KR20190130125A - 열 처리시에 환원 당류의 이성체화를 저해하는 방법 - Google Patents

열 처리시에 환원 당류의 이성체화를 저해하는 방법 Download PDF

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KR20190130125A
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젠와인 바이오테크놀로지 게엠바하
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Abstract

당류 수용액을 그의 열 처리 전에 산성화함으로써 상기 당류 수용액의 열 처리시에 환원 당류를 함유하는 수용액 중의 상기 환원 당류의 이성체화를 저해하는 방법, 및 생물학적 산물의 제조를 위한 상기 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액의 용도가 개시된다.

Description

열 처리시에 환원 당류의 이성체화를 저해하는 방법
본 발명은 적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 수용액의 열 처리를 수반하는 방법에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 환원 당류를 함유하는 수용액의 열 처리시에 수용액 중의 환원 당류의 이성체화를 방지하는 방법에 관한 것이다.
멸균 환경을 유지하는 것은 종종 생명공학적 생산 공정에서 세포를 배양하기 위한 전제 조건이다. 그러나, 이들 공정은 종종 외래성(adventitious) 박테리아, 진균, 또는 바이러스에 의한 외래 성장(foreign growth)에 취약하다. 외래성 미생물로 오염되는 것은, 그것이 생산성(원료, 목적 산물, 또는 목적 바이오매스의 분해 또는 변형으로 인해 감소된 생산 용량, 및 오염물의 제거를 위한 생물반응기의 연장된 조업중단 기간), 산물 품질 및 산물 안전성(외래 성장 자체 및/또는 목적하지 않는 미생물에 의해 생산되는 대사산물로 인한 최종 산물의 오염을 통해)을 손상시키므로, 제조 공정에 심각한 영향을 미친다.
미생물의 편재성(ubiquitous nature) 및 생산 공정 내로 미생물이 진입하는 지점의 다중성으로 인해 생물학적 산물에서와 더불어 그의 생산 공정에서 외래 성장을 방지하는 것은 난제이다. 생명공학적 생산 공정에 사용되어야 하는 장비(예를 들어, 발효기의 내부), 성장 배지와 더불어 성장 배지에 대한 임의의 보충물을 멸균하기 위한 다양한 방법이 개발되어 왔다.
화합물 또는 조성물을 멸균하기 위한 몇몇 방법이 공지되어 있으며, 생명공학적 생산 공정에 사용될 공급물로부터 외래성 미생물을 제거하기 위해 사용된다. 이러한 방법은 가스 멸균(예를 들어, 오존 또는 에틸렌 옥사이드를 이용함), 방사선 멸균(예를 들어, 자외 방사선 또는 감마 방사선), 명광(bright light)/펄스 광(pulsed light) 멸균과 더불어, 액체 및 용액의, 특히 열-민감성이거나 적어도 하나의 열-민감성 화합물을 함유하는 액체 및 용액의 멸균 여과를 포함한다.
임의의 열-용인성 공급물의 열 처리는 가장 신뢰성 있고 효과적인 멸균 방법인 것으로 공지되어 있으며, 열 멸균을 달성하기 위해 습열(wet heat)이 가장 널리 사용된다. 습열(증기) 멸균은 멸균하고자 하는 구성요소를 가압 증기에 한동안 노출시키는 것을 의미한다. 장비 및 공급물을 멸균하기 위해 사용되는 전형적인 습열 멸균 프로토콜은 고압 포화 증기를 115　℃ 내지 140　℃에서 약 60 내지 3 분 동안 그들에게 적용한다. 이들 멸균 프로코콜은 멸균하고자 하는 원료, 용액, 또는 표면의 성질 및 미생물오염도(bioburden)에 따라 변동될 수 있다.
기본적으로, 부적절한 멸균 방법에 의한 구성요소의 손상은 생명공학적 생산 공정의 품질, 안전성, 또는 생산성에 영향을 줄 수 있으므로 피해야 한다. 특히 유체는 열, 조사(irradiation), 또는 화학물질을 사용하는 멸균 방법으로 인해 다양한 화학 반응을 겪을 수 있다.
이러한 화학 반응의 복잡성은 우유 내의 효소를 비활성화하거나 미생물 부하(microbial load)를 감소시킴으로써 우유의 저장-수명을 연장하기 위해 전형적으로 사용되는 우유의 열-처리에 의해 예시된다. 121.1 ℃에서 20 분 동안의 우유의 관용적인 멸균시에 우유의 색 및 맛에 영향을 주는 마이야르 반응(Maillard reaction)이 일어나는 것으로 공지되어 있다. 추가로, 우유의 열 처리로 인해 단백질 또는 비타민의 변성 또는 불활성화와 더불어 알도 당(aldo sugar)과 아미노산 또는 아미노 기 함유 물질의 반응이 일어나는 것으로 공지되어 있다. 한편, 열 처리로 인해 우유의 실질적인 구성성분인 락토스(4-O-β-D-갈락토피라노실-D-글루코피라노스, CAS-번호: 63-42-3)가 락툴로스(4-O-β-D-갈락토피라노실-D-프럭토푸라노스, CAS-번호: 4618-18-2)로 이성체화되고, 글루코스 및 갈락토스와 더불어 산과 같은 추가의 분해 산물로 추가로 분해된다는 것이 또한 주지되어 있다. 이러한 유형의 이성체화는 염기성 pH에 의해 촉진되며, 로브리 드 브루인-알베르다 반 에켄슈타인 전환(Lobry de Bruyn-Alberda van Ekenstein transformation)으로도 공지되어 있다.
우유의 품질 및 조성에 대한 열의 목적하지 않는 효과를 제한하기 위한 시도로, 우유를 수 초 내지 수 분 동안 140　℃에 노출시키는 "초고온 처리", 또는 우유를 최대 74 ℃의 온도로 가열하는 "저온 살균(low temperature pasteurization)"과 같은 대안적인 멸균 방법이 사용된다. 그럼에도 불구하고, 정도는 덜하지만, 이들 대안적인 멸균 방법 중에도 목적하지 않는 열-매개 반응은 또한 일어난다.
120　℃에서 10 분 동안 탈지 원유를 멸균하기 전에, 초기 pH가 6.70인 탈지 원유의 pH 값을 6.59 내지 6.72의 값으로 조정함으로써 이를 추가로 개선할 수 있다. 이는 원래의 우유에서의 락툴로스 형성에 비교하여 pH 6.59에서 28% 만큼 감소된 락툴로스 형성 및 pH 6.72에서 9% 증가된 락툴로스 형성을 유발했다.
2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 3'-시알릴락토스, 또는 6'-시알릴락토스와 같은 모유(human milk) 올리고당류의 생명공학적 생산에서, 생산하고자 하는 목적하는 HMO를 유발하는 추가의 글리코실화 단계를 위한 초기 수용자 분자로서 전형적으로 락토스가 사용된다. 발효 브로스(fermentation broth) 내의 외래 성장을 방지하기 위해, 공급되는 락토스는 멸균되어야 한다. 그러나, 발효 브로스 내의 락툴로스의 존재는 피해야 하며, 이는 그것이 상기 HMO로 보충되는 유아용 조제 분유(infant formula) 또는 임의의 다른 영양 제품에 존재해서는 안 되는 공지된 완하제이기 때문이다. 추가로, 락툴로스는 HMO 생산 박테리아에 의해 대안적인 수용자 분자로서 사용됨으로써 천연적으로 존재하지 않는 올리고당류를 유발할 수 있다.
열 처리에 대한 대안으로서, 락토스 용액을 여과에 의해 멸균하는 것이 가능하다. 전형적으로, 1 mM 내지 1 M의 락토스를 함유하는 용액을 멸균 여과한다. 그러나, 산업적 규모의 생산에 필요한 다량의 용액을 여과에 의해 멸균하는 것은 열 멸균에 비교하여 비용이 많이 들고 시간 소모적이며 신뢰성이 낮다. 그러므로, 락토스의 락툴로스로의 전환이 없거나 소량에 불과한, 신뢰성 있고 더 편리한 락토스 멸균 방법이 필요하다.
락토스 용액을 열에 노출시키기 전 및/또는 노출시키는 과정 중에, 락토스 용액의 산성 pH를 조정하는 방법에 의해 목적이 달성되었지만, 당 용액의 열 처리 전에 당 용액을 산성화하는 원칙은 락토스 이외의 당류에도 적용할 수 있다.
요약
제1 태양에서 본 발명은, 수용액을 그의 열 처리 전 및/또는 열 처리 과정 중에 산성화함으로써 수용액의 열 처리시에 환원 당류를 함유하는 상기 수용액 중의 상기 환원 당류의 이성체화를 저해하는 방법을 제공한다.
제2 태양에서 본 발명은, 적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액을 제공한다.
제3 태양에서 본 발명은, 생물학적 산물의 생명공학적 생산에서의, 적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액의 용도를 제공한다.
제4 태양에서 본 발명은, 적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액이 사용되는, 생물학적 산물의 생산 방법을 제공한다.
제5 태양에서 본 발명은, 적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액을 이용하는 생명공학적 생산에 의해 생산되는 생물학적 산물을 제공한다.
추가의 태양에서 본 발명은, 제형을 제조하기 위한, 적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액을 이용하는 생명공학적 생산에 의해 생산되는 생물학적 산물의 용도를 제공한다.
다른 추가의 태양에서 본 발명은, 적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액을 이용하는 생명공학적 생산에 의해 생산된 생물학적 산물을 포함하는 제형을 제공한다.
도 1은 (A) 열 멸균 전 및 (B) 열 멸균 후의, 락토스를 함유하는 수용액의 크로마토그램을 나타낸다. 수용액을 그의 열 멸균 전에 산성화하지 않았다. 도 1c는 표준품으로서 사용된 다양한 특이적 당류의 크로마토그램을 나타낸다.
도 2는 (A) 열 멸균 전 및 (B) 열 멸균 후의, 락토스를 함유하는 수용액의 크로마토그램을 나타낸다. 락토스를 함유하는 수용액에 황산을 첨가함으로써 수용액을 그의 열 멸균 전에 산성화하였다. 도 2c는 표준품으로서 사용된 다양한 특이적 당류의 크로마토그램을 나타낸다.
상세한 설명
제1 태양에 따라, 당류 수용액을 그의 열 처리 전 및/또는 열 처리 과정 중에 산성화하는 단계를 포함하는, 상기 당류 수용액의 열 처리시에 환원 당류를 함유하는 수용액(당류 수용액) 중의 상기 환원 당류의 이성체화를 저해하는 방법이 제공된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "환원 당류"는, 그것이 유리 알데히드 기를 가짐으로 인해 환원제로서 작용할 수 있는 임의의 당 또는 당류를 지칭한다. 환원 당류는 단당류, 이당류, 및 올리고당류를 포함한다. 모든 단당류는 환원 당이며, 그들은 알데히드 기를 가진 알도스, 및 케톤 기를 가진 케토스로 분류될 수 있다. 케토스는 그들이 환원 당으로서 작용할 수 있기 전에 먼저 알도스로 호변이성체화되어야 한다. 이당류는 2개의 단당류 잔기로부터 형성되고 올리고당류는 3 내지 7개의 단당류 잔기로부터 형성된다. 이당류 및 올리고당류는 환원성 또는 비환원성 중 어느 하나로서 분류될 수 있다. 락토스 및 말토스와 같은 환원 이당류는 그들의 2개의 아노머 탄소 중 1개만이 글리코시드 결합에 참여하며, 이는 그들이 알데히드 기를 가진 개방쇄 형태로 전환될 수 있음을 의미한다.
추가의 및/또는 대안적인 실시 형태에서, 환원 당류는 알도스, 이당류, 및 올리고당류로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "알도스"는 분자당 단 1개의 알데히드 기를 함유하는 단당류를 지칭한다. 알도스의 예는 D-(+)-글리세르알데히드, D-(-)-에리트로스, D-(-)-트레오스, D-(-)-리보스, D-(-)-아라비노스, D-(+)-자일로스, D-(-)-릭소스, D-(+)-알로스, D-(+)-알트로스, D-(+)-글루코스, D-(+)-만노스, D-(-)-굴로스, D-(-)-이도스, D-(+)-갈락토스, 및 D-(+)-탈로스이다.
추가의 및/또는 대안적인 실시 형태에서, 이당류는 락토스, 말토스, 트레할로스, 셀로비오스, 키토비오스, 코지비오스, 니게로스, 이소말토스, 소포로스, 라미나리비오스, 겐티비오스, 투라노스, 마툴로스, 팔라티노스, 겐티비오스, 만노비오스, 멜리비오스, 멜리비울로스, 루티노스, 루티눌로스, 및 자일로비오스로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
본 명세서에 사용되는 용어 "올리고당류"는 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 단당류 잔기로 구성된 당류를 지칭하며, 따라서 삼당류, 사당류, 오당류, 육당류, 및 칠당류를 포함한다.
당류 수용액을 수득하기 위해, 소정량의 적어도 하나의 환원 당류를 공급수에 용해시킨다. 상기 물은 증류수, 이중 증류수, 탈이온수, 지하수, 하천수, 해수, 수돗물, 도시 용수, 및 식염-함유수로 구성된 그룹 중에서 선택될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 용어 "식염-함유수"는 하나 이상의 염의 수용액을 지칭한다. 추가의 및/또는 대안적인 실시 형태에서, 당류 수용액은 단백질, 폴리펩티드, 핵산(예컨대 DNA 및/또는 RNA), 및 지질(예컨대 지방산, 모노-, 디-, 및/또는 트리글리세롤)로 구성된 그룹 중에서 선택된 하나 이상을 포함하지 않는다.
본 방법의 실시 형태에서, 당류 수용액은 약 1 내지 약 6의 값을 가진 pH로, 바람직하게 약 2 내지 약 5의 값을 가진 pH로, 더욱 바람직하게 약 3 내지 약 4의 값을 가진 pH로 산성화된다. 약 3 내지 약 5의 값을 가진 당류 수용액의 pH가 특히 유리한 것으로 확인되었으며, 이는 환원 당류의 이성체화가 저해되거나 심지어 방지되는 한편, 상기 환원 당류의 분해 산물의 형성이 무시할만 하기 때문이다.
추가의 및/또는 대안적인 실시 형태에서, 당류 수용액은 당류 수용액에 산을 첨가함으로써 산성화된다. 산은 환원 당류와의 목적하지 않는 화학 반응을 유발하지 않는 임의의 산일 수 있다. 락토스 수용액에 질산을 첨가하는 경우에 이러한 목적하지 않는 화학 반응의 예는 점액산의 형성이다.
산은 유기산 및 무기산의 그룹 중에서 선택될 수 있으며, 다만, 갈락토스 또는 락토스 같은 갈락토스-함유 화합물의 질산 산화는 점액산을 유발하므로, 환원 당류가 갈락토스 또는 갈락토스-함유 당류인 경우에 무기산은 질산(또는 아질산)이 아니다.
추가의 및/또는 대안적인 실시 형태에서, 당류 수용액을 산성화하기 위한 적어도 하나의 산은 무기산 또는 광산이다. 무기산은 당류 수용액에 첨가하고자 하는 양에서 당류와 우발적으로 반응하지 않는 적합한 무기산이다. 예를 들어, 락토스 수용액에 질산을 첨가하는 단계는 점액산을 유발할 수 있다. 무기산은 염산, 황산, 아황산, 인산, 붕산, 불산(hydrofluoric acid), 브롬산(hydrobromic acid), 과염소산, 요오드산(hydroiodic acid), 및 탄산으로 구성된 그룹 중에서 바람직하게 선택된다.
무기산이 탄산인 실시 형태에서는, 가압 용기 내에서 이산화탄소로 당류 수용액을 가스 처리하여 당류 수용액을 산성화할 수 있다.
추가의 및/또는 대안적인 실시 형태에서, 당류 수용액을 산성화하기 위한 적어도 하나의 산은 유기산이다. 유기산은 모노카르복실산, 디카르복실산, 및 트리카르복실산으로 구성된 그룹 중에서 선택될 수 있다.
추가의 및/또는 대안적인 실시 형태에서, 모노카르복실산은 탄산, 포름산(메타노산), 아세트산(에타노산), 프로프리온산(프로파노산), 부티르산(부타노산), 및 발레르산(펜타노산)으로 구성된 그룹 중에서 선택되지만 이로 제한되지 않는다.
추가의 및/또는 대안적인 실시 형태에서, 디카르복실산은 옥살산, 말론산, 석신산, 글루타르산, 아디프산, 말레산, 말산, 푸마르산, 글루타콘산, 뮤콘산, 및 시트라콘산으로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
추가의 및/또는 대안적인 실시 형태에서, 트리카르복실산은 시트르산, 이소시트르산, 및 아코니트산으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
당류 용액의 pH를 산성 값으로 조정하는 단계는, 환원 당류의 이성체화가 없거나 적어도 감소된, 수용액 중의 환원 당류의 열 처리를 가능하게 한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "열 처리"는 승온, 즉, 실온(21　℃) 초과의 온도에서 당류 수용액을 가온 또는 가열 및/또는 유지하는 단계를 포함한다. 당류 수용액의 열 처리는 산성화 후에 및/또는 산성화 중에 당류 수용액을 약 30　℃, 약 40　℃, 약 50　℃, 약 60　℃, 약 70　℃, 또는 심지어 약 80　℃의 온도로 가열하는 단계를 포함하며, 이러한 온도에서 - 임의로 그것이 심지어 더 높은 온도로 가열된 후에 - 연장된 기간 동안, 즉, 수 시간 또는 심지어 수 일 동안, 예컨대 - 예를 들어, 그러나 이로 제한되지 않음 - 약 20 시간, 약 30 시간, 약 40 시간, 약 50 시간, 약 60 시간, 약 72 시간, 또는 그 이상 동안 당류 수용액을 유지하는 단계 또한 포함한다.
이성체화 없이, 또는 유의적으로 감소된 환원 당류의 이성체화를 동반하여, 환원 당류를 함유하는 수용액을 이러한 승온에서 가열 및/또는 유지하는 단계는 다중의 이점, 예컨대 - 예를 들어 - 주어진 양의 물에 더 많은 양의 당류를 용해시킴으로써 수용액 중의 당류 농도를 증가시키는 것 및 목적하는 최종 당류 농도를 수득하기 위해 배치에 공급해야 하는 당류 수용액의 부피를 감소시키는 것의 선택권을 제공한다. 추가로 및/또는 대안적으로, 당류 수용액을 승온에서 가열/유지함으로써 당류 수용액의 점도를 감소시킬 수 있으며, 이에 의해, 예를 들어 막 필터를 통한 당류 수용액의 취급 및/또는 펌핑을 용이하게 할 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "열 처리"는 또한, 당류 수용액을 멸균하기에 적합한 승온에서 당류 수용액을 한동안 가열 및/또는 유지하는 단계를 포함한다. 그러므로, "열 처리"는 또한, 당류 수용액을 약 115　℃ 내지 150 ℃ 범위의 온도로(그러나 이로 제한되지 않음) 가열하고 최대 약 60 분 동안 온도를 유지하는 단계를 포함한다.
당류 수용액을 멸균하기 위한 열 처리의 실시 형태에서, 당류 수용액은 고압멸균에 의해 멸균된다. 고압멸균은 포화 과열 증기를 이용하는 세균 박멸(germ destruction)의 가장 중요한 방법 중 하나이다. 멸균하고자 하는 물체 상의 증기 응축은 에너지를 방출하며, 이는 미생물에 비가역적인 손상을 야기한다. 이 목적을 위해, 초기 상승 시간 중에 고압멸균기의 내부를 배기시킨다. 그렇게 하는 중에, 대기가 내부로부터 축출되고 포화 과열 증기에 의해 대체된다. 배기는 유동 과정(flow process)을 사용하거나 분획 배기(fractioned venting)를 통해 일어나며; 일단 배기가 완료되면, 배기 밸브가 폐쇄된다. 이는 보상 시간(compensation time)의 시작을 표시한다. 이 기간 후에, 멸균하고자 하는 품목의 모든 지점이 포화 증기의 효과로 인해 필요한 온도에 도달한다. 그 후에 실제 멸균 단계가 시작된다. 멸균의 지속기간은 세균 부하 및 멸균 온도 양자 모두에 따라 달라진다. 121.1　℃(250　°F)에서 15 분 내지 30 분 동안의 고압멸균이 표준으로 보인다. 원핵 및 진핵 유기체와 더불어 바이러스/박테리오파아지를 포함하는 영양형은 65　℃ - 100　℃의 온도에서 수 분 이내에 통상적으로 비활성화될 수 있는 반면에, 포자와 같은 생존형은 최대 140 ℃의 온도에서 처리해야만 한다. 프리온을 비활성화하거나 박멸하기 위해서는 132　℃ 내지 134　℃ 및 3 바의 압력에서 적어도 30 분이 필요하다. 후속의 냉각 단계, 및 따라서 고압멸균 주기의 종료는 멸균 시간 후에 시작된다.
당류 수용액을 멸균하기 위한 열 처리의 대안적인 실시 형태에서, 당류 수용액은, 수용액을 130　℃ - 150 ℃의 온도로 가열하며 140　℃를 주 지점으로 하는 단계를 포함하는 연속 멸균 방법인 "초고온 처리"라고 칭하는 공정에 의해 멸균된다. 상응하는 유지 시간은, 멸균하고자 하는 용액의 특성에 따라 8 내지 40 초, 간혹 최대 5 분까지 변동될 수 있다.
당류 수용액을 멸균하기 위한 열 처리의 또 다른 실시 형태에서는, 당류 수용액에 고온/단시간(HTST) 살균을 적용하며, 여기에서 용액은 71.5　℃ 내지 74　℃의 온도로, 바람직하게 72　℃로 약 15 초 내지 약 30 초 동안 가열되고, 상기 열 처리를 적용하는 동안 제어된 연속 유동으로 이동한다.
당류 수용액을 멸균하기 위한 열 처리의 또 다른 실시 형태에서는, 당류 수용액에 "순간 살균"을 적용하며, 여기에서 당류 수용액에 71.7　℃를 15 초 동안 적용한다.
당류 수용액에 이들 열 처리 중 임의의 것을 적용하기 전 및/또는 당류 수용액을 멸균하기 위한 그의 열 처리 과정 중에 환원 당류의 수용액을 산성화하는 단계는 그의 열 처리시에 수용액 중의 환원 당류의 이성체화를 저해하거나 심지어 방지한다.
따라서, 제2 태양에 따라, 적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액이 제공되며, 이는 제1 태양에 따른 방법에 의해, 즉, 당류 수용액의 열 처리 전 및/또는 열 처리 과정 중의 상기 당류 수용액의 산성화를 포함하는, 상기 환원 당류의 수용액 중의 상기 환원 당류의 이성체화를 저해하는 방법에 의해 수득된다.
당류 수용액의 열 처리 전 및/또는 열 처리 과정 중의 당류 수용액의 산성화에 의해 수득되고 동일한 열 처리 전에 산성화되지 않은 동일한 환원 당류의 유사한 수용액에 비교하여 적어도 하나의 환원 당류의 목적하지 않는 이성체화 산물을 함유하지 않거나 적어도 더 적은 양으로 함유하는 상기 적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액.
제2 태양의 실시 형태에서, 환원 당류를 함유하는 수용액은 멸균 수용액이다. 환원 당류를 함유하는 멸균 수용액은, 당류 수용액을 멸균하기 위한 상기 당류 수용액의 열 처리를 포함하는, 본 명세서에 상기 기재된 바와 같은 상기 환원 당류의 이성체화를 저해하는 방법에 의해 수득된다. 따라서, 수용액은 열 처리에 의해 멸균되었다.
추가의 및/또는 대안적인 실시 형태에서, 환원 당류를 함유하는 수용액은 승온, 즉 약 30　℃, 약 40　℃, 약 50 ℃, 약 60　℃, 약 70　℃, 또는 심지어 약 80　℃의 온도를 가지며, 실온에서 물에 용해될 수 있는 상기 환원 당류의 양보다 더 많은 양으로 환원 당류를 함유한다. 예를 들어, 산성화된 락토스 수용액의 온도가 약 40　℃ 내지 약 60　℃로 유지된다면, 락토스를 10　mM 이상의 농도로, 바람직하게 100　mM 이상의 농도로, 더욱 바람직하게 0.66　M 이상의 농도로, 가장 바람직하게　1 M 이상의 농도로 함유하는 수용액이 제공된다.
실온에서 물에 용해될 수 있는 당류의 양보다 더 많은 양으로 적어도 하나의 환원 당류, 예컨대 - 예를 들어 - 락토스를 함유하는 당류 수용액은, 본 명세서에 상기 기재된 바와 같이 멸균을 위한 열 처리 수단에 의해 멸균되고 멸균 당류 수용액을 유지하는 목적하는 승온까지 냉각시킨 멸균 락토스 수용액일 수 있다.
제3 태양에 따라 본 발명은, 생물학적 산물의 생명공학적 생산에서, 본 명세서에 상기 기재된 바와 같이 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액의 용도를 제공한다. 생물학적 산물의 생산
실시 형태에서, 생물학적 산물의 생명공학적 생산에서의 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액의 용도는 생체촉매 생산 공정에서의 용도를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 용어 "생체촉매 생산 공정"은 하나 이상의 정제되거나 단리된 효소를 시험관내 반응에서 하나 이상의 추출물(educt)과 접촉시켜 하나 이상의 추출물을 목적하는 생물학적 산물로 전환하는 생물학적 산물의 생산 공정을 지칭하는 것으로 이해된다.
대안적인 실시 형태에서, 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액의 용도는 발효성 생산 공정에서의 용도를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 용어 "발효성 생산 공정"은 미생물에 의해 합성되는 생물학적 산물 또는 특수 제품(specialty product)을 생산하는 목적으로 배지 또는 브로스 중에 미생물을 성장시키는 공정을 지칭한다.
당류 수용액의 열 처리 전 및/또는 열 처리 과정 중에 본 명세서에 기재된 바와 같이 당류 수용액이 산성화된, 적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액을 사용하는 것은, 환원 당류의 목적하지 않는 이성체화 산물이 당류 수용액 내에 존재하지 않거나 적게 존재한다는 점, 및 당류 수용액의 열 처리 전에 산성화되지 않은 유사한 당류 수용액에 비교하여 목적하지 않는 이성체화 산물이 생명공학적 생산 공정에 공급되지 않거나 적게 공급된다는 점에서 특히 유리하다. 따라서, 당류 수용액을 생명공학적 생산 공정에 사용할 수 있기 전에 열 처리된 당류 수용액으로부터 목적하지 않는 이성체화 산물을 제거할 필요가 없다.
제4 태양에 따라 본 발명은, 생물학적 산물의 생명공학적 생산 방법을 제공한다.
생물학적 산물의 생명공학적 생산 방법에 대한 본 방법의 실시 형태에서, 본 방법은 생체촉매 생산 공정이다. 본 방법은
- 적어도 하나의 정제된 효소를 제공하는 단계;
- 열 처리 전 및/또는 열 처리 과정 중에 본 명세서에 상기 기재된 바와 같이 산성화된 열 처리된 당류 수용액의 존재 하에 적어도 하나의 정제된 효소를 하나 이상의 추출물과 접촉시켜, 하나 이상의 추출물을 목적하는 생물학적 산물로 전환하도록 반응시키는 단계; 및
- 임의로, 생물학적 산물을 정제하는 단계를 포함한다.
일 실시 형태에서, 당류 수용액의 적어도 하나의 환원 당류는 생체촉매 생산 공정의 추출물을 나타낸다.
생명공학적 생산 공정의 대안적인 실시 형태에서, 본 방법은 발효성 생산 공정이다.
"발효" 또는 "발효성"은 특이적 화학 산물인 "생물학적 산물"의 생산을 목적으로 하는 성장 배지(발효 브로스) 상에서의 또는 내에서의 미생물의 벌크 성장을 지칭한다. 이 목적을 위해, 하나 또는 제한된 수의 미생물 균주의 세포를 생물반응기(발효기) 내에서 미생물에 대한 최적 조건 하에 성장시켜 목적하는 생산을 수행하며 목적하지 않는 불순물의 생성을 제한한다. 생물반응기 내부의 환경적 조건, 예컨대 온도, 영양분 농도, pH, 및 용존 가스(특히 호기성 발효의 경우에 산소)는 유기체의 성장 및 생산성에 영향을 주므로 필요에 따라 모니터링되고 제어되고 조정된다.
따라서, 생물학적 산물의 발효성 생산 방법은
-　 생물학적 산물을 생산할 수 있는 세포를 제공하는 단계;
-　 적어도 하나의 세포가 생물학적 산물을 생산하도록 적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액을 함유하고/하거나 이로 보충된 발효 브로스 중에 적어도 하나의 세포를 배양하는 단계; 및
-　 임의로 발효 브로스로부터 생물학적 산물을 정제하는 단계를 포함한다.
제3 태양에 따른 용도 및/또는 제4 태양에 따른 방법의 실시 형태에서, 상기 생존 세포는 원핵 세포 또는 진핵 세포이다. 적절한 세포는 효모, 박테리아, 고세균, 진균, 곤충 세포, 식물 세포, 및 포유류 세포(예컨대 인간 세포 및 세포주)를 포함하는 동물 세포를 포함한다.
추가의 및/또는 대안적인 실시 형태에서, 원핵 세포는 바실러스(Bacillus), 락토바실러스(Lactobacillus), 락토코커스(Lactococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 비피도박테리움(Bifidobacterium), 스포롤락토바실러스 종 (sporolactobacillus spp.), 마이크로모모스포라 종(Micromomospora spp.), 마이크로코커스 종(Micrococcus spp.), 로도코커스 종(Rhodococcus spp.), 및 슈도모나스(Phseudomonas)로 구성된 그룹 중에서 선택된 속으로부터 바람직하게 선택된 박테리아 세포이다. 적합한 박테리아 종은 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 코아귤란스(Bacillus coagulans), 바실러스 써모필러스(Bacillus thermophilus), 바실러스 락터로스모러스(Bacillus laterosporus), 바실러스 메가터리움(Bacillus megaterium), 바실러스 마이코이데스(Bacillus mycoides), 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus), 바실러스 렌터스(Bacillus lentus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바실러스 컬큐란스(Bacillus circulans), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 비피도박테리움 인팬티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 시트로박터 프룬디(Citrobacter freundii), 클로스트리디움 셀룰로이티쿰(Clostridium cellulolyticum), 클로스트리디움 융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 아세토부티리쿰(Clostridium acetobutylicum), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 엔테로코커스 패시움 (Enterococcus faecium), 엔테로코커스 써모파일스(Enterococcus thermophiles), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 에르위니아 허비콜라(Erwinia herbicola (판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans)), 락토바실러스 에시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실러스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 크리스파터스(Lactobacillus crispatus), 락토바실러스 가세리(Lactobacillus gasseri), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri), 락토바실러스 젠세니이(Lactobacillus jensenii), 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis), 판토에아 시트레아(Pantoea citrea), 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum), 프로피오니박테리움 프레우덴레이치이(Proprionibacterium freudenreichii), 슈도모나스 플루오레스센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 아에루기노사(Phseudomonas aeruginosa), 스트렙토코커스 써모파일스(Streptococcus thermophiles) 및 잔토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)이다.
추가의 및/또는 대안적인 실시 형태에서, 진핵 세포는 효모 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 또는 포유류 세포이다. 효모 세포는 사카로마이세스 종(Saccharomyces sp.), 특히 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이콥시스 종(Saccharomycopsis sp.), 피치아 종(Pichia sp.), 특히 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 한세뉼라 종(Hansenula sp.), 클루이베로마이세스 종(Kluyveromyces sp.), 야로위아 종(Yarrowia sp.), 로도토룰라 종(Rhodotorula sp.), 및 스키조사카로마이세스 종(Schizosaccharomyces sp.)으로 구성된 그룹 중에서 바람직하게 선택된다.
제3 태양에 따른 용도 및/또는 제4 태양에 따른 방법의 실시 형태에서, 상기 생물학적 산물은 모유 올리고당류이다. 모유 올리고당류는 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 2',3-디푸코실락토스, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오푸코펜타오스 I, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토-N-푸코펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코실헥사오스 II, 파라-락토-N-푸코실헥사오스, 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 b, 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 c, 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 c, 디시알릴-락토-N-푸코펜타오스, 3-푸코실-3'-시알릴락토스, 3-푸코실-6'-시알릴락토스, 락토-N-네오디푸코헥사오스 I, 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 시알릴락토-N-테트라오스 LST-a, LST-b, LST-c, 및 디시알릴락토-N-테트라오스로 구성된 그룹 중에서 선택될 수 있다.
제3 태양에 따른 용도 및/또는 제4 태양에 따른 방법의 추가의 및/또는 대안적인 실시 형태에서, 상기 환원 당류는 락토스이다. 이 실시 형태는 목적하는 모유 올리고당류를 생산하기 위한 생존 세포를 위해 발효 브로스에 락토스가 공급되어야 하는 경우에 특히 유리하다. 제1 태양에 따른 방법에 의해 락토스 수용액의 열 멸균시에 락툴로스의 형성을 감소시키거나 피할 수 있음은, 영양 조제 분유(nutritional formula), 특히 유아용 조제 분유, 약용 식품, 또는 식이 보충제의 제조를 위해 HMO 제제를 사용해야 하는 경우에 HMO 제제로부터 락툴로스를 제거할 필요성을 제거한다.
발효성 생산 공정에서 당류 수용액의 열 처리 전 및/또는 열 처리 과정 중에 본 명세서에 기재된 바와 같이 당류 수용액을 산성화한, 적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 열 처리된 당류 수용액을 사용하는 것은 추가의 이점을 제공한다. 첫째로 본 발명은, 환원 당류의 이성체화가 없거나 감소된 열 멸균 방법에 의한, 환원 당류를 함유하는 수용액의 멸균을 가능하게 한다. 그러므로, 특히 큰 부피의 당류 수용액, 예컨대 수 입방 미터를 멸균할 필요가 있는 경우, 환원 당류를 함유하는 수용액을 열 멸균보다 신뢰성이 낮은(예를 들어, 박테리오파아지의 제거에 관해) 멸균 여과에 의해 멸균할 필요가 없다. 추가로, 큰 부피의 열 멸균은 멸균 여과보다 더 경제적이다. 둘째로 본 발명은, 당류 수용액을 승온, 즉 실온 초과의 온도에서 가열하고 유지할 수 있으므로, 적어도 하나의 환원 당류의 농도가 실온에서의 적어도 하나의 환원 당류의 포화 농도보다 더 높은, 적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 당류 수용액을 제공하는 것을 가능하게 한다. 또한, 당류 수용액을 승온에서 유지하는 것은 당류 수용액의 점도를 감소시키며, 예를 들어 당류 수용액을 파이프 또는 호스를 통해 펌핑하는 경우에, 이는 다시 당류 수용액의 취급을 용이하게 한다. 셋째로, 당류 농도가 증가된 당류 수용액을 제공할 수 있는 것은 발효성 생산 공정에서 더 높은 산물 수율을 수득하는 것을 가능하게 한다. 이는 발효기의 부피가 제한되어 있고 발효 브로스에 - 특히 - 당류 수용액이 공급됨으로 인해 발효 공정 중에 발효기 내의 발효 브로스의 부피가 증가하기 때문이며, 이 당류 수용액은 배양되는 세포에 의한 목적하는 생물학적 산물의 생산에 필요하다. 당류 수용액 중의 당류의 농도가 높을수록, 발효 브로스 중의 적어도 하나의 환원 당류의 사전결정된 농도를 얻고/얻거나 유지하기 위해 발효 브로스에 첨가할 필요가 있는 당류 수용액의 부피가 작아진다. 따라서, 당류 농도가 증가된 본 발명에 따른 당류 수용액을 사용하여, 주어진 발효기 내에서 발효 브로스 중의 더 높은 당류 농도를 달성할 수 있거나, 공급을 위해 이용가능한 발효기 내의 부피가 더 천천히 소진되므로 사전결정된 당류 농도를 더 긴 기간 동안 유지할 수 있다. 이는 다시 목적하는 생물학적 산물의 생산을 위해 더 많은 환원 당류를 세포에 제공하므로, 단일 배치 발효에서 수득할 수 있는 목적하는 생물학적 산물의 수율을 증가시킨다. 따라서, 목적하는 생물학적 산물을 - 발효 공정의 말기에 - 발효 브로스 중의 100 g/L 이상의 양으로, 바람직하게 발효 브로스 중의 150 g/L 이상의 양으로, 더욱 바람직하게 발효 브로스 중의 200 g/L 이상의 양으로 생산할 수 있다. 예를 들어, 열 멸균된 산성화된 0.66 M 락토스 수용액을 사용한 경우에 100 g/L 초과, 즉 약 150 g/L의 2'-푸코실락토스의 양이 수득됐고, 발효 브로스에 투입될 수용액 중의 락토스 농도를 추가로 증가시킨다면 훨씬 더 높은 수율을 수득할 수 있다.
제3 태양에 따른 용도 및/또는 제4 태양에 따른 방법의 다른 실시 형태에서, 적어도 하나의 환원 당류는 락토스이고, 상기 생물학적 산물은 락토수크로스 및 락토비온산으로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
따라서, 제5 태양에 따라 본 발명은, 제4 태양에 따른 방법 중 하나에 의해 생산된 생물학적 산물을 제공한다.
실시 형태에서, 생물학적 산물은 모유 올리고당류, 바람직하게 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 2',3-디푸코실락토스, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오푸코펜타오스 I, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토-N-푸코펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코실헥사오스 II, 파라-락토-N-푸코실헥사오스, 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 b, 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 c, 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 c, 디시알릴-락토-N-푸코펜타오스, 3-푸코실-3'-시알릴락토스, 3-푸코실-6'-시알릴락토스, 락토-N-네오디푸코헥사오스 I, 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 시알릴락토-N-테트라오스 LST-a, LST-b, LST-c, 및 디시알릴락토-N-테트라오스로 구성된 그룹 중에서 선택된 모유 올리고당류이다.
대안적인 실시 형태에서, 생물학적 산물은 락토수크로스 및 락토비온산 또는 상기 언급된 모유 올리고당류의 유도체로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
추가의 태양에 따라, 본 발명은 제형을 제조하기 위한 생물학적 산물의 용도를 제공한다.
제형을 제조하기 위한 생물학적 산물의 용도의 실시 형태에서, 생물학적 산물은 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 2',3-디푸코실락토스, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오푸코펜타오스 I, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토-N-푸코펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코실헥사오스 II, 파라-락토-N-푸코실헥사오스, 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 b, 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 c, 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 c, 디시알릴-락토-N-푸코펜타오스, 3-푸코실-3'-시알릴락토스, 3-푸코실-6'-시알릴락토스, 락토-N-네오디푸코헥사오스 I, 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 시알릴락토-N-테트라오스 LST-a, LST-b, LST-c, 및 디시알릴락토-N-테트라오스로 구성된 그룹 중에서 선택된 모유 올리고당류이다. 본 실시 형태에서 제형은 영양 제형, 바람직하게 유아용 조제 분유, 약용 식품, 및 식이 보충제로 구성된 그룹 중에서 선택된다.
환원 당류가 락토스인 경우, 제1 태양에 따라 이성체화를 저해하는 방법은 모유 올리고당류의 발효성 생산을 위해 락툴로스가 없거나 그 양이 감소된 열 멸균 락토스 용액을 제공할 수 있다. 이어서, 영양 제형, 바람직하게 유아용 조제 분유의 제조에 상기 모유 올리고당류를 사용할 수 있으며, 이는 에피락토스, 락툴로스, 및/또는 락툴로스의 유도체, 예컨대 푸코실락툴로스를 함유하지 않거나 더 적은 양을 함유한다(HMO 제제로부터 락툴로스 또는 그의 유도체를 제거할 필요가 없음).
추가의 태양에 따라, 본 명세서에 상기 기재된 바와 같은 생명공학적 생산 공정에 의해 생산된 적어도 하나의 생물학적 산물을 포함하는 제형이 제공된다. 상기 제형은 영양 제형, 바람직하게 유아용 조제 분유, 약용 식품, 및 식이 보충제로 구성된 그룹 중에서 바람직하게 선택된다.
특정 실시 형태에 대해, 그리고 도면을 참조하여 본 발명을 기재할 것이나, 본 발명은 이로 제한되는 것이 아니라 단지 청구범위에 의해 제한된다. 추가로, 상세한 설명 및 청구범위에서 용어 제1, 제2 등은 유사한 요소들 사이의 구별을 위해 사용되며, 반드시 시간적으로, 공간적으로, 순위에 따라, 또는 임의의 다른 방식으로 순서를 기재하기 위한 것은 아니다. 그렇게 사용되는 용어는 적절한 상황 하에 호환적이며 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시 형태는 본 명세서에 기재되거나 예시된 것과는 다른 순서로 작동할 수 있음이 이해되어야 한다.
청구범위에 사용되는 용어 "포함하는"은 그 후에 열거된 수단으로 한정되는 것으로 해석되어서는 안 되며; 그것은 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않음에 유의해야 한다. 따라서 그것은 언급된 특징부, 정수, 단계, 또는 구성요소의 존재를 언급된 바와 같이 명시하는 것으로 해석되어야 하며, 하나 이상의 다른 특징부, 정수, 단계, 또는 구성요소, 또는 그의 그룹의 존재 또는 부가를 배제하지 않는다. 따라서, 표현 "수단 A 및 B를 포함하는 장치"의 범위는 구성요소 A 및 B로만 구성되는 장치로 제한되어서는 안 된다. 그것은 본 발명에 관련하여 장치의 유일한 관련 구성요소가 A 및 B임을 의미한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 "일 실시 형태" 또는 "실시 형태"를 지칭하는 것은, 실시 형태와 관련하여 기재된 특정 특징부, 구조, 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시 형태에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸쳐 다양한 곳에서의 구문 "일 실시 형태에서" 또는 "실시 형태에서"의 출현은 반드시 동일한 실시 형태를 지칭하지는 않지만, 그럴 수도 있다. 추가로, 하나 이상의 실시 형태에서, 본 개시내용으로부터 당업자에게 자명할 바와 같이, 특정 특징부, 구조, 또는 특징을 임의의 적합한 방식으로 조합할 수 있다.
마찬가지로, 개시내용을 간소화하고 하나 이상의 다양한 발명 태양의 이해를 보조할 목적으로 본 발명의 예시적인 실시 형태의 기재에서 본 발명의 다양한 특징부가 간혹 단일 실시 형태, 도면, 또는 그의 설명으로 함께 그룹화됨이 인정되어야 한다. 그러나, 이러한 개시 방법은 청구된 발명이 각각의 청구항에 명시적으로 나열된 것보다 더 많은 특징부를 필요로 한다는 의도를 반영하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 오히려, 하기 청구범위가 반영하는 바와 같이, 발명 태양은 앞서 개시된 단일 실시 형태의 모든 특징부보다 더 적은 특징부에 있다. 따라서, 상세한 설명 뒤에 이어지는 청구범위는 이에 의해 본 상세한 설명에 명시적으로 포함되며, 각각의 청구항은 본 발명의 별도의 실시 형태로서 독립적이다.
추가로, 당업자가 이해할 바와 같이, 본 명세서에 기재된 일부 실시 형태는 다른 실시 형태에 포함된 다른 특징부가 아닌 일부를 포함하지만, 상이한 실시 형태의 특징부의 조합은 본 발명의 범위 내에 있도록 의도되며, 상이한 실시 형태를 형성한다. 예를 들어, 하기 청구범위에서, 청구된 실시 형태 중 임의의 것을 임의의 조합으로 사용할 수 있다.
추가로, 실시 형태 중 일부는 컴퓨터 시스템의 프로세서에 의해, 또는 기능을 수행하는 다른 수단에 의해 시행될 수 있는 방법 또는 방법의 요소의 조합으로서 본 명세서에 기재된다. 따라서, 이러한 방법 또는 방법의 요소를 실행하기 위해 필요한 지침이 있는 프로세서는 방법 또는 방법의 요소를 실행하기 위한 수단을 형성한다. 추가로, 본 명세서에 기재된 기구 실시 형태의 요소는 본 발명을 실행하는 목적으로 요소에 의해 수행되는 기능을 실행하기 위한 수단의 예이다.
본 명세서에 제공된 상세한 설명 및 도면에는 다수의 특이적 상세사항이 기술되어 있다. 그러나 본 발명의 실시 형태는 이들 특이적 상세사항 없이 실시될 수 있음이 이해된다. 다른 경우에, 본 상세한 설명의 이해를 난해하게 하지 않기 위해 주지된 방법, 구조, 및 기술은 상세하게 나타내지 않았다.
이제 본 발명의 몇몇 실시 형태의 상세한 설명에 의해 본 발명을 기재할 것이다. 본 발명의 진정한 사상 또는 기술적 교시로부터 이탈하지 않으면서 당업자의 지식에 따라 본 발명의 다른 실시 형태가 구성될 수 있음이 분명하며, 본 발명은 첨부된 청구범위의 조건에 의해서만 제한된다.
실시예 1 - 열 멸균 전에 유기산을 이용하는 락토스의 산성화
226 g의 락토스를 물에 용해시킴으로써 0.66 M 락토스 용액을 제조하였다. 용액의 최종 부피는 1 리터였다. 30 ℃ 내지 35 ℃의 온도에서 50%(w/v) 시트레이트 또는 99%(v/v) 아세트산을 사용함으로써 pH를 조정하였다. 그 후에, 수직형 고압멸균기(Systec VX-65, 독일 린덴 소재) 내에서 20 분 동안 121 ℃에서 용액을 멸균하였다. 열 멸균 전 및 후에 샘플을 채취하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 분석 전에 냉동 보관하였다. Shimadzu HPLC 시스템에 연결된 RID-10A 굴절률 검출기(Shimadzu, 독일 소재) 및 Waters XBridge Amide Column 3.5 μm(250 x 4.6 mm)(Eschborn, 독일 소재)을 사용하여 HPLC를 실행하였다. 30% 용매 A(이중 증류수 중의 50%(v/v) 아세토니트릴, 0.1%(v/v) NH4OH) 및 70% 용매 B(이중 증류수 중의 80%(v/v) 아세토니트릴, 0.1%(v/v) NH4OH)로 35 ℃ 및 1.4 mL min-1의 유속에서 등용매 용출을 실행하였다. 이온 교환 매트릭스(Strata ABW, Phenomenex) 상에서 고체상 추출에 의해 샘플을 청징화하였다. 10 마이크로리터의 샘플(1:5의 희석)을 컬럼에 적용하였다. 최종적으로, 검출된 당의 상대량을 결정하였다. 표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이, 열 멸균은 열 처리 전의 용액의 pH 값이 감소함에 따라 락토스 이성체화의 감소를 유도하였다. 각각 시트레이트 또는 아세트산으로 산성화를 실행한 경우, pH 4.0 내지 3.0 또는 pH 3.0에서는 락툴로스 형성을 관찰할 수 없었다. 락토스가 그의 단당류로 산-촉매 분해되는 것이 더 낮은 pH 값에 의해 증가되었지만 pH 4.5에서는 검출가능하지 않았다.
열 멸균 전 및 후에 pH 조정된 0.66 M 락토스 용액에서 검출된 당의 상대량. pH 조정은 50%(w/v) 시트레이트를 사용하여 실행하였다. HPLC에 의해 검출된 당의 백분율 양(곡선하 면적; AUC)을 나타낸다.
pH 상대적 조성[%]
단당류 락툴로스 락토스
열 멸균 전
3.0 - 6.8 n. d. n. d. 100
열 멸균 후
6.8(pH 조정 없음) 0.44 6.16 93.40
5.0 0.27 0.87 98.85
4.5 n. d. 0.15 99.85
4.0 0.68 n. d. 99.32
3.5 1.87 n. d. 98.13
3.0 5.96 n. d. 94.04
열 멸균 전 및 후에 pH 조정된 0.66 M 락토스 용액에서 검출된 당의 상대량. pH 조정은 80%(v/v) 아세트산을 사용하여 실행하였다. HPLC에 의해 검출된 당의 백분율 양(곡선하 면적; AUC)을 나타낸다.
pH 상대적 조성 [%]
단당류 락툴로스 락토스
열 멸균 전
3.0 - 6.8 n. d. n. d. 100
열 멸균 후
6.8(pH 조정 없음) 0.44 6.16 93.40
5.0 0.21 1.13 98.65
4.5 n. d. 0.31 99.69
4.0 0.49 0.12 99.39
3.5 1.41 0.07 98.52
3.0 4.35 n. d. 95.65
실시예 2 - 열 멸균 전에 무기산을 이용하는 락토스의 산성화
226 g의 락토스를 물에 용해시킴으로써 0.66 M 락토스 용액을 제조하였다. 용액의 최종 부피는 1 리터였다. 30　℃ 내지 35 ℃의 온도에서 37%(v/v) 염산, 50%(v/v) 인산, 또는 96%(v/v) 황산을 사용함으로써 pH를 조정하였다. 그 후에, 수직형 고압멸균기(Systec VX-65, 독일 린덴 소재) 내에서 20 분 동안 121 ℃에서 용액을 멸균하였다. 열 멸균 전 및 후에 샘플을 채취하고 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 분석 전에 냉동 보관하였다. Shimadzu HPLC 시스템에 연결된 RID-10A 굴절률 검출기(Shimadzu, 독일 소재) 및 Waters XBridge Amide Column 3.5 μm(250 x 4.6 mm)(Eschborn, 독일 소재)을 사용하여 HPLC를 실행하였다. 30% 용매 A(이중 증류수 중의 50%(v/v) 아세토니트릴, 0.1%(v/v) NH4OH) 및 70% 용매 B(이중 증류수 중의 80%(v/v) 아세토니트릴, 0.1%(v/v) NH4OH)로 35 ℃ 및 1.4 mL min-1의 유속에서 등용매 용출을 실행하였다. 이온 교환 매트릭스(Strata ABW, Phenomenex) 상에서 고체상 추출에 의해 샘플을 청징화하였다. 10 마이크로리터의 샘플(1:5의 희석)을 컬럼에 적용하였다. 최종적으로, 검출된 당의 상대량을 결정하였다. 표 3, 표 4, 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 열 처리 전의 용액의 산성화를 증가시킨 결과로서 열 멸균은 락토스 이성체화의 감소를 유도하였다. pH 3.5 내지 3.0에서는 락툴로스 형성을 관찰할 수 없었다. 반면에, 락토스가 그의 단당류로 산-촉매 분해되는 것이 더 낮은 pH 값에 의해 증가되었지만 각각 인산 및 황산 또는 염산을 산성화에 사용한 경우에 pH 값 4.5 내지 4.0 또는 pH 5.0 내지 4.0에서는 없었다.
열 멸균 전 및 후에 pH 조정된 0.66 M 락토스 용액에서 검출된 당의 상대량. pH 조정은 37%(v/v) 염산을 사용하여 실행하였다. HPLC에 의해 검출된 당의 백분율 양(곡선하 면적; AUC)을 나타낸다.
pH 상대적 조성 [%]
단당류 락툴로스 락토스
열 멸균 전
3.0 - 6.8 n. d. n. d. 100
열 멸균 후
6.8(pH 조정 없음) 0.44 6.16 93.40
5.0 n. d. 0.57 99.43
4.5 n. d. 0.17 99.83
4.0 n. d. 0.20 99.80
3.5 1.50 n. d. 98.50
3.0 5.62 n. d. 94.38
열 멸균 전 및 후에 pH 조정된 0.66 M 락토스 용액에서 검출된 당의 상대량. pH 조정은 50%(v/v) 인산을 사용하여 실행하였다. HPLC에 의해 검출된 당의 백분율 양(곡선하 면적; AUC)을 나타낸다.
pH 상대적 조성 [%]
단당류 락툴로스 락토스
열 멸균 전
3.0 - 6.8 n. d. n. d. 100
열 멸균 후
6.8(pH 조정 없음) 0.44 6.16 93.40
5.0 0.30 0.49 99.21
4.5 n. d. 0.10 99.90
4.0 n. d. 0.08 99.92
3.5 1.40 n. d. 98.60
3.0 4.44 n. d. 95.56
열 멸균 전 및 후에 pH 조정된 0.66 M 락토스 용액에서 검출된 당의 상대량. pH 조정은 96%(v/v) 황산을 사용하여 실행하였다. HPLC에 의해 검출된 당의 백분율 양(곡선하 면적; AUC)을 나타낸다.
pH 상대적 조성 [%]
단당류 락툴로스 락토스
열 멸균 전
3.0 - 6.8 n. d. n. d. 100
열 멸균 후
6.8(pH 조정 없음) 0.43 6.34 93.24
5.0 0.26 0.67 99.05
4.5 n. d. 0.17 99.83
4.0 n. d. 0.17 99.82
3.5 1.11 n. d. 98.89
3.0 3.21 n. d. 96.79
실시예 3 - 2'-푸코실락토스의 개선된 생산 공정
유럽 특허 출원　제16　196　486호에 따라, GDP-푸코스의 데노보 합성(de novo synthesis)을 위한 효소(ManB, ManC, Gmd, WcaG), 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)의 이중기능성 L-푸코키나제/L-푸코스 1-포스페이트 구아닐릴트랜스페라제, 이. 콜라이:O126으로부터의 2-푸코실트랜스페라제 유전자 wbgL, 락토스 퍼미아제 유전자 lacY, 여시니아 베르코비에리(Yersinia bercovieri) ATCC 43970으로부터의 당 배출 수송체(sugar efflux transporter) yberc0001_9420, 피섬 세티범(Pisum sativum)으로부터의 프럭토스-1,6-비스포스페이트 알돌라제(fbaB) 및 이종 프럭토스-1,6-비스포스페이트 포스파타제(fbpase)를 과발현하는 조작된 이. 콜라이 BL21(DE3) ΔnagAb ΔwcaJ ΔfucIK ΔpfkA 균주를 사용하였다.
3 L 발효기 내에서 3 g/L KH2PO4, 12 g/L K2HPO4, 5 g/L(NH4)2SO4, 0.3 g/L 시트르산, 2　g/L MgSO4 × 7H2O, 0.1 g/L NaCl, 및 0.015 g/L CaCl2 × 6H2O와 함께 1 mL/L 미량 원소 용액(54.4 g/L 암모늄 페릭 시트레이트, 9.8 g/L MnCl2 × 4H2O, 1.6 g/L CoCl2 × 6H2O, 1 g/L CuCl2 × 2H2O, 1.9 g/L H3BO3, 9 g/L ZnSO4 × 7H2O, 1.1 g/L Na2MoO4 × 2H2O, 1.5 g/L Na2SeO3, 1.5 g/L NiSO4 × 6H2O), 단일 탄소 및 에너지 공급원으로서의 2%(v/v) 글리세롤과 더불어 60 mM의 열 멸균 락토스(이는 멸균 전에 96%(v/v) 황산을 이용하여 pH 3.0으로 산성화되었음)를 함유하는 미네랄 염 배지 중에 이. 콜라이 균주를 33 ℃에서 배양하였다. 25% 암모니아를 적정함으로써 pH를 7.0으로 유지하였다. 락토스가 결여된 기재된 배지 중에 성장시킨 예비-배양물로 0.1의 OD600으로 발효기를 접종하였다. 용존 산소 수준의 상승에 의해 나타나는, 배치 단계를 떠난 후에, 글리세롤 투입(60% v/v)과 더불어 0.66 M 락토스 투입(열 멸균 전에 96%(v/v) 황산을 사용하여 pH 3.0으로 산성화함)을 시작하였다. 발효 공정의 생산 단계 전체에 걸쳐 10-40 mM의 락토스 농도를 유지하였으며, HPLC-분석에 따라 조절하였다. 6-8 ml/L/h(시작 부피를 참조함)의 유속으로 글리세롤(60% v/v)을 투입하였다. 탱크 내의 충전 부피가 그의 최대값에 도달했을 때 발효를 중단하였다. 이 지점에서, 브로스의 배양 상청액에서 146 g/L의 2'-푸코실락토스 역가가 결정되었다.
산성화된 열 멸균 락토스 대신에 멸균-여과 락토스를 사용하는 2'-푸코실라코스 발효 공정의 과정 중에, 유사한 2'-푸코실락토스 역가가 달성되었다. 추가로, 멸균-여과 또는 열-멸균(산성화됨) 락토스를 이용하여 실행한 발효의 배양 브로스에서 검출된 부산물의 종류 및 양이 유사하였다. 산성화된 열-멸균 락토스가 발효에 제공된 경우에, 락툴로스, 에피락토스, 푸코실락툴로스, 또는 푸코실에피락토스 종류의 부산물과 더불어 열-멸균 락토스의 첨가로부터 기원할 수 있는 다른 부산물이 브로스에서 검출되지 않았다.

Claims (18)

  1. 열 처리 전 및/또는 열 처리 과정 중에 당류 수용액을 산성화하는 단계를 포함하는, 상기 당류 수용액의 열 처리시에 환원 당류를 함유하는 수용액 중의 상기 환원 당류의 이성체화를 저해하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    당류 수용액이 약 1 내지 약 6의 값을 가진 pH로, 바람직하게 약 2 내지 약 5의 값을 가진 pH로, 더욱 바람직하게 약 3 내지 약 4의 값을 가진 pH로 산성화되는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    적어도 하나의 산을 당류 수용액에 첨가함으로써 상기 당류 수용액이 산성화되는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    산이 염산, 황산, 아황산, 인산, 붕산, 불산(hydrofluoric acid), 브롬산, 과염소산, 요오드산, 및 탄산으로 구성된 그룹 중에서 바람직하게 선택된 무기산인 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    산이 모노카르복실산, 디카르복실산, 및 트리카르복실산으로 구성된 그룹 중에서 바람직하게 선택된 유기산인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    환원 당이 알도스, 이당류, 및 올리고당류, 바람직하게 락토스 및 말토스로 구성된 그룹 중에서 선택된 이당류로 구성된 그룹 중에서 선택되는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    열 처리가 산성화된 수용액을 약 30 ℃ 내지 약 150 ℃ 범위의 온도에 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는, 적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액.
  9. 제8항에 있어서,
    멸균 상태인 열 처리된 수용액.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    환원 당류가 10　mM 이상의 농도로, 바람직하게 100　mM 이상의 농도로, 더욱 바람직하게 0.66　M 이상의 농도로, 가장 바람직하게　1 M 이상의 농도로 바람직하게 존재하는 락토스인 열 처리된 수용액.
  11. 생물학적 산물을 생산하기 위한 생명공학적 생산 공정에서의, 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액의 용도.
  12. 제11항에 있어서,
    생명공학적 공정이 생체촉매 생산 공정 및 발효성 생산 공정으로 구성된 그룹 중에서 선택되는 용도.
  13. 제12항에 있어서,
    적어도 하나의 환원 당류를 함유하는 열 처리된 수용액이 락토스를 함유하는 습열(wet heat) 멸균 수용액인, 모유(human milk) 올리고당류의 발효성 생산을 위한 용도.
  14. -　 생물학적 산물을 생산할 수 있는 적어도 하나의 세포를 제공하는 단계;
    -　 적어도 하나의 세포가 생물학적 산물을 생산하도록 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 열 처리된 수용액을 함유하고/하거나 이로 보충된 발효 브로스(fermentation broth) 중에 적어도 하나의 세포를 배양하는 단계; 및
    -　 임의로 발효 브로스로부터 생물학적 산물을 정제하는 단계를 포함하는, 생물학적 산물의 생명공학적 생산 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    생물학적 산물이 모유 올리고당류이고, 열 처리된 수용액이 락토스를 함유하는 습열 멸균 수용액인 방법.
  16. 제14항 또는 제15항에 있어서,
    발효 공정의 말기에 생물학적 산물이 발효 브로스 중의 100 g/L 이상의 양으로, 바람직하게 발효 브로스 중의 150 g/L 이상의 양으로, 더욱 바람직하게 발효 브로스 중의 200 g/L 이상의 양으로 생산되는 방법.
  17. 모유 올리고당류, 락토수크로스, 및 락토비온산으로 구성된 그룹 중에서 바람직하게 선택되는, 제14항 또는 제15항에 따른 공정에 의해 제조되는 생물학적 산물.
  18. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항; 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항; 또는 제17항에 있어서, 생물학적 산물이 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 2',3-디푸코실락토스, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오푸코펜타오스 I, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토-N-푸코펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코실헥사오스 II, 파라-락토-N-푸코실헥사오스, 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 b, 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 c, 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 c, 디시알릴-락토-N-푸코펜타오스, 3-푸코실-3'-시알릴락토스, 3-푸코실-6'-시알릴락토스, 락토-N-네오디푸코헥사오스 I, 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 시알릴락토-N-테트라오스 LST-a, LST-b, LST-c, 및 디시알릴락토-N-테트라오스로 구성된 그룹 중에서 선택되는 모유 올리고당류인, 용도; 방법; 또는 생물학적 산물.
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