JP4436635B2 - バクテリオシンを産出する有用物質生産菌を利用した有用物質の製造方法 - Google Patents
バクテリオシンを産出する有用物質生産菌を利用した有用物質の製造方法 Download PDFInfo
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Description
(1)培地に含まれる基質および栄養素がこの雑菌によって消費される;
(2)その結果、雑菌の繁殖が増大し、本命菌である有用物質生産菌の繁殖を上回り、有用物質生産菌が駆逐される;および
(3)また、雑菌が有用物質を分解、破壊する;
このような問題を回避、防止するためには、培養系に雑菌が侵入しない純粋培養系を確立する必要がある。
(1)加熱殺菌をはじめとする従来の方法を用いずに大規模な発酵工業プラントの殺菌を行う手段として、培養系内に、雑菌が生育できない抗菌物質が存在すればよいが、その抗菌物質が本命菌である有用物質生産菌自体を殺菌してしまうと発酵等の有用物質生産プロセスは成立しないということ;
(2)有用物質生産菌に影響を与えず、雑菌のみを殺菌する抗菌物質が、有用物質の生産速度を阻害してはならないということ;
(3)その抗菌物質が、人体に有害で、取り扱いに重大な危険性を有するものであってはならないということ;
以上のことから、確実に雑菌を殺菌し、発酵菌等の有用物質生産菌自体を殺菌せず、かつ、有用物質生産を阻害せず、さらに人体に危険でない抗菌物質が必要である。このような観点から、この出願の発明は、抗菌物質としてバクテリオシン(バクテリオシン生産菌)を利用している。さらに、侵入してくる雑菌はあらかじめ特定することは困難であるため、バクテリオシンの抗菌スペクトルは、なるべく広いものであることが望ましい。
使用菌は発明者が、独自に分離したLactococcus lactis IO-1(JCM7638)を使用した。種菌は−85℃の凍結保存菌をTGC培地(Difco)に植菌し静置培養したものを用いた。これをグルコース3%、酵母エキス 0.5%、ポリペプトン 0.5%、NaC1 0.5%からなる培地100mlをErlenmyer Flaskに分注して、120℃、5分autoclave滅菌したものに接種して8時間培養したものをシードとした。
2.培地
主発酵に用いた培地は、コーンスターチ酵素糖化液(使用酵素 NOVO Thermamyl 120L、 Dextrozyme 225/75L)を希釈してグルコース5%に調製し、これにコーンスティープリカー(CSL)1%を添加し、pH調製したものである(含糖培地)。またCSL 1%を水に溶解したものを希釈水として使用した(無糖培地)。
3.殺菌方法
含糖培地及び無糖培地は、熱殺菌を行わず、精密濾過フィルター(0.2μm)を用いて除菌濾過した。
4.培養装置
連続培養に使用した装置は、図1の概要図に例示した構成を有している。
5.培養方法
図1に例示したとおり、主発酵槽(1)は全容1リットルのガラス製ジャーで、内部にマグネットスターラーの攪拌機(図示せず)を設置し、約400rpmの回転数でゆっくり攪拌している。ジャー全体をwater bathに浸け、37℃の温水を循環して培養温度を37℃に制御した。ジャーにpH測定用複合ガラス電極を装着し、pH測定制御器(3)(東亜電波製)で測定し、pH6.0(下限)でアルカリ(1N-NaOH)を熱殺菌せずフィードしてpH制御を行った。グルコースアナライザーで培地の残糖濃度を適時測定し、残糖レベルが1.5g/lとなった時点でアルカリフィード速度に比例して求めたグルコースフィード速度で培地の添加を行い、連続発酵を開始した。連続培養を実施するにあたり、ジャーから培養液を抜き出し、クロスフロー型精密濾過膜(2)(MICROZAPSP103、旭化成)を用いて培養液を循環し、微生物の濃縮を行った。濾過膜外側からは除菌液を抜き出して、製品である乳酸液を取り出す。また、ジャーにはレーザー濁度測定制御器(5)(たとえば、プロセスオンライン濁度計プローブ)を設置し、その出力をDDC controller(ModelLA-300 工一エスアール)に入力し、ジャーの濁度制御を行って、菌の濃縮管理を行うシステムも組み込んだ。濁度コントロールのシステムとしては、菌液を含有する培養液(V)を抜き出した。これらはペリスタリィックポンプ(61)(62)(63)によって同調させた。したがって、連続培養では、3種類の液(71、72、73)を供給し、2種類の液(74、75と76)の抜き出しを行う。すなわち、アルカリ添加量積算器(4)によるpH制御のためのアルカリ液(1N-NaOH)の添加量の積算値に対応した基質の糖をフィードした。
6.培養結果
培養液をサンプリングし、雑菌混入の有無を次のように調査した。
実施例1と同様のLactococcus lactis IO-1(JCM7638)を使用した。
2.培地
実施例1に同じ培地を用いた。
3.殺菌方法
含糖培地および無糖培地は、熱殺菌および精密濾過フィルターによる除菌濾過のそのどちらも実施しなかった。
4.培養装置
実施例1と同様の培養装置を用いた。
5.培養方法
培養方法においても、実施例1と同様の培養用方法を採択した。
6.培養結果
この培養液のL-乳酸純度は99.8%で、ポリ乳酸原料として十分の品質である。この連続運転の間10日間約250hの間、雑菌汚染によるコンタミネーションは、全く見られなかった。すなわち培養液をサンプリングし、雑菌混入の有無を実施例1と同一の方法で検査した。その結果、いずれのプレートにおいても雑菌の生育は認められなかったことから、この出願の発明が乳酸の工業生産にも十分耐えうる方法であることが実証された。
使用した菌は、発明者が独自に分離したLactococcus lactis IO-1(JCM7638)を使用した。種菌は、-85℃の凍結保存菌をTGC培地に植菌し静地培養したものを用いた。これをグルコース3%、酵母エキス0.5%、NaCl 1%からなる培地100mlをErlenmyer Flaskに分注して120℃、5分オートクレーブ殺菌したものに接種して12時間培養したものをシードとした。
2.培地
グルコースが5%、酵母エキスが1%、ポリペプトンが1%、NaClが0.5%の組成の培地400mlを使用した。
3.殺菌方法
培地は、120℃、15分でオートクレーブ滅菌をした。
4.培養装置
主発酵槽は、全容1リットルのガラス製ジャーで、培養の前処理として、前培養で、すでに回分発酵の終了した除菌培養液(バクテリオシンを含む培養液)で主発酵槽及び発酵装置を洗浄し、除菌培養液でリンスした。
5.培養方法
ジャー内部にマグネットスターラーの攪拌機を設置し、400rpmの回転数でゆっくり攪拌する。ジャー全体をwater bathに浸け、37℃の温水を循環して温度を制御する。培養液のpHを1N-NaOHを添加して6.0とした。このとき1N-NaOH液は、精密濾過フィルター(0.2μm)によって除菌濾過して用いた。シード20mlを植菌してスタートし、回分法で18時間培養した。
6.培養結果
この培養液のL-乳酸の純度は99.9%で、ポリ乳酸原料として十分の品質である。培養終了液を実施例1に記載した雑菌検査法によって雑菌の有無を検査した。その結果、全てのプレートに雑菌の生育は見られなかった。
実施例3に同じ菌株を使用した。
2.培地
蒸留水900mlに、前培養ですでに回分発酵の終了した除菌培養液(バクテリオシンを含む培養液)を100ml添加し、原培養液濃度の10%とした溶液を400ml用意し、グルコースが5%、酵母エキスが1%、ポリペプトンが1%、NaClが0.5%の組成となるようそれぞれ添加した。
3.殺菌方法
培地の熱殺菌は行わなかった。
4.培養装置
実施例1と同じ装置を用いた。
5.培養方法
実施例1に同じ培養方法にて、培養した。
6.培養結果
この培養液のL-乳酸純度は99.9%で、ポリ乳酸原料として十分の品質である。
培養終了液を実施例1に記載した雑菌検査法によって雑菌の有無を検査した。その結果、全てのプレートに雑菌の生育は見られなかった。
2 菌濃縮用クロスフロー型精密濾過膜
3 pH測定制御器
4 アルカリ添加量積算器
5 レーザー濁度測定制御器
61、62、63 ペリスターポンプ
71 pH制御のためのアルカリフィード速度
72 アルカリ添加量から求められる基質フィード速度
73 濁度制御のために添加される糖を含まない栄養成分培地のフィード速度
74 71に等量の培養ろ液引き抜き速度
75 72に等量の培養ろ液引き抜き速度
76 73に等量の培養液引き抜き速度
V 培養液
Claims (6)
- 有用物質と、抗菌および/または殺菌作用を有するバクテリオシンを産出する有用物質生産菌を利用した有用物質の製造方法であって、無殺菌培地において該有用物質生産菌を培養することを特徴とする有用物質の製造方法。
- 無殺菌培地に無殺菌のアルカリを添加することを特徴とする請求項1の有用物質の製造方法。
- 有用物質の生成過程で産出されたバクテリオシンを含有する培養液によって培養装置の殺菌処理を行うことを特徴とする請求項1または2記載の有用物質の製造方法。
- バクテリオシンを産出する有用物質生産菌が、ペディオシン生産菌、ヌカシン生産菌、または、ナイシン生産菌である請求項1から3いずれか記載の有用物質の製造方法。
- バクテリオシンを産出する有用物質生産菌が、Pediococcus属、Staphylococcus属、Lactococcus属、またはLactobacillus属に属する請求項1から4いずれか記載の有用物質の製造方法。
- 有用物質が、L-乳酸である請求項1から5いずれかに記載の有用物質の製造方法。
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