불구하고 애완동물로도 많이 키우는 거미이기도 하다. 그렇지만 Lasiodora 속의 거미들은 라틴아메리카에서만 발견되며 대부분의 종이 브라질의 고유종이고, 특히 Salmon pink spider (Lasiodora parahybana)는 주로 브라질 북동쪽에서 유래된 것으로 알려져 있다.
또한, 큰 크기와 무서운 외모와는 다르게 Lasiodora 속 거미의 독은 사람에게는 크게 해롭지는 않은 것으로 알려져 있다. 타란툴라 거미들은 거미줄을 사용하지 않고 먹이를 사냥해야 한다. 그러므로 독이 들어가면서 효과적으로 중추 및 말초 신경계에 작용해야만 한다. 즉, 독이 다양한 수용체에 작용할 수 있어야 한다. 이들의 독에는 펩타이드 (peptides), 단백질 (proteins), 효소들 (enzymes), 뉴클레오타이드 (nucleotides), 신경전달물질 (neurotransmitters)와 같은 다양한 물질이 포함되어 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 피부 개선에 유용한 천연 유래 소재를 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 연어 핑크 거미 유래 펩타이드인 Spider Ex를 얻고, 피부 개선 효과를 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예시적 목적은 연어 핑크 거미 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 외용제 조성물을 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 연어 핑크 거미 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, "연어 핑크 거미 (Salmon Pink Spider) 유래 펩타이드"는 연어 핑크 거미 (Lasiodora parahybana)로부터 얻어진 펩타이드로, 연어 핑크 거미의 독 물질인 라시오톡신 1(Lasiotoxin 1) 및 라시오톡신 2(Lasiotoxin 2)의 서열 중 전부 또는 일부와 동일성 있는 서열, 예를들어 서열번호 1의 아미노산 서열(KKCSGGWR)을 포함한다.
Lasiotoxin 1과 Lasiotoxin 2는 Lasiodora parahybana에서 분리된 독으로 49개의 아미노산으로 구성된 펩타이드이다. 두 펩타이드는 4개의 이황화결합(disulfide bond)로 교차결합 (cross-linked)되어 있는데, 두 펩타이드의 아미노산서열은 6, 25번째 아미노산을 제외하고 모두 동일하다. 이들은 역상크로마토그래피 (reverse-phase chromatography)를 통해 분리, 확인되었으며 정확한 타겟에 대해서는 알려져 있지 않다
본 발명에 있어서, "피부 개선"이란, 본 발명의 연어 핑크 거미 유래 펩타이드을 사용하여 피부가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 피부 개선은 일 예시로, 자외선 조사에 의한 피부 손상 개선 또는 예방, 피부 장벽 강화, 항노화, 항산화, 피부 주름 개선 또는 예방, 피부 재생 또는 창상 치유 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "피부 장벽 강화"는 각질세포로 이루어진 피부 장벽에서 각질형성세포의 분화를 촉진하여 표피층의 두께를 두껍게 개선시키는 것을 말한다.
본 발명의 용어 "피부 노화"는 내인성/외인성 노화를 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 용어 "유효성분으로 포함하는"의 의미는, 피부 외용제 조성물로써 상기와 같은 다양한 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 포함하는 것을 말한다.
구체적으로, 본 발명의 실험예에서는 연어 핑크 거미 유래 펩타이드는 피부 독성이 없으면서도, SOD1, CAT, NRF1 발현을 감소시키고, H2O2 산화독성으로부터 항산화 효과가 있으며, 프로콜라겐 생합성량 증가에 의한 항주름 효과가 있으며, FLG 발현 증가를 통한 피부 장벽 강화, 창상치유, 피부 개선 등의 항노화 효과를 확인하였다.
이러한 실험 결과를 바탕으로 본 발명의 외용제 조성물은 항산화, 피부장벽 강화, 주름 개선, 항노화, 피부 재생, 창상 치유 등의 피부 개선 용도로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 연어 핑크 거미 유래 펩타이드는 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성 물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발 명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위 (얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물 또는 조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질 또는 조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림 (수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액 (무수 및 수계), 무수 생성물 (오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.
또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형 (리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말 (foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산 화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제 (foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충 전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 피부 재생, 창상 치유, 주름 개선, 항노화, 피부 장벽 강화, 항산화 등의 기능성 화장품의 형태를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 피부 상태 개선을 위한 약제학적 조성물로써 기능할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따른 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 '대한민국약전'을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비자연적 담체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 약학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 투여량 및 횟수는 어떠한 면에서든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 인간인 경우가 바람직할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으며, 예를 들어 경구, 정맥, 근육 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 피부 외용제 조성물은, 의약외품 조성물일 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는한 특히 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 연어 핑크 거미 유래 펩타이드는 주름 개선, 항노화, 피부 장벽 강화, 항산화, 피부재생, 창상 치유등의 피부 개선 효과를 가지는 바, 연어 핑크 거미 유래 펩타이드을 유효성분으로 포함하는 외용제 조성물은 피부 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 연어 핑크 거미 유래 펩타이드의 제조
실시예 1-1: 연어 핑크 거미 유래 펩타이드의 합성
펩타이드는 펩타이드 자동 합성기 (Milligen 9050, Millipore, 미국)를 이용하여 고체상 펩타이드 합성법 (Solid-Phase Peptide Synthesis; SPPS)으로 합성하였고, 펩타이드 서열상 C-말단에서 N-말단의 순으로 합성을 진행하였다. 구체적으로, 본 발명의 연어 핑크 거미 유래 펩타이드인 KKCSGGWR(서열번호 1)은 Fmoc-Arginine이 결합된 레진에 Tryptophan, Glycine, Glycine, Serine, Cysteine, Lysine, Lysine을 차례로 연결하여 합성하였다. 합성된 펩타이드들은 각 아미노산에 결합되어 있는 보호기를 제거한 후 정제용 액체크로마토그래피(Prep. HPLC, HANBON SCI. & TECH., 중국)를 이용하여 정제하였고, 이를 동결건조 하여 파우더화 하였다.
실시예 1-2: 연어 핑크 거미 유래 펩타이드 함유 조성물 제조
실시예 1-1에서 파우더화된 펩타이드를 용매인 정제수에 녹여서 모든 실험을 수행하였다.
실시예 2: 연어 핑크 거미 유래 펩타이드 함유 조성물의 피부개선 효능 확인
2-1: 피부세포 무자극 효과 확인 시험
먼저 실시예 1의 본 발명에 따른 조성물이 피부세포에서 처리 농도 별 독성에 의한 자극이 있는지 알아보기 위해, 세포생존률을 측정하는 MTT assay를 진행하였다.
이를 위하여 HaCaT 세포(keratinocyte, 각질형성세포), Detroit 세포(fibroblast, 섬유아세포)를 각각 10 % FBS(Fetal Bovine Serum), 1 % Antibiotic-Antimycotic이 함유된 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle's Medium)과 함께 96-well plate에 분주하고, 5 % CO2, 37 ℃의 조건인 항온기에서 24시간 배양하였다. 이 후 정제수를 첨가한 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이어 5 mg/mL MTT(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 용액을 각 well에 4 μL씩 첨가하고, 4시간 동안 배양하여 반응시켰다. 배양액을 제거한 다음 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 용액 100 μL씩 첨가하여 세포를 용해시킨 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 조성물을 HaCaT 세포 내에서 1 ~ 100 ppm 농도별 처리 시 대조군 대비 세포생존률이 모두 90 % 이상으로 피부세포 내 독성을 일으키지 않았다.
또한, 본 발명의 조성물을 Detroit 세포 내에서 0.5 ~ 5 ppm 농도별 처리 시 대조군 대비 세포생존률이 모두 90 % 이상으로 피부세포 내 독성을 일으키지 않았다.
이에 "연어 핑크 거미 펩타이드(Salmon Pink Spider peptide)" 이 피부세포에 자극의 유발 가능성이 낮고 무해하다는 효과를 확인하였다.
2-2: 항산화 효과 확인 시험
(1) SOD1, CAT, NRF1 발현 감소에 따른 항산화 효과 확인 시험
본 발명에 따른 조성물의 보습 및 피부장벽 개선 효능을 살펴보기 위하여, 호기성 물질대사에서 생성되는 독성물질인 H2O2나 활성산소종(ROS)의 분해 작용에 관여하는 것으로 알려져 있는 SOD1(Superoxide Dismutase 1), CAT(Catalase), NRF1(Nuclear Respiratory Factor 1)의 발현양 변화를 알아보았다.
HaCaT 세포를 96-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이때 양성대조군으로 N-acetyl-L-cysteine(NAC) 2 mM을 사용하였다. SOD1, CAT, NRF1의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.
RNA isolation과 cDNA 합성을 위해 SuperPrepTM cell lysis & RT Kit for qPCR(TOYOBO, Cat.SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture 를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 앞서 추출한 lysate 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50℃ 5분, 95℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, ThunderbirdTM SYBR qPCR Mix(TOYOBO,Cat.QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect primer assays (GAPDH; Cat. QT01192646, SOD1; Cat. QT01008651, CAT; Cat. QT00079674, NRF1; Cat. QT01192688)이며 시료의 SOD1, CAT, NRF1 mRNA 발현량은 GADPH로 정량하였다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95℃ 1분 반응 후, 1 사이클 당 94℃ 15초, 60℃ 30초, 72℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.
그 결과, 본 발명의 조성물을 농도별 처리 시 대조군 대비 SOD1, CAT, NRF1 mRNA 발현률이 증가함으로써 "Salmon Pink Spider peptide"이 항산화 효과가 있을 것으로 확인하였다.
(2) H
2
O
2
산화 독성으로부터 항산화 효과 확인 시험
본 발명에 따른 조성물의 H2O2 산화 독성으로부터 항산화효과를 살펴보기 위하여, H2O2에 의한 세포생존률의 변화를 알아보았다.
이를 위하여 HaCaT 세포를 48-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 2 mM H2O2를 조사하고, 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하여 12~16시간 동안 추가 배양하였다. 이때 양성대조군으로 N-acetyl-L-cysteine(NAC) 2 mM을 사용하였다. 이후 H2O2 산화 독성 유도에 의한 피부세포의 손상을 보호하는지 확인하고자 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 조성물을 농도별 처리한 세포에서 대조군(+H2O2) 대비 H2O2 처리에 의한 세포 사멸이 저해되어 "Salmon Pink Spider peptide"이 H2O2 산화 독성으로부터 항산화 효과가 있을 것으로 확인하였다.
2-3: PIP 생성 증가에 따른 주름 개선 효과 확인 시험
본 발명에 따른 조성물의 주름 개선 효과를 살펴보기 위하여, 콜라겐의 합성의 전구체인 프로콜라겐(Procollagen Type I C-Peptide, PIP)의 생합성양을 측정하였다.
이를 위하여 Detroit551 세포를 48-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 48시간 동안 추가 배양하였다. 이어 배양한 배지의 상층액을 희석한 일부 20 μL를 취해 PIP EIA Kit(Takara, Cat. MK101) 내 PIP 표준물질 20 μL와 함께 각각 antibody coated microtiter plate에 넣고 100 μL의 peroxidase 표식 antibody solution을 또한 각 well에 첨가하여, 37℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 배지를 제거하여 200 μL의 PBS로 4회 세척한 후, 각 well에 100 μL의 substrate solution을 첨가하고 차광한 상태에서 15분간 실온에서 반응시켰다. 이 후 100 μL stop solution (1 N H2SO4)을 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 본 발명의 조성물을 농도별 처리한 세포에서 대조군 대비 PIP 양이 증가하여 "Salmon Pink Spider peptide" 이 주름 개선 효과가 있을 것으로 확인하였다.
2-4: FLG 발현 증가에 따른 피부장벽 개선 효과 확인 시험
본 발명에 따른 조성물의 보습 및 피부장벽 개선 효능을 살펴보기 위하여, 자연보습인자로 알려진 FLG(Filaggrin)의 발현양 변화를 알아보았다.
HaCaT 세포를 96-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. FLG의 유전자 수준에서 확인하기 위해 Real-time PCR 법을 수행하였으며, 그 시험 순서는 다음과 같다.
RNA isolation과 cDNA합성을 위해 SuperPrepTM cell lysis & RT Kit for qPCR (TOYOBO, Cat. SCQ-101)을 사용하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한 번 세척하고, 50 μL cell lysis mixture 를 넣고 5분간 반응시킨 후, stop solution을 첨가하였다. RT reaction mixture 32 μL에 앞서 추출한 lysate 8 μL를 첨가하고 PCR을 이용하여 37 ℃ 15분, 50 ℃ 5분, 95 ℃ 5분 조건에서 cDNA를 합성하였다. 유전자의 발현을 비교분석하기 위하여 상기에서 합성한 cDNA를 template로 하고, ThunderbirdTM SYBR qPCR Mix (TOYOBO, Cat. QPS-201)를 이용하여 Real-time PCR 분석을 진행하였다. 실험에 사용한 primer는 Qiagen사의 QuantiTect primer assays (GAPDH; Cat. QT01192646, FLG; Cat. QT02448138)이며 시료의 FLG mRNA 발현량은 GADPH로 정량하였다. Real-time qPCR 조건은 먼저 95 ℃ 1분 반응 후, 1 사이클 당 94 ℃ 15초, 60 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 하여 총 40 사이클로 진행하였다.
그 결과, 본 발명의 조성물을 농도별 처리한 세포에서 대조군 대비 FLG의 mRNA 발현양이 증가하여 "Salmon Pink Spider peptide" 이 피부장벽 개선에 효과가 있을 것으로 확인하였다.
2-5: Wound healing를 이용한 창상치유, 항노화 효능 시험
본 발명에 따른 조성물의 피부세포 재생 효과를 살펴보기 위하여, Wound healing assay를 이용하여 시험물질에 의한 세포 proliferation 및 migration을 촉진하는지의 유무를 관찰하여 항노화 효능을 평가하고자 하였다.
이를 위하여 HaCaT 세포를 24-well plate에 분주한 후, insert와 함께 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이 후 대조군과 시험물질인 조성물을 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이 때 양성대조군으로 200 ng/ml EGF를 사용하였다. 물질처리 후 0시간대에 cell image를 현미경 사진으로 찍고 37 ℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 물질처리 후 18-20 시간동안 추가배양 후 배지를 제거하고 fixing solution(4% paraformaldehyde)으로 넣고 15분간 상온에서 incubation하고 PBS로 3번 washing하였다. Fixed cells은 4 ℃에서 한달 동안 보관이 가능하였다. Wound healing이 된 정도는 현미경으로 사진을 찍어 Image J라는 프로그램을 이용하여 계산하였다.
그 결과, 본 발명의 조성물은 농도별 처리한 세포에서 healing area가 증가함을 확인하여, 상기 조성물은 피부세포 재생 효과가 있을 것으로 확인하였다.
실시예 3: 피부 외용제 조성물 제조
본 발명에 따른 연어 핑크 거미 유래 펩타이드를 유효 성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물을 제조하기 위하여, 화장수, 에센스, 로션, 크림 및 젤을 각각 제조하였다.
제조예 3-1: 화장수
다음 처방에 따라 통상의 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.
제조예 3-2: 에센스
다음 처방에 따라 통상의 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.
제조예 3-3: 로션
다음 처방에 따라 통상의 로션 제조 방법에 따라 제조하였다.
제조예 3-4: 크림
다음 처방에 따라 통상의 크림 제조 방법에 따라 제조하였다.
제조예 3-5: 젤
다음 처방에 따라 통상의 젤 제조 방법에 따라 제조하였다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (7)
- 연어 핑크 거미 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 외용제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 연어 핑크 거미 유래 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 것인, 외용제 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 피부 개선은 피부 장벽 강화인, 외용제 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 피부 개선은 피부 항산화용인, 외용제 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 피부 개선은 항노화인, 외용제 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 피부 개선은 피부 재생 또는 창상 치유인, 외용제 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 피부 개선은 피부 주름 개선 또는 예방인, 외용제 조성물.
Priority Applications (1)
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| KR1020220145984A KR20240063706A (ko) | 2022-11-03 | 2022-11-03 | 연어 핑크 거미 펩타이드 함유 피부 개선용 외용제 조성물 |
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| KR1020220145984A KR20240063706A (ko) | 2022-11-03 | 2022-11-03 | 연어 핑크 거미 펩타이드 함유 피부 개선용 외용제 조성물 |
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| KR101686399B1 (ko) | 2015-11-26 | 2016-12-15 | 코스맥스 유에스에이, 코퍼레이션 | 항노화용 화장료 조성물 |
-
2022
- 2022-11-03 KR KR1020220145984A patent/KR20240063706A/ko unknown
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