KR20230140434A - 페닐기를 갖는 질소 함유 헤테로고리 화합물 및 그의 용도 - Google Patents

페닐기를 갖는 질소 함유 헤테로고리 화합물 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 페닐기를 갖는 질소 함유 헤테로고리 화합물 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물은 부작용 없이 시냅스 가소성을 효과적으로 향상시킴으로써 신경퇴행성 질환, 신경퇴행성 병리, 신경정신병적 장애, 기억 상실, 인지 기능 장애/손상 및 소거 학습 장애와 같은 다양한 신경학적 장애에 대해 치료 효과를 발휘할 수 있다.

Description

페닐기를 갖는 질소 함유 헤테로고리 화합물 및 그의 용도{NITROGEN-CONTAINING HETEROCYCLIC COMPOUNDS HAVING PHENYL GROUP AND THEIR USES}
본 발명은 페닐기를 갖는 질소 함유 헤테로고리 화합물 및 그의 용도에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 위한 화합물, 조성물 또는 방법에 관한 것이다.
시냅스 가소성 및 결정적 시기
신경망은 뉴런으로 이루어진 망이다. 시냅스는 뉴런이 서로 정보를 교환하는 신경망 내의 노드이다. 망 내에서, 시냅스는 "가소성"인데, 이는 진행 중인 신경 활동에 반응하여 시냅스 입력이 추가, 제거 또는 정교화됨에 따라 시냅스의 수와 강도가 일생에 걸쳐 지속적으로 변하기 때문이다. 시냅스 가소성은 시냅스 전달의 강도 및/또는 효율성의 변화에 의해 나타나는 시냅스의 이러한 신경 활동 의존적 변형을 지칭한다.
학습, 인지, 종합, 판단, 예술 또는 창의성과 같은 고차 기능은 대뇌 피질에서 신경망(피질 신경망이라고 일컬어짐)을 형성하는 능력에 좌우된다. 피질 신경망의 시냅스 가소성은 출생 후 초기에 최고조에 달하며, 이는 결정적 시기로 알려져 있다. 결정적 시기 이후, 피질의 시냅스 가소성은 나이가 들면서 점차 감소하여, 결국 경험이 더 이상 대뇌 피질의 능동적 변화를 일으키지 않는 상태에 이르게 된다. 그러나 흥미롭게도 최근 연구는 특정 조건 하에서 결정적 시기가 종료된 후에도 시냅스 가소성이 높은 수준으로 회복될 수 있음을 보여주었다: 동물 모델에서, 말초 신경 손상은 말초 감각 신호를 대뇌 피질에 전달하는 체감각 시상피질 회로에서 시냅스 가소성을 재활성화시켰다(문헌[Yu et al., 2012, Neuron. 74:731-42]; 문헌[Petrus et al., 2014, Neuron. 81:664-73]; 문헌[Gao et al., 2014, J Neurosci. 34:10770-9]).
감소된 시냅스 가소성은 성인의 뇌 기능 퇴화와도 관련이 있다. 특히, 시상 피질 회로의 시냅스 가소성은 나이가 들면서 크게 제한된다. 위에서 언급한 바와 같이 결정적 시기를 재개하는 것이 가능한 경우, 치료 수단을 통해 피질 시냅스 가소성을 재활성화하거나 증가시키면 감소된 시냅스 가소성으로 인한 질환을 치료하는 데 유용할 수 있다.
히스톤 데아세틸라제 억제제
세포 내 DNA의 대부분은 염색질로 알려져 있는 더 조밀하고 압축된 형태로 포장되어 존재한다. 압축은 히스톤이라고 일컬어지는 한 무리의 단백질에 DNA를 감음으로써 발생한다. 염색질 압축의 정도는 히스톤의 아세틸화 수준에 따라 달라진다. 일반적으로, 히스톤 아세틸트랜스퍼라제(HAT)는 DNA에 대한 접근을 허용하는 아세틸화를 수행하고, 히스톤 데아세틸라제(HDAC)는 DNA에 대한 접근을 차단하는 탈아세틸화를 수행한다. 접근이 허용될 때에만 전사가 일어날 수 있기 때문에, 염색질 압축은 유전자 발현을 위한 조절 메커니즘으로 작동한다(문헌[Verdin and Ott, 2015, Nat Rev Mol Cell Biol 16:258-264]).
현재까지 11가지 유형의 포유류 HDAC가 확인되었다. 이들 유형은 효모 HDAC와의 상동성 정도에 따라 크게 4가지 부류로 분류된다. 부류 I에는 HDAC 1, 2, 3 및 8이 포함된다. 부류 II HDAC는 구조적 유사성에 따라 부류 IIa(HDAC 4, 5, 7 및 9)와 부류 IIb(HDAC 6 및 10)로 구분된다. 부류 III HDAC에는 SIRT1-7이 포함되고, 부류 IV에는 HDAC11이 포함된다.
부류 I HDAC는 주로 핵에 국한되어 있지만, 부류 II HDAC는 특정 세린 잔기의 인산화를 통해 핵과 세포질 사이를 왕복한다. HDAC의 N-말단 도메인은 여러 조직 특이적 전사 인자와 상호작용하고, 전사 억제인자로 작용한다. HDAC의 C-말단 도메인은 데아세틸라제 효소 활성을 갖는다. 그러나, 부류 IIa HDAC는 데아세틸라제 활성을 보유하지 않는데, 이는 이러한 부류가 C-말단 촉매 도메인의 티로신(Tyr) 잔기가 히스티딘(His)으로 치환되는 기능 상실 돌연변이를 지니고 있기 때문이다.
HDAC4
HDAC4는 몸 전체에 걸쳐 발현된다. HDAC4는 특히 뇌, 심장 및 골격근에서 고도로 발현된다(문헌[Grozinger et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4868-4873]; 문헌[ Darcy et al., 2010, J. Comp. Neurol. 518, 722-740]. 뇌에서, HDAC4 수준은 출생 직후 최고조에 달한다(문헌[Sando et al., 2012, Cell 151, 821-834]). HDAC4는 코르티코트로핀 방출 호르몬(CRH) 뉴런(100±0%), 옥시토신 뉴런(98±2%), 바소프레신 뉴런(100±0%), 오렉신 뉴런(100±0%), AgRP 뉴런(100±0%), POMC 뉴런(92±4%), 히스타민 뉴런(85±7%), 도파민 뉴런(100±0%), 세로토닌 뉴런(93±2%), 및 노르아드레날린 뉴런(100±0%)에서 검출된다(문헌[Takase et al., 2013, PloS ONE 8:e58473]).
세포질 HDAC4는 아폽토시스를 유도하는 낮은 칼륨 또는 흥분독성 글루타메이트 조건에 반응하여 핵으로 빠르게 전위된다. 핵에서의 HDAC4의 이소성 과발현은 신경 세포 사멸을 촉진하고, MEF2 및 CREB와 같은 생존 인자의 전사 활성을 억제한다(문헌[Bolger and Yao, 2005, J Neurosci. 2005; 25 :9544-9553]). HDAC4를 포함하는 뉴런은 크기가 균일하고, 뇌실주위 핵(paraventricular nucleus, PVN), 측면 시상하부(lateral hypothalamus, LHA), 시상하부 궁상 핵(hypothalamic arcuate nucleus, ARC), 결절 유두상 핵(tuberous mammary nucleus, TMN), 봉선핵(dorsal raphe, DR) 및 청반핵(locus coeruleus, LC)을 포함하는 뉴로필(neuropil)에 널리 분포되어 있다. 특히, HDAC4는 PSD95와 공동 국재화되어 있으며(문헌[Mielcarek et al., 2013, PLoS Biol. 11:e1001717]; 문헌[Takase et al., 2013, PloS ONE 8:e58473]), 이는 시냅스 가소성에서 HDAC4의 역할을 시사한다(문헌[Sando et al., 2012, Cell 151, 821-834]; 문헌[Mielcarek et al., 2013, PLoS Biol. 11:e1001717]).
동물 실험 모델에서, 래트 해마에서 HDAC4의 조직 특이적 결실은 오래 지속하는 스트레스 유도성 행동 변화를 제거했다(문헌[Sailaja et al., 2012, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, E3687-E3695]). HDAC4 과발현은 퍼옥시좀 증식인자-활성화 수용체 α(PPARα)의 활성 억제를 통해 H2O2 손상에 대한 감수성을 증가시킴으로써 소뇌 과립 뉴런의 사멸을 가속화시켰다(문헌[Bolger and Yao, 2005, J. Neurosci. 25, 9544-9553]; 문헌[Li et al., 2012, Nat. Med. 18, 783-790]; 문헌[Sando et al., 2012; Cell 151, 821-834]; 문헌[Yang et al., 2011, FEBS Lett. 585, 761-766]). 래트 해마에서의 HDAC4 과발현은 우울증-유사 행동을 유도했다(문헌[Sarkar et al., 2014, Neuropsychopharmacology 39, 2221-2232]).
초파리 모델에서, 기억 형성에 중요한 구조체인 성체 버섯체 뉴런에서의 HDAC4의 과발현은 장기 구애 기억에 손상을 일으키지만 단기 기억에는 영향을 미치지 않았다(문헌[Fitzsimons et al., 2013, PloS ONE 8: e83903]). HDAC4의 세포내 분포와의 관계를 조사한 후속 연구는 버섯체 형태발생, 눈 발달 및 장기 기억의 결손이 핵 HDAC4 풍부도(abundance)와 관련이 있음을 보여주었다(문헌[Main et al., 2021, Front. Mol. Neurosci. 14:616642]).
인간의 경우, HDAC4 수준의 증가가 사후 HD 전측두엽 변성(FTLD) 뇌에서 확인되었다(문헌[Yeh et al., 2013, Brain Res. 1504, 16-24]; 문헌[Whitehouse et al., 2014, Neuropathol. Appl. Neurobiol. 41, 245-257]). HDAC4는 파킨슨병 뇌에서 루이소체의 구성요소로, 그리고 뉴런 핵내 봉입체 질환에서 핵내 봉입체의 구성요소로 확인되었다(문헌[Takahashi-Fujigasaki and Fujigasaki, 2006, Neuropathol. Appl. Neurobiol. 32, 562-566]). HDAC4는 자폐증 환자의 특정 피질 영역에서 유의하게 과발현되는 것으로 관찰되었다(문헌[Nardone et al., 2014, Transl. Psychiatry 4:e433]).
HDAC 억제제 및 시냅스 가소성
히스톤 변형은 성인기에 피질 가소성을 회복하는 잠재적인 방법으로 제안되었다. 발프로산은 히스톤 데아세틸라제(HDAC) 억제제로 알려져 있다. 참가자들이 발프로산 캡슐을 복용한 임상 연구에서, 결정적 시기가 재개되고, 결정적 시기에만 가능했던 절대 음감 학습이 성인에서도 가능해졌다(문헌[Gervain et al., 2013, Front Syst Neurosci. 7:102]). 성체 래트가 정상 케이지 조건과 비교하여 부화 환경(enriching environment)에 노출되었을 때, 대조군에 비해 시각 피질의 총 H3 아세틸화량이 증가하였고, 결정적 시기에만 나타나는 안구 우성 가소성 역시 결정적 시기 이후에 관찰되었다(문헌[Baroncelli L et al., 2016, J Neurosci. 36:3430-40]).
HDAC 억제제인 SAHA(suberoylanilide hydroxamic acid)로의 처리는 시각 피질에서의 H3 아세틸화를 어린 래트에서 일반적으로 관찰되는 수준으로 증가시켰으며, 특히, 시각 피질에서 발달성 시냅스 가소성과 장기 기억에 중요한 것으로 알려진 뇌 유래 신경 영양 인자(BNDF)의 P3 프로모터의 H3 아세틸화가 또한 증가했다(문헌[Baroncelli L et al., 2016, J Neurosci. 36:3430-40]). 증가된 BDNF 발현은 또한 신경구체(neurosphere)에서도 관찰되었다(문헌[Bagheri et al., 2019, Int. J. Mol. Sci. 20: 1109]).
SAHA 또는 기타 HDAC 억제제는 헌팅턴병(HD)의 마우스 모델에서 증상을 개선시키는 효과가 있는 것으로 밝혀졌다(문헌[Ferrante et al., 2003]; 문헌[Hockly et al., 2003, J Biol. Chem. 278, 16059-16072]; 문헌[Gardian et al., 2005, J. Biol. Chem. 280, 556-563]). HDAC4는 헌팅턴병에서 발현되는 폴리글루타민의 길이와 상관관계가 있다. 이는 세포질 봉입체, 및 헌팅턴병에서 나타나는 골격근 위축 및 심부전과 같은 광범위한 말초 기관 병태와 함께 공동 국재화된다(문헌[Zielonka et al., 2014, Front. Physiol. 5:380]; 문헌[Mielcarek et al., 2014, PLoS Genet. 10:e1004550]; 문헌[Mielcarek et al., 2014, PloS ONE 9:e108961]; 문헌[Zielonka et al., 2014, Exp. Clin. Cardiol. 20, 2547-2554]). 헌팅턴병의 마우스 모델인 R6/2에서 HDAC4 수준을 감소시키면, 뇌의 다양한 영역에서 세포질 응집체 형성을 지연시키고, 운동 협응 및 신경학적 표현형을 개선하고, 수명 연장 효과를 가졌다(문헌[Mielcarek et al., 2013, PLoS Biol. 11:e1001717]).
흥미롭게도, R6/2 마우스에서 SAHA 처리는 BDNF의 피질 전사체 수준을 회복시켰다(문헌[Mielcarek et al., 2011, PloS ONE 6:e27746]). HDAC4 및 HDAC5는 특정 BDNF 전사체를 억제할 수 있고 이 효과는 SAHA 처리에 의해 역전되는 것으로 나타났으므로, HDAC 억제제에 의한 기억 강화 및 신경 보호 효과는 증가된 BDNF 발현과 관련될 수 있다(문헌[Koppel and Timmusk, 2013, Neuropharmacology 75, 106-11]).
HDAC4는 뇌 생리학에서 중심적인 역할을 할 수 있고, 여러 신경퇴행성 장애를 치료하는 데 유용한 표적이 될 수 있다. 그러나, 현재 이용 가능한 HDAC 억제제는 광범위하게 HDAC를 억제하며, 이로 인해 그러한 억제제는 특정 HDAC를 억제하는 데 적합하지 않다. SAHA는 시냅스 가소성을 증가시키지만, 피로, 메스꺼움, 설사 또는 혈소판감소증을 포함하는 심각한 부작용을 일으키며, 이로 인해 SAHA는 인간 용도로 적합하지 않다(문헌[Meghan E. et al., 2011, Bone. 48: 1117-1126]).
따라서, 표적 요법을 위한 선택적 HDAC 억제제를 개발하는 것이 유용할 것이다.
본 발명은 상술한 문제점을 모두 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 시냅스 가소성 향상을 위한 페닐기를 갖는 질소 함유 헤테로고리 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공하는 것을 일 목적으로 한다.
본 발명은 시냅스 가소성 향상을 위한 페닐기를 갖는 질소 함유 헤테로고리 화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 HDAC에 의해 매개되는 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애를 치료하거나 예방하기 위한 약학 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 시냅스 가소성 향상을 위한 페닐기를 갖는 질소 함유 헤테로고리 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, HDAC에 의해 매개되는 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애를 치료하거나 예방하는 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 시냅스 가소성 향상을 위한 페닐기를 갖는 질소 함유 헤테로고리 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염과 제2 치료제를 포함하는 병용투여용 약학 조성물 및 이를 이용한 병용투여 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 하기 화학식 (1)의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다:
상기 식에서, R1은 아릴 또는 헤테로아릴이거나, 이웃하는 페닐기와 결합하여 포화되거나 부분적으로 포화된 헤테로 고리를 형성하고, 상기 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로 고리 중의 하나 이상의 수소 원자는 비치환되거나, 할로겐 원자, C1-6 알킬, C3-12 사이클로알킬, C1-6 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아미노 또는 니트로로 치환되고, 상기 치환기는 비치환되거나 하나 이상의 할로겐 원자 또는 C1-6 알킬로 치환되고,
R2는 수소, C1-6 알킬 또는 아릴이고,
R3는 수소, 카르복실, N-하이드록시 카르복스아미드 또는 카르복스아미드이고, 상기 기 중의 수소는 C1-6 알킬로 치환될 수 있고,
n은 0 또는 1이고,
m은 0 내지 6이다.
일 구현예에서, R1은 페닐, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 푸라닐, 티오페닐, 피롤릴, 이미다졸릴 또는 옥사졸릴이거나, 이웃하는 페닐기와 결합하여 퀴녹살리닐 또는 디하이드로벤조디옥시닐을 형성할 수 있다.
다른 구현예에서, R1 중 하나 이상의 수소 원자는 할로겐 원자, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되거나 치환되지 않은 C1-6 알킬 또는 C3-12 사이클로알킬, C1-6 알콕시, 페닐, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 하나 이상의 C1-6 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 아미노, 또는 니트로로 치환될 수 있다.
일 구현예에서, R1은 페닐, 비페닐, 피리딘-4-일, 피리딘-3-일, 피리딘-2-일, 메틸피리딘-3-일, 6-메톡시-피리딘-3-일, 6-사이클로프로필-피리딘-3-일, 트리플루오로메틸피리딘-3-일, 페닐피리딘-3-일, 피리다진-4-일, 피리다진-3-일, 피라다진-2-일, 피리미딘-2-일, 피리미딘-4-일, 피리미딘-5-일, 메틸피리미딘-5일, 5-플루오로피리미딘-2-일, 2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일, 2-사이클로프로필피리미딘-5-일, 피라진-2-일, 티오펜-2-일, 푸란-2-일, 옥사졸-2-일, 3-니트로페닐, 4-니트로페닐, 3-아미노페닐, 4-아미노페닐, 또는 4-디에틸아미노페닐일 수 있다.
일 구현예에서, R2는 H 또는 C1-6 알킬일 수 있다.
일 구현예에서, R3는 H, 카르복실, 메틸 카르복실, 에틸 카르복실, N-하이드록시 카르복스아미드 또는 카르복스아미드일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 입체이성질체는 광학이성질체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 입체이성질체는 (3R,6S)-광학이성질체일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 화합물은 표 2 및 표 3에 제시된 화합물들로부터 선택된 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 화합물은 BnH12003, BnH12017, BnH12045, BnH12046, BnH12047, BnH12048, BnH12051, BnH12053, BnH12057, BnH12058, BnH12064, BnH12066, BnH12067, BnH12071, BnH12072, BnH12078, BnH12085, BnH12086, BnH12088, BnH12089, BnH12090, BnH12091, BnH12092, BnH12093, BnH12095, BnH12097 및 BnH12098로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 화합물은 HDAC의 억제제일 수 있다. 다른 구현예에서, 상기 HDAC는 HDAC4일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 화합물은 시냅스 가소성을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 신경 장애 또는 신경 퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약 0.1 내지 약 3 μM의 농도로 뇌에 전달될 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 장애는 알츠하이머병일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 장애는 PTSD일 수 있다.
일 구현예에서, 상기 조성물은 제2 치료제를 추가로 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 제2 치료제는 솔라네주맙일 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 의약 또는 의약 제조용 용도가 제공된다.
일 구현예에 따르면, 상기 용도는 뇌 시냅스 가소성의 재활성화 또는 증가를 위한 것이다.
다른 구현예에 따르면, 상기 용도는 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 위한 것이다.
본 발명에 따른 화합물은 부작용없이 시냅스 가소성을 효과적으로 향상 또는 재활성화시킴으로써 신경퇴행성 질환, 신경퇴행성 병리, 신경정신병적 장애, 기억 상실, 인지 기능 장애/손상 및 소거 학습 장애와 같은 다양한 신경학적 장애에 대해 치료 효과를 발휘할 수 있다.
도 1a는 SH-SY5Y 세포에서 BnH12003의 투여(0, 0.1, 1, 10, 100 μM)에 반응한 세포 생존율의 측정 결과를 나타낸다.
도 1b는 293T 세포에서 BnH12003의 투여(0, 0.1, 1, 10, 100 μM)에 반응한 세포 생존율의 측정 결과를 나타낸다.
도 2a는 마우스 실험에서 삼투압 펌프(Os pump) 주입 부위를 나타낸다.
도 2b는 마우스 실험에서 패치 기록 부위를 나타낸다.
도 3a는 BnH12003의 투여(Os pump, 뇌실 주입, 3 μM)에 반응한 마우스 배럴 피질(제4층)에서의 흥분/억제 균형의 측정 결과를 나타낸다.
도 3b는 BnH12003의 투여(Os pump, 뇌실 주입, 3 μM)에 반응한 마우스 배럴 피질(제4층)에서의 TC EPSC 포텐시의 변화를 나타낸다.
도 4a는 BnH12003의 복강내 투여(25 mg/kg)에 반응한 마우스 배럴 피질(제4층)에서의 흥분/억제 균형을 측정한 결과를 나타낸다.
도 4b는 BnH12003의 복강내 투여(25 mg/kg)에 반응한 마우스 배럴 피질(제4층)에서의 TC EPSC 포텐시의 변화를 나타낸다.
도 5는 BnH12003의 투여(Os pump, 배럴 피질 주입)에 반응한 마우스 배럴 피질(제4층)에서의 HDAC4 단백질 발현량 변화를 측정한 결과를 나타낸다.
도 6는 BnH12003의 복강내 투여(25 mg/kg)에 반응한 외상후 스트레스 장애의 설치류(래트) 모델에서의 증상의 개선 정도를 나타낸다.
도 7a는 BnH12003 및 솔라네주맙의 투여(Os pump; 3 μM, 200 μg)에 반응한 알츠하이머 마우스 모델의 해마에서의 필드 흥분성 시냅스후 전위(field excitatory postsynaptic potential, fEPSP)의 입력/출력 곡선(I/O 곡선) 변화를 나타낸다.
도 7b는 BnH12003 및 솔라네주맙의 투여(Os pump; 3 μM, 200μg)에 반응한 알츠하이머 마우스 모델의 해마에서의 필드 흥분성 시냅스후 전위의 LTP 측정 결과를 나타낸다.
도 8a는 BnH12003 및 솔라네주맙의 투여(측뇌실, Os pump; 3 μM, 200μg) 투여에 반응한 알츠하이머 마우스 모델의 배럴 피질(제4층)에서의 흥분/억제 균형을 측정한 결과를 나타낸다.
도 8b는 BnH12003 및 솔라네주맙의 투여(Os pump; 3 μM, 200 μg)에 반응한 알츠하이머 마우스 모델의 배럴 피질(제4층)에서의 TC EPSC 포텐시의 변화를 나타낸다.
도 9는 HDAC4로의 BnH12003의 결합 특성을 나타낸다.
도 10a 및 도 10b는 인간 세포주 SH-SY5Y에서 HDAC4, BDNF 및 GluN2B 발현에 대한 HDAC4 shRNA의 녹다운 효과를 나타낸다.
도 11a 내지 도 11c는 BDNF 및 GluN2B의 발현에 대한 BnH12003의 효과를 나타낸다.
도 12a 및 도 12b는 HDAC4 발현에 대한 BnH12003의 시간 경과에 따른 효과를 나타낸다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 구현예에 관하여 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 본 발명을 설명하면서 제시된 용어는 달리 나타내지 않는 한, 일반적으로 그의 통상적인 의미로 이해되어야 하며, 그 용어가 정의된 발명의 태양 또는 구현예뿐만 아니라 본 명세서에 사용된 동일한 용어에 모두 적용된다.
본 발명의 상세한 설명 전체에 걸쳐, 조성물 및 키트가 특정 구성요소를 갖거나 포함하는 것으로 기술되는 경우, 언급된 구성요소로 본질적으로 구성되거나 이로 구성된 본 발명의 조성물 및 키트가 추가적으로 존재하는 것으로 고려된다.
요소 또는 구성요소가 언급된 요소 또는 구성요소의 목록에 포함되고/포함되거나 선택되는 것으로 일컬어지는 적용에서, 그 요소 또는 구성요소는 언급된 요소 또는 구성요소 중 임의의 하나일 수 있거나 그 요소 또는 구성 요소는 언급된 요소 또는 구성 요소로 이루어진 군에서 선택될 수 있는 것으로 이해해야 한다.
특정 동작들을 수행하기 위한 단계들의 순서 또는 순서는 본 발명이 작동 가능한 상태로 유지되는 한 중요하지 않음을 이해해야 한다. 더욱이, 둘 이상의 단계 또는 동작은 동시에 수행될 수 있다.
본 명세서의 여러 곳에서, 변수 또는 매개변수는 군 또는 범위로 개시된다. 상세한 설명은 그러한 군 및 범위의 모든 개별 구성원을 포함하도록 특별히 의도되었다.
본 명세서에서 사용 예 또는 예시적인 표현, 예를 들어 "~와 같은" 또는 "~을 포함하는"은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며, 청구되지 않는 한 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 표현도 임의의 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실시에 필수적인 것임을 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
I. 정의
단수 용어는 문맥이 부적절하지 않은 한 복수의 형태(즉, 적어도 하나)를 또한 지칭하는 것으로 본 명세서에서 사용된다.
"및/또는"은 달리 표시되지 않는 한 "및" 또는 "또는"을 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다.
"적어도 하나"는 문맥 및 용법으로부터 달리 이해되지 않는 한 그 표현 뒤에 언급된 대상 각각 그리고 언급된 대상 중 둘 이상의 다양한 조합을 개별적으로 포함한다.
"포함한다", "포함하고", "포함하는", "갖다", "갖고", "갖는", "함유한다", "함유하고" 또는 "함유하는"(그의 문법적 등가물을 포함함)은 일반적으로 개방형이고 비제한적인 것으로 이해해야 하며, 예를 들어, 문맥으로부터 달리 구체적으로 명시되거나 이해되지 않는 한, 추가적인 언급되지 않은 요소 또는 단계를 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
"약"은 대략, 부근, 거의 또는 ~쯤을 의미한다. "약"이라는 용어가 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이는 명시된 수치의 앞뒤 경계를 확장함으로써 그 범위를 수정한다. 일반적으로, "약"이라는 용어는 본 명세서에서 10%의 변동량으로 명시된 값의 앞뒤로 수치를 수정하는 데 사용된다.
"개체", "환자" 및 "대상"은 상호 교환적으로 사용되며, 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 기타 설치류, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 소, 양, 말 또는 인간을 포함한 영장류)을 비롯한 임의의 동물을 포함한다.
"치료한다", "치료하는" 또는 "치료"는, 질환, 질병, 장애 등의 개선을 가져오는, 경감, 감소, 조절, 호전, 완화 또는 제거, 또는 그 증상의 개선과 같은 임의의 효과를 포함한다. 치료는 장애를 치유하거나, 개선하거나, 적어도 부분적으로 호전시키는 것일 수 있다. 특정 구현예에서, 치료는 질병을 치유하는 것이다.
"활성제"는 생물학적 활성을 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 나타내기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, "활성제"는 약학적 유용성을 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이다. 예를 들어, 활성제는 항신경퇴행 치료제일 수 있다.
"화합물"은 본 명세서에 기재된 화학식으로 표시되는 구조를 갖는 화학물질, 이의 입체이성질체(입체이성질체 혼합물 포함) 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 의미한다.
"약학적으로 허용되는"은 동물 또는 인간에게 적절하게 투여될 때 유해 반응, 알레르기 반응 또는 기타 이상 반응을 일으키지 않는 분자 엔티티(entity) 및 제형을 포함한다.
"약학적으로 허용되는 염"은 유리 염기 또는 유리 산의 생물학적 효과 및 성질을 보유한 이들의 염을 지칭한다. 예컨대, 약학적으로 허용가능한 염은 유리 산에 무기 염기 또는 유기 염기를 첨가하여 제조될 수 있다. 무기 염기로부터 유래된 염은 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘 염 등을 포함하나 이들로 국한되지 않는다. 유기 염기로부터 유래된 염은 1급, 2급, 및 3급 아민, 자연적으로 발생하는 치환된 아민을 포함하는 치환된 아민, 고리형 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 다이에틸아민, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민, 에탄올아민, 다이에틸아민, 리신, 아르기닌, N-에틸피페리딘, 피페리딘, 피페라진 등을 포함하나 이들로 국한되지 않는다.
"약학적으로 허용되는 부형제" 및 "약학적으로 허용되는 담체"는 대상에 대한 활성제의 투여 및 대상에 의한 흡수를 보조하는 물질을 지칭하며, 환자에게 현저하게 유해한 독성학적 효과를 야기하지 않으면서 본 발명의 조성물에 포함될 수 있다. 약학적으로 허용되는 부형제의 비제한적 예에는 물, NaCl, 생리 식염수, 유산화 링거(lactated Ringer's), 정상 수크로오스, 정상 글루코오스, 결합제, 충전제, 붕해제, 윤활제, 코팅제, 감미료, 향료, 염 용액(예를 들어, 링거 용액), 알코올, 오일, 젤라틴, 탄수화물, 예를 들어 락토오스, 아밀로오스 또는 전분, 지방산 에스테르, 하이드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리딘, 착색제 등이 포함된다. 그러한 제제는 멸균될 수 있으며, 요망되는 경우, 본 발명의 화합물과 유해하게 반응하지 않는, 보조제, 예를 들어 윤활제, 방부제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 및/또는 방향족 물질 등과 혼합될 수 있다. 당업자는 다른 약학적 부형제가 본 발명에 유용하다는 것을 인식할 것이다.
예시적인 약제학적으로 허용되는 담체 또는 이의 구성요소는 당, 예컨대 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로오스 및 이의 유도체, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스, 및 메틸 셀룰로오스; 분말 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 활석; 고형 윤활제, 예컨대 스테아르산 및 스테아르산마그네슘; 황산칼슘; 합성 오일; 식물성 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 참기름, 올리브유, 및 옥수수유; 폴리올, 예컨대 프로필렌글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 및 폴리에틸렌 글리콜; 알긴산; 인산염 완충액; 유화제, 예를 들어 TWEENs®; 습윤제, 예컨대 라우릴황산나트륨; 착색제; 향미제; 타정제; 안정제; 산화방지제; 방부제; 발열원이 없는 물; 등장 식염수; 및 인산염 완충액이다.
"약학 조성물" 또는 "약학 제형"은 활성제와 비활성이거나 활성인 담체의 조합물을 지칭한다.
"유효량"은 유리하거나 요망되는 결과를 달성하기에 충분한 화합물 또는 조성물(예를 들어, 본 발명의 화합물 또는 조성물)의 양을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여, 적용 또는 투여량으로 투여될 수 있으며, 특정 제형 또는 투여 경로에 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
"투여"는 대상으로의 경구 투여, 좌약으로서의 투여, 국소 접촉, 정맥내, 비경구, 복강내, 근육내, 병변내, 척수강내, 두개내, 뇌실내, 비강내 또는 피하 투여, 또는 서방성 장치, 예를 들어 미니-Os 펌프의 이식을 의미한다. 투여는 비경구 및 경점막(예를 들어, 협측, 설하, 구개, 치은, 비강, 질, 직장 또는 경피)을 포함하는 임의의 경로에 의해 이루어진다. 비경구 투여는, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 동맥내, 피내, 피하, 복강내, 뇌실내 및 두개내 투여를 포함한다. 다른 전달 방식에는 리포솜 제형, 정맥내 주입, 경피 패치 등의 사용이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. "공동 투여" 또는 "병용 투여"는 본 명세서에 기재된 조성물이 하나 이상의 추가 요법(예를 들어, 항암제, 화학요법제, 또는 신경퇴행성 질환 치료제)의 적용과 동시에, 그 직전에, 또는 그 직후에 투여되도록 의도된다. 본 발명의 화합물은 환자에게 단독으로 투여되거나 공동 투여될 수 있다. 공동 투여는 화합물을 개별적으로 또는 조합하여(하나 이상의 화합물 또는 제제) 동시 또는 순차적 투여를 포함하도록 의도된다. 따라서, 제제는 요망되는 경우 (예를 들어, 대사 분해를 감소시키기 위해) 다른 활성 물질과 또한 조합될 수 있다.
본 발명의 약학적 제형은 포유동물, 예컨대 인간에게 투여될 수 있지만, 또한 다른 포유동물, 예컨대 수의학적 치료가 필요한 동물, 예를 들어, 가축(예를 들어, 개, 고양이 등), 농장 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 등) 및 실험 동물(예를 들어, 래트, 마우스, 기니피그 등)에게 투여될 수 있다.
대상의 "인지 기능"은 지적 활동 또는 작용으로 정의될 수 있다. 지적 활동 또는 작용의 예에는 주의력, 처리 속도, 학습 및 기억력, 실행 기능, 언어 유창성 및 작업 기억이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 인지 기능이 손상된 대상에서 하나 이상의 지적 활동 또는 작용을 개선하는 경우 인지 기능을 개선할 수 있다.
"히스톤 데아세틸라제" 또는 "HDAC"는 단백질(예를 들어, 히스톤 또는 튜불린)의 라이신 잔기의 ε-아미노 그룹에서 Nε-아세틸 그룹을 제거하는 효소 패밀리 중 어느 하나를 지칭하도록 의도된다. 문맥상 달리 표시되지 않는 한, "히스톤"이라는 용어는 임의의 종으로부터의 H1, H2A, H2B, H3, H4 및 H5를 비롯한 임의의 히스톤 단백질을 지칭한다.
"HDAC에 의해 매개되는 질환 또는 장애" 또는 "히스톤 데아세틸라제에 의해 매개되는 질환 또는 장애"는 HDAC 및/또는 HDAC의 작용이 예를 들어 발병, 진행 또는 발현에 중요하거나 필요한 질환 또는 장애를 지칭한다.
"HDAC 효소 활성 억제" 또는 "HDAC 억제"는 HDAC의 촉매 활성을 감소시키거나 촉매 활성과 관련이 없는 HDAC의 활성을 감소시키는 것을 의미한다.
"신경학적 장애"에는 신경퇴행성 질환, 신경 정신 장애, 기억 상실, 인지 기능 장애/손상, 소거 학습 장애가 포함된다.
"신경퇴행성 질환"은 새로운 뉴런의 생성을 자극하는 제제로 역전되거나, 저지되거나, 관리되거나, 치료되거나, 개선되거나, 제거될 수 있는 임의의 장애를 의미한다.
"기억"은 과거의 사건이나 지식에 대한 정보를 복구하는 능력을 지칭한다.
"연령 관련 기억 상실"은 본 명세서에 추가로 정의된 바와 같이 및/또는 문헌[Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders: 4th Edition of the American Psychiatric Association (DSM-IV, 1994)]에 정의된 바와 같이 치매 수준까지 상승하지 않는 신경학적 기능의 악화를 특징으로 하는 상태들의 임의의 연속체를 지칭한다.
"상해 관련 기억 상실"은 뇌 손상이 있고 신경학적 손상이 또한 있을 수 있는 기억 상실을 지칭한다.
"손상된 인지 기능"은 연령 일치 정상 대상에서 관찰되는 것만큼 강건하지 않은 인지 기능을 지칭하며, 인지 기능이 저하된 상태를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "알킬"은, 달리 명시되지 않는 한, 일반적으로 C1 내지 C10의 포화된 선형, 분지형, 또는 고리형인 1차, 2차, 또는 3차 탄화수소를 지칭하며, 구체적으로 메틸, CF3, CCl3, CFCl2, CF2Cl, 에틸, CH2CF3, CF2CF3, 프로필, 이소프로필, 사이클로프로필, 부틸, 이소부틸, sec부틸, t-부틸, 펜틸, 사이클로펜틸, 이소펜틸, 네오펜틸, 헥실, 이소헥실, 사이클로헥실, 사이클로헥실메틸, 3-메틸펜틸, 2,2-디메틸부틸, 및 2,3-디메틸부틸을 포함한다. 이 용어는 치환된 및 비치환된 알킬기를 모두 포함하고, 특히 할로겐화 알킬기를 포함하고, 더욱 특히 플루오르화 알킬기를 포함한다. 알킬기를 치환할 수 있는 모이어티의 비제한적인 예는, 당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Second Edition, 1991]에 교시된 바와 같이, 필요에 따라 비보호되거나 보호된, 할로겐(플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 또는 포스포네이트로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "아릴"은 달리 명시되지 않는 한, 6 내지 14개 탄소 원자를 포함하는 방향족 단환 또는 다환 시스템을 지칭하며, 구체적으로 페닐, 바이페닐, 또는 나프틸, 바람직하게는 페닐을 포함한다. 이 용어는 치환된 및 비치환된 모이어티를 모두 포함한다. 아릴기는, 당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Second Edition, 1991]에 교시된 바와 같이, 필요에 따라 비보호되거나 보호된, 할로겐(플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 사이클로알킬, 알콕시, 아릴옥시, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 또는 포스포네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 기재된 모이어티로 치환될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 "헤테로아릴"은, 달리 명시되지 않는 한, 5개 내지 14개 고리 원자를 갖고 고리 원자 중 1개 내지 4개가 독립적으로 O, N 또는 S이고 나머지 고리 원자가 탄소 원자인 방향족 단환 또는 다환 시스템을 지칭하며, 바람직하게는 5개 또는 6개 고리 원자를 갖고 고리 원자 중 1개 내지 4개가 독립적으로 O, N 또는 S이고 나머지 고리 원자가 탄소 원자인 방향족 단환 시스템일 수 있고, 구체적으로 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 피롤릴, 푸라닐, 티오페닐, 이미다졸릴 또는 옥사졸릴을 포함한다. 헤테로아릴기는, 당업자에게 알려져 있는 바와 같이, 예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 문헌[Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, Second Edition, 1991]에 교시된 바와 같이, 필요에 따라 비보호되거나 보호된, 할로겐(플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도), 하이드록실, 아미노, 알킬아미노, 아릴아미노, 사이클로알킬, 알콕시, 아릴옥시, 티올, 니트로, 시아노, 설폰산, 설페이트, 포스폰산, 포스페이트, 또는 포스포네이트로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 기재된 모이어티로 치환될 수 있다.
II. 활성 화합물
본 발명의 일 태양에서, 하기 화학식 (1)의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염이 제공된다:
상기 식에서,
R1은 아릴 또는 헤테로아릴이거나, 이웃하는 페닐기와 결합하여 포화되거나 부분적으로 포화된 헤테로고리를 형성하고, 상기 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로 고리 중의 하나 이상의 수소 원자는 비치환되거나, 할로겐 원자, C1-6 알킬, C3-12 사이클로알킬, C1-6 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아미노 또는 니트로로 치환되고, 상기 치환기는 비치환되거나 다시 하나 이상의 할로겐 원자 또는 C1-6 알킬로 치환되고,
R2는 수소, C1-6 알킬 또는 아릴이고,
R3는 수소, 카르복실, N-하이드록시 카르복스아미드 또는 카르복스아미드이고, 상기 기 중의 수소는 비치환되거나 C1-6 알킬로 치환될 수 있고,
n은 0 또는 1이고,
m은 0 내지 6이다.
일 구현예에서, 포화되거나 부분적으로 포화된 헤테로 고리는 9개 내지 12개의 고리 원자를 갖고 고리 원자 중 1개 이상(바람직하게는 1개 또는 2개)가 독립적으로 O, N 또는 S이고 나머지 고리 원자는 탄소 원자인 이환 고리일 수 있다.
일 구현예에서, 입체이성질체는 광학이성질체일 수 있다. 바람직하게, 화합물은 (3R,6S)-광학이성질체 또는 (3S,6R)-광학이성질체 형태일 수 있다.
일 구현예에서, R1은 페닐, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 푸라닐, 티오페닐, 피롤릴, 이미다졸릴 또는 옥사졸릴이거나, 이웃하는 페닐기와 결합하여 퀴녹살리닐 또는 디하이드로벤조디옥시닐을 형성할 수 있다.
일 구현예에서, R1 중 하나 이상의 수소 원자는 비치환되거나, 할로겐 원자, C1-6 알킬, C3-12 사이클로알킬, C1-6 알콕시, 아릴(바람직하게는 페닐), 헤테로아릴(바람직하게는, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피롤릴, 푸라닐, 티오페닐, 이미다졸릴, 또는 옥사졸릴), 아미노 또는 니트로로 치환될 수 있고, 상기 치환기는 다시 할로겐 원자 및 C1-6 알킬로부터 선택된 하나 이상의 기로 치환될 수 있다.
일 구현예에서, R1 중 하나 이상의 수소 원자는 할로겐 원자, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되거나 치환되지 않은 C1-6 알킬 또는 C3-12 사이클로알킬, C1-6 알콕시, 페닐, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 하나 이상의 C1-6 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 아미노, 또는 니트로로 치환될 수 있다.
일 구현예에서, R1은 페닐, 비페닐, 피리딘-4-일, 피리딘-3-일, 피리딘-2-일, 메틸피리딘-3-일, 6-메톡시-피리딘-3-일, 6-사이클로프로필-피리딘-3-일, 트리플루오로메틸피리딘-3-일, 페닐피리딘-3-일, 피리다진-4-일, 피리다진-3-일, 피라다진-2-일, 피리미딘-2-일, 피리미딘-4-일, 피리미딘-5-일, 메틸피리미딘-5일, 5-플루오로피리미딘-2-일, 2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일, 2-사이클로프로필피리미딘-5-일, 티오펜-2-일, 푸란-2-일, 옥사졸-2-일, 3-니트로페닐, 4-니트로페닐, 3-아미노페닐, 4-아미노페닐, 또는 4-디에틸아미노페닐일 수 있다.
일 구현예에서, R1은 페닐기의 3번 또는 4번 위치에서 치환될 수 있다.
일 구현예에서, R2는 H 또는 C1-6 알킬일 수 있다.
일 구현예에서, R3는 H, 카르복실, 메틸 카르복실, 에틸 카르복실, N-하이드록시 카르복스아미드 또는 카르복스아미드일 수 있다.
일 구현예에서, m은 0 내지 3일 수 있다. 다른 구현예에서, m은 0 또는 1일 수 있다.
일 구현예에서, 화학식 (1)의 화합물은 이의 약학적으로 허용되는 염 형태로 제공될 수 있다. 바람직하게, 상기 염은 나트륨 염일 수 있다.
일 구현예에서, 화학식 (1)의 화합물에는 하기 표 1에 제시된 화합물이 포함되지만, 이에 제한되지 않는다:
[표 1]
일례에서, 본 명세서에 기재된 화합물 및 조성물은 HDAC의 억제제일 수 있다. 바람직하게는, HDAC는 HDAC4이다.
다른 측면에서, 본 명세서에 기재된 화합물 및 조성물은 시냅스 가소성 조절제이다. 바람직하게, 시냅스 가소성은 뇌의 배럴 피질(예컨대 제4층)에서의 시냅스 가소성이다.
III. 약학 조성물
일반적으로, 본 명세서에 기재된 화합물은 당업자에게 잘 알려진 기법을 이용하여 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 약물 조성물 중 활성 화합물의 농도는 약물의 흡수, 불활성화 및 배출 속도뿐만 아니라 당업자에게 알려진 기타 인자에 따라 달라질 것이다. 투여량 값은 또한 완화시키려는 질환의 중증도에 따라 달라질 것이라는 점에 유의해야 한다. 임의의 특정 대상에 대해, 특정 투여 요법은 개체의 필요 및 조성물을 투여하거나 그 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간 경과에 따라 조정되어야 하고, 본 명세서에 기재된 농도 범위는 예시일 뿐이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하려는 것이 아님을 추가로 이해해야 한다. 활성 성분은 한 번에 투여될 수 있거나 다양한 시간 간격으로 투여되도록 다수의 더 적은 용량으로 분할될 수 있다.
HDAC의 활성을 억제되지 않은 HDAC의 활성의 50%로 감소시키는 억제제의 농도가 IC50 값으로 결정된다. 일부 구현예에서, 그러한 HDAC의 감소는 적어도 50%, 예컨대 적어도 약 75%, 예를 들어, 적어도 약 90%이다. 일부 구현예에서, HDAC 활성은 적어도 95%, 예컨대 적어도 99% 감소된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 화합물은 100 나노몰 미만의 IC50 값을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 화합물은 100 나노몰 내지 1 마이크로몰의 IC50 값을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 화합물은 1 내지 25 마이크로몰의 IC50 값을 갖는다.
일부 구현예에서, 그러한 억제는 특이적이며, 즉, 히스톤 데아세틸라제 억제제는 또 다른 관련 없는 생물학적 효과를 생성하는 데 필요한 그 억제제의 농도보다 낮은 농도에서 단백질로부터 아세틸기를 제거하는 히스톤 데아틸라제의 능력을 감소시킨다. 일부 구현예에서, 히스톤 데아세틸라제 억제 활성에 필요한 억제제의 농도는 관련 없는 생물학적 효과를 생성하는 데 필요하는 농도보다 적어도 2배 더 낮고, 예컨대 적어도 5배 더 낮고, 예를 들어, 적어도 10배 더 낮고, 예컨대 적어도 20배 더 낮다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 약 25 mg, 약 50 mg, 약 75 mg, 약 100 mg, 약 150 mg, 약 200 mg, 약 250 mg, 약 300 mg, 약 350 mg, 약 400 mg, 약 450 mg, 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg, 약 900 mg, 약 1000 mg, 약 1250 mg, 약 1500 mg, 약 1750 mg, 약 2000 mg, 약 2250 mg, 약 2500 mg, 약 2750 mg, 또는 약 3000 mg의 화합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 약학 조성물은 요망되는 치료 효과를 얻기 위해 1일 1회 이상으로 일당 대상 체중 kg당 약 0.01 mg 내지 약 125 mg, 바람직하게는 약 1 mg 내지 약 50 mg을 포함한다.
특정 구현예에서, 조성물은 총 조성물 중량을 기준으로 예를 들어 0.0001 내지 99.9 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 50 중량%의 화합물을 포함한다. 함량비는 용매가 제거된 건조량을 기준으로 한 값이다.
특정 구현예에서, 조성물은 하나 이상의 화합물의 5%(w/v), 10%(w/v), 15%(w/v), 20%(w/v), 25%(w/v), 30%(w/v), 35%(w/v) 또는 40%(w/v) 수용액을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물의 유효량은 하나 이상의 화합물의 25%(w/v) 용액을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 약학적으로 허용되는 부형제는 희석제, 완충제, 보존제, 안정제, 가용화제 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 약학 조성물은 경구, 공동내, 피내, 근육내, 척추강내, 정맥내, 피하, 또는 뇌실내 투여에 적합한 액체 투여 형태로서의 투여를 위해 제형화될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 약학 조성물의 액체 투여 형태는 희석제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 비활성 희석제는 식염수이다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 약학 조성물의 액체 투여 형태는 완충제를 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기에 적합한 완충제는 유기산과 무기산 및 이들의 염 모두, 예를 들어 시트르산염 완충제(예를 들어, 시트르산일나트륨-시트르산이나트륨 혼합물, 시트르산-시트르산삼나트륨 혼합물, 구연산-구연산일나트륨 혼합물), 숙신산염 완충제(예를 들어, 숙신산-숙신산일나트륨 혼합물, 숙신산-수산화나트륨 혼합물, 숙신산-숙신산이나트륨 혼합물), 타르타르산염 완충제(예를 들어, 타르타르산-타르타르산나트륨 혼합물, 타르타르산-타르타르산칼륨 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물), 푸마르산염 완충액(예를 들어, 푸마르산-푸마르산일나트륨 혼합물, 푸마르산-푸마르산이나트륨 혼합물, 푸마르산일나트륨-푸마르산이나트륨 혼합물), 글루콘산염 완충제(예를 들어, 글루콘산-글루콘산나트륨 혼합물) , 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-글루콘산칼륨 혼합물), 옥살산염 완충제(예를 들어, 옥살산-옥살산나트륨 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-옥살산칼륨 혼합물 등), 락트산염 완충액(예를 들어, 락트산-락트산나트륨 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-락트산칼륨 혼합물 등) 및 아세트산염 완충액(예를 들어, 아세트산-아세트산나트륨 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 인산염 완충제, 히스티딘 완충제 및 트리메틸아민 염, 예컨대Tris가 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 약학 조성물의 액체 투여 형태는 보존제를 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기에 적합한 보존제는 페놀, 벤질 알코올, 메타-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤즈알코늄 할라이드(예를 들어, 클로라이드, 브로마이드, 및 요오다이드), 헥사메토늄 클로라이드 및 알킬 파라벤(예를 들어, 메틸 또는 프로필 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올, 및 3-펜탄올)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 약학 조성물의 액체 투여 형태는 안정제를 추가로 포함한다. 예를 들어, 적합한 안정제는 다가 당 알코올, 3가 이상의 당 알코올, 아미노산, 유기 당 또는 당 알코올, 폴리비닐피롤리돈 단당류, 삼당류, 다당류, 단백질, 황 함유 환원제, 아미노산 중합체 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 약학 조성물의 액체 투여 형태는 가용화제를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 가용화제는 이온성 계면활성제이다. 비이온성 계면활성제의 예에는 폴리소르베이트, 폴리옥사머, 플루로닉 폴리올, 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
특정 구현예에서, 본 명세서에 개시된 약학 조성물은, 조성물을 당업계에서 전형적으로 사용되는 임의의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정제(예를 들어, 완충화제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 비이온성 세제, 산화방지제 및 기타 다양한 첨가제)와 혼합함으로써 동결건조된 제형 또는 수용액으로서 보관을 위해 제조될 수 있다.
화합물을 경구 투여하는 경우, 이를 약학적으로 허용가능한 부형제와 함께 알약, 캡슐, 샤쉐, 정제 등으로 배합할 수 있다.
압축 정제는 임의적으로 결합체, 윤활제, 비활성 희석제, 보존제, 계면활성제 또는 분산제와 혼합한, 분말 또는 과립과 같은 자유 유동 형태의 활성 성분을 적합한 기계로 압축하여 제조할 수 있다. 성형 정제는 분말화된 활성 성분을 비활성 액체 희석제로 습윤화시킨 혼합물을 적합한 기계에서 성형하여 제조할 수 있다. 정제는 임의적으로 코팅되거나 자국을 낼 수 있고, 임의적으로 활성 성분의 느린 방출 또는 조절된 방출을 제공하도록 조제된다. 정제, 트로키, 로젠지, 수성 또는 오일 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 예컨대 젤라틴 캡슐, 시럽 또는 엘릭서는 경구용으로 제조할 수 있다. 경구용으로 의도된 본 발명의 화합물의 제형은 약학 조성물의 제조에 대해 당 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 제조할 수 있고, 이러한 조성물은 감미제, 방향제, 착색제 및 보존제를 비롯한 하나 이상의 제제를 함유하여 맛 좋은 제제를 제공할 수 있다. 활성 성분을 함유하는 정제는 정제의 제조에 적합한 비독성의 약학적으로 허용가능한 부형제와 혼합된 것이 적당하다. 이러한 부형제로는, 예컨대 비활성 희석제, 예컨대 탄산 칼슘 또는 탄산나트륨, 락토오스, 인산 칼슘 또는 인산 나트륨; 과립화 및 붕해제, 예컨대 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석일 수 있다. 정제는 비코팅되거나 또는 마이크로캡슐화를 비롯한 공지된 기술로 코팅하여 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시키고 장기간에 걸쳐 지속적인 작용을 제공할 수 있다. 예컨대, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 다이스테아레이트와 같은 시간 지연 물질을 단독으로 또는 왁스와 함께 사용할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 명세서의 약학 조성물은, 예컨대, 경구, 공동내, 피내, 근육내, 척추강내, 정맥내, 피하, 또는 뇌실내 투여에 의해 대상에게 투여된다.
IV. 생물학적 검정
본 발명에 유용한 화합물을 선택하는 방법이 본 명세서에 설명된다.
일 측면에서, 본 발명의 화합물은 HDAC와 상호작용하는 능력에 대해 선택된다. 일 구현예에서, HDAC는 HDAC4이다. 또 다른 구현예에서, 상기 HDAC로의 상기 화합물의 결합은 표면 플라즈몬 공명 검정에 의해 측정된다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 BnH12003이다.
일 측면에서, 화합물은 표적화된 뉴런에서 BDNF 및/또는 GluN2B의 발현을 증가시키는 능력에 대해 선택된다. 일 측면에서, 화합물은 표적화된 뉴런에서 BDNF의 발현을 증가시키는 능력에 대해 선택된다. 또 다른 구현예에서, 화합물은 표적화된 뉴런에서 GluN2B의 발현을 증가시키는 능력에 대해 선택된다. 일 구현예에서, RT-PCR을 사용하여 발현 수준을 측정한다. 일 구현예에서, BnH12003, BnH12017, BnH12045, BnH12046, BnH12047, BnH12048, BnH12051, BnH12053, BnH12057, BnH12058, BnH12064, BnH12066, BnH12067, BnH12071, BnH12072, BnH12078, BnH12085, BnH12086, BnH12088, BnH12089, BnH12090, BnH12091, BnH12092, BnH12093, BnH12095, BnH12097 또는 BnH12098이다. 다른 구현예에서, 상기 화합물은 BnH12003, BnH12046, BnH12057, BnH12067, BnH12091, BnH12092, BnH12095, BnH12097 또는 BnH12098이다.
일 측면에서, 본 발명의 화합물은 인간 세포에 대한 비독성에 대해 선택된다. 일 구현예에서, 본 발명의 화합물은 인간 세포주 SH-SY5Y의 세포 생존율에 유의한 영향을 미치지 않는 것에 대해 선택된다. 또 다른 구현예에서, 본 발명의 화합물은 인간 세포주 293T의 세포 생존율에 유의한 영향을 미치지 않는 것에 대해 선택된다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 약 0.1, 1, 10, 100 μM의 농도에서 SH-SY5Y 또는 293T의 세포 생존율을 낮추지 않는다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 표 4에 기재된 화합물로부터 선택된 하나일 수 있다. 바람직하게는 상기 화합물은 BnH12003이다.
일 측면에서, 본 발명의 화합물은 설치류 배럴 피질(제4층)에서 TC EPSC 포텐시를 통해 측정될 때 포텐시를 증가시키는 능력에 대해 선택된다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 뇌실 주입을 통해 Os 펌프에 의해 전달될 때 약 0.1 내지 약 5 μM의 농도에서 측정된 포텐시를 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 상기 농도는 약 0.1 내지 약 3 μM일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 농도는 약 3 μM일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 상기 농도는 약 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 mg/kg이다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 BnH12003이다. 또 다른 구현예에서, 상기 화합물은 복강내 주입을 통해 전달되며, 이때 상기 화합물은 BnH12003이다. 또 다른 구현예에서, 상기 복강내 주입은 약 25 mg/kg의 화합물을 전달한다.
일 측면에서, 본 발명의 화합물은, 단독으로 또는 아밀로이드 베타 펩타이드에 대한 단일클론 항체와 함께, 알츠하이머 설치류 모델의 해마에서 필드 흥분성 시냅스후 전위(fEPSP)의 I/O 기울기(ms-1)를 증가시키는 능력에 대해 선택된다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 아밀로이드 베타 펩티드에 대한 모노클로날 항체와 함께 화합물 및 항체 각각에 대해 약 3 μM, 200 μg의 속도로 Os 펌프를 통해 투여될 때 I/O 기울기를 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 상기 모노클로날 항체는 솔라네주맙이다. 또 다른 구현예에서, 상기 화합물들은 BnH12003 및 솔라네주맙이다.
일 측면에서, 본 발명의 화합물은 아밀로이드 베타 펩티드에 대한 모노클로날 항체와 조합하여 알츠하이머 설치류 모델의 해마에서 fEPSP 기울기의 LTP를 증가시키는 능력에 대해 선택된다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 아밀로이드 베타 펩티드에 대한 모노클로날 항체와 함께 화합물 및 항체 각각에 대해 약 3 μM, 200 μg의 속도로 Os 펌프를 통해 투여될 때 fEPSP 기울기의 LTP를 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 상기 모노클로날 항체는 솔라네주맙이다. 또 다른 구현예에서, 상기 화합물은 BnH12003이다.
일 측면에서, 본 발명의 화합물은 알츠하이머 설치류 모델 배럴 피질(제4층)에서 TC EPSC 포텐시를 통해 측정할 때 포텐시를 증가시키는 능력에 대해 선택된다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 뇌실 주입을 통해 Os 펌프에 의해 전달될 때 약 3 μM의 농도에서 측정된 포텐시를 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 상기 화합물은 화합물이 아밀로이드 베타 펩티드에 대한 모노클로날 항체와 함께 전달될 때 TC EPSC 포텐시를 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 상기 모노클로날 항체는 솔라네주맙이다. 또 다른 구현예에서, 상기 솔라네주맙은 약 200 ㎍의 농도로 전달된다. 또 다른 구현예에서, 상기 화합물은 BnH12003이다.
일 측면에서, 본 발명의 화합물은 설치류 배럴 피질(제4층)에서 HDAC4의 발현을 감소시키는 능력에 대해 선택된다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 BnH12003이다.
일 측면에서, 본 발명의 화합물은 외상후 스트레스 장애의 증상을 감소시키는 능력에 대해 선택된다. 일 구현예에서, 상기 선택은 설치류가 환경 신호에 대해 프리즈(freeze)하도록 조건화된 외상후 스트레스 장애의 설치류 모델의 프리징(freezing) 백분율을 측정함으로써 수행된다. 일 구현예에서, 상기 화합물은 BnH12003이다.
본 발명의 화합물을 선택하는 데 유용한 방법의 상세한 예가 본 명세서에 설명되어 있다.
V. 화합물의 치료 용도
본 발명의 화합물은 적어도 하나의 HDAC 유형을 억제하는 데 유용할 수 있다. 일 측면에서, 본 명세서에 기재된 화합물은 치료학적으로 유용할 수 있는데, 이는 특정 HDAC가 고차 뇌 기능을 지배하는 생물학적 경로에 관여하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 따라서, 본원에 기재된 화합물은 뇌 병리가 HDAC와 연관되거나 이에 의해 매개되는 경우에 유용할 수 있다.
최근 보고서에는 신경 분화, 기억 형성, 약물 중독 및 우울증과 같은 중추 신경계(CNS) 기능에서 히스톤 아세틸화의 중요성이 자세히 설명되어 있다(문헌[Citrome, Psychopharmacol. Bull. 2003, 37, Suppl. 2, 74-88]; 문헌[Johannessen, CNS Drug Rev. 2003, 9, 199-216]; 문헌[Tsankova et al, 2006, Nat. Neurosci. 9, 519-525]).
신경학적 장애는 중추 또는 말초 신경계 기능 장애를 구성 요소로 갖는 질환이다. 신경학적 장애는 발달 이상, 질병, 유전적 결함, 부상 또는 독소로 인해 신경계의 구조 또는 기능에 교란을 일으킬 수 있다. 이러한 장애는 중추 신경계(예를 들어, 뇌, 뇌간 및 소뇌), 말초 신경계(예를 들어, 뇌신경, 척수 신경, 및 교감 및 부교감 신경계) 및/또는 자율 신경계(예를 들어, 불수의적 작용을 조절하며 교감 신경계와 부교감 신경계로 나뉘는 신경계의 일부)에 영향을 미칠 수 있다.
따라서, 치료적 유효량의 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 화합물을 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상에서 HDAC에 의해 매개되는 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애를 치료하거나 예방하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 구현예에서, 본 명세서에 기재된 화합물은 부류 IIa HDAC의 활성을 조절하는 데 유용할 수 있다. 일부 구현예에서, 화합물은 HDAC4의 억제제이다.
대부분의 신경퇴행성 장애는 뇌에서의 뉴런 퇴화로 인해 발생한다. HDAC4를 포함하는 뉴런은 뇌에 널리 분포되어 있다(문헌[Mielcarek et al., 2013, PLoS Biol. 11:e1001717]; 문헌[Takase et al., 2013, PloS ONE 8:e58473]). 따라서, 뇌에서 HDAC4의 활성을 조절하는 본 발명과 같은 치료는 뇌의 임의의 신경퇴행성 질환에 유용할 수 있는데, 이는 본 발명에 의해 고려되는 개입 메커니즘(mechanism of intervention)은 관찰된 뇌의 병리와 상관없이 뉴런에서 HDAC4를 표적화할 수 있기 때문이다. 본 발명의 화합물이 유용하지 않을 신경퇴행성 질환은 있을 수 없다. 본 발명의 화합물은 뇌의 뉴런에서 HDAC4를 포함하는 분자 메커니즘의 현재 이해에 구속되지 않는다. 이와 같이, 본 발명의 화합물은 질병의 병리학적 징후에 의해 영향을 받는 뉴런이 HDAC4를 발현하는 한 임의의 만성 또는 급성 신경퇴행성 장애에 유용할 수 있다.
만성 신경퇴행성 장애의 예에는 다음이 포함된다: 만성 신경퇴행성 질환, 예를 들어 가족성 및 산발성 근위축성 측삭 경화증(각각 FALS 및 ALS), 가족성 및 산발성 파킨슨병, 헌팅턴병, 가족성 및 산발성 알츠하이머병, 다발성 경화증, 근이영양증, 올리브교소뇌 위축, 다계통 위축, 윌슨병, 진행성 핵상 마비, 미만성 루이소체병, 코르티코덴타토니그랄(corticodentatonigral) 변성, 진행성 가족성 근간대성 간질, 선조흑질 변성, 염전근이긴장증, 가족성 진전, 다운 증후군, 뚜렛 증후군, 할러보덴-스파츠성병, 당뇨병성 말초 신경병증, 권투선수 치매, AIDS 치매, 연령 관련 치매, 연령 관련 기억 손상, 및 아밀로이드증 관련 신경퇴행성 질환, 예를 들어 전염성 해면상뇌증과 관련된 프리온 단백질(PrP)에 의해 유발되는 질환(크로이츠펠트-야콥병, 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 증후군, 면양진전병(scrapie), 및 쿠루(kuru)), 및 과도한 시스타틴 C 축적으로 인한 질환(유전성 시스타틴 C 혈관병증). 급성 신경퇴행성 장애의 예에는 다음이 포함된다: 외상성 뇌 손상(예를 들어, 수술 관련 뇌 손상), 뇌부종, 말초 신경 손상, 척수 손상, 리이병(Leigh's disease), 길랑-바레 증후군, 리소좀 축적 장애, 예컨대 리포푸신증, 알퍼병, 하지불안증후군, CNS 변성으로 인한 현기증; 예를 들어, 청반 및 소뇌에서의 뉴런의 변성, 약물 유발 운동 장애를 비롯한 만성 알코올 또는 약물 남용으로 발생하는 병리; 인지 및 운동 장애로 이어지는 소뇌 뉴런 및 피질 뉴런의 변성을 비롯한 노화로 인해 발생하는 병리; 및 운동 장애로 이어지는 기저핵 뉴런의 변성을 비롯한 만성 암페타민 남용으로 발생하는 병리; 뇌졸중, 국소 허혈, 혈관 부전, 저산소-허혈성 뇌병증, 고혈당증, 저혈당증 또는 직접적인 외상과 같은 국소 외상으로 인한 병리학적 변화; 치료 약물 및 치료법의 부정적인 부작용으로 발생하는 병리(예를 들어, 글루타메이트 수용체의 NMD A 부류의 길항제의 항경련제 용량에 반응한 대상 및 내후각 피질 뉴런의 변성) 및 베르니케-코르사코프 관련 치매.
급성 또는 만성 퇴행성 장애에 더하여, 본 발명의 화합물은 영향을 받은 뉴런이 HDAC4에 의해 부분적으로 조절되는 한 다른 유형의 뇌 질환을 치료하는 데 유용할 수 있다. 이러한 질환의 예에는 다음이 포함된다: 인지, 치매, 사회적 행동, 불안, 또는 기타 인격 장애와 관련된 신경정신병적 장애, 예를 들어 정신분열증, 섬망, 주의력 결핍 장애(ADD), 양극성 장애, 강박 장애, 또는 섭식 장애; 공포 및 불안 장애, 예를 들어, 공황 장애, 다양한 공포증, 외상후 스트레스 장애(PTSD), 심인성 발기 부전, 또는 불면증; 다양한 형태의 중독; 및 기분 장애, 예컨대 우울증.
본 명세서에 기재된 화합물의 사용으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환의 유형은 뇌 질환으로 제한되지 않는다. 영향을 받은 뉴런이 HDAC4에 의해 조절되는 임의의 신경학적 질환은 잠재적으로 본 발명의 화합물로부터 이익을 얻을 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 알츠하이머병 및 PTSD는 병리학 및 질환의 공지된 원인이 크게 다르지만 본 명세서에 기재된 화합물의 처리로부터 이익을 얻었다. PTSD의 경우, BnH12003은 이로 처리되지 않은 공포-조건화(fear-conditioned) 설치류보다 훨씬 더 빠른 속도로 그러한 설치류를 외상으로부터 해방시켰다. 본 발명의 화합물로부터 이익을 얻을 수 있는 신경학적 질환의 예에는 다음이 포함된다: 변성 또는 손상으로 인한 말초 신경계 질환, 예를 들어 운동실조 또는 외상; 및 눈의 급성 또는 만성 퇴행성 질환, 예를 들어 녹내장.
영향을 받은 뉴런의 가소성이 HDAC4에 의해 부분적으로 조절되는 한, 기억 상실 또는 인지 기능 감소는 또한 본 발명의 화합물을 사용하는 처리로부터 이익을 얻을 수 있다. 이러한 장애의 예에는 다음이 포함된다: 기억 상실/손상, 창의성 행위, 문제 해결, 및 직관과 같은 인지 기능과 관련된 질환.
기억에는 단기 기억(작업 또는 최근 기억이라고도 지칭됨)과 장기 기억이 포함된다. 단기 기억은 최근의 사건을 포함하는 한편, 장기 기억은 더 먼 과거의 사건을 회상하는 것과 관련이 있다. 기억을 회상하는 능력을 평가하는 방법은 당업자에게 알려져 있고, 일상적인 인지 시험을 포함할 수 있다.
연령 관련 기억 상실은 대상이 젊었을 때에 비해 나이가 많을 때의 객관적인 기억 상실을 특징으로 하지만, 인지 시험 성적은 대상의 연령에 대해 정상 범위 내에 있다. 연령 관련 기억 상실 대상은 DSM-IV에 설명된 바와 같이 치매에 대한 표준화된 진단 시험에서 정상 범위 내의 점수를 얻는다. 더욱이, DSM-IV는 연령 관련 인지 저하라고 명명되는 질환에 대한 별도의 진단 기준을 제공한다. 연령 관련 기억 상실에는 뇌 무게 감소, 회전 위축(gyral atrophy), 뇌실 확장, 및 다양한 뇌 영역 내에서의 뉴런의 선택적 상실이 포함될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예를 위해, 더 진행성인 형태의 기억 상실이 또한 연령 관련 기억 장애의 정의에 포함된다. 따라서, 정상 연령 초과의 기억 상실 및 인지 장애를 갖고 있지만 프랭크(frank) 치매에 대한 진단 역치 미만의 점수를 받은 사람은 경도 신경인지 장애, 경도 인지 장애, 노년 건망증, 양성 노쇠 건망증, 초기 치매, 잠정 치매 등을 갖는 사람이라고 할 수 있다. 이러한 대상은 노년에 프랭크 치매에 걸릴 가능성이 약간 더 높을 수 있다(또한 미국 특허 출원 2006/008517 참조).
연령 관련 기억 상실과 관련된 증상에는, 장기 강화의 감소, 기억 및 학습의 감소에 의해 입증되는, IL-1 베타, IFN-감마, p-JNK, p-ERK와 같은 노화 중인 뇌와 관련된 생화학적 마커의 변경, 시냅스 가소성과 같은 시냅스 활성 또는 기능의 감소가 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 화합물은 IL-1 베타, IFN-감마, p-JNK, 또는 p-ERK의 활성을 조절한다.
기억을 향상시키는 방법에는 기억에 대한 접근 재설정과 기억 회복이 포함될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 접근 재설정이라는 용어는 기억 탐색을 증가시키는 것을 지칭한다. 작용 메커니즘에 구속되는 것은 아니지만, 본 발명의 화합물은 시냅스 망을 재설정함으로써 기억 탐색을 증가시키는 데 효과적인 것으로 여겨진다. 시냅스 망을 재설정하는 과정은 활성 뇌 시냅스 수의 증가 및/또는 뉴런 손실의 역전을 포함할 수 있다.
일부 경우에, 학습은 기억이라고 지칭된다. 학습은 기억력 향상과 달리 이전에 존재하지 않았던 새로운 기억을 생성하는 능력을 지칭한다. 일부 구현예에서, 대상의 오래된 기억을 회상하는 능력 보다는 학습 능력에 영향을 미치는 화합물의 능력을 시험하기 위해, 기억이 생성되기 전에 또는 그와 동시에 적어도 하나의 본 발명의 화합물이 투여된다. 일부 구현예에서, 이전에 생성된 기억의 회상에 영향을 미치는 화합물의 능력을 시험하기 위해, 기억이 생성된 후, 바람직하게는 기억이 상실된 후에 적어도 하나의 본 명세서에 기재된 화합물이 투여된다.
또한, 유효량의 적어도 하나의 본 명세서에 기재된 화합물을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 기억 상실을 앓고 있는 대상에서 학습 및 기억 형성을 향상시키는 방법이 제공된다. 이 방법은 정상 대상에서 학습 및 기억 형성을 향상시키는 데에도 동등하게 유용할 수 있다.
신경발생 또는 새로운 신경 세포의 탄생은 발달 중인 유기체에서만 발생하는 것으로 생각되었다. 그러나, 최근 연구에 따르면, 신경발생은 성인이 될 때까지 그리고 성인기 전체에 걸쳐 계속된는 것이 입증되었다. 진행 중인 신경발생은 유기체가 환경 변화에 적응할 수 있게 하고 평생에 걸쳐 학습 및 기억에 영향을 미치도록 하는 신경 가소성의 기초가 되는 중요한 메커니즘으로 생각된다. 일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물 또는 전구약물을 시냅스 밀도 증가가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 시냅스 밀도를 증가시키는 방법을 포함한다. 일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물 또는 전구약물을 시냅스 가소성 증가를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 시냅스 가소성을 증가시키는 방법을 포함한다. 일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염, 수화물, 용매화물 또는 전구약물을 뉴런의 수지상 밀도 증가가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 뉴런의 수지상 밀도를 증가시키는 방법을 포함한다.
본 발명은 기억 장애가 있는 대상에서 기억을 향상시키는 방법을 제공한다. 기억 장애 유형의 예에는 알츠하이머병, 건망증 프로세서(absent-minded professor), 건망증, 기억상실, 선행성 기억상실, 블랙아웃(blackout)(알코올 관련 기억상실), 브롬증, 아동기 기억상실, 거짓 기억 증후군, 둔주 상태(fugue state), 과잉기억, 코르사코프 증후군, 부분 기억상실, 기억불신 증후군, 기억 상실, 외상후 기억상실, 안면기억장애(prosopamnesia), 심인성 기억상실, 억압 기억, 역행성 기억상실, 리보의 법칙(Ribot' s Law), 선택적 기억 상실, 근원 기억상실, 근원-모니터링 오류, 기억의 7가지 원죄(seven sins of memory), 설단(tip of the tongue), 일과성 간질성 기억상실, 일과성 완전 기억상실, 및 반몽혼 수면(twilight sleep)이 포함된다.
일 구현예에서, 기억 장애는 알츠하이머병이다. 이러한 방법은 선택적으로 억제제를 투여하고 이전에 상실된 기억의 회복을 확인하는지 대상을 모니터링하는 것을 포함한다. 대상은 당업계에 알려진 일상적인 시험에 의해 모니터링될 수 있다.
다른 구현예에서, 알츠하이머 대상은 말기 알츠하이머병을 앓고 있는 대상이다. 알츠하이머병 치료를 위해 제안된 많은 화합물은 플라크 축적을 방지하여 질병의 초기 단계를 치료하도록 설계된 것이다. 본 발명의 화합물은 플라크 축적만을 방지하기 보다는 기억 및 인지를 개선하기 때문에 초기 및 말기 치매 모두를 치료하는 데 유용하다.
일 구현예에서, HDAC에 의해 매개되는 질환 또는 장애는 인지 기능 장애/손상이다. 따라서, 대상에게 유효량의 적어도 하나의 본 명세서에 기재된 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 인지 기능 장애/손상을 앓고 있는 대상에서 인지 기능을 촉진시키는 방법이 또한 제공된다. 본 발명은 또한 정상 대상에서 인지 기능을 촉진시키는 방법을 제공한다.
일부 경우에, 인지 기능은 연령이 일치하는 정상 대상에서 측정된 인지 기능과 비교하여 약 5%, 약 10%, 약 30% 또는 그 초과만큼 감소한다. 인지 기능은 임의의 검출 가능한 정도까지 촉진될 수 있지만, 인간의 경우, 바람직하게는 손상된 대상이 정상적인 생활의 일상 활동을 수행할 수 있을 정도로 충분히 촉진된다.
인지 기능은 인지 기능에 대한 하나 이상의 시험 또는 검정을 통해 평가될 수 있고, 그에 따라 선택적으로 정의될 수 있다. 인지 기능에 대한 시험 또는 검정의 비제한적 예에는 CANTAB(예를 들어, 문헌[Fray et al. "CANTAB battery: proposed utility in neurotoxicology. "Neurotoxicol Teratol 1996; 18(4):499-504] 참조), Stroop Test, Trail Making, Wechsler Digit Span, 또는 CogState 컴퓨터 인지 시험(또한 문헌[Dehaene et al. "Reward-dependent learning in neuronal networks for planning and decision making." Brain Res. 2000; 126:21729]; 문헌[Iverson et al. "Interpreting change on the WAIS-III/ WMS-I11 in clinical samples." Arch Clin Neuropsychol. 2001 ;16(2):183- 91]; 및 문헌[Weaver et al. "Mild memory impairment in healthy older adults is distinct from normal aging." Cogn. 2006;60(2): 146-55] 참조). 본 발명의 방법은 정상 대상에서 인지 기능을 촉진하거나, 인지 기능 장애가 있는 대상을 치료하고/치료하거나, 완화하고/완화하거나, 대상에서 인지 기능 장애를 예방하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 정상 대상은 인지 기능 손상과 관련된 장애로 진단되지 않은 대상이다.
일부 구현예에서, 인지 기능 장애 또는 손상은 알츠하이머병, 헌팅턴병, 발작 유발 기억 상실, 정신분열증, 루빈스타인 테이비 증후군, 레트 증후군, 취약 X 증후군, 루이소체 치매, 혈관성 치매, 양극성 장애 및 자폐 스펙트럼 장애(ASD)와 관련된 사회, 인지 및 학습 장애, 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 난독증, 학습 장애, 외상성 두부 손상, 뇌졸중 유발 인지 및 운동 장애, 외상성 뇌 손상, 신경변성 및 신경 손실 매개된 인지 장애, 및 주의력 결핍 장애와 관련되지만 이에 제한되지 않는다.
일부 구현예에서, 인지 기능 장애 또는 손상은 불안 장애, 조건화된 공포 반응, 공황 장애, 강박 장애, 외상후 스트레스 장애, 공포증, 사회 불안 장애, 물질 의존 회복 또는 연령 관련 기억 장애(AAMI), 및 연령 관련 인지 저하(ARCD)와 관련되지만 이에 제한되지 않는다.
HDAC 억제제인 소듐 부티레이트 또는 트리코스타틴 A의 투여가 마우스에서 공포 소멸을 촉진한다는 것이 입증되었고, 이러한 촉진은 일반적으로 사용되는 행동 조작에 의해 유발되는 것을 반영하며 맥락적 공포의 소멸에서 해마의 역할을 보여주는 다른 연구와 일치한다(문헌[Lattal, et al., 2007, Behav. Neurosci. 121, 5, 1125-1131]). 일 구현예에서, HDAC에 의해 매개되는 질환 또는 장애는 소거 학습 장애, 예를 들어, 공포 소거 결핍이다. 따라서, 소거 학습 장애를 앓고 있는 대상에게 유효량의 적어도 하나의 본 명세서에 기재된 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 소거 학습 장애를 치료하거나 예방하는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 화합물은 소거 학습의 심리적 과정을 촉진하는 데 사용될 수 있고, 그에 따라 신경정신병 장애 및 기타 관련 장애를 치료, 완화, 및/또는 예방하는 데 유용하다. 장기간으로 투여되고 불안의 생리학적 증상을 다루는 전통적인 항불안 약물과 달리, 본 발명의 화합물은 제2 요법, 예를 들어, 심리요법과 함께 장기간 또는 단기간으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 철저히 조사되지 않았지만, HDAC4는 면역 세포를 포함한 다른 세포 유형에서 유전자 발현을 매개한다. 본 발명의 화합물은 면역 세포 또는 암에서 발견되는 다른 유형의 세포에서 HDAC4를 포함하는 분자 메커니즘의 현재 이해에 구속되지 않는다. 이와 같이, 본 발명의 화합물은 과증식성 질환, 예를 들어, 다양한 기원의 악성 종양; 면역계 질환, 예를 들어, 자가면역 질환, 염증 또는 알레르기; 감염성 질환; 이식 거부; 및 섬유성 질환을 포함한 임의의 질환에 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, HDAC에 의해 매개되는 질환 또는 장애는 치료적 유효량의 적어도 하나의 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물을 대상에게 투여 시에 TNFα 또는 다른 면역 조절제로 공동 치료될 수 있는 면역 장애이다. 따라서, TNFα 또는 기타 면역 조절제로의 치료 전, 치료 동안 또는 치료 후 치료적 유효량의 적어도 하나의 본 명세서에 기재된 화합물을 면역 장애의 치료가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 HDAC에 의해 매개되는 면역 장애를 치료하는 방법이 또한 제공된다.
일부 구현예에서, HDAC에 의해 매개되는 질환 또는 장애는 다음과 같은 전구/줄기 세포 기반 요법에 의해 또한 치료될 수 있는 장애를 포함한다: 당뇨병 관련 장애(장기 부전, 간경변 및 간염); 뇌에서 전구 세포의 조절 장애와 관련된 중추 신경계(CNS) 장애(예를 들어, PTSD); 종양(예를 들어, 망막모세포종); 희소돌기아교세포 전구 세포에 영향을 미치는 장애(예를 들어, 성상세포종 및 뇌실막 세포 종양); 다발성 경화증; 백질 이영양증과 같은 탈수초 장애; 백질 손실과 관련된 신경병; 운동실조와 같은 소뇌 장애; 및 후각 전구체 장애(예를 들어, 후각상실 질환). 따라서, 전구/줄기세포 기반 요법으로의 치료 전, 치료 동안 또는 치료 후에 HDAC에 의해 매개되는 장애의 치료가 필요한 대상에게 치료적 유효량의 적어도 하나의 본 명세서에 기재된 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 HDAC에 의해 매개되는 장애를 치료하는 방법이 또한 제공된다.
일부 구현예에서, HDAC에 의해 매개되는 질환 또는 장애는 산화질소(NO) 조절과 관련된 혈압 장애(예를 들어, 고혈압, 발기 부전, 천식; 및 녹내장과 같은 안구 장애)를 포함한다. 따라서, HDAC에 의해 매개되는 산화질소(NO) 조절과 관련된 혈압 장애의 치료가 필요한 대상에게 치료적 유효량의 적어도 하나의 본 명세서에 기재된 화합물을 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 HDAC에 의해 매개되는 산화질소(NO) 조절과 관련된 혈압 장애를 치료하는 방법이 또한 제공된다.
일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 심장 비대 장애이다. 따라서, 치료적 유효량의 적어도 하나의 본 명세서에 기재된 화합물을 HDAC에 의해 매개되는 심장 비대 장애의 치료가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 HDAC에 의해 매개되는 심장 비대 장애를 치료하는 방법이 또한 제공된다.
일부 구현예에서, HDAC에 의해 매개되는 질환 또는 장애는 혈액학적 장애, 예컨대 지중해빈혈, 빈혈 및 겸상적혈구 빈혈을 포함한다. 따라서, 치료적 유효량의 적어도 하나의 본 명세서에 기재된 화합물을 HDAC에 의해 매개되는 혈액 장애의 치료가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 HDAC에 의해 매개되는 혈액 장애를 치료하는 방법이 또한 제공된다.
일부 구현예에서, HDAC에 의해 매개되는 질환 또는 장애는 전당뇨병 또는 당뇨병(유형 I 또는 II)과 같은 대사 질환을 포함한다. 따라서, 치료적 유효량의 적어도 하나의 본 명세서에 기재된 화합물을 HDAC에 의해 매개되는 당뇨병 전증 또는 당뇨병(I형 또는 II)과 같은 대사 질환의 치료가 필요한 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상에서 대사 질환을 치료하는 방법이 또한 제공된다.
일 측면에서, 본 발명은 HDAC에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상에서 HDAC에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료를 위한 제2 치료제를 추가로 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 제2 치료제는 HDAC, 바람직하게는 HDAC4에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 치료하도록 처방된다.
또한, HDAC에 의해 매개되는 질환 또는 장애를 앓고 있는 대상에서 HDAC에 의해 매개되는 질환 또는 장애의 치료 방법이 제공되며, 여기서 본 명세서에 기재된 적어도 하나의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 하나 이상의 추가 활성제와 함께 대상에게 투여된다.
일부 구현예에서, 제2 치료제는 도네페질, 리바스티그민, 갈란타민, 메만틴, 베루베세스타트, 솔라네주맙, 바피네우주맙, 아두카누맙, 레카네맙, 티데글루십, 에포틸론 D 및 ABBV-8E12로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 제2 치료제는 콜린에스테라제 억제제, NMDA 수용체 길항제, 타우 단백질을 표적으로 하는 인간화 항체, 아밀로이드 베타 단백질을 표적으로 하는 인간화 항체, 및 BACE 억제제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명에 포함되는 전형적인 치료법은 조합 요법을 포함한다. 예를 들어, 병용 요법은 약물요법(즉, 본 발명의 화합물) 및 행동 요법일 수 있다. 행동 요법에는 전기경련성 발작 요법, 운동, 그룹 요법, 대화 요법 또는 컨디셔닝(conditioning)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 또 다른 구현예에서, 행동 요법은 인지-행동 요법이다. 진행 중인 방법에 사용될 수 있는 행동 요법의 예는, 예를 들어, 그 전체가 본 명세서에 참고로 포함된 문헌[Cognitive-Behavioral Therapies by K. Dobson, ed., Guilford Publications, Inc., 2002] 및 문헌[The new Handbook of Cognitive Therapy: Basics and Beyond by Judith S.S. Beck, Guilford Publications, Inc. 1995]에 기재되어 있다. 당업자에 의해 학습 또는 컨디셔닝을 향상시키는 약리학적 제제로 인식되는 임의의 약학적 활성 성분이 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 고려되는 한 부류의 약학적 활성 성분은 뇌에서 노르에피네프린의 수준을 증가시키는 화합물을 포함한다. 이러한 화합물에는 노르에피네프린 재흡수 억제제로 작용하는 화합물, 예를 들어, 토목세틴, 레복세틴, 둘록세틴, 벤라팍신, 및 밀나시프란, 및 노르에피네프린의 방출을 유발하는 화합물, 예를 들어, 암페타민, 덱스트로암페타민, 페몰린 및 메틸페니데이트가 포함된다. 그러한 약학적 활성 성분의 또 다른 부류는 뇌에서 아세틸콜린의 수준을 증가시키는 화합물이며, 예를 들어 아세틸콜린 분해를 차단하는 화합물을 포함한다. 이러한 화합물의 예에는 콜린에스테라제 활성을 억제하는 도네페질 HCl 또는 AriceptTM 및 타크린(tacrine)이 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
조합 요법을 위한 방법은 대상을 조합 요법 프로토콜의 하나 이상의 세션에 적용하는 것을 포함할 수 있으며, 이때 조합 요법 프로토콜은 심리요법 세션과 함께 학습 또는 컨디셔닝을 향상시키는 치료적 유효량의 본 발명의 화합물의 단기 투여(acute administration)를 포함한다. 일 측면에서, 화합물로의 노출은 심리요법 세션을 시작하기 전 약 24시간 이내에, 바람직하게는 심리요법 세션을 시작하기 전 약 12시간 이내에, 더욱 바람직하게는 약 6시간 이내에 발생한다. 신경정신 장애 치료의 전체 과정은 적어도 한 세션의 이러한 조합 요법 프로토콜을 수반한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위해 제시된 것으로, 어떠한 방식으로든 이의 범위를 제한하려는 의도가 아니며, 제한하려는 것으로 해석되어서는 안 된다.
본 명세서에 기재된 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 얻는 방법은 당업자에게 명백할 것이며, 적합한 절차는 예를 들어 하기 제조예 및 본 명세서에 인용된 참고문헌에 기재되어 있다.
VI. 활성 화합물의 제조 방법
본 발명의 화합물을 합성하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 화합물 명칭 및 구조는 표 2 및 표 3에 제시된다.
[표 2]
[표 3]
본원에 기재된 본 발명의 화합물, 이의 약학적으로 허용되는 염, 또는 이의 입체이성질체를 수득하는 방법은 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 적절한 방법이 예시로 하기 제조예 및 실시예 및 본원에 인용된 참고문헌에 기재된다.
제조예
제조예 1. 대표적인 반응식 1에 따른 활성 화합물의 제조
[반응식 1]
(1) 화합물 BnH12036의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(퀴녹살린-6-일)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 메틸 (3R,6S)-6-메틸-1-(2-(퀴녹살린-6-일)아세틸)피페리딘-3-카르복실레이트의 합성
DMF(2.50mL) 중 2-(퀴녹살린-6-일)아세트산(100mg, 0.531mmol)의 용액에 메틸 (3R,6S)-rel-6-메틸-3-피페리딘카르복실레이트(87.7mg, 0.558mg), DIPEA(0.139mL, 0.797mmol), HOBt(86.2mg, 0.638mmol) 및 EDC·HCl(99.0mg, 0.638mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(5.00mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl(5.00mL) 및 염수(5.00mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM: MeOH = 0 내지 5%)로 정제하여, 요망되는 화합물(80.4mg, 46%)을 짙은 황색 오일로 얻었다.
단계 2: 화합물 BnH12036의 합성
THF(1.50mL) 중 메틸 (3R,6S)-6-메틸-1-(2-(퀴녹살린-6-일)아세틸)피페리딘-3-카르복실레이트(72.5mg, 0.221mmol)의 용액에 1N NaOH(0.332mL, 0.332mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(5.00 mL)로 희석하고, DCM(5.00 mL Х 2)으로 2회 세척하였다. 수성층을 0℃에서 pH 2 내지 3이 될 때까지 1N HCl로 산성화시키고, EtOAc(5.00 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(5.00mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여, 화합물 BnH12036(20.0 mg, 28 %)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.42 (s, 1H), 8.92 (d, J = 4.1 Hz, 2H), 8.04 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.94 (d, J = 23.0 Hz, 1H), 7.73 (dd, J = 14.3, 8.6 Hz, 1H), 4.76 (d, J = 8.4 Hz, 0.5H), 4.55 (dd, J = 13.5, 4.2 Hz, 0.5H), 4.36 (d, J = 8.9 Hz, 0.5H), 1.44 - 3.97 (m, 2.5H), 3.08 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.65 (t, J = 12.6 Hz, 0.5H), 2.29 - 2.17 (m, 1H), 1.83 - 1.78 (m, 1H), 1.73 - 1.62 (m, 1H), 1.56 - 1.54 (m, 2H), 1.10 (dd, J = 18.1, 6.9 Hz, 3H).
(2) 화합물 BnH12037의 합성
(3R,6S)-1-(2-(2,3-디히드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 메틸 (3R,6S)-1-(2-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실레이트의 합성
DMF(2.50mL) 중 2-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)아세트산(100mg, 0.515mmol)의 용액에 메틸 (3R,6S)-rel-6-메틸-3-피페리딘카복실레이트(85.0mg, 0.541mmol), DIPEA(0.135mL, 0.772mmol), HOBt(83.5mg, 0.618mmol) 및 EDC·HCl(95.9mg, 0.618mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(5.00mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (5.00mL) 및 염수(5.00mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM: MeOH = 0 내지 5%)로 정제하여, 요망되는 화합물(62.0 mg, 38%)을 짙은 황색 오일로 얻었다.
단계 2: 화합물 BnH12037의 합성
THF(2.00mL) 중 메틸 (3R,6S)-1-(2-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실레이트(135 mg, 0.405mmol)의 용액에 1N NaOH(0.607mL, 0.607mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(5.00 mL)로 희석하고, DCM(5.00 mL Х 2)으로 2회 세척하였다. 수성층을 0℃에서 pH 1 내지 2가 될 때까지 1N HCl로 산성화시키고, EtOAc(5.00 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(5.00mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여, 화합물 BnH12037 (90.0 mg, 69%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.36 (s, 1H), 6.78 - 6.61 (m, 3H), 4.71 (s, 0.5H), 4.51 (dd, J = 13.3, 4.3 Hz, 0.5H), 4.20 (s, 4H), 3.88 - 3.84 (m, 0.5H), 3.63 - 3.54 (m, 2H), 2.97 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.58 (t, J = 12.7 Hz, 0.5H), 2.18 - 2.09 (m, 1H), 1.81 - 1.75 (m, 1H), 1.69 - 1.59 (m, 1H), 1.50 - 1.43 (m, 2H), 1.03 (dd, J = 7.0, 3.4 Hz, 3H).
(3) 화합물 BnH12042의 합성
(3R,6S)-1-(2-([1,1'-바이페닐]-4-일)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 메틸 (3R,6S)-1-(2-([1,1'-바이페닐]-4-일)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실레이트의 합성
DMF(1.73mL) 중 4-바이페닐아세트산(110mg, 0.518mmol)의 용액에 메틸 (3R,6S)-rel-6-메틸-3-피페리딘카르복실레이트(85.6mg, 0.544mmol), DIPEA(0.135mL, 0.777mmol), HOBt(84.0mg, 0.622mmol) 및 EDC·HCl(96.6mg, 0.622mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(5.00mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (5.00mL) 및 염수(5.00mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:EtOAc = 3:1)로 정제하여, 요망되는 화합물 (145 mg, 79%)을 무색 오일로 얻었다.
단계 2: 화합물 BnH12042의 합성
THF(1.42mL) 중 메틸 (3R,6S)-1-(2-([1,1'-바이페닐]-4-일)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실레이트(145mg, 0.413mmol)의 용액에 1N NaOH(0.619mL, 0.619mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(3.00 mL)로 희석하고, DCM(3.00 mL Х 2)으로 2회 세척하였다. 수성층을 0℃에서 pH 1 내지 2가 될 때까지 1N HCl로 산성화시키고, EtOAc(3.00 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(3.00mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여, 화합물 BnH12042(120 mg, 86%)를 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.57 (dd, J = 10.6, 7.8 Hz, 4H), 7.43 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.33 (dd, J = 10.8, 7.6 Hz, 3H), 4.99 (s, 0.5H), 4.84 (d, J = 13.7 Hz, 0.5H), 4.22 (s, 0.5H), 3.96 (d, J = 13.8 Hz, 0.5H), 3.79 (s, 2H), 3.17 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.79 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.41 (s, 0.5H), 2.14 (s, 0.5H), 1.92 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 1.80 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 1.58 (d, J = 24.0 Hz, 2H), 1.15 (d, J = 6.8 Hz, 3H).
(4) 화합물 BnH12078의 합성
(3R,6S)-1-(2-([1,1'-바이페닐]-3-일)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 메틸 (3R,6S)-1-(2-([1,1'-바이페닐]-3-일)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실레이트의 합성
DMF(1.09mL) 중 3-바이페닐릴아세트산(70.0mg, 0.328mmol)의 용액에 메틸 (3R,6S)-rel-6-메틸-3-피페리딘카르복실레이트(54.2mg, 0.345mmol), DIPEA(0.086mL, 0.492mmol), HOBt(53.2mg, 0.394mmol) 및 EDC·HCl(61.2mg, 0.394mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(5.00mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (5.00mL) 및 염수(5.00mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:EtOAc = 2:1)로 정제하여, 요망되는 화합물(69.2mg, 60%)을 무색 오일로 얻었다.
단계 2: 화합물 BnH12078의 합성
THF(0.675mL) 중 (3R,6S)-1-(2-([1,1'-바이페닐]-3-일)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실레이트(69.2mg, 0.196mmol)의 용액에 1N NaOH(0.294mL, 0.294mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(3.00mL)로 희석하고, EtOac(3.00mL Х 2)로 2회 세척하였다. 수성층을 0℃에서 pH 1 내지 2가 될 때까지 1N HCl로 산성화시키고, EtOAc(3.00 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(3.00mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 10% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12078(50.0 mg, 76%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.43 (s, 1H), 7.63 (t, J = 6.1 Hz, 2H), 7.49 (dt, J = 15.4, 9.1 Hz, 4H), 7.39 (dt, J = 14.3, 7.5 Hz, 2H), 7.22 (dd, J = 16.7, 7.6 Hz, 1H), 4.75 (s, 0.5H), 4.54 (d, J = 13.6 Hz, 0.5H), 4.32 (s, 0.5H), 3.96 (d, J = 13.8 Hz, 0.5H), 3.89 - 3.72 (m, 2H), 3.03 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.62 (t, J = 12.7 Hz, 0.5H), 2.16 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 1.79 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 1.71 - 1.59 (m, 1H), 1.57 - 1.42 (m, 2H), 1.06 (t, J = 6.5 Hz, 3H).
(5) 화합물 BnH12080의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(4-(피리딘-3-일)벤조일)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 메틸 (3R,6S)-6-메틸-1-(4-(피리딘-3-일)벤조일)피페리딘-3-카르복실레이트의 합성
DMF(1.67mL) 중 4-(피리딘-3-일)벤조산(100mg, 0.502mmol)의 현탁액에 메틸 (3R,6S)-6-메틸피페리딘-3-카르복실레이트(82.9mg, 0.527mmol), DIPEA(0.132mL, 0.753mmol), HOBt(81.4mg, 0.602mmol) 및 EDC·HCl(93.5mg, 0.602mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(4.00mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (4.00mL) 및 염수(4.00ml)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM: MeOH = 0 내지 2%)로 정제하여, 요망되는 화합물(82.0mg, 48.3%)을 옅은 황색 오일로 얻었다.
단계 2: 화합물 BnH12080의 합성
THF(0.836mL) 중 메틸 (3R,6S)-6-메틸-1-(4-(피리딘-3-일)벤조일)피페리딘-3-카르복실레이트(82.0mg, 0.242mmol)의 용액에 1N NaOH(0.363mL, 0.363mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(5.00 mL)로 희석하고, DCM(5.00 mL Х 2)으로 2회 세척하였다. 수성층을 0℃에서 pH 3 내지 4가 될 때까지 1N HCl로 산성화시키고, EtOAc(5.00 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(5.00mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여, 화합물 BnH12080(47.0 mg, 59.8%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.47 (s, 1H), 8.95 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.62-8.60 (dd, J = 4.8, 1.6 Hz, 1H), 8.15-8.12 (m, 1H), 7.83-7.81 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.53-7.50 (dd, J = 7.9, 4.5 Hz, 3H), 2.45-2.34 (m, 2H), 1.92-1.88 (d, J = 15.5 Hz, 1.5H), 1.80-1.69 (dt, J = 20.7, 7.5 Hz, 2H), 1.57 (s, 1.5H), 1.21-1.18 (dd, J = 7.1, 2.8 Hz, 4H).
제조예 2. 대표적인 반응식 3에 따른 활성 화합물의 제조
[반응식 3]
단계 1: 메틸 (3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실레이트(화합물 3-1)의 합성
위 반응식 3의 첫 번째 단계를 수행하여 화합물 BnH12032를 얻었다. 이어서, 1,4-디옥산(15.6mL) 중 화합물 BnH12032(1.60g, 4.52mmol), 비스(피나콜라토)디보론(1.62 g, 4.97 mmol) 및 KOAc(1.33g, 13.6mmol)의 현탁액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링한 다음, Pd(dppf)Cl2(327mg, 0.447mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 100℃에서 17시간 동안 환류시켰다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, DCM(10.0 mL Х 3)으로 세척하였다. 합한 유기층을 H2O(40.0mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:EtOAc = 1:1)로 정제하여, 화합물 3-1(1.40g, 77%)을 갈색 오일로 얻었다.
(1) 화합물 BnH12043의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(피리딘-4-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12043의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.55mL) 중 화합물 3-1(235mg, 0.586mmol), 4-브로모피리딘(125mg, 0.644mmol) 및 Na2CO3(186mg, 1.76mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(42.9mg, 0.059mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각한 후, 1N NaOH(1.17 mL, 1.17 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(3.00mL)로 희석하고, DCM(3.00mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 4 내지 5로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(3.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 3% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12043(85.0mg, 42%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.65 - 8.59 (m, 2H), 7.76 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.71 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 7.37 (dd, J = 18.7, 7.9 Hz, 2H), 4.75 (s, 0.5H), 4.60 - 4.50 (m, 0.5H), 4.27 (d, J = 7.7 Hz, 0.5H), 3.92 (d, J = 13.7 Hz, 0.5H), 3.88 - 3.72 (m, 2H), 3.04 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.63 (d, J = 12.6 Hz, 0.5H), 2.24 - 2.12 (m, 1H), 1.79 (dt, J = 16.9, 5.7 Hz, 1H), 1.65 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 1.57 - 1.49 (m, 2H), 1.08 (dt, J = 11.7, 4.9 Hz, 3H).
(2) 화합물 BnH12044의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(피리딘-2-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12044의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.55mL) 중 화합물 3-1(235mg, 0.586mmol), 2-브로모피리딘(125mg, 0.644mmol) 및 Na2CO3(186mg, 1.76mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(42.9mg, 0.059mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분간 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.17 mL, 1.17 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(3.00mL)로 희석하고, DCM(3.00mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 4 내지 5로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(3.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 3% 내지 5% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12044(85.0mg, 42%)를 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.75 (d, J = 23.7 Hz, 1H), 7.89 (dd, J = 26.8, 7.9 Hz, 2H), 7.83 - 7.67 (m, 2H), 7.40 (dd, J = 16.2, 7.9 Hz, 2H), 7.26 (m, 1H), 4.97 (s, 0.5H), 4.81 (d, J = 13.9 Hz, 0.5H), 4.18 (s, 0.5H), 3.99 (d, J = 13.7 Hz, 0.5H), 3.83 (s, 2H), 3.13 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.80 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.40 (s, 0.5H), 2.02 (s, 0.5H), 1.88 (s, 1H), 1.81 - 1.69 (m, 1H), 1.62 - 1.40 (m, 2H), 1.14 (d, J = 6.4 Hz, 3H).
(3) 화합물 BnH12045의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(피리다진-4-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12045의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.47mL) 중 화합물 3-1(240mg, 0.598mmol), 4-브로모피리다진 하이드로브로마이드(158mg, 0.658mmol) 및 Na2CO3(190mg, 1.79mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(43.8mg, 0.060mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.20 mL, 1.20 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(3.00mL)로 희석하고, DCM(3.00mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 4 내지 5로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(3.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 5% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12045(65.0mg, 32%)를 분홍색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.48 (s, 1H), 9.23 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 7.65 (d, J = 8.1 Hz, 3H), 7.44 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 4.98 (s, 0.5H), 4.84 (d, J = 13.6 Hz, 0.5H), 4.21 (s, 0.5H), 3.94 (d, J = 14.9 Hz, 0.5H), 3.82 (s, 2H), 3.20 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.82 (s, 0.5H), 2.43 (s, 0.5H), 2.20 (s, 0.5H), 1.97 (d, J = 13.7 Hz, 1H), 1.81 (s, 1H), 1.62 (s, 2H), 1.24 - 1.13 (m, 3H).
(4) 화합물 BnH12046의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(피리딘-3-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12046의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.55mL) 중 화합물 3-1(235mg, 0.586mmol), 3-브로모피리딘(102mg, 0.644mmol) 및 Na2CO3(124mg, 1.17mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(42.9mg, 0.059mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.17 mL, 1.17 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(3.00mL)로 희석하고, DCM(3.00mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 4 내지 5로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(3.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 3% 내지 5% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12046(90.2mg, 45%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.41 (s, 1H), 8.89 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.56 (dd, J = 4.8, 1.6 Hz, 1H), 8.07 (dt, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.48 (dd, J = 7.9, 4.7 Hz, 1H), 7.35 (dd, J = 18.4, 7.8 Hz, 2H), 4.75 (s, 0.5H), 4.57 - 4.49 (m, 0.5H), 4.29 (s, 0.5H), 3.98 - 3.87 (m, 0.5H), 3.87 - 3.71 (m, 2H), 3.04 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.62 (t, J = 12.7 Hz, 0.5H), 2.20 (dq, J = 12.0, 8.1, 7.1 Hz, 1H), 1.80 (dd, J = 13.4, 3.9 Hz, 1H), 1.66 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 1.53 (s, 2H), 1.12 - 1.03 (m, 3H).
(5) 화합물 BnH12047의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(피라진-2-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12047의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.55mL) 중의 화합물 3-1(235mg, 0.586mmol), 2-브로모피라진(102mg, 0.644mmol) 및 Na2CO3(124mg, 1.17mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(42.9mg, 0.059mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.17 mL, 1.17 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(3.00mL)로 희석하고, DCM(3.00mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 1 내지 2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(3.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 3% 내지 5% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12047(76.0mg, 38%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.41 (s, 1H), 9.25 (d, J = 1.5 Hz, 1H), 8.71 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 8.60 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.10 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.39 (dd, J = 18.2, 7.9 Hz, 2H), 4.75 (s, 0.5H), 4.55 (dd, J = 13.6, 4.2 Hz, 0.5H), 4.28 (s, 0.5H), 3.97 - 3.89 (m, 0.5H), 3.89 - 3.74 (m, 2H), 3.04 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.63 (t, J = 12.7 Hz, 0.5H), 2.19 (tt, J = 12.0, 4.2 Hz, 1H), 1.79 (dd, J = 13.5, 3.9 Hz, 1H), 1.66 (h, J = 13.1, 10.8 Hz, 1H), 1.52 (dq, J = 8.8, 4.9, 4.2 Hz, 2H), 1.07 (dd, J = 9.1, 6.8 Hz, 3H).
(6) 화합물 BnH12048의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(피리미딘-2-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12048의 합성
MeCN/H2O(2:1, 5.47mL) 중 화합물 3-1(170mg, 0.424mmol), 2-브로모피리미딘(67.4mg, 0.424mmol) 및 Na2CO3(89.8mg, 0.847mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(31.0mg, 0.042mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(0.847 mL, 0.847 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(2.00mL)로 희석하고, DCM(3.00mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 1 내지 2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(3.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 3% 내지 5% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12048(34.0mg, 23%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.83 (t, J = 5.6 Hz, 2H), 8.37 (dd, J = 16.1, 7.9 Hz, 2H), 7.41 (t, J = 6.8 Hz, 2H), 7.20 (t, J = 4.9 Hz, 1H), 4.98 (s, 0.5H), 4.83 (d, J = 13.7 Hz, 0.5H), 4.17 (s, 0.5H), 3.99 - 3.91 (m, 0.5H), 3.84 (s, 2H), 3.13 (t, J = 13.0 Hz, 0.5H), 2.80 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.40 (s, 0.5H), 2.03 (d, J = 7.0 Hz, 0.5H), 1.88 (s, 1H), 1.76 (t, J = 11.8 Hz, 1H), 1.62 - 1.40 (m, 2H), 1.17 - 1.09 (m, 3H).
(7) 화합물 BnH12049의 합성
(3R,6S)-1-(2-(4-(5-플루오로피리미딘-2-일)페닐)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12049의 합성
MeCN/H2O(2:1, 5.47mL) 중 화합물 3-1(170mg, 0.424mmol), 2-브로모-5-플루오로피리미딘(82.5mg, 0.466mmol) 및 Na2CO3(89.8mg, 0.847mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(31.0mg, 0.042mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(0.847 mL, 0.847 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(2.00mL)로 희석하고, DCM(3.00mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 1 내지 2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(3.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 3% 내지 5% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12049(42.0mg, 27%)를 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.66 (s, 2H), 8.33 (s, 2H), 7.38 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.98 (s, 0.5H), 4.83 (d, J = 13.8 Hz, 0.5H), 4.18 (s, 0.5H), 3.93 (d, J = 13.9 Hz, 0.5H), 3.82 (s, 2H), 3.14 (t, J = 13.0 Hz, 0.5H), 2.79 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.40 (s, 0.5H), 2.10 (s, 0.5H), 1.91 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 1.78 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 1.56 (d, J = 31.7 Hz, 2H), 1.13 (s, 3H).
(8) 화합물 BnH12050의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(2-메틸피리미딘-5-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12050의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.49mL) 중 화합물 3-1(233mg, 0.581mmol), 5-브로모-2-메틸피리미딘(110mg, 0.639mmol) 및 Na2CO3(123mg, 1.16mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(42.5mg, 0.058mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.16mL, 1.16mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(2.00mL)로 희석하고, DCM(3.00mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 1 내지 2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(3.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 3% 내지 5% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12050(45.0 mg, 21%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.88 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.53 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.39 (s, 2H), 4.99 (s, 0.5H), 4.84 (d, J = 13.5 Hz, 0.5H), 4.21 (s, 0.5H), 3.92 (d, J = 13.9 Hz, 0.5H), 3.82 (s, 2H), 3.16 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.79 (s, 3.5H), 2.42 (s, 1H), 2.19 (d, J = 11.2 Hz, 0.5H), 1.96 (s, 0.5H), 1.80 (t, J = 13.5 Hz, 1H), 1.61 (d, J = 16.9 Hz, 2H), 1.18 (q, J = 8.0 Hz, 3H).
(9) 화합물 BnH12051의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12051의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.72mL) 중 화합물 3-1(240mg, 0.598mmol), 2-클로로-5-(트리플루오로메틸)피리미딘(120mg, 0.658mmol) 및 Na2CO3(127mg, 1.20mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(43.8mg, 0.060mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.20 mL, 1.20 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(3.00mL)로 희석하고, DCM(3.00mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 1 내지 2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(3.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 5% 내지 10% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12051(142mg, 58%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.44 (s, 1H), 9.33 (s, 2H), 8.40 (dd, J = 8.3, 2.0 Hz, 2H), 7.43 (dd, J = 17.7, 8.0 Hz, 2H), 4.75 (d, J = 9.4 Hz, 0.5H), 4.55 (dd, J = 13.5, 4.1 Hz, 0.5H), 4.26 (d, J = 8.6 Hz, 0.5H), 3.98 - 3.78 (m, 2.5H), 3.04 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.63 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.25 - 2.11 (m, 1H), 1.78 (dt, J = 12.4, 3.9 Hz, 1H), 1.66 (dq, J = 19.1, 12.9, 10.3 Hz, 1H), 1.52 (dq, J = 11.8, 7.5, 5.7 Hz, 2H), 1.07 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
(10) 화합물 BnH12052의 합성
(3R,6S)-1-(2-(4-(2-시클로프로필피리미딘-5-일)페닐)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12052의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.72mL) 중 화합물 3-1(240mg, 0.598mmol), 5-브로모-2-사이클로프로필프리미딘(131mg, 0.658mmol) 및 Na2CO3(127mg, 1.20mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(43.8mg, 0.060mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.20 mL, 1.20 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(3.00mL)로 희석하고, DCM(3.00mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 1 내지 2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(3.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 5% 내지 10% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12052(84.9mg, 37%)를 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.79 (s, 2H), 7.50 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.38 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 4.99 (s, 0.5H), 4.84 (d, J = 13.8 Hz, 0.5H), 4.21 (s, 0.5H), 3.93 (d, J = 14.0 Hz, 0.5H), 3.80 (s, 2H), 3.17 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.81 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.43 (s, 0.5H), 2.30 (ddd, J = 13.1, 8.2, 4.8 Hz, 1H), 2.20 (s, 0.5H), 1.95 (s, 1H), 1.81 (d, J = 15.7 Hz, 1H), 1.61 (d, J = 16.2 Hz, 2H), 1.15 (dd, J = 16.0, 9.3 Hz, 7H).
(11) 화합물 BnH12053의 합성
소듐 (3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(1-메틸-1H-이미다졸-2-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실레이트
단계 1: 화합물 BnH12053의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.72mL) 중 화합물 3-1(240mg, 0.598mmol), 2-브로모-1-메틸이미다졸(106mg, 0.658mmol) 및 Na2CO3(127mg, 1.20mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(43.8mg, 0.060mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.20 mL, 1.20 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(3.00mL)로 희석하고, DCM(3.00mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층을 감압하에 농축하고, C18-SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(MeOH: H2O = 1:1)로 정제하여, 화합물 BnH12053(163mg, 75%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 7.65 - 7.57 (m, 2H), 7.33 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.28 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.23 (s, 1H), 6.95 (s, 1H), 4.72 (s, 0.5H), 4.46 (dd, J = 14.6, 3.8 Hz, 0.5H), 4.20 (d, J = 5.7 Hz, 0.5H), 3.86 - 3.66 (m, 5.5H), 2.96 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.55 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 1.88 - 1.66 (m, 2H), 1.51 (tq, J = 31.1, 16.4, 13.9 Hz, 3H), 1.05 (t, J = 7.2 Hz, 3H).
(12) 화합물 BnH12054의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(피리미딘-4-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12054의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.72mL) 중 화합물 3-1(240mg, 0.598mmol), 4-클로로피리미딘(99.3mg, 0.658mmol) 및 Na2CO3(190mg, 1.79mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(43.8mg, 0.060mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.20 mL, 1.20 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(3.00mL)로 희석하고, DCM(3.00mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 1 내지 2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(3.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 5% 내지 10% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12054(83.4mg, 41%)를 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.44 (s, 1H), 9.23 (s, 1H), 8.85 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 8.17 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.08 (d, J = 5.4 Hz, 1H), 7.40 (dd, J = 18.3, 7.9 Hz, 2H), 4.75 (s, 0.5H), 4.54 (dd, J = 14.0, 4.2 Hz, 0.5H), 4.28 (d, J = 8.3 Hz, 0.5H), 3.96 - 3.73 (m, 2.5H), 3.03 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.62 (t, J = 12.7 Hz, 0.5H), 2.19 (tt, J = 12.0, 4.1 Hz, 1H), 1.79 (dt, J = 13.4, 4.5 Hz, 1H), 1.67 (tt, J = 17.4, 8.0 Hz, 1H), 1.51 (tq, J = 9.3, 4.6, 4.0 Hz, 2H), 1.08 (q, J = 8.3, 7.8 Hz, 3H).
(13) 화합물 BnH12055의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(티오펜-2-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12055의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.72mL) 중 화합물 3-1(240mg, 0.598mmol), 2-브로모티오펜(107mg, 0.658mmol) 및 Na2CO3(190mg, 1.79mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(43.8mg, 0.060mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.20 mL, 1.20 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(3.00mL)로 희석하고, DCM(3.00mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 1 내지 2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(3.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 5% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12055(30mg, 14%)를 아이보리색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.57 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.26 (d, J = 3.4 Hz, 4H), 7.07 (dd, J = 5.1, 3.6 Hz, 1H), 4.98 (s, 0.5H), 4.83 (d, J = 13.6 Hz, 0.5H), 4.18 (s, 0.5H), 3.93 (d, J = 14.1 Hz, 0.5H), 3.75 (s, 2H), 3.15 (t, J = 13.1 Hz, 0.5H), 2.78 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.40 (s, 0.5H), 2.15 (s, 0.5H), 1.92 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 1.79 (d, J = 12.3 Hz, 1H), 1.57 (d, J = 27.2 Hz, 2H), 1.14 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
(14) 화합물 BnH12056의 합성
(3R,6S)-1-(2-(4-(푸란-2-일)페닐)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12056의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.72mL) 중 화합물 3-1(240mg, 0.598mmol), 5-브로모푸란(96.7mg, 0.658mmol) 및 Na2CO3(190mg, 1.79mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(43.8mg, 0.060mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.20 mL, 1.20 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(3.00mL)로 희석하고, DCM(3.00mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 1 내지 2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(3.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 5% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12056(109mg, 55%)을 아이보리색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.63 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.48 - 7.43 (m, 1H), 7.27 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 6.63 (d, J = 3.3 Hz, 1H), 6.46 (dd, J = 3.4, 1.8 Hz, 1H), 4.97 (s, 0.5H), 4.82 (d, J = 13.6 Hz, 0.5H), 4.17 (s, 0.5H), 3.92 (d, J = 13.7 Hz, 0.5H), 3.76 (s, 2H), 3.13 (t, J = 13.0 Hz, 0.5H), 2.78 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.39 (s, 0.5H), 2.11 (s, 0.5H), 1.91 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 1.77 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 1.67 - 1.40 (m, 2H), 1.13 (d, J = 8.7 Hz, 3H).
(15) 화합물 BnH12072의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(3'-니트로-[1,1'-바이페닐]-4-일)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12072의 합성
MeCN/H2O(2:1, 4.82mL) 중 화합물 3-1(150mg, 0.374mmol), 3-브로모니트로벤젠(75.5mg, 0.374mmol) 및 Na2CO3(79.2mg, 0.4748mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(27.4mg, 0.037mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(0.748 mL, 0.748 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(4.00mL)로 희석하고, EtOAc(4.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 3 내지 4로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(4.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 3% 내지 5% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12072(120mg, 84%)를 회백색(off-white) 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.44 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 8.25 - 8.13 (m, 2H), 7.77 (t, J = 8.1 Hz, 3H), 7.38 (dd, J = 18.2, 7.9 Hz, 2H), 4.75 (s, 0.5H), 4.55 (d, J = 13.3 Hz, 0.5H), 4.29 (s, 0.5H), 3.94 (s, 0.5H), 3.85 - 3.73 (m, 2H), 3.05 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.67 - 2.57 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.20 (s, 1H), 1.80 (dd, J = 18.3, 6.8 Hz, 1H), 1.67 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 1.54 (s, 2H), 1.08 (s, 3H).
(16) 화합물 BnH12077의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4'-니트로-[1,1'-바이페닐]-4-일)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12077의 합성
MeCN/H2O(2:1, 4.82mL) 중 화합물 3-1(150mg, 0.374mmol), 4-브로모니트로벤젠(75.5mg, 0.374mmol) 및 Na2CO3(79.2mg, 0.748mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(27.4mg, 0.037mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(0.748 mL, 0.748 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(4.00mL)로 희석하고, EtOAc(4.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 3 내지 4로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(4.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 5% 내지 10% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12077(107mg, 75%)을 갈색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.30 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 7.97 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.38 (dd, J = 18.5, 7.8 Hz, 2H), 4.75 (s, 0.5H), 4.54 (dd, J = 13.1, 4.0 Hz, 0.5H), 4.29 (s, 0.5H), 3.92 (d, J = 12.9 Hz, 0.5H), 3.82 (q, J = 11.9, 8.6 Hz, 2H), 3.04 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.62 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.19 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 1.79 (q, J = 9.5, 6.7 Hz, 1H), 1.66 (d, J = 13.2 Hz, 1H), 1.57 - 1.49 (m, 2H), 1.15 - 1.08 (m, 3H).
(17) 화합물 BnH12081의 합성
(3R,6S)-1-(2-(4-(6-메톡시피리딘-3-일)페닐)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12081의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.07mL) 중 화합물 3-1(220mg, 0.548mmol), 5-브로모-2-메톡시피리딘(0.071mL, 0.548mmol) 및 Na2CO3(116mg, 1.10mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(40.1mg, 0.055mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.10 mL, 1.10 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(7.00mL)로 희석하고, EtOAc(5.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 3 내지 4로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(5.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 10% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12081(107mg, 75%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.37 (s, 1H), 8.47 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.00 (dd, J = 8.6, 2.6 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.30 (dd, J = 18.4, 7.8 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.75 (s, 0.5H), 4.54 (d, J = 13.5 Hz, 0.5H), 4.28 (s, 0.5H), 3.89 (s, 0.5H), 3.84 - 3.68 (m, 2H), 3.03 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.67 - 2.56 (m, 0.5H), 2.19 (s, 1H), 1.85 - 1.74 (m, 1H), 1.66 (d, J = 13.1 Hz, 1H), 1.52 (s, 2H), 1.10 - 1.04 (m, 3H).
(18) 화합물 BnH12082의 합성
(3R,6S)-1-(2-(4-(6-시클로프로필피리딘-3-일)페닐)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12082의 합성
MeCN/H2O(2:1, 6.42mL) 중 화합물 3-1(200mg, 0.498mmol), 3-브로모-6-(사이클로프로필)피리딘(0.060mL, 0.498mmol) 및 Na2CO3(106mg, 0.997mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(36.5mg, 0.050mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 2시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.10 mL, 1.10 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(6.00mL)로 희석하고, EtOAc(4.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 1 내지 2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(4.00 mL Х 2)로 세척하였다. 수성층에 1N NaOH를 첨가하여 pH 값을 pH 4 내지 5로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(4.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여, 화합물 BnH12082 (120 mg, 64%)를 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.30 (s, 1H), 8.70 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 7.92 (dd, J = 8.1, 2.4 Hz, 1H), 7.63 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.40 - 7.26 (m, 3H), 4.75 (s, 0.5H), 4.59 - 4.50 (m, 1=0.5H), 4.29 (s, 0.5H), 3.93 (d, J = 11.1 Hz, 0.5H), 3.85 - 3.69 (m, 2H), 3.04 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.68 - 2.57 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.31 - 2.04 (m, 2H), 1.80 (dd, J = 13.2, 3.6 Hz, 1H), 1.66 (d, J = 12.5 Hz, 1H), 1.58 - 1.43 (m, 2H), 1.14 - 1.03 (m, 3H), 0.96 (td, J = 7.3, 6.5, 2.5 Hz, 4H).
(19) 화합물 BnH12083의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(6-(트리플루오로메틸)피리딘-3-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12083의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.71mL) 중 화합물 3-1(240mg, 0.598mmol), 5-브로모-2-트리플루오로메틸피리딘(135mg, 0.598mmol) 및 Na2CO3(127mg, 1.20mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(43.8mg, 0.060mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.20 mL, 1.20 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(7.00mL)로 희석하고, EtOAc(5.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 3 내지 4로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(5.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 10% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12083(167mg, 69%)을 회백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.41 (s, 1H), 9.10 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.37 (dd, J = 8.2, 2.3 Hz, 1H), 7.98 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 7.79 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.40 (dd, J = 18.3, 7.9 Hz, 2H), 4.76 (s, 0.5H), 4.59 - 4.51 (d, J = 13.3 Hz, 0.5H), 4.34 - 4.25 (m, 0.5H), 3.94 (d, J = 13.3 Hz, 0.5H), 3.82 (qd, J = 15.4, 5.8 Hz, 2H), 3.06 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.69 - 2.58 (m, 0.5H), 2.31 - 2.13 (m, 1H), 1.87 - 1.77 (m, 1H), 1.67 (d, J = 11.6 Hz, 1H), 1.54 (dt, J = 6.7, 3.8 Hz, 2H), 1.14 - 1.02 (m, 3H).
(20) 화합물 BnH12084의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(6-메틸피리딘-3-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12084의 합성
MeCN/H2O(2:1, 6.42mL) 중 화합물 3-1(200mg, 0.498mmol), 5-브로모-2-메틸피리딘(85.7mg, 0.498mmol) 및 Na2CO3(106mg, 0.997mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(36.5mg, 0.050mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 2.5시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(0.997 mL, 0.997 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(6.00mL)로 희석하고, EtOAc(4.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 3 내지 4로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(4.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물에 Et2O(2.00 mL)를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 침전물을 여과하고, Et2O(3.00mL)로 세척하여, 화합물 BnH12084(92.0mg, 52%)를 백색 고체로 얻었다.
1H NMR 1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.82 (s, 1H), 8.02 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.56 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.41 (d, J = 7.5 Hz, 3H), 5.00 (s, 0.5H), 4.86 (s, 0.5H), 4.23 (s, 0.5H), 3.95 (d, J = 13.6 Hz, 0.5H), 3.84 (s, 2H), 3.18 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.84 (s, 0.5H), 2.74 (s, 3H), 2.44 (s, 0.5H), 2.19 (s, 0.5H), 1.99 (d, J = 13.4 Hz, 1H), 1.82 (s, 1H), 1.64 (s, 2H), 1.17 (d, J = 7.9 Hz, 3H).
(21) 화합물 BnH12085의 합성
(3R,6S)-1-(2-(4'-사이클로헥실-[1,1'-바이페닐]-4-일)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12085의 합성
MeCN/H2O(2:1, 6.14mL) 중 화합물 3-1(191mg, 0.476mmol), 1-브로모-4-사이클로헥실벤젠(0.088mL, 0.476mmol) 및 Na2CO3(101mg, 0.952mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(34.8mg, 0.048mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 2.5시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.20 mL, 1.20 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(6.00mL)로 희석하고, EtOAc(4.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 2 내지 3으로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(4.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 10% MeOH)로 정제하였다. 잔류물에 Et2O(3.00mL)를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 침전물을 여과하고 Et2O(4.00 mL)로 세척하여, 화합물 BnH12085 (127 mg, 64%)를 회백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.44 (s, 1H), 7.57 (t, J = 7.0 Hz, 4H), 7.28 (dd, J = 16.4, 7.9 Hz, 4H), 4.75 (s, 0.5H), 4.58 - 4.50 (m, 0.5H), 4.28 (s, 0.5H), 3.92 (d, J = 13.6 Hz, 0.5H), 3.86 - 3.67 (m, 2H), 3.04 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.63 ((t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.27 - 2.12 (m, 1H), 1.91 - 1.15 (m, 15H), 1.07 (t, J = 6.4 Hz, 3H).
(22) 화합물 BnH12086의 합성
(3R,6S)-1-(2-(4'-아미노-[1,1'-바이페닐]-4-일)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실산
단계 3: 화합물 BnH12086의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.01mL) 중 화합물 3-1(225mg, 0.561mmol), 4-브로모아닐린(96.5mg, 0.561mmol) 및 Na2CO3(119mg, 1.12mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(41.0mg, 0.06mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 2시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.12mL, 1.12mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(5.00mL)로 희석하고, EtOAc(5.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 1 내지 2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(5.00 mL Х 2)로 세척하였다. 수성층에 1N NaOH를 첨가하여 pH 값을 pH 5 내지 6으로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(5.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 0 내지 10% MeOH)로 정제하였다. 잔류물에 Et2O(2.00mL)를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 침전물을 여과하고, Et2O(2.00 mL)로 세척하여, 화합물 BnH12086 (70.0 mg, 35%)을 베이지색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.44 (s, 1H), 7.49-7.46 (m, 2H), 7.36-7.34 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 7.24-7.17 (dd, J = 18.4, 7.8 Hz, 2H), 6.64-6.62 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 5.20 (s, 2H), 4.75 (s, 0.5H), 4.56-4.52 (m, 0.5H), 4.26 (s, 0.5H), 3.92-3.89 (d, J = 13.7 Hz, 0.5H), 3.77-3.66 (m, 2H), 3.04-2.98 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.64-2.57 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.16-2.12 (d, J = 13.6 Hz, 1H), 1.80-1.77 (d, J = 12.9 Hz, 1H), 1.66-1.63 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 1.53-1.50 (d, J = 10.9 Hz, 2H), 1.07-1.05 (dd, J = 6.9, 2.3 Hz, 3H).
(23) 화합물 BnH12087의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(6-페닐피리딘-3-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 3: 화합물 BnH12087의 합성
MeCN/H2O(2:1, 6.04mL) 중 화합물 3-1(194mg, 0.483mmol), 5-브로모-2-페닐피리딘(113mg, 0.483mmol) 및 Na2CO3(102mg, 0.967mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(35.4mg, 0.05mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 2시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(0.967 mL, 0.967 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(5.00mL)로 희석하고, EtOAc(5.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 1 내지 2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(4.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 0 내지 4% MeOH)로 정제하였다. 잔류물에 Et2O(2.00 mL)를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 침전물을 여과하고, Et2O(2.00 mL)로 세척하여, 화합물 BnH12087(70.1 mg, 35%)을 회백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.99 (s, 1H), 8.18-8.13 (t, J = 8.7 Hz, 3H), 8.06-8.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.76-7.73 (dd, J = 8.0, 4.4 Hz, 2H), 7.53-7.49 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 7.47-7.43 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.39-7.37 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 7.34-7.32 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 4.74 (s, 0.5H), 4.55-4.50 (m, 0.5H), 4.28 (s, 0.5H), 3.92-3.89 (d, J = 13.8 Hz, 0.5H), 3.83-3.76 (m, 2H), 3.04-2.98 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.63-2.56 (d, J = 12.6 Hz, 0.5H), 2.11-2.08 (d, J = 10.2 Hz, 1H), 1.80-1.76 (d, J = 12.8 Hz, 1H), 1.64-1.61 (m, 1H), 1.51 (s, 2H), 1.10-1.05 (dd, J = 14.4, 6.8 Hz, 3H).
(24) 화합물 BnH12088의 합성
(3R,6S)-1-(2-(3'-아미노-[1,1'-바이페닐]-4-일)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12088의 합성
MeCN/H2O(2:1, 6.75mL) 중 화합물 3-1(210mg, 0.523mmol), 3-브로모아닐린(0.057mL, 0.523mmol) 및 Na2CO3(111mg, 1.05mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(38.3mg, 0.052mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 2.5시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.05 mL, 1.05 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(6.00mL)로 희석하고, EtOAc(4.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 1 내지 2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(4.00 mL Х 2)로 세척하였다. 수성층에 1N NaOH를 첨가하여 pH 값을 pH 5 내지 6으로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(4.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물에 Et2O/n-헥산(2:1, 2.00mL)을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 침전물을 여과하고, Et2O/n-헥산(2:1, 3.00mL)으로 세척하여, 화합물 BnH12088(115mg, 62%)을 베이지색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.43 (s, 1H), 7.49 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 7.26 (dd, J = 18.0, 7.8 Hz, 2H), 7.08 (t, J = 7.8 Hz, 1H), 6.83 (d, J = 2.1 Hz, 1H), 6.76 (d, J = 7.7 Hz, 1H), 6.54 (dd, J = 7.9, 2.2 Hz, 1H), 5.13 (s, 2H), 4.75 (s, 0.5H), 4.55 (d, J = 13.6 Hz, 0.5H), 4.27 (s, 0.5H), 3.90 (s, 0.5H), 3.84 - 3.61 (m, 2H), 3.03 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.66 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.18 (s, 1H), 1.79 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 1.66 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 1.52 (d, J = 8.8 Hz, 2H), 1.08 (q, J = 6.5, 6.1 Hz, 3H).
(25) 화합물 BnH12089의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4'-(피리딘-3-일)-[1,1'-바이페닐]-4-일)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12089의 합성
MeCN/H2O(2:1, 6.46mL) 중 화합물 3-1(201mg, 0.501mmol), 3-(4-브로모페닐)피리딘(117mg, 0.501mmol) 및 Na2CO3(106mg, 1.00mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(36.7mg, 0.050mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 2시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.00 mL, 1.00 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(6.00mL)로 희석하고, EtOAc(4.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 1 내지 2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(4.00 mL Х 2)로 세척하였다. 수성층에 1N NaOH를 첨가하여 pH 값을 pH 4 내지 5로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(4.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물에 Et2O(3.00 mL)를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 침전물을 여과하고, Et2O(4.00 mL)로 세척하여, 화합물 BnH12089(127 mg, 61%)를 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.43 (s, 1H), 8.96 (d, J = 2.4 Hz, 1H), 8.59 (dd, J = 4.8, 1.6 Hz, 1H), 8.14 (dt, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H), 7.84 (t, J = 6.4 Hz, 4H), 7.70 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.51 (dd, J = 7.9, 4.7 Hz, 1H), 7.34 (dd, J = 18.2, 7.8 Hz, 2H), 4.76 (s, 0.5H), 4.56 (d, J = 13.8 Hz, 0.5H), 4.30 (s, 0.5H), 4.00 - 3.90 (d, J = 13.8 Hz, 0.5H), 3.87 - 3.71 (m, 2H), 3.05 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.68 - 2.58 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.20 (d, J = 3.9 Hz, 1H), 1.81 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 1.75 - 1.60 (m, 1H), 1.54 (s, 2H), 1.09 (dd, J = 10.5, 6.8 Hz, 3H).
(26) 화합물 BnH12090의 합성
(3R,6S)-1-(2-(4'-(디에틸아미노)-[1,1'-바이페닐]-4-일)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12090의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.85mL) 중 화합물 3-1(252mg, 0.628mmol), 4-브로모-N,N-디에틸아닐린(143mg, 0.628mmol) 및 Na2CO3(106mg, 1.00mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(46.0mg, 0.06mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 2시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.00 mL, 1.00 mmol)를 혼합물에 첨가하고, 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(6.00mL)로 희석하고, EtOAc(4.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 4 내지 5로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(4.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 5 내지 10% MeOH)로 정제하였다. 잔류물에 Et2O(2.00 mL)를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 침전물을 여과하고, Et2O(3.00 mL)로 세척하여, 화합물 BnH12090 (55.0 mg, 21%)을 회백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.47 (s, 1H), 7.52-7.47 (dd, J = 13.4, 7.9 Hz, 4H), 7.26-7.19 (dd, J = 18.3, 7.8 Hz, 2H), 6.74-6.72 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 4.75 (s, 0.5H), 4.57-4.53 (d, J = 13.9 Hz, 0.5H), 4.28 (s, 0.5H), 3.94-3.90 (d, J = 14.1 Hz, 0.5H), 3.78-3.67 (m, 2H), 3.48-3.34 (m, 4H), 3.05-2.99 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.64-2.58 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.20-2.14 (m, 1H), 1.81-1.77 (m, 1H), 1.70-1.64 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 1.53-1.51 (d, J = 9.3 Hz, 2H), 1.13-1.10 (t, J = 6.9 Hz, 6H), 1.08-1.05 (dd, J = 7.1, 2.9 Hz, 3H).
제조예 3. 대표적인 반응식 4에 따른 활성 화합물의 제조
[반응식 4]
(1) 화합물 BnH12015의 합성
(R)-N-하이드록시-1-(2-(4-(피리미딘-5-일)페닐)아세틸)피롤리딘-2-카르복스아미드
단계 1: 2-(4-(피리미딘-5-일)페닐)아세트산의 합성
MeCN/H2O(2:1, 60.0mL) 중 4-브로모페닐아세트산(1.00g, 4.65mmol), 5-피리미딘보론산 피나콜 에스테르(910mg, 4.42mmol) 및 Na2CO3(986mg, 9.30mmol)의 현탁액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링한 후, Pd(dppf)Cl2(340mg, 0.465mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 2시간 동안 환류시켰다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, EtOAc(10.0 mL Х 2)로 세척하였다. 여액을 H2O(40.0mL)로 희석하고, EtOAc(40.0mL x 2)로 세척하였다. 수성층을 1N HCl로 pH 1 내지 2가 될 때까지 산성화시키고, 30분 동안 교반하였다. 침전물을 여과하고, H2O(40.0mL)로 세척하였다. 필터 케이크를 감압하에 건조시켜, 요망되는 화합물(542mg, 54%)을 백색 고체로 얻었다.
단계 2: 메틸 (2-(4-(피리미딘-5-일)페닐)아세틸)-D-프롤리네이트의 합성
DMF(1.71mL) 중 2-(4-(피리미딘-5-일)페닐)아세트산(110mg, 0.513mmol)에 메틸 D-프롤리네이트(10.2mg, 0.616mmol), DIPEA(0.135mL, 0.770mmol), HOBt(83.3mg, 0.616mmol) 및 EDC·HCl(95.7mg, 0.616mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 3분 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(5.00mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (5.00mL) 및 염수(5.00mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:EtOAc = 2:1)로 정제하여, 요망되는 화합물(145mg, 79%)을 무색 오일로 얻었다.
단계 3: 화합물 BnH12015의 합성
THF/MeOH(1:1, 3.00mL) 중 메틸 (2-(4-(피리미딘-5-일)페닐)아세틸)-D-프롤리네이트(83.0mg, 0.255mmol)의 용액에 하이드록실아민 하이드로클로라이드(169mg, 2.55mmol) 및 KOH(28.6mg, 0.510mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(2.00 mL)로 희석하고, DCM(3.00 mL Х 2)으로 2회 세척하였다. 수성층을 0℃에서 pH 1 내지 2가 될 때까지 1N HCl로 산성화시키고, EtOAc(3.00 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(3.00mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM:MeOH = 9:1)로 정제하여, 화합물 BnH12015 (48.0 mg, 57%)를 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.90 (s, 1H), 9.21 (s, 1H), 8.94 (s, 2H), 7.60 - 7.53 (m, 2H), 7.40 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.55 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.75 (s, 2H), 3.65 - 3.59 (m, 1H), 3.52 (q, J = 8.7 Hz, 1H), 2.49 (s, 1H), 2.25 - 2.12 (m, 1H), 2.00 (d, J = 38.2 Hz, 2H).
(2) 화합물 BnH12017의 합성
단계 1: 메틸 (2-(4-(피리미딘-5-일)페닐)아세틸)-D-프롤리네이트의 합성
DMF(1.71mL) 중 2-(4-(피리미딘-5-일)페닐)아세트산(110mg, 0.513mmol)에 메틸 L-프롤리네이트(10.2mg, 0.616mmol), DIPEA(0.135mL, 0.770mmol), HOBt(83.3mg, 0.616mmol) 및 EDC·HCl(95.7mg, 0.616mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 3분 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(5.00mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (5.00mL) 및 염수(5.00mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:EtOAc = 2:1)로 정제하여, 요망되는 화합물(83 mg, 49%)을 무색 오일로 얻었다.
단계 2: 화합물 BnH12017의 합성
THF/MeOH(1:1, 3.00mL) 중 메틸 (2-(4-(피리미딘-5-일)페닐)아세틸)-D-프롤리네이트(80.0mg, 0.246mmol)의 용액에 하이드록실아민 하이드로클로라이드(162mg, 2.46mmol) 및 KOH(27.6mg, 0.492mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(2.00 mL)로 희석하고, DCM(3.00 mL Х 2)으로 2회 세척하였다. 수성층을 0℃에서 pH 1 내지 2가 될 때까지 1N HCl로 산성화시키고, EtOAc(3.00 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(3.00mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM:MeOH = 9:1)로 정제하여, 화합물 BnH12017 (52.0 mg, 64%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 9.87 (s, 1H), 7.35 - 7.27 (m, 2H), 7.15 (dd, J = 8.4, 2.6 Hz, 2H), 6.99 (td, J = 8.3, 2.7 Hz, 2H), 4.54 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 3.73 (d, J = 2.6 Hz, 2H), 3.66 - 3.49 (m, 1H), 2.46 (s, 1H), 2.17 (dd, J = 17.6, 8.5 Hz, 1H), 2.09 - 1.89 (m, 2H).
제조예 4. 대표적인 반응식 5에 따른 활성 화합물의 제조
[반응식 5]
(1) 화합물 BnH12058의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(피리미딘-2-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복스아미드
단계 1: 화합물 BnH12058의 합성
MeCN(3.17mL) 중 화합물 BnH12048(100mg, 0.295mmol)의 현탁액에 CDI(71.7mg, 0.442mmol)를 첨가하고, 실온에서 20분 동안 교반하였다. 혼합물 NH4OH(0.172mL, 4.42mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(4.00mL)로 희석하고, 포화 NH4Cl (4.00mL), 10% 시트르산(4.00mL) 및 염수(4.00mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 5% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12058(48mg, 48%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.97 (d, J = 0.8 Hz, 2H), 8.31 - 8.24 (m, 2H), 7.43 - 7.29 (m, 3H), 6.86 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 4.74 (d, J = 6.7 Hz, 0.5H), 4.38 (dd, J = 13.3, 4.2 Hz, 0.5H), 4.30 - 4.24 (m, 0.5H), 3.87 - 3.75 (m, 2.5H), 3.02 (dd, J = 13.7, 11.9 Hz, 0.5H), 2.61 (q, J = 14.0, 13.0 Hz, 0.5H), 2.08 (ddd, J = 16.4, 10.5, 3.1 Hz, 1H), 1.68 (td, J = 13.0, 11.4, 4.6 Hz, 2H), 1.56 - 1.39 (m, 2H), 1.12 - 1.02 (m, 3H).
(2) 화합물 BnH12059의 합성
(3R,6S)-1-(2-(4-(5-플루오로피리미딘-2-일)페닐)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복스아미드
단계 1: 화합물 BnH12059의 합성
MeCN(3.01mL) 중 화합물 BnH12049(100mg, 0.280mmol)의 현탁액에 CDI(68.1mg, 0.420mmol)를 첨가하고, 실온에서 20분 동안 교반하였다. 혼합물에 NH4OH(0.163mL, 4.20mmol)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(4.00mL)로 희석하고, 포화 NH4Cl (4.00mL), 10% 시트르산(4.00mL) 및 염수(4.00mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 농축하였다. 잔류물을 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 5% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12059(52 mg, 52%)를 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.89 (d, J = 4.9 Hz, 2H), 8.34 (dd, J = 8.4, 2.3 Hz, 2H), 7.47 - 7.29 (m, 4H), 6.86 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.75 (s, 0.5H), 4.38 (dd, J = 13.0, 4.2 Hz, 0.5H), 4.25 (d, J = 6.6 Hz, 0.5H), 3.95 - 3.72 (m, 2.5H), 3.02 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.63 (t, J = 12.7 Hz, 0.5H), 2.09 (dd, J = 13.6, 9.5 Hz, 1H), 1.66 (d, J = 14.3 Hz, 2H), 1.58 - 1.36 (m, 2H), 1.13 - 1.02 (m, 3H).
제조예 5. 대표적인 반응식 6에 따른 활성 화합물의 제조
[반응식 6]
(1) 화합물 BnH12064의 합성
(S)-1-(2-메틸피페리딘-1-일)-2-(4-(피리딘-3-일)페닐)에탄-1-온
단계 1: 2-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)아세트산의 합성
1,4-디옥산(11.2mL) 중 화합물 2-(4-브로모페닐)아세트산(700mg, 3.26mmol), 비스(피나콜라토)디보란(911mg, 3.59mmol) 및 KOAc(958.4mg, 9.77mmol)의 현탁액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링한 후, Pd(dppf)Cl2(238mg, 0.326mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 100℃에서 17시간 동안 환류시켰다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, DCM(5.00 mL Х 3)으로 세척하였다. 합한 유기층을 H2O(20.0mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:EtOAc = 3:1 내지 2:1)로 정제하여, 화합물 6-1-BnH12064-1(552 mg, 65%)을 황색 고체로 얻었다.
단계 2: 2-(4-(피리딘-3-일)페닐)아세트산(6-1-BnH12064)의 합성
MeCN/H2O(2:1, 21.4mL) 중 화합물 6-1-BnH12064-1(450mg, 1.72mmol), 3-브로모피리딘(0.182mL, 1.89mmol) 및 Na2CO3(546 mg, 5.15mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(126mg, 0.172mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 그 후, 혼합물을 실온으로 냉각하였다. 혼합물을 H2O(10.0mL)로 희석하고, DCM(10.0mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 1 내지 2로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(15.0 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하고, 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 3: 화합물 BnH12064의 합성
DMF(1.41mL) 중 2-(4-(피리딘-3-일)페닐)아세트산(6-1-BnH12064, 90mg, 0.422mmol)의 용액에 (S)-2-메틸피페리딘(44.0mg, 0.443mmol), DIPEA(0.110mL, 0.633mmol), HOBt(68.4mg, 0.506mmol) 및 EDC·HCl(78.6mg, 0.506mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(2.00mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (2.00mL) 및 염수(2.00mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:EtOAc = 1:1 내지 0:1)로 정제하여, 화합물 BnH12064(46.6mg, 38%)를 황색을 띠는(yellowish) 오일로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 8.88 (d, J = 2.3 Hz, 1H), 8.62 (dd, J = 5.0, 1.6 Hz, 1H), 8.00 (dt, J = 8.0, 2.0 Hz, 1H), 7.57 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.47 (dd, J = 8.0, 4.9 Hz, 1H), 7.39 (d, J = 8.9 Hz, 2H), 4.99 (s, 0.5H), 4.58 (d, J = 13.7 Hz, 0.5H), 4.22 (s, 0.5H), 3.80 (s, 2H), 3.68 (d, J = 13.8 Hz, 0.5H), 3.11 (t, J = 13.5 Hz, 0.5H), 2.72 (t, J = 13.6 Hz, 0.5H), 1.58 (d, J = 31.7 Hz, 6H), 1.18 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
제조예 6. 대표적인 반응식 7(무수 형태)에 따른 활성 화합물의 제조
[반응식 7]
(1) 화합물 BnH12066의 합성
(3S,6R)-6-메틸-1-(2-(4-(피리딘-3-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 메틸 (3S,6R)-6-메틸-1-(2-(4-(피리딘-3-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실레이트의 합성
DMF(1.41mL) 중 2-(4-(피리딘-3-일)페닐)아세트산(6-1-BnH12064, 90mg, 0.422mmol)의 용액에 메틸 (3S,6R)-6- 메틸피페리딘-3-카르복실레이트(무수 형태)(69.7mg, 0.443mmol), DIPEA(0.110mL, 0.633mmol), HOBt(68.4mg, 0.506mmol) 및 EDC·HCl(78.6mg, 0.506mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(2.00mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (2.00mL) 및 염수(2.00mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 5% MeOH)로 정제하여, 요망되는 화합물(37.0 mg, 25%)을 황색을 띠는 오일로 얻었다.
단계 2: 화합물 BnH12066의 합성
THF(0.373mL) 중 메틸 (3S,6R)-6-메틸-1-(2-(4-(피리딘-3-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실레이트(37.0mg, 0.108mmol)의 용액에 1N NaOH(0.162mL, 0.162mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(2.00 mL)로 희석하고, DCM(2.00 mL Х 2)으로 2회 세척하였다. 수성층을 0℃에서 pH 1 내지 2가 될 때까지 1N HCl로 산성화하고, EtOAc(3.00 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(3.00mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여, 화합물 BnH12066 (30.0 mg, 82%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.08 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 8.72 (d, J = 5.2 Hz, 1H), 8.50 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 7.80 (dd, J = 19.9, 8.1 Hz, 3H), 7.40 (dd, J = 18.3, 7.9 Hz, 2H), 4.75 (s, 0.5H), 4.58 - 4.51 (m, 0.5H), 4.30 (s, 0.5H), 3.93 (d, J = 13.6 Hz, 0.5H), 3.89 - 3.74 (m, 2H), 3.05 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.61 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.22 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 1.81 (d, J = 12.7 Hz, 1H), 1.67 (d, J = 12.6 Hz, 1H), 1.58 - 1.46 (m, 2H), 1.09 (dd, J = 16.1, 6.9 Hz, 3H).
(2) 화합물 BnH12071의 합성
(3S,6R)-6-메틸-1-(2-(4-(피리미딘-5-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 메틸 (3S,6R)-6-메틸-1-(2-(피리딘-3-일)아세틸)피페리딘-3-카르복실레이트의 합성
DMF(2.00mL) 중 2-(4-(피리미딘-5-일)페닐)아세트산(100mg, 0.467mmol)의 용액에 메틸 (3S,6R)-6-메틸피페리딘-3-카르복실레이트(무수 형태)(77.1mg, 0.490mmol), DIPEA(0.122mL, 0.700mmol), HOBt(75.7mg, 0.560mmol) 및 EDC·HCl(107mg, 0.560mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(3.00mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (3.00mL) 및 염수(3.00mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(EtOAc단독)로 정제하여, 요망되는 화합물(93.5mg, 57%)을 옅은 황색 오일로 얻었다.
단계 2: 화합물 BnH12071의 합성
THF(1.00mg, 0.260mmol) 중 메틸 (3S,6R)-6-메틸-1-(2-(4-(피리미딘-5-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실레이트(92.0mg, 0.260mmol)의 용액에 1N NaOH(0.390mL, 0.390mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(2.00 mL)로 희석하고, DCM(2.00 mL Х 2)으로 2회 세척하였다. 수성층을 0℃에서 pH 1 내지 2가 될 때까지 1N HCl로 산성화하고, EtOAc(3.00 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(3.00mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 10% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12071(35.0mg, 44%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.16 (d, J = 12.7 Hz, 2H), 7.77 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.38 (dd, J = 19.1, 7.8 Hz, 2H), 4.75 (s, 0.5H), 4.58 - 4.51 (d, J = 13.8 Hz, 0.5H), 4.29 (s, 0.5H), 3.92 (d, J = 13.8 Hz, 0.5H), 3.80 (tt, J = 15.5, 7.8 Hz, 2H), 3.05 (t, J = 12.8 Hz, 1H), 2.60 (t, J = 12.9 Hz, 1H), 2.24 - 2.11 (m, 1H), 1.86 - 1.77 (m, 1H), 1.66 (d, J = 13.3 Hz, 1H), 1.53 (q, J = 5.7, 4.6 Hz, 2H), 1.08 (dd, J = 16.6, 6.9 Hz, 3H).
제조예 7. 대표적인 반응식 8에 따른 활성 화합물의 제조
[반응식 8]
(1) 화합물 BnH12091의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(3-(피리딘-4-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 메틸 (3R,6S)-1-(2-(3-브로모페닐)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실레이트
DMF(12.4mL) 중 3-브로모페닐아세트산(800mg, 3.72mmol)의 용액에 메틸 (3R,6S)-rel-6-메틸-3-피페리딘카르복실레이트(614mg, 3.91mmol), DIPEA(0.972mL, 5.58mmol), HOBt(603mg, 4.46mmol) 및 EDC·HCl(692mg, 4.46mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(15.0mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (15.0mL) 및 염수(15.0ml)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:EtOAc = 2:1 내지 1:1)로 정제하여, 요망되는 화합물(990 mg, 75%)을 무색 오일로 얻었다.
단계 2: 메틸 (3R,6S)-6-메틸-1-(2-(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실레이트(8-2)의 합성
1,4-디옥산(9.70mL) 중 메틸 (3R,6S)-1-(2-(3-브로모페닐)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실레이트(990mg, 2.80mmol), 비스(피나콜라토)디보란(501mg, 1.97mmol) 및 KOAc(823mg, 3.07mmol)의 현탁액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링한 후, Pd(dppf)Cl2(205mg, 0.279mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 100℃에서 14시간 동안 환류시켰다. 반응 완료 후, 반응 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, DCM(10.0 mL Х 3)으로 세척하였다. 합한 유기층을 H2O(30.0mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:EtOAc = 2:1 내지 1:1)로 정제하여, 요망되는 화합물(840mg, 75%)을 황색을 띠는 오일로 얻었다.
단계 3: 화합물 BnH12091의 합성
MeCN/H2O(2:1, 6.70mL) 중 메틸 (3R,6S)-6-메틸-1-(2-(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카복실레이트(8-2, 215mg, 0.536mmol), 4-브로모피리딘 하이드로클로라이드(104mg, 0.536mmol) 및 Na2CO3(170mg, 1.61mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하였다. 혼합물에 Pd(dppf)Cl2(31.0mg, 0.042mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 2시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(2.14mL, 2.14mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(7.00 mL)로 희석하고, EtOAc(7.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 4 내지 5로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(7.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물에 Et2O(5.00 mL)를 첨가하고 실온에서 30분 동안 교반하였다. 침전물을 여과하고, Et2O(3.0 mL)로 세척하여, 화합물 BnH12091 (112 mg, 62%)을 회백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.43 (s, 1H), 8.64-8.63 (d, J = 5.1 Hz, 2H), 7.69-7.63 (d, J = 7.3 Hz, 4H), 7.48-7.44 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.35-7.29 (dd, J = 15.8, 7.6 Hz, 1H), 4.74 (s, 0.5H), 4.56-4.52 (m, 0.5H), 4.32 (s, 0.5H), 3.98-3.94 (d, J = 14.0 Hz, 0.5H), 3.89-3.77 (m, 2H), 3.07-3.01 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.62-2.58 (d, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.18-2.14 (d, J = 14.5 Hz, 1H), 1.77 (s, 1H), 1.70-1.64 (m, 1H), 1.52 (s, 2H), 1.09-1.04 (m, 3H).
(2) 화합물 BnH12092의 합성
(3R,6S)-1-(2-(3-(6-메톡시피리딘-3-일)페닐)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12092의 합성
MeCN/H2O(2:1, 7.50mL) 중 메틸 (3R,6S)-6-메틸-1-(2-(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카복실레이트(8-2, 225mg, 0.561mmol), 5-브로모-2-메톡시피리딘(105mg, 0.561mmol) 및 Na2CO3(119mg, 1.12mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하였다. 혼합물에 Pd(dppf)Cl2(41.0mg, 0.056mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 2시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.12mL, 1.12mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 14시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(7.00 mL)로 희석하고, EtOAc(7.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 4 내지 5로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(7.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM: MeOH = 20:1 내지 10:1)로 정제하였다. 잔류물에 Et2O(4.00 mL)를 첨가하고 실온에서 30분 동안 교반하였다. 침전물을 여과하고 Et2O(2.0 mL)로 세척하여, 화합물 BnH12092(106 mg, 52%)를 회백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.43 (s, 1H), 8.45 (dd, J = 7.3, 2.7 Hz, 1H), 7.97 (dd, J = 8.4, 2.5 Hz, 1H), 7.56 - 7.46 (m, 2H), 7.41 (t, J = 7.6 Hz, 1H), 7.22 (dd, J = 16.2, 7.6 Hz, 1H), 6.92 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 4.75 (s, 0.5H), 4.59 - 4.50 (m, 0.5H), 4.32 (s, 0.5H), 3.90 (s, 3.5H), 3.87 - 3.72 (m, 2H), 3.03 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.62 (t, J = 12.7 Hz, 0.5H), 2.17 (q, J = 10.2, 8.7 Hz, 1H), 1.79 (d, J = 12.0 Hz, 1H), 1.67 (dd, J = 12.5, 6.2 Hz, 1H), 1.51 (d, J = 12.4 Hz, 2H), 1.08 (dt, J = 12.6, 4.7 Hz, 3H).
(3) 화합물 BnH12093의 합성
(3R,6S)-1-(2-(3-(5-플루오로피리미딘-2-일)페닐)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12093의 합성
MeCN/H2O(2:1, 6.84mL) 중 메틸 (3R,6S)-6-메틸-1-(2-(3-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카복실레이트(8-2, 213mg, 0.531mmol), 2-브로모-5-플루오로피리미딘(93.9mg, 0.531mmol) 및 Na2CO3(113mg, 1.06mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하였다. 혼합물에 Pd(dppf)Cl2(38.8mg, 0.053mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 2시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.12mL, 1.12mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(7.00 mL)로 희석하고, EtOAc(7.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 3 내지 4로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(7.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 3 내지 5% MeOH)로 정제하였다. 잔류물에 Et2O(5.00 mL)를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 침전물을 여과하고, Et2O(3.0 mL)로 세척하여, 화합물 BnH12093(122 mg, 64%)을 베이지색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.39 (s, 1H), 8.98 (s, 2H), 8.22 (t, J = 10.5 Hz, 2H), 7.53 - 7.34 (m, 2H), 4.76 (s, 0.5H), 4.55 (dd, J = 13.2, 4.0 Hz, 0.5H), 4.37 - 4.22 (m, 0.5H), 3.98 - 3.76 (m, 2.5H), 3.03 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.62 (t, J = 12.7 Hz, 0.5H), 2.18 (q, J = 10.8, 9.2 Hz, 1H), 1.79 (d, J = 13.0 Hz, 1H), 1.65 (td, J = 12.5, 7.6 Hz, 1H), 1.51 (d, J = 9.5 Hz, 2H), 1.08 (dt, J = 7.1, 4.4 Hz, 3H).
제조예 8. 대표적인 반응식 이외의 방법에 따른 활성 화합물의 제조
(1) BnH12002의 합성
(3R,6S)-1-(2-(4'-플루오로-[1,1'-바이페닐]-4-일)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 1(293 mg, 1.27 mmol)을 5 mL의 DCM에 용해하고, 옥살릴 클로라이드(163μL, 1.91 mmol)를 0℃에서 5분 동안 적가하고, 이어서 촉매와 함께 DMF(1방울)를 첨가하였다. 실온에서 6시간 동안 교반한 후, 혼합물을 감압하에 농축하여 316 mg의 화합물 2를 얻었다. 추가 정제 없이 반응을 다음 단계로 진행시켰다.
단계 2: 화합물 3(200 mg, 1.27 mmol)을 10 mL의 DCM에 용해시키고, 트리에틸 아민(354μL, 2.54 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 화합물 2(316 mg, 1.27 mmol)를 5 mL의 DCM에 용해시키고, 0℃에서 적가한 후, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM 및 물로 후처리한 후, 컬럼을 사용하여 213 mg의 화합물 4를 얻었다(수율 45%).
단계 3: 화합물 4(100 mg, 473 μmol)를 5 mL의 THF/메탄올(1:1) 에 용해시키고, 1 N-NaOH(947 μL, 947 μmol)를 첨가하고, 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 1 N-HCl을 이용하여 pH를 3으로 조정하고, 에틸아세테이트로 추출한 후 감압하에 농축하였다. 얻어진 반응 혼합물로부터 prep TLC를 이용하여 75 mg의 목적 화합물 5 를 얻었다(수율 45%).
NMR 스펙트럼에 의해 동일성을 확인하였다: 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 7.22 (1H, m), 7.08 (1H, m), 6.91 (1H, bs), 4.75(1H, m), 3.86 (1H, m), 3.71(2H, m), 3.01 (1H, m), 2.28 (1H, m), 1.91 (1H, bs), 1.74(1H, m), 1.58 (1H, bs), 1.13(3H, m).
(2) BnH12003의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(피리미딘-5-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 1(547 mg, 2.54 mmol)을 10 mL의 DCM에 용해시키고, 옥살릴 클로라이드(327 μL, 3.81 mmol)를 0℃에서 5분 동안 적가하고, 이어서 촉매와 함께 DMF(1방울)를 첨가하였다. 실온에서 6시간 동안 교반한 후, 혼합물을 감압하에 농축하여 593 mg의 화합물 2를 얻고, 추가 정제 없이 반응을 다음 단계로 진행시켰다.
단계 2: 화합물 3(400 mg, 2.54 mmol)을 10 mL의 DCM에 용해시키고, 트리에틸 아민(708μL, 5.08 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 화합물 2(593 mg, 2.54 mmol)를 5 mL의 DCM에 용해시키고, 0℃에서 적가한 후, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM 및 물로 후처리한 후, 컬럼을 사용하여 347 mg의 화합물 4를 얻었다(수율 38%).
단계 3: 화합물 4(300 mg, 846 μmol), 화합물 5(104 mg, 846 μmol), Pd(PPh3)4(49 mg, 43 μmol) 및 K2CO3(234 mg, 1.69 mmol)를 톨루엔 3 mL/에탄올 1 mL/H2O 1 mL에 용해시키고, 질소하에 탈기하고, 12시간 동안 환류시켰다. 반응 종료 후, EA로 추출하고 감압하에 농축하여 prep TLC를 이용하여 38 mg의 화합물 6을 얻었다(수율 13%).
단계 4: 화합물 6(38 mg, 107 μmol)을 3 mL의 THF/메탄올(1:1)에 용해시키고, 1 N-NaOH(430 μL, 430 μmol)를 첨가하고, 실온에서 12시간 동안 교반하였다. 반응 종료 후, 1 N-HCl을 이용하여 pH를 3으로 조정하고, 에틸아세테이트로 추출한 후 감압하에 농축하였다. 얻어진 반응 혼합물로부터 prep TLC를 이용하여 12 mg의 목적 화합물 7을 얻었다(수율 45%).
NMR 스펙트럼에 의해 동일성을 확인하였다: 1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 9.20 (1H, s), 8.97 (2H, m), 7.55 (2H, d, J=8Hz), 7.42 (2H, d, J=8Hz), 4.88(1H, m), 4.15 (1H, m), 3.82(2H, s), 3.01 (1H, m), 2.28 (1H, m), 1.98 (1H, m), 1.80(1H, m), 1.60 (2H, m), 1.17(3H, m).
(3) BnH12057의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(옥사졸-5-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 메틸 (3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(옥사졸-5-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실레이트(g)
DMA(4.71mL) 중 화합물 1-2-BnH12032(500mg, 1.41mmol), 옥사졸(97.5mg, 1.41mmol) 및 Bu4NOAc(553mg, 1.84mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(Oac)2 (95.1mg, 0.423mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 70℃에서 17시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:EtOAc = 1:1)로 정제하여, 요망되는 화합물(110 mg, 22%)을 갈색 오일로 얻었다.
단계 2: 화합물 BnH12057의 합성
THF(0.252mL) 중 메틸 (3R,6S)-6-메틸-1-(2-(4-(옥사졸-5-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실레이트(25.0mg, 0.073mmol)의 용액에 1N NaOH(0.110mL, 0.110mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(2.00 mL)로 희석하고, DCM(2.00 Х 2)으로 세척하였다. 수성층을 0℃에서 pH 1 내지 2가 될 때까지 1N HCl로 산성화시키고, EtOAc(3.00mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(3.00mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여, 화합물 BnH12057(10.0 mg, 41%)을 백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, Chloroform-d) δ 7.93 (s, 1H), 7.62 (d, J = 8.1 Hz, 2H), 7.37 - 7.29 (m, 3H), 4.98 (s, 0.5H), 4.83 (d, J = 13.9 Hz, 0.5H), 4.15 (d, J = 16.6 Hz, 0.5H), 3.92 (d, J = 13.9 Hz, 0.5H), 3.78 (s, 2H), 3.16 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.79 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.40 (s, 0.5H), 2.16 (d, J = 7.3 Hz, 0.5H), 1.94 (d, J = 14.3 Hz, 1H), 1.80 (q, J = 12.2, 11.3 Hz, 1H), 1.67 - 1.44 (m, 2H), 1.14 (d, J = 6.9 Hz, 3H).
(4) 화합물 BnH12067 합성(무수 형태)
(3S,6R)-6-메틸-1-(2-(4-(피라진-2-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 소듐 2-(4-(피라진-2-일)페닐)아세테이트(BnH12067-2)
MeCN/H2O(2:1, 4.76mL) 중 2-(4-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)페닐)아세트산(6-1-BnH12064-1, 100mg, 0.382mmol), 2-브로모피라진(66.3mg, 0.420mmol) 및 Na2CO3(121mg, 1.15mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(27.9mg, 0.038mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각하였다. 혼합물을 H2O(10.0 mL)로 희석하고, DCM(5.00mL Х 3)으로 세척하였다. 수성층을 감압하에 농축하여, 요망되는 화합물(90.0 mg, quant.)을 황색 고체로 얻었다. 요망되는 화합물을 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 2: 메틸 (3S,6R)-6-메틸-1-(2-(4-(피라진-2-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실레이트(BnH12067-1)
DMF(1.27mL) 중 소듐 2-(4-(피라진-2-일)페닐)아세테이트(BnH12067-2, 90mg, 0.381mmol)의 용액에 메틸 (3R,6S)-rel-6- 메틸-3-피페리딘카복실레이트(무수 형태)(62.9mg, 0.400mmol), DIPEA(0.100mL, 0.572mmol), HOBt(61.8mg, 0.457mmol) 및 EDC·HCl(71.0mg, 0.457mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 혼합물을 EtOAc(2.00mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (2.00mL) 및 염수(2.00mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 5% MeOH)로 정제하여, 요망되는 화합물(67.0 mg, 50%)을 갈색 오일로 얻었다.
단계 3: 화합물 BnH12067의 합성
THF(1.00mL) 중 메틸 (3S,6R)-6-메틸-1-(2-(4-(피라진-2-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실레이트(67.0mg, 0.190mmol)의 용액에 1N NaOH(0.284mL, 0.284mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(2.00 mL)로 희석하고, DCM(2.00 mL Х 2)으로 2회 세척하였다. 수성층을 0℃에서 pH 1 내지 2가 될 때까지 1N HCl로 산성화하고, EtOAc(2.00 mL)로 추출하였다. 유기층을 염수(3.00mL)로 세척하고, MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하여, 화합물 BnH12067(49.9 mg, 88%)을 회백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.25 (s, 1H), 8.71 (t, J = 2.0 Hz, 1H), 8.60 (d, J = 2.5 Hz, 1H), 8.10 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.39 (dd, J = 18.5, 7.9 Hz, 2H), 4.75 (s, 0.5H), 4.55 (d, J = 13.7 Hz, 0.5H), 4.28 (s, 0.5H), 3.92 (d, J = 13.8 Hz, 0.5H), 3.88 - 3.73 (m, 2H), 3.04 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.62 (t, J = 12.8 Hz, 0.5H), 2.19 (ddt, J = 11.7, 8.0, 4.0 Hz, 1H), 1.79 (d, J = 11.9 Hz, 1H), 1.66 (d, J = 13.7 Hz, 1H), 1.52 (s, 2H), 1.07 (dd, J = 9.2, 7.0 Hz, 3H).
(5) 화합물 BnH12095의 합성
(3R,6S)-6-메틸-1-(2-(3-(피리미딘-5-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 화합물 BnH12095의 합성
MeCN/H2O(2:1, 5.46mL) 중 메틸 (3R,6S)-1-(2-(3-브로모페닐)아세틸)-6-메틸피페리딘-3-카르복실레이트(8-1, 170mg, 0.424mmol), 5-(4,4,5 ,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리미딘(87.3mg, 0.424mmol) 및 Na2CO3(89.8 mg, 0.847mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하였다. 혼합물에 Pd(dppf)Cl2(31.0mg, 0.042mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(0.847mL, 0.847mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 혼합물을 H2O(5.00 mL)로 희석하고, EtOAc(5.00mL Х 3)로 세척하였다. 수성층에 1N HCl을 첨가하여 pH 값을 pH 2 내지 3으로 조정하고, 혼합물을 EtOAc(5.00 mL Х 3)로 추출하였다. 합한 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 3 내지 5% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12095(95.0mg, 66%)를 회백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.40 (s, 1H), 9.20 (s, 1H), 9.12 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.68 (d, J = 9.7 Hz, 2H), 7.49 (t, J = 7.7 Hz, 1H), 7.33 (dd, J = 15.5, 7.7 Hz, 1H), 4.74 (s, 0.5H), 4.61 - 4.49 d, J = 13.6 Hz, 0.5H), 4.33 (s, 0.5H), 3.98 (d, J = 13.6 Hz, 0.5H), 3.91 - 3.74 (m, 2H), 3.06 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.62 (t, J = 12.7 Hz, 0.5H), 2.15 (dd, J = 25.2, 12.4 Hz, 1H), 1.76 (s, 1H), 1.66 (dq, J = 12.1, 6.6 Hz, 1H), 1.54 (d, J = 9.8 Hz, 2H), 1.14 - 1.03 (m, 3H).
(6) 화합물 BnH12097의 합성
6-에틸-1-(2-(4-(피리미딘-5-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 에틸 1-(2-(4-브로모페닐)아세틸)-6-에틸피페리딘-3-카르복실레이트(BnH12097-1)
DMF(9.00mL) 중 2-(4-브로모페닐)아세트산(700mg, 3.26mmol)의 용액에 에틸 6-에틸피페리딘-3-카르복실레이트(p, 633mg, 3.42mmol), DIPEA(1.70mL, 9.77mmol), HOBt(528mg, 3.91mmol) 및 EDC·HCl(749mg, 3.91mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc(25.0mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (25.0mL) 및 염수(25.0mL)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:EtOAc = 1:0 내지 2:1)로 정제하여, 요망되는 화합물(302 mg, 36%, 2 단계)을 황색 오일로 얻었다.
단계 2: 화합물 BnH12097의 합성
MeCN: H2O(2:1, 4.80mL) 중 에틸 1-(2-(4-브로모페닐)아세틸)-6-에틸피페리딘-3-카르복실레이트(150mg, 0.392mmol), 5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리미딘(80.9mg, 0.392mmol) 및 Na2CO3(83.2mg, 0.785mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(28.7mg, 0.039mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 3시간 동안 환류시켰다. 교반한 후, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(0.970mL, 0.970mmol)를 첨가하고, 50℃에서 17시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 H2O(5.00mL)로 희석하고, DCM(5.00mL x 2)으로 2회 세척하였다. 수성층을 0℃에서 pH 1 내지 2가 될 때까지 1N HCl로 산성화하고, EtOAc(5.00mL)로 추출하였다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM:MeOH = 1:0 내지 4:1)로 정제하여, 화합물 BnH12097(35.3mg, 26%)을 옅은 갈색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 9.18 - 9.14 (m, 3H), 7.77 (d, J = 7.8 Hz, 2H), 7.39 (dd, J = 14.3, 7.9 Hz, 2H), 4.58 - 4.54 (m, 1H), 3.99 - 3.71 (m, 3.5H), 2.96 (t, J = 12.9 Hz, 0.5H), 2.19 - 2.09 (m, 1H), 1.79 (s, 1H), 1.65 - 1.39 (m, 5H), 0.77 (dt, J = 14.0, 7.3 Hz, 3H).
(7) 화합물 BnH12098의 합성
6-이소프로필-1-(2-(4-(피리미딘-5-일)페닐)아세틸)피페리딘-3-카르복실산
단계 1: 에틸 1-(2-(4-브로모페닐)아세틸)-6-이소프로필피페리딘-3-카르복실레이트(BnH12098-1)의 합성
DMF(9.69mL) 중 2-(4-브로모페닐)아세트산(620mg, 2.91mmol)의 용액에 에틸 6-이소프로필피페리딘-3-카르복실레이트(s, 608mg, 3.05mmol), DIPEA(1.52mL, 8.72mmol), HOBt(471mg, 3.49mmol) 및 EDC·HCl(542mg, 3.49mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc(20.0mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (20.0mL) 및 염수(20.0mL)로 세척하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(n-헥산:EtOAc = 3:1 내지 2:1)로 정제하여, 요망되는 화합물(618 mg, 54%, 2 단계)을 황색 오일로 얻었다.
단계 2: 화합물 BnH12098의 합성
MeCN: H2O(2:1, 9.64mL) 중 에틸 1-(2-(4-브로모페닐)아세틸)-6-이소프로필피페리딘-3-카르복실레이트(300mg, 0.748mmol), 5-(4,4,5,5-테트라메틸-1,3,2-디옥사보롤란-2-일)피리미딘(154mg, 0.748mmol) 및 Na2CO3(158mg, 1.50mmol)의 용액을 격렬하게 교반하고, N2 가스로 5분 동안 버블링하고, Pd(dppf)Cl2(54.7mg, 0.075mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 N2 가스로 5분 동안 버블링하고, 90℃에서 2시간 동안 환류시켰다. 교반한 후, 혼합물을 실온으로 냉각하고, 1N NaOH(1.50mL, 1.50mmol)를 첨가하고, 50℃에서 17시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 H2O(5.00mL)로 희석하고, DCM(5.00mL x 2)으로 2회 세척하였다. 수성층을 0℃에서 pH 1 내지 2가 될 때까지 1N HCl로 산성화하고, EtOAc(10.0mL)로 추출하였다. 유기층을 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 감압하에 농축하였다. 잔류물을 SiO2 상에서의 컬럼 크로마토그래피(DCM 중 5 내지 10% MeOH)로 정제하여, 화합물 BnH12098(90 mg, 33%)을 회백색 고체로 얻었다.
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.39 (s, 1H), 9.20 - 9.12 (m, 3H), 7.78 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.40 (dd, J = 10.7, 7.9 Hz, 2H), 4.62 - 4.54 (m, 0.5H), 4.25 - 4.13 (m, 0.5H), 3.97 (dd, J = 14.9, 4.1 Hz, 0.5H), 3.93 - 3.68 (m, 2H), 3.60 (d, J = 10.2 Hz, 0.5H), 2.96 (t, J = 13.0 Hz, 1H), 2.29 - 1.96 (m, 2H), 1.82 (d, J = 14.5 Hz, 1.5H), 1.70 - 1.55 (m, 1H), 1.32 (dt, J = 28.1, 13.4 Hz, 1H), 0.92 (dd, J = 17.3, 6.5 Hz, 3H), 0.75 (dd, J = 25.8, 6.6 Hz, 3H).
상기 제조예에서 얻은 화합물들을 이용하여 다음과 같이 생물학적 검정을 수행하였다.
실시예
실시예 1. 세포 배양 및 유지
인간 미분화 신경모세포종 세포주 SH-SY5Y 및 인간 배아 신장 세포주(HEK)-293T를 각각 한국 세포주 은행(한국) 및 다카라(Takara)(일본)에서 각각 구입하였다. 세포들을, 10%(v/v) 소태아혈청(FBS), 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토마이신(100 mg/mL)이 보충된, HyClone Minimal Essential Medium(MEM) 및 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에서 각각 성장시켰다. 세포를 37℃에서 95% 공기와 5% CO2의 가습된 분위기에서 유지시켰다. 세포를 최대 10회 계대하였다. 0.05% 트립신-EDTA 용액을 사용하여 세포를 분리하고, 유지를 위해 새로운 배양 접시에 세포를 시딩했다.
한편, 1차 피질 뉴런 세포(Primary cortical neuron cell)는 임신 18일된 쥐의 태아에서 대뇌피질을 적출하여 0.25% 트립신과 DNase1dl 포함된 prep media(조성(mM): NaCl 107.5, NaH2PO4 1, NaHCO3 33.5, glucose 11, HEPS 1%, penicillin-streptomycin 1%)에서 30분간 인큐베이션 후 단일세포로 분리하여 시딩하였다. 1차 피질 뉴런 세포는 1%(v/v)B27, 1% 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토마이신(100 mg/mL), 1% Glutamax이 보충된, Neurobasal 배지에서 성장시켰다. 세포를 37℃에서 95% 공기와 5% CO2의 가습된 분위기에서 유지시켰다. 1차 피질 뉴런 세포는 14일간 배양 후 약물 효능평가를 실시하였다.
실시예 2. 세포 독성 시험
인간 세포주에서 본 명세서에 기재된 화합물의 세포독성을 조사하기 위해, SH-SY5Y 및 293T 세포를 사용하였다. 96-웰 플레이트(한국 포천 소재의 SPL Life Sciences Co., Ltd.)의 웰당 약 8,000개의 세포(293T의 경우) 및 15,000개의 세포(SH-SY5Y의 경우)를 플레이팅하였다. 5% CO2가 함유된 가습된 분위기에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 후, 배양 배지를 해당 배양액으로 희석된 일련의 농도의 시험 화합물로 교체했다. 동시 인큐베이션 시간은 24시간이었고, 각 측정에 대해 6회의 반복실험이 이루어졌다. 마지막으로, 10 μL의 CCK-8 시약(미국 매릴리드 록빌 소재의 Dojindo Laboratories)을 각 웰에 첨가하고, 37°C에서 3분 동안 인큐베이션 후 다기능 마이크로플레이트 판독기(테칸(Tecan)의 Infinite M200 Pro)를 이용하여 450 nm에서의 OD를 측정하였다. 이러한 측정값을 대조군의 측정값과 비교하고, 세포 생존율을 계산하기 위해 이를 대조군의 백분율로 표현하였다. SPSS 소프트웨어를 사용하여 IC50 값을 계산하였다. 이렇게 하기 위해, 성장 배지만 있는 빈 웰의 흡광도를 세포가 있는 웰에 대한 값에서 감하였다. 백그라운드(비히클(vehicle))의 판독값을 100% 생존율로 설정하고, 이어서 각 시험 용액의 생존율을 계산했다.
세포 생존율(%) = [(As-Ab)/(Ac-Ab)] X 100
데이터를 평균값과 평균의 표준오차(S.E.M.)로 나타냈다. Tukey의 사후 시험(미국 GraphPad Software Inc.의 GraphPad Prism 5 소프트웨어 패키지, 버전 5.02)를 사용하여 일원 ANOVA로 통계 분석을 수행했다. 유의성은 p < 0.05에서 인정되었다.
실시예 3. BDNF 및/또는 GluN2B의 발현량 측정
실시예 3.1. RT-PCR
RT-PCR을 사용하여 본 발명의 화합물에 반응한 BDNF 및 GluN2B의 양을 측정하였다. 0.05% 트립신-EDTA 용액을 사용하여 293T 세포를 분리하고, RNA 작업을 위해 24웰 또는 6웰 접시에 시딩했다. 5% CO2가 함유된 가습된 분위기에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션 후, 배양 배지를 FBS가 없는 DMEM으로 희석된 일련의 농도의 시험 화합물을 함유하는 배지로 교체했다. 시간 경과 실험을 수행했다. 음성 대조군으로는 동일한 양의 DMSO를 사용했다.
화합물 처리 후 RNA를 세포로부터 분리하였다. 성장 배지를 제거한 후 1 Х 105 내지 107 개 세포당 0.3 내지 0.4 mL의 TRIzolTM을 배양 접시에 세포를 직접 첨가하여 세포를 용해시켰다. 4℃에서 10분 동안 인큐베이션 후, 샘플을 4℃에서 12,000 x g에서 10분 동안 원심분리했다. 총 RNA 침전물은 튜브 바닥에 흰색 젤 같은 펠릿을 형성했다. 상층액을 버린 후, 펠릿을 용해에 사용된 1 mL의 TRIzolTM당 1 mL의 75% 에탄올에 재현탁시켰다. 샘플을 간단히 볼텍싱한 후, 샘플을 4℃에서 7500 x g에서 5분 동안 원심분리했다. 상층액을 마이크로피펫으로 버리고, 5분 내지 10분 동안 진공 또는 공기 건조시켰다. 펠릿을 20 내지 50 μL의 RNase가 없는 물에 재현탁시켰다. RNA 농도를 Thermo ScientificTM μDropTM 플레이트로 결정하였다. A230/260 및 A260/280 비를 측정하여 RNA 품질을 결정했다.
얼음 위에서, 뉴클레아제가 없는 물 중 실험용 RNA(4 ul 중 최대 1 μg)와 올리고 dT 프라이머 1 ul(100 pmol)을 RT 반응당 5 μl의 최종 부피로 합쳤다. 각각의 RNA 튜브를 단단히 닫은 후, 튜브를 70℃에서 5분 동안 (PCR 기계에) 넣었다. 튜브를 꺼낸 후, 즉시 튜브를 적어도 5분 동안 얼음물에 냉각시켰다. 각 튜브를 미세원심분리기에서 10초 동안 원심분리하여, 응축물을 수집하고 원래 부피를 유지시켰다. 역전사 반응 혼합물을 첨가할 때까지 얼음 위에서 튜브를 닫은 채로 유지하였다. 역전사 반응 혼합물을 다음과 같이 제조하였다.
제조업체의 지침에 따라 Improm-II 역방향 Transcriptase(A3803)(Promega) 및 Recombinant RNasin Ribonuclease Inhibitor(N2515)(Promega)를 사용하여 역전사를 수행하였다. 15 μl 분취량의 역전사 반응 혼합물을 얼음 위의 각 반응 튜브에 첨가하고, 튜브를 PCR 기계에 다시 넣었다. PCR 조건은 다음과 같았다:
25℃, 5분(어닐링) → 42℃, 60분(신장) → 70℃, 15분(RT의 비활성화) → 4℃에서 유지
PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하였다. 하우스키핑 유전자(ACTIN)를 PCR 대조군으로 사용했다. 반복실험용 샘플은 RNA 수준에서 관찰된 변화의 유효성을 확인했다. 사용된 프라이머 서열은 다음과 같다:
실시예 3.2. 웨스턴 블롯팅
웨스턴블롯을 사용하여 본 발명의 화합물에 반응한 GluN2B의 양을 측정하였다. 임신17일 마우스에서 태아의 대뇌피질을 적출하여 단일 세포로 분리하고 13일 동안 배양하여 24시간 BnH 약물들 처리하였다. 약물을 처리한 세포들은 프로테아제 및 인산염 억제제를 포함하는 RIPA 단백질 용해 완충액을 사용하여 세포로부터 단백직 용해물을 제조하였다. 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준으로 하는 BCA 단백질 검정 키트(Pierce Biotechnology)를 사용하여 결정하였다. 동일한 양의 단백질(레인당 20 μg)을 SDS-폴리아크릴아미드 젤에서 90V로 2시간 동안 전기영동으로 분히한 다음 SDS-폴리아크릴아미드 젤을 PVDF 멤브레인으로 100V에서 1시간 동안 트랜스퍼하고 GluN2B 항체 (ab65783, Abcam)로 4℃에서 1차 반응을 하루 동안 수행하고, 1X PBT로 10분 간격으로 3번 세척한 뒤, 항-마우스항체 (sc-2357, Santa Cruz)로 1시간 동안 2차 반응을 수행한 후, 다시 1X PBT로 10분 간격으로 3번 세척하였다. 상기와 같은 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하여 GluN2B 단백질 발현을 확인하였다. 후속하여 항-β-액틴 항체(sc-47778, Santa Cruz)를 사용하여 각 블롯을 리프로빙(re-probing)하였다. 하우스키핑 단백질 β 액틴이 정규화 대조군으로 검출되었다.
그 결과, 표 6과 같이 다양한 BnH12 계열 화합물들에서 GluN2B의 단백질의 변화를 확인하였다.
데이터 분석
비히클을 1로 설정하여 BnH12 계열들의 증감을 확인하였다(각 그룹당 N은 3이상으로 함).
실시예 4. 시냅스 기능 시험
실시예 4.1. Os 펌프 이식
8주령 수컷 C57BL/6J 마우스를 수술 중 이소플루란으로 마취시켰다. 이어서, 마우스를 정위 프레임(중국 소재의 RWD Life Science)에 배치했다. 정수리뼈와 앞머리뼈를 눈높이에서 후두부 돌출부까지의 정중선에서 두피의 시상절개에 의해 노출시켰다. 두개골을 노출시킨 후 작은 천두공(burr hole)을 뚫었다. 주입 캐뉼러를 다음 좌표에 배치하였다: (마우스: 정수리점 -3.30, 외측 -1.50, 및 복측 0.7 mm). 멸균 염수 용액(+/- 본 발명의 화합물)을 미니-Os 펌프(미국 캘리포니아주 소재의 DURECT Corporation ALZET Osmotic Pumps)를 사용하여 주입 캐뉼러를 통해 0.5μL/h의 일정한 유속으로 관류시켰다. 동측 배럴 피질의 제4층에서 이식을 수행하였다. 펌프 주입 중 배럴 피질의 제4층에서의 주입된 화합물의 확산 정도를 추정하기 위해, 먼저 메틸렌 블루를 주입하여 확산 영역을 염색했다. 평균적으로, 메틸렌 블루는 주입 부위에서 2000.0 μm까지 확산하였다(배럴 피질 영역의 전체 면적은 약 1500 μm임). 이 분석을 바탕으로, 배럴 피질 영역을 기록했다.
실시예 4.2. 화합물의 경구 투여
BnH12003을 DMSO:PEG400:식염수(5:55:40)를 사용하여 용해시키고, 25 mg/kg(200 μl/동물)의 용량으로 투여하였다. 대조군의 경우 DMSO:PEG400:식염수(5:55:40)(200㎕/동물)를 투여하였다. 8주령부터 출발하여 10일차에서 31일차까지 화합물을 1일 1회로 22회 투여하였다.
실시예 4.3. 화합물의 복강내 주입
화합물을 DMSO:PEG400:식염수(5:55:40)를 사용하여 25 mg/kg으로 희석하였다. 화합물을 약 11 내지 12일 동안 매일 오전 10시에 복강내 투여하였다(복강내 부피는 200 ㎕임). 대조군의 경우 비히클(DMSO:PEG400:식염수(5:55:40))을 이용하여 동일한 방식으로 복강내 주입에 의해 투여하였다. 화합물 투여군과 대조군 각각의 경우 5마리의 마우스를 사용하였다.
실시예 4.4. 시상피질(TC) 또는 해마 슬라이스의 준비
TC 또는 해마 슬라이스의 준비를 위해, 9주령 내지 10주령 수컷 C57BL/6J 마우스를 이소플루란으로 마취시켰다. 이어서, 빙냉 수크로오스-인공 뇌척수액(aCSF)으로 경심 관류를 통해 뇌를 빠르게 냉각시켰다. 뇌를 분리하고, 빙냉 수크로오스 aCSF에 넣었다. 관상사면(paracoronal) 슬라이스를 10° 각도의 램프(ramp)에서 정중선에 대해 50° 각도로 준비하였다. 이어서, 슬라이스를 35°C에서 30분 동안 aCSF에서 인큐베이션하여 회복시켰다. 이어서, 실험용 기록 챔버에 넣기 전에 슬라이스를 실온(23 내지 25℃)에서 1 내지 4시간 동안 aCSF에서 인큐베이션하였다. 표준 aCSF는 95% O2/5% CO2로 포화된 것을 포함한다. 마우스의 뇌를 분리하고, 50° 각도(마우스의 경우 55° 각도)로 400 um로 절단하여 절단된 부분이 바닥이 되도록 비브라톰 디스크에 부착하였다. 뇌 슬라이스를 35℃에서 30분 동안 aCSF 용액에서 인큐베이션하거나 실온에서 1시간 동안 aCSF 용액에서 인큐베이션하였다.
수크로오스 기반 aCSF의 조성
리코딩(recording) aCSF의 조성(실온: RT)
실시예 4.5. 배럴 피질에 대한 전기생리학적 실험
모든 전기생리학적 실험을 27 내지 29℃에서 수행하였다. 전기생리학적 실험을 위해, 저항이 3.5 내지 4.2 mΩ인 전극을 사용하고, 동심 양극성 전극(미국 메인주 보우도인 소재의 FHC)을 사용하여 복부 후내측 핵(VPM)에 자극을 가했다. 4X 배율 및 차동 간섭 대비(DIC) 광학 하에서 배럴의 존재에 의해 그리고 VPM 자극에 의해 짧고 일정한 잠복장 흥분성 시냅스후 전위(fEPSP)를 유발하는 능력에 의해 체성감각 피질을 확인하였다. 전세포 전압-클램프 기록은 적외선 조명 및 차동 간섭 대비(DIC) 광학을 사용하여 체성 감각 배럴 피질의 IV층에 있는 성상 세포(stellate cell, SC)에서 이루어졌다. 전세포 리코딩 용액의 조성은 다음과 같이 제시된다:
전세포 리코딩 내부 용액
전세포 기록은 10 kHz에서 디지털화되고 2 kHz에서 필터링된 멀티클램프 700A(미국 캘리포니아주 서니배일 소재의 Molecular devices)를 사용하여 이루어졌다. 기록 동안 입력 저항 및 직렬 저항을 이전에 설명된 대로 모니터링하였다(문헌[Isaac, Crair, Nicoll, & Malenka, 1997, Silent synapses during development of thalamocortical inputs, DOI: 10.1016/s0896-6273(00)80267-6]). TC EPSC를 VB 자극에 의해 0.1 Hz에서 유발시켰고, 이는 이전에 설명된 대로 자극 강도가 증가해도 변하지 않는 짧고 일정한 잠복기를 나타내는 경우 단일시냅스로서 인정되었다(문헌[Feldman, Nicoll, Malenka, & Isaac, 1998, Synaptic plasticity at thalamocortical synapses in developing rat somatosensory cortex: LTP, LTD, and silent synapses, https://doi.org/10.1002/(SICI)1097-4695(199910)41:1<92::AID-NEU12>3.0.CO;2-U; 문헌[Isaac et al., 1997, Silent Synapses during Development of Thalamocortical Inputs, https://doi.org/10.1016/S0896-6273(00)80267-6]).
최소 자극 프로토콜(포텐시)의 경우, VB 시상 자극 강도를 조정하여 시냅스 반응과 실패의 혼합을 유발한 가장 낮은 강도를 찾았다. 실패율은 실패 횟수/총 시도 횟수로 계산되었다. 포텐시는 실패를 제외한 평균 EPSC 피크 진폭으로 계산되었다(문헌[Chittajallu & Isaac, 2010, Emergence of cortical inhibition by coordinated sensory-driven plasticity at distinct synaptic loci, DOI: 10.1038/nn.2639]; 문헌[Isaac et al., 1997, Silent Synapses during Development of Thalamocortical Inputs, https://doi.org/10.1016/S0896-6273(00)80267-6]; 문헌[Stevens & Wang, 1995, Facilitation and depression at single central synapses, DOI: 10.1016/0896-6273(95)90223-6]).
단일-축삭 자극에 대한 기준은 이전에 보고된 바와 같이 시냅스 이벤트가 전부 있거나 전혀 없는 것 및 자극 강도의 작은 증가에 의해 유발된 EPSC의 평균 진폭의 변화가 없는 것이었다(문헌[Chittajallu and Isaac, 2010, Emergence of cortical inhibition by coordinated sensory-driven plasticity at distinct synaptic loci, DOI: 10.1038/nn.2639]; 문헌[Gil et al., 1999, Efficacy of Thalamocortical and Intracortical Synaptic Connections: Quanta, Innervation, and Reliability, https://doi.org/10.1016/S0896-6273(00)80788-6]). 측정 매개변수는 다음과 같다:
측정 매개변수
패치 클램프 증폭기(미국 소재의 Molecular Devices)를 사용하여 전세포 패치 클램프 방법으로 흥분성 시냅스후 전위(EPSC)를 기록하였다. 측정 전극은 붕규산 유리 모세관(borosilicate glass capillary)이었고, 전극 내부 용액을 채웠을 때 저항이 3.5 MΩ 내지 4.2 MΩ인 유리 모세관을 사용하였다. 챔버 내의 뇌 슬라이스를 수직 현미경에 놓고, 앵커로 고정하여 중력에 의해 5 내지 10 mL/min의 속도로 리코딩 aCSF 용액을 흐르게 했다. 자극기의 전극을 시상 섬유와 S1 배럴 피질(제4층) 영역 내의 연결부에 놓고, 해당 영역 내의 세포를 찾아 기록했다. 전세포 패치 후, 막 전압을 -70 mV로 고정하고(AMPA 전류를 측정함), 자극을 가하여 EPSC를 확인하고, 자극기를 조작하여 전류 on/off가 50%가 되는 최소 자극 강도를 찾았다. 3분 20초 또는 8분 20초 동안 기록 및 전류에 대한 트레이스(총 20개 또는 50개의 트레이스)로 진폭을 측정하였다. 포텐시의 경우, EPSC 크기를 -70 mV에서 50 내지 100 pA로 설정하고, 0 mV에서 5개의 트레이스를 측정하였다.
실시예 4.6. 해마에 대한 전기생리학적 실험
aCSF로 채워진 세포외 유리 피펫(3.5 MΩ)을 사용하여 CA1 영역의 방사층(stratum radiatum)에 위치한 동심 양극성 전극으로 장(field) 기록을 수행하였다. 구체적으로, fEPSP는 리코딩 피펫으로부터 200 내지 300 μm에 배치된 동심 양극성 전극을 사용하여 샤퍼 콜라테럴(Schaffer collateral, SC)/교련(commissural) 섬유에 의해 유발되었다. 자극은 샤퍼 콜라테럴-CA1(SC)에 배치된 양극성 전극(미국 메인주 보우도인 소재의 FHC)을 통해 전달되었다. Te SC 회로는 4X 배율에서 차동 간섭 대비(DIC) 현미경을 사용하여 시각화되었고, SC 입력 자극에 의해 CA1 시냅스에서 짧고 일정한 잠복장 흥분성 시냅스후 전위(fEPSP)를 유발하는 능력에 의해 확인되었다. 모든 fEPSP 실험에서 모든 실험을 시작하기 전에 시험 자극을 측정하였고(30 μA), 최대 fEPSP의 50%를 유발하는 시험-펄스 자극 강도를 사용했다. 기준선 시냅스 반응을 30분 동안 기록하고, 이어서 고주파 자극(HFS, 100 Hz, 4회 트레인(train), 1초의 지속 시간, 20초의 트레인 사이 간격)에 의해 장기 강화(long-term potentiation, LTP)를 유도했다. Digidata 1440으로 10 kHz에서 디지털화되고 2 kHz에서 필터링되는 멀티클램프(multiclamp) 700A 증폭기(미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 Molecular Devices) 및 pClamp 10.0 소프트웨어(미국 캘리포니아주 새너제이 소재의 Molecular Devices) 를 사용하여 1시간 동안 10초마다 기록을 수행하였다. 측정 매개변수는 다음과 같다:
측정 매개변수
패치 클램프 증폭기(미국 소재의 Molecular Devices)를 사용하는 전세포 패치 클램프 방법에 의해 흥분성 시냅스후 전위(excitatory postsynaptic potential, EPSP)를 기록하였다. 측정 전극은 붕규산 유리 모세관(borosilicate glass capillary)이었고, 전극 내부 용액을 채웠을 때 저항이 3.5 MΩ 내지 4.2 MΩ인 유리 모세관을 사용하였다. 챔버 내의 뇌 슬라이스를 수직 현미경에 놓고, 앵커로 고정하여 중력에 의해 5 내지 10 mL/min의 속도로 리코딩 aCSF 용액을 흐르게 했다. 자극기의 전극을 SC 영역에 놓고, CA1 영역 내의 연결부을 찾아 기록했다. 자극 강도가 증가함에 따라, fEPSP가 증가하지 않거나 팝 스파이크(pop spike)가 발생할 때까지 포인트를 기록했다(I/O 곡선). 기준선 시냅스 반응을 20분 동안 기록하고, 이어서 고주파 자극(HFS, 100 Hz, 4회 트레인, 1초의 지속 시간, 20초의 트레인 사이 간격/TBS; 100 Hz, 10회 트레인, 50 밀리초의 지속 시간, 200 밀리초의 트레인 사이 간격)에 의해 장기 강화(LTP)를 유도했다. 이어서, 60분 동안 기록했다(LTP).
실시예 4.7. 데이터 분석
포텐시 분석을 수행하기 위해, Clampfit 프로그램(Axon Instruments)을 사용했다. 0 내지 100 ms 사이의 간격을 지정하여 기준선을 설정했다. 트레이스는 110 내지 200 ms 이내에 나오는 'On' 전류를 선택하여 평균을 구했다. 평균 트레이스의 네거티브 전류 진폭(pA)을 확인했다.
Clampfit을 사용하여 GABA/AMPA 비를 분석했다. AMPA 전류의 경우, 0 내지 100 ms 사이의 간격을 지정하여 기준선을 설정했다. 110 내지 200 ms 이내의 데이터의 트레이스의 평균을 구했다. 평균 트레이스의 네거티브 전류 진폭(pA)을 확인했다. GABA 전류의 경우, 0 내지 110 ms 사이의 간격을 지정하여 기준선을 설정했다. 110 내지 300 ms 이내의 데이터의 트레이스의 평균을 구했다. 평균 트레이스의 포지티브 전류 진폭(pA)을 확인했다.
Clampfit을 사용하여 I/O 곡선을 계산했다. 0에서 6 ms 사이의 간격을 지정하여 기준선을 설정했다. 동일한 자극으로부터 기록된 트레이스(각각 5개)의 평균을 구했다. 파이버 발리(fiber volley)의 진폭과 fEPSP의 20 내지 80% 상승 기울기를 분석했다. LTP의 경우, 0 내지 6 ms 사이의 간격을 지정하여 기준선을 설정했다. HFS(또는 TBS)를 사용한 LTP 유도 전후 fEPSP의 20 내지 80% 상승 기울기를 분석했다.
실시예 4.8. 통계 분석
모든 데이터를 평균 ± SEM으로 나타냈고, n은 각 실험에 사용된 세포의 수를 나타낸다. 일반적으로, 각 동물로부터 하나의 슬라이스가 사용되었고; 각 슬라이스로부터 1회의 기록이 수행되었다. 두 군으로부터의 평균 값을 비교하기 위해 독립 표본(unpaired) 스튜던트 t 테스트를 이용했고, 셋 이상의 군의 경우 일원 ANOVA를 이용했다. 0.05 미만의 p 값이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. Prism 9.0(미국 소재의 GraphPad Software Inc.의 GraphPad Prism 9.1.2)을 사용하여 이러한 통계 분석을 수행하였다.
제조업체의 지침에 따라 Graphpad, Prism 9를 사용하여 용량 반응 곡선을 작도했다.
실시예 4.9. 웨스턴 블로팅
시상피질(TC) 슬라이스의 준비를 위해, 9주령 내지 10주령 수컷 C57BL/6J 설치류(마우스)를 이소플루란으로 마취시켰다. 이어서, 빙냉 수크로오스-인공 뇌척수액(aCSF)으로 경심 관류를 통해 뇌를 빠르게 냉각시켰다. 뇌를 분리하고, 빙냉 수크로오스 aCSF에 넣었다. 관상사면(paracoronal) 슬라이스를 10° 각도의 램프(ramp)에서 정중선에 대해 50° 각도로 준비하였다. 이어서, 슬라이스를 35℃에서 30분 동안 aCSF에서 인큐베이션하여 회복시켰다.
이어서, 실험용 기록 챔버에 넣기 전에 슬라이스를 실온(23 내지 25℃)에서 1 내지 4시간 동안 aCSF에서 인큐베이션하였다. 표준 aCSF는 95% O2/5% CO2로 포화된 것을 포함한다.
수크로오스 기반 aCSF의 조성
리코딩 Acsf의 조성(실온: RT)
모든 전기생리학적 실험을 27 내지 29℃에서 수행하였다. 중력을 이용하여 수크로오스 기반 aCSF 용액(4℃)으로부터 혈액을 흐르게 하여 설치류(마우스)를 관류시켰다. 설치류(마우스)의 뇌를 분리하고, 50° 각도(마우스의 경우 55° 각도)로 400 um로 절단하여 절단된 부분이 바닥이 되도록 비브라톰 디스크에 부착하였다. 뇌 슬라이스를 35℃에서 35℃ 인큐베이트 aCSF 용액에서 30분 동안 인큐베이션하거나 RT에서 1시간 동안 RT 인큐베이트 aCSF 용액에서 인큐베이션하였다. 위의 프로토콜에 따라 마우스의 피질 조직을 준비하고, 이어서 단백질 추출을 위해 균질화하고 용해시켰다. 제조업체의 지침에 따라 프로테아제 및 포스페이트 억제제를 함유하는 NP40(FNN0021, Invitrogen) 단백질 용해 완충액을 사용하여 조직으로부터 단백질 용해물을 제조하였다. 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준으로 하는 BCA 단백질 검정 키트(Pierce Biotechnology)를 사용하여 결정하였다. 동일한 양의 단백질(레인당 20 μg)을 8% 또는 12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동으로 분리한 다음 PVDF 막(GE Healthcare)에 블로팅하였다. 비특이적 결합을 차단하기 위해, 막을 PBST(150 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7.4, 0.05% Tween 20) 중 5% 무지방 분유에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 항-HDAC4(SAB4300413, Sigma-Aldrich), 항-BDNF(ANT-010, Alomone Las), 항-NMDAR2B(ab65783, abcam plc) 항체를 4°C에서 2% 차단 용액에서 밤새 인큐베이션하였다. 항체와의 인큐베이션 및 PBST에서의 수회 린스(rinse) 후, 막을 마우스 항-토끼 IgG-HRP 접합 이차 항체(sc-2357, Santa Cruz)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다. 후속하여 항-β-액틴 항체(sc-47778, Santa Cruz)를 사용하여 각 블롯을 리프로빙(re-probing)하였다. 하우스키핑 단백질 β 액틴이 정규화 대조군으로 검출되었다. 본 명세서에 설명된 방법에 사용되는 항체는 다음과 같다:
실시예 5. PTSD에서의 치료 효능
실시예 5.1. 동물 입수 및 관리
동물은 DBL에서 입수하였다. 동물은 시험 시작 7일 전에 입수하였다. 약 7주령의 20마리의 수컷 SD-래트를 사용하였다. 동물을 콜로니 룸(colony room)에서 12/12시간 명암 주기에 따른 통상적인 환경 조건으로 유지시키고, 음식과 물을 자유롭게 섭취하게 하였다. 래트를 7일에 걸쳐 새로운 하우징 케이지에 적응시켰다. 이들 동물을 사용하여 모든 시험을 수행하였다. 모든 실험을 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행했고, 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였다. 7일차부터 3일 간격으로 체중을 측정했다.
실시예 5.2. PTSD의 래트 모델링
이 프로토콜은 탈출 기회 없이 발 충격(foot shock)으로의 2회 노출을 포함한다.
컨텍스트(Context) A(-1일차)
체중을 실험 3시간 전에 측정하였다. 실험실의 온도를 22℃로 유지하였다. 동물을 적응시키기 위해 10분 동안 어두운 실험실 공간에 두었다. 동물을 각각 첫 번째 방에 넣었다. 2분 후, 두 구획을 분리하는 문을 열고, 동물이 양쪽을 자유롭게 오가게 하였다. 5분 후, 1 mA/2초의 15회 발 충격을 무작위 시간(90초 내지 270초) 간격으로 적용했다. 시험을 종료한 후, 동물을 상자에 1분간 방치하고 콜로니 룸으로 이동시켰다.
컨텍스트 B(0일차)
체중을 실험 3시간 전에 측정하였다. 실험실의 온도를 22℃로 유지하였다. 동물을 적응시키기 위해 10분 동안 어두운 실험실 공간에 두었다. 동물을 사포(sandpaper)가 부착된 첫 번째 구획에 넣었다. 이때, 문은 닫힌 상태로 유지되어, 동물이 두 번째 구획으로 건너갈 수 없었다. 10분 후 동물에게 2 mA/sec의 3회 충격을 가했다. 시험을 종료한 후, 동물을 상자에 1분간 방치하고 콜로니 룸으로 이동시켰다.
화합물 주입
DMSO:PEG400:식염수(5:55:40)를 사용하여 화합물을 25 mg/kg으로 희석하였다. 7일차부터 24일 동안 화합물을 매일 오전 10시에 복강내 투여하였다(복강내 투여 부피는 200 μl임). 대조군도 비히클(DMSO:PEG400:식염수(5:55:40))을 사용하여 동일한 방식으로 복강내 주입하였다.
프리징 확인
프리징 확인을 위해, 초기 발 충격 프로토콜 후 7일차에 래트를 장치의 사포가 있는 첫 번째 구획에 5분 동안 넣고(발 충격 없음) 제조업체의 지침에 따라 shutavoid_v1803 프로그램(스페인 소재의 Panlab)을 사용하여 프리징 거동을 기록했다. 이때, 문은 컨텍스트 B와 같이 닫힌 채로 유지되었다. 프리징은 래트의 골격근 운동이 없는 상태로 정의하였다. 프리징 시간이 240초 이하인 동물은 제외하였다. 제외된 동물은 CO2를 사용하여 희생시켰다.
데이터 분석
전자 상자의 투명 아크릴 판 앞에는 모든 동물 움직임을 확인하기 위해 카메라를 배치하였다. 모든 군에 대해 7일차부터 3일마다 프리징을 확인하였다. 각 동물을 5분 동안 촬영하였다. 영상을 바탕으로, 각 동물의 프리징 시간을 확인하였다. 7일차의 프리징 시간을 100%로 설정하고, 이어서 요일별 프리징 시간을 백분율로 환산하였다.
실시예 6. AD에서의 치료 효능
실시예 6.1. 동물 입수 및 관리
알츠하이머의 동물 모델인 APP/PS1 마우스는 Taconic Bioscience로부터 입수하였다. 동물은 시험 시작 7일 전에 입수하였다. 약 15개월령의 20마리의 수컷 마우스를 사용하였다. 동물을 콜로니 룸(colony room)에서 12/12시간 명암 주기에 따른 통상적인 환경 조건으로 유지시키고, 음식과 물을 자유롭게 섭취하게 하였다. 마우스를 7일에 걸쳐 새로운 하우징 케이지에 적응시켰다. 이들 동물을 사용하여 모든 시험을 수행하였다. 모든 실험을 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행했고, 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였다. 7일차부터 3일 간격으로 체중을 측정했다.
실시예 7. BnH12003의 선택
실시예 7.1. 시험관내 세포독성
BnH12003으로 세포를 처리하고 세포 생존율을 측정함으로써, 화합물의 세포 독성을 평가했다.
인간 세포주 293T 및 SH-SY5Y에서 BnH12003(0, 0.1, 1, 10, 100 μM) 처리에 반응한 세포 생존율을 측정한 결과, 모든 농도 범위에서 세포 생존율의 유의한 변화가 없는 것으로 나타났고, 이로써 BnH12003의 세포독성 안전성을 확인할 수 있었다(도 1a 및 도 1b).
실시예 7.2. 생체외 시냅스 가소성을 향상시키는 효능의 분석
BnH12003을 투여한 후, 배럴 피질에서 포텐시 및 GABA/AMPA 비를 측정하여 화합물 효능을 확인하였다.
이를 위해, 8주령 C57BL/6J 마우스를 각각 5마리씩 대조군(비히클 투여군)과 실험군(BnH12003 투여군)으로 분류하고, Alzet Os 펌프 주입 수술을 한 후, Os 펌프를 사용하여 2주 동안 연속적으로 총 3 μM의 용량으로 배럴 피질의 제4층에 BnH12003을 직접 주입하였다(도 2a 및 도 2b).
BnH12003 화합물 투여 시, 마우스 배럴 피질(제4층)에서 GABA/AMPA 비의 측정으로 확인된 바와 같이, 여기/억제의 균형이 유지되는 동안(도 3a), 흥분성 TC 시냅스 포텐시(TC 포텐시)가 유의하게 증가함이 확인되었고(도 3b), BnH12003이 시냅스 가소성을 증가시킴으로써 인지 능력을 개선하는 효능을 나타냄을 알 수 있었다. 한편, 8주령 C57BL/6J 마우스를 각각 5마리씩 대조군(비히클 투여군)과 실험군(BnH12003 투여군)으로 분류하여 25 mg/kg의 용량을 1일 1회 약 11일 또는 12일 동안 복강내 투여한 결과, BnH12003의 투여는 흥분/억제의 균형을 유지하면서 감각 피질에서 TC 시냅스 포텐시를 증가시킬 수 있음이 확인되었다(도 4a 및 도 4b).
실시예 7.3. HDAC4의 단백질 분해 효능의 분석
본 발명에 따른 BnH12 계열은 HDAC4를 표적으로 하는 화합물로 합성되었고, BnH12003이 HDAC4를 단백질 수준에서 분해하는지 여부를 결정하고자 하였다. 실시예 7.2의 마우스에서 배럴 피질을 분리하여 BnH12003의 처리 유무에 따른 HDAC4 단백질 수준을 결정한 결과, HDAC4 단백질 수준이 대조군의 마우스와 비교하여 모든 실험군의 마우스에서 60% 내지 80% 감소한 것이 확인되었다(도 5). 이러한 결과로부터, BnH12003이 HDAC4 단백질 수준을 조절하여 시냅스 가소성을 증가시킴으로써 인지 기능을 개선시킴이 확인되었다.
실시예 7.4. 외상후 스트레스 장애의 동물 모델을 이용한 외상후 스트레스 장애를 치료하는 효능의 분석
HDAC4 유전자는 뇌의 공포 반응과 밀접한 관련이 있는 것으로 연구되어 왔으므로, 외상후 스트레스 장애(PTSD) 동물 모델을 이용하여 BnH12003 투여에 따른 치료 효능을 관찰하고자 하였다.
이를 위해, SD 설치류(래트)(300 g)를 3일 동안 적응시키고, 실험에 들어가기 전에 실험용 래트의 프리징을 시험하기 위해 챔버에 5분간 넣어 사진 촬영을 하였다. 거친 사포로 둘러싸인 챔버에서, 90초 내지 270초 간격으로 15회 충격, 1 mA의 강도 및 2초 지속 시간으로 무작위로 전기 자극을 발바닥에 가하였다. 다음날, 거친 사포로 둘러싸인 챔버에서 BnH12003초마다 3회 충격, 2 mA의 강도 및 2초 지속 시간으로 3초마다 발바닥에 전기 자극을 가하였다. 7일차에 프리징 시간을 확인함으로써 PTSD 설치류(래트)를 선택했다. 선택된 설치류(래트)를 각각 12마리씩 대조군과 실험군으로 나누고, Os 펌프를 이용하여 설치류(래트)의 뇌실에 1 μM의 BnH12003을 투여하였다. 설치류(래트) PTSD 모델 제작 개시 후 10일차에, 대조군에는 식염수를 복강내 투여하고, 실험군에는 BnH12003(25 mg/kg)을 복강내 투여한 후, 프리징 시간 확인을 3일 간격으로 수행하였다. 프리징 시간 확인을 총 8회 실시하였고, 프리징 시간 감소는 PTSD 설치류(래트) 모델 제작 후 7일차를 기준으로 백분율(%)로 계산하였다.
그 결과, BnH12003을 투여한 실험군은 대조군에 비해 프리징 시간이 유의하게 감소함이 확인되었고(도 6), BnH12003이 외상 기억(공포 기억)이 있는 래트게 투여된 경우, 외상 기억(공포 기억)을 감소시키거나 사라직게 하는 효과가 확인되었다. 따라서, 본 발명의 화합물이 사용된 경우, 외상 기억(공포 기억) 또는 새로운 기억(더 이상 위험이 없는 장소)을 지우는 학습 효과가 향상됨이 확인되었다.
실시예 7.5. 알츠하이머의 동물 모델에서 생체외 시냅스 가소성을 향상시키는 효능의 분석
알츠하이머의 동물 모델인 APP/PS1 마우스(Taconic Bioscience)로의 BnH12003의 투여 후, 해마에서 포텐시 및 GABA/AMPA 비를 측정함으로써 알츠하이머병에 대한 화합물 효능을 확인하고자 하였고, 특히, BnH12003과 Solanezumab의 단독 투여 및 병용 투여의 효과를 비교하고자 하였다. 이를 위해, BnH12003과 Solanezumab(미국 소재의 Creative Biolabs)을 아래와 같이 Os 펌프 뇌실 주입에 의해 각각 3 μM과 200 μg의 용량으로 해마에 투여하였다: 해마에 있는 샤퍼 콜라테럴 회로의 CA1 영역에서 필드 흥분성 시냅스후 전위(EPSP)의 I/O 곡선 변화를 관찰한 결과, BnH12003의 생체내 투여에 의해 시냅스 효능이 증가함이 확인되었다(도 7a). 또한, 해마에 있는 샤퍼 콜라테럴 회로의 CA1 영역에서 EPSP의 시냅스 장기 강화(LTP)를 측정한 결과, 흥분성 SC 경로의 LTP가 또한 유의하게 증가함이 또한 확인되었다(도 7b).
I/O 곡선 및 LTP의 증가는 시냅스 가소성이 증가함을 나타내므로, 이러한 결과로부터 BnH12003과 솔라네주맙의 병용 투여가 해마에서 SC 경로 시냅스 포텐시를 증가시킴을 알 수 있었고, 이는 BnH12003이 알츠하이머병을 치료하는 데 효과적임을 나타낸다. 이 경우, BnH12003과 솔라네주맙을 각각 단독 투여했을 때보다 BnH12003과 솔라네주맙을 병용 투여했을 때 더 나은 효과가 나타났다.
한편, BnH12003을 APP/PS1 마우스에 투여한 후, 배럴 피질에서 포텐시 및 GABA/AMPA 비를 측정함으로써 알츠하이머병에 대한 화합물 효능을 확인하고자 하였고, 특히, BnH12003과 솔라네주맙의 단독 투여 및 병용 투여의 효과를 비교하고자 하였다.
BnH12003이 APP/PS1 마우스에 투여되었을 때, BnH12003의 생체내 투여는 GABA/AMPA 비의 측정에 의해 확인된 바와 같이 여기/억제의 균형을 유지하면서(도 8a) 흥분성 TC 시냅스 포텐시(TC 포텐시)를 증가시켰다(도 8b). TC 포텐시의 증가는 시냅스 가소성이 증가함을 나타내므로, 이러한 결과로부터 BnH12003 화합물의 투여가 여기/억제의 균형을 유지하면서 감각 피질에서 TC 시냅스 포텐시를 증가시킴을 알 수 있었고, 이는 BnH12003이 알츠하이머병을 치료하는 데 효과적임을 나타낸다. 이 경우, BnH12003과 솔라네주맙을 각각 단독 투여했을 때보다 BnH12003과 솔라네주맙을 병용 투여했을 때 유의하게 우수한 효과가 나타났다.
실시예 8. 표면 플라즈몬 공명 검정
본 발명의 화합물을 HDAC4와 상호작용하는 능력에 대해 선택하였다. 시험을 수행하기 위해, 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용했다. 샘플을 다음과 같이 준비하고, Biacore T200에 로딩했다.
샘플을 다음 조건에서 고정화하였다. 단백질 스톡을 10 mM 아세트산나트륨으로 희석하였다. 1 m 에탄올아민(pH 8.5)를 차단제로 사용했다.
도 9는 HDAC4에 대한 BnH12003의 결합 동역학을 나타낸다.
실시예 9. HDAC 촉매 활성에 대한 화합물의 영향
화합물을 100 mM DMSO에 재현탁시키고, HDAC 1 내지 9 및 11에 대해 100 μM에서 출발하여 3배 연속 희석으로 10-용량 IC50에서 시험했다. 참조 화합물로서, 트리코사틴 A(Trichostatin A, TSA) 및 TMP269를 10 μM 또는 1 μM에서 출발하여 3배 연속 희석으로 10-용량 IC50에서 시험했다.
p53 잔기 379-382(RHKK(Ac)AMC)의 10 μM 형광 펩타이드를 HDAC 1,2,3,6에 대한 기질로 사용하였다. 50 μM 형광 HDAC 클래스2a 기질(트리플루오로아세틸 라이신)을 HDAC 4, 5, 7, 9, 11에 대한 기질로 사용하였다. p53 잔기 379-382(RHK(Ac)K(Ac)AMC)의 100 μM 형광 펩타이드를 HDAC 8에 대한 기질로 사용하였다.
S자형 용량-반응 방정식을 기반으로 하는 GraphPad Prism 4 프로그램을 사용하여 IC50 값을 계산하였고, 블랭크(DMSO) 값 농도를 곡선 피팅(curve fitting)을 위해 1.00E-12 M으로 입력했다. 시험된 화합물의 최고 농도에서 65% 미만의 효소 활성을 나타내는 화합물 데이터 세트에 대해 곡선 피팅을 수행했다.
실험을 이중으로 수행했다. BnH12003 은 HDAC 1 내지 9 및 11의 촉매 활성에 대해 임의의 억제 효과를 나타내지 않았다.
실시예 10. BDNF 및 GluN2B 발현, 및 시상피질 EPSC 포텐시에 대한 효과
렌티바이러스 HDAC4 shRNA를 트랜스펙션시킴으로써 HDAC4 단백질 발현을 억제하였을 때, SH-SY5Y 세포에서 BDNF와 GluN2B 발현이 유의하게 증가하였다(도 10a 및 도 10b). 유사하게, BnH12003(1 μM)은 SH-SY5Y 세포에서의 6시간 및 24시간 적용에 의해 BDNF 및 GluN2B 발현을 증가시켰다(도 11a 및 도 11b). BnH12003은 각각 마우스 배럴 피질에서 경구 및 복강내 투여에 의해 HDAC4 단백질 발현을 유의하게 억제하였고, 이러한 억제 효과는 적어도 10일 동안 유지되었다(도 12a 및 도 12b).
실시예 11. 다양한 BnH12 계열 화합물의 시험관내 세포독성
실시예 2에 기재된 실험 절차를 이용하여 다양한 BnH12 계열 화합물로 세포를 처리하고 세포 생존율을 측정함으로써, 화합물의 세포 독성을 평가했다. 그 결과, 거의 모든 화합물이 10uM의 농도에서 85% 이상의 세포 생존율이 관찰되었고, 농도를 100uM로 높인 경우에도 80% 이상의 세포 생존율이 관찰되었다.
[표 4]
293T 세포주에서 화합물 농도(10 또는 100 μM)에 따른 세포 생존율을 측정한 결과, 대부분의 화합물은 두 농도 범위에서 세포 생존율의 유의한 변화는 없는 것으로 나타났다.
실시예 12. 다양한 BnH12 계열 화합물의 효능 확인
실시예 3에 기술된 실험 절차를 이용하여 다양한 BnH12 계열 화합물이 GluN2B 발현을 증가시키는지 여부를 확인하고, 그 결과를 표 5에 나타내었다. 이러한 in vitro 실험 결과는 화합물을 처리하지 않은 군(비히클)의 효과를 1로 설정하고, 그에 대한 상대적인 값을 나타낸 것이다.
[표 5]
표 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 대표적인 화합물들은 비히클과 비교하여 우수한 효과를 나타내었다. 특히, BnH12003, BnH12046, BnH12057, BnH12067, BnH12091, BnH12092, BnH12095, BnH12097 및 BnH12098이 다른 화합물들에 비해 우수한 효과를 나타내었다.

Claims (21)

  1. 하기 화학식 (1)의 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:

    상기 식에서, R1은 아릴 또는 헤테로아릴이거나, 이웃하는 페닐기와 결합하여 포화되거나 부분적으로 포화된 헤테로 고리를 형성하고, 상기 아릴, 헤테로아릴 또는 헤테로 고리 중의 하나 이상의 수소 원자는 비치환되거나, 할로겐 원자, C1-6 알킬, C3-12 사이클로알킬, C1-6 알콕시, 아릴, 헤테로아릴, 아미노 또는 니트로로 치환되고, 상기 치환기는 비치환되거나 하나 이상의 할로겐 원자 또는 C1-6 알킬로 치환되고,
    R2는 수소, C1-6 알킬 또는 아릴이고,
    R3는 수소, 카르복실, N-하이드록시 카르복스아미드 또는 카르복스아미드이고, 상기 기 중의 수소는 C1-6 알킬로 치환될 수 있고,
    n은 0 또는 1이고,
    m은 0 내지 6이다.
  2. 제1항에 있어서,
    R1은 페닐, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 피라지닐, 푸라닐, 티오페닐, 피롤릴, 이미다졸릴 또는 옥사졸릴이거나, 이웃하는 페닐기와 결합하여 퀴녹살리닐 또는 디하이드로벤조디옥시닐을 형성하는
    화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  3. 제2항에 있어서,
    R1 중 하나 이상의 수소 원자는 할로겐 원자, 하나 이상의 할로겐 원자로 치환되거나 치환되지 않은 C1-6 알킬 또는 C3-12 사이클로알킬, C1-6 알콕시, 페닐, 피리디닐, 피리다지닐, 피리미디닐, 하나 이상의 C1-6 알킬로 치환되거나 치환되지 않은 아미노, 또는 니트로로 치환되는
    화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  4. 제1항에 있어서,
    R1은 페닐, 비페닐, 피리딘-4-일, 피리딘-3-일, 피리딘-2-일, 메틸피리딘-3-일, 6-메톡시-피리딘-3-일, 6-사이클로프로필-피리딘-3-일, 트리플루오로메틸피리딘-3-일, 페닐피리딘-3-일, 피리다진-4-일, 피리다진-3-일, 피라다진-2-일, 피리미딘-2-일, 피리미딘-4-일, 피리미딘-5-일, 메틸피리미딘-5일, 5-플루오로피리미딘-2-일, 2-(트리플루오로메틸)피리미딘-5-일, 2-사이클로프로필피리미딘-5-일, 피라진-2-일, 티오펜-2-일, 푸란-2-일, 옥사졸-2-일, 3-니트로페닐, 4-니트로페닐, 3-아미노페닐, 4-아미노페닐, 또는 4-디에틸아미노페닐인
    화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  5. 제1항에 있어서,
    R2는 H 또는 C1-6 알킬인
    화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  6. 제1항에 있어서,
    R3는 H, 카르복실, 메틸 카르복실, 에틸 카르복실, N-하이드록시 카르복스아미드 또는 카르복스아미드인
    화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 입체이성질체는 광학이성질체인
    화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 입체이성질체는 (3R,6S)-광학이성질체인
    화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 하기 화합물들로부터 선택된 것인
    화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:




  10. 제9항에 있어서,
    상기 화합물은 BnH12003, BnH12017, BnH12045, BnH12046, BnH12047, BnH12048, BnH12051, BnH12053, BnH12057, BnH12058, BnH12064, BnH12066, BnH12067, BnH12071, BnH12072, BnH12078, BnH12085, BnH12086, BnH12088, BnH12089, BnH12090, BnH12091, BnH12092, BnH12093, BnH12095, BnH12097 및 BnH12098로 이루어진 군으로부터 선택된 것인
    화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 HDAC의 억제제인
    화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 HDAC는 HDAC4인
    화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 시냅스 가소성을 증가시키는 것인
    화합물, 이의 입체이성질체, 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 포함하는
    약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 조성물은 신경 장애 또는 신경 퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 위한 것인
    약학 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 약 0.1 내지 약 3 μM의 농도로 뇌에 전달되는,
    약학 조성물.
  17. 제15항에 있어서,
    상기 장애는 알츠하이머병인
    약학 조성물.
  18. 제15항에 있어서,
    상기 장애는 PTSD인
    약학 조성물.
  19. 제14항에 있어서,
    제2 치료제를 추가로 포함하는
    약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 제2 치료제는 솔라네주맙인
    약학 조성물.
  21. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 위한 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5338745A (en) * 1990-08-10 1994-08-16 Mitsui Toatsu Chemicals, Incorporation Amide derivatives of dihydrocaffeic acid and their application to pharmaceuticals
ES2215893T3 (es) * 2000-03-17 2004-10-16 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Derivados de beta-aminoacidos como inhibidores de metaloproteasas de matriz y tnf-alfa.
US20040072802A1 (en) * 2002-10-09 2004-04-15 Jingwu Duan Beta-amino acid derivatives as inhibitors of matrix metalloproteases and TNF-alpha
GB0423356D0 (en) * 2004-10-21 2004-11-24 Merck Sharp & Dohme Therapeutic agents
WO2014110103A1 (en) * 2013-01-09 2014-07-17 Arena Pharmaceuticals, Inc. Biphenyl-ethyl-pyrrolidine derivatives as histamine h3 receptor modulators for the treatment of cognitive disorders
US10913736B2 (en) * 2014-08-22 2021-02-09 University Of Washington Specific inhibitors of methionyl-tRNA synthetase
WO2016140527A1 (ko) * 2015-03-04 2016-09-09 경상대학교산학협력단 오스모틴 펩티드를 유효성분으로 함유하는 신경질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
SG11201708359TA (en) * 2015-04-10 2017-11-29 Agency Science Tech & Res Generation of functional cells from stem cells
US11142546B2 (en) * 2016-04-04 2021-10-12 Research Triangle Institute Neuropeptide S receptor (NPSR) agonists
WO2019152857A1 (en) * 2018-02-02 2019-08-08 Gong Chen Methods and materials for treating brain injuries
US11925659B2 (en) * 2018-10-29 2024-03-12 Cyclo Therapeutics, Inc. Methods for treating Alzheimer's disease
KR20220024161A (ko) * 2019-05-22 2022-03-03 주식회사 지뉴브 트라메티닙 및 마커를 이용한 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 투여 방법 및 투약 용법
KR20210014926A (ko) * 2019-07-31 2021-02-10 (주)뉴로라이브 시냅스 가소성 증가용 조성물
CN111072597B (zh) * 2019-12-26 2022-12-09 四川大学 一种胡椒碱衍生物及其制备方法和用途

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