JP2021167358A - 重水素化化合物およびその使用 - Google Patents

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Abstract

【課題】 アルデヒド毒性が病態形成に関係している疾患、障害、または状態の処置、予防、および／またはそのリスクの低減を提供すること
【解決手段】 本件発明は、毒性アルデヒド、例えば、ＭＤＡ、ならびにＨＮＥをスカベンジする第一級アミンの使用による、眼の障害、皮膚障害、びらん剤からの傷害性作用と関連する状態、ならびに、自己免疫疾患、炎症性疾患、神経系疾患、および心血管疾患を含めた、アルデヒド毒性が病態形成に関係している疾患、障害、または状態の処置、予防、および／またはそのリスクの低減を提供するところのものである。
【選択図】 図１

Description

発明の背景
細胞における代謝過程および炎症過程は、毒性アルデヒド、例えば、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）および４−ヒドロキシル−２−ノネナール（ＨＮＥまたは４ＨＮＥ）を生じさせる。これらのアルデヒドは、タンパク質、炭水化物、脂質およびＤＮＡに対して高度に反応性であり、化学修飾された生物学的分子、炎症メディエーター、例えば、ＮＦ−カッパＢの活性化、および多種多様な器官の損傷をもたらす。例えば、レチンアルデヒドは、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）と反応して、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の発達および進行に関与していると考えられるリポフスチンの構成成分であるＡ２Ｅと呼ばれる高度に毒性の化合物を形成することができる。多くの身体防御機構は、毒性アルデヒドを除去またはそのレベルを低下させるように機能する。新規な小分子治療を使用して、網膜における「逃れた」レチンアルデヒドをスカベンジし、したがってＡ２Ｅの形成を低減させ、ＡＭＤのリスクを低下させることができる（Ｊｏｒｄａｎら（２００６年））。
アルデヒドは、多種多様な病的状態、例えば、ドライアイ、白内障、円錐角膜、角膜におけるフックス内皮ジストロフィー、ブドウ膜炎、アレルギー性結膜炎、眼性瘢痕性類天疱瘡、レーザー屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）の治癒または他の角膜の治癒と関連する状態、涙液脂質の分解または涙腺機能障害と関連する状態、炎症性の眼の状態、例えば、眼性酒さ（マイボーム腺機能障害を伴う、もしくは伴わない）、および眼以外の障害または状態、例えば、皮膚がん、乾癬、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、尋常性座瘡、シェーグレン−ラルソン症候群、虚血再灌流傷害、炎症、糖尿病、神経変性（例えば、パーキンソン病）、強皮症、筋萎縮性側索硬化症、自己免疫障害（例えば、狼瘡）、心血管障害（例えば、アテローム性動脈硬化症）、およびびらん剤の傷害性作用と関連する状態に関係している（Ｎｅｇｒｅ−Ｓａｌｖａｇｒｅら（２００８年）、Ｎａｋａｍｕｒａら（２００７年）、Ｂａｔｉｓｔａら（２０１２年）、Ｋｅｎｎｅｙら（２００３年）、Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、４３巻：４９４頁（２００４年）、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ、４８巻：１５５２頁（２００７年）、Ｇｒａｅｆｅ’ｓ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、２３３巻：６９４頁（１９９４年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ、１８巻：１９４頁（２０１２年））。したがって、アルデヒドを低減または排除することは、症状を軽快させ、これらの病的状態の進行を遅れさせるはずである。
ＭＤＡ、ＨＮＥおよび他の毒性アルデヒドは、脂肪アルコール、スフィンゴ脂質、糖脂質、フィトール、脂肪酸、アラキドン酸（ａｒａｃｈａｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）代謝（Ｒｉｚｚｏ（２００７年））、ポリアミン代謝（Ｗｏｏｄら（２００６年））、脂質過酸化、酸化的代謝（Ｂｕｄｄｉら（２００２年）、Ｚｈｏｕら（２００５年））、およびグルコース代謝（Ｐｏｚｚｉら（２００９年））を含む無数の代謝機序によって生じる。アルデヒドは、タンパク質、リン脂質、炭水化物、およびＤＮＡ上の第一級アミノ基および他の化学部分と架橋することができ、多くの場合、毒性の結果、例えば、変異誘発および発癌をもたらす（Ｍａｒｎｅｔｔ（２００２年））。ＭＤＡは、疾患性の角膜、円錐角膜、水疱性角膜症および他の角膜症、ならびにフックス内皮ジストロフィー角膜と関連する（Ｂｕｄｄｉら（２００２年））。また、皮膚障害、例えば、シェーグレン−ラルソン症候群は、脂肪アルデヒド、例えば、オクタデカナールおよびヘキサデカナールの蓄積と関連する可能性が高い（Ｒｉｚｚｏら（２０１０年））。さらに、脂質過酸化の増加および結果として生じるアルデヒドの生成は、びらん剤の毒性作用と関連する（Ｓｃｉｕｔｏら（２００４年）およびＰａｌら（２００９年））。
Ｉｎｔ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、４３巻：４９４頁（２００４年） Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ、４８巻：１５５２頁（２００７年） Ｇｒａｅｆｅ’ｓ Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、２３３巻：６９４頁（１９９４年） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖｉｓｉｏｎ、１８巻：１９４頁（２０１２年）
アルデヒド、例えば、ＭＤＡおよび／またはＨＮＥに対するスカベンジャーとして作用する小分子治療剤の投与によって、毒性アルデヒドと関連する様々な状態を処置することについては当技術分野で示唆されてこなかった。したがって、アルデヒド毒性が病態形成に関係している疾患または障害を処置し、予防し、かつ／またはそのリスクを低減することが必要とされる。本発明は、このような必要性に対処するものである。
従って、アルデヒド毒性が病態形成に関係している疾患、障害、または状態を処置し、予防し、かつ／またはそのリスクを低減する方法についての必要性が残っている。
発明の概要
本発明の化合物およびその組成物は、アルデヒド毒性が病態形成に関係している疾患、障害、または状態を処置し、予防し、かつ／またはそのリスクを低減するのに有用であることが今や見出された。このような化合物は、一般式Ｉ：
Figure 2021167358
または薬学的に許容されるその塩
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のそれぞれは、本明細書で定義されている通りである）を有する。
本発明の化合物および薬学的に許容されるその組成物は、毒性アルデヒドと関連する種々の疾患、障害または状態を処置するのに有用である。このような疾患、障害または条件には、本明細書に記載のものが含まれる。
本発明によって提供される化合物はまた、生物学および病理学的現象における、ある特定のアルデヒドの研究にも有用である。
図１は、ヒト肝細胞における、参照（ブランク肝細胞）と比較した、０分および１２０分におけるＮＳ２の代謝産物プロファイルのＥＩＣ（抽出イオンクロマトグラム）のオーバーレイを示す。オーバーレイが示す通り、１２０分後、ＮＳ２は、Ｍ１、Ｍ７、Ｍ８、および少量のＭ９に代謝され、一部のＮＳ２が未変化のままである。
図２は、サル肝細胞における、参照（ブランク肝細胞）と比較した、０分および１２０分におけるＮＳ２の代謝産物プロファイルのＥＩＣのオーバーレイを示す。オーバーレイが示す通り、１２０分後、ＮＳ２は、Ｍ１、Ｍ３、Ｍ４、Ｍ７、Ｍ８、および少量のＭ９に代謝され、一部のＮＳ２が未変化のままである。
図３は、イヌ肝細胞における、参照（ブランク肝細胞）と比較した、０分および１２０分におけるＮＳ２の代謝産物プロファイルのＥＩＣのオーバーレイを示す。オーバーレイが示す通り、１２０分後、ＮＳ２は、Ｍ１、Ｍ２、Ｍ５およびＭ６に代謝され、一部のＮＳ２が未変化のままである。
図４は、ラット肝細胞における、参照（ブランク肝細胞）と比較した、０分および１２０分におけるＮＳ２の代謝産物プロファイルのＥＩＣのオーバーレイを示す。オーバーレイが示す通り、１２０分後、ＮＳ２は、Ｍ１、Ｍ７およびＭ８に代謝され、一部のＮＳ２が未変化のままである。
図５は、ヒト肝細胞における、参照（ブランク肝細胞）と比較した、０分および１２０分における重水素化されたＮＳ２（ＮＳ２−Ｄ６；化合物Ｉ−１）の代謝産物プロファイルのＥＩＣのオーバーレイを示す。オーバーレイが示す通り、１２０分後、ＮＳ２−Ｄ６は、少量のＭ１に代謝され、大部分のＮＳ２−Ｄ６が未変化のままである。
図６は、ＮＳ２（ｍ／ｚ＝２３７）の質量スペクトル分析を示す。
図７は、代謝産物Ｍ１（ｍ／ｚ＝２５３、ＲＴ＝２．１分）の質量スペクトル分析を示す。
図８は、代謝産物Ｍ２（ｍ／ｚ＝２５３、ＲＴ＝２．９分）の質量スペクトル分析を示す。
図９は、代謝産物Ｍ３（ｍ／ｚ＝４２９、ＲＴ＝３．０分）の質量スペクトル分析を示す。
図１０は、代謝産物Ｍ４（ｍ／ｚ＝４２９、ＲＴ＝３．２分）の質量スペクトル分析を示す。
図１１は、代謝産物Ｍ５（ｍ／ｚ＝５４２、ＲＴ＝３．５分）の質量スペクトル分析を示す。
図１２は、代謝産物Ｍ６（ｍ／ｚ＝５４２、ＲＴ＝３．７分）の質量スペクトル分析を示す。注意：ｍ／ｚ ４１３は、中性損失（ＮＬ）１２９を表し、ＧＳＨ断片化パターンを示す。
図１３は、代謝産物Ｍ７（ｍ／ｚ＝４２９、ＲＴ＝３．７分）の質量スペクトル分析を示す。
図１４は、代謝産物Ｍ８（ｍ／ｚ＝４１３、ＲＴ＝３．９分）の質量スペクトル分析を示す。
図１５は、代謝産物Ｍ９（ｍ／ｚ＝４２９、ＲＴ＝３．９分）の質量スペクトル分析を示す。
図１６は、ＮＳ２−Ｄ６（化合物Ｉ−１；ｍ／ｚ＝２４３）の質量スペクトル分析を示す。
図１７は、ＮＳ２−Ｄ６（ｍ／ｚ＝２５９）の代謝産物１の質量スペクトル分析を示す。
図１８は、５時間の、１０μＭの過酸化水素による共処理後の、ニューロンの生存率に対するＮＳ２（ＣｏｒｅＲｘ）の効果を示す。
図１９は、様々な濃度のＮＳ２（ＣｏｒｅＲｘ；Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中）におけるＣＦＤＡ（相対蛍光単位）データを、ＥＣ５０値が誘導される曲線に当てはめたグラフを示す。
図２０は、５時間の、１０μＭの過酸化水素による共処理後の、海馬培養物における細胞死に対するＮＳ２（ＣｏｒｅＲｘ）の効果を示す。＊は、ＨＰ処理単独と有意に異なるデータポイントを示す。
図２１は、様々な濃度のＮＳ２（ＣｏｒｅＲｘ；Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中）におけるヨウ化プロピジウムのデータ（相対蛍光単位）を、ＥＣ５０値が誘導される曲線に当てはめたグラフを示す。
図２２は、５時間の、１０ｍＭの過酸化水素による共処理後の、ニューロンの生存率に対するＮＳ２（ＣｏｒｅＲｘ；ＤＭＳＯ中）の効果を示す。＊は、ＨＰ処理単独と有意に異なるデータポイントを示す。
図２３は、様々な濃度のＮＳ２（ＣｏｒｅＲｘ；ＤＭＳＯ中）におけるＣＦＤＡ（相対蛍光単位）データを、ＥＣ５０値が誘導される曲線に当てはめたグラフを示す。
図２４は、１０μＭの過酸化水素による共処理後の、海馬培養物における細胞死に対するＮＳ２（ＣｏｒｅＲｘ；ＤＭＳＯ中）の効果を示す。＊は、ＨＰ処理単独と有意に異なるデータポイントを示す。
図２５は、様々な濃度のＮＳ２（ＣｏｒｅＲｘ；ＤＭＳＯ中）におけるヨウ化プロピジウムのデータ（相対蛍光単位）を、ＥＣ５０値が誘導される曲線に当てはめたグラフを示す。
図２６は、１０μＭの過酸化水素による共処理後の、ニューロンの生存率に対する効果を実証している、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中のミル粉砕されていないＮＳ２（Ｊ−Ｓｔａｒ）に関する用量応答データを示す。＊は、ＨＰ処理単独と有意に異なるデータポイントを示す。
図２７は、様々な濃度のＮＳ２（Ｊ−Ｓｔａｒ；ＤＭＳＯ中）におけるＣＦＤＡ（相対蛍光単位）データを、ＥＣ５０値が誘導される曲線に当てはめたグラフを示す。
図２８は、１０μＭの過酸化水素による共処理後の、海馬培養物における細胞死に対する効果を実証している、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中のミル粉砕されていないＮＳ２（Ｊ−Ｓｔａｒ）に関する用量応答データを示す。＊は、ＨＰ処理単独と有意に異なるデータポイントを示す。
図２９は、様々な濃度のＮＳ２（Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中、ミル粉砕されていない（Ｊ−Ｓｔａｒ））におけるヨウ化プロピジウムのデータ（相対蛍光単位）を、ＥＣ５０値が誘導される曲線に当てはめたグラフを示す。
図３０は、１０μＭの過酸化水素による共処理後の、海馬培養物におけるニューロンの生存率に対する効果を実証している、ＤＭＳＯ中のミル粉砕されていないＮＳ２（Ｊ−Ｓｔａｒ）に関する用量応答データを示す。＊は、ＨＰ処理単独と有意に異なるデータポイントを示す。
図３１は、様々な濃度のミル粉砕されていないＮＳ２（（Ｊ−Ｓｔａｒ）ＤＭＳＯ中）におけるＣＦＤＡ（相対蛍光単位）データを、ＥＣ５０値が誘導される曲線に当てはめたグラフを示す。
図３２は、１０μＭの過酸化水素による共処理後の、海馬細胞における細胞死に対する効果を示す、ＤＭＳＯ中のミル粉砕されていないＮＳ２（Ｊ−Ｓｔａｒ）に関する用量応答データを示す。＊は、ＨＰ処理単独と有意に異なるデータポイントを示す。
図３３は、様々な濃度のミル粉砕されていないＮＳ２（（Ｊ−Ｓｔａｒ）ＤＭＳＯ中）におけるヨウ化プロピジウムのデータ（相対蛍光単位）を、ＥＣ５０値が誘導される曲線に当てはめたグラフを示す。
図３４は、１０μＭの過酸化水素による共処理後のニューロンの細胞生存率に対する製剤ビヒクルに関する用量応答データを示す。
図３５は、１０μＭの過酸化水素による共処理後の細胞死に対する製剤ビヒクルに関する用量応答データを示す。
図３６は、１０μＭの過酸化水素により処理した海馬培養物における、ニューロンの生存率に対するＡＬＤ−６（化合物Ｉ−１）の効果を示す。＊は、ＨＰ処理単独と有意に異なるデータポイントを示す。
図３７は、ＡＬＤ−６により処理された海馬培養物を使用する、ニューロンの生存率アッセイに関して算出されたロジスティック曲線およびＥＣ５０値を示す。
図３８は、１０μＭの過酸化水素による共処理後の、細胞死に対するＡＬＤ−６の用量応答の効果を示す。＊は、ＨＰ処理単独と有意に異なるデータポイントを示す。
図３９は、ＡＬＤ−６により処理された海馬培養物を使用する、細胞死アッセイに関して算出されたロジスティック曲線およびＥＣ５０値を示す。
図４０は、１０μＭの過酸化水素による共処理後の、ニューロンの生存率に対するＡＬＤ−５の用量応答の効果を示す。
図４１は、１０μＭの過酸化水素による共処理後の、細胞死に対するＡＬＤ−５の用量応答の効果を示す。
図４２は、１０μＭの過酸化水素による共処理後の、ニューロンの生存率に対するＡＬＤ−２の用量応答の効果を示す。
図４３は、１０μＭの過酸化水素による共処理後の、細胞死に対するＡＬＤ−２の用量応答の効果を示す。
図４４から図４６は、各対照化合物の特異的結合の百分率として表した、ＮＳ２−Ｄ６の特異的結合の結果のヒストグラムを示す。 図４４から図４６は、各対照化合物の特異的結合の百分率として表した、ＮＳ２−Ｄ６の特異的結合の結果のヒストグラムを示す。 図４４から図４６は、各対照化合物の特異的結合の百分率として表した、ＮＳ２−Ｄ６の特異的結合の結果のヒストグラムを示す。
図４７は、ＮＳ２−Ｄ６に関する酵素および取り込みアッセイにおける、ｉｎ ｖｉｔｒｏ薬理結果のヒストグラムを示す。
発明の詳細な説明
１．本発明のある特定の態様の一般説明
ある特定の実施形態では、本発明は、アルデヒド毒性が病態形成に関係している疾患、障害、または状態を処置する、予防する、かつ／またはそのリスクを低減するための化合物、組成物および方法を提供する。一部の実施形態では、このような化合物には、本明細書に記載の式の化合物または薬学的に許容されるその塩が含まれ、ここで、各可変部分は、本明細書で定義されており、実施形態に記載されている通りである。一態様では、本発明は、式Ｉの化合物：
Figure 2021167358
または薬学的に許容されるその塩
（式中、
Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＤまたは−ＮＤ２から選択され、
Ｒ２は、水素または重水素から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｄ、−ＣＨＤ２または−ＣＤ３から独立して選択され、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、水素または重水素からそれぞれ独立して選択され、
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する）を提供する。
２．定義
本発明の化合物には、上で一般に記載されている化合物が含まれ、本明細書において開示されているクラス、サブクラスおよび種によりさらに例示される。本明細書において使用する場合、特に示さない限り、以下の定義が適用されるものとする。本発明の目的のた
め、化学元素は、Handbook of Chemistry and Physics、第７５版、ＣＡＳ版の元素
周期表に従って特定する。さらに、有機化学の一般原理は、それらの全内容が、参照により本明細書に組み込まれている、「Organic Chemistry」、Thomas Sorrell、University Science Books、Sausalito：１９９９年、ならびに「March's Advanced Organic Chemistry」、第５版、（編）：Smith, M.B.およびMarch, J.、John Wiley & Sons
、New York：２００１年に記載されている。
本明細書において使用する場合、用語「薬学的に許容される塩」は、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応などを伴わず、ヒトおよび下等動物の組織と接触させて使用するのに適した、妥当な医学的判断の範囲内にある塩であって、合理的な利益／リスク比に見合う塩を指す。薬学的に許容される塩は、当技術分野において周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、参照により本明細書に組み込まれている、J. Pharmaceutical Sciences、１９７７年、６６巻、１〜１９頁に、薬学的に許容される塩を詳細に記載している。本発明の化合物の薬学的に許容される塩には、適当な無機および有機の酸ならびに塩基から誘導される塩が含まれる。薬学的に許容される非毒性酸付加塩の例は、無機酸、例えば塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸と、または有機酸、例えば、酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸と、あるいは、当技術分野において使用されている他の方法、例えばイオン交換を使用することによって形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩には、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、二グルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２-ヒドロキシ−エタンスルホン酸塩、ラクトビオ
ン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２-ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイ
ン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる。
好適な塩基から誘導される塩には、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩およびＮ＋（Ｃ１〜４アルキル）４塩が含まれる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが含まれる。さらに、薬学的に許容される塩には、適切な場合、対イオン、例えばハロゲン化物イオン、水酸化物イオン、カルボン酸イオン、硫酸イオン、リン酸イオン、硝酸イオン、低級アルキルスルホン酸イオンおよびアリールスルホン酸イオンを使用して形成される、非毒性アンモニウム陽イオン、第四級アンモニウム陽イオンおよびアミン陽イオンが含まれる。
特に明記しない限り、本明細書において図示されている構造は、構造のすべての異性（例えば、鏡像異性、ジアステレオ異性および幾何異性（または立体配座異性））型；例えば、各不斉中心に関してＲおよびＳ立体配置、ＺおよびＥ二重結合異性体、ならびにＺおよびＥ立体配座異性体を含むことも意味する。したがって、単一立体化学異性体、ならびに親化合物の鏡像異性体、ジアステレオ異性体および幾何異性体（または立体配座異性体）の混合物が、本発明の範囲内にある。特に明記しない限り、本発明の化合物のすべての互変異性型が、本発明の範囲内にある。
「網膜」は、約１億５０００万個のニューロンを有する中枢神経系の領域である。網膜は目の裏側に位置しており、網膜色素上皮（ＲＰＥ）と呼ばれる特化した上皮組織に存在
する。網膜は、「光受容体」と呼ばれる特化したニューロンにおいて、視覚的な刺激を変換することにより、視覚的処理の第１の段階を開始する。光受容体のシナプス出力は、網膜における精巧な神経ネットワークによって処理され、次いで脳へと伝達される。網膜は、２つの特化された光受容体のクラスを進化させて、幅広い範囲の光条件下で働く。「桿体」光受容体は、低い光条件下で視覚像を伝達し、無色視覚を媒介する。「錐体」光受容体は、薄暗から明光条件において視覚像を伝達し、色覚と高性能の視力（high acuity vision）の両方を媒介する。
すべての光受容体は、「外」節および「内」節と呼ばれる、２つの領域に区画分けされている。内節は、細胞核を含有するニューロンの細胞体である。内節は、網膜疾患の非存在下では、生涯、生存する。外節は、光感受性視覚色素分子が集密配列した積層膜構造に集中している領域である。外節の部分は、定期的に剥がれ落ち、外節の更新と呼ばれる、日周過程において再成長する。剥がれ落ちた外節はＲＰＥ細胞により取り込まれて代謝される。
「黄斑」は、高い空間的詳細（「視力」）において、視覚像が細長い錐体によって処理される、中心窩を含有する網膜の中央領域である。「黄斑変性」は、黄斑を攻撃し、視野の中心部における高性能の視力を破壊する網膜神経変性の形態である。加齢黄斑変性（ＡＭＤ）は、ＲＰＥ細胞におけるリポフスチンと呼ばれる、残留リソソーム顆粒によって、および「ドルーゼン」と呼ばれる細胞外沈着物によって特徴付けられる「萎縮型」で始まる。ドルーゼンは、ＲＰＥ細胞によって排出される細胞の廃棄生成物を含有する。「リポフスチン」およびドルーゼンは、眼科医によって臨床的に検出し、蛍光技術を使用して定量することができる。それらは、黄斑変性の最初の臨床的兆候でありうる。
リポフスチン（Lipfuscin）は、Ａ２Ｅの凝集を含有する。リポフスチンは、ＲＰＥ細
胞に蓄積し、複数の公知の機構によって、ＲＰＥ細胞を害する。ＲＰＥ細胞が害されるので、その生化学的活性が低下し、光受容体は変性し始める。細胞外ドルーゼンは、ＲＰＥ細胞への血管栄養素の供給を妨げることによって、ＲＰＥ細胞をさらに損ないうる。ドルーゼンはまた、炎症過程の引き金となり、この過程により、滲出型のＡＭＤに進行する患者１０名のうち１名において、黄斑の脈絡膜血管新生浸潤がもたらされる。萎縮型および滲出型のどちらも、失明へと進行する。
「ＥＲＧ」は、網膜電図の頭字語であり、網膜電図は、実験的に定義された光刺激に対して応答している間に、網膜ニューロンによって発生される電場電位の測定である。ＥＲＧは、生きている被験体（ヒトまたは動物）、または生きている動物から外科的に取り出された、溶液中の半切除した目のどちらかに行うことができる、非侵襲的測定である。
本明細書において使用する場合、用語「ＲＡＬ」は、レチンアルデヒドを意味する。用語「ＲＡＬ−トラップ」は、遊離ＲＡＬに結合する治療用化合物を意味し、これにより、ＲＡＬが、膜ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）とシッフ塩基縮合するのを阻止する。「遊離ＲＡＬ」は、視覚サイクルタンパク質に結合していない、ＲＡＬとして定義される。用語「ｔｒａｎｓ−ＲＡＬ」および「オール−ｔｒａｎｓ−ＲＡＬ」は、互換的に使用され、すべてのｔｒａｎｓ−レチンアルデヒドを意味する。
Ａ２Ｅは、「視覚サイクル」と呼ばれる複雑な生化学経路の反応副生成物であり、ＲＰＥ細胞と光受容体の外節の両方において、協調して働く。視覚サイクルは、ビタミンＡから誘導される「レチンアルデヒド」と呼ばれる光反応性のアルデヒドクロモフォアを再利用し、視覚に必須である。単純化した用語では、視覚サイクルは、４つの主要ステップを有する：１）ＲＰＥ中のビタミンＡを光反応性の歪み二重結合（１１−ｃｉｓ−ＲＡＬ）を１つ有するアルデヒドクロモフォアに変換する、２）１１−ｃｉｓ−ＲＡＬを網膜に輸
送し、ここで、１１−ｃｉｓ−ＲＡＬはオプシンと呼ばれる特化した光受容体タンパク質に結合する、３）結合した１１−ｃｉｓ−ＲＡＬは、光によって、ｔｒａｎｓ−ＲＡＬへと光異性化し、これにより、オプシン結合部位から結合したＲＡＬの放出が開始される、および４）ｔｒａｎｓ−ＲＡＬ（アルデヒド）をビタミンＡ（アルコール）に変換してビタミンＡをＲＰＥに輸送して戻し、ＲＰＥにおいてサイクルが再度始まる。
ＲＡＬのアルデヒド基は、オプシン結合部位において、アミノ酸側鎖に可逆的な化学結合を形成することによって、分子をオプシンに結合させる一助となる。ＲＡＬ上のアルデヒド基は、分子をオプシン結合部位につなぎ止めるために必須である一方、他の生物学的アミンとシッフ塩基を形成する傾向があるために、その他の点で有害である。最初の３つの反応は、光受容体の外節で起こり、Ａ２ＰＥと呼ばれる中間生成物を生成する。Ａ２ＰＥは一旦形成されると、脂質相に分配され、光受容体の外節膜に蓄積する。ＲＰＥ細胞が廃棄された外節を摂取すると、その蓄積されたＡ２ＰＥは、そのリソソームに送り込まれる。
上記の通り、黄斑変性、ならびにその病因にＡ２Ｅおよび／またはリポフスチンの蓄積が関与する網膜疾患の他の形態は、形成されるＡ２Ｅの量を低下させることにより処置または予防することができる。そうするのに有用な化合物としては、ＲＡＬ−トラップが挙げられる。ＲＡＬ−トラップは、例えば、隔離から逃れたＲＡＬと共有結合を形成することにより、形成されるＡ２Ｅの量を低下させる。それにより、ＲＡＬ−トラップ化合物と反応したＲＡＬは、ホスファチジルエタノールアミンと反応するのに利用できない。
本発明はまた、アルデヒド毒性が病態形成に関係している疾患、障害、または状態の処置、予防、および／またはそのリスクの低減のための医薬の製造における、本明細書に記載の化合物の使用を対象とする。さらに具体的には、本発明のこの態様は、（１）これらに限定されないが、角膜疾患（例えば、ドライアイ症候群、白内障、円錐角膜、水疱性角膜症および他の角膜症、ならびにフックス内皮ジストロフィー）、他の眼の障害または状態（例えば、アレルギー性結膜炎、眼性瘢痕性類天疱瘡、ＰＲＫの治癒および他の角膜の治癒と関連する状態、ならびに涙液脂質の分解または涙腺機能障害と関連する状態）、ならびに炎症の結果としての高いアルデヒドレベルと関連する他の眼の状態（例えば、ブドウ膜炎、強膜炎、眼のスティーブンスジョンソン症候群、および眼性酒さ（マイボーム腺機能障害を伴う、もしくは伴わない））を含めた眼の疾患、障害、または状態、（２）皮膚の障害もしくは状態、または美容上の徴候の処置、予防、および／またはそのリスクの低減のための医薬の製造における、本明細書に記載の化合物の使用を対象とする。例えば、疾患、障害、または状態には、これらに限定されないが、乾癬、局部（円板状）狼瘡、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、放射線皮膚炎、尋常性座瘡、シェーグレン−ラルソン症候群および他の魚鱗癬、日光弾力線維症／しわ、肌の張りと弾力、腫脹、湿疹、喫煙または刺激物質誘発性皮膚変化、皮膚切開、ならびに皮膚状態に関連する火傷および創傷、（３）びらん剤の毒性作用またはアルカリ剤からの火傷と関連する状態、あるいは（４）自己免疫性、免疫媒介性、炎症性、心血管性、もしくは神経系の疾患（例えば、狼瘡、強皮症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血症、アテローム性動脈硬化症、虚血再灌流傷害、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病、メタボリックシンドローム、ならびに線維性疾患）が含まれる。
本発明はまた、アルデヒド毒性が病態形成に関係している疾患、障害、または状態を処置し、予防し、かつ／またはそのリスクを低減することおける、本明細書に記載の化合物の使用を対象とする。さらに具体的には、本発明のこの態様は、（１）これらに限定されないが、角膜疾患（例えば、ドライアイ症候群、白内障、円錐角膜、水疱性角膜症および他の角膜症、ならびにフックス内皮ジストロフィー）、他の眼の障害または状態（例えば
、アレルギー性結膜炎、眼性瘢痕性類天疱瘡、ＰＲＫの治癒および他の角膜の治癒と関連する状態、ならびに涙液脂質の分解または涙腺機能障害と関連する状態）、ならびに炎症の結果としての高いアルデヒドレベルと関連する他の眼の状態（例えば、ブドウ膜炎、強膜炎、眼のスティーブンスジョンソン症候群、および眼性酒さ（マイボーム腺機能障害を伴う、もしくは伴わない））を含めた眼の疾患、障害、もしくは状態、（２）皮膚の障害もしくは状態、または美容上の徴候を処置し、予防し、かつ／またはそのリスクを低減することにおける、本明細書に記載の化合物の使用を対象とする。例えば、疾患、障害、または状態には、これらに限定されないが、乾癬、局部（円板状）狼瘡、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、放射線皮膚炎、尋常性座瘡、シェーグレン−ラルソン症候群および他の魚鱗癬、日光弾力線維症／しわ、肌の張りと弾力、腫脹、湿疹、喫煙または刺激物質誘発性皮膚変化、皮膚切開、ならびに皮膚状態に関連する火傷および創傷、（３）びらん剤の毒性作用またはアルカリ剤からの火傷と関連する状態、あるいは（４）自己免疫性、免疫媒介性、炎症性、心血管性、もしくは神経系の疾患（例えば、狼瘡、強皮症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血症、アテローム性動脈硬化症、虚血再灌流傷害、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病、メタボリックシンドローム、ならびに線維性疾患）が含まれる。
本明細書に記載の化合物はまた、局所に、例えば、目に直接的に、例えば、点眼剤または眼科的軟膏剤として投与することができる。点眼薬は典型的には、有効量の少なくとも１種の本明細書に記載の化合物、および目に安全に適用することができるキャリアを含む。例えば、点眼薬は等張液の形態であり、溶液のｐＨは、目の刺激がないように調整される。多くの場合、上皮バリアは、目への分子の浸透を妨げる。したがって、大部分の現在使用される眼科的薬物は、なんらかの形態の浸透増強剤が補充されている。これらの浸透増強剤は、最も上方の上皮細胞のタイトジャンクションを緩めることによって働く（Ｂｕｒｓｔｅｉｎ、Ｔｒａｎｓ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｓｏｃ ＵＫ、１０４巻：４０２頁（１９８５年）；Ａｓｈｔｏｎら、Ｊ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｅｘｐ Ｔｈｅｒ、２５９巻：７１９頁（１９９１年）；Ｇｒｅｅｎら、Ａｍ Ｊ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ、７２巻：８９７頁（１９７１年））。最も一般に使用される浸透増強剤は、微生物汚染に対する保存剤としても働く塩化ベンザルコニウムである（Ｔａｎｇら、Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ、８３巻：８５頁（１９９４年）；Ｂｕｒｓｔｅｉｎら、Ｉｎｖｅｓｔ Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ Ｖｉｓ Ｓｃｉ、１９巻：３０８頁（１９８０年））。
局所投与は、クリーム、懸濁液、エマルジョン、軟膏、ドロップ剤、油、ローション剤、パッチ、テープ、吸入剤、スプレー、またはゲル、フィルム、パッチ、および粘着剤を含めた制御放出局所製剤の形態でありうる。眼内投与は、結膜下、テノン嚢下、眼球後もしくは硝子体内の注射、デポーまたはインプラントの形態をとりうる。これらのルートによって投与される化合物は、溶液または懸濁液形態でありうる。デポー注射による化合物の投与は、薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤を含有する場合があり、これらは、天然または合成の、生分解性または非生分解性であり得、制御された様式での薬物放出を促進しうる。化合物の制御放出に使用されるインプラントは、天然または合成の、生分解性または非生分解性材料から構成されてもよい。キャリアが組成物の他の構成成分と適合性であって、患者に対して傷害性でない点でキャリアは許容される。キャリアのいくつかの例としては、（１）糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロースなど、（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど、（３）セルロース、および（４）シクロデキストリンが挙げられる。有用な局所製剤は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１１／０７２１４１号に記載されており、その内容は、参考として本明細書に援用される。
皮膚への局所投与のための製剤として、例えば、医薬の許容されるキャリア中に第一級
アミン化合物を含む、軟膏、クリーム、ゲルおよびペーストを挙げることができる。局所使用のための第一級アミン化合物の製剤として、当業者に周知であるような油性または水溶性の軟膏基剤の調製物が挙げられる。例えば、これらの製剤は、植物性油、動物性脂肪、および例えば、石油から得られる半固体炭化水素を含みうる。使用される特定の構成成分は、白色軟膏、黄色軟膏、セチルエステルワックス、オレイン酸、オリーブ油、パラフィン、ワセリン、白色ワセリン、鯨蝋、グリセリンデンプン、白蝋、黄蝋、ラノリン、無水ラノリンおよびモノステアリン酸グリセリルを含みうる。グリコールエーテルおよび誘導体、ポリエチレングリコール、ステアリン酸ポリオキシル４０およびポリソルベートを含めた様々な水溶性軟膏基剤もまた使用しうる。
局所投与のための製剤は、０．００１〜１０％、０．０５〜１０％、０．１〜１０％、０．２〜１０％、０．５〜１０％、１〜１０％、２〜１０％、３〜１０％、４〜１０％、５〜１０％、もしくは７〜１０％（重量／容量）の範囲の、または０．００１〜２．０％、０．００１〜１．５％、もしくは０．００１〜１．０％（重量／容量）の範囲の、または０．０５〜２．０％、０．０５〜１．５％、もしくは０．０５〜１．０％（重量／容量）の範囲の、または０．１〜５．０％、０．１〜２．０％、０．１〜１．５％、もしくは０．１〜１．０％（重量／容量）の範囲の、または０．５〜５．０％、０．５〜２．０％、０．５〜１．５％、もしくは０．５〜１．０％（重量／容量）の範囲の、または１〜５．０％、１〜２．０％、もしくは１〜１．５％（重量／容量）の範囲の濃度で、本出願において使用される化合物を含有しうる。局所投与のための製剤はまた、０．００１〜２．５％、０．０１〜２．５％、０．０５〜２．０％、０．１〜２．０％、０．２〜２．０％、０．５〜２．０％、もしくは１〜２．０％（重量／重量）の範囲の、または０．００１〜２．０％、０．００１〜１．５％、０．００１〜１．０％、もしくは０．００１〜５％（重量／重量）の範囲の濃度で、本出願において使用される化合物を含有しうる。
点眼製剤では、組成物は、０．０１〜２０％、０．０２〜１５％、０．０４〜１０％、０．０６〜５％、０．０８〜１％、または０．０９〜０．５％（重量／容量）の濃度で活性化合物を含有し得、溶液に対するｐＨおよび／または浸透圧の調整を伴うか、または伴わない。より具体的には、点眼製剤は、０．０９〜０．５％（重量／容量）、例えば、０．１％の濃度で本明細書に記載の化合物を含有しうる。
一事例では、医薬組成物は、治療有効量の本発明の化合物を、オリゴマーまたはポリマーキャリア、例えば、シクロデキストリン、またはトリメチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリン、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、３−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、およびβ−シクロデキストリンスルホブチルエーテルナトリウム塩（もしくはカリウム塩）を含めた化学修飾されたシクロデキストリンなどと混和することによって作製される組成物を包含する。オリゴマーまたはポリマーキャリアを例示するものは、β−シクロデキストリンスルホブチルエーテルナトリウム塩である。組成物中のβ−シクロデキストリンスルホブチルエーテルナトリウム塩の量は、約０．０１重量／体積％〜３０重量／体積％の範囲でありうる。一例示では、β−シクロデキストリンスルホブチルエーテルナトリウム塩の濃度は、５〜２５重量／体積％である。β−シクロデキストリンスルホブチルエーテルナトリウム塩の濃度をさらに例示するものは、６〜２０重量／体積％である。一事例では、β−シクロデキストリンスルホブチルエーテルの濃度は、６〜１２重量／体積％である。β−シクロデキストリンスルホブチルエーテルの濃度をさらに例示するものは、９．５重量／体積％を含めた９〜１０重量／体積％である。組成物中の本明細書中に記載の化合物の量は、０．０１〜２０％、０．０２〜１５％、０．０４〜１０％、０．０６〜５％、０．０８〜１％、または０．０９〜０．５％（重量／体積）の範囲でありうる。より具体的には、組成物は、０．１％などの０．０９〜０．５％（重量／体積）の濃度で本明細書に記載の化合物を含有しうる。
本明細書に記載の化合物は、経口的に投与してもよく、そのようにして、有効成分を含有する医薬組成物は、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末、または顆粒剤、エマルジョン、硬もしくは軟カプセル剤、またはシロップ、またはエリキシル剤のような経口使用に適した形態でありうる。経口使用を意図した組成物は、医薬組成物の製造のための技術分野で公知の任意の方法によって調製することができ、このような組成物は、薬学的に洗練された口当たりのいい調製物を提供するために、甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤からなる群から選択される１種または複数種の薬剤を含有しうる。
錠剤またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態での経口投与については、活性薬物構成成分を、経口的な無毒性の薬学的に許容される不活性なキャリア、例えば、エタノール、グリセロール、水などと組み合わせることができる。さらに、所望される、または必要な場合、適当な結合剤、潤滑剤、崩壊剤、および着色剤も、混合物中に組み込むことができる。適当な結合剤としては、デンプン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリドン、天然糖、例えば、グルコースもしくはベータ−ラクトース、トウモロコシ甘味料、天然および合成ゴム、例えば、アカシア、トラガカントもしくはアルギン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ワックスなどが挙げられる。これらの剤形で使用される滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、シリカ、タルカム、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩、および／またはポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊薬としては、これらに限定されないが、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムデンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または発泡性混合物、クロスカルメロースもしくはそのナトリウム塩などがある。希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロース、および／またはグリシンが挙げられる。
錠剤は、錠剤の製造に適している無毒性の薬学的に許容される賦形剤と混和した活性成分を含有する。これらの賦形剤は、例えば、不活性な希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなど、顆粒化剤および崩壊剤、例えば、トウモロコシデンプンまたはアルギン酸、結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、またはアカシア、ならびに潤滑剤（ｌｕｂｒｉｃａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクでありうる。錠剤は、コーティングされていなくてもよく、またはこれらは、胃腸管内での崩壊および吸収を遅延させ、それによってより長い期間にわたる持続的作用をもたらすように、公知の技法によってコーティングされていてもよい。
経口製剤中の本明細書中に記載の化合物の治療有効用量は、１日当たり、０．０１ｍｇ／ｋｇ患者体重から５０ｍｇ／ｋｇ患者体重まで、より具体的には、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇで変動してもよく、これは、１日に単回または複数回用量で投与されうる。経口投与について、薬物は、１ｍｇ〜５００ｍｇの活性成分、具体的には、１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２５０ｍｇ、および５００ｍｇを含有する錠剤もしくはカプセル剤の形態で、または少なくとも１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含有する錠剤（ｔａｂｌｅ）もしくはカプセル剤の形態で送達されうる。例えば、カプセル剤は、５０ｍｇの活性成分、または５〜１０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含有しうる。例えば、錠剤は、１００ｍｇの活性成分、または２０〜５０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含有しうる。例えば、錠剤は、活性成分に加えて、崩壊剤（例えば、クロスカルメロースまたはそのナト
リウム塩、およびメチルセルロース）、希釈剤（例えば、微結晶性セルロース）、ならびに滑沢剤（例えば、ステアリン酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム）を含有しうる。薬物は、１日ベースで、１日当たり１回、２回、またはそれより多い回数で投与されうる。
吸入による投与のために、化合物は、適当な噴霧剤、例えば、ガス、例えば、二酸化炭素、を含有するディスペンサーもしくは加圧式容器、またはネブライザーからのエアロゾルスプレーの形態で送達される。
経粘膜的または経皮的投与のために、透過されるバリアに適した浸透剤を、製剤中で使用する。このような浸透剤は一般に当技術分野において公知であり、例えば、経粘膜投与のためには、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体が含まれる。経粘膜投与は、鼻用スプレーまたは坐剤の使用によって達成することができる。経皮的投与のために、活性化合物を、当技術分野において一般に公知のように、軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームに製剤化する。
本明細書中に記載の化合物を含む非経口製剤は、水性の等張液または懸濁液中で調製することができ、坐剤は、脂肪エマルジョンまたは懸濁液から有利に調製される。製剤は、滅菌することができ、かつ／またはアジュバント、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩、および／もしくは緩衝剤を含有することができる。さらに、これらは、他の治療的に価値のある物質も含有しうる。組成物は、従来法によって調製され、約０．１〜７５％、好ましくは約１〜５０％の本明細書に記載の化合物を含有しうる。
語句「非経口投与」および「非経口的に投与される」は、当技術分野で認識されている用語であり、注射などの、経腸および局所投与以外の投与の方式を含み、、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、胸膜内、血管内、心膜内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、および胸骨内の注射および注入が含まれる。
３． 例示的な化合物の説明
重水素（Ｄまたは２Ｈ）は、水素の安定な非放射活性同位体であり、２．０１４４の原子量を有する。水素は、天然には、同位体１Ｈ（水素またはプロチウム）、Ｄ（２Ｈまたは重水素）およびＴ（３Ｈまたはトリチウム）の混合物として存在している。当業者は、水素含有化学化合物中の「水素」表示は、実際には、水素と約０．０１５％の重水素との混合物を表すことを認識している。
いずれか１つの部位における、完全な重水素化、または１００％の重水素化を実験室で達成するのは困難でありうる。重水素原子が、本明細書に記載の任意の化合物の所与の部位で示されている場合、水素が低い割合で依然として存在しうることが理解される。このような化合物は、重水素で富化されていると言われる。重水素を富化した化合物は、適切に富化された出発原料を利用する合成によって調製される。本明細書において使用する場合、用語「重水素を富化した」または「重水素富化」とは、その天然の同位体存在度（０．０１５％）より多い量で重水素を含む化合物、または前記化合物の特定の部位を指す。したがって、一部の実施形態では、本発明は、所与の部位に重水素を含む化合物であって、重水素取込みの割合またはレベルが、その天然の同位体存在度より大きな、化合物を提供する。
一態様によれば、本発明は、式Ｉの化合物：
Figure 2021167358
または薬学的に許容されるその塩
（式中、
Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＤまたは−ＮＤ２から選択され、
Ｒ２は、水素または重水素から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｄ、−ＣＨＤ２または−ＣＤ３から独立して選択され、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、水素または重水素からそれぞれ独立して選択され、
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する）を提供する。
別の態様によれば、本発明は、式Ｉ−Ａの化合物：
Figure 2021167358
または薬学的に許容されるその塩
（式中、
Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＤまたは−ＮＤ２から選択され、
Ｒ２は、水素または重水素から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｄ、−ＣＨＤ２または−ＣＤ３から独立して選択され、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、水素または重水素からそれぞれ独立して選択され、
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する）を提供する。
別の態様によれば、本発明は、式ＩＩ−ＡもしくはＩＩ−Ｂの化合物：
Figure 2021167358
 または薬学的に許容されるその塩
（式中、
Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＤまたは−ＮＤ２から選択され、
Ｒ２は、水素または重水素から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｄ、−ＣＨＤ２または−ＣＤ３から独立して選択され、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、水素または重水素からそれぞれ独立して選択され、
ただし、式ＩＩ−Ａ中のＲ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する）を提供する。
別の態様によれば、本発明は、式ＩＩＩ−Ａ、ＩＩＩ−ＢもしくはＩＩＩ−Ｃの化合物：
Figure 2021167358
または薬学的に許容されるその塩
（式中、
Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＤまたは−ＮＤ２から選択され、
Ｒ２は、水素または重水素から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｄ、−ＣＨＤ２または−ＣＤ３から独立して選択され、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、水素または重水素からそれぞれ独立して選択され、
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する）を提供する。
別の態様によれば、本発明は、式ＩＶの化合物：
Figure 2021167358
または薬学的に許容されるその塩
（式中、
Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＤまたは−ＮＤ２から選択され、
Ｒ２は、水素または重水素から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｄ、−ＣＨＤ２または−ＣＤ３から独立して選択され、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、水素または重水素からそれぞれ独立して選択され、
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つ
は、重水素であるか、または重水素を含有する）を提供する。
別の態様によれば、本発明は、式Ｖの化合物：
Figure 2021167358
または薬学的に許容されるその塩
（式中、
Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＤまたは−ＮＤ２から選択され、
Ｒ２は、水素または重水素から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｄ、−ＣＨＤ２または−ＣＤ３から独立して選択され、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、水素または重水素からそれぞれ独立して選択され、
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する）を提供する。
別の態様によれば、本発明は、式ＶＩ−ＡもしくはＶＩ−Ｂの化合物：
Figure 2021167358
または薬学的に許容されるその塩
（式中、
各Ａは独立して、水素または重水素であり、
Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＤまたは−ＮＤ２から選択され、
Ｒ２は、水素または重水素から選択され、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、水素または重水素からそれぞれ独立して選択され、
ただし、Ａ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する）を提供する。
別の態様によれば、本発明は、式ＶＩＩ−ＡもしくはＶＩＩ−Ｂの化合物：
Figure 2021167358
または薬学的に許容されるその塩
（式中、
各Ａは独立して、水素または重水素であり、
Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＤまたは−ＮＤ２から選択され、
Ｒ２は、水素または重水素から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｄ、−ＣＨＤ２または−ＣＤ３から独立して選択され、
Ｒ８は、水素または重水素から選択され、
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、ＡまたはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する）を提供する。
別の態様によれば、本発明は、式ＶＩＩＩ−ＡもしくはＶＩＩＩ−Ｂの化合物：
Figure 2021167358
または薬学的に許容されるその塩
（式中、
各Ａは独立して、水素または重水素であり、
Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＤまたは−ＮＤ２から選択され、
Ｒ２は、水素または重水素から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｄ、−ＣＨＤ２または−ＣＤ３から独立して選択され、
Ｒ５およびＲ８は、水素または重水素からそれぞれ独立して選択され、
ただし、Ａ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する）を提供する。
別の態様によれば、本発明は、式ＩＸ−ＡもしくはＩＸ−Ｂの化合物：
Figure 2021167358
または薬学的に許容されるその塩
（式中、
Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＤまたは−ＮＤ２から選択され、
Ｒ２は、水素または重水素から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｄ、−ＣＨＤ２または−ＣＤ３から独立して選択され、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、水素または重水素からそれぞれ独立して選択され、
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する）を提供する。
別の態様によれば、本発明は、式Ｘの化合物：
Figure 2021167358
または薬学的に許容されるその塩
（式中、
Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＤまたは−ＮＤ２から選択され、
Ｒ２は、水素または重水素から選択され、
Ｒ３およびＲ４は、−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｄ、−ＣＨＤ２または−ＣＤ３から独立して選択され、
Ｒ５およびＲ６は、水素または重水素からそれぞれ独立して選択され、
ただし、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５またはＲ６のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する）を提供する。
以下の実施形態が、上述の式のそれぞれに適用可能である。
上で定義され、本明細書に記載されている通り、Ｒ１は、−ＮＨ２、−ＮＨＤまたは−ＮＤ２から選択される。
一部の実施形態では、Ｒ１は−ＮＨ２である。一部の実施形態では、Ｒ１は−ＮＨ２であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水
素であるか、または重水素を含有する。
一部の実施形態では、Ｒ１は−ＮＨＤである。一部の実施形態では、Ｒ１は−ＮＨＤであり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
一部の実施形態では、Ｒ１は−ＮＤ２である。一部の実施形態では、Ｒ１は−ＮＤ２であり、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
上で定義され、本明細書に記載されている通り、Ａは、水素または重水素から選択される。
一部の実施形態では、Ａは水素である。一部の実施形態では、Ａは水素であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。一部の実施形態では、Ａは重水素である。一部の実施形態では、Ａは重水素であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
上で定義され、本明細書に記載されている通り、Ｒ２は、水素または重水素から選択される。
一部の実施形態では、Ｒ２は水素である。一部の実施形態では、Ｒ２は水素であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。一部の実施形態では、Ｒ２は重水素である。一部の実施形態では、Ｒ２は重水素であり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
上で定義され、本明細書されている記載の通り、Ｒ３は、−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｄ、−ＣＨＤ２または−ＣＤ３から選択される。
一部の実施形態では、Ｒ３は−ＣＨ３である。一部の実施形態では、Ｒ３は−ＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
一部の実施形態では、Ｒ３は−ＣＨ２Ｄである。一部の実施形態では、Ｒ３は−ＣＨ２Ｄであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
一部の実施形態では、Ｒ３は−ＣＨＤ２である。一部の実施形態では、Ｒ３は−ＣＨＤ２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
一部の実施形態では、Ｒ３は−ＣＤ３である。一部の実施形態では、Ｒ３は−ＣＤ３であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
上で定義され、本明細書に記載されている通り、Ｒ４は、−ＣＨ３、−ＣＨ２Ｄ、−ＣＨＤ２または−ＣＤ３から選択される。
一部の実施形態では、Ｒ４は−ＣＨ３である。一部の実施形態では、Ｒ４は−ＣＨ３であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
一部の実施形態では、Ｒ４は−ＣＨ２Ｄである。一部の実施形態では、Ｒ４は−ＣＨ２Ｄであり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
一部の実施形態では、Ｒ４は−ＣＨＤ２である。一部の実施形態では、Ｒ４は−ＣＨＤ２であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
一部の実施形態では、Ｒ４は−ＣＤ３である。一部の実施形態では、Ｒ４は−ＣＤ３であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
上で定義され、本明細書に記載されている通り、Ｒ５は、水素または重水素から選択される。
一部の実施形態では、Ｒ５は水素である。一部の実施形態では、Ｒ５は水素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。一部の実施形態では、Ｒ５は重水素である。一部の実施形態では、Ｒ５は重水素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ６、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
上で定義され、本明細書に記載されている通り、Ｒ６は、水素または重水素から選択される。
一部の実施形態では、Ｒ６は水素である。一部の実施形態では、Ｒ６は水素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。一部の実施形態では、Ｒ６は重水素である。一部の実施形態では、Ｒ６は重水素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ７またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
上で定義され、本明細書に記載されている通り、Ｒ７は、水素または重水素から選択される。
一部の実施形態では、Ｒ７は水素である。一部の実施形態では、Ｒ７は水素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。一部の実施形態では、Ｒ７は重水素である。一部の実施形態では、Ｒ７は重水素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ８のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
上で定義され、本明細書に記載されている通り、Ｒ８は、水素または重水素から選択される。
一部の実施形態では、Ｒ８は水素である。一部の実施形態では、Ｒ８は水素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。一部の実施形態では、Ｒ８は重水素である。一部の実施形態では、Ｒ８は重水素であり、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６またはＲ７のうちの
少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する。
一部の実施形態では、本発明は、式Ｉ、Ｉ−Ａ、ＩＩ−Ａ、ＩＩ−Ｂ、ＩＩＩ−Ａ、ＩＩＩ−Ｂ、ＩＩＩ−Ｃ、ＩＶまたはＶの化合物であって、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のそれぞれが、上で定義され、本明細書に記載されている通りであり、Ｒ１およびＲ２のそれぞれが、以下の表１ａに示されている項目に定義されている通りである、化合物を提供する。
Figure 2021167358
一部の実施形態では、本発明は、式Ｉ、Ｉ−Ａ、ＩＩ−Ａ、ＩＩ−Ｂ、ＩＩＩ−Ａ、ＩＩＩ−Ｂ、ＩＩＩ−Ｃ、ＩＶまたはＶの化合物であって、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のそれぞれが、上で定義され、本明細書に記載されている通りであり、Ｒ３およびＲ４のそれぞれが、以下の表１ｂに示されている項目に定義されている通りである、化合物を提供する。
Figure 2021167358
一部の実施形態では、本発明は、式Ｉ、Ｉ−Ａ、ＩＩ−Ａ、ＩＩ−Ｂ、ＩＩＩ−Ａ、ＩＩＩ−Ｂ、ＩＩＩ−Ｃ、ＩＶまたはＶの化合物であって、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４のそれぞれが、上で定義され、本明細書に記載されている通りであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のそれぞれが、以下の表１ｃに示されている項目に定義されている通りである、化合物を提供する。
Figure 2021167358
一部の実施形態では、本発明は、式Ｉ、Ｉ−Ａ、ＩＩ−Ａ、ＩＩ−Ｂ、ＩＩＩ−Ａ、ＩＩＩ−Ｂ、ＩＩＩ−Ｃ、ＩＶまたはＶの化合物であって、Ｒ１およびＲ２のそれぞれが、上の表１ａに示されている項目において定義されている通りであり、Ｒ３およびＲ４のそれぞれが、上の表１ｂに示されている項目において定義されている通りであり、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８のそれぞれが、上の表１ｃに示されている項目において定義されている通りである、化合物を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、表１ａ、表１ｂもしくは表１ｃのいずれかに挙げたものから選択される化合物、または薬学的に許容されるその塩を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、以下の表２に示されているものから選択される、式Ｉの化合物を提供する。
Figure 2021167358
Figure 2021167358
Figure 2021167358
一部の実施形態では、本発明は、上の表２に示されている化合物、または薬学的に許容されるその塩を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、以下の表２Ａに示されている化合物の重水素を富化した類似体、または薬学的に許容されるその塩を提供し、重水素は任意の利用可能な水素の位置に富化される。
Figure 2021167358
Figure 2021167358
一部の実施形態では、本発明は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個または１３個の重水素原子を含む、本明細書に記載の任意の化合物を提供する。
一部の実施形態では、提供されている化合物は、重水素を、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％または約１００％の量で含む。重水素富化の文脈において本明細書において使用する場合、用語「約」は、±２％を意味する。
ある特定の実施形態では、本発明は、上および本明細書において記載されている任意の化合物、または薬学的に許容されるその塩を提供する。
一部の実施形態では、本発明は、上および本明細書において記載されている、任意の化合物を単離形態で提供する。
４． 化合物および薬学的に許容されるその組成物の使用
本明細書に記載のある特定の化合物は、毒性アルデヒド、例えば、ＭＤＡおよびＨＮＥをスカベンジするのに有用であることが見出されている。本明細書に記載の化合物は、ＭＤＡ、ＨＮＥ、または他の毒性アルデヒドとのシッフ塩基縮合を起こし、エネルギー的に起こりやすい反応でアルデヒドと錯体を形成し、したがって、タンパク質、脂質、炭水化物、またはＤＮＡとの反応に利用され得るアルデヒドを低減または排除する。重要なことに、本明細書に記載の化合物は、アルデヒドと反応して、アルデヒドを含有する閉環構造を有する化合物を形成することができ、したがってアルデヒドを捕捉し、アルデヒドが細胞環境中に再び放出されることを予防する。
本明細書において使用する場合、用語「処置」、「処置する」および「処置すること」とは、本明細書に記載の通り、疾患もしくは障害、または１つもしくは複数のそれらの症状の進行を反転させること、軽減すること、それらの発症を遅延させること、または阻害することを指す。一部の実施形態では、処置は、１つまたは複数の症状が発症した後に施される。他の実施形態では、処置は、症状の非存在下で施される。例えば、処置は、症状の発症前（例えば、症状の病歴に照らし合わせて、および／または遺伝的もしくは他の感受性因子に照らし合わせて）に、感受性の高い個体に施される。処置はまた、例えば、その再発を予防する、遅延させる、またはその重症度を低下させるために、症状が消散した後にも継続される。
本発明は、アルデヒド毒性が病態形成に関係している疾患、障害、または状態を処置する、予防する、かつ／またはそのリスクを低減するための、本明細書に記載の化合物に関する。
アルデヒド毒性が関係している疾患、障害、または状態の例は、これらに限定されないが、角膜疾患（例えば、ドライアイ症候群、白内障、円錐角膜、水疱性角膜症および他の角膜症、ならびにフックス内皮ジストロフィー）、他の眼の障害または状態（例えば、アレルギー性結膜炎、眼性瘢痕性類天疱瘡、ＰＲＫの治癒および他の角膜の治癒と関連する状態、ならびに涙液脂質の分解または涙腺機能障害と関連する状態）、ならびに炎症の結果としての高いアルデヒドレベルと関連する他の眼の状態（例えば、ブドウ膜炎、強膜炎、眼のスティーブンスジョンソン症候群、眼性酒さ（マイボーム腺機能障害を伴う、もしくは伴わない））を含めた眼の疾患、障害、または状態を含む。一例では、眼の疾患、障害、または状態は、黄斑変性、例えば、加齢黄斑変性（「ＡＭＤ」）、またはシュタルガルト病ではない。さらなる例では、眼の疾患、障害、または状態は、ドライアイ症候群、眼性酒さ、またはブドウ膜炎である。
アルデヒド毒性が関係している疾患、障害、状態または徴候の例はまた、乾癬、局部（円板状）狼瘡、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、放射線皮膚炎、尋常性座瘡、シェーグレン−ラルソン症候群および他の魚鱗癬、日光弾力線維症／しわ、肌の張りと弾力、腫脹、湿疹、喫煙または刺激物質誘発性皮膚変化、皮膚切開、火傷および／または創傷が関連する皮膚状態、狼瘡、強皮症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血症、アテローム性動脈硬化症、虚血再灌流傷害、パーキンソン病、アルツハイマー病、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素欠損症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病、メタボリックシンドローム、加齢関連障害ならびに線維性疾患を含めた眼以外の障害を含む。さらなる例では、眼以外の障害は、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、および放射線皮膚炎から選択される皮膚の疾患、障害、または状態である。別の例では、眼以外の障害は、シェーグレン−ラルソン症候群ならびに美容上の徴候に関連する火傷および／もしくは創傷から選択される皮膚の疾患、障害、または状態である。
さらなる例では、アルデヒド毒性が関係している疾患、障害、または状態は、加齢関連障害である。加齢関連疾患、障害、または状態の例には、皮膚のしわ、乾燥および色素沈着が含まれる。
アルデヒド毒性が関係している疾患、障害、または状態の例は、びらん剤の毒性作用またはアルカリ剤からの火傷と関連する状態をさらに含む。本明細書に記載の化合物は、毒性アルデヒドを低減または排除し、したがって、これらの疾患または障害を処置し、予防し、かつ／またはそのリスクを低減する。
一実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体に本明細書に記載の化合物を投与することを含む、アルデヒド毒性が病態形成に関係している眼の疾患、障害、または状態の処置、予防、および／またはそのリスクの低減に関する。眼の疾患、障害、または状態には、これらに限定されないが、角膜疾患（例えば、ドライアイ症候群、白内障、円錐角膜、水疱性角膜症および他の角膜症、ならびに角膜におけるフックス内皮ジストロフィー）、他の眼の障害または状態（例えば、アレルギー性結膜炎、眼性瘢痕性類天疱瘡、ＰＲＫの治癒および他の角膜の治癒と関連する状態、ならびに涙液脂質の分解または涙腺機能障害と関連する状態）、ならびに炎症が高いアルデヒドレベルをもたらす他の眼の状態（例えば、ブドウ膜炎、強膜炎、眼のスティーブンスジョンソン症候群、眼性酒さ（マイボーム腺機能障害を伴う、もしくは伴わない））が含まれる。眼の疾患、障害、または状態は、黄斑変性症、例えば、ＡＭＤ、またはシュタルガルト病を含まない。一例示では、眼
の疾患、障害、または状態において、ＭＤＡまたはＨＮＥの量または濃度は、眼の組織または細胞において増加している。例えば、アルデヒド（例えば、ＭＤＡまたはＨＮＥ）の量または濃度は、正常な眼の組織または細胞におけるものと比較したとき、少なくとも１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、５倍、１０倍増加している。本明細書に記載の化合物、例えば、化合物９は、時間依存的様式でアルデヒド（例えば、ＭＤＡおよびＨＮＥ）濃度を減少させる。アルデヒド（例えば、ＭＤＡまたはＨＮＥ）の量または濃度は、当技術分野で公知の方法または技術、例えば、Ｔｕｋｏｚｋａｎら、Ｆｕｒａｔ Ｔｉｐ Ｄｅｒｇｉｓｉ、１１巻：８８〜９２頁（２００６年）に記載されているものによって測定することができる。
１つのクラスでは、眼の疾患、障害、または状態は、ドライアイ症候群である。第２のクラスでは、眼の疾患、障害、または状態は、ＰＲＫの治癒および他の角膜の治癒と関連する状態である。例えば、本発明は、それを必要とする被験体に本明細書に記載の化合物を投与することを含む、進行中のＰＲＫの治癒または他の角膜の治癒を対象とする。第３のクラスでは、眼の疾患、障害、または状態は、炎症の結果としての高いアルデヒドレベルと関連する眼の状態（例えば、ブドウ膜炎、強膜炎、眼のスティーブンスジョンソン症候群、および眼性酒さ（マイボーム腺機能障害を伴う、もしくは伴わない）である。第４のクラスでは、眼の疾患、障害、または状態は、円錐角膜、白内障、水疱性角膜症および他の角膜症、フックス内皮ジストロフィー、眼性瘢痕性類天疱瘡、またはアレルギー性結膜炎である。本明細書に記載の化合物は、本明細書の下記に記載のように局所的または全身に投与しうる。
第２の実施形態では、本発明は、アルデヒド毒性が病態形成に関係している、皮膚の障害もしくは状態、または美容上の徴候の処置、予防、および／またはそのリスクの低減であって、それを必要とする被験体に本明細書に記載の化合物を投与することを含む、処置、予防、および／またはそのリスクの低減に関する。皮膚の障害または状態には、これらに限定されないが、乾癬、強皮症、局部（円板状）狼瘡、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、放射線皮膚炎、尋常性座瘡、ならびにシェーグレン−ラルソン症候群および他の魚鱗癬が含まれ、美容上の徴候は、日光弾力線維症／しわ、肌の張りと弾力、腫脹、湿疹、喫煙もしくは刺激物質誘発性皮膚変化、皮膚切開、または皮膚状態に関連する火傷および／もしくは創傷である。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の通り、皮膚の加齢関連疾患、障害、または状態に関する。
様々な皮膚の障害または状態、例えば、アトピー性皮膚炎、局部（円板状）狼瘡、乾癬および強皮症は、高いＭＤＡおよびＨＮＥレベルによって特徴付けられる（Ｂｒ Ｊ Ｄｅｒｍａｔｏｌ、１４９巻：２４８頁（２００３年）；ＪＥＡＤＶ、２６巻：８３３頁（２０１２年）；Ｃｌｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、２５巻：３２０頁（２００６年））。さらに、シェーグレン−ラルソン症候群（ＳＬＳ）の魚鱗癬の特徴は、脂肪アルデヒドの蓄積に起因し、これはラメラ体（ＬＢ）の正常機能および分泌を撹乱し、角質層（ＳＣ）における細胞間脂質沈着、および皮膚層における水バリアの欠陥をもたらす（Ｗ．Ｂ． Ｒｉｚｚｏら（２０１０年））。アルデヒドを代謝する酵素である脂肪アルデヒドデヒドロゲナーゼは、ＳＬＳ患者において機能不全となっている。したがって、アルデヒドを低減または排除する化合物、例えば、本明細書に記載の化合物を使用して、アルデヒド毒性が病態形成に関係している皮膚の障害または状態、例えば、本明細書に記載のものを処置し、予防し、かつ／またはそのリスクを低減することができる。さらに、水バリアの改善およびアルデヒドが媒介する炎症（線維症および弾力線維症（Ｃｈａｉｒｐｏｔｔｏら（２００５年）を含めた）の予防を伴って、多くの美容上の徴候、例えば、日光弾力線維症／しわ、肌の張り、弾力（腫脹）、湿疹、喫煙もしくは刺激物質誘発性皮膚変化および皮膚切開美容術、ならびに皮膚状態に関連する火傷および／もしくは創傷は、本発明の方法を使用して処置することができる。
１つのクラスでは、皮膚の疾患、障害、または状態は、乾癬、強皮症、局部（円板状）狼瘡、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、放射線皮膚炎、尋常性座瘡、またはシェーグレン−ラルソン症候群および他の魚鱗癬である。一事例では、皮膚の疾患、障害、または状態は、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、放射線皮膚炎、またはシェーグレン−ラルソン症候群および他の魚鱗癬である。第２のクラスでは、美容上の徴候は、日光弾力線維症／しわ、肌の張りと弾力、腫脹、湿疹、喫煙もしくは刺激物質誘発性皮膚変化、皮膚切開、または皮膚状態に関連する火傷および／もしくは創傷である。
第３の実施形態では、本発明は、アルデヒド毒性が病態形成に関係しているびらん剤（blister agent）の毒性作用またはアルカリ剤からの火傷と関連する状態の処置、予防、および／またはそのリスクの低減であって、それを必要とする被験体に本明細書に記載の化合物を投与することを含む、処置、予防、および／またはそのリスクの低減に関する。
びらん剤には、これらに限定されないが、サルファマスタード、ナイトロジェンマスタード、およびホスゲンオキシムが含まれる。びらん剤の毒性作用または傷害性作用は、疼痛、刺激、ならびに／または皮膚、目、および／もしくは粘膜における裂け、ならびに結膜炎ならびに／または目への角膜の損傷を含む。サルファマスタードは、化合物ビス（２−クロルエチル）スルフィドである。ナイトロジェンマスタードは、化合物ビス（２−クロルエチル）エチルアミン、ビス（２−クロルエチル）メチルアミン、およびトリス（２−クロルエチル）アミンを含む。サルファマスタードまたはその類似体は、酸化ストレス、特に、ＨＮＥレベルの増加を引き起こすことができ、抗酸化防御系を枯渇させ、それによって脂質過酸化を増加させることによって、酸化ストレス応答を誘発し、したがってアルデヒドレベルを増加させうる（Ｊａｆａｒｉら（２０１０年）；Ｐａｌら（２００９年））。抗酸化剤、例えば、シリビニンは、局所に適用されたとき、サルファマスタードまたはその類似体への曝露によって誘発される皮膚の傷害を減弱し、酸化防止酵素の活性の増加は、サルファマスタードによって生じる活性酸素種への代償性応答でありうる（Ｊａｆａｒｉら（２０１０年）；Ｔｅｗａｒｉ−Ｓｉｎｇｈら（２０１２年））。さらに、フリーラジカル種を低減させる介入は、ホスゲン誘発性肺傷害について曝露後の有効な処置であった（Ｓｃｉｕｔｏら（２００４年））。したがって、アルデヒドを低減または排除する化合物、例えば、本明細書に記載の化合物を使用して、びらん剤、例えば、サルファマスタード、ナイトロジェンマスタード、およびホスゲンオキシムの毒性作用と関連する状態を処置し、予防し、かつ／またはそのリスクを低減することができる。
アルカリ剤には、これらに限定されないが、石灰、灰汁、アンモニア、および排水管洗浄剤が含まれる。アルデヒドを低減または排除する化合物、例えば、本明細書に記載の化合物を使用して、アルカリ剤からの火傷と関連する状態を処置し、予防し、かつ／またはそのリスクを低減することができる。
第４の実施形態では、本発明は、それを必要とする被験体に本明細書に記載の化合物を投与することを含む、アルデヒド毒性が病態形成に関係している自己免疫性、免疫媒介性、炎症性、心血管性、もしくは神経系の疾患、障害、もしくは状態、またはメタボリックシンドローム、または糖尿病の処置、予防、および／もしくはそのリスクの低減に関する。自己免疫性または免疫媒介性の疾患、障害、または状態には、これらに限定されないが、狼瘡、強皮症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および関節リウマチが含まれる。炎症性の疾患、障害、または状態には、これらに限定されないが、関節リウマチ、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、敗血症、ならびに線維症（例えば、腎臓、肝臓、肺、および心臓の線維症）が含まれる。心血管の疾患、障害、または状態には、これらに限定されないが、アテローム性動脈硬化症および虚血再灌流傷害が含まれ
る。神経系の疾患、障害、または状態には、これらに限定されないが、パーキンソン病、アルツハイマー病、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素欠損症、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ならびにシェーグレン−ラルソン症候群の神経学的態様（認知の遅延および痙縮）が含まれる。
本明細書において列挙する疾患、障害、または状態は、１つより多い病理学的機構が関与しうることを当業者は理解する。例えば、本明細書において列挙する疾患、障害、または状態は、免疫応答および炎症応答における調節不全に関与しうる。したがって、疾患、障害、または状態の上記の分類は絶対的ではなく、疾患、障害、または状態は、免疫性、炎症性、心血管性、神経系、および／または代謝性の疾患、障害、または状態であると考えうる。
アルデヒドデヒドロゲナーゼの欠乏を有する個体は、高いアルデヒドレベル、ならびにパーキンソン病（ＰＮＡＳ、１１０巻：６３６頁（２０１３年））およびアルツハイマー病（ＢｉｏＣｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．、２７３巻：１９２頁（２０００年））のリスクの増加を有することが見出されている。パーキンソン病において、アルデヒドは特に、ドパミンの生理機能を妨げる（Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃ Ｂｉｏｌ Ｍｅｄ、５１巻：１３０２頁（２０１１年）；Ｍｏｌ Ａｓｐｅｃｔｓ Ｍｅｄ、２４巻：２９３頁（２００３年）；Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ、１１４５巻：１５０頁（２００７年））。さらに、アルデヒドレベルは、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、自己免疫疾患、例えば、狼瘡、関節リウマチ、狼瘡、乾癬、強皮症、および線維性疾患において上昇しており、ＨＮＥおよびＭＤＡのレベルの増加は、アテローム性動脈硬化症および糖尿病の進行に関係している（Ｊ． Ｃｅｌｌ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ．、１５巻：１３３９頁（２０１１年）；Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ、６２巻：２０６４頁（２０１０年）；Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ、１０１巻：２３３頁（１９９５年）；Ｉｎｔ Ｊ Ｒｈｅｕｍ Ｄｉｓ、１４巻：３２５頁（２０１１年）；ＪＥＡＤＶ、２６巻：８３３頁（２０１２年）；Ｃｌｉｎ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ、２５巻：３２０頁（２００６年）；Ｇｕｔ、５４巻：９８７頁（２００５年）；Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ、２０巻：２１１９頁（２００９年））。ＭＤＡは、アテローム性動脈硬化症をもたらす泡沫細胞の形成の増加にさらに関係している（Ｌｅｉｂｕｎｄｇｕｔら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、１３巻：１６８頁（２０１３年））。また、アルデヒドに関連する毒性は、多くの炎症性肺疾患、例えば、喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の病態形成において重要な役割を果たす（Ｂａｒｔｏｌｉら、Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ ｏｆ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、２０１１年、論文８９１７５２）。したがって、アルデヒドを低減または排除する化合物、例えば、本明細書に記載の化合物を使用して、自己免疫性、免疫媒介性、炎症性、心血管性、もしくは神経系の疾患、障害、もしくは状態、またはメタボリックシンドローム、または糖尿病を処置し、予防し、かつ／またはそのリスクを低減することができる。例えば、本明細書に記載の化合物は、ニューロンにおけるアルデヒド媒介性細胞死を予防する。さらに、本明細書に記載の化合物は、広範囲の炎症促進性サイトカインをダウンレギュレートし、かつ／または抗炎症性サイトカインをアップレギュレートするが、このことは本明細書に記載の化合物が、炎症性疾患、例えば、多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症の処置に有用であることを示す。
上で議論されている通り、開示されている組成物は、黄斑変性、ならびにその病因にＡ２Ｅおよび／またはリポフスチンの蓄積が関与する網膜疾患の他の形態を処置または予防するために、被験体に投与されうる。Ａ２Ｅの蓄積によって特徴付けられる、他の疾患、障害、または状態が同様に処置されうる。
一実施形態では、Ａ２Ｅの形成を低減する化合物が、被験体に投与される。例えば、化合物は、ｔｒａｎｓ−ＲＡＬとの反応に関してＰＥと競合することができ、それにより、
形成されるＡ２Ｅの量を低減する。別の実施形態では、Ａ２Ｅの蓄積を予防する化合物が、被験体に投与される。例えば、化合物は、ｔｒａｎｓ−ＲＡＬとの反応に関して、ＰＥとかなり首尾よく競合し、Ａ２Ｅを形成しない。
処置される個体は、３つの群に分類される：（１）目視検査および／もしくは網膜電図検査によって決定される視覚的欠陥（これらに限定されないが、暗順応、コントラスト感度および明瞭度を含む）、ならびに／またはドルーゼンの蓄積、組織萎縮および／もしくはリポフスチン蛍光に関して、網膜およびＲＰＥ組織の眼底検査（fundoscopic examination）によって示される網膜の健康状態に基づくと、黄斑変性、またはその病因にＡ２Ｅおよび／もしくはリポフスチンの蓄積が関与する網膜疾患の他の形態であると臨床的に診断される者、（２）黄斑変性疾患の発症前にあるが、同一尺度のいずれかまたはすべてにおける異常な結果に基づいてリスクがあると考えられる者、ならびに（３）発症前であるが、黄斑変性疾患の家族歴、および／あるいは疾患と関連する１つもしくは複数のアレルまたは多形を示す遺伝子型判定結果に基づいて、遺伝的にリスクがあると考えられる者。組成物は、１か月、１週または１日当たり、１回または複数回、局所にまたは全身に投与される。投与量は、ある場合、暗順応における視覚性能における副作用を回避するよう選択されうる。処置は、少なくとも１か月間、３か月間、６か月間もしくは１２か月間、またはそれよりも長い期間、継続される。患者は、安全性および有効性を評価するために、１か月間、３か月間、６か月間もしくは１２か月間、またはそれよりも長い間隔で試験されうる。有効性は、上記の視覚性能および網膜の健康状態を検査することにより測定される。
一実施形態では、被験体は、黄斑変性の症状を有すると診断されて、次いで開示した化合物が投与される。別の実施形態では、被験体は、黄斑変性を発症するリスク（リスク要因には、喫煙歴、年齢、女性の性別および家族歴が含まれる）があると同定され得、次いで、開示した化合物が投与される。別の実施形態では、被験体は、両目に萎縮型ＡＭＤを有している場合があり、次いで、開示した化合物が投与される。別の実施形態では、被験体は、一方の目に滲出型ＡＭＤを有しているが、他方の目に萎縮型ＡＭＤを有している場合があり、次いで、開示した化合物が投与される。さらに別の実施形態では、被験体は、シュタルガルト病を有すると診断され得、次いで、開示した化合物が投与される。別の実施形態では、被験体は、その病因にＡ２Ｅおよび／またはリポフスチンの蓄積が関与する網膜疾患の他の形態の症状を有すると診断され、次いで、化合物が投与される。別の実施形態では、被験体は、その病因にＡ２Ｅおよび／またはリポフスチンの蓄積が関与する網膜疾患の他の形態を発症するリスクがあると同定され得、次いで、開示した化合物が投与される。一部の実施形態では、化合物は、予防的に投与される。一部の実施形態では、被験体は、網膜の損傷が明らかとなる前に、疾患を有すると診断されている。例えば、被験体は、ＡＢＣＡ４に関する遺伝子変異を担持することが見出されており、任意の眼科的兆候が明白になる前に、シュタルガルト病のリスクにあると診断されており、または被験体は、被験体が視力に関してなんらかの影響を自覚する前に、黄斑変性を示す早期黄斑変化を有することが見出されている。一部の実施形態では、ヒト被験体は、黄斑生成（macular generation）の処置または予防を必要としていることを知っている場合がある。
一部の実施形態では、被験体は、黄斑変性の程度がモニターされうる。被験体は、例えば、眼検査、散瞳検査（dilated eye examination）、眼底検査、視力検査および／ま
たは生検による種々の方法でモニターされうる。モニタリングは、種々の時間で行うことができる。例えば、被験体は、化合物が投与された後にモニターされうる。モニタリングは、化合物の最初の投与後、例えば、１日間、１週間、２週間、１か月間、２か月間、６か月間、１年間、２年間、５年間、または任意の他の期間、行うことができる。被験体は、繰り返しモニターすることができる。一部の実施形態では、化合物の用量は、モニタリングに応じて、変更することができる。
一部の実施形態では、開示した方法は、黄斑変性、またはその病因にＡ２Ｅおよび／もしくはリポフスチンの蓄積が関与する網膜疾患の他の形態を処置または予防するための他の方法、例えば光線力学療法と組み合わせてもよい。例えば、患者は、１つもしくは複数の疾患または障害に対する、１つよりも多い療法により処置されうる。例えば、患者は、一方の目が萎縮型のＡＭＤに罹患しており、このＡＭＤは、本発明の化合物により処置され、他方の目が滲出型のＡＭＤを罹患しており、このＡＭＤは、例えば、光線力学療法により処置される。
一部の実施形態では、黄斑変性、またはその病因にＡ２Ｅおよび／もしくはリポフスチンの蓄積が関与する網膜疾患の他の形態を処置または予防するための化合物は、長期間、投与されてもよい。化合物は、毎日、１日１回よりも多く、１週間に２回、１週間に３回、毎週、２週間毎、１か月毎、２か月毎、半年毎、１年毎、および／または２年毎、投与されうる。
多様な細胞機能を有する生物活性シグナル伝達分子である、スフィンゴシン１−リン酸は、小胞体酵素であるスフィンゴシン１−リン酸リアーゼによって、不可逆的に分解され、ｔｒａｎｓ−２−ヘキサデセナールおよびホスホエタノールアミンを生じる。ｔｒａｎｓ−２−ヘキサデセナールは、ＪＮＫ依存経路を介して、複数の細胞タイプにおいて、細胞骨格再構築、脱離およびアポトーシスを引き起こすことが実証されている。Biochem Biophys Res Commun. ２０１２年７月２０日；４２４巻（１号）：１８〜２１頁を参照。これらの知見および関連するα，β−不飽和アルデヒドの公知の化学的性質は、ｔｒａｎｓ−２−ヘキサデセナールが追加の細胞構成成分と相互作用する可能性を喚起する。ｔｒａｎｓ−２−ヘキサデセナールは、デオキシグアノシンおよびＤＮＡと容易に反応して、環式１，Ｎ（２）−デオキシグアノシン付加体のジアステレオ異性体である、３−（２−デオキシ−β−ｄ−エリトロ−ペントフラノシル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−８Ｒ−ヒドロキシ−６Ｒ−トリデシルピリミド［１，２−ａ］プリン−１０（３Ｈ）オンおよび３−（２−デオキシ−β−ｄ−エリトロ−ペントフラノシル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−８Ｓ−ヒドロキシ−６Ｓ−トリデシルピリミド［１，２−ａ］プリン−１０（３Ｈ）オンを生成することが示された。これらの知見により、スフィンゴシン１−リン酸リアーゼによって内生的に産生されたｔｒａｎｓ−２−ヘキサデセナールは、変異誘発性の帰結を潜在的に有するＤＮＡ形成性アルデヒドに由来するＤＮＡ付加体と直接反応することが実証される。
４−ヒドロキシ酪酸尿症またはガンマ−ヒドロキシ酪酸尿症としても公知の、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素欠損症（ＳＳＡＤＨＤ）は、ＧＡＢＡ代謝の最も一般的な常染色体性劣性遺伝障害であり（Vogelら、２０１３年）、幼児期における発達遅延および緊
張低下、ならびに青年期および成人期における重症な表出性言語障害および強迫性障害の表現型を呈する。てんかんは、通常、全身性強直性間代性発作として、患者の半分に起こるが、時として、アブサンス発作およびミオクローヌス発作が起こる（Pearlら、２０１
４年）。青年期および成人期において、３分の２よりも多い患者が、身体障害となる恐れのある、神経精神病学的問題（すなわち、ＡＤＨＤ、ＯＣＤおよび攻撃性）を呈する。代謝的に、神経調節性モノカルボン酸である、主要な抑制性神経伝達物質ＧＡＢＡおよびガンマ−ヒドロキシ酪酸（ＧＨＢ）の蓄積がある（SneadおよびGibson、２００５年）。さ
らに、この障害に特有のいくつかの他の中間体が、患者および対応するネズミモデルの両方において検出されている。ＧＡＢＡ−トランスアミナーゼの不可逆性阻害剤である、ビガバトリン（ＶＧＢ；γ−ビニルＧＡＢＡ）は、ＧＡＢＡがＧＨＢに変換されるのを阻止するので、ＳＳＡＤＨ欠乏症の処置に対する論理的な選択である。転帰は様々であり、選択された患者では、処置は、悪化をもたらした（Good、２０１１年；Pellock、２０１１
年；Escaleraら、２０１０年；Casaranoら、２０１１年；Maternら、１９９６年；Al-Ess
aら、２０００年）。ＳＳＡＤＨ欠乏症の標的療法は、依然としてとらえ難く、介入は姑
息的である。
５． 薬学的に許容される組成物
本発明の方法による化合物および組成物は、上で提示されている障害を処置する、またはその重症度を低下させるのに有効な任意の量および任意の投与経路を使用して投与される。必要とされる正確な量は、被験体の種、年齢および全身状態、感染の重症度、特定の薬剤、その投与方式などに応じて、被験体毎に様々である。本発明の化合物は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために、投薬単位形態（dosage unit form）で好ましくは製剤化される。表現「投薬単位形態」とは、本明細書において使用する場合、処置される患者に適切な、薬剤の物理的に個別の単位を指す。しかし、本発明の化合物および組成物の１日の全使用量は、妥当な医学的判断の範囲内で、担当医によって決定されることが理解される。任意の特定の患者または生物に対する具体的な有効用量レベルは、処置される障害および障害の重症度；用いられる具体的な化合物の活性；用いられる具体的な組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康、性別および食事；用いられる具体的な化合物の投与時間、投与経路および排出速度；処置の持続時間；用いられる具体的な化合物と組み合わせて、または同時に使用される薬物、ならびに医療分野において周知の同様の因子を含めた、種々の因子に依存する。
本発明の薬学的に許容される組成物は、処置される感染の重症度に応じて、経口で、直腸に、非経口で、槽内に、膣内に、腹腔内に、局所に（粉剤・散剤（powder）、軟膏またはドロップ剤によって）口腔に、経口または鼻用スプレーとしてなどにより、ヒトおよび他の動物に投与されうる。ある特定の実施形態では、本発明の化合物は、１日当たり、被験体の体重の、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約２５ｍｇ／ｋｇの投薬レベルで、１日に１回または複数回、経口または非経口投与されて、所望の治療効果が得られる。
経口投与のための液体剤形には、これらに限定されないが、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤が含まれる。活性化合物に加えて、液体剤形は、当技術分野において一般的に使用される不活性な希釈剤、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、エチルカーボネート、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにそれらの混合物などを含有してもよい。不活性な希釈剤の他に、経口組成物はまた、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味剤、香味剤および芳香剤を含むことができる。
注射用調製物、例えば、注射用の滅菌の水性または油性の懸濁剤を、適当な分散剤または湿潤剤、および懸濁化剤を使用する、公知の技術に従って製剤化することができる。注射用滅菌調製物は、非経口的に許容される非毒性希釈剤または溶媒中の、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、注射用滅菌液剤、懸濁剤またはエマルジョンとすることもできる。用いられうる許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンガー液、Ｕ．Ｓ．Ｐおよび等張性の塩化ナトリウム溶液がある。さらに、滅菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として、慣用的に用いられる。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含めた、任意の無刺激性の不揮発性油を用いることができる。さらに、脂肪酸、例えばオレイン酸が、注射剤の調製に使用される。
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターによる濾過によって、または使用前に滅菌
水もしくは他の注射用滅菌媒体に溶解または分散することができる、滅菌の固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。
本発明の化合物の効果を延長するために、皮下または筋肉内注射からの化合物の吸収を緩慢にすることが望ましいことが多い。これは、水溶性に乏しい、結晶質または非晶質材料の液体懸濁液の使用によって達成されうる。次いで、化合物の吸収速度は、その溶解速度に依存し、ひいては、結晶サイズおよび結晶性形態に依存しうる。あるいは、非経口で投与される化合物の形態の吸収の遅延は、油状ビヒクルに化合物を溶解または懸濁することにより達成される。注射用デポー形態は、生分解性ポリマー、例えばポリラクチド−ポリグリコリド中に化合物のマイクロ封入マトリックスを形成させることにより作製される。化合物とポリマーとの比、および用いられる特定のポリマーの性質に応じて、化合物の放出速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（酸無水物）が含まれる。デポー注射用製剤はまた、身体組織と適合するリポソームまたはマイクロエマルジョン中に化合物を捕捉することにより調製される。
直腸または膣投与のための組成物は、本発明の化合物を、適当な非刺激性賦形剤またはキャリア、例えば、周囲温度では固体であるが、体温では液体であり、したがって、直腸または膣腔で融解して活性化合物を放出する、カカオバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスと混合することにより調製することができる、好ましくは坐剤である。
経口投与のための固体剤形には、カプセル剤、錠剤、丸剤、粉剤・散剤（powder）および顆粒剤が含まれる。このような固体剤形では、活性化合物は、少なくとも１種の不活性な薬学的に許容される賦形剤またはキャリア、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、ならびに／またはａ）増量剤もしくはエキステンダー、例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトールおよびケイ酸、ｂ）結合剤、例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリジノン、スクロースおよびアカシアなど、ｃ）保湿剤、例えばグリセロール、ｄ）崩壊剤、例えば、寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、ある特定のシリケートおよび炭酸ナトリウム、ｅ）溶解遅延剤、例えばパラフィン、ｆ）吸収促進剤、例えば第四級アンモニウム化合物、ｇ）湿潤剤、例えば、セチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなど、ｈ）吸収剤、例えばカオリンおよびベントナイトクレイ、ならびにｉ）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、ならびにそれらの混合物と混合される。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形はまた、緩衝剤を含みうる。
また、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中に、ラクトースまたは乳糖、および高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用する、類似のタイプの固体組成物が増量剤として用いられてもよい。錠剤、糖剤、カプセル剤、丸剤および顆粒剤の固体剤形は、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶コーティング、および医薬製剤化分野において周知の他のコーティングを用いて調製することができる。それらは、乳白剤を任意選択で含有してもよく、有効成分（複数可）のみ放出する、または腸管のある特定の部分において、任意選択で遅れて、優先的に有効成分（複数可）を放出する組成物のものとすることもできる。使用することができる埋め込み式組成物の例には、ポリマー物質およびワックスが含まれる。また、軟質および硬質充填ゼラチンカプセル中に、ラクトースまたは乳糖、および高分子量ポリエチレングリコールなどの賦形剤を使用する、類似のタイプの固体組成物が増量剤として用いられてもよい。
上記の通り、活性化合物はまた、１種または複数種の賦形剤を含むマイクロ封入化形態とすることができる。錠剤、糖剤、カプセル剤、丸剤、および顆粒剤の固体剤形は、コー
ティングおよびシェル、例えば、腸溶コーティング、放出制御コーティング、および医薬製剤化分野において周知の他のコーティングを用いて調製することができる。このような固体剤形では、活性化合物は、少なくとも１種の不活性な希釈剤、例えば、スクロース、ラクトースまたはデンプンと混和することができる。このような剤形はまた、通常の実行の通り、不活性な希釈剤以外の追加的な物質、例えば、打錠用滑沢剤、および他の打錠用助剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースを含んでもよい。カプセル剤、錠剤および丸剤の場合、剤形はまた、緩衝剤を含んでもよい。それらは、乳白剤を任意選択で含有してもよく、有効成分（複数可）のみ放出する、または腸管のある特定の部分において、任意選択で遅れて、優先的に有効成分（複数可）を放出する組成物のものとすることもできる。使用することができる埋め込み式組成物の例には、ポリマー物質およびワックスが含まれる。
本発明の化合物の局所または経皮投与のための剤形には、軟膏剤、ペースト剤、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤、粉剤・散剤、液剤、スプレー剤、吸入剤またはパッチが含まれる。活性成分は、滅菌条件下、薬学的に許容されるキャリア、および必要な任意の保存剤、または必要な場合にはバッファと混和される。眼科用製剤、点耳薬および点眼薬もまた、本発明の範囲内にあるものとして企図される。さらに、本発明は、経皮パッチの使用を企図しており、経皮パッチは、身体への化合物の制御送達を実現するという追加の利点を有する。このような剤形は、適切な媒体中に化合物を溶解または分配することにより作製されうる。吸収増強剤はまた、皮膚を通過する化合物の流量を増加させるために使用することができる。速度は、速度制御膜を設けることによって、またはポリマーマトリックスもしくはゲルに化合物を分散させることによって、制御することができる。
本発明の化合物はまた、局所に、例えば、目に直接的に、例えば、点眼薬または眼科用軟膏として投与することができる。点眼薬は、典型的には、有効量の少なくとも１つの本発明の化合物、および目に安全に適用することができるキャリアを含む。例えば、点眼薬は、等張液の形態であり、溶液のｐＨは、目の刺激がないように調整される。多くの場合、上皮バリアは、目への分子の浸透を妨げる。したがって、大部分の現在使用される眼科用薬物は、なんらかの形態の浸透増強剤が補充されている。これらの浸透増強剤は、最も上方の上皮細胞のタイトジャンクションを緩めることによって働く（Burstein、１９８５年、Trans Ophthalmol Soc U K １０４巻（Ｐｔ４）：４０２〜９頁；Ashtonら、１９９１年、J Pharmacol Exp Ther ２５９巻（２号）：７１９〜２４頁；Greenら、１９７１年、Am J Ophthalmol ７２巻（５号）：８９７〜９０５頁）。最も一般に使用
される浸透増強剤は、微生物汚染に対する保存剤としても働く塩化ベンザルコニウムである（Tangら、１９９４年、J Pharm Sci ８３巻（１号）：８５〜９０頁；Bursteinら
、１９８０年、Invest Ophthalmol Vis Sci １９巻（３号）：３０８〜１３頁）。塩化ベンザルコニウムは、典型的には、０．０１〜０．０５％の最終濃度となるよう添加される。
用語「生物学的試料」には、本明細書において使用する場合、これらに限定されないが、細胞培養物またはその抽出物、哺乳動物から得られる生検材料またはその抽出物、および血液、唾液、尿、便、精液、涙液もしくは他の体液、またはそれらの抽出物が含まれる。
本発明の態様のそれぞれの特徴はすべて、必要な変更を加えて、他のすべての態様に適用する。
本明細書に記載の本発明が、一層完全に理解されうるよう、以下の実施例が示される。これらの実施例は、例示目的に過ぎず、本発明を決して限定するものとして解釈されるものではないことが理解されるべきである。
例示
以下の実施例に示されている通り、ある特定の例示的な実施形態では、化合物は、以下の一般手順に従って調製される。一般的な方法は、本発明のある特定の化合物の合成を示しているが、以下の一般的な方法、および当業者に公知の他の方法が、すべての化合物、ならびに本明細書に記載のこれらの化合物のそれぞれのサブクラスおよび種に適用されうることが理解される。
（実施例１）
化合物の一般的な反応順序
重水素標識されているアルデヒド捕捉剤は、任意選択で、スキーム１に示されている部位に重水素標識されている中間体を使用する、２０１３年７月２３日に公開された、米国特許出願公開第２０１３／０１９０５００号に記載されている通り作製した。例示的な方法は、さらに以下に記載される。
Figure 2021167358
（実施例２）
Ａ−１の合成
Figure 2021167358
１−（３−エトキシ−２，３−ジオキソプロピル）ピリジン−１−イウムブロミド。２Ｌの丸底フラスコに、エタノール（２２０ｍＬ）およびピリジン（３１ｇ、３９２ｍｍｏｌ）を投入し、得られた溶液を、窒素下、温和なかき混ぜ速度で撹拌した。この溶液に、ブロモピルビン酸エチル（７６．６ｇ、３５４ｍｍｏｌ）を、遅い安定液流で添加した。反応混合物を６５±５℃で２時間、撹拌した。
（実施例３）
Ａ−２ａの合成
Figure 2021167358
１−（６−クロロ−２−（エトキシカルボニル）キノリン−３−イル）ピリジン−１−イウムブロミド。実施例２における２時間の撹拌時間の完了時に、反応混合物を１８〜２２℃にゆっくりと冷却した。フラスコに３回、真空パージして、この時点で、長いプラスチック製漏斗を使用して、２−アミノ−５−クロロ−ベンズアルデヒド（ＡＣＢ）（５０．０ｇ、３２１ｍｍｏｌ）を固体として、反応フラスコに直接、添加した。ピリジン（６４．０ｇ、８０９ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＥｔＯＨすすぎ液（１０ｍＬ）を添加し、反応混合物を窒素下、８０±３℃で約１６時間（一晩）、加熱し、この時点で、ＨＰＬＣ分析により、反応は効果的に完了したことが示された。
（実施例４）
Ａ−２ｂの合成
Figure 2021167358
１−（６−クロロ−２−（エトキシカルボニル）キノリン−３−イル−４−ｄ）ピリジン−１−イウム。化合物Ａ−２ｂは、２−アミノ−５−クロロ−ベンズアルデヒド（ＡＣＢ）を２−アミノ−５−クロロ−ベンズアルデヒド−ｄに代えて、Ａ−２ａ（実施例３を参照）と同様の様式で調製する。
（実施例５）
Ａ−３ａの合成
Figure 2021167358
エチル３−アミノ−６−クロロキノリン−２−カルボキシレート。実施例３からの反応混合物を約７０℃に冷却し、２Ｌの反応フラスコに滴下漏斗を使用して、モルホリン（７６．０ｇ、８７３ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を約２．５時間、８０±２℃で加熱し、この時点で、反応は、ＨＰＬＣ分析により完了していると考えられた（Ａ−３ａの面積％の増加が停止している）。クエンチ、後処理および単離のために、反応混合物を１０〜１５℃に冷却した。
２Ｌの反応フラスコに、滴下漏斗を使用して、３０〜６０分間かけて水（６００ｇ）を投入し、添加速度を調整し、冷却浴を使用することにより、温度を１５℃未満に維持した。反応混合物を１０〜１５℃でさらに４５分間、撹拌し、次いで、ブフナー漏斗を使用する濾過によって、粗製Ａ−３ａを単離した。ケーキを水（１００ｍＬ×４）で洗浄して、各回、ケーキに水を浸透させた後、真空を適用した。ケーキを空気乾燥して、粗製Ａ−３ａをほぼ乾燥した茶色固体として得た。ケーキを２Ｌの反応フラスコに戻し、ヘプタン（３５０ｍＬ）およびＥｔＯＨ（１７０ｍＬ）を添加し、混合物を３０〜６０分間、７０±３℃に加熱した。スラリーを０〜５℃に冷却し、真空下で濾過することにより単離した。Ａ−３ａを真空下、および３５±３℃で一晩（１６〜１８時間）、真空乾燥オーブン中で乾燥して、Ａ−３ａを、暗緑色固体として得た。
（実施例６）
Ａ−３ｂの合成
Figure 2021167358
エチル３−アミノ−６−クロロキノリン−２−カルボキシレート−４−ｄ。化合物Ａ３−ｂは、Ａ２−ａの反応混合物をＡ２−ｂの反応混合物に代えて、化合物Ａ３−ａ（実施例５を参照）と同様の様式で調製する。
（実施例７）
ＮＳ２の合成
Figure 2021167358
２−（３−アミノ−６−クロロキノリン−２−イル）プロパン−２−オール。２Ｌの丸底フラスコにメチルマグネシウムクロリド（ＴＨＦ中の３．０Ｍ溶液を２００ｍＬ、６００ｍｍｏｌ）を投入した。溶液を、氷浴を使用して、０〜５℃に冷却した。
５００ｍＬのフラスコ（磁気撹拌）に、実施例５からのＡ−３ａを２２．８グラムおよびＴＨＦ（３６５ｍＬ）を投入し、撹拌して溶解し、次いで、２Ｌの反応フラスコ上の滴下漏斗に移した。反応フラスコに５．７５時間かけてＡ−３ａ溶液を滴下添加し、添加全体を通じて、反応フラスコの温度を０〜５℃の間に維持した。添加の終了時点で、フラスコの内容物を０〜５℃でさらに１５分間、撹拌し、次いで、冷却浴を除去して、反応物を周囲温度で一晩、撹拌した。
フラスコを氷浴中で冷却し、反応混合物にＥｔＯＨ（３９．５ｇ、８５７ｍｍｏｌ）を滴下添加することにより、反応混合物を注意深くクエンチし、添加の経過の間、反応混合物の温度を１５℃未満に維持した。次いで、ＮＨ４Ｃｌの水溶液（水４１５ｍＬ中に８４．７ｇのＮＨ４Ｃｌ）を注意深く添加し、混合物を約３０分間、温和なかき混ぜ下で撹拌し、次いで、分液漏斗に移して、層を分離した。固体が、水相中に存在し、そこで、ＨＯＡｃ（１２．５ｇ）を添加し、内容物を穏やかに回転させ、下部にほぼ均一な水相を得た。下部の水層を２Ｌの反応フラスコに移して戻し、２−メチルＴＨＦ（５０ｍＬ）と共に約１５分間、温和なかき混ぜ下で撹拌した。元の上部の有機層を≦４０℃、および必要な場合、真空で、ロータリーエバポレーターを使用して、約４０ｍＬに体積を低下させた。分液漏斗中の相を分離し、上部の２−ＭｅＴＨＦ相を生成物の残留物と合わせ、５００ｍＬのフラスコに移して、約２５ｍＬの体積に真空蒸留した。この残留物に、２−ＭｅＴＨＦ（５０ｍＬ）を添加し、約５０ｍＬの体積に蒸留した。粗製化合物ＮＳ２溶液を２−ＭｅＴＨＦ（１２５ｍＬ）で希釈し、５〜１０℃に冷却し、２Ｍ Ｈ２ＳＯ４（水性）（２５０ｍＬ）をゆっくりと添加し、周囲温度に戻るように、混合物を３０分間、撹拌した。ヘプタン（４０ｍＬ）を投入し、反応混合物をさらに１５分間、撹拌し、次いで、分液漏斗に移して層を分離した。下部の水性生成物層を追加のヘプタン（３５ｍＬ）で抽出し、次いで、下部の水相を、機械式撹拌機を備えた１Ｌの反応フラスコに移し、混合物を５〜１０℃に冷却した。合わせた有機層を廃棄した。２５％ ＮａＯＨ（水性）の溶液を調製し（ＮａＯＨ、４７ｇ、水２００ｍＬ）、１Ｌの反応フラスコにゆっくりと添加して、ｐＨを６．５〜８．５の範囲にした。
ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）を添加し、混合物を一晩、撹拌した。混合物を分液漏斗に移し、下部相を廃棄した。上部の有機層をブライン（２５ｍＬ）で洗浄し、次いで、上部の有機生成物層をロータリーエバポレーターで体積を低下させ、粗製化合物ＮＳ２を、暗色油状物として得、これは、数分以内に固化した。粗製化合物ＮＳ２をＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ）に溶解して、シリカゲル（２３ｇ）のプラグにより濾過し、３／１のヘプタン／ＥｔＯＡｃで、すべての化合物ＮＳ２が溶出するまで（約４２０ｍＬが必要であった）溶出し
、化合物ＮＳ２の暗着色物（の大部分を除去した。溶媒を真空中で除去して、１４．７ｇの化合物ＮＳ２を黄褐色固体として得た。化合物ＮＳ２をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）に溶解し、７／１のヘプタン／ＥｔＯＡｃから３／１のヘプタン／ＥｔＯＡｃ（合計１４００ｍＬ）の移動相グラジエントを使用する、シリカゲル（７２ｇ）のカラムにより溶出した。化合物ＮＳ２を含有している溶媒画分を除去した。化合物ＮＳ２をＥｔＯＡｃ（１２０ｍＬ）で希釈し、Ｄａｒｃｏ Ｇ−６０脱色炭（４．０ｇ）を含むフラスコ中で約１時間、撹拌した。フリット漏斗（firtted funnel）を使用するセライトに通して混合物を濾過
し、ケーキをＥｔＯＡｃ（３×１５ｍＬ）ですすいだ。合わせた濾液をロータリーエバポレーターで除去し、化合物ＮＳ２をヘプタン（１６０ｍＬ）／ＥｔＯＡｃ（１６ｍＬ）に７６℃で溶解した。均一な溶液を０〜５℃にゆっくりと冷却し、２時間、保持して、次いで、化合物ＮＳ２を濾過により単離した。最高の真空下、３５℃で５時間、真空オーブン中で乾燥した後、化合物ＮＳ２を白色固体として得た。ＨＰＬＣ純度：１００％（ＡＵＣ）；ＨＰＬＣ（標準条件を使用）：Ａ−２：７．２分；Ａ−３：１１．６分。
（実施例８）
Ｉ−１の合成
Figure 2021167358
２−（６−クロロキノリン−２−イル）プロパン−１，１，１，３，３，３−ｄ６−２−オール。メチルマグネシウムクロリドをメチル−ｄ３−マグネシウムヨージド（９９原子％Ｄ）に代えて、化合物ＮＳ２（実施例７を参照）と同様の様式で化合物Ｉ−１を調製した。エーテル／ＴＨＦ中、Ａ３−ａを１．０Ｍメチル−ｄ３−マグネシウムヨージド（９９原子％Ｄ）５．３ｍｏｌ当量と反応させ、収率２０％のＩ−１を得た。MS (ESI): m/z 242.9 (M+1); 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 7.80 (d, J =6 Hz, 1H), 7.51 (d, J = 2 Hz, 1H), 7.33 (dd, J = 2 and 2 Hz, 1H), 7.07 (s, 1H), 4.68 (br s, 2H), 3.83 (br s, 1H); 13C NMR (CDCl3, 75 MHz)
δ: 154.3, 139.5, 139.1, 132.4, 130.6, 130.0, 126.3, 123.7, 116.4,
76.8, 74.9.
（実施例９）
Ｉ−２の合成
Figure 2021167358
２−（６−クロロキノリン−２−イル−４−ｄ）プロパン−２−オール。化合物Ｉ−２
は、Ａ３−ａをＡ３−ｂに代えて、化合物ＮＳ２（実施例７を参照）と同様の様式で調製する。
ＡＣＢの調製
Figure 2021167358
Ｎ２雰囲気を確立して、わずかなＮ２流を容器に流した後、大型の磁気撹拌子および熱電対を備えた５Ｌの重壁圧力容器に、白金の硫化、炭素上５重量％、還元、乾燥品（platinum, sulfided, 5wt% on carbon, reduced, dry）（９．０４ｇ、ニトロ基質に対して３．０重量％）を添加した。ＭｅＯＨ（１．５０Ｌ）、５−クロロ−２−ニトロベンズアルデヒド（３０２．１ｇ、１．６３ｍｏｌ）、さらに、ＭｅＯＨ（１．５０Ｌ）およびＮａ２ＣＯ３（２．４２ｇ、２２．８ｍｍｏｌ、０．０１４当量）を添加した。フラスコを密封し、撹拌を４５０ｒｐｍで開始した。溶液を排気し、Ｎ２（３５ｐｓｉ）で２回、再加圧した。フラスコを排気し、Ｈ２で３５ｐｓｉに再加圧した。溶液の温度を２０分以内に３０℃に到達させた。次いで、溶液を水浴で冷却した。氷を水浴に添加し、温度を３５℃未満に維持した。開放前に２回、２時間毎に排気しＮ２（５ｐｓｉ）で再加圧ことにより、反応物をモニターした。反応の進行は、ＴＬＣにより追跡することができた：５−クロロ−２−ニトロベンズアルデヒド（Ｒｆ＝０．６０、ＣＨ２Ｃｌ２、ＵＶ）および中間体（Ｒｆ＝０．５１、ＣＨ２Ｃｌ２、ＵＶおよびＲｆ＝０．１４、ＣＨ２Ｃｌ２、ＵＶ）が消費されて、ＡＣＢ（Ｒｆ＝０．４３、ＣＨ２Ｃｌ２、ＵＶ）が得られた。５時間で反応は９８％完了し（ＧＣ）、完了したとみなした。３Ｌの中型のフリット漏斗に、セライト（約８０ｇ）を添加した。これをＭｅＯＨ（約２００ｍＬ）で沈降させて、真空で吸引乾燥させた。穏やかな真空を使用して、セライトプラグを介して溶液を吸引しながら、還元した溶液を、カニューレを介して漏斗に移した。これをＭｅＯＨ（１５０ｍＬ×４）でチェースした。溶液を５Ｌの３つ口丸底フラスコに移した。３０℃、ロータバップで、溶媒（約２Ｌ）を減圧下で除去した。Ｎ２のブランケットを適用した。機械撹拌および滴下漏斗を備えた５Ｌの４つ口丸底フラスコに溶液を移した。４時間かけて、激しく撹拌した溶液に水（２．５Ｌ）を滴下添加した。スラリーを最少量の真空で濾過した。収集した固体を水（１．５Ｌ、２×）、２−プロパノール（１６０ｍＬ）、次いで、ヘキサン（４５０ｍＬ、２×）で洗浄した。収集した固体（カナリア色、粒状固体）を１５０×７５の再結晶皿に移した。次いで、固体を、真空オーブン中、減圧下（２６〜２８ ｉｎ Ｈｇ）、４０℃で一晩、乾燥させた。Ｎ２雰囲気下、５℃で、ＡＣＢ（ＨＰＬＣにより＞９９Ａ％）を保存した。
（実施例１０）
ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ
ＬＤＨ細胞毒性アッセイ
ラット皮質初代培養物を、インキュベーター中に２４時間または４８時間入れ、様々な濃度の開示した化合物で処理した。次いで、２０μＬの培養培地を、Bergmeyerら、Methods of Enzymatic Analysis、第３版（１９８３年）に記載された通りのＬＤＨアッセ
イのために取り出した。
循環サイトカインの量を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイ
雄性Ｃ５７ＢＩ／６マウスに、ＬＰＳ（２０ｍｇ／ｋｇ）に曝露させる３０分前に、開
示した化合物を投与する。ＬＰＳ曝露の２時間後、血液をマウスから収集し、ＥＬＩＳＡを行って、循環サイトカインの量を決定する。開示した化合物による処置は、炎症促進性サイトカイン、例えば、ＩＬ−５およびＩＬ−１β、ＩＬ−１７、ならびにＴＮＦの低減をもたらす。また、開示した化合物による処置が、抗炎症性サイトカイン、例えば、ＩＬ−１０の上昇をもたらす。さらに、様々な他のケモカイン、例えば、エオタキシン、ＩＬ−１２、ＩＰ−１０、ＬＩＦ、ＭＣＰ−１、ＭＩＧ、ＭＩＰおよびＲＡＮＴＥＳもまた、開示した化合物による処置によって減少した。
接触性皮膚炎の処置における有効性を評価するためのアッセイ
接触性皮膚炎の処置における開示される化合物の有効性を決定するために、酢酸ミリスチン酸ホルボール（「ＰＭＡ」）を、マウス（群毎にＮ＝１０）の右の耳介の前側部分および後側部分の両方に局所に適用する（２０μＬ中２．５μｇ）。対照として、左の耳介の前側部分および後側部分の両方に、２０μＬのエタノール（ＰＭＡ賦形剤）を投与する。ＰＭＡ適用の６時間後、右および左の耳介の両方の厚さを決定する。測定は、毛または折り畳まれた耳介を含まないように注意しながら両方の耳の同じ領域から少なくとも２回決定する。
アレルギー性皮膚炎の処置における有効性を評価するためのアッセイ
アレルギー性皮膚炎の処置における開示される化合物の有効性を測定するために、オキサゾロン（「ＯＸＬ」）を、マウスの剪毛した腹部に適用する（アセトン中１．５％、１００μＬ）。７日後、ＯＸＬ処置マウスの耳介の厚さを決定する。次いで、開示される化合物（１００ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（すなわち、Ｃａｐｔｉｓｏｌ）を、マウスの腹腔内に投与し、それに続いて右の耳介の前側部分および後側部分の両方に３０分後にＯＸＬ（１％、２０μＬ）を局所適用する。対照として、左の耳介の前側部分および後側部分の両方に、２０μＬのアセトン（ＯＸＬ賦形剤）を投与する。両方の耳の耳介の厚さを、２４時間後に再び測定する。群毎にＮ＝１０。
アルデヒドの捕捉を測定するアッセイ
別々の反応バイアルに、開示される各化合物（０．０６４ｍｍｏｌ）、ＭＤＡ塩（２２．７％ＭＤＡ、０．０６４ｍｍｏｌ）、ならびにトリオレイン酸グリセリル（６００ｍｇ）を添加する。混合物に、ＰＢＳ水溶液（約２．５ｍｌ）中の２０重量％Ｃａｐｉｔｓｏｌ、それに続いてリノール酸（６００ｍｇ）を添加する。反応混合物を周囲温度にて激しく撹拌し、ＬＣ／ＭＳによってモニターする。開示される化合物は、ＭＤＡと急速に反応し、ＭＤＡ付加体を形成する。
シッフ塩基の確認
ＵＶ／ＶＩＳ分光法を使用して、ＲＡＬと本発明の化合物の第一級アミンとのシッフ塩基縮合をモニターする。ＲＡＬとのシッフ塩基縮合生成物のｉｎ ｖｉｔｒｏ分析を開示化合物に関して行う。
溶液相分析では、遊離化合物とＲＡＬのシッフ塩基縮合生成物（ＲＡＬ−ＳＢＣ）の両方のλｍａｘ値を、ＲＡＬ−ＳＢＣのタウの値と一緒に測定する。本明細書において使用する場合、「ＲＡＬ−ＳＢＣ」は、ＲＡＬのシッフ塩基縮合生成物、およびＲＡＬ−化合物を意味する。溶液相分析は、当技術分野において公知のプロトコールを使用して、化合物とＲＡＬの１００：１混合物を使用して行う。水性の、エタノール、オクタノール、およびクロロホルム：メタノール（様々、例えば、２：１）を含めた、いくつかの溶媒系を試験した。溶液動態を測定し、溶媒条件に大きく依存することが見出される。
シッフ塩基縮合物の固相分析も、化合物とＲＡＬとの１：１混合物を使用して行う。固相分析は、当技術分野において公知のプロトコールを使用して行う。混合物を窒素下で乾
燥させ、縮合反応を行って完了させる。
脂質相分析は、当技術分野において公知のプロトコールを使用して行い、λｍａｘ、タウ（ＲＡＬ−ＳＢＣ対ＡＰＥ／Ａ２ＰＥ）および競合阻害を測定する。リポソーム条件は、ｉｎ ｓｉｔｕ条件に近い。
暗順応のＥＲＧ分析
暗順応は、光への曝露後の視覚感度の回復である。暗順応は、迅速な（ニューロンの）過程と遅い（光化学的）過程の両方を含む、複数の構成成分を有する。視覚色素の再生は、遅い光化学的過程に関連している。暗順応の速度は、いくつかの理由のために測定される。夜盲は、暗順応できないことに起因している（可視光（visual light）感受性の喪
失）。暗順応した可視光感受性に対する薬物効果を測定することにより、夜間の視覚に対する安全用量を見出すことが可能である。
網膜電図（ＥＲＧ）は、正常条件対薬物条件下で、暗順応を測定するために使用される。ＥＲＧは、実験的に定義された光刺激に対して応答している間に、網膜ニューロンによって発生される電場電位の測定である。さらに具体的には、ＥＲＧは、閃光後（例えば、５０ｍｓ）、角膜における網膜の電場電位を測定する。場強度は、網膜細胞に起因する、１０２〜１０３マイクロボルトである。
ＥＲＧは、生きている被験体（ヒトまたは動物）、または生きている動物から外科的に取り出された溶液中の半切除した目のどちらかに行うことができる、非侵襲的測定である。ＥＲＧは、暗順応を遅れさせる全身麻酔を必要とし、実験設計に要因として考慮しなければならない。
暗順応実験の典型的なＥＲＧ分析では、すべてのラットは、光感受性の一定状態に到達するまで数時間、暗順応させる。次いで、ラットは、「光脱色される」、すなわち、網膜から遊離１１−ｃｉｓ−ＲＡＬを一過的に枯渇させるのに十分に強力な光に短時間、曝露させる（例えば、３００ｌｕｘにて２分間）。次いで、ラットを直ちに暗闇に戻して暗順応を開始させる、すなわち、視覚色素の再生に起因する光感受性を回復させる。ＥＲＧを使用して、ラットが、いかに迅速に暗順応して、光感受性を回復するかを測定する。具体的には、光感受性に関する基準応答変数を定義する。
ＥＲＧ測定は、動態分析によって既に決定されている脱色後の暗回復の具体的な持続時間（例えば、３０分間）後に行う。曲線への当てはめを使用して感受性変数の値を算出し、同一ラットにおける、Ｙ５０およびσに関する暗順応動態を含めた、麻酔による回復を示す。Ｙ５０が−４．０に到達し、タウ＝２２．６分という低い光感受性の場合、より遅い順応が観察される。Ｙ５０が−５．５に到達し、タウ＝９．２分という高い光感受性の場合、より迅速な順応が観察される。
用量範囲を決定するため、上記と同じ枠組みに従う。ＥＲＧ用量範囲決定プロトコールでは、腹腔内の化合物は、暗順応したラットの光感受性を、用量依存的に低下させる。視力に対する効果は、３時間後に低下する。
ＲＡＬ反応のＮＭＲ分析
ＮＭＲ分光法を使用して、ＲＡＬと本発明の化合物の第一級アミンとのシッフ塩基縮合および環形成をモニターする。
Ａ２Ｅ形成の阻害
この実験は、野生型スプラーグドーリーラットにおいて、腹腔内への長期間のＲＡＬ−
トラップ化合物の注射により、Ａ２Ｅの蓄積速度が低下するという概念の証拠を確立するために設計する。これらの実験は、ＲＡＬ−トラップ化合物の処置有効性と対照化合物および処置をしない有効性とを比較する。
材料および方法：
研究は、野生型スプラーグドーリーラットを用いて行う。ラット処置群には、例えば、処置条件当たり、性別の混合した８匹のラットが含まれる。各動物は、以下の条件の１つにより処置する：
・ 対照：（１）このような処置により、放出される遊離ｔｒａｎｓ−ＲＡＬの量が低減され、それにより、Ａ２Ｅの形成に利用可能になるが、夜盲という望ましくない副作用を伴うという点でのプロトコール対照として、視覚サイクルタンパク質のレチノイド結合部位を阻害する１３−ｃｉｓ−レチノイン酸、ならびに（２）ヒトで網膜機能をモジュレートすることが臨床的に知られている、および、ｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏの両方の動物モデルにおいて、遊離ＲＡＬとシッフ塩基付加体を形成することが実験的に知られている市販の化合物。
・ ビヒクル
・ 化合物
・ 未処置
開示化合物は、１、５、１５および５０ｍｇ／ｋｇを含めた用量範囲にわたって試験する。処置は、腹腔内注射により、８週間、毎日施す。
化学：
実験は、種々の化学サービスを使用する。例えば、これらの実験は、不純物を特徴付けるための分析規格シートを有する市販の化合物を使用する。化合物は合成もする。化合物は、必要な投与に十分な量で調製する。化合物の製剤は、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を含む、初期動物安全性研究に使用するのに適する。ｔｒａｎｓ−ＲＡＬと本発明の化合物とのシッフ塩基反応生成物の以下の３つの属性を決定する。
・ 反応速度に関する安定性
・ 吸収特性、具体的には、ｕｖ−ｖｉｓ吸収極大および吸光係数（例えば、RappおよびBasinger、Vision Res. ２２巻：１０９７頁、１９８２年の図５を参照）、または反応動態のＮＭＲスペクトル分析
・ 例えば算出したｌｏｇ Ｐおよびｌｏｇ Ｄ溶解度値
生物学および生化学：
本明細書に記載の実験は、種々の生物学および生化学サービスを使用する。点眼薬形成（formation）による毎日の処置に関する、本発明の化合物の「無効レベル」（ＮＯＥＬ
）の用量は、例えば、眼の刺激プロトコールの場合、ウサギにおいて、および光刺激に視覚応答する暗順応のＥＲＧ測定の場合、げっ歯類において確立される。処置後および眼球摘出前に、動物、例えばウサギにおいて、以下の非侵襲性アッセイを行う。
・ 眼底撮影法によって明白となる、ＲＰＥおよび光受容体細胞の変性（Karanら、２
００５年、PNAS １０２巻：４１６４頁）
・ 蛍光眼底撮影法によって測定される、細胞外ドルーゼンおよび細胞内リポフスチン（Karanら、２００５年）
光応答は、ＥＲＧによって特徴付けられる（Wengら、Cell ９８巻：１３頁、１９９９年）。すべての処置動物において、分析方法、例えば、Karanら、２００５年；Raduら、
２００３年；およびParishら、PNAS ９５巻：１４６０９頁、１９９８年により記載されているものを使用して、処置プロトコールを終結してから、網膜のＲＰＥ細胞抽出物の細胞内Ａ２Ｅ濃度を測定する。例えば、処置動物の試料において、一方の目をアッセイし、
他方の目は、組織学的分析のために残す（以下に記載されている通り）。残りの動物では、両目を、個別にＡ２Ｅ形成についてアッセイする。
組織学（上で記載した）用に残して、処置後の目において、網膜およびＲＰＥ組織の形態（morphology）を、光学顕微鏡法による組織学的技法を用いて評価する（Karanら、２
００５年、電子顕微鏡法は、本明細書に記載の実験に使用しないことを除いて）。
処置レジメンの安全性は、例えば、以下の組合せを使用して評価する：
・ 処置期間を通じて、動物の挙動および食性の観察の毎日の記録
・ 処置期間の終了の時点における、ＥＲＧにより測定される視覚性能
・ 処置の終了の時点における眼の組織学検査
（実施例１１）
重水素化されたＮＳ２（ＮＳ２−Ｄ６；化合物Ｉ−１）の異種間代謝産物のプロファイリング
目的：
低分子は、一旦、動物に投与されると、種々の反応を受けて、一連の代謝産物を生じることができる。生成する正確な代謝産物は、多数の要因、例えば、動物、分子構造および分子の組織分布に依存する。低分子の代謝は、尿または便中への分子の排泄を補助するよう、水溶性を向上させる目的に役立つことがあるか、または偶発的な酵素触媒反応の結果に過ぎないことがある。例示的な代謝産物には、酸化生成物およびグルクロン酸抱合生成物が含まれる。生成した代謝産物の分布および量を予測することは不可能であることが多い。この研究の目的の１つは、凍結保存された初代肝細胞における、試験品ＮＳ２の異種間代謝産物プロファイリングを行うことであった。以下に記載されている通り、種々のＮＳ２代謝産物が生成され、代謝産物の分布は、異なる種の間で有意に変動した。低分子薬物の代謝産物の数および量を減少させること、例えば、身体における薬物の半減期を増加させること、および／または毒性代謝産物もしくは不活性代謝産物への変換を阻止することが望ましいことが多い。手元にあるこの知識を用いて、代謝産物の数および量を低下させる可能な経路として、ＮＳ２の重水素化を探索した。分子の重水素化（すなわち、１個または複数の水素原子の重水素への置き換え）は、代謝産物の生成速度に有意な効果を有することが多い。しかし、所与の分子に対する重水素化の効果を予測することは、大部分の場合、ほとんど不可能である。したがって、代謝産物プロファイリングは、ヒト肝細胞における、重水素化されたＮＳ２について行った。
研究条件：
この研究は、非ＧＬＰ条件下で行った。作業はすべて、適切な現地の保健規則および倫理審査による承認を得て行った。
実験設計：
試料分析
試料は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣ Ｉｎｆｉｎｉｔｙシリーズ、ＣＴＣ ＰＡＬ冷却オートサンプラーに接続した、ＳＣＩＥＸ ＱＴｒａｐ ５５００質量分析計を使用してＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析し、すべて、Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアによって制御した。アセトニトリル−水の勾配系を使用する、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラム（Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３、１．８、２．１×５０ｍｍ）での分離後、Ｑ１スキャンモードでＥＳＩイオン化を使用する質量分析（ＭＳ）によって、ピークを分析した。ＬＣ条件を以下の表３に示す。
Figure 2021167358
表４は、代謝産物プロファイリングに関する実験パラメーターを示す。
Figure 2021167358
実験手順
試験品は、３７℃で凍結保存した初代肝細胞と共に、二連でインキュベートした。供給元の指示に従い、細胞を解凍して生存細胞を計数し、平衡化した。穏やかにかき混ぜながら、３７℃で３０分間平衡化した後、試験化合物を細胞に添加して、３μＭの所望の最終濃度を得た。細胞懸濁液を、上記の通り、３７℃でインキュベートした。示されている時間において、試料を取り出し、同量の氷冷停止液（メタノール）と混合した。
並行して、試験剤の非存在下でのブランク肝細胞試料を１２０分間、インキュベートし、肝細胞に由来するピークの存在を示すための対照として使用した。停止した反応物を氷上で少なくとも１０分間、インキュベートし、さらなる量の水を添加した。試料を遠心分離して沈殿したタンパク質を除去し、上清をＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。
可能な代謝産物（新規な質量および既知の相ＩおよびＩＩの代謝産物、例えば、酸化、硫酸化、二酸化（di-oxidation）、脱水素化、硫酸化＋酸化、グルクロン酸抱合、酸化＋グルクロン酸抱合およびグルタチオン抱合）の存在を探索するため、ポジティブイオン化モードおよびネガティブイオン化モードの両方でフルスキャン質量スペクトル（１００〜８００ｍ／ｚ）を上記勾配にわたって実行した。質量分析法は、以下の表５に示されている。
Figure 2021167358
結果
ＮＳ２の重水素化により、ヒト肝細胞における代謝産物の数および量が大幅に低減されることが驚くべきことに分かった。以下の表６Ａおよび６Ｂにまとめられている通り、ＮＳ２のプロテオ（重水素が富化されていない）形態は、ラット、イヌ、サルまたはヒトの肝細胞によって、わずか１２０分間の経過にわたり、有意に代謝された。例えば、イヌ肝細胞は、ＬＣ保持時間および質量分析データによって評価される通り、ＮＳ２を２つの異なるモノ酸化生成物（Ｍ１およびＭ２）および２つの異なるグルタチオン（ＧＳＨ）抱合物（Ｍ５およびＭ６）に代謝した（図３を参照）。カニクイザルの肝細胞は、ＮＳ２を、モノ酸化代謝産物（Ｍ１）、４つの酸化＋グルクロン酸抱合代謝産物（Ｍ３、Ｍ４、Ｍ７およびＭ９）、およびグルクロン酸抱合代謝産物（Ｍ８）に代謝した（図２を参照）。ヒト肝細胞は、ＮＳ２を、モノ酸化代謝産物（Ｍ１）、２つの酸化＋グルクロン酸抱合代謝産物（Ｍ７およびＭ９）、およびグルクロン酸抱合代謝産物（Ｍ８）に代謝した（図１を参照）。
Figure 2021167358
観察された代謝産物形成の相対的な程度を、「＋」によって表し、＋＋＋＋が、最も多量の代謝産物である（親のイオン化ポテンシャルは、代謝産物のそれと類似していると仮定する）。
Figure 2021167358
ＮＳ２の質量スペクトル分析（各代謝産物Ｍ１〜Ｍ９、重水素化されたＮＳ２、およびヒト肝細胞において生成した、重水素化されたＮＳ２に由来する代謝産物）を、図６〜１７に示す。
重水素が富化されていないＮＳ２とは対照的に、重水素を富化したＮＳ２（すなわち、表７における化合物Ｉ−１またはＮＳ２−Ｄ６）のヒト肝細胞への１２０分間の曝露により、唯一の検出可能な代謝産物として、モノ酸化代謝産物Ｍ１が生じた（表７、ならびに図５および１７を参照）。生成したＭ１の量も、重水素化されていないＮＳ２をヒト肝細胞に曝露させた場合に生成したものに比べて、大幅に低減した（図１および５を比較）。代謝産物生成のこのような劇的な低減は、予め予期することができなかった。
Figure 2021167358
観察された代謝産物形成の相対的な程度を、「＋」によって表し、＋＋＋＋が、最も多量の代謝産物である（親のイオン化ポテンシャルは、代謝産物と類似していると仮定する）。
注：観察された代謝産物の数に基づくと、重水素化されたＮＳ２は、重水素化されていな
いＮＳ２分子と比べて、２時間の経過にわたり、それほどの代謝を示さなかった。
代謝産物の数および量の低減が、単に重水素取込みに起因するものではない可能性があるという、表７に示されている結果はやはり驚くべきものであり、酵素により触媒される律速ステップをより複雑にしている。むしろ、観察された２５９のｍ／ｚは、６個の重水素原子がすべて、モノ酸化生成物に保持されているということと一致している。理論に拘泥することを望むものではないが、このことは、重水素富化が、分子上の離れた位置での代謝に影響を及ぼしており、恐らくは、例えば、単に一次動的アイソタイプ効果（kinetic isotype effect）によるものではないことを示しうる。
参考文献：１）McGinnity, D.F.ら（２００４年）「Evaluation of fresh and cryopreserved hepatocytes as in vitro drug metabolism tools for the prediction of metabolic clearance.」 Drug Metab. Dispos. ３２巻（１１号）：１２４７〜１２５３頁 ２）Sahi, J.ら（２０１０年）「Hepatocytes as a tool in drug metabolism, transport and safety evaluations in drug discovery.」 Current Drug Discov. Technol. ７巻（３号）：１８８〜１９８頁
（実施例１２）
ＮＳ２（すなわち重水素化されていないＮＳ２）に関する解離した海馬培養物における、過酸化水素毒性からの保護活性についての用量応答の評価
過酸化水素毒性からの保護についてのＮＳ２用量応答評価の実験プラン：
Ａ．試験剤：ＮＳ２ ＦＷ：２３６
１．供給源１：ＣｏｒｅＲｘロット０９３−ＦＯＲ ＣＮＳ２；使用量：６．４ｍｇ；マイクロミル粉砕した試料（平均粒子サイズは、約１６ミクロンである）は、Ｊ−ＳｔａｒロットＢＲ−ＮＳ２−１１−０１に由来した。
２．供給源２：Ｊ−ＳｔａｒロットＢＲ−ＮＳ２−１；使用量：６ｍｇ；ミル粉砕されていない試料
Ｂ． 製剤および保存溶液の調製
２つのタイプの製剤を比較した：ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびＣａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）。
１．Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）製剤：ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）中に、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）を５ｍｇ／ｍｌ（すなわち、０．５％）で溶解した。Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）溶液０．４２ｍｌに、１ｍｇ（４．２４μｍｏｌ）を溶解することにより、１０ｍＭのＮＳ２保存溶液（ストックＡ）を調製し、１０μｍｏｌ／ｍｌまたは１０ｍＭ（すなわち、２．３８ｍｇ／ｍＬ）の初期ストックを得た。ボルテックス混合の後に、この保存溶液は透明であった。
２．ＤＭＳＯ製剤：ＤＭＳＯをＣａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）との比較対照物として使用した。１００ｍＭの保存溶液（すなわち、２３．８ｍｇ／ｍＬ）とするため、５ｍｇのＮＳ２（２１．１２μｍｏｌ）をＤＭＳＯ ０．２１ｍＬに溶解した。１００ｍＭのＮＳ２ ＤＭＳＯ製剤は透明であった。対数希釈は、ＤＰＢＳを用いて行った。ＤＰＢＳを用いて１：１０希釈して１０ｍＭにすると、溶液は濁ったが、広範なボルテックス混合後、透明になった。一般に、初代ニューロン培養物におけるＤＭＳＯに関する発明者らのベンチマーク濃度の目標は、ＤＭＳＯの薬理的作用を回避するため、０．１％未満である。ＮＳ２が１ｍＭ試験濃度の場合、１％ ＤＭＳＯを使用したことに留意されたい。アッセイでは、５時間の試験で明らかな毒性は観察されなかった（以下の実験９からの結果を参照）。
Ｃ．保存溶液の調製に関する詳細
Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中のＮＳ２：
１．ストックＡは、０．５％Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中、１０ｍＭ ＮＳ２とした。各ウェルにおいて、０．０５％ Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中、１ｍＭ ＮＳ２の最終濃度とするために、１０μｌを１００μｌに添加した。
２．ストックＢは、５０μｌのストックＡを４５０μｌのＤＰＢＳに添加することにより調製し、ＮＳ２の１ｍＭ溶液を得た。０．００５％ Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中、１００μＭ ＮＳ２の最終濃度とするために、１０μｌを１００μｌのＤＰＢＳに添加した。
３．ストックＣは、５０μｌのストックＢを４５０μｌのＤＰＢＳに添加することにより調製し、ＮＳ２の１００μＭ溶液を得た。０．０００５％ Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中、１０μＭ ＮＳ２の最終濃度とするために、１０μｌを１００μｌのＤＰＢＳに添加した。
４．ストックＤは、５０μｌのストックＣを４５０μｌのＤＰＢＳに添加することにより調製し、ＮＳ２の１０μＭ溶液を得た。０．００００５％ Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中、１μＭ ＮＳ２の最終濃度とするために、１０μｌを１００μｌのＤＰＢＳに添加した。
５．ストックＥは、５０μｌのストックＤを４５０μｌのＤＰＢＳに添加することにより調製し、ＮＳ２の１μＭ溶液を得た。０．０００００５％ Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中、０．１μＭ ＮＳ２の最終濃度とするために、１０μｌを１００μｌのＤＰＢＳに添加した。
ＤＭＳＯ中ＮＳ２：
１．ストックＡは、１００％ ＤＭＳＯ中、１００ｍＭ ＮＳ２とした。
２．ストックＢは、１０ｍＭ ＮＳ２の最終濃度とするため、５０μｌのストックＡを４５０μｌのＤＰＢＳに添加することにより調製した。１０μｌを１００μｌのＤＰＢＳに添加して、１％ ＤＭＳＯ中、１ｍＭ ＮＳ２の最終濃度を得た。
３．ストックＣは、１ｍＭ ＮＳ２の最終濃度とするため、５０μｌのストックＢを４５０μｌのＤＰＢＳに添加することにより調製した。１０μｌを１００μｌのＤＰＢＳに添加して、０．１％ ＤＭＳＯ中、１００μＭ ＮＳ２の最終濃度を得た。
４．ストックＤは、１００μＭ ＮＳ２の最終濃度とするため、５０μｌのストックＣを４５０μｌのＤＰＢＳに添加することにより調製した。１０μｌを１００μｌのＤＰＢＳに添加して、０．０１％ ＤＭＳＯ中、１０μＭ ＮＳ２の最終濃度を得た。
５．ストックＥは、１０μＭ ＮＳ２の最終濃度とするため、５０μｌのストックＤを４５０μｌのＤＰＢＳに添加することにより調製した。１０μｌを１００μｌのＤＰＢＳに添加して、０．００１％ ＤＭＳＯ中、１μＭ ＮＳ２の最終濃度を得た。
６．ストックＦは、１μＭ ＮＳ２の最終濃度とするため、５０μｌのストックＥを４５０μｌのＤＰＢＳに添加することにより調製した。０．０００１％ ＤＭＳＯ中、０．１μＭ ＮＳ２の最終濃度にするため、１０μｌを１００μｌのＤＰＢＳに添加した。
すべての場合において、ウェル中の全体積を１１０μｌとするため、適切な希釈液１０μｌを１００μｌに添加した。
Ｄ．過酸化水素と関連する酸化ストレスからのＮＳ２媒介性神経保護を検出するために設計した培養条件
１．ラットの海馬培養物は、以前に記載されている通り調製した（Brenneman DE、Smith GR、Zhang Y、Du Y、Kondaveeti SK、Zdilla MJ、Reitz AB.（２０１２年） J. Molecular Neuroscience、４７巻：３６８〜３７９頁）。これらの条件下では、培養物は、少なくとも９０％がニューロン性である。最も多量の非ニューロン細胞は、星状細胞である。
２．培養物はすべて、ウェル当たり、１０Ｋ個の細胞のプレート培養密度で、９６ウェ
ルフォーマットに調製した。培養物は、Ｅ１８海馬組織の解離後、１０日目から２１日目の間、処理した。これらの実験の場合、プレートはすべて、１３日目に処理した。すべての実験では、ＮＳ２またはカンナビジオール（ＣＢＤ）により処理して１０分後に、過酸化水素を培養物に添加した。各処理条件に関して、反復回数は５回とした。
３．培養物はすべて、Ｂ２７／神経基礎培地（Neural Basal Medium）中でプレート
培養した。処理の当日、培養物はすべて、培地を、抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地に完全に変更した。
４．以前に決定されている通り（Brennemanら、２０１２年）、１０μＭの過酸化水素
を使用して、毒性および酸化ストレスを生じさせた。以前に記載されている通り［Jarrett, SG、Liang, L-P、Hellier, JL、Staley, KJおよびPatel, M.（２００８年）Neurobiol. Dis ３０巻（１号）：１３０〜１３８頁］、１０μＭの過酸化水素が、てんか
ん重積状態のカイニン酸モデルによるラットの海馬において観察された。
５．すべての研究において使用した陽性対照は、初代ニューロンにおける酸化ストレスに対して保護する［Brenneman, DE、Petkanas, DおよびKinney, W.A.（２０１４年）Annual Symposium on the Cannabinoids、１２９頁］、公知の抗酸化剤である、１０
μＭのカンナビジオール（ＣＢＤ）とした［Hampsonら（１９９８年）、Proc.Nat.Acad.
Sci ９５巻：８２６８〜８２７３頁］。
６．陰性対照ウェルである過酸化水素のウェルも陽性対照ウェルも、いかなる薬物ビヒクルも含有しなかった。
Ｅ．アッセイ
この研究に使用したアッセイはどちらも、詳細に記載されている［Brenneman DE、Smith GR、Zhang Y、Du Y、Kondaveeti SK、Zdilla MJ、Reitz AB.（２０１２年） J. Molecular Neuroscience、４７巻：３６８〜３７９頁］。
１．ＣＦＤＡニューロン生存率アッセイ。このアッセイでは、ＣＦＤＡ色素はすべての生細胞により取り込まれ、エステラーゼによって切断されてフルオレセインを放出する。ニューロンはこの色素を取り除くことができないので、ニューロンの特異性が実現される一方、非ニューロン細胞からの色素の流出が、経時的に起こりうる。細胞外色素を洗い流した後、培養物を蛍光計で読み取った。細胞内色素の強度は、生存ニューロンの集団に比例する。元の参考文献：Petroski, REおよびGeller HM.（１９９４年） Selective labeling of embryonic neurons cultures on astrocyte monolayers with 5(6)-carboxyfluorescein diacetate(CFDA) J. Neurosci. Methods ５２巻：２３．３２頁。各実験の平均対照レベルは、長い破線の（longdashed）基準線として示されている。
２．ヨウ化プロピジウムを使用する細胞死アッセイは、同じウェル中、ＣＦＤＡアッセイと同時に行った。この色素は、生細胞から排除され、死細胞のＤＮＡに結合する。アッセイは、壊死およびアポトーシス細胞死の両方を検出する。このアッセイは、ニューロンの細胞死と非ニューロンの細胞死とを区別しない。Sarafian TA、Kouyoumjian S、Tashkin D、Roth MD.（２００２年）Tox. Letters. １３３巻：１７１〜１７９頁を参照
。平均対照レベルは、中度の破線の（medium-dashed）基準線として示されている。
３．使用試薬：
ａ． 過酸化水素溶液、３０重量％；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２１６７３６−１００ｍｌ、ロットＭＫＢＶ３８２Ｖ）
ｂ． Ａｌｄｅｙｒａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって提供されたＣａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）（ロット１７ＣＸ０１−ＨＱ−０００８８）
ｃ． ジメチルスルホキシド；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（４７２３０１−１００ｍｌ）バッチ２１０９６ＪＫ
ｄ． ヨウ化プロピジウム、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｐ４８６４−１０ｍｌ；水中１ｍｇ／ｍｌ溶液）
ｅ． ＣＦＤＡ［５（６）−カルボキシフルオレセイン二酢酸塩］Ｓｉｇｍａ−Ａｌ
ｄｒｉｃｈ製品番号：２１８７９−１００ｍｇ−Ｆ
ｆ． カンナビジオール溶液、エタノール中の１０ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号：９０８９９−１ｍｌ
ｇ． ダルベッコリン酸緩衝食塩水。Ｇｉｂｃｏ（１４１９０−１４４）ロット１１６５７６７
４．データ分析
ａ． データ取得：データは、分析のためＡｄｖａｎｃｅｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓのコンピューターに保存した。データ取得は、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒで行い、Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔ １１による分析のため、Ｅｘｃｅｌスプレッドシートに移した。
ｂ． 統計分析：データはすべて、対照群に対する多重比較（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ）法を用いる、分散分析によって統計学的に分析した。統計的有意性は、Ｐ＜０．０５レベルを採用した。すべての場合において、比較は陰性対照（１０μＭの過酸化水素処理）に対して行った。
ｃ． ＥＣ５０決定の方法論：
ｉ． ＥＣ５０効力分析においてＮＳ２をスクリーニングするため、幅広い濃度範囲を選択した。０．１μＭから１ｍＭまでの対数をベースとする濃度系列を使用し、ＥＣ５０を評価するために、半対数濃度を含むさらなる分析が必要となりうることを認識した。
ｉｉ．非線形回帰分析を使用して、データに最良に適合する線の方程式を決定した（４パラメーターロジスティック曲線）。
ｉｉｉ．以下のロジスティック方程式に基づいて、神経保護に関するＥＣ５０を算出し、両方のアッセイについて、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ １１によりプロットして、最大半量応答を生じるのに必要な濃度を決定した。ドロップラインを使用すると、ＥＣ５０を決定する軸交差点が示された。
４パラメーターロジスティック方程式
Figure 2021167358
これは、可変傾きパラメーターを用いる典型的な用量−応答曲線をもたらす。それは、時として、４ＰＬと略される。４つのパラメーターは、最小値（曲線の最下部）、最大値（曲線の最上部）である。ＥＣ５０＝最大有効応答の５０％を生じるリガンドの濃度。
５．結果のまとめ
表８は、ラットの海馬培養物における、ＮＳ２（すなわち、重水素化されていないＮＳ２）に関する保護研究のまとめを示している。
Figure 2021167358
６．実験知見および生データのグラフ分析
ａ．実験１：Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中の、マイクロミル粉砕したＮＳ２（ＣｏｒｅＲｘ）に対する用量応答。１０μＭの過酸化水素による共処理後の、ニューロンの生存率に対する効果。
ｉ．ＮＳ２供給源：マイクロミル粉砕したＣｏｒｅＲｘ
ｉｉ．製剤：初期ストックは、０．５％ Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中で製剤化した。
ｉｉｉ．アッセイ：ＣＦＤＡ
ｉｖ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｖ．処理の持続時間：５時間
ｖｉ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｖｉｉ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｖｉｉｉ．結論：ＥＣ５０は、６．８μＭにおいて観察された；対照（ＣＢＤ＋ＨＰおよび未処理対照）に対する完全有効性は、１００μＭ ＮＳ２において観察された。
ＮＳ２は、このアッセイでは、１００μＭで過酸化水素毒性に対して完全に神経保護性である。結果を、表９、ならびに図１８および１９に示す。
Figure 2021167358
ｂ．実験２：Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中の、マイクロミル粉砕したＮＳ２（ＣｏｒｅＲｘ）に対する用量応答。１０μＭの過酸化水素による共処理後の細胞死に対する効果。
ｉ．ＮＳ２供給源：ＣｏｒｅＲｘ（マイクロミル粉砕した）
ｉｉ．製剤：初期ストックは、０．５％ Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中で製剤化した。
ｉｉｉ．アッセイ：ヨウ化プロピジウム
ｉｖ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｖ．処理の持続時間：５時間
ｖｉ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｖｉｉ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｖｉｉｉ．結論：ＥＣ５０は、１．３μＭにおいて観察された；対照（ＣＢＤ＋ＨＰおよび未処理対照）に対する完全有効性は、１０μＭ ＮＳ２において観察された。
ＮＳ２は、このアッセイの場合、過酸化水素毒性に対して完全に神経保護性である。これらのデータは、細胞死に対する保護効果が、ニューロンの生存率に関して観察されたものよりもわずかに強力でありうることを示唆している。結果を、表１０、ならびに図２０および２１に示す。
Figure 2021167358
ｃ．実験３：ＤＭＳＯ中の、マイクロミル粉砕したＮＳ２（ＣｏｒｅＲｘ）に対する用
量応答。１０μＭの過酸化水素による共処理後の、ニューロンの生存率に対する効果。
ｉ．ＮＳ２供給源：ＣｏｒｅＲｘ（マイクロミル粉砕した）
ｉｉ．製剤：初期ストックは、１００％ ＤＭＳＯ中で製剤化した。
ｉｉｉ．アッセイ：ＣＦＤＡ
ｉｖ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｖ．処理の持続時間：５時間
ｖｉ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｖｉｉ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｖｉｉｉ．結論：ＥＣ５０は、９．８μＭにおいて観察された；対照（ＣＢＤ＋ＨＰおよび未処理対照）に対する完全有効性は、１００μＭ ＮＳ２において観察された。
製剤としてのＤＭＳＯの使用は、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）を用いて観察されたものに非常に類似したＥＣ５０を生じた。ＮＳ２は、このアッセイでは、過酸化水素毒性に対して完全に神経保護性である。結果を、表１１、ならびに図２２および２３に示す。
Figure 2021167358
ｄ．実験４：ＤＭＳＯ中の、マイクロミル粉砕したＮＳ２（ＣｏｒｅＲｘ）に対する用量応答。１０μＭの過酸化水素による共処理後の細胞死に対する効果。
ｉ．ＮＳ２供給源：ＣｏｒｅＲｘ（マイクロミル粉砕した）
ｉｉ．製剤：初期ストックは、１００％ ＤＭＳＯ中で製剤化した。
ｉｉｉ．アッセイ：ヨウ化プロピジウム
ｉｖ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｖ．処理の持続時間：５時間
ｖｉ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｖｉｉ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｖｉｉｉ．結論：ＥＣ５０は、１．３μＭにおいて観察された；対照（ＣＢＤ＋ＨＰおよび未処理対照）に対する完全有効性は、１０μＭ ＮＳ２において観察された。
ＮＳ２は、このアッセイの場合、過酸化水素毒性に対して完全に神経保護性である。これらのデータは、細胞死に対する保護効果が、ニューロンの生存率に関して観察されたものよりもわずかに強力でありうることを示唆している。結果を、表１２、ならびに図２４および２５に示す。
Figure 2021167358
ｅ．実験５：Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中の、ミル粉砕されていないＮＳ２（Ｊ−Ｓｔａｒ）に対する用量応答。１０μＭの過酸化水素による共処理後の、ニューロンの生存率に対する効果。
ｉ．ＮＳ２供給源：Ｊ−Ｓｔａｒ（ミル粉砕されていない）
ｉｉ．製剤：初期ストックは、０．５％ Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中で製剤化した。
ｉｉｉ．アッセイ：ＣＦＤＡ
ｉｖ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｖ．処理の持続時間：５時間
ｖｉ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｖｉｉ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｖｉｉｉ．結論：ＥＣ５０は、９．１μＭにおいて観察された；対照（ＣＢＤ＋ＨＰおよび未処理対照）に対する完全有効性は、１００μＭ ＮＳ２において観察された。
ＮＳ２は、このアッセイの場合、過酸化水素毒性に対して完全に神経保護性である。結果を、表１３、ならびに図２６および２７に示す。
Figure 2021167358
ｆ．実験６：Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中の、ミル粉砕されていないＮＳ２（Ｊ−
Ｓｔａｒ）に対する用量応答。１０μＭの過酸化水素による共処理後の細胞死に対する効果。
ｉ．ＮＳ２供給源：Ｊ−Ｓｔａｒ（ミル粉砕されていない）
ｉｉ．製剤：初期ストックは、０．５％ Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中で製剤化した。
ｉｉｉ．アッセイ：ヨウ化プロピジウム
ｉｖ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｖ．処理の持続時間：５時間
ｖｉ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｖｉｉ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｖｉｉｉ．結論：ＥＣ５０は、２．８μＭにおいて観察された；対照（ＣＢＤ＋ＨＰおよび未処理対照）に対する完全有効性は、１０μＭ ＮＳ２において観察された。
ＮＳ２は、このアッセイの場合、過酸化水素毒性に対して完全に神経保護性である。これらのデータは、細胞死に対する保護効果が、ニューロンの生存率に関して観察されたものよりもわずかに強力でありうることを示唆している。結果を、表１４、ならびに図２８および２９に示す。
Figure 2021167358
ｇ．実験７：ＤＭＳＯ中の、ミル粉砕されていないＮＳ２（Ｊ−Ｓｔａｒ）に対する用量応答。１０μＭの過酸化水素による共処理後の、ニューロンの生存率に対する効果。
ｉ．ＮＳ２供給源：Ｊ−Ｓｔａｒ（ミル粉砕されていない）
ｉｉ．製剤：初期ストックは、１００％ ＤＭＳＯ中で製剤化した。
ｉｉｉ．アッセイ：ＣＦＤＡ
ｉｖ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｖ．処理の持続時間：５時間
ｖｉ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｖｉｉ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｖｉｉｉ．結論：ＥＣ５０は、２．６μＭにおいて観察された；対照（ＣＢＤ＋ＨＰおよび未処理対照）に対する完全有効性は、１００μＭ ＮＳ２において観察された。
ＮＳ２は、このアッセイの場合、過酸化水素毒性に対して完全に神経保護性である。結果を、表１５、ならびに図３０および３１に示す。
Figure 2021167358
ｈ．実験８：ＤＭＳＯ中の、ミル粉砕されていないＮＳ２（Ｊ−Ｓｔａｒ）に対する用量応答。１０μＭの過酸化水素による共処理後の細胞死に対する効果。
ｉ．ＮＳ２供給源：Ｊ−Ｓｔａｒ（ミル粉砕されていない）
ｉｉ．製剤：初期ストックは、１００％ ＤＭＳＯ中で製剤化した。
ｉｉｉ．アッセイ：ヨウ化プロピジウム
ｉｖ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｖ．処理の持続時間：５時間
ｖｉ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｖｉｉ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｖｉｉ．結論：ＥＣ５０は、１．１μＭにおいて観察された；対照（ＣＢＤ＋ＨＰおよび未処理対照）に対する完全有効性は、１０μＭ ＮＳ２において観察された。
ＮＳ２は、このアッセイの場合、過酸化水素毒性に対して完全に神経保護性である。これらのデータは、細胞死に対する保護効果が、ニューロンの生存率に関して観察されたものよりもわずかに強力でありうることを示唆している。結果を、表１６、ならびに図３２および３３に示す。
Figure 2021167358
ｉ．実験９：製剤ビヒクルに対する用量応答。１０μＭの過酸化水素による共処理後の、ニューロンの生存率に対する効果。
ｉ．試験剤：Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）［Ｃａｐ；（５ｍｇ／ｍｌすなわち０．５％）］および１％ ＤＭＳＯ（ＤＭと略す；１％が使用した最高濃度であった）。製剤に使用した量は、ＮＳ２研究において使用したものと一致させた。
ｉｉ．アッセイ：ＣＦＤＡ
ｉｉｉ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｉｖ．処理の持続時間：５時間
ｖ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｖｉ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｖｉｉ．結論：ＮＳ２に関するものと同じ条件下で試験した場合の、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）またはＤＭＳＯのいずれかからのニューロンの生存率に対する検出可能な効果はなかった。結果を、表１７および１８、ならびに図３４に示す。
Figure 2021167358
Figure 2021167358
ｊ．実験１０：製剤ビヒクルに対する用量応答。１０μＭの過酸化水素による共処理後の細胞死に対する効果。
ｉ．試験剤：Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）［ＣＰ（５ｍｇ／ｍｌすなわち０．５％）］およびＤＭＳＯ（ＤＭと略す；１％が使用した最高であった）。
ｉｉ．アッセイ：ヨウ化プロピジウム
ｉｉｉ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｉｖ．処理の持続時間：５時間
ｖ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｖｉ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｖｉｉ．結論：ＮＳ２に関するものと同じ条件下で試験した場合の、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）またはＤＭＳＯのいずれかからの細胞死に対する検出可能な効果はなかった。結果を、表１９および２０、ならびに図３５に示す。
Figure 2021167358
Figure 2021167358
７．観察および結論のまとめ
Ａ． ＮＳ２は、両製剤（ＤＭＳＯおよびＣａｐｔｉｓｏｌ（登録商標））の場合および両化合物バッチ（それぞれミル粉砕されている、およびミル粉砕されていないＣｏｒｅＲｘおよびＪ−Ｓｔａｒ）の場合、ＣＦＤＡアッセイにおいて過酸化水素毒性に対して神経保護活性を示した。
Ｂ． ＣＦＤＡアッセイにおけるＮＳ２の神経保護効果は、対照（ＨＰ未処理）および陽性対照（ＣＢＤ）と等しく、完全保護を示した。
Ｃ． 対照に比べた完全保護は、ＣＦＤＡニューロン生存率アッセイにおける、１００μＭのＮＳ２でＮＳ２製剤とＮＳ２バッチの両方の場合に観察された一方、製剤とバッチのどちらに関しても、無効濃度は１μＭであった。
Ｄ． 非線形曲線当てはめロジスティック分析により、ＣＦＤＡニューロン生存率アッセイにおけるＮＳ２のＥＣ５０が、３〜１０μＭの範囲であることが示された。最良の利用可能なＥＣ５０の推測値は、Ｃａｐｔｉｓｏｌ（登録商標）中で製剤化されたＣｏｒｅＲｘ ＮＳ２（ミル粉砕）に由来し、これは、７±４μＭのＥＣ５０を示した。ＣＦＤＡアッセイに関する異なるＮＳ２製剤からのＥＣ５０はすべて、この範囲内にある。２種の化合物バッチおよび２種の製剤は、それらの実質的な類似性によって特徴付けられるというのが本発明者らの結論である。
Ｅ． ＮＳ２は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アッセイにおいて、過酸化水素毒性対して保護活性を示した。これは、両製剤の場合および両化合物バッチの場合で観察された。
Ｆ． ＰＩアッセイにおけるＮＳ２の保護効果は、対照（ＨＰ未処理）および陽性対照（ＣＢＤ）のものと等しく、完全保護を示した。
Ｇ． 未処理対照に比べた完全保護は、ＰＩアッセイにおける、１０μＭのＮＳ２でＮＳ２製剤とＮＳ２バッチの両方の場合に観察された一方、製剤およびバッチの両方の無効濃度は１μＭであった。それは、細胞死アッセイにおけるＮＳ２応答が、ＣＦＤＡアッセイにおけるよりも高い完全保護の効力を示したという知見に一致した。細胞死アッセイはニューロンに特異的ではないこと、およびこのモデルのＣＮＳ系に存在する非ニューロン細胞に影響を与えうることを認識すべきである。
Ｈ． 非線形ロジスティック曲線の当てはめは、ＰＩアッセイのＥＣ５０が１．１〜２．８μＭの範囲であることを示した。しかし、このアッセイによるロジスティック曲線が急勾配となる性質により、曲線の変曲点を定める一助となる半対数濃度応答の測定なしに推測することは困難であった。最良の利用可能な推測値は、すべてのＰＩデータに対する平均値であり、これは２±１μＭである。２種の化合物バッチおよび２種の製剤は、それらの実質的な類似性によって特徴付けられたというのが本発明者らの結論である。ＰＩアッセイにおける応答範囲が狭いために、ＥＣ５０の推測値を精査するために、さらなる分析が必要となりうる。これらのデータにより、ＮＳ２は、過酸化水素毒性に対するニューロンの生存率の増加におけるよりも、細胞死の予防においてより効力がありうることが示唆される。
Ｉ． １０μＭの過酸化水素によって生じた毒性シグナルは、過去に試験された多種多様な酸化ストレス因子（エタノール、重金属、酢酸アンモニウムおよびグルタメート）に典型的であり、対照からの低下は、３０〜５０％の範囲であった。
Ｊ． 陽性対照（１０μＭのカンナビジオール）は、すべての試験プレートにおいて活性であり、モデル系が、典型的な様式で応答していることを示した。
（実施例１３）
解離した海馬培養物における、過酸化水素毒性からの保護活性を評価する、３種の重水素化された化合物の用量応答
Ａ． 過酸化水素毒性から保護するための用量応答評価のための実験プラン
１． 試験剤：
ａ．ＡＬＤ−６−バッチ１（レガシーＩＤ：ＮＳ２−Ｄ６または化合物Ｉ−１）；使
用量：５．０ｍｇ；ＭＷ＝２４２．７３４
ｂ．ＡＬＤ−５−バッチ１（レガシーＩＤ：Ｄ３）；使用量：６．１ｍｇ；ＭＷ＝２０３．２４；
構造：
Figure 2021167358
 ｃ．ＡＬＤ−２−バッチ１レガシーＩＤ：Ｄ２）；使用量：５．６ｍｇ；ＭＷ＝２０３．２４；
構造：
Figure 2021167358
２． 製剤および保存溶液の調製
ａ．１００％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）をすべての試料に使用した。
ｂ．観察：
ｉ．ＡＬＤ−６：１００ｍＭの保存溶液とするため、（５ｍｇ、２０．６μｍｏｌ）のＡＬＤ−６を０．２０６ｍｌのＤＭＳＯに溶解した。１００ｍＭのＡＬＤ−６／ＤＭＳＯ溶液は透明であった。対数希釈は、ＤＰＢＳを用いて行った。ＤＰＢＳを用いて１：１０から１０ｍＭに希釈すると、この溶液は濁ったが、ボルテックス混合後、透明になった。一般に、初代ニューロン培養物におけるＤＭＳＯに関するベンチマーク濃度の目標は、ＤＭＳＯに由来する薬理的効果を回避するため、０．１％未満である。すべての試料を３００μＭ試験濃度とする場合、０．３％ ＤＭＳＯを使用したことに留意されたい。アッセイでは、５時間の試験後で明らかな毒性は観察されなかった。
ｉｉ．ＡＬＤ−５：１００ｍＭのＡＬＤ−５の保存溶液は、０．３ｍｌのＤＭＳＯに６．１ｍｇ（３０μｍｏｌ）を溶解することにより調製した。ＡＬＤ−５／ＤＭＳＯ混合物は、透明な黄色溶液であった。対数希釈は、ＤＰＢＳを用いて行った。ＤＰＢＳを用いて１：１０から１０ｍＭに希釈すると、溶液は透明な黄色溶液のままであった。
ｉｉｉ．ＡＬＤ−２：１００ｍＭのＡＬＤ−２の保存溶液は、０．２７５ｍｌのＤＭＳＯに５．６ｍｇ（２７．５５μｍｏｌ）を溶解することにより調製した。ＡＬＤ−２／ＤＭＳＯ混合物は、透明な琥珀色溶液であった。対数希釈は、ＤＰＢＳを用いて行った。ＤＰＢＳを用いて１：１０から１０ｍＭに希釈すると、溶液は透明な琥珀色溶液のままであった。
ｃ．保存溶液の調製に関する詳細：ＤＭＳＯ／ＤＰＢＳ中の化合物の希釈
ｉ．ストックＡは、１００％ ＤＭＳＯ中、１００ｍＭの化合物とした。
ｉｉ．ストックＢは、１０ｍＭの最終濃度とするため、５０μｌのストックＡを４５０μｌのＤＰＢＳに添加することにより調製した。３．３μｌを１００μｌのＤＰＢＳに添加して、０．３％ ＤＭＳＯ中、３００μＭの最終濃度を得た。
ｉｉｉ．ストックＣは、１ｍＭの最終濃度とするため、５０μｌのストックＢを４５０μｌのＤＰＢＳに添加することにより調製した。１０μｌを１００μｌのＤＰＢＳに添加して、０．１％ ＤＭＳＯ中、１００μＭの最終濃度を得た。
ｉｖ．ストックＤは、１００μＭの最終濃度とするため、５０μｌのストックＣを４５０μｌのＤＰＢＳに添加することにより調製した。１０μｌを１００μｌのＤＰＢＳ
に添加して、０．０１％ ＤＭＳＯ中、１０μＭの最終濃度を得た。
ｖ．ストックＥは、１０μＭの最終濃度とするため、５０μｌのストックＤを４５０μｌのＤＰＢＳに添加することにより調製した。１０μｌを１００μｌのＤＰＢＳに添加して、０．００１％ ＤＭＳＯ中、１μＭの最終濃度を得た。
ｖｉ．ストックＦは、１μＭの最終濃度とするため、５０μｌのストックＥを４５０μｌのＤＰＢＳに添加することにより調製した。０．０００１％ ＤＭＳＯ中、０．１μＭの最終濃度とするため、１０μｌを１００μｌのＤＰＢＳに添加した。
ｖｉｉ．ウェル中の全体積を１００μｌとするため、適切な希釈液１０μｌを９０μｌに添加した。
３． 過酸化水素と関連する酸化ストレスからの神経保護を検出するために設計した培養条件：
ａ．ラットの海馬培養物は、以前に記載されている通り調製した（Brenneman DE、Smith GR、Zhang Y、Du Y、Kondaveeti SK、Zdilla MJ、Reitz AB.（２０１２年）
J. Molecular Neuroscience、４７巻：３６８〜３７９頁）。これらの条件下では、
培養物は、少なくとも９０％がニューロン性である。最も多量の非ニューロン細胞は、星状細胞である。ラットＥ１８の海馬組織は、Ｂｒａｉｎ Ｂｉｔｓ，ＬＬＣ（Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ ＩＬ）から購入した。組織は、輸送のため、Ｈｉｂｅｒｎａｔｅ Ｅ培地中で保存した。
ｂ．培養物はすべて、ウェル当たり、１０Ｋ個の細胞のプレート培養密度で、９６ウェルフォーマットに調製した。培養物は、Ｅ１８海馬組織の解離後、１０日目から２１日目の間、処理した。これらの実験の場合、プレートはすべて、１３日目に処理した。すべての実験では、試験剤または陽性対照（カンナビジオール）により処理して１０分後に、過酸化水素を培養物に添加した。各処理条件に関して、反復回数は５回とした。
ｃ．培養物はすべて、Ｂ２７／神経基礎培地中でプレート培養した。処理の当日、培養物はすべて、培地を、抗酸化剤を含まない血清不含のＢ２７／神経基礎培地に完全に変更した。
ｄ．以前に決定されている通り（Brennemanら、２０１２年）、１０μＭの過酸化水
素を使用して、毒性および酸化ストレスを生じさせた。以前に記載されている通り（Jarrett, SG、Liang, L-P、Hellier, JL、Staley, KJおよびPatel, M.（２００８年）Neurobiol. Dis ３０巻（１号）：１３０〜１３８頁）、１０μＭの過酸化水素が、てん
かん重積状態のカイニン酸モデルによるラットの海馬において観察された。
ｅ．すべての研究において使用した陽性対照は、初代ニューロンにおける酸化ストレスに対して保護する（Brenneman, DE、Petkanas, DおよびKinney, W.A.（２０１４年
）Annual Symposium on the Cannabinoids、１２９頁）、公知の抗酸化剤である、１０μＭのカンナビジオールとした（Hampsonら（１９９８年）、Proc.Nat.Acad. Sci.
９５巻：８２６８〜８２７３頁）。
ｆ．陰性対照ウェルである過酸化水素ウェルも陽性対照ウェルも、いかなる薬物ビヒクルも含有しなかった。
４． アッセイ：
この研究に使用したアッセイはどちらも、詳細に記載されている（Brenneman DE、Smith GR、Zhang Y、Du Y、Kondaveeti SK、Zdilla MJ、Reitz AB.（２０１２年）J.
Molecular Neuroscience、４７巻：３６８〜３７９頁）。
ａ．ＣＦＤＡニューロン生存率アッセイ：このアッセイでは、ＣＦＤＡ色素はすべての生細胞により取り込まれ、エステラーゼによって切断されてフルオレセインを放出する。ニューロンはこの色素を取り除くことができないので、ニューロンの特異性が実現される一方、非ニューロン細胞からの色素の流出が、経時的に起こりうる。細胞外色素を洗い流した後、培養物を蛍光計で読み取った。細胞内色素の強度は、生存ニューロンの集団に
比例する。元の参考文献：Petroski, REおよびGeller HM（１９９４年）「Selective labeling of embryonic neurons cultures on astrocyte monolayers with 5(6)-carboxyfluorescein diacetate(CFDA)」J. Neurosci. Methods ５２巻：２３．３
２頁。各実験の平均対照レベルは、長い破線の基準線として示されている。
ｂ．ヨウ化プロピジウムを使用する細胞死アッセイは、同じウェル中、ＣＦＤＡアッセイと同時に行った。この色素は、生細胞から排除され、死細胞のＤＮＡに結合する。アッセイは、壊死およびアポトーシス細胞死の両方を検出する。このアッセイは、ニューロンの細胞死と非ニューロンの細胞死とを区別しない。Sarafian TA、Kouyoumjian S、Tashkin D、Roth MD.（２００２年）Tox. Letters. １３３巻：１７１〜１７９頁を参
照。平均対照レベルは、赤色の中度の破線の基準線として示されている。
ｃ．使用試薬
ｉ． 過酸化水素溶液、３０重量％；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（２１６７３６−１００ｍｌ、ロットＭＫＢＶ３８２Ｖ）
ｉｉ．ジメチルスルホキシド；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（４７２３０１−１００ｍｌ）バッチ２１０９６ＪＫ
ｉｉｉ．ヨウ化プロピジウム；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｐ４８６４−１０ｍｌ；水中１ｍｇ／ｍｌ溶液）
ｉｖ．ＣＦＤＡ［５（６）−カルボキシフルオレセイン二酢酸塩］Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号：２１８７９−１００ｍｇ−Ｆ
ｖ．カンナビジオール溶液、エタノール中の１０ｍｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号：９０８９９−１ｍｌ
ｖｉ．ダルベッコリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ）。Ｇｉｂｃｏ（１４１９０−１４４）ロット１１６５７６７
５． データ分析
ａ． データ取得：データは、分析のためＡｄｖａｎｃｅｄ Ｎｅｕｒａｌ Ｄｙｎａｍｉｃｓのコンピューターに保存した。データ取得は、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ Ｆｌｕｏｒｉｍｅｔｅｒで行い、Ｓｉｇｍａ Ｐｌｏｔ １１による分析のため、Ｅｘｃｅｌスプレッドシートに移した。
ｂ． 統計分析：データはすべて、対照群に対する多重比較（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ）法を用いる、分散分析によって統計学的に分析した。統計的有意性は、Ｐ＜０．０５レベルを採用した。すべての場合において、比較は陰性対照（１０μＭの過酸化水素処理）に対して行った。
ｃ． ＥＣ５０決定の方法論：
ｉ． ＥＣ５０効力分析において化合物をスクリーニングするため、幅広い濃度範囲を選択した。０．１μＭから３００μＭまでの対数をベースとする濃度系列を使用した。
ｉｉ．非線形回帰分析を使用して、データに最良に適合する線の方程式を決定した（４パラメーターロジスティック曲線）。
ｉｉｉ．上述の実施例において使用したロジスティック方程式に基づいて、神経保護に関するＥＣ５０を算出し、両方のアッセイについて、ＳｉｇｍａＰｌｏｔ １１によりプロットして、最大半量応答を生じるのに必要な濃度を決定した。ドロップラインを使用すると、ＥＣ５０を決定する軸交差点が示された。
Ｂ．ラットの海馬培養物におけるＡｌｄｅｙｒａの化合物に関する保護研究のまとめ
Figure 2021167358
Ｃ．実験知見および生データのグラフ分析
１．実験１：ＡＬＤ−６の用量応答。１０μＭの過酸化水素による共処理後の、ニューロンの生存率に対する効果。
ａ．製剤：ＤＭＳＯ
ｂ．アッセイ：ＣＦＤＡ
ｃ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｄ．処理の持続時間：５時間
ｅ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｆ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｇ．結論：ＥＣ５０は、６．８±１．２μＭにおいて観察された；対照（ＣＢＤ＋ＨＰおよび未処理対照）に対する完全有効性は、１００μＭ ＡＬＤ−６において観察された。ＡＬＤ−６は、このアッセイでは、１００μＭで過酸化水素毒性に対して完全に神経保護性である。結果を、表２２、ならびに図３６および３７に示す。
Figure 2021167358
２．実験２：１０μＭの過酸化水素による共処理後の、細胞死に対するＡＬＤ−６の用量応答効果
ａ．製剤：ＤＭＳＯ
ｂ．アッセイ：ヨウ化プロピジウム
ｃ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｄ．処理の持続時間：５時間
ｅ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｆ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｇ．結論：ＥＣ５０は、０．３２±０．０３μＭにおいて観察された；対照（ＣＢＤ＋ＨＰおよび未処理対照）に対する完全有効性は、１０μＭ ＡＬＤ−６において観察された。ＡＬＤ−６は、このアッセイでは、過酸化水素毒性に対して完全に神経保護性である。これらのデータは、細胞死に対する保護効果が、ニューロンの生存率に関して観察されたものよりも強力であることを示唆している。結果を、表２３、ならびに図３８および３９に示す。
Figure 2021167358
３．実験３：ＤＭＳＯ中のＡＬＤ−５に対する用量応答。１０μＭの過酸化水素による共処理後の、ニューロンの生存率に対する効果。
ａ．製剤：ＤＭＳＯ
ｂ．アッセイ：ＣＦＤＡ
ｃ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｄ．処理の持続時間：５時間
ｅ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｆ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｇ．結論：ＡＬＤ−５からの、０．１〜３００μＭでの過酸化水素毒性に対する統計的に有意な神経保護活性はなかった。結果を、表２４および図４０に示す。
Figure 2021167358
４．実験４：ＡＬＤ−５に対する用量応答。１０μＭの過酸化水素による共処理後の、細胞死に対する効果。
ａ．製剤：ＤＭＳＯ
ｂ．アッセイ：ヨウ化プロピジウム
ｃ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｄ．処理の持続時間：５時間
ｅ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｆ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｇ．結論：０．１〜３００μＭのＡＬＤ−５からの、細胞死からの統計的に有意な保護はなかった。結果を、表２５および図４１に示す。
Figure 2021167358
５．実験５：ＡＬＤ−２に対する用量応答。１０μＭの過酸化水素による共処理後の、ニューロンの生存率に対する効果。
ａ．製剤：ＤＭＳＯ
ｂ．アッセイ：ＣＦＤＡ
ｃ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｄ．処理の持続時間：５時間
ｅ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｆ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｇ．結論：ＡＬＤ−２は、過酸化水素処理培養物における、ニューロンの生存率の減少からの統計的に有意な神経保護を有しなかった。結果を、表２６および図４２に示す。
Figure 2021167358
６．実験６：ＡＬＤ−２に対する用量応答。１０μＭの過酸化水素による共処理後の、細胞死に対する効果。
ａ．製剤：ＤＭＳＯ
ｂ．アッセイ：ヨウ化プロピジウム
ｃ．毒素：１０μＭの過酸化水素
ｄ．処理の持続時間：５時間
ｅ．成長培地：抗酸化剤を含まないＢ２７／神経基礎培地
ｆ．培養マトリックス：ポリ−Ｌ−リシン
ｇ．結論：ＡＬＤ−２による処理後の過酸化水素によって生じた細胞死からの統計的に有意な保護はなかった。結果を、表２７および図４３に示す。
Figure 2021167358
７．観察および結論のまとめ
ａ． ＡＬＤ−６は、ＣＦＤＡアッセイにおける、過酸化水素毒性に対して神経保護活性を示した。
ｂ． ＣＦＤＡアッセイにおけるＡＬＤ−６の神経保護効果は、対照（ＨＰ未処理）値および陽性対照（ＣＢＤ）値と統計的に差異はなく、完全保護を示した。
ｃ． 対照に比べた完全保護は、ＣＦＤＡニューロン生存率アッセイにおいて、１００μＭのＡＬＤ−６で観察された。ＣＦＤＡアッセイにおけるＡＬＤ−６の無効濃度は１μＭであった。
ｄ． 非線形曲線当てはめロジスティック分析により、ＣＦＤＡニューロン生存率アッセイにおけるＡＬＤ−６のＥＣ５０が、６．８±１．２μＭであることが示された。
ｅ．ＡＬＤ−６は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アッセイにおける、過酸化水素処理からの、細胞死からの防御活性を示した。
ｆ． ＰＩアッセイにおける細胞死からのＡＬＤ−６の保護効果は、対照（ＨＰ未処理）値および陽性対照（ＣＢＤ）値のものと統計的に差異はなく、完全保護を示した。
ｇ． 未処理対照の値に比べた完全保護は、ＰＩアッセイにおいて、１０μＭのＡＬＤ−６の場合に観察された一方、無効濃度は０．１μＭであった。細胞死アッセイにおけるＡＬＤ−６の応答は、ＣＦＤＡアッセイにおけるよりも高い効力を示した。細胞死アッセイはニューロンに特異的ではないこと、およびこのモデルＣＮＳ系に存在する非ニューロン細胞に影響を与えうることを認識すべきである。
ｈ． 非線形ロジスティック曲線の当てはめは、ＰＩアッセイにおけるＡＬＤ−６のＥＣ５０が０．３２±０．０３μＭであることを示した。
ｉ． ０．１〜３００μＭのＡＬＤ−５またはＡＬＤ−２による処理は、ＣＦＤＡア
ッセイにより評価される通り、過酸化水素処理単独からの統計的に有意な神経保護を生じなかった。
ｊ． ０．１〜３００μＭのＡＬＤ−５またはＡＬＤ−２による処理は、ＰＩアッセイにより評価される通り、過酸化水素処理により生じる細胞死からの統計的に有意な保護を生じなかった。
ｋ． １０μＭの過酸化水素によって生じた毒性シグナルは、過去に試験された多種多様な酸化ストレス因子（エタノール、重金属、酢酸アンモニウムおよびグルタメート）に典型的であり、対照からの低下は、３０〜５０％の範囲であった。
ｌ． 陽性対照（１０μＭのカンナビジオール）は、すべての試験プレートにおいて活性であり、モデル系は、典型的な保護的様式で応答していることを示した。
（実施例１４）
ＮＳ２−Ｄ６（化合物Ｉ−１）のｉｎ ｖｉｖｏ薬理
結合および酵素取り込みアッセイにおいて、ＮＳ２−Ｄ６（化合物ＩＤ １０００２９０５４−１；バッチ番号１６０３３５６１９１）を試験した。化合物の結合は、各標的に特異的な放射活性的に標識されているリガンドの結合の％阻害として算出した。化合物の酵素阻害効果は、対照の酵素活性の％阻害として計算した。５０％を超える阻害または刺激を示す結果は、試験化合物の有意な効果を示すと考えられる。このような効果が、ここで観察され、以下の表に列挙されている。
参照化合物
各実験において、および適用可能な場合、それぞれの参照化合物は、ＮＳ２−Ｄ６と同時に試験し、データを、同じ研究施設において決定された過去の値と比較した。この実験は、業界の標準作業手順書に従って行った。
結果
表２８に、酵素の阻害結果をまとめる。
Figure 2021167358
試験化合物の結果を図４４〜４６に示す。表２９は、ＮＳ２−Ｄ６の特異的結合結果を示す。
Figure 2021167358
Figure 2021167358
Figure 2021167358
Figure 2021167358
Figure 2021167358
表３０は、ＮＳ２−Ｄ６と比較した様々な参照化合物のＩＣ５０値、Ｋｉ値およびｎＨ値を示す。
Figure 2021167358
Figure 2021167358
Figure 2021167358
Figure 2021167358
Figure 2021167358
図４７は、ＮＳ２−Ｄ６に関する酵素および取り込みアッセイにおける、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの薬理的結果のヒストグラムを示す。
表３１は、ＮＳ２−Ｄ６に関する対照値に対する％阻害を示す。
Figure 2021167358
Figure 2021167358
表３２は、参照化合物のＩＣ５０値およびｎＨ値を示す。
Figure 2021167358
Figure 2021167358
表３３は、グアニリルシクラーゼに対するＮＳ２−Ｄ６の試験化合物の結果を示す。
Figure 2021167358
表３４は、グアニリルシクラーゼに対する参照化合物のＥＣ５０の結果を示す。
Figure 2021167358
５０％を超える阻害（または基本条件で行ったアッセイの場合、刺激）を示す結果は、試験化合物の有意な効果を示すと考えられる。５０％は、さらなる調査に対する最も一般的なカットオフ値である（濃度−応答曲線からのＩＣ５０値またはＥＣ５０値の決定）。２５％〜５０％の間の阻害（または刺激）を示す結果は、弱い効果から中程度の効果を示す（大部分のアッセイにおいて、それらは、より多くの実験間ばらつきが起こりうる範囲内にあるので、さらなる試験によって確認されるべきである）。２５％未満の阻害（または刺激）を示す結果は、有意であるとは考えられず、対照レベル付近のシグナルのばらつきに大部分、起因する。
低〜中程度の負の値は、真の意味を有しておらず、対照レベル付近のシグナルのばらつきに起因している。高濃度の試験化合物の場合に、時として得られる高い負の値（≧５０％）は、一般に、アッセイにおいて、試験化合物の非特異的効果に起因している。まれな場合、それらは、試験化合物のアロステリック効果を示唆することがある。
実験条件
表３５に、結合アッセイ条件をまとめる。
Figure 2021167358
Figure 2021167358
Figure 2021167358
Figure 2021167358
Figure 2021167358
Figure 2021167358
Figure 2021167358
表３６は、酵素および取り込みアッセイ条件を示す。
Figure 2021167358
Figure 2021167358
Figure 2021167358
分析および結果の表現
ｉｎ ｖｉｔｒｏ薬理：結合アッセイ
結果は、対照の特異的結合に対するパーセントとして表される：（測定された特異的結合／対照の特異的結合）×１００；および対照の特異的結合に対する阻害パーセントとして表される：１００−（（測定された特異的結合／対照の特異的結合）×１００）（ＮＳ２−Ｄ６の存在下で得た）。
ＩＣ５０値（対照の特異的結合に対する最大半量阻害を引き起こす濃度）およびヒル係数（ｎＨ）は、ヒルの方程式の曲線当てはめを使用する、反復値の平均を用いて生成する競合曲線の非線形回帰分析によって決定した：
Figure 2021167358
（式中、Ｙ＝特異的結合、Ａ＝曲線の左側の漸近線、Ｄ＝曲線の右側の漸近線、Ｃ＝化合物濃度、Ｃ５０＝ＩＣ５０、およびｎＨ＝傾き係数）。この分析は、Ｃｅｒｅｐ（Ｈｉｌｌソフトウェア）において開発されたソフトウェアを使用して行い、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（（著作権）１９９７年、ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．）向けの市販のソフトウェアであるＳｉｇｍａＰｌｏｔ（登録商標）４．０によって生成したデータと比較することにより、検証した。阻害定数（Ｋｉ）は、Ｃｈｅｎｇ Ｐｒｕｓｏｆｆ方程式を使用して算出した：
Figure 2021167358
（式中、Ｌ＝アッセイにおける放射性リガンドの濃度、およびＫＤ＝受容体に対する放射性リガンドの親和力）。スキャッチャードプロットを使用してＫＤを決定する。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ薬理：酵素および取り込みアッセイ
結果は、対照の比活性に対するパーセントとして表される：（測定された比活性／対照の比活性）×１００；および対照の比活性に対する阻害パーセントとして表される：１００−（（測定された比活性／対照の比活性）×１００）（ＮＳ２−Ｄ６の存在下で得た）。
ＩＣ５０値（対照の比活性に対する最大半量阻害を引き起こす濃度）、ＥＣ５０値（対照の基本活性の最大半量の増加を生じる濃度）およびヒル係数（ｎＨ）は、ヒルの方程式の曲線当てはめを使用する、反復値の平均を用いて生成する阻害／濃度−応答曲線の非線形回帰分析によって決定した：
Figure 2021167358
（式中、Ｙ＝比活性、Ａ＝曲線の左側の漸近線、Ｄ＝曲線の右側の漸近線、Ｃ＝化合物濃度、Ｃ５０＝ＩＣ５０またはＥＣ５０、およびｎＨ＝傾き係数）。この分析は、Ｃｅｒｅｐ（Ｈｉｌｌソフトウェア）において開発されたソフトウェアを使用して行い、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）（（著作権）１９９７年、ＳＰＳＳ Ｉｎｃ．）向けの市販のソフトウェアであるＳｉｇｍａＰｌｏｔ（登録商標）４．０によって生成したデータと比較することにより、検証した。
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本発明の好ましい実施形態によれば、例えば、以下が提供される。
（項１）
式Ｉの化合物：
Figure 2021167358
または薬学的に許容されるその塩
（式中、
Ｒ １ は、−ＮＨ ２ 、−ＮＨＤまたは−ＮＤ ２ から選択され、
Ｒ ２ は、水素または重水素から選択され、
Ｒ ３ およびＲ ４ は、−ＣＨ ３ 、−ＣＨ ２ Ｄ、−ＣＨＤ ２ または−ＣＤ ３ から独立して選択され、
Ｒ ５ 、Ｒ ６ 、Ｒ ７ およびＲ ８ は、水素または重水素からそれぞれ独立して選択され、
ただし、Ｒ １ 、Ｒ ２ 、Ｒ ３ 、Ｒ ４ 、Ｒ ５ 、Ｒ ６ 、Ｒ ７ またはＲ ８ のうちの少なくとも１つは、重水素であるか、または重水素を含有する）。
（項２）
Ｒ １ が−ＮＨ ２ である、上記項１に記載の化合物。
（項３）
Ｒ １ が−ＮＨＤである、上記項１に記載の化合物。
（項４）
Ｒ １ が−ＮＤ ２ である、上記項１に記載の化合物。
（項５）
Ｒ ２ が水素である、上記項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
（項６）
Ｒ ２ が重水素である、上記項１から４のいずれか一項に記載の化合物。
（項７）
Ｒ ３ が−ＣＨ ３ である、上記項１から６のいずれか一項に記載の化合物。
（項８）
Ｒ ３ が−ＣＨ ２ Ｄである、上記項１から６のいずれか一項に記載の化合物。
（項９）
Ｒ ３ が−ＣＨＤ ２ である、上記項１から６のいずれか一項に記載の化合物。
（項１０）
Ｒ ３ が−ＣＤ ３ である、上記項１から６のいずれか一項に記載の化合物。
（項１１）
Ｒ ４ が−ＣＨ ３ である、上記項１から１０のいずれか一項に記載の化合物。
（項１２）
Ｒ ４ が−ＣＨ ２ Ｄである、上記項１から１０のいずれか一項に記載の化合物。
（項１３）
Ｒ ４ が−ＣＨＤ ２ である、上記項１から１０のいずれか一項に記載の化合物。
（項１４）
Ｒ ４ が−ＣＤ ３ である、上記項１から１０のいずれか一項に記載の化合物。
（項１５）
Ｒ ５ 、Ｒ ６ 、Ｒ ７ およびＲ ８ のそれぞれが、水素である、上記項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
（項１６）
Ｒ ５ 、Ｒ ６ 、Ｒ ７ およびＲ ８ のうちの１つが、重水素である、上記項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
（項１７）
Ｒ ５ 、Ｒ ６ 、Ｒ ７ およびＲ ８ のうちの２つが重水素である、上記項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
（項１８）
Ｒ ５ 、Ｒ ６ 、Ｒ ７ およびＲ ８ のうちの３つが重水素である、上記項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
（項１９）
Ｒ ５ 、Ｒ ６ 、Ｒ ７ およびＲ ８ のそれぞれが、重水素である、上記項１から１４のいずれか一項に記載の化合物。
（項２０）
Ｒ ５ 、Ｒ ６ 、Ｒ ７ およびＲ ８ のそれぞれが、以下の項目の１つにおいて定義されている通りである、上記項１から１９のいずれか一項に記載の化合物。
Figure 2021167358
（項２１）
以下の構造のいずれか１つ：
Figure 2021167358

Figure 2021167358

Figure 2021167358

Figure 2021167358
から選択される、上記項１に記載の化合物、
または薬学的に許容されるその塩。
（項２２）
上記項１から２１のいずれか一項に記載の化合物、および薬学的に許容されるアジュバント、キャリアまたはビヒクルを含む組成物。
（項２３）
追加の治療剤と組み合わせた、上記項２２に記載の組成物。
（項２４）
被験体における、黄斑変性、ならびにその病因にＡ２Ｅおよび／またはリポフスチンの蓄積が関与する網膜疾患の他の形態を処置する方法であって、該方法は、上記項１から２３のいずれかに記載の化合物または薬学的に許容されるその塩を含む組成物を該被験体に投与することを含み、該投与することにより、該組成物を投与していない前記被験体におけるＡ２Ｅ蓄積のレベルに比べてＡ２Ｅ蓄積のレベルを低減させる、方法。
（項２５）
アルデヒド毒性が関係している疾患、障害、状態、または美容上の徴候を処置し、予防し、またはそのリスクを低減することを必要とする被験体において、アルデヒド毒性が関係している疾患、障害、状態、または美容上の徴候を処置し、予防し、またはそのリスクを低減する方法であって、該被験体に、上記項１から２３のいずれかに記載の化合物を含む組成物を局所にまたは全身に投与することを含む、方法。
（項２６）
前記疾患、障害、または状態が眼の障害である、上記項２５に記載の方法。
（項２７）
前記疾患、障害、または状態が、黄斑変性またはシュタルガルト病から選択される、上記項２６に記載の方法。
（項２８）
前記眼の障害が、ドライアイ症候群、白内障、円錐角膜、水疱性角膜症および他の角膜症、フックス内皮ジストロフィー、アレルギー性結膜炎、眼性瘢痕性類天疱瘡、ＰＲＫの治癒および他の角膜の治癒と関連する状態、涙液脂質の分解または涙腺機能障害と関連する状態、ブドウ膜炎、強膜炎、眼のスティーブンスジョンソン症候群、ならびに眼性酒さからなる群から選択される、上記項２６に記載の方法。
（項２９）
前記眼の障害が、ドライアイ症候群である、上記項２８に記載の方法。
（項３０）
前記眼の障害が、ＰＲＫの治癒および他の角膜の治癒と関連する状態である、上記項２８に記載の方法。
（項３１）
前記眼の障害が、ブドウ膜炎、強膜炎、眼のスティーブンスジョンソン症候群、および眼性酒さからなる群から選択される、上記項２８に記載の方法。
（項３２）
前記眼の障害が、眼性酒さまたはブドウ膜炎である、上記項３１に記載の方法。
（項３３）
前記眼の障害が、円錐角膜、白内障、水疱性角膜症および他の角膜症、フックス内皮ジストロフィー、眼性瘢痕性類天疱瘡、ならびにアレルギー性結膜炎からなる群から選択される、上記項２８に記載の方法。
（項３４）
前記疾患、障害、または状態が、乾癬、局部（円板状）狼瘡、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、放射線皮膚炎、尋常性座瘡、シェーグレン−ラルソン症候群および他の魚鱗癬からなる群から選択される皮膚の疾患、障害、または状態であり、前記美容上の徴候が、日光弾力線維症／しわ、肌の張りと弾力、腫脹、湿疹、喫煙または刺激物質誘発性皮膚変化、皮膚切開、および火傷または創傷が関連する皮膚状態からなる群から選択される、上記項２５に記載の方法。
（項３５）
前記皮膚の疾患、障害、または状態が、乾癬、強皮症、局部（円板状）狼瘡、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、放射線皮膚炎、尋常性座瘡、ならびにシェーグレン−ラルソン症候群および他の魚鱗癬からなる群から選択される、上記項３４に記載の方法。
（項３６）
前記皮膚の疾患、障害、または状態が、接触性皮膚炎、アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、または放射線皮膚炎である、上記項３５に記載の方法。
（項３７）
前記皮膚の疾患、障害、または状態が、シェーグレン−ラルソン症候群である、上記項３５に記載の方法。
（項３８）
前記美容上の徴候が、日光弾力線維症／しわ、肌の張りと弾力、腫脹、湿疹、喫煙または刺激物質誘発性皮膚変化、皮膚切開、および火傷または創傷が関連する皮膚状態からなる群から選択される、上記項３４に記載の方法。
（項３９）
前記疾患、障害、または状態が、びらん剤の毒性作用またはアルカリ剤からの火傷と関連する状態である、上記項２５に記載の方法。
（項４０）
前記びらん剤が、サルファマスタード、ナイトロジェンマスタード、またはホスゲンオキシムである、上記項３９に記載の方法。
（項４１）
前記アルカリ剤が、石灰、灰汁、アンモニア、または排水管洗浄剤である、上記項３９に記載の方法。
（項４２）
前記疾患、障害、または状態が、自己免疫性、免疫媒介性、炎症性、心血管性、もしくは神経系の疾患、または糖尿病、メタボリックシンドローム、もしくは線維性疾患である、上記項２５に記載の方法。
（項４３）
前記疾患、障害、または状態が、狼瘡、強皮症、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血症、アテローム性動脈硬化症、虚血再灌流傷害、パーキンソン病、アルツハイマー病、コハク酸セミアルデヒド脱水素酵素欠損症、多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症からなる群から選択される、上記項４２に記載の方法。
（項４４）
前記線維性疾患が、腎臓、肝臓、肺、または心臓の線維症である、上記項４２に記載の方法。
（項４５）
前記疾患、障害、または状態が、加齢関連疾患、障害または状態である、上記項２５に記載の方法。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。

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