KR101160231B1 - 두충 식초 조성물의 제조 방법 - Google Patents
두충 식초 조성물의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 두충을 추출하여 두충 추출액을 제조하고, 제조된 두충 추출액과 사과농축액을 혼합하여 1차 알코올 발효시키고, 알코올 발효된 두충 추출액을 초산 발효시켜 두충 식초 조성물을 얻는 것으로 이루어진 두충 식초 조성물의 제조 방법 및 그로부터 제조된 두충 식초 조성물, 및 두충 식초 조성물 이용한 두충 식초 음료를 제공한다.
두충, 식초, 알코올 발효, 초산 발효
Description
본 발명은 두충 식초 조성물의 제조 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 두충을 추출하여 두충 추출액을 제조하고, 제조된 두충 추출액과 사과농축액을 혼합하여 1차 알코올 발효시키고, 알코올 발효된 두충 추출액을 초산 발효시켜 두충 식초 조성물을 얻는 것으로 이루어진 두충 식초 조성물의 제조 방법 및 그로부터 제조된 두충 식초 조성물에 관한 것이다.
국민소득이 향상되고 건강 지향적 기능성 식품에 대한 소비자들의 관심이 고조되면서 기호식품에 대하여도 건강 기능성을 부가한 제품들이 지속적으로 요구되고 있고, 따라서 독특한 맛과 향 그리고 약리 효과를 가진 식품소재를 이용한 가공식품의 개발 및 상품화가 촉진되고 그 소비 또한 지속적으로 증가할 전망이다.
또한 한미 FTA 체결과 관련하여 국내농가에 상당한 피해가 예상되고 있으며, 이를 슬기롭게 극복하기 위해서는 신제품 또는 식품신소재 개발 등을 통한 국제경쟁력 강화에 역점을 두어야 할 시점이라고 생각된다. 특히 두충은 국내 재배 농가를 보호하기 위하여 1993년부터 수급조절 대상 품목으로 분류되어 수입이 금지되고 있으나, 경기 불황 및 한정된 용도 등에 이유로 두충의 국내소비량은 급격히 감소하고 있는 실정이다. 현재 두층의 국내 수요량과 연간 생산량을 비교해 볼 때 국내 소비량을 충족하고 남아도는 실정이어서 국내 생산 두충의 경쟁력과 생산성을 향상시키기 위해서는 단순 건조나 가공이 아닌 부가가치 창출을 위한 가공기술의 개발이 절실히 요구되고 있다.
한편, 기능성 식품의 개발은 의약품 개발에 비해 개발비가 저렴하고 상대적으로 단시간 내에 상품화할 수 있는 장점을 가지고 있다. 두충을 기능성 식품소재로 활용하기 위해서는 목적 지향적 기능성 식품용 원료로 이용하는 방법에 대한 실험적 연구가 필요한 실정이다.
식초는 대표적인 알칼리성 식품으로 동맥경화증이나 혈전증을 일으키는 과산화지질을 분해해 동맥경화를 예방해주며 스트레스를 관리하는 부신피질 호르몬의 분비, 소화 및 식욕촉진에 효능이 있다고 알려져 있다. 여기에 인체에 활력을 주는 각종 성분을 함유하면서 웰빙 음료로서 그 기능을 인정받고 있다. 그동안 식초는 강한 신맛이 주는 거부감 때문에 직접 음용하지 않고 조미용으로 대부분 사용되어왔다. 그러나 일부 마시는 식초음료가 개발되고 식초건강론을 설파한 한 기업 회장의 강연과 각 매체에서 식초를 주제로 한 건강기능성에 대한 보도 등에 힘입어 지속적인 소비자들의 관심을 얻고 있다.
또한 현대 소비자들의 웰빙 열풍과 맞물려 국내외 음료시장에도 마시는 음료에 대한 건강기능성에 대한 관심이 고조되면서 소비자들의 구매 패턴의 변화를 가져와 2007년 기준 국내 식초시장은 약 450억 원의 매출규모를 형성한 것으로 업계 는 분석하고 있다. 더욱이 2005년 기준 전체 시장의 약 77%를 차지하는 조미 식초의 경우 전년 대비 약 30%의 신장을 기록하였고, 마시는 식초의 경우 2004년 대비 67%의 신장률을 기록하는 등 그 성장세는 주목할 만하다.
한편, 두충(Eucommia ulmoides Oliver)은 쌍떡잎식물 장미목 두충과의 낙엽활엽 교목으로 지름이 40 cm, 높이가 15 m 정도까지 자라는 식물이다. 산과 들에서 자라며 중국의 특산식물 중의 하나로 중국 남부에서 대량으로 재배되고 있고 우리나라에서는 중남부에서 주로 재배되고 있다. 두충은 콜레스테롤 저하, 고지혈증 개선 및 혈압강하, 암세포증식 저해, 강장, 진정, 이뇨 등의 효과가 잘 알려져 있고, 한방에서는 나무껍질을 보약?강장제로 쓰고, 대뇌를 튼튼하게 하며, 폐와 관절염을 다스리는 것으로 알려져 있다. 민간에서는 잎을 달여서 신경통?고혈압에 쓰고 차로도 복용하기도 한다.
대한민국 특허출원 제10-2001-0003645호 “두충식초를 제조하는 방법”에는 건두충을 세척하여 약한 불로 24 시간이상 달여 진액을 추출하는 단계, 상기 단계 후, 찹쌀이나 멥쌀을 세척하여 맑은 물에 10 시간이상 침수하였다가 고두밥을 지어 상온으로 냉각수하는 단계, 상기 단계 후, 전통누룩을 쌀알크기로 분쇄하여 상기 두충추출액, 냉각된 고두밥 등과 모두 혼합하여 발효용기에 넣고 섭씨 25도 내지 30도의 온도에서 3주 내지 4주간 발효수하는 단계, 상기 단계 후, 발효액을 여과하여 3개월 내지 12개월 기간 동안 섭씨 10도 내지 15도의 온도에서 숙성하는 것이 특징인 두충식초를 제조하는 방법이 개시되어 있다.
하지만 상기 방법은 두충을 주원료로 하고 쌀 과 전통누룩을 이용하여 전통 적인 방법으로 두충식초를 제조하는 방법으로, 두충을 기능성 식품소재로 활용하여 목적 지향성 기능성 식품용 원료로 이용하기에는 수율이나 기능성 측면에서 매우 미흡한 실정이다.
이에 본 발명자들은 현재까지 시도된 바 없는 두충의 유효성분을 추출하고, 천연재료로서 사과 농축액과 혼합하여 1차 알코올 발효와 2차 초산 발효를 통한 2단계 발효공정으로 식초 조성물을 제조하고, 이를 기초(base)로 체지방 감소 기능성 발효음료를 개발하고 그 품질특성을 규명하고 본 발명에 이르게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 두충 추출액과 사과 농축액을 혼합한 원료로부터 식초 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 식초 조성물을 기초로 체지방 감소 기능성 발효음료를 제공하는 데 있다.
본 발명의 상기 목적은 두충 추출액의 최적 추출조건과 최적 알콜발효조건을 규명한 다음, 이들의 최적 초산 발효조건을 규명하며 나아가 두충 식초 음료의 기능성을 확인평가하는 단계를 통하여 달성한다.
더욱 상세한 사항은 하기를 통하여 명료해진다.
더욱 상세한 사항은 하기를 통하여 명료해진다.
본 발명에 따른 방법은, 두충을 추출하여 두충 추출액을 제조하는 단계; 상기 두충 추출액과 사과농축액을 혼합한 후, 알코올 발효 효모를 접종하여 1차 알코올 발효시키는 단계; 상기 1차 알코올 발효된 두충 추출액에 초산 발효 균주를 접종하여 2차 초산 발효시키는 단계; 및 상기 2차 초산 발효된 두충 식초 조성물을 수득하는 단계로 이루어진다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 두충 추출액을 제조하기 위한 최적의 추출조건은 추출온도 90 내지 100 ℃, 추출시간 5 내지 10 시간 및 용매비 40 내지 70%(v/w)인 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 두충 추출액의 1차 알코올 발효 단계는 발효온도 25 내지 30℃, 초기 당함량 12 내지 16oBrix 및 발효시간 2 내지 3일로 수행되는 것이 바람직하다.
상기 1차 알코올 발효 단계에 사용되는 균주로는 알코올 발효에 사용되는 통상적인 효모, 예를 들어 Saccharomyces cerevisiae를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 두충으로부터 분리한 알코올 발효 균주 DUJ-98, DUK-99, DUL-11, DUM-12 및 DUN-3 중 어느 하나를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) DUJ 98을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 방법에 있어서, 상기 알코올 발효된 두충 추출액의 2차 초산 발효 단계는 상기 알코올 발효된 두출 추출액에 초산 발효 균주 접종하고 초기산도 1 내지 25%, 진탕속도 200 내지 250 rpm, 발효시간을 6 내지 7일로 수행되는 것이 바람직하다.
상기 2차 초산 발효 단계에 사용되는 균주로는 초산 발효에 사용되는 통상적인 균주를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 두충에서 분리한 아세토박터 속(Acetobacter sp.) 균주를 사용할 수 있다.
상기와 같은 두충 추출액을 사용하여 1차 알코올 발효 및 2차 초산 발효 단계를 통해 두충 식초 조성물을 얻을 수 있다.
상기와 같은 본 발명에 따른 1차 알코올 발효 및 2차 초산 발효를 통한 2단계 발효 방법은 수율이 낮고 6개월 이상의 장기간이 소요되고, 젖산의 함량이 높아 이취발생의 원인이 되는 재래적인 병행복합발효 방법의 문제점을 개선할 수 있다.
특히 1차 알코올 발효를 통해 발효시간의 단축과 수율 높은 술덧의 제조가 가능하며 발효물의 품질에도 기여할 것으로 기대된다. 예를 들면, 감식초의 경우 2단 발효에 의해 제조된 감식초가 시판감식초에 비해 총 탄닌 함량이 높게 나타났으며, 포도식초 및 사과식초의 경우에도 2단계 발효공법에 의해 생산된 제품의 품질이 일반적으로 우수한 것으로 보고되고 있다.
본 발명에 따른 두충 식초 조성물은 제니포사이드 함량이 0.60 ㎍/mL로 나타났으며, 총산함량은 6.36%로 비교적 높게 나타났으며, 각 식초에 함유된 유기산 중 초산 함량은 5395.56 mg%로 주된 유기산 성분으로 나타났으며, 말산, 숙신산, 타타르산, 시트르산의 순으로 함량이 높았다. 당의 함량은 과당이 가장 많이 잔류함을 볼 수 있었으며, 식초 중 식이섬유함량은 0.5%로 나타났다. 무기성분은 K가 다량으로 존재하였고, 그 다음으로 Na, Ca, Mg의 함량이 높았다. 각 식초에서 총 아미노산 함량은 27.64 mg%로 아스파르트산의 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.
본 발명은 상기 두충 식초 조성물을 베이스로 하여 제조된 두충 식초 음료를 제공한다.
본 발명에 따른 두충 식초 음료는, 바람직하게는 두충 식초 조성물 3 내지 12 중량%, 사과 농축액 3 내지 7 중량%, 자당 8 내지 15 중량%, 벌꿀 0.2 내지 0.7 중량%, 폴리덱스트로스 2 내지 5 중량%, 글루탐산 0.01 내지 0.03 중량%, 아스코르브산 0.01 내지 0.05 중량% 및 정제수 70 내지 74 중량%로 이루어진다.
이와 같이 본 발명에서는 두충으로부터 기능성 성분인 제니포사이드가 함유된 두충 추출액을 성공적으로 추출하였으며, 추출온도, 추출시간 및 용매비에 따른 최적추출조건을 반응표면분석법을 이용하여 확립하였다. 또한 알코올 생성을 위한 배양조건을 검토하여 최적 알코올발효 조건을 도출하였으며, 초산 발효특성을 성공적으로 모니터링하고 최적 식초발효 조건을 도출하였다.
본 발명의 2단계 발효공법을 통한 두충 식초 조성물의 제조방법에 따라 두충 식초 조성물을 성공적으로 제조하고 기능성 품질특성을 분석하였으며, 이 두충 식초 조성물을 이용하여 첨가물의 배합비에 달리하여 두충 식초 음료를 제조하고, 품질특성 분석 및 소비자 검사를 통하여 소비자가 선호하는 배합비를 도출하고 두충식초음료의 개발에 성공하였다.
상기한 바와 같인 본 발명의 방법에 따라 제조된 두충 식초 조성물은는 여러 형태의 건강식품 또는 기능성 우수 간편식이 제품의 개발 및 활용연구이 활성화에 기여할 수 있으며, 두충 식초 음료의 제품화에 따른 경제적인 파급효과가 클 것으로 기대된다.
또한 현재 두충의 가격을 고려하면 출시된 다른 마시는 식초음료와 비교하여 가격경쟁력이 충분히 있고 결과적으로 원가절감의 효과가 기대되며, 새로운 마시는 식초음료를 개발함으로서 식초음료시장의 활성화에 기여하고, 두충의 집단재배를 통한 농가소득의 증대에 기여할 수 있을 것으로 사료된다. 또한 기능성 식품신소재의 개발에도 응용이 가능하며 지역경제의 활성화에도 도움이 되고, 두충의 다양한 생리활성물질을 활용한 기능성관련제품 출시를 통한 중소기업의 경쟁력 제고와 가공제품의 수출기대 및 신수요 창출 및 다양한 품목 개발에 기여할 것으로 판단된다.
아울러, 본 발명에서 선별된 균주를 이용한 다양한 발효제품의 개발에 응용이 가능하고, 발효 부산물의 생리활성을 이용한 새로운 기능성 식품 개발이 가능하며, 상기 균주는 유사 약재를 이용한 발효제품 개발에 응용하여 국내산 약재를 이용한 발효제품 개발에의 적용 가능하며, 식품가공공정에 최신과학기술을 접목한 고부가 제품 개발이 가능할 것이다.
따라서 본 발명의 성공적인 수행을 통해 국내농가의 경제?산업적으로 기여할 뿐만 아니라 병행복합발효 공법의 단점들을 개선하여 기술혁신을 통한 신제품개발에 기여할 것으로 기대된다.
이하에서 본 발명의 바람직한 실시형태를 실시예를 참고로 보다 구체적으로 설명한다. 하지만 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 두충의 최적 추출조건 확립
본 실시예에서는 두충의 최적 추출조건을 확립하기 위하여, 임의의 추출조건에 따른 지표 유효성분을 분석하고 그 최적 추출조건을 설정하기 위하여 반응표면분석법을 이용하였다.
추출공정에서 중요한 독립변수(X i)인 추출온도(X 1), 추출시간(X 2) 및 추출용매의 비(X 3)에 대한 실험 범위를 설정하여 각각 5단계로 부호화하였다. 중심합성계획에 따라 16구간으로 하여 추출 실험을 행하고 이들 독립변수에 영향을 받는 종속변수(Y n)로 두충의 기능성물질인 제니포사이드 함량(Y 1)을 측정하고, 예측 모델식을 바탕으로 반응표면을 분석하여 최적조건을 도출하였다. 추출액의 제니포사이드 함량은 각 추출액을 0.45μm 여과지로 여과한 후 표 1에 주어진 조건에서 HPLC를 이용하여 분석하였다.
<표 1>
HPLC를 이용한 제니포사이드 분석 조건
| HPLC 명세표 | 조건 |
| 장비 | Shimadzu LC 10A |
| 컬럼 | Symmetry C18 (4.6 X 150 mm, 5 m) |
| 유동상 | H2O : Acetonitrile = 91 : 9 |
| 유속 | 1.0mL/min |
| 컬럼 온도 | 40℃ |
| 주입 부피 | 20 L |
| 검출기 | UV 240 nm |
상기와 같은 추출조건에 따른 제니포사이드 함량변화에 대한 반응표면은 도 1에 나타난 바와 같다. 제니포사이드 함량은 추출조건 중 추출온도에 가장 많은 영향을 받는 것으로 나타났다. 정상점은 최고점으로 최대값은 6.18 mg%으로 예측되었고, 이때의 추출조건은 추출온도 93.98℃, 추출시간 6.99 hr, 시료에 대한 용매비 60.59%(v/w)이었다.
이로부터 두충 추출액을 제조하기 위한 최적의 추출조건을 추출온도, 추출시간, 용매비를 각각 95℃, 7 hr, 60%(v/w)로 설정하였다.
실시예 2 : 두충 추출액의 최적 알코올 발효조건 확립
실시예 2-1 : 두충 추출액의 제조
두충 추출액을 제조하기 위하여 본 실시예에 사용된 두충은 2007년도 3월 경북영천에서 생산된 두충(껍질)을 시중으로 부터 구매하였고, 사과농축액(70oBrix)은 2007년 생산된 후지 품종의 사과를 감압농축하여 제조한 것을 시중으로부터 구입하여 사용하였다.
상기 실시예 1에서 확립한 두충 추출액 제조를 위한 최적 추출조건을 이용하여 미리 절단한 두충을 추출온도 95℃, 추출시간 7시간 및 추출 열수 용매비를 60 mL/g로 한 조건에서 환류냉각하여 두충 추출액을 제조하였다.
실시예 2-2 : 알코올 발효 균주 선정
본 실시예에서는 두충 추출액의 발효에 적합한 효모를 선별하기 위하여, 우선 YPD 고체배지(효모 추출물 1%, 펩톤 2%, 글루코스 2%, pH 6.0)를 이용하여 여러 종의 효모를 분리하고, 최종적으로 5 종의 알코올 발효 균주 S사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) DUJ-98, DUK-99, DUL-11, DUM-12 및 DUN-3를 분리하였다. 분리된 알코올 발효 균주의 알코올 발효능을 알아보기 위하여 발효능 시험을 한 결과 표 2과 같은 결과를 나타내었다.
<표 2>
알코올 발효를 위한 분리 효모의 발효능 시험
| 분리균 | 알코올 농도(%) | 산도(%) | 당도(Brix) |
내알코올성
(O.D) |
| DUJ-98 | 7.6 | 1.40 | 5.5 | 0.683 |
| DUJ-99 | 7.8 | 1.44 | 5.0 | 0.705 |
| DUL-11 | 7.4 | 1.39 | 5.5 | 0.673 |
| DUL-12 | 8.0 | 1.38 | 5.0 | 0.697 |
| DUN-3 | 6.8 | 1.42 | 5.0 | 0.384 |
이어서, 상기에서 제조한 두충 추출액에 사과 농축액을 15oBrix까지 보당하고, 상기 5 종의 효모를 각각 접종한 후, 배양온도 30℃, 진탕속도 120 rpm 및 배양시간 3일 동안 발효시켰다. 상기 5종의 알코올 발효 균주의 알코올 발효능을 알아보기 위하여 알코올 함량 및 알코올 수율을 조사하고, 그 결과는 표 3에 나타내었다
<표 3>
다양한 효모 균주로부터 알코올 함량, 알코올 수율, pH, 산도 및 잔당 농도의 비교
| 균주 | 알코올 함량 (%) |
알코올 수율1 (%) |
pH | 적정 산도 (%) |
잔당 농도 (oBrix) |
| DUJ-98 | 7.6 | 99.34 | 3.95 | 0.33 | 5.4 |
| DUK-99 | 7.0 | 91.52 | 4.02 | 0.30 | 5.2 |
| DUL-11 | 7.0 | 91.52 | 4.12 | 0.27 | 4.8 |
| DUM-12 | 7.4 | 96.73 | 4.17 | 0.21 | 4.6 |
| DUN-3 | 7.2 | 94.11 | 4.15 | 0.22 | 5.0 |
최종 에탄올 농도(g/L)
1 알코올 수율 (%) = ------------------------------ X 100
초기 포도당 농도(g/L) X 0.51
상기 표 3에 나타낸 바와 같이, 30℃에서 3일간 발효한 결과 5종의 균주 모두에서 유사한 결과를 보여, 알코올 함량은 7.0-7.6%, 적정산도는 0.21-0.33, pH는 3.95-4.17을 나타내었고, 알코올 발효액이 이화학적 특성 실험값은 균주들 간에 큰 차이가 없었다. 식초를 생산하기 위한 전단계인 1차 알코올 발효 시 충분한 알코올 발효가 일어남을 확인할 수 있었고, 알코올 함량이 가장 높은 사카로마이세스 세레비지애(S. cerevisiae) DUJ-98을 선별하여 YPD 배지(Yeast extract 1%, Peptone 2%, Glucose 2%, pH 6.0)에 접종하여 30℃, 24시간 배양하여 5%(v/v)를 두충의 알코올 발효에 주모로 사용하였다.
실시예 2-3 : 두충 추출액의 최적 알코올 발효조건 확립
본 실시예에서는 상기에서 제조한 두충 추출액과 선정된 균주를 이용하여 1차 알코올 발효의 최적조건을 확립하였다. 즉 S. cerevisia DUJ-98을 이용하여 초기당도(10 내지 18oBrix), 발효시간(1 내지 5 일) 및 발효온도(20 내지 36℃)에 따른 품질변화를 살펴보았다.
알코올 발효공정에서 중요한 독립변수(X i)인 초기 당농도(X 1), 발효시간(X 2) 및 발효온도(X 3)에 대한 실험 범위를 설정하여 각각 5단계로 부호화하였다. 중심합성계획에 따라 16구간으로 하여 발효 실험을 행하고 이들 독립변수에 영향을 받는 종속변수(Y n)로 알코올 함량(Y 1), 산도(Y 2) 및 당도(Y 3)를 측정하고, 예측 모델식을 바탕으로 반응표면을 분석하여 최적조건을 도출하였다.
상기 발효조건에 따라 발효시킨 배양액을 원심분리한 후 상등액 100 mL를 취하여 알코올 증류장치(Alcodest 0362392, J. P. Select Co., Spain)를 이용하여 알코올을 증류한 후 주정계를 이용하여 알코올 함량을 측정하였다. 총산은 0.1 N NaOH용액으로 중화 적정하여 초산함량(%)으로 환산하여 구하였다. 발효액의 당함량은 굴절계(model 507-1, Nippon Optical Works Co., Japan)를 사용하여 3회 반복하여 측정하였다.
알코올 함량, 산도 및 잔당함량에 대한 반응표면 회귀분석 결과에 따른 회귀식은 표 4에 나타내었다.
<표 4>
알코올 발효 공정에 대한 RSM 분석으로부터 얻은 다항 방정식
| 반응 | 2차 다항식 | R2 | 유의도 |
| 알코올 함량 | YAC = 1.3375-2.38125X1+4.8875X2+0.753125X3+0.0125X1 2 +0.2375X1X2 -0.775X2 2+0.059375X1X3-0.09375X2X3-0.021875X3 2 |
0.9016 | 0.0196 |
| 산도 | YA = 2.223125-0.092500X1-0.101250X2-0.093125X3+0.003125X1 2 -0.001250X1X2+0.016250X2 2+0.000937X1X3+0.000625X2X3 +0.001406X3 2 |
0.8284 | 0.0842 |
| 잔당 | YRS = 35.550-1.096875X1-4.718750X2-1.289063X3+0.050000X1 2 -0.093750X1X2+0.675000X2 2+0.010938X1X3+0.046875X2X3 +0.017188X3 2 |
0.9185 | 0.0116 |
알코올 함량은 1.4～9.2%의 값을 나타내었으며, 반응표면 회귀분석을 행한 결과 회귀식의 R2는 0.9016이며, 5% 이내에서 유의성이 인정되었다(표 4 참조). 알코올 함량에 대한 발효조건의 영향은 발효온도보다 발효시간 및 초기 당 함량에 더 많은 영향을 받는 것으로 나타났다(표 5 참조). 중심합성계획에 의해 설계된 실험 조건으로 알코올 발효에 따른 알코올 함량변화를 4차원 반응표면으로 분석한 결과 도 2와 같은 안장점(saddle point) 형태를 나타내어 능선분석(ridge analysis)을 한 결과 알코올 함량은 초기 당함량이 증가할수록, 발효시간이 길어짐에 따라 증가하는 경향을 나타내었다. 최적 알코올 생성 조건은 초기당 함량 17.57 oBrix, 발효시간 3.65 day 및 발효온도 30.41℃일 때로 나타났다.
<표 5>
알코올 발효 조건에 있어 회귀 모델 변수에 대한 변수 분석
| 반응 | F-비 | ||
| 초기 당 농도 (°Brix) |
시간 (day) |
온도 (℃) |
|
| 알코올 함량 | 3.38* | 8.73** | 2.12 |
| 산도 | 5.62** | 1.13 | 2.16 |
| 잔당 | 5.88** | 11.21*** | 1.37 |
*10% 수준에서 유의도; ** 5% 수준에서 유의도; *** 1% 수준에서 유의도.
<표 6>
능선 분석에 의한 알코올 발효 공정에 대한 발효 조건 예상 수준
| 반응 | 발효 조건1) | ||||
| X1 | X2 | X3 | 예상 값 | 형태 | |
| 알코올 함량 | 14.45 | 1.14 | 25.13 | 2.03 (min) | 안장점(Saddle point) |
| 17.57 | 3.65 | 30.41 | 10.10 (max) | ||
| 산도 | 11.22 | 2.99 | 28.68 | 0.22 (min) | 최소점 |
| 17.00 | 2.81 | 33.23 | 0.38 (max) | ||
| 잔당 | 10.16 | 3.15 | 30.15 | 2.96 (min) | 최소점 |
| 15.37 | 1.15 | 26.67 | 8.07 (max) | ||
1)X1 : 초기 당 농도(°Brix), X2 : 시간 (day), X3 : 온도 (℃)
두충 추출액의 1차 알코올 발효조건에 따른 총산의 변화에 대한 반응표면 회귀식의 R2는 0.8284로 유의성이 10% 이내의 유의수준에서 인정되었다(표 4 참조. 표 4에서 보는 바와 같이 알코올 발효 중 총산의 변화는 초기 당함량에 가장 많은 영향을 받고 있었으며, 발효온도와 발효시간의 영향은 거의 없는 것으로 나타났다. 예측된 정상점은 최저점으로(도 3 참조), 최소의 산도를 나타낸 조건은 초기 당함량 11.22oBrix, 발효시간 2.99 일 및 발효온도 28.68℃일 때였다(표 6 참조). 이는 정g 등이 농축사과주스를 이용한 식초제조 시 알코올 발효에서 총산의 변화가 초기 당함량에 비례하여 증가한다는 보고와 일치하였다.
잔당함량에 대한 반응표면 회귀식의 R2는 0.9185로 5% 이내에서 유의성이 인정되었다(표 4 참조). 예측된 정상점은 최저점으로 최저값이 2.96oBrix로 예측되었고, 이때 발효조건은 초기당도 10.16oBrix, 발효시간 3.15 일 및 발효온도 30.15℃이었다(도 4 및 표 6 참조). 도 4의 반응표면에서 보는바와 같이 초기당도가 낮고, 발효시간이 2.5～3.5시간의 범위에서 가장 낮은 함량을 나타내는 것을 알 수 있다. 또한 표 6에서와 같이 잔당함량에 대한 발효조건의 영향은 발효시간의 영향을 주로 받았으며, 발효온도의 영향은 거의 받지 않는 것으로 나타났다.
이상의 결과로 미루어 볼 때 두충추출액을 이용하여 식초제조에 적합한 알코올 함량과 총산 함량이 적은 최적조건 즉, 발효온도 28℃, 초기 당함량 14oBrix 및 발효시간 2.5 day에서 알코올 함량 7% 이상이 생성되었다. 즉, 최적 알코올 발효조건으로 두충 추출액을 이용하여 알코올 발효함으로서 두충식초를 제조하기 위해 충분한 알코올 발효가 일어남을 알 수 있었다.
실시예 3 : 두충 추출액의 최적 초산 발효조건 확립
실시예 3-1 : 식초산 발효균 분리
초산발효에 이용된 초산균은 과실이나 종초 등의 각 시료를 30에서 24시간 동안 활성화 시킨 후, 생리식염수로 적절하게 희석하여 각각의 분리시료에서 0.2mL를 초산균 분리용 평판배지에 도말 접종하고, 30에서 2일 동안 배양하여 집락(colony) 주위에 투명환을 형성하는 균을 순수 분리하였다. 고체배지에서 분리된 균을 다시 두충을 함유한 초산 생성균 액체배지에 접종하고 30에서 진탕배양한 후 초산 생성능이 우수한 아세토박터 속(Acetobacter sp.) DU-4 균주를 최종적으로 선정하였다.
실시예 3-2 : 두충 추출액을 이용한 식초 제조
상기 실시예 1 및 2의 방법에 따른 최적 조건으로 제조한 두충 추출액의 1차 알코올 발효액에 분리후 보관중인 아세토박터 속(Acetobacter sp.) DU-4 균주를 분양 접종시켜 진탕배양기에서 30℃ 및 200 rpm으로 발효시켜 산이 4.5%일 때 종초로 사용하였다.
실시예 3-3 : 두충 추출액의 최적 초산 발효조건 확립
두충 추출액을 이용한 초산 발효조건을 최적화하기 위하여 중심합성계획에 따라 실험을 실시하였다. 초산발효는 500 mL 삼각플라스크에 각각 알코올 발효액 200 mL와 초산균주 10% (v/v)를 접종한 후 30℃ 진탕배양기에서 발효시켰다. 초산발효조건은 요인변수로 설정된 초기산도(0.5-2.5%), 교반속도(50-250 rpm) 및 발효시간(4-8 day)을 각 5수준(-2, -1, 0, 1, 2)으로 부호화하여 중심합성계획을 수립하고 16개의 설정된 조건에서 실험을 수행한 후 발효물의 품질특성인 산도, 제니포사이드 함량, 색도 및 유기산 함량 등을 측정하고 최적조건을 설정하였다.
pH는 pH 미터(691 pH meter, Metrohm Co., Swiss)를 사용하여 측정하였고, 총산은 0.1 N NaOH용액으로 중화 적정하여 초산함량(%)으로 환산하였다. 제니포사이드의 함량은 상기 실시예 1에서 사용한 동일한 방법으로 측정하였다.
색도는 색차계(Chromameter, model CR-300, Minolta Co., Japan)를 이용하여 헌터 색지수( Hunter's color) L값(명도), a값(적색도), b값(황색도)을 3회 반복 측정하였으며, 증류수(L=100.00, a=0.00 및 b=+0.02)를 대조구로 사용하였다. 유기산 분석은 각 식초 원액을 적절한 배율로 희석하여 0.45 m 막 필터로 여과하여 HPLC로 분석하였고 분석조건은 표 7과 같다.
<표 7>
| 명세 | 조건 |
| 장비 | Shimadzu LC-10AT (Japan) |
| 컬럼 | Symmetry C18 (4.6 X 150 mm, 5 m, Waters Co., USA) |
| 이동상 | 0.01 N H2SO4 (pH 2.4) |
| 검출기 | UV 210 nm |
| 유속 | 0.5 mL/min |
1) 두충 식초의 총산 함량
상기와 같이 두충 추출액 식초의 총산을 분석한 결과 2.67～6.61%의 값을 나타났으며, 반응표면 회귀식의 R2는 0.9133로 높게 나타났으며 5%이내의 수준에서 유의성이 인정되었다(표 8 참조). 예측된 정상점은 안장점으로 능선분석 결과 최대값은 7.15%로 예측되었고 이 예측값을 얻을 수 있는 발효조건은 초기산도 1.71%, 교반속도 234.82 rpm 및 발효시간 6.96 일로 나타났다(표 9 참조). 초산발효 시 총산함량은 발효시간 및 교반속도에 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며, 설정된 범위 내에서 초기산도에 대한 영향은 거의 없는 것으로 나타났다(표 10 참조). 총산에 대한 두충추출액 식초의 발효특성은 도 5와 같이 발효시간이 길고, 교반속도가 증가할수록 높아지는 경향을 나타내었다.
<표 8>
초산 발효 공정에 대한 RSM 분석에서 얻은 반응표면 회귀식
| 반응 | 2차 다항식 | R2 | 유의도 |
| 산도 | YAC = 13.370000-1.978750X1-0.060838X2-2.223125X3-0.125X1 2 +0.000154X1X2+0.000193X2 2+0.4975X1X3+0.001925X2X3 +0.155000X3 2 |
0.9133 | 0.0138 |
| 제니포사이드 함량 | YGC = -0.417500-0.067500X1-0.001650X2+0.343750X3-0.060000X1 2 +0.001000X1X2-0.0000055X2 2+0.015000X1X3+0.000350X2X3 -0.031250X3 2 |
0.9288 | 0.0080 |
| L | YL = 49.422500+2.070000X1+0.093700X2+10.650000X3-1.815000X1 2 +0.001300X1X2-0.000336X2 2+0.590000X1X3+0.001000X2X3 -0.970000X3 2 |
0.8347 | 0.0767 |
| a | Ya = -2.235000+2.933750X1-0.029938X2+0.303125X3-0.455000X1 2 +0.006650X1X2+0.0000275X2 2-0.40250X1X3+0.001725X2X3 +0.018750X3 2 |
0.9087 | 0.0159 |
| b | Yb = 56.983750-5.735000X1-0.044950X2-6.502500X3+1.670000X1 2 -0.020600X1X2+0.000201X2 2+0.540000X1X3+0.005000X2X3 +0.447500X3 2 |
0.9041 | 0.0182 |
<표 9>
능선 분석에 의한 초산 발효 공정에 대한 발효 조건의 예상 수준
| 반응 | 발효 조건1) | ||||
| X1 | X2 | X3 | 예측 반응 | 형태 | |
| 산도(%) | 0.52 | 132.47 | 5.69 | 2.94 (min) | 안장점 |
| 1.71 | 234.82 | 6.96 | 7.15 (max) | ||
| 제니포사이드 함량 (ug/mL) | 1.61 | 161.67 | 4.02 | 0.37 (min) | 안장점 |
| 1.97 | 221.73 | 7.02 | 0.64 (max) | ||
| L | 1.17 | 132.50 | 7.86 | 86.35 (min) | 최대 |
| 2.46 | 157.32 | 6.51 | 89.15 (max) | ||
| a | 0.72 | 183.60 | 4.93 | -1.95 (min) | 안장점 |
| 1.06 | 97.99 | 7.46 | -0.23 (max) | ||
| b | 1.55 | 125.10 | 5.68 | 31.44 (min) | 최소 |
| 1.01 | 232.12 | 6.61 | 36.28 (max) | ||
1)X1 : 초기 산도 (%), X2 : 진탕 속도 (rpm), X3 : 시간 (day)
<표 10>
초산 발효 조건에서 변수의 회귀 모델에 대한 변수 분석
| 추출 조건 | F-비 | ||
| 초기 산도 (%) | 진탕 속도 (rpm) | 시간 (day) | |
| 산도 | 1.96 | 6.10** | 7.21** |
| 제니포사이드 함량 | 3.13* | 4.74** | 16.57*** |
| L | 1.75 | 4.38* | 6.11** |
| a | 6.71** | 3.42* | 7.36** |
| b | 4.61** | 10.15*** | 4.88** |
*10% 수준에서 유의도; **5% 수준에서 유의도; ***1% 수준에서 유의도.
2) 두충 추출액 식초의 제니포사이드 함량
두충 추출액 식초의 제니포사이드 함량에 대한 회귀식의 R2는 0.9288이고, 1% 이내에서 유의성이 인정되었다(표 8 참조). 예측된 정상점은 안장점으로 능선분석을 실시하여 본 결과, 제니포사이드 함량의 최대값은 0.64 g/mL로 예측되었으며, 이때의 최적 발효조건은 최값은 1.97%, 교반속도 221.3 rpm 및 발효시간 7.02 시간이었다(표 9 참조). 발효조건별 제니포사이드 함량 변화에 대한 반응표면을 보면, 발효시간이 길어질수록 제니포사이드 함량이 증가하는 것으로 나타났다(도 6 참조). 즉, 제니포사이드 함량에 대한 추출조건의 영향은 표 10와 같이 발효시간에 대한 영향이 가장 크게 나타났으며, 다음으로 교반속도와 초기산도에 영향을 받고 있는 것으로 나타났다.
3) 두충 추출액 식초의 색도 변화
중심합성계획에 의해 제조된 두충추출액 식초의 색도를 측정한 결과 L값은 86.85～90.94, a값은 -1.70～-0.26, b값은 31.30～35.60의 값을 나타내었다. 색도에 대한 반응표면 회귀식은 표 8에 요약된 바와 같고, L값은 10% 이내의 유의성이 인정되었으며, a와 b값은 5% 이내의 유의성을 나타내었다. 색도 L값은 초기산도 2.46%, 교반속도 157.82 rpm 및 발효시간 6.51 일일 때 가장 높은 89.15를 나타내었으며, a값은 초기산도가 1.06%, 교반속도 97.99 rpm 및 발효시간 7.46 일일 때 가장 높은 7.46을 나타내었다. 또한 색도 b값은 초기산도 1.01%, 교반속도 232.12 rpm 및 발효시간 6.61 day일 때 가장 높은 6.61의 값을 나타내었다(표 9 참조).
초기산도, 교반속도 및 발효시간이 색도에 대한 영향을 분석한 결과(표 10 참조), L값의 경우 교반속도 및 발효시간에 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며, 설정된 범위 내에서 초기산도 대한 영향은 거의 없는 것으로 나타났다. a값의 경우는 발효시간이 초기산도 및 교반속도보다 더 많은 영향을 주는 것으로 나타났다. 한편 b값의 경우 초기산도, 교반속도 및 발효시간의 3가지 변수 모두의 영향을 받는 것으로 나타났다. 발효조건별 색도 변화의 반응표면은 도 7과 같이 L값이 가장 높은 범위는 초기산도 1.0～2.0%, 교반속도 100～200 rpm 및 발효시간 5.5～7.5 일이었으며, a값의 경우는 발효시간이 길어질수록 높은 값을 나타내었다. 두충추출액 식초의 발효조건에 따른 b값에 대한 발효특성은 교반속도가 빠를수록 b값이 증가하는 것으로 나타났다.
4) 두충 추출액 식초의 유기산 함량 변화
두충 추출액 식초의 초산 함량에 대한 회귀식은 5% 이내에서 유의성이 인정되었으며(표 11 참조), 예측된 정상점은 안장점으로 능선분석 결과 초기산도 1.64%, 교반속도 232.27 rpm 및 발효시간 7.09 일에서 최대값 6.30%로 예측되었다(표 12 참조). 초산 함량변화의 반응표면은 도 8에서 보는 바와 같이 발효시간이 길고 교반속도가 빠를수록 높은 함량을 나타내었다. 또한 표 13에서 보는 바와 같이 발효시간 및 교반속도의 영향이 유의적인 것으로 나타났다.
발효액의 시트르산 함량에 대한 회귀식의 R2가 0.8909이고 5% 이내에서 유의성이 인정되었으며(표 11 참조), 예측된 정상점은 안장점으로 능선분석을 실시하여 본 결과 최대값은 6.48 mg%로 예측되었으며(표 12 참조), 이 예측값을 얻을 수 있는 발효조건은 초기산도 0.57%, 교반속도 117.43 rpm 및 발효시간 6.43 일로 나타났다. 도 8의 반응표면에서 보는 바와 같이 시트르산 함량은 초기산도가 낮아질수록 증가하였는데 그 영향은 유의적인 것으로 나타났다(표 13 참조).
두충식초의 말산 함량에 대한 회귀식의 R2가 0.8629이고 5% 이내에서 유의성이 인정되었으며(표 11 참조), 예측된 정상점은 최대점으로 최대값은 315.34 mg%로 예측되었다(표 12 참조). 이 최대값을 얻을 수 있는 발효조건은 초기산도 1.56%, 교반속도 161.93 rpm 및 발효시간 6.29 일로 나타났다. 반응표면 분석결과 초기산도 1.0～2.0%, 교반속도 100～200 rpm 및 발효시간 5.5～7.5 일의 범위에서 가장 많은 말산 함량이 검출되었다.
<표 11>
초산 발효 공정에 대한 RSM 분석에서 얻은 다항식
| 반응 | 2차 다항식 | R2 | 유의도 |
| 초산 | YAC = 12.674375-0.741250X1-0.060287X2-2.323125X3-0.250000X1 2 -0.000750X1X2+0.000163X2 2+0.342500X1X3+0.003325X2X3 +0.158750X3 2 |
0.9114 | 0.0147 |
| 시트르산 | YCA = -6.861250-1.258750X1-0.024112X2+4.831875X3+1.110000X1 2 +0.008450X1X2+0.000035X2 2-6.77500X1X3-0.000125X2X3 -0.313750X3 2 |
0.8909 | 0.0259 |
| 말산 | YMA = -452.223125+197.032500X1+1.693025X2+151.607500X3-37.04500X1 2 -0.040500X1X2-0.005057X2 2-11.86000X1X3+0.000900X2X3 -10.593750X3 2 |
0.8629 | 0.0475 |
| 타타르산 | YTA = -29.613125+13.798750X1+0.185238X2+10.583125X3-2.145000X1 2 -0.024450X1X2-0.000276X2 2-0.597500X1X3-0.010475X2X3 -0.615000X3 2 |
0.8391 | 0.0716 |
| 숙신산 | YSA = -15.883750-2.127500X1+0.412025X2+8.795000X3+2.830000X1 2 -0.079000X1X2+0.000308X2 2+1.145000X1X3-0.067100X2X3 +0.048750X3 2 |
0.8454 | 0.0647 |
| 총 유기산 | YTOA = 11.422500-0.310000X1-0.057475X2-1.955000X3-0.290000X1 2 +0.000300X1X2+0.000159X2 2+0.270000X1X3+0.002850X2X3 +0.142500X3 2 |
0.9053 | 0.0176 |
<표 12>
능석 분석에 의한 초산 발효 공정에 대한 발효 조건의 예상 수준
| 반응 | 발효 조건1) | ||||
| X1 | X2 | X3 | 예측 반응 | 형태 | |
| 초산(%) | 0.53 | 132.92 | 5.60 | 2.49 (min) | 안장점 |
| 1.64 | 232.27 | 7.09 | 6.30 (max) | ||
| 시트르산(mg%) | 1.88 | 146.41 | 7.84 | 2.69 (min) | 안장점 |
| 0.57 | 117.43 | 6.43 | 6.48 (max) | ||
| 말산(mg%) | 0.99 | 91.77 | 4.24 | 240.73 (min) | 최대 |
| 1.56 | 161.93 | 6.29 | 315.34 (max) | ||
| 타타르산(mg%) | 1.07 | 88.15 | 4.68 | 23.33 (min) | 최대 |
| 1.47 | 145.41 | 6.59 | 29.10 (max) | ||
| 숙신산(mg%) | 1.25 | 91.06 | 4.45 | 36.30 (min) | 안장점 |
| 1.95 | 79.09 | 7.07 | 56.04 (max) | ||
| 총 유기산(%) | 0.55 | 135.66 | 5.43 | 2.80 (min) | 안장점 |
| 1.65 | 233.83 | 7.04 | 6.62 (max) | ||
1)X1 : 초기 산도 (%), X2 : 진탕 속도 (rpm), X3 : 시간 (day)
<표 13>
초산 발효 조건에서 변수의 회귀 모델에 대한 변수 분석
| 추출 조건 | F-비 | ||
| 초기 산도 (%) | 진탕 속도 (rpm) | 시간 (day) | |
| 초산 | 1.28 | 5.96** | 7.46** |
| 시트르산 | 6.05** | 0.78 | 3.29* |
| 말산 | 3.76* | 6.04** | 5.40** |
| 타타르산 | 2.68 | 4.22* | 5.66** |
| 숙신산 | 2.31 | 6.60** | 5.11** |
| 총 유기산 | 1.26 | 5.50** | 6.63** |
*10% 수준에서 유의도; **5% 수준에서 유의도; ***1% 수준에서 유의도.
타타르산 함량에 회귀식의 R2는 0.8391이고 10% 이내에서 유의성이 인정되었으며(표 11 참조), 예측된 정상점은 최대점이고 최대값은 29.10 mg%로 예측되었고, 이때 발효조건은 초기산도 1.47%, 교반속도 145.41 rpm 및 발효시간 6.59 일이었 다(표 12 참조). 도 9의 반응표면에서 보는 바와 같이 교반속도가 빠르고 발효시간이 길어질수록 타타르산의 함량이 증가하는 것으로 나타났으며, 이는 위의 말산의 결과와 유사하였다. 한편 타타르산 함량은 발효시간에 가장 큰 영향을 받으며, 교반속도 및 초기산도에 대한 영향은 작게 나타났다(표 13 참조).
숙신산 함량에 대한 회귀식의 R2는 0.8454이고 유의성은 10% 이내의 수준에서 인정되었다(표 11 참조). 한편 숙신산의 최적 발효조건은 초기산도 1.95%, 교반속도 79.09 rpm 및 발효시간은 7.07 일로 나타났으며, 이때 최대값 56.04 mg%가 예측되었다(표 12 참조). 발효조건에 따른 숙신산에 대한 발효특성은 도 9에서 보는 바와 같이 교반속도가 느리고 발효시간이 길어질수록 숙신산 함량이 증가하는 경향을 확인할 수 있었다. 숙신산에 대한 추출조건의 영향은 표 13에 나타난 바와 같이 교반속도 및 발효시간에 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며, 설정된 범위 내에서 초기산도에 대한 영향은 거의 없는 것으로 나타났다.
상기에서 분석한 초산, 시트르산, 말산, 타타르산, 숙신산의 값을 모두 더하여 조건별 발효액의 총 유기산 함량을 계산하였다. 표 10에서와 보는 바와 같이 회귀식의 R2는 0.9053이고 5% 이내에서 유의성이 인정되었으며, 예측된 정상점은 안장점으로 능선분석을 실시한 결과 최대값은 6620 mg%로 예측되었다(표 12 참조).
또한 이 예측값에 대한 발효조건은 초기산도 1.65%, 교반속도 233.83 rpm 및 발효시간 7.04 일으로 나타났다. 도 9의 총 유기산 함량에 대한 반응표면을 살펴보면 교반속도가 빠르고 발효시간이 길어질수록 높은 함량을 나타냄을 알 수 있다. 총 유기산 함량 변화는 교반속도와 발효시간에 큰 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며, 초기산도에 대한 영향은 다소 낮은 것으로 나타났다(표 13 참조).
5) 두충 추출액의 최적 초산 발효 조건 확립
상기의 결과를 종합하여 위 결과 값에 대하여 중첩시킨 결과(표 14 및 도 10 참조), 두충추출액 식초 제조를 위해서는 두충에서 분리한 균주를 이용하여 두충추출액을 14oBrix로 보당한 후 28℃에서 2.5일간 발효시켜 알코올 발효액을 얻은 후, 두충에서 분리한 Acetobacter sp. DU4를 이용하여 초기산도 1.5%, 진탕속도 225 rpm, 발효시간을 6.5일로 조정하면 산도 6% 이상의 식초 생산이 가능함이 확인되었다.
<표 14>
중첩 반응 표면에 의해 얻어진 최대 반응 변수에 대한 최적 발효 조건 범위
| 발효 조건 | 예상 조건의 범위 (최적 포인트) |
| 초기 산도 (%) | 1.0~2.0 (1.5) |
| 진탕 속도 (rpm) | 200~250 (225) |
| 시간 (day) | 6~7 (6.5) |
실시예 4 : 두충식초의 기능성 품질특성 분석
본 실시예에서는 상기 실시예 1 내지 3을 통해 설정된 최적조건으로 두충 식초베이스를 제조하고, 이를 이용하여 두충식초의 기능성 품질특성을 분석하였다.
두충 식초의 총산은 0.1 N NaOH용액으로 중화 적정하여 초산함량(%)으로 환 산하였다. 또한 두충 식초의 제니포사이드의 함량은 상기 실시예 1에서 사용한 동일한 방법으로 측정하였다.
색도는 색차계(Chromameter, model CR-300, Minolta Co., Japan)를 이용하여 상기 실시예 3에서 사용한 동일한 방법으로 측정하였다. 유기산은 각 식초 원액을 적절한 비율로 희석하여 0.45 μm 막 필터로 여과한 후 HPLC를 이용하여 분석하였다. 사용된 분석조건은 다음과 같고(column: Sunfire C18, 이동상: 0.01 N H2SO4(pH 2.4), 유속: 0.5 mL/min, detector: UV 210 nm), 동일한 분석 조건으로 표준품의 검량곡선을 작성하여 유기산을 정량하였다.
두충식초를 0.45 μm 막 필터로 여과한 후 각각 HPLC를 이용하여 분석하였다. 유리당 분석조건: ULTRON PS-80N 컬럼, 이동상=증류수, 유속=0.6 mL/min, 검출기(RI 검출기)를 이용하였으며, 동일한 분석 조건으로 표준품의 검량곡선을 작성하여 유리당을 정량하였다. 식이섬유는 식품공전법에 따라 먼저 두충식초를 효소분해 (α-amylase, protease, β-glucosidase) 후, 0.45 μm 막 필터로 여과하고 유리당 분석조건과 같은 조건에서 HPLC로 분석하였다.
<표 15>
HPLC를 이용한 유리당 및 식이섬유 분석에 사용된 조건
| 명세 | 조건 |
| 장비 | Shimadzu LC-10AT (Japan) |
| 컬럼 | Symmetry C18 (4.6 X 150 mm, 5 m, Waters Co., USA) |
| 유동상 | 0.01 N H2SO4 (pH 2.4) |
| 검출기 | UV 210 nm |
| 유속 | 0.5 mL/min |
무기성분 및 아미노산 분석은 시료를 건식분해한 다음 일정량을 취하여 0.45 μm 막 필터로 여과한 후 원자흡광광도기(Analyst 100/300 Atomic absorption spectrometer, Perkin-Elmer Co., Norwalk, USA)를 이용하여 목적하는 무기성분의 분석조건에 따라 검량선을 작성하고 이를 토대로 시험용액을 분석하였다. 시료의 아미노산은 6 N HCl를 시료 2 mL에 가해 110℃에서 24시간 가수분해하여 여과 후, 감압하여 농축건조시킨 다음 시트르산 나트륨 완충액(pH 2.2)에 용해하고 0.45 μm 막 필터로 여과 후 분석하였다.
<표 16>
아미노산 분석을 위한 아미노산 분석기의 조작 조건
| 명세 | 조건 |
| 장비 | S7130 amino acid analyzer (Sykam Co., Germany) |
| 컬럼 | LCA K02/Na Cation separation column |
| 완충액 | A : 0.12 N Sodium citrate buffer (pH 3.45) B : 0.20 N Sodium citrate buffer (pH 10.85) |
| 완충액 유속 | 0.45 mL/min |
| 닌하이드린 유속 | 0.25 mL/min |
| 주입 부피 | 20 uL |
상기와 같은 최적 발효조건(1차 알코올 발효와 2차 초산발효의 2 단계 발효공법)에서 제조된 두충식초의 물리적 품질특성 및 아미노산 함량은 표 17 및 18에 각각 요약되어 있다. 두충식초 중의 제니포사이드 함량은 0.60 ㎍/mL로 나타났으며, 총산함량은 6.36%로 비교적 높게 나타났으며, 각 식초에 함유된 유기산 중 초산 함량은 5395.56 mg%로 주된 유기산 성분으로 나타났으며, 말산, 숙신산, 타타르산, 시트르산의 순으로 함량이 높았다. 당의 함량은 과당이 가장 많이 잔류함을 볼 수 있었으며, 식초 중 식이섬유함량은 0.5%로 나타났다. 무기성분은 K가 다량으 로 존재하였고, 그 다음으로 Na, Ca, Mg의 함량이 높았다. 각 식초에서 총 아미노산 함량은 27.64 mg%로 아스파르트산의 함량이 가장 높은 것으로 나타났다.
<표 17>
두충 식초의 생리화학적 특성
| 특성 | 값 | |
| 제니포사이드 함량 (/mL) | 0.60±0.01 | |
| 산도 (%) | 6.36±0.05 | |
| 헌터 색지수 | L-값 | 87.46±0.00 |
| a-값 | -0.92±0.01 | |
| b-값 | 34.32±0.00 | |
| 유기산 (mg%) | 초산 | 5395.56±07.16 |
| 시트르산 | 2.79±0.06 | |
| L-말산 | 248.65±4.79 | |
| 타타르산 | 25.51±0.12 | |
| 숙신산 | 42.74±0.54 | |
| 합 | 5715.25±31.65 | |
| 당 함량 (mg%) | 포도당 | 37.72±0.50 |
| 과장 | 344.90±4.59 | |
| 자당 | 28.28±0.49 | |
| 합 | 410.90±4.59 | |
| 식이 심유 (%) | 0.5±0.00 | |
| 미네랄 함량 (mg%) | Ca | 5.56±0.04 |
| Fe | 1.65±0.01 | |
| K | 144.75±2.82 | |
| Mg | 4.73±0.15 | |
| Na | 10.30±0.22 | |
| Zn | 0.51±0.01 | |
| Total | 167.50±2.88 | |
<표 18>
두충 식초의 아미노산 함량
| 아미노산 | 함량 (mg%) |
| 아스파르트산 | 10.93±0.30 |
| 세린 | 0.80±0.01 |
| 쎄로닌 | 1.18±0.07 |
| 글루탐산 | 2.14±0.09 |
| 프롤린 | 0.00±0.00 |
| 글리신 | 0.86±0.01 |
| 알라닌 | 1.90±0.13 |
| 시스틴 | 0.00±0.00 |
| 발린 | 0.57±0.01 |
| 메티오닌 | 0.00±0.00 |
| 이소류신 | 0.29±0.04 |
| 류신 | 0.44±0.01 |
| 티로신 | 0.00±0.00 |
| 페닐알라닌 | 0.00±0.00 |
| 히스티딘 | 1.10±0.06 |
| 리신 | 0.77±0.01 |
| 암모니아 | 6.41±0.37 |
| 아르기닌 | 0.25±0.02 |
| 총 아미노산 | 27.64±0.39 |
실시예 5 : 두충식초음료의 조제, 품질특성 분석 및 소비자 검사
상기 실시예 4에서 최적조건에서 제조된 두충 식초(식초베이스)를 이용하여 프락토올리고당 및 비타민 C를 함유하는 기능성 두충식초음료로 제제하기 위하여 하기 표 18에 주어진 배합비에 따라 4가지 두충식초음료를 조제하였다.
각각의 두충식초음료는 50℃에서 10분간 가열한 후 병 또는 팩(120 mL)에 주입하고 실링한 후 다시 80℃에서 15분간 살균하고 냉각수로 냉각한 후 시료로 사용하였다.
대구대학교 식품공학과에 재학 중인 학생 60명을 대상으로 소비자 검사를 실시하였다. 난수가 부착된 종이용기에 약 20 mL의 시료를 담아 무작위로 배열한 후 소비자에 제시하고 색, 향, 맛, 잔미(aftertaste) 및 전체적 기호도에 대하여 1(매우 나쁘다)에서 9(매우 좋다)점을 부여하는 9점척도법을 이용하여 평가하였다.
각 항목별 평가결과에 대하여 통계적 분석 시스템 프로그램(Statistical Analysis System program)으로 분산분석한 후 유의차가 있는 항목에 대하여는 던컨 다중 범위 테스트로 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
<표 19>
본 실시예에서 사용된 두충 식초 음료의 배합비
| 성분 (%) | 시료 | |||
| 3% | 6% | 9% | 12% | |
| 식초 베이스 | 3 | 6 | 9 | 12 |
| 사과 주스 농축액 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| 과장 | 10 | 10 | 10 | 10 |
| 벌꿀 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 폴리덱스트로스 | 3 | 3 | 3 | 3 |
| 글루탐산 | 0.02 | 0.02 | 0.02 | 0.02 |
| 아스코르브산 | 0.04 | 0.04 | 0.04 | 0.04 |
| 정제수 | 78.44 | 75.44 | 72.44 | 69.44 |
| 합l (%) | 100 | 100 | 100 | 100 |
상기 표 19에 주어진 배합비에 따라 제조된 각각의 식초음료의 물리적 품질특성은 표 20에 요약된 바와 같다. 소비자 검사 결과(표 21 참조) 시료 간 색에 대한 선호도는 유의적 차이가 없는 것으로 나타났고 향과 맛에 대하여는 두충식초의 함유량이 3 또는 6%인 다른 시료에 비해 높은 선호도를 나타냈다. 전체적인 기호도에서 두충식초를 3% 함유한 식초음료가 다른 시료에 비해 유의적인 선호도 차이를 보였다(p<0.05).
<표 20>
두충 식초를 기재로 한 식초 음료의 생리화학적 특성
| 특성 | 혼합 음료의 식초 베이스 수준 (%) | |||
| 3 | 6 | 9 | 12 | |
| pH | 3.37 | 3.33 | 3.29 | 3.26 |
| 가용성 고형물 함량 (oBrix) | 15.1 | 15.4 | 15.5 | 15.8 |
| 탁도 | 0.120 | 0.135 | 0.170 | 0.189 |
| L* | 34.44 | 34.07 | 33.91 | 32.65 |
| a* | -0.527 | -0.493 | -0.463 | -0.373 |
| b* | 3.01 | 3.43 | 3.88 | 4.02 |
<표 21>
두충 식초를 기재로 한 식초 음료의 소비자 기호도
| 기호도 | 혼합 음료 중 식초 베이스 수준 (%) | |||
| 3 | 6 | 9 | 12 | |
| 색 | 5.85a | 5.56a | 5.42a | 5.43a |
| 향미 | 5.62a | 5.02a | 3.77b | 3.75b |
| 맛 | 6.67a | 6.12a | 5.40b | 4.13c |
| 뒷맛 | 6.65a | 5.98b | 5.08c | 4.08d |
| 전체적인 만족도 | 6.68a | 6.27a | 5.12b | 4.25c |
a-d공통 문자가 없는 동일한 열 내의 평균이 유의적으로 상이함(p<0.05).
도 1a 내지 1c는 두충의 추출 조건에 의한 제니포사이드 함량 변화에 따른 반응표면을 나타낸 그래프이다.
도 2는 발효온도, 시간 및 초기 당 농도의 함수로서 알코올 함량에 대한 반응표면을 나타낸 그래프이다(알코올 함량 = 6.0%, 7.0%, 8.0%).
도 3은 발효온도, 시간 및 초기 당 농도의 함수로서 산도에 대한 반응표면을 나타낸 그래프이다(산도 = 0.25, 0.30, 0.35%).
도 4는 초기 산도, 진탕 속도 및 시간의 함수로서 잔당 함량에 대한 반응표면을 나타낸 그래프이다(잔당 = 4.0, 5.0, 6.0oBrix).
도 5는 초기 산도, 진탕 속도 및 시간의 함수로서 산도에 대한 반응표면을 나타낸 그래프이다(산도 = 3.5%, 4.0%, 4.5%).
도 6은 초기 산도, 진탕 속도 및 시간의 함수로서 제니포사이드 함량에 대한 반응표면을 나타낸 그래프이다(제니포사이드 함량 = 0.45%, 0.50%, 0.55%).
도 7a 내지 7c는 초기 산도, 진탕 속도 및 시간의 함수로서 헌터 색지수 값에 대한 반응표면을 나타낸 그래프이다(L = 87, 88, 89; a = -1.5, -1.0, -0.5; b = 32, 33, 34).
도 8a 내지 8c는 초기 산도, 진탕 속도 및 시간의 함수로서 초산, 시트르산 및 말산 함량에 대한 반응 표면을 나타낸 그래프이다(초산 함량= 3.0, 3.5, 4.0%; 시트르산 함량 = 3.5, 4.0, 4.5 mg%; 말산 함량 = 250, 270, 290 mg%).
도 9a 내지 9c는 초기 산도, 진탕 속도 및 시간의 함수로서 타타르산, 숙신산 및 총 유기산 함량에 대한 반응 표면을 나타낸 그래프이다(타타르산 함량 = 25, 27, 29 mg%; 숙신산 함량 = 44, 46, 48 mg%; 말산 함량 = 3.5, 4.0, 4.5 mg%).
도 10은 발효 조건의 함수로서 총 유기산과 제니포사이드 함량의 최적화를 위한 중첩된 반응 표면을 나타낸 그래프이다.
Claims (7)
- 두충을 추출온도 90 ~ 100℃, 추출시간 5 ~ 10시간 및 용매비 40 ~ 70%(v/w)의 조건에서 두충 추출액을 제조하는 단계;상기 두충 추출액과 사과농축액을 혼합한 후, 알코올 발효 효모를 접종하여 1차 알코올 발효시키는 단계;상기 1차 알코올 발효된 두충 추출액에 초산 발효 균주를 접종하여 2차 초산 발효시키는 단계; 및상기 2차 초산 발효된 두충 식초 조성물을 수득하는 단계로 이루어진 두충 식초 조성물의 제조 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 두충 추출액의 1차 알코올 발효 단계가 발효온도 25 내지 30℃, 초기 당함량 12 내지 16oBrix 및 발효시간 2 내지 3일로 수행되는 것을 특징으로 하는 두충 식초 조성물의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 알코올 발효된 두충 추출액의 2차 초산 발효 단계가 초기산도 1 내지 25%, 진탕속도 200 내지 250 rpm, 발효시간을 6 내지 7일로 수행되는 것을 특징으로 하는 두충 식초 조성물의 제조 방법.
- 제1항의 방법에 따라 두충 추출액을 1차 알코올 발효시키고, 2차 초산 발효시켜 제조된 두충 식초 조성물.
- 제5항에 따른 두충 식초 조성물을 유효성분으로 함유하는 두충 식초 음료.
- 제6항에 있어서, 상기 두충 식초 음료가 두충 식초 조성물 3 내지 12 중량%, 사과 농축액 3 내지 7 중량%, 자당 8 내지 15 중량%, 벌꿀 0.2 내지 0.7 중량%, 폴리덱스트로스 2 내지 5 중량%, 글루탐산 0.01 내지 0.03 중량%, 아스코르브산 0.01 내지 0.05 중량% 및 정제수 70 내지 74 중량%로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 두충 식초 음료.
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