KR20230035317A - 샘플내 미리-결정된 rna 서열의 존재를 결정하기 위한 등온 실시간 pcr 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 샘플내 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 결정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 RNA- 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 및 가닥-치환 활성의 활성들을 제공하는 하나 이상의 효소를 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 분석할 샘플에 부가하는 단계; 동시에 또는 후속하여, 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 분석할 샘플에 적어도 5개의 DNA 프라이머를 부가하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 DNA 프라이머는 RNA 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고, 적어도 하나의 DNA 프라이머는 RNA 서열에 역-상보적인 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 것인 단계; 이전 단계로부터 생성된 샘플을 고정된 온도에서 인큐베이션하는 단계; 및 연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내 존재하는지 여부를 결정하는 단계로서, 여기서 샘플내 연장된 이중-가닥 DNA 서열의 존재는 샘플내 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하고, 상기 미리-결정된 RNA 서열은 RNA 바이러스의 일부이며, F3 프라이머는 사용하지 않는다.

Description

샘플내 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 결정하기 위한 등온 실시간 PCR 방법
본 발명은 샘플내 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 결정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 RNA- 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 및 가닥-치환 활성 (strand-displacement activity)의 활성들을 제공하는 하나 이상의 효소를 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 분석할 샘플에 부가하는 단계; 동시에 또는 후속하여, 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 분석할 샘플에 적어도 5개의 DNA 프라이머를 부가하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 DNA 프라이머는 RNA 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고, 적어도 하나의 DNA 프라이머는 RNA 서열에 역-상보적인 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 것인 단계; 이전 단계로부터 생성된 샘플을 고정된 온도에서 인큐베이션하는 단계; 및 연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내 존재하는지 여부를 결정하는 단계로서, 여기서 샘플내 연장된 이중-가닥 DNA 서열의 존재는 샘플내 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하고, 상기 미리-결정된 RNA 서열은 RNA 바이러스의 일부이며, F3 프라이머는 사용하지 않는다.
샘플내 RNA 서열의 존재를 검출하기 위한 다양한 방법이 있다. 그러나, 대부분의 알려진 기술은 상당한 시간을 필요로 한다. 그러나, 일부 적용에서는 시간이 제한 요인이다. 예를 들어, 야생 동물 집단에는 많은 코로나바이러스가 존재하지만, SARS-CoV, MERS-CoV 및 새롭게 대두된 SARS-CoV-2를 포함하여 소수만이 인간을 감염시키는 능력을 발전시켰다. 이들 모두는 심각한 호흡기, 위장관 및 중추 신경계 질환을 일으킬 수 있다.
많은 경우에, 코로나바이러스 감염은 환자가 인식하지 못하거나, 또는 감기로 인식한다. 더욱이, 증상이 나타나기 전 코로나바이러스의 잠복기는 약 4일 내지 2주이다. 이는 의료 시스템이 바이러스 확산을 따라가는 것을 어렵게 한다.
또한, 이용 가능한 분자 바이러스 테스트 (molecular virus tests)는 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는데 몇 시간이 걸리며, 집중형 실험실 (centralized laboratory)에서 수행해야 한다. 이 기간 동안, 감염 가능성이 있는 사람은 이미 다른 사람을 감염시켜서, 바이러스를 더 확산시킬 수 있다.
상기의 관점에서, 샘플내 RNA, 구체적으로 바이러스 RNA, 보다 구체적으로 코로나 바이러스로부터 유래된 RNA의 존재에 대한 신속하면서도 신뢰할 수 있는 테스트가 절실히 요구된다.
상기 기술적 문제는 본원에 제공되고 청구범위에서 특징으로 하는 구체예에 의해 해결된다.
따라서, 본 발명은 하기 구체예에 관한 것이다.
1. 샘플내 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하고:
(a) RNA- 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 및 가닥-치환 활성의 활성들을 제공하는 하나 이상의 효소를 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 분석할 샘플에 부가하는 단계;
(b) 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 분석할 샘플에 적어도 5개의 DNA 프라이머를 부가하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 DNA 프라이머는 상기 RNA 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고, 적어도 하나의 DNA 프라이머는 상기 RNA 서열에 역-상보적인 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 것인 단계;
(c) 단계 (a) 및 (b)로부터 생성된 샘플을 고정된 온도에서 인큐베이션하는 단계;
(d) 연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내 존재하는지 여부를 결정하는 단계로서, 여기서 샘플내 연장된 이중-가닥 DNA 서열의 존재는 샘플내 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 나타내는 것인 단계;
상기 미리-결정된 RNA 서열은 RNA 바이러스의 일부이며, F3 프라이머는 사용하지 않는 방법.
2. 구체예 1에 있어서, 적어도 5개의 프라이머 중 4개의 프라이머는 각각 정방향 내부 프라이머 (forward inner primer: FIP), 역방향 내부 프라이머 (backward inner primer: BIP), 루프 프라이머 정방향 (loop primer forward: LPF) 및 루프 프라이머 역방향 (loop primer backwards: LPB)인 방법.
3. 구체예 1 또는 2에 있어서, 제5 프라이머는 B3 프라이머인 방법.
4. 구체예 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 효소는 역전사효소 또는 역전사효소 활성 및 선택적으로 가닥 치환 활성을 갖는 DNA 폴리머라제인 방법.
5. 구체예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, RNA 바이러스는 단일-가닥 RNA 바이러스인 방법.
6. 구체예 5에 있어서, RNA 바이러스는 코로나바이러스 (coronavirus)인 방법.
7. 구체예 6에 있어서, 코로나바이러스 (CoV)는 α-CoV, β-CoV, γ-CoV 또는 δ-CoV 속 (genus)인 방법.
8. 구체예 6 또는 7에 있어서, 코로나바이러스는 인간 코로나바이러스 OC43 (HCoV-OC43), 인간 코로나바이러스 HKU1 (HCoV-HKU1), 인간 코로나바이러스 229E (HCoV-229E), 인간 코로나바이러스 NL63 (HCoV-NL63, New Haven coronavirus), 중동 호흡기 증후군-관련 코로나바이러스 (MERS-CoV 또는 "novel coronavirus 2012"), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV 또는 "SARS-classic"), 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2 또는 "novel coronavirus 2019")로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
9. 구체예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 고정 온도는 50 내지 75℃인 방법.
10. 구체예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 단계 (c)의 샘플을 1 내지 120분 동안 인큐베이션하는 방법.
11. 구체예 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 바이러스는 코로나 바이러스이고, 하나 이상의 프라이머는 하기 서열을 포함하는 방법:
(a) FIP 프라이머 서열: CTT GCT CTT CTT CAG GTT GAC CAA GGT AAA CCT TTG; 및/또는
(b) BIP 프라이머 서열: GGT TAG ATG ATG ATA GTC CTG ATT GTC CTC ACT GCC; 및/또는
(c) LPF 프라이머 서열: AAG AGC AGC AGA AGT GGC AC; 및/또는
(d) LPB 프라이머 서열: CAA ACT GTT GGT CAA CAA G; 및/또는
(e) B3 프라이머 서열: GAA CCT CAA CAA TTG TTT GAA TAG.
12. 구체예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 샘플내 연장된 이중-가닥 DNA 서열의 존재는 연장된 이중-가닥 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 분자를 사용하여 결정하고, 구체적으로 상기 핵산 분자는 연장된 이중-가닥 DNA 서열에 삽입되는 분자를 사용하거나 또는 혼탁도 측정 (turbidity measurement)을 사용하여 표지되는 방법.
13. 구체예 6 내지 12 중 어느 하나의 방법을 사용하여 코로나과 (corona family) 바이러스에 의해 감염된 것으로 이전에 결정된 환자의 치료에 사용하기 위한 항바이러스 화합물 (antiviral compound).
14. 구체예 13에 있어서, 항바이러스 화합물은 렘데시비르 (Remdesivir)를 포함하는 항바이러스 화합물.
따라서, 제1 양상에서, 본 발명은 샘플내 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 결정하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 RNA- 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 및 가닥-치환 활성의 활성들을 제공하는 하나 이상의 효소를 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 분석할 샘플에 부가하는 단계; 동시에 또는 후속하여, 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 분석할 샘플에 적어도 5개의 DNA 프라이머를 부가하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 DNA 프라이머는 RNA 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고, 적어도 하나의 DNA 프라이머는 RNA 서열에 역-상보적인 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 것인 단계; 이전 단계로부터 생성된 샘플을 고정된 온도에서 인큐베이션하는 단계; 및 연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내 존재하는지 여부를 결정하는 단계로서, 여기서 샘플내 연장된 이중-가닥 DNA 서열의 존재는 샘플내 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하고, 상기 미리-결정된 RNA 서열은 RNA 바이러스의 일부이며, F3 프라이머는 사용하지 않는다.
본원에서 사용된, 용어 "미리-결정된 RNA 서열 (pre-determined RNA sequence)"은 RNA 서열을 지칭하며, 여기서 당업자는 RNA 서열이 RNA 바이러스의 일부임을 알고 있다. 구체적으로, 본 발명 내에서, 미리-결정된 RNA 서열은 본 발명의 방법을 사용하여 검출 가능한 서열이다. 즉, 당업자가 RNA 서열이 본원에 제공된 방법을 사용하여 샘플에서 검출될 가능성이 있는지 여부를 결정할 수 있는 경우 당업자가 이용할 수 있는 RNA 서열은 미리-결정된다. 본 발명 내에서, 미리-결정된 RNA 서열은 본 발명의 방법에서 사용되는 프라이머 중 적어도 하나와 적어도 부분적으로 동일한 적어도 하나의 프라이머 결합 부위를 포함한다. 프라이머 결합 부위는 서열이 정확히 동일한 경우 또는 하나의 서열이 티미딘 대신에 우라실을 포함한다는 점에서만 상이한 경우 및/또는 하나의 서열이 각각의 비-변형된 뉴클레오티드(들) 대신에 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다는 점에서만 상이한 경우 프라이머 부위에 대해 동일한 것으로 간주된다.
본원에서 사용된, 용어 "DNA 프라이머 (DNA primer)" 또는 "프라이머 (primer)"는 상보적 핵산 서열에의 혼성화 시에, 예를 들어 효소적 핵산 복제 반응을 통해 연장될 수 있는 3'-말단 -OH 기를 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 본 발명에 따른 프라이머 세트는 핵산의 증폭, 즉 LAMP 분석 또는 RT-LAMP 분석에 사용된다. 프라이머 길이의 상한 및 하한은 모두 경험적으로 결정된다. 본원에 기재된 DNA 프라이머는 정방향 프라이머 (forward primer) 또는 역방향 프라이머 (backward primer)일 수 있다. 본원에서 사용된, 용어 "역방향 프라이머 (backward primer)"는 폴리머라제가 DNA 서열의 상보적 가닥을 따라 한 방향으로 연장되도록 하기 위해 DNA 서열의 안티센스 가닥을 프라이밍하는 프라이머를 지칭한다. 적어도 하나의 역방향 프라이머는 또한 역전사를 위해 RT 프라이머로서 역할을 한다. 본원에서 사용된, 용어 "정방향 프라이머 (forward primer)"는 폴리머라제가 DNA 서열의 한 가닥을 따라 한 방향으로 연장되도록 하기 위해 DNA 서열의 센스 가닥을 프라이밍하는 프라이머를 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "샘플 (sample)"은 잠재적으로 미리-결정된 RNA 서열을 포함하는 임의의 검체 (specimen)를 지칭한다. 본 발명의 방법에 사용되는 샘플은 생체 (예를 들어, 식물 및/또는 동물, 바람직하게는 인간, 예컨대 기관지폐포 세척액, 기관지 세척액, 인두 삼출물, 기관 흡인액, 혈액, 혈청, 혈장, 뼈, 피부, 연조직, 창자 (intestinal tract) 검체, 생식기 검체, 모유, 림프액, 뇌척수액, 흉수, 객담, 소변, 비강 분비물, 눈물, 담즙, 복수액, 고름 (pus), 활액 (synovial fluid), 유리체액, 질 분비물, 정액 및/또는 요도 조직), 일차- 또는 변형된 세포, 조직, 세포 배양물, 배양 배지, 첨가제, 세포 유래 산물, 실험실 장비, 바이오의약품, 미생물로부터 유래될 수 있는 샘플, 및/또는 예를 들어 식품, 토양 및/또는 폐수로부터 분리된 샘플일 수 있다.
초기 샘플로부터 미리-결정된 RNA 서열의 단리는 당업자에게 알려진 임의의 방법, 가령 예를 들어, 계면활성제를 사용한 용해 처리, 음파 처리, 유리 비드를 사용한 진탕 교반 또는 French 프레스 방법 (French press method)에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 핵산 분자의 길이를 줄이기 위해 내인성 뉴클레아제가 사용될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 핵산의 정제는 예를 들어, 페놀 추출, 크로마토그래피, 이온 교환, 겔 전기영동, 밀도-의존성 원심분리 및/또는 당업자에게 알려진 다른 방법에 의해 수행될 수 있다.
RNA- 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성의 활성을 제공하는 효소는 DNA 또는 RNA 가닥으로 이루어진 주형에 기반하여 5'-＞3' 방향으로 DNA를 합성할 수 있다. 당업자가 알고 있는 바와 같이, 이러한 효소는 주형의 유리 3'-하이드록실 기에 뉴클레오티드를 연속적으로 부가할 것이다. 이와 관련하여, 주형 가닥은 Watson-Crick 염기 페어링 (Watson-Crick base pairing)에 기반하여 부가된 뉴클레오티드의 서열을 결정한다. DNA 폴리머라제의 활성은 RNA- 및/또는 DNA-의존성일 수 있다. 예시되는 폴리머라제는 Bst DNA 폴리머라제, Vent DNA 폴리머라제, Vent (엑소-) DNA 폴리머라제, Deep Vent DNA 폴리머라제, Deep Vent (엑소-) DNA 폴리머라제, Bca (엑소-) DNA 폴리머라제, DNA 폴리머라제 I Klenow 단편, Φ29 파지 DNA 폴리머라제, Z-TaqTM DNA 폴리머라제, ThermoPhi 폴리머라제, 9°Nm DNA 폴리머라제, 및 KOD DNA 폴리머라제를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 미국특허 번호 5,814,506; 5,210,036; 5,500,363; 5,352,778; 및 5,834,285; Nishioka, M., et al. (2001) J. Biotechnol. 88, 141; Takagi, M., et al. (1997) Appl. Environ. Microbiol. 63, 4504를 참조한다.
RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성의 활성을 제공하는 효소로서, 임의의 적절한 역전사효소가 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 사용되는 효소는 특별히 제한되지 않으며, 단 RNA를 주형으로 사용하여 cDNA를 합성하는 활성을 가져야 한다. 또한, 핵산 증폭 효소의 내열성을 개선하는 물질, 예컨대 트레할로스가 부가될 수 있다.
본 명세서에서 간단히 "5'-단부 측 (5'-end side)" 또는 "3'-단부 측 (3'-end side)"으로 표시되는 경우, 모든 경우에 주형으로 간주되는 사슬에서의 방향을 의미한다. 또한, 3'-단부 측이 상보적 사슬 합성의 시작점이 된다고 기재되는 경우, 이는 3'-단부 측 -OH 기가 상보적 사슬 합성의 시작점이라는 것을 의미한다.
본원에서 사용된, 용어 "가닥 치환 (strand displacement)"은 프라이머-개시 합성 중에 이중-가닥 DNA 분자 및/또는 이중-가닥 RNA 분자에서 DNA 및/또는 RNA 가닥을 분리하는 효소의 능력을 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "혼성화 (hybridisation)"는 상보적 핵산 분자의 어닐링 (annealing)을 지칭한다. 2개의 핵산이 서로에 "혼성화하는 (hybridise to)" 경우, 또는 하나의 핵산이 다른 핵산에 "혼성화하는 (hybridise to)" 경우, 상기 2개의 핵산 분자가 특정 반응에 사용되는 특정 조건 (예를 들어, 온도, 염 및 다른 버퍼 조건)하에 서로 어닐링할 수 있는 충분한 수의 상보적 핵염기를 상기 2개의 핵산 분자가 나타낸다. 혼성화의 가장 일반적인 기전은 핵산 분자들의 상보적 핵염기들 사이의 수소 결합 (예를 들어, Watson-Crick, Hoogsteen 또는 reversed Hoogsteen 수소 결합)을 포함한다. 혼성화는 다양한 조건하에 발생할 수 있다. 엄격성 조건 (stringent conditions)은 서열-의존성이며, 혼성화될 핵산 분자의 특성 및 조성에 의해 결정된다. 핵산 혼성화 기술 및 조건은 당업자에게 알려져 있고, 광범위하게 기재되어 있다. 예를 들어, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed.. Cold Spring Harbor Press, 1989; Ausubel et al, 1987, Current Protocols in Molecular Biology; Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York; Tijessen, 1993, Hybridization with Nucleic Acid Probes, Elsevier Science Publishers, B.V.; and Kricka, 1992, Non-Isotopic DNA Probe Techniques, Academic Press, San Diego, California를 참조한다.
본원에서 사용된, 용어 "F3"은 프라이머 세트의 외부 정방향 프라이머를 지칭한다.
이전의 LAMP 방법은 F3 프라이머가 증폭 과정 중에 cDNA 가닥을 방출하는데 필요하다고 가정하였지만 (예를 들어, Nagamine et al. 2002. Molecular and Cellular Probes 16. 223-229 참조), 본 발명자들은 F3 프라이머의 생략이 증폭 과정을 손상시키지 않는다는 것을 발견하였다.
그러나, 본 발명 내에서, 놀랍게도 F3 프라이머가 생략된 5-프라이머 시스템 (five-primer system)이 미리-결정된 RNA 서열을 검출하는데 가장 효과적이라는 것을 발견하였다. 본원에서 사용된 "가장 효과적인 (most efficient)"은 통상적으로 사용되는 기술보다 검출이 더 빠르고 더 감수성이 있지만, 바이러스 감염을 검출하는데 사용되는 테스트의 전제 조건인 신뢰성 (reliability)을 유지하는 것을 의미한다. 또한, 표준 LAMP 기술에서와 같이 6개의 프라이머 대신에 5개의 프라이머를 사용함으로써 더 짧은 표적 서열이 검출될 수 있음을 발견하였다.
본 발명은 미리-결정된 RNA 서열을 함유하는 샘플, 및 본 발명의 적어도 하나의 프라이머가 존재하는 반응 시스템에서 샘플내 미리-결정된 RNA 서열의 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는, 핵산을 증폭시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 소정의 구체예에서, 적어도 하나의 프라이머 종 (species)이 본 발명의 핵산 증폭 반응에 사용된다. 즉, 본원에 기재된 DNA 프라이머는 다른 프라이머와 조합하여 사용될 수 있거나, 또는 본원에 기재된 DNA 프라이머의 2개의 종이 사용될 수 있다.
본 발명 내에서 5개의 상이한 프라이머가 사용되는 것이 바람직하다. 일부 구체예에서, 본 발명에서 사용되는 프라이머 중 적어도 2개는 루프 프라이머 (loop primers)이다.
본원에서 사용된, 용어 "루프 프라이머 (loop primer)"는 미리-결정된 RNA 서열의 증폭 산물의 적어도 하나의 루프 영역에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 DNA 프라이머를 지칭한다. 루프 영역은 증폭 산물의 가닥을 자체적으로 어닐링하여 형성된다. 전형적으로, 루프 프라이머는 생성된 DNA 서열에 혼성화하고, 추가 DNA 연장 과정의 개시를 위한 시작점 수의 증가를 제공한다. 루프 프라이머를 사용하면 증폭 과정을 가속화할 수 있다.
본 발명 내에서 적어도 5개의 프라이머 중 4개의 프라이머는 각각 정방향 내부 프라이머 (FIP), 역방향 내부 프라이머 (BIP), 루프 프라이머 정방향 (LPF) 및 루프 프라이머 역방향 (LPB)인 것이 바람직하다.
본원에서 사용된, 용어 "FIP" 또는 "정방향 내부 프라이머 (forward inner primer)"는 가닥 개시를 위한 서열 및 동일한 FIP-개시 가닥에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 정방향 프라이머를 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "BIP" 또는 "역방향 내부 프라이머 (backward inner primer)"는 가닥 개시를 위한 서열 및 동일한 BIP-개시 가닥에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 역방향 프라이머를 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "루프 프라이머 정방향 (loop primer forward)" 또는 "LPF"는 정방향 프라이머인 루프 프라이머를 지칭한다.
본원에서 사용된, 용어 "루프 프라이머 역방향 (loop primer backwards)" 또는 "LPB"는 역방향 프라이머인 루프 프라이머를 지칭한다.
이러한 용어들은 통상적으로 루프-매개 등온 증폭 (loop-mediated isothermal amplification: LAMP) 방법과 관련된 방법, 예컨대 Nagamine et al. 2002. Molecular and Cellular Probes 16. 223-229에 기재된 방법에 사용된다.
따라서 본 발명의 방법 내에서, 제5 프라이머는 B3 프라이머인 것이 바람직하다.
본원에서 사용된, 용어 "B3"은 프라이머 세트의 외부 역방향 프라이머를 지칭한다. 표적 핵산 또는 이의 상보적 서열에 특이적으로 결합하는 본원에 기재된 DNA 프라이머는 길이가 적어도 10, 15 또는 19개의 뉴클레오티드일 수 있고, B3의 경우 적어도 18, 20, 22 또는 24개의 뉴클레오티드, FIP 및 BIP의 경우 적어도 25, 30, 33 또는 36개의 뉴클레오티드, 및 LPF 및 LPB의 경우 적어도 10, 15, 17 또는 19개의 뉴클레오티드일 수 있다. 표적 핵산 서열에 특이적으로 결합하는 DNA 프라이머는 상응하는 영역과 적어도 80% 상보성, 구체적으로 90% 상보성, 보다 구체적으로 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 갖는 핵산 서열을 가질 수 있다.
본 발명에서는 F3 프라이머를 사용하지 않는다. 이는 놀랍게도 B3 프라이머가 존재하지만 F3 프라이머가 부재할 때 검출이 더 빠르고 더 감수성이 있다는 것을 본 발명자들이 발견하였기 때문이다. 본 발명의 방법을 사용하여, 검출은 10분 이내에 가능하고 샘플내 미리-결정된 RNA 서열의 적은 수를 검출하는데 더 감수성이 있는 것으로 관찰되었다. 즉, 첨부된 실시예에 나타난 바와 같이, 5개의 프라이머, 구체적으로 FIP, BIP, LPF, LPB 및 B3을 사용하여 코로나 바이러스의 미리-결정된 RNA 서열의 포지티브 검출이 프라이머 및 효소의 부가 후 10분 이내에 달성되었다. 따라서, 본 발명의 방법은 처음으로 바이러스 감염의 대유행 발생을 제어하는데 중요한 바이러스 감염을 검출하는 신뢰할 수 있고 빠른 방법을 제공한다.
본 발명의 방법 내에서, RNA- 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 및 가닥-치환 활성의 활성들을 제공하는 하나 이상의 효소가 사용된다. 즉, 분석할 RNA 서열에 3가지 활성 모두를 부가해야 한다. 상기 활성은 3가지 활성을 모두 갖는 하나의 효소, 또는 각각 3가지 활성 중 하나 이상의 활성을 갖는 여러 효소에 의해 제공될 수 있다.
본 발명의 방법 내에서, 미리-결정된 RNA 서열을 포함하는 RNA 바이러스는 코로나바이러스인 것이 바람직하다. 그러나, RNA 바이러스는 모든 종류일 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "RNA 바이러스 (RNA virus)"는 RNA를 이의 유전자 물질로 사용하는 임의의 바이러스를 지칭한다.
일부에서 RNA 바이러스는 dsRNA 바이러스, 포지티브-센스 ssRNA 바이러스 및 네가티브-센스 ssRNA 바이러스의 그룹으로부터 선택된 바이러스일 수 있다. 일부 구체예에서, RNA 바이러스는 아말가비리데 (Amalgaviridae), 비르나비리데 (Birnaviridae), 크리소비리데 (Chrysoviridae), 시스토비리데 (Cystoviridae), 엔도르나비리데 (Endornaviridae), 하이포비리데 (Hypoviridae), 메가비르나비리데 (Megabirnaviridae), 파르티티비리데 (Partitiviridae), 피코비르나비리데 (Picobirnaviridae), 레오비리데 (Reoviridae), 토티비리데 (Totiviridae), 쿠아드리비리데 (Quadriviridae), 보티비르나바이러스 (Botybirnavirus), 미지정된 dsRNS 바이러스 (Unassigned dsRNA viruses), 아르테리비리데 (Arteriviridae), 코로나비리데 (Coronaviridae) (이중 코로나바이러스 (Coronavirus), SARS-CoV 포함), 메소니비리데 (Mesoniviridae), 로니비리데 (Roniviridae), 디시스트로비리데 (Dicistroviridae), 이플라비리데 (Iflaviridae), 마르나비리데 (Marnaviridae), 피코르나비리데 (Picornaviridae), 세코비리데 (Secoviridae), 알파플렉시비리데 (Alphaflexiviridae), 베타플렉시비리데 (Betaflexiviridae), 감마플렉시비리데 (Gammaflexiviridae), 티모비리데 (Tymoviridae), 알파테트라비리데 (Alphatetraviridae), 알베르나비리데 (Alvernaviridae), 아스트로비리데 (Astroviridae), 바르나비리데 (Barnaviridae), 베니비리데 (Benyviridae), 보토르미아비리데 (Botourmiaviridae), 브로모비리데 (Bromoviridae), 칼리시비리데 (Caliciviridae), 카르모테트라비리데 (Carmotetraviridae), 클로스테로비리데 (Closteroviridae), 플라비비리데 (Flaviviridae), 푸사리비리데 (Fusariviridae), 헤페비리데 (Hepeviridae), 하이포비리데 (Hypoviridae), 레비비리데 (Leviviridae), 루테오비리데 (Luteoviridae), 폴리시피비리데 (Polycipiviridae), 나르나비리데 (Narnaviridae), 노다비리데 (Nodaviridae), 페르무토테트라비리데 (Permutotetraviridae), 포티비리데 (Potyviridae), 사르트로비리데 (Sarthroviridae), 스타토바이러스 (Statovirus), 토가비리데 (Togaviridae), 톰부스비리데 (Tombusviridae), 비르가비리데 (Virgaviridae), 미지정된 포지티브-센스 ssRNA 바이러스 속 (Unassigned genera positive-sense ssRNA viruses), 퀸비리데 (Qinviridae), 아스피비리데 (Aspiviridae), 추비리데 (Chuviridae), 보르나비리데 (Bornaviridae), 필로비리데 (Filoviridae), 미모나비리데 (Mymonaviridae), 니아미비리데 (Nyamiviridae), 파라믹소비리데 (Paramyxoviridae), 뉴모비리데 (Pneumoviridae), 라브도비리데 (Rhabdoviridae), 순비리데 (Sunviridae), 안페바이러스 (Anphevirus), 아를리바이러스 (Arlivirus), 쳉티바이러스 (Chengtivirus), 크루스타바이러스 (Crustavirus), 와스트리바이러스 (Wastrivirus), 유에비리데 (Yueviridae), 아레나비리데 (Arenaviridae), 크룰리비리데 (Cruliviridae), 페라비리데 (Feraviridae), 피모비리데 (Fimoviridae), 한타비리데 (Hantaviridae), 존비리데 (Jonviridae), 나이로비리데 (Nairoviridae), 페리부냐비리데 (Peribunyaviridae), 파스마비리데 (Phasmaviridae), 페누이비리데 (Phenuiviridae), 토스포비리데 (Tospoviridae), 틸라피네비리데 (Tilapineviridae), 암노온비리데 (Amnoonviridae), 오르토믹소비리데 (Orthomyxoviridae), 위성 바이러스 (Satellite viruses) (이중 사르트로비리데 (Sarthroviridae), 알베토바이러스 (Albetovirus), 아우마이바이러스 (Aumaivirus), 파파니바이러스 (Papanivirus), 비르토바이러스 (Virtovirus), 만성 꿀벌 마비 바이러스 (Chronic bee paralysis virus) 포함), 레트로비리데 (Retroviridae), 메타비리데 (Metaviridae), 및 슈도비리데 (Pseudoviridae)의 그룹으로부터 선택된 바이러스일 수 있다.
본 발명 내에서, 코로나바이러스는 구체적으로 α-CoV, β-CoV, γ-CoV 또는 δ-CoV 속 (genus)일 수 있다. 보다 구체적으로, 코로나바이러스는 인간 코로나바이러스 OC43 (HCoV-OC43), 인간 코로나바이러스 HKU1 (HCoV-HKU1), 인간 코로나바이러스 229E (HCoV-229E), 인간 코로나바이러스 NL63 (HCoV-NL63, New Haven coronavirus), 중동 호흡기 증후군-관련 코로나바이러스 (MERS-CoV 또는 "novel coronavirus 2012"), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV 또는 "SARS-classic"), 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2 또는 "novel coronavirus 2019")로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있다.
일부 양상에서, 본원에 기재된 RNA-바이러스는 본원에 기재된 적어도 하나의 RNA-바이러스의 바이러스 게놈 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%의 서열 동일성을 갖는 변이체이다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 SARS-CoV-2는 SARS-CoV-2 변이체이다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 SARS-CoV-2 변이체는 B.1.1.207 계통 (Lineage), B.1.1.7 계통, 클러스터 (Cluster) 5, 501.V2 변이체, P.1 계통, B.1.429 / CAL.20C 계통, B.1.427 계통, B.1.526 계통, B.1.525 계통, B.1.1.317 계통, B.1.1.318 계통, B.1.351 계통, B.1.617 계통 및 P.3 계통의 그룹으로부터 선택된 SARS-CoV-2 변이체이다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 SARS-CoV-2 변이체는 19A, 20A, 20C, 20G, 20H, 20B, 20D, 20F, 20I, 및 20E 그룹으로부터 선택된 Nextstrain clade에 의해 기재된 SARS-CoV-2 변이체이다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 SARS-CoV-2 바이러스는 D614G, E484K, N501Y, S477G/N, P681H, E484Q, L452R 및 P614R 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 SARS-CoV-2 변이체이다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 SARS-CoV-2 변이체는 SARS-CoV-2 변이체 또는 본원에 기재된 변이체로부터 유래된 혼성체 (hybrid)이다.
본 발명의 방법에서, 구체적으로 이의 단계 (c)에서, 온도는 고정될 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "고정된 온도 (fixed temperature)"는 효소 및 프라이머가 실질적으로 기능할 수 있도록 온도 조건을 일정하거나 또는 거의 일정하게 유지하는 것을 지칭한다. 거의 일정한 온도 조건은 설정한 온도를 정확하게 유지하는 것 뿐만 아니라, 효소 및 프라이머의 실질적인 기능을 손상시키지 않는 범위 내에서 약간의 온도 변화만이 허용 가능하다는 것을 의미한다. 예를 들어, 약 0 내지 10℃의 온도 변화가 허용된다.
고정된 온도하에 핵산 증폭 반응은 사용할 효소의 활성이 유지될 수 있는 수준으로 온도를 유지함으로써 수행될 수 있다. 또한, 상기 핵산 증폭 반응에서 프라이머를 표적 핵산에 어닐링하기 위해, 예를 들어 반응 온도는 프라이머의 Tm 값 부근 또는 그 미만의 온도로 설정할 수 있으며, 프라이머의 Tm 값을 고려하여 엄격성 수준으로 이를 설정하는 것이 바람직하다. 상기 핵산 증폭 반응에서, 증폭 반응은 효소가 불활성화되거나, 또는 프라이머를 포함한 시약들 중 하나가 소진될 때까지 반복될 수 있다.
즉, 하나 이상의 효소, DNA 프라이머 및 분석할 샘플을 동일한 튜브에서 일정한 온도로 인큐베이션한다. 상기 온도는 바람직하게는 50 내지 75℃이다. 그러나, 상기 온도는 또한 더 낮을 수 있으며, 예를 들어 30 내지 75℃일 수 있다. 대안적인 구체예에서, 터치다운 온도 단계 (touchdown temperature step)가 사용된다. 즉, 상기 온도는 분석 과정 중에 더 낮으며, 예를 들어 70℃의 온도에서 시작하여 이후에 50℃로 더 낮춘다.
본 발명의 방법에서, 하나 이상의 효소, DNA 프라이머 및 분석할 샘플을 동일한 튜브에서 1분 내지 120분, 바람직하게는 1분 내지 60분, 1분 내지 45분, 1분 내지 30분, 또는 1분 내지 15분 동안 인큐베이션한다. 바람직한 일 구체예에서, 상기 샘플을 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30분 동안 인큐베이션한다.
본 발명 내에서, 바이러스는 코로나 바이러스인 것이 바람직하다. 본 발명의 이러한 구체예에서, 바람직한 프라이머 서열은 하기에 제시된다:
(a) FIP 프라이머 서열: CTT GCT CTT CTT CAG GTT GAC CAA GGT AAA CCT TTG (서열 번호: 1); 및/또는
(b) BIP 프라이머 서열: GGT TAG ATG ATG ATA GTC CTG ATT GTC CTC ACT GCC (서열 번호: 2); 및/또는
(c) LPF 프라이머 서열: AAG AGC AGC AGA AGT GGC AC (서열 번호: 3); 및/또는
(d) LPB 프라이머 서열: CAA ACT GTT GGT CAA CAA G (서열 번호: 4); 및/또는
(e) B3 프라이머 서열: GAA CCT CAA CAA TTG TTT GAA TAG (서열 번호: 5).
상기 프라이머 서열은 코로나 바이러스의 서열을 표적으로 한다. 구체적으로, 상기 프라이머는 하기 서열을 표적으로 한다:
기탁 번호 NC_045512.2의 염기 3129-3290에 해당하는 ACCAAGGTAAACCTTTGGAATTTGGTGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTACTATTCAAACAATTGTTGAGGTTC (서열 번호: 7).
일부 구체예에서, 구체적으로 코로나바이러스의 경우, 본 발명의 방법에 사용된 프라이머는 하기 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다:
a) 서열 번호: 1의 서열에 대해 적어도 88%, 91%, 94%, 97% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 여전히 프라이머 기능 (primer functionality)을 제공하는 것인 FIP 프라이머,
b) 서열 번호: 2의 서열에 대해 적어도 88%, 91%, 94%, 97% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 여전히 프라이머 기능을 제공하는 것인 BIP 프라이머,
c) 서열 번호: 3의 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 여전히 프라이머 기능을 제공하는 것인 LPF 프라이머,
d) 서열 번호: 4의 서열에 대해 적어도 84%, 89%, 94%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 여전히 프라이머 기능을 제공하는 것인 LPB 프라이머, 및
e) 서열 번호: 5의 서열에 대해 적어도 83%, 87%, 91%, 95% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하고, 상기 서열은 여전히 프라이머 기능을 제공하는 것인 B3 프라이머,
바람직하게는, 상기 프라이머 기능은 서열 번호: 7의 프라이머 기능이다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 프라이머는 코로나바이러스 게놈, 구체적으로 SARS-CoV-2 게놈의 프라이머 기능을 제공하며, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 서열 번호: 23, 서열 번호: 24, 서열 번호: 25, 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30, 서열 번호: 31, 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35, 서열 번호: 36, 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47, 서열 번호: 48, 서열 번호: 49, 서열 번호: 50, 서열 번호: 51, 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55 및 서열 번호: 56의 그룹으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 적어도 하나의 프라이머를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법에 사용된 프라이머는 코로나바이러스 게놈, 구체적으로 SARS-CoV-2 게놈의 프라이머 기능을 제공하며,
a) 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 서열 번호: 23, 서열 번호: 24 또는 서열 번호: 25,
b) 서열 번호: 26, 서열 번호: 27, 서열 번호: 28, 서열 번호: 29, 서열 번호: 30 또는 서열 번호: 31,
c) 서열 번호: 32, 서열 번호: 33, 서열 번호: 34, 서열 번호: 35 또는 서열 번호: 36,
d) 서열 번호: 37, 서열 번호: 38, 서열 번호: 39, 서열 번호: 40, 서열 번호: 41, 서열 번호: 42, 서열 번호: 43, 서열 번호: 44, 서열 번호: 45, 서열 번호: 46, 서열 번호: 47, 서열 번호: 48, 서열 번호: 49, 서열 번호: 50 또는 서열 번호: 51, 및
e) 서열 번호: 52, 서열 번호: 53, 서열 번호: 54, 서열 번호: 55 및 서열 번호: 56의 그룹으로부터 선택된 서열에 대해 적어도 85%, 90%, 95%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 적어도 하나의 프라이머를 포함한다.
참조 서열에 대한 "서열 동일성 퍼센트 (%)"는 서열들을 정렬하고, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 필요한 경우 갭 (gaps)을 도입한 후에, 후보 서열의 뉴클레오티드가 참조 서열의 뉴클레오티드와 동일한 퍼센트로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 목적의 정렬은 예를 들어 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여, 당해 기술 내에 있는 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 대해 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열 정렬을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다.
그러나, 당업자는 샘플내 검출할 표적 서열에 따라 대체 또는 추가 프라이머 서열을 디자인하는 방법을 잘 알고 있다 (예를 들어, Jia, B., et al., 2019, Frontiers in microbiology, 10, 2860 참조).
본 발명의 방법은 연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내에 존재하는지 여부를 결정하는 단계를 포함하며, 구체적으로 샘플내 연장된 이중-가닥 DNA 서열의 존재는 샘플내 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 나타낸다. 당업자는 특히 검출할 서열이 알려져 있는 경우, 샘플내 연장된 이중-가닥 DNA 서열의 존재를 결정하기 위해 사용되는 적합한 방법을 잘 알고 있다. 따라서, 해당 목적을 위해 당업자에게 알려진 임의의 방법이 본 발명 내에서 사용될 수 있다. 그러나, 연장된 이중-가닥 DNA의 존재는 연장된 이중-가닥 DNA에 삽입되어 전문 장비로 검출 및 정량화할 수 있는 형광을 시작하는 분자를 사용하여 결정되는 것이 바람직하다. 구체적으로 핵산 분자가 표지되거나 또는 표면에 결합되는, 연장된 이중-가닥 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 분자를 사용하거나, 또는 효소 반응의 혼탁도 측정을 사용하는 것과 같은 다른 방법이 DNA의 연장을 결정하는데 사용될 수 있다.
본원에서 사용된, 용어 "표지 (label)" 또는 이의 문법적 변형은 임의의 검출 가능하거나 또는 신호-생성 분자 또는 리포터 분자를 지칭한다. 편리한 표지로는 비색, 화학발광, 발색, 방사성 및 형광 표지를 포함하지만, 효소적 (예: 비색, 발광, 발색) 또는 항체-기반 표지화 방법 또는 신호-생성 시스템이 또한 사용될 수 있다. 따라서, 본원에서 사용된 용어 "표지 (label)"는 직접 검출 가능한 신호-제공 또는 수동적 모이어티뿐만 아니라, 신호를 생성하거나 또는 신호 생성 반응에 참여하거나 또는 어떤 방식으로든 간접적으로 검출할 수 있는 임의의 모이어티를 포함한다. 본원에서 사용된 "표지된 (labelled)"은 검출 가능한 표지와 연결되거나 또는 이에 결합되는 것을 의미한다.
연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내에 존재하는지 여부를 결정하는 것은 형광 보고 (fluorescence reporting)를 통해 달성될 수 있다. 이러한 접근법의 대부분은 삽입 염료 (intercalating dyes), 예컨대 에티듐 브로마이드, SYBR Green, EvaGreen 및 YO-PRO-I의 사용에 기반한다 (Zhang X, et al. 2013, PLoS One 8(12):e82841; Mair G. et al. 2013, BMC Veterinary Research 9: 108.). 본원에서 사용된, "삽입하는 (intercalates)" 물질 또는 염료는 핵산 이중 나선으로 적층된 염기쌍들 사이에 비-공유 삽입이 가능한 물질 또는 모이어티를 지칭한다. 연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내에 존재하는지 여부를 결정하는 것은 FRET (Forster resonance energy transfer) 기전에 의존하는 형광 기술에 의해 달성될 수 있다 (Chen Q, et al., 1997, Biochemistry 36(15):4701- 11). 본 발명의 소정의 구체예에서, LPB 및/또는 LPF는 적어도 하나의 표지 및/또는 수용체 형광단으로 5' 단부에서 표지된다.
본원에서 사용된, 용어 "혼탁도 (turbidity)"는 빛이 산란되거나 또는 흡수되도록 하는 유체 또는 투명한 고체 중에 부유 및/또는 가용성 입자의 척도를 지칭한다. 본 발명의 소정의 구체예에서, 연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내에 존재하는지 여부에 대한 간접적인 결정은 본질적으로 반응 부산물로서 피로포스페이트의 형성에 의존한다. 피로포스페이트 이온은 핵산 중합 중에 DNA 가닥에 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP)를 혼입함으로써 방출될 수 있으며, 이들 이온은 반응 혼합물에 존재하는 2가 금속 이온, 구체적으로 마그네슘 이온과 반응하여 백색의 불용성 마그네슘 피로포스페이트 침전물을 생성한다 (Mori Y., et al. 2001 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 289: 150-154에 기재된 바와 같음). 이러한 침전물은 반응 용액의 혼탁도를 점진적으로 증가시키고, 피로포스페이트 침전물은 혼탁도 측면에서 정량적으로 측정될 수 있거나, 또는 원심분리 후 펠렛으로서 육안으로 관찰될 수 있다. 본 발명의 대안적인 구체예에서, 연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내에 존재하는지 여부를 결정하는 것은 반응에서 망간 이온 및 칼세인 (calcein)의 혼입을 통해 달성된다. 칼세인 형광은 망간 이온의 결합에 의해 자연적으로 퀀칭된다. 반응 부산물로서 피로포스페이트 생성은 침전을 통해 버퍼로부터 망간 이온을 제거하고, 칼세인 형광 회복과 결합된 혼탁도 증가는 가시광선 또는 UV 광선으로 여기 시에 용이한 시각적 판독을 가능하게 한다 (Tomita N., et al. 2008. Nat. Protoc. 3:877-882). 본 발명의 또 다른 구체예에서, DNA 합성 중에 생성되는 ATP로 피로포스페이트의 효소적 전환은 연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내에 존재하는지 여부를 결정하기 위해 열안정성 반딧불이 (firefly) 루시퍼라제에 의해 생성된 생물발광을 통해 모니터링한다 (Gandelman OA., et al. 2010, PLoS One 5(11): el4155).
일반적으로, Becherer, Lisa, 등 ("Loop-mediated isothermal amplification (LAMP)-review and classification of methods for sequence-specific detection." Analytical Methods 12.6 (2020): 717-746)이 기재한 모든 방법은 본 발명의 방법과 조합될 수 있다.
본 발명은 또한 코로나 과의 바이러스, 구체적으로 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)에 의해 감염된 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 환자에게 유효량의 항바이러스 치료를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 환자는 본 발명의 방법을 사용하여 코로나 과의 바이러스에 의해 감염된 것으로 이전에 결정되었다. 항바이러스 치료는 환자에게 유효량의 렘데시비르를 투여하는 단계를 포함하는 것이 바람직하다.
소정의 구체예에서, 본 발명은 코로나 과의 바이러스, 구체적으로 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)에 의해 감염된 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 환자에게 유효량의 항바이러스 치료를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 환자는 이전에 본 발명의 방법을 사용하여 코로나 과의 바이러스에 의해 감염된 것으로 결정되었다.
소정의 구체예에서, 본 발명은 환자 치료에 사용하기 위한 항바이러스 화합물에 관한 것으로서, 상기 환자는 이전에 본 발명의 방법을 사용하여 코로나 과의 바이러스, 구체적으로 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)에 의해 감염된 것으로 결정되었다.
본원에서 사용된, 용어 "항바이러스 화합물 (antiviral compound)"은 바이러스 및/또는 바이러스-관련 질병의 증상에 영향을 미치는 화합물을 지칭한다. 바이러스에 대한 효과는 특히 바이러스의 성장, 생존, 복제, 기능 및/또는 전파를 방지, 저해, 억제, 감소, 유해 영향 및/또는 방해하는 특성을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 항바이러스 화합물은 백신, 면역조절제, 심혈관 조절제, 폐기능 조절제 및 바이러스 복제 억제제의 그룹으로부터 선택된다.
일부 구체예에서, 항바이러스 화합물은 다루나비르 (darunavir), 오셀타미비르 (oseltamivir), 우미페노비르 (umifenovir), 파비피라비르 (favipiravir), 리바비린 (ribavirin), 나파모스타트 메실레이트 (nafamostat mesylate), 카모스타트 메실레이트 (camostat mesylate), 로피나비르 (lopinavir), 리토나비르 (ritonavir), 넬피나비르 (nelfinavir), 테이코플라닌 (teicoplanin), 아지트로마이신 (azithromycin), 클로로퀸 (chloroquine), 하이드록시 클로로퀸 (hydroxy chloroquine), 탈리도마이드 (thalidomide), 베바시주맙 (bevacizumab), 토실리주맙 (tocilizumab), 사릴루맙 (sarilumab), 아나킨라 (anakinra), 인터페론 (a, β, X), 로사르탄 (losartan), 코르티코스테로이드 (예: 메틸프레드니솔론), 이베르멕틴 (ivermectin), 니타족사니드 (nitazoxanide), 에메틴 (emetine), 파모티딘 (famotidin), 헤파린 (heparin), EIDD-2801 및 디피리다몰 (dipyridamole)의 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 화합물이다.
바이러스성 질환에서 이들 화합물의 용도 및 투여량은 당업자에게 알려져 있다 (예를 들어, Tarighi, P., et al., 2021, European Journal of Pharmacology, 173890 및 이에 인용된 기록 및 연구 프로토콜 참조).
본원에서 사용된, 용어 "치료 (treatment)" (및 "치료하다 (treat)" 또는 "치료하는 (treating)"과 같은 이의 문법적 변형)는 치료받는 개인의 자연 경과를 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 지칭하며, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정 중에 수행될 수 있다. 치료의 바람직한 효과에는 질병의 발생 또는 재발 방지, 증상의 완화, 질병의 임의의 직접적 또는 간접적 병리학적 결과의 감소, 전이 방지, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 예후 개선을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된, 용어 "환자 (patient)"는 포유동물, 바람직하게는 인간을 포함하는 동물을 지칭한다. 일부 구체예에서, 본원에 기재된 환자는 바이러스 감염 시에 유해 질병 진행의 위험을 증가시키는 소인을 갖는다. 일부 구체예에서, 바이러스 감염 시에 유해 질병 진행의 위험을 증가시키는 소인은 암, 만성 신장 질환, 만성 폐 질환 (예를 들어, COPD, 천식, 간질성 폐 질환, 낭포성 섬유증 및 폐 고혈압, 폐기종, 만성 기관지염, 폐 조직 손상 또는 흉터, 간질성 폐 질환), 폐 고혈압, 신경학적 병태 (예를 들어, 치매, 알츠하이머병), 당뇨병, 다운 증후군, 심장 병태 (예를 들어, 심부전, 관상 동맥 질환, 심근병증 또는 고혈압), HIV 감염, 면역저하 상태, 간 질환, 과체중, 비만, 임신, 겸상 적혈구 질환, 지중해 빈혈, 흡연, 고형 장기 이식, 혈액 줄기세포 이식, 뇌졸중, 뇌혈관 질환 및 물질 사용 장애 (substance use disorders)의 그룹으로부터 선택되는 병태이다.
본원에서 사용된, 용어 "렘데시비르 (Remdesivir)"는 약물 자체뿐만 아니라 약물의 활성 대사산물 및 이의 임의의 약학 조성물을 지칭한다. 본 발명의 바람직한 일 구체예에서, 렘데시비르는 주사 및/또는 흡입될 수 있다.
그러므로, 이전에 본 발명의 방법을 사용하여 코로나 과의 바이러스에 의해 감염된 것으로 결정된 환자는 조기 치료, 예를 들어 (중증) 증상이 발병하기 전에 예방적 치료로부터 유익을 얻을 수 있다.
소정의 구체예에서, 본 발명은 환자의 치료에 사용하기 위한 항바이러스 화합물에 관한 것으로서, 여기서 환자는 이전에 본 발명의 방법을 사용하여 코로나 과의 바이러스에 의해 감염되지 않은 것으로 결정되었으며, 바람직하게는 항바이러스 화합물은 백신이다.
본 발명의 방법은 병원체를 효과적으로 결정할 수 있고, 조기 검출, 스크리닝, 모니터링, 및/또는 과거 감염의 확인을 용이하게 한다. 이러한 검출의 용이함은 감염 치료를 개선하고, 병원체 확산을 감소시키고, 및/또는 질병 진행을 방지할 수 있다.
그러므로, 본 발명은 특히 항바이러스 치료로부터 유익을 얻는 대상체의 결정 및 항바이러스 치료의 개선을 가능하게 한다.
본 발명의 방법을 수행하기 위해, 필요한 시약을 수집하여 키트 (kit)를 제조할 수 있다. 추가 일 구체예에서, 본 발명은 키트, 구체적으로 샘플내 바이러스 RNA를 검출하는데 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 키트는 미리-결정된 RNA 서열을 검출하기 위한 하나 이상, 바람직하게는 모두 5개 또는 6개의 프라이머를 포함한다. 본 발명의 소정의 구체예에서, 키트는 RNA 및/또는 DNA 폴리머라제 활성 및 가닥-치환 활성을 제공하는 효소, 핵산 신타제, dNTP, 버퍼, 용융 온도 조절제, 반응 용기 및 설명서를 포함할 수 있다. 이러한 키트를 사용함으로써, 상기 반응 용기에 샘플을 부가하고, 상기 반응 용기를 특정 온도로 유지하는 것만으로 핵산 증폭 반응을 수행하는 것이 가능해진다.
키트는 또한 예를 들어 소광제-형광단 듀플렉스 영역 (quencher-fluorophore duplex region)을 함유하는 프라이머를 사용하여, 동일한 RNA 바이러스의 상이한 서열을 표적으로 하는 1개 초과의 프라이머 시스템, 구체적으로 2개 이상의 프라이머 시스템을 포함할 수 있다 (Tanner NA, Zhang Y, Evans TC Jr. Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification. Biotechniques. 2012;53(2):81-89.). 이러한 키트는 여러 의학적 병태의 동시 검출 및/또는 여러 RNA 바이러스 또는 바이러스의 여러 변이체의 검출에 의해 특히 유용할 수 있다. 이와 관련하여, 놀랍게도 프라이머 수의 감소는 프라이머 간섭의 감소로 인해 1개 초과의 프라이머 시스템의 유용성 개선을 가져오는 것으로 밝혀졌다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 본 발명의 키트 (문맥상 제조됨) 또는 본 발명의 방법 및 용도는 지침 매뉴얼(들)을 추가로 포함하거나, 또는 이와 함께 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 지침 매뉴얼(들)은 본 발명에 따라 본원에 제공되는 진단 용도에서 본 발명의 키트를 사용하는 방법을 당업자에게 가이드할 수 있다. 구체적으로, 상기 지침 매뉴얼(들)은 본원에 제공된 방법 또는 용도를 사용하거나 또는 적용하기 위한 가이드를 포함할 수 있다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 기술을 가진 자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 또는 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 제한하려는 의도는 아니다.
본원에 기재된 일반적인 방법 및 기술은 달리 지시하지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 당해 기술 분야에 잘 알려진 통상적인 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), and Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)을 참조한다.
본 발명의 양상이 도면 및 전술한 설명에서 상세하게 예시되고 설명되지만, 이러한 예시 및 설명은 제한적이지 않고 예시적이거나 또는 실증적인 것으로 간주되어야 한다. 하기 청구범위의 범위 및 사상 내에서 변경 및 수정이 당업자에 의해 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 구체적으로, 본 발명은 상기 및 하기에 기재된 다양한 구체예로부터의 특징들의 임의의 조합을 갖는 추가 구체예를 포함한다.
또한, 청구범위에서, 단어 "포함하는 (comprising)"은 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않으며, 부정관사 "a" 또는 "an"은 복수를 배제하지 않는다. 단일 유닛이 청구범위에 인용된 여러 특징들의 기능을 수행할 수 있다. 속성 또는 값과 관련하여 용어 "본질적으로 (essentially)", "약 (about)", "대략 (approximately)" 및 유사어는 또한 구체적으로 각각 속성을 정확하게 또는 값을 정확하게 정의한다. 청구범위에서 임의의 참조 기호는 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
도 1은 SARS-CoV-2 RNA의 카피 수가 적은 샘플에 대한 본 발명의 5 프라이머 시스템 및 6 프라이머 시스템 사이의 감수성을 비교한 것이다.
도 2는 5 프라이머 시스템 및 6 프라이머 시스템을 사용하여 신호를 결정한 후의 시간을 보여준다.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기에 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 구체예가 실시될 수 있음을 이해해야 한다.
F3이 부재한 신규한 5 프라이머 시스템은 F3이 존재하는 6 프라이머 시스템만큼 효과적으로 SARS-CoV2 RNA를 증폭한다.
프라이머
FIP CTT GCT CTT CTT CAG GTT GAC CAA GGT AAA CCT TTG (서열 번호: 1) LPF AAG AG C A GC AGA AG T G GC AC (서열 번호: 3)
BIP GGT TAG ATG ATG ATA GTC CTG ATT GTC CTC ACT GCC (서열 번호: 2) LPB CAA ACT GTT GGT CAA CAA G (서열 번호: 4)
B3 GAA CCT CAA CAA TTG TTT GAA TAG (서열 번호: 5) F3 GCC ATC AAC TCA ATA TGA GTA TG (서열 번호: 6)
프라이머 믹스: 신규한 5 프라이머 시스템
최종 농도
FIP 1.6 μM
BIP 1.6 μM
LPF 0.8 μM
LPB 0.8 μM
B3 0.4 μM
프라이머 믹스: LAMP 6 프라이머 시스템
최종 농도
FIP 1.6 μM
BIP 1.6 μM
LPF 0.8 μM
LPB 0.8 μM
B3 0.2 μM
F3 0.2 μM
프라이머/효소 믹스 (PEM)
Vol/rx
등온 마스터 믹스 15.0 μl
프라이머 믹스 2.0 μl
17.0 μl
반응당 PEM 17.0 μl를 부가한다.
주형 부가
추출된 RNA 8.0 μl를 부가한다.
네가티브 분석 대조군으로서 무-RNase H2O 8.0 μl를 부가한다.
등온 증폭 및 염료 포착을 위한 설정
주기 온도 포착 시간 램프 속도
증폭 25 65℃ 없음 27 s 4.4℃
단일 30 s 4.4℃
채널 염료 Quant 인자 용융 인자 통합 시간
염료 포착 #1, 470/514 SYBR Green I 20.00 1.2 동적
SEQUENCE LISTING <110> Ender diagnostics AG <120> Method for determining presence of a pre-determined RNA sequence in a sample <130> AB1828 PCT BS <150> EP20179109.2 <160> 56 <170> BiSSAP 1.3.6 <210> 1 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP primer <400> 1 cttgctcttc ttcaggttga ccaaggtaaa cctttg 36 <210> 2 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP primer <400> 2 ggttagatga tgatagtcct gattgtcctc actgcc 36 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPF primer <400> 3 aagagcagca gaagtggcac 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LPB primer <400> 4 caaactgttg gtcaacaag 19 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 primer <400> 5 gaacctcaac aattgtttga atag 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer <400> 6 gccatcaact caatatgagt atg 23 <210> 7 <211> 162 <212> RNA <213> Coronaviridae <220> <223> Bases 3129-3290 of Accession no. NC_045512.2 of SARS-CoV-2 <400> 7 accaaggtaa acctttggaa tttggtgcca cttctgctgc tcttcaacct gaagaagagc 60 aagaagaaga ttggttagat gatgatagtc aacaaactgt tggtcaacaa gacggcagtg 120 aggacaatca gacaactact attcaaacaa ttgttgaggt tc 162 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer sequence <400> 8 cttgctcttc ttcaggttgg attaccaagg taaacctttg 40 <210> 9 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 9 cttgctcttc ttcaggttgg attaccaagg taaacctttg g 41 <210> 10 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 10 cttgctcttc ttcaggttgg atgattacca aggtaaacct ttgg 44 <210> 11 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 11 cttgctcttc ttcaggtgat gattaccaag gtaaaccttt gg 42 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 12 cttcttcttg ctcttcttcg atgattacca aggtaaacct ttgg 44 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 13 cttcttcttg ctcttctgat gattaccaag gtaaaccttt gg 42 <210> 14 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 14 cttgctcttc ttcaggttgg gtaaaccttt ggaatttg 38 <210> 15 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 15 cttgctcttc ttcaggttgg gtaaaccttt ggaatttgg 39 <210> 16 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 16 cttgctcttc ttcaggttgg gtaaaccttt ggaatttggt 40 <210> 17 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 17 cttcttcttg ctcttcttcg gtaaaccttt ggaatttg 38 <210> 18 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 18 cttcttgctc ttcttcggta aacctttgga atttgg 36 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 19 cttcttcttg ctcttcttcg gtaaaccttt ggaatttgg 39 <210> 20 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 20 cttcttcttg ctcttcggta aacctttgga atttgg 36 <210> 21 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 21 cttgctcttc ttcaggttga ccaaggtaaa cctttgg 37 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 22 cttgctcttc ttcaggttga ccaaggtaaa cctttgga 38 <210> 23 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 23 cttgctcttc ttcaggttga ccaaggtaaa cctttggaa 39 <210> 24 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 24 cttgctcttc ttcaggttgg atgattacca aggtaaacc 39 <210> 25 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 25 cttgctcttc ttcaggttgt gattaccaag gtaaacc 37 <210> 26 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 26 tgaagagcag cagaagtggc ac 22 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 27 aagagcagca gaagtggc 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 28 gaagagcagc agaagtgg 18 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 29 ttgaagagca gcagaagtgg 20 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 30 ggtttacctt ggtaatc 17 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 31 gtttaccttg gtaatcatc 19 <210> 32 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 32 caacaaactg ttggtcaaca ag 22 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 33 acaaactgtt ggtcaac 17 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 34 gaccaacagt ttgttgac 18 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 35 caacaagacg gcagtgag 18 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer sequence <400> 36 aacaagacgg cagtgaggac 20 <210> 37 <211> 41 <212> DNA 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Claims (14)

  1. 샘플내 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 결정하는 방법으로서, 상기 방법은
    (a) RNA- 및 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성 및 가닥-치환 활성 (strand-displacement activity)의 활성들을 제공하는 하나 이상의 효소를 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 분석할 샘플에 부가하는 단계;
    (b) 단계 (a)와 동시에 또는 후속하여, 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 분석할 샘플에 적어도 5개의 DNA 프라이머를 부가하는 단계로서, 여기서 적어도 하나의 DNA 프라이머는 상기 RNA 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하고, 적어도 하나의 DNA 프라이머는 상기 RNA 서열에 역-상보적인 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 서열을 포함하는 것인 단계;
    (c) 단계 (a) 및 (b)로부터 생성된 샘플을 고정된 온도에서 인큐베이션하는 단계;
    (d) 연장된 이중-가닥 DNA 서열이 샘플내 존재하는지 여부를 결정하는 단계로서, 여기서 샘플내 연장된 이중-가닥 DNA 서열의 존재는 샘플내 미리-결정된 RNA 서열의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하고,
    상기 미리-결정된 RNA 서열은 RNA 바이러스의 일부이며, F3 프라이머는 사용하지 않는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 적어도 5개의 프라이머 중 4개의 프라이머는 각각 정방향 내부 프라이머 (forward inner primer: FIP), 역방향 내부 프라이머 (backward inner primer: BIP), 루프 프라이머 정방향 (loop primer forward: LPF) 및 루프 프라이머 역방향 (loop primer backwards: LPB)인 방법.
  3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 제5 프라이머는 B3 프라이머인 방법.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, RNA-의존성 DNA 폴리머라제 활성을 갖는 효소는 역전사효소 및/또는 역전사효소 활성을 갖는 DNA 폴리머라제인 방법.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, RNA 바이러스는 단일-가닥 RNA 바이러스인 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, RNA 바이러스는 코로나바이러스 (coronavirus)인 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 코로나바이러스는 α-CoV, β-CoV, γ-CoV 또는 δ-CoV 속 (genus)인 방법.
  8. 청구항 6 또는 7에 있어서, 코로나바이러스는 인간 코로나바이러스 OC43 (HCoV-OC43), 인간 코로나바이러스 HKU1 (HCoV-HKU1), 인간 코로나바이러스 229E (HCoV-229E), 인간 코로나바이러스 NL63 (HCoV-NL63, New Haven coronavirus), 중동 호흡기 증후군-관련 코로나바이러스 (MERS-CoV 또는 "novel coronavirus 2012"), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 (SARS-CoV 또는 "SARS-classic"), 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2 또는 "novel coronavirus 2019")로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 고정 온도는 50 내지 75℃인 방법.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)의 샘플을 1 내지 120분 동안 인큐베이션하는 방법.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 바이러스는 코로나 바이러스이고, 하나 이상의 프라이머는 하기 서열을 포함하는 방법:
    (f) FIP 프라이머 서열: CTT GCT CTT CTT CAG GTT GAC CAA GGT AAA CCT TTG; 및/또는
    (g) BIP 프라이머 서열: GGT TAG ATG ATG ATA GTC CTG ATT GTC CTC ACT GCC; 및/또는
    (h) LPF 프라이머 서열: AAG AGC AGC AGA AGT GGC AC; 및/또는
    (i) LPB 프라이머 서열: CAA ACT GTT GGT CAA CAA G; 및/또는
    (j) B3 프라이머 서열: GAA CCT CAA CAA TTG TTT GAA TAG.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 샘플내 연장된 이중-가닥 DNA 서열의 존재는 연장된 이중-가닥 DNA 서열에 혼성화할 수 있는 핵산 분자를 사용하여 결정하고, 구체적으로 상기 핵산 분자는 연장된 이중-가닥 DNA 서열에 삽입되는 분자를 사용하거나 또는 혼탁도 측정 (turbidity measurement)을 사용하여 표지되는 방법.
  13. 청구항 6 내지 12 중 어느 한 항의 방법을 사용하여 코로나과 (corona family) 바이러스에 의해 감염된 것으로 이전에 결정된 환자의 치료에 사용하기 위한 항바이러스 화합물 (antiviral compound).
  14. 청구항 13에 있어서, 항바이러스 화합물은 렘데시비르 (Remdesivir)를 포함하는 항바이러스 화합물.
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