JP2020509769A - 熱処理による還元糖の異性化を抑制する方法 - Google Patents

Abstract

熱処理に先立って糖水溶液を酸性化することにより、糖水溶液の熱処理の際の、還元糖を含有する水溶液中の還元糖の異性化を抑制する方法、及びバイオ製品を生産するための該還元糖を含有する熱処理された水溶液の使用が開示される。

Description

本発明は、少なくとも1つの還元糖を含有する水溶液の熱処理を含む方法に関する。より詳細には、本発明は、還元糖を含有する水溶液の熱処理による水溶液中の還元糖の異性化を防止する方法に関する。

無菌環境を維持することは、しばしばバイオテクノロジー生産方法において細胞を培養するための必須条件である。しかし、これらの方法は、外来性の細菌、真菌又はウイルスによる異物の増殖をしばしば起こしやすい。外来性微生物に汚染されることは、生産性（原料、所望の生成物又は所望のバイオマスの劣化又は改変及び汚染物質の除去のためのバイオリアクターの停止期間の長期化による生産能力の低下）、生成物の品質及び生成物の安全性（異物の増殖自体による及び／又は望ましくない微生物によって産生される代謝産物による最終生成物の汚染による）を損なうため、製造方法に重大な影響を及ぼす。

微生物の偏在的な性質及び製造過程に対する多くの微生物の侵入ポイントに起因して、バイオ製品及びその製造過程に対する異物の増殖を防止することは困難である。バイオテクノロジー生産方法において使用されるべき、設備（例えば発酵槽の内部）、増殖培地、及び増殖培地に対する任意の補助剤を、滅菌するための様々な方法が、開発されている。

化合物又は組成物を滅菌するためのいくつかの方法が知られており、バイオテクノロジー生産方法で使用される供給物から外来性微生物を除去するために用いられている。そのような方法には、ガス滅菌（例えばオゾン又はエチレンオキシドを用いる）、放射線滅菌（例えば紫外線照射又はガンマ線照射）、輝線／パルス光滅菌、並びに液体及び溶液の、特に、熱感受性であるか又は少なくとも1つの熱感受性化合物を含有する液体及び溶液の、滅菌濾過が、含まれる。

あらゆる耐熱性供給物の熱処理は、最も信頼性が高く効果的な滅菌方法であることが知られており、湿式加熱は、加熱滅菌を達成するために最も広く使用されている。湿式加熱（蒸気）滅菌は、滅菌する要素を加圧蒸気にしばらく曝すことを意味する。設備及び供給物の滅菌に使用される典型的な湿式加熱滅菌プロトコルは、要素を１１５〜１４０℃で高圧飽和蒸気に約６０〜３分間曝す。これらの滅菌プロトコルは、滅菌される原料、溶液又は表面のバイオバーデン及び性質に依存して変動し得る。

基本的に、不適切な滅菌方法による成分の損傷は、バイオテクノロジー生産方法の品質、安全性又は生産性に影響を及ぼす可能性があるため、避ける必要がある。特に、流体は、熱、照射又は薬品を用いる滅菌法に起因して、種々の化学反応を受け得る。

このような化学反応の複雑さは、微生物負荷を減少させるか、又はミルク中の酵素を不活性化し、それによってミルクの貯蔵寿命を延ばすために典型的に使用される、熱処理ミルクによって例示される。１２１．１℃で２０分間の従来の滅菌では、ミルクの色と味に影響するメイラード反応が起こることが知られている。さらに、タンパク質又はビタミンの変性又は不活性化、並びにアルド糖とアミノ酸又はアミノ基含有物質との反応は、ミルクの熱処理によって起こることが知られている。また、ミルクの主要成分であるラクトース（４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−グルコピラノース、ＣＡＳ番号：６３−４２−３）は、熱処理によりラクツロース（４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−Ｄ−フルクトフラノース、ＣＡＳ番号：４６１８−１８−２）へと異性化し、さらにグルコース及びガラクトースに並びにさらに酸などの分解産物に分解することもよく知られている。この種の異性化は塩基性ｐＨによって促進され、Ｌｏｂｒｙ ｄｅ Ｂｒｕｙｎ−Ａｌｂｅｒｄａ ｖａｎ Ｅｋｅｎｓｔｅｉｎ転位としても知られる。

ミルクの質及び組成に対する熱の望ましくない影響を制限する試みにおいて、ミルクを１４０℃に数秒から数分間暴露する「超高温処理」、又はミルクを最高７４℃の温度に加熱する「低温殺菌」などの代替殺菌方法が使用される。それにもかかわらず、より低い程度ではあるが、望ましくない熱に媒介される反応が、これらの代替の滅菌方法中にも起こる。

これは、１２０℃で１０分間の滅菌の前に、６．７０の初期ｐＨを有する原料スキムミルクのｐＨ値を６．５９〜６．７２の値に調整することによってさらに改善することができた。これは、元のミルク中のラクツロース形成と比較して、ｐＨ６．５９において２８％ラクツロース形成を減少させ、ｐＨ６．７２において９％ラクツロース形成を増加させた。

２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、３’−シアリルラクトース又は６’−シアリルラクトースのようなヒト乳オリゴ糖のバイオテクノロジー生産において、ラクトースは、典型的に、所望のＨＭＯを生産するさらなるグリコシル化ステップのための最初の受容体分子として使用される。発酵ブロス中の異物の増殖を防ぐために、供給されるラクトースは滅菌されなければならない。しかし、ラクツロースは乳児用調製粉乳又は前記ＨＭＯを補充される任意の他の栄養製品中に存在してはならない公知の緩下剤であるため、発酵ブロス中にラクツロースが存在することは、回避されなければならない。さらに、ラクツロースは、代替受容体分子としてＨＭＯ産生細菌によって使用され得るため、天然には存在しないオリゴ糖が生じかねない。

熱処理に代わるものとして、ラクトース溶液を濾過により滅菌することが可能である。典型的には、１ｍＭ〜１Ｍのラクトースを含有する溶液が滅菌濾過される。しかし、工業的規模の生産に必要なろ過による大量の溶液の滅菌は、費用がかかり、時間がかかり、加熱滅菌と比較して信頼性が低い。

したがって、ラクトースをラクツロースに変換することなく、又はわずかな量のラクトースをラクツロースに変換するだけで、ラクトースを滅菌する、信頼性の高いより便利な方法が、必要である。

この目的は、その熱処理に先立って糖溶液を酸性化する原理がラクトース以外の他の糖にも同様に適用することができるにもかかわらず、ラクトース溶液を熱に曝す前及び／又は曝す過程でラクトース溶液の酸性ｐＨを調節する方法によって達成された。

第１の態様では、本発明は、水溶液の熱処理の前及び／又は過程で水溶液を酸性化することにより、水溶液の熱処理の際の、還元糖を含む水溶液中の還元糖の異性化を、抑制する方法を、提供する。

第２の態様では、本発明は、少なくとも１つの還元糖を含有する熱処理された水溶液を提供する。

第３の態様において、本発明は、少なくとも１つの還元糖を含有する熱処理された水溶液の使用であって、バイオ製品のバイオテクノロジー生産における使用を提供する。

第４の態様では、本発明は、少なくとも１つの還元糖を含有する熱処理された水溶液が用いられる、バイオ製品の製造方法を提供する。

第５の態様において、本発明は、少なくとも１つの還元糖を含有する熱処理された水溶液を利用するバイオテクノロジー生産によって生産されるバイオ製品を提供する。

さらなる態様において、本発明は、少なくとも１つの還元糖を含有する熱処理された水溶液を利用するバイオテクノロジー生産によって生産されるバイオ製品の、配合物を製造するための使用を、提供する。

別のさらなる態様では、本発明は、少なくとも１つの還元糖を含有する熱処理された水溶液を利用するバイオテクノロジー生産によって生産されたバイオ製品を含む、配合物を、提供する。

加熱滅菌前のラクトースを含有する水溶液のクロマトグラムを示す。 加熱滅菌後のラクトースを含有する水溶液のクロマトグラムを示す。この水溶液は加熱滅菌前に酸性化されなかった。 標準として使用された種々の特定の糖のクロマトグラムを示す。 加熱殺菌前のラクトースを含む水溶液のクロマトグラムである。 加熱殺菌後のラクトースを含む水溶液のクロマトグラムである。この水溶液は、ラクトースを含有する水溶液に硫酸を加えることによって加熱滅菌する前に酸性化された。 標準として使用された種々の特定の糖のクロマトグラムを示す。

第１の態様によれば、糖水溶液の熱処理の際、還元糖を含有する水溶液（糖水溶液）中の還元糖の異性化を抑制する方法であって、前記糖水溶液の熱処理の前及び／又は過程で、前記糖水溶液を酸性化するステップを含む方法が提供される。

本明細書で使用する「還元糖」という用語は、遊離のアルデヒド基を有するので、還元剤として作用することができる任意の糖（ｓｕｇａｒ）又は糖類（ｓａｃｃｈａｒｉｄｅ）を指す。還元糖は、単糖、二糖及びオリゴ糖を含む。すべての単糖は還元糖であり、アルデヒド基をもつアルドースとケトン基をもつケトースに分類できる。ケトースは還元糖として働くことができる前に、まずアルドースに互変異性化しなければならない。二糖は２つの単糖残基から形成され、オリゴ糖は３〜７つの単糖残基から形成される。二糖及びオリゴ糖は還元型と非還元型のどちらかに分類できる。ラクトース及びマルトースのような還元二糖は、グリコシド結合に関与する二つのアノマー炭素のうちの１つしかもたず、アルデヒド基をもつ開鎖型に変換できることを意味する。

追加の及び／又は代替の実施形態では、還元糖は、アルドース、二糖及びオリゴ糖からなる群から選択される。

本明細書で使用する「アルドース」という用語は、１分子当たりアルデヒド基を１つだけ含む単糖を指す。アルドースの例は、Ｄ−（＋）−グリセルアルデヒド、Ｄ−（−)−エリトロース、Ｄ−(−)−トレオース、Ｄ−(−)−リボース、Ｄ−(−）−アラビノース、Ｄ−（＋）−キシロース、Ｄ−（−）−リキソース、Ｄ−（＋）−アロース、Ｄ−（＋）−アルトロース、Ｄ−（＋）−グルコース、Ｄ−（＋）−マンノース、Ｄ−（−)−グロース、Ｄ−(−）−イドース、Ｄ−（＋）−ガラクトース、及びＤ−（＋）−タロースである。

追加の及び／又は代替の実施形態において、二糖は、ラクトース、マルトース、トレハロース、セロビオース、キトビオース、コージビオース、ニゲロース、イソマルトース、ソホロース、ラミナリビオース、ゲンチビオース、ツラノース、マツロース（ｍａｔｕｌｏｓｅ）、パラチノース、ゲンチビオース、マンノビオース、メリビオース、メリビウロース、ルチノース、ルチヌロース（ｒｕｔｉｎｕｌｏｓｅ）及びキシロビオースからなる群から選択される。

本明細書で使用する「オリゴ糖」という用語は、３、４、５、６、又は７個の単糖残基からなる糖を指し、したがって、三糖、四糖、五糖、六糖、及び七糖を含む。

糖水溶液を得るために、一定量の少なくとも１つの還元糖を供給水に溶解する。前記水は、蒸留水、二重蒸留水、脱イオン水、地下水、河川水、海水、水道水、都市用水、及び生理食塩水含有水からなる群から選択され得る。本明細書で使用する「生理食塩水含有水」という用語は、１つ以上の塩の水溶液を指す。追加の及び／又は代替の実施形態では、糖水溶液は、タンパク質、ポリペプチド、核酸（ＤＮＡ及び／又はＲＮＡなど）及び脂質（脂肪酸、モノグリセロール、ジグリセロール及び／又はトリグリセロールなど）からなる群から選択される１つ以上を含まない。

本方法の実施形態において、糖水溶液は、約１〜約６の値を有するｐＨ、好ましくは約２〜約５の値を有するｐＨ、より好ましくは約３〜約４の値を有するｐＨに酸性化される。約３〜約５の値を有する糖水溶液のｐＨは、還元糖の異性化が抑制されるか、又は防止さえされる一方で、前記還元糖の分解産物の形成が無視できるので、特に有利であることが見出された。

追加の及び／又は代替の実施形態では、糖水溶液は、酸を糖水溶液に添加することによって酸性化される。酸は、還元糖との望ましくない化学反応を引き起こさない任意の酸であり得る。そのような望ましくない化学反応の例は、硝酸をラクトース水溶液に加えた場合の粘液酸の形成である。

還元糖がガラクトース又はガラクトース含有糖である場合、ガラクトース又はラクトースなどのガラクトース含有化合物の硝酸酸化は粘液酸をもたらすので、無機酸が硝酸（又は亜硝酸）でないという条件で、酸は有機酸及び無機酸の群から選択され得る。

追加の及び／又は代替の実施形態では、糖水溶液を酸性化するための少なくとも１つの酸は、無機酸又は鉱酸である。無機酸は、糖水溶液に添加される量で、糖と不注意に反応しない適切な無機酸である。例えば、ラクトース水溶液に硝酸を添加すると、粘液酸が生じ得る。無機酸は、好ましくは、塩酸、硫酸、亜硫酸、リン酸、ホウ酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、過塩素酸、ヨウ化水素酸、及び炭酸からなる群から選択される。

無機酸が炭酸である実施形態において、糖水溶液は、加圧容器内で二酸化炭素によりガス処理されるという点において酸性化することができる。

追加の及び／又は代替の実施形態では、糖水溶液を酸性化するための少なくとも１つの酸は、有機酸である。有機酸は、モノカルボン酸、ジカルボン酸、及びトリカルボン酸からなる群から選択することができる。

追加の及び／又は代替の実施形態では、モノカルボン酸は、炭酸、ギ酸（メタン酸）、酢酸（エタン酸）、プロピオン酸（プロパン酸）、酪酸（ブタン酸）、及び吉草酸（ペンタン酸）からなる群から選択されるが、これらに限定されない。

追加の及び／又は代替の実施形態において、ジカルボン酸は、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、リンゴ酸、フマル酸、グルタコン酸、ムコン酸、及びシトラコン酸からなる群から選択される。

追加の及び／又は代替の実施形態では、トリカルボン酸は、クエン酸、イソクエン酸、及びアコニット酸からなる群から選択される。

糖溶液のｐＨを酸性値に調整することにより、水溶液中の還元糖の熱処理が、還元糖類の異性化なしで、又は少なくとも低減した異性化を伴って、可能になる。

本明細書で使用する「熱処理」という用語は、高温、すなわち、室温（２１℃）を超える温度で糖水溶液を加温又は加熱及び／又は維持することを包含する。糖水溶液の熱処理は、酸性化後及び／又は酸性化中に糖水溶液を約３０℃、約４０℃、約５０℃、約６０℃、約７０℃、さらには約８０℃の温度に加熱することを含み、任意選択で、糖水溶液をさらに高い温度に加熱した後に、長期間、すなわち数時間又は数日間、例えば、限定されないが、約２０時間、約３０時間、約４０時間、約５０時間、約６０時間、約７２時間、さらにはそれよりも長く、糖水溶液をそのような温度に維持することも含む。

還元糖を含有する水溶液を、そのような高温で、還元糖の異性化を伴わずに、又は還元糖の著しく減少した異性化を伴って、加熱及び／又は保つことは、例えば、より多量の糖を所与の量の水に溶解し、それによって、水溶液中の糖濃度を増加させ、所望の最終糖濃度を得るためにバッチに供給される糖水溶液の容積を減少させる選択肢のような、複数の利点を提供する。それに加えて及び／又はそれに代えて、糖水溶液の粘度は、糖水溶液を高温に加熱／維持することにより低下させることができ、それによって糖水溶液の取扱い及び／又は、例えばメンブランフィルターを通してのポンピングが容易になる。

本明細書で使用する「熱処理」という用語は、糖水溶液を、糖水溶液を滅菌するのに適した高温である時間加熱及び／又は維持することも包含する。したがって、「熱処理」は、糖水溶液を約１１５℃〜１５０℃の範囲（これらに限定されない）の温度に加熱し、最長約６０分間までその温度を保つことも含む。

糖水溶液を滅菌するための熱処理の実施形態において、糖水溶液は、高圧蒸気殺菌法によって滅菌される。高圧蒸気殺菌法は、飽和した過熱蒸気を利用する細菌破壊の最も重要な方法の１つである。滅菌される物体上での蒸気の凝縮は、微生物に不可逆的な損傷を引き起こすエネルギーを放出する。この目的のために、オートクレーブの内部は、最初の立ち上がり時間中に換気される。その際、大気は内部から追い出され、飽和した過熱蒸気に置き換わる。換気は、流れ工程又は分画換気を用いて行い、換気が完了すると、換気弁は閉じられる。これは、補償時間の開始を知らせる。この期間の後、滅菌されるアイテムの各ポイントは、飽和蒸気の影響により所要の温度に達する。この後、実際の滅菌段階が開始される。滅菌の持続時間は、細菌負荷と滅菌温度の両方に依存する。１２１．１℃（２５０°Ｆ）で１５分間〜３０分間の高圧蒸気殺菌法が標準とされている。原核生物及び真核生物、ウイルス／バクテリオファージを含む栄養型は、通常６５〜１００℃の温度で数分以内に不活性化されるが、胞子などの生存型は１４０℃までの温度で処理しなければならない。プリオンを不活化又は破壊するためには、１３２℃〜１３４℃及び３ｂａｒの圧力で少なくとも３０分が必要である。その後の冷却段階、ひいてはオートクレーブサイクルの終了は、滅菌時間後に始まる。

糖水溶液を滅菌するための熱処理の代替の実施形態では、糖水溶液は、１４０℃を主点として１３０℃〜１５０℃の温度に水溶液を加熱することを含む、連続滅菌法である「超高温処理」と呼ばれる方法によって滅菌される。対応する保持時間は、滅菌される溶液の性質に応じて、８〜４０秒、時には５分まで変化し得る。

糖水溶液を滅菌するための熱処理のさらに別の実施形態では、糖水溶液は、高温／短時間（ＨＴＳＴ）低温殺菌に供され、そこでは溶液は、７１．５℃〜７４℃、好ましくは７２℃までの温度まで約１５秒から約３０秒間加熱され、該熱処理に供されている間に、制御された連続流れの中で移動する。

糖水溶液を滅菌するための熱処理のさらに別の実施形態では、糖水溶液は「フラッシュ低温殺菌」に供され、糖水溶液は１５秒間７１．７℃に供される。

糖水溶液をこれらの熱処理のいずれかに供する前に、及び／又は糖水溶液を滅菌するためのその熱処理の過程において、還元糖の水溶液を酸性化することは、その熱処理の際の水溶液中の還元糖の異性化を抑制するか、又は妨げることさえある。

したがって、第２の態様によれば、第１の態様による方法、すなわち、糖水溶液の熱処理の前及び／又は過程で糖水溶液の酸性化を含む、還元糖の水溶液中の還元糖の異性化を抑制する方法によって得られる少なくとも１つの還元糖を含有する熱処理された水溶液が提供される。

熱処理の前及び／又は過程で糖水溶液の酸性化によって得られ、同一の熱処理前に酸性化されなかった同じ還元糖の類似の水溶液と比較して、少なくとも１つの還元糖の望ましくない異性化生成物を全く又は少なくともより少ない量しか含有しない、少なくとも１つの還元糖を含有する熱処理水溶液。

第２の態様の実施形態では、還元糖を含有する水溶液は、滅菌水溶液である。還元糖を含有する滅菌水溶液は、糖水溶液を滅菌するための糖水溶液の熱処理を含む、先に本明細書に記載した還元糖の異性化を抑制する方法によって得られる。したがって、水溶液は熱処理によって滅菌されている。

追加の及び／又は代替の実施形態では、還元糖を含有する水溶液は、高温、すなわち、約３０℃、約４０℃、約５０℃、約６０℃、約７０℃又はさらに約８０℃の温度を有し、室温で水に溶解することができる還元糖の量よりも多い量の還元糖を含有する。例えば、酸性化されたラクトース水溶液の温度が約４０℃〜約６０℃に維持される場合、≧１０ｍＭの濃度、好ましくは≧１００ｍＭの濃度、より好ましくは≧０．６６Ｍの濃度、最も好ましくは≧１Ｍの濃度のラクトースを含有する水溶液が提供される。

室温で水に溶解することができる糖の量よりも多い量の、例えばラクトースのような、少なくとも１つの還元糖を含有する糖水溶液は、先に本明細書に記載した滅菌のための熱処理によって滅菌され、滅菌糖水溶液が維持される所望の高温まで冷却された滅菌ラクトース水溶液であることができる。

第３の態様によれば、本発明は、バイオ製品のバイオテクノロジー生産における、本明細書において先に記載した還元糖を含有する熱処理された水溶液の使用を、提供する。バイオ製品の製造

一実施形態において、バイオ製品のバイオテクノロジー生産における、還元糖を含有する熱処理された水溶液の使用は、生体触媒生産方法における使用を含む。

本明細書で使用される「生体触媒生産方法」という用語は、１つ以上の精製又は単離された酵素をインビトロ反応において１つ以上の抽出物と接触させて、１つ以上の抽出物を所望のバイオ製品に変換する、バイオ製品を生産するための方法を指すと理解される。

代替の実施形態において、還元糖を含有する熱処理された水溶液の使用は、発酵生産方法におけるその使用を含む。本明細書で使用する「発酵生産方法」という用語は、微生物によって合成されるバイオ製品又は特殊産物を産生することを目的として、微生物を培地又はブロス中で増殖させる方法を指す。

少なくとも１つの還元糖を含有する熱処理された水溶液であって、糖水溶液の熱処理の前及び／又は過程において、先に本明細書に記載したように酸性化された糖水溶液を使用することは、とりわけ、還元糖の望ましくない異性化生成物が糖水溶液中に全く存在しないか又は少なくしか存在せず、かつ熱処理前に酸性化されなかった類似の糖水溶液と比較して、望ましくない異性化生成物がバイオテクノロジー生産方法に、全く又はわずかしか供給されないという点で、有利である。したがって、バイオテクノロジー生産方法で使用される前に、熱処理された糖水溶液から望ましくない異性化生成物を除去する必要はない。

第４の態様によれば、本発明は、バイオ製品のバイオテクノロジー生産のための方法を提供する。

バイオ製品のバイオテクノロジー生産のための方法の実施形態において、該方法は、生体触媒生産方法である。この方法は以下のステップ、すなわち
−少なくとも１つの精製酵素を準備するステップ；
−少なくとも１つの精製酵素を、熱処理の前及び／又は熱処理の過程で先に本明細書に記載されたように酸性化された、熱処理された糖水溶液の存在下で１つ以上の抽出物と接触させて、１つ以上の抽出物を所望のバイオ製品に変換するステップ；及び
−任意に、バイオ製品を精製するステップ
を含む。

一実施形態において、糖水溶液の少なくとも１つの還元糖は、生体触媒生産方法の抽出物を表す。

バイオテクノロジー生産方法の代替の実施形態では、この方法は発酵生産方法である。

「発酵」又は「発酵性」とは、特定の化学生成物、すなわち「バイオ製品」を産生することを目的とした、増殖培地（発酵ブロス）上又は中での微生物の大量増殖を指す。この目的のために、１種又は限られた数の微生物株の細胞を、微生物が望ましくない不純物の産生が限定された所望の産生を実施するのに最適な条件下で、バイオリアクター（発酵槽）中で増殖させる。バイオリアクター内の環境条件、例えば温度、栄養素濃度、ｐＨ、及び溶存ガス（特に好気的発酵のための酸素）は、生物の増殖及び生産性に影響を与え、したがって、必要に応じて監視、制御、及び調節される。

したがって、バイオ製品の発酵生産の方法は、以下のステップ、すなわち
−バイオ製品を産生することができる細胞を準備するステップ；
−少なくとも１つの細胞がバイオ製品を産生するために、少なくとも１つの細胞を、少なくとも１つの還元糖を含有する熱処理された水溶液を含有する、及び／又は補充された発酵ブロス中で培養するステップ；及び
−任意選択的に発酵ブロスからバイオ製品を精製するステップ
を含む。

第３の態様による使用及び／又は第４の態様による方法の実施形態では、前記生細胞は、原核細胞又は真核細胞である。適切な細胞には、酵母、細菌、古細菌、真菌、昆虫細胞、植物細胞、及び哺乳動物細胞（例えばヒト細胞及び細胞株）を含む動物細胞が含まれる。

追加の及び／又は代替の実施形態において、原核細胞は、細菌細胞であり、好ましくは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スポロラクトバチルス種（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．）、マイクロモモスポラ種（Ｍｉｃｒｏｍｏｍｏｓｐｏｒａ ｓｐｐ．）、マイクロコッカス種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、ロードコッカス種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐｐ．）、及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からなる群から選択される属から選択される。適切な細菌種は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンツス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィズム・ビフィズム（Ｂｉｆｉｄｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・セルロリチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉ）、クロストリジウム・オートエタノゲヌム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｙｌｏｇｅｎｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・サーモフィルス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、エルウィニア・ハービコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ)）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・ジェンセニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトバチルス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｃｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ ｃｉｔｒｅａ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、プロプリオニバクテリウム・フロインデライシイ（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）及びキサントモナス・キャンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である。

追加の及び／又は代替の実施形態において、真核細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、又は哺乳動物細胞である。酵母細胞は、好ましくはサッカロマイセス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、特にサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロマイコプシス種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ ｓｐ．）、ピキア種（Ｐｉｃｈｉａ ｓｐ．）、特にピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｓｐ．）、クルイベロマイセス種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）、ヤロウィア種（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｓｐ．）、ロードトルラ種（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ ｓｐ．）、及びシゾサッカロマイセス種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）からなる群から選択される。

第３の態様による使用及び／又は第４の態様による方法の実施形態において、前記バイオ製品はヒト乳オリゴ糖である。ヒト乳オリゴ糖は、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ネオフロペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコシルヘキサオースＩＩ、パラ−ラクト−Ｎ−フコシルヘキサオース、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｂ、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｃ、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｃ、ジシアリル−ラクト−Ｎ−フコペンタオース、３−フコシル−３’−シアリルラクトース、−３−フコシル−６’−シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−ネオジフコヘキサオース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、シアリルラクト−Ｎ−テトラオーセススＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃ及びジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースからなる群から選択することができる。

第３の態様による使用及び／又は第４の態様による方法の追加の及び／又は代替の実施形態において、前記還元糖はラクトースである。この実施形態は、所望のヒト乳オリゴ糖を産生する生細胞のための発酵ブロスにラクトースを供給しなければならない特別な利点を有する。第１の態様による方法によるラクトース水溶液の加熱滅菌の際にラクツロースの形成を低減又は回避することができることで、ＨＭＯ調製物が栄養食品、特に幼児用調製粉乳、薬効のある食品又は栄養補助食品を製造するために使用される場合、ＨＭＯ調製物からラクツロースを除去する必要がなくなる。

少なくとも１つの還元糖を含有する熱処理された糖水溶液であって、発酵生産方法におけるその熱処理の前及び／又は過程において、先に本明細書において記載したように酸性化された糖水溶液を使用することは、さらなる利点を提供する。第一に、本発明は、還元糖の異性化なしで、又は減少した異性化を伴いながら、加熱滅菌法により、還元糖を含有する水溶液を滅菌することを可能にする。したがって、特に数立方メートルのような大量の糖水溶液を滅菌する必要がある場合、還元糖を含有する水溶液を、加熱滅菌よりも信頼性が低い（例えば、バクテリオファージの除去に関して）滅菌濾過によって、滅菌する必要がない。さらに、大量の加熱滅菌は滅菌濾過よりも経済的である。第二に、本発明は、少なくとも１つの還元糖を含有する糖水溶液を提供することを可能にし、ここで、少なくとも１つの還元糖の濃度は、室温における少なくとも１つの還元糖の飽和濃度よりも高く、これは、糖水溶液を、高温、すなわち、室温より高い温度で加熱及び維持することができるからである。また、糖水溶液を高温に保つことによって、糖水溶液の粘度が低下し、その結果、例えば、配管又はホースを通して糖水溶液をポンピングする際に、糖水溶液の取扱いが容易になる。第三に、糖濃度が増加した糖水溶液を提供することができることで、発酵生産方法においてより高い産物収率を得ることができる。これは発酵槽の容量が限定的であるからであり、発酵槽中の発酵ブロスの容量が、とりわけ、培養される細胞による所望のバイオ製品の産生のために必要とされる糖水溶液の発酵ブロスへの供給に起因して、発酵方法の間に増加するからである。糖水溶液中の糖の濃度が高いほど、発酵ブロス中の少なくとも１つの還元糖の所定の濃度を獲得及び／又は維持するために発酵ブロスに添加される必要がある糖水溶液の容量は少なくなる。したがって、増加した糖濃度を有する本発明に従う糖水溶液を用いて、与えられた発酵槽中の発酵ブロス中のより高い糖濃度が達成され得るか、又は、供給のために利用可能な発酵槽の容量がよりゆっくりと枯渇するので、より長い期間、所定の糖濃度が維持され得る。これは、次に、所望のバイオ製品を産生するための細胞に、より多くの還元糖を提供し、したがって、1回のバッチ発酵において得ることができる所望のバイオ製品の収率を増加させる。よって、所望のバイオ製品は、発酵方法の終わりに、発酵ブロス中で≧１００ｇ／Ｌの量、好ましくは発酵ブロス中で≧１５０ｇ／Ｌの量、より好ましくは発酵ブロス中で≧２００ｇ／Ｌの量で生産することができる。例えば、１００ｇ／Ｌを超える、すなわち約１５０ｇ／Ｌの２’−フコシルラクトースの量は、加熱滅菌され、酸性された０．６６Ｍラクトース水溶液を使用した場合に得られ、発酵ブロスに供給される水溶液中のラクトース濃度がさらに高くなると、さらに高い収率が得られる。

第３の態様による使用及び／又は第４の態様による方法の別の実施形態では、少なくとも１つの還元糖はラクトースであり、前記バイオ製品はラクトスクロース及びラクトビオン酸からなる群から選択される。

したがって、第５の態様によれば、本発明は、第４の態様による方法の１つによって生産されたバイオ製品を提供する。

ある態様において、バイオ製品は、ヒト乳オリゴ糖、好ましくは２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコシルヘキサオースＩＩ、パラ−ラクト−Ｎ−フコシルヘキサオース、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｂ、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｃ、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｃ、ジシアリル−ラクト−Ｎ−フコペンタオース、３−フコシル−３’−シアリルラクトース、３−フコシル−６’−シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−ネオジフコヘキサオースＩ、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃ及びジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースからなる群から選択されるヒト乳オリゴ糖である。

代替の実施形態において、バイオ製品は、ラクトスクロース及びラクトビオン酸、又は上記のヒト乳オリゴ糖の誘導体からなる群から選択される。

さらなる態様によれば、本発明は、配合物を製造するためのバイオ製品の使用を提供する。

配合物の製造のためのバイオ製品の使用の実施形態において、バイオ製品は、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコシルヘキサオースＩＩ、パラ−ラクト−Ｎ−フコシルヘキサオース、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｂ、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｃ、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｃ、ジシアリル−ラクト−Ｎ−フコペンタオース、３−フコシル−３’−シアリルラクトース、３−フコシル−６’−シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−ネオジフコヘキサオースＩ、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃ及びジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースからなる群から選択されるヒト乳オリゴ糖である。この実施形態における配合物は、栄養配合物、好ましくは乳児用調製粉乳、薬効のある食品及び栄養補助食品からなる群から選択される。

還元糖がラクトースであるという条件で、第１の態様による異性化を抑制する方法は、ヒト乳オリゴ糖の発酵生産のためにラクツロースなしで、又は減少した量のラクツロースを伴い加熱滅菌されたラクトース溶液を提供することができる。次いで、そのようなヒト乳オリゴ糖は、エピラクトース、ラクツロース及び／又はフコシルラクツロースのようなラクツロースの誘導体を含有しないか、又は少量しか含有しない（ＨＭＯ調製物からラクツロース又はその誘導体を除去する必要はない）栄養配合物、好ましくは乳児用調製粉乳の製造に用いることができる。

さらなる態様によれば、先に本明細書に記載したバイオテクノロジー生産方法によって生産された少なくとも1つのバイオ製品を含む配合物が提供される。そのような配合物は、好ましくは、栄養配合物、好ましくは乳児用調製粉乳、薬効のある食品及び栄養補助食品からなる群から選択される。

本発明は、特定の実施形態に関して、また図面を参照して記載されるが、本発明は、それらに限定されず、特許請求項の範囲によってのみ限定される。さらに、明細書及び特許請求の範囲における「第１」、「第２」などの用語は、類似の要素を区別するために用いられ、必ずしも、時間的、空間的、ランク付け、又は他の任意の様式のいずれかで、順序を記述するために用いられるわけではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載される又は例示される以外の順序で操作可能であることが理解されるべきである。

特許請求の範囲で使用される「含む」という用語は、その後に列挙される手段に限定されると解釈されるべきではなく、他の要素又はステップを除外しないことに留意されたい。したがって、これは、言及されるような記載された特徴、整数、ステップ又は構成要素の存在を特定するものとして解釈されるべきであるが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ又は構成要素、又はそれらの群の存在又は追加を排除するものではない。したがって、「手段Ａ及びＢを含む装置」という表現の範囲は、要素Ａ及びＢのみからなる装置に限定されるべきではない。それは、本発明に関して、装置の単に関連する要素がＡ及びＢであることを意味する。

本明細書全体を通して「一実施形態」又は「ある実施形態」というときは、その実施形態に関連して記載される特定の特徴、構造又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の全体にわたって様々な箇所における「一実施形態において」又は「ある実施形態において」という語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態を指すわけではなく、同じ実施形態を指すこともある。さらに、特定の特徴、構造、又は特性は、１つ以上の実施形態において本開示から当業者に明らかであろうように、任意の適切な様式で組み合わされ得る。

同様に、本発明の例示的実施形態の説明において、本発明の様々な特徴は、開示を合理化し、様々な発明的態様の１つ以上を理解するのを助ける目的で、時には、単一の実施形態、図、又はその説明にまとめられることが理解されるべきである。しかし、本開示方法は、請求項に係る発明が、各請求項において明示的に記載されるよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映するものとして解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が示すように、決して先に開示した単一の実施形態のすべての特徴に発明的要素が存在するわけではない。したがって、詳細な説明に続く特許請求の範囲は、ここにこの詳細な説明に明示的に組み込まれ、各請求項は、本発明の別個の実施形態としてそれ自体で有効である。

さらに、本明細書に記載されたいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含むが、他の特徴を含まず、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、当業者によって理解されるように、本発明の範囲内であり、異なる実施形態を形成することを意味する。例えば、以下の特許請求の範囲において、請求項に係る実施形態のいずれも、任意の組み合わせで使用することができる。

さらに、実施形態のいくつかは、コンピュータシステムのプロセッサによって、又はその機能を実行する他の手段によって実行され得る方法又は方法の要素の組合せとして、本明細書に記載される。したがって、そのような方法又は方法の要素を実行するために必要な命令を有するプロセッサは、その方法又は方法の要素を実行するための手段を形成する。さらに、装置の実施形態の本明細書に記載される要素は、本発明を実行する目的でその要素によって実行される機能を実行するための手段の一例である。

本明細書で提供される説明及び図面において、多数の具体的な詳細が示される。しかし、本発明の実施形態を、これらの特定の詳細なしで実施し得るということが理解される。他の例において、周知の方法、構造及び技術は、この説明の理解を不明瞭にしないために、詳細に示されていない。

本発明は、本発明のいくつかの実施形態の詳細な説明によって記載される。本発明の他の実施形態は、本発明の真の精神又は技術的教示から逸脱することなく、当業者の知識に従って構成することができることは明らかであり、本発明は、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定される。

［実施例１−加熱滅菌前の有機酸によるラクトースの酸性化］
０．６６Ｍラクトース溶液を、２２６ｇのラクトースを水に溶解することによって調製した。溶液の最終容量は１リットルであった。３０℃〜３５℃の温度で、５０％（ｗ／ｖ）クエン酸又は９９％（ｖ／ｖ）酢酸を用いてｐＨを調整した。その後、溶液を垂直オートクレーブ（Ｓｙｓｔｅｃ ＶＸ−６５、ドイツ、リンデン）中、１２１℃で２０分間滅菌した。加熱滅菌の前後に試料を採取し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析の前に凍結保存した。ＨＰＬＣは、ＲＩＤ−１０Ａ屈折率検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ドイツ）及びＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣシステムに接続したＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ａｍｉｄｅ Ｃｏｌｕｍｎ ３．５μｍ（２５０×４．６ｍｍ）（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、ドイツ）を用いて実施した。３０％溶媒Ａ（二重蒸留水中の５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ＮＨ_４ＯＨ）及び７０％溶媒Ｂ（二重蒸留水中の８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ＮＨ_４ＯＨ）を３５℃及び流速１．４ｍＬ／分で定組成溶離を行った。イオン交換マトリックス（Ｓｔｒａｔａ ＡＢＷ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で固相抽出により試料を洗浄した。１０マイクロリットルの試料（１：５の希釈）をカラムに施した。最後に、検出された糖の相対量を測定した。表１及び２に示すように、加熱滅菌により誘導されたラクトース異性化は、熱処理前の溶液のｐＨ値が減少するにつれて減少した。クエン酸又は酢酸でそれぞれ酸性化を行った場合、ｐＨ４．０〜３．０又はｐＨ３．０ではラクツロース形成は観察されなかった。酸触媒によるラクトースの単糖への分解はより低いｐＨ値で増加したが、ｐＨ４．５では検出できなかった。

［実施例２−加熱滅菌前の無機酸によるラクトースの酸性化］
０．６６Ｍラクトース溶液を、２２６ｇのラクトースを水に溶解することによって調製した。溶液の最終容量は１リットルであった。３０℃〜３５℃の温度で、３７％（ｖ／ｖ）塩酸、５０％（ｖ／ｖ）リン酸又は９６％（ｖ／ｖ）硫酸を用いてｐＨを調整した。その後、溶液を垂直オートクレーブ（Ｓｙｓｔｅｃ ＶＸ−６５、ドイツ、リンデン）中、１２１℃で２０分間滅菌した。加熱滅菌の前後に試料を採取し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による分析の前に凍結保存した。ＨＰＬＣは、ＲＩＤ−１０Ａ屈折率検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、ドイツ）及びＳｈｉｍａｄｚｕ ＨＰＬＣシステムに接続したＷａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ Ａｍｉｄｅ Ｃｏｌｕｍｎ ３．５μｍ（２５０×４．６ｍｍ）（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ、ドイツ）を用いて実施した。３０％溶媒Ａ（二重蒸留水中の５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ＮＨ_４ＯＨ）及び７０％溶媒Ｂ（二重蒸留水中の８０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル、０．１％（ｖ／ｖ）ＮＨ_４ＯＨ）を３５℃及び流速１．４ｍＬ／分で定組成溶離を行った。イオン交換マトリックス（Ｓｔｒａｔａ ＡＢＷ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で固相抽出により試料を洗浄した。１０マイクロリットルの試料（１：５の希釈）をカラムに施した。最後に、検出された糖の相対量を測定した。表３、４及び５に示すように、加熱滅菌により誘導されたラクトース異性化は、熱処理前の溶液の酸性化の増加の結果として減少した。ｐＨ３．５〜３．０ではラクツロースの形成は観察されなかった。対照的に、リン酸及び硫酸又は塩酸をそれぞれ酸性化に使用した場合、酸触媒によるラクトースの単糖への分解は、より低いｐＨ値では増加したが、ｐＨ値４．５〜４．０又はｐＨ５．０〜４．０では、分解が存在しなかった。

［実施例３−２’−フコシルラクトースの改良された生産方法］
欧州特許出願第１６１９６４８６に従って、ＧＤＰ−フコース（ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、ＷｃａＧ）、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）の二機能性Ｌ−フコキナーゼ／Ｌ−フコース１−ホスファトグアニルトランスフェラーゼ、大腸菌Ｏ１２６の２−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ｗｂｇＬ、ラクトースパーミアーゼ遺伝子ｌａｃＹ、エルシニア・ベルコビエリ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｂｅｒｃｏｖｉｅｒｉ）ＡＴＣＣ ４３９７０の糖排出トランスポーターｙｂｅｒｃ０００１＿９４２０、フルクトース−１，６−ビスホスフェートアルドラーゼ（ｆｂａＢ）及びプスム・サティブム（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ）からの非相同フルクトース−１，６−ビスホスフェートホスファターゼ（ｆｂｐａｓｅ）の新規合成のための酵素を過剰発現する操作された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３） ΔｎａｇＡｂ ΔｗｃａＪ ΔｆｕｃＩＫ ΔｐｆｋＡ株を用いた。

大腸菌株を３３℃の３Ｌ発酵槽で、３ｇ／ＬのＫＨ_２ＰＯ_４、１２ｇ／ＬのＫ_２ＨＰＯ_４、５ｇ/Ｌの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．３ｇ／Ｌのクエン酸、２ｇ／ＬのＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、０．１ｇ／ＬのＮａＣｌ及び０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏを１ｍＬ／Ｌの微量元素溶液（５４．４ｇ／Ｌのクエン酸第二鉄アンモニウム、９．８ｇ／ＬのＭｎＣｌ_２・４Ｈ_２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＣｏＣｌ_２・６Ｈ_２Ｏ、１ｇ／ＬのＣｕＣｌ_２・２Ｈ_２Ｏ、１．９ｇ／ＬのＨ_３ＢＯ_３、９ｇ／ＬのＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ、１．１ｇ／ＬのＮａ_２ＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ、１．５ｇ／ＬのＮａ_２ＳｅＯ_３、１．５ｇ／ＬのＮｉＳＯ_４・６Ｈ_２Ｏ）、単一の炭素及びエネルギー源としての２％（ｖ／ｖ）のグリセロール、及び９６％（ｖ／ｖ）の硫酸でｐＨ３．０に酸性化した６０ｍＭの加熱滅菌されたラクトースを含む鉱物塩培地中で培養した。２５％アンモニアで滴定することによりｐＨを７．０に維持した。発酵槽に、記載した、ただしラクトースを含まない培地で増殖させたプレカルチャーを０．１のＯＤ_６００まで接種した。溶存酸素濃度の上昇により示されるバッチ相を残した後、グリセロール供給（６０％ｖ／ｖ）及び０．６６Ｍラクトース供給（加熱滅菌前に９６％（ｖ／ｖ）硫酸を用いてｐＨ３．０に酸性化）を開始した。ＨＰＬＣ−分析に従って調節された発酵方法の産生段階を通して、１０〜４０ｍＭのラクトース濃度を維持した。グリセロール（６０％ｖ／ｖ）を６〜８ｍｌ／Ｌ／時の流速で供給した（出発容量を参照）。タンクの充填容量が最大になった時点で発酵を停止した。この時点で、ブロスの培養上清中の２’−フコシルラクトース力価１４６ｇ／Ｌを測定した。

酸性化した、加熱滅菌したラクトースの代わりに、滅菌濾過したラクトースを用いた２’−フコシルラクトース発酵方法の過程で、同等の２’−フコシルラクトース力価を得た。さらに、滅菌濾過又は加熱滅菌（酸性化）ラクトースで実施した発酵培養液中に検出された副産物の種類と量は同等であった。ラクツロース、エピラクトース、フコシルラクツロース又はフコシルエピラクトースのような副産物並びに加熱滅菌ラクトースの添加に由来する可能性のある他の副産物は、発酵のために酸性化し、加熱滅菌したラクトースを供給した場合、ブロス中に検出されなかった。

Claims (18)

1. 糖水溶液の熱処理の際、還元糖を含有する前記水溶液中の還元糖の異性化を抑制する方法であって、該糖水溶液を該熱処理前及び／又は過程で酸性化するステップを含む方法。
2. 前記糖水溶液が、約１〜約６の値を有するｐＨに、好ましくは約２〜約５の値を有するｐＨに、より好ましくは約３〜約４の値を有するｐＨに酸性化される、請求項１に記載の方法。
3. 前記糖水溶液に少なくとも１つの酸を添加することによって、前記糖水溶液を酸性化する、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記酸が、好ましくは塩酸、硫酸、亜硫酸、リン酸、ホウ酸、フッ化水素酸、臭化水素酸、過塩素酸、ヨウ化水素酸及び炭酸からなる群から選択される無機酸である、請求項３に記載の方法。
5. 前記酸が、好ましくはモノカルボン酸、ジカルボン酸、及びトリカルボン酸からなる群から選択される有機酸である、請求項３に記載の方法。
6. 前記還元糖が、アルドース、二糖及びオリゴ糖からなる群から選択され、好ましくは、ラクトース及びマルトースからなる群から選択される二糖である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記熱処理が、酸性化された前記水溶液を約３０℃〜約１５０℃の範囲の温度に曝すことを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 少なくとも1つの還元糖を含有する熱処理された水溶液であって、該水溶液が、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法によって得られる、熱処理された水溶液。
9. 前記水溶液が滅菌されている、請求項８に記載の熱処理された水溶液。
10. 前記還元糖がラクトースであり、好ましくは≧１０ｍＭの濃度で、好ましくは≧１００ｍＭの濃度で、より好ましくは≧０．６６Ｍの濃度で、最も好ましくは≧１Ｍの濃度で存在する、請求項８又は９に記載の熱処理された水溶液。
11. バイオ製品を製造するためのバイオテクノロジー生産方法における、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の少なくとも1つの還元糖を含有する熱処理された水溶液の使用。
12. 前記バイオテクノロジー方法が、生体触媒生産方法及び発酵生産方法からなる群から選択される、請求項１１に記載の使用。
13. 少なくとも1つの還元糖を含有する熱処理された水溶液が、ラクトースを含有する湿式加熱滅菌水溶液である、ヒト乳オリゴ糖の発酵生産のための請求項１２に記載の使用。
14. バイオ製品のバイオテクノロジー生産方法であって、以下のステップ、すなわち、
    −バイオ製品を産生することができる少なくとも１つの細胞を準備するステップ；
    −該少なくとも１つの細胞が該バイオ製品を産生するために、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の熱処理された水溶液を含有する、及び／又は該水溶液を補充された発酵ブロス中で該少なくとも１つの細胞を培養するステップ；及び
    −任意選択的に該発酵ブロスから該バイオ製品を精製するステップ
    を含む方法。
15. 前記バイオ製品がヒト乳オリゴ糖であり、前記熱処理された水溶液がラクトースを含有する湿式加熱滅菌水溶液である、請求項１４に記載の方法。
16. 前記バイオ製品が、前記発酵方法の終了時に前記発酵ブロス中で≧１００ｇ／Ｌの量、好ましくは前記発酵ブロス中で≧１５０ｇ／Ｌの量、より好ましくは前記発酵ブロス中で≧２００ｇ／Ｌの量で生産される、請求項１４又は１５に記載の方法。
17. 前記バイオ製品が、好ましくはヒト乳オリゴ糖、ラクトスクロース及びラクトビオン酸からなる群から選択される、請求項１４又は１５に記載の方法により製造されるバイオ製品。
18. バイオ製品が、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−ＮネオフロペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコヘキサオースＩＩ、パラ−ラクト−Ｎ−フコシルヘキサオース、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｂ、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｃ、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｃ、ジシアリル−ラクト−Ｎ−フコペンタオース、３−フコシル−３’−シアリルラクトース、−３−フコシル−６’−シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−ネオジフコヘキサオースＩ、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースＬＳＴ−ａ、ＬＳＴ−ｂ、ＬＳＴ−ｃ及びジシアリルラクト−Ｎ−テトラオースからなる群から選択されるヒト乳オリゴ糖である、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の使用、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法又は請求項１７に記載のバイオ製品。

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