KR20170022854A - Lamp를 이용한 인플루엔자 검출용 프라이머 및 그 용도 - Google Patents

Lamp를 이용한 인플루엔자 검출용 프라이머 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 A형 인플루엔자, A형 인플루엔자 H3, A형 인플루엔자 pdm H1N1, B형 인플루엔자를 등온증폭 방식으로 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물 또는 키트, 및 이를 이용한 인플루엔자 바이러스 검출 방법을 개시한다. 본원에 따른 프라이머 및 방법은 높은 민감도와 특이성으로 신속하게 인플루엔자 바이러스 감염여부를 검출할 수 있으며, 증폭종결 후 별도의 처리 없이 검출이 가능하여 편리성이 증대된다.

Description

LAMP를 이용한 인플루엔자 검출용 프라이머 및 그 용도 {Primers used for LAMP reaction for the detection of influenza viruses and its use}
본원은 LAMP 방식을 이용한 인플루엔자 검출용 프라이머 및 그 용도와 관련된 기술이다.
인플루엔자 바이러스는 전세계적으로 인류에게 심각한 치명상을 입히며 이로 인한 경제적 손실 또한 막대한 의학적으로 중요한 병원성 바이러스이다. A 및 B형의 인플루엔자 바이러스는 Orthomyxoviridae에 속하며, 유전체는 8개로 분절된 네가티브 센스의 단일가닥 RNA 바이러스(Webster et al. 1992; Fouchier et al. 2005)이며, 15개의 헤마글루티닌 타입과 9개의 뉴라미다제 서브타입이 포함된다.
이 중 인간에서 단지 3개의 헤마글루틴 서브타입 (H1 내지 H3)과 2개의 뉴라미다제 서브타입 (N1 및 N2) 만이 안정적인 계통이 확립되었을 뿐이다 (Webby, R. J., and R. G. Webster. 2003. Are we ready for pandemic influenza? Science 302:1519-1522; Nicholson, K. G., Wood, J. M., & Zambon, M. (2003). Influenza. Lancet, 362 (9397), 1733-1745).
인플루엔자 바이러스의 강한 전염성으로 인해, 인접한 지역으로 신속하게 확산되기 때문에, 조기 규명, 검출이 질환 대책을 세우는데 있어 매우 중요하다.
현재 인플루엔자 바이러스 검출을 위해 다양한 분자생물학적 기법을 이용한 검출 방법이 개발되어 있다.
미국 공개공보 2015-0184255는 인플루엔자 바이러스 핵산 검출 시스템 및 방법에 관한 것으로, 임상 시료에 존재하는 인플루엔자 바이러스 핵산을 HDA 등온증폭 및 측방유동 분석을 이용하여 검출하는 기술을 개시하고 있다.
미국 특허 8,389,221호는 H5 또는 H7 조류 인플루엔자 바이러스 검출 방법을 개시하고 있다.
하지만 민감도 및 특이성이 보다 높아 효과적 검출이 가능한 새로운 기술에 기반한 다양한 종류의 인플루엔자 바이러스 검출 방법이 필요하다.
본원은 높은 민감도와 특이성을 나타내면서도 신속하고 간편하게 인플루엔자 바이러스 감염여부를 검출할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.
한 양태에서 본원은 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스 검출용 LAMP 분석용 프라이머 세트를 제공한다: 각각 서열번호 1 내지 4의 서열번호로 표시되는 4개의 프라이머, 각각 서열번호 7 내지 10로 표시되는 4개의 프라이머, 또는 각각 서열번호 13 내지 16으로 표시되는 4개의 프라이머를 포함하는 A형 인플루엔자 H3 특이적 프라이머 세트; 각각 서열번호 19 내지 22으로 표시되는 4개의 프라이머, 각각 서열번호 21, 22, 25 및 26으로 표시되는 4개의 프라이머, 또는 각각 서열번호 29 내지 32로 표시되는 4개의 프라이머를 포함하는 A형 인플루엔자 pdm H1N1 특이적 프라이머 세트; 각각 서열번호 35 내지 38로 표시되는 4개의 프라이머, 각각 서열번호 41 내지 44로 표시되는 4개의 프라이머, 또는 각각 서열번호 47 내지 50으로 표시되는 4개의 프라이머를 포함하는 A형 공통 인플루엔자 특이적 프라이머 세트; 및 각각 서열번호 52 내지 55로 표시되는 4개의 프라이머, 각각 서열번호 58 내지 61로 표시되는 4개의 프라이머, 각각 서열번호 64 내지 67로 표시되는 4개의 프라이머, 또는 각각 서열번호 70 내지 73으로 표시되는 4개의 프라이머를 포함하는 B형 인플루엔자 특이적 프라이머 세트.
본원에 따른 프라이머 세트는 상이한 유전자 형의 인플루엔자 바이러스를 신속하고 정확하게 높은 민감도로 검출할 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 프라이머는 RNA를 주형으로 사용하는 RT-LAMP에 사용될 수 있으며, 상기 각 프라이머 세트는 추가로 2개의 프라이머를 포함하는 프라이머 세트를 추가로 포함할 수 있다. 일 구현예에서 본원의 A형 인플루엔자 H3 특이적 각 프라이머 세트는 서열번호 5 및 6, 서열번호 11 및 12, 또는 서열번호 17 및 18로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 특히 서열번호 1 내지 4로 표시되는 프라이머 세트는 서열번호 5 및 6, 서열번호 7 내지 10으로 표시되는 프라이머 세트는 서열번호 11 및 12, 및 서열번호 13 내지 16으로 표시되는 프라이머 세트는 서열번호 17 및 18의 프라이머를 더 포함하며; 상기 각 A형 인플루엔자 pdm H1N1 특이적 프라이머 세트는 서열번호 23 및 24, 서열번호 27 및 28, 또는 서열번호 33 및 34로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 특히 서열번호 19 내지 22로 표시되는 프라이머 세트는 서열번호 23 및 24, 서열번호 21, 22, 25 및 26으로 표시되는 프라이머 세트는 서열번호 27 및 28의 프라이머, 서열번호 29 내지 32로 표시되는 프라이머 세트는 서열번호 33 및 34의 프라이머를 더 포함하며; 상기 각 A형 공통인플루엔자 특이적 프라이머 세트는 서열번호 39 내지 40, 서열번호 45 내지 46, 또는 서열번호 51 내지 46으로 표시되는 프라이머를 포함하는 프라이머 세트, 특히 서열번호 35 내지 38로 표시되는 프라이머 세트는 서열번호 39 및 40, 서열번호 41 내지 44로 표시되는 프라이머 세트는 서열번호 45 및 46, 서열번호 47 내지 50으로 표시되는 프라이머 세트는 서열번호 51 및 46의 프라이머를 더 포함하며; 및 상기 B형 인플루엔자 특이적 프라이머 세트는 서열번호 56 및 57, 서열번호 62 및 63, 서열번호 68 및 69, 또는 서열번호 74 및 75로 표시되는 프라이머, 특히 서열번호 52 내지 55로 표시되는 프라이머 세트는 서열번호 56 및 57, 서열번호 58 내지 61로 표시되는 프라이머 세트는 서열번호 62 및 63, 서열번호 64 내지 67로 표시되는 프라이머 세트는 서열번호 68 및 69, 또는 서열번호 70 내지 73으로 표시되는 프라이머 세트는 서열번호 74 및 75의 프라이머를 추가로 포함한다.
본원에 따른 프라이머는 증폭신호의 검출 방식에 따라 하나 이상의 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 개시된 프라이머 세트를 사용한 인비트로에서 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법으로, 상기 방법은 인플루엔자 바이러스 검출이 필요한 대상체의 시료를 제공하는 단계; 본원에 따른 프라이머 세트 중 어느 하나를 제공하는 단계; 상기 시료 및 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 반응을 수행하는 단계; 및 상기 LAMP 반응 결과물을 분석하고 이를 대조군 시료와 비교하여 차이가 있는 경우, 이를 인플루엔자 감염으로 판정하는 단계를 포함한다.
일 구현예에서 본원에 따른 LAMP 반응은 RT-LAMP로 수행될 수 있다.
본원에 따른 프라이머 세트 또는 이를 이용한 방법은 인플루엔자 바이러스가 검출될 수 있는 다양한 시료 예를 들면 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 소변, 타액, 눈물, 또는 코인두(nasal pharynx) 분비물을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 방법에서 LAMP 반응 결과의 분석은 상기 반응물의 색변화 측정 및/또는 탁도(turbidity) 측정을 통해 결정될 수 있어 그 편리성이 증대된다.
다른 양태에서 본원은 또한 본원에 따른 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물 또는 키트를 제공한다.
본원에 따른 A형 인플루엔자, A형 인플루엔자 H3, A형 인플루엔자 pdm H1N1, B형 인플루엔자를 등온증폭 방식으로 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트, 이를 포함하는 조성물 또는 키트, 및 이를 이용한 인플루엔자 바이러스 검출 방법은 높은 민감도와 특이성은 물론 신속하게 인플루엔자 바이러스 감염여부를 검출할 수 있으며, 특히 증폭종결 후 전기영동과 같은 별도의 처리 없이 바로 검출이 가능하여 편리성이 증대된다.
도 1은 서열번호 7 내지 12의 A형 인플루엔자 H3 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이성을 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 2는 서열번호 21, 22, 및 25 내지 28의 A형 인플루엔자 pdm H1N1 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이성을 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 3은 서열번호 58 내지 63의 B형 인플루엔자 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이성을 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 4는 서열번호 35 내지 40의 A형 공통 인플루엔자 특이적 LAMP 프라이머 세트의 특이성을 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 5는 서열번호 7 내지 12의 A형 인플루엔자 H3 특이적 LAMP 프라이머 세트의 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 6은 서열번호 35 내지 40의 A형 공통 인플루엔자 특이적 LAMP 프라이머 세트의 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 7은 서열번호 21, 22 및 25 내지 28의 A형 인플루엔자 pdm H1N1 특이적 LAMP 프라이머 세트의 민감도를 색변화 및 아가로스젤 전기영동으로 검출한 결과이다.
도 8은 A형 인플루엔자 H3형을 검출할 수 있는 기존 프라이머를 제작하여 RT-PCR을 수행하여 전기영동한 결과이다.
도 9는 A형 인플루엔자 H3 특이적 LAMP 프라이머 서열번호 1~6의 프라이머 세트와 서열번호 13-18 세트의 민감도를 색변화로 비교 검출한 결과이다. 서열번호 1~6의 프라이머 세트는 20의 민감도를 나타내었으며 서열번호 13~18의 프라이머 세트는 2-6의 민감도를 나타내었다.
도 10은 A형 인플루엔자 H3 특이적 LAMP 프라이머 서열번호 7~12의 프라이머 세트와 서열번호 13~18세트의 민감도를 색변화로 비교 검출한 결과이다. 서열번호 7~12의 프라이머 세트는 2ng의 민감도를 나타내었으며 서열번호 13~18의 프라이머세트는 0.4ng의 민감도를 나타내었다.
도 11은 A형 인플루엔자 pdm H1N1 특이적 LAMP 프라이머 서열번호 19~24의 프라이머 세트와 서열번호 25~28의 프라이머 세트의 민감도를 색변화로 비교 검출한 결과이다. 서열번호 19~24의 프라이머세트와 서열번호 25~28세트는 Matrix 유전자 서열을 사용하여 프라이머를 제작하였다. 상기 두 세트의 F3와 B3는 동일 프라이머를 사용하였고 FIP, BIP, LF, LB 서열의 일부를 변경하였다. 서열번호 19~24의 프라이머세트의 경우 2-4의 민감도를 나타내고 서열번호 25~28(서열번호 21, 22포함)세트의 경우 2-8의 민감도를 나타내었다.
도 12는 A형 인플루엔자 pdm H1N1 특이적 LAMP 프라이머 서열번호 25~28(서열번호 21 및 22 포함)세트와 서열번호 29~34세트의 민감도를 색변화로 비교 검출한 결과이다. 서열번호 21, 22 및 25~28의 프라이머 세트는 Matrix 유전자 부위에서 프라이머를 디자인하였으며 서열번호 29~34세트는 HA 유전자 부위에서 프라이머를 디자인하였다. 서열번호 21, 22 및 25~28의 프라이머 세트와 서열번호 29~34세트는 0.08ng의 민감도를 나타내었다.
도 13은 A형 공통 인플루엔자 특이적 LAMP 프라이머 서열번호 35~40의 프라이머 세트와 서열번호 41~46의 프라이머 세트의 민감도를 색변화로 비교 검출한 결과이다. 서열번호 35~40의 프라이머 세트는 2ng의 민감도를 나타내었고 서열번호 41~46의 프라이머 세트는 0.4ng의 민감도를 나타내었다.
도 14는 A형 공통 인플루엔자 특이적 LAMP 프라이머 서열번호 41~46의 프라이머 세트와 서열번호 46 및 47~51의 프라이머 세트의 민감도를 색변화로 비교 검출한 결과이다. 서열번호 41~46의 프라이머 세트와 서열번호 46 및 47~51의 프라이머 세트는 Matrix 유전자의 유사 부위에서 프라이머를 디자인하여 LB 프라이머를 제외하고 염기 서열상 일부(프라이머 당 5bp이내) 차이를 나타낸다. A/Brisbane/59/2007(H1N1) 샘플에서는 서열번호 41~46의 프라이머 세트, 서열번호 46 및 47~51의 프라이머 세트에서 동일하게 0.4ng의 민감도를 나타내었다. A/Korea/01/09(H1N1 pdm) 샘플에서는 서열번호 41~46의 프라이머 세트의 경우 0.4ng의 민감도를 나타내었으나 서열번호 46, 47~51의 프라이머 세트의 경우 2ng의 민감도를 나타내었다.
도 15는 B형 인플루엔자 특이적 LAMP 프라이머 서열번호 52~57의 프라이머 세트, 서열번호 58~63의 프라이머와 서열번호 64~69의 프라이머 세트의 민감도를 색변화로 비교 검출한 결과이다. 서열번호 52~57의 프라이머 세트와 서열번호 64~69의 프라이머 세트는 NEP NS1 유전자 부위에서 디자인한 프라이머이며 서열번호 58~63의 프라이머 세트는 HA 유전자 부위에서 디자인한 프라이머이다. 서열번호 52~57의 프라이머 세트와 서열번호 58~63의 프라이머 세트는 80pg의 민감도를 나타내었고 서열번호 64~69세트는 16pg의 민감도를 나타내었다.
도 16은 B형 인플루엔자 특이적 LAMP 프라이머 서열번호 58~63의 프라이머 세트와 서열번호 70~75의 프라이머 세트의 민감도를 색변화로 비교 검출한 결과이다. HA 유전자 부위의 다른 프라이머 세트 서열번호 70~75의 프라이머 세트를 추가로 디자인한 것이다. 기존의 HA 유전자 부위의 서열번호 58~63세트는 2ng의 민감도를 나타내었고 서열번호 70~75번은 0.4ng의 민감도를 나타내었다.
본원은 LAMP 방식을 이용하여 인플루엔자를 핵산 수준에서 높은 정확도와 민감도로 용이하게 검출할 수 있다는 발견에 근거한 것으로, 본원은 A형 인플루엔자, A형 인플루엔자 H3, A형 인플루엔자 pdm H1N1, B형 인플루엔자를 LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification, 루프 매개 등온 증폭방법)으로 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트 및 그 용도에 관한 것이다. 본원에 따른 프라이머 세트는 그 용도로서, 이를 포함하는 조성물 또는 키트, 및 상기 프라이머 세트 또는 조성물 또는 키트를 이용한 인플루엔자 바이러스 검출 방법에 관한 것이다.
한 양태에서 본원은 A형 인플루엔자, A형 인플루엔자 H3, A형 인플루엔자 pdm H1N1, B형 인플루엔자를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 분석용 프라이머 세트에 관한 것이다.
본원에서 사용된 용어 "프라이머"는 단일가닥의 올리고뉴클레오타이드로 폴리머라제를 이용한 핵산 증폭 또는 합성 반응에서 그 3‘ 말단에 뉴클레오타이드가 공유결합에 의해 추가되어 연장되는 핵산 분자를 일컫는 것이다. 본원에 따른 프라이머 세트는 핵산의 증폭 즉 LAMP 분석 또는 RT-LAMP 분석에 사용되는 것이다.
본원에서 용어 "핵산"은 단일가닥 또는 이중 가닥의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 임의의 형태의 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하는 RNA 또는 DNA 분자 또는 그 유사체 및 그 유도체를 일컫는 것이다. 본원에 따른 프라이머 세트가 사용되는 인플루엔자 바이러스의 핵산은 인플루엔자 바이러스 유래의 RNA, 예를 들면 유전체의 전부 또는 일부를 포함하고, 또는 이에 상응하는 DNA를 포함하는 것이다.
본원에서 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 혼용되어 사용되며, 어느 하나는 양자를 모두 포함하는 것이다. 용어 "프라이머"도 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"와 혼용되어 사용될 수 있으며, 핵산(RNA or DNA), 앱타머 등을 포함하는 것이다.
본원에서 용어 "검출"은 인플루엔자 바이러스의 감염 여부, 또는 감염된 대상체의 예후를 판정하는 것, 감염 후 치료 후 재발 여부 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "표적" 또는 "표적 핵산"은 본원의 프라이머 세트가 결합하여 본원에 따른 프라이머 세트에 의해 특이적으로 증폭되는 핵산 서열을 일컫는 것으로, RNA 또는 DNA를 포함하는 것이다.
본원에 따른 프라이머는 표적 핵산에 상보성을 통해 특이적으로 결합을 하고 LAMP 방식으로 표적 핵산을 증폭한다. LAMP (Loop Mediated Isothermal Amplification)는 등온조건에서 높은 민감도와 특이성으로 표적 핵산을 증폭할 수 있는 핵산 증폭 방법 (Notomi, T. et al. 2000.Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA. Nucleic Acids Res 28, E63)으로 가닥교체 (strand displacement) 활성을 갖는 DNA 폴리머레이즈 및 표적 핵산의 여러 부위에서 특이적으로 고안된 최소 4개의 프라이머 세트 (한국 특허 제612551호 등 참고)를 표준 방법으로 하여, 6개의 프라이머 세트를 이용한 방법 (Nagamine, K. et al. 2002. Accelerated reaction by Loop mediated isothermal amplification using loop primers. Mol Cell Probes 16, 223-9 등 참고), 그리고 역전사 방식의 LAMP (Yoshida, N. et al. 2007. Simple differentiation method of mumps Hoshino vaccine strain from wild strains by RT-LAMP. Vaccine 25, 1281-6 등 참고)를 모두 포함하는 것이다.
본원에서 용어 "상보적" 또는 "상보성"은 소정의 혼성화(교잡), 결합 또는 어닐링 조건에서 프라이머 또는 올리고뉴클레오타이드가 표적 핵산에 와슨-크릭 염기의 페어링을 통해 서열 특이적으로 결합할 수 있는 상태를 일컫는 것으로, 부분적 상보성, 실질적으로 상보성(substantially complementary) 및 완전 상보성(perfectly complementary)인 것을 모두 포함한다. 실질적으로 상보성이란, 두 가닥의 핵산 서열이 서로 완전히 상보적인 것은 아니지만, 표적 핵산에 결합하여 본원에 따른 효과 즉 표적 서열을 LAMP 방식을 통해 증폭할 수 있는 정도의 상보성을 의미하는 것이다.
본원에서 사용된 용어 "교잡" 또는 "혼성화"는 두 가닥의 상보적 핵산분자가 수소결합을 통해 서열특이적인 복합체를 형성하는 반응을 의미하는 것이다. 교잡은 본원에 따른 프라이머가 사용되는 LAMP 반응에서 프라이머가 표적 핵산 또는 주형(template)의 결합하는 단계를 구성할 수 있다. 교잡의 정도는 이에 관여하는 임의의 두 개의 핵산 분자의 상보성 정도, 이들의 변성 온도(melting temperature, Tm) 또는 교잡의 엄격도(stringency)와 같은 다양한 인자에 의해 영향을 받는다. 교잡 반응 조건도 이를 고려하여 결정될 수 있다. 교잡 반응의 엄격도는 서로 교잡하고자하는 임의의 두 개의 핵산 분자가 얼마나 용이하게 결합할 수 있는 지를 결정하는 조건으로, 상보성, 반응 온도, 이온 강도 및/또는 교잡 반응액에 포함되는 일반적인 물질의 농도 및 종류에 따라 결정될 수 있으며, 예를 들면 J. Sambrook and D. W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 4th Ed., 2012; and F. M. Ausubel, Ed., Short Protocols in Molecular Biology, Wiley; 5th Ed, 2002 등에 기재된 것을 참고 할 수 있다.
본원에서 특이적 결합 또는 교잡은 특정 핵산 분자 또는 프라이머가 표적이 아닌 다른 핵산 이외의 핵산에는 실질적으로 결합하지 않고 표적 핵산에만 결합하는 것을 의미한다. 본원에 따른 프라이머는 높은 엄격도 조건에서 본원에 따른 표적인 인플루엔자 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합할 수 있으며, 주형 기반의 DNA 합성에서 프라이머 서열 길이, 완충액, 핵산 종류, pH, 마그네슘 농도 및 반응온도 등을 고려하여 결정할 수 있을 것이다.
본원에 따른 프라이머는 A형 인플루엔자 H3 및 pdm H1N1 타입(또는 pdm H1N1 2009, 신종플루), B형 인플루엔자, 그리고 타입에 관계없이 A형 인플루엔자를 LAMP 방식을 통해 특이적으로 검출할 수 있도록 디자인 된 것으로, 각 표적 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합한다. 일 구현예에서, 본원에 따른 프라이머 세트는 HA(Hemagglutinin) 유전자, Matrix 유전자 및 NA(Neuraminidase) 유전자 부위를 특이적으로 인식하여 높은 민감도로 바이러스를 검출할 수 있도록 디자인 되었다.
상술한 바와 같이 LAMP 반응 또는 RT-LAMP 에는 최소 4개의 다음과 같은 프라이머가 사용된다: FIP (forward inner primer), BIP (backward inner primer), F3 (forward outer primer) 및 B3 (backward outer primer). 그리고 신속한 반응을 위해 LF (Loop F) 및 LB (Loop B)를 추가로 포함하여 총 6개의 프라이머가 사용될 수 있다. 각 F3 프라이머, B3 프라이머, FIP 프라이머, BIP 프라이머, LF 프라이머, 및 LB 프라이머의 특징 및 기능에 대하여 앞서 언급한 문헌 Notomi et al., 2000 and Nagamine et al., 2002을 참고할 수 있다.
본원에 따른 표적 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합하는 프라이머는 길이가 최소 10 뉴클레오타이드이며, F3와 B3의 경우 최소 10 뉴클레오타이드이며, FIP와 BIP의 경우 최소 25 뉴클레오타이드이며, LF와 LB의 경우 최소 15 뉴클레오타이드이다. 표적 핵산의 상응하는 부분과 최소 70%의 상보성, 특히 80% 상보성, 더욱 90% 상보성, 더더욱 특히 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 가진다.
일구현예서 본원에 따른 프라이머는 서열번호 1 내지 75로 표시되는 프라이머 및 이와 실질적으로 동일한 것을 포함하며, 표적 핵산 또는 그 상보서열에 특이적으로 결합한다. 실질적으로 동일한 서열의 프라이머는 서열번호 1 내지 75로 표시되는 프라이머와 70%의 상보성, 특히 80% 상보성, 더욱 특히 90% 상보성, 더더욱 특히 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 가진다. FIP 및 BIP의 경우, 후술하는 바와 같이 각각 표적핵산 및 그 상보서열에 결합하는 두 가지의 서열이 표적 핵산에 결합하지 않는 링커에 의해 연결될 수 있으며 이 경우 상보성은 링커 부분을 제외한 부분과 상보성을 의미하는 것이다.
본원에 따른 LAMP 프라이머는 표적인 A형 인플루엔자 H3 및 pdm H1N1 타입, B형 인플루엔자, 그리고 타입에 관계없이 A형 인플루엔자 핵산에 특이적으로 결합한다.
일 구현예에서 본원에서 A형 인플루엔자를 특이적으로 검출할 수 있는 LAMP 프라이머 세트는 서열번호 1, 7, 13, 19, 25, 29, 35, 41 또는 47로부터 선택되는 FIP, 서열번호 2, 8, 14, 20, 26, 30, 36, 42 또는 48로부터 선택되는 BIP, 서열번호 3, 9, 15, 21, 31, 37, 43 또는 49로부터 선택되는 F3 및 서열번호 4, 10, 16, 22, 32, 38, 44 또는 50으로부터 선택되는 B3를 포함한다. 다른 구현예에서 A형 인플루엔자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 1, 7, 13, 19, 25, 29, 35, 41 또는 47로부터 선택되는 FIP, 서열번호 2, 8, 14, 20, 26, 30, 36, 42 또는 48로부터 선택되는 BIP, 서열번호 3, 9, 15, 21, 31, 37, 43 또는 49로부터 선택되는 F3, 서열번호 4, 10, 16, 22, 32, 38, 44 또는 50으로부터 선택되는 B3, 서열번호 5, 11, 17, 23, 27, 33, 39, 45 또는 51로부터 선택되는 LF 및 서열번호 6, 12, 18, 24, 28, 34, 40, 또는 46으로부터 선택되는 LB를 포함한다.
일 구현예에서 LAMP 방식으로 A형 인플루엔자 H3를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 1-4 세트, 서열번호 7-10 세트, 서열번호 13-16 세트 또는 이와 실질적으로 동일한 서열로 표시되는 서열의 프라이머 세트를 포함한다. 다른 구현예에서 LAMP 방식으로 A형 인플루엔자 H3를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 1-6 세트, 서열번호 7-12 세트, 서열번호 13-18 세트 또는 이와 실질적으로 동일한 서열로 표시되는 서열의 프라이머 세트를 포함한다.
일 구현예에서 LAMP 방식으로 A형 인플루엔자 pdm H1N1을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 19-22 세트, 서열번호 21, 22 및 25-26 세트, 서열번호 29-32 세트 또는 이와 실질적으로 동일한 서열로 표시되는 서열의 프라이머 세트를 포함한다. 다른 구현예에서 A형 인플루엔자 pdm H1N1를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 19-24 세트, 서열번호 21, 22 및 25-28 세트, 서열번호 29-34 세트 또는 이와 실질적으로 동일한 서열로 표시되는 서열의 프라이머 세트를 포함한다. 서열번호 19~24 세트와 서열번호 25~28 세트는 Matrix 유전자 서열을 사용하여 프라이머를 제작하였다.
일 구현예에서 LAMP 방식으로 A형 인플루엔자를 타입과 관련없이 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 35-38 세트, 서열번호 41-44 세트, 서열번호 47-50세트 또는 이와 실질적으로 동일한 서열로 표시되는 서열의 프라이머 세트를 포함한다. 또한 다른 구현예에서 A형 인플루엔자를 타입과 관련없이 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 35-40 세트, 서열번호 41-46 세트, 서열번호 46 및 47-51 세트 또는 이와 실질적으로 동일한 서열로 표시되는 서열의 프라이머 세트를 포함한다. 서열번호 41~46 세트와 서열번호 46 및 47~51 세트는 Matrix 유전자의 유사 부위에서 프라이머를 디자인하여 LB 프라이머를 제외하고 염기 서열상 일부(프라이머 당 5bp이내) 차이를 나타낸다.
일 구현예에서 LAMP 방식으로 B형 인플루엔자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 52-55 세트, 서열번호 58-61 세트, 서열번호 64-67 세트, 서열번호 70-73 세트 또는 이와 실질적으로 동일한 서열로 표시되는 서열의 프라이머 세트를 포함한다. 또한 다른 구현예에서 B형 인플루엔자를 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 세트는 서열번호 52-57 세트, 서열번호 58-63 세트, 서열번호 64-69 세트, 서열번호 70-75 세트 또는 이와 실질적으로 동일한 서열로 표시되는 서열의 프라이머 세트를 포함한다. 서열번호 52~57 세트와 서열번호 64~69 세트는 NEP NS1 유전자 부위에서 디자인한 프라이머이며 서열번호 58~63 세트 및 서열번호 70~75세트는 HA 유전자 부위에서 디자인한 프라이머이다.
본원에 따른 프라이머 및 이를 포함하는 조성물 또는 키트 및 방법은 인플루엔자 바이러스의 검출이 필요한 임의의 생물학적 시료의 분석에 사용될 수 있다.
일 구현예에서 생물학적 시료는 전형적으로 인간을 포함하는 포유류의 액상 또는 세포 또는 조직 시료이다. 본원에서 사용될 수 있는 시료는 예를 들면 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 소변, 타액, 눈물, 코인두 분비물, 모유를 포함하나 이로 제한하는 것이다. 또한 상기 혈액, 세포 또는 조직의 분획 또는 유도물을 포함하는 것이다. 세포 또는 조직을 이용하는 경우, 세포 자체 또는 세포 또는 조직의 융해물이 사용될 수 있다.
일 구현예에서 인플루엔자 바이러스 검출이 필요한 대상체 유래로서, 이러한 대상체는 인플루엔자 바이러스 검출이 필요하거나 필요할 것으로 예상되는 대상체 유래의 시료를 포함하는 것이다.
다른 구현예에서 생물학적 시료로는 건조된 형태의 액상 또는 조직시료가 사용될 수 있다.
또한 이러한 생물학적 시료는 검사 직전에 인플루엔자 검출이 필요한 통상의 시료 수득방법에 의해 대상체로부터 직접 수득한 것이거나 또는 종전에 분리되어 보관된 것일 수 있다.
다른 구현예에서는 인플루엔자 검출이 필요한 대상체에서 수득한 조직/세포 또는 인비트로 세포 배양물이 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니다.
본원에 따른 일 구현예에서는 코인두 분비물이 직접 또는 이로부터 핵산이 분리하여 사용된다.
또 다른 구현예에서 생물학적 시료는 상술한 액상 또는 조직시료로부터 분리된 핵산이 시료로서 사용될 수 있다. 분리란 핵산이 포함되어 있던 시료로부터의 분리된 것으로, 다양한 순도로 분리된 것을 포함하는 것이다.
본원에 따른 프라이머 및 이를 포함하는 조성물 또는 키트 및 방법은 인플루엔자 바이러스가 존재할 가능성이 있는 임의의 생물학적 시료를 사용한 LAMP 방식으로 분석에 사용된다.
LAMP 분석을 위한 반응에는 본원에 따른 프라이머 세트, dNTPs, 완충액, 마그네슘 및 DNA 폴리머라제 및 인플루엔자 검출이 필요한 생물학적 시료가 사용된다. 또한 반응을 향상시키기 위한 베타인 또는 DMSO와 같은 물질을 추가로 포함할 수 있다.
인플루엔자 바이러스는 RNA 바이러스이다. LAMP 방식에서 RNA를 주형으로 사용하고자 하는 경우에는 LAMP 분석 반응물에 역전사효소를 추가로 포함하여 RT-LAMP를 수행할 수 있다.
반응물에 포함되는 프라이머 세트는 앞서 설명한 바와 같으며, 4개 또는 6개의 프라이머 세트가 사용될 수 있다.
마그네슘은 마그네슘 아세테이트, 마그네슘 클로라이드 또는 마그네슘 설페이트와 같은 염의 형태로 사용된다.
완충액은 예를 들면 소디움포스페이트 완충액, 포타슘포스페이트 완충액, Tris-HCl 완충액 또는 Tricine 완충액 같은 것이 사용될 수 있다.
반응에 사용될 수 있는 DNA 폴리머라제는 호열성 미생물 유래의 폴리머라제로서, 특히 5‘->3’ 엑소뉴클리아제 기능이 결여된 폴리머라제를 포함한다. 비제한적 예로는 Bacillus stearothermophilus, Bst, DNA 폴리머라제; Thermus, thermophilus, Tth, DNA 폴리머라제; Thermus aquaticus, Taq, DNA 폴리머라제; Thermococcus litoralis DNA 폴리머라제; Pyrococcus furiosus, Pfu, DNA 폴리머라제; 및 Bacillus caldotenax DNA 폴리머라제를 포함한다.
반응에 사용될 수 있는 역전사효소의 비제한적 예로는 Moloney murine leukemia virus, MMLV, 역전사효소 및 avian myeloblastosis virus, AMV, 역전사효소를 포함한다.
또한 반응물에는 dNTP 대신에 뉴클레오타이드 유사체 (analog)가 또한 사용될 수 있다. 뉴클레오타이드 유사체는 변형되거나 또는 자연에서 발견되지 않는 것으로 주형 유도된 DNA 합성 과정에서 천연의 뉴클레오타이드와 함께 또는 단독으로 중합될 수 있는 것이다. 이러한 와슨 크릭 베이스 페어링을 통해 중합될 수 있는 유사체로 뉴클레오타이드 베이스의 유사를 포함하는 것은 예를 들면 치환된 퓨린 또는 피리미딘, 데아자퓨린, 메틸퓨린, 메틸피리미딘, 아미노퓨린, 아미노피리미딘, 티오퓨린, 티오피리미딘, 인돌, 피롤, 7-데아자구아닌, 7-메틸구아닌, 하이포잔틴, 쉐도사이토신, 쉐도아이소사이토신, 아이소사이토신, 아이소구아닌, 2-티오피리미딘, 4-티오티민, 6-티오구아닌, 니트로피롤, 니트로인돌 및 4-메틸인돌을 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 치환된 데옥시리보스 유사체를 포함하는 뉴클레오타이드는 치환 또는 비치환된 아라비노스, 치환 또는 비치환된 자일로스 및 치환 또는 비치환된 피라노스를 포함한다. 포스페이트 에스테르 유사체를 포함하는 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로아미데이트, 포스포로셀로노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포로아닐리데이트, 포스포로아미데이트, 보론포스페이트, 포스포트리에스테르 및 메틸포스포네이트와 같은 알킬포스포네이트를 포함한다.
일 구현예에서 반응물은 총 25 μl에 0.2 μM 의 각 F3 및 B3 프라이머, 1.6 μM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8 μM의 각 LF 및 LB 프라이머, 0.4M betaine, 10 mM MgSO4, 1.4 mM dNTPs, 1×ThermoPol reaction buffer (New England Biolabs), 8 U Bst DNA polymerase (New England Biolabs), 0.625 U AMV reverse transcriptase (Invitrogen), 및 10 μl의 인플루엔자 분석이 필요한 시료를 포함한다.
반응물은 이어서 DNA 폴리머라제 및 역전사 효소의 활성에 적합한 온도에서 반응된다. 반응온도는 반응에 사용되는 효소, 표적의 핵산 서열을 고려하여 어려움 없이 결정될 수 있다. 이어 반응물은 표적 핵산의 증폭에 적합한 시간으로 반응된다. 당업자라면 반응조건을 고려하여 반응시간을 결정할 수 있을 것이며, 예를 들면 15분-60분의 시간에서 결정할 수 있으나, 시료에 포함된 표적 핵산의 양에 따라 달라질 수 있으며, 결정될 수 있다. 예를 들면 민감도를 높이기 위해 반응시간을 증가시킬 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서는 DNA 폴리머라제와 역전사효소가 함께 사용되며, 역전사 반응 및 증폭반응을 하나의 반응에서 수행하여 편의성이 증대된다. 특히 핵산을 분리하지 않고, 콧물, 혈액과 같은 시료가 직접 사용되는 경우 이러한 시료에는 인플루엔자 바이러스의 RNA 및 DNA가 모두 존재하여 효율적 증폭이 가능하다. 본원에 따른 RT-LAMP 반응은 DNA는 물론 역전사된 DNA가 증폭될 수 있기 때문에, 프로바이러스 DNA 및/또는 RNA가 또한 검출될 수 있다.
본원에 따른 LAMP 분석은 다양한 분석 포맷으로 분석될 수 있으며, 예를 들면 액상반응 또는 일부 성분이 고상기질에 흡착된 상태로 수행될 수도 있다.
본원에 따른 프라이머 및 이를 포함하는 조성물 또는 키트 및 방법은 인플루엔자 바이러스가 존재할 가능성이 있는 임의의 생물학적 시료를 사용한 LAMP 방식으로 분석에 사용되며, 증폭된 산물은 주형으로 사용한 분자와 상응하는 서열을 가지며, 당업계에 공지된 다양한 방법으로 분석될 수 있다.
증폭 후 증폭반응 산물은 다양한 방법으로 검출될 수 있으며, 예를 들면 DNA 합성에 따른 반응액의 색변화, 탁도변화, 형광 및/또는 전기영동으로 검출될 수 있으며, 검출된 산물은 양성 및/또는 음성 대조군 시료의 산물과 비교되어 인플루엔자를 정량 또는 정성분석에 사용된다.
일 구현예에서 본원에 따른 증폭산물은 DNA 합성에 따른 반응액의 색변화로 검출될 수 있다. 이 경우, 반응액은 적절한 지시 시약(indicator)을 포함할 수 있으며, 반응액 중 마그네슘 이온 농도에 반응하여 색이 변하는 염료로서 HNB (hydroxy naphthol blue)을 사용하여 양성 및/또는 음성 대조군 시료의 산물과 비교되어 인플루엔자를 정량 또는 정성분석 할 수 있으며, 특히 나안으로 검출이 가능하여 그 편리성이 증대된다.
다른 구현예에서 증폭 산물은 핵산은 직접적 또는 간접적 방법에 의해 검출될 수 있다. 직접적 방법에서는 검출가능하게 표지된 프라이머가 사용될 수 있으며, 핵산에 특이적 결합 후 표지된 프라이머를 통해 방출되는 신호를 통해 핵산의 증폭여부가 검출되며, 실시간 검출이 가능하다. 간접적 검출방법에서는 증폭된 핵산에 결합할 수 있는 표지된 프로브가 사용될 수 있다. 본원에서 검출가능하게 표지된은 분광학적, 광학적, 광화학적, 생화학적, 효소적, 전기적 및/또는 면역화학적 방법과 같은 임의의 적절한 방법을 이용하여 검출가능한 신호를 방출할 수 있는 물질로 표지된 물질을 의미한다. 이러한 물질은 예를 들면 형광모이어티, 화학발광 모이어티, 생발광모이어티, 자성입자, 효소, 기질, 방사능 및 발색단 물질을 포함한다.
일 구현예에서 검출을 위한 표지자(label)는 이로 제한하는 것은 아니나, 광방출, 광산란, 광흡수 물질과 같은 검출가능한 형광, 화학발광 또는 생발광 신호를 생성 또는 소거할 수 있는 화합물을 포함하며, 예를 들면 Garman A., Non-Radioactive Labeling, Academic Press 1997을 참조할 수 있다. 형광 물질은 예를 들면 이로 제한하는 것은 아니다 플루오레신 (예를 들면 미국특허 6,020,481), 로다민 (예를 들면 미국 특허 6,191,278), 벤조페녹사진 (예를 들면 미국특허 6,140,500), 공여체와 수용체를 포함하는 에너지 전이 형광 염료 (예를 들면 미국특허 5,945,526) 및 사이아나인 (예를 들면 WO1997-45539), 리사민, 파이코에리쓰린, Cy2, Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5, Cy7, FluorX (Amersham), Alexa 350, Alexa 430, AMCA, BODIPY 630/650, BODIPY 650/665, BODIPY-FL, BODIPY-R6G, BODIPY-TMR, BODIPY-TRX, Cascade Blue, 6-FAM, Fluorescein Isothiocyanate, HEX, 6-JOE, Oregon Green 488, Oregon Green 500, Oregon Green 514, Pacific Blue, REG, Rhodamine Green, Rhodamine Red, Renographin, ROX, SYPRO, TAMRA, Tetramethylrhodamine, 및/또는 Texas Red는 물론 기타 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 임의의 형광 모이어티를 포함한다. 형광염료는 6-carboxyfluorescein; 2′,4′,1,4,-tetrachlorofluorescein; 및 2′,4′,5′,7′,1,4-hexachlorofluorescein를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 일 구현예에서는 형광 표지로 SYBR-Green, 6-carboxyfluorescein ("FAM"), TET, ROX, VIC, 또는 JOE가 사용된다. 일 구현예에서는 리포터 형광물질과 소거형광물질의 두 개의 형광물질로 표지된 프로브가 사용되며, 이 경우 형광물질은 구분이 가능한 파장이 스펙트럼을 방출하는 형광물질이 사용된다. 또한 표지자는 핵산의 결합을 향상, 안정화 또는 핵산의 결합에 영향을 미칠 수 있는 화합물 예를 들면 에씨디움 브로마이드 및 SYBR-Green을 포함하는 인터칼레이터, 마이너그루브 결합체 및 가교가능한 작용기가 사용될 수 있으나, 이로 제한하는 것은 아니며, Blackburn et al., eds. "DNA and RNA Structure" in Nucleic Acids in Chemistry and Biology (1996)을 참조할 수 있다.
또한 프라이머의 비 특이적 프라이밍 발생에 의한 비특이적 증폭여부의 검출이 필요한 경우, 비특이적 핵산 결합제인 에씨디움 브로마이드 또는 피코그린과 같은 물질을 주형을 포함하지 않는 대조군 반응에 사용하여 비특이적으로 합성된 총 증폭산물의 양을 결정할 수 있다.
다른 양태에서 본원은 또한 상술한 바와 같은 본원에 따른 프라이머 또는 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 검출용 조성물 또는 키트에 관한 것이다.
본원에 따른 조성물은 주형을 제외한 상술한 바와 같은 LAMP 또는 RT-LAMP 반응에 사용되는 성분 및 검출하고자 하는 인플루엔자 유형에 적합한 4개 또는 6개의 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
본원에 따른 키트는 주형을 제외한 상술한 바와 같은 LAMP 또는 RT-LAMP 반응에 사용되는 성분 및 검출하고자 하는 인플루엔자 유형에 적합한 4개 또는 6개의 프라이머 세트를 별도로 또는 하나의 튜브에 제공할 수 있다. 본원에 따른 키트는 양성대조군, 음성대조군 및 사용설명서를 추가로 포함한다. 음성대조군으로는 핵산을 포함하지 않는 시료, 양상대조군은 하나 이상의 검출대상 핵산을 포함할 수 있다.
본원에 따른 프라이머, 키트 및 조성물은 생물학적 시료에서 인플루엔자를 핵산수준에서 검출하고, 이를 대조군 또는 참조군과 비교하여, 핵산의 존재 여부, 핵산 증가, 변화 정도에 따라 인플루엔자 감염 또는 감염 후 치료를 받는 경우 치료의 효과를 예측할 수 있다.
이런 측면에서 본원은 또한 인플루엔자의 검출, 진단 또는 예후에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 생물학적 시료에서 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법은 상술한 바와 같은 프라이머세트, 조성물 또는 키트를 이용하여 수행되며, 일 구현예에서 인플루엔자 검출이 필요한 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계; 상기 시료로부터 본원에 따른 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 또는 RT-LAMP를 수행하여 표적 핵산을 증폭하는 단계; 이어 증폭결과를 대조군의 시료와 비교하는 단계를 포함하며, 상기 대상체 시료와 비교하여 증폭산물의 양에 변화가 있는 경우, 이를 인플루엔자 감염으로 판정하는 단계를 포함하는, 인플루엔자를 검출하는 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법은 정성 또는 정량분석을 통해 감염 여부를 판별할 수 있으며, 예를 들면 음성 대조군과 비교하여 그 양이 증가한 경우, 또는 음성 대조군에는 검출되지 않았으나, 시료에서 양성 반응이 나온 경우, 또는 일정한 양 이상으로 검출이 된 경우 이를 감염으로 판정할 수 있을 것이다. 판정 또는 판단 기준은 당업계의 기준을 고려하여 용이하게 결정할 수 있을 것이다.
본원의 방법에 사용되는 시료, 시약, 증폭 방법 및 반응 조건 등은 앞서 기술한 바를 참조할 수 있다.
이하 실시예를 통해 본 발명을 상세히 설명하나, 본 실시예는 예시적인 것일 뿐 어떤 식으로든 본원의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명은 달리 언급이 없는 한 세포생물학, 세포배양, 분자생물학, 유전자 형질전환 기술, 미생물학, DNA 재조합기술에 관한 당업자의 기술수준 내인 통상의 기술을 사용하여 실시될 수 있다. 또한, 일반적인 기술에 관한 보다 자세한 설명은 Molecular Biotechnology: (Bernard et al., ASM press 2014); Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th Ed. (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press 2012); Short Protocols in Molecular Biology, 5th Ed. (Ausubel F. et al. eds., John Wiley & Sons 2002) 등을 참고할 수 있다.
실시예
실시예 1. 바이러스 RNA 시료 준비
인플루엔자 바이러스 RNA는 A형 H1N1, H3N2 및 pdm H1N1 형, B형의 인플루엔자 바이러스는 질병관리본부에서 분양받아, pathogen free egg 에 배양한 후 인플루엔자 바이러스 RNA를 QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen, Germany)를 제조자의 방법대로 사용하여 RNA를 추출하였다.
실시예 2. RT-LAMP를 이용한 인플루엔자 바이러스의 특이도 분석
본원에서는 RT-LAMP 프라이머로서 A형 인플루엔자 H3 및 pdm H1N1 타입, B형 인플루엔자, 그리고 A형 인플루엔자를 타입에 관계없이 공통적으로 검출할 수 있는 프라이머를 디자인하였다.
pdm H1N1, H3, 및 인플루엔자 B형 유전자 서열 및 유전체 서열은 GenBank 및 GISAID (Global Initiative on Sharing All Influenza Data) 로부터 수득하였으며, 사용한 해당 스트레인은 다음과 같다: pdm H1N1: Influenza A virus (A/Boston/DOA21/2011(H1N1)); Influenza A virus (A/Beijing/01/2009(H1N1); H3N2 : Influenza A virus (A/Chicago/YGA_04002/2012(H3N2); Influenza A virus (A/Korea/3773/2014(H3N2) 및 Influenza B : Influenza B virus (B/Georgia/04/2013), Influenza B virus (B/Massachusetts/04/2014). 상기 스트레인의 유전체에서 HA, Matrix, NA 유전자 서열을 서로 배열(align) 하였다. 인플루엔자 A 형 공용 프라이머는 Matrix 유전자 서열을 사용하였으며 pdm H1N1 검출 프라이머는 Matrix 유전자 서열 및 HA 유전자 서열을 사용하였으며, H3 와 인플루엔자 B형 검출 프라이머는 HA 유전자 서열을 사용하여 프라이머를 제작하였다.
구체적으로 ClustalX multiple sequence alignment program을 이용하여 정렬한 뒤 이로부터 RT-LAMP 프라이머를 디자인하였다. 프라이머는 HA(Hemagglutinin) 유전자, Matrix 유전자 및 NA(Neuraminidase) 유전자 부위의 서열로부터 다양한 서열 및 조합으로 디자인하였고, 프라이머로서의 가능성은 BLAST program (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi website)으로 검증하였다. 각 프라이머 서열은 다양한 서열 및 조합으로 실험된 프라이머 중에서 특이성 및 민감도 측면에서 최적이며, LAMP 반응에 최적화되도록 디자인된 것이다. 나아가 본원에 따른 프라이머는 FIP, BIP 프라이머에 링커를 포함하지 않아 제조 비용이 낮은 것은 물론 LAMP 반응이 보다 효과적으로 진행될 수 있도록 디자인된 것이다. 프라이머는 외부에 의뢰하여 합성하였으며, 프라이머 서열은 아래 표 1-1, 1-2, 1-3 및 1-4와 같다.
[표 1-1]
Figure pat00001
[표 1-2]
Figure pat00002
[표 1-3]
Figure pat00003
[표 1-4]
Figure pat00004
상기 표에서 Y = T 또는 C (pyrimidine), R = G 또는 A (purine), K = G 또는 T (keto), M은 A 또는 C(amino), W는 A 또는 T (weak)이다.
RT-LAMP는 총 25μl로 반응하였으며, LF 및 LB를 제외한 4개의 프라이머 또는 6개의 프라이머를 사용하여 수행하였다. 반응에 사용된 조성 및 성분은 프라이머의 갯수를 제외하고는 동일하였으며, 다음과 같다. 총 25μl에 0.2μM 의 각 F3 및 B3 프라이머, 1.6μM의 각 FIP 및 BIP 프라이머, 0.8μM의 각 LF 및 LB 프라이머, 0.4M betaine, 10 mM MgSO4, 1.4 mM dNTPs, 1×ThermoPol reaction buffer (New England Biolabs), 8 U Bst DNA polymerase (New England Biolabs), 0.625 U AMV reverse transcriptase (Invitrogen), 120μM HNB (Sigma) 및 10μl의 인플루엔자 분석이 필요한 시료 혹은 분리된 50ng RNA를 포함한 조성의 용액에서 수행하였다. RT-LAMP 반응은 4개의 프라이머를 사용한 경우에는 58℃에서 60분, 6개의 프라이머를 사용한 경우는 58℃에서 35분 동안 실시하였으며 Bst DNA polymerse는 80℃ 이상의 온도에서 불활성을 나타내므로 80℃에서 5분간 반응시켜 반응을 종료하였다.
본원에 따른 인플루엔자 A 타입 및 B 타입 특이적 프라이머의 특이성 판단을 위해 사용한 대조군은 각 도면에 표시된 바와 같으며, 증폭 결과는 색분석 및 전기영동으로 분석하였다. 결과는 도 1 내지 도 4에 기재되어 있다. 도 1은 서열번호 7 내지 12의 프라이머 세트, 도 2는 서열번호 21, 22 및 25 내지 28의 프라이머 세트, 도 3은 서열번호 58 내지 63의 프라이머 세트, 도 4는 서열번호 35 내지 40의 프라이머 세트를 사용하였다.
색분석은 HNB (hydroxy naphthol blue) 염료를 반응액에 넣어 수행하였다. HNB는 Mg2 + 이온 농도의 지시자(indicator)로서 작용한다. Mg2 + 이온이 없을 경우, 하늘색으로 보이며, Mg2 + 이온이 있을 경우, 보라색을 띤다. 따라서 반응 전에는 보라색으로 존재하다가, DNA 합성 반응이 일어나면서 Mg2 + 이온의 농도가 줄어들고 이에 따라서 보라색에서 푸른색으로 색의 변화 일어난다. 색의 변화는 핵산이 증폭되었음을 나타내는 양성 반응으로, 나안 또는 약 650nm 파장에서 흡광도를 측정하여 정성 및 정량 분석이 가능하다. 본원에 따른 방법은 신속하고 편리하게 결과를 눈으로 보고 정성 분석을 할 수 있으며, 또한 분광광도계를 이용하여 650nm 파장에서 흡광도를 측정할 경우 정성 및 정량 분석이 가능한 장점이 있다.
도 1에 나타난 바와 같이 본원에 따른 A형 인플루엔자 타입 H3 특이적 프라이머는 H3N2만을 특이적으로 검출하였다. 4개의 프라이머를 이용하여 수행한 실험의 경우에도 동일한 특이도를 나타냈다 (실험결과 나타내지 않음).
도 2 및 3에 나타난 바와 같이 본원에 따른 인플루엔자 A형 pdm H1N1 특이적 프라이머 및 인플루엔자 B형 프라이머 또한 각각의 인플루엔자를 특이적으로 검출하였다. 4개의 프라이머를 이용하여 수행한 실험의 경우에도 동일한 특이도를 나타냈다 (실험결과 나타내지 않음).
아울러 도 4에 나타난 바와 같이 본 실시예에서 사용한 모든 타입의 A형 인플루엔자는 공통 인플루엔자 A 프라이머에 의해 특이적으로 검출되었다. 4개의 프라이머를 이용하여 수행한 실험의 경우에도 동일한 특이도를 나타냈다 (실험결과 나타내지 않음).
실시예 3. RT-LAMP를 이용한 인플루엔자 바이러스의 민감도 분석
민감도 분석을 위해 각 바이러스 RNA의 농도를 2-2, 2-4, 2-6, 2-8, 2-10 TCID50 (Tissue Culture Infective Dose 50)로 다르게 하여 실시예 2에서와 같이 4개 또는 6개의 프라이머를 이용하여 LAMP 반응을 수행하였다.
결과는 도 5 내지 도 7에 기재되어 있다.
인플루엔자 H3 타입 및 공통 A 타입 프라이머의 경우는 2-10 PFU (도 5 및 도 6) 그리고 pdm H1N1 인플루엔자 프라이머의 경우는 2-10 PFU (도 7)의 민감도를 갖는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 기존 RT-PCR과 비교하여 총 소요시간 및 민감도 측면에서 매우 우수한 것으로, 질병관리본부 국립보건원에서 제시된 인플루엔자 검출법 중 H3 형 인플루엔자 검출법과 비교한 결과 (감염병 실험실진단-질환별 시험법, 참고-http://www.cdc.go.kr/CDC/contents/CdcKrContentView.jsp?cid=18302&menuIds=HOME001-MNU1175-MNU0834-MNU0839 14장 인플루엔자) 상기 방법의 경우 3시간이 소요되며 2-4 PFU 까지 검출가능하였다 (도 8). 하지만 본원에 따른 프라이머 세트를 사용한 경우, 35분 이내 2-10 PFU 까지 검출 가능하였다. 4개의 프라이머를 이용하여 수행한 실험의 경우에도 동일한 민감도를 나타냈다 (실험결과 나타내지 않음).
또한 서열번호 1 내지 6, 서열번호 7 내지 12, 또는 서열번호 13 내지 18의 A형 인플루엔자 H3 타입 특이적 프라이머 세트, 서열번호 19 내지 24, 서열번호 21, 22 및 25 내지 28, 또는 서열번호 29 내지 34의 pdm H1N1 특이적 프라이머 세트, 서열번호 35 내지 40, 서열번호 41 내지 46, 또는 서열번호 46 및 47 내지 51의 인플루엔자 공통 A 타입 프라이머 세트, 및 서열번호 52 내지 57, 서열번호 58 내지 63, 서열번호 64 내지 69, 또는 서열번호 70 내지 75의 B형 인플루엔자 프라이머의 인플루엔자 타입 별로 각 둘 또는 셋 프라이머 세트의 민감도를 서로 비교분석하였다. 각 바이러스 RNA의 농도를 50ng, 10ng, 2ng, 0.4ng 또는 0.08ng로 다르게 하여 실시예 2와 같은 방법으로 4개 (각 프라이머 세트에서 LF 및 LB 제외) 또는 6개의 프라이머를 이용하여 LAMP 반응을 수행하였다.
결과는 도 9 내지 도 16에 기재되어 있다.
A형 인플루엔자 H3 타입 프라이머의 경우 도 9에 나타난 바와 같이 서열번호 1~6세트는 20, 서열번호 13~18세트는 2-6의 민감도를 나타내었고, 혹은 도 10에 나타난 바와 같이 서열번호 7~12세트는 2ng, 서열번호 13-18세트는 0.4ng의 민감도를 나타내었다.
A형 인플루엔자 pdm H1N1 프라이머의 경우 도 11에 나타난 바와 같이 서열번호 19~24세트는 2-4의 민감도를 나타내었고, 서열번호 25~28(서열번호 21 및 22 포함)세트는 2-8의 민감도를 나타내었고, 혹은 도 12에 나타난 바와 같이 서열번호 21, 22 및 25~28 세트와 서열번호 29~34 세트는 0.08ng의 민감도를 나타내었다.
A형 공통 인플루엔자 프라이머의 경우 도 13에 나타난 바와 같이 서열번호 35~40세트는 2ng, 서열번호 41~46세트는 0.4ng의 민감도를 나타내었다. 또한 도 14에 나타난 바와 같이 A/Brisbane/59/2007(H1N1) 샘플에서는 서열번호 41~46세트, 서열번호 46 및 47~51에서 동일하게 0.4ng의 민감도를 나타내었으나, A/Korea/01/09(H1N1 pdm) 샘플에서는 서열번호 41~46세트의 경우 0.4ng의 민감도를 나타내었으나 서열번호 46 및 47~51 세트의 경우 2ng의 민감도를 나타내었다.
그리고 B형 인플루엔자 프라이머의 경우 도 15에 나타난 바와 같이 서열번호 52~57세트와 서열번호 58~63세트는 80pg의 민감도를 나타내었고 서열번호 64~69세트는 16pg의 민감도를 나타내었다. 또는 도 16에 나타난 바와 같이 서열번호 58~63세트는 2ng의 민감도를 나타내었고 서열번호 70~75번은 0.4ng의 민감도를 나타낸다.
또한 본원에 따른 증폭산물의 검출은 기존의 경우 아가로즈 전기영동 또는 별도의 장비를 이용한 것이 아닌, 증폭반응 후에 색변화로 바로 결과 확인이 나안(裸眼)으로 검출가능하여 그 편리성이 월등히 향상된다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
<110> Mmonitor Inc. <120> Primers used for LAMP reaction for the detection of influenza viruses and its use <130> DP201511011P/DIV <150> KR 2015-0117834 <151> 2015-08-21 <160> 75 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP <400> 1 ttgraagcca tcacactgag ggtcatcaga tccttgatgg aga 43 <210> 2 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP <400> 2 aagccyacag caactgttac ccatgaggca actagtgacc t 41 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 <400> 3 aggtgaaata tgcracagtc 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 <400> 4 tgttaaactc cagtgtgcc 19 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF <400> 5 agagcatcta ttagtgtgca gt 22 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB <400> 6 tgtgccggat tatgcctc 18 <210> 7 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP <400> 7 tgggaatgct tccatttgga gtgctcaata atgagatcag atgc 44 <210> 8 <211> 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<220> <223> F3 <400> 43 cgcagagact kgaarrtg 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 <400> 44 rtccatgtta tttggrtc 18 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF <400> 45 tgtctttagc caytccatga ga 22 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB <400> 46 gaggactgca gcgtagac 18 <210> 47 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP <400> 47 agtcagaggt gacarrattg gtraayacag atcttgaggc tc 42 <210> 48 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP <400> 48 ttgtkttcac gctcaccgtc cattcccatt dagggcatt 39 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 <400> 49 gagatcgcrc agagactkg 19 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 <400> 50 agtttaactg ctytrtccat 20 <210> 51 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF <400> 51 cttgtcttta gccaytccat ga 22 <210> 52 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP <400> 52 tcagctgctc gaattggctt tcggatcctc aattcactct 40 <210> 53 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP <400> 53 ctgcggtggg agtcttatcc gtgaccagtc taattgtctc c 41 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 <400> 54 gcatatgacc agagtggaag 20 <210> 55 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 <400> 55 ggagctgtta gctattactg tt 22 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF <400> 56 tgtccttcat taagacgctc g 21 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB <400> 57 tggtcaagag caccgattat c 21 <210> 58 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP <400> 58 agccrccaat ctgagaaacr ttctatggag actcaaatcc yca 43 <210> 59 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP <400> 59 agaagacgga ggrctaccac aayaattgtt cctgttttcc cag 43 <210> 60 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 <400> 60 gggaagacca aattactgtt tg 22 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 <400> 61 tattactttg ctcctgccac 20 <210> 62 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF <400> 62 ctccrttagc agatgaggtg aa 22 <210> 63 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB <400> 63 gyggcagaat tgtygttga 19 <210> 64 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP <400> 64 tcagggacaa tacattacgc atatcgataa aggaggaagt aaacactca 49 <210> 65 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP <400> 65 taaacggaac attcctcaaa caccactctg gtcataggca ttc 43 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 <400> 66 agggacatga acaacaaaga 20 <210> 67 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 <400> 67 caagtttagc aacaagcct 19 <210> 68 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF <400> 68 tcaaacggaa cttcccttct ttc 23 <210> 69 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB <400> 69 ggatacaagt ccttatcaac tctgc 25 <210> 70 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FIP <400> 70 ccattggcma gcttcaargg tgagccttac tacacaggrg aa 42 <210> 71 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BIP <400> 71 aaggaaaggg gtttcttcgg agctgcaatc attccttccc a 41 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 <400> 72 cggtggatta aacaaaagca 20 <210> 73 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 <400> 73 atgtgtatcc gtgccaac 18 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LF <400> 74 tgggcaattt cctatggcyt 20 <210> 75 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB <400> 75 attgctggtt tcytagaagg ag 22

Claims (10)

  1. 하기로 구성되는 군으로부터 선택되는 인플루엔자 바이러스 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트:
    서열번호 1 내지 4; 서열번호 7 내지 10; 또는 서열번호 13 내지 16으로 표시되는 염기서열의 프라이머를 포함하는 A형 인플루엔자 H3 특이적 프라이머 세트;
    서열번호 19 내지 22; 서열번호 21, 22, 25 및 26; 또는 서열번호 29 내지 32로 표시되는 염기서열의 프라이머를 포함하는 A형 인플루엔자 pdm H1N1 특이적 프라이머 세트;
    서열번호 35 내지 38; 서열번호 41 내지 44; 또는 서열번호 47 내지 50으로 표시되는 염기서열의 프라이머를 포함하는 A형 공통 인플루엔자 특이적 프라이머 세트; 및
    서열번호 52 내지 55; 서열번호 58 내지 61; 서열번호 64 내지 67; 또는 서열번호 70 내지 73으로 표시되는 염기서열의 프라이머를 포함하는 B형 인플루엔자 특이적 프라이머 세트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 A형 인플루엔자 H3 특이적 프라이머 세트는 서열번호 5 및 6, 서열번호 11 및 12, 또는 서열번호 17 및 18으로 표시되는 프라이머 세트;
    상기 A형 인플루엔자 pdm H1N1 특이적 프라이머 세트는 서열번호 23 및 24, 서열번호 27 및 28, 또는 서열번호 33 및 34로 표시되는 프라이머 세트;
    상기 A형 공통 인플루엔자 특이적 프라이머 세트는 서열번호 39 및 40, 서열번호 45 및 46, 또는 서열번호 51 및 46으로 표시되는 프라이머 세트;
    상기 B형 인플루엔자 특이적 프라이머 세트는 서열번호 56 및 57, 서열번호 62 및 63, 서열번호 68 및 69, 또는 서열번호 74 및 75로 표시되는 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것인, 인플루엔자 바이러스 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 LAMP는 RT-LAMP인, 인플루엔자 바이러스 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 각 세트의 하나 이상의 프라이머는 검출가능한 표지 물질로 표지된 것인, 인플루엔자 바이러스 검출을 위한 LAMP 분석용 프라이머 세트.
  5. 하기의 단계를 포함하는, 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 프라이머 세트를 사용한 인비트로에서 인플루엔자 바이러스를 검출하는 방법:
    인플루엔자 바이러스 검출이 필요한 대상체 유래의 시료를 제공하는 단계;
    제 1 항 또는 제 2 항에 따른 프라이머 세트 중 어느 하나를 제공하는 단계;
    상기 시료 및 프라이머 세트를 이용하여 LAMP 반응을 수행하는 단계; 및
    상기 LAMP 반응 결과를 분석하고 이를 대조군 시료와 비교하여 차이가 있는 경우, 상기 시료를 인플루엔자 감염으로 판정하는 단계.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 LAMP 반응은 RT-LAMP인, 방법.
  7. 제 5 항에 있어서,
    상기 시료는 전혈, 혈장, 혈청, 림프액, 소변, 타액, 눈물, 또는 코인두 분비물 중 하나 이상인, 방법.
  8. 제 5 항에 있어서,
    상기 LAMP 반응 결과물 분석은 상기 반응물의 색변화 측정 또는 탁도(turbidity) 중 하나 이상을 이용하여 측정을 통해 결정되는 것인, 방법.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 조성물.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 따른 프라이머 세트를 포함하는 인플루엔자 바이러스 검출용 키트.
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