KR20220120589A - 에텔칼세타이드 중간체 및 에텔칼세타이드의 합성 방법 - Google Patents

에텔칼세타이드 중간체 및 에텔칼세타이드의 합성 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 에텔칼세타이드 중간체 및 에텔칼세타이드의 합성 방법을 공개한다. 여기서, 상기 에텔칼세타이드 중간체는 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH이고, 에텔칼세타이드 중간체의 합성 방법은, N-Boc-L-Cys-OtBu를 출발 원료로 하여 치환 반응을 통해 식(A)로 표시되는 1차 생성물을 생성하되, R은 S-Py 또는 Cl인 단계; 및 1차 생성물과 Fmoc-D-Cys-OH 아미노산을 커플링 반응시켜 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 얻는 단계;를 포함한다. 상기 핵심 중간체는 에텔칼세타이드의 합성에 사용되어 순도 및 수율을 향상시킬 수 있고, 중요한 것은, 이 핵심 중간체를 합성하는 원료가 저렴하고 쉽게 얻을 수 있으며 공정이 간단하다는 것이다.
Figure pct00006

Description

에텔칼세타이드 중간체 및 에텔칼세타이드의 합성 방법
본 발명은 화학 합성 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로, 에텔칼세타이드 중간체 및 에텔칼세타이드의 합성 방법에 관한 것이다.
에텔칼세타이드는 KaiPharmaceuticals, Inc.에 의해 개발된 부갑상선 호르몬의 분비를 억제할 수 있는 새로운 칼슘 유사 작용제이다. 에텔칼세타이드는 부갑상선의 칼슘 감지 수용체에 결합하고 활성화하여 부갑상선 호르몬 수치를 감소시킬 수 있다.
에텔칼세타이드는 3개의 D-아르기닌, 2개의 D-알라닌, 1개의 D-아르기닌 아미드, 1개의 L-시스테인 및 1개의 D-시스테인(N-말단은 아세틸기에 의해 폐쇄됨)으로 구성되고, 그 중 D-시스테인과 L-시스테인은 이황화 결합에 의해 함께 연결된다(N-acetyl-D-cysteinyl-D-alanyl-D-arginyl-D-arginyl-D-arginyl-D-alanyl-D-Argininamide, disulfide with L-cysteine).
현재 보고된 특허에서는, 모두 고상으로 7개의 펩티드를 연결시키고, 다음 상이한 방법을 선택하여 이황화 결합을 연결시키며, 특히 MMT를 제거하는 과정에서, 1% ~ 2%의 TFA/DCM을 사용하여 15회 이상 반복적으로 조작해야 하므로, 조작이 상당히 번거롭다.
특허 2017/114238 A1: 이용된 액상 합성 방법은 경로가 길고 총 수율은 11%에 불과하며; 특허 WO 2017/114240 A1: 특허에 따르면, 조 펩티드의 순도는 81.0%이고, 불순물이 많으며, 정제 후 총 수율은 30.5%이고; 특허 US 2019/0100554 A1: 특허에 따르면, 조 펩티드의 순도는 낮아 여러 번 정제해야 하며, 총 수율은 50%이고; 중국 특허 CN201811277081에서, 조 펩티드의 순도는 88.2%이며, 정제 후 총 수율은 57.8%이다. 다시 말하면, 현재 7 펩티드를 고상 합성하여 시스테인 및 유도체를 연결하는 방법은 조 펩티드의 순도가 낮고 불순물이 많으며 정제가 어려운 등 문제가 존재한다.
본 발명은 에텔칼세타이드 중간체 및 에텔칼세타이드의 합성 방법을 제공하는 것을 목적으로 하고, 상기 중간체는 에텔칼세타이드의 합성에 사용되어 종래 기술에서 에텔칼세타이드 합성 단계가 복잡한 기술적 과제를 해결한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 측면에 따르면, 에텔칼세타이드 중간체의 합성 방법을 제공한다. 상기 에텔칼세타이드 중간체는 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH이고, 이는 구조식 I로 표시된다.
Figure pct00001
에텔칼세타이드 중간체의 합성 방법은, N-Boc-L-Cys-OtBu를 출발 원료로 하여 치환 반응을 통해 1차 생성물
Figure pct00002
을 생성하되, R은 S-Py 또는 Cl인 단계; 및 1차 생성물과 Fmoc-D-Cys-OH 아미노산을 커플링 반응시켜 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 얻는 단계;를 포함한다.
또한, 1차 생성물은 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu이고, Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH는, N-Boc-L-Cys-OtBu와 디티오디피리딘을 치환 반응시켜 1차 생성물 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu를 합성하여 얻는 단계; 및 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu와 Fmoc-D-Cys-OH를 커플링시켜 Fmoc-D-Cys-(S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu)-OH를 얻는 단계;를 통해 제조된다.
또한, Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH는, 실온에서, N-Boc-L-Cys-OtBu 및 디티오디피리딘을 용매 A에 첨가하고, 6 ~ 12 시간 동안 교반한 다음, 물을 첨가하고, 추출제를 사용하여 추출하고, 얻은 유기상을 건조시키고 여과하고, 정제한 후 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu를 얻는 단계; 및 용매 B에 Fmoc-D-Cys-OH 및 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu를 첨가하고, 온도를 15 ~ 30℃로 조절하여 0.5 ~ 2 시간 동안 교반하여 반응시키고, 반응 시스템을 물로 세척하고, 농축 및 정제하여 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 얻는 단계;를 통해 제조되고; 바람직하게는, 용매 A는 DMF, NMP 및 DMAc 중 하나 이상으로부터 선택되며; 바람직하게는, 추출제는 EtOAc, MTBE 및 DCM 중 하나 이상으로부터 선택되고; 바람직하게는, 용매 B는 DCM, DMF, THF, NMP 및 DMAc 중 하나 이상으로부터 선택된다.
또한, N-Boc-L-Cys-OtBu와 디티오디피리딘의 반응에서, N-Boc-L-Cys-OtBu와 디티오디피리딘의 몰비는 1 : 1.2 ~ 1 : 6.4이고; 용매 A에서 N-Boc-L-Cys-OtBu의 농도는 0.01 ~ 0.3 g/mL이며; 용매 B에서 Fmoc-D-Cys-OH의 농도는 0.01 ~ 0.3 g/mL이고; Fmoc-D-Cys-OH와 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu의 몰비는 1 : 0.8 ~ 1.4이다.
또한, 1차 생성물은 (N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu이고, Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH는, N-Boc-L-Cys-OtBu와 NCS를 반응시켜 (N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu를 합성하는 단계; 및 (N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu와 Fmoc-D-Cys-OH를 반응시켜 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 얻는 단계;를 통해 제조된다.
또한, Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH는, N-Boc-L-Cys-OtBu를 용매 C에 용해시키고, 온도를 0 ~ 10℃로 조절하고, DIPEA를 첨가하고, NCS를 여러 번 나누어 첨가하고, 4 ~ 5 시간 동안 교반하고, 반응이 종료된 후, 여과하고, 헹구어 여과액을 얻는 단계 A; 및 온도를 0 ~ 10℃로 조절하고, Fmoc-D-Cys-OH를 여과액에 첨가하고, DIPEA를 첨가하고, 반응 온도를 10 ~ 30℃로 조절하고, 0.5 ~ 2 시간 동안 교반하고, 반응 시스템을 물로 세척하고, 농축 및 정제하여 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 얻는 단계 B;를 통해 제조되고; 바람직하게는, 용매 C는 DCM, THF, DMF, NMP 및 DMAc 중 하나 이상으로부터 선택된다.
또한, 단계 A에서, N-Boc-L-Cys-OtBu를 용매 C에 용해시켜 농도가 0.01 ~ 0.3 g/mL인 용액을 얻고, DIPEA의 첨가량은 몰 기준으로 2 ~ 3eq이며, NCS의 첨가량은 1.1 ~ 1.5eq이고; 단계 B에서, Fmoc-D-Cys-OH의 첨가량은 1.1 ~ 1.5eq이다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 에텔칼세타이드의 합성 방법을 제공한다. 상기 합성 방법은, 상기 어느 한 에텔칼세타이드 중간체의 합성 방법에 따라 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 합성하는 단계 S1; 및 NH2 -D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg와 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 반응시킨 다음, Fmoc를 제거하고, 아세틸화를 통해 에텔칼세타이드를 얻는 단계 S2;를 포함한다.
또한, S2에서, NH2 -D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg는 NH2 -D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-수지 헥사펩티드이다.
또한, S2는, 아미노 수지를 사용하여 고상 합성법에 따라 NH2 -D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-수지 헥사펩티드를 연결하고, Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH, PyBop 및 DIPEA를 0 ~ 5℃에서 0 ~ 10 분 동안 활성화하고, 온도를 20 ~ 30℃로 조절하여 2 ~ 6 시간 동안 반응시키고, 반응이 종료된 후 DMF로 4 ~ 6회 세척하며, 10% ~ 20%의 피페리딘으로 Fmoc를 제거하고, 아세틸화를 통해 에텔칼세타이드의 펩티드 수지를 얻는 단계를 포함한다.
또한, Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH : PyBop : DIPEA = 3 : 3 ~ 6 : 3 ~ 6이다.
본 발명의 기술적 해결수단을 적용하여, 핵심 중간체 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 합성한 후 에텔칼세타이드를 합성함으로써, 펩티드 사슬이 이황화 결합을 구축할 때의 부반응을 방지하고, 조작을 간소화하여, 에텔칼세타이드의 합성에 사용시 순도 및 수율을 향상시킬 수 있고, 중요한 것은, 이 중간체를 합성하는 원료가 저렴하고 쉽게 얻을 수 있으며 공정이 간단하다는 점이다.
본 발명의 일부를 구성하는 명세서의 도면은 본 발명을 더 잘 이해하기 위한 것이고, 본 발명의 예시적인 실시예 및 그 설명은 본 발명을 해석하기 위한 것일 뿐 본 발명에 대해 부적절하게 한정하지 않는다.
도 1은 실시예 1의 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH의 순도 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 실시예 1의 중간체 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH의 LCMS 스펙트럼(LC-MS: m/z = 617.9(M-1, 30 ev), 1235.7(2M-1, 30 ev))을 나타낸다.
도 3은 실시예 3의 제조 및 정제 후의 에텔칼세타이드의 순도 스펙트럼을 나타낸다.
여기서, 모순되지 않는 경우, 본 발명의 실시예 및 실시예의 특징은 서로 조합될 수 있다. 아래 도면을 참조하고 실시예와 함께 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에 관련된 약어는 다음과 같이 해석된다.
Fmoc: 9-플루오레닐메톡시카르보닐
Boc: tert-부틸카르보닐
tBu: tert-부틸
Arg: 아르기닌
Cys: 시스테인
Ala: 알라닌
PyBop:헥사플루오로인산(벤조트리아졸-1-일-옥시)트리피롤리디노-포스포늄
DIPEA: N,N-디이소프로필에틸아민
DCM: 디클로로메탄
NCS: N-클로로숙신이미드
DMF: N,N-디메틸포름아미드
NMP: N-메틸피롤리돈
DMAc: N,N-디메틸아세트아미드
THF: 테트라히드로푸란
OtBu: tert-부톡시
EtOAc: 아세트산에틸
에텔칼세타이드의 합성에서, 가장 핵심적인 것은 이황화 결합의 합성이다. 상기 단계의 수율의 좋고 나쁨은 최종 전체 경로의 수율에 직접적인 영향을 미친다. 본 발명의 발명자들은 핵심 중간체 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH, (N-플루오레닐포르밀-D-시스테인-S-S-(N-tert-부톡시카르보닐-L-시스테인 tert-부틸 에스테르))의 합성은 이황화 결합을 미리 합성함으로써, 고상 반응 효율이 낮고 수율이 낮은 문제를 완벽하게 피할 수 있다.
본 발명의 일 전형적인 실시형태에 따르면, 에텔칼세타이드 중간체의 합성 방법을 제공하되, 에텔칼세타이드 중간체는 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH이고, 에텔칼세타이드 중간체의 합성 방법은, N-Boc-L-Cys-OtBu를 출발 원료로 하여 치환 반응을 통해 1차 생성물
Figure pct00003
을 생성하되, R은 S-Py 또는 Cl인 단계; 및 1차 생성물과 Fmoc-D-Cys-OH 아미노산을 커플링 반응시켜 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 얻는 단계;를 포함한다.
본 발명의 기술적 해결수단을 적용하여, 핵심 중간체 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 합성한 후 에텔칼세타이드를 합성함으로써, 펩티드 사슬이 이황화 결합을 구축할 때의 부반응을 방지하고, 조작을 간소화하여, 에텔칼세타이드의 합성에 사용시 순도 및 수율을 향상시킬 수 있고, 중요한 것은, 이 핵심 중간체를 합성하는 원료가 저렴하고 쉽게 얻을 수 있으며 공정이 간단하다는 점이다.
본 발명의 일 전형적인 실시형태에 따르면, 1차 생성물은 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu이고, Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH는, N-Boc-L-Cys-OtBu와 디티오디피리딘을 반응시켜 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu를 합성하여 얻는 단계; 및 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu와 Fmoc-D-Cys-OH를 커플링시켜 Fmoc-D-Cys-(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 얻는 단계;를 통해 제조되고, 중요한 것은, 이 중간체를 합성하는 원료가 저렴하고 쉽게 얻을 수 있으며 공정이 간단하다는 점이다.
바람직하게는, Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH는, 실온에서, (N-Boc)-L-Cys-OtBu 및 디티오디피리딘을 용매 A에 첨가하고, 6 ~ 12 시간 동안 교반한 다음, 물을 첨가하고, 추출제를 사용하여 추출하고, 얻은 유기상을 건조시키고 여과하여, 정제한 후 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu를 얻는 단계; 및 용매 B에 Fmoc-D-Cys-OH 및 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu를 첨가하고, 온도를 15 ~ 30℃로 조절하여 0.5 ~ 2 시간 동안 교반하여 반응시키고, 반응 시스템을 물로 세척하고, 농축 및 정제하여 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 얻는 단계;를 통해 제조된다. 바람직하게는, 용매 A는 DMF, NMP 및 DMAc 중 하나 이상으로부터 선택되며; 바람직하게는, 추출제는 EtOAc, MTBE 및 DCM 중 하나 이상으로부터 선택되고; 바람직하게는, 상기 용매 B는 DCM, DMF, THF, NMP 및 DMAc 중 하나 이상으로부터 선택된다.
원료의 이용률을 향상시키고 신속하고 효과적인 반응을 보장하기 위해, 더 바람직하게는, N-Boc-L-Cys-OtBu와 디티오디피리딘의 반응에서, N-Boc-L-Cys-OtBu와 디티오디피리딘의 몰비는 1 : 1.2 ~ 1 : 6.4이고, 용매 A에서 (N-Boc)-L-Cys-OtBu의 농도는 0.01 ~ 0.3 g/mL이며; 용매 B에서 Fmoc-D-Cys-OH의 농도는 0.01 ~ 0.3 g/mL이고; Fmoc-D-Cys-OH와 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu의 몰비는 1 : 0.8 ~ 1.4이다.
본 발명의 일 전형적인 실시형태에 따르면, 1차 생성물은 (N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu이고, Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH는, N-Boc-L-Cys-OtBu와 NCS를 반응시켜 (N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu를 합성하는 단계; 및 (N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu와 Fmoc-D-Cys-OH를 반응시켜 Fmoc-D-Cys-(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 얻는 단계;를 통해 제조된다.
바람직하게는, Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH는, (N-Boc)-Cys-OtBu를 용매 C에 용해시키고, 온도를 0 ~ 10℃로 조절하고, DIPEA를 첨가하고, NCS를 여러 번 나누어 첨가하고, 4 ~ 5 시간 동안 교반하고, 반응이 종료된 후, 여과하고, 헹구어 여과액을 얻는 단계 A; 및 온도를 0 ~ 10℃로 조절하고, Fmoc-D-Cys-OH를 여과액에 첨가하고, DIPEA를 첨가하고, 반응 온도를 10 ~ 30℃로 조절하여, 0.5 ~ 2 시간 동안 교반하고, 반응 시스템을 물로 세척하고, 농축 및 정제하여 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 얻는 단계 B;를 통해 제조된다. 바람직하게는, 상기 용매 C는 DCM, THF, DMF, NMP 및 DMAc 중 하나 이상으로부터 선택된다.
원료의 이용률을 향상시키고 신속하고 효과적인 반응을 보장하기 위해, 더 바람직하게는, 단계 A에서, (N-Boc)-L-Cys-OtBu를 용매 C에 용해시켜 농도가 0.01 ~ 0.3 g/mL인 용액을 얻고, DIPEA의 첨가량은 몰 기준으로 2 ~ 3eq이며, NCS의 첨가량은 1.1 ~ 1.5eq이고; 상기 단계 B에서, Fmoc-D-Cys-OH의 첨가량은 1.1 ~ 1.5eq이다.
본 발명의 일 전형적인 실시형태에 따르면, 에텔칼세타이드의 합성 방법을 제공한다. 상기 합성 방법은, 상기 어느 한 에텔칼세타이드 중간체의 합성 방법에 따라 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 합성하는 단계 S1; 및 NH2 -D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg와 상기 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 반응시킨 다음, Fmoc를 제거하고, 아세틸화를 통해 에텔칼세타이드를 얻는 단계 S2;를 포함한다.
핵심 중간체 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH의 원료가 저렴하고 쉽게 얻을 수 있으며, 공정이 간단하므로, 본 발명의 에텔칼세타이드의 합성 방법은, 원료가 저렴하고 쉽게 얻을 수 있으며, 공정이 간단하다.
바람직하게는, S2에서, NH2 -D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg는 NH2 -D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-수지 헥사펩티드이다. 바람직하게는, S2는, 아미노 수지를 사용하여 고상 합성법에 따라 NH2 -D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-수지 헥사펩티드를 연결하고, Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH, PyBop 및 DIPEA를 0 ~ 10℃에서 0 ~ 10 분 동안 활성화하고, 온도를 20 ~ 30℃로 조절하여 2 ~ 6 시간 동안 반응시키고, 반응이 종료된 후 DMF로 6회 세척하고, 10% ~ 20%의 피페리딘으로 Fmoc를 제거하고, 아세틸화를 통해 에텔칼세타이드의 펩티드 수지를 얻는 단계를 포함한다. 더 바람직하게는, Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH : PyBop : DIPEA = 3 : 3 ~ 6 : 3 ~ 6이다.
아래에 실시예와 함께 본 발명의 유익한 효과를 설명한다.
구체적인 실시형태 합성 경로:
Figure pct00004
실시예 1
R = S-Py
N-Boc-L-Cys-OtBu(Cpd 1)를 원료로 하여 디티오디피리딘과 반응시켜 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu(Cpd 2a)를 합성하고, Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu(Cpd 2a)와 Fmoc-D-Cys-OH를 커플링시켜 Fmoc-D-Cys-(S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu)-OH(Cpd 3)를 얻는다.
단계 1
실온에서, Cpd 1(1.6g, 1.0eq) 및 2,2-디티오디피리딘(2,2-dithiodipyridne)(5.1g, 4.0eq)을 DMF(16mL, 10 vol.)에 첨가한다. 반응물을 실온에서 6 ~ 12 시간 동안 교반한 다음, 시스템에 물을 첨가하고, 아세트산에틸(100mL×3)로 추출하여, 유기상을 합한 후 MgSO4로 건조시키고, 여과하고, 유기상을 농축하여 Cpd 2a 조 생성물을 얻고, 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 순수한 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu(Cpd 2a)를 얻는다.
단계 2
15 ~ 30℃에서, DCM(30ml, 30 vol.)에 Fmoc-D-Cys-OH(1.0g, 1.0eq.)를 첨가한 다음, Cpd 2a(1.13g, 1.0eq.)를 반응 시스템에 첨가하고, 온도를 15 ~ 30℃로 조절하여 0.5 ~ 2 시간 동안 교반하여 반응시키고, 시스템을 3회 세척하고, 농축하여 조 생성물 Cpd 3을 얻어, 컬럼 크로마토그래피를 통해 순수한 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys-(OtBu))-OH(Cpd 3)를 얻는다.
도 1은 정제 후의 Cpd 3의 순도 스펙트럼을 나타내고; 도 2는 정제 후의 Cpd 3의 LCMS 스펙트럼을 나타낸다.
실시예 2
R＝Cl
N-Boc-L-Cys-OtBu(Cpd 1)를 원료로 하여 NCS와 반응시켜 (N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu(Cpd 2b)를 합성하고, (N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu(Cpd 2b)와 Fmoc-D-Cys-OH를 반응시켜 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys-(OtBu))-OH(Cpd 3)를 얻는다.
단계 1
(N-Boc)-Cys-OtBu(0.28g, 0.1 mmol)를 DCM(20mL)에 용해시키고, 교반하며 온도를 0 ~ 10℃로 조절하고, DIPEA(0.19g, 0.15 mmol)를 첨가하고, 온도를 0 ~ 10℃로 조절하고, NCS(0.15g, 1.1eq)를 여러 번 나누어 첨가하고, 반응물을 보온하며 4 ~ 5 시간 동안 교반하고, HPLC로 반응 종점을 모니터링하고, 반응이 종료된 후, 여과하고, 필터 케이크를 DCM(20mL)으로 헹구고, 여과액을 합하여 다음 단계에 직접 사용한다.
단계 2
온도를 0 ~ 10℃로 조절하고, Fmoc-D-Cys-OH(0.34g, 0.1 mmol)를 이전 단계의 여과액에 첨가한다. DIPEA(0.15g, 1.1eq)를 반응 시스템에 적가하고, 반응 온도를 10 ~ 30℃로 조절하여, 0.5 ~ 2 시간 동안 교반하고, 시스템을 3회 세척하고, 농축하여 조 생성물 Cpd 3을 얻고, 컬럼 크로마토그래피를 통해 순수한 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys-(OtBu))-OH(Cpd 3)를 얻는다.
정제 후의 Cpd 3의 LCMS 스펙트럼은 도 2에 도시된 바와 같다.
실시예 3
핵심 중간체를 사용한 에텔칼세타이드의 합성:
아미노 수지(Sieber 수지, Rink Amide MBHA, Rink Amide 수지를 포함하지만 이에 한정되지 않음)를 사용하여 고상 합성법에 따라 NH2 -D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-수지 헥사펩티드를 연결하고, 핵심 중간체를 사용하여 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH : PyBop : DIPEA = 3 : 3 : 3의 비율에 따라 0 ~ 5℃에서 0 ~ 5 분 동안 활성화하고, 온도를 20 ~ 30℃로 조절하여 2 ~ 6 시간 동안 반응시키고, kaiser로 반응 종점을 검출한다. 반응이 종료된 후 DMF로 6회 세척하고, 20%의 피페리딘으로 Fmoc를 제거하고, 아세틸화를 통해 에텔칼세타이드의 펩티드 수지를 얻는다. 절단 후 조 펩티드의 순도는 90.3%이고, 제조 및 정제 후 순도는 99.51%이며, 총 수율은 65%이다.
새로 개발된 에텔칼세타이드 핵심 중간체 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH의 합성 공정을 참조하여, 100g의 시스테인을 출발 물질로 하여 최종적으로 357g의 핵심 중간체를 합성한다. 이 중간체를 사용하여 실시예 3에 따라 에텔칼세타이드를 합성하고, 제조 및 정제 후 227g(TFA염)의 순수한 생성물을 얻었으며, 순도는 99.51%(도 3)이고, 총 수율은 65%이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명에 따른 실시예는 다음과 같은 기술적 효과를 구현하였다. 본 발명에서는 먼저 에텔칼세타이드의 핵심 중간체 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 합성하고, 상기 중간체를 사용하여 에텔칼세타이드를 합성하여, 제조 후 순도는 99.51%(도 3)에 도달할 수 있고, 분리 수율은 73%이므로, 기존 합성 과정에서 폴리펩티드 사슬 간 이황화 결합이 미스매치하는 반응이 존재하고, 부반응 및 부산물의 종류가 많은 문제를 해결하였음을 알 수 있다.
이상은 단지 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐, 본 발명을 제한하지 않고, 당업자에게 있어서, 본 발명은 다양한 변경 및 변형을 가할 수 있다. 본 발명의 사상 및 원칙 내에서 진행된 모든 수정, 등가적 대체, 개선 등은 모두 본 발명의 보호범위 내에 속해야 한다.

Claims (11)

  1. 에텔칼세타이드 중간체의 합성 방법으로서,
    상기 에텔칼세타이드 중간체는 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH이고,
    N-Boc-L-Cys-OtBu를 출발 원료로 하여 치환 반응을 통해 1차 생성물
    Figure pct00005
    을 생성하되, R은 S-Py 또는 Cl인 단계; 및
    상기 1차 생성물과 Fmoc-D-Cys-OH 아미노산을 커플링 반응시켜 상기 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 얻는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 에텔칼세타이드 중간체의 합성 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 1차 생성물은 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu이고, 상기 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH는,
    N-Boc-L-Cys-OtBu와 디티오디피리딘을 치환 반응시켜 1차 생성물 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu를 합성하여 얻는 단계; 및
    상기 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu와 Fmoc-D-Cys-OH를 커플링시켜 상기 Fmoc-D-Cys-(S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu)-OH를 얻는 단계;를 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH는,
    실온에서, N-Boc-L-Cys-OtBu 및 디티오디피리딘을 용매 A에 첨가하고, 6 ~ 12 시간 동안 교반한 다음, 물을 첨가하고, 추출제를 사용하여 추출하고, 얻은 유기상을 건조시키고 여과하여, 정제한 후 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu를 얻는 단계; 및
    용매 B에 Fmoc-D-Cys-OH 및 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu를 첨가하고, 온도를 15 ~ 30℃로 조절하여 0.5 ~ 2 시간 동안 교반하여 반응시키고, 반응 시스템을 물로 세척하고, 농축 및 정제하여 상기 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 얻는 단계;를 통해 제조되고;
    상기 용매 A는 DMF, NMP 및 DMAc 중 하나 이상으로부터 선택되며;
    상기 추출제는 EtOAc, MTBE 및 DCM 중 하나 이상으로부터 선택되고;
    상기 용매 B는 DCM, DMF, THF, NMP 및 DMAc 중 하나 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  4. 청구항 3에 있어서,
    상기 N-Boc-L-Cys-OtBu와 디티오디피리딘의 반응에서, N-Boc-L-Cys-OtBu와 디티오디피리딘의 몰비는 1 : 1.2 ~ 1 : 6.4이고, 상기 용매 A에서 N-Boc-L-Cys-OtBu의 농도는 0.01 ~ 0.3 g/mL이며; 상기 용매 B에서 Fmoc-D-Cys-OH의 농도는 0.01 ~ 0.3 g/mL이고; Fmoc-D-Cys-OH와 Py-S-S-(N-Boc)-L-Cys-OtBu의 몰비는 1 : 0.8 ~ 1.4인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 1차 생성물은 (N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu이고, 상기 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH는,
    N-Boc-L-Cys-OtBu와 NCS를 반응시켜 (N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu를 합성하는 단계; 및
    (N-Boc)-L-Cys(S-Cl)-OtBu와 Fmoc-D-Cys-OH를 반응시켜 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 얻는 단계;를 통해 제조되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH는,
    N-Boc-L-Cys-OtBu를 용매 C에 용해시키고, 온도를 0 ~ 10℃로 조절하고, DIPEA를 첨가하고, NCS를 여러 번 나누어 첨가하고, 4 ~ 5 시간 동안 교반하고, 반응이 종료된 후, 여과하고, 헹구어 여과액을 얻는 단계 A; 및
    온도를 0 ~ 10℃로 조절하고, Fmoc-D-Cys-OH를 상기 여과액에 첨가하고, DIPEA를 첨가하고, 반응 온도를 10 ~ 30℃로 조절하여, 0.5 ~ 2 시간 동안 교반하고, 반응 시스템을 물로 세척하고, 농축 및 정제하여 상기 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 얻는 단계 B;를 통해 제조되고;
    상기 용매 C는 DCM, THF, DMF, NMP 및 DMAc 중 하나 이상으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 단계 A에서, N-Boc-L-Cys-OtBu를 상기 용매 C에 용해시켜 농도가 0.01 ~ 0.3 g/mL인 용액을 얻고, DIPEA의 첨가량은 몰 기준으로 2 ~ 3eq이며, NCS의 첨가량은 1.1 ~ 1.5eq이고; 상기 단계 B에서, Fmoc-D-Cys-OH의 첨가량은 1.1 ~ 1.5eq인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  8. 에텔칼세타이드의 합성 방법으로서,
    청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 따른 에텔칼세타이드 중간체의 합성 방법에 따라 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 합성하는 단계 S1; 및
    NH2 -D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg와 상기 Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH를 반응시킨 다음, Fmoc를 제거하고, 아세틸화를 통해 에텔칼세타이드를 얻는 단계 S2;를 포함하는 것을 특징으로 하는 에텔칼세타이드의 합성 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 S2에서, 상기 NH2 -D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg는 NH2 -D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-수지 헥사펩티드인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 S2는, 아미노 수지를 사용하여 고상 합성법에 따라 NH2 -D-Ala-D-Arg-D-Arg-D-Arg-D-Ala-D-Arg-수지 헥사펩티드를 연결하고, Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH, PyBop 및 DIPEA를 0 ~ 5℃에서 0 ~ 10 분 동안 활성화하고, 온도를 20 ~ 30℃로 조절하여 2 ~ 6 시간 동안 반응시키고, 반응이 종료된 후 DMF로 4 ~ 6회 세척하고, 10% ~ 20%의 피페리딘으로 Fmoc를 제거하고, 아세틸화를 통해 에텔칼세타이드의 펩티드 수지를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 합성 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    Fmoc-D-Cys(S-S-(N-Boc)-L-Cys(OtBu))-OH : PyBop : DIPEA = 3 : 3 ~ 6 : 3 ~ 6인 것을 특징으로 하는 합성 방법.
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