KR20180053316A

KR20180053316A - 항 garp 항체

Info

Publication number: KR20180053316A
Application number: KR1020187008255A
Authority: KR
Inventors: 가즈키 사토; 가즈키 히라하라; 이치로 와타나베; 마사토 아마노
Original assignee: 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤
Priority date: 2015-09-24
Filing date: 2016-09-23
Publication date: 2018-05-21
Also published as: US20180258184A1; IL302932A; IL258322B1; SG11201802352VA; HK1254310A1; CN108026521A; MY194586A; RU2769379C2; US20180327511A1; AU2022231706A1; TWI751979B; JP2020202875A; AU2016325858B2; FI3354729T3; MX2023003470A; US20220010026A1; JP6878283B2; JP6868739B2; JPWO2017051888A1; CN108026521B

Abstract

본 발명은, 종양의 치료제로서 유용한 GARP 에 결합하는 항체, 및 당해 항체를 사용한 종양의 치료법 등에 관한 것이다. 본 발명의 과제는, 종양에 있어서의 Treg 의 기능을 저해함으로써 치료 효과를 갖는 의약품이 되는 항체, 및 당해 항체를 사용한 종양의 치료 방법 등을 제공하는 것이다. GARP 에 결합하여 Treg 기능 저해 활성 및 ADCC 활성을 나타내는 항 GARP 항체를 얻고, 당해 항체를 함유하는 종양 치료용 의약 조성물 등을 얻는다.

Description

항 GARP 항체

본 발명은 종양의 치료제로서 유용한 GARP 에 결합하는 항체, 및 당해 항체를 사용한 종양의 치료법에 관한 것이다.

제어성 T 세포 (Treg) 는, 암환자의 종양역에서 관찰되는 면역 관용을 초래하는 주된 원인 세포이다. 즉, 암환자는, 종양에 의해 활성화된 Treg 에 의해, 본래 작용해야 할 항종양 면역 세포군이 억제되어 있는 상태에 있으며, 이 점이 종양의 악성화로 연결된다 [비특허문헌 1].

Glycoprotein-A Repetitions Predominant (GARP) 는, 1 회 막관통 구조를 갖는 단백질이고 [비특허문헌 2], 활성화된 Treg 의 세포 표면에 발현하여, 잠재형 (latent) TGF-β (면역 관용 유도의 중요 분자인 TGF-β 의 전구체) 와의 복합체를 형성한다 [비특허문헌 3].

Treg 와, Treg 가 면역 억제를 초래하는 표적 세포의 세포-세포간 상호 작용에 의해, GARP 를 통해서 Treg 의 세포 표면에 고정되어 있는 잠재형 TGF-β 로부터 성숙화 TGF-β 가 분비되어, TGF-β 의 면역 억제 시그널이 표적 세포에 직접 전달된다 [비특허문헌 4, 5]. 이 TGF-β 의 성숙화에는 GARP 의 세포막 상에서의 발현이 필요하다는 것이 나타나 있지만 [비특허문헌 5], 한편 막관통 영역을 결손한 가용성 GARP 를 CD4 양성 T 세포에 직접 첨가했을 경우에도 CD4 양성 T 세포의 증식이 억제되므로 [비특허문헌 6], 세포막 상에서의 TGF-β 성숙화 기구를 개재하지 않는, GARP 에 의한 면역 억제 메커니즘의 존재도 부정할 수 없다.

GARP 는, 말초혈 유래 활성화 Treg 에 발현이 관찰되는 것 외에, 임상적으로는 암환자의 종양 환부에 침윤된 T 세포 (Tumor Infiltrating Tcells) 중에 존재하는 Treg [비특허문헌 7], 및 복수 중에 존재하는 Treg [비특허문헌 8], 또는 환자 말초혈 중에 존재하는 Treg 에서의 발현이 관찰된다 [비특허문헌 9].

GARP 의 발현을 억제했을 때의 Treg 기능에의 영향을 검토한 보고로서, GARP 에 대한 siRNA 를 도입한 Treg 에서는, 헬퍼 T 세포에 대한 증식 억제 기능의 저해가 관찰되었지만, 당해 저해 효과는 부분적이었다 [비특허문헌 10].

한편, TGF-β 성숙화의 저해능을 지표로 획득된 항 GARP 항체 (MHG-8, LHG-10) 는, 헤모크로마토시스 환자로부터 수립한 Treg A1 세포주 [비특허문헌 11] 의 헬퍼 T 세포에 대한 증식 억제 기능을 저해시켰다 [특허문헌 1, 비특허문헌 12]. 그러나, 당해 항체가 종양 미소 환경하의 Treg 에 대해 당해 저해 효과를 유효하게 나타내는지의 여부는 분명하지 않고, 또 지금까지 그러한 효과를 갖는 항 GARP 항체의 보고는 없다. 또한 GARP 및 TGF-β 의 양자를 인식하는 항체도 알려져 있다 [특허문헌 2].

Treg 에 대해서는, 종양 외에도, 말라리아, HIV 감염증의 각 환자에의 Treg 의 과잉인 존재와 활성화가 그것들 병세와의 상관 관계를 나타내는 것 [비특허문헌 13, 14], 및 마우스 병태 모델에서는 Treg 의 제거가 병상의 관해 (寬解) 를 초래하는 것 [비특허문헌 15, 16] 이 나타나 있다.

WO2015/015003 WO2016/125017

Int J Cancer. 2010 Aug 15 ; 127(4) : 759-67. PLoS One. 2008 ; 3(7) : e2705. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 ; 106(32) : 13445-50. Eur J Immunol. 2009 ; 39(12) : 3315-22. Mol Biol Cell. 2012 ; 23(6) : 1129-39. Blood. 2013 ; 122(7) : 1182-91. (특허문헌 7) Eur J Immunol. 2012 Jul ; 42(7) : 1876-85. Clin Immunol. 2013 Oct ; 149(1) : 97-110. Cancer Res. 2013 ; 73 : 2435. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Aug 11 ; 106(32) : 13445-50. Eur J Immunol. 2009 ; 39(12) : 869-82. Sci Transl Med. 2015 Apr 22 ; 7(284) PLoS One. 2008 Apr 30 ; 3(4) : e2027. Clin Exp Immunol. 2014 Jun ; 176(3) : 401-9. J Immunol. 2012 Jun 1 ; 188(11) : 5467-77. PLoS Pathog. 2013 ; 9(12) : e1003798.

본 발명의 과제는, 종양에 있어서의 Treg 의 기능을 저해함으로써, 치료 효과를 갖는 의약품이 되는 항체, 및 당해 항체를 사용한 종양의 치료 방법 등을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 실시한 결과, GARP 에 특이적으로 결합하고, 항체 의존성 세포 상해 활성을 통해서 Treg 의 기능을 저해하는 활성을 나타내는 항체를 알아내어 본 발명을 완성시켰다. 즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.

(1) 이하의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 ;

(a) Glycoprotein-A Repetitions Predominant (GARP) 에 특이적으로 결합한다

(b) 제어성 T 세포의 면역 억제 기능에 대한 저해 활성을 갖는,

(c) 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성을 갖는, 및

(d) in vivo 로 항종양 활성을 갖는다.

(2) GARP 가 배열 번호 1 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 분자인 상기 (1) 에 기재된 항체.

(3) (a) 배열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 366 내지 377, 407 내지 445 및 456 내지 470

(b) 배열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 54 내지 112 및 366 내지 392

(c) 배열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 352 내지 392, 또는

(d) 배열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 18 내지 112

에 결합하는 상기 (1) 또는 (2) 에 기재된 항체.

(4) GARP 에의 결합에 대해,

(a) 배열 번호 2 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 3 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬,

(b) 배열 번호 4 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 5 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬,

(c) 배열 번호 25 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 27 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬, 또는

(d) 배열 번호 29 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 31 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬

을 갖는 항체와 경합 저해 활성을 갖는 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 한 항에 기재된 항체.

(5) 종양이 암인 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 한 항에 기재된 항체.

(6) 암이 폐암, 신장암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경 교아종, 난소암, 췌암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 또는 혈액암인 상기 (5) 에 기재된 항체.

(7) (a) 배열 번호 2 에 있어서 아미노산 번호 26 내지 35 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 2 에 있어서 아미노산 번호 50 내지 66 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 및 배열 번호 2 에 있어서 아미노산 번호 99 내지 107 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3, 그리고 배열 번호 3 에 있어서 아미노산 번호 23 내지 36 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 3 에 있어서 아미노산 번호 52 내지 58 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 및 배열 번호 3 에 있어서 아미노산 번호 91 내지 101 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3,

(b) 배열 번호 4 에 있어서 아미노산 번호 26 내지 35 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 4 에 있어서 아미노산 번호 50 내지 66 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 및 배열 번호 4 에 있어서 아미노산 번호 99 내지 112 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3, 그리고 배열 번호 5 에 있어서 아미노산 번호 23 내지 36 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 5 에 있어서 아미노산 번호 52 내지 58 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 및 배열 번호 5 에 있어서 아미노산 번호 91 내지 100 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3,

(c) 배열 번호 25 에 있어서 아미노산 번호 45 내지 54 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 25 에 있어서 아미노산 번호 69 내지 78 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 및 배열 번호 25 에 있어서 아미노산 번호 118 내지 125 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3, 그리고 배열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 44 내지 54 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 70 내지 76 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 및 배열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 109 내지 117 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3, 또는

(d) 배열 번호 29 에 있어서 아미노산 번호 45 내지 54 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 29 에 있어서 아미노산 번호 69 내지 77 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 및 배열 번호 29 에 있어서 아미노산 번호 117 내지 128 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3, 그리고 배열 번호 31 에 있어서 아미노산 번호 44 내지 54 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 31 에 있어서 아미노산 번호 70 내지 76 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 및 배열 번호 31 에 있어서 아미노산 번호 109 내지 117 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3

을 갖는 상기 (1) 내지 (6) 중 어느 한 항에 기재된 항체.

(8) (a) 배열 번호 2 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 118 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 3 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 112 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,

(b) 배열 번호 4 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 123 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 5 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 111 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,

(c) 배열 번호 25 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 136 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 또는

(d) 배열 번호 29 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 139 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 31 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역

을 갖는 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 한 항에 기재된 항체.

(9) 정상 영역이 인간 유래 정상 영역인 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 한 항에 기재된 항체.

(10) (a) 배열 번호 2 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 3 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬,

(c) 배열 번호 25 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 466 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬, 또는

(d) 배열 번호 29 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 469 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 31 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬

을 갖는 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 한 항에 기재된 항체.

(11) 인간화되어 있는 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 한 항에 기재된 항체.

(12) (a) 배열 번호 33 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 136 에 기재된 아미노산 배열,

(b) 배열 번호 35 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 136 에 기재된 아미노산 배열,

(c) 배열 번호 41 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 139 에 기재된 아미노산 배열,

(d) (a) 내지 (c) 의 배열에 있어서 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열, 및

(e) (a) 내지 (c) 의 배열에 있어서의 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬의 가변 영역, 그리고

(f) 배열 번호 37 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열,

(g) 배열 번호 39 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열,

(h) 배열 번호 43 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열,

(i) (f) 내지 (h) 의 배열에 있어서 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열, 및 (j) (f) 내지 (h) 의 배열에 있어서의 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬의 가변 영역

을 갖는 청구항 11 에 기재된 항체.

(13) (a) 배열 번호 33 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 136 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 37 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,

(b) 배열 번호 35 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 136 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 39 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 또는

(c) 배열 번호 41 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 139 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 43 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역

을 갖는 상기 (11) 또는 (12) 에 기재된 항체.

(14) (a) 배열 번호 33 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 466 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 중사슬, 배열 번호 35 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 466 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 중사슬, 및 배열 번호 41 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 469 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 중사슬로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬, 그리고

(b) 배열 번호 37 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 경사슬, 배열 번호 39 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 경사슬, 및 배열 번호 43 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 군에서 선택되는 경사슬

을 갖는 상기 (11) 내지 (13) 중 어느 한 항에 기재된 항체.

(15) (a) 배열 번호 33 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 466 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 37 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 경사슬,

(b) 배열 번호 35 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 466 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 39 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 경사슬, 또는

(c) 배열 번호 41 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 469 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 43 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 경사슬

을 갖는 상기 (11) 내지 (14) 중 어느 한 항에 기재된 항체.

(16) 상기 (1) 내지 (15) 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.

(17) (a) 배열 번호 6 에 있어서 뉴클레오티드 번호 76 내지 105 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH1 의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 6 에 있어서 뉴클레오티드 번호 148 내지 198 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH2 의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 6 에 있어서 뉴클레오티드 번호 295 내지 321 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH3 의 폴리뉴클레오티드, 그리고 배열 번호 7 에 있어서 뉴클레오티드 번호 67 내지 108 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL1 의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 7 에 있어서 뉴클레오티드 번호 154 내지 174 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL2 의 폴리뉴클레오티드, 및 배열 번호 7 에 있어서 뉴클레오티드 번호 271 내지 303 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL3 의 폴리뉴클레오티드,

(b) 배열 번호 8 에 있어서 뉴클레오티드 번호 76 내지 105 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH1 을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 8 에 있어서 뉴클레오티드 번호 148 내지 198 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH2 의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 8 에 있어서 뉴클레오티드 번호 295 내지 336 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH3 의 폴리뉴클레오티드, 그리고 배열 번호 9 에 있어서 뉴클레오티드 번호 67 내지 108 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL1 의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 9 에 있어서 뉴클레오티드 번호 154 내지 174 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL2 의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 9 에 있어서 뉴클레오티드 번호 271 내지 300 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL3 의 폴리뉴클레오티드,

(c) 배열 번호 24 에 있어서 뉴클레오티드 번호 133 내지 162 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH1 의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 24 에 있어서 뉴클레오티드 번호 205 내지 234 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH2 의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 24 에 있어서 뉴클레오티드 번호 352 내지 375 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH3 의 폴리뉴클레오티드, 그리고 배열 번호 26 에 있어서 뉴클레오티드 번호 130 내지 162 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL1 의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 26 에 있어서 뉴클레오티드 번호 208 내지 228 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL2 의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 26 에 있어서 뉴클레오티드 번호 325 내지 351 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL3 의 폴리뉴클레오티드, 또는

(d) 배열 번호 28 에 있어서 뉴클레오티드 번호 133 내지 162 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH1 의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 28 에 있어서 뉴클레오티드 번호 205 내지 231 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH2 의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 28 에 있어서 뉴클레오티드 번호 349 내지 384 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH3 의 폴리뉴클레오티드, 그리고 배열 번호 30 에 있어서 뉴클레오티드 번호 130 내지 162 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL1 의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 30 에 있어서 뉴클레오티드 번호 208 내지 228 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL2 의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 30 에 있어서 뉴클레오티드 번호 325 내지 351 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL3 의 폴리뉴클레오티드

를 갖는 상기 (16) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(18) (a) 배열 번호 6 에 있어서 뉴클레오티드 번호 1 내지 354 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 7 에 있어서 뉴클레오티드 번호 1 내지 336 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역의 폴리뉴클레오티드,

(b) 배열 번호 8 에 있어서 뉴클레오티드 번호 1 내지 369 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 9 에 있어서 뉴클레오티드 배열 번호 1 내지 333 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역의 폴리뉴클레오티드,

(c) 배열 번호 24 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 26 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 또는

(d) 배열 번호 28 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 417 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 30 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역

을 갖는 상기 (16) 또는 (17) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(19) (a) 배열 번호 6 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 7 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드,

(b) 배열 번호 8 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 9 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드

(c) 배열 번호 24 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 26 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드, 또는

(d) 배열 번호 28 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1407 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 30 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드

를 갖는 상기 (16) 내지 (18) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(20) (a) 배열 번호 32 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 배열 번호 34 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및 배열 번호 40 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 417 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역으로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 가변 영역, 그리고

(b) 배열 번호 36 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 배열 번호 38 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및 배열 번호 42 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역으로 이루어지는 군에서 선택되는 경사슬 가변 영역

을 갖는 상기 (16) 또는 (17) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(21) (a) 배열 번호 32 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 36 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,

(b) 배열 번호 34 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 38 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 또는

(c) 배열 번호 40 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 417 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 42 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역

을 갖는 상기 (16), (17) 또는 (20) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(22) (a) 배열 번호 32 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 34 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드, 및 배열 번호 40 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1407 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬의 폴리뉴클레오티드, 그리고

(b) 배열 번호 36 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 38 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드, 및 배열 번호 42 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 경사슬의 폴리뉴클레오티드,

를 갖는 상기 (16), (17), (20) 또는 (21) 에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(23) (a) 배열 번호 32 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드, 및 배열 번호 36 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드,

(b) 배열 번호 34 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드, 및 배열 번호 38 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드, 또는

(c) 배열 번호 40 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1407 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드, 및 배열 번호 42 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드

를 갖는 상기 (16), (17) 및 (20) 내지 (22) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드.

(24) 상기 (16) 내지 (23) 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터.

(25) 상기 (24) 에 기재된 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.

(26) 상기 (25) 에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체를 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당해 항체 또는 당해 단편의 제조 방법.

(27) 상기 (26) 의 제조 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 항체.

(28) N-결합에의 당 사슬 부가, O-결합에의 당 사슬 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화 및 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실된 중사슬로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 포함하는 상기 (1) 내지 (15) 및 (27) 중 어느 한 항에 기재된 항체.

(29) 중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는 상기 (28) 에 기재된 항체.

(30) 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산이 결실되어 있는 상기 (29) 에 기재된 항체.

(31) 중사슬의 카르복실 말단의 프롤린 잔기가 추가로 아미드화되어 있는 상기 (28) 내지 (30) 중 어느 한 항에 기재된 항체.

(32) 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강시키기 위해 당 사슬 수식이 조절되어 있는 상기 (1) 내지 (15) 및 (27) 내지 (31) 중 어느 한 항에 기재된 항체.

(33) 상기 (1) 내지 (15) 및 (27) 내지 (32) 에 기재된 항체 중 적어도 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.

(34) 종양 치료용인 상기 (33) 에 기재된 의약 조성물.

(35) 종양이 암인 상기 (34) 에 기재된 의약 조성물.

(36) 암이 폐암, 신장암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경 교아종, 난소암, 췌암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 또는 혈액암인 상기 (35) 에 기재된 의약 조성물.

(37) 상기 (1) 내지 (15) 및 (27) 내지 (32) 에 기재된 항체 중 적어도 하나를 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 종양의 치료 방법.

(38) 종양이 암인 상기 (37) 에 기재된 치료 방법.

(39) 암이 폐암, 신장암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경 교아종, 난소암, 췌암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 또는 혈액암인 상기 (38) 에 기재된 치료 방법.

본 발명에 의하면, GARP 에 결합하고, ADCC 활성을 통한 Treg 억제 효과에 의한, 항종양 활성을 갖는 항체를 함유하는 암의 치료제 등을 얻을 수 있다. 또, 말라리아 및 HIV 감염증의 각 환자에서의 Treg 의 과잉인 존재와 활성화가 그것들 병세와의 상관 관계를 나타내는 것 및 마우스 병태 모델에서는 Treg 의 제거가 병상의 관해를 초래하므로, Treg 기능의 효과적인 저해는, 말라리아 및 HIV 등의 난치성 감염증에 있어서도 치료 효과를 기대할 수 있다.

도 1 은, GARP 의 아미노산 배열 (배열 번호 1) 을 나타내는 도면이다.
도 2 는, 105F 항체 중사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 2) 을 나타내는 도면이다.
도 3 은, 105F 항체 경사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 3) 을 나타내는 도면이다.
도 4 는, 110F 항체 중사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 4) 을 나타내는 도면이다.
도 5 는, 110F 항체 경사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 5) 을 나타내는 도면이다.
도 6 은, 105F 항체 중사슬의 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 6) 을 나타내는 도면이다.
도 7 은, 105F 항체 경사슬의 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 7) 을 나타내는 도면이다.
도 8 은, 110F 항체 중사슬의 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 8) 을 나타내는 도면이다.
도 9 는, 110F 항체 경사슬의 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 9) 을 나타내는 도면이다.
도 10 은, 항체의 GARP 에의 결합을 나타내는 도면이다. 105F 항체 및 110F 항체는, ELISA 법으로 GARP 에의 결합을 나타냈다.
도 11 은, 항체의 GARP 특이적 결합을 나타내는 도면이다. 105F 항체는, 벡터만을 도입한 HEK293T 세포에는 결합하지 않고, HEK293T 세포에 GARP 를 일과성 발현시킨 세포에만 결합을 나타냈다.
도 12 는, 항체의 GARP 특이적 결합을 나타내는 도면이다. 105F 항체는, 내인성으로 GARP 를 발현하는 L428 세포에의 결합 활성을 나타냈다.
도 13 은, 항체의 GARP 특이적 결합을 나타내는 도면이다. 105F 항체는, 활성화된 Treg 에 결합 활성을 나타냈다.
도 14 는, 항체의 ADCC 능을 나타내는 도면이다. 내인성으로 GARP 를 발현하는 L428 세포를 표적으로 했을 때, 105F 항체의 항체 농도 의존적으로 ADCC 활성의 증강을 관찰하였다.
도 15 는, 항체의 Treg 기능 저해능을 나타내는 도면이다. 105F 항체 (50 ㎍/㎖) 는, Treg 에 의한 헬퍼 T 세포에 대한 증식 억제 기능을 저해하였다.
도 16 은, 항체의 Treg 기능 저해능을 나타내는 도면이다. 105F 항체 (10 ㎍/㎖) 는, Treg 에 의한 헬퍼 T 세포에 대한 증식 억제 기능을 저해하였다. 한편, MHG-8, LHG-10 항체는, 헬퍼 T 세포에 대한 증식 억제 기능에의 효과를 나타내지 않았다.
도 17 은, c151D 항체 중사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 25) 을 나타내는 도면이다.
도 18 은, c151D 항체 경사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 27) 을 나타내는 도면이다.
도 19 는, c198D 항체 중사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 29) 을 나타내는 도면이다.
도 20 은, c198D 항체 경사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 31) 을 나타내는 도면이다.
도 21 은, h151D-H1 중사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 33) 을 나타내는 도면이다.
도 22 는, h151D-L1 경사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 37) 을 나타내는 도면이다.
도 23 은, h151D-H4 중사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 35) 을 나타내는 도면이다.
도 24 는, h151D-L4 경사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 39) 을 나타내는 도면이다.
도 25 는, h198D-H3 중사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 41) 을 나타내는 도면이다.
도 26 은, h198D-L4 경사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 43) 을 나타내는 도면이다.
도 27 은, c151D 항체 중사슬의 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 24) 을 나타내는 도면이다.
도 28 은, c151D 항체 경사슬의 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 26) 을 나타내는 도면이다.
도 29 는, c198D 항체 중사슬의 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 28) 을 나타내는 도면이다.
도 30 은, c198D 항체 경사슬의 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 30) 을 나타내는 도면이다.
도 31 은, h151D-H1 중사슬의 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 32) 을 나타내는 도면이다.
도 32 는, h151D-L1 경사슬의 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 36) 을 나타내는 도면이다.
도 33 은, h151D-H4 중사슬의 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 34) 을 나타내는 도면이다.
도 34 는, h151D-L4 경사슬의 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 38) 을 나타내는 도면이다.
도 35 는, h198D-H3 중사슬의 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 40) 을 나타내는 도면이다.
도 36 은, h198D-L4 경사슬의 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 42) 을 나타내는 도면이다.
도 37 은, 각 항체의 GARP 발현 세포에의 결합을 나타내는 도면이다. h151D-H1L1, h151D-H4L4 및 h198D-H3L4 는, GARP 에 대해 특이적인 결합 활성을 나타냈다.
도 38 은, 각 항체의 GARP-TGFβ1 공발현 세포에의 결합을 나타내는 도면이다. 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4 및 h198D-H3L4 의 각 항체는, TGFβ1 과 공발현한 GARP 및 GARP 변이체의 양방에 결합하는 것이 나타나고, 공지 항체인 MHG8 및 LHG10 의 각 항체란, GARP 에 있어서 상이한 영역에의 결합 활성을 나타냈다.
도 39 는, 각 항체의 L428 세포에의 결합을 나타내는 도면이다. h151D-H1L1, h151D-H4L4 및 h198D-H3L4 의 각 항체는 내인성으로 발현하고 있는 GARP 에 대해 결합 활성을 나타냈다.
도 40 은, 각 항체의 Treg 에의 결합을 나타내는 도면이다. h151D-H1L1, h151D-H4L4 및 h198D-H3L4 의 각 항체는, FoxP3 양성 Treg 에 대해 결합 활성을 나타냈다.
도 41 은, 각 항체의 ADCC 활성을 나타내는 도면이다. h151D-H1L1, h151D-H4L4 및 h198D-H3L4 의 각 항체는 ADCC 활성을 나타냈다.
도 42 는, 각 항체의 Treg 기능 저해 활성을 나타내는 도면이다. h151D-H1L1, h151D-H4L4 및 h198D-H3L4 의 각 항체는, Treg 기능 저해 활성을 나타냈다.
도 43 은, Treg 에 의한 CTL 의 표적 세포 용해 활성의 억제를 나타내는 도면이다.
도 44 는, 각 항체에 의한 항종양 활성의 증강을 나타내는 도면이다. 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 의 각 항체는, CTL 세포 활성의 Treg 에 의한 억제를 저해하고, 항종양 활성을 증강시켰다.
도 45 는, 각 항체의 in vivo 항종양 활성을 나타내는 도면이다. 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 의 각 항체는, in vivo 모델에 있어서 항종양 활성을 나타냈다.

본 명세서 중에 있어서, 「암」 과 「종양」 은 동일한 의미로 사용하고 있다.

본 명세서 중에 있어서, 「유전자」 라는 단어에는, DNA 뿐만 아니라 그 mRNA, cDNA 및 그 cRNA 도 포함된다.

본 명세서 중에 있어서, 「폴리뉴클레오티드」 라는 단어는 핵산과 동일한 의미로 사용되고 있으며, DNA, RNA, 프로브, 올리고 뉴클레오티드, 및 프라이머도 포함된다.

본 명세서 중에 있어서는, 「폴리펩티드」 와 「단백질」 은 구별하지 않고 사용하고 있다.

본 명세서 중에 있어서, 「세포」 에는, 동물 개체 내의 세포, 배양 세포도 포함하고 있다.

본 명세서 중에 있어서, 「GARP」 는, GARP 단백질과 동일한 의미로 사용하고 있다.

본 명세서 중에 있어서의 「세포 상해」 란, 어떠한 형태로 세포에 병리적인 변화를 초래하는 것을 말하고, 직접적인 외상에 그치지 않고, DNA 의 절단이나 염기의 2 량체의 형성, 염색체의 절단, 세포 분열 장치의 손상, 각종 효소 활성의 저하 등 모든 세포의 구조나 기능상의 손상을 말한다.

본 명세서 중에 있어서의 「세포 상해 활성」 이란 상기 세포 상해를 일으키는 것을 말한다.

본 명세서 중에 있어서의 「항체 의존성 세포 상해 활성」 이란, 「antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) 활성」 을 말하고, NK 세포가 항체를 통해서 종양 세포 등의 표적 세포를 상해하는 작용 활성을 의미한다.

본 명세서에 있어서의 「에피토프」 란, 특정한 항 GARP 항체가 결합하는 GARP 의 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조를 의미한다. 상기의 GARP 의 부분 펩티드인 에피토프는, 면역 어세이법 등 당업자에게 잘 알려져 있는 방법, 예를 들어 이하의 방법에 의해 결정할 수 있다. 먼저, 항원의 여러 가지 부분 구조를 제조한다. 부분 구조의 제조시에는, 공지된 올리고 펩티드 합성 기술을 사용할 수 있다. 예를 들어, GARP 의 C 말단 혹은 N 말단으로부터 적당한 길이로 순차 짧게 한 일련의 폴리펩티드를 당업자에게 주지된 유전자 재조합 기술을 사용하여 제조한 후, 그것들에 대한 항체의 반응성을 검토하고, 대략적인 인식 부위를 결정한 후에, 더욱 짧은 펩티드를 합성하여 그들 펩티드와의 반응성을 검토함으로써, 에피토프를 결정할 수 있다. 또, 특정한 항체가 결합하는 항원의 부분 입체 구조인 에피토프는, X 선 구조 해석에 의해 상기의 항체와 인접하는 항원의 아미노산 잔기를 특정함으로써 결정할 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「동일한 에피토프에 결합하는 항체」 란, 공통의 에피토프에 결합하는 상이한 항체를 의미하고 있다. 제 1 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 제 2 항체가 결합하면, 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 또, 제 1 항체의 항원에 대한 결합에 대해 제 2 항체가 경합하는 (즉, 제 2 항체가 제 1 항체와 항원의 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 배열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 또한 제 1 항체와 제 2 항체가 동일한 에피토프에 결합하고, 또한 제 1 항체가 항종양 활성 등의 특수한 효과를 갖는 경우, 제 2 항체도 동일한 활성을 갖는 것을 기대할 수 있다. 따라서, 제 1 항 GARP 항체가 결합하는 부분 펩티드에 제 2 항 GARP 항체가 결합하면, 제 1 항체와 제 2 항체가 GARP 의 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 또, 제 1 항 GARP 항체의 GARP 에 대한 결합에 대해 제 2 항 GARP 항체가 경합하는 것을 확인함으로써, 제 1 항체와 제 2 항체가 GARP 의 동일한 에피토프에 결합하는 항체로 판정할 수 있다.

본 명세서에 있어서의 「CDR」 이란, 상보성 결정 영역 (Complemetarity deterring region) 을 의미한다. 항체 분자의 중사슬 및 경사슬에는 각각 3 지점의 CDR 이 있는 것이 알려져 있다. CDR 은, 초가변 영역 (hypervariable domain) 이라고도 불리며, 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역 내에 있고, 일차 구조의 변이성이 특히 높은 부위이고, 중사슬 및 경사슬의 폴리펩티드 사슬의 일차 구조상에 있어서, 각각 3 지점으로 분리되어 있다. 본 명세서 중에 있어서는, 항체의 CDR 에 대해, 중사슬의 CDR 을 중사슬 아미노산 배열의 아미노 말단측으로부터 CDRH1, CDRH2, CDRH3 으로 표기하고, 경사슬의 CDR 을 경사슬 아미노산 배열의 아미노 말단측으로부터 CDRL1, CDRL2, CDRL3 으로 표기한다. 이들 부위는 입체 구조 상에서 서로 근접하여, 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정하고 있다.

본 발명에 있어서, 「스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈한다」 란, 시판되는 하이브리다이제이션 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (클론텍사 제조) 중, 68 ℃ 에서 하이브리다이즈하는 것, 또는 DNA 를 고정시킨 필터를 사용하여 0.7 - 1.0 M 의 NaCl 존재하 68 ℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1 - 2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도 SSC 란 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산나트륨으로 이루어진다) 을 사용하여, 68 ℃ 에서 세정함으로써 동정할 수 있는 조건 또는 그것과 동등한 조건으로 하이브리다이즈하는 것을 말한다.

1. GARP

본 발명에서 사용하는 GARP 는, 인간, 비인간 포유 동물 (래트, 마우스 등) 의 GARP 발현 세포로부터 직접 정제하여 사용하거나, 혹은 당해 세포의 세포막 획분을 조제하여 사용할 수 있고, 또, GARP 를 in vitro 로 합성하거나, 혹은 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생산시킴으로써 얻을 수 있다. 유전자 조작에서는, 구체적으로는, GARP cDNA 를 발현 가능한 벡터에 삽입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 함유하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 다른 원핵 생물, 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 GARP 를 발현시킴으로써, 당해 단백질을 얻을 수 있다.

인간 GARP 의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 1 에 기재되어 있다. 또, 배열 번호 1 의 배열은 도 1 에 기재되어 있다.

또, 상기 GARP 의 아미노산 배열에 있어서, 1 또는 수 개의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 당해 단백질과 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 GARP 에 포함된다.

시그널 배열이 제거된 성숙 인간 GARP 는, 배열 번호 1 에 나타내는 아미노산 배열의 20 번째 내지 662 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열에 상당한다.

또, 배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 아미노산 배열, 또는 이들 배열로부터 시그널 배열이 제거된 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 GARP 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 GARP 에 포함된다. 또한 인간 GARP 유전자좌 (座) 로부터 전사되는 스플라이싱 베어리언트에 코드되는 아미노산 배열 또는 당해 아미노산 배열에 있어서, 1 혹은 수 개의 아미노산이 치환, 결실, 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지고, 또한 GARP 와 동등한 생물 활성을 갖는 단백질도 GARP 에 포함된다.

2. 항 GARP 항체의 제조

본 발명의 GARP 에 대한 항체로는, 항 GARP 인간 항체를 들 수 있고, 항 GARP 인간 항체란, 인간 염색체 유래의 항체의 유전자 배열만을 갖는 인간 항체를 의미한다.

항 GARP 인간 항체는, 인간 항체의 중사슬과 경사슬의 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체 생산 마우스를 사용한 방법 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p.133-143, ; Kuroiwa, Y. et. al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448 ; Yoshida, H. et. al., Animal Cell Technology : Basic and Applied Aspects vol.10, p.69-73 (Kitagawa, Y., Matsuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999. ; Tomizuka, K. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, p.722-727 등을 참조) 에 의해 취득할 수 있다.

이와 같은 인간 항체 생산 마우스는, 구체적으로는, 내재성 면역 글로블린 중사슬 및 경사슬의 유전자좌가 파괴되고, 대신에 효모 인공 염색체 (Yeast artificial chromosome, YAC) 벡터 등을 통해서 인간 면역 글로블린 중사슬 및 경사슬의 유전자좌가 도입된 유전자 재조합 동물을, 녹아웃 동물 및 트랜스제닉 동물의 제조, 및 이들 동물끼리를 교배함으로써 만들어 낼 수 있다.

또, 유전자 재조합 기술에 의해, 그러한 인간 항체의 중사슬 및 경사슬의 각각을 코드하는 cDNA, 바람직하게는 당해 cDNA 를 함유하는 벡터에 의해 진핵 세포를 형질 전환하고, 유전자 재조합 인간 모노클로날 항체를 생산하는 형질 전환 세포를 배양함으로써, 당해 항체를 배양 상청 중에서 얻을 수도 있다. 숙주 세포로는 예를 들어 진핵 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 림프구나 미엘로마 등의 포유 동물 세포를 사용할 수 있다.

또, 인간 항체 라이브러리로부터 선별한 파지 디스플레이 유래의 인간 항체를 취득하는 방법 (Wormstone, I. M. et. al, Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43(7), p.2301-2308 ; Carmen, S. et. al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1(2), p.189-203 ; Siriwardena, D. et. al., Ophthalmology (2002) 109(3), p.427-431 등 참조) 에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간 항체의 가변 영역을 1 본쇄 항체 (scFv) 로서 파지 표면에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 파지 디스플레이법 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p.1105-1116) 을 사용할 수 있다.

항원에 결합함으로써 선택된 파지의 유전자를 해석함으로써, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 코드하는 DNA 배열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv 의 DNA 배열이 분명해지면, 항체의 정상 영역의 DNA 배열을 연결함으로써, 당해 배열을 갖는 IgG 발현 벡터를 제조하고, 적당한 숙주에 도입하여 발현시킴으로써 인간 항체를 취득할 수 있다 (WO92/01047, WO92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO93/19172, WO95/01438, WO95/15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p.433-455, Nature Biotechnology (2005) 23(9), p.1105-1116).

또, 본 발명의 GARP 에 대한 항체는, 통상적인 방법을 사용하여, GARP 또는 GARP 의 아미노산 배열에서 선택되는 임의의 폴리펩티드를 동물에 면역시키고, 생체 내에 생산되는 항체를 채취, 정제함으로써 얻을 수 있다. 항원이 되는 GARP 의 생물종은 인간에 한정되지 않고, 마우스, 래트 등의 인간 이외의 동물에서 유래하는 GARP 를 동물에 면역시킬 수도 있다. 이 경우에는, 취득된 이종 (異種) GARP 에 결합하는 항체와 인간 GARP 의 교차성을 시험함으로써, 인간의 질환에 적용 가능한 항체를 선별할 수 있다.

또, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975)256, p.495-497, Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p.365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) 에 따라, GARP 에 대한 항체를 생산하는 항체 생산 세포와 미엘로마 세포를 융합시킴으로써 하이브리도마를 수립하여, 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다.

또한, 항원이 되는 GARP 는 GARP 유전자를 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생산시킴으로써 얻을 수 있다.

구체적으로는, GARP 유전자를 발현 가능한 벡터를 제조하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 그 유전자를 발현시키고, 발현한 GARP 를 정제하면 된다. 이하, 구체적으로 GARP 에 대한 항체의 취득 방법을 설명한다.

(1) 항원의 조제

항 GARP 항체를 제조하기 위한 항원으로는, GARP 또는 그 적어도 6 개가 연속된 부분 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드, 혹은 이들에 임의의 아미노산 배열이나 담체가 부가된 유도체를 들 수 있다.

GARP 는, 인간의 종양 조직 혹은 종양 세포로부터 직접 정제하여 사용할 수 있고, 또, GARP 를 in Vitro 로 합성하거나, 혹은 유전자 조작에 의해 숙주 세포에 생산시킴으로써 얻을 수 있다.

유전자 조작에서는, 구체적으로는, GARP 의 cDNA 를 발현 가능한 벡터에 삽입한 후, 전사와 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 함유하는 용액 중에서 합성하거나, 혹은 다른 원핵 생물, 또는 진핵 생물의 숙주 세포를 형질 전환시킴으로써 GARP 를 발현시킴으로써, 항원을 얻을 수 있다.

또, 막단백질인 GARP 의 세포외 영역과 항체의 정상 영역을 연결한 융합 단백질을 적절한 숙주·벡터계에 있어서 발현시킴으로써, 분비 단백질로서 항원을 얻는 것도 가능하다.

GARP 의 cDNA 는 예를 들어, GARP 의 cDNA 를 발현하고 있는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, GARP cDNA 를 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 사용하여 폴리메라아제 연쇄 반응 (이하 「PCR」 이라고 한다) (Saiki, R. K., et al. Science (1988) 239, p.487-489 참조) 을 실시하는, 소위 PCR 법에 의해 취득할 수 있다.

폴리펩티드의 인·비트로 (in Vitro) 합성으로는, 예를 들어 로슈·다이아그노스틱스사 제조의 래피드 트랜스레이션 시스템 (RTS) 을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.

원핵 세포의 숙주로는, 예를 들어, 대장균 (Escherichia coli) 이나 고초균 (Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 목적으로 하는 유전자를 이들 숙주 세포 내에서 형질 전환시키기 위해서는, 숙주와 적합할 수 있는 종 유래의 레프리콘 즉 복제 기점과, 조절 배열을 포함하고 있는 플라스미드 벡터로 숙주 세포를 형질 전환시킨다. 또, 벡터로는, 형질 전환 세포에 표현 형질 (표현형) 의 선택성을 부여할 수 있는 배열을 갖는 것이 바람직하다.

진핵 세포의 숙주 세포에는, 척추 동물, 곤충, 효모 등의 세포가 포함되고, 척추 동물 세포로는, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아 세포 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658) 이나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로 엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, p.4126-4220) 등이 자주 사용되고 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

상기와 같이 하여 얻어지는 형질 전환체는, 통상적인 방법에 따라 배양할 수 있고, 그 배양에 의해 세포 내, 또는 세포 외에 목적으로 하는 폴리펩티드가 생산된다.

그 배양에 사용되는 배지로는, 채용한 숙주 세포에 따라 관용되는 각종 것을 적절히 선택할 수 있고, 대장균이면, 예를 들어, LB 배지에 필요에 따라, 암피실린 등의 항생 물질이나 IPMG 를 첨가하여 사용할 수 있다.

상기 배양에 의해, 형질 전환체의 세포 내 또는 세포 외에 생산되는 재조합 단백질은, 그 단백질의 물리적 성질이나 화학적 성질 등을 이용한 각종 공지된 분리 조작법에 의해 분리·정제할 수 있다.

그 방법으로는, 구체적으로는 예를 들어, 통상적인 단백질 침전제에 의한 처리, 한외 여과, 분자체 크로마토그래피 (겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피 등의 각종 액체 크로마토그래피, 투석법, 이들의 조합 등을 예시할 수 있다.

또, 발현시키는 재조합 단백질에 6 잔기로 이루어지는 히스티딘 태그를 연결함으로써, 니켈 어피니티 칼럼으로 효율적으로 정제할 수 있다. 혹은, 발현시키는 재조합 단백질에 IgG 의 Fc 영역을 연결함으로써, 프로테인 A 칼럼으로 효율적으로 정제할 수 있다.

상기 방법을 조합함으로써 용이하게 고수율, 고순도로 목적으로 하는 폴리펩티드를 대량으로 제조할 수 있다.

(2) 항 GARP 모노클로날 항체의 제조

GARP 와 특이적으로 결합하는 항체의 예로서, GARP 와 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 들 수 있지만, 그 취득 방법은 이하에 기재하는 바와 같다.

모노클로날 항체의 제조시에는, 일반적으로 하기와 같은 작업 공정이 필요하다.

즉,

(a) 항원으로서 사용하는 생체 고분자의 정제,

(b) 항원을 동물에 주사함으로써 면역시킨 후, 혈액을 채취하여 그 항체가를 검정하여 비장 적출의 시기를 결정하고 나서, 항체 생산 세포를 조제하는 공정,

(c) 골수종 세포 (이하 「미엘로마」 라고 한다) 의 조제,

(d) 항체 생산 세포와 미엘로마의 세포 융합,

(e) 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마군의 선별,

(f) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝),

(g) 경우에 따라서는, 모노클로날 항체를 대량으로 제조하기 위한 하이브리도마의 배양, 또는 하이브리도마를 이식한 동물의 사육,

(h) 이와 같이 하여 제조된 모노클로날 항체의 생리 활성, 및 그 결합 특이성의 검토, 혹은 표지 시약으로서의 특성의 검정 등이다.

이하, 모노클로날 항체의 제조법을 상기 공정을 따라 상세히 서술하지만, 그 항체의 제조법은 이것에 제한되지 않고, 예를 들어 비세포 이외의 항체 생산 세포 및 미엘로마를 사용할 수도 있다.

(a) 항원의 정제

항원으로는, 상기한 바와 같은 방법으로 조제한 GARP 또는 그 일부를 사용할 수 있다.

또, GARP 발현 재조합 체세포로부터 조제한 막 획분, 또는 GARP 발현 재조합 체세포 자신, 또한 당업자에게 주지된 방법을 사용하여, 화학 합성한 본 발명의 단백질의 부분 펩티드를 항원으로서 사용할 수도 있다.

(b) 항체 생산 세포의 조제

공정 (a) 에서 얻어진 항원과, 프로인드의 완전 또는 불완전 애주번트, 또는 칼리 명반과 같은 보조제를 혼합하고, 면역원으로서 실험 동물에 면역시킨다. 실험 동물은 공지된 하이브리도마 제조법에 사용되는 동물을 지장없이 사용할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 말 등을 사용할 수 있다. 단, 적출한 항체 생산 세포와 융합시키는 미엘로마 세포의 입수 용이성 등의 관점에서, 마우스 또는 래트를 피면역 동물로 하는 것이 바람직하다.

또, 실제로 사용하는 마우스 및 래트의 계통에는 특별히 제한은 없고, 마우스의 경우에는, 예를 들어 각 계통 A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, 129 등이, 또 래트의 경우에는, 예를 들어, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer 등을 사용할 수 있다.

이들 마우스 및 래트는 예를 들어 닛폰 클레아, 닛폰 찰스 리버 등 실험 동물 사육 판매 업자로부터 입수할 수 있다.

이 중, 후술하는 미엘로마 세포와의 융합 적합성을 감안하면, 마우스에서는 BALB/c 계통이, 래트에서는 Wistar 및 Low 계통이 피면역 동물로서 특히 바람직하다.

또, 항원의 인간과 마우스에서의 상동성을 고려하여, 자기 항체를 제거하는 생체 기구를 저하시킨 마우스, 즉 자기 면역 질환 마우스를 사용하는 것도 바람직하다.

또한, 이들 마우스 또는 래트의 면역시의 주령은, 바람직하게는 5 ∼ 12 주령, 더욱 바람직하게는 6 ∼ 8 주령이다.

GARP 또는 이 재조합체에 의해 동물을 면역시키기 위해서는, 예를 들어, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) 등에 상세하게 기재되어 있는 공지된 방법을 사용할 수 있다.

이들 면역법 중, 본 발명에 있어서 바람직한 방법을 구체적으로 나타내면, 예를 들어 이하와 같다.

즉, 먼저, 항원인 막단백질 획분, 혹은 항원을 발현시킨 세포를 동물의 피내 또는 복강 내에 투여한다.

단, 면역 효율을 높이기 위해서는 양자의 병용이 바람직하고, 전반은 피내 투여를 실시하고, 후반 또는 최종회만 복강 내 투여를 실시하면, 특히 면역 효율을 높일 수 있다.

항원의 투여 스케줄은, 피면역 동물의 종류, 개체차 등에 따라 상이하지만, 일반적으로는, 항원 투여 횟수 3 ∼ 6 회, 투여 간격 2 ∼ 6 주간이 바람직하고, 투여 횟수 3 ∼ 4 회, 투여 간격 2 ∼ 4 주간이 더욱 바람직하다.

또, 항원의 투여량은, 동물의 종류, 개체차 등에 따라 상이하지만, 일반적으로는 0.05 ∼ 5 ㎎, 바람직하게는 0.1 ∼ 0.5 ㎎ 정도로 한다.

추가 면역은, 이상과 같은 항원 투여의 1 ∼ 6 주 후, 바람직하게는 2 ∼ 4 주 후, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 3 주 후에 실시한다.

또한, 추가 면역을 실시할 때의 항원 투여량은, 동물의 종류, 크기 등에 따라 상이하지만, 일반적으로, 예를 들어 마우스의 경우에는 0.05 ∼ 5 ㎎, 바람직하게는 0.1 ∼ 0.5 ㎎, 더욱 바람직하게는 0.1 ∼ 0.2 ㎎ 정도로 한다.

상기 추가 면역으로부터 1 ∼ 10 일 후, 바람직하게는 2 ∼ 5 일 후, 더욱 바람직하게는 2 ∼ 3 일 후에 피면역 동물로부터 항체 생산 세포를 함유하는 비장 세포 또는 림프구를 무균적으로 취출한다. 그 때에 항체가를 측정하고, 항체가가 충분히 높아진 동물을 항체 생산 세포의 공급원으로서 사용하면, 이후의 조작 효율을 높일 수 있다.

여기서 사용되는 항체가의 측정법으로는, 예를 들어, RIA 법 또는 ELISA 법을 들 수 있지만 이들 방법에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서의 항체가의 측정은, 예를 들어 ELISA 법에 의하면, 이하에 기재하는 바와 같은 순서에 의해 실시할 수 있다.

먼저, 정제 또는 부분 정제한 항원을 ELISA 용 96 구멍 플레이트 등의 고상 표면에 흡착시키고, 또한 항원이 흡착되어 있지 않은 고상 표면을 항원과 무관계한 단백질, 예를 들어 소 혈청 알부민 (이하 「BSA」 라고 한다) 에 의해 덮고, 그 표면을 세정 후, 제 1 항체로서 단계 희석시킨 시료 (예를 들어 마우스 혈청) 에 접촉시키고, 상기 항원에 시료 중의 항체를 결합시킨다.

또한 제 2 항체로서 효소 표지된 마우스 항체에 대한 항체를 첨가하여 마우스 항체에 결합시키고, 세정 후 그 효소의 기질을 첨가하여, 기질 분해에 기초하는 발색에 의한 흡광도의 변화 등을 측정함으로써, 항체가를 산출한다.

피면역 동물의 비장 세포 또는 림프구로부터의 항체 생산 세포의 분리는, 공지된 방법 (예를 들어, Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495, ; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977) 6, p.511, ; Milstein et al., Nature (1977), 266, p.550, ; Walsh, Nature, (1977) 266, p.495) 에 따라 실시할 수 있다. 예를 들어, 비장 세포의 경우에는, 비장을 가늘게 절단하고 세포를 스테인리스 메시로 여과한 후, 이글 최소 필수 배지 (MEM) 에 부유시켜 항체 생산 세포를 분리하는 일반적 방법을 채용할 수 있다.

(c) 골수종 세포 (이하, 「미엘로마」 라고 한다) 의 조제

세포 융합에 사용하는 미엘로마 세포에는 특별한 제한은 없고, 공지된 세포주에서 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 단, 융합 세포로부터 하이브리도마를 선택할 때의 편리성을 고려하여, 그 선택 수속이 확립되어 있는 HGPRT (Hypoxanthine-GUANINE phosphoribosyl transferase) 결손주를 사용하는 것이 바람직하다.

즉, 마우스 유래의 X63-Ag8 (X63), NS1-ANS/1 (NS1), P3X63-Ag8.U1 (P3U1), X63-Ag8.653 (X63.653), SP2/0-Ag14 (SP2/0), MPC11-45.6TG1.7 (45.6TG), FO, S149/5XXO, BU.1 등, 래트 유래의 210.RSY3.Ag.1.2.3 (Y3) 등, 인간 유래의 U266AR (SKO-007), GM1500·GTG-A12 (GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2 (HMy2), 8226AR/NIP4-1 (NP41) 등이다. 이들 HGPRT 결손주는 예를 들어, American Type Culture Collection (ATCC) 등으로부터 입수할 수 있다.

이들 세포주는, 적당한 배지, 예를 들어 8-아자구아닌 배지 [RPMI-1640 배지에 글루타민, 2-메르캅토에탄올, 겐타마이신, 및 소 태아 혈청 (이하 「FCS」 라고 한다) 을 첨가한 배지에 8-아자구아닌을 첨가한 배지], 이스코브 개변 둘베코 배지 (Iscove's Modified Dulbecco's Medium ; 이하 「IMDM」 이라고 한다), 또는 둘베코 개변 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium ; 이하 「DMEM」 이라고 한다) 에서 계대 배양하지만, 세포 융합의 3 내지 4 일 전에 정상 배지 [예를 들어, 10 ％ FCS 를 함유하는 ASF104 배지 (아지노모토 (주) 사 제조)] 에서 계대 배양하여, 융합 당일에 2 × 10⁷ 이상의 세포수를 확보해 둔다.

(d) 세포 융합

항체 생산 세포와 미엘로마 세포의 융합은, 공지된 방법 (Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology, Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987), Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) 등) 에 따라, 세포의 생존율을 극도로 저하시키지 않을 정도의 조건하에서 적절히 실시할 수 있다.

그러한 방법은, 예를 들어, 폴리에틸렌글리콜 등의 고농도 폴리머 용액 중에서 항체 생산 세포와 미엘로마 세포를 혼합하는 화학적 방법, 전기적 자극을 이용하는 물리적 방법 등을 사용할 수 있다. 이 중, 상기 화학적 방법의 구체예를 나타내면 이하와 같다.

즉, 고농도 폴리머 용액으로서 폴리에틸렌글리콜을 사용하는 경우에는, 분자량 1500 ∼ 6000, 바람직하게는 2000 ∼ 4000 의 폴리에틸렌글리콜 용액 중에서, 30 ∼ 40 ℃, 바람직하게는 35 ∼ 38 ℃ 의 온도에서 항체 생산 세포와 미엘로마 세포를 1 ∼ 10 분간, 바람직하게는 5 ∼ 8 분간 혼합한다.

(e) 하이브리도마군의 선택

상기 세포 융합에 의해 얻어지는 하이브리도마의 선택 방법은 특별히 제한은 없지만, 통상적으로 HAT (히포크산틴·아미노프테린·티미딘) 선택법 (Kohler et al., Nature (1975) 256, p.495 ; Milstein et al., Nature (1977) 266, p.550) 이 사용된다.

이 방법은, 아미노프테린에서 생존할 수 없는 HGPRT 결손주의 미엘로마 세포를 사용하여 하이브리도마를 얻는 경우에 유효하다.

즉, 미융합 세포 및 하이브리도마를 HAT 배지에서 배양함으로써, 아미노프테린에 대한 내성을 가진 하이브리도마만을 선택적으로 잔존시키고, 또한 증식시킬 수 있다.

(f) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝)

하이브리도마의 클로닝법으로는, 예를 들어 메틸셀룰로오스법, 연 (軟) 아가로오스법, 한계 희석법 등의 공지된 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어 Barbara, B. M. and Stanley, M. S. : Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980) 참조). 이들 방법 중, 특히 메틸셀룰로오스법 등의 삼차원 배양법이 바람직하다. 예를 들어, 세포 융합에 의해 형성된 하이브리도마군을 ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies 사 제조, #03804) 등의 메틸셀룰로오스 배지에 현탁하여 배양하고, 형성된 하이브리도마 콜로니를 회수함으로써 모노클론 하이브리도마의 취득이 가능하다. 회수된 각 하이브리도마 콜로니를 배양하고, 얻어진 하이브리도마 배양 상청 중에 안정적으로 항체가가 관찰된 것을 GARP 모노클로날 항체 생산 하이브리도마주로서 선택한다.

이와 같이 하여 수립된 하이브리도마주의 예로는, GARP 하이브리도마 151D 및 198D 를 들 수 있다. 또한, 본 명세서 중에 있어서는, GARP 하이브리도마 151D 및 198D 가 생산하는 항체를, 「151D 항체」 혹은 「198D 항체」 또는 간단히 「151D」 혹은 「198D」 라고 기재한다.

151D 항체의 중사슬 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 15 에 나타내는 아미노산 배열을 갖는다. 또, 151D 항체의 경사슬 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 17 에 나타내는 아미노산 배열을 갖는다. 또한, 배열표의 배열 번호 15 에 나타내는 중사슬 가변 영역의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 14 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 또, 배열표의 배열 번호 17 에 나타내는 경사슬 가변 영역의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 16 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다.

198D 항체의 중사슬 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 19 에 나타내는 아미노산 배열을 갖는다. 또, 198D 항체의 경사슬 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 21 에 나타내는 아미노산 배열을 갖는다. 또한, 배열표의 배열 번호 19 에 나타내는 중사슬 가변 영역의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 18 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 또, 배열표의 배열 번호 21 에 나타내는 경사슬 가변 영역의 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 20 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다.

(g) 하이브리도마의 배양에 의한 모노클로날 항체의 조제

이와 같이 하여 선택된 하이브리도마는, 이것을 배양함으로써, 모노클로날 항체를 효율적으로 얻을 수 있지만, 배양에 앞서, 목적으로 하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 스크리닝하는 것이 바람직하다.

이 스크리닝에는 그 자체가 이미 알려진 방법을 채용할 수 있다.

본 발명에 있어서의 항체가의 측정은, 예를 들어 상기 (b) 의 항목에서 설명한 ELISA 법에 의해 실시할 수 있다.

이상의 방법에 의해 얻은 하이브리도마는, 액체 질소 중 또는 -80 ℃ 이하의 냉동고 중에 동결 상태로 보존할 수 있다.

클로닝을 완료한 하이브리도마는, 배지를 HT 배지에서 정상 배지로 바꾸어 배양된다.

대량 배양은, 대형 배양병을 사용한 회전 배양, 혹은 스피너 배양으로 실시된다. 이 대량 배양에 있어서의 상청으로부터, 겔 여과 등, 당업자에게 주지된 방법을 사용하여 정제함으로써, 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 얻을 수 있다.

또, 동 계통의 마우스 (예를 들어, 상기의 BALB/c), 혹은 Nu/Nu 마우스의 복강 내에 하이브리도마를 주사하고, 그 하이브리도마를 증식시킴으로써, 본 발명의 모노클로날 항체를 대량으로 함유하는 복수를 얻을 수 있다.

복강 내에 투여하는 경우에는, 사전 (3 ∼ 7 일 전) 에 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸 (2,6,10,14-tetramethyl pentadecane) (프리스탄) 등의 광물유를 투여하면, 보다 다량의 복수가 얻어진다.

예를 들어, 하이브리도마와 동 계통의 마우스의 복강 내에 미리 면역 억제제를 주사하고, T 세포를 불활성화시킨 후, 20 일 후에 10⁶∼ 10⁷ 개의 하이브리도마·클론 세포를, 혈청을 함유하지 않는 배지 중에 부유 (0.5 ㎖) 시켜 복강 내에 투여하고, 통상적으로 복부가 팽만되어, 복수가 고인 시점에서 마우스로부터 복수를 채취한다. 이 방법에 의해, 배양액 중에 비해 약 100 배 이상의 농도의 모노클로날 항체가 얻어진다.

상기 방법에 의해 얻은 모노클로날 항체는, 예를 들어 Weir, D. M. : Handbook of Experimental Immunology, Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978) 에 기재되어 있는 방법으로 정제할 수 있다.

이렇게 하여 얻어지는 모노클로날 항체는, GARP 에 대해 높은 항원 특이성을 갖는다.

(h) 모노클로날 항체의 검정

얻어진 모노클로날 항체의 아이소 타입 및 서브 클래스의 결정은 이하와 같이 실시할 수 있다.

먼저, 동정법으로는 옥털로니 (Ouchterlony) 법, ELISA 법, 또는 RIA 법을 들 수 있다.

옥털로니법은 간편하기는 하지만, 모노클로날 항체의 농도가 낮은 경우에는 농축 조작이 필요하다.

한편, ELISA 법 또는 RIA 법을 사용한 경우에는, 배양 상청을 그대로 항원 흡착 고상과 반응시키고, 추가로 제 2 차 항체로서 각종 이뮤노글로블린 아이소 타입, 서브 클래스에 대응하는 항체를 사용함으로써, 모노클로날 항체의 아이소 타입, 서브 클래스를 동정하는 것이 가능하다.

또, 더욱 간편한 방법으로서, 시판되는 동정용 키트 (예를 들어, 마우스 타이퍼 키트 ; 바이오래드사 제조) 등을 이용할 수도 있다.

또한, 단백질의 정량은, 폴린로리법, 및 280 ㎚ 에 있어서의 흡광도 [1.4 (OD280) = 이뮤노글로블린 1 ㎎/㎖] 로부터 산출하는 방법에 의해 실시할 수 있다.

또한, (2) 의 (a) 내지 (h) 의 공정을 다시 실시하여 별도로 독립적으로 모노클로날 항체를 취득한 경우에 있어서도, F105 항체, F110 항체, 151D 유래 항체 (인간화 151D 항체) 및 198D 유래 항체 (인간화 198D 항체) 와 동등한 특성을 갖는 항체를 취득하는 것이 가능하다. 이와 같은 항체의 일례로서, 상기 각 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 들 수 있다. F105 항체는 GARP 의 아미노산 배열 (배열 번호 1) 에 있어서 아미노산 번호 366 내지 377, 407 내지 445 및 456 내지 470 을 인식하고, F110 항체는 당해 배열에 있어서 아미노산 번호 54 내지 112 및 366 내지 392 를 인식하고, 151D 유래 항체 (인간화 151D 항체) 는 당해 배열에 있어서 아미노산 번호 352 내지 392 를 인식하고, 및 198D 유래 항체 (인간화 98D 항체) 는 당해 배열에 있어서 아미노산 번호 18 내지 112 를 인식하여 결합하므로, 특히 당해 에피토프로는 GARP 의 아미노산 배열에 있어서의 당해 영역을 에피토프로서 들 수 있다.

새롭게 제조된 모노클로날 항체가 상기 F105 항체 등이 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 결합하면, 당해 모노클로날 항체가 상기 F105 항체 등의 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 또, 상기 F105 항체 등의 항체의 GARP 에 대한 결합에 대해 당해 모노클로날 항체가 경합하는 (즉, 당해 모노클로날 항체가 상기 F105 항체 등의 항체와 GARP 의 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 배열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 당해 모노클로날 항체가 상기 F105 항체 등의 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 에피토프가 동일하다는 것이 확인되었을 경우, 당해 모노클로날 항체가 상기 F105 항체 등의 항체와 동등한 특성을 가지고 있을 것이 강하게 기대된다.

(3) 그 밖의 항체

본 발명의 항체에는, 상기 GARP 에 대한 모노클로날 항체에 더하여, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들어, 키메라 (Chimeric) 항체, 인간화 (Humanized) 항체, 및 상기의 인간 항체 등도 포함된다. 이들 항체는 이미 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

얻어진 항체는 균일해질 때까지 정제할 수 있다. 항체의 분리, 정제는 통상적인 단백질로 사용되고 있는 분리, 정제 방법을 사용하면 된다. 예를 들어 칼럼 크로마토그래피, 필터 여과, 한외 여과, 염석, 투석, 조제용 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동, 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리, 정제할 수 있지만 (Strategies for Protein Purification and Characterization : A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996) ; Antibodies : A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 이들에 한정되는 것은 아니다.

크로마토그래피로는, 어피니티 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 들 수 있다.

이들 크로마토그래피는, HPLC 나 FPLC 등의 액체 크로마토그래피를 사용하여 실시할 수 있다.

어피니티 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로는, 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 예를 들어 프로테인 A 칼럼을 사용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F. F. (파르마시아) 등을 들 수 있다.

또 항원을 고정화시킨 담체를 사용하여, 항원에의 결합성을 이용하여 항체를 정제할 수도 있다.

얻어진 항체는, 후술하는 실시예에 나타낸 방법 등에 의해 항원에 대한 결합성을 평가하여, 바람직한 항체를 선발할 수 있다.

항체의 성질을 비교할 때의 지표로는, 항체의 안정성을 들 수 있다. 시차 주사 칼로리메트리 (DSC) 는 단백의 상대적 구조 안정성이 양호한 지표가 되는 열변성 중점 (Tm) 을 빠르고, 또 정확하게 측정할 수 있는 장치이다. DSC 를 사용하여 Tm 값을 측정하고, 그 값을 비교함으로써, 열 안정성의 차이를 비교할 수 있다. 항체의 보존 안정성은, 항체의 열 안정성과 어느 정도의 상관을 나타내는 것이 알려져 있고 (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, p.265-273), 열 안정성을 지표로, 바람직한 항체를 선발할 수 있다. 항체를 선발하기 위한 다른 지표로는, 적절한 숙주 세포에 있어서의 수량이 높은 것, 및 수용액 중에서의 응집성이 낮은 것을 들 수 있다. 예를 들어 수량이 가장 높은 항체가 가장 높은 열 안정성을 나타낸다고는 할 수 없기 때문에, 이상에 서술한 지표에 기초하여 종합적으로 판단하여, 인간에 대한 투여에 가장 적합한 항체를 선발할 필요가 있다.

본 발명의 항 GARP 인간 항체로는, 상기 파지 디스플레이법에 의해 얻어지는 항체를 들 수 있고, 바람직하게는 하기 구조를 갖는 105F 항체 및 110F 항체를 들 수 있다.

105F 항체의 중사슬은, 배열표의 배열 번호 2 에 나타내는 아미노산 배열을 갖는다. 배열표의 배열 번호 2 에 나타내는 중사슬 아미노산 배열 중에서, 1 내지 118 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이고, 119 내지 448 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다. 당해 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 2 에 있어서, 26 내지 35 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 50 내지 66 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 및 99 내지 107 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다. 또, 배열 번호 2 의 배열은 도 2 에 기재되어 있다.

105F 항체의 경사슬은, 배열표의 배열 번호 3 에 나타내는 아미노산 배열을 갖는다. 배열표의 배열 번호 3 에 나타내는 경사슬 아미노산 배열 중에서, 1 내지 112 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이고, 113 내지 217 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다. 당해 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 3 에 있어서, 23 내지 36 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 52 내지 58 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 및 91 내지 101 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 을 갖는다. 또, 배열 번호 3 의 배열은 도 3 에 기재되어 있다.

110F 항체의 중사슬은, 배열표의 배열 번호 4 에 나타내는 아미노산 배열을 갖는다. 배열표의 배열 번호 4 에 나타내는 중사슬 아미노산 배열 중에서, 1 내지 123 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이고, 124 내지 453 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다. 당해 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 4 에 있어서, 26 내지 35 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 50 내지 66 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 및 99 내지 112 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다. 또, 배열 번호 4 의 배열은 도 4 에 기재되어 있다.

110F 항체의 경사슬은, 배열표의 배열 번호 5 에 나타내는 아미노산 배열을 갖는다. 배열표의 배열 번호 5 에 나타내는 경사슬 아미노산 배열 중에서, 1 내지 111 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이고, 112 내지 216 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다. 당해 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 5 에 있어서, 23 내지 36 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 52 내지 58 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 및 91 내지 100 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 을 갖는다. 또, 배열 번호 5 의 배열은 도 5 에 기재되어 있다.

배열표의 배열 번호 2 에 나타내는 105F 항체 중사슬 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 6 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 배열표의 배열 번호 6 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 354 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 105F 항체의 중사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 355 내지 1344 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 105F 항체의 중사슬 정상 영역을 코드하고 있다. 당해 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열 번호 6 에 있어서, CDRH1 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 76 내지 105 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, CDRH2 를 코드하는 뉴클레오티드 번호 148 내지 198 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 및 CDRH3 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 295 내지 321 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 갖는다. 또, 배열 번호 6 의 배열은 도 6 에 기재되어 있다.

배열표의 배열 번호 3 에 나타내는 105F 항체 경사슬 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 7 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 배열표의 배열 번호 7 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 336 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 105F 항체의 경사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 337 내지 651 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 105F 항체의 경사슬 정상 영역을 코드하고 있다. 당해 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열 번호 7 에 있어서, CDRL1 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 67 내지 108 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, CDRL2 를 코드하는 뉴클레오티드 번호 154 내지 174 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 및 CDRL3 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 271 내지 303 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 갖는다. 또, 배열 번호 7 의 배열은 도 7 에 기재되어 있다.

배열표의 배열 번호 4 에 나타내는 110F 항체 중사슬 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 8 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 배열표의 배열 번호 8 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 369 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 110F 항체의 중사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 370 내지 1359 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 110F 항체의 중사슬 정상 영역을 코드하고 있다. 당해 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열 번호 8 에 있어서, CDRH1 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 76 내지 105 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, CDRH2 를 코드하는 뉴클레오티드 번호 148 내지 198 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 및 CDRH3 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 295 내지 336 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 갖는다. 또, 배열 번호 8 의 배열은 도 8 에 기재되어 있다.

배열표의 배열 번호 5 에 나타내는 110F 항체 경사슬 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 9 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 배열표의 배열 번호 9 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 333 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 110F 항체의 경사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 334 내지 648 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 110F 항체의 경사슬 정상 영역을 코드하고 있다. 당해 가변 영역을 코드하는 뉴클레오티드 배열은, 배열 번호 9 에 있어서, CDRL1 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 67 내지 108 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, CDRL2 를 코드하는 뉴클레오티드 번호 154 내지 174 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드, 및 CDRL3 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 271 내지 300 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 폴리뉴클레오티드를 갖는다. 또, 배열 번호 9 의 배열은 도 9 에 기재되어 있다.

본 발명의 항체에는, 상기 항 GARP 인간 항체에 더하여, 상기의 항체 취득 방법 이외의 방법에 의해, 별도로 독립적으로 항체를 취득했을 경우에 있어서도, 105F 항체 또는 110F 항체와 동등한 세포 상해 활성을 갖는 항체를 취득하는 것이 가능하다. 이와 같은 항체의 일례로서, 105F 항체 또는 110F 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 들 수 있다.

새롭게 제조된 항체가, 105F 항체 또는 110F 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 결합하면, 당해 항체가 105F 항체 또는 110F 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 또, 105F 항체 또는 110F 항체의 GARP 에 대한 결합에 대해 당해 항체가 경합하는 (즉, 당해 항체가 105F 항체 또는 110F 항체와 GARP 의 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 배열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 당해 항체가 105F 항체 또는 110F 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 에피토프가 동일하다는 것이 확인되었을 경우, 당해 항체가 105F 항체 또는 110F 항체와 동등한 세포 상해 활성을 가지고 있을 것이 강하게 기대된다.

또한, 본 발명의 항체에는, 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체도 포함된다. 이들 항체는 이미 알려진 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 당해 항체로는, 적어도 상기 105F 항체 또는 110F 항체의 각 중사슬 및 경사슬의 6 종 모든 CDR 을 갖고, ADCC 활성 및 Treg 의 면역 억제 기능에 대한 저해 활성을 갖는 항체인 것이 바람직하고, 당해 특성을 갖는 한, 특정한 항체에 한정되지 않는다. 더욱 바람직하게는 상기 105F 항체 또는 110F 항체의 각 중사슬 가변 영역 및 경사슬 가변 영역을 갖는 항체이다.

또, 105F 항체 또는 110F 항체의 각 중사슬 아미노산 배열 및 경사슬 아미노산 배열과 높은 상동성을 나타내는 배열을 조합함으로써, 당해 항체와 동등한 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다. 이와 같은 상동성은, 일반적으로는 80 ％ 이상의 상동성이고, 바람직하게는 90 ％ 이상의 상동성이고, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 상동성이고, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상의 상동성이다 (단, 각 CDR 은 상기의 각 항체와 동일하다). 또, 상기 중사슬 또는 경사슬의 아미노산 배열 (단, 각 CDR 의 부위를 제외한다) 에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열을 조합함으로써도, 상기의 각 항체와 동등한 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다.

또 본 발명에 관련된 항 GARP 항체로는, 하기의 키메라 항체 및 인간화 항체를 들 수 있다.

키메라 항체로는, 항체의 가변 영역과 정상 영역이 서로 이종인 항체, 예를 들어 마우스 또는 래트 유래 항체의 가변 영역을 인간 유래의 정상 영역에 접합한 키메라 항체를 들 수 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 6851-6855, (1984) 참조).

래트 항인간 GARP 항체 151D 유래의 키메라 항체는, 배열 번호 15 의 1 내지 117 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 17 의 1 내지 109 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체이고, 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.

또, 래트 항인간 GARP 항체 198D 유래의 키메라 항체는, 배열 번호 19 의 1 내지 120 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬 및 배열 번호 21 의 1 내지 109 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬로 이루어지는 항체이고, 임의의 인간 유래의 정상 영역을 가지고 있어도 된다.

이와 같은 키메라 항체의 예로서, 배열표의 배열 번호 25 의 20 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 27 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 및 배열표의 배열 번호 29 의 20 내지 469 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 31 의 21 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.

또한, 배열표의 배열 번호 25 에 나타내는 중사슬 배열 중에서, 1 내지 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 시그널 배열이고, 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이고, 137 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다.

또, 배열표의 배열 번호 27 에 나타내는 경사슬 배열 중에서, 1 내지 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 시그널 배열이고, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이고, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다.

또한, 배열표의 배열 번호 29 에 나타내는 중사슬 배열 중에서, 1 내지 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 시그널 배열이고, 20 내지 139 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이고, 140 내지 469 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다.

또, 배열표의 배열 번호 31 에 나타내는 경사슬 배열 중에서, 1 내지 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 시그널 배열이고, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이고, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다.

배열표의 배열 번호 25 에 나타내는 c151D 항체의 중사슬 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 24 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 배열표의 배열 번호 24 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 c151D 항체의 중사슬 시그널 배열을 코드하고 있고, 58 내지 408 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 c151D 항체의 중사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 409 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 c151D 항체의 중사슬 정상 영역을 코드하고 있다.

또, 배열표의 배열 번호 27 에 나타내는 c151D 항체의 경사슬 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 26 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 배열표의 배열 번호 26 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 c151D 항체의 경사슬 시그널 배열을 코드하고 있고, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 c151D 항체의 경사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 c151D 항체의 경사슬 정상 영역을 코드하고 있다.

또한, 배열표의 배열 번호 29 에 나타내는 c198D 항체의 중사슬 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 28 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 배열표의 배열 번호 28 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 c198D 항체의 중사슬 시그널 배열을 코드하고 있고, 58 내지 417 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 c198D 항체의 중사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 418 내지 1407 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 c198D 항체의 중사슬 정상 영역을 코드하고 있다.

또, 배열표의 배열 번호 31 에 나타내는 c198D 항체의 경사슬 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 배열표의 배열 번호 30 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 c198D 항체의 경사슬 시그널 배열을 코드하고 있고, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 c198D 항체의 경사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 c198D 항체의 경사슬 정상 영역을 코드하고 있다.

인간화 항체로는, 상보성 결정 영역 (CDR ; complementarity determining region) 만을 인간 유래의 항체에 삽입한 항체 (Nature (1986) 321, p.522-525 참조), CDR 이식법에 의해, CDR 의 배열에 더하여 일부의 프레임 워크의 아미노산 잔기도 인간 항체에 이식한 항체 (국제 공개 팜플렛 WO90/07861) 를 들 수 있다.

단, 151D 항체 유래의 인간화 항체로는, 151D 항체의 6 종 모든 CDR 배열을 유지하고, 항종양 활성을 갖는 한, 특정한 인간화 항체에 한정되지 않는다.

또한, 151D 항체의 중사슬 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 15 에 있어서 아미노산 번호 26 내지 35 의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1 (GFTFSNYYMA), 배열 번호 15 에 있어서 아미노산 번호 50 내지 59 의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 (SIGTVGGNTY), 및 배열 번호 15 에 있어서 아미노산 번호 99 내지 106 의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 (EDYGGFPH) 을 보유하고 있다.

또, 151D 항체의 경사슬 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 17 에 있어서 아미노산 번호 24 내지 34 의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1 (KASQNVGTNVD), 배열 번호 17 에 있어서 아미노산 번호 50 내지 56 의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 (GASNRYT), 및 배열 번호 17 에 있어서 아미노산 번호 89 내지 97 의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 (LQYKYNPYT) 을 보유하고 있다.

또한, 198D 항체의 중사슬 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 19 에 있어서 아미노산 번호 26 내지 35 의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1 (GFSLTSFHVS), 배열 번호 19 에 있어서 아미노산 번호 50 내지 58 의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 (TISSGGGTY), 및 배열 번호 19 에 있어서 아미노산 번호 98 내지 109 의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 (ISGWGHYYVMDV) 을 보유하고 있다.

또, 198D 항체의 경사슬 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 21 에 있어서 아미노산 번호 24 내지 34 의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1 (QASEDIYSGLA), 배열 번호 21 에 있어서 아미노산 번호 50 내지 56 의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 (GAGSLQD), 및 배열 번호 21 에 있어서 아미노산 번호 89 내지 97 의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 (QQGLKFPLT) 을 보유하고 있다.

래트 항체 151D 의 인간화 항체의 실례로는, (1) 배열표의 배열 번호 33 (h151D-H1) 또는 35 (h151D-H4) 의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열, (2) 상기 (1) 의 배열에 있어서 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열, 및 (3) 상기 (1) 의 배열에 있어서의 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열 중 어느 하나로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬, 그리고 (4) 배열 번호 37 (h151D-L1) 또는 39 (h151D-L4) 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열, (5) 상기 (4) 의 배열에 있어서 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열, 및 (6) 상기 (4) 의 배열에 있어서의 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열 중 어느 하나로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬의 임의의 조합을 들 수 있다.

또, 래트 항체 198D 의 인간화 항체의 실례로는, (1) 배열표의 배열 번호 41 (h198D-H3) 의 20 내지 139 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열, (2) 상기 (1) 의 배열에 있어서 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열, 및 (3) 상기 (1) 의 배열에 있어서의 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열 중 어느 하나로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 포함하는 중사슬, 그리고 (4) 배열 번호 43 (h198D-L4) 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열, (5) 상기 (4) 의 배열에 있어서 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열, 및 (6) 상기 (4) 의 배열에 있어서의 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열 중 어느 하나로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 포함하는 경사슬의 임의의 조합을 들 수 있다.

인간화 151D 항체의 중사슬 및 경사슬의 바람직한 조합으로는, 배열 번호 33 의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 갖는 중사슬 및 배열 번호 37 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체, 그리고 배열 번호 35 의 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 갖는 중사슬 및 배열 번호 39 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.

더욱 바람직한 조합으로는, 배열 번호 33 의 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 37 의 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체 (h151D-H1L1), 그리고 배열 번호 35 의 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 39 의 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체 (h151D-H4L4) 를 들 수 있다.

인간화 198D 항체의 중사슬 및 경사슬의 바람직한 조합으로는, 배열 번호 41 의 20 내지 139 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역을 갖는 중사슬 및 배열 번호 43 의 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체를 들 수 있다.

더욱 바람직한 조합으로는, 배열 번호 41 의 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 43 의 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 항체 (h198D-H3L4) 를 들 수 있다.

상기의 중사슬 아미노산 배열 및 경사슬 아미노산 배열과 높은 상동성을 나타내는 배열을 조합함으로써, 상기의 각 항체와 동등한 세포 상해성 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다. 이와 같은 상동성은, 일반적으로는 80 ％ 이상의 상동성이고, 바람직하게는 90 ％ 이상의 상동성이고, 보다 바람직하게는 95 ％ 이상의 상동성이고, 가장 바람직하게는 99 ％ 이상의 상동성이다. 또, 중사슬 또는 경사슬의 아미노산 배열에 1 내지 수 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 배열을 조합함으로써도, 상기의 각 항체와 동등한 세포 상해성 활성을 갖는 항체를 선택하는 것이 가능하다.

또한, 본 명세서 중에 있어서의 「수 개」 란, 1 내지 10 개, 1 내지 9 개, 1 내지 8 개, 1 내지 7 개, 1 내지 6 개, 1 내지 5 개, 1 내지 4 개, 1 내지 3 개, 또는 1 혹은 2 개를 의미한다.

또, 본 명세서 중에 있어서의 아미노산의 치환으로는 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 보존적 아미노산 치환이란, 아미노산 측사슬에 관련이 있는 아미노산 그룹 내에서 생기는 치환이다. 바람직한 아미노산 그룹은 이하와 같다 : 산성 그룹 = 아스파르트산, 글루탐산 ; 염기성 그룹 = 리신, 아르기닌, 히스티딘 ; 비극성 그룹 = 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판 ; 및 비대전극성 패밀리 = 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 티로신. 다른 바람직한 아미노산 그룹은 다음과 같다 : 지방족 하이드록시 그룹 = 세린 및 트레오닌 ; 아미드 함유 그룹 = 아스파라긴 및 글루타민 ; 지방족 그룹 = 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신 ; 그리고 방향족 그룹 = 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신. 이러한 아미노산 치환은 원래의 아미노산 배열을 갖는 물질의 특성을 저하시키지 않는 범위에서 실시하는 것이 바람직하다.

2 종류의 아미노산 배열간의 상동성은, Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), 「Gapped BLAST and PSI-BLAST : a new generation of protein database search programs」, Nucleic Acids Res.25 : 3389-3402) 의 디폴트 파라미터를 사용함으로써 결정할 수 있다. Blast algorithm 은, 인터넷으로 www.ncbi.nlm.nih.gov/blast 에 액세스함으로써도 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 항체에 관련된 뉴클레오티드 배열과 다른 항체의 뉴클레오티드 배열 사이의 상동성에 대해서도 Blast algorithm 에 의해 결정할 수 있다.

또한, 인간화 151D 항체에 관련된 배열표의 배열 번호 33 또는 35 에 나타내는 중사슬 아미노산 배열 중에서, 1 내지 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 시그널 배열이고, 20 내지 136 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이고, 137 내지 466 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다.

또, 인간화 151D 항체에 관련된 배열표의 배열 번호 37 또는 39 에 나타내는 경사슬 아미노산 배열 중에서, 1 내지 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 시그널 배열이고, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이고, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다.

또한, 인간화 198D 항체에 관련된 배열표의 배열 번호 41 에 나타내는 중사슬 아미노산 배열 중에서, 1 내지 19 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 시그널 배열이고, 20 내지 139 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이고, 140 내지 469 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다.

또, 인간화 198D 항체에 관련된 배열표의 배열 번호 43 에 나타내는 경사슬 아미노산 배열 중에서, 1 내지 20 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 시그널 배열이고, 21 내지 129 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 가변 영역이고, 130 내지 234 번째의 아미노산 잔기로 이루어지는 아미노산 배열은 정상 영역이다.

인간화 151D 항체에 관련된 배열표의 배열 번호 33 또는 35 에 나타내는 중사슬 아미노산 배열은, 각각 배열표의 배열 번호 32 또는 34 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 또, 배열 번호 33 의 배열은 도 21 에, 배열 번호 35 의 배열은 도 23 에, 배열 번호 32 의 배열은 도 31, 및 배열 번호 34 의 배열은 도 33 에 각각 기재되어 있다.

각 뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 인간화 151D 항체의 중사슬 시그널 배열을 코드하고 있고, 58 내지 408 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 인간화 151D 항체 항체의 중사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 409 내지 1398 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 인간화 151D 항체의 중사슬 정상 영역을 코드하고 있다.

인간화 198D 항체에 관련된 배열표의 배열 번호 41 에 나타내는 중사슬 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 40 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 또, 배열 번호 41 의 배열은 도 25 에, 배열 번호 40 의 배열은 도 35 에 기재되어 있다.

뉴클레오티드 배열의 1 내지 57 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 인간화 198D 항체의 중사슬 시그널 배열을 코드하고 있고, 58 내지 417 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 인간화 198D 항체 항체의 중사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 418 내지 1407 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 인간화 198D 항체의 중사슬 정상 영역을 코드하고 있다.

인간화 151D 항체에 관련된 배열표의 배열 번호 37 또는 39 에 나타내는 경사슬 아미노산 배열은, 각각 배열표의 배열 번호 36 또는 38 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 또, 배열 번호 37 의 배열은 도 22 에, 배열 번호 39 의 배열은 도 24 에, 배열 번호 36 의 배열은 도 32 에, 및 배열 번호 38 의 배열은 도 34 에 각각 기재되어 있다.

각 뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 인간화 151D 항체의 경사슬 시그널 배열을 코드하고 있고, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 인간화 151D 항체의 경사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 인간화 151D 항체의 경사슬 정상 영역을 코드하고 있다.

인간화 198D 항체에 관련된 배열표의 배열 번호 43 에 나타내는 경사슬 아미노산 배열은, 배열표의 배열 번호 42 에 나타내는 뉴클레오티드 배열에 의해 코드되어 있다. 또, 배열 번호 43 의 배열은 도 26 에, 배열 번호 42 의 배열은 도 36 에 기재되어 있다.

뉴클레오티드 배열의 1 내지 60 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 인간화 198D 항체의 경사슬 시그널 배열을 코드하고 있고, 61 내지 387 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 인간화 198D 항체의 경사슬 가변 영역을 코드하고 있고, 그리고 388 내지 702 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 뉴클레오티드 배열은 인간화 198D 항체의 경사슬 정상 영역을 코드하고 있다.

이들 뉴클레오티드 배열과 다른 항체의 뉴클레오티드 배열 사이의 상동성에 대해서도 Blast algorithm 에 의해 결정할 수 있다.

본 발명의 항체로는, 추가로 인간화 151D 항체 또는 인간화 198D 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 인간 항체를 들 수 있다. 항 GARP 인간 항체란, 인간 염색체 유래의 항체의 유전자 배열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항 GARP 인간 항체는, 전술한 방법으로 취득할 수 있다.

새롭게 제조된 인간 항체가, 인간화 151D 항체 또는 인간화 198D 항체가 결합하는 부분 펩티드 또는 부분 입체 구조에 결합하면, 당해 인간 항체가 인간화 151D 항체 또는 인간화 198D 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 또, 인간화 151D 항체 또는 인간화 198D 항체의 GARP 에 대한 결합에 대해 당해 인간 항체가 경합하는 (즉, 당해 인간 항체가 인간화 151D 항체 또는 인간화 198D 항체와 GARP 의 결합을 방해하는) 것을 확인함으로써, 구체적인 에피토프의 배열 또는 구조가 결정되어 있지 않아도, 당해 인간 항체가 인간화 151D 항체 또는 인간화 198D 항체와 동일한 에피토프에 결합한다고 판정할 수 있다. 에피토프가 동일하다는 것이 확인되었을 경우, 당해 인간 항체가 인간화 151D 항체 또는 인간화 198D 항체와 동등한 세포 상해 활성을 가지고 있을 것이 강하게 기대된다.

이상의 방법에 의해 얻어진 키메라 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체는, 후술하는 실시예에 나타낸 방법 등에 의해 항원에 대한 결합성을 평가하여, 바람직한 항체를 선발할 수 있다.

본 발명에는 항체의 수식체도 포함된다. 당해 수식체란, 본 발명의 항체에 화학적 또는 생물학적인 수식이 실시되어 이루어지는 것을 의미한다. 화학적인 수식체에는, 아미노산 골격에의 화학 부분의 결합, N-결합 또는 O-결합 탄수화물 사슬의 화학 수식체 등이 포함된다. 생물학적인 수식체에는, 번역 후 수식 (예를 들어, N-결합 또는 O-결합에의 당 사슬 부가, N 말단 또는 C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화) 된 것, 원핵 생물 숙주 세포를 사용하여 발현시킴으로써 N 말단에 메티오닌 잔기가 부가된 것 등이 포함된다. 또, 본 발명의 항체 또는 항원의 검출 또는 단리를 가능하게 하기 위해서 표지된 것, 예를 들어, 효소 표지체, 형광 표지체, 어피니티 표지체도 이러한 수식물의 의미에 포함된다. 이와 같은 본 발명의 항체의 수식물은, 원래의 본 발명의 항체의 안정성 및 혈중 체류성의 개선, 항원성의 저감, 이러한 항체 또는 항원의 검출 또는 단리 등에 유용하다.

또, 본 발명의 항체에 결합하고 있는 당 사슬 수식을 조절함 (글리코실화, 탈푸코오스화 등) 으로써, 항체 의존성 세포 상해 활성을 증강시키는 것이 가능하다. 항체의 당 사슬 수식의 조절 기술로는, WO99/54342, WO00/61739, WO02/31140 등이 알려져 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 항체에는 당해 당 사슬 수식을 조절한 항체도 포함된다.

항체 유전자를 일단 단리한 후, 적당한 숙주에 도입하여 항체를 제조하는 경우에는, 적당한 숙주와 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 항체 유전자의 구체예로는, 본 명세서에 기재된 항체의 중사슬 배열을 코드하는 유전자, 및 경사슬 배열을 코드하는 유전자를 조합한 것을 들 수 있다. 숙주 세포를 형질 전환할 때에는, 중사슬 배열 유전자와 경사슬 배열 유전자는, 동일한 발현 벡터에 삽입되어 있는 것이 가능하고, 또 다른 발현 벡터에 삽입되어 있는 것도 가능하다.

진핵 세포를 숙주로서 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 진핵 미생물을 사용할 수 있다. 특히 동물 세포로는, 포유류 세포, 예를 들어, 원숭이의 세포인 COS 세포 (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.175-182, ATCC CRL-1650), 마우스 선유아 세포 NIH3T3 (ATCC : No.CRL-1658) 이나 차이니즈·햄스터 난소 세포 (CHO 세포, ATCC CCL-61) 의 디하이드로 엽산 환원 효소 결손주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1980) 77, p.4126-4220) 를 들 수 있다.

원핵 세포를 사용하는 경우에는, 예를 들어, 대장균, 고초균을 들 수 있다.

이들 세포에 목적으로 하는 항체 유전자를 형질 전환에 의해 도입하고, 형질 전환된 세포를 in vitro 로 배양함으로써 항체가 얻어진다. 당해 배양에 있어서는 항체의 배열에 의해 수량이 상이한 경우가 있으며, 동등한 결합 활성을 갖는 항체 중에서 수량을 지표로 의약으로서의 생산이 용이한 것을 선별하는 것이 가능하다. 따라서, 본 발명의 항체에는, 상기 형질 전환된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체를 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당해 항체의 제조 방법에 의해 얻어지는 항체도 포함된다.

또한, 포유류 배양 세포로 생산되는 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 리신 잔기가 결실되는 것이 알려져 있고 (Journal of Chromatography A, 705 : 129-134 (1995)), 또, 동일하게 중사슬 카르복실 말단의 글리신, 리신의 2 아미노산 잔기가 결실되고, 새롭게 카르복실 말단에 위치하는 프롤린 잔기가 아미드화되는 것이 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, 360 : 75-83 (2007)). 그러나, 이들 중사슬 배열의 결실 및 수식은, 항체의 항원 결합능 및 이펙터 기능 (보체의 활성화나 항체 의존성 세포 장해 작용 등) 에는 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명에는 당해 수식을 받은 항체도 포함되고, 중사슬 카르복실 말단에 있어서 1 또는 2 개의 아미노산이 결실된 결실체, 및 아미드화된 당해 결실체 (예를 들어, 카르복실 말단 부위의 프롤린 잔기가 아미드화된 중사슬) 등을 들 수 있다. 단, 항원 결합능 및 이펙터 기능이 유지되어 있는 한, 본 발명에 관련된 항체의 중사슬의 카르복실 말단의 결실체는 상기의 종류에 한정되지 않는다. 본 발명에 관련된 항체를 구성하는 2 개의 중사슬은, 완전 길이 및 상기의 결실체로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 중 어느 1 종이어도 되고, 어느 2 종을 조합한 것이어도 된다. 각 결실체의 양비는 본 발명에 관련된 항체를 생산하는 포유류 배양 세포의 종류 및 배양 조건에 영향을 받을 수 있지만, 본 발명에 관련된 항체의 주성분으로는 2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단의 하나의 아미노산 잔기가 결실되어 있는 경우를 들 수 있다.

본 발명의 항체의 아이소 타입으로는, 예를 들어 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 를 들 수 있다.

항체의 기능으로는, 일반적으로는 항원 결합 활성, 항원의 활성을 중화시키는 활성, 항원의 활성을 증강시키는 활성, ADCC 활성, 항체 의존성 세포 매개 식작용 (ADCP) 활성 및 보체 의존성 세포 상해 (CDC) 활성 등을 들 수 있지만, 본 발명에 관련된 항체가 갖는 기능은, GARP 에 대한 결합 활성이고, 바람직하게는 ADCC 활성이고, 보다 바람직하게는 ADCC 활성을 통한 Treg 기능 저해 활성에 의한 세포 상해 활성 (항종양 활성) 이다. 또한, 본 발명의 항체는, ADCC 활성에 더하여, ADCP 활성 및/또는 CDC 활성을 겸비하고 있어도 된다. 특히 기존의 항종양 항체를 함유하는 의약에 대해서는, 종양 세포에 직접적으로 작용하여 증식 시그널을 차단하는 것, 종양 세포에 직접적으로 작용하여 세포사 시그널을 유도하는 것, 혈관 신생을 억제하는 것, NK 세포를 통해서 ADCC 활성을 일으키는 것, 및 보체를 통해서 CDC 활성을 유도함으로써 종양 세포의 증식을 억제하는 것이 보고되고 있지만 (J Clin Oncol 28 : 4390-4399. (2010), Clin Cancer Res ; 16(1) ; 11-20. (2010)), 본원 발명에 관련된 항 GARP 항체가 갖는 ADCP 활성에 대해서는, 기존의 항종양 항체를 함유하는 의약의 활성으로서 보고되고 있는 것을 적어도 본 발명자들은 모른다.

본 발명의 항체는, 다량화하여 항원에 대한 친화성을 높인 것이어도 된다. 다량화하는 항체로는, 1 종류의 항체이어도 되고, 동일한 항원의 복수의 에피토프를 인식하는 복수의 항체이어도 된다. 항체를 다량화하는 방법으로는, IgG CH3 도메인과 2 개의 scFv (1 본쇄 항체) 의 결합, 스트렙토아비딘과의 결합, 헬릭스-턴-헬릭스 모티프의 도입 등을 들 수 있다.

본 발명의 항체는, 아미노산 배열이 상이한 복수 종류의 항 GARP 항체의 혼합물인 폴리클로날 항체이어도 된다. 폴리클로날 항체의 일례로는, CDR 이 상이한 복수 종류의 항체의 혼합물을 들 수 있다. 그러한 폴리클로날 항체로는, 상이한 항체를 생산하는 세포의 혼합물을 배양하고, 당해 배양물로부터 정제된 항체를 사용할 수 있다 (WO2004/061104호 참조).

항체의 수식물로서, 폴리에틸렌글리콜 (PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용할 수도 있다.

본 발명의 항체는, 또한 이들 항체와 다른 약제가 콘주게이트를 형성하고 있는 것 (Immunoconjugate) 이어도 된다. 이와 같은 항체의 예로는, 그 항체가 방사성 물질이나 약리 작용을 갖는 화합물과 결합하고 있는 것을 들 수 있고 (Nature Biotechnology (2005) 23, p.1137-1146), 예를 들어, 인듐 (¹¹¹In) 카프로마브 펜데타이드 (Indium (¹¹¹In) Capromab pendetide), 테크네튬 (^99mTc) 노페투모마브 메르펜탄 (Technetium (^99mTc) Nofetumomab merpentan), 인듐 (¹¹¹In) 이브리투모마브 (Indium (¹¹¹In) Ibritumomab), 이트륨 (⁹⁰Y) 이브리투모마브 (Yttrium (⁹⁰Y) Ibritumomab), 요오드 (¹³¹I) 토시투모마브 (Iodine (¹³¹I) Tositumomab) 등을 들 수 있다.

3. 항 GARP 항체를 함유하는 의약

상기 서술한 「2. 항 GARP 항체의 제조」 의 항에 기재된 방법으로 얻어지는 항체는, Treg 에 대해 세포 상해 활성을 나타내므로, 의약으로서, 특히 암 및 감염증 (특히 말라리아 및 HIV 감염증) 에 대한 치료제로서 사용할 수 있다.

in vitro 에서의 항체에 의한 살세포 활성은, 세포의 증식의 억제 활성으로 측정할 수 있다.

예를 들어, GARP 를 과잉 발현하고 있는 암 세포주를 배양하고, 배양계에 여러 가지 농도로 항체를 첨가하여, 포커스 형성, 콜로니 형성 및 스페로이드 증식에 대한 억제 활성을 측정할 수 있다.

in vivo 에서의 실험 동물을 이용한 항체의 암에 대한 치료 효과는, 예를 들어, GARP 를 고발현하고 있는 종양 세포주를 이식한 누드 마우스에 항체를 투여하여, 암 세포의 변화를 측정할 수 있다.

암의 종류로는, 폐암, 신장암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경 교아종, 난소암, 췌암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 혈액암 등을 들 수 있지만, 치료 대상이 되는 암 세포가 GARP 를 발현하고 있는 한 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 의약 조성물에 있어서 허용되는 제제에 사용하는 물질로는 투여량이나 투여 농도에 있어서, 의약 조성물이 투여되는 자에 대해 비독성인 것이 바람직하다.

본 발명의 의약 조성물은, pH, 침투압, 점도, 투명도, 색, 등장성, 무균성, 안정성, 용해율, 서방률 (徐放率), 흡수율, 침투율을 바꾸거나, 유지하거나 하기 위한 제제용 물질을 함유할 수 있다. 제제용 물질로서 이하의 것을 들 수 있지만, 이들에 제한되지 않는다 : 글리신, 알라닌, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신 등의 아미노산류, 항균제, 아스코르브산, 황산나트륨 또는 아황산수소나트륨 등의 항산화제, 인산, 시트르산, 붕산 버퍼, 탄산수소나트륨, 트리스-염산 (Tris-Hcl) 용액 등의 완충제, 만니톨이나 글리신 등의 충전제, 에틸렌디아민사아세트산 (EDTA) 등의 킬레이트제, 카페인, 폴리비닐피롤리딘, β-시클로덱스트린이나 하이드록시프로필-β-시클로덱스트린 등의 착화제, 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린 등의 증량제, 단당류, 이당류 등의 다른 탄수화물, 착색제, 향미제, 희석제, 유화제나 폴리비닐피롤리딘 등의 친수 폴리머, 저분자량 폴리펩티드, 염 형성 카운터 이온, 염화벤즈알코늄, 벤조산, 살리실산, 티메로살, 페네틸알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 클로렉시딘, 소르브산 또는 과산화수소 등의 방부제, 글리세린, 프로필렌·글리콜 또는 폴리에틸렌글리콜 등의 용매, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당 알코올, 현탁제, 소르비탄에스테르, 폴리소르베이트 20 이나 폴리소르베이트 80 등의 폴리소르베이트, 트리톤 (triton), 트로메타민 (tromethamine), 레시틴 또는 콜레스테롤 등의 계면 활성제, 수크로오스나 소르비톨 등의 안정화 증강제, 염화나트륨, 염화칼륨이나 만니톨·소르비톨 등의 탄성 증강제, 수송제, 부형제 및/또는 약학상의 보조제. 이들 제제용 물질의 첨가량은, 항 GARP 항체의 중량에 대하여 0.001 ∼ 100 배, 특히 0.1 ∼ 10 배 첨가하는 것이 바람직하다. 제제 중의 바람직한 의약 조성물의 조성은 당업자에 의해, 적용 질환, 적용 투여 경로 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.

의약 조성물 중의 부형제나 담체는 액체이어도 되고 고체이어도 된다. 적당한 부형제나 담체는 주사용 물이나 생리 식염수, 인공 뇌척수액이나 비경구 투여에 통상적으로 사용되고 있는 다른 물질이어도 된다. 중성의 생리 식염수나 혈청 알부민을 함유하는 생리 식염수를 담체에 사용할 수도 있다. 의약 조성물에는 pH7.0 - 8.5 의 Tris 버퍼, pH4.0 - 5.5 의 아세트산 버퍼, pH3.0 - 6.2 의 시트르산 버퍼를 함유할 수 있다. 또, 이들 버퍼에 소르비톨이나 다른 화합물을 함유할 수도 있다.

본 발명의 의약 조성물에는 항 GARP 항체를 함유하는 의약 조성물, 그리고 항 GARP 항체 및 적어도 하나의 암 치료제를 함유하는 의약 조성물을 들 수 있고, 본 발명의 의약 조성물은 선택된 조성과 필요한 순도를 갖는 약제로서, 동결 건조품 혹은 액체로서 준비된다. 항 GARP 항체를 함유하는 의약 조성물, 그리고 항 GARP 항체 및 적어도 하나의 암 치료약제를 함유하는 의약 조성물은 수크로오스와 같은 적당한 부형제를 사용한 동결 건조품으로서 성형될 수도 있다.

상기의 의약 조성물에 있어서, 항 GARP 항체와 함께 함유되는 암 치료제는, 항 GARP 항체와 동시에, 따로따로, 혹은 연속해서 개체에 투여되어도 되고, 각각의 투여 간격을 바꾸어 투여해도 된다. 이와 같은 암 치료제로서, 아브락산 (abraxane), 카보플라틴 (carboplatin), 시스플라틴 (cisplatin), 젬시타빈 (gemcitabine), 이리노테칸 (irinotecan) (CPT-11), 파클리탁셀 (paclitaxel), 페메트렉시드 (pemetrexed), 소라페닙 (sorafenib), 빈블라스틴 (vinblastin) 또는 국제 공개 제 WO2003/038043호 팜플렛에 기재된 약제, 또한 LH-RH 아날로그 (류프로렐린, 고세렐린 등), 에스트라무스틴·포스페이트, 에스트로젠 길항약 (타목시펜, 랄록시펜 등), 아로마타아제 저해제 (아나스트로졸, 레트로졸, 엑스메스탄 등) 등을 들 수 있지만, 항종양 활성을 갖는 약제이면, 상기의 약제에 한정되지 않는다.

투여 대상이 되는 개체로는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 포유 동물, 더욱 바람직하게는 인간을 들 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은 비경구 투여용으로 조제할 수도 있고, 경구에 의한 소화관 흡수용으로 조제할 수도 있다. 제제의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라 결정할 수 있고, 본 발명의 의약 조성물에 함유되는 항 GARP 항체의 GARP 에 대한 친화성, 즉, GARP 에 대한 해리 정수 (定數) (Kd 값) 에 대해, 친화성이 높을 (Kd 값이 낮을) 수록, 인간에 대한 투여량을 줄여도 약효를 발휘할 수 있기 때문에, 이 결과에 기초하여 본 발명의 의약 조성물의 인간에 대한 투여량을 결정할 수도 있다. 투여량은, 인간형 항 GARP 항체를 인간에 대해 투여할 때에는, 약 0.001 ∼ 100 ㎎/㎏ 을 1 회 혹은 1 ∼ 180 일 사이에 1 회의 간격으로 복수회 투여하면 된다. 본 발명의 의약 조성물의 형태로는, 점적을 포함하는 주사제, 좌제, 경비제 (經鼻劑), 설하제, 경피 흡수제 등을 들 수 있다.

이하, 실시예를 나타내어 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

하기 실시예에 있어서 유전자 조작에 관한 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, 「몰레큘러 클로닝 (Molecular Cloning)」 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold SpringHarbor Laboratory Press 로부터 1989년 발간) 에 기재된 방법 및 그 밖의 당업자가 사용하는 실험서에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라 실시하였다.

실시예 1 : 항체의 취득

1)-1 파지 디스플레이법 (Phage display) 에 있어서의 패닝에 의한 항 GARP Fab 의 분리

n-CoDeR Fab phage library (BioInvent 사) 를 GARP 에 결합하는 Fab 의 분리에 사용하였다. EZ-Link NHS-Chomogenic - Biotin 시약 (Thermo Scientific 사) 을 사용하여, GARP (R ＆ D Systems 사) 를 비오틴화하였다. 액상 패닝은, Dynabeads Streptavidin M-280 (Life Technologies 사) 에 비오틴화 GARP 를 고상화 후, 파지를 첨가하고, 결합하지 않는 파지를 마그넷 스탠드 (DynaMag-2, Life Technologies 사) 를 사용한 세정 조작에 의해 제거하였다. 그 후, GARP 에 결합한 파지를 트립신 (Sigma-Aldrich 사) 처리에 의해 회수하고, 대장균을 사용하여 파지를 증폭시켰다. 합계 3 회의 패닝을 실시하고, 폴리클로날한 파지미드로부터, Fab 를 코드하는 DNA 단편을 제한 효소로 잘라내고, 대장균용의 발현 벡터로 바꾼 후, 대장균 TOP10F' (Life Technologies 사) 를 형질 전환하고, IPTG (Sigma-Aldrich 사) 존재하에서 Fab 를 발현시켜, ELISA 에 의한 스크리닝에 제공하였다.

1)-2 ELISA 에 의한 GARP 결합 Fab 의 스크리닝

384 웰 Maxi-sorp 플레이트 (Black, Nunc 사) 에 PBS (0.138 M 염화나트륨, 0.0027 M 염화칼륨을 함유하는 0.01 M 인산 완충 생리 식염수 (pH7.4), Sigma-Aldrich 사) 로 2 ㎍/㎖ 로 희석시킨 GARP 를 50 ㎕ 씩 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 가만히 정지시켜 고상화하였다. 또는, 384 웰 Maxi-sorp 플레이트에 PBS 로 1 ㎍/㎖ 로 희석시킨 뉴트라비딘 (NeutrAvidin, Life Technologies 사) 을 50 ㎕ 씩 첨가함으로써 고상화 (4 ℃, 하룻밤 가만히 정지) 한 후, ELISA 버퍼 (0.05 ％ Tween-20 (Bio-RAD 사) 를 함유하는 PBS (Sigma-Aldrich 사)) 로 3 회 세정 후, 비오틴화 GARP 를 첨가 (1 p㏖/50 ㎕ PBS/웰) 하고 1 시간 실온에서 진탕하였다. ELISA 버퍼로 3 회 세정 후, Blocker Casein (Thermo Scientific 사) 을 사용하여 블로킹하고, 또한 ELISA 버퍼로 3 회 세정하였다. 그 후, Fab 를 발현시킨 대장균의 배양액을 첨가하고, 실온에서 1 시간 진탕 반응시켰다. ELISA 버퍼로 3 회 세정 후, 2500 배 희석시킨 허스래디시 페록시다제 (Horseradish peroxidase, HRP) 표지 항인간 F(ab')₂ 항체 (R ＆ D Systems 사) 를 50 ㎕ 첨가하고, 추가로 실온에서 1 시간 진탕 반응시켰다. ELISA 버퍼로 3 회 세정 후, SuperSignal Pico ELISA 화학 발광 기질 (Chemiluminescent substrate) (Thermo Scientific 사) 를 첨가하고, 10 분 후의 화학 발광을 플레이트 리더 (Envision 2104 Multilabel Reader, Perkin Elmer) 로 측정하고, GARP 결합 Fab 를 분리하였다.

1)-3 ELISA 양성 클론의 뉴클레오티드 배열의 결정

ELISA 양성 클론 (105F, 110F) 의 중사슬 및 경사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 배열의 해석은, Dye Terminator 법 (BigDye (등록상표) Terminator v3.1, Life Technologies 사) 으로 실시하였다. 배열 해석에 사용한 주요한 프라이머의 배열은 이하와 같다.

Primer A : 5'-GAA ACA GCT ATG AAA TAC CTA TTG C-3' (배열 번호 10)

Primer B : 5'-GCC TGA GCA GTG GAA GTC C-3' (배열 번호 11)

Primer C : 5' -TAG GTA TTT CAT TAT GAC TGT CTC-3' (배열 번호 12)

Primer D : 5'-CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG-3' (배열 번호 13)

상기 해석에 의해, 105F 항체 및 110F 항체 유전자의 가변 영역의 뉴클레오티드 배열을 결정하였다.

105F 항체의 중사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 6 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 354 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이고, 경사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 7 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 336 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이었다.

110F 항체의 중사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 8 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 369 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이고, 경사슬 가변 영역의 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 9 에 나타내는 뉴클레오티드 배열의 1 내지 333 번째의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이었다.

1)-4 : 완전 길이 IgG 화와 IgG 의 발현 정제

105F 및 110F 를 함유하는 ELISA 양성 클론의 완전 길이 IgG 화는 이하의 방법으로 실시하였다.

Fab 를 코드하는 뉴클레오티드 배열을 결정 후, 상기 1)-3 에서 특정한 각 항체의 중사슬 및 경사슬의 가변 영역에 상당하는 뉴클레오티드 배열을 특정하였다.

통상적인 방법에 의해 상기 중사슬의 가변 영역의 뉴클레오티드 배열을 인간 IgG₁ 의 중사슬의 정상 영역 (CH1 + Fc 영역 : 배열표의 배열 번호 2 에 나타내는 아미노산 배열의 119 내지 448 번째의 아미노산 배열) 을 코드하는 뉴클레오티드 배열과 연결하고, 또, 상기 경사슬의 가변 영역의 뉴클레오티드 배열을 인간 IgG₁ 의 경사슬의 정상 영역 (CL : 배열표의 배열 번호 3 에 나타내는 아미노산 배열의 113 내지 217 번째의 아미노산 배열) 을 코드하는 뉴클레오티드 배열과 연결 후, pcDNA3.3 (Invitrogen) 등의 동물 세포용 발현 벡터에 삽입하여, 동물 세포용 IgG 발현 벡터를 구축하였다.

구축한 IgG 발현 벡터의 염기 배열을 재해석하고, 105F 항체의 중사슬 전체 길이의 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 6 에 나타내는 뉴클레오티드 배열이고, 경사슬 전체 길이의 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 7 에 나타내는 뉴클레오티드 배열인 것을 확인하였다.

또, 110F 항체의 중사슬 전체 길이의 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 8 에 나타내는 뉴클레오티드 배열이고, 경사슬 전체 길이의 뉴클레오티드 배열은 배열표의 배열 번호 9 에 나타내는 뉴클레오티드 배열인 것을 확인하였다.

또, 상기 뉴클레오티드 배열로부터, 당해 배열이 코드하는 105F 항체의 중사슬 및 경사슬 전체 길이의 아미노산 배열, 그리고 110F 항체의 중사슬 및 경사슬 전체 길이의 아미노산 배열을 결정하였다.

105F 항체의 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 2 에 나타내는 아미노산 배열이고, 경사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 3 에 나타내는 아미노산 배열이었다.

110F 항체의 중사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 4 에 나타내는 아미노산 배열이고, 경사슬의 아미노산 배열은 배열표의 배열 번호 5 에 나타내는 아미노산 배열이었다.

105F 항체 또는 110F 항체의 IgG 는, FreeStyle 293F 세포 (Life Technologies 사) 에 상기의 동물 세포용 IgG 발현 벡터를 삽입함으로써 일과성 발현시키고, 필요에 따라 프로테인 A 어피니티 (Protein A Affinity) 칼럼 (HiTrap Mab Select SuRe, GE Healthcare 사) 으로 정제 후, vivaspin 20 (7 k MWCO, GE Healthcare 사) 에 의해, IgG 가 용해되어 있는 완충액을 PBS 로 치환하고, 이하의 공정 「1)-5」 에 제공하였다.

1)-5 정제 IgG 를 사용한 ELISA 에 의한 GARP 에의 결합 확인

96 웰 Maxi-sorp 플레이트 (Black, Nunc 사) 에 PBS 로 1 ㎍/㎖ 로 희석시킨 인간 GARP (R ＆ D Systems 사, 형번 : 6055-LR) 를 100 ㎕ 씩 첨가하고, 4 ℃ 에서 하룻밤 가만히 정지시켜 고상화하였다.

ELISA 버퍼로 3 회 세정 후, Blocker Casein 을 사용하여 1 시간 실온에서 블로킹하고, 추가로 ELISA 버퍼로 3 회 세정 후, 50 nM 의 105F 항체, 50 nM 의 110F 항체, 50 nM 의 인간 IgG (Jackson Immuno Research 사), 50 nM 의 마우스 항 GARP 항체 (Plato-1, ENZO Life Science 사) 및 50 nM 의 마우스 IgG (Jackson Immuno Research 사) 를 100 ㎕ 씩 첨가하고, 1 시간 실온에서 진탕 반응시켰다.

ELISA 버퍼로 3 회 세정 후, 105F 항체, 110F 항체 및 인간 IgG 첨가군에는, PBS 로 5000 배 희석시킨 HRP 표지 항인간 Fc 항체 (R ＆ D Systems 사) 를, 마우스 항 GARP 항체와 마우스 IgG 첨가군에는, PBS 로 5000 배 희석시킨 HRP 표지 항마우스 Fc 항체 (R ＆ D Systems 사) 를 100 ㎕ 씩 첨가하고, 실온에서 1 시간 진탕 반응시켰다.

ELISA 버퍼로 5 회 세정 후, SuperSignal Pico ELISA Chemiluminescent substrate 를 0.1 ㎖ 첨가하고, 10 분 후의 화학 발광을 플레이트 리더 (Envision 2104 Multilabel Reader, Perkin Elmer) 로 측정하였다.

그 결과, 105F 항체와 110F 항체는, 시판되는 항 GARP 항체와 동일하게, GARP 에 결합하는 것이 나타났다 (도 10).

실시예 2 : 항원 유전자 발현 세포에의 결합

GARP 발현 벡터는, 인간 GARP 의 cDNA 클론 (Origene 사 제조) 을 구입하고, 통상적인 방법에 따라 pcDNA3.1(+) 벡터 (Invitrogen 사) 에 클로닝하여 염기 배열을 확인하였다.

HEK-293T 세포 (ATCC : CRL-11268) 에, GARP 발현 벡터 및 컨트롤로서 pcDNA3.1 벡터를 Lipofectamin2000 (Invitrogen 사) 을 사용하여 유전자 도입하였다. 10 ％ 소 태아 혈청 (FBS, Hyclone 사) 함유 DMEM 배지 (Invitrogen 사) 중에서 5 ％ CO₂ 의 조건하 37 ℃ 에서 하룻밤 배양한 후, TrypLE Express (Invitrogen 사) 처리에 의해 세포를 플레이트로부터 회수하고, MACS 버퍼 (0.5 ％ BSA, 2 mM EDTA, 함유 PBS, Miltenyi Biotec 사) 로 2 회 세정 후, 동 용액에 현탁하였다. 얻어진 세포 현탁액에 105F 항체 및 컨트롤 인간 IgG (ENZO Life Science 사) 를 첨가하고, 15 분간 4 ℃ 에서 가만히 정지시켰다. MACS 버퍼로 2 회 세정 후, 플루오레세인이소티오시안산염 (Fluorescein isothiocyanate, FITC) 표지 항 IgG 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories 사) 를 첨가하여 현탁하고, 추가로 15 분간 4 ℃ 에서 가만히 정지시켰다. 다시 MACS 버퍼로 2 회 세정 후, 1 ％ PFA (파라포름알데히드 32 ％ 용액 (ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES 사) 으로부터 조제) 로 세포를 고정시키고, 플로우 사이토미터 (Facs Canto II : Becton Dickinson 사) 를 사용하여 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 Flowjo (TreeStar사) 로 실시하고, Horizon FVS450 (Becton Dickinson 사) 을 사용하여 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포의 FITC 형광 강도의 히스토그램을 제조하였다.

벡터만을 도입한 HEK-293T 세포에서는, 105F 항체는 컨트롤 IgG 와 동일한 형광 강도 히스토그램을 나타냈다. 한편, GARP 발현 HEK-293T 세포에서는, 컨트롤 IgG 의 형광 강도 히스토그램에 대해 105F 항체의 히스토그램이 강 (强) 형광 강도측으로 시프트되어 있는 것을 확인하였다 (도 11). 이상의 결과로부터, 105F 항체가 HEK-293T 세포에 발현시킨 GARP 에 특이적으로 결합하는 것이 분명해졌다.

실시예 3 : 내인성 GARP 발현 세포에의 결합

3)-1 L428 세포를 사용한 플로우 사이토메트리 해석

Alexa Fluor 647 모노클론 항체 라벨링 키트 (Alexa Fluor 647 Monoclonal antibody labeling kit (Invitrogen 사) 를 사용하여 105F 항체의 형광 라벨체를 제조하였다. L428 세포 (DSMZ 로부터 입수) 를 MACS 버퍼로 2 회 세정 후, 동 용액에 현탁하고, 라벨화 105F 항체를 첨가하고 30 분간 4 ℃ 에서 가만히 정지시켰다. MACS 버퍼로 2 회 세정하고, 1 ％ PFA 로 세포 고정 후에 플로우 사이토미터 (Facs Canto II, Becton Dickinson 사) 를 사용하여 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 Flowjo (TreeStar 사) 로 실시하고, Horizon FVS450 을 사용하여 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포의 FITC 형광 강도의 히스토그램을 제조하였다. L428 세포의 형광 강도 히스토그램에 대해, 105F 항체를 첨가한 히스토그램의 강형광 강도측으로의 시프트를 관찰하고, 105F 항체가 내인성으로 세포에 발현하고 있는 GARP 에 결합하는 것을 확인하였다 (도 12).

3)-2 인간 Treg 를 사용한 플로우 사이토메트리 해석

정상인의 말초혈 단핵구 (PBMC) 는 Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare 사) 를 사용하여 분리하고, 10 ％ FBS 를 첨가한 RPMI1640 배지 (Invitrogen 사) (이하, RP-F10 배지라고 한다) 를 사용하여, 저부착성 24 웰 플레이트 (Costar 사) 를 사용하여 2 × 10⁶ 세포/㎖ 로 파종하였다. 항 CD3 항체 (BD Pharmingen 사) 와 항 CD28 항체 (BD Pharmingen 사) 를 첨가하여 20 시간 배양 후, 세포를 FACS 버퍼 (10 mM Hepes (Invitrogen 사), 2 mM EDTA (Invitrogen 사), 2 ％ FBS 를 첨가한 HBSS (Invitrogen 사)) 에 현탁하고, 3)-1 에서 조제한 라벨화 105F 항체 및 Alexa Fluor 647 표지 항 GARP 항체 (G14D9, eBioscience 사) 를 첨가하고, 30 분간 빙중 (氷中) 에서 가만히 정지시켰다. 다시 FACS 버퍼로 세포를 세정 후, 고정/투과 워킹 용액 (Fixation/Permeabilization working solution) (eBioscience 사) 를 첨가하고 추가로 30 분간 빙중에서 가만히 정지시키고, 투과 버퍼 (Permeabilization buffer) (eBioscience 사) 를 사용하여 세포를 세정 후, 2 ％ 래트 혈청 (eBioscience 사) 을 첨가하였다. 실온에서 15 분간 가만히 정지시킨 후, PE 표지 항 Foxp3 항체 (eBioscience 사) 를 첨가하고 추가로 실온에서 30 분간 가만히 정지시켰다. 세포 세정 후, 4 ％ 파라포름알데히드 인산염 버퍼 용액 (Paraformaldehyde phosphate buffer solution) (와코우 순약사) 을 D-PBS (Invitrogen 사) 로 2 배로 희석시킨 조직 고정액을 첨가하고, 15 분 이상 4 ℃ 에서 가만히 정지시켰다. FACS 버퍼로 세포를 세정 후, 플로우 사이토미터 (Facs Canto II : Becton Dickinson 사) 를 사용하여 측정하고, FlowJo (Tree Star 사) 로 해석하였다. 그 결과, 105F 항체는, 시판되는 항 GARP 항체와 동일하게, FoxP3 양성 Treg 에 결합하는 것이 나타났다 (도 13).

실시예 4. 항 GARP 항체의 성질

4)-1 ADCC 활성

4)-1-1 이펙터 세포의 조제

정상인의 신선 말초혈로부터 PBMC 를 상기 3)-2 의 방법에 의해 분리하였다. PBMC 로부터 NK 세포를 NK cell isolation kit (Miltenyi Biotec 사) 를 사용하여 정제하였다. 얻어진 NK 세포를 100 IU/㎖ rhIL-2 (Novartis 사) 를 함유하는 RP-F10 배지 (Invitrogen 사) 중에서 하룻밤 순화 (馴化) 배양하였다. 생세포수를 트리판 블루 색소 배제 시험으로 계측하고, 생세포 밀도로 2 × 10⁵ 세포/㎖ 가 되도록 RP-F10 배지로 재현탁하여 이펙터 세포로 하였다.

4)-1-2 표적 세포의 조제

실시예 3)-1 에 기재한 L428 세포를, 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 배지 (Invitrogen 사) 중에 0.6 × 10⁶ 개에 대하여, 크롬-51 (Chromium-51, ⁵¹Cr) 을 30 ㎕ (1110 kBq) 혼합하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 2 시간 배양함으로써 세포를 라벨하였다. 라벨한 세포를 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 배지 (Invitrogen 사) 로 3 회 세정하고, RP-F10 배지로 4 × 10⁴ 세포/㎖ 가 되도록 재현탁하여 표적 세포로 하였다.

4)-1-3 ⁵¹Cr 릴리스 어세이

어세이 종농도가 1, 10, 100, 1000 ng/㎖ 가 되도록 RP-F10 배지로 희석 조제한 105F 항체를 96 웰 U 바닥 마이크로 플레이트 (Costar 사) 에 50 ㎕/웰씩 분주하고, 표적 세포를 첨가 (50 ㎕/웰) 하여 30 분 4 ℃ 에서 가만히 정지시켰다. 이어서, 이펙터 세포를 첨가 (100 ㎕/웰) 하고, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 4 시간 37 ℃ 에서 배양한 후, 상청 50 ㎕/웰을 LumaPlate (PerkinElmer 사) 에 회수하고, 감마 카운터에서 방출된 감마선량을 측정하였다. ADCC 활성에 의한 세포 용해율은 다음 식으로서 산출하였다.

세포 용해율 (％) = (A - B)/(C - B) × 100

A : 샘플 웰의 카운트

B : 자연 방출 (항체·이펙터 세포 비첨가 웰) 카운트의 평균값 (n = 3). 항체 첨가시와 이펙터 세포 첨가시에 각각 RP-F10 배지를 50 ㎕, 100 ㎕ 첨가하였다. 그 이외는 샘플 웰과 동일한 조작을 실시하였다.

C : 최대 방출 (표적 세포를 계면 활성제로 용해시킨 웰) 카운트의 평균값 (n = 3). 항체 첨가시에 RP-F10 배지를 50 ㎕, 이펙터 세포 첨가시에 Triton-X100 (Sigma 사) 을 2 ％ (v/v) 함유하는 RP-F10 배지를 100 ㎕ 첨가하였다. 그 이외는 샘플 웰과 동일한 조작을 실시하였다.

측정 결과를 도 14 에 나타낸다. 105F 항체는, L428 세포에 대해 항체 농도 의존적으로 세포 용해 활성을 나타냈다. 한편 컨트롤 인간 IgG 에 대해서는 세포 용해 활성이 관찰되지 않았다. 이런 점에서, 105F 항체는 내인성 GARP 를 발현하고 있는 L428 세포에 대해 ADCC 활성을 갖는 것이 나타났다. 또한, 특허문헌 1 에 기재된 배열 정보에 기초하여 제조한 인간 IgG1 항 GARP 항체 (MHG8 및 LHG10) 에는 ADCC 활성은 관찰되지 않았다.

4)-2 Treg 기능 저해 활성

4)-2-1 Treg, Teff (이펙터 T 세포 : CD4 양성 CD25 음성 헬퍼 T 세포) 및 액세서리 세포의 조제

4)-1-1 과 동일하게 조제한 PBMC 로부터, CD4 T cell ISOLATION Kit (Miltenyi Biotec 사) 를 사용하여 CD4 양성 T 세포를 분리하고, FITC 표지 항 CD4 항체 (Miltenyi Biotec 사) 및 APC 표지 항 CD25 항체 (Miltenyi Biotec 사) 를 첨가하고 30 분간 4 ℃ 에서 가만히 정지시켰다. 세포 세정 후, MACS 버퍼로 현탁하고, FACS Aria IIu (Becton Dickinson 사) 를 사용하여 CD4 양성 CD25 음성 세포 (Teff) 및 CD4 양성 CD25 강양성 세포 (Treg) 를 분리하였다.

한편, PBMC 로부터 CD3 Microbeads (Miltenyi Biotec 사) 를 사용하여 CD3 양성 세포를 제거 후, X 선 조사 장치 (히타치 메디코사) 를 사용하여 조사선량 1 C/㎏ (흡수선량 38.76 Gy/㎏ (3876 Rad/㎏)) 의 X 선을 조사하여 액세서리 세포를 조제하였다.

4)-2-2 공배양 방법과 Treg 기능 저해 어세이

배양 배지에는, 페니실린 스트렙토마이신 (Penicillin Streptomycin) (Invitrogen 사), 1 × MEM NEAA (Invitrogen 사), 1 × 피루브산나트륨 (Sodium pyruvate) (Invitrogen 사), 5 mM Hepes 및 5 ％ 인간 수컷 AB 혈청 (human male AB serum) (Sigma 사) 을 함유하는 RPMI1640 배지 (Invitrogen 사) 를 사용하였다. 96 웰 U 바닥 마이크로 플레이트의 각 웰에, Teff (2000 세포/웰) 와 액세서리 세포 (20000 세포/웰) 를 혼합하고, 추가로 Treg 를 500 세포/웰이 되도록 첨가 파종하였다. 또, Treg 를 첨가하지 않는 군도 조제하였다. 항 CD3 항체 및 항 CD28 항체, 그리고 105F 항체를 종농도 50 또는 10 ㎍/㎖ 로 첨가하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 5 일간 배양하였다. 그 후, [³H]-티미딘 ([³H]-thymidine) (PerkinElmer 사) 를 18.5 kBq/㎖ 로 조제하여 20 ㎕/웰씩 첨가하고, 추가로 18 시간 배양을 계속하였다. 셀 하베스터 (Mach II, Tomtech 사) 를 사용하여 세포를 필터매트 A (Filtermat A) (PerkinElmer 사) 에 회수하고, 신틸레이션 카운터 (MicroBeta, PerkinElmer 사) 를 사용하여 각 웰의 [³H]-티미딘의 세포 내 도입값을 1 분간당 보정 계수값 (CCPM, corrected count per minute) 으로서 계측하였다.

특허문헌 1 에 기재된 배열 정보에 기초하여 제조한 인간 IgG1 항 GARP 항체 (MHG8 및 LHG10) 에 대해서도 동일하게 본 시험계에 제공하였다.

4)-2-3 저해 활성의 산출

각 공배양 조건의 3 웰의 평균값을 산출하고, Teff 만 증식 활성값에 비해, Treg 를 첨가한 공배양계로 빼어진 Teff 증식 활성값을 「Treg 에 의한 Teff 에 대한 증식 억제율」 (= 1 - [공배양의 CCPM/Teff 만의 CCPM]) 로 하였다. 항체 비첨가시의 Treg 에 의한 억제율에 대해, 각각의 항체를 첨가했을 때에 저해된 억제율 (= [항체 비첨가시의 억제율] - [각 항체 첨가시의 억제율]) 을 각 항체의 Treg 기능의 저해 활성으로 하였다. 또한, 당해 저해 활성은, 각 실험에 공여된 검체마다 산출되는 결과이다.

105F 항체 50 ㎍/㎖ 의 Treg 기능 저해 결과 (저해율 72.6 ％) 를 도 15 에, 105F 항체, MHG-8 및 LHG-10 항체의 10 ㎍/㎖ 의 결과를 도 16 에 나타낸다. MHG-8, LHG-10 항체에는 Treg 기능 저해 활성이 관찰되지 않지만 (저해율 0.8 ％, 0.0 ％), 105F 항체는 현저하게 Treg 기능을 저해 (저해율 65.8 ％) 하는 것이 나타났다. 또한, [비특허문헌 10] 에 기재가 있는 GARP 에 대한 siRNA 를 도입한 Treg 에 의한 상기 저해율을 도 5A 의 CD4+CD25- (Teff) : Treg 가 4 : 1 인 그래프값을 계측하여 개산하면, 15 ％ 정도이었다.

실시예 5 : 래트 항체의 제조

5)-1 GARP 발현 벡터의 조제

GARP 발현 벡터는 실시예 2 에 기재한 발현 벡터를 사용하여, 대량 조제에는, EndoFree Plasmid Giga Kit (QIAGEN 사) 를 사용하였다.

5)-2 래트 면역

면역에는 WKY/Izm 래트의 암컷 (닛폰 SLC 사) 을 사용하였다. 먼저 래트 양다리 하퇴부를 히알루로니다아제 (Hyaluronidase) (SIGMA-ALDRICH 사) 로 전처리 후, 동 부위에 GARP 발현 벡터를 근주 (筋注) 하였다. 계속해서, ECM830 (BTX 사) 을 사용하고, 2 니들 전극을 사용하여, 동 부위에 인비보 일렉트로포레이션을 실시하였다. 2 주에 한 번, 동일한 인비보 일렉트로포레이션을 반복한 후, 래트의 림프절 또는 비장을 채취하여 하이브리도마 제조에 사용하였다.

5)-3 하이브리도마의 제조

림프절 혹은 비장 세포와 마우스 미엘로마 SP2/0-ag14 세포 (ATCC, No.CRL-1581) 를 LF301 Cell Fusion Unit (BEX 사) 을 사용하여 전기 세포 융합하고, ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies 사) 로 희석시켜 배양하였다. 출현한 하이브리도마 콜로니를 회수함으로써 모노클론 하이브리도마를 제조하였다. 회수된 각 하이브리도마 콜로니를 배양하고, 얻어진 하이브리도마 배양 상청을 사용하여 항 GARP 항체 생산 하이브리도마의 스크리닝을 실시하였다.

5)-4 Cell-ELISA 법에 의한 항체 스크리닝

5)-4-1 Cell-ELISA 용 항원 유전자 발현 세포의 조제

293α 세포 (인테그린 αv 및 인테그린 β3 을 발현하는 HEK-293 세포 (ATCC : CRL-1573) 유래의 안정 발현 세포주) 를 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 (Invitrogen 사) 중 7.5 × 10⁵ 세포/㎖ 가 되도록 조제하였다. 그에 대해, Lipofectamine 2000 (Life Technologies 사) 을 사용한 형질 이입 순서에 따라, GARP 발현 벡터 또는 음성 컨트롤로서 pcDNA3.1(+) 벡터를 도입하고, 96-Half area 웰 플레이트 (Corning 사) 에 50 ㎕ 씩 분주하고, 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 24 내지 27 시간 배양하였다. 얻어진 도입 세포를 접착 상태인 채로, Cell-ELISA 에 사용하였다.

5)-4-2 Cell-ELISA

실시예 5)-4-1 에서 조제한 발현 벡터 도입 293α 세포의 배양 상청을 제거 후, GARP 발현 벡터 또는 pcDNA3.1(+) 벡터 도입 293α 세포의 각각에 대해 하이브리도마 배양 상청을 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS(+) 로 1 회 세정 후, 5 ％ FBS 함유 PBS(+) 로 500 배로 희석시킨 래빗에서 생산된 Anti-Rat IgG-페록시다아제 항체 (SIGMA 사) 을 첨가하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 웰 중의 세포를 5 ％ FBS 함유 PBS(+) 로 3 회 세정한 후, OPD 발색액 (OPD 용해액 (0.05 M 시트르산 3 나트륨, 0.1 M 인산수소 2 나트륨·12 물 pH4.5) 에 o-페닐렌디아민 2 염산염 (와코우 순약사), H₂O₂ 를 각각 0.4 ㎎/㎖, 0.6 ％ (v/v) 가 되도록 용해) 을 50 ㎕/웰로 첨가하였다. 가끔 교반하면서 발색 반응을 실시하고, 1 M HCl 을 50 ㎕/웰로 첨가하여 발색 반응을 정지시킨 후, 플레이트 리더 (ENVISION : PerkinElmer 사) 로 490 ㎚ 의 흡광도를 측정하였다. 세포막 표면 상에 발현하는 인간 GARP 에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하기 위해, 컨트롤의 pcDNA3.1(+) 도입 293α 세포와 비교하여 GARP 발현 벡터 도입 293α 세포 쪽에서 보다 높은 흡광도를 나타내는 배양 상청을 생산하는 하이브리도마를 항인간 GARP 항체 생산 양성으로서 선택하였다.

5)-5 플로우 사이토메트리법에 의한 항체 스크리닝

5)-5-1 플로우 사이토메트리 해석용 항원 유전자 발현 세포의 조제

HEK-293T 세포 (ATCC 로부터 입수) 를 5 × 10⁴ 세포/㎠ 가 되도록 225 ㎠ 플라스크 (스미토모 베이클라이트사) 에 파종하고, 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 중에서 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 하룻밤 배양하였다. 다음날, GARP 발현 벡터, 음성 컨트롤로서 pcDNA3.1(+) 벡터를 각각 HEK-293T 세포에 Lipofectamine 2000 을 사용하여 도입하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 추가로 하룻밤 배양하였다. 다음날, 발현 벡터 도입 HEK-293T 세포를 TrypLE Express (Life Technologies 사) 로 처리하고, 10 ％ FBS 함유 DMEM 배지로 세포를 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 에 현탁하였다. 얻어진 세포 현탁액을 플로우 사이토메트리 해석에 사용하였다.

5)-5-2 플로우 사이토메트리 해석

실시예 5)-4-2 의 Cell-ELISA 에서 양성으로 판정된 하이브리도마가 생산하는 항체의 인간 GARP 에 대한 결합 특이성을 플로우 사이토메트리 해석에 의해 다시 확인하였다.

실시예 5)-5-1 에서 조제한 일과성 발현 HEK-293T 세포의 현탁액을 원심하고, 상청을 제거한 후, 각각에 대해 하이브리도마 배양 상청을 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 5 ％ FBS 함유 PBS 로 500 배로 희석시킨 Anti-Rat IgG FITC 콘쥬게이트 (SIGMA 사 제조) 를 첨가하여 현탁하고, 4 ℃ 에서 1 시간 가만히 정지시켰다. 5 ％ FBS 함유 PBS 로 2 회 세정한 후, 2 ㎍/㎖ 7-아미노액티모머이신 D (7-aminoactinomycin D) (Molecular Probes 사) 를 함유하는 5 ％ FBS 함유 PBS 에 재현탁하고, 플로우 사이토미터 (FC500 : BeckmanCoulter 사 제조) 로 검출을 실시하였다. 데이터 해석은 Flowjo (TreeStar 사 제조) 로 실시하였다. 7-아미노액티모머이신 D 양성의 사세포를 게이트로 제외한 후, 생세포의 FITC 형광 강도의 히스토그램을 제조하였다. 컨트롤인 pcDNA3.1 벡터 도입 HEK-293T 세포의 형광 강도 히스토그램에 대해 GARP 발현 벡터 도입 HEK-293T 세포의 히스토그램이 강형광 강도측으로 시프트되어 있는 항체를 생산하는 하이브리도마를 인간 GARP 에 결합하는 항체 생산 하이브리도마로서 (113 클론) 선택하였다.

5)-6 모노클로날 항체의 조제

5)-6-1 하이브리도마 151D, 198D 의 배양

5)-5-2 에서 취득된 래트 항인간 GARP 항체 생산 하이브리도마 중에서, 인간 GARP 에 강하게 결합하는 것이 시사된 151D, 198D 를 선발하였다.

래트 항 GARP 모노클로날 항체는, 하이브리도마 배양 상청으로부터 정제하였다.

먼저, 래트 항 GARP 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 ClonaCell-HY Selection Medium E 로 충분히 양까지 증식시켜, Ultra Low IgG FBS (Life Technologies 사) 를 20 ％ 첨가한 Hybridoma SFM (Life Technologies 사) 에 배지 교환한 후, 8 ∼ 9 × 10⁷ 세포의 하이브리도마를 1272 ㎠ 플라스크 (Corning 사) 에 파종하고 7 일간 배양하였다. 본 배양 상청을 원심에 의해 회수하고 0.8 ㎛ 의 필터를 통과시킨 후, 추가로 0.45 ㎛ 의 필터 (Corning 사) 를 통과시켜 멸균하였다.

5)-6-2 모노클로날 항체의 정제

실시예 5)-6-1 에서 조제한 하이브리도마의 배양 상청으로부터 항체를 Protein G 어피니티 크로마토그래피로 정제하였다. Protein G 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사) 에 항체를 흡착시키고, PBS 로 칼럼을 세정 후에 0.1 M 글리신/염산 수용액 (pH2.7) 으로 용출하였다. 용출액에 1 M Tris-HCl (pH9.0) 을 첨가하여 pH7.0 ∼ 7.5 로 조정한 후에, 투석 (Thermo Scientific 사, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) 에 의해 PBS 에의 버퍼 치환을 실시하였다. Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF30K, Sartorius 사) 으로 항체를 농축하고, 항체 농도를 0.7 ㎎/㎖ 이상으로 조제하였다. 마지막에 Minisart-Plus filter (Sartorius 사) 로 여과하고, 정제 샘플로 하였다.

실시예 6 래트 항체의 클로닝과 인간 키메라 항체의 제조

6)-1 래트 항체 151D 의 cDNA 의 클로닝과 배열의 결정

6)-1-1 151D 생산 하이브리도마로부터의 total RNA 의 조제

151D 의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 증폭시키기 위해, 151D 생산 하이브리도마로부터 TRIzol Reagent (Ambion 사) 를 사용하여 total RNA 를 조제하였다.

6)-1-2 5'-RACE PCR 에 의한 151D 의 중사슬 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭과 배열의 결정

중사슬 가변 영역을 포함하는 cDNA 의 증폭은, 실시예 6)-1-1 에서 조제한 total RNA 의 약 1 ㎍ 과 SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech 사) 를 사용하여 실시하였다.

151D 의 중사슬 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속), 및 공지된 래트 중사슬의 정상 영역의 배열로부터 설계한 프라이머를 사용하였다.

5'-RACE PCR 로 증폭시킨 중사슬의 가변 영역을 포함하는 cDNA 를 플라스미드로 클로닝하고, 다음으로 중사슬의 가변 영역의 cDNA 의 뉴클레오티드 배열의 시퀀스 해석을 실시하였다.

결정된 151D 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 14 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 15 에 나타냈다.

6)-1-3 5'-RACE PCR 에 의한 151D 의 경사슬 가변 영역을 함유하는 cDNA 의 증폭과 배열의 결정

실시예 6)-1-2 와 동일한 방법으로 실시하였다. 단, 151D 의 경사슬 유전자의 가변 영역의 cDNA 를 PCR 로 증폭시키기 위한 프라이머로서, UPM (Universal Primer A Mix : SMARTer RACE cDNA Amplification Kit 에 부속), 및 공지된 래트 경사슬의 정상 영역의 배열로부터 설계한 프라이머를 사용하였다.

결정된 151D 의 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 16 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 17 에 나타냈다.

6)-2 래트 항체 198D 의 cDNA 의 클로닝과 배열의 결정

실시예 2)-1 과 동일한 방법으로 배열을 결정하였다.

결정된 198D 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 18 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 19 에 나타냈다. 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열을 배열 번호 20 에 나타내고, 아미노산 배열을 배열 번호 21 에 나타냈다.

6)-3 인간 키메라 항체 발현 벡터의 제조

6)-3-1 인간 키메라 경사슬 발현 벡터 pCMA-LK 의 구축

플라스미드 pcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen 사) 를 제한 효소 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 얻어지는 약 5.4 kb 의 프래그먼트와, 배열 번호 22 에 나타내는 인간 경사슬 시그널 배열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 코드하는 DNA 배열을 함유하는 DNA 단편을 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (CLONTECH 사) 를 사용하여 결합하여, pcDNA3.3/LK 를 제조하였다.

pcDNA3.3/LK 로부터 네오마이신 발현 유닛을 제거함으로써 pCMA-LK 를 구축하였다.

6)-3-2 인간 키메라 IgG1 타입 중사슬 발현 벡터 pCMA-G1 의 구축

pCMA-LK 를 XbaI 및 PmeI 로 소화하여 경사슬 시그널 배열 및 인간 κ 사슬 정상 영역을 제거한 DNA 단편과, 배열 번호 23 으로 나타내는 인간 중사슬 시그널 배열 및 인간 IgG1 정상 영역의 아미노산을 코드하는 DNA 배열을 포함하는 DNA 단편을 In-Fusion Advantage PCR 클로닝 키트 (CLONTECH 사) 를 사용하여 결합하여, pCMA-G1 을 구축하였다.

6)-3-3 인간 키메라 151D 중사슬 발현 벡터의 구축

실시예 2)-1 에서 얻어진 래트 항체 151D 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 템플릿으로 하여, In-fusion 클로닝용으로 설계한 프라이머로 PCR 을 실시함으로써 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 함유하는 DNA 단편을 증폭시켰다. pCMA-G1 을 제한 효소 BIpI 로 절단한 지점에, In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여, 증폭시킨 DNA 단편을 삽입함으로써 인간 키메라 151D 중사슬 발현 벡터를 구축하였다.

인간 키메라 151D 중사슬의 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을, 배열 번호 24 및 배열 번호 25 에 각각 나타낸다.

6)-3-4 인간 키메라 151D 경사슬 발현 벡터의 구축

실시예 6)-1 에서 얻어진 151 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 템플릿으로 하여, In-fusion 클로닝용으로 설계한 프라이머로 PCR 을 실시함으로써 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 함유하는 DNA 단편을 증폭시켰다. pCMA-LK 를 제한 효소 BsiWI 로 절단한 지점에, In-Fusion HD PCR 클로닝 키트 (Clontech 사) 를 사용하여, 증폭시킨 DNA 단편을 삽입함으로써 인간 키메라 151D 경사슬 발현 벡터를 구축하였다.

인간 키메라 151D 경사슬의 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을, 배열 번호 26 및 배열 번호 27 에 각각 나타낸다.

6)-3-5 인간 키메라 198D 중사슬 발현 벡터의 구축

실시예 6)-2 에서 얻어진 래트 항체 198D 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 템플릿으로 하여, 실시예 6)-3-3 과 동일한 방법으로 인간 키메라 198D 중사슬 발현 벡터를 구축하였다.

인간 키메라 198D 중사슬의 뉴클레오티드 배열 및 그 중사슬의 아미노산 배열을, 배열 번호 28 및 배열 번호 29 에 각각 나타낸다.

6)-3-6 인간 키메라 198D 경사슬 발현 벡터의 구축

실시예 6)-2 에서 얻어진 198D 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 를 템플릿으로 하여, 실시예 6)-3-3 과 동일한 방법으로 인간 키메라 198D 경사슬 발현 벡터를 구축하였다.

인간 키메라 198D 경사슬의 뉴클레오티드 배열 및 그 경사슬의 아미노산 배열을, 배열 번호 30 및 배열 번호 31 에 각각 나타낸다.

6)-4 인간 키메라 항체의 조제

6)-4-1 인간 키메라 항체의 생산

FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 는 매뉴얼에 따라, 계대, 배양을 실시하였다. 대수 증식기의 1 × 10⁸ 개의 FreeStyle 293F 세포 (Invitrogen 사) 를 250 ㎖ Fernbach Erlenmeyer Flask (CORNING 사) 에 파종하고, FreeStyle293 expression medium (Invitrogen 사) 로 희석시켜 2.0 × 10⁶ 세포/㎖ 로 조제하였다.

5 ㎖ 의 Opti-Pro SFM 배지 (Invitrogen 사) 에 20 ㎍ 의 중사슬 발현 벡터와 30 ㎍ 의 경사슬 발현 벡터와 150 ㎍ 의 폴리에틸렌이민 (Polyethyleneimine) (Polyscience #24765) 을 첨가하여 천천히 교반하고, 추가로 5 분간 방치한 후에 FreeStyle 293F 세포에 첨가하였다.

37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터로 4 시간, 125 rpm 으로 진탕 배양 후에 50 ㎖ 의 EX-CELL VPRO 배지 (SAFC Biosciences 사), 0.36 ㎖ 의 GlutaMAX I (GIBCO 사), 및 2.5 ㎖ 의 Yeastolate Ultrafiltrate (GIBCO 사) 를 첨가하고, 37 ℃, 8 ％ CO₂ 인큐베이터로 7 일간, 125 rpm 으로 진탕 배양하여 얻어진 배양 상청을 250 ㎖ Filter System (CORNING 사 #431096) 으로 여과하였다.

인간 키메라 151D 중사슬 발현 벡터와 인간 키메라 151D 경사슬 발현 벡터의 조합으로 취득된 인간 키메라 151D 항체를 「c151D」 라고 명명하고, 인간 키메라 198D 중사슬 발현 벡터와 인간 키메라 198D 경사슬 발현 벡터의 조합으로 취득된 인간 키메라 198D 항체를 「c198D」 라고 명명하였다.

6)-4-2 키메라 항체의 정제

실시예 6)-4-1 에서 얻어진 배양 상청을 rProtein A 어피니티 크로마토그래피의 1 단계 공정으로 정제하였다. 배양 상청을 PBS 로 평형화한 MabSelectSuRe 가 충전된 칼럼 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 에 어플라이한 후에, 칼럼 용량의 2 배 이상의 PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 2 M 아르기닌 염산염 용액 (pH4.0) 으로 용출하고, 항체가 함유되는 획분을 모았다. 당해 획분을 Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (분획 분자량 UF30K, Sartorius 사) 으로 PBS 에의 버퍼 치환을 실시함과 함께 항체의 농축을 실시하고, 항체 농도를 1 ㎎/㎖ 이상으로 조제하였다. 마지막에 Minisart-Plus filter (Sartorius 사) 로 여과하고, 정제 샘플로 하였다.

6)-5 인간 키메라 항체의 인간 GARP 에 대한 결합성 평가

실시예 6)-4 에서 제조한 c151D 및 c198D 와 인간 GARP 의 해리 정수 측정은, Biacore T200 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 을 사용하여, 고정화된 Protein A 에 항체를 리간드로서 포착 (캡쳐) 하고, 항원 (리컴비넌트 인간 GARP : R ＆ D Systems 사) 을 아날라이트로서 측정하는 캡처법으로 실시하였다. 러닝 버퍼로서 HBS-EP+ (GE Healthcare Bioscience 사 제조), 센서 칩으로서 Protein A (GE 헬스케어 바이오사이언스 (주)) 를 사용하였다.

칩 상에 1 ㎍/㎖ 의 인간 키메라화 항체를 10 ㎕/min 으로 20 초간 첨가한 후, 항원의 희석 계열 용액 (8 ∼ 128 nM) 을 유속 30 ㎕/분으로 120 초간 첨가하고, 계속해서 480 초간의 해리상을 모니터하였다. 재생 용액으로서, 글리신 (Glycine) 1.5 (GE Healthcare Bioscience 사 제조) 를 유속 20 ㎕/분으로 30 초간 첨가하였다.

데이터의 해석에는 1 : 1 결합 모델을 사용하고, 결합 속도 정수 ka, 해리 속도 정수 kd 및 해리 정수 (KD ; KD = kd/ka) 를 산출하였다.

결과를 표 1 에 나타낸다.

표 1 c151D 및 c198D 와 인간 GARP 의 해리 정수

실시예 7 인간화 항체의 제조

7)-1 c151D 항체의 가변 영역의 분자 모델링

c151D 항체의 가변 영역의 분자 모델링은, 상동성 모델링으로서 일반적으로 공지된 방법 (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)) 에 의해 실행되었다.

Protein Data Bank (Nuc. Acid Res.28, 235-242 (2000)) 에 등록되는 인간 면역 글로블린의 가변 영역의 1 차 배열 (X 선 결정 구조로부터 유도되는 삼차원 구조가 입수 가능하다) 을, c151D 항체의 가변 영역과 비교하였다.

가변 영역의 삼차원 구조는, c151D 항체의 중사슬 및 경사슬 그리고 그것들계면에 대해 높은 배열 상동성을 갖는 모델의 좌표를 조합하여, 「프레임 워크 모델」 을 얻음으로써 제조되었다.

이어서, 각각의 CDR 에 대한 대표적인 컨퍼메이션이 프레임 워크 모델에 삽입되었다.

마지막으로, 에너지의 점에서 불리한 원자간 접촉을 제외하기 위한 에너지 최소화 계산을 실시하였다. 상기 순서는, Discovery Studio (다쏘·시스템즈 (주)) 를 사용하여 실시하였다.

7)-2 인간화 151D 항체에 대한 아미노산 배열의 설계

인간화 151D 항체의 구축을, CDR 그래프팅 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 으로서 일반적으로 공지된 방법에 의해 실시하였다. 억셉터 항체는, 프레임 워크 영역 내의 아미노산 상동성에 기초하여 선택되었다.

c151D 항체의 프레임 워크 영역의 배열을, 인간의 서브 그룹·컨센서스 배열의 프레임 워크 영역과 비교하였다. 결과적으로, KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 에 있어서 기정된 인간 γ 사슬 서브 그룹 3 의 컨센서스 배열과 인간 κ 사슬 서브 그룹 1 및 인간 κ 사슬 서브 그룹 4 의 컨센서스 배열이, 그 프레임 워크 영역에 있어서 높은 배열 상동성을 갖는 것에서 기인하여, 억셉터로서 선택되었다.

인간 γ 사슬 서브 그룹 3 의 컨센서스 배열과 인간 κ 사슬 서브 그룹 1 및 인간 κ 사슬 서브 그룹 4 의 컨센서스 배열에 대한 프레임 워크 영역의 아미노산 잔기를, c151D 항체에 대한 아미노산 잔기와 정렬시켜, 상이한 아미노산이 사용되는 위치를 동정하였다. 이들 잔기의 위치는, 상기 7)-1 에서 구축된 c151D 항체의 삼차원 모델을 사용하여 분석되고, 그리고 억셉터 상에 그래프팅되어야 할 도너 잔기가, Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86,10029-10033 (1989)) 에 의해 부여되는 기준에 의해 선택되었다.

선택된 몇 개의 도너 잔기를 억셉터 항체에 이입함으로써, 인간화 h151D 의 배열을 이하의 실시예에 기재되도록 구축하였다.

7)-3 인간화 151D 중사슬 h151D-H 의 설계

7)-3-1 h151D-H1 타입 중사슬

배열표의 배열 번호 25 에 나타내는 c151D 중사슬의 아미노산 번호 35 번째의 아르기닌 잔기를 글리신 잔기로, 37 번째의 리신 잔기를 류신 잔기로, 38 번째의 리신 잔기를 아르기닌 잔기로, 42 번째의 세린 잔기를 알라닌 잔기로, 61 번째의 트레오닌 잔기를 글리신 잔기로, 62 번째의 글루타민 잔기를 리신 잔기로, 68 번째의 알라닌 잔기를 세린 잔기로, 80 번째의 아르기닌 잔기를 알라닌 잔기로, 94 번째의 알라닌 잔기를 세린 잔기로, 96 번째의 세린 잔기를 아스파라긴 잔기로, 103 번째의 아스파르트산 잔기를 아스파라긴 잔기로, 107 번째의 세린 잔기를 알라닌 잔기로, 112 번째의 트레오닌 잔기를 발린 잔기로, 130 번째의 발린 잔기를 트레오닌 잔기로, 131 번째의 메티오닌 잔기를 류신 잔기로 치환함에 따라 설계된 인간화 151D 중사슬을 「h151D-H1 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.

h151D-H1 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 32) 에 있어서, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이고, 정상 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 409 내지 1398 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이다. 당해 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 32 에 있어서, CDRH1 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 133 내지 162 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열, CDRH2 를 코드하는 뉴클레오티드 번호 205 내지 234 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 CDRH3 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 352 내지 375 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 갖는다.

또, h151D-H1 타입 중사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 33) 에 있어서, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬은 아미노산 번호 20 내지 466 으로 이루어지는 아미노산 배열이고, 가변 영역은 아미노산 번호 20 내지 136 으로 이루어지는 아미노산 배열이고, 정상 영역은 아미노산 번호 137 내지 466 으로 이루어지는 아미노산 배열이다. 당해 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 33 에 있어서, 아미노산 번호 45 내지 54 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 아미노산 번호 69 내지 78 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 및 아미노산 번호 118 내지 125 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다.

또한, 배열 번호 32 및 33 의 배열은, 각각 도 31 및 21 에도 기재되어 있다.

7)-3-2 h151D_H4 타입 중사슬

배열표의 배열 번호 25 에 나타내는 c151D 중사슬의 아미노산 번호 35 번째의 아르기닌 잔기를 글리신 잔기로, 37 번째의 리신 잔기를 류신 잔기로, 38 번째의 리신 잔기를 아르기닌 잔기로, 42 번째의 세린 잔기를 알라닌 잔기로, 61 번째의 트레오닌 잔기를 글리신 잔기로, 62 번째의 글루타민 잔기를 리신 잔기로, 94 번째의 알라닌 잔기를 세린 잔기로, 103 번째의 아스파르트산 잔기를 아스파라긴 잔기로, 107 번째의 세린 잔기를 알라닌 잔기로, 112 번째의 트레오닌 잔기를 발린 잔기로, 130 번째의 발린 잔기를 트레오닌 잔기로, 131 번째의 메티오닌 잔기를 류신 잔기로 치환함에 따라 설계된 인간화 151D 중사슬을 「h151D_H4 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.

h151D-H4 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 34) 에 있어서, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이고, 정상 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 409 내지 1398 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이다. 당해 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 34 에 있어서, CDRH1 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 133 내지 162 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열, CDRH2 를 코드하는 뉴클레오티드 번호 205 내지 234 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 CDRH3 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 352 내지 375 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 갖는다.

또, h151D-H4 타입 중사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 35) 에 있어서, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬은 아미노산 번호 20 내지 466 으로 이루어지는 아미노산 배열이고, 가변 영역은 아미노산 번호 20 내지 136 으로 이루어지는 아미노산 배열이고, 정상 영역은 아미노산 번호 137 내지 466 으로 이루어지는 아미노산 배열이다. 당해 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 35 에 있어서, 아미노산 번호 45 내지 54 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 아미노산 번호 69 내지 78 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 및 아미노산 번호 118 내지 125 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다.

또한, 배열 번호 34 및 35 의 배열은, 각각 도 33 및 23 에도 기재되어 있다.

7)-4 인간화 151D 경사슬 h151D_L 의 설계

7)-4-1 h151D-L1 타입 경사슬

배열표의 배열 번호 27 에 나타내는 c151D 경사슬의 아미노산 번호 29 번째의 트레오닌 잔기를 아스파르트산 잔기로 31 번째의 메티오닌 잔기를 류신 잔기로 32 번째의 페닐알라닌 잔기를 알라닌 잔기로 33 번째의 이소류신 잔기를 발린 잔기로 35 번째의 발린 잔기를 류신 잔기로, 37 번째의 아스파르트산 잔기를 글루탐산 잔기로, 39 번째의 발린 잔기를 알라닌 잔기로, 41 번째의 메티오닌 잔기를 이소류신 잔기로, 60 번째의 트레오닌 잔기를 프롤린 잔기로, 83 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로, 97 번째의 아스파라긴 잔기를 세린 잔기로, 98 번째의 메티오닌 잔기를 류신 잔기로, 103 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 120 번째의 트레오닌 잔기를 글루타민 잔기로, 124 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 126 번째의 류신 잔기를 이소류신 잔기로, 127 번째의 아스파라긴 잔기를 리신 잔기로, 129 번째의 알라닌 잔기를 트레오닌 잔기로 치환함에 따라 설계된 인간화 151D 경사슬을 「h151D_L1 타입 경사슬」 이라고 명명하였다.

h151D-L1 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 36) 에 있어서, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이고, 정상 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 388 내지 702 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이다. 당해 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 36 에 있어서, CDRH1 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 130 내지 162 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열, CDRH2 를 코드하는 뉴클레오티드 번호 208 내지 228 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 CDRH3 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 325 내지 351 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 갖는다.

또, h151D_L1 타입 경사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 37) 에 있어서, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬은 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 배열이고, 가변 영역은 아미노산 번호 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 배열이고, 정상 영역은 아미노산 번호 130 내지 234 로 이루어지는 아미노산 배열이다. 당해 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 37 에 있어서, 아미노산 번호 44 내지 54 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 아미노산 번호 70 내지 76 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 및 아미노산 번호 109 내지 117 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다.

또한, 배열 번호 36 및 37 의 배열은, 각각 도 32 및 22 에도 기재되어 있다.

7)-4-2 h151D-L4 타입 경사슬 :

배열표의 배열 번호 27 에 나타내는 c151D 경사슬의 아미노산 번호 29 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로 31 번째의 메티오닌 잔기를 류신 잔기로 32 번째의 페닐알라닌 잔기를 세린 잔기로 33 번째의 이소류신 잔기를 알라닌 잔기로 41 번째의 메티오닌 잔기를 이소류신 잔기로, 60 번째의 트레오닌 잔기를 프롤린 잔기로, 62 번째의 글루타민 잔기를 리신 잔기로, 83 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로, 97 번째의 아스파라긴 잔기를 세린 잔기로, 98 번째의 메티오닌 잔기를 류신 잔기로, 100 번째의 알라닌 잔기를 프롤린 잔기로, 103 번째의 류신 잔기를 페닐알라닌 잔기로, 105 번째의 발린 잔기를 트레오닌 잔기로, 120 번째의 트레오닌 잔기를 글루타민 잔기로, 124 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 126 번째의 류신 잔기를 이소류신 잔기로, 127 번째의 아스파라긴 잔기를 리신 잔기로, 129 번째의 알라닌 잔기를 트레오닌 잔기로 치환함에 따라 설계된 인간화 151D 경사슬을 「h151D-L4 타입 경사슬」 이라고 명명하였다.

h151D-L4 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 38) 에 있어서, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이고, 정상 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 388 내지 702 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이다. 당해 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 38 에 있어서, CDRH1 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 130 내지 162 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열, CDRH2 를 코드하는 뉴클레오티드 번호 208 내지 228 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 CDRH3 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 325 내지 351 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 갖는다.

또, h151D-L4 타입 경사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 39) 에 있어서, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬은 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 배열이고, 가변 영역은 아미노산 번호 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 배열이고, 정상 영역은 아미노산 번호 130 내지 234 로 이루어지는 아미노산 배열이다. 당해 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 39 에 있어서, 아미노산 번호 44 내지 54 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 아미노산 번호 70 내지 76 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 및 아미노산 번호 109 내지 117 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3 을 갖는다.

또한, 배열 번호 38 및 39 의 배열은, 각각 도 34 및 24 에도 기재되어 있다.

7)-5 c198D 의 가변 영역의 분자 모델링

c198D 항체의 가변 영역의 분자 모델링은, 상동성 모델링으로서 일반적으로 공지된 방법 (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)) 에 의해 실행되었다. Protein Data Bank (Nuc. Acid Res.28, 235-242 (2000)) 에 등록되는 인간 면역 글로블린의 가변 영역의 1 차 배열 (X 선 결정 구조로부터 유도되는 삼차원 구조가 입수 가능하다) 을, c198D 항체의 가변 영역과 비교하였다.

가변 영역의 삼차원 구조는, c198D 항체의 중사슬 및 경사슬 그리고 그것들계면에 대해 높은 배열 상동성을 갖는 모델의 좌표를 조합하여, 「프레임 워크 모델」 을 얻음으로써 제조되었다.

7)-6 인간화 198D 에 대한 아미노산 배열의 설계

인간화 198D 항체의 구축을, CDR 그래프팅 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 으로서 일반적으로 공지된 방법에 의해 실시하였다. 억셉터 항체는, 프레임 워크 영역 내의 아미노산 상동성에 기초하여 선택되었다.

c198D 항체의 프레임 워크 영역의 배열을, 인간의 서브 그룹·컨센서스 배열의 프레임 워크 영역과 비교하였다. 결과적으로, KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) 에 있어서 기정된 인간 γ 사슬 서브 그룹 2 의 컨센서스 배열과 인간 κ 사슬 서브 그룹 1 의 컨센서스 배열이, 그 프레임 워크 영역에 있어서 높은 배열 상동성을 가지는 것에서 기인하여, 억셉터로서 선택되었다. 또, 중사슬의 일부의 잔기에는, 인간 γ 사슬 서브 그룹 3 의 컨센서스 배열의 잔기를 이입하였다.

일부 인간 γ 사슬 서브 그룹 3 의 컨센서스 배열을 포함하는 인간 γ 사슬 서브 그룹 2 의 컨센서스 배열과 인간 κ 사슬 서브 그룹 1 의 컨센서스 배열에 대한 프레임 워크 영역의 아미노산 잔기를, c198D 항체에 대한 아미노산 잔기와 정렬시켜, 상이한 아미노산이 사용되는 위치를 동정하였다. 이들 잔기의 위치는, 상기 7)-5 에서 구축된 c198D 항체의 삼차원 모델을 사용하여 분석되고, 그리고 억셉터 상에 그래프팅되어야 할 도너 잔기가, Queen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029-10033 (1989)) 에 의해 부여되는 기준에 의해 선택되었다.

선택된 몇 개의 도너 잔기를 억셉터 항체에 이입함으로써, 인간화 h198D 의 배열을 이하의 실시예에 기재되도록 구축하였다.

7)-7 인간화 198D 중사슬 h198D-H 의 설계

7)-7-1 h198D-H3 타입 중사슬

배열표의 배열 번호 29 에 나타내는 c198D 중사슬의 아미노산 번호 20 번째의 글루타민 잔기를 글루탐산 잔기로 24 번째의 아르기닌 잔기를 발린 잔기로 28 번째의 프롤린 잔기를 글리신 잔기로 32 번째의 글루타민 잔기를 리신 잔기로 61 번째의 글루탐산 잔기를 글리신 잔기로, 80 번째의 세린 잔기를 프롤린 잔기로, 81 번째의 알라닌 잔기를 세린 잔기로, 86 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 87 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 95 번째의 세린 잔기를 아스파라긴 잔기로, 98 번째의 페닐알라닌 잔기를 세린 잔기로, 101 번째의 메티오닌 잔기를 류신 잔기로, 103 번째의 트레오닌 잔기를 세린 잔기로, 104 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 105 번째의 글루타민 잔기를 트레오닌 잔기로, 106 번째의 트레오닌 잔기를 알라닌 잔기로, 107 번째의 글루탐산 잔기를 알라닌 잔기로, 111 번째의 메티오닌 잔기를 발린 잔기로, 113 번째의 페닐알라닌 잔기를 티로신 잔기로, 133 번째의 알라닌 잔기를 트레오닌 잔기로, 134 번째의 세린 잔기를 류신 잔기로 치환함에 따라 설계된 인간화 198D 중사슬을 「h198D_H3 타입 중사슬」 이라고 명명하였다.

h198D-H3 타입 중사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 40) 에 있어서, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 1407 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 58 내지 417 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이고, 정상 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 418 내지 1407 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이다. 당해 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 40 에 있어서, CDRH1 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 130 내지 162 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열, CDRH2 를 코드하는 뉴클레오티드 번호 205 내지 231 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 CDRH3 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 349 내지 384 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 갖는다.

또, h198D-H3 타입 중사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 41) 에 있어서, 시그널 배열이 절제된 성숙 중사슬은 아미노산 번호 20 내지 469 로 이루어지는 아미노산 배열이고, 가변 영역은 아미노산 번호 20 내지 139 로 이루어지는 아미노산 배열이고, 정상 영역은 아미노산 번호 140 내지 469 로 이루어지는 아미노산 배열이다.

또한, 배열 번호 40 및 41 의 배열은, 각각 도 35 및 25 에도 기재되어 있다.

7)-8 인간화 198D 경사슬 h198D-L 의 설계

7)-8-1 h198D-L4 타입 경사슬

배열표의 배열 번호 31 에 나타내는 c198D 경사슬의 아미노산 번호 29 번째의 알라닌 잔기를 세린 잔기로 33 번째의 글리신 잔기를 알라닌 잔기로 35 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 37 번째의 글루탐산 잔기를 아스파르트산 잔기로, 38 번째의 트레오닌 잔기를 아르기닌 잔기로, 42 번째의 글루타민 잔기를 트레오닌 잔기로, 65 번째의 글루타민 잔기를 리신 잔기로, 85 번째의 글리신 잔기를 세린 잔기로, 92 번째의 세린 잔기를 트레오닌 잔기로, 94 번째의 리신 잔기를 트레오닌 잔기로, 98 번째의 메티오닌 잔기를 류신 잔기로, 100 번째의 트레오닌 잔기를 프롤린 잔기로, 103 번째의 글루탐산 잔기를 페닐알라닌 잔기로, 104 번째의 글리신 잔기를 알라닌 잔기로, 105 번째의 발린 잔기를 트레오닌 잔기로, 120 번째의 세린 잔기를 글루타민 잔기로, 124 번째의 류신 잔기를 발린 잔기로, 129 번째의 알라닌 잔기를 트레오닌 잔기로 치환함에 따라 설계된 인간화 198D 경사슬을 「h198D-L4 타입 경사슬」 이라고 명명하였다.

h198D-L4 타입 경사슬을 코드하는 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 42) 에 있어서, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이고, 가변 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이고, 정상 영역을 코드하는 것은 뉴클레오티드 번호 388 내지 702 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열이다. 당해 가변 영역은, 배열표의 배열 번호 42 에 있어서, CDRH1 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 130 내지 162 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열, CDRH2 를 코드하는 뉴클레오티드 번호 208 내지 228 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열 및 CDRH3 을 코드하는 뉴클레오티드 번호 325 내지 351 로 이루어지는 뉴클레오티드 배열을 갖는다.

또, h198D_L4 타입 경사슬의 아미노산 배열 (배열 번호 43] 에 있어서, 시그널 배열이 절제된 성숙 경사슬은 아미노산 번호 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 배열이고, 가변 영역은 아미노산 번호 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 배열이고, 정상 영역은 아미노산 번호 130 내지 234 로 이루어지는 아미노산 배열이다.

또한, 배열 번호 42 및 43 의 배열은, 각각 도 36 및 26 에도 기재되어 있다.

7)-9 인간화 항체의 발현 벡터의 구축

7)-9-1 인간화 항인간 GARP 항체 h151D-H1L1 발현 벡터의 구축

배열표의 배열 번호 1 에 나타내는 h151D-H1 타입 중사슬의 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 에 나타내는 h151D-H1 타입 중사슬을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스). 합성한 DNA 단편을 사용하여, BioWa 사 및 Lonza 사의 Potelligent (등록상표) CHOK1SV Technology 의 프로토콜에 준하여 h151D-H1 타입 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 구축한 발현 벡터를 「GSV-h151D-H1」 이라고 명명하였다.

다음으로, 배열표의 배열 번호 9 에 나타내는 h151D-L1 타입 경사슬의 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 61 내지 704 에 나타내는 h151D-L1 타입 경사슬을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스).

합성한 DNA 단편을 BioWa 사 및 Lonza 사의 Potelligent (등록상표) CHOK1SV Technology 의 프로토콜에 준하여, h151D-L1 타입 중사슬 발현 벡터를 구축하였다. 구축한 발현 벡터를 「GSV-h151D-L1」 이라고 명명하였다.

다음으로, 구축한 발현 벡터 「GSV-h151D-H1」 및 「GSV-h151D-L1」 로부터, BioWa 사 및 Lonza 사의 Potelligent (등록상표) CHOK1SV Technology 의 프로토콜에 준하여, MACA-1511a 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「DGV-h151D-H1L1-GS」 라고 명명하였다.

7)-9-2 인간화 항인간 GARP 항체 h151D_H4L4 발현 벡터의 구축

실시예 7)-9-1 과 동일하게, 배열표의 배열 번호 34 에 나타내는 h151D-H4 타입 중사슬의 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 에 나타내는 h151D-H4 타입 중사슬을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편과 배열표의 배열 번호 15 에 나타내는 h151D-L4 타입 경사슬의 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 61 내지 704 에 나타내는 h151D-L4 타입 경사슬을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스).

합성한 DNA 단편을 사용하여, BioWa 사 및 Lonza 사의 Potelligent (등록상표) CHOK1SV Technology 의 프로토콜에 준하여, MACA-1514a 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「DGV-h151D-H4L4-GS」 라고 명명하였다.

7)-9-3 인간화 항인간 GARP 항체 h198D_H3L4 발현 벡터의 구축

실시예 4)-9-1 과 동일하게, 배열표의 배열 번호 40 에 나타내는 h198D-_H3 타입 중사슬의 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 58 내지 1407 에 나타내는 h198D-H3 타입 중사슬을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편과 배열표의 배열 번호 42 에 나타내는 h198D-L4 타입 경사슬의 뉴클레오티드 배열의 뉴클레오티드 번호 61 내지 704 에 나타내는 h198D-L4 타입 경사슬을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편을 합성하였다 (GENEART 사 인공 유전자 합성 서비스).

합성한 DNA 단편을 사용하여, BioWa 사 및 Lonza 사의 Potelligent (등록상표) CHOK1SV Technology 의 프로토콜에 준하여, MACA-1983a 발현 벡터를 구축하였다. 얻어진 발현 벡터를 「DGV-h198D-H3L4-GS」 라고 명명하였다.

7)-10 인간화 항인간 GARP 항체의 조제

7)-10-1 인간화 항인간 GARP 항체 생산 세포의 제조

7)-10-1-1 인간화 항인간 GARP 항체 h151D-H1L1 생산 세포의 제조

BioWa 사 및 Lonza 사의 Potelligent (등록상표) CHOK1SV Technology 의 프로토콜에 준하여, 실시예 7)-9-1 에서 구축한 인간화 항인간 GARP 항체 h151D-H1L1 발현 벡터, DGV-h151D-H1L1-GS 를 Potelligent CHOK1SV 세포 (BioWa 사 및 Lonza 사) 에 트랜스펙션하고, 인간화 항인간 GARP 항체 h151D-H1L1 생산주를 구축하였다. 얻어진 생산주를 「MAC1-1」 이라고 명명하였다.

7)-10-1-2 인간화 항인간 GARP 항체 h151D-H4L4 생산 세포의 제조

실시예 7)-10-1-1 과 동일하게, 실시예 4)-9-2 에서 구축한 인간화 항인간 GARP 항체 h151D-H4L4 발현 벡터, DGV-h151D-H4L4-GS 를 Potelligent CHOK1SV 세포 (BioWa 사 및 Lonza 사) 에 트랜스펙션하고, 인간화 항인간 GARP 항체 h151D-H4L4 생산주를 구축하였다. 얻어진 생산주를 「MAC2-1」 이라고 명명하였다.

7)-10-1-3 인간화 항인간 GARP 항체 h198D-H3L4 생산 세포의 제조

실시예 7)-10-1-1 과 동일하게, 실시예 7)-9-3 에서 구축한 인간화 항인간 GARP 항체 h198D_H3L4 발현 벡터, DGV-h198D_H3L4-GS 를 Potelligent CHOK1SV 세포 (BioWa 사 및 Lonza 사) 에 트랜스펙션하고, 인간화 항인간 GARP 항체 h151D-H4L4 생산주를 구축하였다. 얻어진 생산주를 「MAC3-1」 이라고 명명하였다.

7)-10-2 인간화 항인간 GARP 항체 생산 세포의 배양

7)-10-2-1 인간화 항인간 GARP 항체 h151D-H1L1 생산 세포의 배양

실시예 7)-10-1-1 에서 제조한 인간화 항인간 GARP 항체 h151D-H1L1 생산주 「MAC1-1」 의 배양은, 배양 장치 Wave reactor (GE 헬스케어·재팬사) 를 사용하여 실시하였다. 생산주 「MAC1-1」 을 Dsp04B (JX 에너지사) 배지를 사용하여 해동하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 인큐베이터 내에서 120 rpm 으로 배양하였다. 얻어진 배양액을 C36 (JX 에너지사) 배지로 희석시키고, 37 ℃, 5 ％ CO₂ 인큐베이터 내에서 120 rpm 으로 확대 배양하였다.

얻어진 배양액을 세포 밀도 30 × 10⁴ 세포/㎖ 가 되도록 C36 배지에서 희석시켜 WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience 사) 에 주입하고, 37 ℃, 5 ％ CO₂, 에어 공급량 0.3 ℓ/분, 요동 18 - 24 rpm, 각도 6 - 8°에서 13 일간 배양하였다.

배양 개시 3 일째부터 FM4Ae2 배지 (자가 조제) 를 1 일당, 주입량의 6 ％ 분을 매일 첨가하였다. 얻어진 배양액을 뎁스 필터 Millistak MC0HC054H1 (Merck Millipore 사) 로 조 (粗) 여과 후, Flexboy Bags 에 부속된 0.22 ㎛ 필터 (Sartorius 사) 로 여과하였다. 이 여과액을 「MACA-1511a 배양 상청」 이라고 명명하였다.

7)-10-2-2 인간화 항인간 GARP 항체 h151D_H4L4 생산 세포의 배양

실시예 7)-10-2-1 과 동일하게, 실시예 7)-10-1-2 에서 제조한 인간화 항인간 GARP 항체 h151D-H4L4 생산주 「MAC2-1」 을 배양, 확대하고, 배양 장치 Wave reactor (GE 헬스케어·재팬사) 를 사용하여 페드 배치 배양을 실시하였다. 세포 밀도 30 × 10⁴ 세포/㎖ 가 되도록 C36 배지로 희석시켜 WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience 사) 에 주입하고, 13 일간 배양하였다. 얻어진 배양액을 여과하고, 이 여과액을 「MACA-1514a 배양 상청」 이라고 명명하였다.

7)-10-2-3 인간화 항인간 GARP 항체 h198D-H3L4 생산 세포의 배양

실시예 7)-10-2-1 과 동일하게, 실시예 7)-10-1-3 에서 제조한 인간화 항인간 GARP 항체 h198D-H3L4 생산주 「MAC3-1」 을 배양, 확대하고, 배양 장치 Wave reactor (GE 헬스케어·재팬사) 를 사용하여 페드 배치 배양을 실시하였다. 세포 밀도 30 × 10⁴ 세포/㎖ 가 되도록 C36 배지로 희석시켜 WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience 사) 에 주입하고, 13 일간 배양하였다. 얻어진 배양액을 여과하고, 이 여과액을 「MACA-1983a 배양 상청」 이라고 명명하였다.

7)-10-3 인간화 항인간 GARP 항체의 정제

7)-10-3-1 인간화 항인간 GARP 항체 h151D-H1L1 의 정제

실시예 7)-10-2-1 에서 얻어진 「MACA-1511a 배양 상청」 을, rProteinA 어피니티 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피의 3 단계 공정으로 정제하였다.

최초로, 배양 상청을, PBS 로 평형화한 rProteinA 어피니티 크로마토 수지에 어플라이하였다. 배양액이 칼럼에 모두 들어간 후, PBS, 아르기닌을 함유하는 완충액, PBS 로 칼럼을 세정하였다. 다음으로, 아세트산 완충액으로 용출하고, 280 ㎚ 의 흡수 피크를 회수하였다. 회수액을 Tris 완충액으로 중화시키고, 글래스 파이버 필터 AP20 (Merck Millipore 사) 로 조여과 후, 0.22 ㎛ 필터인 스테리컵 GV (Merck Millipore 사) 로 여과한 것을 rProteinA 정제 풀로 하였다.

다음으로, rProteinA 정제 풀을, PBS 로 평형화한 음이온 교환 크로마토 수지에 어플라이하였다. 어플라이액이 칼럼에 모두 들어간 후, PBS 를 통액하였다. 통과 획분 및 PBS 통액시에 있어서의 280 ㎚ 의 흡수 피크를 회수하였다. 회수액을 아세트산으로 pH 조정하고, 글래스 파이버 필터 AP20 (Merck Millipore 사) 으로 조여과 후, 0.22 ㎛ 필터인 스테리컵 GV (Merck Millipore 사) 로 여과한 것을 AEX 정제 풀로 하였다.

다음으로, AEX 정제 풀을 아세트산 완충액으로 평형화한 양이온 교환 크로마토 수지에 어플라이하였다. 어플라이액이 칼럼에 모두 들어간 후, 아세트산 완충액으로 칼럼을 세정하였다. 다음으로 고농도의 NaCl 을 함유하는 아세트산 완충액을 사용하여 용출하고, 280 ㎚ 의 흡수 피크를 회수하였다. 회수액을 글래스 파이버 필터 AP20 (Merck Millipore 사) 으로 조여과 후, 0.22 ㎛ 필터인 스테리컵 GV (Merck Millipore 사) 로 여과한 것을 CEX 정제 풀로 하였다.

CEX 정제 풀을, Pellicon 3 Cassette 30kDa (Merck Millipore 사) 로 항체 농도 25 ㎎/㎖ 로 농축한 후, 히스티딘 버퍼 (25 mM Histidine, 5 ％ Sorbitor, pH6.0) 로 치환하였다. 마지막에 글래스 파이버 필터 AP20 (Merck Millipore 사) 으로 조여과 후, 0.22 ㎛ 필터인 스테리컵 GV (Merck Millipore 사) 로 여과한 것을 정제 샘플로 하였다. 정제 샘플을 「h151D-H1L1」 이라고 명명하였다.

7)-10-3-2 인간화 항인간 GARP 항체 h151D-H4L4 의 정제

실시예 7)-10-3-1 과 동일하게, 실시예 7)-10-2-2 에서 얻어진 「MACA-1514a 배양 상청」 을, rProteinA 어피니티 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피의 3 단계 공정으로 정제하였다. 정제 샘플을 「h151D-H4L4」 라고 명명하였다.

7)-10-3-3 인간화 항인간 GARP 항체 h198D-H3L4 의 정제

실시예 7)-10-3-1 과 동일하게, 실시예 7)-10-2-3 에서 얻어진 「MACA-1983a 배양 상청」 을, rProteinA 어피니티 크로마토그래피, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피의 3 단계 공정으로 정제하였다. 정제 샘플을 「h198D-H3L4」 라고 명명하였다.

7)-11 인간화 항인간 GARP 항체의 인간 GARP 에 대한 결합성 평가

실시예 7)-10 에서 제조한 인간화 항인간 GARP 항체 h151D-H1L1, h151D-H4L4 및 h151D-H3L4 와 GARP 의 해리 정수 측정은, Biacore T200 (GE 헬스케어 바이오사이언스 (주)) 을 사용하여, 고정화된 Protein A 에 항체를 리간드로서 포착 (캡처) 하고, 항원을 아날라이트로서 측정하는 캡처법으로 실시하였다. 러닝 버퍼로서 HBS-EP+ (GE 헬스케어 바이오사이언스 (주)), 센서 칩으로서 Protein A (GE 헬스케어 바이오사이언스 (주)) 를 사용하였다.

칩 상에 1 ㎍/㎖ 의 인간 키메라화 항체를 10 ㎕/min 으로 20 초간 첨가한 후, 항원의 희석 계열 용액 (8 ∼ 128 nM) 을 유속 30 ㎕/분으로 120 초간 첨가하고, 계속해서 480 초간의 해리상을 모니터하였다. 재생 용액으로서, Glycine 1.5 (GE 헬스케어 바이오사이언스 (주)) 를 유속 20 ㎕/분으로 30 초간 첨가하였다.

데이터의 해석에는 1 : 1 결합 모델을 사용하여, 결합 속도 정수 ka, 해리 속도 정수 kd 및 해리 정수 (KD ; KD = kd/ka) 를 산출하였다.

결과를 표 2 에 나타낸다.

표 2 인간화 항인간 GARP 항체의 해리 정수

실시예 8 : 항원 유전자 발현 세포에의 결합

8)-1 GARP 에의 결합

실시예 2 에 기재한 방법에 의해, 인간 GARP 발현 벡터 및 컨트롤 벡터를 도입한 HEK-293T 세포 현탁액을 조제하였다. 얻어진 세포 현탁액에 h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4, 그리고 컨트롤 인간 IgG (human IgG : Eureka Therapeutics 사) 를 첨가하고, 15 분간 4 ℃ 에서 가만히 정지시켰다.

FACS 버퍼 (3 ％ FBS 함유 PBS (Invitrogen 사)) 로 2 회 세정 후, R-피코에리트린 (R-Phycoerythrin, PE) 표지 항 IgG 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories 사) 및 Horizon FVS450 (Becton Dickinson 사) 을 첨가하여 현탁하고, 추가로 15 분간 4 ℃ 에서 가만히 정지시켰다. 이후의 플로우 사이토미터 해석 방법은 실시예 2 에 기재한 내용과 동일하게 실시하여, PE 형광 강도의 히스토그램을 제조하였다 (도 37).

컨트롤 벡터를 도입한 HEK-293T 세포에서는, h151DH-1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-_H3L4 는 컨트롤 IgG 와 동일한 형광 강도 히스토그램을 나타냈다 (도면 중에는 Mock vector-transfected HEK293T 로 표기).

한편, GARP 발현 HEK-293T 세포 (도면 중에는 hGARP-transfected HEK293T 로 표기) 에서는, 컨트롤 인간 IgG 의 형광 강도 히스토그램에 대해 h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D_H3L4 의 각각의 히스토그램이 강형광 강도측으로 시프트되어 있는 것을 확인하였다.

이상의 결과로부터, h151D-H1L1, h151D-H4L4 및 h198D-H3L4 는, GARP 에 특이적으로 결합하는 것이 분명해졌다.

8)-2 GARP-TGFβ1 에의 결합

8)-2-1 인간 GARP 변이체 발현 벡터의 구축

인간 GARP 발현 벡터 (Origene 사) 를 주형으로서, 프라이머 F (cacggcaacctgctggagcggctgctgggggagg) (배열 번호 44), 프라이머 R (caggctgttcccagacaggtccag) (배열 번호 45), 및 KOD-Plus-Mutagenesis Kit (Toyobo 사) 를 사용하여, 인간 GARP 아미노산 배열 (배열 번호 : 1) 의 아미노산 배열 번호 137 - 139 의 YSG 를 HGN 으로 변환한, 인간 GARP 변이체 발현 벡터를 구축하여 염기 배열을 확인하였다.

8)-2-2 GARP-TGFβ1 의 공발현

인간 TGFβ1 발현 벡터 (Sino Biological 사) 를, 인간 GARP 발현 벡터 또는 인간 GARP 변이체 발현 벡터와 함께, HEK-293T 세포에 Lipofectamin2000 (Invitrogen 사) 을 사용하여 유전자 도입하였다.

10 ％ FBS 함유 DMEM 배지 (Invitrogen 사) 중에서 5 ％ CO₂ 의 조건하 37 ℃ 에서 하룻밤 배양한 후, TrypLE Express (Invitrogen 사) 처리에 의해 세포를 플레이트로부터 회수하고, FACS 버퍼로 2 회 세정 후, 동 용액에 현탁하였다.

얻어진 세포 현탁액에 본원 발명에 관련된 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4, 그리고 공지 항체 (특허문헌 1 에 기재된 배열 정보에 기초하여 제조한 인간 IgG1 항 GARP 항체 : MHG8 및 LHG10) 의 각 항체, 및 컨트롤 인간 IgG (Eureka Therapeutics 사) 를 첨가하고, 15 분간 4 ℃ 에서 가만히 정지시켰다.

FACS 버퍼로 2 회 세정 후, PE 표지 항 IgG 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories 사) 및 Horizon FVS450 (Becton Dickinson 사) 을 첨가하여 현탁하고, 추가로 15 분간 4 ℃ 에서 가만히 정지시켰다. 이후의 플로우 사이토미터 해석 방법은 실시예 2 에 기재한 내용과 동일하게 실시하여, PE 형광 강도의 히스토그램을 제조하였다 (도 38).

TGFβ1 과 GARP 를 공도입한 HEK-293T 세포에서는, 모든 항체가 컨트롤 IgG 의 형광 강도 히스토그램에 대해 강형광 강도측으로 시프트되어 있는 것을 확인하였다 (도 38).

한편, TGFβ1 과 GARP 변이체를 공도입한 HEK-293T 세포에서는, 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 의 각 항체에서는 동일한 강형광 강도측으로의 시프트가 관찰되었지만, MHG8 및 LHG10 에 대해서는 컨트롤 IgG 와 동일한 형광 강도 히스토그램이 되어, [비특허문헌 12] 에 기재된 바와 같이 GARP 변이체에는 결합하지 않는 것이 나타났다.

이상의 결과로부터, 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 의 각 항체는, TGFβ1 과 공발현한 GARP 및 GARP 변이체의 양방에 결합하는 것이 나타나고, MHG8 및 LHG10 항체는, GARP 에 있어서 상이한 영역에 결합하는 것이 분명해졌다.

실시예 9 : 내인성 GARP 발현 세포에의 결합

9)-1 L428 세포를 사용한 플로우 사이토메트리 해석

428 세포를 FACS 버퍼로 2 회 세정 후, 동 용액에 현탁하고, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D_H3L4, 그리고 컨트롤 인간 IgG (human IgG : Eureka Therapeutics 사) 를 각각 첨가하여 15 분간 4 ℃ 에서 가만히 정지시켰다. FACS 버퍼로 2 회 세정 후, PE 표지 항 IgG 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories 사) 를 첨가하여 현탁하고, 추가로 15 분간 4 ℃ 에서 가만히 정지시켰다. 이후의 플로우 사이토미터에서의 해석 방법은 실시예 3 에 기재한 내용과 동일하게 실시하여, PE 형광 강도의 히스토그램을 제조하였다.

컨트롤 IgG 를 첨가한 L428 세포의 형광 강도 히스토그램에 비해, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D_H3L4 의 각 항체를 첨가한 히스토그램은 강형광 강도측으로 시프트되어 있는 것이 관찰되고, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 가 내인성으로 발현하고 있는 GARP 에 결합하는 것이 확인되었다 (도 39).

9)-2 인간 Treg 를 사용한 플로우 사이토메트리 해석

PBMC 는, 동결 인간 PBMC (Cellular Technology 사) 를 프로토콜에 따라 해동하고, 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 (Invitrogen 사) 을 사용하여 24 웰 플레이트 (스미토모 베이클라이트사) 에 2 × 10⁶ 세포/㎖ 로 파종하였다.

Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 (Life technologies 사) 을 첨가하여 48 시간 배양 후, 세포를 FACS 버퍼에 현탁하고, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 의 각 항체, 그리고 컨트롤 인간 IgG (human IgG : Eureka Therapeutics 사) 를 APC 표지 항 CD4 항체 (Becton Dickinson 사) 와 함께 첨가하고, 10 분간 4 ℃ 로 가만히 정지시켰다.

FACS 버퍼로 세포를 세정 후, FITC 표지 항 IgG 항체 (Jackson ImmunoResearch Laboratories 사) 및 Horizon FVS450 (Becton Dickinson 사) 을 첨가하여 현탁하고, 추가로 15 분간 4 ℃ 에서 가만히 정지시켰다.

다시 FACS 버퍼로 세포를 세정 후, FoxP3 Staining Buffer Set (Miltenyi Biotec 사) 를 사용하여 세포를 조제한 후, PE 표지 항 Foxp3 항체 (Miltenyi Biotec 사) 를 첨가하고 4 ℃ 에서 30 분간 가만히 정지시켰다.

세포 세정 후, 플로우 사이토미터 (Facs Canto II : Becton Dickinson 사) 를 사용하여 측정하고, Horizon FVS450 에 의해 사세포를 제거한 CD4 양성 세포에 대해, FlowJo (Tree Star 사) 로 해석하였다.

그 결과, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 의 각 항체는, FoxP3 양성 Treg 에 결합하는 것이 나타났다 (도 40).

실시예 10 : 항 GARP 항체의 성질

10)-1 ADCC 활성

h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4, 그리고 공지 항체 (특허문헌 1 에 기재된 배열 정보에 기초하여 제조한 인간 IgG1 항 GARP 항체 : MHG8 및 LHG10) 의 각 항체, 및 컨트롤 인간 IgG (Sigma 사) 의 각 항체의 ADCC 활성을 실시예 4 에 기재된 방법에 의해 측정하였다.

h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 항체는, L428 세포에 대해 항체 농도 의존적으로 세포 용해 활성을 나타냈다 (도 41A).

한편, MHG8 및 LHG10 은, 실시예 4 에 기재한 바와 같이, 컨트롤 인간 IgG 와 동일하게 세포 용해 활성을 관찰할 수 없었다 (도 41B).

이상으로부터, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 의 각 항체는 ADCC 활성을 갖는 것이 나타났다.

10)-2 Treg 기능 저해 활성

h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 의 각 항체의 Treg 기능 저해 활성을 실시예 4 에 기재된 방법에 의해 측정하였다. h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 의 종농도 1 ㎍/㎖ 의 Treg 기능 저해 활성 (h151D-H1L1 저해율 81.5 ％, h151D-H4L4 저해율 80.4 ％, h198D-H3L4 저해율 70.8 ％) 을 도 42 에 나타낸다.

h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 항체는, Treg 기능 저해 활성을 갖는 것이 나타났다.

10)-3 항종양 활성 (in vitro)

10)-3-1 세포 독성 T 림프구 (Cytotoxic T lymphocyte, CTL) 의 조제

NY-ESO-1 특이적 T 세포 수용체를 갖는 CTL 세포 (MU28 CD8B35 Clone #7 : 미에 대학으로부터 입수) 를 미에 대학의 프로토콜에 따라, 3 × 10⁵ 세포/25 ㎠ 플라스크 (스미토모 베이클라이트사) 로 항 CD3 항체 (OKT3 : Imgenex 사), IL-2 (Novartis 사), 그리고 피더 세포군의 존재하에서, 10 ％ 인간 수컷 AB 혈청 (Human male AB serum) (Sigma 사) 함유 RPMI1640 배지 (Invitrogen 사) 중에서 7 일간 배양하였다.

피더 세포군은, 동결 인간 PBMC (Cellular Technology 사) 를 프로토콜에 따라 해동한 PBMC 로부터 CD8 MicroBeads (Miltenyi Biotech 사) 를 사용하여 CD8 양성 세포를 제거한 CD8-depleted PBMC (7.5 × 10⁶ 세포/25 ㎠ 플라스크), 그리고 103-LCL 세포 (이화학 연구소 바이오리소스 센터로부터 입수) (1.5 × 10⁶ 세포/25 ㎠ 플라스크) 에 X 선 조사 장치 (히타치 메디코사) 를 사용하여 X-선 조사를 실시한 것을 사용하였다.

실시예 4)-2-1 에 나타낸 방법으로 얻은 Treg 를 본 배양 개시시에 첨가 (1.5 × 10⁵ 세포/25 ㎠ 플라스크) 함으로써, CTL 세포 활성의 Treg 에 의한 억제 효과를 평가하였다. 또, 동법으로 얻은 Treg (7.5 × 10⁴ 세포/25 ㎠ 플라스크) 와, 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4, 그리고 인간 IgG1 (Enzo 사) 의 각 항체를 본 배양 개시시에 첨가 (10 ㎍/㎖) 함으로써, 각 항체의 항종양 활성을 평가하였다.

각 배양 후, CD8⁺ T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotech 사) 를 사용하여 CD8 양성 세포를 정제 분리함으로써 CTL 세포를 조제하고, 활성 평가에 사용하였다.

10)-3-2 표적 세포의 조제

인간 멜라노마 세포주로 NY-ESO-1 을 발현하는 SK-MEL-52 세포 (미에 대학으로부터 입수 : Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Jul ; 77(7) : 4260-4) 는 10 ％ FBS 함유 RPMI1640 배지 (Invitrogen 사) 를 사용하여 배양하고, ⁵¹Cr 에 의한 라벨화에 대해서는, 실시예 4)-1-2 와 동일한 방법으로 실시하고, 2 × 10⁴ 세포/㎖ 로 조제하여 표적 세포로 하였다.

10)-3-3 ⁵¹Cr 릴리스 어세이

96 웰 U 바닥 마이크로 플레이트 (Costar 사) 에 표적 세포를 분주 (50 ㎕/웰) 하였다.

이어서, CTL 세포수가 표적 세포의 16, 8, 4, 2 배 (CTL 세포 : 표적 세포 = 16 : 1, 8 : 1, 4 : 1, 2 : 1) 가 되도록, CTL 세포를 첨가 (100 ㎕/웰) 하고, 5 ％ CO₂ 의 조건하에서 4 시간 37 ℃ 에서 배양하였다. 이후는 실시예 4)-1-3 의 방법에 따랐다. 또한, 당해 저해 활성은, 각 실험에 공여된 검체마다 산출되는 결과이다. 또, 당해 CTL 세포는 NY-ESO-1 을 발현하지 않는 세포에 대해서는 세포 용해를 나타내지 않는 것을 확인하고 있다.

측정 결과를 도 43, 44 에 나타낸다.

SK-MEL-52 에 대한 CTL 세포의 세포 용해 활성은, Treg 에 의해 억제되었다 (도 43).

한편, 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 의 각 항체를 첨가한 CTL 세포에서는, CTL 세포수의 증가에 수반하여 SK-MEL-52 세포에 대한 세포 용해율의 상승을 볼 수 있고, 또한 그 효과는 컨트롤 IgG 를 첨가한 각 세포비에서의 용해율에 비해 분명하게 높았다 (도 44).

따라서 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 의 각 항체는, CTL 세포 활성의 Treg 에 의한 억제를 저해하여, 항종양 활성을 증강시키는 것이 나타났다.

10)-4 항종양 활성 (in vivo)

L428 세포를 이식한 NOD/Shi-scid, IL-2Rγ^null (NOG) 마우스에 인간 PBMC 를 이입함으로써, ADCC 활성을 갖는 키메라 항체의 항종양 효과를 평가 가능하다는 것이 알려져 있다 (J Immunol. 2009 Oct 1 ; 183(7) : 4782-91).

RPMI1640 배지 (Invitrogen 사) 와 매트리젤 (Becton Dickinson 사) 1 : 1 의 혼액으로 1 x 10⁷ 세포/㎖ 에 현탁한 L428 세포 (DSMZ) 를 NOG 마우스 (자성, In vivo science 사) 의 겨드랑이부 피하에 0.1 ㎖ 이식하고, 이식한 날을 제 0 일로 하였다. 제 6 일에 종양 체적값을 사용하여 군나누기를 실시하고 (각 군 n = 6), 다음의 투여군을 설정하였다.

PBS 컨트롤 1 : 제 6, 10, 14, 18, 22, 26 일에 투여, 제 6, 14, 22 일에 인간 PBMC (Lot : 20140707) 투여

105F 항체 : 제 6, 10, 14, 18, 22, 26 일에 5 ㎎/㎏ 투여, 제 6, 14, 22 일에 인간 PBMC (Lot : 20140707) 투여

PBS 컨트롤 2 : 제 6, 10, 14, 18, 22 일에 투여, 제 6, 14, 22 일에 인간 PBMC (Lot : 20150924) 투여

h151D-H1L1 항체 : 제 6, 10, 14, 18, 22 일에 1 ㎎/㎏ 투여, 제 6, 14, 22 일에 인간 PBMC (Lot : 20150924) 투여

h151D-H4L4 항체 : 제 0, 6, 10, 14, 18, 22 일에 1 ㎎/㎏ 투여, 제 6, 14, 22 일에 인간 PBMC (Lot : 20150924) 투여

h198D-H3L4 항체 : 제 0, 6, 10, 14, 18, 22 일에 1 ㎎/㎏ 투여, 제 6, 14, 22 일에 인간 PBMC (Lot : 20150924) 투여

각 항체는 PBS (Invitrogen 사) 로 희석 조제하여, 미정맥 내로부터 투여 (10 ㎖/㎏) 하였다.

인간 PBMC 는, 동결 인간 PBMC (Cellular Technology 사) 를 프로토콜에 따라 해동한 것을 1 x 10⁷ 세포/㎖ 로 조제하여 0.2 ㎖ 를 미정맥 내로부터 투여하였다.

시간 경과적으로 종양의 장경 (mm) 및 단경 (mm) 을 전자 디지털 노기스 (주식회사 미츠토요 제조) 로 계측하고, 이하에 나타내는 계산식에 의해 종양 체적을 산출하였다.

종양 체적 (mm3) = 1/2 × [종양 장경] × [종양 단경] × [종양 단경]

각 군의 종양 체적의 평균값 ± 표준 오차 (SE) 의 변화를 도 45 에 나타낸다.

105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 의 각 항체는, PBMC 만을 투여한 컨트롤군에 비해, L428 세포에 대한 항종양 활성을 나타내고, 컨트롤군에 대한 유의차 (105F : t 검정, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 : Dunnett 형 다중 비교 검정) 가 관찰되었다. 각 투여군의 측정 마지막 날 (105F : 제 31 일, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 : 제 25 일) 에 있어서의 유의차 검정 결과 (P 값) 를 도면 중에 병기한다.

따라서, 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, 및 h198D-H3L4 의 각 항체는, in vivo 모델에 있어서도 항종양 활성을 나타내는 것이 분명해졌다.

실시예 11 항 GARP 항체의 에피토프 해석

항인간 GARP 항체 (105F, 110F, h151D-H1L1, 및 h198D-H3L4) 의 에피토프는, 수소 중수소 교환 질량 분석법에 의해 해석되었다.

7 ㎎/㎖ 의 항인간 GARP 항체와 3 ㎎/㎖ 의 인간 GARP (R ＆ D Systems 사) 또는 블랭크 완충액을 등량 혼합하고, 이 용액에 9 등량의 경수 또는 중수를 첨가하였다. 30 초, 480 초, 6000 초 후, 또는 하룻밤 후, 시료에 100 mM 인산, 4 M Gdn·HCl, 150 mM TCEP, pH2.5 를 등량 첨가하여 중수 치환시켰다. 중수 치환한 시료는 냉각하에서 HPLC 로 주입되고, 0.1 ％ TFA 용액으로 고정화 펩신 칼럼으로 송액되었다.

펩신 칼럼 내에서 인간 GARP 가 소화됨으로써 얻어진 펩티드 단편은, C18 트랩 칼럼에 유지되고, 계속해서 0.1 ％ 포름산 및 0.025 ％ TFA 를 첨가한 물 및 아세토니트릴의 리니어 그래디언트 구배에 의해 용출되어 C18 분석 칼럼으로 분리되었다. 분리된 펩티드 단편은, 비행 시간형 질량 분석계에 의해 질량 분석되었다.

각 펩티드의 질량으로부터 중수 치환율이 산출되고, 항인간 GARP 항체의 첨가에 의해 중수 치환율의 현저한 저하가 관찰된 펩티드 단편을 에피토프 단편으로서 동정하였다.

105F 에서는 배열 번호 1 에 나타내는 인간 GARP 의 366-377, 407-445, 456-470 잔기에서 중수 치환율의 억제가 관찰되고, 에피토프로서 동정되었다.

110F 에서는 배열 번호 1 에 나타내는 인간 GARP 의 54-112, 366-392 잔기에서 중수 치환율의 억제가 관찰되고, 에피토프로서 동정되었다.

h151D-H1L1 에서는 배열 번호 1 에 나타내는 인간 GARP 의 352-392 잔기에서 중수 치환율의 억제가 관찰되고, 에피토프로서 동정되었다.

h198D-H3L4 에서는 배열 번호 1 에 나타내는 인간 GARP 의 18-112 잔기에서 중수 치환율의 억제가 관찰되고, 에피토프로서 동정되었다.

산업상 이용가능성

본 발명의 항 GARP 항체는 ADCC 활성을 통한 Treg 기능 저해 활성에 의한 항종양 활성을 갖고, 당해 항 GARP 항체를 함유하는 의약 조성물은 항암제가 될 수 있다.

또, 말라리아 및 HIV 감염증의 각 환자에서의 Treg 의 과잉인 존재와 활성화가 그것들 병세와의 상관 관계를 나타내는 것 및 마우스 병태 모델에서는 Treg 의 제거가 병상의 관해를 초래하므로, Treg 기능의 효과적인 저해는 말라리아 및 HIV 등의 난치성 감염증에 있어서도 치료 효과를 기대할 수 있다.

배열표 프리 텍스트

배열 번호 1-GARP 의 아미노산 배열

배열 번호 2-105F 항체 중사슬의 아미노산 배열

배열 번호 3-105F 항체 경사슬의 아미노산 배열

배열 번호 4-110F 항체 중사슬의 아미노산 배열

배열 번호 5-110F 항체 경사슬의 아미노산 배열

배열 번호 6-105F 항체 중사슬의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 7-105F 항체 경사슬의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 8-110F 항체 중사슬의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 9-110F 항체 경사슬의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 10-프라이머 A

배열 번호 11-프라이머 B

배열 번호 12-프라이머 C

배열 번호 13-프라이머 D

배열 번호 14-151D 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 15-151D 의 중사슬의 가변 영역의 아미노산 배열

배열 번호 16-151D 의 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 17-151D 의 경사슬의 가변 영역의 아미노산 배열

배열 번호 18-198D 의 중사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 19-198D 의 중사슬의 가변 영역의 아미노산 배열

배열 번호 20-198D 의 경사슬의 가변 영역을 코드하는 cDNA 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 21-198D 의 경사슬의 가변 영역의 아미노산 배열

배열 번호 22-인간 경사슬 시그널 배열 및 인간 κ 사슬 정상 영역의 아미노산을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 23-인간 중사슬 시그널 배열 및 인간 IgG1 정상 영역의 아미노산을 코드하는 배열을 포함하는 DNA 단편의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 24-인간 키메라 항체 c151D 중사슬의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 25-인간 키메라 항체 c151D 중사슬의 아미노산 배열

배열 번호 26-인간 키메라 항체 c151D 경사슬의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 27-인간 키메라 항체 c151D 경사슬의 아미노산 배열

배열 번호 28-인간 키메라 항체 c198D 중사슬의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 29-인간 키메라 항체 c198D 중사슬의 아미노산 배열

배열 번호 30-인간 키메라 항체 c198D 경사슬의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 31-인간 키메라 항체 c198D 경사슬의 아미노산 배열

배열 번호 32-인간화 항체 h151D-H1 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 33-인간화 항체 h151D-H1 의 아미노산 배열

배열 번호 34-인간화 항체 h151D-H4 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 35-인간화 항체 h151D-H4 의 아미노산 배열

배열 번호 36-인간화 항체 h151D-L1 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 37-인간화 항체 h151D-L1 의 아미노산 배열

배열 번호 38-인간화 항체 h151D-L4 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 39-인간화 항체 h151D-L4 의 아미노산 배열

배열 번호 40-인간화 항체 h198D-H3 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 41-인간화 항체 h198D-H3 의 아미노산 배열

배열 번호 42-인간화 항체 h198D-L4 의 뉴클레오티드 배열

배열 번호 43-인간화 항체 h198D-L4 의 아미노산 배열

배열 번호 44-프라이머 F

배열 번호 45-프라이머 R

SEQUENCE LISTING <110> DAIICHI SANKYO CO. LTD. <120> ANTI-GARP ANTIBODY <130> FP1628 <150> JP2015-187488 <151> 2015-09-24 <160> 45 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 662 <212> PRT <213> Human <400> 1 Met Arg Pro Gln Ile Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Thr Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ala Ala Gln His Gln Asp Lys Val Pro Cys Lys Met Val Asp Lys Lys 20 25 30 Val Ser Cys Gln Val Leu Gly Leu Leu Gln Val Pro Ser Val Leu Pro 35 40 45 Pro Asp Thr Glu Thr Leu Asp Leu Ser Gly Asn Gln Leu Arg Ser Ile 50 55 60 Leu Ala Ser Pro Leu Gly Phe Tyr Thr Ala Leu Arg His Leu Asp Leu 65 70 75 80 Ser Thr Asn Glu Ile Ser Phe Leu Gln Pro Gly Ala Phe Gln Ala Leu 85 90 95 Thr His Leu Glu His Leu Ser Leu Ala His Asn Arg Leu Ala Met Ala 100 105 110 Thr Ala Leu Ser Ala Gly Gly Leu Gly Pro Leu Pro Arg Val Thr Ser 115 120 125 Leu Asp Leu Ser Gly Asn Ser Leu Tyr Ser Gly Leu Leu Glu Arg Leu 130 135 140 Leu Gly Glu Ala Pro Ser Leu His Thr Leu Ser Leu Ala Glu Asn Ser 145 150 155 160 Leu Thr Arg Leu Thr Arg His Thr Phe Arg Asp Met Pro Ala Leu Glu 165 170 175 Gln Leu 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caccatctcc cgggacgact ccaagaacac cctgtacctg 300 cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccag agaggactac 360 ggcggcttcc ctcattgggg ccagggcaca ctcgtgaccg tgtcctctgc ttccaccaag 420 ggcccctccg tgtttcctct ggccccttcc agcaagtcca cctctggcgg aacagccgct 480 ctgggctgcc tcgtgaagga ctacttcccc gagcccgtga cagtgtcttg gaactctggc 540 gccctgacct ccggcgtgca cacctttcca gctgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc 600 ctgtcctccg tcgtgactgt gccctccagc tctctgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtgaaccaca agccctccaa caccaaggtg gacaagcggg tggaacccaa gtcctgcgac 720 aagacccaca cctgtccccc ttgtcctgcc cctgaactgc tgggcggacc ttccgtgttc 780 ctgttccccc caaagcctaa ggacaccctg atgatctccc ggacccccga agtgacctgc 840 gtggtggtgg atgtgtccca cgaggaccct gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc 900 gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct agagaggaac agtacaactc cacctaccgg 960 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcatcag gactggctga acggcaaaga gtacaagtgc 1020 aaggtgtcca acaaggccct gcctgccccc atcgaaaaga ccatctccaa ggccaagggc 1080 cagccccggg aaccccaggt gtacacactg ccccctagcc gggaagagat gaccaagaac 1140 caggtgtccc tgacctgtct cgtgaaaggc ttctacccct ccgatatcgc cgtggaatgg 1200 gagagcaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccctgtgct ggactccgac 1260 ggctcattct tcctgtacag caagctgaca gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac 1320 gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1380 tccctgagcc ccggcaaa 1398 <210> 33 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <400> 33 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ser Ser Ile Gly Thr Val Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Gly Phe Pro His Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 34 <211> 1398 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <400> 34 atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtggccgctc ccagatgggt gctgtctgaa 60 gtgcagctgg tggaatccgg cggaggcctg gtgcagcctg gcggatctct gagactgtct 120 tgtgccgcct ccggcttcac cttctccaac tactacatgg cctgggtgcg acaggcccct 180 ggcaagggac tggaatgggt ggcctctatc ggcaccgtgg gcggcaacac ctactaccgg 240 gattctgtga agggccggtt caccatctcc cgggacgact ccaagtccac cctgtacctg 300 cagatgaact ccctgcgggc cgaggacacc gccgtgtact actgtgccag agaggactac 360 ggcggcttcc ctcattgggg ccagggcaca ctcgtgaccg tgtcctctgc ttccaccaag 420 ggcccctccg tgtttcctct ggccccttcc agcaagtcta cctccggcgg aacagccgct 480 ctgggctgcc tcgtgaagga ctacttcccc gagcccgtga cagtgtcttg gaactctggc 540 gccctgacca gcggcgtgca cacctttcca gctgtgctgc agtcctccgg cctgtactcc 600 ctgtcctccg tcgtgactgt gccctccagc tctctgggca cccagaccta catctgcaac 660 gtgaaccaca agccctccaa caccaaggtg gacaagcggg tggaacccaa gtcctgcgac 720 aagacccaca cctgtccccc ttgtcctgcc cctgaactgc tgggcggacc ttccgtgttc 780 ctgttccccc caaagcccaa ggacaccctg atgatctccc ggacccccga agtgacctgc 840 gtggtggtgg atgtgtccca cgaggaccct gaagtgaagt tcaattggta cgtggacggc 900 gtggaagtgc acaacgccaa gaccaagcct agagaggaac agtacaactc cacctaccgg 960 gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcatcag gactggctga acggcaaaga gtacaagtgc 1020 aaggtgtcca acaaggccct gcctgccccc atcgaaaaga ccatctccaa ggccaagggc 1080 cagccccggg aaccccaggt gtacacactg ccccctagcc gggaagagat gaccaagaac 1140 caggtgtccc tgacctgtct cgtgaaaggc ttctacccct ccgatatcgc cgtggaatgg 1200 gagtccaacg gccagcctga gaacaactac aagaccaccc cccctgtgct ggactccgac 1260 ggctcattct tcctgtacag caagctgaca gtggacaagt cccggtggca gcagggcaac 1320 gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1380 tccctgagcc ccggcaaa 1398 <210> 35 <211> 466 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <400> 35 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ser Ile Gly Thr Val Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Tyr Gly Gly Phe Pro His Trp Gly Gln 115 120 125 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 130 135 140 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 145 150 155 160 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 165 170 175 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 180 185 190 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 195 200 205 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 210 215 220 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 225 230 235 240 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 245 250 255 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 260 265 270 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 275 280 285 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 290 295 300 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 305 310 315 320 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 325 330 335 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 340 345 350 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 355 360 365 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 370 375 380 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 385 390 395 400 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 405 410 415 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 420 425 430 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 435 440 445 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 450 455 460 Gly Lys 465 <210> 36 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <400> 36 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcctacggc 60 aacatcgtga tgacccagtc ccccgactcc ctggctgtgt ctctgggcga gagagccacc 120 atcaactgca aggcctccca gaacgtgggc accaacgtgg actggtatca gcagaagccc 180 ggccagtccc ctaagctgct gatctacggc gccagcaacc ggtacaccgg cgtgcccgat 240 agattctccg gctctggctc tggcaccgac tttaccctga caatcagctc tctgcaggcc 300 gaggacgtgg ccgtgtacga ctgcctgcag tacaagtaca acccctacac cttcggccag 360 ggcacaaagg tggaaatcaa gcggaccgtg gccgctccct ccgtgtttat cttcccaccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcacagct tccgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 540 gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 600 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 660 ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gc 702 <210> 37 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <400> 37 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala 20 25 30 Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn 35 40 45 Val Gly Thr Asn Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Asp Cys Leu Gln Tyr Lys 100 105 110 Tyr Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 38 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <400> 38 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcctacggc 60 aacatcgtga tgacccagtc cccctccagc ctgtctgctt ccgtgggcga cagagtgacc 120 atcaactgca aggcctccca gaacgtgggc accaacgtgg actggtatca gcagaagccc 180 ggcaagtccc ccaagctgct gatctacggc gccagcaaca gatacaccgg cgtgcccgac 240 agattctccg gctctggctc tggcaccgac tttaccctga ccatcagctc cctgcagccc 300 gaggacttcg ccacctacga ctgcctgcag tacaagtaca acccctacac cttcggccag 360 ggcacaaagg tggaaatcaa gcggaccgtg gccgctccct ccgtgtttat cttcccaccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcacagct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 540 gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc caccctgacc 600 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 660 ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gc 702 <210> 39 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <400> 39 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asn Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn 35 40 45 Val Gly Thr Asn Val Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Asp Cys Leu Gln Tyr Lys 100 105 110 Tyr Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 40 <211> 1407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <400> 40 atgaagcacc tgtggttctt tctgctgctg gtggccgctc ccagatgggt gctgtctgaa 60 gtgcagctgg tggaatccgg cggaggcctc gtgaagcctt cccagaccct gtctctgacc 120 tgcaccgtgt ccggcttctc cctgacctcc ttccacgtgt catgggtgcg acagcctcca 180 ggcaagggcc tggaatggat cgccaccatc tcctctggcg gcggaaccta ctacaacccc 240 agcctgaagt ccagagtgac catctcccgg gacacctcca agaaccaggt gtccctgaag 300 ctgtcctccg tgaccgccgc tgataccgcc gtgtactact gcgccagaat ctccggctgg 360 ggccactact acgtgatgga cgtgtggggc cagggcaccc tcgtgacagt gtcctctgct 420 tccaccaagg gcccctccgt gtttcctctg gccccttcca gcaagtctac ctccggcgga 480 acagccgctc tgggctgcct cgtgaaagac tacttccccg agcccgtgac cgtgtcttgg 540 aactctggcg ctctgaccag cggcgtgcac acctttccag ctgtgctgca gtcctccggc 600 ctgtactccc tgtccagcgt cgtgactgtg ccctccagct ctctgggcac ccagacctac 660 atctgcaacg tgaaccacaa gccctccaac accaaggtgg acaagcgggt ggaacccaag 720 tcctgcgaca agacccacac ctgtccccct tgtcctgccc ctgaactgct gggcggacct 780 tccgtgttcc tgttcccccc aaagcccaag gacaccctga tgatctcccg gacccccgaa 840 gtgacctgcg tggtggtgga tgtgtcccac gaggaccctg aagtgaagtt caattggtac 900 gtggacggcg tggaagtgca caacgccaag accaagccta gagaggaaca gtacaactcc 960 acctaccggg tggtgtccgt gctgaccgtg ctgcaccagg attggctgaa cggcaaagag 1020 tacaagtgca aggtgtccaa caaggccctg cctgccccca tcgaaaagac catcagcaag 1080 gccaagggcc agccccggga accccaggtg tacacactgc cccctagccg ggaagagatg 1140 acaaaaaatc aggtgtcact gacctgtctc gtgaagggct tctacccctc cgatatcgcc 1200 gtggaatggg agtccaacgg ccagcctgag aacaactaca agaccacccc ccctgtgctg 1260 gactccgacg gctcattctt cctgtacagc aagctgacag tggacaagtc ccggtggcag 1320 cagggcaacg tgttctcctg ctccgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1380 aagtccctgt ccctgagccc cggcaaa 1407 <210> 41 <211> 469 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <400> 41 Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15 Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys 20 25 30 Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu 35 40 45 Thr Ser Phe His Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Ile Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr 100 105 110 Tyr Cys Ala Arg Ile Ser Gly Trp Gly His Tyr Tyr Val Met Asp Val 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly 130 135 140 Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly 145 150 155 160 Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val 165 170 175 Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe 180 185 190 Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val 195 200 205 Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val 210 215 220 Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu 245 250 255 Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr 260 265 270 Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val 275 280 285 Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val 290 295 300 Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser 305 310 315 320 Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu 325 330 335 Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala 340 345 350 Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro 355 360 365 Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln 370 375 380 Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala 385 390 395 400 Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr 405 410 415 Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu 420 425 430 Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser 435 440 445 Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser 450 455 460 Leu Ser Pro Gly Lys 465 <210> 42 <211> 702 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <400> 42 atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcctacggc 60 gacatccaga tgacccagag cccttccagc ctgtccgctt ccgtgggcga cagagtgacc 120 atcacctgtc aggcctccga ggacatctac tccggcctgg cctggtatca gcagaagccc 180 ggcaagtccc ccaagctgct gatctacggc gctggatctc tgcaggacgg cgtgccctct 240 agattctccg gctctggatc cggcacccac tacaccctga ccatctccag cctgcagccc 300 gaggacttcg ctacctactt ctgtcagcaa ggcctgaagt tccccctgac cttcggccag 360 ggcaccaagg tggaaatcaa gcggaccgtg gccgctccct ccgtgtttat cttcccaccc 420 tccgacgagc agctgaagtc cggcacagct tctgtcgtgt gcctgctgaa caacttctac 480 ccccgcgagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg caactcccag 540 gaatccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtcctc taccctgacc 600 ctgtccaagg ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaagtgac ccaccagggc 660 ctgtctagcc ccgtgaccaa gtctttcaac cggggcgagt gc 702 <210> 43 <211> 234 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized Antibody <400> 43 Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15 Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Glu Asp 35 40 45 Ile Tyr Ser Gly Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Gly Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr His Tyr Thr Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Leu 100 105 110 Lys Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 115 120 125 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 130 135 140 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 145 150 155 160 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 165 170 175 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 180 185 190 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 195 200 205 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 210 215 220 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 <210> 44 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer F <400> 44 cacggcaacc tgctggagcg gctgctgggg gagg 34 <210> 45 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer R <400> 45 caggctgttc ccagacaggt ccag 24

Claims

이하의 특성을 갖는 것을 특징으로 하는 항체 ;
(1) Glycoprotein-A Repetitions Predominant (GARP) 에 특이적으로 결합하고,
(2) 제어성 T 세포의 면역 억제 기능에 대한 저해 활성을 갖고,
(3) 항체 의존성 세포 상해 (ADCC) 활성을 갖고,
(4) in vivo 로 항종양 활성을 갖는다.
제 1 항에 있어서,
GARP 가 배열 번호 1 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 분자인 항체.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
(1) 배열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 366 내지 377, 407 내지 445 및 456 내지 470,
(2) 배열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 54 내지 112 및 366 내지 392,
(3) 배열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 352 내지 392, 또는
(4) 배열 번호 1 에 있어서 아미노산 번호 18 내지 112,
에 결합하는 항체.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
GARP 에의 결합에 대해,
(1) 배열 번호 2 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 3 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬,
(2) 배열 번호 4 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 5 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬,
(3) 배열 번호 25 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 27 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬, 또는
(4) 배열 번호 29 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 31 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬,
을 갖는 항체와 경합 저해 활성을 갖는 항체.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
종양이 암인 항체.
제 5 항에 있어서,
암이 폐암, 신장암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경 교아종, 난소암, 췌암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 또는 혈액암인 항체.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
(1) 배열 번호 2 에 있어서 아미노산 번호 26 내지 35 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 2 에 있어서 아미노산 번호 50 내지 66 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 및 배열 번호 2 에 있어서 아미노산 번호 99 내지 107 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3, 그리고 배열 번호 3 에 있어서 아미노산 번호 23 내지 36 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 3 에 있어서 아미노산 번호 52 내지 58 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 및 배열 번호 3 에 있어서 아미노산 번호 91 내지 101 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3,
(2) 배열 번호 4 에 있어서 아미노산 번호 26 내지 35 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 4 에 있어서 아미노산 번호 50 내지 66 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 및 배열 번호 4 에 있어서 아미노산 번호 99 내지 112 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3, 그리고 배열 번호 5 에 있어서 아미노산 번호 23 내지 36 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 5 에 있어서 아미노산 번호 52 내지 58 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 및 배열 번호 5 에 있어서 아미노산 번호 91 내지 100 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3,
(3) 배열 번호 25 에 있어서 아미노산 번호 45 내지 54 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 25 에 있어서 아미노산 번호 69 내지 78 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 및 배열 번호 25 에 있어서 아미노산 번호 118 내지 125 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3, 그리고 배열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 44 내지 54 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 70 내지 76 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 및 배열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 109 내지 117 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3, 또는
(4) 배열 번호 29 에 있어서 아미노산 번호 45 내지 54 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH1, 배열 번호 29 에 있어서 아미노산 번호 69 내지 77 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH2 및 배열 번호 29 에 있어서 아미노산 번호 117 내지 128 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRH3, 그리고 배열 번호 31 에 있어서 아미노산 번호 44 내지 54 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL1, 배열 번호 31 에 있어서 아미노산 번호 70 내지 76 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL2 및 배열 번호 31 에 있어서 아미노산 번호 109 내지 117 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 CDRL3 을 갖는 항체.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
(1) 배열 번호 2 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 118 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 3 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 112 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(2) 배열 번호 4 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 123 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 5 에 있어서 아미노산 번호 1 내지 111 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(3) 배열 번호 25 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 136 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 또는
(4) 배열 번호 29 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 139 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 31 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 갖는 항체.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
정상 영역이 인간 유래 정상 영역인 항체.
제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
(1) 배열 번호 2 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 3 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬,
(2) 배열 번호 4 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 5 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬,
(3) 배열 번호 25 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 466 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 27 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬, 또는
(4) 배열 번호 29 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 469 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 및 배열 번호 31 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬을 갖는 항체.
제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
인간화되어 있는 항체.
제 11 항에 있어서,
(a) 배열 번호 33 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 136 에 기재된 아미노산 배열,
(b) 배열 번호 35 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 136 에 기재된 아미노산 배열,
(c) 배열 번호 41 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 139 에 기재된 아미노산 배열,
(d) (a) 내지 (c) 의 배열에 있어서 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열, 및
(e) (a) 내지 (c) 의 배열에 있어서의 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬의 가변 영역, 그리고
(f) 배열 번호 37 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열,
(g) 배열 번호 39 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열,
(h) 배열 번호 43 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열,
(i) (f) 내지 (h) 의 배열에 있어서 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 대해 적어도 95 ％ 이상의 상동성을 갖는 아미노산 배열, 및
(j) (f) 내지 (h) 의 배열에 있어서의 각 CDR 배열 이외의 프레임 워크 영역의 배열에 있어서 1 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬의 가변 영역을 갖는 항체.
제 11 항 또는 제 12 항에 있어서,
(1) 배열 번호 33 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 136 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 37 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(2) 배열 번호 35 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 136 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 39 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 또는
(3) 배열 번호 41 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 139 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 43 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 129 에 기재된 아미노산 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 갖는 항체.
제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
(1) 배열 번호 33 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 466 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 중사슬, 배열 번호 35 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 466 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 중사슬, 및 배열 번호 41 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 469 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 중사슬로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬, 그리고
(2) 배열 번호 37 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 경사슬, 배열 번호 39 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 경사슬, 및 배열 번호 43 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 경사슬로 이루어지는 군에서 선택되는 경사슬을 갖는 항체.
제 11 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서,
(1) 배열 번호 33 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 466 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 37 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 경사슬,
(2) 배열 번호 35 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 466 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 39 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 경사슬, 또는
(3) 배열 번호 41 에 있어서 아미노산 번호 20 내지 469 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 중사슬 및 배열 번호 43 에 있어서 아미노산 번호 21 내지 234 에 기재된 아미노산 배열을 갖는 경사슬을 갖는 항체.
제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 기재된 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
제 16 항에 있어서,
(1) 배열 번호 6 에 있어서 뉴클레오티드 번호 76 내지 105 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH1 의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 6 에 있어서 뉴클레오티드 번호 148 내지 198 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH2 의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 6 에 있어서 뉴클레오티드 번호 295 내지 321 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH3 의 폴리뉴클레오티드, 그리고 배열 번호 7 에 있어서 뉴클레오티드 번호 67 내지 108 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL1 의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 7 에 있어서 뉴클레오티드 번호 154 내지 174 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL2 의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 7 에 있어서 뉴클레오티드 번호 271 내지 303 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL3 의 폴리뉴클레오티드,
(2) 배열 번호 8 에 있어서 뉴클레오티드 번호 76 내지 105 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH1 의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 8 에 있어서 뉴클레오티드 번호 148 내지 198 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH2 의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 8 에 있어서 뉴클레오티드 번호 295 내지 336 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH3 의 폴리뉴클레오티드, 그리고 배열 번호 9 에 있어서 뉴클레오티드 번호 67 내지 108 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL1 의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 9 에 있어서 뉴클레오티드 번호 154 내지 174 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL2 의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 9 에 있어서 뉴클레오티드 번호 271 내지 300 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL3 의 폴리뉴클레오티드,
(3) 배열 번호 24 에 있어서 뉴클레오티드 번호 133 내지 162 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH1 의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 24 에 있어서 뉴클레오티드 번호 205 내지 234 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH2 의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 24 에 있어서 뉴클레오티드 번호 352 내지 375 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH3 의 폴리뉴클레오티드, 그리고 배열 번호 26 에 있어서 뉴클레오티드 번호 130 내지 162 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL1 의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 26 에 있어서 뉴클레오티드 번호 208 내지 228 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL2 의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 26 에 있어서 뉴클레오티드 번호 325 내지 351 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL3 의 폴리뉴클레오티드, 또는
(4) 배열 번호 28 에 있어서 뉴클레오티드 번호 133 내지 162 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH1 의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 28 에 있어서 뉴클레오티드 번호 205 내지 231 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH2 의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 28 에 있어서 뉴클레오티드 번호 349 내지 384 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRH3 의 폴리뉴클레오티드, 그리고 배열 번호 30 에 있어서 뉴클레오티드 번호 130 내지 162 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL1 의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 30 에 있어서 뉴클레오티드 번호 208 내지 228 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL2 의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 30 에 있어서 뉴클레오티드 번호 325 내지 351 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 CDRL3 의 폴리뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드.
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서,
(1) 배열 번호 6 에 있어서 뉴클레오티드 번호 1 내지 354 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 7 에 있어서 뉴클레오티드 번호 1 내지 336 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역의 폴리뉴클레오티드,
(2) 배열 번호 8 에 있어서 뉴클레오티드 번호 1 내지 369 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 9 에 있어서 뉴클레오티드 번호 1 내지 333 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역의 폴리뉴클레오티드,
(3) 배열 번호 24 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 26 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 또는
(4) 배열 번호 28 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 417 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 30 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 갖는 폴리뉴클레오티드.
제 16 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
(1) 배열 번호 6 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 7 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드,
(2) 배열 번호 8 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 9 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드
(3) 배열 번호 24 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 26 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드, 또는
(4) 배열 번호 28 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1407 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드 및 배열 번호 30 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드.
제 16 항 또는 제 17 항에 있어서,
(1) 배열 번호 32 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 배열 번호 34 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역, 및 배열 번호 40 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 417 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역으로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬 가변 영역, 그리고
(2) 배열 번호 36 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 배열 번호 38 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 및 배열 번호 42 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역으로 이루어지는 군에서 선택되는 경사슬 가변 영역을 갖는 폴리뉴클레오티드.
제 16 항, 제 17 항 또는 제 20 항에 있어서,
(1) 배열 번호 32 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 36 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역,
(2) 배열 번호 34 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 408 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 38 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역, 또는
(3) 배열 번호 40 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 417 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬 가변 영역 및 배열 번호 42 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 387 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬 가변 영역을 갖는 폴리뉴클레오티드.
제 16 항, 제 17 항, 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
(1) 배열 번호 32 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 34 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드, 및 배열 번호 40 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1407 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 중사슬의 폴리뉴클레오티드, 그리고
(2) 배열 번호 36 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드, 배열 번호 38 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드, 및 배열 번호 42 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드로 이루어지는 군에서 선택되는 경사슬의 폴리뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드.
제 16 항, 제 17 항 및 제 20 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서,
(1) 배열 번호 32 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드, 및 배열 번호 36 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드,
(2) 배열 번호 34 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1398 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드, 및 배열 번호 38 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드, 또는
(3) 배열 번호 40 에 있어서 뉴클레오티드 번호 58 내지 1407 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 중사슬의 폴리뉴클레오티드, 및 배열 번호 42 에 있어서 뉴클레오티드 번호 61 내지 702 에 기재된 뉴클레오티드 배열로 이루어지는 경사슬의 폴리뉴클레오티드를 갖는 폴리뉴클레오티드.
제 16 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터.
제 24 항에 기재된 발현 벡터에 의해 형질 전환된 숙주 세포.
제 25 항에 기재된 숙주 세포를 배양하는 공정, 및 당해 공정에서 얻어진 배양물로부터 목적으로 하는 항체를 채취하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 당해 항체 또는 당해 단편의 제조 방법.
제 26 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 항체.
제 1 항 내지 제 15 항 및 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서,
N-결합에의 당 사슬 부가, O-결합에의 당 사슬 부가, N 말단의 프로세싱, C 말단의 프로세싱, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성화, 메티오닌의 산화, N 말단에 메티오닌 잔기의 부가, 프롤린 잔기의 아미드화 및 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실된 중사슬로 이루어지는 군에서 선택되는 1 또는 2 이상의 수식을 포함하는 항체.
제 28 항에 있어서,
중사슬의 카르복실 말단에 있어서 1 개 또는 2 개의 아미노산이 결실되어 있는 항체.
제 29 항에 있어서,
2 개의 중사슬의 쌍방에서 카르복실 말단에 있어서 1 개의 아미노산이 결실되어 있는 항체.
제 28 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서,
중사슬의 카르복실 말단의 프롤린 잔기가 추가로 아미드화되어 있는 항체.
제 1 항 내지 제 15 항 및 제 27 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
항체 의존성 세포 상해 활성을 증강시키기 위해서 당 사슬 수식이 조절되어 있는 항체.
제 1 항 내지 제 15 항 및 제 27 항 내지 제 32 항에 기재된 항체 중 적어도 하나를 함유하는 것을 특징으로 하는 의약 조성물.
제 33 항에 있어서,
종양 치료용인 의약 조성물.
제 34 항에 있어서,
종양이 암인 의약 조성물.
제 35 항에 있어서,
암이 폐암, 신장암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경 교아종, 난소암, 췌암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 또는 혈액암인 의약 조성물.
제 1 항 내지 제 15 항 및 제 27 항 내지 제 32 항에 기재된 항체 중 적어도 하나를 개체에 투여하는 것을 특징으로 하는 종양의 치료 방법.
제 37 항에 있어서,
종양이 암인 치료 방법.
제 38 항에 있어서,
암이 폐암, 신장암, 요로 상피암, 대장암, 전립선암, 다형 신경 교아종, 난소암, 췌암, 유방암, 멜라노마, 간암, 방광암, 위암, 식도암, 또는 혈액암인 치료 방법.