BR112019017840A2 - método de inibir a isomerização de um sacarídeo redutor após tratamento térmico - Google Patents

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Abstract

é divulgado um método de inibir isomerização de um sacarídeo redutor em uma solução aquosa contendo o referido sacarídeo redutor após tratamento térmico da referida solução aquosa de sacarídeo por acidificar a solução aquosa de sacarídeo antes de seu tratamento térmico, e o uso da solução aquosa termicamente tratada contendo o referido sacarídeo redutor para produzir um produto biológico.

Description

MÉTODO DE INIBIR A ISOMERIZAÇÃO DE UM SACARÍDEO REDUTOR APÓS TRATAMENTO TÉRMICO, SOLUÇÃO AQUOSA TERMICAMENTE TRATADA CONTENDO PELO MENOS UM SACARÍDEO REDUTOR, USO DA MESMA, MÉTODO DE PRODUÇÃO BIOTECNOLÓGICO DE UM PRODUTO BIOLÓGICO E PRODUTO BIOLÓGICO FABRICADO PELO MESMO [001] A presente invenção refere-se a métodos envolvendo um tratamento térmico de uma solução aquosa contendo pelo menos um sacarídeo redutor. Mais especificamente, a invenção refere-se a métodos de prevenção da isomerização do sacarídeo redutor em uma solução aquosa após um tratamento térmico de solução aquosa contendo o sacarídeo redutor.
ANTECEDENTES [002] A manutenção de um ambiente estéril é frequentemente um prérequisito para o cultivo de células em processos de produção biotecnológica. Entretanto, estes processos são frequentemente propensos a crescimento estranho por bactérias acidentais, fungos ou vírus. Ser contaminado com microorganismos acidentais tem um severo impacto sobre o processo de fabricação já que prejudica a produtividade (menor capacidade de produção devido a uma degradação ou modificação das matérias-primas, o produto desejado ou a biomassa desejada e períodos de paralisação prolongados do biorreator para a remoção do contaminante), qualidade do produto e segurança do produto (através de contaminações do produto final devido ao próprio crescimento estranho e/ou devido a metabólitos produzidos pelos micro-organismos indesejáveis).
[003] Prevenção de crescimento estranho sobre um produto biológico assim como no processo de sua produção é desafiador devido à natureza ubíqua de micro-organismos e pontos múltiplos de entrada microbiana no processo de produção. Vários métodos foram desenvolvidos para a esterilização de
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2/31 equipamento (por exemplo, o interior de um fermentador), meios de crescimento bem como quaisquer suplementos para os meios de crescimento que têm de ser usados em um processo de produção biotecnológica.
[004] Vários métodos são conhecidos para a esterilização de compostos ou composições e são empregados para a eliminação de micro-organismos acidentais a partir de suprimentos a serem usados em processos de produção biotecnológica. Tais métodos incluem esterilização a gás (por exemplo, com ozônio ou óxido de etileno), esterilização por radiação (por exemplo, radiação ultravioleta ou radiação gama), esterilização de luz brilhante/luz pulsada, bem como filtração estéril de líquidos e soluções, em particular de líquidos e soluções que são sensíveis ao calor ou contêm pelo menos um composto sensível ao calor.
[005] O tratamento térmico de quaisquer suprimentos tolerantes ao calor é conhecido como sendo o método de esterilização mais confiável e eficaz e o calor úmido é mais amplamente usado para a obtenção de esterilização por calor. Meios de esterilização por calor úmido (vapor) significa expor os componentes a serem esterilizados a vapor pressurizado por algum tempo. Os protocolos típicos de esterilização por calor úmido que são usados para a esterilização de equipamentos e suprimentos são submetidos a vapor saturado de alta pressão a 115°C a 140°C por cerca de 60 a 3 minutos. Estes protocolos de esterilização podem variar dependendo da biocarga e natureza da matériaprima, solução ou superfície a ser esterilizada.
[006] Fundamentalmente, o dano a um componente por um método de esterilização inadequado pode afetar a qualidade, segurança ou produtividade de um processo de produção biotecnológica, assim, deve ser evitado. Especialmente fluidos podem sofrer várias reações químicas devido a métodos de esterilização usando calor, irradiação ou produtos químicos.
[007] A complexidade de tais reações químicas é exemplificada pelo
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3/31 tratamento térmico do leite que é tipicamente empregado para reduzir a carga microbiana ou para inativar enzimas no leite, e assim prolongar a vida de prateleira do leite. Sabe-se que as reações de Maillard ocorrem as quais afetam a cor e o sabor do leite após a sua esterilização convencional em 121,1°C por 20 minutos. Além disso, sabe-se que a desnaturação ou inativação de proteínas ou vitaminas assim como as reações de aldo-açúcares com aminoácidos ou substâncias contendo grupo amino ocorre devido ao tratamento térmico do leite. Além disso, sabe-se também que lactose (4-O-3-D-galactopiranosil-Dglicopiranose, número CAS: 63-42-3), um constituinte substancial do leite, isomeriza em lactulose (4-O-3-D-galactopiranosil-D-frutofuranose, número CAS: 4618-18-2) devido ao tratamento térmico e é adicionalmente degradada em glucose e galactose, bem como em produtos de degradação adicionais, como ácidos. Este tipo de isomerização é favorecido pelo pH básico e é também conhecido como a transformação Lobry de Bruyn-Alberda van Ekenstein.
[008] Em tentativas de limitar os efeitos indesejáveis do calor para a qualidade e composição do leite, métodos alternativos de esterilização são usados como tratamento por temperatura ultra alta , em que o leite é exposto a 140°C por alguns segundos a poucos minutos, ou pasteurização a baixa temperatura em que o leite é aquecido a uma temperatura de até 74°C. Não obstante, as reações mediadas por calor indesejadas também ocorrem durante estes métodos alternativos de esterilização, embora em menor extensão.
[009] Isto ainda pode ser melhorado pelo ajuste dos valores de pH do leite desnatado bruto, tendo um pH inicial de 6,70, a valores entre 6,59 e 6,72 antes de sua esterilização a 120°C por 10 minutos. Isto levou a uma formação de lactulose reduzida em 28% em pH 6,59 e uma formação de lactulose aumentada de 9% em pH 6,72 em comparação com a formação de lactulose no leite original.
[0010] Na produção biotecnológica de oligossacarídeos do leite humano
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4/31 como 2'-fucosil-lactose, 3-fucosil4actose, lacto-N-tetraose, lacto-N-neotetraose, 3'-sialil-lactose ou 6'-sialil-lactose, lactose é tipicamente usada como molécula receptora inicial para etapas de glicosilação adicionais que levam à produção do HMO desejado. Para impedir o crescimento estranho no meio de fermentação, a lactose sendo fornecida tem que ser esterilizada. Entretanto, a presença de lactulose no meio de fermentação deve ser evitada uma vez que é um laxante conhecido que não deve estar presente em fórmula infantil ou qualquer outro produto nutricional sendo suplementado com os HMOs. Além disso, lactulose pode ser usada pela bactéria produtora de HMO como uma molécula aceptora alternativa, assim, levando a oligossacarídeos que não estão presentes na natureza.
[0011] Como uma alternativa ao tratamento térmico, é possível esterilizar uma solução de lactose por filtração. Tipicamente, soluções contendo entre 1 mM e 1 M de lactose são filtradas estéreis. Entretanto, a esterilização de grandes quantidades de uma solução por filtração, conforme necessário para a produção em escala industrial, é cara, demorada e menos confiável, em comparação com a esterilização por calor. Portanto, uma maneira confiável e mais conveniente de esterilização de lactose com nenhuma ou somente conversão de quantidades diminutas de lactose em lactulose é necessária.
[0012] O objetivo tem sido alcançado por um método em que um pH ácido de uma solução de lactose é ajustado antes e/ou no curso de expor a solução de lactose ao calor, não obstante, o princípio de acidificar uma solução de açúcar antes de seu tratamento térmico pode ser aplicado a outros sacarídeos além da lactose também.
Sumário [0013] Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece um método de inibir a isomerização de um sacarídeo redutor em uma solução aquosa
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5/31 contendo o referido sacarídeo redutor após tratamento térmico da solução aquosa por acidificar a solução aquosa antes e/ou no curso de seu tratamento térmico.
[0014] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece uma solução aquosa termicamente tratada contendo pelo menos um sacarídeo redutor.
[0015] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece o uso de uma solução aquosa termicamente tratada contendo pelo menos um sacarídeo redutor em uma produção biotecnológica de um produto biológico.
[0016] Em um quarto aspecto, a invenção fornece métodos de produção de um produto biológico, em que uma solução aquosa termicamente tratada contendo pelo menos um sacarídeo redutor é empregada.
[0017] Em um quinto aspecto, a invenção fornece um produto biológico produzido por produção biotecnológica utilizando uma solução aquosa termicamente tratada contendo pelo menos um sacarídeo redutor.
[0018] Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso do produto biológico produzido por produção biotecnológica utilizando uma solução aquosa termicamente tratada contendo pelo menos um sacarídeo redutor para a produção de uma formulação.
[0019] Em outro aspecto adicional, a invenção fornece uma formulação compreendendo um produto biológico que foi produzido por uma produção biotecnológica utilizando uma solução aquosa termicamente tratada contendo pelo menos um sacarídeo redutor.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [0020] A Figura 1 exibe os cromatogramas de uma solução aquosa contendo lactose (A) antes da esterilização por calor e (B) após a esterilização por calor. A solução aquosa não foi acidificada antes da sua esterilização por calor. A Figura IC mostra um cromatograma de vários sacarídeos específicos
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6/31 usados como padrões.
[0021] A Figura 2 exibe os cromatogramas de uma solução aquosa contendo lactose (A) antes da esterilização por calor e (B) após a esterilização por calor. A solução aquosa foi acidificada antes da sua esterilização por calor pela adição de ácido sulfúrico à solução aquosa contendo lactose. A Figura 2C mostra um cromatograma de vários sacarídeos específicos usados como padrões.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0022] De acordo com o primeiro aspecto, é fornecido um método de inibir a isomerização de um sacarídeo redutor em uma solução aquosa contendo o referido sacarídeo redutor (solução aquosa de sacarídeo) após o tratamento térmico da solução aquosa de sacarídeo, o método compreendendo a etapa de acidificar a solução aquosa de sacarídeo antes e/ou no decorrer de seu tratamento térmico.
[0023] O termo sacarídeo redutor, como usado na presente invenção, refere-se a qualquer açúcar ou sacarídeo que seja capaz de atuar como um agente redutor, porque tem um grupo aldeído livre. O sacarídeo redutor compreende monossacarídeos, dissacarídeos e oligossacarídeos. Todos os monossacarídeos são açúcares redutores, os mesmos podem ser classificados em aldoses, que têm um grupo aldeído, e cetoses, que têm um grupo cetona. Cetoses devem primeiro tautomerizar em aldoses antes que possam atuar como açúcares redutores. Dissacarídeos são formados a partir de dois resíduos de monossacarídeo e oligossacarídeos são formados de três a sete resíduos de monossacarídeo. Dissacarídeos e oligossacarídeos podem ser classificados como redutores ou não redutores. Dissacarídeos redutores como lactose e maltose têm apenas um dos dois carbonos anoméricos envolvidos na ligação glicosídica, significando que podem converter em uma forma de cadeia aberta com um
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7/31 grupo aldeído.
[0024] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o sacarídeo redutor é selecionado a partir do grupo consistindo em aldoses, dissacarídeos e oligossacarídeos.
[0025] O termo aldose, conforme usado na presente invenção, refere-se a monossacarídeos que contêm apenas um grupo aldeído por molécula. Exemplos de aldoses são D-(+)-gliceraldeído, D-(-)-eritrose, D-(-)-treose, D-(-)ribose, D-(-)-arabinose, D-(+)-xilose, D-(-)-lixose, D-(+)-alose, D-(+)-altrose, D-(+)glicose, D-(+)-manose, D-(-)-gulose, D-(-)-idose, D-(+)-galactose, e D-(+)-talose.
[0026] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o dissacarídeo é selecionado a partir do grupo consistindo em lactose, maltose, trealose, celobiose, quitobiose, kojibiose, nigerose, isomaltose, soforose, laminaribiose, gentibiose, turanose, matulose, palatinose, gentibiose, manobiose, melibiose, melibiulose, rutinose, rutinulose e xilobiose.
[0027] O termo oligossacarídeo, como usado na presente invenção, refere-se a sacarídeos que consistem em 3, 4, 5, 6 ou 7 resíduos de monossacarídeo, e assim compreende trissacarídeos, tetrassacarídeos, pentassacarídeos, hexassacarídeos e heptassacarídeos.
[0028] Para a obtenção da solução aquosa de sacarídeo, uma quantidade de pelo menos um sacarídeo redutor é dissolvida em um fornecimento de água. A água pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em água destilada, água destilada duas vezes, água deionizada, água subterrânea, água de rio, água do mar, água da torneira, água municipal e água contendo solução salina. O termo água contendo solução salina, como usado na presente invenção, refere-se a uma solução aquosa de um ou mais sais. Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a solução aquosa de sacarídeo não compreende um ou mais selecionados a partir do grupo consistindo em proteínas, polipeptídios,
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8/31 ácidos nucleicos (como DNA e/ou RNA) e lipídeos (como ácidos graxos, mono -, di- e/ou trigliceróis).
[0029] Em uma modalidade do método, a solução aquosa de sacarídeo é acidificada para um pH que tem um valor entre cerca de 1 e cerca de 6, preferivelmente para um pH tendo um valor entre cerca de 2 a cerca de 5, e mais preferivelmente para um pH tendo um valor entre cerca de 3 e cerca de 4. Um pH da solução aquosa de sacarídeo tendo um valor entre cerca de 3 e cerca de 5 apresentou vantagem específica, porque a isomerização do sacarídeo redutor é inibida ou mesmo evitada enquanto a formação de produtos de degradação do referido sacarídeo redutor é desprezível.
[0030] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a solução aquosa de sacarídeo é acidificada pela adição de um ácido à solução aquosa de sacarídeo. O ácido pode ser qualquer ácido que não conduza a uma reação química indesejada com o sacarídeo redutor. Um exemplo de tal reação química indesejada é a formação de ácido múcico se ácido nítrico for adicionado a uma solução aquosa de lactose.
[0031] O ácido pode ser selecionado a partir do grupo de ácidos orgânicos e ácidos inorgânicos, com a provisão de que o ácido inorgânico não seja ácido nítrico (ou ácido nitroso) se o sacarídeo redutor for galactose ou um sacarídeo contendo galactose, visto que a oxidação de ácido nítrico da galactose ou compostos contendo galactose, como lactose, leva a ácido múcico.
[0032] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o pelo menos um ácido para acidificar a solução aquosa de sacarídeo é um ácido inorgânico ou ácido mineral. O ácido inorgânico é um ácido inorgânico adequado que - na quantidade a ser adicionada às soluções aquosas de sacarídeo- não reage inadvertidamente com o sacarídeo. Por exemplo, a adição de ácido nítrico a uma solução aquosa de lactose pode levar a ácido múcico. O ácido inorgânico é
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9/31 preferivelmente selecionado a partir do grupo consistindo em ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido sulfuroso, ácido fosfórico, ácido bórico, ácido fluorídrico, ácido bromídrico, ácido perclórico, ácido iodídrico, e ácido carbônico.
[0033] Na modalidade em que o ácido inorgânico é o ácido carbônico, a solução aquosa de sacarídeo pode ser acidificada em que a solução aquosa de sacarídeo é gaseificada com dióxido de carbono em um recipiente pressurizado.
[0034] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o pelo menos um ácido para acidificar a solução aquosa de sacarídeo é um ácido orgânico. O ácido orgânico pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em ácidos monocarboxílicos, ácidos dicarboxílicos e ácidos tricarboxílicos [0035] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o ácido monocarboxílico é selecionado a partir do, mas não limitado ao, grupo consistindo em ácido carbônico, ácido fórmico (ácido metanóico), ácido acético (ácido etanóico), ácido propriônico (ácido propanóico), ácido butírico (ácido butanóico) e ácido valérico (ácido pentanóico).
[0036] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o ácido dicarboxílico é selecionado a partir do grupo consistindo em ácido oxálico, ácido malônico, ácido succínico, ácido glutárico, ácido adípico, ácido maléico, ácido málico, ácido fumárico, ácido glutacônico, ácido mucônico e ácido citracônico.
[0037] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, o ácido tricarboxílico é selecionado a partir do grupo consistindo em ácido cítrico, ácido isocítrico e ácido aconítico.
[0038] O ajuste do pH da solução de sacarídeo a um valor ácido permite um tratamento térmico do sacarídeo redutor na solução aquosa sem ou pelo menos com uma isomerização reduzida do sacarídeo redutor.
[0039] O termo tratamento térmico, como usado na presente invenção, abrange aquecimento ou aquecimento e/ou manutenção da solução aquosa de
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10/31 sacarídeo a uma temperatura elevada, isto é, uma temperatura acima da temperatura ambiente (21°C). Tratamento térmico da solução aquosa de sacarídeo compreende aquecimento da solução aquosa de sacarídeo após acidificação e/ou durante acidificação até uma temperatura de cerca de 30°C, cerca de 40°C, cerca de 50°C, cerca de 60°C, cerca de 70°C ou mesmo cerca de 80°C e também inclui a manutenção da solução aquosa de sacarídeo a uma tal temperatura - opcionalmente após a mesma ter sido aquecida até temperaturas ainda mais altas - por um período prolongado de tempo, isto é, por várias horas ou mesmo dias, como - por exemplo, mas não limitados a - cerca de 20 horas, cerca de 30 horas, cerca de 40 horas, cerca de 50 horas, cerca de 60 horas, cerca de 72 horas ou mesmo mais tempo.
[0040] O aquecimento e/ou a manutenção de uma solução aquosa contendo um sacarídeo redutor a tais temperaturas elevadas sem isomerização ou com isomerização significativamente reduzida do sacarídeo redutor proporciona múltiplas vantagens, como, -por exemplo - a opção de dissolver uma quantidade maior do sacarídeo em uma dada quantidade de água, desse modo aumentando a concentração de sacarídeo na solução aquosa e reduzindo o volume de uma solução aquosa de sacarídeo a ser fornecida a uma batelada para obtenção de uma concentração final de sacarídeo desejada. Adicionalmente e/ou alternativamente, a viscosidade da solução aquosa de sacarídeo pode ser diminuída por aquecimento/manutenção da solução aquosa de sacarídeo a uma temperatura elevada, facilitando assim a manipulação e/ou o bombeamento da solução aquosa de sacarídeo, por exemplo, através de um filtro de membrana.
[0041] O termo tratamento térmico como usado na presente invenção também abrange aquecimento e/ou manutenção da solução aquosa de sacarídeo por algum tempo a uma temperatura elevada que é adequada para a
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11/31 esterilização da solução aquosa de sacarídeo. Portanto, tratamento térmico também compreende o aquecimento da solução aquosa de sacarídeo a uma temperatura na faixa de cerca de, mas não limitada a, 115 a 150°C e manter a temperatura por até cerca de 60 minutos.
[0042] Em uma modalidade do tratamento térmico para a esterilização da solução aquosa de sacarídeo, a solução aquosa de sacarídeo é esterilizada por autoclavagem. A autoclavagem é um dos métodos mais importantes de destruição de germes em que é utilizado vapor saturado, superaquecido. A condensação de vapor sobre o objeto a ser esterilizado libera energia que causa dano irreversível aos micro-organismos. Para esta finalidade, o interior da autoclave é ventilado durante o tempo de elevação inicial. Ao fazer isso, o ar atmosférico é deslocado do interior e substituído por vapor saturado, superaquecido. A ventilação ocorre utilizando um processo de fluxo ou através de ventilação fracionada; uma vez que a ventilação está completa, a válvula de ventilação é fechada. Isto marca o início do tempo de compensação. Após este período, cada ponto do item a ser esterilizado alcança a temperatura necessária devido ao efeito do vapor saturado. Após isto, a fase de esterilização real começa. A duração da esterilização depende tanto da carga de germe como da temperatura de esterilização. Autoclavagem em 121,1°C (250°F) por 15 minutos a 30 minutos é visto como padrão. Formas vegetativas, abrangendo organismos procarióticos e eucarióticos bem como vírus/bacteriófagos, podem ser normalmente inativados dentro de alguns minutos a temperaturas de 65°C 100°C enquanto as formas de sobrevivência tal como esporos podem ter que ser tratadas a temperaturas de até 140°C. Príons requerem pelo menos 30 minutos em 132°C a 134° C e pressão de 300 kPa (3 bar) para serem inativados ou destruídos. A fase de resfriamento subsequente, e assim o término do ciclo de autoclave, começa após o tempo de esterilização.
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12/31 [0043] Em uma modalidade alternativa do tratamento térmico para a esterilização da solução aquosa de sacarídeo, a solução aquosa de sacarídeo é esterilizada por um processo chamado tratamento por temperatura ultra alta, um método de esterilização contínua, o qual compreende o aquecimento da solução aquosa a uma temperatura de 130°C - 150°C com 140°C como um ponto principal. O tempo de retenção correspondente pode variar de 8 a 40 segundos, ocasionalmente até 5 minutos, dependendo das propriedades da solução a ser esterilizada.
[0044] Ainda em outra modalidade do tratamento térmico para a esterilização da solução aquosa de sacarídeo, a solução aquosa de sacarídeo é submetida a uma pasteurização em alta temperatura/tempo curto (HTST), em que a solução é aquecida a uma temperatura entre 71,5°C e 74°C, de preferência a 72°C por cerca de 15 segundos até cerca de 30 segundos, e é movida em um fluxo contínuo controlado enquanto submetido ao tratamento térmico.
[0045] Ainda em outra modalidade do tratamento térmico para a esterilização da solução aquosa de sacarídeo, a solução aquosa de sacarídeo é submetida à pasteurização instantânea , em que a solução aquosa de sacarídeo é submetida a 71,7°C por 15 segundos.
[0046] Acidificação de uma solução aquosa de um sacarídeo redutor antes de submeter a solução aquosa de sacarídeo a qualquer um destes tratamentos térmicos e/ou no curso de seu tratamento térmico para esterilização da solução aquosa de sacarídeo inibe ou mesmo impede a isomerização do sacarídeo redutor na solução aquosa após seu tratamento térmico.
[0047] Assim, de acordo com o segundo aspecto, uma solução aquosa termicamente tratada contendo pelo menos um sacarídeo redutor é fornecida que é obtida pelo método de acordo com o primeiro aspecto, isto é, por um método de inibir a isomerização do sacarídeo redutor em uma solução aquosa
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13/31 do sacarídeo redutor, incluindo a acidificar a solução aquosa de sacarideo antes e/ou no curso de um tratamento térmico da solução aquosa de sacarideo.
[0048] A solução aquosa termicamente tratada contendo pelo menos um sacarídeo redutor que é obtido pela acidificação da solução aquosa de sacarídeo antes e/ou no curso de seu tratamento térmico e que contém nenhuma ou pelo menos quantidades menores de produtos de isomerização indesejáveis de pelo menos um sacarídeo redutor em comparação com uma solução aquosa similar do mesmo sacarídeo redutor que não foi acidificada antes de um tratamento térmico idêntico.
[0049] Em uma modalidade do segundo aspecto, a solução aquosa contendo um sacarídeo redutor é uma solução aquosa estéril. A solução aquosa estéril contendo um sacarídeo redutor é obtida pelo método de inibir a isomerização do sacarídeo redutor como descrito anteriormente, incluindo o tratamento térmico da solução aquosa de sacarídeo para a esterilização da solução aquosa de sacarídeo. Assim, a solução aquosa foi esterilizada pelo tratamento térmico.
[0050] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a solução aquosa contendo um sacarídeo redutor tem uma temperatura elevada, isto é, uma temperatura de cerca de 30°C, cerca de 40°C, cerca de 50° C, cerca de 60°C, cerca de 70°C ou mesmo cerca de 80°C, e contém o sacarídeo redutor em uma quantidade que é maior do que a quantidade do sacarídeo redutor que pode ser dissolvido em água à temperatura ambiente. Por exemplo, uma solução aquosa contendo lactose em uma concentração de >10 mM, de preferência, em uma concentração de > 100 mM, mais preferivelmente em uma concentração de > 0,66 M, mais preferivelmente em uma concentração de > 1 M, é fornecido se a temperatura da solução aquosa de lactose acidificada for mantida em cerca de 40°C a cerca de 60° C.
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14/31 [0051] A solução de sacarideo aquosa contendo pelo menos um sacarídeo redutor, tal como, por exemplo, lactose, em uma quantidade que é maior do que a quantidade do sacarídeo que pode ser dissolvida em água à temperatura ambiente, pode ser uma solução aquosa de lactose estéril que foi esterilizada por meio de um tratamento térmico para esterilização conforme descrito na presente invenção anteriormente e deixada resfriar até a temperatura elevada desejada na qual a solução aquosa de sacarídeo estéril é mantida.
[0052] De acordo com o terceiro aspecto, a invenção fornece o uso de uma solução aquosa termicamente tratada contendo um sacarídeo redutor como descrito anteriormente em uma produção biotecnológica de um produto biológico. A produção do produto biológico.
[0053] Em uma modalidade, o uso da solução aquosa termicamente tratada contendo um sacarídeo redutor em uma produção biotecnológica de um produto biológico compreende o uso em um processo de produção biocatalítico.
[0054] O termo processo de produção biocatalítico, conforme usado na presente invenção é entendido como ao que se refere a um processo para a produção de um produto biológico em que uma ou mais enzimas purificadas ou isoladas são colocadas em contato com um ou mais edutos em uma reação in vitro para converter um ou mais edutos no produto biológico desejado.
[0055] Em uma modalidade alternativa, o uso da solução aquosa termicamente tratada contendo um sacarídeo redutor compreende o uso em um processo de produção fermentativo. O termo processo de produção fermentativo, conforme usado na presente invenção, refere-se a um processo em que os micro-organismos são cultivados em um meio ou meio com o objetivo de produzir um produto biológico ou produto especial que é sintetizado pelos micro-organismos.
[0056] O uso uma solução aquosa termicamente tratada contendo pelo
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15/31 menos um sacarídeo redutor, em que a solução aquosa de sacarídeo foi acidificada conforme descrito anteriormente e/ou no curso do tratamento térmico da solução aquosa de sacarídeo é vantajosa, entre outros, em que nenhum ou menos produtos de isomerização indesejados do sacarídeo redutor estão presentes na solução aquosa de sacarídeo e que nenhum ou menos produtos de isomerização indesejados são fornecidos ao processo de produção biotecnológica em comparação com uma solução de sacarídeo aquosa similar que não foi acidificada antes de seu tratamento térmico. Assim, não há necessidade de remover os produtos de isomerização indesejados da solução aquosa de sacarídeo tratada com calor antes de poder ser usado em um processo de produção biotecnológico.
[0057] De acordo com o quarto aspecto, a invenção fornece métodos para a produção biotecnológica de um produto biológico.
[0058] Em uma modalidade do método para a produção biotecnológica de um produto biológico, o método é um processo de produção biocatalítico. O método compreende as etapas de
- fornecer pelo menos uma enzima purificada;
- colocar pelo menos uma enzima purificada em contato com um ou mais edutos na presença da solução aquosa de sacarídeo termicamente tratada, que foi acidificada conforme descrito anteriormente e/ou no curso do tratamento térmico, para a reação para converter um ou mais edutos no produto biológico desejado; e
- opcionalmente, purificar o produto biológico.
[0059] Em uma modalidade, o pelo menos um sacarídeo redutor da solução aquosa de sacarídeo representa um eduto do processo de produção biocatalítico.
[0060] Em uma modalidade alternativa do processo de produção
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16/31 biotecnológico, o método é um processo de produção fermentativo.
[0061] Fermentação ou fermentativo refere-se ao crescimento em volume de micro-organismos sobre ou em um meio de crescimento (meio de fermentação) com o objetivo de produzir um produto químico específico, o produto biológico. Para esta finalidade, células de um ou um número limitado de cepas de micro-organismos são crescidas em um biorreator (fermentador) sob condições ótimas para que os micro-organismos realizem a produção desejada com produção limitada de impurezas indesejadas. As condições ambientais dentro do biorreator, como temperatura, concentrações de nutrientes, pH e gases dissolvidos (especialmente oxigênio para fermentações aeróbicas) afetam o crescimento e a produtividade dos organismos, e são, portanto, monitoradas, controladas e ajustadas, se necessário.
[0062] Assim, o método de produção fermentativo de um produto biológico compreende as etapas de:
- fornecer uma célula que é capaz de produzir o produto biológico;
- Cultivar pelo menos uma célula em um meio de fermentação contendo e/ou sendo suplementado com a solução aquosa termicamente tratada contendo pelo menos um sacarídeo redutor para pelo menos uma célula para produzir o produto biológico; e
- opcionalmente purificar o produto biológico a partir do meio de fermentação.
[0063] Em uma modalidade do uso de acordo com o terceiro aspecto e/ou método de acordo com o quarto aspecto, a célula viva é uma célula procariótica ou uma célula eucariótica. Células apropriadas incluem leveduras, bactérias, arquebactérias, fungos, células de insetos, células vegetais e células animais, incluindo células de mamíferos (como células humanas e linhagens celulares).
[0064] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula procariótica
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17/31 é uma célula bacteriana, preferencialmente selecionada do gênero selecionado a partir do grupo consistindo em Bacillus, Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Bifidobacterium, Sporololactobacillus spp., Micromomospora spp., Micrococcus spp., Rhodococcus spp. e Pseudomonas. Espécies bacterianas adequadas são Bacillus subtilis, Bacillus Hcheniformis, Bacillus coagulans, Bacillus thermophilus, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus mycoides, Bacillus pumilus, Bacillus lentus, Bacillus creus, Bacillus circulans, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, Citrobacter freundii, Clostridium cellulolyticum, Clostridium ljungdahlil, Clostridium autoethanogenum, Clostridium acetobutylicum, Corynebacterium glutamicum, Enterococcus faecium, Enterococcus thermophiles, Escherichia coli, Erwinia herbicola (Pantoea Aglomerans), Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus casei, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus jensenii, Lactococcus lactis, Pantoea citrea, Pectobacteriuma carotovorum, Proprionibacterium freudenreichii, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa, Streptococcus thermophiles e Xanthomonas campestris.
[0065] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa, a célula eucariótica é uma célula de levedura, uma célula de inseto, uma célula vegetal ou uma célula de mamífero. A célula de levedura é, de preferência, selecionada a partir do grupo que consiste em Saccharomyces sp., em particular, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomycopsis sp., Pichia sp., em particular Pichia pastoris, Hansenula sp., Kluyveromyces sp. Yarrowia sp. Rhodotorula sp. e Schizosaccharomyces sp.
[0066] Em uma modalidade do uso de acordo com o terceiro aspecto e/ou
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18/31 método de acordo com o quarto aspecto, o produto biológico é um oligossacarídeo do leite humano. O oligossacarídeo do leite humano pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em 2'-fucosil-lactose, 3-fucosil-lactose, 2',3-difucosil-lactose, lacto-/V-triose II, lacto-/V-tetraose, lacto-/V-/?eotetraose, lacto-/V-fucopentaose I, lacto-/V-/?eofuopentaose I, lacto-/V-fucopentaose II, lacto-/V-fucopentaose III, lacto-/V-fucopentaose V, lacto-/V-/?eofuopentaose V, lacto-/V-difucohexaose I, lacto-/V-difucosil-hexaose II, para-lacto-/V-fucosilhexaose, fucosil-lacto-/V-sialil-pentaose b, fucosil-lacto-/V-sialil-pentaose c, fucosil-lacto-/V-sialil-pentaose c, disialil-lacto-/V-fucopentaose, 3-fucosil-3'-sialillactose, 3-fucosil-6'-sialil-lactose, I lacto-/V-/?eodifucohexaose, 3'-sialil-lactose, 6'-sialil-lactose, sialil-lacto-/V-tetraoses LST-a, LST-b, LST-c, e disialil-lacto-/Vtetraose.
[0067] Em uma modalidade adicional e/ou alternativa do uso de acordo com o terceiro aspecto e/ou método de acordo com o quarto aspecto, o sacarídeo redutor é lactose. Esta modalidade é de particular vantagem em que a lactose tem que ser fornecida ao meio de fermentação para as células vivas para a produção do oligossacarídeo do leite humano desejado. Sendo capaz de reduzir ou evitar a formação de Lactulose após esterilização térmica de uma solução aquosa de lactose pelo método de acordo com o primeiro aspecto, elimina a necessidade de remover lactulose da preparação de HMO quando a preparação de HMO será usada para a fabricação de uma fórmula nutricional, especialmente uma fórmula infantil, um alimento medicinal ou um suplemento dietético.
[0068] A utilização de uma solução aquosa de sacarídeo termicamente tratada contendo pelo menos um sacarídeo redutor, em que a solução aquosa de sacarídeo foi acidificada conforme descrito anteriormente e/ou no curso de seu tratamento térmico em um processo de produção fermentativa,
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19/31 proporciona vantagens adicionais. Primeiro, a presente invenção permite a esterilização de uma solução aquosa contendo um sacarídeo redutor por métodos de esterilização térmica sem ou com isomerização reduzida do sacarídeo redutor. Portanto, soluções aquosas contendo um sacarídeo redutor não têm que ser esterilizadas por filtração estéril, que é menos confiável do que a esterilização por calor (por exemplo com relação à eliminação de bacteriófagos), em particular, se grandes volumes de uma solução aquosa de sacarídeo, como vários metros cúbicos, precisam ser esterilizados. Além disso, a esterilização por calor de grandes volumes é mais econômica do que a filtragem estéril. Segundo, a presente invenção permite o fornecimento de soluções aquosas de sacarídeo contendo pelo menos um sacarídeo redutor, em que as concentrações de pelo menos um sacarídeo redutor são maiores do que a concentração de saturação do pelo menos um sacarídeo redutor em temperatura ambiente, visto que a solução aquosa de sacarídeo pode ser aquecida e mantida em uma temperatura elevada, isto é, uma temperatura acima da temperatura ambiente. Além disso, a manutenção de uma solução aquosa de sacarídeo a uma temperatura elevada reduz a viscosidade da solução aquosa de sacarídeo que, por sua vez, facilita a manipulação da solução aquosa de sacarídeo, por exemplo, ao bombear a solução aquosa de sacarídeo através de um tubo ou uma mangueira. Terceiro, sendo capaz de fornecer uma solução de sacarídeo aquosa com uma concentração aumentada de sacarídeo permite a obtenção de rendimentos mais elevados de produto em um processo de produção fermentativa. Isto se deve ao fato de que o volume de um fermentador é limitado e o volume do meio de fermentação em um fermentador aumenta durante um processo de fermentação, devido ao fornecimento de entre outros -uma solução aquosa de sacarídeo ao meio de fermentação, cuja solução aquosa de sacarídeo é necessária para a produção do produto biológico desejado pelas
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20/31 células que são cultivadas. Quanto maior a concentração do sacarídeo na solução aquosa de sacarídeo, menor o volume da solução aquosa de sacarídeo, que precisa ser adicionada a um meio de fermentação a fim de obter e/ou manter uma concentração pré-determinada do pelo menos um sacarídeo redutor no meio de fermentação. Assim, a utilização de uma solução aquosa de sacarídeo de acordo com a invenção tendo uma concentração aumentada de sacarídeo, uma concentração de sacarídeo maior no meio de fermentação em um determinado fermentador pode ser alcançada ou uma concentração de sacarídeo pré-determinada pode ser mantida por um período de tempo mais longo quando o volume no fermentador estando disponível para suprimentos é esgotado mais lentamente. Isto, por sua vez, fornece mais sacarídeo redutor para as células para produzir o produto biológico desejado, e assim aumenta o rendimento do produto biológico desejado que pode ser obtido em uma fermentação em batelada única. Portanto, o produto biológico desejado pode ser produzido - no final do processo de fermentação - em uma quantidade de > 100 g/L no meio de fermentação, de preferência em uma quantidade de > 150 g/L no meio de fermentação, mais preferivelmente em uma quantidade de > 200 g/L no meio de fermentação. Por exemplo, quantidades de 2'-fucosil-lactose de mais do que 100 g/L, a saber, cerca de 150 g/L foram obtidas quando uma solução aquosa de lactose aquosa a 0,66 M acidificada foi usada, a qual foi esterilizada por calor, e rendimentos mesmo maiores podem ser obtidos se a concentração de lactose na solução aquosa a ser alimentada para o meio de fermentação for adicionalmente aumentada.
[0069] Em outra modalidade do uso de acordo com o terceiro aspecto e/ou método de acordo com o quarto aspecto, o pelo menos um sacarídeo redutor é lactose, e o produto biológico é selecionado a partir do grupo consistindo em lactosacarose e ácido lactobiônico.
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21/31 [0070] Assim, de acordo com o quinto aspecto, a invenção fornece um produto biológico que foi produzido por um dos métodos de acordo com o quarto aspecto.
[0071] Em uma modalidade, o produto biológico é um oligossacarídeo do leite humano, preferencialmente um oligossacarídeo do leite humano selecionado a partir do grupo consistindo em 2'-fucosil-lactose, 3-fucosil-lactose, 2',3-difucosillactose, lacto-/V-triose II, lacto-/V-tetraose, lacto-/V-/?eotetraose, lacto-/V-fucopentaose I, lacto-/V-/?eofucopentaose I, lacto-/V-fucopentaose II, lacto-/V-fucopentaose III, lacto-/V-fucopentaose V, lacto-/V-/?eofuncopentaose V, lacto-/V-difuco-hexaose I, lacto-/V-difucosil-hexaose II, para-lacto-/V-fucosilhexaose, fucosil-lacto-/V-sialil-pentaose b, fucosil-lacto-/V-sialil-pentaose c, fucosil-lacto-/V-sialil-pentaose c, disialil-lacto-/V-fucopentaose, 3-fucosil-3'-sialillactose, 3-fucosil-6'-sialillactose, I lacto-/V-neodifucohexaose, 3'-sialil-lactose, 6'sialil-lactose, sialil-lacto-/V-tetraoses LST-a, LST-b, LST-c, e disialil-lacto-/Vtetraose.
[0072] Em uma modalidade alternativa, o produto biológico é selecionado a partir do grupo consistindo em lactosacarose e ácido lactobiônico ou derivados dos oligossacarídeos do leite humano mencionados acima.
[0073] De acordo com um aspecto adicional, a invenção fornece o uso do produto biológico para a produção de uma formulação [0074] Em uma modalidade do uso do produto biológico para a fabricação de uma formulação, o produto biológico é um oligossacarídeo do leite humano, selecionado a partir do grupo consistindo em 2'-fucosil-lactose, 3-fucosil-lactose, 2',3-difucosil-lactose, lacto-/V-triose II, lacto-/V-tetraose, lacto-/V-/?eotetraose, lacto-/V-fucopentaose I, lacto-/V-/?eofucopentaose I, lacto-/V-fucopentaose II, lacto-/V-fucopentaose III, lacto-/V-fucopentaose V, lacto-/V-/?eofuncopentaose V, lacto-/V-difucohexaose I, lacto-/V-difucosil-hexaose II, para-lacto-/V-fucosil
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22/31 hexaose, fucosil-lacto-/V-sialil-pentaose b, fucosil-lacto-ZV-sialil-pentaose c, fucosil-lacto-ZV-sialil-pentaose c, disialil-lacto-/V-fucopentaose, 3-fucosil-3'sialillactose, 3-fucosil-6'-sialil-lactose, I lacto-/V-neodifucohexaose, 3'-sialillactose, 6'-sialillactose, sialil-lacto-/V-tetraoses LST-a, LST-b, LST-c, e disialil-lacto/V-tetraose. A formulação desta modalidade é selecionada a partir do grupo consistindo em formulações nutricionais, de preferência fórmula infantil, alimento medicinal e suplementos dietéticos.
[0075] Contanto que o sacarídeo redutor seja lactose, o método de inibir a isomerização de acordo com o primeiro aspecto pode fornecer uma solução de lactose esterilizada por calor sem ou com reduzidas quantidades de lactulose para produção fermentativa de um oligossacarídeo do leite humano. O oligossacarídeo do leite humano pode então ser empregado na fabricação de uma formulação nutricional, de preferência uma fórmula infantil, que não contém ou contém menor quantidade de epilactose, lactulose e/ou derivado de lactulose como fucosil-lactulose (sem a necessidade de remover lactulose ou seu derivado da preparação De HMO).
[0076] De acordo com um aspecto adicional, são fornecidas formulações compreendendo pelo menos um produto biológico que foi produzido por um processo de produção biotecnológica como descrito anteriormente. A formulação é de preferência selecionada a partir do grupo consistindo em formulações nutricionais, de preferência fórmula infantil, alimento medicinal e suplementos dietéticos.
[0077] A presente invenção será descrita com relação às modalidades particulares e com referência às figuras, mas a invenção não é limitada às mesmas, porém apenas pelas reivindicações. Além disso, os termos primeiro, segundo e similares na descrição e nas reivindicações, são usados para distinguir entre elementos similares e não necessariamente para descrever uma
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23/31 sequência, seja temporalmente, espacialmente, em classificação ou de qualquer outra maneira. Deve ser entendido que os termos assim usados são intercambiáveis sob circunstâncias apropriadas e que as modalidades da invenção aqui descritas são capazes de operação em outras sequências do que descritas ou ilustradas aqui.
[0078] Deve ser observado que o termo compreendendo, usado nas reivindicações, não deve ser interpretado como estando restrito aos meios listados a seguir; não exclui outros elementos ou etapas. Portanto, deve ser interpretado como especificando a presença das características declaradas, inteiros, etapas ou componentes como referido, mas não exclui a presença ou adição de uma ou mais outras características, inteiros, etapas ou componentes, ou seus grupos. Assim, o escopo da expressão um dispositivo compreendendo meios A e B não deve ser limitado a dispositivos consistindo apenas nos componentes A e B. Significa que com relação à presente invenção, os únicos componentes relevantes do dispositivo são A e B.
[0079] A referência por todo este relatório descritivo a uma modalidade ou uma modalidade significa que um aspecto, estrutura ou característica particular descrita em conexão com a modalidade é incluída em pelo menos uma modalidade da presente invenção. Assim, os surgimentos das frases em uma modalidade ou em uma modalidade em vários lugares por todo este relatório descritivo não são necessariamente todas com referência à mesma modalidade, mas podem ser. Além disso, os aspectos, estruturas ou características particulares podem ser combinadas de qualquer maneira adequada, como seria aparente para um técnico no assunto a partir desta divulgação, em uma ou mais modalidades.
[0080] Similarmente, deve ser apreciado que na descrição de modalidades exemplares da invenção, várias características da invenção são algumas vezes
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24/31 agrupadas em uma única modalidade, figura, ou descrição das mesmas, com a finalidade de simplificar a revelação e auxiliar na compreensão de um ou mais dos vários aspectos inventivos. Este método de revelação, no entanto, não deve ser interpretado como refletindo uma intenção de que a invenção reivindicada requer mais características do que as expressamente citadas em cada reivindicação. Em vez disso, conforme as reivindicações a seguir refletem, os aspectos inventivos situam-se em menos de todas as características de uma única modalidade divulgada acima. Assim, as reivindicações a seguir da descrição detalhada são aqui expressamente incorporadas nesta descrição detalhada, com cada reivindicação em si como uma modalidade separada desta invenção.
[0081] Além disso, embora algumas modalidades descritas na presente invenção incluam algumas mas não outras características incluídas em outras modalidades, as combinações de características de diferentes modalidades devem estar compreendidas no escopo da invenção, e formam diferentes modalidades, como seria entendido por técnicos no assunto. Por exemplo, nas reivindicações a seguir, qualquer uma das modalidades reivindicadas pode ser usada em qualquer combinação.
[0082] Além disso, algumas das modalidades são descritas na presente invenção como um método ou combinação de elementos de um método que pode ser implementado por um processador de um sistema de computador ou por outros meios de realização da função. Assim, um processador com as instruções necessárias para a realização de tal método ou elemento de um método forma um meio para a realização do método ou elemento de um método. Além disso, um elemento descrito na presente invenção de uma modalidade de aparelho é um exemplo de um meio para a realização da função realizada pelo elemento para a finalidade de realização da invenção.
[0083] Na descrição e figuras fornecidas na presente invenção, numerosos
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25/31 detalhes específicos são estabelecidos. Entretanto, entende-se que as modalidades da invenção podem ser postas em prática sem estes detalhes específicos. Em outros casos, métodos bem conhecidos, estruturas e técnicas não foram mostrados em detalhe a fim de não obscurecer a compreensão desta descrição.
[0084] A invenção será agora descrita por uma descrição detalhada de diversas modalidades da invenção. Fica claro que outras modalidades da invenção podem ser configuradas de acordo com o conhecimento de técnicos no assunto sem se afastar do espírito verdadeiro ou ensinamento técnico da invenção, a invenção sendo limitada somente pelos termos das reivindicações anexas.
Exemplo 1 - Acidificação de lactose com ácidos orgânicos antes da esterilização por calor [0085] Uma solução de 0,66 M de lactose foi preparada por dissolução de 226g de lactose em água. O volume final da solução foi de 1 litro. A uma temperatura de 30° C a 35°C o pH foi ajustado por uso de citrato a 50% (m/v) ou ácido acético a 99% (v/v). Posteriormente, a solução foi esterilizada em uma autoclave vertical (Systec VX -65, Linden, Alemanha) a 121°C por 20 minutos. Amostras foram tiradas antes e depois da esterilização por calor e mantidas congeladas antes da análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). HPLC foi realizada utilizando-se um detector de índice refrativo RID-10A (Shimadzu, Alemanha) e uma Coluna de amida Waters XBridge 3,5 pm (250 x 4,6 mm) (Eschborn, Alemanha) conectado a um sistema HPLC Shimadzu. A eluição isocrática foi realizada com 30% de solvente A (50% (v/v) acetonitrila em água destilada duas vezes, 0,1% (v/v) NH4OH) e 70% de solvente B (80% (v/v) acetonitrila em água destilada duas vezes, 0,1% (V/v) NH4OH) a 35° Cea uma vazão de 1,4 ml min1. Amostras foram limpas por extração em fase sólida em
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26/31 uma matriz de troca iônica (Strata ABW, Phenomenex). Dez microlitros da amostra (diluição de 1:5) foram aplicados à coluna. Finalmente, a quantidade relativa de açúcares detectados foi determinada. Conforme representado nas tabelas 1 e 2, a isomerização de lactose induzida por esterilização térmica diminuiu com os valores de pH decrescentes das soluções antes do tratamento térmico. Nenhuma formação de lactulose pode ser observada em pH 4,0 a 3,0 ou pH 3,0 quando a acidificação foi realizada com citrato ou ácido acético, respectivamente. A degradação catalisada por ácido de lactose em seus monossacarídeos foi aumentada com valores de pH menores, mas não foi detectável em pH 4,5.
pH Composição relativa [%]
Monossacarídeos Lactulose Lactose
Antes de esterilização por calor
3,0 - 6,8 n.d. n.d. 100
Após esterilização por calor
6,8 (sem ajuste de pH) 0,44 6,16 93,40
5,0 0,27 0,87 98,85
4,5 n.d. 0,15 99,85
4,0 0,68 n.d. 99,32
3,5 1,87 n.d. 98,13
3,0 5,96 n.d. 94,04
Tabela 1: quantidade relativa de açúcares detectados em soluções de lactose de 0,66 M com pH ajustado antes e depois da esterilização por calor. O ajuste do pH foi realizado utilizando-se citrato a 50% (p/v). É mostrada a quantidade percentual de açúcares (área sob a curva; AUC) detectada por HPLC.
pH Composição relativa [%]
Monossacarídeos Lactulose Lactose
Antes de esterilização a calor
3,0 - 6,8 n.d. n.d. 100
Após esterilização por calor
6,8 (sem ajuste de pH) 0,44 6,16 93,40
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27/31
5,0 0,21 1,13 98,65
4,5 n.d. 0,31 99,69
4,0 0,49 0,12 99,39
3,5 1,41 0,07 98,52
3,0 4,35 n.d. 95,65
Tabela 2: Quantidade relativa de açúcares detectados em soluções de lactose de 0,66 M com pH ajustado antes e depois da esterilização por calor. O ajuste do pH foi realizado usando ácido acético a 80% (v/v). É mostrada a quantidade percentual de açúcares (área sob a curva; AUC) detectada por HPLC.
Exemplo 2 - Acidificação de lactose com ácidos inorgânicos antes da esterilização por calor [0086] Uma solução a 0,66 M de lactose foi preparada por dissolução de 226 g de lactose em água. O volume final da solução foi de 1 litro. A uma temperatura de 30°C a 35° C, o pH foi ajustado pelo uso de ácido clorídrico a 37% (v/v), ácido fosfórico a 50% (v/v) ou ácido sulfúrico a 96% (v/v). Posteriormente, a solução foi esterilizada em uma autoclave vertical (Systec VX-65, Linden, Alemanha) a 121°C por 20 minutos. Amostras foram tiradas antes e depois da esterilização por calor e mantidas congeladas antes da análise por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). A HPLC foi realizada utilizando-se um detector de índice refrativo RID-10A (Shimadzu, Alemanha) e uma coluna de amida Waters XBridge 3.5pm (250 x 4,6 mm) (Eschborn, Alemanha) conectada a um Sistema HPLC Shimadzu. Eluição isocrática foi realizada com 30% de solvente A (50% (v/v) acetonitrila em água destilada duas vezes, 0,1 % (v/v) NH4OH) e 70% de solvente B (80% (v/v) acetonitrila em água destilada duas vezes, 0,1% (v/v) NH4OH) a 35° Cea uma vazão de 1,4 ml de min1. As amostras foram limpas por extração em fase sólida em uma matriz de troca iônica (Strata ABW, Phenomenex). Dez microlitros da amostra (diluição de 1: 5) foram aplicados à coluna. Finalmente, a quantidade relativa de açúcares detectados foi determinada. Conforme representado nas tabelas 3, 4 e 5, a isomerização de
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28/31 lactose induzida por esterilização térmica diminuiu em consequência de acidificação aumentada das soluções antes do tratamento térmico. Nenhuma formação de lactulose pode ser observada em pH 3,5 a 3,0. Contrariamente, a degradação catalisada por ácido de lactose em seus monossacarídeos foi aumentada com valores de pH mais baixos mas estavam ausentes em valores de pH 4,5 a 4,0 ou pH 5,0 a 4,0 quando ácido fosfórico e ácido sulfúrico ou ácido clorídrico foi usado para acidificação, respectivamente.
PH Composição relativa [%]
Monossacarídeos Lactulose Lactose
Antes de esterilização a calor
3,0-6,8 n.d. n.d. 100
Após esterilização por calor
6,8 (sem ajuste de pH) 0,44 6,16 93,40
5,0 n.d. 0,57 99.43
4,5 n.d. 0,17 99,83
4,0 n.d. 0,20 99,80
3,5 1,50 n.d. 98,50
3,0 5,62 n.d. 94,38
Tabela 3: quantidade relativa de açúcares detectados em soluções de lactose de 0,66 M de pH ajustado antes e depois da esterilização por calor. O ajuste do pH foi realizado usando ácido clorídrico a 37% (v/v). É mostrada a quantidade percentual de açúcares (área sob a curva; AUC) detectada por HPLC.
pH Composição relativa [%]
Monossacarídeos Lactulose Lactose
Antes de esterilização a calor
3,0 - 6,8 n.d. n.d. 100
Após esterilização por calor
6,8 (sem ajuste de pH) 0,44 6,16 93,40
5,0 0,30 0,49 99,21
4,5 n.d. 0,10 99,90
4,0 n.d. 0,08 99,92
3,5 1,40 n.d. 98,60
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29/31
3,0 4,44 n.d. 95,56
Tabela 4: quantidade relativa de açúcares detectados em soluções de lactose de 0,66 M de pH ajustado antes e depois da esterilização por calor. O ajuste do pH foi realizado utilizando ácido fosfórico a 50% (v/v). É mostrada a quantidade percentual de açúcares (área sob a curva; AUC) detectada por HPLC.
pH Composição relativa [%]
Monossacarídeos Lactulose Lactose
Antes de esterilização a calor
3,0-6,8 n.d. n.d. 100
Após esterilização por calor
6,8 (sem ajuste de pH) 0,43 6,34 93,24
5,0 0,26 0,67 99,05
4,5 n.d. 0,17 99,83
4,0 n.d. 0,17 99,82
3,5 1,11 n.d. 98,89
3,0 3,21 n.d. 96,79
Tabela 5: quantidade relativa de açúcares detectados em soluções de lactose de 0,66 M de pH ajustado antes e depois da esterilização por calor. O ajuste do pH foi realizado usando ácido sulfúrico 96% (v/v). É mostrada a quantidade percentual de açúcares (área sob a curva; AUC) detectada por HPLC.
Exemplo 3 - Processo de produção aperfeiçoada de 2'-fucosil-lactose [0087] Uma cepa de E coli BL21 (DE3) ânagAb ÁwcaJ âfuclK ÁpfkA foi usada de acordo com o Pedido de patente européia 16 196 486, superexpressando enzimas para a síntese de novo de GDP-Fucose (ManB, ManC, Gmd, WcaG), a bifuncional L-fucocinase/L-fucose 1-fosfat guaniltranferase de Bacteroides fragilis, o gene 2-fucosiltransferase wbgL de E Coli: 0126, o gene de permease de lactose lacY, o transportador de fluxo de açúcar yberc0001_9420 da Yersinia bercovieri ATCC 43970, a frutose-l,6-bifosfato aldolase (fbaB) e uma fosfatase
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30/31 de frutose-l,6-bifosfato heterólogo (fbpase) de Pisum sativum.
[0088] A cepa de E coli foi cultivada em um fermentador 3L a 33° C em um meio de sais minerais que contém 3 g/L de KH2PO4, 12 g/L de K2HPO4, 5 g/L (NH4)2SO4, 0,3 g/L de ácido cítrico, 2 g/L de MgSO4 x 7H2O, 0,1 g/L de NaCI e 0,015 g/L de CaCb χ 6H2O com 1 ml/L de solução de elemento residual (54,4 g/L de citrato férrico de amônio, 9,8 g/L de MnCb x 4hbO, 1,6 g/L de CoCb x 6H20,1 g/L de CuCb x 2hbO, 1,9 g/L H3BO3, 9 g/L de ZnSO4 x 7H2O, 1,1 g/L Na2MoO4 x 2hbO, 1,5 g/L de Na2SOs, 1,5 g/L N1O4 x 6H2O), glicerol a 2% (v/v) como a única fonte de carbono e energia bem como 60 mM de lactose esterilizada por calor, que foi acidificada a pH 3,0 com ácido sulfúrico a 96% (v/v) antes da esterilização. O pH foi mantido em 7,0 por titulação de amônia a 25%. O fermentador foi inoculado com um ODeoo de 0,1 com uma pré-cultura cultivada no meio descrito mas sem lactose. Após deixar a fase em batelada, indicada por uma elevação no nível de oxigênio dissolvido, a alimentação de glicerol (60% v/v) bem como a alimentação de lactose a 0,66 M (acidificada a pH 3,0 usando ácido sulfúrico 96% (v/v) antes da esterilização térmica) foi iniciada. Uma concentração de 10-40 mM de lactose foi mantida durante a fase de produção do processo de fermentação, regulada de acordo com análises de HPLC. Glicerol (60% v/v) foi alimentado com vazões de 6-8 mL/L/h (com referência ao volume inicial). A fermentação foi interrompida quando o volume de enchimento no tanque atingiu seu máximo. Neste ponto, um título de 2'-fucosil-lactose de 146 g/L foi determinado no sobrenadante de cultura do meio.
[0089] No curso dos processos de fermentação de 2'-fucosil-lactose usando-se lactose estéril filtrada, em vez de lactose esterilizada por calor, acidificada, títulos de 2'-fucosil-lactose comparáveis foram obtidos. Além disso, o tipo e quantidades de subprodutos detectados no meio de cultura de fermentações realizadas com lactose estéril filtrada ou esterilizada por calor
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31/31 (acidificada) foram comparáveis. Nenhum dos subprodutos do tipo lactulose, epilactose, fucosil-lactulose ou fucosilepilactose bem como nenhum outro subproduto que pode se originar da adição de lactose esterilizada por calor, foram detectados no meio quando acidificados, a lactose esterilizada por calor foi fornecida para a fermentação.

Claims (19)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método de inibir a isomerização de um sacarídeo redutor em uma solução aquosa contendo o referido sacarídeo redutor após um tratamento térmico da referida solução aquosa de sacarídeo, o método caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de acidificar a solução aquosa de sacarídeo antes e/ou no curso do tratamento térmico.
  2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa de sacarídeo é acidificada para um pH tendo um valor entre cerca de 1 a cerca de 6, preferivelmente para um pH tendo um valor entre cerca de 2 a cerca de 5, e mais preferivelmente para um pH tendo um valor entre cerca de 3 a cerca de 4.
  3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a solução aquosa de sacarídeo é acidificada adicionando pelo menos um ácido à referida solução aquosa de sacarídeo.
  4. 4. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o ácido é um ácido inorgânico, preferivelmente selecionado a partir do grupo que consiste em ácido clorídrico, ácido sulfúrico, ácido sulfuroso, ácido fosfórico, ácido bórico, ácido fluorídrico, ácido bromídrico, ácido perclórico, ácido iodídrico e ácido carbônico.
  5. 5. Método de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o ácido é um ácido orgânico, preferivelmente selecionado a partir do grupo que consiste em ácidos monocarboxílicos, ácidos dicarboxílicos e ácidos tricarboxílicos.
  6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o açúcar redutor é selecionado a partir do grupo que consiste em aldoses, dissacarídeos e oligossacarídeos, preferivelmente um dissacarídeo selecionado a partir do grupo que consiste em lactose e maltose.
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    2/4
  7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o tratamento térmico compreende expor a solução aquosa acidificada a uma temperatura na faixa de cerca de 30°C a cerca de 150°C.
  8. 8. Solução aquosa tratada termicamente contendo pelo menos um sacarídeo redutor, caracterizada pelo fato de que é obtida por um método definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
  9. 9. Solução aquosa termicamente tratada de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que a solução aquosa é estéril.
  10. 10. Solução aquosa termicamente tratada de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizada pelo fato de que o sacarídeo redutor é lactose, preferivelmente presente em uma concentração de > 10 mM, preferivelmente em uma concentração de > 100 mM, mais preferivelmente em uma concentração de > 0,66 M e mais preferivelmente em uma concentração de > 1 M.
  11. 11. Uso de uma solução aquosa termicamente tratada contendo pelo menos um sacarídeo redutor definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado pelo fato de ser em um processo de produção biotecnológico para produzir um produto biológico.
  12. 12. Uso de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o processo biotecnológico é selecionado a partir do grupo que consiste em um processo de produção biocatalítico e um processo de produção fermentativo.
  13. 13. Uso de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que é para uma produção fermentativa de um oligossacarídeo do leite humano, em que a solução aquosa termicamente tratada contendo pelo menos um sacarídeo redutor é uma solução aquosa esterilizada por calor úmido contendo lactose.
  14. 14. Método de produção biotecnológico de um produto biológico,
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    3/4 caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    - fornecer pelo menos uma célula que é capaz de produzir o produto biológico;
    - cultivar pelo menos uma célula em um meio de fermentação contendo e/ou sendo suplementado com a solução aquosa termicamente tratada definida em qualquer uma das reivindicações 8 a 10 para pelo menos uma célula para produzir o produto biológico; e
    - opcionalmente purificar o produto biológico a partir do meio de fermentação.
  15. 15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o produto biológico é um oligossacarídeo do leite humano, e em que a solução aquosa termicamente tratada é uma solução aquosa esterilizada por calor úmido contendo lactose.
  16. 16. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o produto biológico é produzido em uma quantidade de > 100 g/L no meio de fermentação, preferivelmente em uma quantidade de > 150 g/L no meio de fermentação, mais preferivelmente em uma quantidade de > 200 g/L no meio de fermentação no término do processo de fermentação.
  17. 17. Produto biológico fabricado por um processo definido na reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o produto biológico é preferivelmente selecionado a partir do grupo que consiste em um oligossacarídeo do leite humano, lactosacarose e ácido lactobiônico.
  18. 18. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, ou produto biológico de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o produto biológico é um oligossacarídeo do leite humano sendo selecionado a partir do grupo que consiste em 2'-fucosil-lactose, 3-fucosil-lactose, 2',3-difucosil-lactose,
    Petição 870190088453, de 06/09/2019, pág. 43/45 lacto-/V-triose II, lacto-/V-tetraose, lacto-/V-neotetraose, lacto-/V-fucopentaose I, lacto-/V-neofuopentaose I, lacto-/V-fucopentaose II, lacto-/V-fucopentaose III, lacto-/V-fucopentaose V, lacto-/V-neofuopentaose V, lacto-/V-difucohexaose I, lacto-/V-difucosil-hexaose II, para-lacto-/V-fucosil-hexaose, fucosil-lacto-/V-sialilpentaose b, fucosil-lacto-ZV-sialil-pentaose c, fucosil-lacto-ZV-sialil-pentaose c, disialil-lacto-/V-fucopentaose, 3-fucosil-3'-sialil-lactose, 3-fucosil-6'-sialil-lactose, lacto-/V-neodifucohexaose I, 3'-sialil-lactose, 6'-sialil-lactose, sialil-lacto-Ntetraoses LST-a, LST-b, LST-c, e disialil-lacto-N-tetraose.
  19. 19. Invenção de produto, processo, sistema, kit ou uso, caracterizada pelo fato de que compreende um ou mais elementos descritos no presente pedido de patente.
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