CN116134156A - 用于确定样本中预定的rna序列的存在的等温实时pcr方法 - Google Patents
用于确定样本中预定的rna序列的存在的等温实时pcr方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116134156A CN116134156A CN202180056494.3A CN202180056494A CN116134156A CN 116134156 A CN116134156 A CN 116134156A CN 202180056494 A CN202180056494 A CN 202180056494A CN 116134156 A CN116134156 A CN 116134156A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- primer
- dna
- sample
- rna
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 94
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 68
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 title description 3
- 239000013615 primer Substances 0.000 claims abstract description 202
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 97
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 37
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 29
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims abstract description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 25
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 claims abstract description 24
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 20
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims abstract description 9
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 claims description 43
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 36
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 34
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 31
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 31
- 241001678559 COVID-19 virus Species 0.000 claims description 27
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 claims description 17
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims description 14
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 8
- 241000315672 SARS coronavirus Species 0.000 claims description 8
- 241000127282 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus Species 0.000 claims description 7
- 241000711467 Human coronavirus 229E Species 0.000 claims description 6
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 claims description 5
- 229960001997 adefovir Drugs 0.000 claims description 5
- WOZSCQDILHKSGG-UHFFFAOYSA-N adefovir depivoxil Chemical compound N1=CN=C2N(CCOCP(=O)(OCOC(=O)C(C)(C)C)OCOC(=O)C(C)(C)C)C=NC2=C1N WOZSCQDILHKSGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 201000003176 Severe Acute Respiratory Syndrome Diseases 0.000 claims description 4
- 241001109669 Human coronavirus HKU1 Species 0.000 claims description 3
- 241000482741 Human coronavirus NL63 Species 0.000 claims description 3
- 241001428935 Human coronavirus OC43 Species 0.000 claims description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 51
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 21
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 13
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 13
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 12
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 235000011180 diphosphates Nutrition 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 5
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 241000114864 ssRNA viruses Species 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- KJHKTHWMRKYKJE-SUGCFTRWSA-N Kaletra Chemical compound N1([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)COC=2C(=CC=CC=2C)C)CC=2C=CC=CC=2)CCCNC1=O KJHKTHWMRKYKJE-SUGCFTRWSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 3
- DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N calcein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(O)=O)CC(O)=O)=C(O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(O)=O)CC(=O)O)C(O)=C1 DEGAKNSWVGKMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J diphosphate(4-) Chemical compound [O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 238000009830 intercalation Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 229960004525 lopinavir Drugs 0.000 description 3
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 229960002378 oftasceine Drugs 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 208000002815 pulmonary hypertension Diseases 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 2
- 241000004176 Alphacoronavirus Species 0.000 description 2
- 241000712892 Arenaviridae Species 0.000 description 2
- 241001533362 Astroviridae Species 0.000 description 2
- 241000008904 Betacoronavirus Species 0.000 description 2
- 241000702628 Birnaviridae Species 0.000 description 2
- QAGYKUNXZHXKMR-UHFFFAOYSA-N CPD000469186 Natural products CC1=C(O)C=CC=C1C(=O)NC(C(O)CN1C(CC2CCCCC2C1)C(=O)NC(C)(C)C)CSC1=CC=CC=C1 QAGYKUNXZHXKMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000520666 Carmotetraviridae Species 0.000 description 2
- 241001050320 Chronic bee paralysis virus Species 0.000 description 2
- 241001461743 Deltacoronavirus Species 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000711950 Filoviridae Species 0.000 description 2
- 241000008920 Gammacoronavirus Species 0.000 description 2
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 2
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 2
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 description 2
- 241000439378 Nyamiviridae Species 0.000 description 2
- 241000711504 Paramyxoviridae Species 0.000 description 2
- 241000702247 Reoviridae Species 0.000 description 2
- IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N Ribavirin Chemical compound N1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 IWUCXVSUMQZMFG-AFCXAGJDSA-N 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N Ritonavir Natural products C=1C=CC=CC=1CC(NC(=O)OCC=1SC=NC=1)C(O)CC(CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010053950 Teicoplanin Proteins 0.000 description 2
- 241000710924 Togaviridae Species 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 2
- SRXKIZXIRHMPFW-UHFFFAOYSA-N [4-[6-[amino(azaniumylidene)methyl]naphthalen-2-yl]oxycarbonylphenyl]-(diaminomethylidene)azanium;methanesulfonate Chemical compound CS([O-])(=O)=O.CS([O-])(=O)=O.C1=CC(N=C([NH3+])N)=CC=C1C(=O)OC1=CC=C(C=C(C=C2)C([NH3+])=N)C2=C1 SRXKIZXIRHMPFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 2
- 229960000772 camostat Drugs 0.000 description 2
- FSEKIHNIDBATFG-UHFFFAOYSA-N camostat mesylate Chemical compound CS([O-])(=O)=O.C1=CC(CC(=O)OCC(=O)N(C)C)=CC=C1OC(=O)C1=CC=C([NH+]=C(N)N)C=C1 FSEKIHNIDBATFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- DDTDNCYHLGRFBM-YZEKDTGTSA-N chembl2367892 Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]([C@H]1C(N[C@@H](C2=CC(O)=CC(O[C@@H]3[C@H]([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)=C2C=2C(O)=CC=C(C=2)[C@@H](NC(=O)[C@@H]2NC(=O)[C@@H]3C=4C=C(O)C=C(C=4)OC=4C(O)=CC=C(C=4)[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CC=4C=C(Cl)C(O5)=CC=4)C(=O)N3)C(=O)N1)C(O)=O)=O)C(C=C1Cl)=CC=C1OC1=C(O[C@H]3[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O3)NC(C)=O)C5=CC2=C1 DDTDNCYHLGRFBM-YZEKDTGTSA-N 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 2
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 229960005107 darunavir Drugs 0.000 description 2
- CJBJHOAVZSMMDJ-HEXNFIEUSA-N darunavir Chemical compound C([C@@H]([C@H](O)CN(CC(C)C)S(=O)(=O)C=1C=CC(N)=CC=1)NC(=O)O[C@@H]1[C@@H]2CCO[C@@H]2OC1)C1=CC=CC=C1 CJBJHOAVZSMMDJ-HEXNFIEUSA-N 0.000 description 2
- IZEKFCXSFNUWAM-UHFFFAOYSA-N dipyridamole Chemical compound C=12N=C(N(CCO)CCO)N=C(N3CCCCC3)C2=NC(N(CCO)CCO)=NC=1N1CCCCC1 IZEKFCXSFNUWAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960002768 dipyridamole Drugs 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 229960004171 hydroxychloroquine Drugs 0.000 description 2
- XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N hydroxychloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CCO)CC)=CC=NC2=C1 XXSMGPRMXLTPCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229950009865 nafamostat Drugs 0.000 description 2
- 229960000884 nelfinavir Drugs 0.000 description 2
- QAGYKUNXZHXKMR-HKWSIXNMSA-N nelfinavir Chemical compound CC1=C(O)C=CC=C1C(=O)N[C@H]([C@H](O)CN1[C@@H](C[C@@H]2CCCC[C@@H]2C1)C(=O)NC(C)(C)C)CSC1=CC=CC=C1 QAGYKUNXZHXKMR-HKWSIXNMSA-N 0.000 description 2
- VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N oseltamivir Chemical compound CCOC(=O)C1=C[C@@H](OC(CC)CC)[C@H](NC(C)=O)[C@@H](N)C1 VSZGPKBBMSAYNT-RRFJBIMHSA-N 0.000 description 2
- 229960003752 oseltamivir Drugs 0.000 description 2
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 229960000329 ribavirin Drugs 0.000 description 2
- HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N ribavirin Natural products O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1N=CN=C1 HZCAHMRRMINHDJ-DBRKOABJSA-N 0.000 description 2
- 229960000311 ritonavir Drugs 0.000 description 2
- NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N ritonavir Chemical compound N([C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C[C@H](O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)OCC=1SC=NC=1)CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N(C)CC1=CSC(C(C)C)=N1 NCDNCNXCDXHOMX-XGKFQTDJSA-N 0.000 description 2
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229960001608 teicoplanin Drugs 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 2-(2,6-dioxopiperidin-3-yl)-1H-isoindole-1,3(2H)-dione Chemical compound O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)N1C1CCC(=O)NC1=O UEJJHQNACJXSKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000994388 Albetovirus Species 0.000 description 1
- 241000520665 Alphatetraviridae Species 0.000 description 1
- 241000025051 Alvernaviridae Species 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 241000405487 Amalgaviridae Species 0.000 description 1
- 241000489724 Anphevirus Species 0.000 description 1
- 241000489718 Arlivirus Species 0.000 description 1
- 241001292006 Arteriviridae Species 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241001018175 Aumaivirus Species 0.000 description 1
- 241001533460 Barnaviridae Species 0.000 description 1
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 description 1
- 241001011612 Botybirnavirus Species 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000000540 Brassica rapa subsp rapa Nutrition 0.000 description 1
- 241000724256 Brome mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241001533462 Bromoviridae Species 0.000 description 1
- 239000005489 Bromoxynil Substances 0.000 description 1
- 206010006458 Bronchitis chronic Diseases 0.000 description 1
- 208000031229 Cardiomyopathies Diseases 0.000 description 1
- 241000489720 Chengtivirus Species 0.000 description 1
- 208000006545 Chronic Obstructive Pulmonary Disease Diseases 0.000 description 1
- 241001060419 Chrysoviridae Species 0.000 description 1
- 241000973027 Closteroviridae Species 0.000 description 1
- 208000001528 Coronaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000489728 Crustavirus Species 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 206010012289 Dementia Diseases 0.000 description 1
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010014561 Emphysema Diseases 0.000 description 1
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 1
- 241000311863 Fusariviridae Species 0.000 description 1
- 238000001327 Förster resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 241000150362 Hantaviridae Species 0.000 description 1
- 206010019280 Heart failures Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001122120 Hepeviridae Species 0.000 description 1
- 101000878605 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Proteins 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 241001533448 Hypoviridae Species 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 241000714210 Leviviridae Species 0.000 description 1
- 241001134453 Lista Species 0.000 description 1
- 102100038007 Low affinity immunoglobulin epsilon Fc receptor Human genes 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 241000253097 Luteoviridae Species 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001661687 Marnaviridae Species 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001112067 Metaviridae Species 0.000 description 1
- 241000456230 Mymonaviridae Species 0.000 description 1
- 241001112477 Narnaviridae Species 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 241000723741 Nodaviridae Species 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 206010033307 Overweight Diseases 0.000 description 1
- 241000209117 Panicum Species 0.000 description 1
- 235000006443 Panicum miliaceum subsp. miliaceum Nutrition 0.000 description 1
- 235000009037 Panicum miliaceum subsp. ruderale Nutrition 0.000 description 1
- 241001286534 Papanivirus Species 0.000 description 1
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 1
- 206010072369 Pharyngeal exudate Diseases 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000150354 Phenuiviridae Species 0.000 description 1
- 241000711904 Pneumoviridae Species 0.000 description 1
- 208000032236 Predisposition to disease Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241001112091 Pseudoviridae Species 0.000 description 1
- 206010064911 Pulmonary arterial hypertension Diseases 0.000 description 1
- -1 Pyrophosphate ions Chemical class 0.000 description 1
- 241000983876 Quadriviridae Species 0.000 description 1
- 241000712907 Retroviridae Species 0.000 description 1
- 241001534527 Roniviridae Species 0.000 description 1
- 241001515849 Satellite Viruses Species 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 241000489711 Sunviridae Species 0.000 description 1
- 208000002903 Thalassemia Diseases 0.000 description 1
- 241000016010 Tomato spotted wilt orthotospovirus Species 0.000 description 1
- 241000710915 Totiviridae Species 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 206010044688 Trisomy 21 Diseases 0.000 description 1
- 241001059845 Tymoviridae Species 0.000 description 1
- 241000196252 Ulva Species 0.000 description 1
- 235000010726 Vigna sinensis Nutrition 0.000 description 1
- 244000042314 Vigna unguiculata Species 0.000 description 1
- 241001346158 Virtovirus Species 0.000 description 1
- 241000489731 Wastrivirus Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N azithromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)N(C)C[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 MQTOSJVFKKJCRP-BICOPXKESA-N 0.000 description 1
- 229960004099 azithromycin Drugs 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 210000000941 bile Anatomy 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 description 1
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 208000015114 central nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 208000026106 cerebrovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 210000003756 cervix mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 208000007451 chronic bronchitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003246 corticosteroid Substances 0.000 description 1
- 229960001334 corticosteroids Drugs 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 208000010643 digestive system disease Diseases 0.000 description 1
- XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J dimagnesium;phosphonato phosphate Chemical compound [Mg+2].[Mg+2].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O XZTWHWHGBBCSMX-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- NSYZCCDSJNWWJL-YXOIYICCSA-N erythromycin ethylsuccinate Chemical compound O1[C@H](C)C[C@H](N(C)C)[C@@H](OC(=O)CCC(=O)OCC)[C@@H]1O[C@H]1[C@@](O)(C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)[C@@H](O)[C@](C)(O)[C@@H](CC)OC(=O)[C@H](C)[C@@H](O[C@@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@](C)(OC)C2)[C@@H]1C NSYZCCDSJNWWJL-YXOIYICCSA-N 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 208000018685 gastrointestinal system disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000019622 heart disease Diseases 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000009240 nasopharyngitis Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009340 pathogen transmission Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 210000004910 pleural fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009325 pulmonary function Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 210000004915 pus Anatomy 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 230000000391 smoking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 1
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 1
- 238000011476 stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960003433 thalidomide Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 229960003989 tocilizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000014599 transmission of virus Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000017105 transposition Effects 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- KCFYEAOKVJSACF-UHFFFAOYSA-N umifenovir Chemical compound CN1C2=CC(Br)=C(O)C(CN(C)C)=C2C(C(=O)OCC)=C1CSC1=CC=CC=C1 KCFYEAOKVJSACF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004626 umifenovir Drugs 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
- 239000002351 wastewater Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Virology (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于确定样本中预定的RNA序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：向待分析是否存在预定的RNA序列的样本中添加一种或多种提供RNA‑和DNA‑依赖性DNA聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；同时或之后向待分析是否存在预定的RNA序列的样本中添加至少五种DNA引物，其中，至少一种DNA引物包含与RNA序列可杂交的序列并且至少一种DNA引物包含与RNA序列反向互补的DNA序列可杂交的序列；在固定温度孵育由前述步骤产生的样本；并且，确定样本中是否存在延长的双链DNA序列，其中，样本中延长的双链DNA序列的存在表示样本中预定的RNA序列的存在，其中，预定的RNA序列为RNA病毒的一部分，并且其中未使用F3引物。
Description
本发明涉及一种用于确定样本中预定的RNA序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：向待分析是否存在预定的RNA序列的样本中添加一种或多种提供RNA-和DNA-依赖性DNA聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；同时或之后向待分析是否存在预定的RNA序列的样本中添加至少五种DNA引物，其中，至少一种DNA引物包含与RNA序列可杂交的序列并且至少一种DNA引物包含与与RNA序列反向互补的DNA序列可杂交的序列；在固定温度孵育由前述步骤产生的样本；并且，确定所述样本中是否存在延长的双链DNA序列，其中，所述样本中延长的双链DNA序列的存在表示所述样本中预定的RNA序列的存在，其中，所述预定的RNA序列为RNA病毒的一部分，并且其中未使用F3引物。
存在多种用于检测样本中RNA序列的存在的方法。然而，大多数已知的技术需要大量的时间。然而，在某些应用中，时间为限制因素。例如，野生动物群体中存在许多冠状病毒，但仅有少数发展出感染人类的能力，包括SARS-CoV、MERS-CoV以及新出现的SARS-CoV-2。它们都可以引起严重的呼吸的、胃肠的和中枢神经系统的疾病。
在许多情况下，冠状病毒感染未被患者识别或被识别为普通感冒。此外，冠状病毒在症状出现前的潜伏期(incubation time)为约4天至2周。这使得医疗保健系统跟踪病毒传播面临挑战。
此外，可用的分子病毒测试需要若干个小时以提供可靠的结果，并且必须在中央(centralized)实验室实施。在此期间，潜在感染者可能已经感染了其他人，从而进一步传播该病毒。
鉴于上述情况，迫切需要快速且可靠的检测方法用于确定样本中RNA的存在，特别是病毒RNA，更特别是来源于冠状病毒的RNA。
上述技术问题由本文所提供的并且如权利要求中所表征的实施方案解决。
因此，本发明涉及以下实施方案。
1.一种用于确定样本中预定的RNA序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)向待分析是否存在预定的RNA序列的所述样本中添加一种或多种提供RNA-和DNA-依赖性DNA聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；
(b)向待分析是否存在预定的RNA序列的所述样本中添加至少五种DNA引物，其中，至少一种DNA引物包含与所述RNA序列可杂交的序列并且至少一种DNA引物包含与与所述RNA序列反向互补的DNA序列可杂交的序列；
(c)在固定温度孵育步骤(a)和(b)产生的所述样本；
(d)确定所述样本中是否存在延长的双链DNA序列，
其中，所述样本中所述延长的双链DNA序列的存在表示所述样本中所述预定的RNA序列的存在，
其中，所述预定的RNA序列为RNA病毒的一部分，并且其中未使用F3引物。
2.根据实施方案1所述的方法，其中，所述至少五种引物中的四种分别为正向内引物(forward inner primer，FIP)、反向内引物(backward inner primer，BIP)、正向环引物(loop primer forward，LPF)和反向环引物(loop primer backward，LPB)。
3.根据实施方案1和2所述的方法，其中，所述第五种引物为B3引物。
4.根据实施方案1至3中任一项所述的方法，其中，具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶为逆转录酶或具有逆转录酶活性以及任选的链置换活性的DNA聚合酶。
5.根据实施方案1至4中任一项所述的方法，其中，RNA病毒为单链RNA病毒。
6.根据实施方案5所述的方法，其中，所述RNA病毒为冠状病毒。
7.根据实施方案6所述的方法，其中，所述冠状病毒(CoV)属于α-CoV属、β-CoV属、γ-CoV属或δ-CoV属。
8.根据实施方案6或7所述的方法，其中，所述冠状病毒选自由人类冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人类冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人类冠状病毒229E(HCoV-229E)、人类冠状病毒NL63(HCoV-NL63、纽黑文冠状病毒)、中东呼吸综合征相关的冠状病毒(MERS-CoV或“新型冠状病毒2012”)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV或“SARS-典型”)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2或“新型冠状病毒2019”)组成的组。
9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其中，所述固定温度在50℃和75℃之间。
10.根据实施方案1至9中任一项所述的方法，其中，将步骤(c)中的所述样本孵育1分钟至120分钟。
11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中，所述病毒为冠状病毒，所述引物中的一种或多种包括以下序列：
(a)FIP引物序列：CTT GCT CTT CTT CAG GTT GAC CAA GGT AAA CCT TTG；和/或
(b)BIP引物序列：GGT TAG ATG ATG ATA GTC CTG ATT GTC CTC ACT GCC；和/或
(c)LPF引物序列：AAG AGC AGC AGA AGT GGC AC；和/或
(d)LPB引物序列：CAA ACT GTT GGT CAA CAA G；和/或
(e)B3引物序列：GAA CCT CAA CAA TTG TTT GAA TAG。
12.根据实施方案1至11中任一项所述的方法，其中，通过使用与所述延长的双链DNA序列可杂交的核酸分子以确定所述样本中所述延长的双链DNA序列的存在，特别地其中所述核酸分子被标记，或通过使用嵌入所述延长的双链DNA序列的分子或使用浊度测量来确定所述样本中所述延长的双链DNA序列的存在。
13.一种用于治疗患者的抗病毒化合物，其中，所述患者先前已通过使用根据实施方案6至12中任一项所述的方法被确定为被冠状病毒科的病毒感染。
14.根据实施方案13所述的抗病毒化合物，其中，所述抗病毒化合物包括瑞德西韦(Remdesivir)。
因此，在第一方面，本发明涉及一种用于确定样本中预定的RNA序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：向待分析是否存在预定的RNA序列的样本中添加一种或多种提供RNA-和DNA-依赖性DNA聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；同时或之后向待分析是否存在预定的RNA序列的样本中添加至少五种DNA引物，其中，至少一种DNA引物包含与RNA序列可杂交的序列并且至少一种DNA引物包含与与RNA序列反向互补的DNA序列可杂交的序列；在固定温度孵育由前述步骤产生的样本；并且，确定所述样本中是否存在延长的双链DNA序列，其中，所述样本中延长的双链DNA序列的存在表示所述样本中预定的RNA序列的存在，其中，所述预定的RNA序列为RNA病毒的一部分，并且其中未使用F3引物。
如本文所使用的术语“预定的RNA序列”是指RNA序列，其中，本领域技术人员知晓它是RNA病毒的一部分。特别地，本发明中预定的RNA序列为使用本发明的方法可检测的序列。换言之，如果本领域技术人员能够使用本文所提供的方法确定序列是否可能在样本中检测到，那么本领域技术人员可获得的RNA序列是预定的。在本发明中，该预定的RNA序列包含至少一个引物结合位点，该至少一个引物结合位点与本发明的方法中使用的至少一种引物至少部分相同。如果序列完全相同或如果它们的不同之处仅在于一个序列包含尿嘧啶而非胸腺嘧啶和/或如果它们的不同之处仅在于一个序列包含一个或多个修饰的核苷酸而非各自的非修饰的核苷酸，那么引物结合位点被认为与引物位点相同。
如本文所使用的术语“DNA引物”或“引物”是指包含3’端-羟基的核酸分子，其在与互补核酸序列杂交时，可以例如通过酶催化的核酸复制反应伸长。根据本发明的引物对用于核酸的扩增，即用于LAMP分析或RT-LAMP分析。引物的长度的上限和下限均根据经验确定。本文所描述的DNA引物可以是正向引物或反向引物。如本文所使用的术语“反向引物”是指一种引物，其引发DNA序列的反义链以使得聚合酶沿DNA序列的互补链在一个方向上延伸。至少一个反向引物也可作为用于逆转录的RT引物。如本文所使用的术语“正向引物”是指一种引物，其引发DNA序列的有义链以使得聚合酶沿DNA序列的一条链在一个方向上延伸。
如本文所使用的术语“样本”是指可能包含预定的RNA序列的任何样品。本发明方法中使用的样品可以来源于活体(例如，植物和/或动物，优选人类，如支气管肺泡灌洗液、支气管冲洗液、咽渗出物、气管抽吸物、血液、血清、血浆、骨、皮肤、软组织、肠道样品、生殖道样品、母乳、淋巴、脑脊液、胸膜液、痰、尿、鼻分泌物、眼泪、胆汁、腹水、脓液、滑液、玻璃体液、阴道分泌物、精液和/或尿道组织)、原代或修饰的细胞、组织、细胞培养物、培养基、添加剂、细胞来源的产物、实验室设备、生物制药产物、微生物和/或，例如从食物、土壤和/或废水中分离的样本。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法实施从初始样本中分离预定的RNA序列，例如，使用表面活性剂的裂解处理、声波处理、使用玻璃珠的摇动搅拌或法式滤压方法(French press method)。在本发明的方法中，内源性核酸酶可以用于减少核酸分子的长度。在本发明的方法中，核酸的纯化可以通过例如苯酚萃取、色谱法、离子交换、凝胶电泳、密度依赖性离心和/或本领域技术人员已知的其它方法实施。
一种提供RNA-和DNA-依赖性DNA聚合酶活性的活性的酶可以基于由DNA或RNA链组成的模板以5′→3′方向合成DNA。如本领域技术人员所知晓的，这种酶将连续向模板的游离3′-羟基添加核苷酸。在这方面，模板链基于Watson-Crick碱基配对确定添加的核苷酸的序列。DNA聚合酶的活性可以是RNA-和/或DNA-依赖性的。示例性的聚合酶包括但不限于BstDNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Vent(外部-)DNA聚合酶、Deep Vent DNA聚合酶、Deep Vent(外部-)DNA聚合酶、Bca(外部-)DNA聚合酶、DNA聚合酶IKlenow片段、Φ29噬菌体DNA聚合酶、Z-TaqTM DNA聚合酶、嗜热性(ThermoPhi)聚合酶、9°Nm DNA聚合酶和KOD DNA聚合酶。例如，参见U.S.专利号5,814,506、5,210,036、5,500,363、5,352,778和5,834,285；Nishioka,M.,等(2001)J.Biotechnol.88,141；Takagi,M.,等(1997)Appl.Environ.Microbiol.63,4504。
作为提供RNA-依赖性DNA聚合酶活性的活性的酶，可以采用任何合适的逆转录酶。在这方面，待使用的酶没有被特别限制，条件是它具有使用RNA作为模板以合成cDNA的活性。此外，可以添加提高核酸扩增酶的耐热性的物质，如海藻糖。
当在本说明书中简单地表述为“5'-端侧”或“3'-端侧”时，其表示在所有情况下都被视为模板的链中的方向。此外，当描述3'-端侧成为互补链合成的起点时，其表示3'-端侧-羟基为互补链合成的起点。
如本文所使用的术语“链置换”是指在引物引发的合成过程中，酶分离双链DNA分子和/或双链RNA分子中的DNA和/或RNA链的能力。
如本文所使用的术语“杂交”是指互补的核酸分子的退火。当两个核酸彼此“杂交”时，或者当一个核酸与另一个核酸“杂交”时，这两个核酸分子表现出足够数量的互补核碱基，使得这两个核酸分子可以在用于特定的反应的特定条件(例如，温度、盐和其它缓冲条件)下彼此退火。最常见的杂交的机制涉及核酸分子的互补核碱基之间的氢键合(例如，Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen氢键合)。杂交可以在不同条件下发生。严格条件是序列依赖性的并且由待杂交的核酸分子的性质和组成确定。核酸杂交技术和条件是本领域技术人员已知的并且已经被广泛描述。例如参见Sambrook et al,MolecularCloning:A Laboratory Manual 2nd ed.；Cold Spring Harbor Press,1989；Ausubel etal,1987,Current Protocols in Molecular Biology；Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York；Tijessen,1993,Hybridization with Nucleic Acid Probes,Elsevier Science Publishers,B.V.；以及Kricka,1992,Non-Isotopic DNA ProbeTechniques,Academic Press,San Diego,California。
如本文所使用的术语“F3”是指引物对的外部正向引物。
虽然以前的LAMP方法假定F3引物在扩增过程(例如参见Nagamine etal.2002.Molecular and Cellular Probes 16.223-229)中是释放cDNA链所必需的，发明人发现，省略F3引物不会损害扩增过程。
然而，在本发明中，令人意外地发现其中省略了F3引物的五引物系统在检测预定的RNA序列中是最有效的。如本文所使用的“最有效的”的意思是检测比通常使用的技术更快速和更灵敏，但保持了可靠性，这是用于检测病毒感染的测试的先决条件。此外，发现通过使用五种引物代替标准LAMP技术中的六种引物，可以检测到较短的靶序列。
本发明提供了一种含有预定的RNA序列的样本，以及一种用于扩增核酸的方法，其包括：在其中存在至少一种本发明的引物的反应系统中实施样本中的预定的RNA序列的扩增反应。在本发明的一些实施方案中，至少一类(species)引物用于本发明的核酸扩增反应。换言之，本文所描述的DNA引物可以与其它引物组合使用，或可以使用两类本文所描述的DNA引物。
在本发明的方法中优选的是，使用五种不同的引物。在一些实施方案中，本发明中采用的至少两种引物是环引物。
如本文所使用的术语“环引物”是指一种DNA引物，其包含与预定的RNA序列的扩增产物的至少一个环区可杂交的序列。该环区是通过扩增产物链退火至自身而形成的。通常，环引物与生成的DNA序列杂交，并且为进一步DNA延伸过程的启动提供增加的数量的起点。环引物的使用可以加速扩增过程。
在本发明中优选的是，所述至少五种引物中的四种分别为正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LPF)和反向环引物(LPB)。
如本文所使用的术语“FIP”或“正向内引物”是指包含用于链引发的序列和与相同的FIP引发的链可杂交的序列的正向引物。
如本文所使用的术语“BIP”或“反向内引物”是指包含用于链引发的序列和与相同的BIP引发的链可杂交的序列的反向引物。
如本文所使用的术语“正向环引物”或“LPF”是指作为正向引物的环引物。
如本文所使用的术语“反向环引物”或“LPB”是指作为反向引物的环引物。
这些术语常用于与环介导等温扩增(loop-mediated isothermalamplification，LAMP)方法相关的方法，如由Nagamine et al.2002.Molecular andCellular Probes 16.223-229所描述的那些。
因此，在本发明的方法中优选的是，所述第五种引物为B3引物。
如本文所使用的术语“B3”是指引物对的外部反向引物。本文所描述的特异性结合至靶核酸或其互补序列的DNA引物的长度可以是至少10、15或19个核苷酸，B3的长度是至少18、20、22或24个核苷酸，FIP和BIP的长度是至少25、30、33或36个核苷酸，以及LPF和LPB的长度是至少10、15、17或19个核苷酸。特异性结合至靶核酸序列的DNA引物可以具有与相应区域至少80％的互补性的核酸序列，特别是90％的互补性，更特别是95％、96％、97％、98％、99％或100％的互补性。
在本发明中未使用F3引物。这是因为发明人意外地发现，在存在B3引物但不存在F3引物的情况下，检测更快且更灵敏。使用本发明的方法，观察到检测在10分钟内是可能的，并且对检测样本中少量的预定的RNA序列更灵敏。换言之，如所附实施例中所示的，使用五种引物，特别是FIP、BIP、LPF、LPB和B3，在添加引物和酶之后10分钟内实现了冠状病毒的预定的RNA序列的阳性检测。因此，本发明的方法第一次提供了检测病毒感染的可靠和快速的方式，这在控制病毒感染的疫情爆发中是重要的。
在本发明的方法中，使用了一种或多种提供RNA-和DNA-依赖性DNA聚合酶活性与链置换活性的活性的酶。换言之，所有三种活性都要添加到待分析的RNA序列中。活性可以由一种具有全部三种活性的酶提供，或者由若干种各自具有三种活性中的一种或多种的酶提供。
在本发明的方法中优选的是，包含预定的RNA序列的RNA病毒为冠状病毒。然而，该RNA病毒可以是任何种类的。
如本文所使用的术语“RNA病毒”是指使用RNA作为它的遗传物质的任何病毒。
在一些情况下，RNA病毒可以是选自由dsRNA病毒、正义ssRNA病毒(positive-sense ssRNA virus)和反义ssRNA病毒(negative-sense ssRNA virus)组成的组的病毒。在一些实施方案中，RNA病毒可以是选自由以下组成的组的病毒：混合病毒科(Amalgaviridae)、双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)、金色病毒科(Chrysoviridae)、囊状噬菌体科(Cystoviridae)、内源核糖核酸病毒科(Endornaviridae)、低毒性病毒科(Hypoviridae)、巨大双分核糖核酸病毒科(Megabirnaviridae)、分体病毒科(Partitiviridae)、小双节病毒科(Picobirnaviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、整体病毒科(Totiviridae)、Quadriviridae、Botybirnavirus、未指定的dsRNA病毒、动脉炎病毒科(Arteriviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)(尤其包括冠状病毒、SARS-CoV)、海洋病毒科(Mesoniviridae)、杆状套病毒科(Roniviridae)、二顺反子病毒科(Dicistroviridae)、传染性软化病毒科(Iflaviridae)、海洋RNA病毒科(Marnaviridae)、微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)、伴生豇豆病毒科(Secoviridae)、甲型线形病毒科(Alphaflexiviridae)、乙型线形病毒科(Betaflexiviridae)、丙型线形病毒科(Gammaflexiviridae)、芜菁发黄镶嵌病毒科(Tymoviridae)、阿尔法四体病毒科(Alphatetraviridae)、蜂窝状病毒科(Alvernaviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、杆菌状核糖核酸病毒科(Barnaviridae)、甜菜坏死黄脉病毒科(Benyviridae)、葡萄孢欧尔密病毒科(Botourmiaviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、杯状病毒科(Caliciviridae)、香石竹斑驳病毒样四体病毒科(Carmotetraviridae)、长线形病毒科(Closteroviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、Fusariviridae、肝炎病毒科(Hepeviridae)、低毒性病毒科(Hypoviridae)、光滑病毒科(Leviviridae)、黄症病毒科(Luteoviridae)、多顺反子类小RNA病毒科(Polycipiviridae)、裸露RNA病毒科(Narnaviridae)、野田村病毒科(Nodaviridae)、复制酶置换四体病毒科(Permutotetraviridae)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、小节肢动物病毒科(Sarthroviridae)、Statovirus、披膜病毒科(Togaviridae)、番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)、植物杆状病毒科(Virgaviridae)、未指定的正义ssRNA病毒属、秦病毒科(Qinviridae)、蛇形病毒科(Aspiviridae)、楚病毒科(Chuviridae)、玻那病毒科(Bornaviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、真菌单分子负链RNA病毒科(Mymonaviridae)、尼亚米病毒科(Nyamiviridae)、副黏液病毒科(Paramyxoviridae)、肺病毒科(Pneumoviridae)、炮弹病毒科(Rhabdoviridae)、阳光病毒科(Sunviridae)、Anphevirus、Arlivirus、Chengtivirus、Crustavirus、Wastrivirus、越病毒科(Yueviridae)、沙状病毒科(Arenaviridae)、甲壳类林肯病毒科(Cruliviridae)、费拉病毒科(Feraviridae)、无花果花叶病毒科(Fimoviridae)、汉坦病毒科(Hantaviridae)、米卡多病毒科(Jonviridae)、内罗病毒科(Nairoviridae)、泛布尼亚病毒科(Peribunyaviridae)、幻影病毒科(Phasmaviridae)、白纤病毒科(Phenuiviridae)、番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)、Tilapineviridae、罗非鱼病毒科(Amnoonviridae)、正黏液病毒科(Orthomyxoviridae)、卫星病毒(尤其包括小节肢动物病毒科(Sarthroviridae)、烟草坏死卫星病毒属(Albetovirus)、绿萝卫星病毒属(Aumaivirus)、黍花叶卫星病毒属(Papanivirus)、烟草花叶卫星病毒属(Virtovirus)、慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic beeparalysis virus))、逆转录病毒科(Retroviridae)、转座病毒科(Metaviridae)以及假病毒科(Pseudoviridae)。
在本发明中，冠状病毒特别可以属于α-CoV属、β-CoV属、γ-CoV属或δ-CoV属。更具体地，该冠状病毒可以选自由人类冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人类冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人类冠状病毒229E(HCoV-229E)、人类冠状病毒NL63(HCoV-NL63、纽黑文冠状病毒)、中东呼吸综合征相关的冠状病毒(MERS-CoV或“新型冠状病毒2012”)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV或“SARS-典型”)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2或“新型冠状病毒2019”)组成的组。
在一些方面，本文所描述的RNA-病毒是与本文所描述的至少一种RNA-病毒的病毒基因组序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％序列同一性的变体。在一些实施方案中，本文所描述的SARS-CoV-2为SARS-CoV-2变体。在一些实施方案中，本文所描述的SARS-CoV-2变体为选自由以下组成的组的SARS-CoV-2变体：B.1.1.207谱系、B.1.1.7谱系、5簇、501.V2变体、P.1谱系、B.1.429/CAL.20C谱系、B.1.427谱系、B.1.526谱系、B.1.525谱系、B.1.1.317谱系、B.1.1.318谱系、B.1.351谱系、B.1.617谱系以及P.3谱系。在一些实施方案中，本文所描述的SARS-CoV-2变体为由Nextstrain分支描述的SARS-CoV-2变体，其选自组19A、20A、20C、20G、20H、20B、20D、20F、20I和20E。在一些实施方案中，本文所描述的SARS-CoV-2病毒为包含至少一个突变的SARS-CoV-2变体，该突变选自由D614G、E484K、N501Y、S477G/N、P681H、E484Q、L452R和P614R组成的组。在一些实施方案中，本文所描述的SARS-CoV-2变体为SARS-CoV-2变体或衍生自本文所描述的变体的杂交体(hybrid)。
在本发明的方法中，特别是在其步骤(c)中，温度可以是固定的。
如本文所使用的术语“固定温度”是指保持温度条件恒定或几乎恒定，使得酶和引物可以实质上(substantially)起作用。几乎恒定的温度条件的意思是，不仅设定温度被精确地保持，而且温度的轻微改变在它不破坏酶和引物的实质性功能的程度内是可接受的。例如，约从0℃到10℃的温度改变是可接受的。
可以通过将温度保持在可以维持待使用的酶的活性的水平来实施在固定温度下的核酸扩增反应。此外，为了在所述核酸扩增反应中实现引物与靶核酸的退火，例如，为了设定反应温度，可以将温度设定在引物的Tm值附近或低于该Tm值，并且优选通过考虑引物的Tm值而将其设定在严格性水平。在所述核酸扩增反应中，扩增反应可以被重复直到酶失活或包括引物的试剂之一用完。
换言之，在恒定的温度下在相同的管中孵育一种或多种酶、DNA引物和待分析的样本。该温度优选在50℃和75℃之间。然而，温度也可以更低，例如30℃至75℃。在可替代的实施方案中，使用降落式(touchdown)温度步骤。换言之，在分析过程中降低温度，例如从70℃的温度开始，然后降低至50℃。
在本发明的方法中，将一种或多种酶、DNA引物和待分析的样本在相同管中孵育1至120分钟，优选1至60分钟、1至45分钟、1至30分钟或1至15分钟。在一优选的实施方案中，将样本孵育3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30分钟。
在本发明中优选的是，所述病毒为冠状病毒。在本发明的这种实施方案中，优选的引物序列如下所示：
(a)FIP引物序列：CTT GCT CTT CTT CAG GTT GAC CAA GGT AAA CCT TTG(SEQ IDNO:1)；和/或
(b)BIP引物序列：GGT TAG ATG ATG ATA GTC CTG ATT GTC CTC ACT GCC(SEQ IDNO:2)；和/或
(c)LPF引物序列：AAG AGC AGC AGA AGT GGC AC(SEQ ID NO:3)；和/或
(d)LPB引物序列：CAA ACT GTT GGT CAA CAA G(SEQ ID NO:4)；和/或
(e)B3引物序列：GAA CCT CAA CAA TTG TTT GAA TAG(SEQ ID NO:5)。
上述引物序列靶向冠状病毒的序列。特别地，上述引物靶向以下序列
对应于登录号NC_045512.2的碱基3129-3290的ACCAAGGTAAACCTTTGGAATTTGGTGCCACTTCTGCTGCTCTTCAACCTGAAGAAGAGCAAGAAGAAGATTGGTTAGATGATGATAGTCAACAAACTGTTGGTCAACAAGACGGCAGTGAGGACAATCAGACAACTACTATTCAAACAATTGTTGAGGTTC(SEQ ID NO:7)。
在一些实施方案中，本发明的方法中使用的引物，特别是用于冠状病毒的引物，包含至少一种选自以下的引物：
a)FIP引物，其包含与序列SEQ ID NO:1具有至少88％、91％、94％、97％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
b)BIP引物，其包含与序列SEQ ID NO:2具有至少88％、91％、94％、97％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
c)LPF引物，其包含与序列SEQ ID NO:3具有至少85％、90％、95％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
d)LPB引物，其包含与序列SEQ ID NO:4具有至少84％、89％、94％或100％序列同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，以及
e)B3引物，其包含与序列SEQ ID NO:5具有至少83％、87％、91％、95％或100％同一性的序列，该序列仍然提供引物功能性，
优选地，其中，该引物功能性是在SEQ ID NO:7处的引物功能性。
在一些实施方案中，本发明方法中使用的引物包含至少一种在冠状病毒基因组(特别是在SARS-CoV-2基因组)提供引物功能性并且具有与序列(选自由以下组成的组：SEQID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56)具有至少85％、90％、95％或100％序列同一性的序列的引物。
在一些实施方案中，本发明方法中使用的引物包含至少一种在冠状病毒基因组(特别是在SARS-CoV-2基因组)提供引物功能性并且具有与序列(选自由以下组成的组：a)SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24或SEQ IDNO:25；b)SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30或SEQID NO:31；c)SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36；d)SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50或SEQ ID NO:51；以及e)SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56)具有至少85％、90％、95％或100％序列同一性的序列的引物。
相对于参考序列的“序列同一性百分比(％)”被定义为，在比对序列并引入间隙(如有必要)以实现最大序列同一性百分比之后，候选序列中与参考序列中的核苷酸相同的核苷酸的百分比。以确定氨基酸序列同一性百分比为目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在被比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
然而，本领域技术人员熟知如何根据样本中待检测的靶序列设计可替代的或另外的引物序列(例如参见Jia,B.,et al.,2019,Frontiers in microbiology,10,2860)。
本发明的方法包括确定样本中是否存在延长的双链DNA序列的步骤，特别地，其中，样本中延长的双链DNA序列的存在表示样本中预定的RNA序列的存在。本领域技术人员熟知适用于确定样本中延长的双链DNA序列的存在的方法，特别是在待检测的序列已知的情况下。因此，本领域技术人员已知的用于该目的的任何方法都可以用在本发明中。然而，优选地，通过使用一种嵌入延长的双链DNA并由此开始发出可以用专门的设备检测和定量的荧光的分子，以确定延长的双链DNA的存在。其它方法可以用于确定DNA的延长，如使用与延长的双链DNA序列可杂交的核酸分子，特别地，其中，核酸分子被标记或结合至表面，或使用酶反应的浊度测量。
如本文所使用的术语“标记”或其语法变体是指任何可检测的或生成信号的分子或报告分子(reporter molecule)。方便的标记包括比色标记、化学发光标记、生色标记、放射性标记和荧光标记，但是也可以使用酶标记(例如比色、发光、生色)或基于抗体的标记方法或信号生成系统。因此，如本文所使用的术语“标记”不仅包括直接可检测的信号发出或无源(passive)的部分，而且包括生成信号或参与信号生成反应的任何部分或可以以某种方式间接检测的任何部分。如本文所使用的“标记的”是指与可检测的标记相连接或者连接至可检测的标记。
可以通过荧光报告来实现确定样本中是否存在延长的双链DNA序列。此类方法中的大多数基于嵌入染料的使用，染料如溴化乙锭、SYBR Green、EvaGreen和YO-PRO-I(ZhangX,et al.2013,PLoS One 8(12):e82841；Mair G.et al.2013,BMC Veterinary Research9:108)。如本文所使用的，“嵌入”的试剂或染料是指能够在核酸双螺旋中的堆叠的碱基对之间非共价插入的试剂或部分。可以通过依赖于荧光共振能量转移(Forster resonanceenergy transfer，FRET)的机制的荧光技术来实现确定样本中是否存在延长的双链DNA序列(Chen Q,et al.,1997,Biochemistry 36(15):4701-11)。在本发明的某些实施方案中，LPB和/或LPF在5'端被至少一个标记和/或受体荧光团标记。
如本文所使用的术语“浊度”是指使光被散射或吸收的流体或透明固体中的悬浮的和/或可溶颗粒的度量。在本发明的某些实施方案中，间接确定样本中是否存在延长的双链DNA序列本质上依赖于作为反应副产物的焦磷酸盐的形成。焦磷酸根离子可以通过在核酸聚合期间将脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)结合至DNA链中而被释放，并且这些离子与反应混合物中存在的二价金属离子(特别是镁离子)反应，以生成白色不溶性焦磷酸镁沉淀物，如Mori Y.等人所描述(2001(Biochem.Biophys.Res.Commun.289:150-154))。这种参与导致反应溶液的浊度的逐渐增加，并且焦磷酸盐沉淀物可以依据浊度进行定量测量，或在离心后作为沉淀块通过肉眼观察到。在本发明的可替代的实施方案中，通过在反应中掺入锰离子和钙黄绿素来实现确定样本中是否存在延长的双链DNA序列。钙黄绿素的荧光由于锰离子的结合自然淬灭。作为反应副产物的焦磷酸盐的生成通过沉淀从缓冲液中去除锰离子，并且与恢复的钙黄绿素荧光相结合的增加的浊度使得在可见光或紫外光激发下可以容易地目视读出(Tomita N.,et al.2008.Nat.Protoc.3:877-882)。在本发明的另一个实施方案中，通过由热稳定的萤火虫荧光素酶产生的生物发光监测在DNA合成过程中产生的焦磷酸盐向ATP的酶转化，用于确定样本中是否存在延长的双链DNA序列(Gandelman OA.,etal.2010,PLoS One 5(11):el4155)。
通常，由Becherer，Lisa等人("Loop-mediated isothermal amplification(LAMP)–review and classification of methods for sequence-specific detection."Analytical Methods 12.6(2020):717-746)描述的所有方法都可以与本发明的方法结合。
本发明还涉及一种治疗被冠状病毒科的病毒(特别是，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2))感染的患者的方法，该方法包括向患者施用有效量的抗病毒治疗，其中，患者先前已通过使用本发明的方法被确定为被冠状病毒科的病毒感染。优选的是，抗病毒治疗包括向患者施用有效量的瑞德西韦。
在一些实施方案中，本发明涉及一种治疗被冠状病毒科的病毒(特别是，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2))感染的患者的方法，该方法包括向患者施用有效量的抗病毒治疗，其中，患者先前已通过使用本发明的方法被确定为被冠状病毒科的病毒感染。
在一些实施方案中，本发明涉及一种用于治疗患者的抗病毒化合物，其中，所述患者先前已通过使用本发明的方法被确定为被冠状病毒科的病毒(特别是，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2))感染。
如本文所使用的术语“抗病毒化合物”是指对病毒和/或病毒相关的疾病的症状具有效果的化合物。对病毒的效果尤其可以包括预防、抑制、压制、减少、不利地影响和/或干扰病毒的生长、存活、复制、功能和/或传播的性质。在一些实施方案中，抗病毒化合物选自由疫苗、免疫调节剂、心血管调节剂、肺功能调节剂和病毒复制抑制剂组成的组。
在一些实施方案中，抗病毒化合物是至少一种选自以下的化合物：地瑞那韦(darunavir)、奥司他韦(oseltamivir)、阿比朵尔(umifenovir)、法匹拉韦(favipiravir)、利巴韦林(ribavirin)、甲磺酸萘莫司他(nafamostat mesylate)、甲磺酸卡莫司他(camostat mesylate)、洛匹那韦(lopinavir)、利托那韦(ritonavir)、奈非那韦(nelfinavir)、替考拉宁(teicoplanin)、阿奇霉素(azithromycin)、氯喹(chloroquine)、羟氯喹(hydroxy chloroquine)、沙利度胺(thalidomide)、贝伐单抗(bevacizumab)、托珠单抗(tocilizumab)、沙利鲁单抗(sarilumab)、阿那白滞素(anakinra)、干扰素(a、β、X)、氯沙坦(losartan)、皮质类固醇(例如甲基强的松龙(methylprednisolone))、伊维菌素(ivermectin)、硝唑尼特(nitazoxanide)、依米丁(emetine)、法莫替丁(famotidin)、肝素(heparin)、EIDD-2801和双嘧达莫(dipyridamole)。
这些化合物在病毒性疾病中的用途和剂量是本领域技术人员已知的(例如参见Tarighi,P.,et al.,2021,European Journal of Pharmacology,173890以及其中引用的试验的文件和研究方案)。
如本文所使用的术语“治疗(treatment)”(及其语法变型，如“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指一种临床干预，旨在改变正在治疗的个体的自然进程，并且可以用于预防或在临床病理学过程中实施。治疗的理想的效果包括但不限于：预防疾病的发生或复发，症状的减轻，疾病的任何直接的或间接的病理结果的减弱，防止转移，降低疾病进展的速度，疾病状态的改善或缓和，以及缓解或改善的预后。
如本文所使用的术语“患者”是指动物，包括哺乳动物，优选人类。在一些实施方案中，本文所描述的患者具有在病毒感染后增加不利的疾病进展的风险的易染病体质(predisposition)。在一些实施方案中，在病毒感染时增加不利的疾病进展的风险的易染病体质为一种病症，其选自由以下组成的组：癌症、慢性肾病、慢性肺病(例如COPD、哮喘、间质性肺病、囊性纤维化和肺高压(pulmonary hypertension)、肺气肿、慢性支气管炎、损伤的或结疤的肺组织、间质性肺病)、肺动脉高压症(pulmonary hypertension)、神经系统疾病(例如痴呆症、阿尔茨海默病)、糖尿病、唐氏综合症、心脏病(例如心力衰竭、冠状动脉疾病、心肌病或高血压)、HIV感染、免疫功能低下状态、肝病、超重、肥胖、妊娠、镰状细胞病、地中海贫血、吸烟、实体器官移植、血液干细胞移植、中风、脑血管疾病和物质使用障碍。
如本文所使用的术语“瑞德西韦”不仅指药物本身，还指该药物的活性代谢物及其任何药物组合物。在本发明的优选实施方案中，可以注射和/或吸入瑞德西韦。
因此，患者可以受益于早期治疗，例如，在(严重)症状出现之前的预防性治疗，该患者先前已通过使用本发明的方法被确定为被冠状病毒科的病毒感染。
在一些实施方案中，本发明涉及一种用于治疗患者的抗病毒化合物，其中，该患者先前已通过使用本发明的方法被确定为未被冠状病毒科的病毒感染，优选地其中，该抗病毒化合物为疫苗。
本发明的方法可以有效地确定病原体，并且促进早期检测、筛查、监测和/或确认过去的感染。这种促进的检测可以改善感染的治疗，减少病原体传播和/或避免疾病进展。
因此，本发明能够确定特别受益于抗病毒治疗和抗病毒治疗的改善的受试者。
为了实施本发明的方法，可以通过收集必要的试剂来制备试剂盒。在另一个实施方案中，本发明涉及一种试剂盒，特别是用于检测样本中的病毒RNA的试剂盒。试剂盒包含一种或多种、优选全部五种或六种引物，用于检测预定的RNA序列。在本发明的某些实施方案中，试剂盒可以包含提供RNA和/或DNA聚合酶活性和链置换活性的酶、核酸合成酶、dNTP、缓冲液、熔解温度调节剂、反应容器和说明书。通过使用此类试剂盒，可以仅通过向上述反应容器中添加样本并将所述反应容器保持在一定温度来实施核酸扩增反应。
试剂盒还可以包含多于一个的引物系统，特别是靶向相同RNA病毒的不同序列的两个或更多个引物系统，例如通过使用含有淬灭剂-荧光团双链区的引物(Tanner NA,Zhang Y,Evans TC Jr.Simultaneous multiple target detection in real-time loop-mediated isothermal amplification.Biotechniques.2012；53(2):81-89.)。此类试剂盒对于同时检测多种医学病症和/或检测多种RNA病毒或多种病毒的变体可以是特别有用的。在这方面，令人意外地发现，由于减少的引物干扰，减少的引物数量导致多于一种引物系统的可用性提高。
在本发明的特别优选的实施方案中，本发明的(在上下文中待制备的)试剂盒或本发明的方法和用途还可以包括或提供有使用手册(instruction manual)。例如，所述使用手册可以指导技术人员如何在本文提供的诊断用途中和根据本发明使用本发明的试剂盒。特别地，所述使用手册可以包括使用或应用本文提供的方法或用途的指南。
除非另有定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管类似于或相当于本文所描述的方法和材料的那些可以用于本发明的实践或测试中，但是下文描述了合适的方法和材料。如果存在冲突，将以本说明书(包括定义)为准。此外，材料、方法和实施例仅为说明性的，而并非旨在限制。
除非另有说明，否则可以根据本领域众所周知的常规方法以及在遍及本说明书中引用的和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所描述的方法来实施本文所描述的一般方法和技术。例如，参见Sambrook et al.,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2ded.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)和Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates(1992),以及Harlow and Lane Antibodies:ALaboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)。
虽然在附图和前文的描述中详细说明并描述了本发明的方面，但是这种说明和描述被认为是说明性或示例性的，而不是限制性的。可以理解的是，在以下权利要求的范围和精神内，本领域技术人员可以进行改变和修改。特别地，本发明涵盖了具有来自上文和下文描述的不同实施方案的特征的任何组合的其它实施方案。
此外，在权利要求书中，词语“包括/包含(comprising)”不排除其它元素或步骤，而不定冠词“一个(a)”或“一种(an)”不排除多个。单个单元可以实现权利要求中列举的若干特征的功能。特别地，与属性或值相关的术语“本质上”、“约”、“近似”等也分别准确地定义了属性或值。权利要求中的任何附图标记都不应被解释为对范围的限制。
图1示出了本发明的5引物系统和6引物系统对具有SARS-CoV-2RNA的低拷贝数的样本的灵敏度比较。
图2示出了在其后使用5引物系统和6引物系统确定信号的时间。
实施例
以下是本发明的方法和组合物的实施例。可以理解的是，考虑到上面提供的一般描述，可以实施各种其它实施例。
不具有F3的新的5引物系统与具有F3的6引物系统一样有效地扩增SARS-CoV2 RNA
表1-引物
表2-引物混合物:新的5引物系统
| 终浓度 | |
| FIP | 1.6μM |
| BIP | 1.6μM |
| LPF | 0.8μM |
| LPB | 0.8μM |
| B3 | 0.4μM |
表3-引物混合物:LAMP 6引物系统
| 终浓度 | |
| FIP | 1.6μM |
| BIP | 1.6μM |
| LPF | 0.8μM |
| LPB | 0.8μM |
| B3 | 0.2μM |
| F3 | 0.2μM |
表4-引物/酶混合物(PEM)
| Vol/rx | |
| 等温反应混合物(master mix) | 15.0μl |
| 引物混合物 | 2.0μl |
| 17.0μl |
每次反应添加17.0μl的PEM
模板添加
添加8.0μl提取的RNA
添加8.0μl作为阴性分析对照的无核糖核酸酶(RNase)的H2O
表5-用于等温扩增与染料采集的设置
序列表
<110> 恩德诊断股份公司
<120> 用于确定样本中预定的RNA序列的存在的等温实时PCR方法
<130> AB1828 PCT BS
<150> EP20179109.2
<160> 56
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> FIP引物
<400> 1
cttgctcttc ttcaggttga ccaaggtaaa cctttg 36
<210> 2
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BIP引物
<400> 2
ggttagatga tgatagtcct gattgtcctc actgcc 36
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LPF引物
<400> 3
aagagcagca gaagtggcac 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> LPB引物
<400> 4
caaactgttg gtcaacaag 19
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> B3引物
<400> 5
gaacctcaac aattgtttga atag 24
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> F3引物
<400> 6
gccatcaact caatatgagt atg 23
<210> 7
<211> 162
<212> RNA
<213> 冠状病毒科
<220>
<223> SARS-CoV-2的登录号NC_045512.2的碱基3129-3290
<400> 7
accaaggtaa acctttggaa tttggtgcca cttctgctgc tcttcaacct gaagaagagc 60
aagaagaaga ttggttagat gatgatagtc aacaaactgt tggtcaacaa gacggcagtg 120
aggacaatca gacaactact attcaaacaa ttgttgaggt tc 162
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 8
cttgctcttc ttcaggttgg attaccaagg taaacctttg 40
<210> 9
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 9
cttgctcttc ttcaggttgg attaccaagg taaacctttg g 41
<210> 10
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 10
cttgctcttc ttcaggttgg atgattacca aggtaaacct ttgg 44
<210> 11
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 11
cttgctcttc ttcaggtgat gattaccaag gtaaaccttt gg 42
<210> 12
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 12
cttcttcttg ctcttcttcg atgattacca aggtaaacct ttgg 44
<210> 13
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 13
cttcttcttg ctcttctgat gattaccaag gtaaaccttt gg 42
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 14
cttgctcttc ttcaggttgg gtaaaccttt ggaatttg 38
<210> 15
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 15
cttgctcttc ttcaggttgg gtaaaccttt ggaatttgg 39
<210> 16
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 16
cttgctcttc ttcaggttgg gtaaaccttt ggaatttggt 40
<210> 17
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 17
cttcttcttg ctcttcttcg gtaaaccttt ggaatttg 38
<210> 18
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 18
cttcttgctc ttcttcggta aacctttgga atttgg 36
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 19
cttcttcttg ctcttcttcg gtaaaccttt ggaatttgg 39
<210> 20
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 20
cttcttcttg ctcttcggta aacctttgga atttgg 36
<210> 21
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 21
cttgctcttc ttcaggttga ccaaggtaaa cctttgg 37
<210> 22
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 22
cttgctcttc ttcaggttga ccaaggtaaa cctttgga 38
<210> 23
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 23
cttgctcttc ttcaggttga ccaaggtaaa cctttggaa 39
<210> 24
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 24
cttgctcttc ttcaggttgg atgattacca aggtaaacc 39
<210> 25
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 25
cttgctcttc ttcaggttgt gattaccaag gtaaacc 37
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 26
tgaagagcag cagaagtggc ac 22
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 27
aagagcagca gaagtggc 18
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 28
gaagagcagc agaagtgg 18
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 29
ttgaagagca gcagaagtgg 20
<210> 30
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 30
ggtttacctt ggtaatc 17
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 31
gtttaccttg gtaatcatc 19
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 32
caacaaactg ttggtcaaca ag 22
<210> 33
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 33
acaaactgtt ggtcaac 17
<210> 34
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 34
gaccaacagt ttgttgac 18
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 35
caacaagacg gcagtgag 18
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 36
aacaagacgg cagtgaggac 20
<210> 37
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 37
ggttagatga tgatagtcgt tgtctgattg tcctcactgc c 41
<210> 38
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 38
ggttagatga tgatagtcgt tgtctgattg tcctcactgc 40
<210> 39
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 39
gttagatgat gatagtcagt tgtctgattg tcctcactgc c 41
<210> 40
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 40
ggttagatga tgatagtcgt tgtctgattg tcctcactg 39
<210> 41
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 41
tggttagatg atgatagtcg ttgtctgatt gtcctcactg 40
<210> 42
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 42
ggttagatga tgatagtctg attgtcctca ctgccgtc 38
<210> 43
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 43
ggttagatga tgatagtcgt tgtctgattg tcctcac 37
<210> 44
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 44
gattggttag atgatgttgt cctcactgcc gtcttg 36
<210> 45
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 45
gattggttag atgatggatt gtcctcactg ccgtcttg 38
<210> 46
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 46
gattggttag atgatgtgtc tgattgtcct cactgc 36
<210> 47
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 47
ggttagatga tgatagtcgt agttgtctga ttgtcctc 38
<210> 48
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 48
gatgatgata gtcaacagaa tagtagttgt ctgattg 37
<210> 49
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 49
gatgatagtc aacaaactgg aatagtagtt gtctgattg 39
<210> 50
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 50
gatgatgata gtcaacaagt agttgtctga ttgtc 35
<210> 51
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 51
gatgatagtc aacaaactga gtagttgtct gattgtc 37
<210> 52
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 52
caattgtttg aatagtagtt g 21
<210> 53
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 53
cctcaacaat tgtttgaata gtag 24
<210> 54
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 54
gaacctcaac aattgtttga atag 24
<210> 55
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 55
aggttgaacc tcaacaattg tttg 24
<210> 56
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223>引物序列
<400> 56
ctctaattga ggttgaacct caac 24
Claims (14)
1.一种用于确定样本中预定的RNA序列的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)向待分析是否存在预定的RNA序列的所述样本中添加一种或多种提供RNA-依赖性和DNA-依赖性DNA聚合酶活性与链置换活性的活性的酶；
(b)在步骤(a)的同时或在步骤(a)之后，向待分析是否存在预定的RNA序列的所述样本中添加至少五种DNA引物，其中，至少一种DNA引物包含与所述RNA序列可杂交的序列并且至少一种DNA引物包含与与所述RNA序列反向互补的DNA序列可杂交的序列；
(c)在固定温度孵育步骤(a)和(b)产生的所述样本；
(d)确定所述样本中是否存在延长的双链DNA序列，
其中，所述样本中所述延长的双链DNA序列的存在表示所述样本中所述预定的RNA序列的存在，
其中，所述预定的RNA序列为RNA病毒的一部分，并且其中未使用F3引物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述至少五种引物中的四种分别为正向内引物(FIP)、反向内引物(BIP)、正向环引物(LPF)和反向环引物(LPB)。
3.根据权利要求1和2所述的方法，其中，所述第五种引物为B3引物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中，具有RNA依赖性DNA聚合酶活性的酶为逆转录酶和/或具有逆转录酶活性的DNA聚合酶。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中，RNA病毒为单链RNA病毒。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述RNA病毒为冠状病毒。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述冠状病毒属于α-CoV属、β-CoV属、γ-CoV属或δ-CoV属。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述冠状病毒选自由人类冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人类冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人类冠状病毒229E(HCoV-229E)、人类冠状病毒NL63(HCoV-NL63、纽黑文冠状病毒)、中东呼吸综合征相关的冠状病毒(MERS-CoV或“新型冠状病毒2012”)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV或“SARS-典型”)和严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2或“新型冠状病毒2019”)组成的组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，所述固定温度在50℃和75℃之间。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中，将步骤(c)中的所述样本孵育1分钟至120分钟。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中，所述病毒为冠状病毒，所述引物中的一种或多种包括以下序列：
(f)FIP引物序列：CTT GCT CTT CTT CAG GTT GAC CAA GGT AAA CCT TTG；和/或
(g)BIP引物序列：GGT TAG ATG ATG ATA GTC CTG ATT GTC CTC ACT GCC；和/或
(h)LPF引物序列：AAG AGC AGC AGA AGT GGC AC；和/或
(i)LPB引物序列：CAA ACT GTT GGT CAA CAA G；和/或
(j)B3引物序列：GAA CCT CAA CAA TTG TTT GAA TAG。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，通过使用与所述延长的双链DNA序列可杂交的核酸分子，特别地其中所述核酸分子被标记；使用嵌入所述延长的双链DNA序列的分子或使用浊度测量来确定所述样本中所述延长的双链DNA序列的存在。
13.一种用于治疗患者的抗病毒化合物，其中，所述患者先前已使用根据权利要求6至12中任一项所述的方法被确定为被冠状病毒科的病毒感染。
14.根据权利要求13所述的抗病毒化合物，其中，所述抗病毒化合物包括瑞德西韦。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20179109.2A EP3922734A1 (en) | 2020-06-09 | 2020-06-09 | Method for determining presence of a pre-determined viral rna sequence in a sample |
| EP20179109.2 | 2020-06-09 | ||
| PCT/EP2021/065549 WO2021250140A1 (en) | 2020-06-09 | 2021-06-09 | Isothermal real-time pcr method for determining presence of a pre-determined rna sequence in a sample |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116134156A true CN116134156A (zh) | 2023-05-16 |
Family
ID=71083454
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202180056494.3A Pending CN116134156A (zh) | 2020-06-09 | 2021-06-09 | 用于确定样本中预定的rna序列的存在的等温实时pcr方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP3922734A1 (zh) |
| JP (1) | JP2023538180A (zh) |
| KR (1) | KR20230035317A (zh) |
| CN (1) | CN116134156A (zh) |
| AU (1) | AU2021288610A1 (zh) |
| CA (1) | CA3181838A1 (zh) |
| WO (1) | WO2021250140A1 (zh) |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5352778A (en) | 1990-04-26 | 1994-10-04 | New England Biolabs, Inc. | Recombinant thermostable DNA polymerase from archaebacteria |
| US5500363A (en) | 1990-04-26 | 1996-03-19 | New England Biolabs, Inc. | Recombinant thermostable DNA polymerase from archaebacteria |
| US5210036A (en) | 1990-04-26 | 1993-05-11 | New England Biolabs, Inc. | Purified thermostable DNA polymerase obtainable from thermococcus litoralis |
| US5814506A (en) | 1995-08-02 | 1998-09-29 | New England Biolabs, Inc. | Over-expression and purification of a truncated thermostable DNA polymerase by protein fusion |
| JP5740112B2 (ja) * | 2010-07-26 | 2015-06-24 | 株式会社東芝 | コロナウイルスのためのｌａｍｐ増幅用核酸プライマーセット |
| WO2018089943A1 (en) * | 2016-11-10 | 2018-05-17 | Slipchip Corporation | Probe detection of loop-mediated amplification products |
| CN111206120A (zh) * | 2020-03-20 | 2020-05-29 | 江苏奇天基因生物科技有限公司 | 一种检测新型冠状病毒SARS-CoV-2的引物探针组及检测方法 |
-
2020
- 2020-06-09 EP EP20179109.2A patent/EP3922734A1/en not_active Withdrawn
-
2021
- 2021-06-09 CA CA3181838A patent/CA3181838A1/en active Pending
- 2021-06-09 JP JP2022576084A patent/JP2023538180A/ja active Pending
- 2021-06-09 EP EP21731167.9A patent/EP4153785A1/en not_active Withdrawn
- 2021-06-09 AU AU2021288610A patent/AU2021288610A1/en active Pending
- 2021-06-09 KR KR1020237000746A patent/KR20230035317A/ko unknown
- 2021-06-09 CN CN202180056494.3A patent/CN116134156A/zh active Pending
- 2021-06-09 WO PCT/EP2021/065549 patent/WO2021250140A1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2021250140A1 (en) | 2021-12-16 |
| KR20230035317A (ko) | 2023-03-13 |
| CA3181838A1 (en) | 2021-12-16 |
| EP3922734A1 (en) | 2021-12-15 |
| EP4153785A1 (en) | 2023-03-29 |
| JP2023538180A (ja) | 2023-09-07 |
| AU2021288610A1 (en) | 2023-01-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210025016A1 (en) | Compositions and methods for detecting an rna virus | |
| EP1583949B1 (en) | Compositions and methods for detecting west nile virus | |
| US7595163B2 (en) | Method for detecting SARS coronavirus | |
| CA3176536C (en) | Compositions and methods for detection of viral pathogens in samples | |
| JP5210634B2 (ja) | スペーサー領域を使用するセラチア（Ｓｅｒｒａｔｉａ）種の検出、同定および鑑別 | |
| CN116134156A (zh) | 用于确定样本中预定的rna序列的存在的等温实时pcr方法 | |
| JP2022191442A (ja) | 非特異的な核酸増幅を抑制する方法 | |
| JP2022105717A (ja) | アデノウイルス、メタニューモウイルス、および／またはライノウイルス核酸を検出するための組成物、方法、およびキット | |
| CN115989323A (zh) | 检测SARS-CoV-2感染的方法 | |
| Nordén | Assessment of methods for microRNA isolation, microRNA amplification, and development of a normalization strategy for sepsis biomarker research | |
| CN116606946A (zh) | 一组检测克罗诺杆菌的引物探针及其检测试剂盒 | |
| CN115852056A (zh) | 呼吸道病毒检测的荧光pcr试剂盒及检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20230516 |
|
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |