WO2023191425A1 - 약물의 전기생리학적 스크리닝 방법 - Google Patents

약물의 전기생리학적 스크리닝 방법 Download PDF

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mgso
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정승수
김영환
정지현
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material

Definitions

  • the present invention relates to a method for electrophysiological screening of drugs.
  • the present invention is an electrochemical method that can effectively screen substances that change the activity of brain cortical synaptic plasticity, especially drugs for the prevention or treatment of neurological disorders or neurodegenerative disorders, by evaluating the impact of candidate drugs on synaptic plasticity. It relates to physiological screening methods.
  • a neural network is a network made up of neurons.
  • a synapse is a node in a neural network where neurons exchange information with each other.
  • synapses are “plastic,” because their number and strength change continuously throughout life as synaptic inputs are added, removed, or refined in response to ongoing neural activity. Synaptic plasticity refers to these neuronal activity-dependent modifications of synapses resulting from changes in the strength and/or efficiency of synaptic transmission.
  • cortical networks neural networks
  • cortical networks a neural network in the cerebral cortex.
  • synaptic plasticity in cortical neural networks peaks in the early postnatal period, known as the critical period. After the critical period, cortical synaptic plasticity gradually declines with age, eventually reaching a state where experience no longer causes active changes in the cerebral cortex.
  • recent studies have shown that high levels of synaptic plasticity can be restored even after the critical period has ended under certain conditions: In animal models, peripheral nerve damage causes damage to the somatosensory thalamocortex, which transmits peripheral sensory signals to the cerebral cortex.
  • a patch clamp is a device used to study ionic currents in isolated living cells. This instrument is particularly useful for studying excitable cells such as neurons, cardiomyocytes, muscle fibers, and pancreatic beta cells.
  • Patch clamp can be performed using voltage clamp or current clamp techniques. In voltage clamp, the experimenter adjusts the voltage across the cell membrane and records the generated current, and in current clamp, the experimenter controls the current through the cell membrane. It self-regulates and records the generated voltage. Ion channels are targets of various diseases. Recently, with the development of automated patch clamps, in the case of voltage-gated sodium channels (Nav1.7), a major target of pain, screening of candidate drugs has been attempted using automated patch clamp technology. . However, the conventional patch clamp technology was not suitable for drug screening because the method itself, such as sample preparation, was difficult and difficult to reproduce.
  • the purpose of the present invention is to solve all the problems of the prior art described above.
  • the purpose of the present invention is to provide a method or kit for screening candidate drugs for reactivation or increase of brain cortical synaptic plasticity using patch clamp technology, which is one of the electrophysiological methods.
  • a representative configuration of the present invention to achieve the above object is as follows.
  • a) administering a candidate agent to a non-human animal comprising: (b) cooling the brain by injecting first artificial cerebrospinal fluid at 2 to 5°C into the animal and then separating the brain from the animal; (c) preparing a brain slice containing the cerebral cortex region from the separated brain in first artificial cerebrospinal fluid at 2 to 5°C; (d) culturing the brain slice obtained in step (c) in a second artificial cerebrospinal fluid at 30 to 35°C; and (e) recording excitatory postsynaptic currents (EPSCs) from cortical regions of said brain slices in a third artificial cerebrospinal fluid using patch clamps.
  • EPCs excitatory postsynaptic currents
  • the method may further comprise, after step (d) or before step (e), further culturing the brain slices in a third artificial cerebrospinal fluid at room temperature.
  • the step of preparing the brain slice of step (c) is performed by placing the separated brain in the first artificial cerebrospinal fluid at 2 to 5°C at an angle of 50° to 55° relative to the midline and at a distance of 300 to 500 ⁇ m. It may include sectioning by thickness.
  • the recording of step (e) may be performed in a third artificial cerebrospinal fluid circulating at a flow rate of 5 to 10 ml/min.
  • the cerebral cortex region may include a fourth layer of the barrel cortex.
  • the brain slice may be a thalamocortical slice.
  • excitatory postsynaptic currents in step (e) may be recorded by patching layer 4 of the barrel cortex in a cortical region.
  • the first artificial cerebrospinal fluid may include sucrose, KCl, NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , glucose, Na pyruvate, Na L-ascorbate, MgSO 4 and CaCl 2 .
  • the first artificial cerebrospinal fluid contains 175 to 215mM sucrose, 2.25 to 2.75mM KCl, 0.9 to 1.1mM NaH 2 PO 4 , 29 to 36mM NaHCO 3 , 9.5 to 12.5mM It may include glucose, 1.8 to 2.2mM Na pyruvate, 0.9 to 1.1mM Na L-ascorbate, 4.5 to 5.5mM MgSO 4 and 0.45 to 0.55mM CaCl 2 .
  • the first artificial cerebrospinal fluid is prepared including sucrose, KCl, NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , glucose, Na pyruvate, and Na L-ascorbate, and MgSO 4 and CaCl 2 are of the first artificial cerebrospinal fluid. It may be added just before use or on the day of use.
  • the second or third artificial cerebrospinal fluid may include NaCl, KCl, NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , glucose, Na pyruvate, Na L-ascorbate, MgSO 4 and CaCl 2 .
  • the second artificial cerebrospinal fluid contains 115 to 142 mM NaCl, 2.25 to 2.75 mM KCl, 0.9 to 1.1 mM NaH 2 PO 4 , 19 to 24 mM NaHCO 3 , 9.5 to 12.5 mM glucose.
  • the third artificial cerebrospinal fluid contains 111 to 137mM of NaCl, 2.25 to 2.75mM of KCl, 0.9 to 1.1mM of NaH 2 PO 4 , 23 to 29mM of NaHCO 3 , 9.5 to 12.5mM of glucose, 1.8 to 2.2M.
  • the second or third artificial cerebrospinal fluid is prepared containing NaCl, KCl, NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , glucose, Na pyruvate, and Na L-ascorbate, and MgSO 4 and CaCl 2 are the second or third artificial cerebrospinal fluid. It may be added immediately before or on the day of use of the third artificial cerebrospinal fluid.
  • the method (f) determines the potency and ⁇ -aminobutyric acid (GABA)/ ⁇ -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (GABA) based on the recorded EPSCs. acid) deriving a ratio; and (g) selecting a substance that statistically significantly increases the potency and/or does not statistically significantly change the GABA/AMPA ratio compared to a control group that did not administer the candidate substance. there is.
  • GABA ⁇ -aminobutyric acid
  • GABA ⁇ -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid
  • the agent may be a candidate drug for the prevention or treatment of neurological or neurodegenerative disorders.
  • the non-human animal may be a member of the order Rodentia, Marsupialia, or Lagomorpha.
  • the non-human animals include mouse, rat, hamster, gerbil, muskrat, guinea pig, chinchilla, May be a flying squirrel, chipmunk, ground squirrel, prairie dog, gray squirrel, porcupine, opossum or rabbit. , to the extent that the purpose of the present invention can be achieved, it is not limited to specific animals.
  • step (e) can be performed with whole-cell recording using manual patch clamps.
  • the recording in step (e) may be performed in astrocytes of layer 4 of the barrel cortex within the cerebral cortical region.
  • step (e) may be performed at 27 to 29°C.
  • the EPSC of step (e) may be recorded using an electrode with a resistance of 3.5 to 4.2 m ⁇ .
  • the EPSC of step (e) can be recorded by fixing the membrane voltage at -70 mV.
  • the potential of step (f) is determined by setting the interval between 0 and 100 ms as the baseline and selecting the on current that appears in the interval between 110 and 200 ms. It may be a negative current amplitude (pA).
  • the GABA/AMPA ratio in step (f) is (i) the average trace in the interval between 110 and 200 ms when the interval between 0 and 100 ms in the -70 mV EPSC recording is used as the baseline. (ii) Compared to the negative current amplitude (pA), it may be the positive current amplitude (pA) value of the average trace in the section between 110 and 300 ms when the section between 0 and 110 ms in the 0 mV EPSC recording is used as the baseline.
  • the second artificial cerebrospinal fluid should contain 4.5 to 5.5 mM MgSO 4 and 0.9 to 1.1 mM CaCl 2 before use, and be used for culturing for recovery of brain slices at a temperature of 30 to 35°C; and instructions that the third artificial cerebrospinal fluid contain 1.17 to 1.43 mM MgSO 4 and 2.25 to 2.75 mM CaCl 2 before use, and to use it for further culturing or electrophysiological recording of brain slices at room temperature.
  • a kit for use in a screening method according to the invention, including instructions, is provided.
  • the kit may further include MgSO 4 solution and CaCl 2 solution.
  • the screening method of the present invention can evaluate the effect of candidate drugs on synaptic plasticity using electrophysiological techniques, thereby effectively selecting candidate drugs for the prevention or treatment of neurological disorders or neurodegenerative disorders.
  • drugs can be screened with high reproducibility by factors such as sample preparation conditions, measurement conditions, and measurement area optimized for measuring changes in synaptic plasticity using patch clamps.
  • Figure 1 shows a mouse implanted with an Os pump (left image) and a brain region implanted with an Os pump (right image) according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a microscope image confirming the shape and size of brain cells according to the composition and temperature difference of artificial cerebrospinal fluid (left image, when using the artificial cerebrospinal fluid of the present invention; right image, the composition or temperature of the artificial cerebrospinal fluid When the composition or temperature conditions of cerebrospinal fluid are different).
  • Figure 3 schematically shows the ramp and cutting angle (left) and cutting sequence (right) for preparing a paracoronal slice from a mouse or rat brain according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a microscopic image showing the fourth layer of the barrel cortex where EPSC is measured with a patch clamp according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5A-5C are illustrations of analysis of the potential (FIG. 5A), negative current amplitude of AMPA current (FIG. 5B), and positive current amplitude of GABA current (FIG. 5C), respectively, from EPSCs recorded according to one embodiment of the present invention. shows.
  • Figures 6a and 6b show the results of screening tests for candidate substances BnH12001, BnH12003, BnH12005, BnH12022, BnH12036, BnH12048, and BnH12049 according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6a shows the potency of each compound
  • Figure 6b shows the GABA/AMPA ratio of each compound.
  • Figure 7 shows the effect of improving cognitive function by oral administration of BnH12001 in an Alzheimer's disease animal model.
  • Figure 8 shows the degree of symptom improvement in a rodent (rat) model of post-traumatic stress disorder in response to intraperitoneal administration of BnH12003 (25 mg/kg).
  • Figures 9a and 9b show the results of a screening test for compounds previously studied as substances for the treatment of brain and nervous system diseases according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 9a shows the potency of each compound
  • Figure 9b shows the GABA/AMPA ratio of each compound.
  • neurodegenerative diseases includes neurodegenerative diseases, neuropsychiatric disorders, memory loss, cognitive dysfunction/impairment, and extinction learning disorder.
  • neurodegenerative disorder refers to any disorder that can be reversed, inhibited, managed, treated, ameliorated, or eliminated with agents that stimulate the production of new neurons.
  • cognitive ability can be used interchangeably with “cognitive ability” and refers to a series of activities, skills, and internal control processes that occur in the brain to accept external information and process it.
  • cognitive ability enhancement refers to the improvement or beneficial change in cognitive decline, which is one of the symptoms of a neurological disorder or neurodegenerative disorder, or the improvement in cognitive ability of normal people without a neurological disorder or neurodegenerative disorder, or It means to increase or change to advantage.
  • the term "about” refers to a quantity, level, value, number, frequency, percent, dimension, size, volume, weight or length of 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4. means a quantity, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, quantity, weight or length that varies by , 3, 2 or 1%.
  • the term “about” when used in relation to a value x expressed as a number or figure may mean x ⁇ 10%.
  • Amounts (or concentrations), variables or parameters described herein are disclosed as groups or ranges. The description of the invention is specifically intended to include all individual members of the above groups and ranges.
  • the present invention relates to an electrophysiological method that can screen for substances that can induce changes in neural plasticity in the cerebral cortex, specifically the fourth layer of the barrel cortex.
  • Substances that can induce reactivation or increase in neuroplasticity can be developed into drugs for the prevention or treatment of neurological or neurodegenerative disorders.
  • the present invention is based in part on the surprising discovery that drug screening can be performed by measuring neural plasticity in layer 4 of the barrel cortex, which had not been attempted before.
  • the present invention is based in part on a highly precise and reproducible electrophysiological method that can prepare difficult-to-handle cerebral cortical slices in vitro and effectively measure changes in neural plasticity.
  • the present invention is based on the new discovery that changes in neural plasticity can be detected with high reliability and resolution by highly precise electrophysiological methods, especially (manual) patch clamp.
  • a method for screening a substance that alters the activity of brain cortical synaptic plasticity comprising the following steps: (a) administering a candidate substance to a non-human animal; (b) cooling the brain by injecting first artificial cerebrospinal fluid at 2 to 5°C into the animal and then separating the brain from the animal; (c) preparing a brain slice containing the cerebral cortex region from the separated brain in first artificial cerebrospinal fluid at 2 to 5°C; (d) culturing the brain slice obtained in step (c) in a second artificial cerebrospinal fluid at 30 to 35°C; and (e) recording excitatory postsynaptic currents (EPSCs) in the cortical region of the brain slice within the third artificial cerebrospinal fluid using a patch clamp.
  • EPCs excitatory postsynaptic currents
  • the method may further comprise the step of further culturing the brain slices in a third artificial cerebrospinal fluid at room temperature after step (d) or before step (e).
  • This additional culture step can further accelerate the recovery of the brain slice and give it time to adapt to the environment in which step (e) is performed, further increasing the probability of patch clamp success.
  • the method (f) determines the potency and ⁇ -aminobutyric acid (GABA)/ ⁇ -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid (GABA) based on the recorded EPSCs. ) Deriving a ratio; and (g) compared to a control group not administered the candidate substance, a substance that statistically significantly increases the potency and/or does not statistically significantly change the GABA/AMPA ratio can induce changes in neuroplasticity. It may further include the step of selecting a substance that is present, such as a candidate drug for the prevention or treatment of neurological disorders or neurodegenerative disorders.
  • the artificial cerebrospinal fluid (aCSF) used in the screening method is a (manual) patch clamp with an extremely low probability of successful measurement by varying its composition (constituents and concentration), pH, temperature, etc. at each stage.
  • the success rate of the technique can be significantly increased.
  • each artificial cerebrospinal fluid provided in the present invention will be described in detail.
  • the first artificial cerebrospinal fluid used in the screening method of the present invention is sucrose-based artificial cerebrospinal fluid.
  • the first artificial cerebrospinal fluid may be used as a perfusate in step (b) and as a brain fragmentation solution in step (c).
  • the first artificial cerebrospinal fluid may include sucrose, KCl, NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , glucose, Na pyruvate, Na L-ascorbate, MgSO 4 and CaCl 2 .
  • the first artificial cerebrospinal fluid may be understood to include or not include MgSO 4 and CaCl 2 depending on the context.
  • the first artificial cerebrospinal fluid refers to artificial cerebrospinal fluid for perfusion (or perfusate) or for sectioning, it may include MgSO 4 and CaCl 2 .
  • the first artificial cerebrospinal fluid when included in the kit, it may not include MgSO 4 and CaCl 2 .
  • the first artificial cerebrospinal fluid contains 175 to 215 mM sucrose, 2.25 to 2.75 mM KCl, 0.9 to 1.1 mM NaH 2 PO 4 , 29 to 36 mM NaHCO 3 , 9.5 to 12.5 mM glucose, It may include 1.8 to 2.2mM Na pyruvate, 0.9 to 1.1mM Na L-ascorbate, 4.5 to 5.5mM MgSO 4 and 0.45 to 0.55mM CaCl 2 .
  • the first artificial cerebrospinal fluid contains sucrose in an amount of 175-215mM, 176-214mM, 178-213mM, 179-212mM, 180-211mM, 181-210mM, 182-209mM, 183-213mM.
  • the concentration of NaHCO 3 in the first artificial cerebrospinal fluid may be 29 to 36mM, 30 to 35mM, 31 to 34mM, 31.5 to 33.5mM, 32 to 33mM, preferably 32.5mM. Since NaHCO 3 is a compound that can change pH, which has a significant impact on patch clamp success rate, its concentration range is particularly important in this screening method.
  • the concentration of MgSO 4 in the first artificial cerebrospinal fluid may be 4 to 6mM, 4.5 to 5.5mM, preferably 5mM.
  • the concentration of CaCl 2 in the first artificial cerebrospinal fluid may be 0.45 to 0.55mM, 0.48 to 0.52mM, preferably 0.5mM.
  • the first artificial cerebrospinal fluid is used in step (b) or step (c) at a temperature of 2 to 5°C, 3 to 5°C, 3.5 to 4.5°C, preferably 4°C.
  • the pH of the first artificial cerebrospinal fluid may be 7.35 to 7.45.
  • the first artificial cerebrospinal fluid may have a composition as shown in Table 1 below.
  • MgSO 4 and CaCl 2 act as major constituents contributing to measures of synaptic plasticity (or function).
  • MgSO 4 and CaCl 2 are preferably added immediately before or on the day of use in step (b) or step (c).
  • the first artificial cerebrospinal fluid is prepared with a solution containing sucrose, KCl, NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , glucose, Na pyruvate, and Na L-ascorbate, and then in step (b) the first artificial cerebrospinal fluid It is preferable to add MgSO 4 and CaCl 2 to the previously prepared solution immediately before or on the day of perfusing the animal.
  • the first artificial cerebrospinal fluid is prepared with a solution containing sucrose, KCl, NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , glucose, Na pyruvate and Na L-ascorbate, and then in step (c) the first artificial cerebrospinal fluid MgSO 4 and CaCl 2 may be added to the previously prepared solution immediately before or on the day of preparing the brain slices.
  • the second artificial cerebrospinal fluid used in the screening method of the present invention has a different composition from the artificial cerebrospinal fluid used in other steps (e.g., preparing brain slices or recording EPSCs), and the second artificial cerebrospinal fluid is sliced by varying the temperature when used. It can induce recovery of brain tissue and significantly increase the success rate of the (manual) patch clamp technique.
  • the second artificial cerebrospinal fluid may include NaCl, KCl, NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , glucose, Na pyruvate, Na L-ascorbate, MgSO 4 , and CaCl 2 .
  • the second artificial cerebrospinal fluid may be understood to include or not include MgSO 4 and CaCl 2 depending on the context.
  • the second artificial cerebrospinal fluid refers to artificial cerebrospinal fluid for recovery as in step (d)
  • it may include MgSO 4 and CaCl 2 .
  • the second artificial cerebrospinal fluid when included in the kit, it may not contain MgSO 4 and CaCl 2 .
  • the second artificial cerebrospinal fluid contains 115-142mM NaCl, 2.25-2.75mM KCl, 0.9-1.1mM NaH 2PO 4 , 19-24mM NaHCO3 , 9.5-12.5mM glucose, 1.8mM to 2.2mM Na pyruvate, 0.9 to 1.1mM Na L-ascorbate, 4.5 to 5.5mM MgSO 4 and 0.9 to 1.1mM CaCl 2 .
  • the concentration of NaHCO 3 in the second artificial cerebrospinal fluid is 19 to 24mM, 19.5 to 23.7mM, 20 to 23.5mM, 20.5 to 23mM, 21 to 22.5mM, 21.5 to 22mM, 21.6 to 21.8mM, Preferably it may be 21.7mM.
  • the concentration of MgSO 4 in the second artificial cerebrospinal fluid may be 4 to 6mM, 4.5 to 5.5mM, preferably 5mM.
  • the concentration of CaCl 2 in the second artificial cerebrospinal fluid may be 0.9 to 1.1mM, 0.95 to 1.05mM, preferably 1mM.
  • the second artificial cerebrospinal fluid is used at a temperature of 30 to 35°C, 31 to 35°C, 32 to 35°C, or 33 to 35°C.
  • the pH of the second artificial cerebrospinal fluid may be 7.35 to 7.45.
  • the second artificial cerebrospinal fluid may have a composition as shown in Table 2 below.
  • MgSO 4 and CaCl 2 are the major components contributing to measures of synaptic plasticity (or function).
  • MgSO 4 and CaCl 2 are preferably added immediately before use in step (d) or on the day of use.
  • the second artificial cerebrospinal fluid is prepared with a solution containing NaCl, KCl, NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , glucose, Na pyruvate, and Na L-ascorbate immediately before or on the day of the culture in step (d).
  • MgSO 4 and CaCl 2 can be added to the previously prepared solution.
  • the third artificial cerebrospinal fluid used in the screening method according to one aspect of the present invention has a different composition from the artificial cerebrospinal fluid used in other steps (e.g., preparing brain slices or culturing steps for recovery), and also has a temperature when used. Unlike other steps, setting the temperature to room temperature or close to it has the effect of significantly increasing the success rate of the (manual) patch clamp technique.
  • the third artificial cerebrospinal fluid may include NaCl, KCl, NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , glucose, Na pyruvate, Na L-ascorbate, MgSO 4 , and CaCl 2 .
  • the third artificial cerebrospinal fluid may be understood to include or not include MgSO 4 and CaCl 2 depending on the context.
  • the third artificial cerebrospinal fluid refers to artificial cerebrospinal fluid for recording used in a screening method, it may include MgSO 4 and CaCl 2 .
  • the third artificial cerebrospinal fluid is included in the kit, it may not contain MgSO 4 and CaCl 2 .
  • the third artificial cerebrospinal fluid contains 111 to 137 mM NaCl, 2.25 to 2.75 mM KCl, 0.9 to 1.1 mM NaH 2 PO 4 , 23 to 29 mM NaHCO 3 , 9.5 to 12.5 mM glucose, 1.8 to 2.2mM Na pyruvate, 0.9 to 1.1mM Na L-ascorbate, 1.17 to 1.43mM MgSO 4 and 2.25 to 2.75mM CaCl 2 .
  • the concentration of NaHCO 3 in the third artificial cerebrospinal fluid is 23 to 29mM, 24 to 28mM, 25 to 27mM, 25.5 to 26.5mM, 25.7 to 26.5mM, 26 to 26.5mM, preferably 26.2mM. It can be.
  • the concentration of MgSO 4 in the third artificial cerebrospinal fluid may be 1 to 1.6mM, 1.1 to 1.5mM, 1.17 to 1.43mM, 1.2 to 1.4mM, 1.25 to 1.35mM, preferably 1.3mM.
  • the concentration of CaCl 2 in the third artificial cerebrospinal fluid may be 2.25 to 2.75mM, 2.3 to 2.7mM, 2.35 to 2.65mM, 2.4 to 2.6mM, 2.45 to 2.55mM, preferably 2.5mM.
  • the temperature of the third artificial cerebrospinal fluid is preferably room temperature when the third artificial cerebrospinal fluid is used in an additional culture step after the culture in step (d) or before the EPSC recording in step (e).
  • the room temperature is 15 to 30°C, 16 to 29°C, 17 to 28°C, 18 to 27°C, 19 to 26°C, 20 to 25°C, 21 to 25°C, 22 to 25°C, preferably 23 to 25°C. It may be °C.
  • the third artificial cerebrospinal fluid when used in the recording step of step (e), its temperature is preferably between 27 and 29°C.
  • the pH of the third artificial cerebrospinal fluid may be 7.35 to 7.45.
  • the third artificial cerebrospinal fluid may have a composition as shown in Table 3 below.
  • composition (concentration) and/or temperature of the first, second and/or third artificial cerebrospinal fluid described above may be important to its performance as a sample preparation and screening platform for measuring neural plasticity.
  • concentration and temperature directly affect the pH of artificial cerebrospinal fluid, and pH is thought to be closely related to the probability of success of electrophysiological measurement methods using patch clamps.
  • the left microscope image of FIG. 2 shows the state of brain tissue in the third artificial cerebrospinal fluid that satisfies the composition concentration and temperature conditions according to the present invention. It can be seen that the shape of the cell membrane is clear and that various shapes and sizes are well preserved.
  • the right microscope image of FIG. 2 shows the state of brain tissue when the composition or temperature of the artificial cerebrospinal fluid is different from the composition or temperature conditions of the artificial cerebrospinal fluid according to the present invention.
  • the screening method of the present invention includes culturing the brain slices in a second artificial cerebrospinal fluid at 30 to 35° C., wherein the temperature range is above or below the temperature range, or one or more of the second artificial cerebrospinal fluid If the composition does not meet the concentration conditions disclosed herein and the pH becomes less than 7.35 or more than 7.45, cell membrane damage may result. In addition, even if one or more compositions of the third artificial cerebrospinal fluid used in the EPSC recording step of step (e) in the screening method of the present invention do not satisfy the concentration conditions disclosed herein and the pH becomes less than 7.35 or more than 7.45, the cell membrane Damage is observed.
  • the right microscope image of Figure 2 shows the state of brain tissue in the third artificial cerebrospinal fluid where the final concentration of NaHCO 3 is less than 23mM or more than 29mM. It can be seen that the cell membranes are damaged and the boundaries of each cell membrane are not clear. The nucleus is observed to be expanded into a round shape. The patch clamp experiment itself cannot be performed on such brain tissue (or cells).
  • the screening method of the present invention can be performed using a brain slice containing the cerebral cortex region.
  • excitatory postsynaptic currents are recorded in cortical regions, preferably EPSCs are recorded in the somatosensory cortex, thalamocortical or barrel cortex.
  • EPSCs can be recorded in an area containing More preferably, EPSCs can be recorded from a region comprising the barrel cortex or the fourth layer of the barrel cortex.
  • a brain of a non-human animal that includes a somatosensory cortex, especially a thalamic cortex or a barrel cortex.
  • Non-human animals with a barrel cortex in the brain may belong to the order Rodentia, Marsupialia, or Lagomorpha (Woolsey et al. The Journal of comparative neurology vol. 164,1 (1975): 79-94.]).
  • Non-limiting examples of animals belonging to the rodents, marsupials, or marsupials include the following animals: mouse, rat, hamster, gerbil, muskrat ( muskrat, guinea pig, chinchilla, flying squirrel, chipmunk, ground squirrel, prairie dog, gray squirrel, porcupine ), opossum or rabbit.
  • the efficacy or therapeutic activity of a candidate substance is evaluated based on changes in synaptic plasticity based on the analysis results of excitatory postsynaptic current (EPSC) measured in the brain, so the candidate substance subject to screening is It can be administered directly to specific areas of the brain where neural plasticity is altered.
  • ESC excitatory postsynaptic current
  • the administration of the candidate substance may be intracerebral injection.
  • Intracerebral administration or intracerebral injection has the potential to cause traumatic tissue damage, so it is desirable to appropriately control the amount of liquid. Despite these disadvantages, it can be used for the purpose of directly diffusing the active ingredient to the target area with minimal systemic exposure and toxicity. .
  • the candidate agent is delivered directly to the cerebral cortex by intracerebral administration.
  • the candidate substance is administered directly to the somatosensory cortex, thalamocortical, or barrel cortex areas of the cerebral cortex, or to adjacent areas of the area or neurologically connected to the area (e.g., It can be administered directly to other areas (where neurons are connected).
  • Figure 1 shows a mouse implanted with an Os pump and its implantation site to deliver a candidate substance to the fourth layer of the barrel cortex according to an embodiment of the present invention.
  • the administration is intraparenchymal injection, intracerebroventricular injection, intrathecal injection, intrastriatal injection, intracisternal injection, intracranial injection. This may include intracranial injection or subpial injection.
  • the candidate substance that is the subject of screening can be administered systemically.
  • Systemic administration methods may use methods known in the related art.
  • the systemic administration may be oral administration, intraperitoneal injection, or intravenous injection, but is not limited thereto.
  • Oral administration can be performed without anesthesia of the animal, and can be performed by inserting a standard gavage needle (or feeding needle) into the animal's mouth and passing it down the esophagus to administer the candidate directly into the lower esophagus or stomach.
  • the maximum drug dose for oral administration is determined based on body weight.
  • candidate substance it may be administered intraperitoneally or intravenously.
  • Intraperitoneal or intravenous administration may be performed according to previously known methods.
  • the candidate for screening can be processed directly into tissue sections obtained from the brain by isolating it.
  • candidate substances can be processed before or during recording of excitatory postsynaptic currents (EPSCs), etc. by electrophysiological methods.
  • EPCs excitatory postsynaptic currents
  • the screening method of the present invention is characterized by measuring electrophysiological parameters in brain slices, and the conditions for preparing brain slices are important in order to screen candidate substances with high reliability and resolution.
  • the screening method includes the step of (c) preparing a brain slice comprising a cerebral cortex region in a first artificial cerebrospinal fluid at 2 to 5° C. from an isolated brain.
  • step (c) is performed by placing the brain isolated in step (b) at an angle of 50° to 55° relative to the midline and at a thickness of 300 to 500 ⁇ m in the first artificial cerebrospinal fluid at 2 to 5°C. It may include a fragmentation step.
  • the brain slice may be a thalamocortical slice, and the thalamocortical slice may include the fourth layer of the barrel cortex.
  • the sectioning is preferably done at an angle of 50° to 55° relative to the midline of the brain to prepare a paracoronal section.
  • EPSCs can be recorded from the barrel cortex present in the fourth layer of the cerebral cortex.
  • a brain slice including the barrel cortex it is desirable to prepare a coronal oblique slice.
  • 3 to 5 sections can be obtained with a thickness of 300 to 500 ⁇ m, 350 to 450 ⁇ m, and preferably 400 ⁇ m, including the first section where the thalamus is clearly observed (e.g., the thalamus appears yellow). there is.
  • the brain slice obtained in step (c) can be incubated in a second artificial cerebrospinal fluid at 30 to 35° C. to induce recovery of damaged cells.
  • incubation in the second artificial cerebrospinal fluid may be performed for 10 minutes to 1 hour, 20 minutes to 50 minutes, 25 minutes to 40 minutes, 30 minutes to 35 minutes, preferably 30 minutes.
  • culture in the second artificial cerebrospinal fluid is performed at 30 to 37°C, 30 to 36°C, 30 to 35°C, 30 to 34°C, 30 to 33°C, 31 to 37°C, 31 to 36°C, 31 to 35°C.
  • the brain slices cultured in the second artificial cerebrospinal fluid are further cultured in a third artificial cerebrospinal fluid ( incubation).
  • the third artificial cerebrospinal fluid includes saturated with 95% O 2 /5% CO 2 .
  • the room temperature is 15 to 30°C, 16 to 29°C, 17 to 28°C, 18 to 27°C, 19 to 26°C, 20 to 25°C, 21 to 25°C, 22 to 25°C, preferably 23 to 23°C. It may be 25°C.
  • the culturing may be performed for 1 to 4 hours, 1 to 3 hours, 1 to 2 hours, and preferably 1 hour.
  • first artificial cerebrospinal fluid “second artificial cerebrospinal fluid” and “third artificial cerebrospinal fluid” is in item ‘1. See full disclosure under ‘Artificial Cerebrospinal Fluid Used at Each Step of the Screening Method’.
  • All electrophysiological experiments are preferably performed at 27 to 29°C.
  • An electrode having a resistance value of 3.5 to 4.2 m ⁇ may be used.
  • the patch clamp of step (e) of the screening method may be a manual patch clamp.
  • Manual patch clamps have the advantage of significantly higher data reliability and reproducibility compared to automated patch clamps. Therefore, manual patch clamps are especially useful in cases where the mechanism of action is the same or similar, or the effects are similar, making it difficult to detect differences in efficacy by automated patch clamps.
  • the recording of EPSCs in step (e) of the screening method may be performed by whole-cell recording.
  • Whole-cell recordings can involve recording currents through multiple channels simultaneously over large areas of the cell membrane.
  • the cortical region of step (e) of the screening method may include layer 4 of the barrel cortex. Therefore, the EPSC recording in step (e) can be performed in the fourth layer of the cerebral cortex, especially the barrel cortex.
  • the EPSC recording can be performed by patching astrocytes or neurons present in the fourth layer of the barrel cortex.
  • the barrel cortex is an area of the somatosensory cortex and includes a barrel field.
  • the plasticity of layer 4 of the barrel cortex declines rapidly after 4 days of life, whereas the plasticity of layers 2/3 remains highly flexible even into adulthood. Therefore, substances that can change the plasticity of the fourth layer of the barrel cortex can be strong candidates for treatments for various neurological or neurodegenerative disorders or as cognitive enhancers.
  • the recording of step (e) of the screening method can be performed in a third artificial cerebrospinal fluid circulating at a flow rate of 5 to 10 ml/min.
  • third artificial cerebrospinal fluid refers to the entirety of item ‘(3) third artificial cerebrospinal fluid – for electrophysiological recording’.
  • the EPSC of step (e) can be recorded by fixing the membrane voltage at -70 mV. EPSCs recorded in this way are used for potency and GABA/AMPA ratio analysis.
  • Potency is expressed as the negative current amplitude (pA) of the average trace in a specific section, and can be used as a measure to confirm the ability of a candidate material to regulate synaptic plasticity.
  • the potency sets the interval between 0 and 100 ms as the baseline, and selects the on current appearing in the interval between 110 and 200 ms to determine the negative current amplitude (pA) of the average trace. It was calculated and analyzed.
  • the ratio between the inhibitory neurotransmitter GABA ( ⁇ -aminobutyric acid) and the excitatory neurotransmitter AMPA ( ⁇ -amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) decreased despite the administration of the candidate substance. It is important that it remains constant. This is because if the GABA/AMPA ratio changes (increases or decreases), the likelihood of side effects such as dizziness, fatigue, excitement, and epileptic seizures increases.
  • the GABA/AMPA ratio is derived based on recorded EPSCs.
  • the GABA/AMPA ratio is (i) the negative current amplitude (pA) of the average trace in the interval between 110 and 200 ms when the interval between 0 and 100 ms in the -70 mV EPSC recording is used as the baseline. Contrast (ii) When the section between 0 and 110 ms in the 0 mV EPSC recording is used as the baseline, the positive current amplitude (pA) value of the average trace in the section between 110 and 300 ms is derived.
  • candidate substances that statistically significantly increase the potency and do not statistically significantly change the GABA/AMPA ratio are found to increase the activity of brain cortical synaptic plasticity. It may be judged to have altering or effective efficacy (preventive or therapeutic activity against neurological disorders or neurodegenerative disorders, cognitive function enhancing activity, etc.). Therefore, substances that statistically significantly increase the potency and do not statistically significantly change the GABA/AMPA ratio can be selected as candidate drugs for the prevention or treatment of neurological disorders or neurodegenerative disorders.
  • a candidate substance that statistically significantly increases potency compared to a control group that did not administer the candidate substance may be determined to be effective.
  • the potency is increased by about 1.2 times or more, 1.5 times or more, 2 times or more, 2.5 times or more, 3 times or more, or 4 times or more compared to a control group that did not administer the candidate substance or a group that administered another candidate substance.
  • a candidate substance that increases the efficacy by more than 5 times may be judged to have excellent efficacy.
  • a candidate substance that does not statistically significantly change (increase or decrease) the GABA/AMPA ratio compared to a control group that did not administer the candidate substance may be judged to be safe or have no side effects.
  • Substances that can be selected using the screening methods of the present invention include candidate drugs for the prevention or treatment of neurological or neurodegenerative disorders. Additionally, substances that can be selected using the screening method of the present invention include candidate drugs for improving cognitive function.
  • the neurological disorder is a disease having central or peripheral nervous system dysfunction as a component.
  • Neurological disorders can cause disturbances in the structure or function of the nervous system due to developmental abnormalities, disease, genetic defects, injury, or toxins. These disorders may affect the central nervous system (e.g., brain, brainstem, and cerebellum), peripheral nervous system (e.g., cranial nerves, spinal nerves, and sympathetic and parasympathetic nervous systems), and/or autonomic nervous system (e.g., control involuntary actions). It can affect the nervous system (part of the nervous system, which is divided into the sympathetic and parasympathetic nervous systems).
  • the neurodegenerative disorder includes a chronic neurodegenerative disorder or an acute neurodegenerative disorder. Most neurodegenerative disorders are caused by neuron degeneration in the brain.
  • Non-limiting examples of chronic neurodegenerative disorders include the following diseases: familial and sporadic amyotrophic lateral sclerosis (FALS and ALS, respectively), familial and sporadic Parkinson's disease, Huntington's disease, familial and sporadic Alzheimer's disease, multiple sclerosis, Muscular dystrophy, olivopontocerebellar atrophy, multiple system atrophy, Wilson's disease, progressive supranuclear palsy, diffuse Lewy body disease, corticodentatonigral degeneration, progressive familial myoclonic epilepsy, substantia nigra degeneration.
  • FALS and ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • Dystonia torsion familial tremor, Down syndrome, Tourette syndrome, Hallervorden-Spatz disease, diabetic peripheral neuropathy, boxer's dementia, AIDS dementia, age-related dementia, age associated memory impairment, and amyloidosis-related neurodegenerative diseases, such as diseases caused by the prion protein (PrP) associated with transmissible spongiform encephalopathies (Creutzfeldt-Jakob disease, Gerstmann-Streussler-Schaer). Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, scrapie, and kuru), and diseases caused by excessive cystatin C accumulation (e.g., hereditary cystatin C angiopathy).
  • PrP prion protein
  • Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome scrapie, and kuru
  • diseases caused by excessive cystatin C accumulation e.g., hereditary cystatin C angiopathy.
  • Non-limiting examples of acute neurodegenerative disorders include: traumatic brain injury (e.g., surgery-related brain injury), cerebral edema, peripheral nerve injury, spinal cord injury, Leigh's disease, and Guillain-Barre syndrome. (Guillain-Barre syndrome), lysosomal storage disorders such as lipofuscinoses, Alpers disease, restless legs syndrome, vertigo due to CNS degeneration; For example, pathologies that occur with chronic alcohol or drug abuse, including degeneration of neurons in the locus coeruleus and cerebellum, drug-induced motor disorders; Pathologies resulting from aging, including degeneration of cerebellar and cortical neurons leading to cognitive and motor impairment; and pathologies that occur with chronic amphetamine abuse, including degeneration of basal ganglia neurons leading to motor impairment; Pathological changes due to local trauma such as stroke, focal ischemia, vascular insufficiency, hypoxic-ischemic encephalopathy, hyperglycemia, hypoglycemia or direct trauma; Pathologies
  • the candidate agent may be useful for treating other types of brain diseases as long as it is partially regulated by HDAC (e.g., HDAC4).
  • HDAC e.g., HDAC4
  • these disorders include: Neuropsychiatric disorders associated with cognition, dementia, social behavior, anxiety, or other personality disorders, such as schizophrenia, delirium, attention deficit disorder (ADD), bipolar disorder, and obsessive-compulsive disorder. , or eating disorders; Fear and anxiety disorders, such as panic disorder, various phobias, post-traumatic stress disorder (PTSD), psychogenic impotence, or insomnia; various forms of addiction; and mood disorders such as depression.
  • the candidate substance may be a substance belonging to HDAC (histone deacetylase) inhibitors.
  • a candidate agent may be useful for modulating the activity of class IIa HDACs.
  • Histone deacetylase refers to any one of a class of enzymes that remove acetyl groups from ⁇ -N-acetyl lysine residues of histones. A total of 18 subtypes of HDAC have been identified to date, and the 18 subtypes are further classified into four classes (class I to IV) based on similarity in protein structure and function. “HDAC inhibitor” means a substance that can interact with HDAC and inhibit its enzymatic activity.
  • HDAC inhibitors Since being first approved for T-cell lymphoma, HDAC inhibitors have been used to treat other solid cancers, neurodegenerative diseases such as Huntington's disease and Alzheimer's disease, antiepileptics, cyclothymic disorder, epilepsy, essential hypertension, pulmonary fibrosis and polycystic diseases. It is being developed as a treatment for various diseases, including anti-fibrotic agents for the treatment of heart disease.
  • the candidate substance may be a substance for preventing or treating a condition mediated by HDAC, specifically a condition in which HDAC and/or HDAC action is important or necessary for the initiation, progression, expression, etc. of the condition.
  • a condition mediated by HDAC specifically a condition in which HDAC and/or HDAC action is important or necessary for the initiation, progression, expression, etc. of the condition.
  • candidate substances exhibiting HDAC inhibitory activity can be selected, and the selected HDAC inhibitors can inhibit HDAC activity in various types of cells or tissues, including the brain.
  • the conditions mediated by the HDACs may include, but are not limited to, the following diseases: cancer (e.g., Vigushin et al., 2001, Clin. Cancer Res., Vol. 7, No. 4, pp.
  • psoriasis see, e.g., lavarone et al., 1999, Mol. Cell Biol. Vol. 19, No. 1, pp. 916-922
  • Fibroproliferative disorders e.g., liver fibrosis, etc.; Niki et al., 1999, Hepatology, Vol. 29, No. 3, pp. 858-867; Corneil et al., 1998, Japanese Patent Application Publication JP 10114681 A2 ] reference
  • Smooth muscle proliferative disorders e.g., atherosclerosis, restenosis, etc.; see Kimura et al., 1994, Biol. Pharm. Bull., Vol. 17, No. 3, pp.
  • Neurodegenerative diseases e.g., Alzheimer's disease, Parkinson's disease, Huntington's disease, amyotrophic lateral sclerosis, spinocerebellar degeneration, etc.; Kuusisto et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 280, No. 1, pp. 223-228; Stefan, J. et al., 2002, PCT Publication No. WO 02/090534]
  • Inflammatory diseases e.g., osteoarthritis, rheumatoid arthritis, etc.; Dangond et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 242, No. 3, pp.
  • Fungal infections e.g., Bernstein et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 97, No. 25, pp. 13708-13713; Tsuji et al., 1976, J.. Antibiot. (Tokyo), Vol. 29, No. 1, pp. 1-6]
  • Parasitic infections e.g., malaria, trypanosomiasis, helminthiasis, protozoal infections, etc.; see Andrews et al., 2000, Int. J. Parasitol. Vol. 30, No. 6, pp.
  • Candidates that can be selected by the screening method of the present invention may be for the prevention or treatment of neurological disorders, examples of which include: peripheral nervous system diseases due to degeneration or damage, e.g. ataxia or trauma; and acute or chronic degenerative diseases of the eye, such as glaucoma.
  • the candidate substance may be a substance for the prevention or treatment of memory disorders (including memory loss/impairment) or cognitive dysfunction (cognitive function decline, etc.).
  • memory disorders including memory loss/impairment
  • cognitive dysfunction cognitive function decline, etc.
  • these disorders include: memory loss/impairment, disorders related to cognitive functions such as creativity, problem solving, and intuition.
  • This memory includes short-term memory (also called working or recent memory) and long-term memory. Short-term memory includes recent events, while long-term memory involves recalling events from the more distant past. Methods for assessing the ability to recall memories are known to those skilled in the art and may include routine cognitive testing.
  • Age-related amnesia is characterized by objective memory loss when the subject is older compared to when the subject is younger, but cognitive test scores are within the normal range for the subject's age. Subjects with age-related amnesia score within the normal range on standardized diagnostic tests for dementia as described in DSM-IV. Furthermore, DSM-IV provides separate diagnostic criteria for a condition termed age-related cognitive decline.
  • Age-related memory loss can include loss of brain weight, gyral atrophy, ventricular enlargement, and selective loss of neurons within various brain regions. In some embodiments of the invention, more progressive forms of memory loss are also included in the definition of age-related memory impairment.
  • Examples of types of memory disorders include Alzheimer's disease, amnesia, anterograde amnesia, blackout (e.g., alcohol-related amnesia), bromopathy, childhood amnesia, false memory syndrome, fugue state, Hypermemory, Korsakoff syndrome, partial amnesia, amnestic syndrome, amnesia, post-traumatic amnesia, prosopamnesia, psychogenic amnesia, repressed memory, retrograde amnesia, Ribot's Law.
  • Cognitive dysfunction or impairment is associated with Alzheimer's disease, Huntington's disease, seizure-induced amnesia, schizophrenia, Rubinstein-Tavy syndrome, Rett syndrome, Fragile , cognitive and learning disorders, attention deficit hyperactivity disorder (ADHD), dyslexia, learning disabilities, traumatic head injury, stroke-induced cognitive and motor disorders, traumatic brain injury, neurodegeneration and neuronal loss-mediated cognitive impairment, and attention deficit disorder.
  • ADHD attention deficit hyperactivity disorder
  • Cognitive dysfunction or impairment may also include anxiety disorders, conditioned fear responses, panic disorder, obsessive-compulsive disorder, post-traumatic stress disorder, phobias, social anxiety disorder, substance dependence recovery or age-related memory impairment (AAMI), and age-related cognitive decline ( Related to, but not limited to, ARCD).
  • candidate substances that can be selected using the screening method according to another aspect of the present invention include substances that have a cognitive function enhancing effect.
  • Cognitive function enhancement includes improvement or beneficial change in cognitive decline symptoms that appear as one of the symptoms of the above-mentioned neurological disorder or neurodegenerative disorder, and further improves the cognitive ability of normal people without neurological disorder or neurodegenerative disorder. It also includes anything that increases, increases or changes beneficially.
  • kits for use in a screening method according to the invention comprising the following artificial cerebrospinal fluid and instructions:
  • the first artificial cerebrospinal fluid is made to contain 4.5 to 5.5mM of MgSO 4 and 0.45 to 0.55mM of CaCl 2 before use, and is perfused or isolated from the brain of a non-human animal as a test subject at a temperature of 2 to 5°C.
  • the second artificial cerebrospinal fluid should contain 4.5 to 5.5 mM MgSO 4 and 0.9 to 1.1 mM CaCl 2 before use, and be used for culturing for recovery of brain slices at a temperature of 30 to 35°C; and instructions that the third artificial cerebrospinal fluid contain 1.17 to 1.43 mM MgSO 4 and 2.25 to 2.75 mM CaCl 2 before use, and to use it for further culturing or electrophysiological recording of brain slices at room temperature. directions.
  • MgSO 4 and CaCl 2 are key factors contributing to reproducibility and reliability in the measurement of synaptic plasticity and function.
  • concentration and pH of each compound are precisely adjusted. may change unintentionally. Therefore, it is preferable to add and mix the MgSO 4 and CaCl 2 immediately before using the artificial cerebrospinal fluid.
  • the kit of the present invention contains MgSO 4 and CaCl 2 in the first to third artificial cerebrospinal fluid. It is preferable not to include them, and these compounds may be provided in the kit as separate stock solutions in separate vials or containers.
  • the kit may further include MgSO 4 solution and CaCl 2 solution.
  • the MgSO 4 solution or CaCl 2 solution may have a concentration of 1M.
  • first artificial cerebrospinal fluid “second artificial cerebrospinal fluid” and “third artificial cerebrospinal fluid” is in item ‘1. See full disclosure under ‘Artificial Cerebrospinal Fluid Used at Each Step of the Screening Method’.
  • Candidate substances (BnH12001, etc.) were dissolved in DMSO (dimethyl sulfoxide) to prepare a stock solution at a concentration of 100 mM. Except when used directly for testing, stock solutions of candidate substances were dispensed into tubes and stored at -20°C. Stock solutions of candidate substances were prepared as final test solutions by diluting them 25 to 10,000 times with analysis buffer (or physiological saline) before administration to animals or use in tests, depending on the type of compound and route of administration.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the candidate substances BnH12001, BnH12003, BnH12005, BnH12022, BnH12036, BnH12048 and BnH12049 used in Example 7 were each prepared as a final test solution at a concentration of 5 mM, and the candidate substances were selected according to the screening method of the present invention.
  • the chemical structures of the candidate materials BnH12001 to BnH12049 are shown in Table 4 below.
  • Example 10 compounds previously developed for the treatment of brain nervous system-related diseases such as neurodegenerative diseases (SAHA, MC1568, LMK-235, TMP195, TMP269, Tasquinimod, Santacruzamate A, CHDI #1, CHDI #3) and BnH12001 was used as a test material to verify the screening method of the present invention.
  • SAHA neurodegenerative diseases
  • MC1568, LMK-235, TMP195, TMP269, Tasquinimod, Santacruzamate A, CHDI #1, CHDI #3) and BnH12001 was used as a test material to verify the screening method of the present invention.
  • SAHA neurodegenerative diseases
  • MC1568 LMK-235
  • TMP195 TMP195
  • TMP269 Tasquinimod
  • Santacruzamate A CHDI #1, CHDI #3
  • BnH12001 BnH12001
  • Example 2.2 Administration of candidate substances
  • the candidate substance can be administered by routes such as intracerebral administration, oral administration, intraperitoneal administration, or intravenous administration.
  • intracerebral administration was performed by an osmotic pump (hereinafter referred to as 'Os pump'). Each administration method was performed as described below.
  • the drug was injected into a cannula (Plastic One Inc.) connected to a small Os pump (Model 2002, DURECT Corporation ALZET Osmotic Pumps) and vinyl catheter tubing (8 cm for rats, 4 cm for mice). After binding, it was placed in a conical tube filled with physiological saline (vehicle of the candidate substance) and incubated at 35°C overnight.
  • Sterile saline solution (+/- candidate substance) was injected at a constant flow rate of 0.5 ⁇ l/hr through the infusion cannula using an Os pump.
  • the Os pump was inserted into the back skin of the mouse, dental cement (Jet Set 4 Denture Repair Powder and Jet Liquid mixed, LANG) was applied around the cannula, and the incision was sutured. After suturing, 2 mg/kg of ketoprofen and 20 mg/kg of cefazolin as anti-inflammatory drugs and antibiotics were intraperitoneally administered to the mouse.
  • methylene blue was first injected to stain the diffusion area.
  • methylene blue diffused up to 2000.0 ⁇ m from the injection site (the total area of the barrel cortex region is approximately 1500 ⁇ m). Based on this analysis, electrophysiological recordings were performed in the barrel cortex region.
  • Oral administration was performed without anesthesia in 4-week-old male rats (Sprague-Dawley ® ) or 8-week-old male C57BL/6J mice.
  • 2 mg of candidate material was dissolved in 800 ⁇ l of DMSO and prepared as a stock solution.
  • the stock solution of the candidate substance: PEG400: saline was mixed at a ratio of 5:55:40, and 200 ⁇ l was administered per experimental animal.
  • a vehicle containing DMSO:PEG400:saline mixed in a ratio of 5:55:40 was administered at 200 ⁇ l per experimental animal.
  • Stock solutions of candidate substances were diluted using DMSO:PEG400:saline (5:55:40) and administered intraperitoneally daily at a dose of 25 mg/kg of animal body weight (kg) for approximately 12 days (administration volume: 200 mg/kg). ⁇ l).
  • vehicle DMSO:PEG400:saline solution mixed at 5:55:40 was administered intraperitoneally in the same manner.
  • TC (thalamocortical) sections for patch clamp were prepared as follows. First, 6-7 week old male rats or 9-10 week old male C57BL/6J mice administered with the candidate drug or vehicle were anesthetized with isoflurane and then perfused with ice-cold sucrose-artificial cerebrospinal fluid (sucrose-aCSF). and for sectioning; referred to as first artificial cerebrospinal fluid (see Table 1 for detailed composition) to rapidly cool the brain through transcardial perfusion. The brain was removed from the animal, and the isolated brain was placed in ice-cold sucrose-aCSF.
  • sucrose-aCSF sucrose-artificial cerebrospinal fluid
  • the TC slices obtained as above were cultured in artificial cerebrospinal fluid for recovery at 30°C to 35°C (second artificial cerebrospinal fluid, see Table 2 for detailed composition) for 30 minutes, and then incubated in artificial cerebrospinal fluid for recording at room temperature (third artificial cerebrospinal fluid). Cerebrospinal fluid (see Table 3 for detailed composition) was further cultured for 1 hour.
  • TC EPSCs were evoked at 0.1 Hz by VB stimulation and were accepted as monosynaptic if they exhibited a short, constant latency that did not change with increasing stimulus intensity, as previously described (Feldman, Nicoll, Malenka, & Isaac, 1998 , Synaptic plasticity at thalamocortical synapses in developing rat somatosensory cortex: LTP, LTD, and silent synapses] and the literature [Isaac et al., 1997, Silent Synapses during Development of Thalamocortical Inputs]).
  • the ventrobasal thalamus stimulation intensity was adjusted to find the lowest intensity that evoked a mixture of synaptic responses and failures. Failure rate was calculated as number of failures/total number of attempts. Potency was calculated as the average EPSC peak amplitude excluding failures (Chittajallu & Isaac, 2010, Emergence of cortical inhibition by coordinated sensory-driven plasticity at distinct synaptic loci]; Isaac et al., 1997, Silent Synapses during Development of Thalamocortical Inputs]; and Stevens & Wang, 1995, Facilitation and depression at single central synapses).
  • Excitatory postsynaptic potentials were recorded by the whole-cell patch clamp method using a patch clamp amplifier (Molecular Devices, USA).
  • the measuring electrode was a borosilicate glass capillary, and a glass capillary with a resistance of 3.5 to 4.2 M ⁇ when filled with the solution inside the electrode was used.
  • the brain slice placed in the chamber was placed on an upright microscope, fixed with an anchor, and artificial cerebrospinal fluid (third artificial cerebrospinal fluid, see Table 3 for detailed composition) for recording was flowed by gravity at a rate of 5 to 10 mL/min.
  • the stimulator electrode was placed at the junction between the thalamic fibers and the S1 barrel cortex (layer 4) area, and cells in the area were located and recorded.
  • the membrane voltage was fixed at -70 mV (AMPA current was measured), stimulation was applied to check EPSCs, and the stimulator was manipulated to achieve minimal stimulation such that the current on/off was 50%. I found the robber. Amplitudes were measured with traces (20 or 50 traces total) for recording and current for 3 minutes 20 seconds or 8 minutes 20 seconds. For potency, the EPSC magnitude was set to 50 to 100 pA at -70 mV, and five traces were measured at 0 mV.
  • GABA/AMPA ratio was analyzed using Clampfit.
  • the baseline was set by specifying an interval between 0 and 100 ms.
  • the traces of data within 110 to 200 ms were averaged, and the negative current amplitude (pA) of the average trace was confirmed.
  • Figure 5b shows an example of negative current amplitude analysis of AMPA current.
  • the baseline was set by specifying an interval between 0 and 110 ms.
  • the average of the data traces within 110 to 300 ms was obtained, and the positive current amplitude (pA) of the average trace was confirmed.
  • Figure 5C shows an example of positive current amplitude analysis of GABA current.
  • candidate substances that statistically significantly increased potency compared to the control group that did not administer the candidate substance were judged to be primarily effective.
  • candidate substances that did not statistically significantly change (increase or decrease) the GABA/AMPA ratio compared to the control group that did not administer the candidate substance were primarily judged to have no side effects.
  • n represents the number of cells used in each experiment. Typically, one section was used for each animal, and one recording was performed from each section. between two groups Unpaired Student's t-test was used to compare mean values, and one-way ANOVA was used for statistical treatment of three or more groups. A p value of less than 0.05 was considered statistically significant. The statistical analysis was performed using Prism 9.0 (GraphPad Prism 9.1.2, GraphPad Software Inc., USA).
  • Example 7 Screening of candidate substances using electrophysiological methods
  • Candidate materials BnH12001, BnH12003, BnH12005, BnH12022, BnH12036, BnH12048, and BnH12049 were screened according to the methods described in Examples 1 to 6.
  • the GABA/AMPA ratio was confirmed to be maintained without statistically significant change in all other substance treatment groups except the BnH12022 treatment group.
  • BnH12001 and BnH12003 which had the greatest ability to increase potency and did not change the GABA/AMPA ratio, were selected as final candidates.
  • the efficacy of the selected final candidate substances was verified in an Alzheimer's animal model and a PTSD animal model.
  • the Active Avoidance Conditioning Test provides results from efficacy tests related to learning and memory. Specifically, it is a method of measuring the degree to which an animal actively avoids electrical stimulation using only light or sound through repetitive learning in which electrical stimulation is provided after sound or light signals are given. Therefore, the faster the avoidance time by sound or light, the better the learning and memory effects.
  • mice were obtained from the Jackson laboratory 7 days before the start of testing. Eighteen male Alzheimer's disease genetically modified mice B6;SJL-Tg(APPSWE)2576, approximately 15 months old, were used. Animals were maintained in a colony room under normal environmental conditions with a 12/12 hour light/dark cycle and had free access to food and water. Mice were acclimated to their new housing cages over 7 days. All tests were performed using these animals. All animal experiments were performed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, and every effort was made to minimize animal suffering. Body weight was measured every 3 days starting from the 7th day.
  • each mouse was placed in an interactive shuttle box (27 cm ⁇ 19 cm ⁇ 20 cm) consisting of a base plate consisting of two stainless steel bars (3 mm in diameter, 1 cm apart) and two 24V DC lights and a speaker. Each was placed. Electric shocks were transmitted to the base plate by an isolated shock generator (Panlab, s.l.u., Spain). After a 3-minute adaptation period in the shuttle box, the mouse was subjected to 30 avoidance conditions at an internal variable interval (20 seconds). Avoidance in the test was conducted 60 seconds after closing the middle door, and each avoidance consisted of giving a warning tone (conditioned stimulus, 4.0 kHz tone 80Db) for 5 seconds, waiting for 25 seconds, and then applying an unconditional electric shock (0.2 mA). Daily training was conducted.
  • an isolated shock generator Panlab, s.l.u., Spain.
  • the conditioned avoidance response was defined by crossing to the opposite room within the first 10 s of each trial. After 10 seconds, 0.2 mA of electricity was applied through the floor and lasted for 25 seconds. At this time, the tone sound was continuously played, and after 25 seconds, the electric shock and tone sound were turned off, and the middle door was also closed. When the mouse passes through the middle door to the other side of the room, the middle door closes and the tone sound and electric shock turn off. Therefore, the mouse could escape the room when only a tone was heard or after being exposed to an electric shock, and the time until escape was recorded.
  • the cognitive and learning effects of BnH12001 were observed in genetically modified mice for Alzheimer's disease, one of the neurodegenerative disorders.
  • the selected mice were divided into a control group and an experimental group (nine each), and 1 mg/kg of BnH12001 was administered by oral administration.
  • Animals were obtained from DBL. Animals were obtained 7 days prior to the start of testing. Twenty male SD-rats, approximately 7 weeks old, were used. Animals were maintained in a colony room under normal environmental conditions with a 12/12 hour light/dark cycle and had free access to food and water. Rats were acclimated to their new housing cages over 7 days. All tests were performed using these animals. All experiments were performed in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, and every effort was made to minimize animal suffering. Body weight was measured every 3 days starting from the 7th day.
  • This protocol includes two exposures to foot shock without opportunity for escape.
  • Body weight was measured 3 hours before the experiment.
  • the temperature in the laboratory was maintained at 22°C.
  • Animals were placed in a dark laboratory room for 10 min to acclimate. Each animal was placed in the first room. After 2 minutes, the door separating the two compartments was opened and the animals were allowed to freely move between both compartments. After 5 minutes, 15 foot shocks of 1 mA/2 s were applied at random intervals (90 to 270 s). After completing the test, the animals were left in the box for 1 minute and moved to the colony room.
  • Body weight was measured 3 hours before the experiment.
  • the temperature in the laboratory was maintained at 22°C.
  • Animals were placed in a dark laboratory room for 10 min to acclimate. Animals were placed in the first compartment with sandpaper attached. At this time, the door remained closed, preventing the animal from crossing into the second compartment. After 10 minutes, the animal was shocked three times at 2 mA/sec. After completing the test, the animals were left in the box for 1 minute and moved to the colony room.
  • the compound was diluted to 25 mg/kg using DMSO:PEG400:saline (5:55:40). Starting from day 7, the compound was administered intraperitoneally every day for 24 days at 10 am (intraperitoneal administration volume is 200 ⁇ l). The control group was also injected intraperitoneally in the same manner using vehicle (DMSO:PEG400:saline (5:55:40)).
  • a camera was placed in front of the transparent acrylic plate of the electronic box to check all animal movements. For all groups, freezing was checked every 3 days starting from the 7th day. Each animal was filmed for 5 minutes. Based on the video, the freezing time of each animal was confirmed. The freezing time on the 7th day was set to 100%, and then the freezing time for each day of the week was converted into a percentage.
  • PTSD post-traumatic stress disorder
  • SD rodents (rats) (300 g) were acclimatized for 3 days, and were placed in the chamber for 5 minutes and photographed to test the freezing of the experimental rats before entering the experiment.
  • electrical stimulation was randomly applied to the sole of the foot with 15 shocks at intervals of 90 to 270 seconds, an intensity of 1 mA, and a duration of 2 seconds.
  • electrical stimulation was applied to the sole of the foot every 3 seconds with BnH12003 shocks, an intensity of 2 mA, and a duration of 2 seconds.
  • PTSD rodents (rats) were selected by checking the freezing time on day 7.
  • the selected rodents (rats) were divided into a control group and an experimental group (12 each), and 1 ⁇ M of BnH12003 was administered to the ventricle of the rodents (rats) using an Os pump.
  • saline was intraperitoneally administered to the control group and BnH12003 (25 mg/kg) was intraperitoneally administered to the experimental group, and freezing time was checked at 3-day intervals. Freezing time was checked a total of 8 times, and the reduction in freezing time was calculated as a percentage (%) based on the 7th day after producing the PTSD rodent (rat) model.
  • SAHA also known as Vorinostat
  • Vorinostat is a type of HDAC inhibitor and is an FDA-approved anticancer drug.
  • SAHA showed a tendency to slightly increase the potency and did not appear to cause a significant change in the GABA/AMPA ratio.
  • MC1568 is a class IIa HDAC inhibitor that has been shown to significantly increase potency without causing significant changes in the GABA/AMPA ratio. In fact, MC1568 has been reported to be effective in treating experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) (see “Inhibition of Class IIa HDACs in the Treatment of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, Scientific Reports, 2017]) and in a Parkinson’s disease model. It has been reported to reduce brain cell damage and improve motor function (see literature ["Class IIa histone deacetylases as therapeutic targets for Parkinson's disease", Neurobiology of Disease, 2020)].
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • LMK-235, TMP195, and TMP269 are all HDAC inhibitors that significantly increase potency but do not cause changes in the GABA/AMPA ratio.
  • LMK-235 has been reported to reduce brain cell damage and improve cognitive function in animal models of senile dementia ("HDAC Inhibition as a Therapeutic Strategy in Neurodegeneration: Insights from LMK-235", Current Alzheimer Research, 2017]).
  • TMP195 has been studied as a treatment for neurological diseases such as senile dementia and schizophrenia, and has been shown to improve cognitive function in animal models ("HDAC inhibition improves cognitive deficits in models for dementia and schizophrenia", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013], TMP269 has been reported to improve motor function in relation to Huntington's disease (see “HDAC inhibitor TMP269 improves motor function and shows neuroprotective effects in the R6 /2 mouse model of Huntington's disease", Molecular Neurodegeneration, 2017].
  • Tasquinimod increased potency to some extent and did not appear to cause significant changes in the GABA/AMPA ratio. Tasquinimod was initially developed as an anticancer drug, but failed to pass the phase 3 clinical trial. It is currently being studied as a treatment for neurological diseases such as Parkinson's disease, and has been reported to improve motor function in animal models (literature ["Tasquinimod is a potential disease-modifying therapy in Parkinson's disease", Scientific Reports, 2017].
  • CHDI #1 801251
  • CHDI #3 CHDI00390576
  • the potency increasing effect was found to be significantly lower compared to MC1568 or BnH12001.
  • CHDI #1 and CHDI #3 were tested in preclinical trials for Huntington's disease, but both failed. This suggests that the degree of increase in potency in the screening method of the present invention may also be useful in predicting the efficacy of an actual drug.
  • Santacruzamate A (CAY10683) did not increase potency compared to the control group, and the GABA/AMPA ratio was also found to be reduced.
  • Santacruzamate A is a reagent used only for experimental purposes, and although it has the effect of promoting neuronal proliferation in brain cells, it cannot be applied to actual humans due to safety reasons (document ["Santacruzamate A improves memory impairment and increases neurogenesis in aged mice” , Marine drugs, 17(4), 234].

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Abstract

발명은 뇌 피질 시냅스 가소성에 영향을 미치는 물질을 스크리닝하기 위한 전기생리학적 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 의해 선별된 물질은 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물로 개발될 수 있다.

Description

약물의 전기생리학적 스크리닝 방법
본 발명은 약물의 전기생리학적 스크리닝(screening) 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 후보 약물의 시냅스 가소성에 대한 영향을 평가하여 뇌 피질 시냅스 가소성의 활성을 변화시키는 물질, 특히 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 위한 약물을 효과적으로 선별할 수 있는 전기생리학적 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 출원은 2022년 3월 28일에 출원된 미국 특허출원 US 63/324,221에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
시냅스 가소성 및 결정적 시기
신경망은 뉴런으로 이루어진 망이다. 시냅스는 뉴런이 서로 정보를 교환하는 신경망 내의 노드이다. 망 내에서, 시냅스는 "가소성"인데, 이는 진행 중인 신경 활동에 반응하여 시냅스 입력이 추가, 제거 또는 정교화됨에 따라 시냅스의 수와 강도가 일생에 걸쳐 지속적으로 변하기 때문이다. 시냅스 가소성은 시냅스 전달의 강도 및/또는 효율성의 변화에 의해 나타나는 시냅스의 이러한 신경 활동 의존적 변형을 지칭한다.
학습, 인지, 종합, 판단, 예술 또는 창의성과 같은 고차 기능은 대뇌피질에서 신경망(피질 신경망이라고 일컬어짐)을 형성하는 능력에 좌우된다. 피질 신경망의 시냅스 가소성은 출생 후 초기에 최고조에 달하며, 이는 결정적 시기로 알려져 있다. 결정적 시기 이후, 피질의 시냅스 가소성은 나이가 들면서 점차 감소하여, 결국 경험이 더 이상 대뇌피질의 능동적 변화를 일으키지 않는 상태에 이르게 된다. 그러나 흥미롭게도 최근 연구는 특정 조건 하에서 결정적 시기가 종료된 후에도 시냅스 가소성이 높은 수준으로 회복될 수 있음을 보여주었다: 동물 모델에서, 말초 신경 손상은 말초 감각 신호를 대뇌피질에 전달하는 체감각 시상피질 회로에서 시냅스 가소성을 재활성화시켰다(문헌[Yu et al., 2012, Neuron. 74:731-42]; 문헌[Petrus et al., 2014, Neuron. 81:664-73]; 및 문헌[Gao et al., 2014, J Neurosci. 34:10770-9]).
감소된 시냅스 가소성은 성인의 뇌 기능 퇴화와도 관련이 있다. 특히, 시상 피질 회로의 시냅스 가소성은 나이가 들면서 크게 제한된다. 위에서 언급한 바와 같이 결정적 시기를 재개하는 것이 가능한 경우, 치료 수단을 통해 피질 시냅스 가소성을 재활성화하거나 증가시키면 감소된 시냅스 가소성으로 인한 질환을 치료하는 데 유용할 수 있다.
따라서, 시냅스 가소성을 재활성화하거나 증가시킬 수 있는 약물을 선별할 수 있는 방법 또는 플랫폼을 개발하는 것이 유용할 것이다.
패치 클램프를 이용한 전기생리학적 분석
한편, 패치 클램프(Patch Clamp)는 분리된 살아있는 세포의 이온 흐름(ionic currents)을 연구하는 데 사용되는 기기이다. 이 기기는 특히 신경세포(neurons), 심근세포(cardiomyocytes), 근섬유(muscle fibers) 및 췌장 베타 세포와 같은 여기 세포(excitable cells)를 연구하는 데 유용하다. 패치 클램프는 전압 클램프 또는 전류 클램프 기술을 사용하여 수행될 수 있는데, 전압 클램프는 세포 막을 통과하는 전압을 실험자가 조절해 주고 그 생성된 전류를 기록하는 것이고, 전류 클램프는 세포 막을 통과하는 전류를 실험자가 조절해 주고 그 생성된 전압을 기록하는 것이다. 이온 채널은 다양한 질환의 타겟이다. 최근 자동화된 패치 클램프의 개발에 따라, 통증의 주요 타겟인 전압-개폐 나트륨 채널(voltage-gated sodium channels; Nav1.7)의 경우, 자동화된 패치 클램프 기술을 이용하여 후보 약물의 스크리닝을 시도한 바 있다. 그러나, 종래 패치 클램프 기술은 시료 준비 등 방법 자체가 난이도가 높고 재현이 어려워 약물 스크리닝에 적합하지 않았다.
본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 모두 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 전기생리학적 방법 중 하나인 패치 클램프 기술을 이용하여 뇌 피질 시냅스 가소성의 재활성화 또는 증가를 위한 후보 약물을 스크리닝할 수 있는 방법 또는 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.
본 발명의 일 태양에 따르면, (a) 비인간 동물에 후보 물질을 투여하는 단계; (b) 상기 동물에 2 내지 5℃의 제1 인공 뇌척수액을 주입하여 뇌를 냉각시킨 후 동물로부터 뇌를 분리하는 단계; (c) 상기 분리된 뇌로부터 2 내지 5℃의 제1 인공 뇌척수액 내에서 대뇌피질(cerebral cortex) 영역을 포함하는 뇌 절편을 준비하는 단계; (d) 상기 단계 (c)에서 수득한 뇌 절편을 30 내지 35℃의 제2 인공 뇌척수액에서 배양하는 단계; 및 (e) 패치 클램프를 사용하여 제3 인공 뇌척수액 내에서 상기 뇌 절편의 대뇌피질 영역에서 흥분성 시냅스후 전류(excitatory postsynaptic current, EPSC)를 기록하는 단계를 포함하는 뇌 피질 시냅스 가소성의 활성을 변화시키는 물질을 스크리닝하는 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 방법은 단계 (d) 이후 또는 단계 (e) 이전에, 뇌 절편을 실온의 제3 인공 뇌척수액에서 추가로 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 단계 (c)의 뇌 절편을 준비하는 단계는 분리된 뇌를 2 내지 5℃의 제1 인공 뇌척수액 내에서 정중선을 기준으로 50° 내지 55°의 각도 및 300 내지 500 μm의 두께로 절편화하는 것을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 단계 (e)의 기록은 5 내지 10 ml/min의 유속으로 순환하는 제3 인공 뇌척수액 내에서 수행될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 대뇌피질 영역은 배럴피질(barrel cortex)의 제4층을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 뇌 절편은 시상피질(thalamocortical) 절편일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 단계 (e)에서 흥분성 시냅스후 전류는 대뇌피질 영역에서 배럴피질의 제4층을 패치하여 기록될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 제1 인공 뇌척수액은 수크로스, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, 글루코스, Na 피루베이트, Na L-아스코르베이트, MgSO4 및 CaCl2를 포함할 수 있다. 보다 구체화된 예에서, 상기 제1 인공 뇌척수액은 175 내지 215 mM의 수크로스, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 29 내지 36 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트, 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트, 4.5 내지 5.5 mM의 MgSO4 및 0.45 내지 0.55 mM의 CaCl2를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 제1 인공 뇌척수액은 수크로스, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, 글루코스, Na 피루베이트 및 Na L-아스코르베이트를 포함하여 제조되고, MgSO4 및 CaCl2는 제1 인공 뇌척수액의 사용 직전 또는 사용 당일 추가되는 것일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 제2 또는 제3 인공 뇌척수액은 NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, 글루코스, Na 피루베이트, Na L-아스코르베이트, MgSO4 및 CaCl2를 포함할 수 있다. 보다 구체화된 예에서, 상기 제2 인공 뇌척수액은 115 내지 142 mM의 NaCl, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 19 내지 24 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트, 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트, 4.5 내지 5.5 mM의 MgSO4 및 0.9 내지 1.1 mM의 CaCl2를 포함할 수 있다. 또한, 상기 제3 인공 뇌척수액은 111 내지 137 mM의 NaCl, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 23 내지 29 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트, 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트, 1.17 내지 1.43 mM의 MgSO4 및 2.25 내지 2.75 mM의 CaCl2를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 제2 또는 제3 인공 뇌척수액은 NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, 글루코스, Na 피루베이트 및 Na L-아스코르베이트를 포함하여 제조되고, MgSO4 및 CaCl2는 제2 또는 제3 인공 뇌척수액의 사용 직전 또는 사용 당일 추가되는 것일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 방법은 (f) 상기 기록된 EPSC에 기초하여 포텐시(potency) 및 GABA(γ-aminobutyric acid)/AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) 비를 도출하는 단계; 및 (g) 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 포텐시를 통계적으로 유의하게 상승시키고/거나 상기 GABA/AMPA 비를 통계적으로 유의하게 변화시키지 않는 물질을 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 물질은 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 비인간 동물은 설치목(rodentia), 유대목(marsupialia) 또는 토류목(lagomorpha) 속하는 것일 수 있다. 보다 구체화된 예에서, 상기 비인간 동물은 마우스(mouse), 래트(rat), 햄스터(hamster), 게르빌루스쥐(gerbil), 사향쥐(muskrat), 기니피그(guinea pig), 친칠라(chinchilla), 날다람쥐(flying squirrel), 얼룩다람쥐(chipmunk), 들다람쥐(ground squirrel), 프레리도그(prairie dog), 회색다람쥐(grey squirrel), 호저(porcupine), 주머니쥐(opossum) 또는 토끼(rabbit)일 수 있으나, 본 발명의 목적을 달성할 수 있는 한도 내에서 특정 동물로 제한되지 않는다.
또 다른 구현예에서, 상기 단계 (e)는 수동 패치 클램프를 사용하여 전세포 기록(whole-cell recording)으로 수행될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 단계 (e)의 기록은 대뇌피질 영역 내 배럴피질(barrel cortex)의 제4층의 성상세포에서 수행될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 단계 (e)는 27 내지 29℃에서 수행될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 단계 (e)의 EPSC는 저항이 3.5 내지 4.2 mΩ인 전극을 사용하여 기록될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 단계 (e)의 EPSC는 막 전압을 -70 mV로 고정하여 기록될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 단계 (f)의 포텐시는 0 내지 100 ms 사이의 구간을 기준선으로 설정하고, 110 내지 200 ms 사이의 구간에서 나타나는 온(on) 전류를 선택하여 도출된 평균 트레이스의 네거티브 전류 진폭(pA)일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 단계 (f)의 GABA/AMPA 비는 (ⅰ) -70 mV의 EPSC 기록에서 0 내지 100 ms 사이의 구간을 기준선으로 하였을 때 110 내지 200 ms 사이 구간에서의 평균 트레이스의 네거티브 전류 진폭(pA) 대비 (ⅱ) 0 mV의 EPSC 기록에서 0 내지 110 ms 사이의 구간을 기준선으로 하였을 때 110 내지 300 ms 사이 구간에서의 평균 트레이스의 포지티브 전류 진폭(pA) 값일 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, (ⅰ) 175 내지 215 mM의 수크로스, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 29 내지 36 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트 및 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트를 포함하는 제1 인공 뇌척수액; (ⅱ) 115 내지 142 mM의 NaCl, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 19 내지 24 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트 및 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트를 포함하는 제2 인공 뇌척수액; (ⅲ) 111 내지 137 mM의 NaCl, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 23 내지 29 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트 및 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트를 포함하는 제3 인공 뇌척수액; 및 (ⅳ) 상기 제1 인공 뇌척수액은 사용 전 4.5 내지 5.5 mM의 MgSO4 및 0.45 내지 0.55 mM의 CaCl2를 포함하도록 하고, 2 내지 5℃의 온도로 실험 대상체인 비인간 동물의 관류 또는 분리된 뇌의 절편화에 사용할 것; 상기 제2 인공 뇌척수액은 사용 전 4.5 내지 5.5 mM의 MgSO4 및 0.9 내지 1.1 mM의 CaCl2를 포함하도록 하고, 30 내지 35℃ 온도로 뇌 절편의 회복을 위한 배양시 사용할 것; 및 상기 제3 인공 뇌척수액은 사용 전 1.17 내지 1.43 mM의 MgSO4 및 2.25 내지 2.75 mM의 CaCl2를 포함하도록 하고, 실온에서 뇌 절편의 추가 배양 또는 전기생리학적 기록에 사용할 것을 포함하는 지시가 포함된 지시서를 포함하는 본 발명에 따른 스크리닝 방법에 사용하기 위한 키트가 제공된다.
일 구현예에서, 상기 키트는 MgSO4 용액 및 CaCl2 용액을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법은 전기생리학적 기법에 의해 후보 약물의 시냅스 가소성에 대한 영향을 평가할 수 있으며, 이로써 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물을 효과적으로 선별할 수 있다. 특히, 패치 클램프를 이용한 시냅스 가소성 변화 측정에 최적화된 시료 준비 조건, 측정 조건, 측정되는 부위 등의 요소에 의해 높은 재현성으로 약물을 스크리닝할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 Os 펌프가 이식된 마우스(좌측 이미지) 및 Os 펌프가 이식된 뇌의 부위(우측 이미지)를 도시한다.
도 2는 인공 뇌척수액의 조성 및 온도 차이에 따른 뇌 세포의 모양과 크기를 확인한 현미경 이미지이다(좌측 이미지, 본 발명의 인공 뇌척수액을 사용한 경우; 우측 이미지, 인공 뇌척수액의 조성이나 온도가 본 발명의 인공 뇌척수액의 조성이나 온도 조건과 상이한 경우).
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라 마우스 또는 래트의 뇌로부터 관상사면 절편(paracoronal slice)을 준비하기 위한 경사로 및 절단 각도(좌측)와 절단 순서(우측)를 개략적으로 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 패치 클램프로 EPSC가 측정되는 배럴피질의 제4층을 보여주는 현미경 이미지이다.
도 5a 내지 도 5c는 본 발명의 일 실시예에 따라 기록된 EPSC로부터 각각 포텐시(도 5a), AMPA 전류의 네거티브 전류 진폭(도 5b) 및 GABA 전류의 포지티브 전류 진폭(도 5c) 분석의 예시를 도시한다.
도 6a 및 도 6b는 본 발명의 일 실시예에 따라 후보 물질 BnH12001, BnH12003, BnH12005, BnH12022, BnH12036, BnH12048 및 BnH12049에 대한 스크리닝 시험을 수행한 결과를 도시한다. 도 6a는 각 화합물의 포텐시를, 도 6b는 각 화합물의 GABA/AMPA 비를 도시한다.
도 7은 알츠하이머병 동물 모델에서 BnH12001의 경구 투여에 의한 인지기능 개선 효과를 나타낸다.
도 8은 BnH12003의 복강내 투여(25 mg/kg)에 반응한 외상후 스트레스 장애의 설치류(래트) 모델에서의 증상의 개선 정도를 나타낸다.
도 9a 및 도 9b는 본 발명의 일 실시예에 따라 기존에 뇌 신경계 질환 관련 치료를 위한 물질로 연구된 화합물에 대해 스크리닝 시험을 수행한 결과를 도시한다. 도 9a는 각 화합물의 포텐시를, 도 9b는 각 화합물의 GABA/AMPA 비를 도시한다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 구현예에 관하여 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 본 발명의 다양한 구현예/실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 일 구현예/실시예에서 다른 구현예/실시예로 변경되거나 구현예/실시예들이 조합되어 구현될 수 있다. 본 명세서에 사용된 기술 및 학술 용어들은, 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석할 목적으로 하기 정의들이 적용될 것이고, 단수로 사용된 용어는 적절한 경우에는 복수형을 포함할 것이며 그 반대도 마찬가지이다.
Ⅰ. 정의
본 명세서에서 사용된 용어 "신경학적 장애"에는 신경퇴행성 질환, 신경 정신 장애, 기억 상실, 인지기능 장애/손상, 소거 학습 장애가 포함된다.
용어 "신경퇴행성 장애"는 새로운 뉴런의 생성을 자극하는 제제로 역전되거나, 저지되거나, 관리되거나, 치료되거나, 개선되거나, 제거될 수 있는 임의의 장애를 의미한다.
용어 "인지능력"은 "인식능력"과 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 외부의 정보를 받아들이고 이를 처리하기 위해 뇌에서 일어나는 일련의 활동과 기술, 내적 통제과정 등을 의미한다.
용어 "인지능력 증강"은 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 증상 중 하나인 인지능력 감퇴 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 것, 또는 신경학적 장애나 신경퇴행성 장애를 갖지 않는 정상인의 인지능력이 개선되거나, 상승되거나 또는 이롭게 변경되는 것을 의미한다.
용어 "약"은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다. 예를 들어, 용어 "약"은 숫자 또는 수치로 표현된 값 x와 관련하여 사용될 때 x ± 10%를 의미할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상 이 기술 분야의 통상의 기술자가 인식할 수 있는 의미를 모두 포함하고, 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용되며, 문맥에 따라 적절히 해석될 수 있다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 명세서에 기재된 함량(또는 농도), 변수 또는 매개변수는 군 또는 범위로 개시된다. 발명의 설명은 상기 군 및 범위의 모든 개별 구성요소를 포함하도록 특별히 의도되었다.
본 명세서에서 사용 예 또는 예시적인 표현, 예를 들어 "~와 같은" 또는 "~을 포함하는"은 단지 본 발명을 더 잘 설명하기 위한 것이며, 청구되지 않는 한 본 발명의 범위를 제한하지 않는다. 본 명세서의 어떠한 표현도 임의의 청구되지 않은 요소가 본 발명의 실시에 필수적인 것임을 나타내는 것으로 해석되어서는 안 된다.
Ⅱ. 스크리닝 방법
본 발명은 대뇌피질, 구체적으로 배럴피질(barrel cortex)의 제4층에서 신경 가소성의 변화를 유도할 수 있는 물질을 스크리닝할 수 있는 전기생리학적 방법에 관한 것이다. 신경 가소성의 재활성화 또는 증가를 유도할 수 있는 물질은 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 위한 약물로 개발될 수 있다. 본 발명은 부분적으로 기존에 시도되지 못했던 배럴피질 제4층에서 신경 가소성을 측정하여 약물을 스크리닝할 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 또한, 본 발명은 부분적으로 생체 외에서 다루기 어려운 대뇌피질 절편을 살아 있는 상태로 준비할 수 있고 신경 가소성 변화를 유효하게 측정할 수 있는 고도로 정밀화되고 재현성 있는 전기생리학적 방법에 기초한다. 다른 측면에서, 본 발명은 신경 가소성의 변화가 고도로 정밀화된 전기생리학적 방법, 특히 (수동) 패치 클램프(patch clamp)에 의해 높은 신뢰도 및 해상도로 감지될 수 있다는 새로운 발견에 기초한다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 뇌 피질 시냅스 가소성의 활성을 변화시키는 물질을 스크리닝하는 방법이 제공된다: (a) 비인간 동물에 후보 물질을 투여하는 단계; (b) 상기 동물에 2 내지 5℃의 제1 인공 뇌척수액을 주입하여 뇌를 냉각시킨 후 동물로부터 뇌를 분리하는 단계; (c) 상기 분리된 뇌로부터 2 내지 5℃의 제1 인공 뇌척수액 내에서 대뇌피질(cerebral cortex) 영역을 포함하는 뇌 절편을 준비하는 단계; (d) 상기 단계 (c)에서 수득한 뇌 절편을 30 내지 35℃의 제2 인공 뇌척수액에서 배양하는 단계; 및 (e) 패치 클램프(patch clamp)를 사용하여 제3 인공 뇌척수액 내에서 상기 뇌 절편의 대뇌피질 영역의 흥분성 시냅스후 전류(excitatory postsynaptic current, EPSC)를 기록하는 단계.
일 구현예에서, 상기 방법은 단계 (d) 이후 또는 단계 (e) 이전에 뇌 절편을 실온의 제3 인공 뇌척수액에서 추가로 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이러한 추가 배양 단계는 뇌 절편의 회복을 더욱 촉진시키고 단계 (e)가 수행되는 환경에 적응할 수 있는 시간을 부여하여 패치 클램프의 성공 확률을 더욱 높여줄 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 방법은 (f) 상기 기록된 EPSC에 기초하여 포텐시(potency) 및 GABA(γ-aminobutyric acid)/AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) 비를 도출하는 단계; 및 (g) 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여, 상기 포텐시를 통계적으로 유의하게 상승시키고/거나 상기 GABA/AMPA 비를 통계적으로 유의하게 변화시키지 않는 물질을 신경 가소성의 변화를 유도할 수 있는 물질, 예컨대 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물로 선별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 설명 전체에 걸쳐, 스크리닝 방법의 일부 단계 또는 단계들의 순서는 본 발명이 작동 가능한 상태로 유지되거나 발명의 목적(후보 물질의 스크리닝)을 달성할 수 있는 한 중요하지 않음을 이해해야 한다. 또한, 둘 이상의 단계 또는 동작은 동시에 수행될 수 있다.
이하, 본 발명에서 제공되는 스크리닝 방법의 각 단계 및 이의 구성 요소에 대해 상세히 설명한다.
1. 스크리닝 방법에서 사용되는 인공 뇌척수액(artificial cerebrospinal fluid, aCSF)
본 발명의 일 측면에 따르면, 스크리닝 방법에서 사용되는 인공 뇌척수액(aCSF)은 이의 조성(구성성분 및 농도), pH, 온도 등을 각 단계마다 상이하게 함으로써 측정 성공 확률이 극히 낮은 (수동) 패치 클램프 기법의 성공률을 현저하게 상승시킬 수 있다. 이하, 본 발명에서 제공되는 각각의 인공 뇌척수액에 대해 상세히 설명한다.
(1) 제1 인공 뇌척수액 - 관류 및 절편화용
본 발명의 스크리닝 방법에서 사용되는 제1 인공 뇌척수액은 수크로스 기반의 인공 뇌척수액이다. 상기 제1 인공 뇌척수액은 단계 (b)에서는 관류액(perfusate)으로 사용될 수 있고, 단계 (c)에서는 뇌의 절편화 용액으로 사용될 수 있다.
제1 인공 뇌척수액은 수크로스, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, 글루코스, Na 피루베이트, Na L-아스코르베이트, MgSO4 및 CaCl2를 포함할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐서, 제1 인공 뇌척수액은 문맥에 따라 MgSO4 및 CaCl2를 포함하거나 포함하지 않는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들어, 제1 인공 뇌척수액이 관류용(또는 관류액) 또는 절편화용 인공 뇌척수액을 의미하는 경우 MgSO4 및 CaCl2를 포함할 수 있다. 다른 예로, 제1 인공 뇌척수액이 키트에 포함되는 것인 경우 MgSO4 및 CaCl2를 포함하지 않을 수 있다.
일 구현예에서, 제1 인공 뇌척수액은 175 내지 215 mM의 수크로스, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 29 내지 36 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트, 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트, 4.5 내지 5.5 mM의 MgSO4 및 0.45 내지 0.55 mM의 CaCl2를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 제1 인공 뇌척수액은 수크로스를 175 내지 215 mM, 176 내지 214 mM, 178 내지 213 mM, 179 내지 212 mM, 180 내지 211 mM, 181 내지 210 mM, 182 내지 209 mM, 183 내지 208 mM, 184 내지 207 mM, 185 내지 206 mM, 186 내지 205 mM, 187 내지 204 mM, 188 내지 203 mM, 189 내지 202 mM, 190 내지 201 mM, 189 내지 200 mM, 190 내지 199 mM, 191 내지 198 mM, 192 내지 197 mM, 193 내지 197 mM, 바람직하게는 194 내지 197 mM, 195 내지 197 mM, 194 내지 196 mM, 195 내지 196 mM, 보다 바람직하게는 195.5 mM의 농도로 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 제1 인공 뇌척수액에서 NaHCO3의 농도는 29 내지 36 mM, 30 내지 35 mM, 31 내지 34 mM, 31.5 내지 33.5 mM, 32 내지 33 mM, 바람직하게는 32.5 mM일 수 있다. NaHCO3는 패치 클램프 성공률에 중요한 영향을 미치는 pH를 변화시킬 수 있는 화합물이므로, 이의 농도 범위는 본 스크리닝 방법에 있어서 특히 중요하다.
또 다른 구현예에서, 제1 인공 뇌척수액에서 MgSO4의 농도는 4 내지 6 mM, 4.5 내지 5.5 mM, 바람직하게는 5 mM일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 제1 인공 뇌척수액에서 CaCl2의 농도는 0.45 내지 0.55 mM, 0.48 내지 0.52 mM, 바람직하게는 0.5 mM일 수 있다.
일 구현예에서, 제1 인공 뇌척수액은 단계 (b) 또는 단계 (c)에서 2 내지 5℃, 3 내지 5℃, 3.5 내지 4.5℃, 바람직하게는 4℃의 온도로 사용된다.
일 구현예에서, 제1 인공 뇌척수액의 pH는 7.35 내지 7.45일 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 제1 인공 뇌척수액은 하기 표 1에 기재된 바와 같은 조성을 가질 수 있다.
제1 인공 뇌척수액 (4℃)
화합물 몰 질량(g/mol) 최종 농도(mM) 리터당 첨가량(g)
수크로스 342.3 195.5 66.931
KCl 74.56 2.5 0.186
NaH2PO4 119.98 1 0.120
NaHCO3 84.01 32.5 2.730
글루코스 180.16 11 1.982
Na 피루베이트 110.04 2 0.220
Na L-아스코르베이트 198.11 1 0.198
사용 직전 또는 사용 당일 추가 (4℃)
스톡 용액 스톡 용액 농도(M) 최종 농도(mM) 리터당 첨가량(ml)
MgSO4 용액 1 5 5
CaCl2 용액 1 0.5 0.5
이론에 얽매이지는 않지만, 상기 제1 인공 뇌척수액에서, MgSO4 및 CaCl2는 시냅스 가소성(또는 기능) 측정에 기여하는 주요 구성 성분으로서 작용하는 것으로 생각된다. MgSO4 및 CaCl2는 단계 (b) 또는 단계 (c)에서 사용하기 직전 또는 사용 당일 추가하는 것이 바람직하다. 일 예로, 제1 인공 뇌척수액은 수크로스, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, 글루코스, Na 피루베이트 및 Na L-아스코르베이트를 포함하는 용액으로 제조된 후 단계 (b)에서 제1 인공 뇌척수액으로 동물을 관류하기 직전 또는 관류하는 당일에 MgSO4 및 CaCl2를 상기 먼저 제조된 용액에 첨가하는 것이 바람직하다. 다른 예로, 제1 인공 뇌척수액은 수크로스, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, 글루코스, Na 피루베이트 및 Na L-아스코르베이트를 포함하는 용액으로 제조된 후 단계 (c)에서 제1 인공 뇌척수액 내에서 뇌 절편을 준비하기 직전 또는 준비하는 당일에 MgSO4 및 CaCl2를 상기 먼저 제조된 용액에 첨가할 수 있다.
(2) 제2 인공 뇌척수액 - 회복용
본 발명의 스크리닝 방법에서 사용되는 제2 인공 뇌척수액은 다른 단계(예를 들어, 뇌 절편을 준비하는 단계 또는 EPSC를 기록 단계)에서 사용되는 인공 뇌척수액과 상이한 조성을 가지며, 사용시 온도 또한 다르게 함으로써 절편화된 뇌 조직의 회복을 유도하고 (수동) 패치 클램프 기법의 성공률을 현저하게 상승시킬 수 있다.
여기서, 제2 인공 뇌척수액은 NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, 글루코스, Na 피루베이트, Na L-아스코르베이트, MgSO4 및 CaCl2를 포함할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐서, 제2 인공 뇌척수액은 문맥에 따라 MgSO4 및 CaCl2를 포함하거나 포함하지 않는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들어, 제2 인공 뇌척수액이 단계 (d)에서와 같이 회복용 인공 뇌척수액을 의미하는 경우 MgSO4 및 CaCl2를 포함할 수 있다. 다른 예로, 제2 인공 뇌척수액이 키트에 포함되는 것인 경우 MgSO4 및 CaCl2를 포함하지 않을 수 있다.
일 구현예에서, 제2 인공 뇌척수액은 115 내지 142 mM의 NaCl, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 19 내지 24 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트, 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트, 4.5 내지 5.5 mM의 MgSO4 및 0.9 내지 1.1 mM의 CaCl2를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 제2 인공 뇌척수액에서 NaHCO3의 농도는 19 내지 24 mM, 19.5 내지 23.7 mM, 20 내지 23.5 mM, 20.5 내지 23 mM, 21 내지 22.5 mM, 21.5 내지 22 mM, 21.6 내지 21.8 mM, 바람직하게는 21.7 mM일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 제2 인공 뇌척수액에서 MgSO4의 농도는 4 내지 6 mM, 4.5 내지 5.5 mM, 바람직하게는 5 mM일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 제2 인공 뇌척수액에서 CaCl2의 농도는 0.9 내지 1.1 mM, 0.95 내지 1.05 mM, 바람직하게는 1 mM일 수 있다.
일 구현예에서, 제2 인공 뇌척수액은 30 내지 35℃, 31 내지 35℃, 32 내지 35℃ 또는 33 내지 35℃의 온도로 사용된다.
일 구현예에서, 제2 인공 뇌척수액의 pH는 7.35 내지 7.45일 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 제2 인공 뇌척수액은 하기 표 2에 기재된 바와 같은 조성을 가질 수 있다.
제2 인공 뇌척수액 (35℃)
화합물 몰 질량(g/mol) 최종 농도(mM) 리터당 첨가량(g)
NaCl 58.44 128.5 7.510
KCl 74.56 2.5 0.186
NaH2PO4 119.98 1 0.120
NaHCO3 84.01 21.7 1.823
글루코스 180.16 11 1.982
Na 피루베이트 110.04 2 0.220
Na L-아스코르베이트 198.11 1 0.198
사용 직전 또는 사용 당일에 추가 (35℃)
스톡 용액 스톡 용액 농도(M) 최종 농도(mM) 리터당 첨가량(ml)
MgSO4 용액 1 5 5
CaCl2 용액 1 1 1
이론에 얽매이지는 않지만, 상기 제2 인공 뇌척수액에서, MgSO4 및 CaCl2는 시냅스 가소성(또는 기능) 측정에 기여하는 주요 구성 성분으로 생각된다. MgSO4 및 CaCl2는 단계 (d)에서 사용하기 사용하기 직전 또는 사용 당일에 추가하는 것이 바람직하다. 일 예로, 제2 인공 뇌척수액은 NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, 글루코스, Na 피루베이트 및 Na L-아스코르베이트를 포함하는 용액으로 제조된 후 단계 (d)의 배양 직전 또는 배양 당일에 MgSO4 및 CaCl2를 상기 먼저 제조된 용액에 첨가할 수 있다.
(3) 제3 인공 뇌척수액 - 전기생리학적 기록(recording)용
본 발명의 일 태양에 따른 스크리닝 방법에서 사용되는 제3 인공 뇌척수액은 다른 단계(예를 들어, 뇌 절편을 준비하는 단계 또는 회복을 위한 배양 단계)에서 사용되는 인공 뇌척수액과 상이한 조성을 가지며, 사용시 온도 또한 다른 단계에서와 다르게 실온 또는 그에 가까운 온도로 함으로써 (수동) 패치 클램프 기법의 성공률을 현저하게 상승시킬 수 있는 효과가 있다.
여기서, 제3 인공 뇌척수액은 NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, 글루코스, Na 피루베이트, Na L-아스코르베이트, MgSO4 및 CaCl2를 포함할 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐서, 제3 인공 뇌척수액은 문맥에 따라 MgSO4 및 CaCl2를 포함하거나 포함하지 않는 것으로 이해될 수 있다. 예를 들어, 제3 인공 뇌척수액이 스크리닝 방법에서 사용되는 기록용 인공 뇌척수액을 의미하는 경우 MgSO4 및 CaCl2를 포함할 수 있다. 다른 예로, 제3 인공 뇌척수액이 키트에 포함되는 것인 경우 MgSO4 및 CaCl2를 포함하지 않을 수 있다.
일 구현예에서, 제3 인공 뇌척수액은 111 내지 137 mM의 NaCl, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 23 내지 29 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트, 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트, 1.17 내지 1.43 mM의 MgSO4 및 2.25 내지 2.75 mM의 CaCl2를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 제3 인공 뇌척수액에서 NaHCO3의 농도는 23 내지 29 mM, 24 내지 28 mM, 25 내지 27 mM, 25.5 내지 26.5 mM, 25.7 내지 26.5 mM, 26 내지 26.5 mM, 바람직하게는 26.2 mM일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 제3 인공 뇌척수액에서 MgSO4의 농도는 1 내지 1.6 mM, 1.1 내지 1.5 mM, 1.17 내지 1.43 mM, 1.2 내지 1.4 mM, 1.25 내지 1.35 mM, 바람직하게는 1.3 mM일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 제3 인공 뇌척수액에서 CaCl2의 농도는 2.25 내지 2.75 mM, 2.3 내지 2.7 mM, 2.35 내지 2.65 mM, 2.4 내지 2.6 mM, 2.45 내지 2.55 mM, 바람직하게는 2.5 mM일 수 있다.
일 구현예에서, 제3 인공 뇌척수액이 상기 단계 (d)의 배양 이후 또는 단계 (e)의 EPSC 기록 전에 추가 배양 단계에서 사용될 때 제3 인공 뇌척수액의 온도는 실온인 것이 바람직하다. 예컨대, 실온은 15 내지 30℃, 16 내지 29℃, 17 내지 28℃, 18 내지 27℃, 19 내지 26℃, 20 내지 25℃, 21 내지 25℃, 22 내지 25℃, 바람직하게는 23 내지 25℃일 수 있다.
다른 구현예에서, 제3 인공 뇌척수액이 상기 단계 (e)의 기록 단계에서 사용되는 경우 이의 온도는 27 내지 29℃인 것이 바람직하다.
일 구현예에서, 제3 인공 뇌척수액의 pH는 7.35 내지 7.45일 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 제3 인공 뇌척수액은 하기 표 3에 기재된 바와 같은 조성을 가질 수 있다.
제3 인공 뇌척수액 (22 또는 27-29℃)
화합물 몰 질량(g/mol) 최종 농도(mM) 리터당 첨가량(g)
NaCl 58.44 124 7.247
KCl 74.56 2.5 0.186
NaH2PO4 119.98 1 0.120
NaHCO3 84.01 26.2 2.201
글루코스 180.16 11 1.982
Na 피루베이트 110.04 2 0.220
Na L-아스코르베이트 198.11 1 0.198
사용 직전 또는 사용 당일에 추가
스톡 용액 스톡 용액 농도(M) 최종 농도(mM) 리터당 첨가량(ml)
MgSO4 용액 1 1.3 1.3
CaCl2 용액 1 2.5 2.5
상술한 제1, 제2 및/또는 제3 인공 뇌척수액의 조성(농도) 및/또는 온도는 신경 가소성 측정을 위한 시료 준비 및 스크리닝 플랫폼으로서의 성능에 중요할 수 있다. 이론에 얽매이는 것은 아니지만, 상기 농도와 온도는 인공 뇌척수액의 pH에 직접적인 영향을 미치며, pH는 패치 클램프를 사용한 전기생리학적 측정 방법의 성공 확률과 관련이 깊은 것으로 생각된다.
도 2의 좌측 현미경 이미지는 본 발명에 따른 조성 농도 및 온도 조건을 만족하는 제3 인공 뇌척수액 내의 뇌 조직 상태를 보여준다. 세포막의 형태가 명확하고 다양한 모양과 크기가 잘 보존된 것을 확인할 수 있다. 반면, 도 2의 우측 현미경 이미지는 인공 뇌척수액의 조성이나 온도가 본 발명에 따른 인공 뇌척수액의 조성이나 온도 조건과 상이한 경우의 뇌 조직 상태를 보여준다. 예컨대, 본 발명의 스크리닝 방법은 뇌 절편을 30 내지 35℃의 제2 인공 뇌척수액에서 배양하는 단계를 포함하는데, 여기서 상기 온도 범위를 초과하거나 온도 범위에 미달하는 경우, 또는 제2 인공 뇌척수액의 하나 이상의 조성이 본 명세서에서 개시하는 농도 조건을 불만족하여 pH가 7.35 미만 또는 7.45 초과가 되는 경우 세포막 손상이 초래될 수 있다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법에서 단계 (e)의 EPSC 기록 단계에서 사용되는 제3 인공 뇌척수액의 하나 이상의 조성이 본 명세서에서 개시하는 농도 조건을 불만족하여 pH가 7.35 미만 또는 7.45 초과가 되는 경우에도 세포막 손상이 관찰된다. 도 2의 우측 현미경 이미지는 NaHCO3의 최종 농도가 23 mM 미만이거나 29 mM을 초과하는 제3 인공 뇌척수액 내의 뇌 조직 상태로서, 세포막이 손상되어 각각의 세포막 경계가 선명하지 않은 것을 확인할 수 있으며, 크고 동그란 모양으로 팽창되어 핵이 관찰된다. 이와 같은 뇌 조직(또는 세포)에서는 패치 클램프 실험 자체를 수행할 수 없다.
2. 스크리닝 방법에 사용되는 동물
본 발명의 스크리닝 방법은 대뇌피질(cerebral cortex) 영역을 포함하는 뇌 절편을 이용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 스크리닝 방법에서 흥분성 시냅스후 전류(excitatory postsynaptic current, EPSC)는 대뇌피질 영역에서 기록되며, 바람직하게 EPSC는 체성감각피질(somatosensory cortex), 시상피질(thalamocortical) 또는 배럴피질(barrel cortex)을 포함하는 영역에서 기록될 수 있다. 더욱 바람직하게, EPSC는 배럴피질 또는 배럴피질의 제4층을 포함하는 영역에서 기록될 수 있다.
따라서 본 발명의 스크리닝 방법에서, 비인간 동물의 뇌는 체성감각피질, 그 중에서도 시상피질 또는 배럴피질을 포함하는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 뇌에 배럴피질을 갖는 비인간 동물은 설치목(rodentia), 유대목(marsupialia) 또는 토류목(lagomorpha) 속할 수 있다(문헌[Woolsey et al. The Journal of comparative neurology vol. 164,1 (1975): 79-94.] 참조). 상기 설치목, 유대목 또는 토류목에 속하는 동물의 비제한적인 예시로서 다음 동물이 포함된다: 마우스(mouse), 래트(rat), 햄스터(hamster), 게르빌루스쥐(gerbil), 사향쥐(muskrat), 기니피그(guinea pig), 친칠라(chinchilla), 날다람쥐(flying squirrel), 얼룩다람쥐(chipmunk), 들다람쥐(ground squirrel), 프레리도그(prairie dog), 회색다람쥐(grey squirrel), 호저(porcupine), 주머니쥐(opossum) 또는 토끼(rabbit).
3. 후보 물질의 투여/처리 방법
(1) 국소 투여(직접 투여)
본 발명의 일 측면에 따르면, 뇌에서 측정된 흥분성 시냅스후 전류(EPSC)의 분석 결과에 기초한 시냅스 가소성의 변화 여부에 따라 후보 물질의 효능 또는 치료 활성을 평가하므로, 스크리닝의 대상이 되는 후보 물질은 신경 가소성이 변화되는 뇌의 특정 영역에 직접 투여될 수 있다.
일 구현예에 따르면, 스크리닝 방법의 (a) 비인간 동물에 후보 물질을 투여하는 단계에서 후보 물질의 투여는 뇌내 투여(intracerebral injection)일 수 있다. 뇌내 투여 또는 뇌내 주사는 외상성 조직 손상을 유발할 가능성이 있으므로 액량을 적절하게 조절하는 것이 바람직하며, 이러한 단점에도 불구하고 최소한의 전신 노출 및 독성으로 유효 성분을 표적 부위에 직접 확산시킬 목적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 후보 물질은 뇌내 투여에 의해 대뇌피질에 직접 전달된다. 구체적으로, 후보 물질은 대뇌피질 중 체성감각피질(somatosensory cortex), 시상피질(thalamocortical) 또는 배럴피질(barrel cortex) 영역에 직접 투여되거나 상기 영역의 인접 부위 또는 상기 영역과 신경학적으로 연결된(예컨대, 뉴런이 연결된) 다른 부위에 직접 투여될 수 있다. 도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 배럴피질의 제4층에 후보 물질이 전달되도록 Os 펌프가 이식된 마우스 및 이의 이식 부위를 도시한다.
다른 구현예에서, 상기 투여는 뇌실질내 투여(intraparenchymal injection), 뇌실내 투여(intracerebroventricular injection), 척추강내 투여(intrathecal injection), 선조체내 투여(intrastriatal injection), 수조내 투여(intracisternal injection), 두개내 투여(intracranial injection) 또는 경추하 투여(subpial injection) 등을 포함할 수 있다.
(2) 전신 투여(systemic administration)
본 발명의 다른 측면에 따르면, 스크리닝의 대상이 되는 후보 물질은 전신 투여될 수 있다. 전신 투여 방법은 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 일 구현예에서, 상기 전신 투여는 경구 투여(oral administration), 복강내 투여(intraperitoneal injection) 또는 정맥 투여(intravenous injection)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
경구 투여는 동물의 마취 없이 수행될 수 있으며, 표준 위관 주사 바늘(또는 영양 주사 바늘)을 동물의 입에 삽입하고 식도 아래로 통과시켜 후보 물질을 하부 식도 또는 위에 직접 투여하는 방식으로 수행될 수 있다. 여기서, 경구 투여를 위한 최대 약물 용량은 체중에 따라 결정된다.
또한, 후보 물질의 종류에 따라 복강내 또는 정맥내 투여될 수 있다. 복강내 또는 정맥내 투여 방법은 기존에 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다.
(3) 조직 절편에 직접 처리
또 다른 구현예에서, 스크리닝의 대상이 되는 후보 물질은 뇌를 분리하고 이로부터 수득한 조직 절편에 직접 처리될 수 있다. 예를 들어, 후보 물질은 전기생리학적 방법으로 흥분성 시냅스후 전류(EPSC) 등을 기록하기 전 또는 이를 기록하는 도중에 처리될 수 있다.
4. 뇌 절편(brain slice)의 준비
본 발명의 스크리닝 방법은 뇌 절편에서 전기생리학적 파라미터를 측정하는 것을 특징으로 하며, 높은 신뢰도와 해상도로 후보 물질을 스크리닝하기 위해서는 뇌 절편을 준비하는 조건이 중요하다.
일 구현예에서, 스크리닝 방법은 (c) 분리된 뇌로부터 2 내지 5℃의 제1 인공 뇌척수액 내에서 대뇌피질(cerebral cortex) 영역을 포함하는 뇌 절편을 준비하는 단계를 포함한다.
다른 구현예에서, 상기 단계 (c)는 단계 (b)에서 분리된 뇌를 2 내지 5℃의 제1 인공 뇌척수액 내에서 정중선을 기준으로 50° 내지 55°의 각도 및 300 내지 500 μm의 두께로 절편화하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 뇌 절편은 시상피질(thalamocortical) 절편일 수 있으며, 상기 시상피질 절편은 배럴피질의 제4층을 포함할 수 있다.
상기 절편화는 관상사면(paracoronal) 절편으로 준비하기 위해 뇌의 정중선을 기준으로 50° 내지 55°의 각도로 절편화하는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, EPSC는 대뇌피질의 제4층에 존재하는 배럴피질에서 기록될 수 있는데, 상기 배럴피질을 포함하는 뇌 절편을 얻기 위해서는 관상사면 절편을 준비하는 것이 바람직하다. 이때, 시상(thalamus)이 뚜렷하게 관찰되는(예컨대, 시상이 노랗게 보이는) 첫 절편을 포함하여 300 내지 500 μm, 350 내지 450 μm, 바람직하게는 400 μm의 두께로 3 내지 5장의 절편을 수득할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 단계 (c)에서 수득한 뇌 절편은 30 내지 35℃의 제2 인공 뇌척수액에서 배양(incubation)함으로써 손상된 세포의 회복을 유도할 수 있다. 여기서, 제2 인공 뇌척수액에서의 배양은 10분 내지 1시간, 20분 내지 50분, 25분 내지 40분, 30분 내지 35분, 바람직하게는 30분 동안 수행될 수 있다. 또한, 상기 제2 인공 뇌척수액에서의 배양은 30 내지 37℃, 30 내지 36℃, 30 내지 35℃, 30 내지 34℃, 30 내지 33℃, 31 내지 37℃, 31 내지 36℃, 31 내지 35℃, 31 내지 34℃, 31 내지 33℃, 32 내지 37℃, 32 내지 36℃, 32 내지 35℃, 32 내지 34℃, 32 내지 33℃, 33 내지 37℃, 33 내지 36℃, 33 내지 35℃, 33 내지 34℃, 34 내지 37℃, 34 내지 36℃, 34 내지 35℃, 바람직하게는 30 내지 35℃에서 수행될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 제2 인공 뇌척수액에서 배양된 뇌 절편은 배양 이후 또는 전기생리학 실험을 위해 기록 챔버(recording chamber)에 넣기 전에 실온에서 1 내지 4시간 동안 제3 인공 뇌척수액에서 추가로 배양(incubation)될 수 있다. 여기서, 상기 제3 인공 뇌척수액은 95% O2/5% CO2로 포화된 것을 포함한다. 또한, 상기 실온은 15 내지 30℃, 16 내지 29℃, 17 내지 28℃, 18 내지 27℃, 19 내지 26℃, 20 내지 25℃, 21 내지 25℃, 22 내지 25℃, 바람직하게는 23 내지 25℃일 수 있다. 상기 배양은 1 내지 4시간 동안 수행될 수 있으며, 1 내지 3시간, 1 내지 2시간, 바람직하게는 1시간 동안 수행될 수 있다.
상기 "제1 인공 뇌척수액", "제2 인공 뇌척수액" 및 "제3 인공 뇌척수액"에 대한 설명은 항목 '1. 스크리닝 방법의 각 단계에서 사용되는 인공 뇌척수액'에 기재된 사항 전체를 참조한다.
5. 패치 클램프(patch clamp)를 사용한 EPSC의 측정
모든 전기생리학적 실험은 27 내지 29℃에서 수행되는 것이 바람직하다. 전극(electrode)은 저항 값이 3.5 내지 4.2 mΩ인 것이 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 스크리닝 방법의 단계 (e)의 패치 클램프는 수동 패치 클램프(manual patch clamp)일 수 있다. 수동 패치 클램프는 자동화된 패치 클램프(automated-patch clamp)와 비교하여 데이터의 신뢰도와 재현성이 현저하게 높다는 장점이 있다. 따라서 수동 패치 클램프는 작용 기전이 동일 또는 유사하거나 효과가 유사하여 자동화된 패치 클램프에 의해서는 효능 차이를 감지하기 어려운 경우에 특히 유용하다.
다른 구현예에서, 스크리닝 방법의 단계 (e)에서 EPSC의 기록은 전세포 기록(whole-cell recording)으로 수행되는 것일 수 있다. 전세포 기록은 세포막의 넓은 영역에서 동시에 여러 채널을 통한 전류의 기록을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 스크리닝 방법의 단계 (e)의 대뇌피질 영역은 배럴피질(barrel cortex)의 제4층(layer 4)을 포함할 수 있다. 따라서 상기 단계 (e)의 EPSC 기록은 대뇌피질 중 특히 배럴피질의 제4층에서 수행될 수 있다. 여기서, 상기 EPSC 기록은 배럴피질 제4층에 존재하는 성상세포(stellate cell) 또는 뉴런을 패치하여 수행될 수 있다.
배럴피질은 체성감각피질의 영역으로서 배럴필드(barrel field)를 포함한다. 래트에서, 배럴피질 중 제4층의 가소성은 생후 4일 후 급속하게 감소하는 반면, 제2/3층의 가소성은 성년기에도 매우 유연하게 남아있다고 알려져 있다. 따라서 배럴피질의 제4층의 가소성을 변경시킬 수 있는 물질은 다양한 신경장애 또는 신경퇴행성 장애의 치료제나 인지기능 강화제 등의 유력한 후보가 될 수 있다.
일부 구현예에서, 스크리닝 방법의 단계 (e)의 기록은 5 내지 10 ml/min의 유속으로 순환하는 제3 인공 뇌척수액 내에서 수행될 수 있다.
상기 "제3 인공 뇌척수액"에 대한 설명은 항목 '(3) 제3 인공 뇌척수액 - 전기생리학적 기록(recording)용'에 기재된 사항 전체를 참조한다.
다른 구현예에서, 상기 단계 (e)의 EPSC는 막 전압을 -70 mV로 고정하여 기록될 수 있다. 이와 같이 기록된 EPSC는 포텐시 및 GABA/AMPA 비 분석에 사용된다.
6. 데이터 분석 및 후보 물질의 선별 기준
(1) 포텐시(potency)
포텐시는 특정 구간에서의 평균 트레이스의 네거티브 전류 진폭(pA)으로 표현되며, 후보 물질의 시냅스 가소성 조절 능력을 확인할 수 있는 척도로 활용될 수 있다. 일 실시예에서, 포텐시는 0 내지 100 ms 사이의 구간을 기준선으로 설정하고, 110 내지 200 ms 사이의 구간에서 나타나는 온(on) 전류를 선택하여 도출된 평균 트레이스의 네거티브 전류 진폭(pA)을 계산하여 분석되었다.
(2) GABA/AMPA 비
억제성 신경전달물질인 GABA(γ-aminobutyric acid)와 흥분성 신경전달물질인 AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid)의 비(ratio)는 후보 물질의 투여에도 불구하고 일정하게 유지되는 것이 중요하다. GABA/AMPA 비가 변화(증가 또는 감소)되면 현기증, 피로, 흥분, 간질 발작 등의 부작용이 발생할 가능성이 높아지기 때문이다.
일 구현예에서, 상기 GABA/AMPA 비는 기록된 EPSC에 기초하여 도출된다. 일 예로, GABA/AMPA 비는 (ⅰ) -70 mV의 EPSC 기록에서 0 내지 100 ms 사이의 구간을 기준선으로 하였을 때 110 내지 200 ms 사이 구간에서의 평균 트레이스의 네거티브(negative) 전류 진폭(pA) 대비 (ⅱ) 0 mV의 EPSC 기록에서 0 내지 110 ms 사이의 구간을 기준선으로 하였을 때 110 내지 300 ms 사이 구간에서의 평균 트레이스의 포지티브(positive) 전류 진폭(pA) 값으로 도출된다.
(3) 후보 물질의 선별 기준
본 발명의 스크리닝 방법을 통해 포텐시를 통계적으로 유의하게 상승시키고 GABA/AMPA 비를 통계적으로 유의하게 변화시키지 않는(즉, 여기/억제의 균형이 유지되는) 후보 물질이 뇌 피질 시냅스 가소성의 활성을 변화시키거나 유효한 효능(신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애에 대한 예방 또는 치료 활성, 인지기능 증강 활성 등)이 있는 것으로 판단될 수 있다. 따라서 포텐시를 통계적으로 유의하게 상승시키고 GABA/AMPA 비를 통계적으로 유의하게 변화시키지 않는 물질을 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물로 선별할 수 있다.
일 구현예에서, 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 포텐시를 통계적으로 유의하게 상승시키는 후보 물질을 효능이 있는 것으로 판단할 수 있다. 다른 구현예에서, 후보 물질을 투여하지 않은 대조군 또는 다른 후보 물질을 투여한 군과 비교하여 포텐시를 약 1.2배 이상, 1.5배 이상, 2배 이상, 2.5배 이상, 3배 이상, 4배 이상 또는 5배 이상 상승시키는 일 후보 물질을 효능이 우수한 것으로 판단할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 GABA/AMPA 비를 통계적으로 유의하게 변화(증가 또는 감소)시키지 않는 후보 물질은 안전성이 있거나 부작용 등이 없는 것으로 판단할 수 있다.
7. 스크리닝된 물질의 산업적 응용
본 발명의 스크리닝 방법을 이용하여 선별될 수 있는 물질은 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물을 포함한다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법을 이용하여 선별될 수 있는 물질은 인지기능 개선을 위한 후보 약물을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 신경학적 장애는 중추 또는 말초 신경계 기능 장애를 구성 요소로 갖는 질환이다. 신경학적 장애는 발달 이상, 질병, 유전적 결함, 부상 또는 독소로 인해 신경계의 구조 또는 기능에 교란을 일으킬 수 있다. 이러한 장애는 중추 신경계(예를 들어, 뇌, 뇌간 및 소뇌), 말초 신경계(예를 들어, 뇌신경, 척수 신경, 및 교감 및 부교감 신경계) 및/또는 자율 신경계(예를 들어, 불수의적 작용을 조절하며 교감 신경계와 부교감 신경계로 나뉘는 신경계의 일부)에 영향을 미칠 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 신경퇴행성 장애는 만성 신경퇴행성 장애 또는 급성 신경퇴행성 장애를 포함한다. 대부분의 신경퇴행성 장애는 뇌에서의 뉴런 퇴화로 인해 발생한다.
만성 신경퇴행성 장애의 비제한적인 예시로서 다음 질환이 포함된다: 가족성 및 산발성 근위축성 측삭 경화증(각각 FALS 및 ALS), 가족성 및 산발성 파킨슨병, 헌팅턴병, 가족성 및 산발성 알츠하이머병, 다발성 경화증, 근이영양증, 올리브교소뇌 위축증(olivopontocerebellar atrophy), 다계통 위축증, 윌슨병(Wilson's disease), 진행성 핵상 마비, 미만성 루이소체병, 코르티코덴타토니그랄(corticodentatonigral) 변성, 진행성 가족성 근간대성 간질, 선조흑질 변성, 염전근이긴장증, 가족성 진전, 다운 증후군, 투렛 증후군(Tourette syndrome), 할러보덴-스파츠병(Hallervorden-Spatz disease), 당뇨병성 말초 신경병증, 권투선수 치매, AIDS 치매, 연령 관련 치매, 연령 관련 기억 손상, 및 아밀로이드증 관련 신경퇴행성 질환, 예를 들어 전염성 해면상뇌증과 관련된 프리온 단백질(PrP)에 의해 유발되는 질환(크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease), 게르스트만-슈트로이슬러-샤잉커 증후군(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome), 면양진전병(scrapie), 및 쿠루(kuru)), 및 과도한 시스타틴 C 축적으로 인한 질환(예를 들어, 유전성 시스타틴 C 혈관병증).
급성 신경퇴행성 장애의 비제한적인 예시로서 다음 질환이 포함된다: 외상성 뇌 손상(예를 들어, 수술 관련 뇌 손상), 뇌부종, 말초 신경 손상, 척수 손상, 리이병(Leigh's disease), 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), 리소좀 축적 장애, 예컨대 리포푸신증(lipofuscinoses), 알퍼병(alpers disease), 하지불안증후군, CNS 변성으로 인한 현기증; 예를 들어, 청반 및 소뇌에서의 뉴런의 변성, 약물 유발 운동 장애를 비롯한 만성 알코올 또는 약물 남용으로 발생하는 병리; 인지 및 운동 장애로 이어지는 소뇌 뉴런 및 피질 뉴런의 변성을 비롯한 노화로 인해 발생하는 병리; 및 운동 장애로 이어지는 기저핵 뉴런의 변성을 비롯한 만성 암페타민 남용으로 발생하는 병리; 뇌졸중, 국소 허혈, 혈관 부전, 저산소-허혈성 뇌병증, 고혈당증, 저혈당증 또는 직접적인 외상과 같은 국소 외상으로 인한 병리학적 변화; 치료 약물 및 치료법의 부정적인 부작용으로 발생하는 병리(예를 들어, 글루타메이트 수용체의 NMDA(N-methyl-D-aspartate) 부류의 길항제의 항경련제 용량에 반응한 대상 및 내후각 피질 뉴런의 변성) 및 베르니케-코르사코프(wernicke-korsakoff) 관련 치매.
급성 또는 만성 퇴행성 장애에 더하여, 후보 물질은 HDAC(예를 들어, HDAC4)에 의해 부분적으로 조절되는 한 다른 유형의 뇌 질환을 치료하는 데 유용한 물질일 수 있다. 이러한 질환의 예에는 다음이 포함된다: 인지, 치매, 사회적 행동, 불안, 또는 기타 인격 장애와 관련된 신경정신병적 장애, 예를 들어 정신분열증, 섬망, 주의력 결핍 장애(ADD), 양극성 장애, 강박 장애, 또는 섭식 장애; 공포 및 불안 장애, 예를 들어, 공황 장애, 다양한 공포증, 외상후 스트레스 장애(PTSD), 심인성 발기 부전, 또는 불면증; 다양한 형태의 중독; 및 기분 장애, 예컨대 우울증.
따라서 상기 후보 물질은 HDAC(histone deacetylase) 억제제에 속하는 물질일 수 있다. 일부 구현예에서, 후보 물질은 클래스 IIa HDAC의 활성을 조절하는 데 유용한 것일 수 있다.
"HDAC(histone deacetylase)"는 히스톤의 ε-N-아세틸 라이신 잔기에서 아세틸기를 제거하는 효소의 부류 중 어느 하나를 의미한다. HDAC은 현재까지 총 18개의 아형이 동정되었으며, 단백질 구조와 기능의 유사성을 기준으로 18개의 아형은 다시 네 개의 부류(class Ⅰ 내지 Ⅳ)로 분류된다. "HDAC 억제제"는 HDAC과 상호작용할 수 있고 이의 효소 활성을 억제할 수 있는 물질을 의미한다. HDAC 억제제는 T 세포 림프종을 적응증으로 하여 최초로 승인을 받은 이후 다른 고형암을 비롯하여 헌팅턴병이나 알츠하이머병과 같은 신경퇴행성 질환의 치료제, 항간질제, 순환기분장애 치료제, 뇌전증 치료제, 본태성고혈압 치료제, 폐섬유증이나 다낭성 심장질환 등의 치료를 위한 항섬유화제 등 다양한 질병에 대한 치료제로서 개발되고 있다.
상기 후보 물질이 HDAC 억제제에 속하는 경우, 후보 물질은 HDAC 의해 매개된 병태, 구체적으로 HDAC 및/또는 HDAC 작용이 병태의 개시, 진행, 발현 등에 중요하거나 필요한 병태의 예방 또는 치료용 물질일 수 있다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의하면 HDAC 억제 활성을 나타내는 후보 물질을 선별할 수 있고, 이렇게 선별된 HDAC 억제제는 뇌를 포함하여 다양한 유형의 세포 또는 조직에서 HDAC 활성을 억제할 수 있다. 따라서 상기 HDAC에 의해 매개된 병태는 다음의 질환을 비제한적으로 포함할 수 있다: 암(예컨대, 문헌[Vigushin et al., 2001 , Clin. Cancer Res., Vol. 7, No. 4, pp. 971-976] 참조); 건선(예컨대, 문헌[lavarone et al., 1999, Mol. Cell Biol. Vol. 19, No. 1, pp. 916-922] 참조); 섬유 증식성 장애(예컨대, 간 섬유증 등; 문헌[Niki et al., 1999, Hepatology, Vol. 29, No. 3, pp. 858-867; Corneil et al., 1998, 일본 특허출원공보 JP 10114681 A2] 참조); 평활근 증식성 장애(예컨대, 아테롬성 동맥경화증, 재협착증 등; 문헌[Kimura et al., 1994, Biol. Pharm. Bull., Vol. 17, No. 3, pp. 399-402] 참조); 신경퇴행성 질환(예컨대, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 근위축성 측색 경화증, 척수소뇌변성증 등; 문헌[Kuusisto et al., 2001, Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 280, No. 1, pp. 223-228; Stefan, J. et al., 2002, 국제특허(PCT) 공개공보 WO 02/090534] 참조); 염증성 질환(예컨대, 골관절염, 류마티스 관절염 등; 문헌[Dangond et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 242, No. 3, pp. 648-652; Takahashi, I. et al, 1996, J. Antibiot. (Tokyo). Vol. 49, No. 5, pp. 453-457] 참조); 혈관 신생 관련 질환(예컨대, 암, 류마티스 관절염, 건선, 당뇨병성 망막증 등; 문헌[Kim et al., 2001, Nature Medicine. Vol. 7, No. 4, pp. 437-443] 참조); 조혈성 장애(예컨대, 빈혈, 겸상적혈구빈혈, 지중해빈혈 등; 문헌[McCaffrey et al., 1997, Blood, Vol. 90, No. 5, pp. 2075-2083] 참조); 진균 감염증(예컨대, 문헌[Bernstein et al., 2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 97, No. 25, pp. 13708-13713; Tsuji et al., 1976, J..Antibiot. (Tokyo), Vol. 29, No. 1, pp. 1-6] 참조); 기생충 감염증(예컨대, 말라리아, 트리파노소마증, 연충증, 원충 감염 등; 문헌[Andrews et al., 2000, Int. J. Parasitol. Vol. 30, No. 6, pp. 761-768] 참조); 박테리아 감염증(예컨대, 문헌[Onishi et al., 1996, Science, Vol. 274, pp. 939-940] 참조); 바이러스 감염증(예컨대, 문헌[Chang et al., 2000, Nucleic Acids Res., Vol. 28, No. 20, pp. 3918-3925] 참조); 면역 조절에 의해 치료 가능한 병태(예컨대, 다발성 경화증, 자가면역성 당뇨병, 루푸스, 아토피 피부염, 알레르기, 천식, 알레르기 비염, 염증성 장 질환, 이식 접목의 개선에 대한 것 등; 문헌[Dangond et al., 1998, Biochem. Biophvs. Res. Commun. Vol. 242, No. 3, pp. 648-652; Takahashi et al., 1996, J. Antibiot. (Tokyo), Vol. 49, No. 5, pp. 453-457] 참조).
즉, 본 발명의 스크리닝 방법이 유효하게 적용되고 선별될 수 있는 후보 물질의 의약적 용도는 '뇌' 질환 치료용으로 제한되지 않는다. 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 선별될 수 있는 후보 물질은 신경학적 장애의 예방 또는 치료용일 수 있으며, 상기 신경학적 장애의 예에는 다음이 포함된다: 변성 또는 손상으로 인한 말초 신경계 질환, 예를 들어 운동실조 또는 외상; 및 눈의 급성 또는 만성 퇴행성 질환, 예를 들어 녹내장.
또한, 후보 물질은 기억 장애(기억 상실/손상 포함) 또는 인지기능 장애(인지기능 감소 등)에 대한 예방 또는 치료용 물질일 수 있다. 이러한 장애의 예에는 다음이 포함된다: 기억 상실/손상, 창의성 행위, 문제 해결, 및 직관과 같은 인지기능과 관련된 질환.
상기 기억에는 단기 기억(작업 또는 최근 기억이라고도 지칭됨)과 장기 기억이 포함된다. 단기 기억은 최근의 사건을 포함하는 한편, 장기기억은 더 먼 과거의 사건을 회상하는 것과 관련이 있다. 기억을 회상하는 능력을 평가하는 방법은 당업자에게 알려져 있고, 일상적인 인지 시험을 포함할 수 있다.
연령 관련 기억 상실은 대상이 젊었을 때에 비해 나이가 많을 때의 객관적인 기억 상실을 특징으로 하지만, 인지 시험 성적은 대상의 연령에 대해 정상 범위 내에 있다. 연령 관련 기억 상실 대상은 DSM-IV에 설명된 바와 같이 치매에 대한 표준화된 진단 시험에서 정상 범위 내의 점수를 얻는다. 더욱이, DSM-IV는 연령 관련 인지 저하라고 명명되는 질환에 대한 별도의 진단 기준을 제공한다. 연령 관련 기억 상실에는 뇌 무게 감소, 뇌회 위축(gyral atrophy), 뇌실 확장, 및 다양한 뇌 영역 내에서의 뉴런의 선택적 상실이 포함될 수 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 더 진행성인 형태의 기억 상실 또한 연령 관련 기억 장애의 정의에 포함된다. 따라서, 정상 연령 초과의 기억 상실 및 인지 장애를 갖고 있지만 프랭크(frank) 치매에 대한 진단 역치 미만의 점수를 받은 사람은 경도 신경인지 장애, 경도 인지 장애, 노년 건망증, 양성 노쇠 건망증, 초기 치매, 잠정 치매 등을 갖는 사람이라고 할 수 있다. 이러한 대상은 노년에 프랭크 치매에 걸릴 가능성이 약간 더 높을 수 있다(또한 미국 특허 출원 2006/008517 참조).
기억 장애 유형의 예에는 알츠하이머병, 건망증, 기억상실, 선행성 기억상실, 블랙아웃(blackout; 예컨대, 알코올 관련 기억상실), 브롬증, 아동기 기억상실, 거짓 기억 증후군, 둔주 상태(fugue state), 과잉기억, 코르사코프 증후군, 부분 기억상실, 기억불신 증후군, 기억 상실, 외상후 기억상실, 안면기억장애(prosopamnesia), 심인성 기억상실, 억압 기억, 역행성 기억상실, 리보의 법칙(Ribot' s Law), 선택적 기억 상실, 근원 기억상실, 근원-모니터링 오류, 기억의 7가지 원죄(seven sins of memory), 설단(tip of the tongue), 일과성 간질성 기억상실, 일과성 완전 기억상실, 및 반몽혼 수면(twilight sleep)이 포함된다.
인지기능 장애 또는 손상은 알츠하이머병, 헌팅턴병, 발작 유발 기억 상실, 정신분열증, 루빈스타인 테이비 증후군, 레트 증후군, 취약 X 증후군, 루이소체 치매, 혈관성 치매, 양극성 장애 및 자폐 스펙트럼 장애(ASD)와 관련된 사회, 인지 및 학습 장애, 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 난독증, 학습 장애, 외상성 두부 손상, 뇌졸중 유발 인지 및 운동 장애, 외상성 뇌 손상, 신경변성 및 신경 손실 매개된 인지 장애, 및 주의력 결핍 장애와 관련되지만 이에 제한되지 않는다. 또한 인지기능 장애 또는 손상은 불안 장애, 조건화된 공포 반응, 공황 장애, 강박 장애, 외상후 스트레스 장애, 공포증, 사회 불안 장애, 물질 의존 회복 또는 연령 관련 기억 장애(AAMI), 및 연령 관련 인지 저하(ARCD)와 관련되지만 이에 제한되지 않는다.
다른 구현예에서, 본 발명의 다른 태양에 따른 스크리닝 방법을 이용하여 선별될 수 있는 후보 물질은 인지기능 증강 효과가 있는 물질을 포함한다. 인지기능 증강은 상술한 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 증상 중 하나로서 나타나는 인지능력 감퇴 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 것을 포함하며, 신경학적 장애나 신경퇴행성 장애를 갖지 않는 정상인의 인지능력이 더욱 개선되거나, 상승되거나 또는 이롭게 변경되는 것 또한 포함한다.
Ⅲ. 키트(kit)
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 다음의 인공 뇌척수액 및 지시서를 포함하는 본 발명에 따른 스크리닝 방법에 사용하기 위한 키트가 제공된다:
(ⅰ) 175 내지 215 mM의 수크로스, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 29 내지 36 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트 및 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트를 포함하는 제1 인공 뇌척수액;
(ⅱ) 115 내지 142 mM의 NaCl, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 19 내지 24 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트 및 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트를 포함하는 제2 인공 뇌척수액;
(ⅲ) 111 내지 137 mM의 NaCl, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 23 내지 29 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트 및 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트를 포함하는 제3 인공 뇌척수액; 및
(ⅳ) 상기 제1 인공 뇌척수액은 사용 전 4.5 내지 5.5 mM의 MgSO4 및 0.45 내지 0.55 mM의 CaCl2를 포함하도록 하고, 2 내지 5℃의 온도로 실험 대상체인 비인간 동물의 관류 또는 분리된 뇌의 절편화에 사용할 것; 상기 제2 인공 뇌척수액은 사용 전 4.5 내지 5.5 mM의 MgSO4 및 0.9 내지 1.1 mM의 CaCl2를 포함하도록 하고, 30 내지 35℃ 온도로 뇌 절편의 회복을 위한 배양시 사용할 것; 및 상기 제3 인공 뇌척수액은 사용 전 1.17 내지 1.43 mM의 MgSO4 및 2.25 내지 2.75 mM의 CaCl2를 포함하도록 하고, 실온에서 뇌 절편의 추가 배양 또는 전기생리학적 기록에 사용할 것을 포함하는 지시가 포함된 지시서.
MgSO4 및 CaCl2는 시냅스 가소성 및 기능 측정에 있어서 재현성 및 신뢰성에 기여하는 주요 요소로서, 이들 화합물이 인공 뇌척수액의 다른 화합물들과 함께 혼합되어 장시간 방치되는 경우 정밀하게 조정된 각 화합물들의 농도 및 pH가 의도하지 않게 변화할 수 있다. 따라서 상기 MgSO4 및 CaCl2는 인공 뇌척수액을 사용하기 직전에 추가하여 혼합하는 것이 바람직하다. 이에, 본 발명의 키트는 제1 내지 제3 인공 뇌척수액 내에 MgSO4 및 CaCl2를 포함하고 있지 않는 것이 바람직하며, 이들 화합물은 별개의 스톡(stock) 용액으로서 본 키트에 별개의 바이알(vial) 또는 컨테이너(container)에 담긴 형태로 포함되어 제공될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 키트는 MgSO4 용액 및 CaCl2 용액을 더 포함할 수 있다. 여기서, MgSO4 용액 또는 CaCl2 용액은 1M의 농도를 가질 수 있다.
상기 "제1 인공 뇌척수액", "제2 인공 뇌척수액" 및 "제3 인공 뇌척수액"에 대한 설명은 항목 '1. 스크리닝 방법의 각 단계에서 사용되는 인공 뇌척수액'에 기재된 사항 전체를 참조한다.
이하, 실시예를 통해 본 명세서가 제공하는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 이 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
이하, 실시예를 통해 본 명세서가 제공하는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 명세서에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 명세서에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 이 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1. 실험 동물의 준비
실험 동물로서 4주령의 수컷 래트(Sprague-Dawley®) 또는 8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 사용하였다. 모든 동물 실험은 실험 동물 관리 및 사용에 관한 지침(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 BnH 연구동물관리에서 승인한 프로토콜을 사용하여 수행되었다.
실시예 2. 후보 물질의 준비 및 투여
실시예 2.1. 후보 물질의 준비와 보관
후보 물질(BnH12001 등)은 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해하여 100 mM 농도의 스톡(stock) 용액으로 제조하였다. 시험에 바로 사용되는 경우를 제외하고, 후보 물질의 스톡 용액은 튜브에 분주하여 -20℃에서 보관하였다. 후보 물질의 스톡 용액은 동물에 투여하기 전 또는 시험에 사용하기 전에 분석용 완충액(또는 생리 식염수)으로 화합물의 종류 및 투여 경로에 따라 25배 내지 10,000배로 희석하여 최종 시험 용액으로 제조하였다.
실시예 7에서 사용된 후보 물질 BnH12001, BnH12003, BnH12005, BnH12022, BnH12036, BnH12048 및 BnH12049는 각각 5 mM 농도의 최종 시험 용액으로 제조하고, 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 상기 후보 물질을 선별하였다. 상기 후보 물질 BnH12001 내지 BnH12049의 화학 구조는 하기 표 4에 제시된다.
Figure PCTKR2023004054-appb-img-000001
한편, 실시예 10에서는 기존에 신경퇴행성 질환 등의 뇌 신경계 관련 치료를 위해 개발된 화합물(SAHA, MC1568, LMK-235, TMP195, TMP269, Tasquinimod, Santacruzamate A, CHDI #1, CHDI #3) 및 BnH12001을 시험 물질로 사용하여 본 발명의 스크리닝 방법을 검증하였다. 상기 개발된 화합물의 명칭 및 화학 구조는 하기 표 5에 제시된다.
Figure PCTKR2023004054-appb-img-000002
실시예 2.2. 후보 물질의 투여
본 발명의 스크리닝 방법에서, 후보 물질은 뇌내 투여, 경구 투여, 복강내 투여 또는 정맥내 투여 등의 경로로 투여될 수 있다. 본 실시예에서 내뇌 투여는 삼투 펌프(osmotic pump, 이하 'Os 펌프')에 의해 수행되었다. 각각의 투여 방법은 후술하는 바에 따라 수행되었다.
실시예 2.2.1. 내뇌 투여를 위한 Os 펌프의 이식
이식 하루 전날, 소형 Os 펌프(Model 2002, DURECT Corporation ALZET Osmotic Pumps)와 비닐 카테터 튜빙(래트용 8 cm, 마우스용 4 cm)을 연결한 캐뉼라(cannula; Plastic One Inc.)에 각각 약물을 주입하여 결합한 후, 생리 식염수(후보 물질의 비히클)을 채운 코니컬 튜브에 넣고 35℃에서 밤새 배양하였다.
4주령의 수컷 래트(Sprague-Dawley®) 또는 8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 Os 펌프 이식 수술 동안 이소플루란(isoflurane; 하나제약)으로 마취시켰다. 이어서, 마우스를 정위 프레임(stereotaxic frame; RWD Life Science)에 고정시켰다. 마우스의 눈높이에서 후두돌기까지의 정중선을 따라 두피를 시상(sagittal) 절개하여 두정골과 전두골을 노출시켰다. 두개골을 노출시킨 후 주입 캐뉼라를 배치하기 위한 작은 천두공(burr hole)을 드릴을 사용하여 뚫어 주었다. 주입 캐뉼라는 다음 좌표에 배치하여 배럴피질의 제4층에 후보 물질이 전달되도록 하였다(도 1 참조):
래트, 브레그마 기준, AP(anteroposterior) = -5.45 mm, ML(mediolateral) = -2.38 mm, DV(dorsoventral) = 1.2 mm;
마우스, 브레그마 기준, AP = -3.30 mm, ML = -1.50 mm, DV = 0.7 mm.
멸균 식염수(+/- 후보 물질)를 Os 펌프를 사용하여 주입 캐뉼라를 통해 0.5 μl/hr의 일정한 유속으로 주입되도록 하였다. Os 펌프는 마우스의 등 가죽 안쪽에 삽입하고, 캐뉼라 주변에 치과용 시멘트(Jet Set 4 Denture Repair Powder 및 Jet Liquid를 혼합, LANG)를 도포한 후 절개 부위를 봉합하였다. 봉합 후, 항염증제 및 항생제로서 2 mg/kg의 케토프로펜(ketoprofen) 및 20 mg/kg의 세파졸린(cefazolin)을 마우스에 복강내 투여하였다.
한편, Os 펌프에 의한 후보 물질의 주입 동안 배럴피질 제4층에서 주입된 물질의 확산 정도를 추정하기 위해, 먼저 메틸렌 블루를 주입하여 확산 영역을 염색하였다. 평균적으로, 메틸렌 블루는 주입 부위에서 2000.0 μm까지 확산하였다(배럴피질 영역의 전체 면적은 약 1500 μm임). 이 분석을 바탕으로, 배럴피질 영역에 대한 전기생리학적 기록을 수행하였다.
실시예 2.2.2. 경구 투여
경구 투여는 4주령의 수컷 래트(Sprague-Dawley®) 또는 8주령의 수컷 C57BL/6J 마우스에서 마취 없이 수행하였다. 2 mg의 후보 물질을 800 μl의 DMSO에 용해시키고, 스톡(stock) 용액으로 준비하였다. 경구 투여를 위해, 후보 물질의 스톡 용액:PEG400:식염수를 5:55:40의 비율로 혼합하고, 실험동물당 200 μl를 투여하였다. 대조군의 경우, DMSO:PEG400:식염수가 5:55:40 비로 혼합된 비히클(vehicle)을 실험동물당 200 μl로 투여하였다.
실시예 2.2.3. 복강내 투여
후보 물질의 스톡 용액을 DMSO:PEG400:식염수(5:55:40)를 사용하여 희석하고, 동물의 체중(kg) 당 25 mg의 용량으로 약 12일 동안 매일 복강내 투여하였다(투여 부피는 200 μl). 대조군의 경우 비히클(DMSO:PEG400:식염수가 5:55:40로 혼합된 용액)을 이용하여 동일한 방식으로 복강내 투여하였다.
실시예 3. 패치 클램프를 위한 뇌 절편(slice)의 준비
패치 클램프를 위한 TC(thalamocortical) 절편은 다음과 같은 방법으로 준비하였다. 먼저, 후보 약물 또는 비히클(vehicle)이 투여된 6-7주령의 수컷 래트 또는 9-10주령의 수컷 C57BL/6J 마우스를 이소플루란으로 마취한 후 빙냉 수크로스-인공 뇌척수액(sucrose-aCSF; 관류 및 절편화용; 제1 인공 뇌척수액으로 지칭되며 상세 조성은 표 1 참조)으로 경심 관류(transcardial perfusion)를 통해 뇌를 빠르게 냉각시켰다. 동물로부터 뇌를 분리하고, 분리된 뇌를 빙냉 수크로스-aCSF에 넣었다.
관상사면(paracoronal) 절편을 준비하기 위해, 분리된 마우스 또는 래트의 뇌를 10° 각도의 경사로(ramp)에서 정중선에 대해 50°(래트 기준; 마우스의 경우 55°) 각도로 절단하였다(도 3 참조). 절단된 부분(도 3의 우측 그림에서 1번 화살표의 단면)이 바닥이 되도록 비브라톰 디스크(vibratome disc)에 부착하여 고정시키고, 50° 각도(래트 기준; 마우스의 경우 55° 각도) 및 두께 400 μm로 절편화하였다. 상술한 절편 준비 과정은 모두 빙냉 수크로스-aCSF(제1 인공 뇌척수액)에서 수행되었다.
상기와 같이 수득한 TC 절편은 30℃ 내지 35℃의 회복을 위한 인공 뇌척수액(제2 인공 뇌척수액으로서 상세 조성은 표 2 참조)에서 30분 동안 배양하고, 이어서 실온의 기록용 인공 뇌척수액(제3 인공 뇌척수액으로서 상세 조성은 표 3 참조)에서 1시간 동안 추가로 배양하였다.
실시예 4. 전기생리학적 실험 - 패치 클램프(patch clamp)
모든 전기생리학적 실험은 27 내지 29℃에서 수행되었다. 전기생리학적 실험을 위해, 저항이 3.5 내지 4.2 mΩ인 전극을 사용하였고, 동심 양극성 전극(FHC, 미국)을 사용하여 복부 후내측 핵(ventral posteromedial nucleus, VPM)에 자극을 가하였다. 4X 배율 및 차동 간섭 대비(DIC) 광학현미경 하에서 배럴필드(barrel field)의 존재에 의해 그리고 VPM 자극에 의해 짧고 일정한 잠복장 흥분성 시냅스후 전위(field EPSPs)를 유발하는 능력에 의해 체성감각 피질을 확인하였다. 본 전기생리학 실험에 사용된 장비 및 장치 목록과 이의 정보는 하기 표 6에 개시된다.
명칭 제조사 또는 공급자 코드명 (Lot #)
액손 패치 클램프 증폭기 Molecular Device Multiclamp 700A
데이터 수집 시스템 Molecular Device Digidata 1440
적외선 카메라 Hamamatsu C3077
정전류 절연 자극기 Digitimer Ltd. DS3
동심 양극성 전극 FHC 30200, 30205
현미경 Olympus BX51WI
전동 미세조작기 Scientifica PatchStar
진동 블레이드 및 마이크로톰 Leica VT1000S
기록 프로그램 Molecular Device pClamp 10
전세포 전압-클램프 기록(whole-cell voltage-clamp recording)은 적외선 조명 및 차동 간섭 대비(DIC) 광학현미경을 사용하여 체성감각 배럴피질의 제4층에 존재하는 성상세포(stellate cell, SC; 뉴런)에서 이루어졌다(도 4 참조). 전세포 기록 용액(피펫 용액)의 조성은 하기 표 7에 제시된다:
Cs 메탄설포네이트 기반 피펫 용액
화합물 몰 질량(g/mol) 농도(mM) 100 ml당 첨가량(g)
Cs-meSO4 228 125 2.8500
NaCl 58.44 8 0.0468
포스포크레아틴(phosphocreatine)di(Tris) 453.4 5 0.2267
MgATP 507.2 4 0.2029
Na2GTP 523.2 0.4 0.0209
EGTA 380.4 0.5 0.0190
HEPES 238.3 10 0.2383
QX314-Cl 289.85 5 0.1449
모든 화합물은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich) 사 제품
pH=7.35(실온에서 CsOH로 조정됨), QX314-Cl(구입처: Alomone Labs)
mOsm = ~ 285 mOsm
전세포 기록은 10 kHz에서 디지털화되고 2 kHz에서 필터링된 멀티클램프 700A(Molecular devices, 미국)를 사용하여 수행되었다. 기록 동안 입력 저항 및 직렬 저항을 이전에 설명된 대로 모니터링하였다(문헌[Isaac, Crair, Nicoll, & Malenka, 1997, Silent synapses during development of thalamocortical inputs] 참조). TC EPSC를 VB 자극에 의해 0.1 Hz에서 유발시켰고, 이는 이전에 설명된 대로 자극 강도가 증가해도 변하지 않는 짧고 일정한 잠복기를 나타내는 경우 단일 시냅스로서 인정되었다(문헌[Feldman, Nicoll, Malenka, & Isaac, 1998, Synaptic plasticity at thalamocortical synapses in developing rat somatosensory cortex: LTP, LTD, and silent synapses] 및 문헌[Isaac et al., 1997, Silent Synapses during Development of Thalamocortical Inputs] 참조).
최소 자극 프로토콜(포텐시)의 경우, VB(ventrobasal) 시상 자극 강도를 조정하여 시냅스 반응과 실패의 혼합을 유발한 가장 낮은 강도를 찾았다. 실패율은 실패 횟수/총 시도 횟수로 계산되었다. 포텐시는 실패를 제외한 평균 EPSC 피크 진폭으로 계산되었다(문헌[Chittajallu & Isaac, 2010, Emergence of cortical inhibition by coordinated sensory-driven plasticity at distinct synaptic loci]; 문헌[Isaac et al., 1997, Silent Synapses during Development of Thalamocortical Inputs]; 및 문헌[Stevens & Wang, 1995, Facilitation and depression at single central synapses] 참조).
단일-축삭 자극에 대한 기준은 이전에 보고된 바와 같이 시냅스 이벤트가 전부 있거나 전혀 없는 것 및 자극 강도의 작은 증가에 의해 유발된 EPSC의 평균 진폭의 변화가 없는 것이었다(문헌 [Chittajallu and Isaac, 2010, Emergence of cortical inhibition by coordinated sensory-driven plasticity at distinct synaptic loci]; 문헌[Gil et al., 1999, Efficacy of Thalamocortical and Intracortical Synaptic Connections: Quanta, Innervation, and Reliability] 참조). 측정 매개변수는 하기 표 8에 제시된 바와 같다:
측정 홀딩(holding) 전압 기록 방법
최소 자극(포텐시) -70 mV 20회 또는 50회 시도 중 50% on/off
GABA/AMPA 비 0 mV/-70 mV 각 5회 시도 후 평균
흥분성 시냅스후 전위(EPSC)는 패치 클램프 증폭기(미국 소재의 Molecular Devices)를 사용하여 전세포 패치 클램프 방법으로 기록하였다. 측정 전극은 붕규산 유리 모세관(borosilicate glass capillary)이었고, 전극 내부 용액을 채웠을 때 저항이 3.5 내지 4.2 MΩ인 유리 모세관을 사용하였다. 챔버 내에 위치시킨 뇌 절편을 수직 현미경에 놓고, 앵커로 고정하여 중력에 의해 5 내지 10 mL/min의 속도로 기록용 인공 뇌척수액(제3 인공 뇌척수액으로서 상세 조성은 표 3 참조)을 흐르게 했다. 이어서, 자극기의 전극을 시상 섬유와 S1 배럴피질 (제4층) 영역 내의 연결부에 놓고, 해당 영역 내의 세포를 찾아 기록하였다. 전세포 패치 후, 막 전압을 -70 mV로 고정하고(AMPA 전류를 측정함), 자극을 가하여 EPSC를 확인하고, 자극기를 조작하여 전류 온/오프(on/off)가 50%가 되는 최소 자극 강도를 찾았다. 3분 20초 또는 8분 20초 동안 기록 및 전류에 대한 트레이스(총 20개 또는 50개의 트레이스)로 진폭을 측정하였다. 포텐시의 경우, EPSC 크기를 -70 mV에서 50 내지 100 pA로 설정하고, 0 mV에서 5개의 트레이스를 측정하였다.
실시예 5. 데이터 분석 및 후보 물질의 선별
실시예 5.1. 후보 물질의 포텐시(potency) 분석
포텐시 분석을 수행하기 위해, Clampfit 프로그램(Axon Instruments)을 사용하였다. 기준선은 0 내지 100 ms 사이의 구간을 지정하여 설정하였고, 트레이스는 110 내지 200 ms 이내에 나오는 '온(On)' 전류를 선택하여 평균을 구하였다. 평균 트레이스의 네거티브 전류 진폭(pA)을 확인하였다. 도 5a는 포텐시 분석의 예시를 도시한다.
실시예 5.2. 후보 물질의 GABA/AMPA 비 분석
Clampfit을 사용하여 GABA/AMPA 비를 분석하였다.
AMPA 전류의 경우, 0 내지 100 ms 사이의 간격을 지정하여 기준선을 설정하였다. 110 내지 200 ms 이내의 데이터의 트레이스의 평균을 구하고, 평균 트레이스의 네거티브 전류 진폭(pA)을 확인하였다. 도 5b는 AMPA 전류의 네거티브 전류 진폭 분석의 예시를 도시한다.
GABA 전류의 경우, 0 내지 110 ms 사이의 간격을 지정하여 기준선을 설정하였다. 110 내지 300 ms 이내의 데이터의 트레이스의 평균을 구하고, 평균 트레이스의 포지티브 전류 진폭(pA)을 확인하였다. 도 5c는 GABA 전류의 포지티브 전류 진폭 분석의 예시를 도시한다.
실시예 5.3. 스크리닝 기준 설정 및 최종 물질 선별
후보 물질 중 포텐시를 통계적으로 유의하게 상승시키고 GABA/AMPA 비를 통계적으로 유의하게 변화시키지 않는(즉, 여기/억제의 균형이 유지되는) 물질이 유효한 효능(신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애에 대한 예방 또는 치료 활성, 인지기능 증강 활성 등)이 있는 것으로 판단하였다.
구체적으로, 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 포텐시를 통계적으로 유의하게 상승시키는 후보 물질을 1차적으로 효능이 있는 것으로 판단하였다.
또한, 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 GABA/AMPA 비를 통계적으로 유의하게 변화(증가 또는 감소)시키지 않는 후보 물질은 1차적으로 부작용 등이 없는 것으로 판단하였다.
실시예 6. 통계 분석
모든 데이터는 평균 ± SEM으로 나타냈으며, n은 각 실험에 사용된 세포의 수를 나타낸다. 일반적으로, 각 동물 당 하나의 절편이 사용되었고, 각 절편에서 1회의 기록이 수행되었다. 두 그룹 사이의 평균 값 비교는 독립 표본(unpaired) 스튜던트 t-테스트를 이용하였고, 셋 이상의 그룹의 통계 처리는 일원 ANOVA를 이용하였다. 0.05 미만의 p 값이 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다. 상기 통계 분석은 프리즘 9.0(GraphPad Prism 9.1.2, GraphPad Software Inc., 미국)을 사용하여 수행되었다.
실시예 7. 전기생리학적 방법을 이용한 후보 물질의 스크리닝
후보 물질 BnH12001, BnH12003, BnH12005, BnH12022, BnH12036, BnH12048 및 BnH12049에 대해 실시예 1 내지 6에 기술된 방법에 따라 상기 후보 물질을 선별하였다.
그 결과 도 6a에 도시된 바와 같이, 포텐시의 경우 BnH12005, BnH12022, BnH12036 및 BnH12049 처리군은 대조군과 비교하여 유의한 차이가 나타나지 않았다. 또한, BnH12048 처리군은 대조군과 비교하여 포텐시가 유의하게 증가하였으나, 증가 폭은 크지 않았다. 반면, BnH12001 및 BnH12003 처리군은 대조군과 비교하여 포텐시가 현저하게 증가하는 것이 확인되었다.
또한, 도 6b에 도시된 바와 같이, GABA/AMPA 비는 BnH12022 처리군을 제외한 다른 모든 물질 처리군에서 통계적으로 유의한 변화 없이 유지되는 것으로 확인되었다.
상기 결과에 기초하여 포텐시의 증가 능력이 가장 크고 GABA/AMPA 비는 변화시키지 않는 BnH12001 및 BnH12003을 최종 후보로 선택하였다. 선택된 최종 후보 물질의 효능을 알츠하이머 동물 모델 및 PTSD 동물 모델에서 검증하였다.
위 결과는 모두 5회 내지 7회 반복한 실험을 통해 재현성 있게 얻어졌다.
실시예 8. 스크리닝 방법의 유효성 검증 I - 알츠하이머 동물 모델
상기 선별된 BnH12001이 실제로 치료 효과가 있는지 확인하기 위해, 능동회피시험(active avoidance test)(셔틀 박스)을 수행하였다. 능동 회피 조건 테스트는 학습 및 기억과 연관된 효력시험의 결과를 제공한다. 구체적으로, 소리 또는 빛의 신호를 준 후 전기 자극을 주는 반복 학습으로 빛 또는 소리만으로 동물이 능동적으로 전기자극을 회피하는 정도를 측정하는 방법이다. 따라서 소리 또는 빛에 의한 회피의 시간이 빠를 수록 학습 및 기억 효과가 향상됨을 의미한다.
실시예 8.1. 동물 입수 및 관리
동물은 시험 시작 7일 전 잭슨 연구소(Jackson laboratory)에서 입수하였다. 약 15개월령의 수컷 알츠하이머 유전자 변형 마우스 B6;SJL-Tg(APPSWE)2576 18 마리를 사용하였다. 동물을 콜로니 룸(colony room)에서 12/12시간 명암 주기에 따른 통상적인 환경 조건으로 유지시키고, 음식과 물을 자유롭게 섭취하게 하였다. 마우스를 7일에 걸쳐 새로운 하우징 케이지에 적응시켰다. 이들 동물을 사용하여 모든 시험을 수행하였다. 모든 동물 실험은 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행했고, 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였다. 7일차부터 3일 간격으로 체중을 측정했다.
실시예 8.2. 능동회피 시험의 장치, 방법 및 효과
본 실험에서 각각의 마우스는 두 개의 스테인 리스 강철 막대(직경 3 mm, 간격 1 cm)로 구성된 바닥판과 두 개의 24V DC 라이트 및 스피커로 구성된 쌍방향 셔틀 박스(27 cm Х 19 cm Х 20 cm)에 각각 배치하였다. 전기 충격은 격리된 충격 발생기(Panlab, s.l.u., 스페인)에 의해 바닥판에 전송시켰다. 마우스는 셔틀 박스에 3분의 적응 기간 후에, 내부의 변수 간격(20 초)에 한 30번의 회피조건을 설정하였다. 시험의 회피는 중간문을 닫은 후 60초 후 각각의 회피는 5초 동안 경고 톤(조건 자극, 4.0kHz tone 80Db)을 준 후 25초간 대기에 이어 무조건적인 전기 충격(0.2mA)을 가하는 것으로 10일간 훈련을 실시하였다. 조건부 회피 반응은 각 시도의 최초 10초 안에 반대 방으로 건너는 것에 의해서 정의되었다. 10초가 지나면 0.2mA의 전기가 바닥을 통해 가해지며, 25초간 지속되었다. 이때 톤 소리도 지속적으로 들려주었으며, 25초가 지나면 전기충격과 톤 소리는 꺼지고, 중간문도 닫힌다. 마우스가 중간문을 통해서 반대쪽으로 방으로 건너가면, 중간문은 닫히고 톤소리 및 전기충격도 꺼진다. 따라서 마우스는 톤만 들려줄 때나, 전기충격에 노출된 이후에 방을 탈출할 수 있으며 이때 탈출하기까지의 시간을 기록하였다.
신경퇴행성 장애 중 하나인 알츠하이머 유전 변형 마우스에서 BnH12001의 인지 및 학습효과를 관찰하였다. 선택된 마우스 각각 9마리씩 대조군과 실험군으로 나누고, 구강투여 방법으로 1mg/kg의 BnH12001을 투여하였다.
그 결과, BnH12001을 투여한 실험군은 대조군에 비해 회피시간이 유의하게 감소함이 확인되었고(도 7), 이를 통해 BnH12001은 학습 능력을 향상시키는 효과가 있음이 확인되었다. 이는 인지기능 증진을 통한 것으로 확인된 바, 본 발명의 전기생리학적 방법을 통한 스크리닝 방법으로 선별된 약물 BnH12001은 실제 동물 실험에서도 인지기능 증진 효과가 나타남이 확인되어, 본 발명의 스크리닝 방법의 유효성이 입증되었다.
실시예 9. 스크리닝 방법의 유효성 검증 II - 외상후 스트레스 장애의 동물 모델
실시예 9.1. 동물 입수 및 관리
동물은 DBL에서 입수하였다. 동물은 시험 시작 7일 전에 입수하였다. 약 7주령의 20마리의 수컷 SD-래트를 사용하였다. 동물을 콜로니 룸(colony room)에서 12/12시간 명암 주기에 따른 통상적인 환경 조건으로 유지시키고, 음식과 물을 자유롭게 섭취하게 하였다. 래트를 7일에 걸쳐 새로운 하우징 케이지에 적응시켰다. 이들 동물을 사용하여 모든 시험을 수행하였다. 모든 실험을 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침(the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행했고, 동물의 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였다. 7일차부터 3일 간격으로 체중을 측정했다.
실시예 9.2. PTSD의 래트 모델링
이 프로토콜은 탈출 기회 없이 발 충격(foot shock)으로의 2회 노출을 포함한다.
컨텍스트(Context) A(-1일차)
체중을 실험 3시간 전에 측정하였다. 실험실의 온도를 22℃로 유지하였다. 동물을 적응시키기 위해 10분 동안 어두운 실험실 공간에 두었다. 동물을 각각 첫 번째 방에 넣었다. 2분 후, 두 구획을 분리하는 문을 열고, 동물이 양쪽을 자유롭게 오가게 하였다. 5분 후, 1 mA/2초의 15회 발 충격을 무작위 시간(90초 내지 270초) 간격으로 적용했다. 시험을 종료한 후, 동물을 상자에 1분간 방치하고 콜로니 룸으로 이동시켰다.
컨텍스트 B(0일차)
체중을 실험 3시간 전에 측정하였다. 실험실의 온도를 22℃로 유지하였다. 동물을 적응시키기 위해 10분 동안 어두운 실험실 공간에 두었다. 동물을 사포(sandpaper)가 부착된 첫 번째 구획에 넣었다. 이때, 문은 닫힌 상태로 유지되어, 동물이 두 번째 구획으로 건너갈 수 없었다. 10분 후 동물에게 2 mA/sec의 3회 충격을 가했다. 시험을 종료한 후, 동물을 상자에 1분간 방치하고 콜로니 룸으로 이동시켰다.
화합물 주입
DMSO:PEG400:식염수(5:55:40)를 사용하여 화합물을 25 mg/kg으로 희석하였다. 7일차부터 24일 동안 화합물을 매일 오전 10시에 복강내 투여하였다(복강내 투여 부피는 200 μl임). 대조군도 비히클(DMSO:PEG400:식염수(5:55:40))을 사용하여 동일한 방식으로 복강내 주입하였다.
프리징 확인
프리징 확인을 위해, 초기 발 충격 프로토콜 후 7일차에 래트를 장치의 사포가 있는 첫 번째 구획에 5분 동안 넣고(발 충격 없음) 제조업체의 지침에 따라 shutavoid_v1803 프로그램(스페인 소재의 Panlab)을 사용하여 프리징 거동을 기록했다. 이때, 문은 컨텍스트 B와 같이 닫힌 채로 유지되었다. 프리징은 래트의 골격근 운동이 없는 상태로 정의하였다. 프리징 시간이 240초 이하인 동물은 제외하였다. 제외된 동물은 CO2를 사용하여 희생시켰다.
데이터 분석
전자 상자의 투명 아크릴 판 앞에는 모든 동물 움직임을 확인하기 위해 카메라를 배치하였다. 모든 군에 대해 7일차부터 3일마다 프리징을 확인하였다. 각 동물을 5분 동안 촬영하였다. 영상을 바탕으로, 각 동물의 프리징 시간을 확인하였다. 7일차의 프리징 시간을 100%로 설정하고, 이어서 요일별 프리징 시간을 백분율로 환산하였다.
실시예 9.3. PTSD 개선 효능
신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애 중 하나인 외상 후 스트레스 장애(PTSD) 동물 모델에 BnH12003을 투여하여 치료 효능을 관찰하고자 하였다.
이를 위해, SD 설치류(래트)(300 g)를 3일 동안 적응시키고, 실험에 들어가기 전에 실험용 래트의 프리징을 시험하기 위해 챔버에 5분간 넣어 사진 촬영을 하였다. 거친 사포로 둘러싸인 챔버에서, 90초 내지 270초 간격으로 15회 충격, 1 mA의 강도 및 2초 지속 시간으로 무작위로 전기 자극을 발바닥에 가하였다. 다음날, 거친 사포로 둘러싸인 챔버에서 BnH12003초마다 3회 충격, 2 mA의 강도 및 2초 지속 시간으로 3초마다 발바닥에 전기 자극을 가하였다. 7일차에 프리징 시간을 확인함으로써 PTSD 설치류(래트)를 선택했다. 선택된 설치류(래트)를 각각 12마리씩 대조군과 실험군으로 나누고, Os 펌프를 이용하여 설치류(래트)의 뇌실에 1 μM의 BnH12003을 투여하였다. 설치류(래트) PTSD 모델 제작 개시 후 10일차에, 대조군에는 식염수를 복강내 투여하고, 실험군에는 BnH12003(25 mg/kg)을 복강내 투여한 후, 프리징 시간 확인을 3일 간격으로 수행하였다. 프리징 시간 확인을 총 8회 실시하였고, 프리징 시간 감소는 PTSD 설치류(래트) 모델 제작 후 7일차를 기준으로 백분율(%)로 계산하였다.
그 결과, BnH12003을 투여한 실험군은 대조군에 비해 프리징 시간이 유의하게 감소함이 확인되었고(도 8), BnH12003이 외상 기억(공포 기억)이 있는 래트게 투여된 경우, 외상 기억(공포 기억)을 감소시키거나 사라지지게 하는 효과가 확인되었다. 따라서, 본 발명에 의해 선별된 화합물이 사용된 경우, 외상 기억(공포 기억) 또는 새로운 기억(더 이상 위험이 없는 장소)을 지우는 학습 효과가 향상됨이 확인되었다.
실시예 10. 스크리닝 방법의 유효성 검증 III
본 발명의 스크리닝 방법의 유효성을 검증하기 위해 신경퇴행성 질환 등의 뇌 신경계 관련 치료를 위해 개발된 화합물들과 BnH12001을 시험 물질로 사용하여 본 발명의 스크리닝 방법을 검증하였다. 각 화합물의 전기생리학적 시험 결과는 도 9a 및 도 9b에 나타내었다.
SAHA는 보리노스탓(Vorinostat)이라고도 지칭되는 HDAC 억제제의 일종으로서 항암제로 FDA 승인을 받은 약물이다. 도 9a에서 확인할 수 있는 바와 같이 SAHA는 포텐시를 소폭 증가시키는 경향을 보였으며, 유의한 GABA/AMPA 비의 변화를 유발하지 않는 것으로 나타났다. 현재 SAHA는 신생아 뇌 손상에 대해 염증 및 세포자멸사를 억제할 수 있다고 보고되고 있으며(문헌 [Vorinostat, a Histone Deacetylase Inhibitor, Can Mitigate the Impact of Neonatal Hypoxic-Ischemic Brain Injury in Rats", Molecular Neurobiology, 2021] 참조), 뇌 세포의 생존과 기능 유지를 개선할 수 있다는 보고가 있다(문헌 ["Histone Deacetylase Inhibitors in the Treatment of Multiple Sclerosis and Other Neurological Diseases", Current Opinion in Neurology, 2020] 참조).
MC1568은 부류 IIa HDAC 억제제로서 포텐시를 현저하게 증가시키면서도 유의한 GABA/AMPA 비의 변화는 유발하지 않는 것으로 나타났다. 실제로 MC1568은 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 치료에 효과가 있는 것으로 보고된 바 있으며(문헌 ["Inhibition of Class IIa HDACs in the Treatment of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis", Scientific Reports, 2017] 참조), 파킨슨병 모델에서 뇌 세포 손상을 줄이고, 운동 기능의 개선 효과가 있다고 보고되었다(문헌 ["Class IIa histone deacetylases as therapeutic targets for Parkinson's disease", Neurobiology of Disease, 2020)] 참조).
LMK-235, TMP195 및 TMP269는 모두 HDAC 억제제로서 포텐시를 유의하게 증가시키면서도 GABA/AMPA 비의 변화는 유발하지 않는 것으로 나타났다. 실제로 LMK-235는 노인성 치매 동물 모델에서 뇌 세포의 손상을 감소시키고 인지기능 개선 효과를 나타내는 것으로 보고되었다(문헌 ["HDAC Inhibition as a Therapeutic Strategy in Neurodegeneration: Insights from LMK-235", Current Alzheimer Research, 2017] 참조). 또한, TMP195는 노인성 치매, 조현병 등과 같은 신경학적 질환의 치료제로 연구되었으며, 동물 모델에서 인지기능을 개선하는 것으로 나타났으며(문헌 ["HDAC inhibition improves cognitive deficits in models for dementia and schizophrenia", Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2013] 참조), TMP269는 헌팅턴병과 관련되어 운동 기능 개선 효과가 있는 것으로 보고되었다(문헌 ["HDAC inhibitor TMP269 improves motor function and shows neuroprotective effects in the R6/2 mouse model of Huntington's disease", Molecular Neurodegeneration, 2017] 참조).
타스퀴니모드(Tasquinimod)는 포텐시를 어느 정도 증가시키며, 유의한 GABA/AMPA 비의 변화는 유발하지 않는 것으로 나타났다. 타스퀴니모드는 당초 항암제로 개발되었다가 임상 3상 단계를 통과하지 못하고, 현재 파킨슨병과 같은 신경학적 질환 치료제로서 연구되고 있으며, 동물 모델에서 운동 기능을 개선하는 것으로 보고되었다(문헌 ["Tasquinimod is a potential disease-modifying therapy in Parkinson's disease", Scientific Reports, 2017] 참조).
또한, CHDI #1(801251) 및 CHDI #3(CHDI00390576)은 HDAC 억제제로서 포텐시를 어느 정도 증가시키며, 유의한 GABA/AMPA 비의 변화는 유발하지 않는 것으로 나타났다. 상기 포텐시 증가 효과는 MC1568이나 BnH12001과 비교하였을 때 현저하게 낮은 것으로 나타났는데, 실제로 CHDI #1 및 CHDI #3는 헌팅턴병에 대한 전임상 시험을 진행하였으나 모두 실패하였다. 이는 본 발명의 스크리닝 방법에서 포텐시의 증가 정도가 실제 약물의 효능을 예측하는 데에도 유용할 수 있음을 시사한다.
한편, Santacruzamate A (CAY10683)는 대조군과 비교하여 포텐시를 증가시키지 못하였으며, GABA/AMPA 비율도 감소되는 것으로 나타났다. 실제로, Santacruzamate A는 실험용으로만 사용되는 시약으로 뇌 세포에서 신경 증식을 촉진하는 효과는 있으나 안전성 등의 이유로 실제 인간에게는 적용되지 못하고 있다(문헌 ["Santacruzamate A improves memory impairment and increases neurogenesis in aged mice", Marine drugs, 17(4), 234] 참조).
상기 결과를 종합하면, 본 발명의 스크리닝 방법을 사용하면 높은 신뢰성과 재현성으로 각종 신경 계통 질환, 뇌 질환 등에 대한 치료제를 스크리닝할 수 있음을 알 수 있다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (27)

  1. 다음의 단계를 포함하는 뇌 피질 시냅스 가소성의 활성을 변화시키는 물질을 스크리닝하는 방법:
    (a) 비인간 동물에 후보 물질을 투여하는 단계;
    (b) 상기 동물에 2 내지 5℃의 제1 인공 뇌척수액을 주입하여 뇌를 냉각시킨 후 동물로부터 뇌를 분리하는 단계;
    (c) 상기 분리된 뇌로부터 2 내지 5℃의 제1 인공 뇌척수액 내에서 대뇌피질(cerebral cortex) 영역을 포함하는 뇌 절편을 준비하는 단계;
    (d) 상기 단계 (c)에서 수득한 뇌 절편을 30 내지 35℃의 제2 인공 뇌척수액에서 배양하는 단계; 및
    (e) 패치 클램프를 사용하여 제3 인공 뇌척수액 내에서 상기 뇌 절편의 대뇌피질 영역에서 흥분성 시냅스후 전류(excitatory postsynaptic current, EPSC)를 기록하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    단계 (d) 이후 또는 단계 (e) 이전에, 뇌 절편을 실온의 제3 인공 뇌척수액에서 추가로 배양하는 단계를 더 포함하는
    방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (c)의 뇌 절편을 준비하는 단계는 분리된 뇌를 2 내지 5℃의 제1 인공 뇌척수액 내에서 정중선을 기준으로 50° 내지 55°의 각도 및 300 내지 500 μm의 두께로 절편화하는 것을 포함하는
    방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (e)의 기록은 5 내지 10 ml/min의 유속으로 순환하는 제3 인공 뇌척수액 내에서 수행되는
    방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 대뇌피질 영역은 배럴피질(barrel cortex)의 제4층을 포함하는
    방법.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌 절편은 시상피질(thalamocortical) 절편인
    방법.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (e)에서 흥분성 시냅스후 전류는 대뇌피질 영역에서 배럴피질의 제4층을 패치하여 기록되는
    방법.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 인공 뇌척수액은 수크로스, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, 글루코스, Na 피루베이트, Na L-아스코르베이트, MgSO4 및 CaCl2를 포함하는
    방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제1 인공 뇌척수액은 175 내지 215 mM의 수크로스, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 29 내지 36 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트, 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트, 4.5 내지 5.5 mM의 MgSO4 및 0.45 내지 0.55 mM의 CaCl2를 포함하는
    방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 제1 인공 뇌척수액은 수크로스, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, 글루코스, Na 피루베이트 및 Na L-아스코르베이트를 포함하여 제조되고, MgSO4 및 CaCl2는 제1 인공 뇌척수액의 사용 직전 또는 사용 당일 추가되는 것인
    방법.
  11. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 또는 제3 인공 뇌척수액은 NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, 글루코스, Na 피루베이트, Na L-아스코르베이트, MgSO4 및 CaCl2를 포함하는
    방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제2 인공 뇌척수액은 115 내지 142 mM의 NaCl, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 19 내지 24 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트, 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트, 4.5 내지 5.5 mM의 MgSO4 및 0.9 내지 1.1 mM의 CaCl2를 포함하는
    방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 제3 인공 뇌척수액은 111 내지 137 mM의 NaCl, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 23 내지 29 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트, 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트, 1.17 내지 1.43 mM의 MgSO4 및 2.25 내지 2.75 mM의 CaCl2를 포함하는
    방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 제2 또는 제3 인공 뇌척수액은 NaCl, KCl, NaH2PO4, NaHCO3, 글루코스, Na 피루베이트 및 Na L-아스코르베이트를 포함하여 제조되고, MgSO4 및 CaCl2는 제2 또는 제3 인공 뇌척수액의 사용 직전 또는 사용 당일 추가되는 것인
    방법.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    (f) 상기 기록된 EPSC에 기초하여 포텐시(potency) 및 GABA(γ-aminobutyric acid)/AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) 비를 도출하는 단계; 및
    (g) 후보 물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 상기 포텐시를 통계적으로 유의하게 상승시키고/거나 상기 GABA/AMPA 비를 통계적으로 유의하게 변화시키지 않는 물질을 선별하는 단계를 추가로 포함하는
    방법.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 물질은 신경학적 장애 또는 신경퇴행성 장애의 예방 또는 치료를 위한 후보 약물인
    방법.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 비인간 동물은 설치목(rodentia), 유대목(marsupialia) 또는 토류목(lagomorpha) 속하는 것인
    스크리닝 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 비인간 동물은 마우스(mouse), 래트(rat), 햄스터(hamster), 게르빌루스쥐(gerbil), 사향쥐(muskrat), 기니피그(guinea pig), 친칠라(chinchilla), 날다람쥐(flying squirrel), 얼룩다람쥐(chipmunk), 들다람쥐(ground squirrel), 프레리도그(prairie dog), 회색다람쥐(grey squirrel), 호저(porcupine), 주머니쥐(opossum) 또는 토끼(rabbit)인
    방법.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (e)는 수동 패치 클램프를 사용하여 전세포 기록(whole-cell recording)으로 수행되는
    방법.
  20. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (e)의 기록은 대뇌피질 영역 내 배럴피질(barrel cortex)의 제4층의 성상세포에서 수행되는
    방법.
  21. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (e)는 27 내지 29℃에서 수행되는
    방법.
  22. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (e)의 EPSC는 저항이 3.5 내지 4.2 mΩ인 전극을 사용하여 기록되는
    방법.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (e)의 EPSC는 막 전압을 -70 mV로 고정하여 기록되는
    방법.
  24. 제15항에 있어서,
    상기 단계 (f)의 포텐시는 0 내지 100 ms 사이의 구간을 기준선으로 설정하고, 110 내지 200 ms 사이의 구간에서 나타나는 온(on) 전류를 선택하여 도출된 평균 트레이스의 네거티브 전류 진폭(pA)인
    방법.
  25. 제15항에 있어서,
    상기 단계 (f)의 GABA/AMPA 비는 (ⅰ) -70 mV의 EPSC 기록에서 0 내지 100 ms 사이의 구간을 기준선으로 하였을 때 110 내지 200 ms 사이 구간에서의 평균 트레이스의 네거티브 전류 진폭(pA) 대비 (ⅱ) 0 mV의 EPSC 기록에서 0 내지 110 ms 사이의 구간을 기준선으로 하였을 때 110 내지 300 ms 사이 구간에서의 평균 트레이스의 포지티브 전류 진폭(pA) 값인
    방법.
  26. 다음의 인공 뇌척수액 및 지시서를 포함하는 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 스크리닝 방법에 사용하기 위한 키트:
    (ⅰ) 175 내지 215 mM의 수크로스, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 29 내지 36 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트 및 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트를 포함하는 제1 인공 뇌척수액;
    (ⅱ) 115 내지 142 mM의 NaCl, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 19 내지 24 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트 및 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트를 포함하는 제2 인공 뇌척수액;
    (ⅲ) 111 내지 137 mM의 NaCl, 2.25 내지 2.75 mM의 KCl, 0.9 내지 1.1 mM의 NaH2PO4, 23 내지 29 mM의 NaHCO3, 9.5 내지 12.5 mM의 글루코스, 1.8 내지 2.2 mM의 Na 피루베이트 및 0.9 내지 1.1 mM의 Na L-아스코르베이트를 포함하는 제3 인공 뇌척수액; 및
    (ⅳ) 상기 제1 인공 뇌척수액은 사용 전 4.5 내지 5.5 mM의 MgSO4 및 0.45 내지 0.55 mM의 CaCl2를 포함하도록 하고, 2 내지 5℃의 온도로 실험 대상체인 비인간 동물의 관류 또는 분리된 뇌의 절편화에 사용할 것; 상기 제2 인공 뇌척수액은 사용 전 4.5 내지 5.5 mM의 MgSO4 및 0.9 내지 1.1 mM의 CaCl2를 포함하도록 하고, 30 내지 35℃ 온도로 뇌 절편의 회복을 위한 배양시 사용할 것; 및 상기 제3 인공 뇌척수액은 사용 전 1.17 내지 1.43 mM의 MgSO4 및 2.25 내지 2.75 mM의 CaCl2를 포함하도록 하고, 실온에서 뇌 절편의 추가 배양 또는 전기생리학적 기록에 사용할 것을 포함하는 지시가 포함된 지시서.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 키트는 MgSO4 용액 및 CaCl2 용액을 더 포함하는
    키트.
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