KR20230008691A - 면역세포의 생체외 배양, 유도, 활성화, 동결보존 방법 및 그 세포 은행의 구축 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역세포의 생체외 배양, 유도, 활성화, 동결보존 방법 및 그 세포 은행의 구축을 공개한다. 상기 방법은, 면역세포 전용 증폭 배지를 이용하여 단핵세포에 대해 제1 단계 증폭 배양을 수행하여 초보적으로 증폭된 면역세포를 얻는 단계; 면역세포 전용 유도 배지를 이용하여, 초보적으로 증폭된 면역세포에 대해 제2 단계 유도 및 증폭 배양을 수행하여 유도된 면역세포를 얻는 단계; 면역세포 전용 활성화 배지를 이용하여, 유도된 면역세포에 대해 제3 단계 활성화 및 증폭 배양을 수행하여 기능이 활성화된 대량의 면역세포를 얻는 단계; 면역세포 전용 동결보존액을 이용하여 면역세포를 동결보존하여 동결보존된 면역세포를 얻는 단계; 및 ABO/RH 형별 및 HLA 형별에 따라 보존하고, 검색 가능한 면역세포 정보 아카이브를 구축하여 면역세포 은행을 구축하는 단계를 포함한다.

Description

면역세포의 생체외 배양, 유도, 활성화, 동결보존 방법 및 그 세포 은행의 구축
본 발명은 생물공학 분야에 관한 것으로, 구체적으로, 면역세포의 생체외 배양, 유도, 활성화, 동결보존 방법 및 그 세포 은행의 구축 방법에 관한 것이다.
세포생물학적 치료는 수술, 방사선 치료 및 화학 치료, 내분비 치료에 이어 다섯 번째 주요 치료 모드가 되었다. 입양 면역세포 치료는 세포생물학적 치료법 중 하나로 항종양 활성을 갖는 면역세포를 종양 환자에게 직접 주입하여 종양 세포를 직접 살상하거나 신체의 면역 반응을 자극하여 종양 세포를 살상하여 종양 치료 목적을 달성하는 것이다. 현재 임상적으로 적용되고 있는 면역세포는 DC-CIK 세포, TIL 세포, LAK 세포 및 NK 세포를 포함하고, 여기서 CIK 세포, LAK 세포 및 NK 세포는 모두 자연살해세포를 주체로 하는 항암 시스템이다.
NK 세포는 자연살해세포(natural killer cell)라고도 불리며, 인체의 전신을 순찰하면서 암세포와 바이러스에 감염된 세포 등을 찾아 공격하고, 인체의 자연면역에서 중요한 역할을 한다. NK 세포는 혈액 내 림프구의 10 ~ 30 %를 차지하며 퍼포린, 그랜자임 등 세포독성 인자를 함유하고 있다. NK 세포는 퍼포린, 그랜자임을 방출할 수 있으며, 퍼포린은 표적 세포의 표면을 천공하여 그랜자임 b가 표적 세포에 들어가 표적 세포의 세포 사멸을 유도한다. NK 세포는 ifn-v, tnf-x, gm-csf, il-3, m-csf 등과 같은 대량의 시토카인을 동시에 분비하여 표적 세포에 직접 작용하거나 다른 유형의 면역세포를 추가로 활성화하여 표적 세포를 공격한다.
NK 세포는 종양 면역과 비자기 세포 제거에 중요한 역할을 하는 바, 이는 자연 면역 방어의 주요 구성 요소이며 신체 방어 시스템의 첫 번째 방어선에 위치하고, NK 세포의 살상 활성은 MHC에 의해 제한되지 않으며, 항체에 의존하지 않고, 항원의 사전 감작 없이 종양 및 바이러스에 감염된 세포를 식별하여 살상할 수 있으며, 퍼포린-그랜자임 경로와 Fas-FasL 경로를 통해 종양 세포에 직접 세포독성 작용을 발휘하여 종양 세포를 살상하는 동시에 TNF-α, IFN-γ, IL 등과 같은 다양한 시토카인과 케모카인을 분비할 수 있고, 이러한 시토카인은 항암 및 후천면역반응 조절에 관여하므로, NK 세포도 선천면역과 후천면역을 연결하는 가교 역할을 한다.
NK 세포 치료법의 장점: (1) NK 세포의 활성이 높아 어떤 암세포라도 살상할 수 있고, 현재까지 활성이 높은 NK 세포에 의해 죽지 않는 암세포는 거의 발견되지 않았으며; (2) 면역을 효과적으로 자극하고, 면역체계를 활성화하며, 독성 부작용이 없고; (3) 수술 및 방사선 치료 후 잔류 암세포를 효과적으로 제거하고; (4) NK 세포는 환자의 면역 기능을 향상시킬 수 있는 동시에 항 악성 종양 및 항 바이러스 작용이 있으며; 5) NK 세포는 어떤 암세포라도 파괴할 수 있는 타고난 세포로 면역세포 치료의 주역이다.
NK 세포의 항암 효과의 안전성과 치료 효과는 인정받았지만, 말초혈액 림프구의 10 ~ 30 %에 불과하기 때문에 어떻게 고순도, 고품질 NK 세포 제품을 얻을 수 있을 것인가는 NK 치료의 핵심이다. 최근에는 생체외 자극 및 배양을 통해 비교적 대규모의 NK 세포 제조가 가능하다는 것을 발견하였고, IL-2, IL-15, IL-18 및 IL-7 등과 같은 시토카인이 NK 세포의 생체외 증폭에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 이들이 NK 세포를 생체외에서 증폭시키는 배수는 몇 배에서 수십 배까지 다양하다. IL-2는 NK 세포의 증식을 유도하는 중요한 시토카인으로, NK 세포를 활성화하고 NK 세포 증식 및 시토카인 생성을 촉진할 수 있다. IL-15 및 IL-7의 작용은 IL-2와 유사함과 동시에 NK 세포 표면에 발현되는 복합 수용체 γ 사슬에 결합하여 조혈 줄기세포의 NK 세포로의 방향성 분화를 촉진할 수도 있고, 또한 NK 세포의 발달, 분화 및 장기간의 생체외 생존을 유지하는 등 측면에서 중요한 역할을 한다. IL-15와 IL-2의 시너지 효과는 또한 양자가 NK 세포의 생체외 증폭에 함께 작용할 수 있도록 하며, 이는 현재 NK 세포의 생체외 증폭을 위한 시토카인의 가장 전통적인 조합이다. IL-18은 활성화된 THi 세포의 분비를 유도하여 대량의 IFN-γ를 생성할 수 있을 뿐만 아니라, 용량 의존적으로 Fas-FasL 경로의 개방을 촉진하여 NK 세포의 세포독성을 향상시키는 것으로 보고되어 있다.
현재 시중에 NK 세포 치료 제품이 나와있지만 사용되는 배양 시스템이 복잡하고, 증폭 배수 및 종양 사멸 효과가 좋지 않으며, 동결보존 후 해동 효과가 좋지 않고, 일부 배양 시스템은 안전성 위험 등의 문제가 존재한다. 따라서, 자연살해세포의 배양, 유도, 활성화 및 동결보존 방법의 개선이 필요하다.
본 발명은 종래 기술에 존재하는 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다. 이에, 본 발명은 면역세포의 생체외 배양, 유도, 활성화, 동결보존 방법 및 그 세포 은행의 구축 방법을 제공하되, 상기 방법으로 면역세포를 배양, 유도 및 활성화하는 효율이 높고, 속도가 빠르며, 안전성이 높고 비용이 저렴하며, 유도 및 증폭에 의해 얻은 기능이 활성화된 대량의 면역세포는 장기 보존을 위한 세포 은행을 구축할 수 있고, 해동 후 여전히 우수한 세포 활성을 유지할 수 있다.
본 발명은 면역세포의 생체외 배양, 유도, 활성화, 동결보존 방법 및 그 세포 은행의 구축 방법을 제공한다. 본 발명의 실시예에 따르면, 상기 방법은,
면역세포 전용 증폭 배지를 이용하여 단핵세포에 대해 제1 단계 증폭 배양을 수행하여 초보적으로 증폭된 면역세포를 얻는 단계; 면역세포 전용 유도 배지를 이용하여, 초보적으로 증폭된 면역세포에 대해 제2 단계 유도 및 증폭 배양을 수행하여 유도된 면역세포를 얻는 단계; 면역세포 전용 활성화 배지를 이용하여, 유도된 면역세포에 대해 제3 단계 활성화 및 증폭 배양을 수행하여 기능이 활성화된 대량의 면역세포를 얻는 단계; 면역세포 전용 동결보존액을 이용하여 면역세포를 동결보존하여 동결보존된 면역세포를 얻는 단계; 및 ABO/RH 형별 및 HLA 형별에 따라 보존하고, 검색 가능한 면역세포 정보 아카이브를 구축하여 면역세포 은행을 구축하는 단계를 포함한다.
상기 면역세포 전용 증폭 배지는 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-2, 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-10, 0.5 ~ 1 ng/ml의 IL-1α 및 1 ~ 4 ng/ml의 LIF, 0.5 ~ 2.5 ng/ml의 EPO, 1 ~ 4 ng/ml의 KGF, 2 ~ 5의 ng/ml의 테스토스테론, 1 ~ 4 μg/ml의 부갑상선 호르몬, 1 ~ 4 μg/ml의 라미닌이 첨가된 무혈청 림프구 배지이다.
상기 면역세포 전용 유도 배지는 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-2, 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-10, 1 ~ 4 ng/ml의 bFGF, 1 ~ 4 ng/ml의 BMP-4, 0.2 ~ 0.8 μg/ml의 라파마이신, 0.2 ~ 0.8 μg/ml의 이카린, 20 ~ 80 ng/ml의 트라메티닙, 1 ~ 4 ng/ml의 히드로코르티손, 1 ~ 4 μg/ml의 라미닌이 첨가된 무혈청 림프구 배지이다.
상기 면역세포 전용 활성화 배지는 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-2, 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-10, 1 ~ 4 ng/ml의 TGF-β, 1-2 ng/ml의 포스콜린(Forskolin), 20 ~ 80 ng/ml의 레스베라트롤, 1 ~ 4 μg/ml의 아세트아미노펜, 1 ~ 4 μg/ml의 라미닌이 첨가된 무혈청 림프구 배지이다.
상기 면역세포 전용 동결보존액은 5 부피 백분율의 DMSO, 1 ~ 2 부피 백분율의 알부민, 1 ~ 2 부피 백분율의 아미노에탄올, 91 ~ 93 부피 백분율의 무혈청 림프구 배지를 포함한다.
상기 면역세포 전용 증폭 배지, 면역세포 전용 유도 배지, 면역세포 전용 활성화 배지 및 면역세포 전용 동결보존액에서, 상기 무혈청 림프구 배지는 X-VOVO15 무혈청 배지 또는 시판되는 다른 유형의 무혈청 배지이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 면역세포는 자연살해세포이다.
본 발명을 이용하여 단핵세포에 대해 유도 및 증폭 배양을 수행하여 기능이 활성화된 대량의 면역세포를 얻을 수 있다. 본 발명은 유도 효율이 높고, 증폭 속도가 빠르며, 안전성이 높고 비용이 저렴한 등 장점을 갖는다. 또한, 본 발명은 상응한 세포 은행을 구축하고, 대규모의 면역세포를 분류하고 저장하며, 유효 저장 시간이 길고, 해동 후 세포는 여전히 우수한 세포 활성을 유지하며, 세포 회수율이 높음으로써, 임상 치료에서 대량의 면역세포가 필요한 수요를 만족시킨다.
도 1은 본 발명에 따른 방법의 흐름도이다.
도 2은 본 발명에 따른 방법의 14일 이내 말초혈액 단핵세포에 대한 증폭 효율 및 세포 생존율을 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따른 방법의 14일 이내 표적 세포에 대한 증폭 효율을 나타낸다.
도 4은 본 발명에 따른 방법의 12일 이내 말초혈액 단핵세포에 대한 증폭 효율 및 세포 생존율을 나타낸다.
도 5은 본 발명에 따른 방법의 12일 이내 표적 세포에 대한 증폭 효율을 나타낸다.
본 발명은 면역세포의 생체외 배양, 유도, 활성화, 동결보존 방법 및 그 세포 은행의 구축 방법을 제공하되, 이는 구체적으로, 면역세포 전용 증폭 배지를 이용하여 단핵세포에 대해 제1 단계 증폭 배양을 수행하여 초보적으로 증폭된 면역세포를 얻는 단계; 면역세포 전용 유도 배지를 이용하여, 초보적으로 증폭된 면역세포에 대해 제2 단계 유도 및 증폭 배양을 수행하여 유도된 면역세포를 얻는 단계; 면역세포 전용 활성화 배지를 이용하여, 유도된 면역세포에 대해 제3 단계 활성화 및 증폭 배양을 수행하여 기능이 활성화된 대량의 면역세포를 얻는 단계; 면역세포 전용 동결보존액을 이용하여 면역세포를 동결보존하여 동결보존된 면역세포를 얻는 단계; 및 ABO/RH 형별 및 HLA 형별에 따라 보존하고, 검색 가능한 면역세포 정보 아카이브를 구축하여 면역세포 은행을 구축하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시예에 따르면, 면역세포 전용 증폭 배지는 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-2, 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-10, 0.5 ~ 1 ng/ml의 IL-1α 및 1 ~ 4 ng/ml의 LIF, 0.5 ~ 2.5 ng/ml의 EPO, 1 ~ 4 ng/ml의 KGF, 2 ~ 5의 ng/ml의 테스토스테론, 1 ~ 4 μg/ml의 부갑상선 호르몬, 1 ~ 4 μg/ml의 라미닌이 첨가된 무혈청 림프구 배지이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 면역세포 전용 유도 배지는 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-2, 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-10, 1 ~ 4 ng/ml의 bFGF, 1 ~ 4 ng/ml의 BMP-4, 0.2 ~ 0.8 μg/ml의 라파마이신, 0.2 ~ 0.8 μg/ml의 이카린, 20 ~ 80 ng/ml의 트라메티닙, 1 ~ 4 ng/ml의 히드로코르티손, 1 ~ 4 μg/ml의 라미닌이 첨가된 무혈청 림프구 배지이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 면역세포 전용 활성화 배지는 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-2, 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-10, 1 ~ 4 ng/ml의 TGF-β, 1-2 ng/ml의 포스콜린(Forskolin), 20 ~ 80 ng/ml의 레스베라트롤, 1 ~ 4 μg/ml의 아세트아미노펜, 1 ~ 4 μg/ml의 라미닌이 첨가된 무혈청 림프구 배지이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 상기 면역세포는 자연살해세포이다.
본 발명의 실시예에 따르면, 제1 단계의 면역세포 증폭 배양 과정에서, 2 ~ 3일에 1회씩 계대하되 2회 계대하고; 제2 단계의 유도 및 증폭 배양 과정에서, 2 ~ 3일에 1회씩 계대하되 2회 계대하며; 제3 단계의 대규모 활성화 및 증폭 배양 과정에서, 2일에 1회씩 계대하되 적어도 2회(여러 회 계대 가능) 계대한다. 따라서, 면역세포는 단기간 내에 고순도의 대규모 증폭을 구현하고, 기능이 활성화된 충분한 면역세포를 얻을 수 있음으로써, 임상 면역 치료가 가능하다.
본 발명의 실시예에 따르면, 면역세포 전용 동결보존액은 5 부피 백분율의 DMSO, 1 ~ 2 부피 백분율의 알부민, 1 ~ 2 부피 백분율의 아미노에탄올, 91 ~ 93 부피 백분율의 무혈청 림프구 배지를 포함한다. 각 107 ~ 108개의 면역세포는 1 ml의 상기 면역세포 전용 동결보존액을 사용한다. 따라서, 동결보존된 세포의 농도가 높아 대규모 면역세포의 동결보존에 적합하고, 동결보존 비용이 저렴하며, 세포의 동결보존 효과가 좋고, 해동 후 세포 생존율 및 세포 수율이 높다.
본 발명의 실시예에 따르면, 활성화 및 증폭된 면역세포를 ABO/RH 형별 및 HLA 형별에 따라 보존하고, 검색 가능한 면역세포 정보 아카이브를 구축하여 면역세포 은행을 구축한다.
아래 실시예와 결부하여 본 발명의 해결수단을 해석한다. 당업자는 아래의 실시예가 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하는 것으로 간주되어서는 아니됨을 이해할 수 있다. 실시예에서 구체적인 기술 또는 조건이 명시되지 않은 경우, 본 기술분야의 문헌에 설명된 기술 또는 조건을 따르거나 제품 설명서에 따라 수행된다. 사용되는 시약 또는 기기는 제조사가 명시되지 않은 경우 모두 시중에서 구입할 수 있는 통상적인 제품이다.
실시예 1
본 발명에 따른 면역세포의 배양, 유도, 활성화 및 증폭 방법을 이용하여, 분리된 단핵세포를 표적 면역세포(NK 세포)로 유도, 활성화 및 증폭하고, 표적 면역세포의 활성을 검출하였다.
가. 실험 방법
1. 공여자 선별
1.1. 병원은 공여자와 함께 1식 3부의 동의서에 서명해야 한다. 공여자 및 의료 기관은 각각 1부씩 가지고, 나머지 1부는 검체와 함께 실험실로 발송된다.
1.2. 병원은 공여자의 개인정보, 과거 치료 이력, 가족 유전력, 및 감염병 이력 및 조혈 또는 면역체계 이상 여부 등 정보를 문의하고 양식에 기입하는 방식을 통해 조회한다. 병원은 공여자 본인 또는 위임받은 자의 동의를 얻어 신체검사 자료를 조회하고 신체검사 정보를 입수해야 한다. 공여자의 신체검사 정보에는 HIV-1/2 항체(에이즈 항체), HBsAg(B형 간염 표면 항원), 항-HCV(C형 간염 항체), CMV-IgM 항체(사이토메갈로바이러스 항체), ALT(트랜스아미나제), 트레포네마팔리덤 항체 등 항목이 포함되어야 한다. 검출 방법은 각각 현재 보건부의 검출 기준에 따라 수행된다. 공여자의 신체검사는 최소한 "헌혈자의 건강검진 요건"을 충족해야 한다.
1.3. 경험이 풍부한 지정 의료진이 수집된 정보를 종합적으로 평가하여 공여자가 요건을 충족하는지 여부를 판단한다. 공여자 동의서, 개인정보 수집서, 검사 정보 등은 넘버링하여 봉인해야 한다. 데이터에 접근할 수 있는 모든 사람은 공여자 본인 또는 위임받은 자의 동의 없이 공여자의 개인정보를 공개할 수 없다.
1.4. ABO/RH 형별 및 HLA 형별에 따라 보존하고, 검색 가능한 면역 공여자 아카이브 정보 데이터베이스를 구축하였다.
2. 말초혈액의 채취, 말초혈액 혈장과 단핵세포의 분리
2.1. 항응고제가 첨가된 무균 채혈백을 사용하여 약 100 ml의 인간 말초혈액을 채취하고, 빠른 검사 및 혈액형 검사를 위해 1 ml의 말초혈액을 미리 남겨두며, 채혈백을 즉시 무균 포장하여 4˚C에서 무균 상태로 보관 및 운송하고, 채취 정보를 정확하게 기록하였다. 빠른 검사 선별에 합격한 후 말초혈액을 GMP 실험실로 보내고, 빠른 검사에 불합격한 경우, 혈액 샘플을 폐기 처리하였다.
2.2. GMP 실험실에서 혈액백을 꺼내고, 알코올로 채혈백을 소독하며, 응혈 및 용혈 여부를 관찰한 후 슈퍼 클린 벤치에서 혈액백을 개봉하고, 혈액을 50 ml의 무균 원심분리 튜브(≤ 45 ml/튜브)에 옮기며, 2500 rpm으로 10 min 동안 원심분리하였다.
2.3 상층 혈장을 다른 무균 원심분리 튜브에 옮기고, 3500 rpm으로 10 min 동안 원심분리하며, 상층 혈장을 새로운 무균 원심분리 튜브에 수집하고, 원심분리 튜브 입구를 막으로 밀봉하며, 혈구를 단핵세포의 분리에 사용하였다.
2.4. 혈장을 56˚C의 워터 배스에 30 ~ 50 min 동안 넣어 보체를 비활성화하고, 3500 rpm으로 15 min 동안 원심분리하여 보체를 제거하며, 각 15 ml의 무균 원심분리 튜브에 10 ml씩 분취하고, -20˚C에서 동결보존하여 준비하며, 바이러스 5가지 항목, 마이코플라즈마, 내독소 및 미생물 검사를 포함하는 느린 검사를 위해 7.5 ml의 혈장을 남겨두었다.
2.5. 단계 2의 혈구 침전물을 혈장과 동일한 부피의 생리 식염수로 재현탁한 후 250 ml의 무균 유리병에 옮기고, 혈액 전체 부피의 1/3이 되는 양의 헤타스타치를 넣고 식염수 병을 부드럽게 혼들어 균일하게 혼합하고, 적혈구가 침강되도록 가만히 놓아두었다.
2.6. 적혈구층이 침강되어 분층된 후, 상층 유백색 현탁액을 무균 원심분리 튜브에 부드럽게 피펫팅하고, 1800 rpm으로 5 min 동안 원심분리하여 상층액을 버리며, 침전물을 10 ml의 생리 식염수로 재현탁시켰다.
2.7. 무균의 15 ml의 원심분리 튜브를 2개를 취하여 각각에 5 ml의 상온 인간 말초혈액 림프구 분리액을 넣고, 상층에 각각 5 ml의 세포 현탁액을 부드럽게 넣었다. 실온에서 2000 rpm으로 25 min 동안 느린 상승과 하강 원심분리(slow-to-rise up/down centrifugation)를 수행하였다.
2.8. 원심분리 튜브를 부드럽게 꺼내고, 경계면 중간 거품층의 백혈구를 새로운 15 ml의 원심분리 튜브에 조심스럽게 흡인하며, 생리 식염수를 추가하여 2회 세척하였다.
2.9. 세포를 1 ml의 생리 식염수로 재현탁하고, 5μl의 세포를 취하여 245 μl의 생리 식염수에 넣어 50배로 희석하며, 계수하고, 트리판블루 염색을 통해 세포 생존율을 기록하였다.
2.10. 유세포 분석 항체 표지용으로 NK 세포의 비율을 측정하기 위해 4.5Х106개 세포를 남기고, 나머지 단핵세포를 20 ml의 배지가 있는 배양 플라스크에 접종하며, 1000 IU/ml의 IL-2, 1000 IU/ml의 IL-10, 0.8 ng/ml의 IL-1α 및 2 ng/ml의 LIF, 1.5 ng/ml의 EPO, 2 ng/ml의 KGF, 3 ng/ml의 테스토스테론, 2 μg/ml의 부갑상선 호르몬, 2 μg/ml의 라미닌이 첨가된 X-VOVO15 무혈청 배지인 면역세포 전용 증폭 배지를 넣고, 37˚C, 5 % CO2 인큐베이터에서 무균 배양하되, 0일째로 기록하였다. 매일 세포를 관찰하고, 배지의 색상에 따라 2 ~ 3일에 1회씩 배지를 교체하여 계대하였다.
2.11. 배지를 2회 교체한 후, 배양 시스템이 이미 2 L에 도달했을 경우, 배양 시스템을 1000 IU/ml의 IL-2, 1000 IU/ml의 IL-10, 2 ng/ml의 bFGF, 2 ng/ml의 BMP-4, 0.6 μg/ml의 라파마이신, 0.6 μg/ml의 이카린, 50 ng/ml의 트라메티닙, 2 ng/ml의 히드로코르티손, 2 μg/ml의 라미닌이 첨가된 X-VOVO15 무혈청 배지인 면역세포 전용 유도 배지로 교체하였다. 매일 세포를 관찰하고, 배지의 색상에 따라 2 ~ 3일에 1회씩 배지를 교체하여 계대하였다.
2.12. 계속하여 배지를 2회 더 교체한 후, 배양 시스템을 1000 IU/ml의 IL-2, 1000 IU/ml의 IL-10, 2 ng/ml의 TGF-β, 2 ng/ml의 포스콜린(Forskolin), 50 ng/ml의 레스베라트롤, 2 μg/ml의 아세트아미노펜, 2 μg/ml의 라미닌이 첨가된 X-VOVO15 무혈청 배지인 면역세포 전용 활성화 배지로 교체하였다. 매일 세포를 관찰하고, 2일에 1회씩 배지를 교체하여 계대하였다.
2.13. 배양 및 증폭 14일째에 세포를 회수하고, Elisa 분비 인자 검출을 위해 10 ml의 배지 상층액을 남겨두었다.
2.14. 회수된 세포를 200 ml의 생리 식염수로 재현탁하고, 10 ml의 인간 혈청 알부민을 넣어 균일하게 혼합하며, 여기서 10 ml의 세포 현탁액을 취하여 검출에 대기하고, 나머지 세포를 재주입백에 주입하여 재주입을 위해 준비할 수 있다. 재주입백에서 10 ml의 세포 현탁액을 뽑아 마이코플라스마, 내독소, 미생물 및 바이러스 5가지 항목 검출을 수행하였다.
3. 유세포 분석기를 이용한 세포 중 림프구 계보의 검출
10 ml의 세포 현탁액을 취하여 1800 rpm으로 원심분리하여 세포를 회수하고, 유세포 분석 항체 표지를 수행하였다. 동형 대조군, 단일 표지 샘플 및 염색 튜브를 설정하고, 각 튜브의 샘플 세포 수는 약 5Х105개이며, 다음 대응되는 항체를 넣어 염색하였다. 4˚C에서 30 min 동안 놓고 생리 식염수로 세척한 다음, 림프구 집단에서 NK 세포의 비율에 대한 컴퓨터 테스트 및 분석을 수행하였다.
4. 나머지 10 ml의 세포 현탁액 상층액을 나누어 바이러스 5가지 항목, 내독소, 마이코플라스마, 미생물 검출을 수행하였다.
5. 4 ~ 6주령이고 체중이 18 ~ 20 g인 누드 마우스 종양 형성 시험 SPF 등급 암컷 BALB/c 누드 마우스를 식수, 표준 사료, 및 동물과 접촉하는 다른 물품이 모두 멸균 처리된 공기 층류 랙에 뚜껑이 있는 마우스 케이지에서 사육하였다. 양성 대조군인 Ragi 세포와 K562 세포 및 생체외에서 분화 유도된 28일째의 검출할 NK 세포를 취하여 누드 마우스의 옆구리 피하에 3Х107개/0.2 ml로 접종하고, 피크린산으로 표지하여 2개월 동안 종양 형성 상황을 관찰하였다.
6. 수집된 세포의 배지 상층액에 대해 Elisa 분비 인자 검출, 즉 IFN-γ, TNF-α 및 퍼포린(Perforin) 검출을 수행하였다.
나. 실험 결과
1. 배양 및 증폭 14일의 실험 결과
1.1. 배양 및 증폭 14일 후 세포가 220배 증폭 가능
상기 말초혈액 림프구 분리액으로 분리된 6.0Х107개 말초혈액 단핵세포를 20 ml의 배양 시스템에 접종한 후 세포는 빠르게 대수생장 단계로 진입하였다. 배양 및 증폭 14일 후, 배양 시스템은 4 L로 확장되고, 세포 수는 1.3 Х1010로 증폭되며, 증폭 배수는 최대 220배이고, 생존 세포 수는 95 %이상이며, 배양 시간이 상이한 말초혈액 단핵세포 수 및 세포 활성의 결과는 도 2에 도시된 바와 같다.
1.2. 증폭된 말초혈액 단핵세포에서 NK 세포의 비율이 현저히 증가
말초혈액 단핵세포가 14일 동안 배양 및 증폭된 후, 림프구에서 NK 세포의 비율(CD3-CD56+)은 18.15 %에서 97.64 %로 증가되고, 이와 동시에 T림프구(CD3+)의 비율은 71.47 %에서 3.22 %로 감소되며, 보조 T 세포(Th, CD3+CD4+) 및 세포독성 T세포(Tc, CD3+CD8a+)는 모두 감소되고, B 림프구(CD3-CD19+)는 거의 모두 사라지며, 세포 균일성은 현저히 향상되었다. 도 1의 세포 계수의 계산과 결부하여 알 수 있는 바, 배양 14일 후 NK 세포는 1165배로 증폭되고, 배양 14일 전후 말초혈액 단핵세포에서 림프구의 비율은 도 3에 도시된 바와 같으며, 여기서, NK 세포: CD3- CD56+; T세포: CD3+; 보조 T 세포(Th): CD3+CD4+; 세포독성 T세포(Tc세포): CD3+CD8a+; B세포: CD3-CD9+이다.
1.3. 배양 및 증폭에 의해 얻은 세포 제품에서 병원체 감염 미발견
우리는 배양된 세포 및 세포 현탁액을 검출 플랫폼에 B형 간염 표면 항원, C형 간염 항원, 인간 면역 결핍 바이러스 항체, 트레포네마팔리덤 특이적 항체, 대식세포 바이러스 및 마이코플라스마, 세균과 내독소 검출을 의뢰하였고, 검출 결과 모두 음성으로 나타났는데, 이는 해당 배치(batch) 제품이 안전하고 배양 과정에서 오염되지 않음을 설명한다.
2. 배양 12일의 실험 결과
2.1. 배양 12일 후 세포가 162배 증폭 가능
말초혈액 림프구 분리액으로 분리된 6.0Х107개 말초혈액 단핵세포를 20 ml의 배양 시스템에 접종한 후 세포는 빠르게 대수생장 단계로 진입하였다. 배양 12일 후, 세포 수는 9.7Х109로 증폭되며, 증폭 배수는 162배에 달하고, 생존 세포 수는 95 %이상이며, 실험 결과는 도 4에 도시된 바와 같다.
2.2. 증폭된 말초혈액 단핵세포에서 NK 세포의 비율이 현저히 증가
말초혈액 단핵세포가 12일 동안 증폭된 후, 림프구에서 NK 세포의 비율(CD3-CD56+)은 6일째의 21.47 %에서 12일째의 93.22 %로 증가되고, 이와 동시에 T림프구(CD3+)의 비율은 3.86 %로 감소되며, 보조 T 세포(Th, CD3+CD4+) 및 세포독성 T세포(Tc, CD3+CD8a+)는 모두 감소되고, B 림프구(CD3-CD19+)는 거의 모두 사라지며, 세포 균일성은 현저히 향상되고, 배양 12일 전후 말초혈액 단핵세포에서 림프구의 비율은 도 5에 도시된 바와 같다.
2.3. 배양 및 증폭에 의해 얻은 세포 제품에서 병원체 감염 미발견
우리는 배양된 세포 및 세포 현탁액을 검출 플랫폼에 B형 간염 표면 항원, C형 간염 항원, 인간 면역 결핍 바이러스 항체, 트레포네마팔리덤 특이적 항체, 대식세포 바이러스 및 마이코플라스마, 세균과 내독소 검출을 의뢰하였고, 검출 결과 모두 음성으로 나타났는데, 이는 해당 배치 제품이 안전하고 배양 과정에서 오염되지 않음을 설명한다.
3. 배양된 세포는 모두 IFN-γ, TNF-α, 퍼포린을 분비하며, 결과는 표 1과 같다.
배지 상층액에 대한 Elisa 검출
14일 12일
IFN-γ 298.17 ng/ml 262.45 ng/ml
TNF-α 113.24 pg/ml 98.47 pg/ml
Perforin 23.78 ng/ml 18.93 ng/ml
4. 배양 및 증폭된 NK 세포는 체내에서 종양을 형성하지 않음
누드 마우스 종양 형성 실험 결과: A군인 생리 식염수 대조군(종양 형성 마우스의 수/군 내 마우스의 수, 0/5), B군인 Raji세포 대조군(3/5), C군인 K562세포 대조군(4/5), D군인 NK 세포군(0/5), 즉, 2개월의 관찰 기간 동안 0.2 ml의 생리 식염수 피하 주사군 및 3Х107개/0.2 ml 배양 28일째의 NK 세포군의 마우스에서 모두 종양이 형성되지 않았고, 동일한 양의 Raji세포 및 K562세포를 주사한 마우스 B군에서 각각 4/5 및 5/5마리의 마우스에서 가시적인 종양이 형성되었다. 상기 결과는 28일까지 배양하더라고 NK 세포가 여전히 안전하고 효과적이며 종양 형성을 일으키지 않음을 설명한다.
실시예 2
실시예 1에서 생체외 유도, 활성화 및 증폭된 NK 세포를 동결보존하고, 동결보존 효과를 비교하였다.
하기와 같은 4가지 동결보존액을 각각 사용하여, 실시예 1에서 생체외 유도 및 증폭 14일째에 얻은 NK 세포를 동결보존하되, 여기서 4가지 동결보존액의 성분은 하기와 같다.
동결보존액 1: 5 부피 백분율의 DMSO, 1 부피 백분율의 알부민, 1 부피 백분율의 아미노에탄올, 93 부피 백분율의 X-VOVO15 무혈청 배지;
동결보존액 2: 5 부피 백분율의 DMSO, 2 부피 백분율의 알부민, 2 부피 백분율의 아미노에탄올, 91 부피 백분율의 X-VOVO15 무혈청 배지;
동결보존액 3: 5 부피 백분율의 DMSO, 2 부피 백분율의 알부민, 93 부피 백분율의 X-VOVO15 무혈청 배지;
동결보존액 4: 5 부피 백분율의 DMSO, 2 부피 백분율의 아미노에탄올, 93 부피 백분율의 X-VOVO15 무혈청 배지;
동결보존액 5: 5 부피 백분율의 DMSO, 95 부피 백분율의 X-VOVO15 무혈청 배지;
동결보존액 6: 5 부피 백분율의 DMSO, 10 부피 백분율의 자가 혈장, 85 부피 백분율의 X-VOVO15 무혈청 배지;
동결보존액 7: 10 부피 백분율의 DMSO, 2 부피 백분율의 알부민, 2 부피 백분율의 아미노에탄올, 86 부피 백분율의 X-VOVO15 무혈청 배지.
다음과 같은 단계에 따라 NK 세포를 동결보존하였는 바, 동결보존액과 세포를 균일하게 혼합한 후, 동결보존 튜브에 신속하에 옮기고, 동결보존 박스에 넣어 -70˚C에서 프로그램으로 밤새 냉각시키며, 다음날 액체 질소에 옮겼다. 여기서, 각 107개 NK 세포에 1 ml의 동결보존액을 사용하였다. NK 세포를 60일 동안 동결보존한 다음 해동하였다. 동결보존 전후 세포의 생존율, 및 해동 후 세포 회수율을 검출하였다. 구체적으로, 동결보존 전 및 동결보존하고 해동 후 세포 생존율의 계산 방법은 [생존 세포 수/(생존 세포 수+죽은 세포 수)]Х100 %이다. 해동 후 세포 회수율의 계산 방법은 (해동 후 생존 세포 수/동결보존 시 생존 세포 수)Х100 %이다.
해동 후 NK 세포의 검출 결과:
상이한 동결보존액에 따른 동결보존 및 해동 효과 비교
세포 생존율(%) 세포 수율(%)
동결보존액 1 97.12 95.99
동결보존액 2 98.32 96.46
동결보존액 3 93.21 91.57
동결보존액 4 94.63 92.49
동결보존액 5 85.22 81.17
동결보존액 6 86.33 82.31
동결보존액 7 93.23 91.62
표 2에 나타낸 바와 같이, 해동 후 세포 생존율은 모두 동결보존 전보다 낮았다. 구체적으로, 동결보존액 1 및 2로 보존된 세포 생존율 및 세포 수율은 동결보존액 3 및 4보다 현저히 우수하고, 동결보존액 1과 2 사이는 차이가 없으며, 동결보존액 3과 4 사이는 차이가 없는데, 이는 1 ~ 2 부피 백분율의 알부민 및 1 ~ 2 부피 백분율의 아미노에탄올을 첨가하면 NK 세포에 대한 보호 작용이 좋은 것을 설명한다. 동결보존액 1로 보존된 세포 생존율 및 세포 수율은 동결보존액 7보다 현저히 우수한데, 이는 5 %의 DMSO 농도가 가장 적합한 농도이고, DMSO 농도의 증가는 DMSO의 세포독성 작용을 증가시키므로, NK 세포 생존율 및 세포 수율을 오히려 향상시킬 수 없음을 설명한다. 동결보존액 5와 동결보존액 6에 의한 세포 생존율 및 세포 수율은 큰 차이가 없고, 이들에 의한 생존율은 동결보존액 1 및 동결보존액 2보다 현저히 낮는데, 이는 자가 혈장의 첨가는 세포 수율 및 세포 생존율을 향상시킬 수 없음을 설명한다. 종합하면, 본 발명에 따른 면역세포 전용 동결보존액(즉, 동결보존액 1 및 동결보존액 2)에 의한 세포 생존율 및 세포 수율은 다른 유형의 동결보존액보다 현저히 높다.
실시예 3
본 발명의 실시예에 따른 면역세포의 배양, 유도, 활성화 방법을 이용하여, 분리된 단핵세포를 면역세포로 유도 및 증폭하고, ABO/RH 형별 및 HLA 형별에 따라 보존하며, 검색 가능한 면역세포 정보 아카이브를 구축하여 면역세포 은행을 구축하였다.
1. 공여자 선별
병원은 공여자의 개인정보, 과거 치료 이력, 가족 유전력, 및 감염병 이력 및 조혈 또는 면역체계 이상 여부 등 정보를 문의하고 양식에 기입하는 방식을 통해 조회한다. 병원은 공여자와 함께 동의서에 서명하여 공여자 본인 또는 위임받은 자의 동의를 얻어 신체검사 자료를 조회하고 신체검사 정보를 입수해야 한다. 공여자의 신체검사 정보에는 HIV-1/2 항체, HbsAg, 항-HCV, CMV-IgM 항체, ALT, 트레포네마팔리덤 항체 등 항목이 포함되어야 한다. 개인정보 수집서, 동의서, 검사 정보 등은 넘버링하여 봉인하고, 검색 가능한 면역 공여자 아카이브 정보 데이터베이스를 구축해야 한다.
2. 말초혈액의 채취, 말초혈액 혈장과 단핵세포의 분리
2.1. 항응고제가 첨가된 무균 채혈백을 사용하여 약 100 ml의 인간 말초혈액을 채취하고, 빠른 검사(HIV-1/2 항체, HBsAg, 항-HCV, CMV-IgM 항체, 트레포네마팔리덤 항체) 및 BO/RH 형별, HLA 형별 검사를 위해 5 ml의 말초혈액을 미리 남겨두며, 채혈백을 즉시 무균 포장하여 4
Figure pct00001
에서 무균 상태로 보관 및 운송하고, 채취 정보를 정확하게 기록하였다. 빠른 검사 선별에 합격한 후 말초혈액을 GMP 실험실로 보내고, 빠른 검사에 불합격한 경우, 혈액 샘플을 폐기 처리하였다.
2.2. GMP 실험실에서 혈액백을 꺼내고, 알코올로 채혈백을 소독하며, 응혈 및 용혈 여부를 관찰한 후 슈퍼 클린 벤치에서 혈액백을 개봉하고, 혈액을 50 ml의 무균 원심분리 튜브(≤45 ml/튜브)에 옮기며, 2500 rpm으로 10 min 동안 원심분리하였다.
2.3. 상층 혈장을 다른 무균 원심분리 튜브에 옮기고, 3500 rpm으로 10 min 동안 원심분리하며, 상층 혈장을 새로운 무균 원심분리 튜브에 수집하고, 원심분리 튜브 입구를 막으로 밀봉하며, 혈구를 단핵세포의 분리에 사용하였다.
2.4. 단계 2의 혈구 침전물을 혈장과 동일한 부피의 생리 식염수로 재현탁한 후 250 ml의 무균 유리병에 옮기고, 혈액 전체 부피의 1/3이 되는 양의 헤타스타치를 넣고 식염수 병을 부드럽게 혼들어 균일하게 혼합하고, 적혈구가 침강되도록 가만히 놓아두었다.
2.5. 적혈구층이 침강되어 분층된 후, 상층 유백색 현탁액을 무균 원심분리 튜브에 부드럽게 피펫팅하고, 1800 rpm으로 5 min 동안 원심분리하여 상층액을 버리며, 침전물을 10 ml의 생리 식염수로 재현탁시켰다.
2.6. 무균의 15 ml의 원심분리 튜브를 2개를 취하여 각각에 5 ml의 상온 인간 말초혈액 림프구 분리액을 넣고, 상층에 각각 5 ml의 세포 현탁액을 부드럽게 넣었다. 실온에서 2000 rpm으로 25 min 동안 느린 상승과 하강 원심분리를 수행하였다.
2.7. 원심분리 튜브를 부드럽게 꺼내고, 경계면 중간 거품층의 백혈구를 새로운 15 ml의 원심분리 튜브에 조심스럽게 흡인하며, 생리 식염수를 추가하여 2회 세척하였다.
2.8. 세포를 1 ml의 생리 식염수로 재현탁하고, 5μl의 세포를 취하여 245 μl의 생리 식염수에 넣어 50배로 희석하며, 계수하고, 트리판블루 염색을 통해 세포 생존율을 기록하였다.
2.9. 단핵세포를 20 ml의 배지가 있는 배양 플라스크에 접종하고, 배지는 1500 IU/ml의 IL-2, 1500 IU/ml의 IL-10, 0.7 ng/ml의 IL-1α 및 2.5 ng/ml의 LIF, 1.5 ng/ml의 EPO, 2.5 ng/ml의 KGF, 3.5 ng/ml의 테스토스테론, 2.5 μg/ml의 부갑상선 호르몬, 2.5 μg/ml의 라미닌이 첨가되어 배합된 X-VOVO15 무혈청 배지인 면역세포 전용 증폭 배지이며, 37˚C, 5 % CO2 조건에서 무균 배양하되, 0일째로 기록하였다. 매일 세포를 관찰하고, 배지의 색상에 따라 2 ~ 3일에 1회씩 배지를 교체하여 계대하였다.
2.10. 배지를 2회 교체한 후, 배양 시스템이 이미 2 L에 도달했을 경우, 배양 시스템을 1500 IU/ml의 IL-2, 1500 IU/ml의 IL-10, 2.5 ng/ml의 bFGF, 2.5 ng/ml의 BMP-4, 0.5 μg/ml의 라파마이신, 0.5 μg/ml의 이카린, 50 ng/ml의 트라메티닙, 2.5 ng/ml의 히드로코르티손, 2.5 μg/ml의 라미닌이 첨가된 X-VOVO15 무혈청 배지인 면역세포 전용 유도 배지로 교체하였다. 매일 세포를 관찰하고, 배지의 색상에 따라 2 ~ 3일에 1회씩 배지를 교체하여 계대하였다.
2.11. 계속하여 배지를 2회 더 교체한 후, 배양 시스템을 1500 IU/ml의 IL-2, 1500 IU/ml의 IL-10, 2.5 ng/ml의 TGF-β, 1.5 ng/ml의 포스콜린(Forskolin), 50 ng/ml의 레스베라트롤, 2.5 μg/ml의 아세트아미노펜, 2.5 μg/ml의 라미닌이 첨가된 X-VOVO15 무혈청 배지인 면역세포 전용 활성화 배지로 교체하였다. 매일 세포를 관찰하고, 2일에 1회씩 배지를 교체하여 계대하였다.
2.12. 5 부피 백분율의 DMSO, 2 부피 백분율의 알부민, 2 부피 백분율의 아미노에탄올, 91 부피 백분율의 X-VOVO15 무혈청 배지의 비율에 따라 면역세포 전용 동결보존액을 조제하였다.
2.13. 상기 활성화 및 증폭된 면역세포를 수집하였다. 세포 현탁액에 대해 마이코플라스마, 내독소, 미생물 및 바이러스 5가지 항목 검출을 수행하였다. 합격된 면역세포를 검출하고, 각 107개 면역세포에 1 ml의 상기 조제된 면역세포 전용 동결보존액을 사용하여 동결보존하며, ABO/RH 형별 및 HLA 형별에 따라 보존하고, 검색 가능한 면역세포 정보 아카이브를 구축하여 면역세포 은행을 구축하였다.

Claims (6)

  1. 면역세포의 생체외 배양, 유도, 활성화, 동결보존 방법 및 그 세포 은행의 구축으로서,
    500 ~ 2000 IU/ml의 IL-2, 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-10, 0.5 ~ 1 ng/ml의 IL-1α 및 1 ~ 4 ng/ml의 LIF, 0.5 ~ 2.5 ng/ml의 EPO, l ~ 4 ng/ml의 KGF, 2 ~ 5 ng/ml의 테스토스테론, 1 ~ 4 μg/ml의 부갑상선 호르몬, 1 ~ 4 μg/ml의 라미닌이 첨가된 무혈청 림프구 배지인 면역세포 전용 증폭 배지를 이용하여 단핵세포에 대해 제1 단계 증폭 배양을 수행하여 초보적으로 증폭된 면역세포를 얻는 단계;
    면역세포 전용 유도 배지를 이용하여, 초보적으로 증폭된 면역세포에 대해 제2 단계 유도 및 증폭 배양을 수행하여 유도된 면역세포를 얻는 단계;
    면역세포 전용 활성화 배지를 이용하여, 유도된 면역세포에 대해 제3 단계 활성화 및 증폭 배양을 수행하여 기능이 활성화된 대량의 면역세포를 얻는 단계;
    면역세포 전용 동결보존액을 이용하여 면역세포를 동결보존하여 동결보존된 면역세포를 얻는 단계; 및
    ABO/RH 형별 및 HLA 형별에 따라 보존하고, 검색 가능한 면역세포 정보 아카이브를 구축하여 면역세포 은행을 구축하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포 전용 유도 배지는 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-2, 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-10, 1 ~ 4 ng/ml의 bFGF, 1 ~ 4 ng/ml의 BMP-4, 0.2 ~ 0.8 μg/ml의 라파마이신, 0.2 ~ 0.8 μg/ml의 이카린, 20 ~ 80 ng/ml의 트라메티닙, 1 ~ 4 ng/ml의 히드로코르티손, 1 ~ 4 μg/ml의 라미닌이 첨가된 무혈청 림프구 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포 전용 활성화 배지는 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-2, 500 ~ 2000 IU/ml의 IL-10, 1 ~ 4 ng/ml의 TGF-β, 1-2 ng/ml의 포스콜린(Forskolin), 20 ~ 80 ng/ml의 레스베라트롤, 1 ~ 4 μg/ml의 아세트아미노펜, 1 ~ 4 μg/ml의 라미닌이 첨가된 무혈청 림프구 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포 전용 동결보존액은 5 부피 백분율의 DMSO, 1 ~ 2 부피 백분율의 알부민, 1 ~ 2 부피 백분율의 아미노에탄올, 91 ~ 93 부피 백분율의 무혈청 림프구 배지를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 면역세포 전용 증폭 배지, 면역세포 전용 유도 배지, 면역세포 전용 활성화 배지 및 면역세포 전용 동결보존액에서, 상기 무혈청 림프구 배지는 X-VOVO15 무혈청 배지 또는 시판되는 다른 유형의 무혈청 배지인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포는 자연살해세포인 것을 특징으로 하는 방법.
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