KR20230172226A - 라벤더잎세포추출물을 유효성분으로 포함하는 외부 자극에 의한 피부 장벽개선 및 피부 진정(붉은기)에 효과적인 조성물 - Google Patents
라벤더잎세포추출물을 유효성분으로 포함하는 외부 자극에 의한 피부 장벽개선 및 피부 진정(붉은기)에 효과적인 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 라벤더잎세포추출물을 함유하는 피부 개선용 외용제 조성물; 및 상기 외용제 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 라벤더잎세포추출물은 자외선 조사에 의한 피부 손상 개선 또는 예방, 피부 장벽 강화, 항노화, 항산화, 피부 가려움 완화 또는 예방, 피부 스트레스 개선 또는 예방, 피부 주름 개선 또는 예방, 피부 재생 또는 창상 치유 등의 피부 개선 효과를 가지는 바, 라벤더잎세포추출물을 함유하는 외용제 조성물은 피부 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 라벤더잎세포추출물은 자외선 조사에 의한 피부 손상 개선 또는 예방, 피부 장벽 강화, 항노화, 항산화, 피부 가려움 완화 또는 예방, 피부 스트레스 개선 또는 예방, 피부 주름 개선 또는 예방, 피부 재생 또는 창상 치유 등의 피부 개선 효과를 가지는 바, 라벤더잎세포추출물을 함유하는 외용제 조성물은 피부 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 라벤더잎세포추출물을 유효성분으로 포함하는 외부 자극에 의한 피부 장벽개선 및 피부 진정(붉은기)에 효과적인 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 라벤더잎세포추출물을 유효성분으로 포함하는 자외선 보호, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 미백, 주름 개선과 같은 피부 노화 방지를 위한 외용제 조성물 및 제조방법에 관한 것이다.
피부는 무게를 기준으로 몸에서 가장 큰 기관이며 각질화된 바깥쪽 표피와 혈관이 풍부하게 발단된 내부 결합조직인 진피, 그리고 가장 안쪽의 피하조직의 3 층으로 되어 있으며, 피부와 연관된 여러 부속기구 (털, 손발톱, 감각수용기, 분비샘)와 함께 피부계 (integumentary system)를 이룬다. 피부는 몸 안의 여러 기관의 주요한 기능 수행을 위해 몸의 안과 밖의 경계를 이룬다.
피부는 항상성 (homeostasis) 유지에 필수적이며 보호기능 외에도 체온조절, 수분손실 억제, 감각수용기 함유, 다양한 생화학물질 합성 및 소량의 노폐물 배출 등 다양한 기능을 수행하는 중요한 기관이다.
그러나 다른 기관과 비교하여 피부는 외부로부터의 자극이나 여러 병원체와 직접 접촉하는 기회가 많으며, 특히 피부에 자외선이 흡수될 경우 광화학 반응을 일으킴으로써 피부 병변을 야기하게 된다. 뿐만 아니라 정신적인 스트레스, 비만, 술, 담배 등 현대사회에서 일반적으로 발생하는 요소들에 의한 피부질환 환자가 급격히 늘고 있는 추세이다.
이에 따라 피부 손상을 억제하고 피부세포를 보호하기 위한 다양한 피부 보호제에 대한 개발이 활발히 이루어지고 있으나, 개발된 피부 보호제는 주로 합성 화합물을 유효성분으로 하고 있어, 피부에 손상을 유발시키거나 가려움 및 반점 등 부작용이 발생한다는 단점이 있다. 따라서, 피부에 부작용이 없으면서도 피부 손상 억제 및 피부 강화 기능이 우수한 새로운 천연물 소재의 개발이 필요한 실정이다.
한편, 라벤더 (Lavandula Angustifolia)는 쌍떡잎식물 통화식물목 꿀풀과 라반둘라속에 속하는 다년생 초본으로 자주색 또는 보라색의 꽃이 피며 포기 전체에서 상쾌하고 가벼운 허브향이 난다. 라벤더의 전초를 추출 또는 수증기 증류하여 얻어지는 라벤더 오일은 피부의 세포를 활성화하고, 살충, 소독 작용을 하며, 피로회복 및 긴장완화, 불면증완화에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 피부 개선에 유용한 천연 유래 소재를 개발하기 위해 예의 연구 노력한 결과, 라벤더잎세포추출물을 얻고, 피부 개선 효과를 나타냄을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 전술한 문제 및 이와 연관된 다른 문제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 예시적 목적은 라벤더잎세포추출물을 포함하는 피부 개선용 외용제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 예시적 목적은 상기 피부개선용 외용제 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 명세서에 개시된 발명의 기술적 사상에 따라 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 문제점을 해결하기 위한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제는 아래의 기재로부터 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 라벤더잎세포 배양물 또는 그로부터 얻어진 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 외용제 조성물을 제공한다.
"식물세포 배양물"은 식물체에서 잘라낸 조직을 배지에서 배양하여 생기는 세포 덩어리를 포함한 배양 결과물을 말하며, 넓은 의미로 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 응력을 잃은 세포덩어리인 캘러스 또는 아그로박테리움 등의 감염에 의해서 생기는 식물종양조직의 배양물을 포함한다.
본 발명에 있어서, 라벤더의 식물세포 배양물은 라벤더 식물체의 일부, 예를 들어 잎, 줄기, 뿌리 등 또는 그 일부를 유도배지에서 배양을 통해 얻어지는 것을 말한다.
본 발명에 있어서, "라벤더잎세포"는 라벤더 잎으로부터 수득한 식물세포를 의미한다.
본 발명의 용어 "추출물"은 상기 라벤더의 식물세포배양물의 추출처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출물을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다. 일 예시로, 본 발명은 라벤더잎으로부터 유도된 식물세포인 라벤더잎세포 또는 이러한 식물세포배양물로부터 얻어지는 추출물인, 라벤더잎세포추출물을 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, "피부 개선"이란 본 발명의 라벤더 식물세포 배양물 또는 그로부터 얻어진 추출물을 사용하여 피부가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 상기 피부 개선은 일 예시로, 자외선 조사에 의한 피부 손상 개선 또는 예방, 피부 장벽 강화, 항노화, 항산화, 피부 가려움 완화 또는 예방, 피부 스트레스 개선 또는 예방, 피부 주름 개선 또는 예방, 피부 재생 또는 창상 치유, 피부 진정 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 "피부 장벽 강화"는 각질세포로 이루어진 피부 장벽에서 각질형성세포의 분화를 촉진하여 표피층의 두께를 두껍게 개선시키는 것을 말한다.
본 발명의 용어 "피부 노화"는 내인성/외인성 노화를 모두 포함하는 개념이다.
본 발명의 용어 "유효성분으로 포함하는"의 의미는, 피부 외용제 조성물로써 상기와 같은 다양한 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 포함하는 것을 말한다.
구체적으로, 본 발명의 실험예에서는 라벤더잎세포배양물 유래 추출물, 일예로 라벤더잎세포추출물 처리 시 자외선 조사에 의한 피부 세포 보호 효과를 나타내며, 보습 효과와 연관되어 있는 AQP-3(Aquaporin-3), 항노화와 관련있는 TERT(Telomerase Reverse Transcriptase), 피부 장벽 기능과 관련 있는 FLG(Filaggrin) 유전자의 발현이 증가함을 확인하였으며, 프로콜라겐 생합성량 증가에 의한 항주름 효과를 확인하였다. 또한 가려움증 억제 또는 완화 효과가 있음을 확인하였다. 또한 wound healing assay를 통한 창상치유, 피부재생, 항노화 효과를 확인하였고, 세포 에너지 증진 효과, 피부 장벽강화 및 피부 진정 효과를 확인하였다.
아울러, 항스트레스, 항산화와 관련된 HMOX1, NQO1, FTL, TXNRD1 유전자 발현 증가에 의해 우수한 항스트레스 효과, 항상성 유지, 항산화 등의 효과가 있음을 확인하였다. 또한, 항산화반응 간의 불균형으로 인해 세포 내 ROS(활성산소종)가 증가하게 되면, DNA나 단백질, 지질과 반응하여 피부를 손상시키고, 이는 노화를 일으키는 주요 원인이 될 수 있으며, 이러한 피부 노화를 예방하기 위하여 활성산소종을 저해시키는 것은 필수적이다.
HMOX-1(Heme oxygenase-1)은 heme catabolism의 속도결정단계에 작용하는 효소로서, 반응산물로 CO, biliverdin, free ion(Fe2+)을 생성하고, 반응산물 중에 CO는 염증관련 인자들을 억제하며, heme 또는 다른 금속이온을 가지고 있는 효소들과 반응하여 구조를 변형시킴으로써 활성의 변화를 일으키며 능동적 세포 사멸을 억제한다. 기능적으로는 항스트레스, 항산화, 스트레스에 주요한 세포 반응과 관여될 수 있다.
NQO1(NAD(P)H quinone oxidoreductase)은 세포 내 독성물질 저해 단백질로서, NAD+라 불리는 대사 물질을 많이 만들어내는데, NAD+는 써투인1이라는 노화와 대사조절에 관여하는 효소의 활성을 높여 항염증 반응을 통해 활성 산소종을 제거한다. 기능적으로 산화적 스트레스 감소 및 해독(detoxification)에 관여될 수 있다.
페리틴(Ferritin)은 세균에서 포유동물에 이르기까지 생물체에 널리 존재하는 철분결합 단백질이다. 페레틴은 세포 내 철분과 결합함으로써 철분 함량을 조절하는데, 특히, 페리독신과 사이토크롬 등의 철 단백질에 철분을 공급하고, 세포내 철분과의 결합을 통해 철분에 의한 산화반응을 저해함으로써 OH- 같은 강력한 반응성 산소종으로부터의 세포 손상을 방지할 수 있다.
또한, 산화/환원(redox) 시스템은 세포 내 산화적 스트레스와 관련된 다양한 기능을 조절하는 것으로 알려져 있고, 이러한 세포 내 레독스 상태는 레독스를 조절하는 분자들에 의해 유지된다. 티오레독신 시스템(thioredoxin system)은 거의 모든 생물체가 가지는 대표적인 레독스 시스템 중 하나로, Thioredoxin(Trx), NADPH 및 Thioredoxin reductase (TrxR)로 구성된다. 이중 Trx는 12 kDa의 작은 크기를 갖는 레독스 단백질이며, 주로 세포질과 핵 내에 존재하는 Trx1과 미토콘드리아에 존재하는 Trx2의 두가지 형태를 갖는다. Trx1은 UV, X-ray 방사 및 H2O2와 같은 다양한 스트레스에 의해 반응하여 발현되며 세포 내에서 Trx1은 주로 세포 성장, 세포 사멸, 전사요소 활성화 그리고 ROS(Reactive Oxygen Species, 활성산소종)를 제거함으로써 세포 보호 역할을 하는 등 넒은 범위의 세포 반응 기작에 관련된다.
이러한 실험 결과를 바탕으로 본 발명의 외용제 조성물은 주름 개선, 항노화, 피부 장벽 강화, 항산화, 피부 진정 등의 피부 개선 용도로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
본 발명에 있어서, 상기 라벤더의 식물세포 배양물, 그로부터 얻어지는 추출물, 일 예로 라벤더잎세포추출물은 조성물의 총 중량에 대하여 0.1 내지 10 중량%로 함유할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물에 있어서는, 화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체를 포함할 수 있다. 여기서, "화장품 제제에 있어서 수용가능한 담체"란 화장품 제제에 포함될 수 있는 이미 공지되어 사용되고 있는 화합물 또는 조성 물이거나 앞으로 개발될 화합물 또는 조성물로서 피부와의 접촉시 인체가 적응 가능한 이상의 독성, 불안정성 또는 자극성이 없는 것을 말한다. 상기 담체는 본 발명의 피부 외용제 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 조성물의 중량의 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있다. 그러나 상기 비율은 본 발 명의 피부 외용제 조성물이 제조되는 제형에 따라 또 그것의 구체적인 적용 부위 (얼굴, 목 등)나 그것의 바람직한 적용량 등에 따라 달라지는 것이기 때문에, 상기 비율은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
상기 담체로서는 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료 등이 예시될 수 있다. 상기 알코올, 오일, 계면활성제, 지방산, 실리콘 오일, 습윤제, 보습제, 점성 변형제, 유제, 안정제, 자외선산란제, 자외선흡수제, 발색제, 향료로 사용될 수 있는 화합물 또는 조성물 등은 이미 당업계에 공지되어 있기 때문에 당업자라면 적절한 해당 물질 또는 조성물을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 다양한 형태로 제조될 수 있는데, 예컨대, 화장수, 에센스, 젤, 에멀젼, 로션, 크림 (수중유적형, 유중수적형, 다중상), 용액, 현탁액 (무수 및 수계), 무수 생성물 (오일 및 글리콜계), 젤, 마스크, 팩, 분말, 또는 젤라틴 등의 피막이 있는 캅셀 (소프트 캅셀, 하드 캅셀) 제형 등의 형태로 제조될 수 있다.
또한, 적합한 화장품의 제형으로는, 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형 (리포좀), 비이온형의 소낭 분산 제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실스틱의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말 (foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.
또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산 화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제 (foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충 전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부 과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 그리고, 상기의 성분들은 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
본 발명에 있어서의 피부는 얼굴 뿐만 아니라, 두피, 전신도 포함되는 개념으로, 이러한 두피에 적용될 수 있는 피부 외용제 조성물로써, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 발모제 등이 있고, 전신에 적용될 수 있는 바디클렌져 등의 용도로써 다양한 형태로 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 주름 개선, 항노화, 피부 장벽 강화, 항산화 등의 기능성 화장품의 형태를 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 피부 외용제 조성물은 피부 상태 개선을 위한 약제학적 조성물로써 기능할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따른 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 약학적으로 허용되는 담체는 투여 경로나 제형에 따라 당업계에 주지되어 있으며, 구체적으로는 '대한민국약전'을 포함한 각국의 약전을 참조할 수 있다. 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 비자연적 담체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다. 약학적 조성물의 구체적인 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)] 등을 참조할 수 있다. 상기 문헌은 본 명세서의 일부로서 간주 된다.
본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 상기 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 건강상태, 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 투여량 및 횟수는 어떠한 면에서든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 개, 고양이, 소, 말, 돼지, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로를 통해 투여될 수 있으며, 인간인 경우가 바람직할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있으며, 예를 들어 경구, 정맥, 근육 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 피부 외용제 조성물은, 의약외품 조성물일 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는한 특히 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 라벤더 식물세포 배양 방법을 제공한다: 라벤더 식물체의 잎에 상처를 내고 암배양하여 식물세포를 유도하는 단계; 및 상기 유도된 식물세포를 계대 배양하여 식물 세포 배양물을 얻는 단계.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 상기 외용제 조성물의 제조방법을 제공한다: (a) 라벤더 식물의 잎 또는 줄기 조직을 분리하여 식물 세포로 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 얻은 식물세포배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 외용제 조성물을 제조하는 단계.
일 예시로, 본 발명은 (a) 라벤더 식물의 잎을 분리하여 라벤더잎세포를 배양하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 얻은 라벤더잎세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 외용제 조성물을 제조하는 단계.
본 발명의 상기 배양을 위하여 적절한 배지를 사용할 수 있으며, 본 발명의 기술분야에서 식물조직배양에 일반적으로 사용되고 있는 배지가 있다면 제한 없이 사용가능하다.
일 실시예로, 본 발명의 식물세포 유도 배양을 위해 MS 배지를 사용할 수 있다. 상기 MS 배지는 제아틴(Zeatin), 수크로스(Sucrose), 및/또는 아가(Agar)를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 추출은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 냉침 추출법, 용매 추출법, 수증기 증류법, 용출법, 압착법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등이 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.
일 실시예로, 본 발명의 추출 단계는 열수추출에 의한 것일 수 있다. 바람직하게는 90℃ 내지 120℃에서 3 내지 5 시간 열수추출하는 것일 수 있다.
본 발명의 상기 추출물은 적절한 용매를 이용하여 라벤더 식물세포배양물로부터 추출한 것이며, 예를 들어 조추출물, 극성용매 가용 추출물 또는 비극성 용매 가용 추출물을 모두 포함할 수 있다. 상기 추출물을 제조하기 위해 사용되는 추출 용매의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 공지된 임의의 용매를 사용할 수 있다. 상기 추출 용매의 비제한적인 예로는 물; 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 프로필알콜, 부틸알콜 등의 탄소수 1 내지 4 저급 알콜; 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 다가 알코올; 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 아세톤, 벤젠, 헥산, 디에틸에테르, 디클로로메탄 등의 탄화수소계 용매; 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 또한, 상기 용매를 사용하여 1회 이상 추출하여 용매 추출물을 제조할 수 있다.
본 발명의 상기 추출물은 부유하는 고체 입자를 제거하기 위해 여과, 예를 들어 mesh로 여과하여 고형분을 제거하고 사용하거나, 이를 동결건조, 열풍건조, 분무건조 등을 이용해 건조시켜 사용될 수 있다. 또한, 상기 추출물은 추가로 통상의 분획 공정을 거칠 수도 있으며, 통상의 정제 방법을 이용하여 정제될 수도 있다.
본 발명에 따른 라벤더의 식물세포배양물, 또는 그로부터 얻어진 추출물은 주름 개선, 항노화, 피부 장벽 강화, 항산화, 피부 진정 등의 피부 개선 효과를 가지는 바, 라벤더의 식물세포배양물, 또는 그로부터 얻어진 추출물을 유효성분으로 포함하는 외용제 조성물은 피부 개선용으로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 라벤더잎 식물세포 배양 결과를 나타낸 이미지이다.
도 2는 본 발명의 조성물의 피부 스트레스 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 조성물의 항노화, 피부 재생 등 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 조성물의 피부장벽개선 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 조성물의 피부 진정 효과를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 조성물의 피부 스트레스 억제 효과를 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 조성물의 항노화, 피부 재생 등 효과를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 조성물의 피부장벽개선 효과를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 조성물의 피부 진정 효과를 확인한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 본 발명에 따른 라벤더잎세포 유도
본 발명에 사용된 라벤더 씨앗은(입수처: 아람종료, ITALY산)을 70 % 에탄올에 30초 동안 침지한 후 멸균수로 세척하고 다시 소독액 (30 % 락스 + Tween 20)으로 20분 소독한 후 멸균수로 3회 수세하여 발아시켜 키웠다. 발아된 라벤더잎을 날카로운 칼을 이용하여 단번에 상처를 내어 1 mg/L Zeatin, 3% Sucrose 및 agar 8g/L 가 포함된 기본 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70%의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 라벤더잎으로부터 세포를 유도하였다. 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 고체상태에서의 계대배양은 2주간으로 진행하였고, 액상 대량배양은 온도조건 23±2 ℃, 습도 70 % 배양실 조건에서 20 L 생물반응기(Bioreactor)(구입처:(주)삼성과학)에 공기공급량 0.1 vvm 정도로 5주간 배양하여 라벤더잎세포(라벤더식물세포배양물)를 준비하였다.
실시예 2: 라벤더잎세포추출물 제조
실시예 1에서 배양하여 얻은 라벤더잎세포를 수확하여 깨끗한 티슈로 충분히 수분을 제거한 후 60℃로 2일 동안 건조기에서 건조하였다. 건조된 라벤더잎세포 분말 2 g을 용기에 담고, 1 L의 정제수를 넣은 후 90 ~ 120 ℃에서 4시간 열수 추출하였다. 추출 후, mesh로 여과하여 고형분을 제거하고, 여과한 라벤더잎세포추출물을 본 발명에 사용하였다.
실시예 3: 피부세포 배양을 통한 무자극 및 세포 증식에 의한 재생 효과 확인 시험
본 발명의 조성물이 피부 세포에서 독성을 일으켜 피부자극이 유발되는지 알아보기 위해, MTT assay를 진행하였다. HaCaT 세포(human keratinocyte, 각질형성세포), Detroit 세포(human fibroblast, 섬유아세포, Detroit 551, 5116)를 10 % FBS(Fetal Bovine Serum)가 함유된 DMEM(Dubelcco's Modified Eagle's Medium) 배지와 함께 96-well plate에 분주하고 5% CO2, 37℃의 조건인 항온기에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군과 본 발명 조성물을 최종 0.5, 1, 5 %인 농도가 되도록 세포에 처리하고, 24시간 동안 추가 배양하였다. 이어 5 mg/mL MTT(3-(4, 5-dimethyl-2-thiazolyl)-2, 5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide) 용액을 각 well에 4 μL씩 첨가하고, 4시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거한 다음 DMSO(Dimethyl sulfoxide) 용액 100 μL씩 첨가하여 세포를 용해시킨 후, spectrophotometer를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
| 처리농도(%) | 세포 독성율 % (Cytotoxicity) |
||
| Human Keratinocyte | Human Fibroblast | ||
| 대조군 | 100 | 100 | |
| 라벤더잎세포 추출물 |
0.5 | 102 | 105 |
| 1.0 | 110 | 108 | |
| 5.0 | 120 | 115 | |
그 결과, 본 발명의 조성물은 0.5 ~ 5 % 처리 농도에서 피부세포 내 독성을 보이지 않아 자극이 없음을 확인하였다. 따라서 상기 조성물은 피부 자극 유발 가능성이 낮고 안전한 물질임을 의미한다.
실시예 4: 자외선 조사에 의한 세포보호 효과
UV 조사에 사용할 광원으로는 302 nm 파장의 자외선을 방출하는 ultraviolet crosslinker CL-1000 (Ultra-Violet Products, CA)을 사용하였다. 피부각질형성세포인 HaCaT 세포를 1x105 cells/ml 농도로 24-well plate에 넣고 배양기에서 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 인산완충액으로 세척하였다. 인산완충액을 500 μL 첨가한 다음 자외선을 10 mJ/cm²로 조사 후 FBS를 포함하지 않은 신선한 세포배양배지로 교체하고 본 발명에 의한 조성물을 농도별로 처리한 다음 24시간 추가배양하였다. 여기에, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, Sigma) 5 mg/ml를 첨가한 후 배양기에서 3시간 배양한 후 형성된 fomazan을 DMSO로 녹이고, 96well plate로 옮긴 후 595 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하여 자외선 조사 후 시료를 처리하지 않은 대조군과 세포생존율을 비교하였다.
| 구분 | 자외선 조사 여부 |
처리농도(%) | 자외선 조사에 의한 세포 보호 효과 ( % of Control ) |
| 대조군 | - | - | 100 |
| 대조군 | + | - | 51 |
| 라벤더잎세포 추출물 |
+ | 0.5 | 60 |
| 1.0 | 68 | ||
| 5.0 | 85 |
본 발명에 의한 조성물의 각질형성세포 보호 효과를 평가하기 위하여, 인간각질형성세포(Keratinocytes, HaCaT)를 자외선 조사 20 mJ/cm²에 노출시킨 뒤 24시간 추가 배양한 뒤 세포생존율을 확인할 수 있는 MTT assay를 수행한 결과, 라벤더잎세포추출물 처리 농도가 증가함에 따라 대조군과 비교하여 세포 생존율(Cell Vialbility)가 증가하였다. 따라서, 본 발명에 의한 조성물의 자외선조사에 의한 피부세포 보호효과를 확인할 수 있었다.
실시예 5: AQP, TERT, Filaggrin 유전자 발현에 의한 피부장벽강화, 보습, 항노화 효과
세포배양
인간 각질형성세포주(HaCaT)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic(GIBCO, Cat.# 15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm² culture dish에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양한다. 인간각질형성세포가 80%이상 confluence 될 때 96 well plate에 1×10⁴ cells/well 분주한 후 세포배양 조건에서 confluence가 80%이상 도달될 때까지 배양하고, 80% 이상의 confluence가 되면 배지를 DMEM free 배지(without FBS)로 교환 후 본 발명에 의한 조성물을 처리한다. 본 발명에 의한 조성물 처리 후 24시간동안 추가 배양하여 본 발명에 의한 조성물에 의한 각 유전자 발현에 어떠한 영향이 있는지 본다. 시험방법은 Real-time PCR 법을 수행하며, 그 시험 순서는 아래와 같다.
RNA isolation은 FastLane Cell one-step buffer set (QIAGEN Cat.# 216213)이용한다. 배지를 제거한 세포는 FCW(cell wash buffer)로 세척하고, 50ul cell processing mixture (Buffer FCPL이 첨가된 Buffer FCPW에 gDAN Wipeout buffer 첨가한 mixture)을 첨가하여 실온에서 5분간 incubation 한 후 새로운 E-tube에 옮긴 후 75℃에서 5분간 반응시킨다.
유전자 발현을 확인하기 위하여, 상기에서 추출한 RNA를 template로하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen社)으로 진행하였다. 실험에 사용한 primer들은 Qiagen사의 QuantiTect®primerassays (Aquaporin3 Cat.#QT00212996, Telomerase reverse transcriptase (TERT) Cat.#QT00073409, Filaggrin Cat.#QT01192646) 및 GAPDH(Cat.# QT01192646)로 Normalization 하였다.
Real-time PCR 조건은 다음과 같다.
| < Real-time cycler conditions > Step |
Time | Temperature |
| Reverse transcription | 30 min | 50 ℃ |
| PCR initial activation step | 15 min | 95 ℃ |
| 3-step cycling | ||
| Denaturation | 15 s | 94 ℃ |
| Annealing | 30 s | 60 ℃ |
| Extension | 30 s | 72 ℃ |
| Number of cycles | 45 |
발현율(fold) = (시료처리군의발현율)/(대조군의발현율)
실시예 5-1: AQP3 발현증가에 의한 보습효과
본 발명의 조성물 함량이 증가함에 따라 보습효과와 관련한 AQP-3 (Aquaporin-3) 유전자의 생합성량이 증가함을 알 수 있었다.
| 처리농도(%) | AQP-3 발현양 ( % of control) |
|
| 대조군 | 100 | |
| 라벤더잎세포 추출물 |
0.5 | 108 |
| 1.0 | 116 | |
| 5.0 | 125 |
실시예 5-2: 항노화 관련 유전자 TERT 발현 영향 시험
본 발명의 조성물에 의한 항노화 관련 유전자인 TERT(Telomerase Reverse Transcriptase) 발현을 통한 세포수명 연장 효능 평가를 확인한 결과, 본 발명에 의한 조성물은 양성 대조군으로 사용된 1mM Shikimic acid(SA)과 비슷할 정도의 우수한 TERT 발현능을 가지고 있음을 확인하였다.
| 처리농도(%) | TERT 발현양 ( % of control) |
|
| - | 음성 대조군 | 100 |
| 양성 대조군 (1mM SA) |
520 | |
| 라벤더잎세포 추출물 |
0.5 | 110 |
| 1.0 | 250 | |
| 5.0 | 310 |
실시예 5-3: 피부 장벽 기능 확인 시험
본 발명에 의한 조성물에 의하여 각질형성세포의 정상적인 분화를 촉진하고, 피부에서의 자연보습인자로 변환되는 filaggrin의 피부내 발현을 촉진함으로써 피부장벽기능을 개선할 수 있음을 나타낸다. 즉, 라벤더잎세포추출물의 Filaggrin 유전자의 발현을 측정한 결과, 유전자 발현율이 유전자 발현양이 월등히 증가함을 확인하였다.
| 처리농도 (%) |
Filaggrin 유전자 발현율 (Relative Expression of Filaggrin) |
|
| 음성 대조군 | 1.00 | |
| 라벤더잎세포 추출물 |
0.5 | 1.24 |
| 1.0 | 2.65 | |
| 5.0 | 4.76 |
실시예 6: 사이토카인 유전자 발현 분석에 의한 가려움증 완화 효과
본 발명에 의한 조성물이 가려움증을 억제 및 완화효과를 확인하기 위하여, IL-4, IL-33, TSLP mRNA 발현 수준을 분석하였다.
세포배양
인간 각질형성세포주(HaCaT)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic(GIBCO, Cat.# 15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm² culture dish에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양한다. 인간각질형성세포가 80%이상 confluence 될 때 96 well plate에 1×10⁴ cells/well 분주한 후 세포배양 조건에서 confluence가 80%이상 도달 될 때까지 배양하고, 80% 이상의 confluence가 되면 배지를 DMEM free 배지(without FBS)로 교환 후 본 발명에 의한 조성물을 처리한다. 본 발명에 의한 조성물 처리 후 24시간동안 추가 배양하여 본 발명에 의한 조성물에 의한 각 유전자 발현에 어떠한 영향이 있는지 본다. 시험방법은 Real-time PCR 법을 수행하며, 그 시험 순서는 아래와 같다.
RNA isolation은 FastLane Cell one-step buffer set (QIAGEN Cat.# 216213)이용한다. 배지를 제거한 세포는 FCW(cell wash buffer)로 세척하고, 50ul cell processing mixture (Buffer FCPL이 첨가된 Buffer FCPW에 gDAN Wipeout buffer 첨가한 mixture)을 첨가하여 실온에서 5분간 incubation 한 후 새로운 E-tube에 옮긴 후 75℃에서 5분간 반응시킨다.
유전자 발현을 확인하기 위하여, 상기에서 추출한 RNA를 template로하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen社)으로 진행하였다. 실험에 사용한 primer들은 Qiagen사의 QuantiTect®primerassays (Interleukin 4 (IL-4) Cat.#QT00012565, Thymic Stromal Lymphopoietin (TSLP) Cat.#QT00051464, Interleukin 33 (IL-33) Cat.#QT00041559) 및 GAPDH(Cat.# QT01192646)로 Normalization 하였다. Real-time PCR 조건은 다음과 같다.
| < Real-time cycler conditions > Step |
Time | Temperature |
| Reverse transcription | 30 min | 50 ℃ |
| PCR initial activation step | 15 min | 95 ℃ |
| 3-step cycling | ||
| Denaturation | 15 s | 94 ℃ |
| Annealing | 30 s | 60 ℃ |
| Extension | 30 s | 72 ℃ |
| Number of cycles | 45 |
발현율(fold) = (시료처리군의발현율)/(대조군의발현율)
실시예 6-1: IL-4 유전자 발현 감소 의한 가려움증 완화
본 발명의 조성물의 함량이 증가함에 따라서 사이토카인 IL-4 유전자 발현 감소를 확인함으로써 가려움증 개선효과를 확인하였다.
| 처리농도(%) | IL-4 발현양 ( % of control) |
|
| 음성 대조군 | 100 | |
| 라벤더잎세포 추출물 |
0.5 | 101 |
| 1.0 | 76 | |
| 5.0 | 67 |
실시예 6-2: TSLP 유전자 발현 감소 의한 가려움증 개선 효과
본 발명의 조성물 함량이 증가함에 따라서 사이토카인 TSLP 유전자 발현 감소를 확인함으로써 가려움증 개선효과를 확인하였다.
| 처리농도(%) | TSLP 발현양 ( % of control) |
|
| 음성 대조군 | 100 | |
| 라벤더잎세포 추출물 |
0.5 | 105 |
| 1.0 | 75 | |
| 5.0 | 65 |
실시예 6-3: IL-33 유전자 발현 감소 의한 가려움증 개선 효과
본 발명의 조성물 라벤더잎세포 추출물 함량이 증가함에 따라서 사이토카인 IL-33 유전자 발현 감소를 확인함으로써 가려움증 개선효과를 확인하였다.
| 처리농도(%) | IL-33 발현양 ( % of control) |
|
| 음성 대조군 | 100 | |
| 라벤더잎세포 추출물 |
0.5 | 98 |
| 1.0 | 81 | |
| 5.0 | 72 |
실시예 7: HMOX1, NQO1, FTL, TXNRD1 유전자 발현에 의한 스트레스 억제 효과
세포배양
인간 각질형성세포주(HaCaT)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic(GIBCO, Cat.# 15240-062)과 함께 100 mm/60.1 cm² culture dish에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양한다. 인간각질형성세포가 80%이상 confluence 될 때 96 well plate에 1×10⁴ cells/well 분주한 후 세포배양 조건에서 confluence가 80%이상 도달될 때까지 배양하고, 80% 이상의 confluence가 되면 배지를 DMEM free 배지(without FBS)로 교환 후 본 발명에 의한 조성물을 처리한다. 본 발명에 의한 조성물 처리 후 24시간동안 추가 배양하여 본 발명에 의한 조성물에 의한 각 유전자 발현에 어떠한 영향이 있는지 본다. 시험방법은 Real-time PCR 법을 수행하며, 그 시험 순서는 아래와 같다.
RNA isolation은 FastLane Cell one-step buffer set (QIAGEN Cat.# 216213)이용한다. 배지를 제거한 세포는 FCW(cell wash buffer)로 세척하고, 50ul cell processing mixture (Buffer FCPL이 첨가된 Buffer FCPW에 gDAN Wipeout buffer 첨가한 mixture)을 첨가하여 실온에서 5분간 incubation 한 후 새로운 E-tube에 옮긴 후 75℃에서 5분간 반응시킨다.
유전자 발현을 확인하기 위하여, 상기에서 추출한 RNA를 template로하여 2X QuantiTect SYBR Green RT-PCR Master mix의 매뉴얼에 따라 Rotor Gene Q Real-time PCR Machine (Qiagen社)으로 진행하였다. 실험에 사용한 primer들은 Qiagen사의 QuantiTect®primerassays (HMOX1 Cat.#QT00092645, NQO1 Cat.#QT00050281, FTL Cat.#QT00055860, TXNRD1 Cat.#QT00055902 및 GAPDH(Cat.# QT01192646)로 Normalization 하였다.
Real-time PCR 조건은 다음과 같다.
| < Real-time cycler conditions > Step |
Time | Temperature |
| Reverse transcription | 30 min | 50 ℃ |
| PCR initial activation step | 15 min | 95 ℃ |
| 3-step cycling | ||
| Denaturation | 15 s | 94 ℃ |
| Annealing | 30 s | 60 ℃ |
| Extension | 30 s | 72 ℃ |
| Number of cycles | 45 |
발현율(fold) = (시료처리군의발현율)/(대조군의발현율)
실시예 7-1: HMOX1 발현증가에 의한 스트레스 억제 효과
본 발명의 조성물 함량이 증가함에 따라 Anti stress-anti oxidation 관련한 HMOX1 (Heme Oxygenase 1) 유전자의 생합성량이 증가함을 알 수 있었다(도 2).
| 처리농도(%) | HMOX1 발현양 ( % of control) |
|
| 음성 대조군 | 1.000 | |
| 라벤더잎세포 추출물 |
0.5 | 1.450 |
| 1.0 | 1.510 | |
| 5.0 | 2.735 |
실시예 7-2: NQO1 발현증가에 의한 스트레스 억제 효과
본 발명의 조성물 함량이 증가함에 따라 Reduction of oxidative stress, detoxification 관련한 NQO1 (NAD(P)H Quinone dehydrogenase 1) 유전자의 생합성량이 증가함을 알 수 있었다(도 2).
| 처리농도(%) | NQO1 발현양 ( % of control) |
|
| - | 음성 대조군 | 1.000 |
| 라벤더잎세포 추출물 |
0.5 | 1.425 |
| 1.0 | 1.500 | |
| 5.0 | 1.725 |
실시예 7-3: FTL 발현증가에 의한 스트레스 억제 효과
본 발명의 조성물 함량이 증가함에 따라 Detoxification of iron 관련한 FTL (Ferritin) 유전자의 생합성량이 증가함을 알 수 있었다(도 2).
| 처리농도(%) | FTL 발현양 ( % of control) |
|
| - | 음성 대조군 | 1.000 |
| 라벤더잎세포 추출물 |
0.5 | 1.475 |
| 1.0 | 1.595 | |
| 5.0 | 1.635 |
실시예 7-4: TXNRD1 발현증가에 의한 스트레스 억제 효과
본 발명의 조성물 함량이 증가함에 따라 Control of redox system, homeostasis 관련한 TXNRD1 (Thioredoxin reductase 1) 유전자의 생합성량이 증가함을 알 수 있었다(도 2).
| 처리농도(%) | TXNRD1 발현양 ( % of control) |
|
| - | 음성 대조군 | 1.000 |
| 라벤더잎세포 추출물 |
0.5 | 1.450 |
| 1.0 | 1.555 | |
| 5.0 | 1.680 |
실시예 8: 콜라겐 증진에 의한 항주름 효과 확인 시험
본 발명의 조성물이 주름 개선과 관련된 콜라겐 생성양을 증진시키는지 알아보고자 PIP assay를 진행하였다.
이를 위하여 Detroit 세포를 48-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군과 시험 물질인 조성물을 최종 0.5, 1, 5 %인 농도가 되도록 세포에 처리하고 24시간 동안 세포를 추가 배양하였다. 상기 과정을 통해 배양한 배지의 상층액을 희석한 일부 20 μL를 취해 PIP EIA kit(Takara, Cat. MK101) 내 PIP 표준물질 20 μL와 함께 각각 antibody coated microtiter plate에 넣고 100 μL의 peroxidase 표식 antibody solution을 또한 각 well에 첨가하여, 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 배지를 제거하여 200 μL의 PBS로 4회 세척한 후, 각 well에 100 μL의 substrate solution을 첨가하고 차광한 상태에서 15분간 실온에서 반응시켰다. 이후 100 μL stop solution (1 N H2SO4)을 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정한 후 PIP 표준농도곡선을 작성하여 시료 내 PIP 양을 산정하였다.
| 처리농도(%) | Procollagen 생합성량 ( % of control) |
|
| - | 100 | |
| 라벤더잎세포 추출물 |
0.5 | 103 |
| 1.0 | 118 | |
| 5.0 | 134 |
본 발명의 의한 조성물 라벤더잎세포추출물 처리 농도 증가함에 따라 콜라겐의 생합성량이 증가함을 알 수 있고, 이에 본 발명의 조성물이 탁월한 콜라겐 합성 증진 효과를 나타냄을 알 수 있다.
실시예 9: Wound healing assay를 이용한 창상치유, 피부재생, 항노화 효과
인간 각질형성세포주 HaCaT(human keratinocyte)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 10% Fatal bovine serum (FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic (GIBCO) 과 함께 100 mm/60.1 cm2 culture dish에서 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. HaCaT이 90%정도 confluence 될 때 100 mm/60.1 cm2 dish에 1.5×105 cells/12well plate 분주한 후 24시간 배양하고, FBS를 포함하지 않는 배지로 교체한 후 각 well에 200P tip을 이용해 #모양으로 스크레치를 내고 본 발명에 의한 조성물을 처리하였다. 물질처리 후 0시간대에 cell image를 현미경 사진으로 찍고 (T0), 37℃, 5% CO2의 조건으로 배양하였다. 물질처리 후 18-20 시간동안 추가배양 후 배지를 제거하고 fixing solution(4% paraformaldehyde)으로 넣고 15분간 상온에서 incubation하고 PBS로 3번 washing하였다. Fixed cells은 4℃에서 한달 동안 보관이 가능하였다. Wound healing이 된 정도는 현미경으로 사진을 찍어 Image J라는 프로그램을 이용하여 계산하였다 (T7은 24시간 후).
Wound healing assay를 이용하여 시험물질에 의한 세포 proliferation 및 migration을 촉진하는지의 유무를 관찰하여 피부재생, 항노화 효능을 평가하고자 하였다. 양성대조군으로 100ng/ml EGF를 사용하였다.
본 발명에 의한 조성물인 라벤더잎세포추출물을 처리하여 실험한 결과, 대조군과 비교하여 피부세포가 바닥에 붙어 자라면서 healing area가 증가함을 확인하였다. 어린 세포에 비하여 노화된 세포는 세포의 이동성이 떨어지는데, 본 발명의 조성물에 의하여 노화된 세포의 이동성이 활발하게 증가함을 확인할 수 있다. (도 3).
실시예 10: 세포의 에너지 증진 효과 시험
본 발명의 조성물의 세포 에너지 증진 효과를 살펴보기 위하여, 세포가 대사과정에서 방출하는 ATP의 활성 정도를 측정하였다. 이러한 ATP는 세포 증식, 세포 활성의 마커로써 기능할 수 있다.
이를 위하여 Detroit 세포를 12-well plate에 분주한 후, 세포 배양 조건에서 24시간 배양하였다. 이후 정제수를 첨가한 대조군과 시험 물질인 조성물을 최종 0.1, 1, 5 %인 농도가 되도록 세포에 처리하고, 이후 24시간 동안 세포를 추가 배양하였다. 상기 과정을 통해 배양한 세포의 용해물을 희석한 일부 50 μL를 취해 ATP assay kit(Abcam, Cat. ab83355) 내 ATP 표준물질 50 μL와 함께 각각 96-well plate에 넣고 50 μL의 ATP reaction mix 용액을 또한 각 well에 첨가하여 차광한 상태에서 30분간 실온 반응시켰다. 이후 570 nm에서 흡광도를 측정한 후 ATP 표준농도곡선을 작성하여 시료 내 ATP 양을 산정하였다.
| 처리농도(%) | ATP Content (%) | |
| 대조군 | - | 100 |
| 라벤더잎세포 추출물 |
0.5 | 99 |
| 1.0 | 111 | |
| 5.0 | 123 |
그 결과, 본 발명의 조성물은 0.5 ~ 5 % 처리 농도에서 ATP 양이 증가하여 에너지 활성 증진 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 11: 피부 장벽강화 및 피부 진정효과 시험
본 발명의 조성물의 외부 자극에 의한 피부 장벽 개선 및 피부 진정(붉은기) 효과에 대한 효능을 확인하고자 본 인체적용시험 참여에 동의한 자 중 선정 기준에 적합하고 제외 기준에 해당되지 않는 시험대상자를 대상으로 정해진 시험부위에 ‘라벤더잎세포추출물’ 1% 함유된 본 발명의 조성물을 크림제형으로 제품화하여 14일간 사용한 후 SLS첩포 전과 조성물 사용 전(SLS 24시간 첩포 및 제거 후), 조성물 사용 7일 후 및 조성물 사용 14일 후에 피부 측정 및 사진 촬영을 하였다.
즉, 구체적으로 전박부위에 제품 미사용부위와 사용부위를 나누어 각각 1.2% SLS(Sodium Lauryl Sulfate)를 24시간 폐쇄 첩포하고 피부 자극을 일시적으로 약하게 하여 피부 손상을 가한 후, 지정된 사용부위에만 ‘라벤더잎세포추출물’ 1% 함유된 본 발명의 조성물을 사용하였다. 사용기간은 2주동안 1일 2회 사용하였다.
<평가방법>
- 외부 자극에 의한 피부 장벽 측정
외부 자극에 의한 피부 장벽 측정은 시험대상자의 전박 부위에 제품 미사용 부위와 제품 사용 부위를 구획한 뒤, 1.2% SLS(Sodium Lauryl Sulfate) 용액을 IQ Chamber에 적하하여 각 부위에 24시간 동안 첩포하였다. 인위적으로 피부를 손상시킨 뒤 첩포를 제거하고 정해진 부위에만 시험제품을 14일간 사용하도록 한 후, Vapometer를 사용하여 SLS 첩포 전과 제품 사용 전(SLS 24시간 첩포 및 제거 후), 제품 사용 7일 후 및 제품 사용 14일 후 각 부위의 피부 경표피수분손실량을 측정하였다. 경표피수분손실량 측정은 부위당 1회 측정하였고, 그 단위는 g/m2h이다. 경표피수분손실량 측정 값은 외부 자극에 의한 피부 장벽 개선 정도와 반비례하므로 측정 값이 낮아질수록 외부 자극에 의한 피부 장벽이 개선됨을 의미한다.
- 외부 자극에 의한 피부 진정(붉은기) 효과 측정
외부 자극에 의한 피부 진정(붉은기) 효과 측정은 시험대상자의 전박 부위에 제품 미사용 부위와 제품 사용 부위를 구획한 뒤, 1.2% SLS(Sodium Lauryl Sulfate) 용액을 IQ Chamber에 적하하여 각 부위에 24시간 동안 첩포하였다. 인위적으로 피부를 손상시킨 뒤 첩포를 제거하고 정해진 부위에만 시험제품을 2주간 사용하도록 한 후, Chromameter CR400을 사용하여 SLS 첩포 전과 제품 사용 전(SLS 24시간 첩포 및 제거 후), 제품 사용 7일 후 및 제품 사용 14일 후 각 부위의 피부 붉은기를 측정하였다. 피부 붉은기 측정은 3회 측정한 평균값을 사용하였고, 측정 변수는 a value이다. 측정 값과 피부 붉은기 정도는 비례하므로 측정 값이 낮아질수록 외부 자극에 의한 피부 진정(붉은기) 효과가 있음을 의미한다.
- 피부 일반 사진 촬영: Antera 3D
<시험결과>
- 본 시험은 만 19~60세의 성인 여성 23명을 대상으로 진행하였으며, 중도 탈락 3명을 제외한 총 20명의 시험대상자가 시험제품인 “라벤더잎세포추출물”을 함유한 본 발명의 조성물 제품을 전박 부위에 14일간 사용한 결과,
1) 시험제품 사용 후 외부 자극에 의한 피부 장벽 측정 결과, 시험제품 사용 부위의 경표피수분손실량 측정 값이 시험제품 미사용 부위 대비 제품 사용 14일 후 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(p<0.05).
즉, 외부자극에 의하여 “라벤더잎세포추출물” 1%가 함유된 본 발명의 조성물 제품을 사용하였을 경우, 사용 7일 후 7.0 %, 사용 14일 후 9.8 %의 경표피수분손실변화로 피부장벽개선에 도움을 주는 것을 확인하였다(도4).
2) 시험제품 사용 후 외부 자극에 의한 피부 진정(붉은기) 효과 측정 결과, 시험제품 사용 부위의 피부 붉은기 측정 값이 시험제품 미사용 부위 대비 제품 사용 14일 후 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다(p<0.05).
즉, 외부자극에 의하여 “라벤더잎세포추출물” 1%가 함유된 본 발명의 조성물을 사용하였을 경우, 사용 7일 후 5.1 %, 사용 14일 후 8.1 %의 피부 진정(붉은기)에 도움을 주는 것을 확인하였다(도5).
실시예 12: 피부 외용제 조성물 제조
본 발명에 따른 라벤더 식물세포 배양물 유래 추출물을 유효 성분으로 포함하는 피부 외용제 조성물을 제조하기 위하여, 화장수, 에센스, 로션, 크림 및 젤을 각각 제조하였다.
제조예 3-1: 화장수
다음 처방에 따라 통상의 화장수 제조 방법에 따라 제조하였다.
| 원 료 명 | 중량 %(w/w) |
| 글리세린 | 5.0 |
| 디프로필렌글리콜 | 3.0 |
| 히아루론산 | 0.5 |
| 폴리옥시에틸렌 경화피마자유 | 0.1 |
| 폴리에틸렌 올레일에틸 | 0.1 |
| 에탄올 | 5.0 |
| 방부제 | 0.15 |
| 항료 | 적량 |
| 착색료 | 적량 |
| 라벤더잎세포추출물 | 1.0 |
| 정제수 | to 100 |
제조예 3-2: 에센스
다음 처방에 따라 통상의 에센스 제조 방법에 따라 제조하였다.
| 원 료 명 | 중량 %(w/w) |
| 세토스테아릴알코올 | 1.0 |
| 자기유화형모노스테아린산 | 1.0 |
| 밀납 | 0.5 |
| 스쿠알란 | 5.0 |
| 이소세틸옥타노에이트 | 3.0 |
| 디메틸실록산 | 0.3 |
| 모노스테아린산소르비탄 | 0.5 |
| 모노스테아린산폴리에틸렌글리콜 | 8.0 |
| 글리세린 | 4.0 |
| 프로필렌글리콜 | 0.2 |
| 카르복시폴리머 | 0.22 |
| 트리에탄올아민 | 0.25 |
| 방부제 | 적량 |
| 향료 | 적량 |
| 착색료 | 적량 |
| 라벤더잎세포추출물 | 1.0 |
| 정제수 | to 100 |
제조예 3-3: 로션
다음 처방에 따라 통상의 로션 제조 방법에 따라 제조하였다.
| 원료명 | 중량 %(w/w) |
| 세토스테아릴알코올 | 0.8 |
| 자기유화형모노스테아린산 | 1.0 |
| 밀납 | 0.5 |
| 스테아린산 | 0.5 |
| 유동파라핀 | 7.0 |
| 스쿠알란 | 5.0 |
| 마카데미아오일 | 3.0 |
| 이소세틸옥타노에이트 | 2.0 |
| 디메틸실록산 | 0.3 |
| 모노스테아린산소르비탄 | 0.5 |
| 모노스테아린산폴리에틸렌글리콜 | 1.2 |
| 글리세린 | 4.0 |
| 프로필렌글리콜 | 4.0 |
| 베타인 | 4.0 |
| 카르복시폴리머 | 0.12 |
| 트리에탄올아민 | 0.15 |
| 방부제 | 0.25 |
| 향료 | 적량 |
| 착색료 | 적량 |
| 라벤더잎세포추출물 | 1.0 |
| 정제수 | to 100 |
제조예 3-4: 크림
다음 처방에 따라 통상의 크림 제조 방법에 따라 제조하였다.
| 원 료 명 | 중량 %(w/w) |
| 세토스테아릴알코올 | 3.0 |
| 자기유화형모노스테아린산 | 1.5 |
| 친유형모노스테아린산 | 1.5 |
| 밀납 | 0.5 |
| 유동파라핀 | 8.0 |
| 스쿠알란 | 7.0 |
| 이소세틸옥타노에이트 | 4.0 |
| 정제호호바유 | 4.0 |
| 디메틸실록산 | 0.3 |
| 모노스테아린산소르비탄 | 1.0 |
| 모노스테아린산폴리에틸렌글리콜 | 1.2 |
| 글리세린 | 6.0 |
| 프로필렌글리콜 | 4.0 |
| 베타인 | 4.0 |
| 산탄검 | 0.06 |
| 트리에탄올아민 | 0.10 |
| 방부제 | 0.25 |
| 향료 | 적량 |
| 착색료 | 적량 |
| 라벤더잎세포추출물 | 1.0 |
| 정제수 | to 100 |
제조예 3-5: 젤
다음 처방에 따라 통상의 젤 제조 방법에 따라 제조하였다.
| 원료명 | 중량 %(w/w) |
| 글리세린 | 4.0 |
| 프로필렌글리콜 | 4.0 |
| 에탄올 | 10 |
| 폴리옥시에틸렌경화피마자유 | 0.1 |
| 카르복시폴리머 | 0.30 |
| 트리에탄올아민 | 0.30 |
| 방부제 | 적량 |
| 향료 | 적량 |
| 착색료 | 적량 |
| 라벤더잎세포추출물 | 1.0 |
| 정제수 | to 100 |
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
Claims (12)
- 라벤더잎세포추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 개선용 외용제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 피부 개선은 자외선 조사에 의한 피부 손상 개선 또는 예방인, 외용제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 피부 개선은 피부 장벽 강화인, 외용제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 피부 개선은 피부 보습 개선인, 외용제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 피부 개선은 항노화인, 외용제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 피부 개선은 항산화인, 외용제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 피부 개선은 피부 가려움 완화 또는 예방인, 외용제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 피부 개선은 피부 스트레스 개선 또는 예방인, 외용제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 피부 개선은 피부 주름 개선 또는 예방인, 외용제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 피부 개선은 피부 재생 또는 창상 치유인, 외용제 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 피부 개선은 피부 진정인, 외용제 조성물.
- 다음의 단계를 포함하는 제1항에 따른 외용제 조성물의 제조방법:
(a) 라벤더 식물의 잎을 분리하여 라벤더잎세포를 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a)단계에서 얻은 라벤더잎세포 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 외용제 조성물을 제조하는 단계.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220072810A KR20230172226A (ko) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | 라벤더잎세포추출물을 유효성분으로 포함하는 외부 자극에 의한 피부 장벽개선 및 피부 진정(붉은기)에 효과적인 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020220072810A KR20230172226A (ko) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | 라벤더잎세포추출물을 유효성분으로 포함하는 외부 자극에 의한 피부 장벽개선 및 피부 진정(붉은기)에 효과적인 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20230172226A true KR20230172226A (ko) | 2023-12-22 |
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| KR1020220072810A KR20230172226A (ko) | 2022-06-15 | 2022-06-15 | 라벤더잎세포추출물을 유효성분으로 포함하는 외부 자극에 의한 피부 장벽개선 및 피부 진정(붉은기)에 효과적인 조성물 |
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| KR (1) | KR20230172226A (ko) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100529014B1 (ko) | 2003-05-29 | 2005-11-16 | 주식회사 에버코스 | 허브 추출물을 포함하는 피지를 억제하는 모공수축 화장료조성물 |
-
2022
- 2022-06-15 KR KR1020220072810A patent/KR20230172226A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (1)
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| KR100529014B1 (ko) | 2003-05-29 | 2005-11-16 | 주식회사 에버코스 | 허브 추출물을 포함하는 피지를 억제하는 모공수축 화장료조성물 |
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