KR20180073554A - 중수소화 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

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KR20180073554A
KR20180073554A KR1020187008122A KR20187008122A KR20180073554A KR 20180073554 A KR20180073554 A KR 20180073554A KR 1020187008122 A KR1020187008122 A KR 1020187008122A KR 20187008122 A KR20187008122 A KR 20187008122A KR 20180073554 A KR20180073554 A KR 20180073554A
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토드 브래디
스캇 영
윌리엄 에이. 키니
수잔 맥도날드
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알데이라 테라퓨틱스, 아이엔씨.
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Abstract

본 발명은 안과 장애, 피부 장애, 수포작용제로부터의 손상 효과와 관련된 병태, 및 MDA 및 HNE와 같은 독성 알데히드를 제거하기 위한 1급 아민의 사용에 의한 자가면역, 염증, 신경 및 심혈관 질환을 포함하여 발병에 알데히드 독성이 연관되는 질환, 장애, 또는 병태의 치료, 예방 및/또는 위험의 감소를 제공한다.

Description

중수소화 화합물 및 이의 용도
세포에서의 대사 및 염증 과정은 말론디알데히드(MDA) 및 4-하이드록실-2-노네날(HNE 또는 4HNE)과 같은 독성 알데히드를 생성한다. 이들 알데히드는 단백질, 탄수화물, 지질 및 DNA에 매우 반응성이어서, 화학적으로 개질된 생물학적 분자, NF-카파B와 같은 염증 매개인자의 활성화, 및 다양한 기관의 손상을 야기한다. 예를 들면, 레틴알데히드는 포스파티딜에탄올아민(PE)과 반응하여 A2E라고 불리는 고도의 독성 화합물을 형성할 수 있으며, 이는 연령 관련 황반 변성(AMD)의 발병 및 진행에 관여하는 것으로 믿어지는 리포푸신의 성분이다. 여러 신체 방어 기전이 독성 알데히드를 제거하거나 이의 수준을 낮추는 기능을 한다. 신규한 소분자 치료제가 망막에서 "탈출한" 레틴알데히드를 제거하는데 사용될 수 있고, 이에 따라 A2E 형성을 감소시키고 AMD의 위험을 줄일 수 있다(Jordan 등 (2006)).
알데히드는 건성 안, 백내장, 원추각막, 각막의 푹스 내피세포 이상증(Fuch's endothelial dystrophy), 포도막염, 알레르기 결막염, 안구 반흔성 유천포창, 굴절교정 레이저 각막 절제술(PRK) 치료 또는 기타 각막 치료와 관련된 병태, 눈물 지질 분해 또는 누선 기능장애와 관련된 병태, (마이봄선 기능장애를 갖거나 갖지 않는) 안구 주사(ocular rosacea)와 같은 염증성 안구 병태, 및 비-안과 장애 또는 병태, 예를 들면, 피부 암, 건선, 접촉 피부염, 아토피 피부염, 여드름, 쇼그렌-라르슨 증후군(Sjogren-Larsson Syndrome), 허혈성-재관류 손상, 염증, 당뇨병, 신경변성(예를 들면, 파킨슨 질환), 피부경화증, 근위축성 측삭 경화증, 자가면역 장애(예를 들면, 루푸스), 심혈관 장애(예를 들면, 죽상동맥경화증), 및 수포작용제의 손상 효과와 관련된 병태와 같은 다양한 병리학적 상태에 연관된다(Negre-Salvagre et al. (2008), Nakamura et al. (2007), Batista et al. (2012), Kenney et al. (2003), Int J Dermatol 43: 494 (2004), Invest Ophthalmol Vis Sci 48: 1552 (2007), Graefe's Clin Exp Ophthalmol 233: 694 (1994), Molecular Vision 18: 194 (2012)). 따라서, 알데히드를 감소시키거나 제거하는 것이 이러한 병리학적 상태의 증상을 개선시키고 진행을 더디게 할 것이다.
MDA, HNE 및 기타 독성 알데히드는 지방 알콜, 스핑고지질, 당지질, 피톨, 지방산, 아라카돈산 대사(Rizzo (2007)), 폴리아민 대사(Wood 등 (2006)), 지질 과산화, 산화적 대사(Buddi 등 (2002), Zhou 등 (2005)), 및 글루코스 대사(Pozzi 등 (2009))를 포함한 무수한 대사 기전에 의해 생성된다. 알데히드는 단백질, 인지질, 탄수화물, 및 DNA 상의 1급 아미노 그룹 및 다른 화학적 모이어티와 가교 결합하여 다수의 경우에 돌연변이유발 및 발암과 같은 독성 결과를 야기할 수 있다(Marnett (2002)). MDA는 병에 걸린 각막, 원추각막, 물집 및 기타 각막병증, 및 푹스 내피세포 이상증 각막과 관련된다(Buddi 등 (2002)). 또한, 피부 장애, 예를 들면, 쇼그렌-라르슨 증후군은 옥타데칸알 및 헥사데칸알과 같은 지방 알데히드의 축적과 상관성이 있는 경향이 있다(Rizzo 등 (2010)). 게다가, 증가된 지질 과산화 및 이에 따른 알데히드 생성은 수포작용제의 독성 효과와 관련된다(Sciuto 등 (2004) 및 Pal 등 (2009)).
MDA 및/또는 HNE와 같은 알데히드에 대한 스캐빈저로서 작용하는 소분자 치료제의 투여에 의해 독성 알데히드와 관련된 다양한 병태들을 치료하는데 대해서는 당업계에 제안된 바 없다. 따라서, 발병에 알데히드 독성이 연관되는 질환 또는 장애를 치료, 예방, 및/또는 이의 위험을 감소시키는 것이 필요하다. 본 발명은 이러한 요구를 해결한다.
따라서, 발병에 알데히드 독성이 연관되는 질환, 장애, 또는 병태를 치료, 예방, 및/또는 이의 위험을 감소시키는 것이 여전히 요구된다.
본 발명에 이르러, 본 발명의 화합물 및 이의 조성물이, 발병에 알데히드 독성이 연관되는 질환, 장애, 또는 병태를 치료, 예방, 및/또는 이의 위험을 감소시키는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 이러한 화합물은 화학식 I 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 갖는다:
[화학식 I]
Figure pct00001
상기 화학식 I에서,
각각의 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 및 R8은 본원에 정의된 바와 같다.
본 발명의 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 조성물은 독성 알데히드와 관련된 각종 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 유용하다. 이러한 질환, 장애 또는 병태는 본원에 기재된 것들을 포함한다.
본 발명에 의해 제공되는 화합물은 또한 생물학 및 병리학적 현상에서의 특정 알데히드의 연구에 유용하다.
도 1은 표준물(블랭크 간세포)과 비교하여 인간 간세포에서 0분 및 120분에서의 NS2의 대사산물 프로파일의 EIC(추출된 이온 크로마토그램)의 오버레이를 보여준다. 오버레이가 보여주는 바와 같이, 120분 후 NS2는 M1, M7, M8, 및 저량의 M9로 대사되며, 일부 변하지 않은 NS2가 남아있다.
도 2는 표준물(블랭크 간세포)과 비교하여 원숭이 간세포에서 0분 및 120분에서의 NS2의 대사산물 프로파일의 EIC의 오버레이를 보여준다. 오버레이가 보여주는 바와 같이, 120분 후 NS2는 M1, M3, M4, M7, M8, 및 저량의 M9로 대사되며, 일부 변하지 않은 NS2가 남아있다.
도 3은 표준물(블랭크 간세포)과 비교하여 개 간세포에서 0분 및 120분에서의 NS2의 대사산물 프로파일의 EIC의 오버레이를 보여준다. 오버레이가 보여주는 바와 같이, 120분 후 NS2는 M1, M2, M5, 및 M6으로 대사되며, 일부 변하지 않은 NS2가 남아있다.
도 4는 표준물(블랭크 간세포)과 비교하여 랫트 간세포에서 0분 및 120분에서의 NS2의 대사산물 프로파일의 EIC의 오버레이를 보여준다. 오버레이가 보여주는 바와 같이, 120분 후 NS2는 M1, M7, 및 M8로 대사되며, 일부 변하지 않은 NS2가 남아있다.
도 5는 표준물(블랭크 간세포)과 비교하여 인간 간세포에서 0분 및 120분에서의 중수소화 NS2(NS2-D6; 화합물 I-1)의 대사산물 프로파일의 EIC의 오버레이를 보여준다. 오버레이가 보여주는 바와 같이, 120분 후 NS2-D6은 소량의 M1으로 대사되며, 대부분의 변하지 않은 NS2가 남아있다.
도 6은 NS2의 질량 스펙트럼 분석을 보여준다(m/z = 237).
도 7은 대사산물 M1의 질량 스펙트럼 분석을 보여준다(m/z = 253, RT = 2.1분)
도 8은 대사산물 M2의 질량 스펙트럼 분석을 보여준다(m/z = 253, RT = 2.9분).
도 9는 대사산물 M3의 질량 스펙트럼 분석을 보여준다(m/z = 429, RT = 3.0분).
도 10은 대사산물 M4의 질량 스펙트럼 분석을 보여준다(m/z = 429, RT = 3.2분).
도 11은 대사산물 M5의 질량 스펙트럼 분석을 보여준다(m/z = 542, RT = 3.5분).
도 12는 대사산물 M6의 질량 스펙트럼 분석을 보여준다(m/z = 542, RT = 3.7분). 주석: 413의 m/z는 GSH 단편화 패턴을 가리키는 129의 중성 손실(NL)을 나타낸다.
도 13은 대사산물 M7의 질량 스펙트럼 분석을 보여준다(m/z = 429, RT = 3.7분).
도 14는 대사산물 M8의 질량 스펙트럼 분석을 보여준다(m/z = 413, RT = 3.9분).
도 15는 대사산물 M9의 질량 스펙트럼 분석을 보여준다(m/z = 429, RT = 3.9분).
도 16은 NS2-D6의 질량 스펙트럼 분석을 보여준다(화합물 I-1; m/z = 243).
도 17은 NS2-D6의 대사산물 1의 질량 스펙트럼 분석을 보여준다(m/z = 259).
도 18은 5시간 동안 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 NS2(CoreRx)의 효과를 보여준다.
도 19는 EC50 값이 유도되는 곡선에 다양한 NS2(CoreRx; Captisol® 중의) 농도에서 CFDA 데이터를 (상대적 형광 단위로) 피팅시킨 그래프를 보여준다.
도 20은 5시간 동안 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 해마 배양물에서의 세포사에 대한 NS2(CoreRx)의 효과를 보여준다. *는 HP 처리 단독과는 유의적으로 상이한 데이터 포인트를 나타낸다.
도 21은 EC50 값이 유도되는 곡선에 다양한 NS2(CoreRx; Captisol® 중의) 농도에서 요오드화 프로피듐 데이터를 (상대적 형광 단위로) 피팅시킨 그래프를 보여준다.
도 22는 5시간 동안 10mM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 NS2(CoreRx; DMSO 중에서의)의 효과를 보여준다. *는 HP 처리 단독과는 유의적으로 상이한 데이터 포인트를 나타낸다.
도 23은 EC50 값이 유도되는 곡선에 다양한 NS2(CoreRx; DMSO 중의) 농도에서 CFDA 데이터를 (상대적 형광 단위로) 피팅시킨 그래프를 보여준다.
도 24는 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 해마 배양물에서의 세포사에 대한 NS2(CoreRx; DMSO 중의)의 효과를 보여준다. *는 HP 처리 단독과는 유의적으로 상이한 데이터 포인트를 나타낸다.
도 25는 EC50 값이 유도되는 곡선에 다양한 NS2(CoreRx; DMSO 중의) 농도에서 요오드화 프로피듐 데이터를 (상대적 형광 단위로) 피팅시킨 그래프를 보여준다.
도 26은 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과를 입증하는, Captisol® 중의 비-분쇄된 NS2(J-Star)에 대한 용량 반응 데이터를 보여준다. *는 HP 처리 단독과는 유의적으로 상이한 데이터 포인트를 나타낸다.
도 27은 EC50 값이 유도되는 곡선에 다양한 NS2(J-Star; DMSO 중의) 농도에서 CFDA 데이터를 (상대적 형광 단위로) 피팅시킨 그래프를 보여준다.
도 28은 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 해마 배양물에서의 세포사에 대한 효과를 입증하는, Captisol® 중의 비-분쇄된 NS2(J-Star)에 대한 용량 반응 데이터를 보여준다. *는 HP 처리 단독과는 유의적으로 상이한 데이터 포인트를 나타낸다.
도 29는 EC50 값이 유도되는 곡선에 다양한 NS2(Captisol® 중의 비-분쇄됨 (J-Star)) 농도에서 요오드화 프로피듐 데이터(상대적 형광 단위로)를 피팅시킨 그래프를 보여준다.
도 30은 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 해마 배양물에서의 뉴런 생존력에 대한 효과를 입증하는, DMSO 중의 비-분쇄된 NS2(J-Star)에 대한 용량 반응 데이터를 보여준다. *는 HP 처리 단독과는 유의적으로 상이한 데이터 포인트를 나타낸다.
도 31은 EC50 값이 유도되는 곡선에 다양한 비-분쇄된 NS2(DMSO 중의 (J-Star)) 농도에서 CFDA 데이터를 (상대적 형광 단위로) 피팅시킨 그래프를 보여준다.
도 32는 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 해마 세포에서의 세포사에 대한 효과를 보여주는, DMSO 중의 비-분쇄된 NS2(J-Star)에 대한 용량 반응 데이터를 보여준다. *는 HP 처리 단독과는 유의적으로 상이한 데이터 포인트를 나타낸다.
도 33은 EC50 값이 유도되는 곡선에 다양한 비-분쇄된 NS2(DMSO 중의 (J-Star)) 농도에서 요오드화 프로피듐 데이터를 (상대적 형광 단위로) 피팅시킨 그래프를 보여준다.
도 34는 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 세포 생존력에 대한 제형 비히클에 대한 용량 반응 데이터를 보여준다.
도 35는 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 세포사에 대한 제형 비히클에 대한 용량 반응 데이터를 보여준다.
도 36은 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 해마 배양물에서 뉴런 생존력에 대한 ALD-6(화합물 I-1)의 효과를 보여준다. *는 HP 처리 단독과는 유의적으로 상이한 데이터 포인트를 나타낸다.
도 37은 ALD-6으로 처리된 해마 배양물을 사용한 뉴런 생존력 검정에 대한 EC50 값 및 계산된 로지스틱 곡선을 보여준다.
도 38은 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 세포사에 대한 ALD-6의 용량 반응 효과를 보여준다. *는 HP 처리 단독과는 유의적으로 상이한 데이터 포인트를 나타낸다.
도 39는 ALD-6로 처리된 해마 배양물을 사용한 세포사 검정에 대한 EC50 값 및 계산된 로지스틱 곡선을 보여준다.
도 40은 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 ALD-5의 용량 반응 효과를 보여준다.
도 41은 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 세포사에 대한 ALD-5의 용량 반응 효과를 보여준다.
도 42는 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 ALD-2의 용량 반응 효과를 보여준다.
도 43은 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 세포사에 대한 ALD-2의 용량 반응 효과를 보여준다.
도 44 내지 도 46은 각 대조 화합물의 특이 결합의 백분율로서 표현된 NS2-D6에 대한 특이 결합 결과의 히스토그램을 보여준다.
도 47은 NS2-D6에 대한 효소 및 흡수 검정(uptake assay)에서의 시험관내 약리학 결과의 히스토그램을 보여준다.
1. 본 발명의 특정 측면에 대한 일반적인 설명
특정 양태에서, 본 발명은 발병에 알데히드 독성이 연관되는 질환, 장애 또는 병태의 치료, 예방, 및/또는 위험의 감소를 위한 화합물, 조성물, 및 방법을 제공한다. 몇몇 양태에서, 이러한 화합물은 본원에 기재된 화학식의 것, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하며, 여기서 각 변수는 본원에 정의되고 양태들에 기재된 바와 같다. 하나의 측면에서, 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
화학식 I
Figure pct00002
상기 화학식 I에서,
R1은 -NH2, -NHD, 또는 -ND2로부터 선택되고;
R2는 수소 또는 중수소로부터 선택되고;
R3 및 R4는 -CH3, -CH2D, -CHD2, 또는 -CD3으로부터 독립적으로 선택되고;
R5, R6, R7, 및 R8은 각각 수소 또는 중수소로부터 독립적으로 선택되고;
단, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
2. 정의
본 발명의 화합물은 상기 일반적으로 기재된 것들을 포함하며, 본원에 개시된 종류, 하위종류, 및 화학종에 의해 추가로 예시된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 달리 나타내지 않는 한 다음의 정의가 적용될 것이다. 본 발명의 목적을 위해, 화학 원소는 CAS 버전의 Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed의 원소 주기율표에 따라 식별된다. 추가로, 유기 화학의 일반적인 원리는 문헌[참조; "Organic Chemistry", Thomas Sorrell, University Science Books, Sausali 1999, and "March's Advanced Organic Chemistry", 5th Ed., Ed.: Smith, M.B. and March, J., John Wiley & Sons, New York: 2001]에 기재되어 있으며, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 타당한 의학적 판단, 범위내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 인간 및 하등 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합당한 이익/위험 비에 걸맞는 염을 가리킨다. 약제학적으로 허용되는 염은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들면, S. M. Berge 등은 본원에 참고로 포함된 문헌[참조; J. Pharmaceutical Sciences, 1977, 66, 1-19]에서 약제학적으로 허용되는 염을 상세하게 설명한다. 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염은 적합한 무기 및 유기 산 및 염기로부터 유도되는 것들을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 비독성 산 부가염의 예는 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기 산으로, 또는 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 석신산 또는 말론산과 같은 유기 산으로, 또는 이온 교환과 같은 당업계에서 사용되는 기타의 방법들을 사용하여 형성된 아미노 그룹의 염이다. 기타 약제학적으로 허용되는 염은 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠설포네이트, 벤조에이트, 비설페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르설포네이트, 시트레이트, 사이클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실설페이트, 에탄설포네이트, 포르메이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 글루코네이트, 헤미설페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 하이드로요오다이드, 2-하이드록시-에탄설포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 설페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄설포네이트, 2-나프탈렌설포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼설페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 석시네이트, 설페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, p-톨루엔설포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염 등을 포함한다.
적합한 염기로부터 유도되는 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄 및 N+(C1-4알킬)4 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 추가의 약제학적으로 허용되는 염은 경우에 따라 비독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 할라이드, 하이드록사이드, 카복실레이트, 설페이트, 포스페이트, 니트레이트, 저급 알킬 설포네이트 및 아릴 설포네이트와 같은 짝이온을 사용하여 형성된 아민 양이온을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 도시된 구조는 구조의 모든 이성체(예를 들면, 에난티오머성, 부분입체이성체성, 및 기하(또는 형태적) 이성체) 형태를 포함하는 것을 의미한다; 예를 들면, 각 비대칭 중심에 대한 R 및 S 배위, Z 및 E 이중 결합 이성체, 및 Z 및 E 형태 이성체. 따라서, 본 발명의 화합물의 단일 입체화학 이성체 뿐만 아니라 에난티오머, 부분입체이성체, 및 기하(또는 형태) 이성체 혼합물은 본 발명의 범위내에 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 화합물의 모든 호변이성체 형태는 본 발명의 범위내에 있다.
"망막"은 대략 1억 5천만개의 뉴런을 갖는 중추 신경계의 영역이다. 이는 눈의 뒤쪽에 위치하며 망막 색소 상피(RPE)라 불리는 특수한 상피 조직에 있다. 망막은 "광수용기"라고 불리는 특수한 뉴런에서 시각 자극을 변환시킴으로써 시각적 과정의 첫 단계를 개시한다. 이들의 시냅스 출력은 망막에서의 정교한 신경망에 의해 처리된 다음 뇌로 전달된다. 망막은 광범위한 빛 조건하에서 작동하는 두 개의 특수한 종류의 광수용기를 발달시켰다. "간상" 광수용기는 낮은 빛 조건하에서 시각 상을 변환시키고 전색맹(achromatic vision)을 매개한다. "원추" 광수용기는 어둑한 내지 밝은 빛 조건에서 시각 상을 변환시키고 색각 및 매우 예리한 시각(high acuity vision) 둘 다를 매개한다.
모든 광수용기는 "외절" 및 "내절"이라고 불리는 두 개의 영역으로 분류된다. 내절은 세포 핵을 함유하는 뉴런 세포체이다. 내절은 망막 질환의 부재하에서 일생 동안 생존한다. 외절은 감광성 시각 색소 분자가 적층된 막 구조의 조밀한 배열로 집중되어 있는 영역이다. 외절의 일부는 일상적으로 외절 재생이라 불리는 일주 과정(diurnal process)에서 탈락되고 재성장한다. 탈락된 외절은 RPE 세포에 의해 섭취되고 대사된다.
"황반"은 길고 가는 추상체에 의해 시각 상이 높은 공간적 디테일("시력")로 처리되는 와(fovea)를 함유하는 망막의 중심 영역이다. "황반 변성"은 황반을 공격하여 시야의 중심내 매우 예리한 시각을 파괴하는 망막 신경변성의 한 형태이다. 연령-관련 황반 변성(AMD)은 RPE 세포에서 리포푸신이라 불리는 잔류 리소좀 과립, 및 "드루젠"이라 불리는 세포외 침착물을 특징으로 하는 "건성형(dry form)"으로 시작된다. 드루젠은 RPE 세포에 의해 배출된 세포 폐기물을 함유한다. "리포푸신" 및 드루젠은 안과 의사에 의해 임상적으로 검출되고 형광 기법을 사용하여 정량될 수 있다. 이들은 황반 변성의 첫 임상 징후일 수 있다.
리포푸신은 A2E의 집합체를 함유한다. 리포푸신은 RPE 세포에 축적되며 다수의 공지된 메카니즘에 의해 이들을 독성화한다. RPE 세포가 독성화됨에 따라, 이들의 생화학적 활성이 감퇴되고 광수용기가 퇴화되기 시작한다. 세포외 드루젠은 혈관 영양분의 공급을 방해함으로써 RPE 세포를 더욱 손상시킬 수 있다. 드루젠은 또한 염증 과정을 촉발시키고, 이것이 습성형(wet form) AMD로 진행되는 10명 중 1명의 환자에서 황반의 맥락막 신생혈관 침입을 야기한다. 건성형 및 습성형 둘 다 실명으로 진행된다.
"ERG"는 망막전위도(electroretinogram)의 두문자어이며, 이는 실험적으로 정의된 광 자극에 대한 이의 반응 동안 망막 뉴런에 의해 방출되는 전기장 전위의 측정이다. ERG는 살아있는 대상체(인간 또는 동물)에서 또는 살아있는 동물로부터 수술적으로 제거된 용액내 편측절단, 안구에서 실시될 수 있는 비침습 측정이다.
본원에서 사용되는 용어 "RAL"은 레틴알데히드를 의미한다. 용어 "RAL-트랩"은 유리 RAL에 결합하여 막 포스파티딜에탄올아민(PE)과의 쉬프(Schiff) 염기 축합으로부터 RAL을 막아주는 치료 화합물을 의미한다. "유리 RAL"은 시각 회로 단백질에 결합되지 않은 RAL로 정의된다. 용어 "트랜스-RAL" 및 "모든-트랜스-RAL"은 상호교환 가능하게 사용되며 모든 트랜스-레틴알데히드를 의미한다.
A2E는 RPE 세포 및 광수용기 외절 둘 다에서 협력적으로 작동하는 "시각 회로"라고 불리는 복잡한 생화학적 경로의 반응 부산물이다. 시각 회로는, 비타민 A로부터 유도되고 시력에 필수적인 "레틴알데히드"라고 불리는 광반응성 알데히드 발색단을 재순환시킨다. 간단하게 말하자면, 시각 회로는 네 가지 주요 단계를 갖는다: 1) RPE에서 비타민 A를 하나의 광반응성 스트레인드(strained) 이중 결합(11-시스-RAL)을 갖는 알데히드 발색단으로 전환시키고; 2) 11-시스-RAL을 망막으로 수송하고, 여기서, 옵신이라고 불리는 특수 광수용기 단백질에 결합되며; 3) 광이 결합된 11-시스-RAL을 트랜스-RAL로 광이성화시키고, 이것이 옵신 결합 부위로부터의 결합된 RAL의 방출을 개시하며; 4) 트랜스-RAL(알데히드)을 비타민 A(알콜)로 전환시키고 비타민 A를 RPE로 되돌려 보내며 여기서 사이클이 다시 시작된다.
RAL의 알데히드 그룹은 옵신 결합 부위에서 아미노산 측쇄에의 가역적 화학 결합을 형성함으로써 옵신에 분자가 결합하는 것을 돕는다. RAL 상의 알데히드 그룹이 분자를 옵신 결합 부위에 고정(anchoring)하는데 필수적이기는 하지만, 이는 다른 생물학적 아민과 쉬프 염기를 형성하는 이들의 성향 때문에 위험하다. 처음 세 가지 반응은 광수용기 외절에서 일어나며 A2PE라고 불리는 중간 산물을 생산한다. 일단, 형성되면, A2PE는 지질 상 내로 분배되고 광수용기 외절 막에 축적된다. RPE 세포가 폐기된 외절을 섭취하는 경우, 이들의 축적된 A2PE가 리소좀으로 보내어진다.
상기한 바와 같이, 병인이 A2E 및/또는 리포푸신의 축적을 수반하는 황반 변성 및 다른 형태의 망막 질환은 형성된 A2E의 양을 낮춤으로써 치료되거나 예방될 수 있다. 이렇게 하는데 유용한 화합물은 RAL-트랩을 포함한다. RAL-트랩은, 예를 들면 격리되지 않은 RAL과 공유 결합을 형성함으로써 형성된 A2E의 양을 낮춘다. RAL-트랩 화합물과 반응한 RAL은 이에 의해 포스파티딜 에탄올아민과 반응할 수 없다.
본 발명은 또한 발병에 알데히드 독성이 연관되는 질환, 장애, 또는 병태의 치료, 예방, 및/또는 위험의 감소를 위한 약제의 제조에 있어서의 본원에 기재된 화합물의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 이러한 측면은 (1) 각막 질환(예를 들면, 안구 건조증, 백내장, 원추각막, 물집 및 기타 각막병증, 및 푹스 내피세포 이상증), 기타의 안과 장애 또는 병태(예를 들면, 알레르기 결막염, 안구 반흔성 유천포창, PRK 치료 및 기타 각막 치료와 관련된 병태, 및 눈물 지질 분해 또는 누선 기능장애와 관련된 병태), 및 염증의 결과로서 높은 알데히드 수준과 관련된 기타의 안과 병태(예를 들면, 포도막염, 공막염, 안과 스티븐스 존슨 증후군, 및 (마이봄선 기능장애를 갖거나 갖지 않는) 안구 주사)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 안과 질환, 장애, 또는 병태, (2) 피부 장애 또는 병태 또는 미용 증상(cosmetic indication)의 치료, 예방, 및/또는 이의 위험의 감소를 위한 약제의 제조에 있어서의 본원에 기재된 화합물의 용도에 관한 것이다. 예를 들면, 질환, 장애, 또는 병태는 건선, 국소 (원판상) 루푸스, 접촉 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 방사선 피부염, 여드름, 쇼그렌-라르슨 증후군 및 기타 어린선, 일광 탄력섬유증/주름, 피부 톤 견고성, 부기, 습진, 흡연 또는 자극물 유도된 피부 변화, 피부 절개, 및 화상 및 상처와 관련된 피부 병태, (3) 수포작용제의 독성 효과 또는 알칼리제로부터의 화상과 관련된 병태, 또는 (4) 자가면역, 면역-매개, 염증, 심혈관, 또는 신경 질환(예를 들면, 루푸스, 피부경화증, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 패혈증, 죽상동맥경화증, 허혈성-재관류 손상, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 당뇨병, 대사 증후군, 및 섬유증 질환)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 발병에 알데히드 독성이 연관되는 질환, 장애, 또는 병태를 치료, 예방, 및/또는 위험을 감소시키는데 있어서의 본원에 기재된 화합물의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명의 이러한 측면은 (1) 각막 질환(예를 들면, 안구 건조증, 백내장, 원추각막, 물집 및 기타 각막병증, 및 푹스 내피세포 이상증), 기타의 안과 장애 또는 병태(예를 들면, 알레르기 결막염, 안구 반흔성 유천포창, PRK 치료 및 기타 각막 치료와 관련된 병태, 및 눈물 지질 분해 또는 누선 기능장애와 관련된 병태), 및 염증의 결과로서 높은 알데히드 수준과 관련된 기타의 안과 병태(예를 들면, 포도막염, 공막염, 안과 스티븐스 존슨 증후군, 및 (마이봄선 기능장애를 갖거나 갖지 않는) 안구 주사)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 안과 질환, 장애, 또는 병태, (2) 피부 장애 또는 병태 또는 미관 증상의 치료, 예방, 및/또는 위험을 감소시키는데 있어서의 본원에 기재된 화합물의 용도에 관한 것이다. 예를 들면, 질환, 장애, 또는 병태는 건선, 국소 (원판상) 루푸스, 접촉 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 방사선 피부염, 여드름, 쇼그렌-라르슨 증후군 및 기타 어린선, 일광 탄력섬유증/주름, 피부 톤 견고성, 부기, 습진, 흡연 또는 자극물 유도된 피부 변화, 피부 절개, 및 화상 및 상처와 관련된 피부 병태, (3) 수포작용제의 독성 효과 또는 알칼리제로부터의 화상과 관련된 병태, 또는 (4) 자가면역, 면역-매개된, 염증, 심혈관, 또는 신경 질환(예를 들면, 루푸스, 피부경화증, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 패혈증, 죽상동맥경화증, 허혈성-재관류 손상, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 당뇨병, 대사 증후군, 및 섬유증 질환)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본원에 기재된 화합물은 또한 국소적으로, 예를 들면, 눈에 직접, 예를 들면, 점안액 또는 안 연고로서 투여될 수 있다. 점안액은 전형적으로 유효량의 본원에 기재된 적어도 하나의 화합물 및 눈에 안전하게 적용할 수 있는 담체를 포함한다. 예를 들면, 점안액은 등장성 용액의 형태이며, 용액의 pH는 눈의 자극이 없도록 조절된다. 다수의 경우에, 상피 장막이 눈으로의 분자의 침투를 방해한다. 따라서, 가장 최근에 사용되는 안과 약물에는 몇 가지 형태의 침투 촉진제가 보충된다. 이러한 침투 촉진제는 가장 우월한 상피 세포의 견고한 접합부를 느슨하게 함으로써 작용한다(Burstein, Trans Ophthalmol Soc UK 104: 402 (1985); Ashton et al., J Pharmacol Exp Ther 259: 719 (1991); Green et al., Am J Ophthalmol 72: 897 (1971)). 가장 흔히 사용되는 침투 촉진제는 벤즈알코늄 클로라이드이며(Tang et al., J Pharm Sci 83: 85 (1994); Bursteinet al, Invest Ophthalmol Vis Sci 19: 308 (1980)), 이는 또한 미생물 오염에 대한 보존제로서 작용한다.
국소 투여는 크림, 현탁액, 에멀젼, 연고, 드롭, 오일, 로션, 패치, 테이프, 흡입제, 스프레이, 또는 겔, 필름, 패치, 및 접착제를 포함한 제어 방출 국소 제형의 형태일 수 있다. 안내 투여는 결막하, 서브테논(subtenon) 캡슐, 연수후부 또는 유리체내 주사, 데포트 또는 임플란트의 형태를 취할 수 있다. 이러한 경로에 의해 투여되는 화합물은 용액 또는 현탁액 형태일 수 있다. 데포트 주사에 의한 화합물의 투여는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 함유할 수 있으며; 이들은 천연 또는 합성일 수 있고 생분해성 또는 비-생분해성일 수 있으며 제어된 방식으로 약물 방출을 촉진시킨다. 화합물의 제어 방출에 사용되는 임플란트는 천연 또는 합성, 생분해성 또는 비-생분해성 물질로 이루어질 수 있다. 담체는 조성물의 다른 성분들과 상용성이며 환자에게 해롭지 않다는 점에서 허용 가능하다. 담체의 몇 가지 예는 (1) 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당, (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분, (3) 셀룰로스 및 (4) 사이클로덱스트린을 포함한다. 유용한 국소 제형이 PCT 공개 제WO 2011/072141호에 기재되어 있으며, 이의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
피부에 국소 투여하기 위한 제형은, 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체 중의 1급 아민 화합물을 포함하는 연고, 크림, 겔 및 페이스트를 포함할 수 있다. 국소 사용을 위한 1급 아민 화합물의 제형은 당업계에 널리 알려진 바와 같이 유성 또는 수용성 연고 베이스의 제조를 포함한다. 예를 들면, 이러한 제형은 식물성 오일, 동물 지방, 및 예를 들면, 석유로부터 수득된 반고체 탄화수소를 포함할 수 있다. 사용되는 특정 성분들은 백색 연고, 황색 연고, 세틸 에스테르 왁스, 올레산, 올리브유, 파라핀, 석유, 백색 석유, 경랍, 전분 글리세라이트, 백색 왁스, 황색 왁스, 라놀린, 무수 라놀린 및 글리세릴 모노스테아레이트를 포함할 수 있다. 글리콜 에테르 및 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리옥실 40 스테아레이트 및 폴리소르베이트를 포함한 다양한 수용성 연고 베이스가 또한 사용될 수 있다.
국소 투여용 제형은 0.001 내지 10%, 0.05 내지 10%, 0.1 내지 10%, 0.2 내지 10%, 0.5 내지 10%, 1 내지 10%, 2 내지 10%, 3 내지 10%, 4 내지 10%, 5 내지 10%, 또는 7 내지 10% (중량/용적)의 범위, 또는 0.001 내지 2.0%, 0.001 내지 1.5%, 또는 0.001 내지 1.0%, (중량/용적)의 범위, 또는 0.05 내지 2.0%, 0.05 내지 1.5%, 또는 0.05 내지 1.0%, (중량/용적)의 범위, 또는 0.1 내지 5.0%, 0.1 내지 2.0%, 0.1 내지 1.5%, 또는 0.1 내지 1.0% (중량/용적)의 범위, 또는 0.5 내지 5.0%, 0.5 내지 2.0%, 0.5 내지 1.5%, 또는 0.5 내지 1.0% (중량/용적)의 범위, 또는 1 내지 5.0%, 1 내지 2.0%, 또는 1 내지 1.5% (중량/용적)의 범위의 농도로 본원에서 사용되는 화합물을 함유할 수 있다. 국소 투여용 제형은 또한 0.001 내지2.5%, 0.01 내지 2.5%, 0.05 내지 2.0%, 0.1 내지 2.0%, 0.2 내지 2.0%, 0.5 내지 2.0%, 또는 1 내지 2.0% (중량/중량)의 범위, 또는 0.001 내지 2.0%, 0.001 내지 1.5%, 0.001 내지 1.0%, 또는 0.001 내지 5% (중량/중량)의 범위의 농도로 본원에서 사용되는 화합물을 함유할 수 있다.
점안액 제형에서 조성물은 용액에의 pH 및/또는 삼투 조절의 존재 또는 부재하에 0.01 내지 20%, 0.02 내지 15%, 0.04 내지 10%, 0.06 내지 5%, 0.08 내지 1%, 또는 0.09 내지 0.5% (중량/용적)의 농도로 활성 화합물을 함유할 수 있다. 보다 특히, 점안액 제형은 0.09 내지 0.5% (중량/용적), 예를 들면 0.1%의 농도로 본원에 기재된 화합물을 함유할 수 있다.
한 가지 예시에서, 약제학적 조성물은 치료학적 유효량의 본원에 기재된 화합물을, 올리고머성 또는 중합체성 담체, 예를 들면, 사이클로덱스트린, 또는 트리메틸-β-사이클로덱스트린, 2-하이드록시에틸-β-사이클로덱스트린, 2-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 3-하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 및 β-사이클로덱스트린 설포부틸에테르 나트륨 염(또는 칼륨 염)을 포함한 화학적으로 개질된 사이클로덱스트린과 혼합함으로써 제조된 조성물을 포함한다. 올리고머성 또는 중합체성 담체를 예시하자면 β-사이클로덱스트린 설포부틸에테르 나트륨 염이 있다. 조성물 중의 β-사이클로덱스트린 설포부틸에테르 나트륨 염의 양은 약 0.01% 내지 30% 중량/용적에 이를 수 있다. 한 가지 예시에서, β-사이클로덱스트린 설포부틸에테르 나트륨 염의 농도는 5 내지 25% 중량/용적이다. β-사이클로덱스트린 설포부틸에테르 나트륨 염의 농도를 추가로 예시하면 6 내지 20%중량/용적이다. 하나의 예시에서 β-사이클로덱스트린 설포부틸에테르의 농도는 6 내지 12% 중량/용적이다. β-사이클로덱스트린 설포부틸에테르의 농도를 추가로 예시하면 9.5% 중량/용적을 포함한 9 내지 10% 중량/용적이다. 조성물 중의 본원에 기재된 화합물의 양은 0.01 내지 20%, 0.02 내지 15%, 0.04 내지 10%, 0.06 내지 5%, 0.08 내지 1%, 또는 0.09 내지 0.5% (중량/용적)에 이를 수 있다. 보다 특히, 조성물은 0.1%와 같은 0.09 내지 0.5% (중량/용적)의 농도로 본원에 기재된 화합물을 함유할 수 있다.
본원에 기재된 화합물은 경구 투여될 수 있으며 이로서 활성 성분을 함유하는 약제학적 조성물은, 예를 들면, 정제, 트로키제, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭시르로서 경구 사용에 적합한 형태일 수 있다. 경구 사용을 위해 의도된 조성물은 약제학적 조성물의 제조를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있으며 이러한 조성물은 약제학적으로 훌륭하고 맛이 좋은 제제를 제공하기 위해 감미제, 방향제, 착색제 및 보존제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 제제를 함유할 수 있다.
정제 또는 캡슐(예를 들면, 젤라틴 캡슐) 형태의 경구 투여를 위해, 활성 약물 성분을 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 비독성 약제학적으로 허용되는 불활성 담체와 배합할 수 있다. 더욱이, 경우에 따라 또는 필요에 따라, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 착색제를 또한 혼합물에 혼입할 수 있다. 적합한 결합제는 전분, 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로스, 나트륨 카복시메틸셀룰로스 및/또는 폴리비닐피롤리돈, 천연 당, 예를 들면, 글루코스 또는 베타-락토스, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 검, 예를 들면, 아카시아, 트래거캔트 또는 나트륨 알기네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 왁스 등을 포함한다. 이러한 투여형에 사용되는 윤활제는 나트륨 올레에이트, 나트륨 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 염화나트륨, 실리카, 탤컴, 스테아르산, 이의 마그네슘 또는 칼슘 염 및/또는 폴리에틸렌글리콜 등을 포함한다. 붕해제는 전분, 메틸 셀룰로스, 한천, 벤토나이트, 크산탄 검 전분, 한천, 알긴산 또는 이의 나트륨 염, 또는 포화제(effervescent mixture), 크로스카멜로스 또는 이의 나트륨 염 등을 제한 없이 포함한다. 희석제는, 예를 들면, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 만니톨, 소르비톨, 셀룰로스 및/또는 글리신을 포함한다.
정제는 정제의 제조에 적합한 비독성 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합된 활성 성분을 함유한다. 이러한 부형제는, 예를 들면, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨과 같은 불활성 희석제; 과립화제 및 붕해제, 예를 들면, 옥수수 전분, 또는 알긴산; 결합제, 예를 들면 전분, 젤라틴 또는 아카시아, 및 윤활제, 예를 들면 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석일 수 있다. 정제는 피복되지 않을 수 있거나 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시켜 장기간에 걸친 지속된 작용을 제공하기 위해 공지된 기술로 피복될 수 있다.
경구 제형에서의 본원에 기재된 화합물의 치료학적 유효량은 1일당 0.01mg/kg 내지 50mg/kg 환자 체중, 보다 특히 0.01 내지 10mg/kg 환자 체중으로 다양할 수 있으며, 이는 1일당 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 경구 투여를 위해 약물은 1mg 내지 500mg의 활성 성분, 구체적으로, 1mg, 5mg, 10mg, 20mg, 50mg, 100mg, 250mg, 및 500mg을 함유하는 정제 또는 캡슐 형태로, 또는 적어도 1%, 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50% (w/w)의 활성 성분을 함유하는 정제 또는 캡슐 형태로 전달될 수 있다. 예를 들면, 캡슐은 50mg의 활성 성분, 또는 5 내지 10% (w/w)의 활성 성분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 정제는 100mg의 활성 성분, 또는 20 내지 50% (w/w)의 활성 성분을 함유할 수 있다. 예를 들면, 정제는, 활성 성분 이외에, 붕해제(예를 들면, 크로스카멜로스 또는 이의 나트륨 염 및 메틸 셀룰로스), 희석제(예를 들면, 미세결정성 셀룰로스), 및 윤활제(예를 들면, 나트륨 스테아레이트 및 마그네슘 스테아레이트)를 함유할 수 있다. 약물은 매일 기준으로 1일당 1회, 2회 또는 그 이상 투여될 수 있다.
흡입에 의한 투여를 위해, 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 이산화탄소와 같은 가스를 함유하는 가압 용기 또는 분배기, 또는 분무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 전달된다.
경점막 또는 경피 투여를 위해, 침투하고자 하는 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들면, 경점막 투여를 위해, 세제, 담즙염, 및 푸시드산 유도체를 포함한다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약의 사용을 통해 달성될 수 있다. 경피 투여를 위해, 활성 화합물은 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같은 연고, 고약, 겔, 또는 크림으로 제형화된다.
본원에 기재된 화합물을 포함하는 비경구 제형은 수성 등장성 용액 또는 현탁액으로 제조될 수 있으며, 좌제는 지방 에멀젼 또는 현탁액으로부터 유리하게 제조된다. 제형은 살균될 수 있고/살균될 수 있거나 보존제, 안정제, 습윤제 또는 유화제, 용해 촉진제, 삼투압을 조절하기 위한 염 및/또는 완충제와 같은 보조제(adjuvant)를 함유할 수 있다. 또한, 이들은 다른 치료학적으로 귀중한 물질을 함유할 수도 있다. 조성물은 통상의 방법에 따라 제조되며, 약 0.1 내지 75%, 바람직하게는 약 1 내지 50%의 본원에 기재된 화합물을 함유할 수 있다.
어구 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여된"은 당업계에 인지된 용어이고, 주사와 같은 장관 및 국소 투여 이외의 투여 모드를 포함하며, 제한 없이 정맥내, 근육내, 흉강내, 혈관내, 심낭내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
3. 예시적인 화합물에 대한 설명
중수소(D 또는 2H)는 수소의 안정한 비-방사성 동위원소이며 2.0144의 원자량을 갖는다. 수소는 동위원소 1H(수소 또는 프로튬), D(2H 또는 중수소), 및 T(3H 또는 트리튬)의 혼합물로서 자연적으로 발생한다. 당업계의 숙련가는 수소-함유 화학적 화합물에서 명칭 "수소"는 실제로 수소와 약 0.015% 중수소의 혼합물을 나타냄을 인지한다.
어느 하나의 부위에서의 완전한 중수소화, 또는 100% 중수소화는, 실험실에서 달성하기가 어려울 수 있다. 중수소 원자가 주어진 부위에서 본원에 기재된 임의의 화합물에 대해 나타내어지는 경우, 작은 백분율의 수소가 여전히 존재할 수 있는 것으로 이해된다. 이러한 화합물을 중수소가 풍부하다고 말한다. 중수소-풍부화된 화합물은 적당하게 풍부화된 출발 물질을 사용한 합성을 통해 제조된다. 본원에서 사용되는 용어 "중수소-풍부화된" 또는 "중수소 풍부화"는 이의 천연 동위원소 존재비(0.015%)보다 큰 양으로 중수소를 포함하는 화합물 또는 상기 화합물의 특정 부위를 가리킨다. 따라서, 몇몇 양태에서, 본 발명은 주어진 부위에 중수소를 포함하는 화합물을 제공하며, 여기서 중수소 혼입의 백분율 또는 수준은 이의 천연 동위원소 존재비보다 크다.
하나의 측면에 따르면, 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
화학식 I
Figure pct00003
상기 화학식 I에서,
R1은 -NH2, -NHD, 또는 -ND2로부터 선택되고;
R2는 수소 또는 중수소로부터 선택되고;
R3 및 R4는 -CH3, -CH2D, -CHD2, 또는 -CD3으로부터 독립적으로 선택되고;
R5, R6, R7, 및 R8은 각각 수소 또는 중수소로부터 독립적으로 선택되고;
단, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 화학식 I-A의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
[화학식 I-A]
Figure pct00004
상기 화학식 I-A에서,
R1은 -NH2, -NHD, 또는 -ND2로부터 선택되고;
R2는 수소 또는 중수소로부터 선택되고;
R3 및 R4는 -CH3, -CH2D, -CHD2, 또는 -CD3으로부터 독립적으로 선택되고;
R5, R6, R7, 및 R8은 각각 수소 또는 중수소로부터 독립적으로 선택되고;
단, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 화학식 II-A 또는 II-B의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
[화학식 II-A]
Figure pct00005
[화학식 II-B]
Figure pct00006
상기 화학식 II-A 및 II-B에서,
R1은 -NH2, -NHD, 또는 -ND2로부터 선택되고;
R2는 수소 또는 중수소로부터 선택되고;
R3 및 R4는 -CH3, -CH2D, -CHD2, 또는 -CD3으로부터 독립적으로 선택되고;
R5, R6, R7, 및 R8은 각각 수소 또는 중수소로부터 독립적으로 선택되고;
단, 화학식 II-A에서의 R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 화학식 III-A, III-B, 또는 III-C의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
[화학식 III-A]
Figure pct00007
[화학식 III-B]
Figure pct00008
[화학식 III-C]
Figure pct00009
상기 화학식 III-A, III-B, 및 III-C에서,
R1은 -NH2, -NHD, 또는 -ND2로부터 선택되고;
R2는 수소 또는 중수소로부터 선택되고;
R3 및 R4는 -CH3, -CH2D, -CHD2, 또는 -CD3으로부터 독립적으로 선택되고;
R5, R6, R7, 및 R8은 각각 수소 또는 중수소로부터 독립적으로 선택되고;
단, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 화학식 IV의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
[화학식 IV]
Figure pct00010
상기 화학식 IV에서,
R1은 -NH2, -NHD, 또는 -ND2로부터 선택되고;
R2는 수소 또는 중수소로부터 선택되고;
R3 및 R4는 -CH3, -CH2D, -CHD2, 또는 -CD3으로부터 독립적으로 선택되고;
R5, R6, R7, 및 R8은 각각 수소 또는 중수소로부터 독립적으로 선택되고;
단, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 화학식 V의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
[화학식 V]
Figure pct00011
상기 화학식 V에서,
R1은 -NH2, -NHD, 또는 -ND2로부터 선택되고;
R2는 수소 또는 중수소로부터 선택되고;
R3 및 R4는 -CH3, -CH2D, -CHD2, 또는 -CD3으로부터 독립적으로 선택되고;
R5, R6, R7, 및 R8은 각각 수소 또는 중수소로부터 독립적으로 선택되고;
단, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 화학식 VI-A 또는 VI-B의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
[화학식 VI-A]
Figure pct00012
[화학식 VI-B]
Figure pct00013
상기 화학식 VI-A 및 VI-B에 있어서,
각각의 A는 독립적으로 수소 또는 중수소이고;
R1은 -NH2, -NHD, 또는 -ND2로부터 선택되고;
R2는 수소 또는 중수소로부터 선택되고;
R5, R6, R7, 및 R8은 각각 수소 또는 중수소로부터 독립적으로 선택되고;
단, A, R1, R2, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 화학식 VII-A 또는 VII-B의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
[화학식 VII-A]
Figure pct00014
[화학식 VII-B]
Figure pct00015
상기 화학식 VII-A 및 VII-B에서,
각각의 A는 독립적으로 수소 또는 중수소이고;
R1은 -NH2, -NHD, 또는 -ND2로부터 선택되고;
R2는 수소 또는 중수소로부터 선택되고;
R3 및 R4는 -CH3, -CH2D, -CHD2, 또는 -CD3으로부터 독립적으로 선택되고;
R8은 수소 또는 중수소로부터 선택되고;
단, R1, R2, R3, R4, A, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 화학식 VIII-A 또는 VIII-B의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
[화학식 VIII-A]
Figure pct00016
[화학식 VIII-B]
Figure pct00017
상기 화학식 VIII-A 및 VIII-B에서,
각각의 A는 독립적으로 수소 또는 중수소이고;
R1은 -NH2, -NHD, 또는 -ND2로부터 선택되고;
R2는 수소 또는 중수소로부터 선택되고;
R3 및 R4는 -CH3, -CH2D, -CHD2, 또는 -CD3으로부터 독립적으로 선택되고;
R5 및 R8은 각각 수소 또는 중수소로부터 독립적으로 선택되고;
단, A, R1, R2, R3, R4, R5, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 화학식 IX-A 또는 IX-B의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
[화학식 IX-A]
Figure pct00018
[화학식 IX-B]
Figure pct00019
상기 화학식 IX-A 및 IX-B에서,
R1은 -NH2, -NHD, 또는 -ND2로부터 선택되고;
R2는 수소 또는 중수소로부터 선택되고;
R3 및 R4는 -CH3, -CH2D, -CHD2, 또는 -CD3으로부터 독립적으로 선택되고;
R5, R6, R7, 및 R8은 각각 수소 또는 중수소로부터 독립적으로 선택되고;
단, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 화학식 X의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
[화학식 X]
Figure pct00020
상기 화학식 X에서,
R1은 -NH2, -NHD, 또는 -ND2로부터 선택되고;
R2는 수소 또는 중수소로부터 선택되고;
R3 및 R4는 -CH3, -CH2D, -CHD2, 또는 -CD3으로부터 독립적으로 선택되고;
R5 및 R6은 각각 수소 또는 중수소로부터 독립적으로 선택되고;
단, R1, R2, R3, R4, R5, 또는 R6 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
다음의 양태들은 상기 화학식 각각에 적용 가능하다.
상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같이, R1은 -NH2, -NHD, 또는 -ND2로부터 선택된다.
몇몇 양태에서, R1은 -NH2이다. 몇몇 양태에서, R1은 -NH2이고 R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
몇몇 양태에서, R1은 -NHD이다. 몇몇 양태에서, R1은 -NHD이고 R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
몇몇 양태에서, R1은 -ND2이다. 몇몇 양태에서, R1은 -ND2이고 R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같이, A는 수소 또는 중수소로부터 선택된다.
몇몇 양태에서, A는 수소이다. 몇몇 양태에서, A는 수소이고 R1, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다. 몇몇 양태에서, A는 중수소이다. 몇몇 양태에서, A는 중수소이고 R1, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같이, R2는 수소 또는 중수소로부터 선택된다.
몇몇 양태에서, R2는 수소이다. 몇몇 양태에서, R2는 수소이고 R1, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다. 몇몇 양태에서, R2는 중수소이다. 몇몇 양태에서, R2는 중수소이고 R1, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같이, R3은 -CH3, -CH2D, -CHD2, 또는 -CD3으로부터 선택된다.
몇몇 양태에서, R3은 -CH3이다. 몇몇 양태에서, R3은 -CH3이고 R1, R2, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
몇몇 양태에서, R3은 -CH2D이다. 몇몇 양태에서, R3은 -CH2D이고 R1, R2, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
몇몇 양태에서, R3은 -CHD2이다. 몇몇 양태에서, R3은 -CHD2이고 R1, R2, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
몇몇 양태에서, R3은 -CD3이다. 몇몇 양태에서, R3은 -CD3이고 R1, R2, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같이, R4는 -CH3, -CH2D, -CHD2, 또는 -CD3으로부터 선택된다.
몇몇 양태에서, R4는 -CH3이다. 몇몇 양태에서, R4는 -CH3이고 R1, R2, R3, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
몇몇 양태에서, R4는 -CH2D이다. 몇몇 양태에서, R4는 -CH2D이고 R1, R2, R3, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
몇몇 양태에서, R4는 -CHD2이다. 몇몇 양태에서, R4는 -CHD2이고 R1, R2, R3, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
몇몇 양태에서, R4는 -CD3이다. 몇몇 양태에서, R4는 -CD3이고 R1, R2, R3, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같이, R5는 수소 또는 중수소로부터 선택된다.
몇몇 양태에서, R5는 수소이다. 몇몇 양태에서, R5는 수소이고 R1, R2, R3, R4, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다. 몇몇 양태에서, R5는 중수소이다. 몇몇 양태에서, R5는 중수소이고 R1, R2, R3, R4, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같이, R6은 수소 또는 중수소로부터 선택된다.
몇몇 양태에서, R6은 수소이다. 몇몇 양태에서, R6은 수소이고 R1, R2, R3, R4, R5, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다. 몇몇 양태에서, R6은 중수소이다. 몇몇 양태에서, R6은 중수소이고 R1, R2, R3, R4, R5, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같이, R7은 수소 또는 중수소로부터 선택된다.
몇몇 양태에서, R7은 수소이다. 몇몇 양태에서, R7은 수소이고 R1, R2, R3, R4, R5, R6, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다. 몇몇 양태에서, R7은 중수소이다. 몇몇 양태에서, R7은 중수소이고 R1, R2, R3, R4, R5, R6, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같이, R8은 수소 또는 중수소로부터 선택된다.
몇몇 양태에서, R8은 수소이다. 몇몇 양태에서, R8은 수소이고 R1, R2, R3, R4, R5, R6, 또는 R7 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다. 몇몇 양태에서, R8은 중수소이다. 몇몇 양태에서, R8은 중수소이고 R1, R2, R3, R4, R5, R6, 또는 R7 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 함유한다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 화학식 I, I-A, II-A, II-B, III-A, III-B, III-C, IV, 또는 V의 화합물을 제공하며, 여기서, 각각의 R3, R4, R5, R6, R7, 및 R8은 상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같고, 각각의 R1 및 R2는 아래 표 1a에 제시된 엔트리 세트에 정의된 바와 같다.
[표 1a]
Figure pct00021
몇몇 양태에서, 본 발명은 화학식 I, I-A, II-A, II-B, III-A, III-B, III-C, IV, 또는 V의 화합물을 제공하며, 여기서, 각각의 R1, R2, R5, R6, R7, 및 R8은 상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같고, 각각의 R3 및 R4는 아래 표 1b에 제시된 엔트리 세트에 정의된 바와 같다.
[표 1b]
Figure pct00022
몇몇 양태에서, 본 발명은 화학식 I, I-A, II-A, II-B, III-A, III-B, III-C, IV, 또는 V의 화합물을 제공하며, 여기서, 각각의 R1, R2, R3, 및 R4는 상기 정의되고 본원에 기재된 바와 같고, 각각의 R5, R6, R7, 및 R8은 아래 표 1c에 제시된 엔트리 세트에 정의된 바와 같다.
[표 1c]
Figure pct00023
몇몇 양태에서, 본 발명은 화학식 I, I-A, II-A, II-B, III-A, III-B, III-C, IV, 또는 V의 화합물을 제공하며, 여기서, 각각의 R1 및 R2는 상기 표 1a에 제시된 엔트리 세트에 정의된 바와 같고, 각각의 R3 및 R4는 상기 표 1b에 제시된 엔트리 세트에 정의된 바와 같고, 각각의 R5, R6, R7, 및 R8은 상기 표 1c에 제시된 엔트리 세트에 정의된 바와 같다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 표 1a, 표 1b, 또는 표 1c 중의 어느 것에 인용된 것들로부터 선택된 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 아래 표 2에 나타낸 것들로부터 선택된 화학식 I의 화합물을 제공한다.
[표 2] 대표적인 화학식 I의 화합물
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
몇몇 양태에서, 본 발명은 상기 표 2에 나타낸 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 아래 표 2A에 나타낸 화합물의 중수소-풍부 유사체, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공하며, 여기서 중수소는 임의의 이용 가능한 수소에서 풍부화된다.
[표 2A]
Figure pct00055
Figure pct00056
Figure pct00057
Figure pct00058
Figure pct00059
Figure pct00060
Figure pct00061
Figure pct00062
Figure pct00063
Figure pct00064
Figure pct00065
Figure pct00066
Figure pct00067
Figure pct00068
Figure pct00069
Figure pct00070
몇몇 양태에서, 본 발명은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 또는 13개 중수소 원자를 포함하는 임의의 본원에 기재된 화합물을 제공한다.
몇몇 양태에서, 제공된 화합물은 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 100%의 양으로 중수소를 포함한다. 중수소 풍부화의 맥락에서 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약"은 ±2%를 의미한다.
특정 양태에서, 본 발명은 상기 및 본원에 기재된 임의의 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
몇몇 양태에서, 본 발명은 상기 및 본원에 기재된 임의의 화합물을 분리된 형태로 제공한다.
4. 화합물 및 이의 약제학적으로 허용되는 조성물의 용도
본원에 기재된 특정 화합물은 MDA 및 HNE와 같은 독성 알데히드를 제거하는데 유용한 것으로 밝혀졌다. 본원에 기재된 화합물은 MDA, HNE, 또는 다른 독성 알데히드와 쉬프 염기 축합을 겪고, 에너지적으로 유리한 반응으로 알데히드와 착물을 형성하여, 단백질, 지질, 탄수화물, 또는 DNA와의 반응에 이용 가능한 알데히드를 감소 또는 제거한다. 중요하게도, 본원에 기재된 화합물은 알데히드와 반응하여 알데히드를 함유하는 폐환 구조를 갖는 화합물을 형성할 수 있어, 알데히드를 포획하고 알데히드가 세포 환경으로 다시 방출되는 것을 방지한다.
본원에서 사용되는 용어 "치료", "치료하다" 및 "치료하는"은 본원에 기재된 바와 같은 질환 또는 장애, 또는 이의 하나 이상의 증상을 역전, 완화, 개시 지연, 또는 억제함을 가리킨다. 몇몇 양태에서, 치료는 하나 이상의 증상이 발병한 후 투여된다. 다른 양태에서, 치료는 증상의 부재시 투여된다. 예를 들면, 치료는 (예를 들면, 증상의 이력에 비추어 그리고/또는 유전적 또는 다른 감수성 인자에 비추어) 증상의 개시 전에 민감한 개체에게 투여된다. 치료는 또한 증상이 해결되어, 예를 들면 증상의 재발을 예방하거나 지연하거나 중증도를 감소시킨 후에도 계속된다.
본 발명은 발병에 알데히드 독성이 연관되는 질환, 장애 또는 병태의 치료, 예방, 및/또는 위험 감소를 위한 본원에 기재된 화합물에 관한 것이다.
알데히드 독성이 연관되는 질환, 장애 또는 병태의 예는 각막 질환(예를 들면, 안구 건조증, 백내장, 원추각막, 물집 및 기타 각막병증, 및 푹스 내피세포 이상증), 기타의 안과 장애 또는 병태(예를 들면, 알레르기 결막염, 안구 반흔성 유천포창, PRK 치료 및 기타 각막 치료와 관련된 병태, 및 눈물 지질 분해 또는 누선 기능장애와 관련된 병태), 및 염증의 결과로서 높은 알데히드 수준과 관련된 기타의 안과 병태(예를 들면, 포도막염, 공막염, 안과 스티븐스 존슨 증후군, 및 (마이봄선 기능장애를 갖거나 갖지 않는) 안구 주사)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 안과 질환, 장애, 또는 병태를 포함한다. 하나의 예에서, 안과 질환, 장애, 또는 병태는 황반 변성, 예를 들면, 연령-관련 황반 변성("AMD"), 또는 스타르카르트병은 아니다. 추가의 예에서, 안과 질환, 장애, 또는 병태는 안구 건조증, 안구 주사, 또는 포도막염이다.
알데히드 독성이 연관되는 질환, 장애, 병태 또는 증상의 예는 또한 건선, 국소 (원판상) 루푸스, 접촉 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 방사선 피부염, 여드름, 쇼그렌-라르슨 증후군 및 기타 어린선, 일광 탄력섬유증/주름, 피부 톤 견고성, 부기, 습진, 흡연 또는 자극물 유도된 피부 변화, 피부 절개, 화상 및/또는 상처와 관련된 피부 병태, 루푸스, 피부경화증, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 패혈증, 죽상동맥경화증, 허혈성-재관류 손상, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 석신산 세미알데히드 데하이드로게나제 결핍증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 당뇨병, 대사 증후군, 연령-관련 장애, 및 섬유증 질환을 포함하는 비-안과 장애를 포함한다. 추가의 예에서, 비-안과 장애는 접촉 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 및 방사선 피부염으로부터 선택되는 피부 질환, 장애, 또는 병태이다. 또 다른 예에서, 비-안과 장애는 쇼그렌-라르슨 증후군 및 화상 및/또는 상처와 관련된 미용 증상으로부터 선택되는 피부 질환, 장애, 또는 병태이다.
추가의 예에서, 알데히드 독성이 연관되는 질환, 장애 또는 병태는 연령-관련 장애이다. 연령-관련 질환, 장애 또는 병태의 예는 피부의 주름, 건조, 및 착색을 포함한다.
알데히드 독성이 연관되는 질환, 장애 또는 병태의 예는 수포작용제의 독성 효과 또는 알킬화제로부터의 화상과 관련된 병태를 추가로 포함한다. 본원에 기재된 화합물은 독성 알데히드를 감소 또는 제거하며, 따라서 이들 질환 또는 장애를 치료, 예방, 및/또는 위험을 감소시킨다.
하나의 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 화합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함한, 발병에 알데히드 독성이 연관되는 안과 질환, 장애, 또는 병태의 치료, 예방, 및/또는 위험 감소에 관한 것이다, 안과 질환, 장애, 또는 병태는 각막 질환(예를 들면, 각막에서의 안구 건조증, 백내장, 원추각막, 물집 및 기타 각막병증, 및 푹스 내피세포 이상증), 기타의 안과 장애 또는 병태(예를 들면, 알레르기 결막염, 안구 반흔성 유천포창, PRK 치료 및 기타 각막 치료와 관련된 병태, 및 눈물 지질 분해 또는 누선 기능장애와 관련된 병태), 및 염증이 높은 알데히드 수준을 야기하는 기타의 안과 병태(예를 들면, 포도막염, 공막염, 안과 스티븐스 존슨 증후군, (마이봄선 기능장애를 갖거나 갖지 않는) 안구 주사)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 안과 질환, 장애, 또는 병태는 황반 변성, 예를 들면, AMD, 또는 스타르카르트병을 포함하지 않는다. 하나의 예시에서, 안과 질환, 장애, 또는 병태에서, MDA 또는 HNE의 양 또는 농도는 안과 조직 또는 세포에서 증가된다. 예를 들면, 알데히드(예를 들면, MDA 또는 HNE)의 양 또는 농도는 정상 안과 조직 또는 세포에서와 비교하여 적어도 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 2배, 2.5배, 5배, 10배 증가된다. 화합물 9와 같은 본원에 기재된 화합물은 알데히드(예를 들면, MDA 및 HNE) 농도를 시간-의존적 방식으로 감소시킨다. 알데히드(예를 들면, MDA 또는 HNE)의 양 또는 농도는 문헌[Tukozkanet al., Furat Tip Dergisi 11: 88-92 (2006)]에 기재된 것들과 같은 당업계에 공지된 방법 또는 기술에 의해 측정될 수 있다.
한 종류에서, 안과 질환, 장애, 또는 병태는 안구 건조증이다. 제2 종류에서, 안과 질환, 장애, 또는 병태는 PRK 치료 및 기타 각막 치료와 관련된 병태이다. 예를 들면, 본 발명은 본원에 기재된 화합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는 PRK 치료 또는 기타의 각막 치료의 진전에 관한 것이다. 제3 종류에서, 안과 질환, 장애, 또는 병태는 염증의 결과로서 높은 알데히드 수준과 관련된 안과 병태(예를 들면, 포도막염, 공막염, 안과 스티븐스 존슨 증후군, 및 (마이봄선 기능장애를 갖거나 갖지 않는) 안구 주사)이다. 제4 종류에서, 안과 질환, 장애, 또는 병태는 원추각막, 백내장, 물집 및 기타 각막병증, 푹스 내피세포 이상증, 안구 반흔성 유천포창, 또는 알레르기 결막염이다. 본원에 기재된 화합물은 아래 본원에 기재된 바와 같이 국소 또는 전신 투여될 수 있다.
제2 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 화합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는, 발병에 알데히드 독성이 연관되는 피부 장애 또는 병태 또는 미용 증상의 치료, 예방, 및/또는 위험 감소에 관한 것이다. 피부 장애 또는 병태는 건선, 피부경화증, 국소 (원판상) 루푸스, 접촉 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 방사선 피부염, 여드름, 및 쇼그렌-라르슨 증후군 및 기타 어린선을 포함하지만, 이에 제한되지 않고, 미용 증상은 일광 탄력섬유증/주름, 피부 톤 견고성, 부기, 습진, 흡연 또는 자극물 유도된 피부 변화, 피부 절개, 또는 화상 및/또는 상처와 관련된 피부 병태이다. 몇몇 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 바와 같이 피부의 연령-관련 질환, 장애 또는 병태에 관한 것이다.
아토피 피부염, 국소 (원판상) 루푸스, 건선 및 피부경화증과 같은 다양한 피부 장애 또는 병태는 높은 MDA 및 HNE 수준을 특징으로 한다(Br J Dermatol 149: 248 (2003); JEADV 26: 833 (2012); Clin Rheumatol 25: 320 (2006)). 또한, 쇼그렌-라르슨 증후군(SLS)을 특징지우는 어린선은 지방 알데히드의 축적으로부터 기원하며, 이는 라멜라체(LB)의 정상적인 기능 및 분비를 방해하고 피부각질층(SC)에 세포간 지질 침착물 및 피부 층에 결함성 수분 장벽을 야기한다(W.B. Rizzo 등 (2010)). 알데히드를 대사시키는 효소, 지방 알데히드 데하이드로게나제는 SLS 환자에서 제대로 기능하지 않는다. 따라서, 본원에 기재된 화합물과 같은 알데히드를 감소 또는 제거하는 화합물은 본원에 기재된 것들과 같은 발병에 알데히드 독성이 연관되는 피부 장애 또는 병태를 치료, 예방, 및/또는 위험을 감소시키는데 사용될 수 있다. 더욱이, 수분 장벽의 개선 및 알데히드-매개된 염증(섬유증 및 탄력섬유증 포함(Chairpotto 등 (2005))의 예방으로, 일광 탄력섬유증/주름, 피부 톤, 견고성(부기), 습진, 흡연 또는 자극물 유도된 피부 변화 및 피부 절개 성형술, 및 화상 및/또는 상처와 관련된 피부 병태와 같은 다수의 미용 증상들이 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있다.
한 종류에서, 피부 질환, 장애, 또는 병태는 건선, 피부경화증, 국소 (원판상) 루푸스, 접촉 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 방사선 피부염, 여드름, 또는 쇼그렌-라르슨 증후군 및 기타의 어린선이다. 하나의 예시에서, 피부 질환, 장애, 또는 병태는 접촉 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 방사선 피부염, 또는 쇼그렌-라르슨 증후군 및 기타의 어린선이다. 제2 종류에서, 미용 증상은 일광 탄력섬유증/주름, 피부 톤 견고성, 부기, 습진, 흡연 또는 자극물 유도된 피부 변화, 피부 절개, 또는 화상 및/또는 상처와 관련된 피부 병태이다.
제3 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 화합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는, 발병에 알데히드 독성이 연관되는 수포작용제의 독성 효과 또는 알킬화제로부터의 화상과 관련된 병태의 치료, 예방, 및/또는 위험 감소에 관한 것이다.
수포작용제는 황 머스터드, 질소 머스터드, 및 포스겐 옥심을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 수포작용제의 독성 또는 유해 작용은 통증, 자극, 및/또는 피부, 눈, 및/또는 점막의 찢김, 및 눈에 대한 결막염 및/또는 각막 손상을 포함한다. 황 머스터드는 화합물 비스(2-클로르에틸) 설파이드이다. 질소 머스터드는 화합물 비스(2-클로르에틸)에틸아민, 비스(2-클로르에틸)메틸아민, 및 트리스(2-클로르에틸)아민을 포함한다. 황 머스터드 또는 이의 유사체는 산화 스트레스 및 특히 HNE 수준의 증가를 유발할 수 있으며, 항산화 방어 시스템을 고갈시켜 지질 과산화를 증가시킴으로써 산화적 스트레스 반응을 유도하고 이에 따라 알데히드 수준을 증가시킬 수 있다(Jafari 등 (2010); Pal 등 (2009)). 실리비닌(Silibinin)과 같은 항산화제는, 국소 적용되는 경우, 황 머스터드 또는 이의 유사체에 대한 노출로부터 유도되는 피부 손상을 약독화시키며, 항산화 효소의 증가된 활성은 황 머스터드에 의해 생성된 반응성 산소 종에 대한 보상 반응일 수 있다(Jafari 등 (2010); Tewari-Singh 등 (2012)). 게다가, 유리 라디칼 종을 감소시키기 위한 개입이 포스겐 유도된 폐 손상에 대한 노출 후 효과적인 치료이었다(Sciuto 등 (2004)). 따라서, 본원에 기재된 화합물과 같은 알데히드를 감소 또는 제거하는 화합물이 황 머스터드, 질소 머스터드, 및 포스겐 옥심과 같은 수포작용제의 독성 효과와 관련된 병태를 치료, 예방, 및/또는 위험을 감소시키는데 사용될 수 있다.
알칼리제는 석회, 가성소다, 암모니아, 및 배수관 청소제를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 기재된 화합물과 같은 알데히드를 감소 또는 제거하는 화합물이 알칼리제로부터의 화상과 관련된 병태를 치료, 예방, 및/또는 위험을 감소시키는데 사용될 수 있다.
제4 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 화합물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함하는, 발병에 알데히드 독성이 연관되는 자가면역, 면역-매개, 염증, 심혈관 또는 신경 질환, 장애, 또는 병태, 또는 대사 증후군, 또는 당뇨병의 치료, 예방, 및/또는 위험 감소에 관한 것이다. 자가면역 또는 면역-매개 질환, 장애, 또는 병태는 루푸스, 피부경화증, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 및 류마티스 관절염을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 염증 질환, 장애, 또는 병태는 류마티스 관절염, 염증성 장 질환(예를 들면, 크론병 및 궤양성 대장염), 패혈증, 및 섬유증(예를 들면, 신장, 간, 폐 및 심장 섬유증)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 심혈관 질환, 장애, 또는 병태는 죽상동맥경화증 및 허혈성-재관류 손상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 신경 질환, 장애, 또는 병태는 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 석신산 세미알데히드 데하이드로게나제 결핍증, 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 및 쇼그렌-라르슨 증후군의 신경학적 측면(인지 지연 및 강직)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
숙련가는 본원에 열거된 질환, 장애, 또는 병태가 하나 이상의 병리학적 기전을 수반할 수 있음을 이해할 것이다. 예를 들면, 본원에 열거된 질환, 장애, 또는 병태는 면역학적 반응 및 염증 반응의 이상조절을 수반할 수 있다. 따라서, 질환, 장애, 또는 병태의 상기 범주는 절대적인 것이 아니며, 질환, 장애, 또는 병태는 면역, 염증, 심혈관, 신경, 및/또는 대사 질환, 장애, 또는 병태로 간주될 수 있다.
알데히드 데하이드로게나제의 결핍증을 갖는 개체는 높은 알데히드 수준 및 파킨슨 질환(PNAS 110:636 (2013)) 및 알츠하이머 질환 (BioChem Biophys Res Commun. 273:192 (2000))의 증가된 위험을 갖는 것으로 밝혀졌다. 파킨슨 질환에서, 알데히드는 특히 도파민 생리학을 방해한다(Free Radic Biol Med, 51: 1302 (2011); Mol Aspects Med, 24: 293 (2003); Brain Res, 1145: 150 (2007)). 또한, 알데히드 수준은 다발성 경화증, 근위축성 측삭 경화증, 자가면역 질환, 예를 들면, 루푸스, 류마티스 관절염, 루푸스, 건선, 피부경화증, 및 섬유증 질환에서 증가되며, 증가된 수준의 HNE 및 MDA는 죽상동맥경화증 및 당뇨병의 진행에 연관된다(J. Cell. Mol. Med., 15: 1339 (2011); Arthritis Rheum 62: 2064 (2010); Clin Exp Immunol, 101: 233 (1995); Int J Rheum Dis, 14: 325 (2011); JEADV 26: 833 (2012); Clin Rheumatol 25: 320 (2006); Gut54: 987 (2005); J Am Soc Nephrol 20: 2119 (2009)). MDA는 추가로 죽상동맥경화증을 야기하는 포말 세포의 증가된 형성에 연관된다(Leibundgut et al., CurrentOpinion in Pharmacology 13: 168 (2013)). 또한, 알데히드-관련 독성은 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)과 같은 여러 염증성 폐 질환의 발병에 중요한 역할을 한다(Bartoli et al., Mediators of Inflammation 2011, Article 891752). 따라서, 본원에 기재된 화합물과 같은 알데히드를 감소 또는 제거하는 화합물은 자가면역, 면역-매개, 염증, 심혈관, 또는 신경 질환, 장애, 또는 병태, 또는 대사 증후군, 또는 당뇨병을 치료, 예방, 및/또는 위험을 감소시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 화합물은 뉴런에서 알데히드-매개된 세포사를 예방한다. 게다가, 본원에 기재된 화합물은 광범위한 전염증성 사이토킨을 하향조절하고/하거나 항염증성 사이토킨을 상향조절하며, 이는 본원에 기재된 화합물이 다발성 경화증 및 근위축성 측삭 경화증과 같은 염증성 질환을 치료하는데 유용하다는 것을 나타낸다.
상기 논의된 바와 같이, 개시된 조성물은 병인이 A2E 및/또는 리포푸신의 축적을 수반하는 황반 변성 및 다른 형태의 망막 질환을 치료 또는 예방하기 위해 대상체에 투여될 수 있다. A2E 축적을 특징으로 하는 다른 질환, 장애 또는 병태가 유사하게 치료될 수 있다.
하나의 양태에서, A2E의 형성을 감소시키는 화합물이 대상체에 투여된다. 예를 들면, 화합물은 트랜스-RAL과의 반응을 위해 PE와 경쟁하여, 형성된 A2E의 양을 감소시킬 수 있다. 또 다른 양태에서, A2E의 축적을 방지하는 화합물이 대상체에 투여된다. 예를 들면, 화합물은 트랜스-RAL과의 반응을 위해 PE와 성공적으로 경쟁하며, A2E는 형성되지 않는다.
치료되는 개체는 세 가지 그룹으로 나뉜다: (1) 육안 시험 및/또는 망막전위도검사에 의해 결정되는 바와 같은 (암순응, 대비 민감도 및 예리함을 포함하지만 이에 제한되지 않는) 시야 결손, 및/또는 드루젠 축적, 조직 위축 및/또는 리포푸신 형광에 대한 망막 및 RPE 조직의 안저 검사에 의해 나타내어지는 바와 같은 망막 건강에 기초하여, 황반 변성 또는 병인이 A2E 및/또는 리포푸신의 축적을 수반하는 다른 형태의 망막 질환으로 임상적으로 진단된 개체; (2) 황반 변성 질환에 대해 증상을 보이기 전이지만 동일한 측정 중의 어느 것 또는 전부에서의 비정상적인 결과에 기초하여 위험이 있는 것으로 생각되는 개체; 및 (3) 증상을 보이기 전이지만 황반 변성 질환의 가족력 및/또는 질환과 관련된 하나 이상의 대립형질 또는 다형성을 보이는 유전형 분석 결과에 기초하여 유전적으로 위험이 있다고 생각되는 개체. 조성물은 1개월, 1주 또는 1일당 1회 이상 국소 또는 전신 투여된다. 투여량은 암순응에서 시각 성능에 대한, 존재한다면, 부작용을 피하도록 선택될 수 있다. 치료는 적어도 1, 3, 6, 또는 12개월 또는 그 이상의 기간 동안 계속된다. 환자는 안전성 및 효능을 평가하기 위해 1, 3, 6, 또는 12개월 또는 보다 더 긴 간격으로 시험될 수 있다. 효능은 상기한 바와 같은 시각 성능 및 망막 건강의 검사에 의해 측정된다.
하나의 양태에서, 대상체가 황반 변성의 증상을 갖는 것으로 진단되고, 그후 개시된 화합물이 투여된다. 또 다른 양태에서, 대상체가 황반 변성을 발병할 위험이 있는 것으로 확인될 수 있으며(위험 인자는 흡연 이력, 연령, 여성, 및 가족력을 포함한다), 그후 개시된 화합물이 투여된다. 또 다른 양태에서, 대상체가 양쪽 눈 모두에 건성 AMD를 가질 수 있으며, 그후 개시된 화합물이 투여된다. 또 다른 양태에서, 대상체가 한쪽 눈에는 습성 AMD를 갖지만 다른 쪽 눈에는 건성 AMD를 가질 수 있으며, 그후 개시된 화합물이 투여된다. 또 다른 양태에서, 대상체가 스타르가르트 질환을 갖는 것으로 진단될 수 있으며, 그후 개시된 화합물이 투여된다. 또 다른 양태에서, 대상체는 병인이 A2E 및/또는 리포푸신의 축적을 수반하는 다른 형태의 망막 질환의 증상을 갖는 것으로 진단되고, 그후 화합물이 투여된다. 또 다른 양태에서 대상체는 병인이 A2E 및/또는 리포푸신의 축적을 수반하는 다른 형태의 망막 질환을 발병할 위험이 있는 것으로 확인될 수 있으며, 그후 개시된 화합물이 투여된다. 몇몇 양태에서, 화합물은 예방학적으로 투여된다. 몇몇 양태에서, 대상체는 망막 손상이 분명해지기 전에 질환을 갖는 것으로 진단되었다. 예를 들면, 대상체는 ABCA4에 대해 유전자 돌연변이를 지니는 것으로 발견되며 임의의 안과적 징후가 드러나기 전에 스타르가르트 질환에 대한 위험이 있는 것으로 진단되거나, 대상체는 대상체가 시력에 어떠한 영향을 의식하기 전에 황반 변성을 나타내는 조기 황반 변화를 갖는 것으로 발견된다. 몇몇 양태에서, 인간 대상체는 황반 변성 치료 또는 예방이 필요한지를 알 수 있다.
몇몇 양태에서, 대상체는 황반 변성의 정도에 대해 모니터링될 수 있다. 대상체는 눈 검사, 확장된 눈 검사(dilated eye examination), 안저 검사, 시력 검사, 및/또는 생검에 의해서와 같은 다양한 방식으로 모니터링될 수 있다. 모니터링은 다양한 횟수로 수행될 수 있다. 예를 들면, 대상체는 화합물이 투여된 후 모니터링될 수 있다. 모니터링은 화합물의 최초 투여 후, 예를 들면, 1일, 1주, 2주, 1달, 2달, 6달, 1년, 2년, 5년, 또는 임의의 다른 시기에 일어날 수 있다. 대상체는 반복해서 모니터링될 수 있다. 몇몇 양태에서, 화합물의 용량을 모니터링에 반응하여 변경할 수 있다.
몇몇 양태에서, 개시된 방법을 황반 변성 또는 병인이 A2E 및/또는 리포푸신의 축적을 수반하는 다른 형태의 망막 질환을 치료 또는 예방하기 위한 다른 방법들, 예를 들면, 광선역학 요법과 병용할 수 있다. 예를 들면, 환자는 하나 이상의 질환 또는 장애에 대해 하나 이상의 치료법으로 치료될 수 있다. 예를 들면, 환자는 건성형 AMD가 걸린 한 쪽 눈은 본 발명의 화합물로 치료되고, 습성형 AMD가 걸린 다른 쪽 눈은, 예를 들면, 광선역학 요법으로 치료될 수 있다.
몇몇 양태에서, 황반 변성 또는 병인이 A2E 및/또는 리포푸신의 축적을 수반하는 다른 형태의 망막 질환을 치료 또는 예방하기 위한 화합물은 만성적으로 투여될 수 있다. 화합물은 매일, 매일 1회 이상, 1주일에 2회, 1주일에 3회, 매주, 격주로, 매달, 격월로, 반년마다, 매년, 및/또는 연 2회 투여될 수 있다.
다양한 세포 기능을 갖는 생리활성 신호전달 분자인 스핑고신 1-포스페이트는 소포체 효소 스핑고신 1-포스페이트 리가제에 의해 비가역적으로 분해되어, 트랜스-2-헥사데센알 및 포스포에탄올아민을 생성한다. 트랜스-2-헥사데센알은 JNK-의존적 경로를 통해 다중 세포 유형에서 세포골격 개편, 분리, 및 아폽토시스를 야기하는 것으로 입증되었다. 문헌[Biochem Biophys Res Commun.　2012 Jul20;424(1):18-21]을 참조한다. 이러한 조사결과들 및 관련된 α,β-불포화 알데히드의 공지된 화학 물질(chemistry)은 트랜스-2-헥사데센알이 추가의 세포 성분과 상호작용을 할 가능성을 야기한다. 이는 데옥시구아노신 및 DNA와 쉽게 반응하여 부분이성체성 사이클릭 1,N(2)-데옥시구아노신 부가물 3-(2-데옥시-β-d-에리트로-펜토푸라노실)-5,6,7,8-테트라하이드로-8R-하이드록시-6R-트리데실피리미도[1,2-a]퓨린-10(3H)온 및 3-(2-데옥시-β-d-에리트로-펜토푸라노실)-5,6,7,8-테트라하이드로-8S-하이드록시-6S-트리데실피리미도[1,2-a]퓨린-10(3H)온을 생산하는 것으로 나타났다. 이러한 조사결과는 스핑고신 1-포스페이트 리가제에 의해 내인성으로 생산된 트랜스-2-헥사데센알이 DNA와 직접 반응하여 잠재적으로 돌연변이유발성인 결과를 갖는 알데히드-유래 DNA 부가물을 형성함을 입증한다.
4-하이드록시부티르산 산성뇨 또는 감마-하이드록시부티르산 산성뇨로도 알려진 석신산 세미알데히드 데하이드로게나제 결핍증(SSADHD)은 가장 유행하는 GABA 대사의 상염색체성 열성 유전된 장애이며(Vogel 등 2013), 유아기에는 발육 지연 및 긴장 저하의 표현형을 그리고 청소년기 및 성인기에는 심각한 표현 언어 장애 및 강박 신경증을 나타낸다. 간질은 환자의 절반에서, 통상적으로 강직 간대 발작으로서 발생하지만 때로는 발생하지 않으며 근간대 경련이 발생한다(Pearl 등 2014). 2/3 이상의 환자가 청소년기 및 성인기에 신경정신병학 문제(즉, ADHD, OCD 및 공격성)를 나타내며, 이는 장애를 초래할 수 있다. 대사적으로, 주요 억제성 신경전달물질 GABA 및 감마-하이드록시부티레이트(GHB), 신경조절성 모노카복실산이 축적된다(Snead and Gibson 2005). 또한, 이러한 장애에 특이적인 몇 가지 다른 중간체가 환자 및 상응하는 뮤린 모델 둘 다에서 검출되었다. GABA-트랜스아미나제의 비가역적 억제제인 비가바트린(VGB; γ-비닐GABA)은 GABA에서 GHB로의 전환을 방지할 것이기 때문에 SSADH 결핍증의 치료를 위한 타당한 선택이다. 성과가 엇갈렸으며, 선택된 환자에서 치료가 악화를 초래하였다(Good 2011; Pellock 2011; Escalera 등 2010; Casarano 등 2011; Matern 등 1996; Al-Essa 등 2000). SSADH 결핍증에 대한 표적화된 치료법을 찾기가 어렵고 임시방편적인 개입이 있다.
5. 약제학적으로 허용되는 조성물
본 발명의 방법에 따르는 화합물 및 조성물은 상기 제공된 장애를 치료하거나 중증도를 감소시키는데 효과적인 투여량 및 투여 경로를 사용하여 투여된다. 정확한 필요량은 대상체의 종, 연령, 및 일반적인 상태, 감염의 중증도, 특정 제제, 이의 투여 모드 등에 따라 대상체마다 다를 것이다. 본 발명의 화합물은 바람직하게는 투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해 투여 단위형으로 제형화된다. 본원에서 사용되는 표현 "투여 단위형"은 치료하고자 하는 환자에 적합한 제제의 물리적 이산 단위를 가리킨다. 그러나, 본 발명의 화합물 및 조성물의 총 1일 사용량은 타당한 의학적 판단, 범위 내에서 담당의에 의해 결정되는 것으로 이해될 것이다. 임의의 특정 환자 또는 유기체를 위한 구체적인 유효 용량 수준은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특정 화합물의 활성; 사용되는 특정 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 사용되는 특정 화합물의 투여 시간, 투여 경로, 및 배설률; 치료의 지속시간; 사용되는 특정 화합물과 병용하여 또는 동시에 사용되는 약물 등의 의학 분야에 널리 알려진 인자들을 포함한 다양한 인자들에 따라 좌우될 것이다.
본 발명의 약제학적으로 허용되는 조성물은 치료되는 감염의 중증도에 따라 인간 및 다른 동물에게 경구, 직장, 비경구, 수조내, 질내, 복강내, 국소(분말, 연고, 또는 드롭으로서), 구강, 경구 또는 비용 스프레이 등으로서 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 화합물은 목적하는 치료 효과를 수득하기 위해 하루 1회 이상 1일당 약 0.01mg/kg 내지 약 50mg/kg 및 바람직하게는 약 1mg/kg 내지 약 25mg/kg의 대상체 체중의 투여량 수준으로 경구 또는 비경구 투여된다.
경구 투여용 액체 투여형은 약제학적으로 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 활성 화합물 이외에, 액체 투여형은 당업계에서 일반적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들면, 물 또는 기타 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들면, 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일(특히, 면실유, 낙화생유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 호마유), 글리세롤, 테트라하이드로푸르푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 함유할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 또한 보조제, 예를 들면, 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 방향제 및 향미제를 포함할 수 있다.
주사용 제제, 예를 들면, 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액은 적합한 분산 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제형화할 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균 주사용 용액, 현탁액 또는 에멀젼, 예를 들면, 1,3-부탄디올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매에는 물, 링거액, U.S.P. 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균 고정유가 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이러한 목적으로, 합성 모노- 또는 디글리세라이드를 포함한 블랜드 고정유가 사용될 수 있다. 또한, 지방산, 예를 들면, 올레산이 주사용 제제에 사용된다.
주사용 제형은, 예를 들면, 세균-보유 필터를 통한 여과에 의해 또는 사용 전에 멸균수 또는 다른 멸균 주사용 매질에 용해되거나 분산될 수 있는 멸균 고체 조성물 형태로 멸균제를 혼입시킴으로써 멸균시킬 수 있다.
본 발명의 화합물의 효과를 연장시키기 위해, 종종 피하 또는 근육내 주사로부터 화합물의 흡수를 지연시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 수용해도가 불량한 결정질 또는 비정질 물질의 액체 현탁액을 이용하여 달성할 수 있다. 이때 화합물의 흡수 속도는 용해 속도에 따라 좌우되며, 용해 속도는 결정 크기 및 결정 형태에 따라 좌우될 수 있다. 대안적으로, 비경구적으로 투여되는 화합물 형태의 지연 흡수는 화합물을 오일 비히클에 용해 또는 현탁시킴으로써 달성된다. 주사용 데포트 형태는 생분해성 중합체, 예를 들면, 폴리락티드-폴리글리콜리드 중의 화합물의 마이크로캡슐 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 화합물 대 중합체의 비율 및 사용되는 특정 중합체의 성질에 따라, 화합물의 방출 속도를 조절할 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(무수물)을 포함한다. 데포트 주사용 제형은 또한 화합물을 신체 조직과 상용성인 리포좀 또는 마이크로에멀젼에 포획시킴으로써 제조된다.
직장 또는 질내 투여를 위한 조성물은 바람직하게는 본 발명의 화합물을 적합한 비자극성 부형제 또는 담체, 예를 들면, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 주위 온도에서는 고체이나 체온에서는 액체여서 직장 또는 질강에서 용융하여 활성 화합물을 방출하는 좌제 왁스와 혼합함으로써 제조될 수 있는 좌제이다.
경구 투여를 위한 고체 투여형은 캡슐제, 정제, 환제, 산제 및 과립제를 포함한다. 이러한 고체 투여형에서, 활성 화합물은 하나 이상의 불활성인 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 담체, 예를 들면, 나트륨 시트레이트 또는 인산이칼슘 및/또는 a) 충전제 또는 증량제, 예를 들면, 전분, 락토즈, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및 규산, b) 결합제, 예를 들면, 카복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈, 수크로스 및 아카시아, c) 보습제, 예를 들면, 글리세롤, d) 붕해제, 예를 들면, 한천-한천, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트 및 탄산나트륨, e) 용해 지연제, 예를 들면, 파라핀, f) 흡수 촉진제, 예를 들면, 4급 암모늄 화합물, g) 습윤제, 예를 들면, 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트, h) 흡수제, 예를 들면, 카올린 및 벤토나이트 점토 및 i) 윤활제, 예를 들면, 활석, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 설페이트 및 이의 혼합물과 혼합된다. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우, 투여형은 또한 완충제를 포함할 수 있다.
유사한 유형의 고체 조성물은 또한 락토스 또는 유당 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용될 수 있다. 정제, 당의정, 캡슐제, 환제 및 과립제의 고체 투여형은 장용제피 및 약제학적 제형화 분야에 익히 공지된 기타의 피막과 같은 피막 및 쉘을 사용하여 제조될 수 있다. 이들은 임의로 불투명화제를 함유할 수 있으며, 또한 유일하게 또는 우선적으로 장관의 특정 부분에서 임의로 지연 방식으로 활성 성분(들)을 방출시키는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 매봉 조성물의 예는 중합체성 물질 및 왁스를 포함한다. 유사한 유형의 고체 조성물은 또한 락토스 또는 유당 뿐만 아니라 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등과 같은 부형제를 사용하여 연질 및 경질-충전된 젤라틴 캡슐에서 충전제로서 사용될 수 있다.
활성 화합물은 또한 앞서 주지한 바와 같은 하나 이상의 부형제와 함께 마이크로캡슐화된 형태일 수 있다. 정제, 당의정, 캡슐제, 환제 및 과립제의 고체 투여형은 장용제피, 방출 제어 피막 및 약제학적 제형화 분야에서 널리 공지된 다른 피막과 같은 피막 및 쉘을 사용하여 제조될 수 있다. 이러한 고형 투여형에서, 활성 화합물은 적어도 하나의 불활성 희석제, 예를 들면, 수크로스, 락토스 또는 전분과 함께 혼합될 수 있다. 이러한 투여형은 또한 통상의 실시에서와 같이 불활성 희석제 이외의 추가의 물질, 예를 들면, 정제화 윤활제 및 다른 정제화 조제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트 및 미세결정성 셀룰로스를 포함할 수 있다. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우, 투여형은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 이들은 임의로 불투명화제를 포함할 수 있으며, 또한 유일하게 또는 우선적으로 장관의 특정 부분에서 임의로 지연 방식으로 활성 성분(들)을 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 매봉 조성물의 예는 중합체성 물질 및 왁스를 포함한다.
본 발명의 화합물의 국소 또는 경피 투여를 위한 투여형은 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 산제, 용액, 스프레이, 흡입제 또는 패치를 포함한다. 활성 화합물은 멸균 조건 하에서 약제학적으로 허용되는 담체 및 필요한 경우 방부제 또는 완충제와 혼합된다. 또한, 안과용 제형, 점이액 및 점안액이 본 발명의 범위에 속하는 것으로 고려된다. 추가로, 본 발명은 화합물을 체내에 제어 전달하는 추가 이점을 갖는 경피 패치의 사용을 고려한다. 이러한 투여형은 화합물을 적합한 매질에 용해 또는 분배시켜 제조할 수 있다. 또한, 흡수 촉진제를 사용하여 피부를 가로지르는 화합물의 유입을 증가시킬 수 있다. 속도는 속도 조절 막을 제공함으로써 또는 화합물을 중합체 매트릭스 또는 겔에 분산시킴으로써 조절할 수 있다.
본 발명의 화합물은 또한 국소적으로, 예를 들면, 눈에 직접, 예를 들면, 점안액 또는 안과 연구로서 투여될 수 있다. 점안액은 전형적으로 유효량의 적어도 하나의 본 발명의 화합물 및 눈에 안전하게 적용될 수 있는 담체를 포함한다. 예를 들면, 점안액은 등장성 용액의 형태이며, 용액의 pH는 눈을 자극하지 않도록 조절된다. 여러 경우에, 상피 장막은 눈 안으로 분자가 침투하는 것을 방해한다. 따라서, 가장 최근 사용된 안과 약물에는 몇 가지 형태의 침투 촉진제가 보충된다. 이러한 침투 촉진제는 가장 우월한 상피 세포의 견고한 접합부를 느슨하게 함으로써 작용한다(Burstein, 1985, Trans Ophthalmol Soc U K 104(Pt 4): 402-9; Ashton et al., 1991, J Pharmacol Exp Ther 259(2): 719-24; Green et al., 1971, Am J Ophthalmol 72(5): 897-905). 가장 흔히 사용되는 침투 촉진제는 벤즈알코늄 클로라이드이며(Tang et al., 1994, J Pharm Sci 83(1): 85-90; Bursteinet al, 1980, Invest Ophthalmol Vis Sci 19(3): 308-13), 이는 또한 미생물 오염에 대한 보존제로서 작용한다. 이는 전형적으로 0.01 내지 0.05%의 최종 농도로 되도록 첨가된다.
본원에서 사용되는 용어 "생물학적 샘플"은 제한함이 없이 세포 배양물 또는 이의 추출물; 포유동물로부터 수득된 생검 재료 또는 이의 추출물; 및 혈액, 타액, 뇨, 변, 정액, 눈물, 또는 기타의 체액 또는 이의 추출물을 포함한다.
본 발명의 각각의 측면의 모든 특성들은 필요한 부분만 약간 수정하여 다른 측면에도 적용된다.
본원에 기재된 발명이 더욱 충분히 이해될 수 있도록 하기 위해, 하기 실시예가 제시된다. 이들 실시예는 단지 예시 목적일 뿐 어떠한 방식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다.
실시예
하기 실시에에 나타낸 바와 같이, 특정의 예시적인 양태에서, 화합물은 다음의 일반적인 과정에 따라 제조된다. 일반적인 방법이 본 발명의 특정 화합물의 합성을 묘사하지만, 다음의 일반적인 방법, 및 당업계의 통상의 숙련가에게 알려진 다른 방법들이 본원에 기재된 바와 같이 모든 화합물 및 이들 화합물 각각의 하위종류 및 화학종에 적용될 수 있음을 인지할 것이다.
실시예 1. 화합물에 대한 일반적인 반응 순서
중수소-표지된 알데히드 포획제는 반응 도식 1에 나타낸 부위에 중수소-표지된 중간체를 임의로 사용하여 2013년 7월 23일자로 공개된 미국 특허 출원 공개 US 2013/0190500에 기재된 바와 같이 제조하였다. 예시적인 방법이 아래에 추가로 기재된다.
반응 도식 1
Figure pct00071
실시예 2: A-1의 합성
Figure pct00072
1-(3- 에톡시 -2,3- 디옥소프로필 )피리딘-1- 이움 브로마이드. 2L 환저 플라스크에 에탄올(220mL) 및 피리딘(31g, 392mmol)을 충전하고, 생성된 용액을 질소하에 보통의 교반 속도에서 교반하였다. 이 용액에 에틸 브로모피루베이트(76.6g, 354mmol)를 느리고 꾸준한 스트림으로 가하였다. 반응 혼합물을 65±5℃에서 2시간 동안 교반되도록 하였다.
실시예 3: A-2a의 합성
Figure pct00073
1-(6- 클로로 -2-( 에톡시카보닐 )퀴놀린-3-일)피리딘-1- 이움 브로마이드. 실시예 2에서 2시간의 교반 시간 완료시, 반응 혼합물을 18 내지 22℃로 서서히 냉각시켰다. 플라스크를 3회 진공-퍼징시켰으며, 그때에 2-아미노-5-클로로-벤즈알데히드(ACB)(50.0g, 321mmol)를 긴 플라스틱 펀넬을 사용하여 고체로서 반응 플라스크에 직접 가하였다. 피리딘(64.0g, 809mmol)을 가한 다음 EtOH 린스(10mL) 및 반응 혼합물을 질소하에 약 16시간 동안(밤새) 80±3℃에서 가열하였으며, 이때 HPLC 분석은 반응이 효과적으로 완료되었음을 나타내었다.
실시예 4: A-2b의 합성
Figure pct00074
1-(6- 클로로 -2-( 에톡시카보닐 )퀴놀린-3-일-4- d )피리딘-1- 이움. 화합물 A-2b는 2-아미노-5-클로로-벤즈알데히드(ACB)를 2-아미노-5-클로로-벤즈알데히드-d로 치환시켜 A-2a와 유사한 방식으로 제조한다(실시예 3 참조).
실시예 5: A-3a의 합성
Figure pct00075
에틸 3-아미노-6- 클로로퀴놀린 -2- 카복실레이트. 실시예 3으로부터의 반응 혼합물을 약 70℃로 냉각시키고 첨가 펀넬을 사용하여 모르폴린(76.0g, 873mmol))을 2L 반응 플라스크에 가하였다. 반응 혼합물을 80±2℃에서 약 2.5시간 동안 가열하였으며, 그때 반응은 HPLC 분석(A-3a의 면적%가 증가를 멈춤)에 의해 완료된 것으로 간주되었다. 반응 혼합물을 급냉, 후처리, 및 분리를 위해 10 내지 15℃로 냉각시켰다.
첨가 속도를 조절하고 냉욕을 사용함으로써 온도를 15℃ 아래로 유지하면서, 2L 반응 플라스크에 첨가 펀넬을 사용하여 30 내지 60분에 걸쳐 물(600g)을 충전하였다. 반응 혼합물을 10 내지 15℃에서 추가로 45분 동안 교반한 다음 조 A-3a를 부흐너 펀넬을 사용하여 여과에 의해 분리하였다. 케이크를 매회 물(100 mL x 4)로 세척하여 진공을 적용하기 전에 물이 케이크를 통해 스며들도록 하였다. 케이크를 공기 건조시켜 조 A-3a을 거의 건조된 갈색 고체로서 제공하였다. 케이크를 2L 반응 플라스크에 되돌려 보내고 헵탄(350mL) 및 EtOH(170mL)을 가하였으며, 혼합물을 30 내지 60분 동안 70±3℃로 가열하였다. 슬러리를 0 내지 5℃로 냉각시키고 진공하에 여과에 의해 분리하였다. A-3a를 진공하에 35±3℃에서 밤새(16시간) 진공 건조 오븐에서 건조시켜 A-3a를 암록색 고체로서 제공하였다.
실시예 6: A-3b의 합성
Figure pct00076
에틸 3-아미노-6- 클로로퀴놀린 -2- 카복실레이트 -4- d . 화합물 A3-b는 A2-a의 반응 혼합물을 A2-b의 반응 혼합물로 치환하여 화합물 A3-a(실시예 5 참조)와 유사한 방식으로 제조한다.
실시예 7: NS2의 합성
Figure pct00077
2-(3-아미노-6- 클로로퀴놀린 -2-일)프로판-2- 올. 2L 환저 플라스크에 메틸마그네슘 클로라이드(THF 중의 3.0M 용액 200mL, 600mmol)를 충전하였다. 용액을 빙욕을 사용하여 0 내지 5℃로 냉각시켰다.
500mL 플라스크(자기 교반)를 실시예 5로부터의 A-3a 22.8 그램 및 THF(365 mL)로 충전하고, 용해되도록 교반한 다음 2L 반응 플라스크 상의 첨가 펀넬로 옮겼다. 반응 플라스크의 온도를 첨가 전반에 걸쳐 0 내지 5℃로 유지시키면서 A-3a 용액을 5.75시간에 걸쳐 반응 플라스크에 적가하였다. 첨가 말기에, 플라스크의 내용물을 0 내지 5℃에서 추가로 15분 동안 교반한 다음 냉욕을 제거하고 반응물을 주위 온도에서 밤새 교반되도록 하였다.
플라스크를 빙욕에서 냉각시키고, 반응 혼합물의 온도를 첨가 과정 동안 15℃ 미만으로 유지하면서 EtOH(39.5g, 857mmol)를 반응 혼합물에 적가함으로써 반응 혼합물을 주의해서 켄칭시켰다. 그후, NH4Cl의 수용액(415mL 물 중의 84.7g NH4Cl)을 주의해서 가하고, 혼합물을 보통의 교반하에 약 30분 동안 교반한 다음 분리 펀넬로 옮겨 층이 분리되도록 하였다. 고체가 수성 상에 존재하므로 HOAc(12.5 g)를 가하고 내용물을 부드럽게 와류시켜 거의 균질한 하부 수성 상을 수득하였다. 하부 수성 상을 2L 반응 플라스크로 다시 옮기고 보통의 교반하에 2-메틸THF(50mL)와 약 15분 동안 교반하였다. 원래의 상부 유기 층을 회전 증발기를 사용하여 필요에 따라 진공 및 ≤ 40℃에서 대략 40mL로 되도록 용적을 감소시켰다. 분리 펀넬에서 상을 분리하고 상부 2-MeTHF 상을 생성 잔류물과 합하여 500mL 플라스크로 옮기고, 25mL의 근사 용적으로 되도록 진공 증류시켰다. 이 잔류물에 2-MeTHF(50mL)를 가하고 50mL의 근사 용적으로 되도록 증류시켰다. 조 화합물 NS2 용액을 2-MeTHF(125mL)로 희석시키고, 5 내지 10℃로 냉각시키고, 2M H2SO4(aq)(250mL)를 서서히 가하고, 온도가 주위 온도로 되돌아가도록 하면서 혼합물을 30분 동안 교반하였다. 헵탄(40mL)을 충전하고 반응 혼합물을 추가로 15분 동안 교반한 다음 분리 펀넬로 옮기고, 층을 분리되도록 하였다. 하부 수성 생성물 층을 추가의 헵탄(35mL)으로 추출한 다음 하부 수성 상을 기계적 교반기가 장착된 1L 반응 플라스크로 옮기고, 혼합물을 5 내지 10℃로 냉각시켰다. 합한 유기 층은 버렸다. 25% NaOH의 용액(aq)을 제조하고(NaOH, 47g, 물, 200mL) 1L 반응 플라스크에 서서히 가하여 pH가 6.5 내지 8.5의 범위로 되게 하였다.
EtOAc(250mL)를 가하고 혼합물을 밤새 교반하였다. 혼합물을 분리 펀넬로 옮기고 하부 상은 버렸다. 상부 유기 층을 염수(25mL)로 세척한 다음 상부 유기 생성물 층을 회전 증발기에서 용적을 감소시켜 조 화합물 NS2를 수 분 내에 고화되는 짙은색 오일로서 수득하였다. 조 화합물 NS2를 EtOAc(20mL)에 용해시키고, 모든 화합물 NS2가 용출될 때까지(대략 420mL가 필요함) 3/1 헵탄/EtOAc로 용출시키면서 실리카겔 플러그(23g)를 통해 여과시켜 짙은색의 화합물 NS2의 대부분을 제거하였다. 용매를 진공에서 제거하여 화합물 NS2 14.7g을 황갈색 고체로서 제공하였다. 화합물 NS2를 EtOAc(25mL)에 흡수시키고 7/1 헵탄/EtOAc으로부터 3/1헵탄/EtOAc(총 1400mL)의 이동상 구배를 사용하여 실리카겔의 컬럼(72g)을 통해 용출시켰다. 화합물 NS2를 함유하는 용매 분획을 스트리핑시켰다. 화합물 NS2를 EtOAc(120mL)로 희석시키고 플라스크 중에서 Darco G-60 탈색 탄소(4.0g)와 약 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 프릿화 펀넬을 사용하여 셀라이트를 통해 여과하여, 케이트를 EtOAc(3 x 15mL)로 세정하였다. 합한 여액을 회전 증발기 상에서 스트리핑시키고 화합물 NS2를 76℃에서 헵탄(160mL)/EtOAc(16mL)에 용해시켰다. 균질 용액을 0 내지 5℃로 서서히 냉각시키고, 2시간 동안 유지시킨 다음 화합물 NS2를 여과에 의해 분리하였다. 진공 오븐에서 35℃에서 최상의 진공하에 5시간 동안 건조시킨 후, 화합물 NS2를 백색 고체로서 수득하였다. HPLC 순도: 100%(AUC); HPLC (표준 조건 사용): A-2: 7.2분; A-3: 11.6분.
실시예 8: I-1의 합성
Figure pct00078
2-(6- 클로로퀴놀린 -2-일)프로판-1,1,1,3,3,3- d 6 -2- 올. 화합물 I-1은 메틸마그네슘 클로라이드를 메틸-d 3-마그네슘 요오다이드(99원소% D)로 치환시켜 화합물 NS2와 유사한 방식으로 제조하였다(실시예 7 참조). A3-a를 5.3mol equiv 1.0M 메틸-d 3-마그네슘 요오다이드(99원소% D)와 에테르/THF 중에서 반응시켜 20% 수율의 I-1을 제공하였다.
Figure pct00079
실시예 9: I-2의 합성
Figure pct00080
2-(6- 클로로퀴놀린 -2-일-4-d)프로판-2- 올. 화합물 I-2는 A3-a를 A3-b로 치환시켜 화합물 NS2와 유사한 방식으로 제조한다(실시예 7 참조).
ACB의 제조
Figure pct00081
N2 대기를 확립하고 N2의 경미한 스트림을 용기를 통해 유동시킨 후, 황화, 탄소상 5wt%, 환원된 무수 백금(9.04g, 3.0wt% vs 니트로 기질)을 큰 자기 교반-막대 및 열전대가 장착된 5L 중질 벽 가압 용기에 가하였다. MeOH(1.50 L), 5-클로로-2-니트로벤즈알데히드(302.1g, 1.63mol), 추가의 MeOH(1.50L) 및 Na2CO3(2.42g, 22.8mmol, 0.014 equiv)을 가하였다. 플라스크를 밀봉하고 교반을 450rpm에서 개시하였다. 용액을 배기시키고 N2(35 psi), 2x로 재가압시켰다. 플라스크를 배기시키고 H2로 35psi로 되도록 재가압시켰다. 용액의 온도는 20분 내에 30℃에 도달하였다. 그후, 용액을 수욕으로 냉각시켰다. 얼음을 수욕에 가하여 온도를 35℃ 미만으로 유지시켰다. 2h 마다, 개방 전에 배기시키고 N2(5 psi), 2x로 재가압시킴으로써 반응을 모니터링하였다. 반응의 진행은 TLC로 추적할 수 있다: 5-클로로-2-니트로벤즈알데히드(Rf = 0.60, CH2Cl2, UV) 및 중간체(Rf = 0.51, CH2Cl2, UV 및 Rf = 0.14, CH2Cl2, UV)를 소모시켜 ACB(Rf = 0.43, CH2Cl2, UV)를 생성시킨다. 5h에, 반응이 98% 완료되었으며(GC), 이것을 완료된 것으로 간주하였다. 3L 중간 프릿화 펀넬에 셀라이트(ca. 80g)를 가하였다. 이를 MeOH(ca. 200 mL)로 침강시키고 진공으로 건조되게 하였다. 감소된 용액을 캐뉼라를 통해 펀넬로 옮기면서 부드러운 진공을 사용하여 용액을 셀라이트 플러그를 통해 끌어당겼다. 이것을 MeOH(150mL 4x)로 추적하였다. 용액을 5L 3구 환저 플라스크로 옮겼다. 로타뱁(rotavap) 상에서 30℃에서, 용매(ca. 2L)를 감압하에 제거하였다. N2 블랭킷을 적용하였다. 용액을 자기 교반기 및 첨가 펀넬이 장착된 5L 4구 환저 플라스크로 옮겼다. 물(2.5L)을 격렬하게 교반시킨 용액에 4 h에 걸쳐 적가하였다. 슬러리를 최소량의 진공으로 여과시켰다. 수집된 고체를 물(1.5L 2x), 2-프로판올(160mL)에 이어 헥산(450mL 2x)으로 세척하였다. 수집된 고체(카나리아 황색, 과립상 고체)를 150 X 75 재결정화 디쉬로 옮겼다. 그후, 고체를 감압하에(26 내지 28 Hg) 40℃에서 밤새 진공-오븐에서 건조시켰다. ACB(HPLC에 의해 > 99A%)를 N2 대기하에 5℃에서 저장하였다.
실시예 10: 시험관내 검정
LDH 세포독성 검정
1차 랫트 피질 배양물을 24 또는 48시간 동안 항온처리기에 배치하고 다양한 농도의 개시된 화합물로 처리한다. 그후, 문헌[Bergmeyer et al., Methods of Enzymatic Analysis, 3rd ed. (1983)]에 기재된 바와 같은 LDH 검정을 위해 20㎕의 배양 배지를 제거한다.
순환 사이토킨의 양을 측정하기 위한 ELISA 검정
수컷 C57BI/6 마우스를 LPS(20mg/kg)에 노출시키기 30분 전에 개시된 화합물을 복용시켰다. LPS 노출 2시간 후, 마우스로부터 혈액을 수집하고 순환 사이토킨의 양을 측정하기 위해 ELISA를 실시하였다. 개시된 화합물로의 처리는 IL-5 및 IL-1β, IL-17, 및 TNF와 같은 전염증성 사이토킨의 감소를 초래한다. 또한, 개시된 화합물로의 처리는 IL-10과 같은 항-염증성 사이토킨의 증가를 초래한다. 또한, 에오탁신, IL-12, IP-10, LIF, MCP-1, MIG, MIP, 및 RANTES와 같은 다양한 다른 케모카인도 개시된 화합물로의 처리에 의해 감소된다.
접촉 피부염을 치료하는데 있어서의 효능을 평가하기 위한 검정
접촉 피부염을 치료하는데 있어서의 개시된 화합물의 효능을 알아내기 위해, 포르볼 미리스테이트 아세테이트("PMA")를 마우스의 우측 귓바퀴의 전방부 및 후방부 둘 다에 국소 적용한다(20㎕ 중 2.5㎍)(그룹당 N=10). 대조군으로서, 좌측 귓바퀴에 20㎕의 에탄올(PMA 부형제)를 전방부 및 후방부 둘 다에 제공한다. PMA를 적용한지 6시간 후, 우측 및 좌측 귓바퀴 두께 둘 다를 측정한다. 측정은 양 귀의 동일 부위로부터 적어도 2회 실시하며, 모발 또는 접힌 귓바퀴를 포함시키지 않도록 주의한다.
알레르기성 피부염을 치료하는데 있어서의 효능을 평가하기 위한 검정
알레르기성 피부염을 치료하는데 있어서의 개시된 화합물의 효능을 측정하기 위해, 옥사졸론("OXL")을 마우스의 면도한 복부에 적용한다(1.5%, 아세톤 중의 100㎕). 7일 후, OXL 처리된 마우스의 뒷바퀴의 두께를 측정한다. 그후, 개시된 화합물(100mg/kg) 또는 비히클(즉., Captisol)을 마우스에게 복강내 투여한 다음 30분 후 OXL(1%, 20㎕)을 우측 귓바퀴의 전방부 및 후방부 둘 다에 국소 적용하였다. 대조군으로서, 좌측 귓바퀴에 20㎕의 아세톤(OXL 부형제)을 전방부 및 후방부 둘 다에 제공한다. 양 귀의 귓바퀴 두께를 24시간 후 다시 측정한다. 그룹당 N=10.
알데히드 포획을 측정하기 위한 검정
별도의 반응 바이알에 각각의 개시된 화합물, (0.064mmol), MDA 염(22.7% MDA, 0.064mmol), 및 글리세릴 트리올레에이트(600mg)를 가한다. 혼합물에 수성 PBS(~2.5ml) 중의 20 wt% Capitsol을 가한 다음 리놀레산(600mg)을 가한다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 격렬하게 교반하고 LC/MS로 모니터링한다. 개시된 화합물은 MDA와 급속히 반응하여 MDA 부가물을 형성한다.
쉬프 염기 확인
UV/VIS 분광법을 사용하여 본 발명의 화합물의 1급 아민과 RAL의 쉬프 염기 축합을 모니터링한다. RAL과의 쉬프 염기 축합 생성물의 시험관내 분석을 개시된 화합물에 대해 실시한다.
용액 상 분석에서, 유리 화합물 및 RAL 쉬프 염기 축합 생성물(RAL-SBC) 둘 다의 λmax 값을 RAL-SBC의 tau에 대한 값과 함께 측정한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "RAL-SBC"는 RAL과 RAL-화합물의 쉬프 염기 축합 생성물을 의미한다. 용액 상 분석은 당업계에 공지된 프로토콜을 사용하여 화합물과 RAL의 100:1 혼합물을 사용하여 수행한다. 수성, 에탄올, 옥탄올, 및 클로로포름:메탄올(다양 예를 들면, 2:1)을 포함하는 몇 개의 용매 시스템을 시험하였다. 용액 역학을 측정하고 용매 조건에 매우 의존적임을 밝혀내었다.
쉬프 염기 축합의 고체 상 분석을 또한 화합물 대 RAL의 1:1 혼합물을 사용하여 수행한다. 고체 상 분석을 당업계에 공지된 프로토콜을 사용하여 수행한다. 혼합물을 질소하에 건조시키며 축합 반응을 완료되도록 일으킨다.
지질 상 분석을 당업계에 공지된 프로토콜을 사용하여 수행하고 λmax, tau(RAL-SBC vs. APE/A2PE), 및 경쟁적 억제를 측정한다. 리포솜 상태는 원위치 상태(in situ condition)에 가깝다.
암순응의 ERG 분석
암순응은 빛에 노출 후의 시감도의 회복이다. 암순응은 빠른(뉴런성) 과정 및 느린(광화학적) 과정 둘 다를 포함하는 다중 성분을 갖는다. 시각 색소의 재생은 느린 광화학적 과정과 관련이 있다. 암순응 속도는 몇 가지 이유로 측정된다. 야맹증은 암순응 기능상실(광 시감도의 손실)로부터 야기된다. 암순응된 광 시감도에 대한 약물 효과를 측정함으로써 야간 시력에 대한 안전 용량을 찾는 것이 가능하다.
망막전위도(ERG)를 사용하여 정상 vs. 약물 조건하에서 암순응을 측정한다. ERG는 실험적으로 규정된 광 자극에 대한 반응 동안 망막 뉴런에 의해 방출된 전기장 전위의 측정이다. 보다 구체적으로, ERG는 빛을 순간적으로(예를 들면, 50ms) 비춘 후 각막에서 망막 전계 전위(retinal field potential)를 측정한다. 망막 세포에 기인하는 전계 강도는 102 내지 103 마이크로볼트이다.
ERG는 살아있는 대상체(인간 또는 동물) 또는 살아있는 동물로부터 수술적으로 제거된 용액내 편측절단, 안구에서 수행될 수 있는 비침습 측정이다. ERG는 암순응을 늦추고 실험 설계에 포함되어야 하는 전신 마취를 필요로 한다.
암순응 실험의 전형적인 ERG 분석에서, 모든 랫트를 일정한 상태의 광 감도에 도달하도록 수 시간 동안 암순응시킨다. 그후, 랫트를 "광-표백", 즉, 유리 11-시스-RAL의 망막을 일시적으로 고갈시키기에 충분한 강한 빛에 잠시 노출시킨다(예를 들면, 300 lux에서 2분). 그후, 랫트를 암순응의 개시, 즉, 시각 색소의 재생으로 인한 광 감도의 회복 즉시 다시 어둡게 한다. ERG를 사용하여, 랫트가 얼마나 빨리 암순응되고 광 감도를 회복하는지를 측정한다. 특히, 광 감도에 대한 기준 반응 변수를 정한다.
ERG 측정은 동력학 분석에 의해 미리 결정된 표백후 암순응 회복의 특정 지속시간(예를 들면, 30분) 후 이루어진다. 곡선 적합도(curve fit)를 사용하여 감도 변수에 대한 값을 계산하며 Y50 및 σ에 대한 암순응 동력학을 포함한 동일 랫트에서의 마취로의 회복을 보여준다. 더 작은 광 감도로 더 느린 적응이 관찰되며, 여기서 Y50은 -4.0에 도달하고 tau = 22.6분이다. 더 큰 광 감도로 더 빠른 적응이 관찰되며, 여기서 Y50은 -5.5에 도달하고 tau = 9.2분이다.
용량 범위결정을 위해 상기한 바와 동일한 패러다임을 따른다. ERG 용량 범위결정 프로토콜에서, 화합물 i.p.는 용량 의존적 방식으로 암순응된 랫트의 광 감도를 낮춘다. 시력에 대한 효과는 3시간 후 감소한다.
RAL 반응의 NMR 분석
NMR 분광법을 사용하여 본 발명의 화합물의 1급 아민과 RAL의 쉬프 염기 축합 및 환 형성을 모니터링한다.
A2E 형성의 억제
당해 실험은 RAL-트랩 화합물의 만성 i.p. 주사가 야생형 스프래규 돌리 랫트에서 A2E의 축적 속도를 낮춘다는 개념 입증을 확립하기 위해 설계된다. 이러한 실험은 RAL-트랩 화합물의 치료 효능을 대조 화합물 및 비처리군과 비교한다.
재료 및 방법 :
연구는 야생형 스프래규 돌리 랫트로 수행한다. 랫트 치료군은, 예를 들면, 치료 조건당 혼성의 8마리 랫트를 포함한다. 각 동물을 다음의 조건들 중의 하나로 치료한다:
ㆍ 대조군: (1) 이러한 치료는 방출되어 A2E를 형성하는데 이용 가능한 유리 트랜스-RAL의 양을 감소시키지만, 야맹증의 바람직하지 못한 부작용을 갖는다는 점에서 프로토콜 대조군으로서 시각 회로 단백질의 레티노이드 결합 부위를 억제시키는 13-시스 레티노산, 및 (2) 인간에서 망막 기능을 조절하는 것으로 임상적으로 알려져 있고 동물 모델에서 시험관내 및 생체내 둘 다에서 유리 RAL과 쉬프 염기 부가물을 형성하는 것으로 실험적으로 알려진 상업적으로 이용 가능한 화합물.
ㆍ 비히클
ㆍ 화합물
ㆍ 비처리
개시된 화합물을 1, 5, 15, 및 50mg/kg을 포함한 용량 범위에 걸쳐 시험한다. 치료는 i.p. 주사에 의해 8주간 매일 투여한다.
화학 :
실험은 다양한 화학 서비스를 사용한다. 예를 들면, 이러한 실험은 불순물을 특성화하기 위해 분석용 규격 시트와 상업적으로 이용 가능한 화합물을 사용한다. 화합물을 또한 합성한다. 화합물은 필요한 용량에 충분한 양으로 제조한다. 화합물의 제형은 복강내(i.p.) 주사를 포함한 초기 동물 안전성 연구에 사용하기에 적합하다. 트랜스-RAL과 본 발명의 화합물의 쉬프 염기 반응 생성물의 다음의 세 가지 특성이 밝혀진다:
ㆍ 반응 속도에 대한 안정성
ㆍ 흡수성, 특히 uv-vis 흡수 최대 및 소광 계수(예를 들면, 문헌[Rapp and Basinger, Vision Res. 22:1097, 1982]의 도 5 참조) 또는 반응 동력학의 NMR 스펙트럼 분석
ㆍ log P 및 log D 용해도 값, 예를 들면 계산치
생물학 및 생화학
본원에 기재된 실험은 다양한 생물학 및 생화학 서비스를 사용한다. 예를 들면, 안구 자극 프로토콜로 토끼에서 및 광 자극에 대한 시각 반응에서 암순응의 ERG 측정으로 설치류에서, 점안액 형성으로의 매일 치료에 대한 본 발명의 화합물의 "무효과 수준"(NOEL) 용량을 확립한다. 치료 후 및 안구 적출 전, 다음의 비침습 검정을 동물, 예를 들면, 토끼에서 수행한다:
ㆍ 안저 촬영에 의해 자명한 바와 같은 RPE 및 광수용기 세포 변성(Karan, et al. 2005, PNAS 102:4164)
ㆍ 안저 형광 촬영에 의해 측정되는 바와 같은 세포외 드루젠 및 세포내 리포푸신(Karan 등 2005)
광 반응을 ERG로 특성화한다(Weng, et al., Cell 98:13, 1999). 문헌[Karan et al., 2005; Radu et al., 2003; and Parish et al., PNAS 95:14609, 1998]에 기재된 바와 같은 분석 방법을 사용한 치료 프로토콜의 종결시 망막 RPE 세포 추출물의 세포내 A2E 농도를 모든 치료된 동물에서 측정한다. 예를 들면, 치료된 동물의 샘플에서, 한쪽 눈은 분석하고 다른쪽 눈은 조직학 분석을 위해 남겨 둔다(아래 기재된 바와 같음). 나머지 동물에서, 양눈을 A2E 형성에 대해 별도로 분석한다.
치료후 안구를 조직학 분석을 위해 챙겨두고(상기한 바와 같음), 망막 및 RPE 조직의 형태를 광학 현미경 조직학 기술(Karan 등 2005, 전자 현미경이 본원에 기재된 실험에서는 사용되지 않는다는 점은 제외함)로 평가한다.
치료 섭생의 안전성을, 예를 들면, 다음의 조합을 사용하여 평가한다:
ㆍ 치료 기간 전반에 걸쳐 동물 행동 및 식성에 대해 매일 문서 관찰
ㆍ 치료 기간 말기에 ERG에 의해 측정되는 시각 성능
ㆍ 치료 말기에 안구 조직학 분석
실시예 11: 중수소화 NS2(NS2-D6; 화합물 I-1)의 교차-종 대사산물 프로파일링 시험
목적:
일단, 동물에 투여되면, 소분자는 다수의 대사산물을 생성하는 다양한 반응을 겪을 수 있다. 생성되는 정확한 대사산물은 동물, 분자 구조, 및 분자의 조직 분포와 같은 여러 인자들에 따라 좌우된다. 소분자의 대사는 뇨 또는 변으로의 분자의 배출을 돕기 위해 수용해도를 증가시키는 목적에 알맞을 수 있거나, 단순히 우연한 효소-촉매 반응의 결과일 수 있다. 예시적인 대사산물은 산화 및 글루쿠론산화(glucuronidation) 산물을 포함한다. 생성되는 대사산물의 분포 및 양을 예측하는 것은 종종 불가능하다. 이러한 연구의 한 가지 목적은 저온보존된 일차 간세포에서 시험 물품 NS2의 교차 종 대사산물 프로파일링을 수행하는 것이었다. 아래 기재된 바와 같이, 각종 NS2 대사산물이 제조되었으며 대사산물의 분포는 상이한 종에 걸쳐 유의적으로 달랐다. 소분자 약물의 대사산물의 갯수 및 양을 감소시키는 것, 예를 들면 체내 약물 반감기를 증가시키고/시키거나 독성 또는 불활성 대사산물로의 전환을 방지하는 것이 종종 바람직하다. 수중의 이러한 지식으로, NS2의 중수소화가 대사산물의 갯수 및 양을 감소시키는 가능한 경로로서 탐구되었다. 분자의 중수소화(즉, 중수소로의 하나 이상의 수소원자의 대체)는 종종 대사산물의 생산율에 상당한 효과를 갖는다; 그러나, 주어진 분자에 대한 중수소화의 효과는 대개의 경우에 예측하기가 거의 불가능하다. 따라서, 인간 간세포에서 중수소화-NS2에 대해 대사산물 프로파일링을 수행하였다.
연구 조건:
당해 연구는 비-GLP 조건하에서 수행하였다. 모든 작업은 적합한 현지 보건 법규 및 윤리적 승인으로 수행하였다.
실험 설계:
샘플 분석
샘플을 Agilent 1290 HPLC Infinity 시리즈, CTC PAL 냉각 자동샘플러와 커플링된 SCIEX QTrap 5500 질량 분석계를 사용하여 LC-MS/MS로 분석하였으며, 모두는 Analyst 소프트웨어로 제어하였다. 아세토니트릴-물 구배를 사용하여 C18 역상 HPLC 컬럼(Acquity UPLC HSS T3, 1.8, 2.1 x 50mm) 상에서 분리한 후, Q1 스캔 모드로 ESI 이온화를 사용하는 질량 분석법(MS)에 의해 피크를 분석하였다. LC 조건이 아래 표 3에 나타내어져 있다.
표 3: LC 구배
Figure pct00082
표 4는 대사산물 프로파일링을 위한 실험 파라미터를 보여준다.
표 4: 간세포에서의 대사산물 프로파일링: 실험 조건
Figure pct00083
실험 과정
시험 물품을 37℃에서 일차 저온보존된 간세포와 이중으로 배양하였다. 세포를 해동시키고, 생존 가능한 세포를 계수하고, 공급자의 지침에 따라 평형화하였다. 부드럽게 교반하면서 37℃에서 30분 평형화한 후, 시험 화합물을 세포에 가하여 3μM의 목적하는 최종 농도를 제공하였다. 세포 현탁액을 상기한 바와 같이 37℃에서 배양하였다. 제시된 시간에, 샘플을 제거하고 등용적의 빙냉 정지액(메탄올)과 혼합하였다.
동시에, 시험 제제의 부재하에 블랭크 간세포 샘플을 120분 동안 배양하고 간세포로부터 유도된 피크의 존재를 보여주기 위한 대조군으로서 사용하였다. 정지된 반응물을 적어도 10분간 빙상에서 배양하고, 추가 용적의 물을 가하였다. 샘플을 원심분리하여 침전된 단백질을 제거하고, 상청액을 LC-MS/MS로 분석하였다.
전체 스캔 질량 스펙트럼(100 내지 800 m/z)을 양성 및 음성 이온화 모드 둘 다로 구배에 걸쳐 실시하여 가능성있는 대사산물의 존재여부를 찾아보았다(신규 덩어리 및 알려진 상 I 및 II 대사산물, 예를 들면: 산화, 황산화, 이산화, 탈수소화, 황산화 + 산화, 글루쿠론산화, 산화 + 글루쿠론산화, 및 글루타티온 접합). 질량 분석 방법이 아래 표 5에 나타내어져 있다.
표 5: 질량 분석 방법 개발
Figure pct00084
결과
놀랍게도, NS2의 중수소화가 인간 간세포에서 대사산물의 갯수 및 양을 크게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 아래 표 6A 및 6B에 요약된 바와 같이, NS2의 프로테오-(비-중수소 풍부화된) 형태는 랫트, 개, 원숭이, 또는 인간 간세포에서 단, 120분에 걸쳐 상당히 대사되었다. 예를 들면, LC 체류 시간 및 질량 분석법 데이터에 의해 평가되는 바와 같이 개 간세포는 NS2를 두 개의 상이한 단일-산화 산물(M1 및 M2) 및 두 개의 상이한 글루타티온(GSH) 접합체(M5 및 M6)로 대사시켰다(도 3 참조). 시노 원숭이 간세포는 NS2를 단일-산화 대사산물(M1), 네 개의 산화 + 글루쿠론산화 대사산물(M3, M4, M7, 및 M9), 및 글루쿠론산화 대사산물(M8)로 대사시켰다(도 2 참조). 인간 간세포는 NS2를 단일-산화 대사산물(M1), 두 개의 산화 + 글루쿠론산화 대사산물(M7 및 M9), 및 글루쿠론산화 대사산물(M8)로 대사시켰다(도 1 참조).
표 6A: 간세포에서 NS2의 대사산물 프로파일링: 데이터 요약
Figure pct00085
관찰된 대사산물 형성의 상대적인 정도를 "+"로 표시하며, 여기서 ++++는 가장 풍부한 대사산물이다(부모의 이온화 전위가 대사산물의 이온화 전위와 유사하다고 가정함).
표 6B: 관찰된 대사산물의 피크 면적
Figure pct00086
NS2, 각각의 대사산물 M1 내지 M9, 중수소화 NS2, 및 중수소화 NS2로부터 인간 간세포에서 생산된 대사산물의 질량 스펙트럼 분석이 도 6 내지 도 17에 나타내어져 있다.
비-중수소-풍부화 NS2와는 달리, 120분 동안 인간 간세포에의 중수소-풍부화 NS2(즉, 화합물 I-1, 또는 표 7에서 NS2-D6)의 노출은 검출 가능한 유일한 대사산물로서 단일-산화 대사산물 M1을 초래한다(표 7과 도 5 및 도 17 참조). 생산되는 M1의 양은 또한 비-중수소화 NS2를 인간 간세포에 노출시킨 경우에 생산된 것에 비해 크게 감소하였다(도 1 및 도 5 비교). 대사산물 생산에 있어서의 이러한 극적인 감소는 사전에 예측할 수 없었다.
표 7: 인간 간세포에서 중수소화 NS2의 대사산물 프로파일링: 데이터 요약
Figure pct00087
관찰된 대사산물 형성의 상대적인 정도를 "+"로 표시하며, 여기서 ++++는 가장 풍부한 대사산물이다(부모의 이온화 전위가 대사산물과 유사하다고 가정함).
주지: 관찰된 대사산물의 갯수에 기초하여, 중수소화-NS2는 비-중수소화 NS2 분자에 비해 2시간에 걸쳐 더 적은 대사를 나타내었다.
표 7에 나타낸 결과는, 또한 대사산물의 갯수와 양의 감소가 단순히 중수소 삽입으로 인한 것이 아닐 수 있어, 효소-촉매된 속도-결정 단계를 더욱 어렵게 만들 수 있다는 점에서 놀랍다. 오히려, 259의 관찰된 m/z는 단일-산화 산물에 보유되어 있는 모든 6개 중수소 원자와 일치한다. 이론에 결부시키고자 하는 것은 아니지만, 이는 중수소 풍부화가 분자 상의 외딴 위치에서 대사에 영향을 미치며, 아마도 단순히, 예를 들면, 1차 동력학적 동위 원소 효과를 통해서가 아님을 나타낼 수 있다.
참고문헌 : 1) McGinnity, D.F. et al. (2004). "Evaluation of fresh and cryopreserved hepatocytes as in vitro drug metabolism tools for the prediction of metabolic clearance." Drug Metab . Dispos . 32(11):1247-1253. 2) Sahi, J. et al. (2010). "Hepatocytes as a tool in drug metabolism, transport and safety evaluations in drug discovery." Current Drug Discov . Technol . 7(3):188-198.
실시예 12: NS2(즉, 비-중수소화 NS2 )에 대한 분리된 해마 배양물에서의 과산화수소 독성으로부터의 보호 활성에 대한 용량 반응의 평가
과산화수소 독성으로부터의 보호에 대한 NS2 용량 반응 평가를 위한 실험 계획:
A. 시험 제제: NS2 FW: 236
1. 공급원 1: CoreRx lot 093-FOR CNS2; 사용량: 6.4mg; 미세-분쇄된 샘플(평균 입자 크기는 약 16 마이크론이다)은 J-Star Lot BR-NS2-11-01로부터 유도되었다.
2. 공급원 2: J-Star lot BR-NS2-1; 사용량: 6mg; 비-분쇄된 샘플
B. 제형 및 스톡 용액 제조
두 가지 유형의 제형을 비교하였다: 디메틸 설폭사이드(DMSO) 및 Captisol®
1. Captisol® 제형: Captisol®을 둘세코 인산염 완충 염수(DPBS)에서 5mg/ml(즉, 0.5%)로 용해시켰다. 10mM NS2 스톡 용액(스톡 A)은 1mg(4.24㎛ol)을 0.42ml의 Captisol® 용액에 용해시켜 1㎛ol/ml 또는 10mM(즉, 2.38mg/mL)의 초기 스톡을 제공함으로써 제조하였다. 스톡 용액은 보텍스 혼합 후 투명하였다.
2. DMSO 제형: DMSO를 Captisol®에 대한 비교기(comparator)로서 사용하였다. 100mM 스톡 용액(즉, 23.8mg/mL)을 위해 5mg(21.12㎛ol)의 NS2를 0.21mL의 DMSO에 용해시켰다. 100mM NS2 DMSO 제형은 투명하였다. 로그 희석을 DPBS로 수행하였다. DPBS로 1:10 내지 10mM 희석시, 용액은 혼탁해졌지만, 대규모 보텍스 혼합 후 투명해졌다. 일반적으로, 일차 뉴런 배양물에서 DMSO에 대한 우리의 기준 농도 목표는 DMSO의 약리학적 작용을 피하기 위해 0.1% 미만이다. NS2의 1mM 시험 농도에 대해서는 1% DMSO가 사용되었음을 주지한다. 5시간 시험에서의 검정에서 명백한 독성은 관찰되지 않았다(아래 실험 9로부터의 결과 참조).
C. 스톡 용액의 제조에 대한 세부사항
Captisol® 중의 NS2
1. 스톡 A는 0.5% Captisol® 중의 10mM NS2이었다. 각 웰에, 0.05% Captisol® 중의 1mM NS2의 최종 농도를 위해 100㎕에 10㎕를 가하였다.
2. 스톡 B는 50㎕의 스톡 A를 450㎕의 DPBS에 가하여 NS2의 1mM 용액을 생성함으로써 제조하였다. 0.005% Captisol® 중의 100μM NS2의 최종 농도를 위해 100㎕ DPBS에 10㎕를 가하였다.
3. 스톡 C은 50㎕의 스톡 B를 450㎕의 DPBS에 가하여 NS2의 100μM 용액을 생성함으로써 제조하였다. 0.0005% Captisol® 중의 10μM NS2의 최종 농도를 위해 100㎕ DPBS에 10㎕를 가하였다.
4. 스톡 D는 50㎕의 스톡 C를 450㎕의 DPBS에 가하여 NS2의 10μM 용액을 생성함으로써 제조하였다. 0.00005% Captisol® 중의 1μM NS2의 최종 농도를 위해 100㎕ DPBS에 10㎕를 가하였다.
5. 스톡 E는 50㎕의 스톡 D를 450㎕의 DPBS에 가하여 NS2의 1μM 용액을 생성함으로써 제조하였다. 0.000005% Captisol® 중의 0.1μM NS2의 최종 농도를 위해 100㎕ DPBS에 10㎕를 가하였다.
DMSO 중의 NS2:
1. 스톡 A는 100% DMSO 중의 100mM NS2이었다.
2. 스톡 B는 10mM NS2의 최종 농도를 위해 50㎕의 스톡 A를 450㎕의 DPBS에 가함으로써 제조하였다. 1% DMSO 중의 1mM NS2의 최종 농도를 산출하기 위해 100㎕ DPBS에 10㎕를 가하였다.
3. 스톡 C는 1mM NS2의 최종 농도를 위해 50㎕의 스톡 B를 450㎕의 DPBS에 가함으로써 제조하였다. 0.1% DMSO 중의 100μM NS2의 최종 농도를 산출하기 위해 100㎕ DPBS에 10㎕를 가하였다.
4. 스톡 D는 100μM NS2의 최종 농도를 위해 50㎕의 스톡 C를 450㎕의 DPBS에 가함으로써 제조하였다. 0.01% DMSO 중의 10μM NS2의 최종 농도를 산출하기 위해 100㎕ DPBS에 10㎕를 가하였다.
5. 스톡 E는 10μM NS2의 최종 농도를 위해 50㎕의 스톡 D를 450㎕의 DPBS에 가함으로써 제조하였다. 0.001% DMSO 중의 1μM NS2의 최종 농도를 산출하기 위해 100㎕ DPBS에 10㎕를 가하였다.
6. 스톡 F는 1μM NS2의 최종 농도를 위해 50㎕의 스톡 E를 450㎕의 DPBS에 가함으로써 제조하였다. 0.0001% DMSO 중의 0.1μM NS2의 최종 농도를 위해 100㎕ DPBS에 10㎕를 가하였다.
모든 경우에, 웰에서 110㎕의 총 용적을 위해 10㎕의 적절한 희석액을 100㎕에 가하였다.
D. 과산화수소와 관련된 산화 스트레스로부터의 NS2-매개된 신경보호를 검출하기 위해 설계된 배양 조건
1. 랫트 해마 배양물을 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다(Brenneman DE, Smith GR, Zhang Y, DuY, Kondaveeti SK, Zdilla MJ, Reitz AB. (2012) J. Molecular Neuroscience, 47:368-379). 이러한 조건하에서, 배양물은 적어도 90% 뉴런이다. 가장 풍부한 비-뉴런 세포는 성상세포이다.
2. 모든 배양물을 웰당 10K 세포의 평판배양 밀도로 96-웰 포맷으로 제조하였다. E18 해마 조직의 분리 후 10일 내지 21일 사이에 배양물을 처리하였다. 이 실험을 위해, 모든 플레이트는 13일째에 처리하였다. 모든 실험에서, 과산화수소를 NS2 또는 칸나비디올(CBD)로 처리한지 10분 후 배양물에 가하였다. 각각의 처리 조건에 대해, 반복실험(replicate) 횟수는 5회이었다.
3. 모든 배양물을 B27/신경 기본 배지(Neural Basal Medium)에 평판배양하였다. 처리일에, 모든 배양물을 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지로 배지를 완전 교체하였다.
4. 이전에 결정된 바와 같이(Brenneman 등, 2012), 10μM 과산화수소를 사용하여 독성 및 산화 스트레스를 생성시켰다. 이전에 기재된 바와 같이[Jarrett, SG, Liang, L-P, Hellier, JL, Staley, KJ and Patel, M. (2008) Neurobiol. Dis 30(1): 130-138], 10μM 과산화수소가 간질 지속증의 카이네이트 모델로 랫트의 해마에서 관찰되었다.
5. 모든 연구에서 사용되는 양성 대조군은 알려진 항산화제인 10μM 칸나비디올(CBD)이었으며[Hampson et al. (1998), Proc.Nat.Acad. Sci 95:8268-8273], 이는 1차 뉴런에서 산화 스트레스에 대해 보호성이다[Brenneman, DE, Petkanas, D and Kinney, W.A. (2014) Annual Symposium on the Cannabinoids, page 129].
6. 음성 대조군 웰, 과산화수소 웰, 및 양성 대조군 웰 중 어느 것도 약물 비히클을 함유하지 않았다.
E. 검정
이 연구에서 사용되는 검정 둘 다는 상세하게 기재되어 있다[Brenneman DE, Smith GR, Zhang Y, DuY, Kondaveeti SK, Zdilla MJ, Reitz AB. (2012) J. Molecular Neuroscience, 47:368-379].
1. CFDA 뉴런 생존력 검정. 이러한 검정에서, CFDA 염료는 모든 살아있는 세포에 의해 흡수되고 에스테라제에 의해 분해되어 플루오레세인을 방출한다. 뉴런이 이 염료를 제거할 수 없기 때문에 뉴런 특이성(neuronal specificity)이 달성되는 반면, 시간 경과에 따라 비-뉴런 세포로부터의 염료의 유출이 발생할 수 있다. 세포외 염료를 씻어낸 후, 배양물을 형광계에서 판독하였으며; 세포내 염료 강도는 살아있는 뉴런 개체군에 비례한다. 원래의 참조문헌: Petroski, RE and Geller HM. (1994) Selective labeling of embryonic neurons cultureson astrocyte monolayers with 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) J. Neurosci. Methods 52:23.32. 각 실험에 대한 평균 대조군 수준(mean control level)이 긴 점선 기준선으로 나타내어져 있다.
2. 요오드화 프로피듐을 사용한 세포사 검정을 동일한 웰에서 CFDA 검정과 동시에 수행하였다. 이 염료는 살아있는 세포로부터 배제되어 죽은 세포의 DNA에 결합한다. 검정은 괴사성 및 세포사멸성 세포사 둘 다를 검출하며; 이는 뉴런 세포사와 비-뉴런 세포사를 구별하지 못한다. 문헌[Sarafian TA, Kouyoumjian S, Tashkin D, Roth MD. (2002) Tox. Letters. 133: 171-179] 참조. 평균 대조군 수준이 중간-점선 기준선으로 나타내어져 있다.
3. 사용되는 시약:
a. 과산화수소 용액, 30wt%; Sigma-Aldrich(216736-100ml, Lot MKBV382V)
b. Aldeyra Therapeutics에 의해 제공된 Captisol®(Lot 17CX01-HQ-00088)
c. 디메틸 설폭사이드; Sigma-Aldrich(472301-100ml) 배취 21096 JK
d. 요오드화 프로피듐 Sigma-Aldrich(P4864-10ml; 물 중의 1mg/ml 용액)
e. CFDA [5(6)-카복시플루오레세인 디아세테이트] Sigma-Aldrich 제품 번호: 21879-100mg-F
f. 칸나비디올 용액, 에탄올 중의 10mg/ml; Sigma-Aldrich 제품 번호: 90899-1ml
g. 둘베코 인산염 완충 염수. Gibco(14190-144) Lot 1165767
4. 데이터 분석
a. 데이터 수집: 분석을 위해 데이터를 Advanced Neural Dynamics 컴퓨터에 저장하였다. 데이터 수집은 Cytofluor 형광계에서 실시하였으며 Sigma Plot 11으로 분석을 위해 엑셀 스프레드시트로 옮겼다.
b. 통계적 분석: 모든 데이터를 다중 비교 대 대조 그룹(Holm-Sidak) 방법으로 분산 분석에 의해 통계적으로 분석하였다. 통계적 유의도는 P < 0.05 수준으로 취하였다. 모든 경우에, 음성 대조군(10μM 과산화수소 처리)에 대해 비교하였다.
c. EC50 결정을 위한 방법:
i. EC50 효능 분석에서 NS2를 스크리닝하기 위해 넓은 농도 범위를 선택하였다. EC50을 평가하는데 반-로그 농도를 수반하는 추가의 분석이 필요할 수 있음을 인지하여, 0.1μM 내지 1mM의 로그-기반 농도 시리즈가 사용되었다.
ii. 비선형 회귀 분석을 사용하여 데이터에 최적합한 선의 방정식을 구하였다. (4-모수 로지스틱 곡선)
iii. 아래 로지스틱 방정식에 기초하여, 신경보호에 대한 EC50을 계산하고 SigmaPlot 11로 플롯팅하여, 두 가지 검정 모두에 대해 반-최고 반응을 생성하는데 필요한 농도를 구하였다. EC50을 구하는 축 교차점을 보여주기 위해 드롭 라인을 사용하였다.
4-모수 로지스틱 방정식
Figure pct00088
이는 가변 기울기 모수를 갖는 전형적인 용량-반응 곡선을 야기한다. 이는 때때로 4PL로 약칭된다. 4개 모수는 다음과 같다: min(곡선의 하단), max(곡선의 상단). EC50 = 최대 유효 반응의 50%를 생성하는 리간드의 농도.
5. 결과의 요약
표 8은 랫트 해마 배양물에서 NS2(즉, 비-중수소화 NS2)에 대한 보호 연구의 요약을 보여준다.
표 8: 랫트 해마 배양물에서 NS2에 대한 보호 연구의 요약
Figure pct00089
6. 실험적 조사결과 및 원 데이터의 그래픽 분석
a. 실험 1: Captisol® 중의 미세-분쇄된 NS2(CoreRx)에 대한 용량 반응. 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과.
i. NS2 공급원: 미세-분쇄된 CoreRx
ii. 제형: 초기 스톡은 0.5% Captisol® 중에서 제형화되었다
iii. 검정: CFDA
iv. 독소: 10μM 과산화수소
v. 처리의 지속시간: 5시간
vi. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
vii. 배양 기질: 폴리-L-리신
viii. 결론: EC50은 6.8μM에서 관찰되었다; 대조군(CBD + HP 및 비처리 대조군)과 비교한 최대 효능은 100μM NS2에서 관찰되었다.
NS2는 당해 검정에서 100μM에서 과산화수소 독성에 대해 완전히 신경보호성이다. 결과는 표 9와 도 18 및 도 19에 나타내어져 있다.
표 9: 10μM 과산화수소로의 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과
Figure pct00090
b. 실험 2: Captisol® 중의 미세-분쇄된 NS2(CoreRx)에 대한 용량 반응. 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 세포사에 대한 효과.
i. NS2 공급원: CoreRx(미세-분쇄됨)
ii. 제형: 초기 스톡은 0.5% Captisol® 중에서 제형화되었다
iii. 검정: 요오드화 프로피듐
iv. 독소: 10μM 과산화수소
v. 처리의 지속시간: 5시간
vi. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
vii. 배양 기질: 폴리-L-리신
viii. 결론: EC50은 1.3μM에서 관찰되었다; 대조군들(CBD + HP 및 비처리 대조군)과 비교한 최대 효능은 10μM NS2에서 관찰되었다.
NS2는 당해 검정으로 과산화수소 독성에 대해 완전히 신경보호성이다. 이러한 데이터는 세포사에 대한 보호 효과가 뉴런 생존력에 대해 관찰된 것보다 약간 더 강력할 수 있음을 시사한다. 결과는 표 10과 도 20 및 도 21에 나타내어져 있다.
표 10: 10μM 과산화수소로 5시간 동안 공동-처리 후 해마 배양물에서 세포사에 대한 NS2(CoreRx)의 효과
Figure pct00091
c. 실험 3: DMSO 중의 미세-분쇄된 NS2(CoreRx)에 대한 용량 반응. 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과.
i. NS2 공급원: CoreRx(미세-분쇄됨)
ii. 제형: 초기 스톡은 100% DMSO 중에서 제형화되었다
iii. 검정: CFDA
iv. 독소: 10μM 과산화수소
v. 처리의 지속시간: 5시간
vi. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
vii. 배양 기질: 폴리-L-리신
viii. 결론: EC50은 9.8μM에서 관찰되었다; 대조군(CBD + HP 및 비처리 대조군)과 비교한 최대 효능은 100μM NS2에서 관찰되었다.
Captisol® NS2에서 관찰된 바와 매우 유사한 EC50을 생성하는 제형으로서의 DMSO의 사용은 당해 검정에서 과산화수소 독성에 대해 완전히 신경보호성이다. 결과는 표 11과 도 22 및 도 23에 나타내어져 있다.
표 11: 10mM 과산화수소로 5시간 동안 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 NS2(CoreRx; DMSO 중의)의 효과
Figure pct00092
d. 실험 4: DMSO 중의 미세-분쇄된 NS2(CoreRx)에 대한 용량 반응. 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 세포사에 대한 효과.
i. NS2 공급원: CoreRx(미세-분쇄됨)
ii. 제형: 초기 스톡은 100% DMSO 중에서 제형화되었다
iii. 검정: 요오드화 프로피듐
iv. 독소: 10μM 과산화수소
v. 처리의 지속시간: 5시간
vi. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
vii. 배양 기질: 폴리-L-리신
viii. 결론: EC50은 1.3μM에서 관찰되었다; 대조군(CBD + HP 및 비처리 대조군)과 비교한 최대 효능은 10μM NS2에서 관찰되었다.
NS2는 당해 검정으로 과산화수소 독성에 대해 완전히 신경보호성이다. 이러한 데이터는 세포사에 대한 보호 효과가 뉴런 생존력에 대해 관찰된 것보다 약간 더 강력할 수 있음을 시사한다. 결과는 표 12와 도 24 및 도 25에 나타내어져 있다.
표 12: 10μM 과산화수소로의 공동-처리 후 해마 배양물에서 세포사에 대한 NS2(DMSO 중의 CoreRx)의 효과
Figure pct00093
e. 실험 5: Captisol® 중의 비-분쇄된 NS2(J-Star)에 대한 용량 반응. 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과.
i. NS2 공급원: J-Star(비-분쇄됨)
ii. 제형: 초기 스톡은 0.5% Captisol® 중에서 제형화되었다
iii. 검정: CFDA
iv. 독소: 10μM 과산화수소
v. 처리의 지속시간: 5시간
vi. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
vii. 배양 기질: 폴리-L-리신
viii. 결론: EC50은 9.1μM에서 관찰되었다; 대조군(CBD + HP 및 비처리 대조군)과 비교한 최대 효능은 100μM NS2에서 관찰되었다.
NS2는 당해 검정에서 과산화수소 독성에 대해 완전히 신경보호성이다. 결과는 표 13과 도 26 및 도 27에 나타내어져 있다.
표 13: 10μM 과산화수소로의 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과를 보여주는, Captisol® 중의 비-분쇄된 NS2(J-Star)에 대한 용량 반응 데이터
Figure pct00094
f. 실험 6: Captisol® 중의 비-분쇄된 NS2(J-Star)에 대한 용량 반응. 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 세포사에 대한 효과.
i. NS2 공급원: J-Star(비-분쇄됨)
ii. 제형: 초기 스톡은 0.5% Captisol® 중에서 제형화되었다
iii. 검정: 요오드화 프로피듐
iv. 독소: 10μM 과산화수소
v. 처리의 지속시간: 5시간
vi. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
vii. 배양 기질: 폴리-L-리신
viii. 결론: EC50은 2.8μM에서 관찰되었다; 대조군(CBD + HP 및 비처리 대조군)과 비교한 최대 효능은 10μM NS2에서 관찰되었다.
NS2는 당해 검정으로 과산화수소 독성에 대해 완전히 신경보호성이다. 이러한 데이터는 세포사에 대한 보호 효과가 뉴런 생존력에 대해 관찰된 것보다 약간 더 강력할 수 있음을 시사한다. 결과는 표 14와 도 28 및 도 29에 나타내어져 있다.
표 14: 10μM 과산화수소로의 공동-처리 후 세포사에 대한 효과를 보여주는, Captisol® 중의 비-분쇄된 NS2(J-Star)에 대한 용량 반응 데이터
Figure pct00095
g. 실험 7: DMSO 중의 비-분쇄된 NS2(J-Star)에 대한 용량 반응. 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과.
i. NS2 공급원: J-Star(비-분쇄됨)
ii. 제형: 초기 스톡은 100% DMSO 중에서 제형화되었다
iii. 검정: CFDA
iv. 독소: 10μM 과산화수소
v. 처리의 지속시간: 5시간
vi. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
vii. 배양 기질: 폴리-L-리신
viii. 결론: EC50은 2.6μM에서 관찰되었다; 대조군(CBD + HP 및 비처리 대조군)과 비교한 최대 효능은 100μM NS2에서 관찰되었다.
NS2는 당해 검정으로 과산화수소 독성에 대해 완전히 신경보호성이다. 결과는 표 15와 도 30 및 도 31에 나타내어져 있다.
표 15: 10μM 과산화수소로의 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과를 보여주는, DMSO 중의 비-분쇄된 NS2(J-Star)에 대한 용량 반응 데이터
Figure pct00096
h. 실험 8: DMSO 중의 비-분쇄된 NS2(J-Star)에 대한 용량 반응. 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 세포사에 대한 효과.
i. NS2 공급원: J-Star(비-분쇄됨)
ii. 제형: 초기 스톡은 100% DMSO 중에서 제형화되었다
iii. 검정: 요오드화 프로피듐
iv. 독소: 10μM 과산화수소
v. 처리의 지속시간: 5시간
vi. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
vii. 배양 기질: 폴리-L-리신
viii. 결론: EC50은 1.1μM에서 관찰되었다; 대조군(CBD + HP 및 비처리 대조군)과 비교한 최대 효능은 10μM NS2에서 관찰되었다.
NS2는 당해 검정으로 과산화수소 독성에 대해 완전히 신경보호성이다. 이러한 데이터는 세포사에 대한 보호 효과가 뉴런 생존력에 대해 관찰된 것보다 약간 더 강력할 수 있음을 시사한다. 결과는 표 16과 도 32 및 도 33에 나타내어져 있다.
표 16: 10μM 과산화수소로의 공동-처리 후 세포사에 대한 효과를 보여주는, DMSO 중의 비-분쇄된 NS2(J-Star)에 대한 용량 반응 데이터
Figure pct00097
i. 실험 9: 제형 비히클에 대한 용량 반응. 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과.
i. 시험 제제: Captisol®[Cap; (5mg/ml, 즉, 0.5%)] 및 1% DMSO(DM으로 약칭됨; 사용되는 최고 농도는 1%이었다). 제형에 대해 사용되는 양을 NS2 연구에서 사용되는 양에 매치시켰다.
ii. 검정: CFDA
iii. 독소: 10μM 과산화수소
iv. 처리의 지속시간: 5시간
v. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
vi. 배양 기질: 폴리-L-리신
vii. 결론: NS2에 대해서와 동일한 조건하에서 사용하는 경우 Captisol® 또는 DMSO로부터 뉴런 생존력에 대해 감지할 수 있는 효과가 없었다. 결과는 표 17 및 표 18과 도 34에 나타내어져 있다.
표 17: 10μM 과산화수소로의 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과를 보여주는, 제형 비히클에 대한 용량 반응 데이터
Figure pct00098
표 18: 10μM 과산화수소로의 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과를 보여주는, 제형 비히클에 대한 용량 반응 데이터
Figure pct00099
j. 실험 10: 제형 비히클에 대한 용량 반응. 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 세포사에 대한 효과.
i. 시험 제제: Captisol®[CP; (5mg/ml, 즉, 0.5%)] 및 DMSO(DM으로 약칭됨; 사용되는 최고 농도는 1%이었다).
ii. 검정: 요오드화 프로피듐
iii. 독소: 10μM 과산화수소
iv. 처리의 지속시간: 5시간
v. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
vi. 배양 기질: 폴리-L-리신
vii. 결론: NS2에 대해서와 동일한 조건하에서 사용하는 경우 Captisol® 또는 DMSO로부터 세포사에 대해 감지할 수 있는 효과가 없었다. 결과는 표 19 및 표 20과 도 35에 나타내어져 있다.
표 19: 10μM 과산화수소로의 공동-처리 후 세포사에 대한 효과를 보여주는, 제형 비히클에 대한 용량 반응 데이터
Figure pct00100
표 20: 10μM 과산화수소로의 공동-처리 후 세포사에 대한 효과를 보여주는, 제형 비히클에 대한 용량 반응 데이터
Figure pct00101
7. 관찰 및 결론의 요약
A. NS2는 제형 둘 다(DMSO 및 Captisol®) 및 화합물 배취 둘 다(CoreRx 및 J-Star, 각각 분쇄 및 비분쇄)를 사용한 CFDA 검정에서 과산화수소 독성에 대해 신경보호 활성을 나타내었다.
B. CFDA 검정에서 NS2의 신경보호 효과는 대조군(비 HP 처리군) 및 양성 대조군(CBD)과 동등하였으며, 이는 완전 보호를 나타낸다.
C. 대조군과 비교한 완전 보호는 CFDA 뉴런 생존력 분석에서는 100μM NS2에서 NS2 제형 및 NS2 배취 둘 다에서 관찰된 반면, 제형 및 배취 둘 다에 대한 비 효과 농도는 1μM이었다.
D. 비선형 곡선 피팅 로지스틱 분석은 CFDA 뉴런 생존력 검정에서 NS2 EC50 범위가 3 내지 10μM임을 나타내었다. 최상의 이용 가능한 EC50 추정치는 Captisol®에서 제형화된 CoreRx NS2(분쇄됨)로부터의 것이며, 이는 7 ± 4μM의 EC50을 나타내었다. CFDA 검정에 대한 상이한 NS2 제형으로부터의 모든 EC50은 이 범위내에 든다. 두 개의 화합물 배취 및 두 개의 제형이 상당한 유사성을 특징으로 한다는 것이 본 출원인의 결론이다.
E. NS2는 요오드화 프로피듐(PI) 검정에서 과산화수소 독성에 대해 보호 활성을 나타내었다. 이는 제형 둘 다 및 화합물 배취 둘 다에서 관찰되었다.
F. PI 검정에서 NS2의 보호 효과는 대조군(비 HP 처리군) 및 양성 대조군(CBD)과 동등하였으며, 이는 완전 보호를 나타낸다.
G. 비처리 대조군과 비교한 완전 보호는 PI 검정에서는 10μM NS2에서 NS2 제형 및 NS2 배취 둘 다에서 관찰된 반면, 제형 및 배취 둘 다에 대한 비 효과 농도는 1μM이었다. 이는 세포사 검정에서의 NS2 반응이 CFDA 검정에서보다 완전 보호에 대해 더 큰 효능을 나타내었다는 일치하는 조사결과이었다. 세포사 검정은 뉴런에 특이적이지 않으며 이 모델 CNS계에 존재하는 비-뉴런 세포를 수반할 수 있음을 인지해야 한다.
H. 비선형 로지스틱 곡선 피팅은 PI 검정에 대한 EC50 범위가 1.1 내지 2.8μM임을 나타내었다. 그러나, 이러한 검정에서 로지스틱 곡선의 경사진 특성은 곡선의 변곡점을 정의하는 것을 돕기 위한 반-로그 농도 반응의 측정 없이는 추정을 어렵게 하였다. 최상의 이용 가능한 추정치는 모든 PI 데이터에 대한 평균 값이며, 이는 2±1μM이다. 두 개의 화합물 배취 및 두 개의 제형은 상당한 유사성을 특징으로 하였다는 것이 본 출원인의 결론이다. PI 검정에서의 좁은 반응 범위 때문에, EC50 추정치를 개량하기 위해 추가의 분석이 필요할 수 있다. 이러한 데이터는 NS2가 과산화수소 독성에 대해 뉴런 생존력을 증가시키는 것보다는 세포사를 방지하는데 더욱 효력이 있을 수 있음을 시사한다.
I. 10μM 과산화수소에 의해 생긴 독성 신호는 과거에 시험되었던 광범위한 산화적 스트레스 요인(에탄올, 중금속, 암모늄 아세테이트, 및 글루타메이트)을 대표하며, 대조군으로부터의 감소는 30 내지 50%에 이른다.
J. 양성 대조군(10μM 칸나비디올)은 모든 시험 플레이트 상에서 활성이었으며, 이는 모델 시스템이 전형적인 방식으로 반응하고 있음을 나타낸다.
실시예 13: 분리된 해마 배양물에서 과산화수소 독성으로부터의 보호 활성을 평가하는 세 가지 중수소화 화합물에 대한 용량 반응
A. 과산화수소 독성으로부터의 보호에 대한 용량 반응 평가를 위한 실험 계획.
1. 시험 제제:
a. ALD-6 - 배취 1(Legacy ID: NS2-D6 또는 화합물 I-1); 사용량: 5.0mg; MW = 242.734
b. ALD-5 - 배취 1(Legacy ID: D3); 사용량: 6.1mg; MW = 203.24;
구조:
Figure pct00102
c. ALD-2 - 배취 1(Legacy ID: D2); 사용량: 5.6mg; MW = 203.24;
구조:
Figure pct00103
2. 제형 및 스톡 용액 제조
a. 100%의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 모든 샘플에 사용하였다.
b. 관찰:
i. ALD-6: 100mM 스톡 용액을 위해 (5mg, 20.6㎛ol)의 ALD-6을 0.206ml의 DMSO에 용해시켰다. 100mM ALD-6/DMSO 용액은 투명하였다. 로그 희석을 DPBS로 수행하였다. DPBS로 1:10 내지 10mM 희석시, 용액은 혼탁해졌지만, 보텍스 혼합 후 투명해졌다. 일반적으로, 일차 뉴런 배양물에서 DMSO에 대한 기준 농도 목표는 DMSO로부터의 약리학적 작용을 피하기 위해 0.1% 미만이다. 300μM 시험 농도의 모든 샘플에 대해 0.3% DMSO가 사용되었음을 주지한다. 5시간 시험 후 검정에서 분명한 독성은 관찰되지 않았다.
ii. ALD-5: ALD-5의 100mM 스톡 용액은 6.1mg(30㎛ol)을 0.3ml의 DMSO에 용해시킴으로써 제조하였다. ALD-5/DMSO 혼합물은 투명 황색 용액이었다. 로그 희석을 DPBS로 수행하였다. DPBS로 1:10 내지 10mM 희석시, 용액은 여전히 투명 황색 용액으로 있었다.
iii. ALD-2: ALD-2의 100mM 스톡 용액은 5.6mg(27.55㎛ol)을 0.275ml의 DMSO에 용해시킴으로써 제조하였다. ALD-2/DMSO 혼합물은 투명 황갈색 용액이었다. 로그 희석을 DPBS로 수행하였다. DPBS로 1:10 내지 10mM 희석시, 용액은 여전히 투명 황갈색 용액으로 있었다.
c. 스톡 용액의 제조에 대한 세부사항: DMSO/DPBS에서의 화합물 희석
i. 스톡 A는 100% DMSO 중의 100mM의 화합물이었다.
ii. 스톡 B는 10mM의 최종 농도를 위해 50㎕의 스톡 A를 450㎕의 DPBS에 가함으로써 제조하였다. 100㎕ DPBS에 3.3㎕를 가하여 0.3% DMSO 중의 300μM의 최종 농도를 생성하였다.
iii. 스톡 C는 1mM의 최종 농도를 위해 50㎕의 스톡 B를 450㎕의 DPBS에 가함으로써 제조하였다. 100㎕ DPBS에 10㎕를 가하여 0.1% DMSO 중의 100μM의 최종 농도를 생성하였다.
iv. 스톡 D는 100μM의 최종 농도를 위해 50㎕의 스톡 C를 450㎕의 DPBS에 가함으로써 제조하였다. 100㎕ DPBS에 10㎕를 가하여 0.01% DMSO 중의 10μM의 최종 농도를 생성하였다.
v. 스톡 E는 10μM의 최종 농도를 위해 50㎕의 스톡 D를 450㎕의 DPBS에 가함으로써 제조하였다. 100㎕ DPBS에 10㎕를 가하여 0.001% DMSO 중의 1μM의 최종 농도를 생성하였다.
vi. 스톡 F는 1μM의 최종 농도를 위해 50㎕의 스톡 E를 450㎕의 DPBS에 가함으로써 제조하였다. 100㎕ DPBS에 10㎕를 가하여 0.0001% DMSO 중의 0.1μM의 최종 농도를 생성하였다.
vii. 웰의 100㎕의 총 용적을 위해 10㎕의 적당한 희석물을 90㎕에 가하였다.
3. 과산화수소와 관련된 산화 스트레스로부터의 신경보호를 검출하기 위해 설계된 배양 조건:
a. 랫트 해마 배양물을 이전에 기재된 바와 같이 제조하였다(Brenneman DE, Smith GR, Zhang Y, DuY, Kondaveeti SK, Zdilla MJ, Reitz AB. (2012) J. Molecular Neuroscience, 47:368-379). 이러한 조건하에서, 배양물은 적어도 90%의 뉴런이다. 가장 풍부한 비-뉴런 세포는 성상세포이다. 랫트 E18 해마 조직은 Brain Bits, LLC(Springfield IL)로부터 구입하였다. 이들 조직을 운반을 위해 Hibernate E 배지에 저장하였다.
b. 모든 배양물을 웰당 10K 세포의 평판배양 밀도로 96-웰 포맷으로 제조하였다. E18 해마 조직의 분리 후 10일 내지 21일 사이에 배양물을 처리하였다. 이 실험을 위해, 모든 플레이트는 13일째에 처리하였다. 모든 실험에서, 과산화수소를 시험 제제 또는 양성 대조군(칸나비디올)으로 처리한지 10분 후 배양물에 가하였다. 각각의 처리 조건에 대해, 반복실험 횟수는 5회이었다.
c. 모든 배양물을 B27/신경 기본 배지(Neural Basal Medium)에 평판배양하였다. 처리일에, 모든 배양물을 항산화제 없는 혈청-비함유 B27/신경 기본 배지로 배지를 완전히 교체하였다.
d. 이전에 결정된 바와 같이(Brenneman et al., 2012), 10μM 과산화수소를 사용하여 독성 및 산화 스트레스를 생성시켰다. 이전에 기재된 바와 같이[Jarrett, SG, Liang, L-P, Hellier, JL, Staley, KJ and Patel, M. (2008) Neurobiol. Dis 30(1): 130-138], 10μM 과산화수소가 간질 지속증의 카이네이트 모델로 랫트의 해마에서 관찰되었다.
e. 모든 연구에서 사용되는 양성 대조군은 알려진 항산화제인 10μM 칸나비디올이었으며(Hampson et al. (1998), Proc. Nat. Acad. Sci. 95:8268-8273), 이는 1차 뉴런에서 산화 스트레스에 대해 보호성이다(Brenneman, DE, Petkanas, D and Kinney, W.A. (2014) Annual Symposium on the Cannabinoids, page 129).
f. 음성 대조군 웰, 과산화수소 웰, 및 양성 대조군 웰 중 어느 것도 약물 비히클을 함유하지 않았다.
4. 검정:
이 연구에서 사용되는 검정 둘 다는 상세하게 기재되어 있다(Brenneman DE, Smith GR, Zhang Y, DuY, Kondaveeti SK, Zdilla MJ, Reitz AB. (2012) J. Molecular Neuroscience, 47:368-379).
a. CFDA 뉴런 생존력 검정: 이러한 검정에서, CFDA 염료는 모든 살아있는 세포에 의해 흡수되고 에스테라제에 의해 분해되어 플루오레세인을 방출한다. 뉴런이 이 염료를 제거할 수 없기 때문에 뉴런 특이성이 달성되는 반면, 시간 경과에 따라 비-뉴런 세포로부터의 염료의 유출이 발생할 수 있다. 세포외 염료를 씻어낸 후, 배양물을 형광계에서 판독하였다; 세포내 염료 강도는 살아있는 뉴런 개체군에 비례한다. 원래의 참조문헌: Petroski, RE and Geller HM, (1994) "Selective labeling of embryonic neurons cultureson astrocyte monolayers with 5(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA)," J. Neurosci . Methods 52:23.32. 각 실험에 대한 평균 대조군 수준이 긴 점선 기준선으로 나타내어져 있다.
b. 요오드화 프로피듐을 사용한 세포사 검정을 동일한 웰에서 CFDA 검정과 동시에 수행하였다. 이 염료는 살아있는 세포로부터 배제되어 죽은 세포의 DNA에 결합한다. 검정은 괴사성 및 세포사멸성 세포사 둘 다를 검출하며; 이는 뉴런 세포사와 비-뉴런 세포사를 구별하지 못한다. 문헌[Sarafian TA, Kouyoumjian S, Tashkin D, Roth MD. (2002) Tox. Letters. 133: 171-179] 참조. 평균 대조군 수준이 중간-점선 기준선으로 나타내어져 있다.
c. 사용되는 시약
i. 과산화수소 용액, 30wt%; Sigma-Aldrich(216736-100ml, Lot MKBV382V)
ii. 디메틸 설폭사이드; Sigma-Aldrich(472301-100ml) 배취 21096 JK
iii. 요오드화 프로피듐; Sigma-Aldrich(P4864-10ml; 물 중의 1mg/ml 용액)
iv. CFDA [5(6)-카복시플루오레세인 디아세테이트] Sigma-Aldrich 제품 번호: 21879-100mg-F
v. 칸나비디올 용액, 에탄올 중의 10mg/ml; Sigma-Aldrich 제품 번호: 90899-1ml
vi. 둘베코 인산염 완충 염수(DPBS). Gibco(14190-144) Lot 1165767
5. 데이터 분석:
a. 데이터 수집: 분석을 위해 데이터를 Advanced Neural Dynamics 컴퓨터에 저장하였다. 데이터 수집은 Cytofluor 형광계에서 실시하였으며 Sigma Plot 11으로 분석을 위해 엑셀 스프레드시트로 옮겼다.
b. 통계적 분석: 모든 데이터를 다중 비교 대 대조 그룹(Holm-Sidak) 방법으로 분산 분석에 의해 통계적으로 분석하였다. 통계적 유의도는 P < 0.05 수준으로 취하였다. 모든 경우에, 음성 대조군(10μM 과산화수소 처리)에 대해 비교하였다.
c. EC50 결정을 위한 방법:
i. EC50 효능 분석에서 화합물을 스크리닝하기 위해 넓은 농도 범위를 선택하였다. 0.1μM 내지 300μM의 로그-기반 농도 시리즈가 사용되었다.
ii. 비선형 회귀 분석을 사용하여 데이터에 최적합한 선의 방정식을 구하였다. (4-모수 로지스틱 곡선)
iii. 상기 실시예에서 사용된 로지스틱 방정식에 기초하여, 신경보호에 대한 EC50을 계산하고 SigmaPlot 11로 플롯팅하여, 두 가지 검정 모두에 대해 반-최고 반응을 생성하는데 필요한 농도를 구하였다. EC50을 구하는 축 교차점을 보여주기 위해 드롭 라인을 사용하였다.
B. 랫트 해마 배양물에서의 Aldeyra 화합물에 대한 보호 연구의 요약
표 21: 보호 연구 데이터의 요약
Figure pct00104
C. 실험적 조사결과 및 원 데이터의 그래픽 분석
1. 실험 1: ALD-6의 용량 반응. 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과.
a. 제형: DMSO
b. 검정: CFDA
c. 독소: 10μM 과산화수소
d. 처리의 지속시간: 5시간
e. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
f. 배양 기질: 폴리-L-리신
g. 결론: EC50은 6.8±1.2μM에서 관찰되었다; 대조군(CBD + HP 및 비처리 대조군)과 비교한 최대 효능은 100μM ALD-6에서 관찰되었다. ALD-6은 본 검정에서 100μM에서 과산화수소 독성에 대해 완전히 신경보호성이었다. 결과는 표 22와 도 36 및 도 37에 나타내어져 있다.
표 22: 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과를 보이는, ALD-6에 대한 용량 반응 데이터
Figure pct00105
2. 실험 2: 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 세포사에 대한 ALD-6의 용량 반응 효과.
a. 제형: DMSO
b. 검정: 요오드화 프로피듐
c. 독소: 10μM 과산화수소
d. 처리의 지속시간: 5시간
e. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
f. 배양 기질: 폴리-L-리신
g. 결론: EC50은 0.32 ± 0.03μM에서 관찰되었다; 대조군(CBD + HP 및 비처리 대조군)과 비교한 최대 효능은 10μM ALD-6에서 관찰되었다. ALD-6은 당해 검정에서 과산화수소 독성에 대해 완전히 신경보호성이다. 이러한 데이터는 세포사에 대한 보호 효과가 뉴런 생존력에 대해 관찰된 것보다 더 강력하다는 것을 시사한다. 결과는 표 23과 도 38 및 도 39에 나타내어져 있다.
표 23: 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과를 보여주는, ALD-6에 대한 용량 반응 데이터
Figure pct00106
3. 실험 3: DMSO 중의 ALD-5에 대한 용량 반응. 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과.
a. 제형: DMSO
b. 검정: CFDA
c. 독소: 10μM 과산화수소
d. 처리의 지속시간: 5시간
e. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
f. 배양 기질: 폴리-L-리신
g. 결론: 과산화수소 독성에 대해 0.1 내지 300μM의 ALD-5로부터의 신경보호 활성은 통계적으로 유의적이지 않았다. 결과는 표 24 및 도 40에 나타내어져 있다.
표 24: 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과를 보여주는, ALD-5에 대한 용량 반응 데이터
Figure pct00107
4. 실험 4: ALD-5에 대한 용량 반응. 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 세포사에 대한 효과.
a. 제형: DMSO
b. 검정: 요오드화 프로피듐
c. 독소: 10μM 과산화수소
d. 처리의 지속시간: 5시간
e. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
f. 배양 기질: 폴리-L-리신
g. 결론: 0.1 내지 300μM ALD-5로부터의, 세포사로부터의 보호는 통계적으로 유의적이지 않았다. 결과는 표 25 및 도 41에 나타내어져 있다.
표 25: 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 세포사에 대한 효과를 보여주는, ALD-5에 대한 용량 반응 데이터
Figure pct00108
5. 실험 5: ALD-2에 대한 용량 반응. 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과.
a. 제형: DMSO
b. 검정: CFDA
c. 독소: 10μM 과산화수소
d. 처리의 지속시간: 5시간
e. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
f. 배양 기질: 폴리-L-리신
g. 결론: ALD-2는 과산화수소-처리된 배양물에서 뉴런 생존력의 감소로부터 통계적으로 유의적인 신경보호를 갖지 않았다. 결과는 표 26 및 도 42에 나타내어져 있다.
표 26: 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 뉴런 생존력에 대한 효과를 보여주는, ALD-2에 대한 용량 반응 데이터
Figure pct00109
6. 실험 6: ALD-2에 대한 용량 반응. 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 세포사에 대한 효과.
a. 제형: DMSO
b. 검정: 요오드화 프로피듐
c. 독소: 10μM 과산화수소
d. 처리의 지속시간: 5시간
e. 성장 배지: 항산화제 없는 B27/신경 기본 배지
f. 배양 기질: 폴리-L-리신
g. 결론: ALD-2로 처리 후 과산화수소에 의해 야기된 세포사로부터의 보호는 통계적으로 유의적이지 않았다. 결과는 표 27 및 도 43에 나타내어져 있다.
표 27: 10μM 과산화수소로 공동-처리 후 세포사에 대한 효과를 보여주는, ALD-2에 대한 용량 반응 데이터
Figure pct00110
7. 관찰의 요약 및 결론
a. ALD-6은 CFDA 검정에서 과산화수소 독성에 대해 신경보호 활성을 나타내었다.
b. CFDA 검정에서의 ALD-6의 신경보호 효과는 대조군(비 HP 처리군) 및 양성 대조군(CBD) 값과 통계적으로 상이하지 않았으며, 이는 완전 보호를 나타낸다.
c. 대조군과 비교한 완전 보호는 CFDA 뉴런 생존력 검정에서 100μM ALD-6에서 관찰되었다. CFDA 검정에서 ALD-6에 대한 비-효과 농도는 1μM이었다.
d. 비선형 곡선 피팅 로지스틱 분석은 CFDA 뉴런 생존력 검정에서 ALD-6의 EC50이 6.8+1.2μM임을 나타내었다.
e. ALD-6은 요오드화 프로피듐(PI) 검정에서 과산화수소 처리로부터의 세포사로부터 신경보호 활성을 나타내었다.
f. PI 검정에서 세포사로부터의 ALD-6의 보호 효과는 대조군(비 HP 처리군) 및 양성 대조군(CBD) 값과 통계적으로 상이하지 않았으며, 이는 완전 보호를 나타낸다.
g. 비처리 대조군 값과 비교한 완전 보호는 PI 검정에서 10μM의 ALD-6에서 관찰된 반면, 비-효과 농도는 0.1μM이었다. 세포사 검정에서 ALD-6 반응은 CFDA 검정에서보다 더 큰 효능을 나타내었다. 세포사 검정은 뉴런에 특이적이지 않으며 이 모델 CNS계에 존재하는 비-뉴런 세포를 수반할 수 있음을 인지해야 한다.
h. 비선형 로지스틱 곡선 피팅은 PI 검정에서 ALD-6에 대한 EC50이 0.32+0.03μM임을 나타내었다.
i. 0.1 내지 300μM의 ALD-5 또는 ALD-2로의 처리는 CFDA 검정으로 평가되는 바와 같이 과산화수소 처리 단독으로부터 통계적으로 유의적인 신경보호를 생성하지 못했다.
j. 0.1 내지 300μM의 ALD-5 또는 ALD-2로의 처리는 PI 검정으로 평가되는 바와 같이 과산화수소 처리에 의해 야기된 세포사로부터 통계적으로 유의적인 보호를 생성하지 못했다.
k. 10μM 과산화수소에 의해 생긴 독성 신호는 과거에 시험되었던 광범위한 산화적 스트레스 요인(에탄올, 중금속, 암모늄 아세테이트, 및 글루타메이트)을 대표하며, 대조군으로부터의 감소는 30 내지 50%에 이른다.
l. 양성 대조군(10μM 칸나비디올)은 모든 시험 플레이트 상에서 활성이었으며, 이는 모델 시스템이 전형적인 보호 방식으로 반응하고 있음을 나타낸다.
실시예 14: NS2-D6(화합물 I-1)의 생체내 약리학
NS2-D6(화합물 ID 100029054-1; 배취 번호 1603356191)을 결합 및 효소 흡수 검정으로 시험하였다. 화합물 결합은 각 표적에 특이적인 방사능 표지된 리간드의 결합의 억제 %로서 계산하였다. 화합물 효소 억제 효과는 대조군 효소 활성의 억제 %로서 계산하였다. 50%보다 높은 억제 또는 자극을 보이는 결과를 시험 화합물의 유의적 효과를 나타내는 것으로 간주한다. 이러한 효과가 본원에서 관찰되었으며 하기 표에 열거되어 있다.
참조 화합물
각 실험에서 그리고 적용 가능한 경우, 각각의 참조 화합물을 NS2-D6과 동시에 시험하였으며, 데이터를 동일 연구 시설에서 결정된 과거 값(historical value)과 비교하였다. 실험은 산업 표준 작동 절차에 따라 수행하였다.
결과
표 28은 효소 억제 결과를 요약한 것이다.
표 28: 효소 억제 결과의 요약
Figure pct00111
시험 화합물 결과는 도 44 내지 도 46에 나타내어져 있다. 표 29는 NS2-D6에 대한 특이 결합 결과를 보여준다.
표 29: 시험 화합물 결과
Figure pct00112
Figure pct00113
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
표 30은 NS2-D6과 비교되었던 다양한 참조 화합물에 대한 IC50, Ki, 및 nH 값을 보여준다.
표 30: 참조 화합물 결과
Figure pct00121
Figure pct00122
Figure pct00123
Figure pct00124
Figure pct00125
도 47은 NS2-D6에 대한 효소 및 흡수 검정에서의 시험관내 약리학 결과의 히스토그램을 보여준다.
표 31은 NS2-D6에 대한 대조군 값의 억제 %를 보여준다.
표 31: 시험 화합물 결과
Figure pct00126
Figure pct00127
표 32는 참조 화합물에 대한 IC50 및 nH 값을 보여준다.
표 32: 참조 화합물 IC50 및 nH 값
Figure pct00128
Figure pct00129
표 33은 구아닐릴 사이클라제에 대한 NS2-D6의 시험 화합물 결과를 보여준다.
표 33: 구아닐릴 사이클라제로의 시험 화합물 결과
Figure pct00130
표 34는 구아닐릴 사이클라제에 대한 참조 화합물 EC50 결과를 보여준다.
표 34: 구아닐릴 사이클라제로의 참조 화합물 결과
Figure pct00131
50%보다 높은 억제(또는 기초 조건에서 수행된 검정에 대한 자극)를 보이는 결과는 시험 화합물의 유의적인 효과를 나타내는 것으로 간주된다. 50%는 추가의 조사(농도-반응 곡선으로부터의 IC50 또는 EC50 값 결정)를 위한 가장 일반적인 컷-오프 값(cut-off value)이다. 25% 내지 50%의 억제(또는 자극)를 보이는 결과는 약한 내지 중간 정도의 효과를 가리킨다(대부분의 검정에서, 이들은 더 많은 실험간 변동성이 발생할 수 있는 범위 내에 있기 때문에 추가의 시험에 의해 이것이 확인되어야 한다). 25% 미만의 억제(또는 자극)를 보이는 결과는 유의적인 것으로 간주되지 않으며 주로 대조군 수준 부근의 신호의 변동성에 기인할 수 있다.
낮은 내지는 중간 정도의 음의 값은 실제 의미를 갖지 않으며 대조군 수준 부근의 신호의 변동성에 기인할 수 있다. 때때로 시험 화합물의 농도로 수득되는 높은 음의 값(≥50%)은 일반적으로 검정에서 시험 화합물의 비특이 효과에 기인할 수 있다. 드물게 이들은 시험 화합물의 알로스테릭 효과(allosteric effect)를 시사할 수 있다.
실험 조건
표 35는 결합 검정 조건을 요약한 것이다.
표 35: 결합 검정 조건
Figure pct00132
Figure pct00133
Figure pct00134
Figure pct00135
Figure pct00136
Figure pct00137
Figure pct00138
Figure pct00139
Figure pct00140
Figure pct00141
Figure pct00142
Figure pct00143
표 36은 효소 및 흡수 검정 조건을 보여준다.
표 36: 효소 및 흡수 검정 조건
Figure pct00144
Figure pct00145
Figure pct00146
결과의 분석 및 표현
시험관내 약리학: 결합 검정
결과는 NS2-D6의 존재하에서 수득된 대조군 특이 결합의 퍼센트: (측정된 특이 결합 / 대조군 특이 결합) x 100로; 그리고 대조군 특이 결합의 억제 퍼센트: 100 - ((측정된 특이 결합 / 대조군 특이 결합) x 100)로 표현된다.
IC50 값(대조군 특이 결합의 반-최고 억제를 야기하는 농도) 및 Hill 계수(nH)는 Hill 방정식 곡선 피팅을 사용하여 평균 반복실험 값으로 생성된 경쟁 곡선의 비선형 회귀 분석에 의해 구하였다:
Figure pct00147
여기서, Y = 특이 결합, A = 곡선의 좌측 점근선, D = 곡선의 우측 점근선, C = 화합물 농도, C50 = IC50, 및 nH = 기울기 인자. 이러한 분석은 Cerep(Hill software)에서 개발한 소프트웨어를 사용하여 수행되었으며 Windows®(ⓒ 1997 by SPSS Inc.)에 대한 상업용 소프트웨어 SigmaPlot® 4.0에 의해 생성된 데이터와의 비교에 의해 입증되었다. 억제 상수(Ki)는 Cheng Prusoff 방정식을 사용하여 계산하였다:
Figure pct00148
여기서, L = 검정에서 방사리간드의 농도, KD = 수용체에 대한 방사리간드의 친화도이다. 스캐차드 플롯을 사용하여 KD를 구한다.
시험관내 약리학: 효소 및 흡수 검정
결과는 NS2-D6의 존재하에서 수득된 대조군 특이 활성의 퍼센트: (측정된 특이 활성 / 대조군 특이 활성) x 100로; 그리고 대조군 특이 활성의 억제 퍼센트: 100 - ((측정된 특이 활성 / 대조군 특이 활성) x 100)로 표현된다.
IC50 값(대조군 특이 활성의 반-최고 억제를 야기하는 농도), EC50 값(대조군 기초 활성의 반-최고 증가를 생성하는 농도), 및 Hill 계수(nH)는 Hill 방정식 곡선 피팅을 사용하여 평균 반복실험 값으로 생성된 억제/농도-반응 곡선의 비선형 회귀 분석에 의해 구하였다:
Figure pct00149
여기서, Y = 특이 활성, A = 곡선의 좌측 점근선, D = 곡선의 우측 점근선, C = 화합물 농도, C50 = IC50 또는 EC50, 및 nH = 기울기 인자이다. 이러한 분석은 Cerep(Hill software)에서 개발한 소프트웨어를 사용하여 수행되었으며 Windows®(ⓒ 1997 by SPSS Inc.)에 대한 상업용 소프트웨어 SigmaPlot® 4.0에 의해 생성된 데이터와의 비교에 의해 입증되었다.
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Claims (45)

  1. 화학식 I의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    화학식 I
    Figure pct00150

    상기 화학식 I에서,
    R1은 -NH2, -NHD, 또는 -ND2로부터 선택되고;
    R2는 수소 또는 중수소로부터 선택되고;
    R3 및 R4는 -CH3, -CH2D, -CHD2, 또는 -CD3으로부터 독립적으로 선택되고;
    R5, R6, R7, 및 R8은 각각 수소 또는 중수소로부터 독립적으로 선택되고;
    단, R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, 또는 R8 중의 적어도 하나는 중수소이거나 중수소를 포함한다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 -NH2인, 화합물.
  3. 제1항에 있어서, R1이 -NHD인, 화합물.
  4. 제1항에 있어서, R1이 -ND2인, 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 수소인, 화합물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 중수소인, 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 -CH3인, 화합물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 -CH2D인, 화합물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 -CHD2인, 화합물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 -CD3인, 화합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R4가 -CH3인, 화합물.
  12. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R4가 -CH2D인, 화합물.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R4가 -CHD2인, 화합물.
  14. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R4가 -CD3인, 화합물.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R5, R6, R7, 및 R8이 수소인, 화합물.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R5, R6, R7, 및 R8이 중수소인, 화합물.
  17. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, R5, R6, R7, 및 R8 중의 두 개가 중수소인, 화합물.
  18. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, R5, R6, R7, 및 R8 중의 세 개가 중수소인, 화합물.
  19. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R5, R6, R7, 및 R8이 중수소인, 화합물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 R5, R6, R7, 및 R8이 다음의 엔트리(entry) 중의 하나에 정의된 바와 같은 화합물:
    Figure pct00151
  21. 제1항에 있어서, 다음의 구조들 중의 어느 하나로부터 선택되는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00152

    Figure pct00153

    Figure pct00154

    Figure pct00155
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따르는 화합물 및 약제학적으로 허용되는 보조제(adjuvant), 담체, 또는 비히클을 포함하는 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 추가의 치료제와 병용되는, 조성물.
  24. 대상체에게 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따르는 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 조성물을 투여함을 포함하고, 상기 조성물은 이를 투여하지 않은 상기 대상체에서의 A2E 축적의 수준에 비해 A2E 축적의 수준을 감소시키는, 대상체에서 병인이 A2E 및/또는 리포푸신의 축적을 수반하는 황반 변성 및 다른 형태의 망막 질환을 치료하는 방법.
  25. 대상체에게 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따르는 화합물을 포함하는 조성물을 국소 또는 전신 투여함을 포함하여, 알데히드 독성이 연관되는 질환, 장애, 병태, 또는 미용 증상(cosmetic indication)을 치료하거나, 예방하거나, 이들의 위험을 감소시키는 것을 필요로 하는 대상체에서 알데히드 독성이 연관되는 질환, 장애, 병태, 또는 미용 증상을 치료하거나, 예방하거나, 이들의 위험을 감소시키는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 질환, 장애, 또는 병태가 안과 장애인, 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 질환, 장애, 또는 병태가 황반 변성 또는 스타르가르트 질환으로부터 선택되는, 방법.
  28. 제26항에 있어서, 상기 안과 장애가 안구 건조증, 백내장, 원추각막, 물집 및 기타 각막병증, 푹스 내피세포 이상증(Fuchs' endothelial dystrophy), 알레르기 결막염, 안구 반흔성 유천포창, PRK 치료 및 기타 각막 치료와 관련된 병태, 눈물 지질 분해 또는 누선 기능장애와 관련된 병태, 포도막염, 공막염, 안과 스티븐스 존슨 증후군(ocular Stevens Johnson Syndrome), 및 안구 주사(ocular rosacea)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 안과 장애가 안구 건조증인, 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 안과 장애가 PRK 치료 및 기타 각막 치료와 관련된 병태인, 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 안과 장애가 포도막염, 공막염, 안과 스티븐스 존슨 증후군, 및 안구 주사로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 안과 장애가 안구 주사 또는 포도막염인, 방법.
  33. 제28항에 있어서, 상기 안과 장애가 원추각막, 백내장, 물집 및 기타 각막병증, 푹스 내피세포 이상증, 안구 반흔성 유천포창, 및 알레르기 결막염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  34. 제25항에 있어서, 상기 질환, 장애, 또는 병태가 건선, 국소 (원판상) 루푸스, 접촉 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 방사선 피부염, 여드름, 쇼그렌-라르슨 증후군(Sjogren-Larsson Syndrome) 및 기타 어린선으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 피부 질환, 장애, 또는 병태이고, 상기 미용 증상이 일광 탄력섬유증/주름, 피부 톤 견고성(skin tone firmness), 부기(puffiness), 습진, 흡연 또는 자극물 유도된 피부 변화, 피부 절개, 및 화상 또는 상처와 관련된 피부 병태로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제34항에 있어서, 상기 피부 질환, 장애, 또는 병태가 건선, 피부경화증, 국소 (원판상) 루푸스, 접촉 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 방사선 피부염, 여드름, 및 쇼그렌-라르슨 증후군 및 기타 어린선으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 피부 질환, 장애, 또는 병태가 접촉 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 또는 방사선 피부염인, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 피부 질환, 장애, 또는 병태가 쇼그렌-라르슨 증후군인, 방법.
  38. 제34항에 있어서, 상기 미용 증상이 일광 탄력섬유증/주름, 피부 톤 견고성, 부기, 습진, 흡연 또는 자극물 유도된 피부 변화, 피부 절개, 및 화상 또는 상처와 관련된 피부 병태로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  39. 제25항에 있어서, 상기 질환, 장애, 또는 병태가 수포작용제(blister agent)의 독성 효과 또는 알칼리제로부터의 화상과 관련된 병태인, 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 수포작용제가 황 머스터드, 질소 머스터드, 또는 포스겐 옥심인, 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 알칼리제가 석회, 가성소다, 암모니아, 또는 배수관 청소제(drain cleaner)인, 방법.
  42. 제25항에 있어서, 상기 질환, 장애, 또는 병태가 자가면역, 면역-매개, 염증, 심혈관, 또는 신경 질환, 또는 당뇨병, 대사 증후군, 또는 섬유증 질환인, 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 질환, 장애, 또는 병태가 루푸스, 피부경화증, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 패혈증, 죽상동맥경화증, 허혈성-재관류 손상, 파킨슨 질환, 알츠하이머 질환, 석신산 세미알데히드 데하이드로게나제 결핍증, 다발성 경화증, 및 근위축성 측삭 경화증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 섬유증 질환이 신장, 간, 폐, 또는 심장 섬유증인, 방법.
  45. 제25항에 있어서, 상기 질환, 장애, 또는 병태가 연령-관련 질환, 장애, 또는 병태인, 방법.
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