KR20200082294A - 엘더베리로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 균주, 이의 분리 방법, 상기 균주를 이용한 오디발효농축액 제조방법 및 이로부터 제조된 오디발효농축액 - Google Patents
엘더베리로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 균주, 이의 분리 방법, 상기 균주를 이용한 오디발효농축액 제조방법 및 이로부터 제조된 오디발효농축액 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 엘더베리(Elder berry)로부터 분리된 유산균 락토바실러스 플란타룸 균주와, 이의 분리방법, 상기 분리된 락토바실러스 플란타룸 균주를 이용하여 오디 농축액을 발효하는 과정을 거쳐 제조되는 오디발효농축액에 관한 것으로서, 이와 같이 제조된 오디발효농축액의 이화학적 특성 및 유산발효물의 효능을 확인하여 기능성 발효 음료의 제조 가능성 및 식품산업에서의 활용 가능성을 제시하고자 하는 발명이다.
Description
본 발명은 엘더베리(Elder berry)로부터 분리된 유산균 락토바실러스 플란타룸 균주와, 이의 분리방법, 상기 분리된 락토바실러스 플란타룸 균주를 이용하여 오디 농축액을 발효하는 과정을 거쳐 제조되는 오디발효농축액에 관한 것으로서, 이와 같이 제조된 오디발효농축액의 이화학적 특성 및 유산발효물의 효능을 확인하여 기능성 발효 음료의 제조 가능성 및 식품산업에서의 활용 가능성을 제시하고자 하는 발명이다.
경제성장에 따른 생활수준의 향상은 소비자들의 건강에 대한 관심을 증대시켜 맛에 의해 좌우 되는 기호 식품뿐만 아니라 건강 보조식품으로서의 기능까지 고려한 소비 트렌드를 보편화 시키고 있다.
이에 따라 대표적인 기호식품으로 분류되던 음료 시장에서 기능성 음료에 대한 소비가 지속적인 성장세를 보이는 가운데 발효음료에 대한 관심 또한 증가하는 추세이다(Yang M 등 2013).
발효음료는 이용되는 미생물에 따라 에탄올 발효를 통한 알콜형 음료와 유기산 발효를 통한 산형 음료로 구분할 수 있으며(Kim ML 등 2008, Jeon MJ 등 2013), 발효 과정에서 생성된 2차 대사산물인 젖산 등에 의하여 기능성 및 풍미를 증진 시키게 된다(Ryu EH 등 2015).
특히 유산균에 의한 발효는 특유의 풍미를 증가시키고 발효 중 생성된 젖산에 의하여 보존성을 향상시킬 뿐만 아니라 유산균이 분비한 단백질 분해효소에 의하여 소화 흡수성이 향상된다(Kim ML 등 2008).
이와 같은 발효를 통한 기능성 향상이 주목 받게 됨에 따라 다양한 유산균에 의한 발효 효과와 관련된 연구가 각광받고 있다. 뿐만 아니라 이러한 연구에는 우수한 유산균이 필수적이기에 다양한 유산균을 발굴하고 이를 이용한 발효 연구가 지속적으로 필요한 실정이다(Ryu EH 등 2015).
세계적으로 베리류의 기능성에 대한 관심이 고조되면서 베리류의 생산 및 소비가 급증하고 있으며, 국내 역시 블루베리, 아로니아, 복분자, 오디 등의 재배 및 생산이 점차 증가하는 추세이다(Ju MJ 등 2009).
이 중 오디는 뽕나무과(Moraceae) 뽕나무속(Morus)에 속하는 교목성 낙엽수인 뽕나무의 열매로서 검은색 또는 자홍색을 띄고 온대와 열대 지방에 주로 분포하며(Park SW 등 1997), 복분자와 더불어 국내에서 재배역사가 가장 오래된 베리류로 분류된다(Ju MJ 등 2009).
오디를 비롯한 베리류는 비타민, 카로테노이드 및 플라보노이드와 같은 페놀성 화합물을 다량 함유하고 있어(Handeland M 등 2014), 강력한 항산화 효과를 지니는 것으로 알려져 있을 뿐만 아니라(Azuma K 등 1999), 항궤양 및 항경련, 위장관의 위액 분비 조절과 설사예방, 당뇨예방(Ham SS 등 1997), 암 예방, 면역 증강 등(Cho YJ 등 2007)의 다양한 생리활성을 가지는 것으로 보고되고 있다(Atoui AK 등 2005).
하지만 오디는 다른 과실에 비해 수분함량이 높아 저장성이 낮으므로 잼, 젤리, 음료 및 술 등에 일부 이용되고 있어 이를 이용한 가공식품 및 기능성 식품 개발이 필요한 실정이다. 최근 Park JB 등(2015)에 의해 젖산균을 이용한 과채류의 발효가 항산화 활성을 증가시킨다는 보고가 있는 만큼 오디를 이용한 발효를 통해 기능성을 강화함으로써 오디의 소비량을 늘리고 국민 건강증진을 위한 음료개발이 필요한 실정이다.
따라서 본 발명에서는 엘더베리로부터 분리된 유산균을 이용하여 오디 농축액을 발효하였고, 이화학적 특성 및 유산발효물의 효능을 확인하여 기능성 발효 음료의 제조 가능성 및 식품산업에서의 활용 가능성을 제시하고자 한다.
본 발명은 엘더베리(Elder berry)로부터 분리된 유산균 락토바실러스 플란타룸 균주와, 이의 분리방법, 상기 분리된 락토바실러스 플란타룸 균주를 이용하여 오디 농축액을 발효하는 과정을 거쳐 제조되는 오디발효농축액에 관한 것으로서, 이와 같이 제조된 오디발효농축액의 이화학적 특성 및 유산발효물의 효능을 확인하여 기능성 발효 음료의 제조 가능성 및 식품산업에서의 활용 가능성을 제시하고자 하는 것을 발명의 목적으로 한다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 엘더베리로부터 순수 분리, 동정하는 것임을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum GBL44(수탁번호 KCCM12371P)) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 상기 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum GBL44(수탁번호 KCCM12371P)) 균주를 분리하는 방법으로서 도 1에 도시된 바와 같이, 엘더베리를 멸균용기에 담은 후 25 ℃에서 3 ~ 7 일간 발효한 후 멸균 거즈로 분리하여 엘더베리 여과액을 제조하는 단계(S10)와,
멸균식염수를 이용한 10배 희석법으로 상기 엘더베리 여과액을 희석하여 엘더베리 여과희석액을 제조하는 단계(S20)와,
탄산칼슘(CaCO3)을 1 ~ 5 wt%로 함유한 MRS 고체배지에 상기 엘더베리 여과희석액을 도말하고 28 ~ 32 ℃에서 45 ~ 52 시간 동안 배양하여 엘더베리 배양액을 제조하는 단계(S30)와,
상기 엘더배리 배양액으로부터 산 생성이 우수하여 투명환을 생성하는 콜로니(colony) 중에서 투명환이 가장 큰 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum GBL44(수탁번호 KCCM12371P)) 균주를 선발하고 순수 분리하는 단계(S40)를 포함하여 이루어지는 락토바실러스 플란타룸 균주 분리방법을 제공한다.
탄산칼슘을 넣은 MRS배지의 경우 유산균 배양 시 유산균에 의해 생성되는 유기산에 의해 배지성분 중 탄산칼슘부분이 중화되어 투명환을 생성하게 된다. 이때 도 2에 도시된 바와 같이, 하얀색 집락 주변에 생기는 투명환이 균주에 따라 크기가 다르다. 본 발명에서는 여러 균주들 중 투명환이 가장 큰 GBL44균주를 선택한다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 상기 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum GBL44(수탁번호 KCCM12371P)) 균주를 이용한 오디발효농축액 제조방법으로서 도 3에 도시된 바와 같이, 오디농축액을 증류수로 희석한 후 85 ~ 95 ℃에서 20 ~ 40 분 동안 가열 살균하여 오디농축 희석액을 준비하는 단계(S10')와,
상기 락토바실러스 플란타룸 균주를 상기 오디농축 희석액에 접종하는 단계(S20')와,
상기 오디농축 희석액을 28 ~ 32 ℃에서 20 ~ 30 시간 동안 발효하는 단계(S30')를 포함하여 이루어지는, 엘더베리로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 균주에 의한 오디발효농축액 제조방법을 제공한다.
이때, 상기 오디농축 희석액은 오디를 10±2°Brix로 희석한 후 85 ~ 95 ℃에서 20 ~ 40 분간 가열 살균하여 제조된 것을 사용한다.
또한, 본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, 상기 락토바실러스 플란타룸 균주에 의한 제조되는 오디발효농축액을 제공한다.
본 발명에서, 엘더베리로부터 분리된 유산균이 오디 농축액의 정상적인 유산발효가 진행됨을 실험을 통해 확인하였으며, 이를 통해 오디를 이용한 유산균 발효제품 제조의 스타터(starter)로 이용 가능함을 확인하였다. 또한 오디 농축액 발효시 본 발명에 따른 발효균주 및 발효조건이 항산화활성에 큰 영향을 주는 것을 확인하였다.
도 1은 본 발명에 따른 락토바실러스 플란타룸 균주 분리방법에 따른 순서도.
도 2는 투명환이 생성된 MRS 배지의 실제 사진.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주를 이용하여 오디발효농축액의 제조방법에 따른 순서도.
도 2는 투명환이 생성된 MRS 배지의 실제 사진.
도 3은 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 균주를 이용하여 오디발효농축액의 제조방법에 따른 순서도.
본 발명은 엘더베리로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum GBL44)(수탁번호 KCCM12371P) 균주를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum GBL44) 균주의 분리방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum GBL44) 균주를 이용한 오디발효농축액 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum GBL44) 균주를 이용하여 제조된 오디발효농축액을 제공한다.
본 발명자들은 상기 분리 및 동정된 균주를 2018년 11월 06일자로 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12371P를 부여받았다.
이하, 본 발명에 따른 구체적인 기술내용에 대해 살펴보도록 한다.
[ 균주 분리, 유산균 발효 실험 ]
1. 실험 재료
본 실험에 사용한 오디농축액은 2018년 전라북도 고창군 선운산 농협에서 구입하였으며, 10°Brix로 희석한 후 90 ℃에서 30 분간 가열 살균하여 사용하였다.
2. 사용균주의 분리 및 배양
전라북도 고창군 농가에서 수집한 엘더베리를 25 ℃에서 5 일간 발효한 후 각각 멸균 거즈로 여과한 액을 균주 분리를 위한 시료로 사용하였다. 시료를 10 배 희석법으로 희석한 후 2% CaCO3(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 함유한 MRS(Difco, Detroit, MI, USA) 고체배지에 도말하고 30 ℃에서 48 시간 배양하였다.
산 생성이 우수하여 투명환을 생성하는 colony 중에서 투명환이 가장 큰 균주를 선발하고, 순수 분리된 균주는 ㈜마크로젠(Seoul, Korea)을 통하여 16S rDNA의 염기서열을 분석 후 NCBI BLASTN 프로그램을 이용하여 균을 동정하였다.
엘더베리로부터 분리 동정한 균주는 Lactobacillus plantarum GBL44(수탁번호 KCCM12371P)로 명명하였다. 유산균은 MRS(Difco) 액체 배지에서 2회 이상 계대 배양한 후 오디 농축 희석액의 2 %가 되도록 접종하였으며, 예비 실험을 통해 오디 농축액에 유산균을 접종하여 발효할 경우 30 ℃에서 24 시간 이후 pH 및 당도의 변화가 거의 없으며, 생균수가 8.79 ~ 9.38 log CFU/mL로 급격히 감소하여 발효가 더 이상 진행되지 않았음을 확인함에 따라 본 발명에서도 30 ℃에서 24 시간 동안 발효한 후 유산균에 따른 발효특성을 비교하였다.
3. 발효특성
유산균 발효액의 pH는 pH meter(S20, Mettler Toledo, Schwerzenbach, Switzerland)로 측정하였으며, 총산도는 시료 용액 10 mL를 pH 8.3까지 도달하는데 필요한 0.1 N NaOH 용액의 소비량(mL)으로 정의하고 lactic acid(%, w/w) 함량으로 환산하여 나타내었다(Chang JY 등 2011).
당도는 상온에서 당도계(PAL-1 Pocket Refractometer, ATAGO, Tokyo, Japan)를 이용하여 측정하였다. 유산발효 기간의 생균수 측정은 배양액 1 mL에 멸균 식염수 9 mL를 혼합하여 10 배 희석법으로 희석하였고, 희석액 100 μL를 MRS 평판배지에 도말한 후 30 ℃에서 48 시간 배양하여 형성된 colony를 계측하여 colony forming unit(CFU/mL)으로 나타내었다.
4. 유기산 함량 분석
유기산은 오디 유산균 발효액을 0.45 μm membrane filter(Millipore, Bedford, MA, USA)로 여과한 후 희석하여 HPLC(Ultimate 3000, Dionex, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 분석하였다.
이 때 표준물질은 젖산, 시트르산, 말산, 초산, 숙신산, 옥살산, 푸마르산(Sigma-Aldrich)을 사용하였으며, 컬럼은 Aminex HPX-87H(300×10 mm; Bio-Rad, Hercules, CA, USA), solvent는 0.01N H2SO4(Sigma-Aldrich)를 사용하였다. 분석조건으로 flow rate는 0.5 mL/min, UV 조건은 210 nm, injection volume은 10 μL였다(Sung JM 등 2008).
5. 유리당 함량 분석
유리당 분석을 위해 시료 5 g에 50 % 에탄올(Sigma-Aldrich) 용액을 가하여 85℃ 수조(Model 10-101, Dae Han Co., Seoul, Korea)에서 25 분간 가온하여 추출하였다. 이를 12,000 ×g으로 10분간 원심분리한 후 membrane filter(0.45 μm)로 여과하여 HPLC(Dionex), RI detector(Shodex RI-101, Showa Denko, Tokyo, Japan)를 사용하여 분석하였으며, 기기의 오븐(Dionex)온도는 70 ℃로 유지하였다.
이 때 표준물질은 글루코스, 갈락토오스, 아라비노오스, 소르비톨, 자일로오스, 프룩토오스, 만노오스, 수크로스, 말토오스, 락토오스, 라피노오스, 스타키오스(Sigma-Aldrich)를 사용하였으며, 컬럼은 Sugar-pak column(300×6.5 mm; Waters, Milford, MA, USA), solvent는 3차 증류수를 0.5 mL/min의 속도로 흐르도록 하였으며, injection volume은 10 μL였다.
최종분석은 운영소프트웨어(Chromeleon 6.0 Chromatography Data System Software, Dionex)를 이용하였다(Kim MH 등 2017).
6. 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 안토시아닌 함량
총 폴리페놀 함량은 건강기능식품공전 방법(Korea Food and Drug Administration 2012)을 응용하여 측정하였다. 오디 유산 발효물 각각의 시료 1 mL에 증류수 7.5 mL와 Folin-Ciocalteau’s phenol regent(Sigma-Aldrich) 0.5 mL, 35% Na2CO3(Sigma-Aldrich) 1 mL를 가한 후 암소에서 1시간 동안 정치한 후, UV/VIS 분광광도계(UV-2450, Shimadzu Co., Kyoto, Japan)를 사용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다.
이때 탄닌산(Sigma-Aldrich)을 표준물질로 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 폴리페놀 함량을 구하였다. 총 플라보노이드 함량은 Chang CC 등(2002)의 방법을 응용하여 측정하였다.
즉 각각의 시료 1 mL에 diethylene glycol3(Sigma-Aldrich) 2 mL, 1 N-NaOH(Samchun Chemicals, Seoul, Korea) 20 μL를 순서대로 가한 다음 37 ℃ 항온수조(Dae Han)에서 1시간 동안 반응시킨 후 UV/VIS 분광광도계(Shimadzu)를 사용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드 함량은 루틴(Sigma-Aldrich)을 표준물질로 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 플라보노이드 함량을 구하였다.
총 안토시아닌 함량은 Kim YD 등(1998)의 방법을 응용하여, 각각의 시료 10 mL에 0.1 % HCl을 함유하는 80% 메탄올(Sigma-Aldrich) 용액 40 mL로 24 시간 동안 진탕배양기(VS-8480, Vision Scientific Co., Ltd., Daejeon, Korea)에서 추출한 후 UV/VIS 분광광도계(Shimadzu)를 사용하여 528 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준물질은 시아니딘(Sigma-Aldrich)을 사용하여 검량곡선을 작성하고 이로부터 총 안토시아닌 함량을 구하였다.
7. DPPH 라디칼 소거활성
DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거능은 Choi JS 등(1993)의 방법을 응용하여 5, 10, 15, 25, 35, 50 μL/mL 농도로 조제한 각각의 추출물 0.1 mL에 에탄올 0.2 mL를 가하고 0.2 mM DPPH 용액(Sigma-Aldrich) 0.3 mL를 가한 후 볼텍스 믹서(VM-10, Daihan Scientific Co., Ltd., Gangwon, Korea)로 교반하였고, 실온에서 30분간 반응시키고 마이크로플레이트 리더(Synergy HT, Biotec, Washington, DC, USA)를 사용하여 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조구는 에탄올을 사용하여 분석하였다.
8. ABTS 라디칼 소거활성
ABTS(2-2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt) 라디칼 소거능은 Arts MJTJ 등(2004)의 방법을 응용하여 5, 10, 15, 25, 35, 50 μL/mL 농도로 조제한 각각의 시료 5 μL에 ABTS 라디칼 용액(Sigma-Aldrich) 195 μL를 첨가하여 7분간 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더(Biotec)를 사용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였고, 대조구는 시료 대신에 에탄올을 첨가하였다.
[ 균주 분리, 유산균 발효 실험의 결과 및 고찰]
1. 오디의 발효 중 pH, 산도 및 당도 변화
엘더베리로부터 분리된 유산균이 오디 농축액의 발효에 미치는 영향을 구명 하고자 발효에 따른 이화학적 특성 변화를 분석하고 표 1에 나타내었다.
발효시간(h) | 대조구 | L. plantarum GBL44 | |
pH | 0 | 4.37±0.13 | 4.34±0.12 |
24 | 4.34±0.14 | 3.51±0.06 | |
총산도(%) | 0 | 0.46±0.01 | 0.49±0.06 |
24 | 0.46±0.01 | 1.17±0.10 | |
당도(°Brix) | 0 | 9.97±0.05 | 9.80±0.09 |
24 | 9.93±0.05 | 9.43±0.10 |
pH의 경우 발효 전 4.34±0.12에서 발효 후 pH가 급격히 감소하여 3.51±0.06을 나타내었으며, 총산도는 발효 전 0.49±0.06%에서 발효 후 총산도가 급격히 증가하여 1.17±0.10%를 나타내었다. 당도의 경우 발효 전 9.80±0.09°Brix에서 발효 후 감소하여 9.43±0.10으로 나타났다.
한편, 유산균을 접종하지 않은 대조군의 경우 pH는 발효 전 4.37±0.13에서 발효 후 4.34±0.14로 나타났으며, 총산도는 발효 전과 후 모두 0.46±0.01%로 나타났다. 당도의 경우 발효 전 9.97±0.05°Brix에서 발효 후 9.93±0.05°Brix로 소폭 감소한 것으로 나타났다.
이는 Chae KS 등(2017)의 연구와 유사한 결과로 유산균을 이용한 발효에서 발효가 진행됨에 따라 유산균의 대사산물인 유기산에 의하여 pH는 감소하고 총산도는 증가한다는 보고와 일치하였다.
당도는 발효 전 9.80°Brix에서 발효가 진행됨에 따라 유의적인 감소를 나타낸 반면, 유산균을 접종하지 않은 대조군의 경우 당도의 변화는 유의적(p<0.05)인 차이가 없는 것으로 나타났다.
이는 Ryu EH 등(2015)의 L. plantarum GBL17 균주를 이용한 복분자 착즙액의 젖산발효특성 연구에서 발효가 진행됨에 따라 당도가 감소하였으나 유산균을 접종하지 않은 대조군의 경우 당도의 변화가 거의 없었다는 보고 및 Chae KS 등(2017)의 연구에서 유산균을 이용한 발효에서 복분자, 아로니아, 오디 및 블루베리 생과를 24시간 동안 발효한 결과, 당도가 감소하였다는 보고와 일치하였다.
따라서 엘더베리로부터 분리된 L. plantarum GBL44 균주는 정상적인 유산발효가 진행된 것으로 판단된다.
2. 발효에 따른 생균수 변화
오디 농축액에 L. plantarum GBL44를 접종한 후 생균수 변화를 측정한 결과는 표 2와 같다.
균주 | 유산균수 (log CFU/mL) | |
0 시간 | 24 시간 | |
대조구 | ND1) | ND |
L. plantarum GBL44 | 8.27±0.15 | 12.74±0.71 |
1) Not detected.
유산균을 8.27±0.15 log CFU/mL의 농도로 접종 후 24시간 동안 발효를 진행한 결과, 발효 후에 생균수가 급격히 증가하여 12.74±0.71 log CFU/mL을 나타내었다. 반면 대조구로 유산균을 접종하지 않은 오디 농축액의 경우 발효 기간 동안 유산균이 검출되지 않았다.
유산균을 이용한 발효연구에서 발효 시간에 따른 생균수 변화는 일반적으로 24시간이 경과될 때까지 지속적으로 증가한 다음 점차 감소하는 경향을 보이는데 이는 유산균에 의해 생성된 유기산과 낮은 pH 및 높은 산도가 유산균의 생육에 영향을 주는 원인이라고 보고되고 있다(Ryu EH 등 2015, Lee DH & Hong JH 2016).
이러한 사실에 비추어 볼 때 본 연구에서 이용된 L. plantarum GBL44 균주는 일반적인 유산균의 생육 특성을 가지고 있으며, 오디를 이용한 유산균 발효 제품의 제조에 starter로 이용 가능한 것으로 판단되었다.
3. 발효에 따른 유기산 및 유리당 변화
발효 전후 L. plantarum GBL44 균주에 따른 유기산의 변화를 표 3에 나타내었다.
발효 시간(h) |
균주 | 유기산 함량(mg/mL) | |||
젖산 | 구연산 | 초산 | 푸마르산 | ||
0 | 대조구 | ND | 2.59±0.03 | 0.11±0.00 | 0.05±0.08 |
24 | L. plantarum GBL44 | 9.80±0.12 | 2.41±0.04 | 0.28±0.00 | ND |
발효 전 오디 농축액의 주요한 유기산은 시트르산으로 2.59 mg/mL를 나타내었으며, 초산과 푸마르산은 각각 0.11 mg/mL 및 0.05 mg/mL를 나타내었다.
발효 전후 가장 큰 차이를 보인 것은 젖산으로 발효 전 오디 농축액에서는 검출되지 않았으나 L. plantarum GBL44 균주를 이용한 발효에서는 증가하는 경향을 보였다. 젖산의 경우 9.80 mg/mL로 유기산 중 가장 높게 나타났으며, 구연산과 초산은 각각 2.41 mg/mL, 0.28 mg/mL를 나타내었으며, 푸마르산은 검출되지 않았다.
이러한 결과는 감자 주스를 유산발효한 후 젖산과 초산의 함량이 증가하였다는 Kim NJ & Yoon KY(2013)의 연구결과와 유사한 것으로 나타났으나, 발효 후 유기산 함량 변화의 차이는 발효 균주 차이에 기인한 것으로 판단된다.
유산균에 의한 젖산의 함량 증가는 대부분의 발효식품의 맛과 기능성을 증가시키며(Ryu IH & Kwon TO 2013), 식품에서 병원성 미생물의 생육 저해에도 도움이 된다(Kim DC 등 2011). 따라서 본 연구에서 이용된 5종의 균주는 유산발효를 통해 대사산물로서 젖산과 초산을 생성하며, 오디 발효음료 개발 시 맛과 품질에 영향을 줄 것으로 생각된다.
발효 전후 L. plantarum GBL44 균주에 따른 유리당의 변화를 표 4에 나타내었다.
발효 시간(h) |
균주 | 유리당(mg/mL) | ||||
수크로스 | 글루코스 | 프룩토오스 | 갈락토오스 | 소르비톨 | ||
0 | 대조구 | 3.28±0.07 | 38.96±0.38 | 39.35±0.36 | 1.66±0.02 | 0.96±0.01 |
24 | L. plantarum GBL44 | 3.36±0.10 | 33.48±0.31 | 33.22±0.04 | 1.88±0.01 | 1.03±0.03 |
발효 전 오디 농축액에 존재하는 주요 유리당은 글루코스와 프룩토오스로 함량은 각각 38.96 mg/mL과 39.35 mg/mL로 나타났으나 수크로스, 갈락토오스, 소르비톨은 이들보다 10배 이상 낮은 함량을 나타내었다.
발효가 진행됨에 따라 L. plantarum GBL44 균주를 접종한 오디 농축액에서 글루코스와 프룩토오스는 감소하였으며, 이는 오디 농축액의 유산발효 후 글루코스와 프룩토오스의 감소는 유산균의 생육을 위한 영양원으로 이용되었을 것으로 생각된다.
4. 발효에 따른 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 안토시아닌 함량 변화
오디 농축액의 발효 균주에 따른 오디농축액의 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 안토시아닌 함량변화를 표 5에 나타내었다.
발효시간(h) | 균주 | 총 폴리페놀 함량 (TAE1) mg/mL) |
총 플라보노이드 함량 (RUE2) mg/mL) |
총 안토시아닌 함량 (CYE3) mg/mL) |
0 | 대조구 | 1.99±0.05 | 0.51±0.01 | 0.22±0.01 |
24 | L. plantarum GBL44 | 1.87±0.01 | 0.39±0.01 | 0.19±0.01 |
1) 총 폴리페놀 함량은 100 g에 대한 tannin acid (TAE) mg로 표시함. 2) 총 플라보노이드 함량은 100g에 대한 rutin (RUE) mg로 표시함.
3) 총 안토시아닌 함량은 100g에 대한 cyanidin (CYE) mg로 표시함.
항산화 활성의 간접적인 지표가 되는 것으로 알려진(Lee SY 등 2008, Kwak JH 등 2010) 총 폴리페놀 함량의 경우 발효 전 1.99 TAE mg/mL에서 L. plantarum GBL44 균주를 이용한 발효 후 1.87 TAE mg/mL로 발효 후에 총 폴리페놀 함량이 감소하는 것으로 나타났다.
활성산소종을 효과적으로 제거하는 항산화능이 높다고 알려진(Tsao R 2010) 총 플라보노이드 함량은 발효 전 0.51 RUE mg/mL에서 L. plantarum GBL44 균주를 이용한 발효 후 0.39 RUE mg/mL로 총 플라보노이드 함량 역시 감소하는 것으로 나타났다.
또한 총 안토시아닌 함량을 측정한 결과 역시 발효에 의하여 감소하는 경향을 나타내었으며 발효 전 0.22 CYE mg/mL에서 발효 후 0.19 CYE mg/mL로 감소하였다. 이러한 결과는 Lee DH & Hong JH(2016)의 연구에서 유산균을 이용한 오디 발효 시 폴리페놀 및 플라보노이드 등의 함량이 증가되었다는 보고와 차이를 보였다.
하지만 Filannino P 등(2013)의 연구에서 석류 주스를 3종의 L. plantarum으로 발효한 경우 폴리페놀 함량이 감소하였고, Oh BT 등(2017)은 블루베리를 유산균으로 발효한 경우 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 감소하였다는 보고와 유사한 결과를 나타내었다.
Kim YS 등(2011)의 연구에 따르면 미생물을 이용한 발효 초기에는 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량이 감소하지만 발효 시간이 증가할수록 그 함량이 증가한다고 보고하고 있다.
각 연구에서 이용된 균주가 상이한 만큼 본 연구에서 폴리페놀 및 플라보노이드의 함량의 감소는 발효에 이용된 균주 고유의 특성 또는 폴리페놀, 플라보노이드, 안토시아닌의 조성 차이에 기인한 것으로 판단되기 때문에 본 연구에서 이용한 균주의 생육특성 및 페놀화합물의 구성에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다.
폴리페놀 및 플라보노이드의 함량이 기능성 음료의 품질을 결정하는 중요한 요소이기는 하지만 함량이 높아질수록 감칠맛은 떨어지고 쓴맛과 떫은맛이 강해지게 된다(Kim YS 등 2011).
이러한 맛의 변화는 오히려 음료 개발에 제약이 될 수 있기 때문에 폴리페놀 및 플라보노이드 함량의 감소가 유산균의 다른 생리활성에 큰 영향을 주지 않는다면 본 연구에서 사용된 L. plantarum GBL44 균주는 다양한 기능성에 대한 추가적인 연구를 통해 기능성 발효음료 개발에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
5. 발효에 따른 DPPH 및 ABTS 리디칼 소거활성 변화
L. plantarum GBL44 균주를 이용한 오디 농축액의 발효 전후의 항산화 활성 변화를 측정하기 위하여 항산화 활성 지표인 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성의 IC50 값을 측정한 결과를 표 6에 나타내었다.
발효시간(h) | 균주 | DPPH 라디컬 소거활성 | ABTS 라디컬 소거활성 |
(IC50 μL/mL) | |||
0 | 대조구 | 19.72±0.10 | 29.55±0.22 |
24 | L. plantarum GBL44 | 26.15±0.22 | 34.99±0.24 |
발효 전 오디 농축액의 DPPH 라디칼 소거활성의 IC50 값은 19.72 μL/mL이었으나 24시간 발효 후 26.15 μL/mL로 라디칼 소거활성이 감소하는 것으로 나타났다. 또한 ABTS 라디칼 소거활성의 IC50 값을 측정한 결과에서도 발효 전 29.55 μL/mL에서 발효 후에 34.99 μL/mL로 라디칼 소거활성이 감소하는 것으로 나타났다.
이러한 결과는 Lee DH & Hong JH(2016)에 의해 보고된 오디의 유산발효에 의한 항산화 효과의 증가와는 대조되는 결과이나 Park YS & Chang HG(2003)의 복분자의 유산발효와 생리활성 평가 연구에서 유산발효 후 전자공여능이 감소하였다는 보고와 유사한 결과를 보였고, Chae KS 등(2017)의 젖산발효에 의한 복분자, 아로니아, 오디, 블루베리의 이화학적 특성 및 항산화활성 변화 연구에서 오디의 경우 발효 후 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성이 감소하였다는 보고와도 유사하였다.
이러한 결과는 총 폴리페놀, 총 플라보노이드 및 총 안토시아닌의 함량이 DPPH 및 ABTS 라디칼 소거활성에 영향을 미치는 것으로 판단되었고, 오디 농축액 발효 시 발효 균주 및 발효조건이 항산화 활성에 큰 영향을 주는 것으로 판단하였다.
본 발명에서, 엘더베리로부터 분리된 유산균이 오디 농축액의 정상적인 유산발효가 진행됨을 실험을 통해 확인하였으며, 이를 통해 오디를 이용한 유산균 발효제품 제조의 스타터(starter)로 이용 가능함을 확인하였으며, 또한 오디 농축액 발효시 본 발명에 따른 발효균주 및 발효조건이 항산화활성에 큰 영향을 주는 것을 확인함으로써, 오디발효농축액을 이용한 기능성 발효 음료의 제조 가능성 및 식품산업에서의 활용 가능성이 뛰어나 산업상 이용가능성이 높다.
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ctcaggacga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgaacgaact ctggtattga 60
ttggtgcttg catcatgatt tacatttgag tgagtggcga actggtgagt aacacgtggg 120
aaacctgccc agaagcgggg gataacacct ggaaacagat gctaataccg cataacaact 180
tggaccgcat ggtccgagct tgaaagatgg cttcggctat cacttttgga tggtcccgcg 240
gcgtattagc tagatggtgg ggtaacggct caccatggca atgatacgta gccgacctga 300
gagggtaatc ggccacattg ggactgagac acggcccaaa ctcctacggg aggcagcagt 360
agggaatctt ccacaatgga cgaaagtctg atggagcaac gccgcgtgag tgaagaaggg 420
tttcggctcg taaaactctg ttgttaaaga agaacatatc tgagagtaac tgttcaggta 480
ttgacggtat ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt 540
aggtggcaag cgttgtccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg ttttttaagt 600
ctgatgtgaa agccttcggc tcaaccgaag aagtgcatcg gaaactggga aacttgagtg 660
cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata tggaagaaca 720
ccagtggcga aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa gtatgggtag 780
caaacaggat tagataccct ggtagtccat accgtaaacg atgaatgcta agtgttggag 840
ggtttccgcc cttcagtgct gcagctaacg cattaagcat tccgcctggg gagtacggcc 900
gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt 960
aattcgaagc tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat actatgcaaa tctaagagat 1020
tagacgttcc cttcggggac atggatacag gtggtgcatg gttgtcgtca gctcgtgtcg 1080
tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttatcagttg ccagcattaa 1140
gttgggcact ctggtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaaa 1200
tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta caacgagttg 1260
cgaactcgcg agagtaagct aatctcttaa agccattctc agttcggatt gtaggctgca 1320
actcgcctac atgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac 1380
gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca cccaaagtcg 1440
gtggggtaac cttttaggaa ccagccgcct aaggtgggac agatgattag ggtgaagtcg 1500
taacaaggta gccgtaggag aacctgcggc tggatacc 1538
Claims (5)
- 엘더베리로부터 순수 분리, 동정하는 것임을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum GBL44) 균주.
- 엘더베리를 멸균용기에 담은 후 25 ℃에서 3 ~ 7 일간 발효한 후 멸균 거즈로 분리하여 엘더베리 여과액을 제조하는 단계(S10)와,
멸균식염수를 이용한 10배 희석법으로 상기 엘더베리 여과액을 희석하여 엘더베리 여과희석액을 제조하는 단계(S20)와,
탄산칼슘(CaCO3)을 1 ~ 5 wt%로 함유한 MRS 고체배지에 상기 엘더베리 여과희석액을 도말하고 28 ~ 32 ℃에서 45 ~ 52 시간 동안 배양하여 엘더베리 배양액을 제조하는 단계(S30)와,
상기 엘더배리 배양액으로부터 산 생성이 우수하여 투명환을 생성하는 콜로니(colony) 중에서 투명환이 가장 큰 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum GBL44) 균주를 선발하고 순수 분리하는 단계(S40)를 포함하여 이루어지는 것임을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum GBL44) 균주 분리방법.
- 오디농축액을 증류수로 희석한 후 85 ~ 95 ℃에서 20 ~ 40 분 동안 가열 살균하여 오디농축 희석액을 준비하는 단계(S10')와,
상기 락토바실러스 플란타룸 균주를 상기 오디농축 희석액에 접종하는 단계(S20')와,
상기 오디농축 희석액을 28 ~ 32 ℃에서 20 ~ 30 시간 동안 발효하는 단계(S30')를 포함하여 이루어지는, 엘더베리로부터 분리된 락토바실러스 플란타룸 균주에 의한 오디발효농축액 제조방법.
- 청구항 3에 있어서,
오디농축액은 오디를 10±2°Brix로 희석한 후 90℃에서 30분간 가열 살균하여 제조된 것임을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주에 의한 오디발효농축액 제조방법.
- 청구항 3 또는 청구항 4 중 어느 한 방법으로 제조된 것임을 특징으로 하는 락토바실러스 플란타룸 균주에 의한 오디발효농축액
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