TW201718643A - 抗ｇａｒｐ抗體 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於有用於作為腫瘤的治療劑之結合於GARP的抗體，及使用該抗體之腫瘤的治療法等。本發明之課題係提供藉由抑制腫瘤中Treg的機能而成為具有治療效果的醫藥品之抗體，及使用該抗體之腫瘤的治療方法等。本發明之解決手段係獲得結合於GARP而顯示Treg機能抑制活性及ADCC活性之抗GARP抗體，而獲得含有該抗體之腫瘤治療用醫藥組成物等。

Description

抗GARP抗體
本發明係關於有用於作為腫瘤的治療劑之結合於GARP的抗體，及使用該抗體之腫瘤的治療法。
調節性T細胞(regulatory T cell)(Treg)係導致癌症患者的腫瘤區域所觀察到的免疫耐受性(immunotolerance)之主要原因細胞。亦即，於癌症患者中，藉由因腫瘤被活化的Treg，而原本應作動的抗腫瘤免疫細胞群處於被抑制的狀態，此係與腫瘤的惡性化有關[非專利文獻1]。
以醣蛋白-A為主的重複結構(Glycoprotein-A Repetitions Predominant)(GARP)係具有單次跨膜結構的蛋白質[非專利文獻2]，表現於經活化之Treg的細胞表面，形成與latent TGF-β(為免疫耐受性誘導的重要分子之TGF-β的前驅物)之複合體[非專利文獻3]。
藉由「Treg」與「Treg導致免疫抑制的標的細胞」之細胞-細胞間相互作用，經由GARP而自被滯留在Treg細胞表面的latent TGF-β分泌成熟化的TGF-β，將TGF-β的免疫抑制訊息直接傳遞至標的細胞[非專利文獻 4、5]。已指出GARP之在細胞膜上的表現對於此TGF-β的成熟化係必要的[非專利文獻5]，但另一方面，因為將跨膜區域經缺損之可溶性GARP直接添加於CD4陽性T細胞的情形，CD4陽性T細胞之增殖亦被抑制[非專利文獻6]，故亦不能否認「不經由細胞膜上的TGF-β成熟化機制之利用GARP的免疫抑制機制」之存在。
GARP除了被觀察到在源自末梢血液的活化Treg表現之外，臨床上亦被觀察到在浸潤至癌症患者的腫瘤患部之T細胞(Tumor Infiltrating Tcells)中所存在的Treg[非專利文獻7]、及腹水中所存在的Treg[非專利文獻8]、或患者末梢血液中所存在的Treg之表現[非專利文獻9]。
作為檢討抑制GARP的表現時對Treg機能的影響之報告，在導入有對GARP之siRNA的Treg中，雖觀察到對於輔助型T細胞的增殖抑制機能之抑制，但該抑制效果為部分性的[非專利文獻10]。
另一方面，以TGF-β成熟化的抑制能力為指標所獲得的抗GARP抗體(MHG-8、LHG-10)，係抑制自血色素沉著症患者所建立的Treg A1細胞株[非專利文獻11]之對於輔助型T細胞的增殖抑制機能[專利文獻1、非專利文獻12]。然而，該抗體對於腫瘤微環境(tumor microenvironment)下的Treg是否有效地顯示該抑制效果則為不明，又，具有如此效果的抗GARP抗體迄今尚未被報告。另外，亦已知有辨識GARP及TGF-β兩者的抗體[專利文獻2]。
針對Treg，除了腫瘤之外，亦被指出在瘧疾、HIV感染症的各患者中之Treg的過量存在及活化係顯示與此等病勢具有相關性[非專利文獻13、14]，及在小鼠病態模式中Treg的去除係導致病狀的緩解[非專利文獻15、16]。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO2015/015003
[專利文獻2]WO2016/125017
[非專利文獻]
[非專利文獻1]Int J Cancer. 2010 Aug 15; 127(4): 759-67.
[非專利文獻2]PLoS One. 2008; 3(7): e2705.
[非專利文獻3]Proc Natl Acad Sci U S A. 2009; 106(32): 13445-50.
[非專利文獻4]Eur J Immunol. 2009; 39(12): 3315-22.
[非專利文獻5]Mol Biol Cell. 2012; 23(6): 1129-39.
[非專利文獻6]Blood. 2013; 122(7): 1182-91.
[非專利文獻7]Eur J Immunol. 2012 Jul; 42(7): 1876-85.
[非專利文獻8]Clin Immunol. 2013 Oct; 149(1): 97-110.
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[非專利文獻16]PLoS Pathog. 2013; 9(12): e1003798.
本發明之課題係提供藉由抑制腫瘤中Treg的機能而成為具有治療效果的醫藥品之抗體，及使用該抗體之腫瘤的治療方法等。
本發明人等為了解決上述課題而進行銳意探討的結果，發現特異性地結合於GARP，並經由抗體依賴性細胞毒殺活性而顯示抑制Treg的機能之抗體，進而完成本發明。亦即，本發明係包含以下之發明。
(1)一種抗體，其特徵係具有以下之特性； (a)特異性地結合於以醣蛋白-A為主的重複結構(Glycoprotein-A Repetitions Predominant(GARP))、(b)具有對於調節性T細胞的免疫抑制機能之抑制活性、(c)具有抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性、及(d)於活體內具有抗腫瘤活性。
(2)如上述(1)所記載之抗體，其中GARP為包含序列識別號1所記載的胺基酸序列的分子。
(3)如上述(1)或(2)所記載之抗體，其係結合於(a)序列識別號1中之胺基酸編號366至377、407至445及456至470、(b)序列識別號1中之胺基酸編號54至112及366至392、(c)序列識別號1中之胺基酸編號352至392、或(d)序列識別號1中之胺基酸編號18至112。
(4)如上述(1)至(3)中任一項所記載之抗體，其對於對GARP之結合，具有與具有下列重鏈及輕鏈的抗體之競爭性抑制活性：(a)包含序列識別號2所記載的胺基酸序列的重鏈及包含序列識別號3所記載的胺基酸序列的輕鏈、(b)包含序列識別號4所記載的胺基酸序列的重鏈及包含序列識別號5所記載的胺基酸序列的輕鏈、(c)包含序列識別號25所記載的胺基酸序列的重鏈及包含序列識別號27所記載的胺基酸序列的輕鏈、或(d)包含序列識別號29所記載的胺基酸序列的重鏈及包含序列識別號31所記載的胺基酸序列的輕鏈。
(5)如上述(1)至(4)中任一項所記載之抗體，其中腫 瘤為癌症。
(6)如上述(5)所記載之抗體，其中癌症為肺癌、腎癌、尿道上皮癌(urothelial carcinoma)、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、或血液癌(hematological malignancy)。
(7)如上述(1)至(6)中任一項所記載之抗體，其具有(a)包含序列識別號2中之胺基酸編號26至35所記載的胺基酸序列之CDRH1、包含序列識別號2中之胺基酸編號50至66所記載的胺基酸序列之CDRH2及包含序列識別號2中之胺基酸編號99至107所記載的胺基酸序列之CDRH3、以及包含序列識別號3中之胺基酸編號23至36所記載的胺基酸序列之CDRL1、包含序列識別號3中之胺基酸編號52至58所記載的胺基酸序列之CDRL2及包含序列識別號3中之胺基酸編號91至101所記載的胺基酸序列之CDRL3、(b)包含序列識別號4中之胺基酸編號26至35所記載的胺基酸序列之CDRH1、包含序列識別號4中之胺基酸編號50至66所記載的胺基酸序列之CDRH2及包含序列識別號4中之胺基酸編號99至112所記載的胺基酸序列之CDRH3、以及包含序列識別號5中之胺基酸編號23至36所記載的胺基酸序列之CDRL1、包含序列識別號5中之胺基酸編號52至58所記載的胺基酸序列之CDRL2及包含序列識別號5中之胺基酸編號91至100所記載的胺基酸序列之CDRL3、 (c)包含序列識別號25中之胺基酸編號45至54所記載的胺基酸序列之CDRH1、包含序列識別號25中之胺基酸編號69至78所記載的胺基酸序列之CDRH2及包含序列識別號25中之胺基酸編號118至125所記載的胺基酸序列之CDRH3、以及包含序列識別號27中之胺基酸編號44至54所記載的胺基酸序列之CDRL1、包含序列識別號27中之胺基酸編號70至76所記載的胺基酸序列之CDRL2及包含序列識別號27中之胺基酸編號109至117所記載的胺基酸序列之CDRL3、或(d)包含序列識別號29中之胺基酸編號45至54所記載的胺基酸序列之CDRH1、包含序列識別號29中之胺基酸編號69至77所記載的胺基酸序列之CDRH2及包含序列識別號29中之胺基酸編號117至128所記載的胺基酸序列之CDRH3、以及包含序列識別號31中之胺基酸編號44至54所記載的胺基酸序列之CDRL1、包含序列識別號31中之胺基酸編號70至76所記載的胺基酸序列之CDRL2及包含序列識別號31中之胺基酸編號109至117所記載的胺基酸序列之CDRL3。
(8)如上述(1)至(7)中任一項所記載之抗體，其具有(a)包含序列識別號2中之胺基酸編號1至118所記載的胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號3中之胺基酸編號1至112所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區、(b)包含序列識別號4中之胺基酸編號1至123所記載的胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號5中之胺基酸編號1至111所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區、 (c)包含序列識別號25中之胺基酸編號20至136所記載的胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號27中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區、或(d)包含序列識別號29中之胺基酸編號20至139所記載的胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號31中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
(9)如上述(1)至(8)中任一項所記載之抗體，其中恒定區為源自人類的恒定區。
(10)如上述(1)至(9)中任一項所記載之抗體，其具有(a)包含序列識別號2所記載的胺基酸序列之重鏈及包含序列識別號3所記載的胺基酸序列之輕鏈、(b)包含序列識別號4所記載的胺基酸序列之重鏈及包含序列識別號5所記載的胺基酸序列之輕鏈、(c)包含序列識別號25中之胺基酸編號20至466所記載的胺基酸序列之重鏈及包含序列識別號27中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈、或(d)包含序列識別號29中之胺基酸編號20至469所記載的胺基酸序列之重鏈及包含序列識別號31中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈。
(11)如上述之(1)至(10)中任一項所記載之抗體，其係經人源化(humanized)。
(12)如請求項11所記載之抗體，其具有下列重鏈可變區及輕鏈可變區；含有選自包含下列之群組之胺基酸 序列的重鏈可變區：(a)序列識別號33中之胺基酸編號20至136所記載的胺基酸序列、(b)序列識別號35中之胺基酸編號20至136所記載的胺基酸序列、(c)序列識別號41中之胺基酸編號20至139所記載的胺基酸序列、(d)於(a)至(c)的序列中，對於各CDR序列以外之框架區(framework region)的序列具有至少95%以上同源性的胺基酸序列、及(e)於(a)至(c)的序列中之各CDR序列以外的框架區序列中經缺失、取代或附加一或數個胺基酸的胺基酸序列；以及含有選自包含下列之群組之胺基酸序列的輕鏈可變區：(f)序列識別號37中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列、(g)序列識別號39中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列、(h)序列識別號43中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列、(i)於(f)至(h)的序列中，對於各CDR序列以外之框架區的序列具有至少95%以上同源性的胺基酸序列、及(j)於(f)至(h)的序列中之各CDR序列以外的框架區序列中經缺失、取代或附加一或數個胺基酸的胺基酸序列。
(13)如上述(11)或(12)所記載之抗體，其具有(a)包含序列識別號33中之胺基酸編號20至136所記載的胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號37中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區、(b)包含序列識別號35中之胺基酸編號20至136所記載的胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號39中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區、或(c)包含序列識別號41中之胺基酸編號21至139所記載的胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號43中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
(14)如上述(11)至(13)中任一項所記載之抗體，其具有(a)選自包含下列之群組之重鏈：具有序列識別號33中之胺基酸編號20至466所記載的胺基酸序列之重鏈、具有序列識別號35中之胺基酸編號20至466所記載的胺基酸序列之重鏈、及具有序列識別號41中之胺基酸編號20至469所記載的胺基酸序列之重鏈、以及(b)選自包含下列之群組之輕鏈：具有序列識別號37中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈、具有序列識別號39中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈、及具有序列識別號43中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈。
(15)如上述(11)至(14)中任一項所記載之抗體，其具有 (a)具有序列識別號33中之胺基酸編號20至466所記載的胺基酸序列之重鏈及具有序列識別號37中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈、(b)具有序列識別號35中之胺基酸編號20至466所記載的胺基酸序列之重鏈及具有序列識別號39中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈、或(c)具有序列識別號41中之胺基酸編號20至469所記載的胺基酸序列之重鏈及具有序列識別號43中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈。
(16)一種多核苷酸，其係編碼如上述(1)至(15)中任一項所記載之抗體。
(17)如上述(16)所記載之多核苷酸，其具有(a)包含序列識別號6中之核苷酸編號76至105所記載的核苷酸序列之CDRH1的多核苷酸、包含序列識別號6中之核苷酸編號148至198所記載的核苷酸序列之CDRH2的多核苷酸及包含序列識別號6中之核苷酸編號295至321所記載的核苷酸序列之CDRH3的多核苷酸、以及包含序列識別號7中之核苷酸編號67至108所記載的核苷酸序列之CDRL1的多核苷酸、包含序列識別號7中之核苷酸編號154至174所記載的核苷酸序列之CDRL2的多核苷酸及包含序列識別號7中之核苷酸編號271至303所記載的核苷酸序列之CDRL3的多核苷酸、(b)包含序列識別號8中之核苷酸編號76至105所記載的核苷酸序列之編碼CDRH1的多核苷酸、包含序列識別 號8中之核苷酸編號148至198所記載的核苷酸序列之CDRH2的多核苷酸及包含序列識別號8中之核苷酸編號295至336所記載的核苷酸序列之CDRH3的多核苷酸、以及包含序列識別號9中之核苷酸編號67至108所記載的核苷酸序列之CDRL1的多核苷酸、包含序列識別號9中之核苷酸編號154至174所記載的核苷酸序列之CDRL2的多核苷酸及包含序列識別號9中之核苷酸編號271至300所記載的核苷酸序列之CDRL3的多核苷酸、(c)包含序列識別號24中之核苷酸編號133至162所記載的核苷酸序列之CDRH1的多核苷酸、包含序列識別號24中之核苷酸編號205至234所記載的核苷酸序列之CDRH2的多核苷酸及包含序列識別號24中之核苷酸編號352至375所記載的核苷酸序列之CDRH3的多核苷酸、以及包含序列識別號26中之核苷酸編號130至162所記載的核苷酸序列之CDRL1的多核苷酸、包含序列識別號26中之核苷酸編號208至228所記載的核苷酸序列之CDRL2的多核苷酸及包含序列識別號26中之核苷酸編號325至351所記載的核苷酸序列之CDRL3的多核苷酸、或(d)包含序列識別號28中之核苷酸編號133至162所記載的核苷酸序列之CDRH1的多核苷酸、包含序列識別號28中之核苷酸編號205至231所記載的核苷酸序列之CDRH2的多核苷酸及包含序列識別號28中之核苷酸編號349至384所記載的核苷酸序列之CDRH3的多核 苷酸、以及包含序列識別號30中之核苷酸編號130至162所記載的核苷酸序列之CDRL1的多核苷酸、包含序列識別號30中之核苷酸編號208至228所記載的核苷酸序列之CDRL2的多核苷酸及包含序列識別號30中之核苷酸編號325至351所記載的核苷酸序列之CDRL3的多核苷酸。
(18)如上述(16)或(17)所記載之多核苷酸，其具有(a)包含序列識別號6中之核苷酸編號1至354所記載的核苷酸序列之重鏈可變區的多核苷酸及包含序列識別號7中之核苷酸編號1至336所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區的多核苷酸、(b)包含序列識別號8中之核苷酸編號1至369所記載的核苷酸序列之重鏈可變區的多核苷酸及包含序列識別號9中之核苷酸編號1至333所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區的多核苷酸、(c)包含序列識別號24中之核苷酸編號58至408所記載的核苷酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號26中之核苷酸編號61至387所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區、或(d)包含序列識別號28中之核苷酸編號58至417所記載的核苷酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號30中之核苷酸編號61至387所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區。
(19)如上述(16)至(18)中任一項所記載之多核苷酸，其具有 (a)包含序列識別號6所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸及包含序列識別號7所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸、(b)包含序列識別號8所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸及包含序列識別號9所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸、(c)包含序列識別號24中之核苷酸編號58至1398所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸及包含序列識別號26中之核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸、或(d)包含序列識別號28中之核苷酸編號58至1407所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸及包含序列識別號30中之核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸。
(20)如上述(16)或(17)所記載之多核苷酸，其具有(a)選自包含下列之群組之重鏈可變區：包含序列識別號32中之核苷酸編號58至408所記載的核苷酸序列之重鏈可變區、包含序列識別號34中之核苷酸編號58至408所記載的核苷酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號40中之核苷酸編號58至417所記載的核苷酸序列之重鏈可變區、以及(b)選自包含下列之群組之輕鏈可變區：包含序列識別號36中之核苷酸編號61至387所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區、包含序列識別號38中之核苷酸編號61至387所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區、及包含序列 識別號42中之核苷酸編號61至387所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區。
(21)如上述(16)、(17)或(20)所記載之多核苷酸，其具有(a)包含序列識別號32中之核苷酸編號58至408所記載的核苷酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號36中之核苷酸編號61至387所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區、(b)包含序列識別號34中之核苷酸編號58至408所記載的核苷酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號38中之核苷酸編號61至387所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區、或(c)包含序列識別號40中之核苷酸編號58至417所記載的核苷酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號42中之核苷酸編號61至387所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區。
(22)如上述(16)、(17)、(20)或(21)之多核苷酸，其具有(a)選自包含下列之群組之重鏈的多核苷酸：包含序列識別號32中之核苷酸編號58至1398所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸、包含序列識別號34中之核苷酸編號58至1398所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸、及包含序列識別號40中之核苷酸編號58至1407所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸、以及(b)選自包含下列之群組之輕鏈的多核苷酸：包含序列識 別號36中之核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸、包含序列識別號38中之核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸、及包含序列識別號42中之核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸。
(23)如上述(16)、(17)及(20)至(22)中任一項所記載之多核苷酸，其具有(a)包含序列識別號32中之核苷酸編號58至1398所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸、及包含序列識別號36中之核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸、(b)包含序列識別號34中之核苷酸編號58至1398所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸、及包含序列識別號38中之核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸、或(c)包含序列識別號40中之核苷酸編號58至1407所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸、及包含序列識別號42中之核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸。
(24)一種表現載體(vector)，其含有如上述(16)至(23)中任一項所記載之多核苷酸。
(25)一種宿主細胞，其係藉由如上述(24)所記載之表現載體而被轉形(transformation)。
(26)一種該抗體或該斷片的製造方法，其特徵係含有培養如上述(25)所記載之宿主細胞的步驟、及自該步 驟所得之培養物採取目的之抗體的步驟。
(27)一種抗體，其特徵係藉由如上述(26)所記載之製造方法而獲得。
(28)如上述(1)至(15)及(27)中任一項所記載之抗體，其含有選自包含下列之群組之1或2種以上的修飾：對N-鍵結之醣苷化(glycosylation)、對O-鍵結之醣苷化、N末端加工(N-terminal processing)、C末端加工(C-terminal processing)、脫醯胺化、天冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化、於N末端之甲硫胺酸殘基的添加、脯胺酸殘基的醯胺化及於羧基末端經缺失1個或2個胺基酸的重鏈。
(29)如上述(28)所記載之抗體，其於重鏈的羧基末端缺失1個或2個胺基酸。
(30)如上述(29)所記載之抗體，其2條重鏈雙方於羧基末端缺失1個胺基酸。
(31)如上述(28)至(30)中任一項所記載之抗體，其重鏈的羧基末端之脯胺酸殘基進一步被醯胺化。
(32)如上述(1)至(15)及(27)至(31)中任一項所記載之抗體，其調節糖鏈修飾用以增強抗體依賴性細胞毒殺活性。
(33)一種醫藥組成物，其特徵為含有如上述(1)至(15)及(27)至(32)所記載之抗體之至少一種。
(34)如上述(33)所記載之醫藥組成物，其係腫瘤治療用。
(35)如上述(34)所記載之醫藥組成物，其中腫瘤為癌症。
(36)如上述(35)所記載之醫藥組成物，其中癌症為肺癌、腎癌、尿道上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、或血液癌。
(37)一種腫瘤的治療方法，其特徵為將如上述(1)至(15)及(27)至(32)所記載之抗體之至少一種投予至個體。
(38)如上述(37)所記載之治療方法，其中腫瘤為癌症。
(39)如上述(38)所記載之治療方法，其中癌症為肺癌、腎癌、尿道上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、或血液癌。
若根據本發明，則可獲得含有下述抗體之癌症的治療劑：結合於GARP且利用經由ADCC活性之Treg抑制効果而具有抗腫瘤活性之抗體。又，因為在瘧疾、HIV感染症的各患者中之Treg的過量存在及活化係顯示與此等病勢具有相關性，及在小鼠病態模式中Treg的去除係導致病狀的緩解，所以Treg機能之有效抑制在瘧疾及HIV等難治性感染症亦可期待治療效果。
[第1圖]第1圖係顯示GARP之胺基酸序列(序列識別號1)的圖。
[第2圖]第2圖係顯示105F抗體重鏈之胺基酸序列(序列識別號2)的圖。
[第3圖]第3圖係顯示105F抗體輕鏈之胺基酸序列(序列識別號3)的圖。
[第4圖]第4圖係顯示110F抗體重鏈之胺基酸序列(序列識別號4)的圖。
[第5圖]第5圖係顯示110F抗體輕鏈之胺基酸序列(序列識別號5)的圖。
[第6圖]第6圖係顯示105F抗體重鏈之核苷酸序列(序列識別號6)的圖。
[第7圖]第7圖係顯示105F抗體輕鏈之核苷酸序列(序列識別號7)的圖。
[第8圖]第8圖係顯示110F抗體重鏈之核苷酸序列(序列識別號8)的圖。
[第9圖]第9圖係顯示110F抗體輕鏈之核苷酸序列(序列識別號9)的圖。
[第10圖]第10圖係顯示抗體對GARP之結合的圖。
105F抗體及110F抗體係藉由ELISA法而顯示對GARP之結合。
[第11圖]第11圖係顯示抗體之GARP特異性結合的圖。105F抗體對僅導入有載體之HEK293T細胞未進行結合，而顯示僅對使HEK293T細胞暫時性表現(transient expression)GARP之細胞進行結合。
[第12圖]第12圖係顯示抗體之GARP特異性結合的圖。105F抗體係顯示對內源性表現GARP的L428細胞之結合活性。
[第13圖]第13圖係顯示抗體之GARP特異性結合的 圖。105F抗體係顯示對經活化的Treg之結合活性。
[第14圖]第14圖係顯示抗體之ADCC能力的圖。在將內源性表現GARP的L428細胞作為標的時，觀察到ADCC活性係105F抗體的抗體濃度依賴性地增強。
[第15圖]第15圖係顯示抗體之Treg機能抑制能力的圖。105F抗體(50μg/mL)係抑制「因Treg造成之對於輔助型T細胞的增殖抑制機能」。
[第16圖]第16圖係顯示抗體之Treg機能抑制能力的圖。105F抗體(10μg/mL)係抑制「因Treg造成之對於輔助型T細胞的增殖抑制機能」。另一方面，MHG-8、LHG-10抗體並未顯示對於「對於輔助型T細胞的增殖抑制機能」之效果。
[第17圖]第17圖係顯示c151D抗體重鏈之胺基酸序列(序列識別號25)的圖。
[第18圖]第18圖係顯示c151D抗體輕鏈之胺基酸序列(序列識別號27)的圖。
[第19圖]第19圖係顯示c198D抗體重鏈之胺基酸序列(序列識別號29)的圖。
[第20圖]第20圖係顯示c198D抗體輕鏈之胺基酸序列(序列識別號31)的圖。
[第21圖]第21圖係顯示h151D-H1重鏈之胺基酸序列(序列識別號33)的圖。
[第22圖]第22圖係顯示h151D-L1輕鏈之胺基酸序列(序列識別號37)的圖。
[第23圖]第23圖係顯示h151D-H4重鏈之胺基酸序 列(序列識別號35)的圖。
[第24圖]第24圖係顯示h151D-L4輕鏈之胺基酸序列(序列識別號39)的圖。
[第25圖]第25圖係顯示h198D-H3重鏈之胺基酸序列(序列識別號41)的圖。
[第26圖]第26圖係顯示h198D-L4輕鏈之胺基酸序列(序列識別號43)的圖。
[第27圖]第27圖係顯示c151D抗體重鏈之核苷酸序列(序列識別號24)的圖。
[第28圖]第28圖係顯示c151D抗體輕鏈之核苷酸序列(序列識別號26)的圖。
[第29圖]第29圖係顯示c198D抗體重鏈之核苷酸序列(序列識別號28)的圖。
[第30圖]第30圖係顯示c198D抗體輕鏈之核苷酸序列(序列識別號30)的圖。
[第31圖]第31圖係顯示h151D-H1重鏈之核苷酸序列(序列識別號32)的圖。
[第32圖]第32圖係顯示h151D-L1輕鏈之核苷酸序列(序列識別號36)的圖。
[第33圖]第33圖係顯示h151D-H4重鏈之核苷酸序列(序列識別號34)的圖。
[第34圖]第34圖係顯示h151D-L4輕鏈之核苷酸序列(序列識別號38)的圖。
[第35圖]第35圖係顯示h198D-H3重鏈之核苷酸序列(序列識別號40)的圖。
[第36圖]第36圖係顯示h198D-L4輕鏈之核苷酸序列(序列識別號42)的圖。
[第37圖]第37圖係顯示各抗體之對GARP表現細胞之結合的圖。h151D-H1L1、h151D-H4L4及h198D-H3L4係對GARP顯示特異性結合活性。
[第38圖]第38圖係顯示各抗體之對GARP-TGFβ1共表現(coexpression)細胞之結合的圖。105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4及h198D-H3L4之各抗體，係顯示結合於與TGFβ1共表現的GARP及GARP變異體之兩者，為周知抗體之MHG8及LHG10之各抗體係顯示對GARP中的不同區域之結合活性。
[第39圖]第39圖係顯示各抗體之對L428細胞之結合的圖。h151D-H1L1、h151D-H4L4及h198D-H3L4之各抗體係顯示對於內源性表現的GARP之結合活性。
[第40圖]第40圖係顯示各抗體之對Treg之結合的圖。h151D-H1L1、h151D-H4L4及h198D-H3L4之各抗體係對於FoxP3陽性Treg顯示結合活性。
[第41圖]第41圖係顯示各抗體之ADCC活性的圖。h151D-H1L1、h151D-H4L4及h198D-H3L4之各抗體係顯示ADCC活性。
[第42圖]第42圖係顯示各抗體之Treg機能抑制活性的圖。h151D-H1L1、h151D-H4L4及h198D-H3L4之各抗體係顯示Treg機能抑制活性。
[第43圖]第43圖係顯示「因Treg造成之CTL的標的細胞溶解活性」之抑制的圖。
[第44圖]第44圖係顯示因各抗體造成之抗腫瘤活性之增強的圖。105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4之各抗體，係抑制CTL細胞活性之因Treg造成的抑制，而使抗腫瘤活性增強。
[第45圖]第45圖係顯示各抗體之活體內抗腫瘤活性的圖。105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4之各抗體，係於活體內模式顯示抗腫瘤活性。
[實施發明之形態]
於本說明書中，「癌症」與「腫瘤」係以相同的意義來使用。
於本說明書中，所謂「基因」之用語不僅包含DNA，亦包含其mRNA、cDNA及其cRNA。
於本說明書中，所謂「多核苷酸」之用語係以與核酸相同的意義來使用，亦包含DNA、RNA、探針、寡核苷酸、及引子。
於本說明書中，「多胜肽」與「蛋白質」並未區分而使用。
於本說明書中，「細胞」中亦包含動物個體內的細胞、培養細胞。
於本說明書中，「GARP」係以與GARP蛋白質相同的意義來使用。
於本說明書中之「細胞毒殺」係指以任何形式於細胞導致病理性變化，不僅止於直接的外傷，亦指DNA的切斷或鹼基之二聚體的形成、染色體的切斷、細胞分 裂構造的損傷、各種酵素活性的降低等所有細胞之構造或機能上的損傷。
於本說明書中之「細胞毒殺活性」係指引起上述細胞毒殺。
於本說明書中之「抗體依賴性細胞毒殺活性」係「antibody dependent cellular cytotoxicity(ADCC)活性」，意指NK細胞經由抗體而傷害腫瘤細胞等標的細胞的作用活性。
於本說明書中之「抗原決定區」係意指特定的抗GARP抗體所結合之GARP的部分胜肽或部分立體構造。前述GARP的部分胜肽之抗原決定區，可藉由免疫分析法等所屬技藝領域中具有通常知識者所熟知的方法，例如以下的方法而確定。首先，製作抗原之各式各樣的部分構造。關於部分構造的製作，可使用周知的寡胜肽合成技術。例如，使用所屬技藝領域中具有通常知識者所周知的基因重組技術而製作自GARP的C末端或者N末端以適當的長度依序縮短之一系列的多胜肽後，探討抗體對於此等的反應性，確定粗略的辨識部位後，藉由合成更短的胜肽並探討與此等胜肽的反應性，而可確定抗原決定區。又，特定的抗體所結合之抗原的部分立體構造之抗原決定區，可藉由利用X射線構造分析來特定出與前述抗體鄰接之抗原的胺基酸殘基而確定。
於本說明書中之「結合於相同的抗原決定區之抗體」係意指結合於共通的抗原決定區之相異的抗體。若第二抗體結合於第一抗體所結合之部分胜肽或部分立 體構造，則可判定第一抗體與第二抗體結合於相同的抗原決定區。又，藉由確認第二抗體係對於第一抗體之對抗原的結合進行競爭(亦即，第二抗體妨礙第一抗體與抗原之結合)，即使未確定具體的抗原決定區之序列或構造，亦可判定第一抗體與第二抗體結合於相同的抗原決定區。再者，第一抗體與第二抗體結合於相同的抗原決定區，且第一抗體具有抗腫瘤活性等特殊效果的情形，可期待第二抗體亦具有同樣的活性。因此，若第二抗GARP抗體結合於第一抗GARP抗體所結合之部分胜肽，則可判定第一抗體與第二抗體結合於GARP之相同的抗原決定區。又，藉由確認第二抗GARP抗體係對於第一抗GARP抗體之對GARP的結合進行競爭，可判定第一抗體與第二抗體係結合於GARP之相同的抗原決定區之抗體。
於本說明書中之「CDR」係意指互補性決定區(Complemetarity deterring region)。已知抗體分子的重鏈及輕鏈中各自有3處CDR。CDR亦稱為高度變異區(hypervariable domain)，位於抗體的重鏈及輕鏈之可變區內，為一次構造的變異性特高的部位，於重鏈及輕鏈之多胜肽鏈的一次構造上各自分離成3處。於本說明書中，針對抗體之CDR，係將重鏈的CDR自重鏈胺基酸序列的胺基末端側起標記為CDRH1、CDRH2、CDRH3，將輕鏈的CDR自輕鏈胺基酸序列的胺基末端側起標記為CDRL1、CDRL2、CDRL3。此等部位在立體構造上相互接近，並決定對於結合的抗原之特異性。
於本發明，「在嚴格的條件下進行雜交」係指 於市售的雜交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(Clontech公司製)中，於68℃進行雜交，或在下列條件或與其同等的條件下雜交：使用固定有DNA的過濾器，在0.7-1.0M的NaCl存在下於68℃進行雜交後，使用0.1-2倍濃度的SSC溶液(1倍濃度SSC溶液係包含150mM NaCl、15mM檸檬酸鈉)，於68℃進行洗淨，藉此可鑑定之條件。
1. GARP
本發明所使用的GARP可自人類、非人類哺乳動物(大鼠、小鼠等)的GARP表現細胞直接純化而使用，或者可製備該細胞的細胞膜劃份(fraction)而使用，又，可藉由將GARP以活體外合成、或者藉由利用基因操作使其於宿主細胞產生而獲得。基因操作具體而言可將GARP cDNA組入可表現的載體後，藉由於含有轉錄與轉譯所需要的酵素、基質及能量物質的溶液中進行合成，或者藉由利用將其他原核生物或真核生物的宿主細胞轉形來使其表現GARP，而獲得該蛋白質。
人類GARP的胺基酸序列係記載於序列表之序列識別號1。又，序列識別號1的序列係記載於第1圖。
又，GARP中亦包含：包含於上述GARP的胺基酸序列中經取代、缺失及/或附加一或數個胺基酸之胺基酸序列，且具有與該蛋白質同等的生物活性之蛋白質。
去除訊息序列之成熟人類GARP，係相當於包含序列識別號1所示的胺基酸序列之第20號至第662號的胺基酸殘基之胺基酸序列。
又，GARP中亦包含：包含於序列表之序列識別號1所示的胺基酸序列、或自此等序列去除訊息序列的胺基酸序列中經取代、缺失、或附加一或數個胺基酸之胺基酸序列，且具有與GARP同等的生物活性之蛋白質。再者，GARP中亦包含：包含編碼自人類GARP基因座轉錄的剪接變異體(splicing variant)之胺基酸序列、或於該胺基酸序列中經取代、缺失、或附加一或數個胺基酸之胺基酸序列，且具有與GARP同等的生物活性之蛋白質。
2. 抗GARP抗體之製造
作為本發明之對GARP的抗體，可列舉抗GARP人類抗體，抗GARP人類抗體係意指僅具有源自人類染色體之抗體的基因序列之人類抗體。
抗GARP人類抗體可藉由下列方法而取得：使用具有「包含人類抗體之重鏈與輕鏈的基因之人類染色體片段」之人類抗體產生小鼠的方法(參照Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics(1997)16,p.133-143,；Kuroiwa,Y.et.al.,Nucl.Acids Res.(1998)26,p.3447-3448；Yoshida,H.et.al.,Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol.10,p.69-73(Kitagawa,Y.,Matsuda,T.and Iijima,S.eds.),Kluwer Academic Publishers,1999.；Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722-727等)。
此種人類抗體產生小鼠，具體而言，可藉由基因剔除動物(knockout animal)及基因轉殖動物(transgenic animal)的製作、及使此等動物彼此交配，而 作出內源性免疫球蛋白重鏈及輕鏈的基因座被破壞，並經由酵母人工染色體(Yeast artificial chromosome，YAC)導入有人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈的基因座來取代的基因重組動物。
又，藉由基因重組技術，利用各自編碼該種人類抗體的重鏈及輕鏈之cDNA，較佳為包含該cDNA的載體，而將真核細胞轉形，培養產生基因重組人類單株抗體的轉形細胞，藉此可自培養上清液中獲得該抗體。作為宿主細胞，可使用例如真核細胞，較佳為CHO細胞、淋巴球或骨髓瘤等哺乳動物細胞。
又，可藉由自人類抗體庫挑選之源自噬菌體顯示之取得人類抗體的方法(參照Wormstone,I.M.et.al,Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7),p.2301-2308；Carmen,S.et.al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2),p.189-203；Siriwardena,D.et.al.,Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431等)而獲得。例如，可使用使人類抗體的可變區作為單鏈抗體(scFv)而表現在噬菌體表面，而選擇結合於抗原的噬菌體之噬菌體顯示法(Nature Biotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)。
藉由解析利用結合於抗原所選擇的噬菌體之基因，而可確定編碼結合於抗原之人類抗體的可變區之DNA序列。若結合於抗原之scFv的DNA序列變得明確，則利用連結抗體恒定區的DNA序列，而製作具有該序列的IgG表現載體，導入適當的宿主而使其表現，藉此可取 得人類抗體(WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388、Annu.Rev.Immunol(1994)12,p.433-455、Nature Biotechnology(2005)23(9),p.1105-1116)。
又，本發明之對GARP的抗體，可藉由使用常用方法，以選自GARP或GARP的胺基酸序列之任意的多胜肽來免疫動物，採取、純化活體內所產生的抗體而獲得。成為抗原之GARP的生物種不限定於人類，亦可以源自小鼠、大鼠等人類以外的動物之GARP來免疫動物。此情形，可藉由試驗所取得的結合於異種GARP的抗體與人類GARP之交叉性，而挑選可適用於人類疾病的抗體。
又，按照周知的方法(例如，Kohler and Milstein,Nature(1975)256,p.495-497、Kennet,R.ed.,Monoclonal Antibodies,p.365-367、Plenum Press,N.Y.(1980))，可藉由使產生對GARP之抗體的抗體產生細胞與骨髓瘤細胞融合，而建立融合瘤，獲得單株抗體。
另外，成為抗原之GARP可藉由將GARP基因利用基因操作使其於宿主細胞產生而獲得。
具體而言，只要製作可表現GARP基因的載體，將其導入宿主細胞使該基因表現，並純化所表現的GARP即可。以下，具體說明對GARP之抗體的取得方法。
(1)抗原的製備
作為用以製作抗GARP抗體的抗原，可列舉GARP或包含其至少6個連續的部分胺基酸序列之多胜肽、或者於此等中附加任意的胺基酸序列或載體(carrier)之衍生物。
GARP可自人類的腫瘤組織或者腫瘤細胞直接純化而使用，又，藉由將GARP於活體外合成，或者藉由利用基因操作使其於宿主細胞產生而獲得。
基因操作，具體而言，可將GARP的cDNA組入可表現的載體後，藉由於含有轉錄與轉譯所需要的酵素、基質及能量物質的溶液中進行合成，或者藉由利用使其他原核生物或真核生物的宿主細胞轉形而使GARP表現，而獲得抗原。
又，藉由使為膜蛋白質之GARP的細胞外區域與抗體的恒定區連結之融合蛋白質於適當的宿主、載體系統表現，亦可作為分泌蛋白質而獲得抗原。
GARP的cDNA，例如可藉由將表現GARP的cDNA的cDNA庫作為模板，使用特異性增幅GARP cDNA的引子來進行聚合酶連鎖反應(以下稱為「PCR」)(參照Saiki,R.K.,et al.Science(1988)239,p.487-489)之所謂的PCR法而取得。
作為多胜肽的活體外(in Vitro)合成，例如可列舉Roche Diagnostics公司製的快速轉譯系統(Rapid Translation System)(RTS)，但不限定於此。
作為原核細胞的宿主，例如可列舉大腸桿菌(Escherichia coli)或枯草桿菌(Bacillus subtilis)等。為了使目的基因轉形至此等宿主細胞內，係以包含源自可適合宿主的物種之複製子(即複製起點)、與調節序列之質體載體而使宿主細胞轉形。又，作為載體，較佳為具有可將表型(表現型)的選擇性賦予轉形細胞之序列。
真核細胞的宿主細胞中包含脊椎動物、昆蟲、酵母等的細胞，作為脊椎動物細胞，例如常使用為猴的細胞之COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182，ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞，ATCC CCL-61)的二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1980)77,p.4126-4220)等，但不限定於此等。
如上述進行而獲得的轉形體，可按照常用方法培養，藉由該培養而於細胞內或細胞外產生目的之多胜肽。
作為該培養所使用的培養基，可因應所採用的宿主細胞而適宜選擇慣用的各種者，若為大腸桿菌，則例如可於LB培養基因應必要而添加胺苄青黴素等抗生素或IPMG來使用。
藉由上述培養而於轉形體的細胞內或細胞外所產生的重組蛋白質，可藉由利用該蛋白質的物理性質或化學性質等之各種周知的分離操作法而分離、純化。
作為該方法，具體而言，例如可例示利用通常的蛋白質沉澱劑之處理、超過濾、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、親和性層析等各種液體層析、透析法、此等的組合等。
又，藉由將包含6殘基的組胺酸標記(histidine-tag)連接所表現的重組蛋白質，能以鎳親和性管柱有效率地純化。或者，藉由將IgG的Fc區域連接所表 現的重組蛋白質，能以蛋白質A(Protein A)管柱有效率地純化。
藉由組合上述方法，可容易地以高產率、高純度大量製造作為目的之多胜肽。
(2)抗GARP單株抗體的製造
作為與GARP特異性結合的抗體之例，可列舉與GARP特異性結合的單株抗體，其取得方法係如以下所記載。
關於單株抗體的製造，一般需要如下述的作業步驟。
亦即，(a)作為抗原使用之生物聚合物的純化、(b)藉由將抗原注射至動物進行免疫後，採取血液並檢定其抗體價，決定脾臓摘出的時期，之後製備抗體產生細胞的步驟、(c)骨髓瘤細胞(以下稱為「骨髓瘤」)的製備、(d)抗體產生細胞與骨髓瘤的細胞融合、(e)產生作為目的之抗體之融合瘤群的挑選、(f)分劃為單一細胞殖株(選殖)、(g)依據情形，培養用於大量製造單株抗體的融合瘤，或飼育經移植融合瘤的動物、(h)如此進行而製造的單株抗體之生理活性及其結合特異性的檢討，或者作為標識試劑之特性的檢定、等。
以下，順著上述步驟詳述單株抗體的製作法，但該抗體的製作法並不受此所限制，例如亦可使用脾細 胞以外的抗體產生細胞及骨髓瘤。
(a)抗原的純化
作為抗原，可使用以如前述的方法製備的GARP或其一部份。
又，作為抗原亦可使用自GARP表現重組體細胞製備的膜劃份、或GARP表現重組體細胞本身、進一步可使用利用所屬技藝領域中具有通常知識者所周知的方法而化學合成之本發明的蛋白質的部分胜肽。
(b)抗體產生細胞的製備
混合步驟(a)所得的抗原、與弗氏的完全或不完全佐劑或鉀明礬之類的助劑，作為免疫原而對實驗動物進行免疫。實驗動物可無障礙地使用周知之用於融合瘤製作法的動物。具體而言，例如可使用小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。但自與所摘出的抗體產生細胞融合之骨髓瘤細胞的取得容易性的觀點，較佳為將小鼠或大鼠作為被免疫動物。
又，對於實際使用之小鼠及大鼠的系統並沒有限制，於小鼠的情形，例如可使用各系統A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB、129等，又於大鼠的情形，例如可使用Wistar、Low、Lewis、Sprague、Dawley、ACI、BN、Fischer等。
此等小鼠及大鼠，例如可自CLEA Japan、Charles River Japan等實驗動物飼育販賣業者取得。
其中，若斟酌與後述的骨髓瘤細胞之融合適合 性，則於小鼠特佳為使用BALB/c系統作為被免疫動物，於大鼠特佳為使用Wistar及Low系統作為被免疫動物。
又，考慮抗原之於人類與小鼠的同源性，亦較佳使用去除自體抗體之降低生物機制的小鼠，亦即自體免疫疾病小鼠。
另外，此等小鼠或大鼠之免疫時的週齡，較佳為5~12週齡，更佳為6~8週齡。
對於藉由GARP或其重組體來免疫動物，例如可使用詳細記載於Weir,D.M.,Handbook of Experimental Immunology,Vol.I.II.III.,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987)、Kabat,E.A.and Mayer,M.M.,Experimental Immunochemistry,Charles C Thomas Publisher Springfield,Illinois(1964)等之周知的方法。
此等免疫法中，若具體例示本發明中之較佳的方法，則如以下所示。
亦即，首先，將為抗原之膜蛋白質劃份、或者表現抗原的細胞投予至動物的皮內或腹腔內。
但為了提高免疫效率，較佳為兩者併用，若前半進行皮內投予，後半或僅最後一次進行腹腔內投予，則可特別提高免疫效率。
抗原的投予時程雖依據被免疫動物的種類、個體差異等而相異，但一般而言，較佳為抗原投予次數3~6次、投予間隔2~6週，更佳為抗原投予次數3~4次、投予間隔2~4週。
又，抗原的投予量雖依據動物的種類、個體差異等而相異，但一般而言係設為0.05~5mg左右，較佳設為0.1~0.5mg左右。
追加免疫係在如以上之抗原投予的1~6週後，較佳為2~4週後，更佳為2~3週後進行。
另外，進行追加免疫時的抗原投予量雖依據動物的種類、大小等而相異，但一般而言，於小鼠的情形係設為0.05~5mg左右，較佳設為0.1~0.5mg左右，更佳設為0.1~0.2mg左右。
在自上述追加免疫起1~10日後，較佳為2~5日後，更佳為2~3日後，自被免疫動物無菌地取出包含抗體產生細胞的脾臓細胞或淋巴球。此時測定抗體價，若將抗體價變得充分高的動物作為抗體產生細胞的供給源使用，則可提高以後的操作之效率。
作為於此所使用之抗體價的測定法，例如可列舉RIA法或ELISA法，但不受此等方法所限制。
本發明中之抗體價的測定，例如若根據ELISA法，則可依據如以下所記載的程序而進行。
首先，使純化或部分純化的抗原吸附在ELISA用96孔盤等的固相表面，進一步將抗體未吸附的固相表面藉由與抗原無關的蛋白質，例如牛血清白蛋白(以下稱為「BSA」)而被覆，將該表面洗淨後，使其接觸作為一級抗體(primary antibody)之經序列稀釋的試料(例如，小鼠血清)，使試料中的抗體結合於上述抗原。
進一步加入作為二級抗體(secondary antibody) 之經酵素標識之對於小鼠抗體的抗體而使其結合於小鼠抗體，洗淨後加入該酵素的基質，藉由測定因基於基質分解的呈色所造成之吸光度變化等而算出抗體價。
自被免疫動物的脾臓細胞或淋巴球之抗體產生細胞的分離，可按照周知的方法(例如，Kohler et al.,Nature(1975)256,p.495,；Kohler et al.,Eur.J.Immunol.(1977)6,p.511,；Milstein et al.,Nature(1977),266,p.550,；Walsh,Nature,(1977)266,p.495)而進行。例如，於脾臓細胞的情形，可採用將脾臓切碎而將細胞以不鏽鋼篩網過濾後，使其懸浮於伊格爾最低必需培養基(Eagle's minimal essential medium)(MEM)而分離抗體產生細胞之一般的方法。
(c)骨髓瘤細胞(以下稱為「骨髓瘤」)的製備
對於細胞融合所使用的骨髓瘤細胞並沒有特別的限制，可自周知的細胞株適宜選擇而使用。但考慮自融合細胞選擇融合瘤時的便利性，較佳為使用其選擇程序已確立的HGPRT(次黃嘌呤-鳥糞嘌呤磷酸核糖轉移酶(Hypoxanthine-GUANINE phosphoribosyl transferase))缺損株。
亦即，源自小鼠的X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、BU.1等，源自大鼠的210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)等，源自人類的U266AR(SKO-007)、GM1500．GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2 )、8226AR/NIP4-1(NP41)等。此等HGPRT缺損株例如可自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)(ATCC)等取得。
此等細胞株能以適當的培養基，例如8-氮鳥嘌呤培養基[於RPMI-1640培養基中加入麩醯胺酸、2-巰乙醇、建它黴素(gentamicin)、及胎牛血清(以下稱為「FCS」)的培養基中，進一步加入8-氮鳥嘌呤的培養基]、經伊斯科夫修改之杜爾貝寇培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；以下稱為「IMDM」)、或經杜爾貝寇修改之伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；以下稱為「DMEM」)進行繼代培養，但在細胞融合的3至4日前以正常培養基[例如，包含10% FCS的ASF104培養基(Ajinomoto(股)公司製)]進行繼代培養，在融合當日確保2×107以上的細胞數。
(d)細胞融合
抗體產生細胞與骨髓瘤細胞的融合，可按照周知的方法(Weir,D.M.,Handbookof Experimental Immunology,Vol.I.II.III.,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987)、Kabat,E.A.and Mayer,M.M.,Experimental Immunochemistry,Charles C Thomas Publisher Springfield,Illinois(1964)等)，在不使細胞的生存率極度降低之程度的條件下適宜實施。
該種方法例如可使用於聚乙二醇等高濃度聚合物溶液中將抗體產生細胞與骨髓瘤細胞混合之化學性方法、利用電刺激之物理性方法等。其中，若例示上述化 學性方法的具體例，則如以下所示。亦即，於使用聚乙二醇作為高濃度聚合物溶液的情形，於分子量1500~6000，較佳為2000~4000的聚乙二醇溶液中，於30~40℃，較佳為35~38℃的溫度，將抗體產生細胞與骨髓瘤細胞混合1~10分鐘，較佳為5~8分鐘。
(e)融合瘤群的選擇
藉由上述細胞融合而獲得的融合瘤之選擇方法並沒有特別限制，但通常使用HAT(次黃嘌呤‧胺基喋呤‧胸腺嘧啶)選擇法(Kohler et al.,Nature(1975)256,p.495；Milstein et al.,Nature(1977)266,p.550)。
此方法對於使用無法於胺基喋呤生存的HGPRT缺損株之骨髓瘤細胞而獲得融合瘤的情形為有效的。
亦即，可藉由將未融合細胞及融合瘤以HAT培養基培養，而僅使具有對胺基喋呤之耐性的融合瘤選擇性地殘存且增殖。
(f)分劃為單一細胞殖株(選殖)
作為融合瘤的選殖法，例如可使用甲基纖維素法、軟瓊脂糖法、極限稀釋法等周知的方法(例如參照Barbara,B.M.and Stanley,M.S.：Selected Methods in Cellular Immunology,W.H.Freeman and Company,San Francisco(1980))。此等方法中，特別適合為甲基纖維素法等三維培養法。例如，藉由將利用細胞融合所形成的融合瘤群懸浮於ClonaCell-HY Selection Medium D(StemCell Technologies公司製，#03804)等甲基纖維素培養基來培養，並將所形成的融合瘤群落(colony)回收， 而可取得單殖株融合瘤。培養所回收的各融合瘤群落，選擇於所獲得的融合瘤培養上清液中穩定地觀察到抗體價者作為GARP單株抗體產生融合瘤株。
作為如此進行所建立的融合瘤株之例，可列舉GARP融合瘤151D及198D。另外，於本說明書中，將GARP融合瘤151D及198D所產生的抗體記載為「151D抗體」或「198D抗體」，或者僅記載為「151D」或「198D」。
151D抗體的重鏈可變區係具有序列表之序列識別號15所示的胺基酸序列。又，151D抗體的輕鏈可變區係具有序列表之序列識別號17所示的胺基酸序列。另外，序列表之序列識別號15所示的重鏈可變區之胺基酸序列係藉由序列表之序列識別號14所示的核苷酸序列所編碼。又，序列表之序列識別號17所示的輕鏈可變區之胺基酸序列係藉由序列表之序列識別號16所示的核苷酸序列所編碼。
198D抗體的重鏈可變區係具有序列表之序列識別號19所示的胺基酸序列。又，198D抗體的輕鏈可變區係具有序列表之序列識別號21所示的胺基酸序列。另外，序列表之序列識別號19所示的重鏈可變區之胺基酸序列係藉由序列表之序列識別號18所示的核苷酸序列所編碼。又，序列表之序列識別號21所示的輕鏈可變區之胺基酸序列係藉由序列表之序列識別號20所示的核苷酸序列所編碼。
(g)利用融合瘤的培養之單株抗體的製備
如此進行所選擇的融合瘤，可藉由將其培養而有效 率地獲得單株抗體，但在培養之前，篩選產生作為目的之單株抗體的融合瘤較為理想。
於此篩選，可採用本身已知的方法。
本發明中之抗體價的測定，例如可藉由於上述(b)項目所說明的ELISA法而進行。
藉由以上的方法所獲得的融合瘤，可於液態氮中或-80℃以下的冷凍庫中以凍結狀態保存。
選殖完成的融合瘤係將培養基自HT培養基更換為正常培養基而培養。
大量培養係以使用大型培養瓶的旋轉培養或者旋轉器培養來進行。自此大量培養中之上清液，藉由使用凝膠過濾等所屬技藝領域中具有通常知識者所周知的方法進行純化，可獲得特異性結合於本發明之蛋白質的單株抗體。
又，藉由將融合瘤注射至同系統的小鼠(例如，上述BALB/c)、或者Nu/Nu小鼠之腹腔內，使該融合瘤增殖，而可獲得大量含有本發明之單株抗體的腹水。
於投予至腹腔內的情形，若在事前(3~7日前)投予2,6,10,14-四甲基十五烷(2,6,10,14-tetramethyl pentadecane)(姥鮫烷(pristine))等礦物油，則可獲得更多量的腹水。
例如，預先將免疫抑制劑注射至與融合瘤同系統之小鼠的腹腔內，使T細胞不活化後，在20日後使106~107個融合瘤‧殖株細胞懸浮於不含血清的培養基中(0.5ml)而投予至腹腔內，通常在腹部膨脹、腹水積存時 自小鼠採取腹水。藉由此方法，相較於培養液中，可獲得約100倍以上的濃度之單株抗體。
藉由上述方法而獲得的單株抗體，例如能以記載於Weir,D.M.：Handbook of Experimental Im munology,Vol.I,II,III,Blackwell Scientific Pu blications,Oxford(1978)的方法進行純化。
如此獲得的單株抗體相對於GARP係具有高抗原特異性。
(h)單株抗體的檢定
所獲得之單株抗體的同型(isotype)及亞型(subclass)之確定可如以下的方式進行。
首先，作為鑑定法，可列舉歐氏(Ouchterlony)法、ELISA法、或RIA法。
歐氏法雖簡便，但於單株抗體之濃度低的情形需要濃縮操作。
另一方面，使用ELISA法或RIA法的情形，藉由使培養上清液直接與抗原吸附固相進行反應，進一步使用對應各種免疫球蛋白同型、亞型之抗體，而可鑑定單株抗體的同型、亞型。
又，作為進一步簡便的方法，亦可利用市售之鑑定用的套組(kit)(例如，Mouse Typer套組；Bio-Rad公司製)等。
再者，蛋白質的定量可藉由斐林-洛利法(Folin Lowry method)，及利用280nm中之吸光度[1.4(OD280)]=免疫球蛋白1mg/ml]而算出的方法來進行。
再者，於再度實施(2)之(a)至(h)的步驟而另外獨立取得單株抗體的情形，亦可取得具有與F105抗體、F110抗體、源自151D的抗體(人源化151D抗體)及源自198D的抗體(人源化198D抗體)同等的特性之抗體。作為此種抗體之一例，可列舉結合於與上述各抗體相同的抗原決定區之抗體。由於F105抗體係辨識GARP的胺基酸序列(序列識別號1)中之胺基酸編號366至377、407至445及456至470，F110抗體係辨識該序列中之胺基酸編號54至112及366至392，源自151D的抗體(人源化151D抗體)係辨識該序列中之胺基酸編號352至392，及源自198D的抗體(人源化198D抗體)係辨識該序列中之胺基酸編號18至112而結合，故作為該抗原決定區，特別可列舉以GARP的胺基酸序列中之該區域作為抗原決定區。
若新製作的單株抗體結合於上述F105抗體等所結合的部分胜肽或部分立體構造，則可判定該單株抗體結合於與上述F105抗體等抗體相同的抗原決定區。又，藉由確認對於上述F105抗體等抗體之對GARP的結合，該單株抗體係進行競爭(亦即，該單株抗體妨礙上述F105抗體等抗體與GARP的結合)，而即使未確定具體的抗原決定區之序列或構造，亦可判定該單株抗體結合於與上述F105抗體等抗體相同的抗原決定區。於確認抗原決定區相同的情形，可強烈期待該單株抗體具有與上述F105抗體等抗體同等的特性。
(3)其他抗體
本發明的抗體中，除了上述對GARP之單株抗體以外 ，亦包含以降低對人類之異種抗原性為目的而人為改造的基因重組型抗體，例如，嵌合(Chimeric)抗體、人源化(Humanized)抗體、及上述人類抗體等。此等抗體可使用已知的方法製造。
所獲得的抗體，可純化至均一。抗體的分離、純化只要使用通常於蛋白質使用的分離、純化方法即可。例如，若將管柱層析、過濾器過濾、超過濾、鹽析、透析、製備用聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等適宜選擇、組合，則可將抗體分離、純化(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual,Daniel R.Marshak et al.eds.,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但不限定於此等。
作為層析，可列舉親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾層析、逆相層析、吸附層析等。
此等層析可使用HPLC或FPLC等液體層析來進行。
作為親和性層析所使用的管柱，可列舉蛋白質A管柱、蛋白質G(Protein G)管柱。例如，作為使用蛋白質A管柱的管柱，可列舉Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia)等。
又，亦可使用將抗原固定化的支撐體，利用對抗原的結合性而純化抗體。
所獲得的抗體可藉由後述實施例所示的方法等 而評價對抗原的結合性，選出適合的抗體。
作為比較抗體的性質時之指標，可列舉抗體的穩定性。示差掃描熱析儀(DSC)係可快速又正確的測定為蛋白的相對構造穩定性之優異指標的熱變性中點(Tm)之裝置。藉由使用DSC測定Tm值，將其值進行比較，而可比較熱穩定性的差異。已知抗體的保存穩定性係顯示與抗體的熱穩定性有某種程度的相關性(Lori Burton,et.Al.,PharmaceuticalDevelopment and Technology(2007)12,p.265-273)，將熱穩定性作為指標，可選出適合的抗體。作為用以選出抗體的其他指標，可列舉於適當的宿主細胞中之產量高、及於水溶液中的凝集性低。由於例如產量最高的抗體並不一定顯示最高的熱穩定性，所以有必要基於以上所述的指標而綜合性地判斷，來選出最適合投予至人類的抗體。
作為本發明之抗GARP人類抗體，可列舉藉由上述噬菌體顯示法而獲得的抗體，較佳可列舉具有下述構造的105F抗體及110F抗體。
105F抗體的重鏈具有序列表之序列識別號2所示的胺基酸序列。於序列表之序列識別號2所示的重鏈胺基酸序列中，由第1至118號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為可變區，由第119至448號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為恒定區。該可變區具有由序列表之序列識別號2中之26至35所記載的胺基酸序列構成的CDRH1、由50至66所記載的胺基酸序列構成的CDRH2及由99至107所記載的胺基酸序列構成的CDRH3。又，序列識別號2之序 列係記載於第2圖。
105F抗體的輕鏈具有序列表之序列識別號3所示的胺基酸序列。於序列表之序列識別號3所示的輕鏈胺基酸序列中，由第1至112號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為可變區，由第113至217號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為恒定區。該可變區具有由序列表之序列識別號3中之23至36所記載的胺基酸序列構成的CDRL1、由52至58所記載的胺基酸序列構成的CDRL2及由91至101所記載的胺基酸序列構成的CDRL3。又，序列識別號3之序列係記載於第3圖。
110F抗體的重鏈具有序列表之序列識別號4所示的胺基酸序列。於序列表之序列識別號4所示的重鏈胺基酸序列中，由第1至123號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為可變區，由第124至453號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為恒定區。該可變區具有由序列表之序列識別號4中之26至35所記載的胺基酸序列構成的CDRH1、由50至66所記載的胺基酸序列構成的CDRH2及由99至112所記載的胺基酸序列構成的CDRH3。又，序列識別號4之序列係記載於第4圖。
110F抗體的輕鏈具有序列表之序列識別號5所示的胺基酸序列。序列表之序列識別號5所示的輕鏈胺基酸序列中，由第1至111號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為可變區，由第112至216號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為恒定區。該可變區具有由序列表之序列識別號5中之23至36所記載的胺基酸序列構成的CDRL1、由52至 58所記載的胺基酸序列構成的CDRL2及由91至100所記載的胺基酸序列構成的CDRL3。又，序列識別號5之序列係記載於第5圖。
序列表之序列識別號2所示的105F抗體重鏈胺基酸序列，係藉由序列表之序列識別號6所示的核苷酸序列所編碼。序列表之序列識別號6所示的核苷酸序列之由第1至354號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼105F抗體的重鏈可變區，而由第355至1344號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼105F抗體的105F重鏈恒定區。編碼該可變區的核苷酸序列於序列識別號6中，具有編碼CDRH1之由核苷酸編號76至105所記載的核苷酸序列構成的多核苷酸、編碼CDRH2之由核苷酸編號148至198所記載的核苷酸序列構成的多核苷酸、及編碼CDRH3之由核苷酸編號295至321所記載的核苷酸序列構成的多核苷酸。又，序列識別號6之序列係記載於第6圖。
序列表之序列識別號3所示的105F抗體輕鏈胺基酸序列係藉由序列表之序列識別號7所示的核苷酸序列所編碼。序列表之序列識別號7所示的核苷酸序列之由第1至336號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼105F抗體的輕鏈可變區，而由第337至651號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼105F抗體的輕鏈恒定區。編碼該可變區的核苷酸序列於序列識別號7中，具有編碼CDRL1之由核苷酸編號67至108所記載的核苷酸序列構成的多核苷酸、編碼CDRL2之由核苷酸編號154至174所記載的核苷酸序列構成的多核苷酸、及編碼CDRL3之由核苷酸編號271至 303所記載的核苷酸序列構成的多核苷酸。又，序列識別號7之序列係記載於第7圖。
序列表之序列識別號4所示的110F抗體重鏈胺基酸序列係藉由序列表之序列識別號8所示的核苷酸序列所編碼。序列表之序列識別號8所示的核苷酸序列之由第1至369號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼110F抗體的重鏈可變區，而由第370至1359號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼110F抗體的重鏈恒定區。編碼該可變區的核苷酸序列於序列識別號8中，具有編碼CDRH1之由核苷酸編號76至105所記載的核苷酸序列構成的多核苷酸、編碼CDRH2之由核苷酸編號148至198所記載的核苷酸序列構成的多核苷酸、及編碼CDRH3之由核苷酸編號295至336所記載的核苷酸序列構成的多核苷酸。又，序列識別號8之序列係記載於第8圖。
序列表之序列識別號5所示的110F抗體輕鏈胺基酸序列係藉由序列表之序列識別號9所示的核苷酸序列所編碼。序列表之序列識別號9所示的核苷酸序列之由第1至333號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼110F抗體的輕鏈可變區，而由第334至648號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼110F抗體的輕鏈恒定區。編碼該可變區的核苷酸序列於序列識別號9中，具有編碼CDRL1之由核苷酸編號67至108所記載的核苷酸序列構成的多核苷酸、編碼CDRL2之由核苷酸編號154至174所記載的核苷酸序列構成的多核苷酸、及編碼CDRL3之由核苷酸編號271至300所記載的核苷酸序列構成的多核苷酸。又，序列識別 號9之序列係記載於第9圖。
於本發明的抗體中，除了上述抗GARP人類抗體以外，即使藉由上述的抗體取得方法以外之方法而另外獨立取得抗體的情形，亦可取得具有與105F抗體或110F抗體同等的細胞毒殺活性之抗體。作為此種抗體之一例，可列舉結合於與105F抗體或110F抗體相同的抗原決定區之抗體。
若新製作的抗體結合於F105抗體或110F抗體所結合的部分胜肽或部分立體構造，則可判定該抗體結合於與105F抗體或110F抗體相同的抗原決定區。又，藉由確認對於105F抗體或110F抗體之對GARP的結合，該抗體係進行競爭(亦即，該抗體妨礙105F抗體或110F抗體與GARP的結合)，而即使未確定具體的抗原決定區之序列或構造，亦可判定該抗體結合於與105F抗體或110F抗體相同的抗原決定區。於確認抗原決定區相同的情形，可強烈期待該抗體具有與105F抗體或110F抗體同等的細胞毒殺活性。
再者，本發明的抗體中亦包含經人為改造的基因重組型抗體。此等抗體可使用已知的方法製造。作為該抗體，較佳為至少具有上述105F抗體或110F抗體的各重鏈及輕鏈之6種全部的CDR，並具有ADCC活性及對於Treg的免疫抑制機能之抑制活性，只要具有該特性，則不限定於特定的抗體。更佳為具有上述105F抗體或110F抗體的各重鏈可變區及輕鏈可變區之抗體。
又，藉由組合與105F抗體或110F抗體的各重鏈 胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列顯示高同源性的序列，而可選擇具有與該抗體同等的活性之抗體。如此之同源性，一般而言為80%以上的同源性，較佳為90%以上的同源性，更佳為95%以上的同源性，最佳為99%以上的同源性(但各CDR係與上述各抗體相同)。又，藉由組合於上述重鏈或輕鏈的胺基酸序列(但各CDR之部位除外)中經取代、缺失或附加一至數個胺基酸殘基之胺基酸序列，亦可選擇具有與上述各抗體同等的活性之抗體。
又，作為本發明之抗GARP抗體，可列舉下述嵌合抗體及人源化抗體。
作為嵌合抗體，可列舉抗體的可變區與恒定區互為異種之抗體，例如將源自小鼠或大鼠之抗體的可變區接合於源自人類的恒定區之嵌合抗體(參照Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81,6851-6855,(1984))。
源自大鼠抗人類GARP抗體151D之嵌合抗體，係包含含有下列重鏈可變區的重鏈及含有下列輕鏈可變區的輕鏈之抗體，亦可具有任意之源自人類的恒定區：包含由序列識別號15之第1至117號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之重鏈可變區；包含由序列識別號17之第1至109號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之輕鏈可變區。
又，源自大鼠抗人類GARP抗體198D之嵌合抗體，係包含含有下列重鏈可變區的重鏈及含有下列輕鏈可變區的輕鏈之抗體，亦可具有任意之源自人類的恒定區：包含由序列識別號19之第1至120號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之重鏈可變區；包含由序列識別號21之 第1至109號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之輕鏈可變區。
作為此種嵌合抗體之例，可列舉包含「具有由序列表之序列識別號25之第20至466號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之重鏈」及「具有由序列表之序列識別號27之第21至234號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之輕鏈」的抗體、以及包含「具有由序列表之序列識別號29之第20至469號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之重鏈」及「具有由序列表之序列識別號31之第21至234號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之輕鏈」的抗體。
另外，於序列表之序列識別號25所示的重鏈序列中，由第1至19號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為訊息序列，由第20至136號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為可變區，由第137至466號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為，恒定區。
又，於序列表之序列識別號27所示的輕鏈序列中，由第1至20號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為訊息序列，由第21至129號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為可變區，由第130至234號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為恒定區。
再者，於序列表之序列識別號29所示的重鏈序列中，由第1至19號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為訊息序列，由第20至139號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為可變區，由第140至469號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為恒定區。
又，於序列表之序列識別號31所示的輕鏈序列中，由第1至20號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為訊息序列，由第21至129號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為可變區，由第130至234號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列為恒定區。
序列表之序列識別號25所示的c151D抗體的重鏈胺基酸序列，係藉由序列表之序列識別號24所示的核苷酸序列所編碼。序列表之序列識別號24所示的核苷酸序列之由第1至57號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼c151D抗體的重鏈訊息序列，由第58至408號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼c151D抗體的重鏈可變區，而由第409至1398號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼c151D抗體的重鏈恒定區。
又，序列表之序列識別號27所示的c151D抗體的輕鏈胺基酸序列係藉由序列表之序列識別號26所示的核苷酸序列所編碼。序列表之序列識別號26所示的核苷酸序列之由第1至60號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼c151D抗體的輕鏈訊息序列，由第61至387號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼c151D抗體的輕鏈可變區，而由第388至702號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼c151D抗體的輕鏈恒定區。
再者，序列表之序列識別號29所示的c198D抗體的重鏈胺基酸序列係藉由序列表之序列識別號28所示的核苷酸序列所編碼。序列表之序列識別號28所示的核苷酸序列之由第1至57號的核苷酸構成的核苷酸序列係 編碼c198D抗體的重鏈訊息序列，由第58至417號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼c198D抗體的重鏈可變區，而由第418至1407號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼c198D抗體的重鏈恒定區。
又，序列表之序列識別號31所示的c198D抗體的輕鏈胺基酸序列係藉由序列表之序列識別號30所示的核苷酸序列所編碼。序列表之序列識別號30所示的核苷酸序列之由第1至60號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼c198D抗體的輕鏈訊息序列，由第61至387號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼c198D抗體的輕鏈可變區，而由第388至702號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼c198D抗體的輕鏈恒定區。
作為人源化抗體，可列舉僅將互補性決定區(CDR；complementarity deterrnining region)組入源自人類的抗體之抗體(參照Nature(1986)321,p.522-525)；藉由CDR移植(CDR-grafting)法，除了CDR的序列以外，亦將一部份之框架的胺基酸殘基移植至人類抗體之抗體(國際公開小冊WO90/07861)。
但作為源自151D抗體的人源化抗體，只要保持151D抗體之6種全部的CDR序列並具有抗腫瘤活性，則並未限定於特定的人源化抗體。
另外，151D抗體的重鏈可變區保有包含由序列表之序列識別號15中之胺基酸編號26至35的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之CDRH1(GFTFSNYYMA)、包含由序列表之序列識別號15中之胺基酸編號50至59的胺基酸殘 基構成的胺基酸序列之CDRH2(SIGTVGGNTY)、及包含由序列表之序列識別號15中之胺基酸編號99至106的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之CDRH3(EDYGGFPH)。
又，151D抗體的輕鏈可變區保有包含由序列表之序列識別號17中之胺基酸編號24至34的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之CDRL1(KASQNVGTNVD)、包含由序列表之序列識別號17中之胺基酸編號50至56的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之CDRL2(GASNRYT)、及包含由序列表之序列識別號17中之胺基酸編號89至97的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之CDRL3(LQYKYNPYT)。
再者，198D抗體的重鏈可變區保有包含由序列表之序列識別號19中之胺基酸編號26至35的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之CDRH1(GFSLTSFHVS)、包含由序列表之序列識別號19中之胺基酸編號50至58的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之CDRH2(TISSGGGTY)、及包含由序列表之序列識別號19中之胺基酸編號98至109的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之CDRH3(ISGWGHYYVMDV)。
又，198D抗體的輕鏈可變區保有包含由序列表之序列識別號21中之胺基酸編號24至34的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之CDRL1(QASEDIYSGLA)、包含由序列表之序列識別號21中之胺基酸編號50至56的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之CDRL2(GAGSLQD)、及包含由序列表之序列識別號21中之胺基酸編號89至97的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之CDRL3(QQGLKFPLT)。
作為大鼠抗體151D的人源化抗體之實例，可列 舉「包含由(1)包含序列表之序列識別號33(h151D-H1)或35(h151D-H4)之第20至136號的胺基酸殘基之胺基酸序列；(2)於上述(1)之序列中，對於各CDR序列以外之框架區的序列具有至少95%以上同源性的胺基酸序列；及(3)於上述(1)之序列中之各CDR序列以外之框架區的序列中經缺失、取代或附加一或數個胺基酸之胺基酸序列之任一者構成的重鏈可變區之重鏈」，以及「包含由(4)包含序列識別號37(h151D-L1)或39(h151D-L4)之第21至129號的胺基酸殘基之胺基酸序列；(5)於上述(4)之序列中，對於各CDR序列以外之框架區的序列具有至少95%以上同源性的胺基酸序列；及(6)於上述(4)之序列中之各CDR序列以外之框架區的序列中經缺失、取代或附加一或數個胺基酸之胺基酸序列之任一者構成的輕鏈可變區之輕鏈」之任意的組合。
又，作為大鼠抗體198D的人源化抗體之實例，可列舉「包含由(1)包含序列表之序列識別號41(h198D-H3)之第20至139號的胺基酸殘基之胺基酸序列；(2)於上述(1)之序列中，對於各CDR序列以外之框架區的序列具有至少95%以上同源性的胺基酸序列；及(3)於上述(1)之序列中之各CDR序列以外之框架區的序列中經缺失、取代或附加一或數個胺基酸之胺基酸序列之任一者構成的重鏈可變區之重鏈」，以及「包含由(4)包含序列識別號43(h198D-L4)之第21至129號的胺基酸殘基之胺基酸序列；(5)於上述(4)之序列中，對於各CDR序列以外之框架區的序列具有至少95%以上同源性的胺 基酸序列；及(6)於上述(4)之序列中之各CDR序列以外之框架區的序列中經缺失、取代或附加一或數個胺基酸之胺基酸序列之任一者構成的輕鏈可變區之輕鏈」之任意的組合。
作為人源化151D抗體的重鏈及輕鏈之適合的組合，可列舉包含具有「包含由序列識別號33之第20至136號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之重鏈可變區」的重鏈及具有「包含由序列識別號37之第21至129號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之輕鏈可變區」的輕鏈之抗體、以及包含具有「包含由序列識別號35之第20至136號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之重鏈可變區」的重鏈及具有「包含由序列識別號39之第21至129號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之輕鏈可變區」的輕鏈之抗體。
作為更適合的組合，可列舉包含具有序列識別號33之胺基酸序列的重鏈及具有序列識別號37之胺基酸序列的輕鏈之抗體(h151D-H1L1)、以及包含具有序列識別號35之胺基酸序列的重鏈及具有序列識別號39之胺基酸序列的輕鏈之抗體(h151D-H4L4)。
作為人源化198D抗體的重鏈及輕鏈之適合的組合，可列舉包含具有下列重鏈可變區的重鏈及下列輕鏈可變區的輕鏈之抗體：包含由序列識別號41之第20至139號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之重鏈可變區；包含由序列識別號43之第21至129號的胺基酸殘基構成的胺基酸序列之輕鏈可變區。
作為更適合的組合，可列舉包含具有序列識別 號41之胺基酸序列的重鏈及具有序列識別號43之胺基酸序列的輕鏈之抗體(h198D-H3L4)。
藉由組合與上述重鏈胺基酸序列及輕鏈胺基酸序列顯示高同源性的序列，而可選擇具有與上述各抗體同等的細胞毒殺性活性之抗體。如此之同源性，一般而言為80%以上的同源性，較佳為90%以上的同源性，更佳為95%以上的同源性，最佳為99%以上的同源性。又，藉由組合於上述重鏈或輕鏈的胺基酸序列中經取代、缺失或附加1至數個胺基酸殘基之胺基酸序列，亦可選擇具有與上述各抗體同等的細胞毒殺性活性之抗體。
另外，本說明書中之「數個」係意指1至10個、1至9個、1至8個、1至7個、1至6個、1至5個、1至4個、1至3個、或者1或2個。
又，作為本說明書中之胺基酸的取代，較佳為保守性胺基酸取代(conservative amino acid substitution)。保守性胺基酸取代係指於與胺基酸側鏈有關聯之胺基酸群組內所產生的取代。較佳的胺基酸群組係如以下所示：酸性群組=天冬胺酸、麩胺酸；鹼性群組=離胺酸、精胺酸、組胺酸；非極性群組=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸；及不帶電極性家族=甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸。其他之適合的胺基酸群組係如下列所示：脂肪族羥基群組=絲胺酸及蘇胺酸；含有醯胺群組=天冬醯胺酸及麩醯胺酸；脂肪族群組=丙胺酸、纈胺酸、白胺酸及異白胺酸；以及芳香族群組= 苯丙胺酸、色胺酸及酪胺酸。該胺基酸取代較佳為在不使具有原胺基酸序列之物質的特性降低之範圍內進行。
兩種類的胺基酸序列間之同源性，可藉由使用Blast algorithm version 2.2.2(Altschul,Stephen F.,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Z hang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lip man(1997),「Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs」,Nucleic Acids Res.25：3389-3402)之系統內定參數而確定。Blast algorithm亦可藉由於網際網路存取www.ncbi.nlm.nih.gov/blast而使用。另外，針對本發明的抗體之核苷酸序列與其他抗體之核苷酸序列的同源性，亦可藉由Blast algorithm而確定。
另外，於與人源化151D抗體有關的序列表之序列識別號33或35所示的重鏈胺基酸序列中，由第1至19號胺基酸殘基構成的胺基酸序列為訊息序列，由第20至136號胺基酸殘基構成的胺基酸序列為可變區，由第137至466號胺基酸殘基構成的胺基酸序列為恒定區。
又，於與人源化151D抗體有關的序列表之序列識別號37或39所示的輕鏈胺基酸序列中，由第1至20號胺基酸殘基構成的胺基酸序列為訊息序列，由第21至129號胺基酸殘基構成的胺基酸序列為可變區，由第130至234號胺基酸殘基構成的胺基酸序列為恒定區。
再者，於與人源化198D抗體有關的序列表之序列識別號41所示的重鏈胺基酸序列中，由第1至19號胺基 酸殘基構成的胺基酸序列為訊息序列，由第20至139號胺基酸殘基構成的胺基酸序列為可變區，由第140至469號胺基酸殘基構成的胺基酸序列為恒定區。
又，於與人源化198D抗體有關的序列表之序列識別號43所示的輕鏈胺基酸序列中，由第1至20號胺基酸殘基構成的胺基酸序列為訊息序列，由第21至129號胺基酸殘基構成的胺基酸序列為可變區，由第130至234號胺基酸殘基構成的胺基酸序列為恒定區。
於與人源化151D抗體有關的序列表之序列識別號33或35所示的重鏈胺基酸序列，係各自藉由序列表之序列識別號32或34所示的核苷酸序列所編碼。又，序列識別號33之序列係記載於第21圖，序列識別號35之序列係記載於第23圖，序列識別號32之序列係記載於第31圖，及序列識別號34之序列係記載於第33圖。
各核苷酸序列之由第1至57號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼人源化151D抗體的重鏈訊息序列，由第58至408號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼人源化151D抗體抗體的重鏈可變區，而由第409至1398號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼人源化151D抗體的重鏈恒定區。
與人源化198D抗體有關的序列表之序列識別號41所示的重鏈胺基酸序列，係藉由序列表之序列識別號40所示的核苷酸序列所編碼。又，序列識別號41之序列係記載於第25圖，序列識別號40之序列係記載於第35圖。
核苷酸序列之由第1至57號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼人源化198D抗體的重鏈訊息序列，由第58至417號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼人源化198D抗體抗體的重鏈可變區，而由第418至1407號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼人源化198D抗體的重鏈恒定區。
與人源化151D抗體有關的序列表之序列識別號37或39所示的輕鏈胺基酸序列，係各自藉由序列表之序列識別號36或38所示的核苷酸序列所編碼。又，序列識別號37之序列係記載於第22圖，序列識別號39之序列係記載於第24圖，序列識別號36之序列係記載於第32圖，及序列識別號38之序列係記載於第34圖。
各核苷酸序列之由第1至60號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼人源化151D抗體的輕鏈訊息序列，由第61至387號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼人源化151D抗體的輕鏈可變區，而由第388至702號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼人源化151D抗體的輕鏈恒定區。
與人源化198D抗體有關的序列表之序列識別號43所示的輕鏈胺基酸序列，係藉由序列表之序列識別號42所示的核苷酸序列所編碼。又，序列識別號43之序列係記載於第26圖，序列識別號42之序列係記載於第36圖。
核苷酸序列之由第1至60號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼人源化198D抗體的輕鏈訊息序列，由第61至387號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼人源化 198D抗體的輕鏈可變區，而由第388至702號的核苷酸構成的核苷酸序列係編碼人源化198D抗體的輕鏈恒定區。
針對此等核苷酸序列與其他抗體的核苷酸序列之間的同源性，亦可藉由Blast algorithm而確定。
作為本發明之抗體，進一步可列舉結合於與人源化151D抗體或人源化198D抗體相同的抗原決定區之人類抗體。抗GARP人類抗體係意指僅具有源自人類染色體之抗體的基因序列之人類抗體。抗GARP人類抗體能以前述的方法取得。
若新製作的人類抗體結合於人源化151D抗體或人源化198D抗體所結合的部分胜肽或部分立體構造，則可判定該人類抗體結合於與人源化151D抗體或人源化198D抗體相同的抗原決定區。又，藉由確認對於人源化151D抗體或人源化198D抗體之對GARP的結合，該人類抗體係進行競爭(亦即，該人類抗體妨礙人源化151D抗體或人源化198D抗體與GARP的結合)，即使未確定具體的抗原決定區之序列或構造，亦可判定該人類抗體結合於與人源化151D抗體或人源化198D抗體相同的抗原決定區。於確認抗原決定區相同的情形，可強烈期待該人類抗體具有與人源化151D抗體或人源化198D抗體同等的細胞毒殺活性。
藉由以上的方法所獲得的嵌合抗體、人源化抗體、或人類抗體，可利用後述的實施例所示的方法等，評價對抗原的結合性，選出適合的抗體。
本發明中亦包含抗體的修飾體。該修飾體係意 指對本發明之抗體施加化學性或生物學性的修飾而成者。化學性的修飾體中，包含對胺基酸骨架之化學部分的結合、N-鍵結或O-鍵結碳水化合物鏈之化學修飾體等。生物學性的修飾體中，包含經轉譯後修飾(例如，對N-鍵結或O-鍵結的醣苷化、N末端或C末端的加工、脫醯胺化、天冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化)者、藉由使用原核生物宿主細胞使其表現而於N末端附加甲硫胺酸殘基者等。又，為了使本發明的抗體或抗原之檢測或單離成為可能而經標識者，例如，酵素標識體、螢光標識體、親和性標識體亦包含於該修飾物之意義中。此種本發明的抗體之修飾物，係有用於原本之本發明的抗體之穩定性及血中滯留性的改善、抗原性的減低、該抗體或抗原的檢測或單離等。
又，藉由調節結合於本發明的抗體之糖鏈修飾(醣苷化、去海藻糖化等)，可增強抗體依賴性細胞毒殺活性。作為抗體的糖鏈修飾之調節技術，已知有WO99/54342、WO00/61739、WO02/31140等，但不限定於此等。本發明的抗體中亦包含經調節該糖鏈修飾的抗體。
於將抗體基因暫時單離後，導入適當的宿主而製作抗體的情形，可使用適當的宿主與表現載體之組合。作為抗體基因的具體例，可列舉組合編碼本明細書所記載的抗體的重鏈序列之基因、及編碼輕鏈序列之基因者。將宿主細胞轉形時，重鏈序列基因與輕鏈序列基因可插入相同的表現載體，又亦可插入各別的表現載體。
使用真核細胞作為宿主的情形，可使用動物細胞、植物細胞、真核微生物。特別就動物細胞而言，可列舉哺乳類細胞，例如，為猴的細胞之COS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182，ATCC CRL-1650)、小鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC：No.CRL-1658)或中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞，ATCC CCL-61)的二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)。
使用原核細胞的情形，例如可列舉大腸桿菌、枯草桿菌。
於此等細胞中藉由轉型而導入作為目的之抗體基因，將經轉形的細胞於活體外培養，藉此可獲得抗體。於該培養中，有依據抗體的序列而產量不同的情形，可自具有同等的結合活性之抗體中，以產量為指標，而挑選作為醫藥的生產為容易者。因此，本發明之抗體中，亦包含藉由下述該抗體的製造方法所獲得的抗體，該抗體的製造方法之特徵係包含培養上述經轉形的宿主細胞的步驟、及自該步驟所得的培養物採取目的之抗體的步驟。
另外，已知以哺乳類培養細胞生產的抗體之重鏈的羧基末端之離胺酸殘基係缺失(Journal of Chromatography A,705：129-134(1995))，又，已知同樣地重鏈羧基末端之甘胺酸、離胺酸之2胺基酸殘基係缺失，且位於新羧基末端之脯胺酸殘基經醯胺化(Analytical Biochemistry,360：75-83(2007))。然而，此等重鏈序列 之缺失及修飾，對抗體的抗原結合能力及效應物功能(effector function)(補體的活化或抗體依賴性細胞毒殺作用等)不造成影響。因此，本發明中亦包含受該修飾的抗體，可列舉於重鏈羧基末端經缺失1或2個胺基酸的缺失體、及經醯胺化的該缺失體(例如，羧基末端部位之脯胺酸殘基經醯胺化的重鏈)等。但只要保有抗原結合能力及效應物功能，則本發明之抗體的重鏈的羧基末端之缺失體並不限定於上述種類。構成本發明之抗體的2條重鏈可為選自包含全長及上述缺失體之群組之任一種，亦可為任兩種的組合。各缺失體的量比雖受到產生本發明之抗體的哺乳類培養細胞之種類及培養條件的影響，但作為本發明之抗體的主成分，可列舉於2條重鏈雙方羧基末端的1個胺基酸殘基缺失的情形。
作為本發明的抗體之同型，例如可列舉IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)等，但較佳可列舉IgG1或IgG2。
作為抗體的機能，一般可列舉抗原結合活性、中和抗原活性的活性、增強抗原活性的活性、ADCC活性、抗體依賴性細胞媒介吞噬作用(ADCP)活性及補體依賴性細胞毒殺(CDC)活性等，但本發明之抗體所具有的機能為對GARP的結合活性，較佳為ADCC活性，更佳為利用經由ADCC活性的Treg機能抑制活性之細胞毒殺活性(抗腫瘤活性)。再者，本發明的抗體除了ADCC活性以外，亦可兼具ADCP活性及/或CDC活性。特別是針對既有之含有抗腫瘤抗體的醫藥，已報告藉由直接作用於腫瘤細 胞來遮斷增殖訊息、直接作用於腫瘤細胞來誘導細胞死亡訊息、抑制血管新生、經由NK細胞而引起ADCC活性、及經由補體而誘導CDC活性，而抑制腫瘤細胞的增殖(J Clin Oncol 28：4390-4399.(2010)、Clin Cancer Res；16(1)；11-20.(2010))，但針對本案發明之抗GARP抗體所具有的ADCP活性，至少本發明人等並未得知其被報告作為既有之含有抗腫瘤抗體的醫藥之活性。
本發明的抗體亦可為多聚體化而提高對抗原的親和性者。作為多聚體化的抗體，可為1種類的抗體，亦可為辨識相同的抗原之複數的抗原決定區之複數的抗體。作為將抗體多聚體化的方法，可列舉IgG CH3結構域(domain)與2個scFv(單鏈抗體)的結合、與鏈黴抗生物素蛋白(streptavidin)的結合、螺旋-轉角-螺旋模體(helix-turn-helix motif)之導入等。
本發明的抗體亦可為胺基酸序列相異之複數種類的抗GARP抗體的混合物之多株抗體。作為多株抗體之一例，可列舉CDR相異之複數種類的抗體的混合物。作為此種多株抗體，可使用培養產生不同抗體之細胞的混合物，並自該培養物純化的抗體(參照WO2004/061104號)。
作為抗體的修飾物，亦可使用與聚乙二醇(PEG)等之各種分子結合的抗體。
本發明的抗體進一步亦可為此等抗體與其他藥劑形成結合物者(免疫結合物(Immunoconjugate))。作為此種抗體之例，可列舉該抗體與放射性物質或具有藥理 作用的化合物結合之物(Nature Biotechnology(2005)23，p.1137-1146)，例如可列舉銦(111In)卡羅單株抗體噴地肽(Indium(111In)Capromab pendetide)、鎝(99mTc)巰諾莫單株抗體(Technetium(99mTc)Nofetumomab merpentan)、銦(111In)替伊莫單株抗體(Indium(111In)Ibritumomab)、釔(90Y)替伊莫單株抗體(Yttrium(90Y)Ibritumomab)、碘(131I)托西莫單株抗體(Iodine(131I)Tositumomab)等。
3. 含有抗GARP抗體的醫藥
由上述「2. 抗GARP抗體的製造」之項目所記載的方法所得的抗體，因為對Treg顯示細胞毒殺活性，而可作為醫藥，特別是作為對癌及感染症(特別是瘧疾及HIV感染症)的治療劑而使用。
於活體外之因抗體造成之殺細胞活性，能以細胞增殖的抑制活性來測定。
例如，培養過量表現GARP的癌細胞株，於培養系中以各種濃度添加抗體，可測定對集落形成(focus formation)、群落形成(colony formation)、及球體(spheroid)增殖之抑制活性。
於活體內之利用實驗動物之抗體對癌症的治療效果，係例如將抗體投予至經移植高表現GARP的腫瘤細胞株之裸鼠，可測定癌細胞的變化。
作為癌症的種類，可列舉肺癌、腎癌、尿道上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃 癌、食道癌、血液癌等，但只要成為治療對象的癌細胞表現GARP則並不限定於此等。
作為本發明的醫藥組成物中所容許之用於製劑的物質，較佳為於投予量或投予濃度下對於被投予醫藥組成物者為非毒性。
本發明的醫藥組成物可包含用以變更或保持pH、滲透壓、黏度、透明度、顏色、等張性、無菌性、穩定性、溶解率、緩釋率、吸收率、滲透率之製劑用的物質。作為製劑用的物質，可列舉以下者，但不限定於此等：甘胺酸、丙胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺酸、精胺酸或離胺酸等胺基酸類、抗菌劑、抗壞血酸、硫酸鈉或亞硫酸氫鈉等抗氧化劑、磷酸、、檸檬酸、硼酸緩衝液、碳酸氫鈉、參(羥甲基)胺基甲烷-鹽酸(Tris-Hcl)溶液等緩衝劑、甘露醇或甘胺酸等填充劑、乙二胺四乙酸(EDTA)等螯合劑、咖啡因、聚乙烯基吡咯啶酮、β-環糊精或羥丙基-β-環糊精等錯合劑、葡萄糖、甘露糖或糊精等增量劑、單糖類、雙糖類等其他碳水化合物、著色劑、香味劑、稀釋劑、乳化劑或聚乙烯基吡咯啶酮等親水性聚合物、低分子量多胜肽、鹽形成對離子、氯化苄烷銨(benzalkoniumchloride)、苯甲酸、柳酸、硫柳汞、苯乙醇、對羥基苯甲酸甲酯(methylparaben)、對羥基苯甲酸丙酯(propylparaben)、洛赫西定(chlorhexidine)、山梨酸或過氧化氫等防腐劑、甘油、丙二醇或聚乙二醇等溶劑、甘露醇或山梨糖醇等糖醇、懸浮劑、去水山梨醇酯、聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80等聚山梨醇酯、triton、 胺丁三醇(tromethamine)、卵磷脂或膽固醇等界面活性劑、蔗糖或山梨糖醇等穩定化增強劑、氯化鈉、氯化鉀或甘露醇.山梨糖醇等彈性增強劑、輸送劑、賦形劑、及/或藥學上的補助劑。此等製劑用的物質之添加量，相對於抗GARP抗體的重量較佳為添加0.001~100倍，特佳為添加0.1~10倍。製劑中之適合的醫藥組成物之組成，可依據所屬技藝領域中具有通常知識者，因應適用疾病、適用投予路徑等而適宜決定。
醫藥組成物中之賦形劑或載劑可為液體或固體。適當的賦形劑或載劑亦可為注射用的水或生理食鹽水、人工腦脊髓液或非經口投予所通常使用的其他物質。載劑亦可使用中性的生理食鹽水或包含血清白蛋白的生理食鹽水。醫藥組成物中可包含pH7.0-8.5的Tris緩衝液、pH4.0-5.5的乙酸緩衝液、pH3.0-6.2的檸檬酸緩衝液。又，此等緩衝液中亦可包含山梨糖醇或其他化合物。
於本發明的醫藥組成物，可列舉包含抗GARP抗體的醫藥組成物、以及包含抗GARP抗體及至少一種癌症治療劑的醫藥組成物，本發明的醫藥組成物作為具有所選擇的組成與必要的純度之藥劑，可作為冷凍乾燥品或者液體而準備。包含抗GARP抗體的醫藥組成物、以及包含抗GARP抗體及至少一種癌症治療藥劑的醫藥組成物，可作為使用如蔗糖之適當的賦形劑之冷凍乾燥品而成形。
上述醫藥組成物中，與抗GARP抗體一起被包含的癌症治療劑，可與抗GARP抗體同時、各別、或者連 續地投予至個體，亦可變更各自的投予間隔而投予。作為此種癌症治療劑，可列舉亞伯杉(abraxane)、卡鉑、順鉑、吉西他濱(gemcitabine)、愛萊諾迪肯(irinotecan)(CPT-11)、紫杉醇、培美曲塞(pemetrexed)、蕾莎瓦(sorafenib)、長春花鹼(vinblastin)或國際公開第WO2003/038043號小冊所記載的藥劑，進一步可列舉LH-RH類似物(LH-RH analog)(亮丙瑞林(leuprorelin)、戈舍瑞林(goserelin)等)、雌莫司汀(estramustine)磷酸鹽、雌激素拮抗藥(它莫西芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)等)、芳香酶抑制劑(阿那曲唑(anastrozole)、來曲唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)等)等，但只要為具有抗腫瘤活性的藥劑則並不限定於上述藥劑。
作為成為投予對象的個體，並沒有特別限定，但較佳可列舉哺乳動物，更佳可列舉人類。
本發明的醫藥組成物可製備成非經口投予用，亦可製備成利用經口之消化道吸收用。製劑之組成及濃度可依據投予方法而決定，由於相對於本發明的醫藥組成物中包含的抗GARP抗體之對GARP的親和性，即，相對於對GARP的解離常數(Kd值)，親和性越高(Kd值越低)，而即使減少對人類的投予量亦能發揮藥效，所以亦可基於此結果而決定本發明的醫藥組成物之對人的投予量。在將人類型抗GARP抗體對人類投予時，投予量只要將約0.001~100mg/kg以1次或者於1~180日間1次的間隔而投予複數次即可。作為本發明的醫藥組成物之形態，可列舉包含點滴的注射劑、栓劑、經鼻劑、舌下劑、經 皮吸收劑等。
以下，例示實施例而具體說明本發明，但本發明不限定於此等實施例。
[實施例]
於下述實施例，關於基因操作之各操作只要沒有特別指明，則係依據「分子選殖(Molecular Cloning)」(Sambrook,J.、Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，由Cold SpringHarbor Laboratory Press於1989年發行)所記載的方法及其他所屬技藝領域中具有通常知識者使用的實驗書所記載的方法進行，或者於使用市售的試藥或套組的情形，係按照市售品的說明書進行。
以下，例示實施例而具體說明本發明，但本發明不限定於此等實施例。
實施例1：抗體的取得
1)-1噬菌體顯示(Phage display)中利用淘選(panning)之抗GARP Fab的分離
將n-CoDeR Fab噬菌體庫(n-CoDeR Fab phage library)(BioInvent公司)使用於結合至GARP之Fab的分離。使用EZ-Link NHS-呈色-生物素(EZ-Link NHS-Chomogenic-Biotin)試藥(Thermo Scientific公司)，將GARP(R & D Systems公司)生物素化(biotinylation)。液相淘選係將生物素化GARP固定化至Dynabeads鏈黴抗生物素蛋白M-280(Dynabeads Streptavidin M-280)(Life Technologies公司)後，添加噬菌體，將未結合的噬菌體藉由使用磁架(magnet stand)(DynaMag-2，Life Technologies公司)之洗淨操作而除去。之後，將結合於GARP的噬菌體藉由胰蛋白酶(Sigma-Aldrich公司)處理而回收，使用大腸桿菌增幅噬菌體。實施共計3次的淘選，利用限制酶由多株的噬質體(phagemid)切出編碼Fab的DNA片段，轉移至大腸桿菌用的表現載體後，將大腸桿菌TOP10F‘(Life Technologies公司)轉形，在IPTG(Sigma-Aldrich公司)存在下使Fab表現，而供給至利用ELISA之篩選。
1)-2利用ELISA之GARP結合Fab的篩選
將以PBS(含有0.138M氯化鈉、0.0027M氯化鉀之0.01M磷酸緩衝生理食鹽水(pH 7.4)，Sigma-Aldrich公司)稀釋成2μg/mL的GARP各自添加50μL至384孔Maxi-sorp盤(Maxi-sorp plate)(黑色，Nunc公司)，於4℃靜置一晚進行固定化。或者，藉由將以PBS稀釋成1μg/mL的中性抗生物素蛋白(NeutrAvidin)(Life Technologies公司)各自添加50μL至384孔Maxi-sorp盤而固定化(4℃，靜置一晚)後，以含有ELISA緩衝液(包含0.05%土溫-20(Tween-20)(Bio-RAD公司)之PBS(Sigma-Aldrich公司))洗淨3次後，添加生物素化GARP(1pmol/50μL PBS/孔)於室溫振盪1小時。以ELISA緩衝液洗淨3次後，使用Blocker酪蛋白(Blocker Casein)(Thermo Scientific公司)進行阻斷(blocking)，進一步以ELISA緩衝液洗淨3次。之後，添加表現Fab的大腸桿菌之培養液，於室溫振盪1小時使其反應。以ELISA緩衝液洗淨3次後，添加50μL之稀釋2500倍的山葵過氧化酶(Horseradish peroxidase)(HRP) 標識抗人類F(ab’)2抗體(R & D Systems公司)，進一步於室溫振盪1小時使其反應。以ELISA緩衝液洗淨3次後，添加SuperSignal Pico ELISA化學發光基質(SuperSignal Pico ELISA Chemiluminescent substrate)(Thermo Scientific公司)，以盤式分析儀(plate reader)(Envision 2104 Multilabel Reader，Perkin Elmer)測定10分後的化學發光，分離GARP結合Fab。
1)-3 ELISA陽性殖株之核苷酸序列的確定
ELISA陽性殖株(105F、110F)的重鏈及輕鏈可變區之核苷酸序列的解析，係以染料終止劑(Dye Terminator)法(BigDye(註冊商標)Terminator v3.1，Life Technologies公司)來實施。序列解析所使用之主要的引子序列係如以下所示。
引子A：5’-GAA ACA GCT ATG AAA TAC CTA TTG C-3’(序列識別號10)
引子B：5’-GCC TGA GCA GTG GAA GTC C-3’(序列識別號11)
引子C：5'-TAG GTA TTT CAT TAT GAC TGT CTC-3’(序列識別號12)
引子D：5’-CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG-3’(序列識別號13)
藉由上述解析，而確定105F抗體及110F抗體基因之可變區的核苷酸序列。
105F抗體之重鏈可變區的核苷酸序列係由序列 表之序列識別號6所示的核苷酸序列之第1至354號的核苷酸構成的序列，輕鏈可變區的核苷酸序列係由序列表之序列識別號7所示的核苷酸序列之第1至336號的核苷酸構成的序列。
110F抗體之重鏈可變區的核苷酸序列係由序列表之序列識別號8所示的核苷酸序列之第1至369號的核苷酸構成的序列，輕鏈可變區的核苷酸序列係由序列表之序列識別號9所示的核苷酸序列之第1至333號的核苷酸構成的序列。
1)-4：全長IgG化與IgG的表現純化
包含105F及110F之ELISA陽性殖株的全長IgG化係藉由以下的方法實施。
確定編碼Fab的核苷酸序列後，特定出相當於以上述1)-3所特定之各抗體的重鏈及輕鏈之可變區的核苷酸序列。
藉由常用方法，將上述重鏈可變區之核苷酸序列與編碼人類IgG1之重鏈的恒定區(CH1+Fc區域：序列表之序列識別號2所示的胺基酸序列之第119至448號的胺基酸序列)之核苷酸序列作連結，又，將上述輕鏈可變區之核苷酸序列與編碼人類IgG1之輕鏈的恒定區(CL：序列表之序列識別號3所示的胺基酸序列之第113至217號的胺基酸序列)之核苷酸序列連結後，插入至pcDNA3.3(Invitrogen)等之動物細胞用表現載體，構築動物細胞用IgG表現載體。
將所構築之IgG表現載體的鹼基序列進行再解 析，確認105F抗體之重鏈全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號6所示的核苷酸序列，且輕鏈全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號7所示的核苷酸序列。
又，確認110F抗體之重鏈全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號8所示的核苷酸序列，且輕鏈全長的核苷酸序列為序列表之序列識別號9所示的核苷酸序列。
又，自上述核苷酸序列確定該序列所編碼的105F抗體之重鏈及輕鏈全長的胺基酸序列、以及110F抗體之重鏈及輕鏈全長的胺基酸序列。
105F抗體之重鏈的胺基酸序列為序列表之序列識別號2所示的胺基酸序列，且輕鏈的胺基酸序列為序列表之序列識別號3所示的胺基酸序列。
110F抗體之重鏈的胺基酸序列為序列表之序列識別號4所示的胺基酸序列，且輕鏈的胺基酸序列為序列表之序列識別號5所示的胺基酸序列。
105F抗體或110F抗體的IgG，係藉由將上述動物細胞用IgG表現載體插入至FreeStyle 293F細胞(Life Technologies公司)而使其暫時性表現，因應必要以蛋白質A親和性(Protein A Affinity)管柱(HiTrap Mab Select SuRe，GE Healthcare公司)純化後，藉由vivaspin 20(7k MWCO，GE Healthcare公司)而將溶解有IgG的緩衝液取代成PBS，供給至以下的步驟「1)-5」。
1)-5利用使用純化IgG的ELISA之對GARP的結合確認
將以PBS稀釋成1μg/mL之人類GARP(R & D System s公司，型號：6055-LR)各自添加100μL至96孔Maxi-sorp盤(黑色，Nunc公司)，於4℃靜置一晚進行固定化。
以ELISA緩衝液洗淨3次後，使用Blocker酪蛋白於室溫進行1小時阻斷，進一步以ELISA緩衝液洗淨3次後，將50nM的105F抗體、50nM的110F抗體、50nM的人類IgG(Jackson Immuno Research公司)、50nM的小鼠抗GARP抗體(Plato-1，ENZO Life Science公司)及50nM的小鼠IgG(Jackson Immuno Research公司)各自添加100μL，於室溫使其振盪反應1小時。
以ELISA緩衝液洗淨3次後，對於105F抗體、110F抗體及人類IgG添加組係各自添加100μL以PBS稀釋5000倍的HRP標識抗人類Fc抗體(R & D Systems公司)，對於小鼠抗GARP抗體與小鼠IgG添加組係各自添加100μL以PBS稀釋5000倍的HRP標識抗小鼠Fc抗體(R & D Systems公司)，於室溫使其振盪反應1小時。
以ELISA緩衝液洗淨5次後，添加SuperSignal Pico ELISA化學發光基質0.1mL，以盤式分析儀(plate reader)(Envision 2104 Multilabel Reader，Perkin Elmer)測定10分後的化學發光。
其結果，105F抗體與110F抗體係顯示與市售的抗GARP抗體同樣地結合於GARP(第10圖)。
實施例2：對抗原基因表現細胞的結合
GARP表現載體係購入人類GARP的cDNA殖株(Origene公司製)，依照常用方法選殖pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen公司)而確認鹼基序列。
將GARP表現載體及作為對照組的pcDNA3.1載體，使用Lipofectamin2000(Invitrogen公司)對HEK-293T細胞(ATCC：CRL-11268)進行基因導入。於含有10%胎牛血清(FBS，Hyclone公司)的DMEM培養基(Invitrogen公司)中，在5% CO2的條件下以37℃培養一晚後，藉由TrypLE Express(Invitrogen公司)處理而自盤回收細胞，以MACS緩衝液(0.5%BSA、2mM EDTA，含有PBS，Miltenyi Biotec公司)洗淨2次後，懸浮於同溶液。對所獲得的細胞懸浮液添加105F抗體及對照組人類IgG(ENZO Life Science公司)，於4℃靜置15分鐘。以MACS緩衝液洗淨2次後，添加螢光異硫氰酸鹽(FITC)標識抗IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)而懸浮，進一步於4℃靜置15分鐘。再次以MACS緩衝液洗淨2次後，以1% PFA(由三聚甲醛32%溶液(ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES公司)製備)將細胞固定，使用流式細胞儀(Facs Canto II：Becton Dickinson公司)進行檢測。數據解析係以Flowjo(TreeStar公司)進行，使用Horizon FVS450(Becton Dickinson公司)以閘(gate)將死細胞除外後，作成活細胞之FITC螢光強度的分佈圖(histogram)。
於僅導入有載體的HEK-293T細胞，105F抗體係顯示與對照組IgG同樣的螢光強度分佈圖。另一方面，於GARP表現HEK-293T細胞，確認105F抗體的分佈圖相對於對照組IgG的螢光強度分佈圖，係位移(shift)至強螢光強度側(第11圖)。自以上的結果，可知105F抗體係特 異性地結合至表現於HEK-293T細胞的GARP。
實施例3：對內源性GARP表現細胞的結合
3)-1使用L428細胞之流動式細胞測量術解析
使用Alexa Fluor 647單株抗體標識套組(Alexa Fluor 647 Monoclonal antibody labeling kit)(Invitrogen公司)製作105F抗體的螢光標識體。將L428細胞(由DSMZ取得)以MACS緩衝液洗淨2次後，懸浮於同溶液，添加標識化105F抗體，於4℃靜置30分鐘。以MACS緩衝液洗淨2次，以1% PFA固定細胞後，使用流式細胞儀(Facs Canto II，Becton Dickinson公司)進行檢測。數據解析係以Flowjo(TreeStar公司)進行，使用Horizon FVS450以閘將死細胞除外後，作成活細胞之FITC螢光強度的分佈圖。相對於L428細胞的螢光強度分佈圖，觀察到添加105F抗體的分佈圖之往強螢光強度側的位移，確認105F抗體結合至內源性地表現於細胞的GARP(第12圖)。
3)-2使用人類Treg之流動式細胞測量術解析
健康人的末梢血液單核白血球(PBMC)係使用Ficoll-Paque PLUS(GE Healthcare公司)進行分離，使用添加10% FBS的RPMI1640培養基(Invitrogen公司)(以下，稱為RP-F10培養基)，並使用低附著性24孔盤(Costar公司)，以2×106細胞/mL進行接種。添加抗CD3抗體(BD Pharmingen公司)與抗CD28抗體(BD Pharmingen公司)而培養20小時後，將細胞懸浮於FACS緩衝液(添加10mM Hepes(Invtrogen公司)、2mM EDTA(Invitrogen公司)、2%FBS之HBSS(Invitrogen公司))，添加3)-1所製備的標 識化105F抗體及Alexa Fluor 647標識抗GARP抗體(G14D9，eBioscience公司)於冰中靜置30分鐘。再次以FACS緩衝液將細胞洗淨後，添加固定/滲透作業溶液(Fixsation/Permeabilization working solution)(eBioscience公司)並進一步於冰中靜置30分鐘，使用滲透緩衝液(Permeabilization buffer)(eBioscience公司)將細胞洗淨後，添加2%大鼠血清(eBioscience公司)。於室溫靜置15分鐘後，添加PE標識抗Foxp3抗體(eBioscience公司)並進一步於室溫靜置30分鐘。細胞洗淨後，添加將4%三聚甲醛磷酸鹽緩衝溶液(Paraformaldehyde phosphate buffer solution)(和光純藥公司)以D-PBS(Invitrogen公司)稀釋成2倍的組織固定液，於4℃靜置15分鐘以上。以FACS緩衝液將細胞洗淨後，使用流式細胞儀(Facs Canto II：Becton Dickinson公司)測定，以FlowJo(Tree Star公司)進行解析。其結果，105F抗體係與市售的抗GARP抗體同樣地，顯示結合於FoxP3陽性Treg(第13圖)。
實施例4. 抗GARP抗體的性質
4)-1 ADCC活性
4)-1-1 效應細胞(effector cell)的製備
藉由上述3)-2的方法將PBMC由健康人的新鮮末梢血液分離。使用NK細胞分離套組(NK cell isolation kit)(Miltenyi Biotec公司)將NK細胞由PBMC純化。將所獲得的NK細胞於包含100IU/mL rhIL-2(Novartis公司)的RP-F10培養基(Invitrogen公司)中馴化培養一晚。以台盼藍(trypan blue)色素排除試驗計量活細胞數，以RP-F10 培養基再懸浮使活細胞密度成為2×105細胞/mL，而作為效應細胞。
4)-1-2 標的細胞的製備
將實施例3)-1所記載的L428細胞，於含有10% FBS的RPMI1640培養基(Invitrogen公司)中，相對於0.6×106個而混合鉻-51(51Cr)30μL(1110kBq)，在37℃、5% CO2的條件下培養2小時，藉此標識細胞。將經標識的細胞以含有10% FBS的RPMI1640培養基(Invitrogen公司)洗淨3次，以RP-F10培養基再懸浮使其成為4×104細胞/mL，而作為標的細胞。
4)-1-3 51Cr釋放分析
將以RP-F10培養基稀釋製備使分析最終濃度成為1、10、100、1000ng/mL的105F抗體各自分注50μL/孔至96孔U型底微量盤(microplate)(Costar公司)，添加標的細胞(50μL/孔)，於4℃靜置30分鐘。接著，添加效應細胞(100μL/孔)，在5% CO2的條件下於37℃培養4小時後，將上清液50μL/孔回收至LumaPlate(PerkinElmer公司)，以伽瑪計數器(gamma counter)測定所放出的伽瑪射線量。因ADCC活性造成之細胞溶解率係以下式算出。
細胞溶解率(%)=(A-B)/(C-B)×100
A：樣本孔的計數
B：自然放出(抗體、效應細胞未添加孔)計數的平均值(n=3)。在抗體添加時與效應細胞添加時係各自添加RP-F10培養基50μL、100μL。除此之外係進行與樣本孔 同樣的操作。
C：最大放出(以界面活性劑使標的細胞溶解的孔)計數的平均值(n=3)。在抗體添加時係添加RP-F10培養基50μL，在效應細胞添加時係添加含有2%(v/v)Triton-X100(Sigma公司)的RP-F10培養基100μL。除此之外係進行與樣本孔同樣的操作。
將測定結果示於第14圖。105F抗體對於L428細胞係抗體濃度依賴性地顯示細胞溶解活性。另一方面，關於對照組人類IgG並未觀察到細胞溶解活性。由此，係顯示105F抗體對於表現內源性GARP的L428細胞具有ADCC活性。另外，於基於專利文獻1所記載的序列情報所製作的人類IgG1抗GARP抗體(MHG8及LHG10)並未觀察到ADCC活性。
4)-2 Treg機能抑制活性
4)-2-1 Treg、Teff(效應T細胞(effector T cell)：CD4陽性CD25陰性輔助型T細胞)及輔助細胞的製備
使用CD4 T細胞分離套組(CD4 T cell ISOLATION Kit)(Miltenyi Biotec公司)，由與4)-1-1同樣製備的PBMC分離CD4陽性T細胞，添加FITC標識抗CD4抗體(Miltenyi Biotec公司)及APC標識抗CD25抗體(Miltenyi Biotec公司)，於4℃靜置30分鐘。細胞洗淨後，以MACS緩衝液懸浮，使用FACS Aria IIu(Becton Dickinson公司)分離CD4陽性CD25陰性細胞(Teff)及CD4陽性CD25強陽性細胞(Treg)。
另一方面，使用CD3微珠(CD3 Microbeads)(M iltenyi Biotec公司)自PBMC除去CD3陽性細胞後，使用X射線照射裝置(Hitachi Medical公司)照射照射劑量1C/kg(吸收劑量38.76Gy/kg(3876Rad/kg))的X射線而製備輔助細胞。
4)-2-2 共培養方法與Treg機能抑制分析
於培養基係使用含有青黴素-鏈黴素(Penicillin Streptomycin)(Invitrogen公司)、1×MEM NEAA(Invitrogen公司)、1×丙酮酸鈉(Invitrogen公司)、5mM Hepes及5%人類雄性AB血清(Human male AB serum)(Sigma公司)的RPMI1640培養基(Invitrogen公司)。於96孔U型底微量盤之各孔中，混合Teff(2000細胞/孔)與輔助細胞(20000細胞/孔)，進一步以Treg成為500細胞/孔之方式進行添加接種。又，亦製備未添加Treg的群組。以最終濃度50或10μg/mL添加抗CD3抗體及抗CD28抗體、以及105F抗體，在37℃、5% CO2的條件下培養5日。之後，將[3H]-胸腺嘧啶(PerkinElmer公司)製備成18.5kBq/mL並各自添加20μL/孔，進一步繼續培養18小時。使用細胞收穫機(cell harvester)(Mach II，Tomtech公司)將細胞回收於Filtermat A(PerkinElmer公司)，使用閃爍計數器(MicroBeta，PerkinElmer公司)，將各孔之[3H]-胸腺嘧啶之細胞內攝入值以每一分鐘的校正計數值(CCPM，corrected countper minute)來計量。
針對基於專利文獻1所記載的序列情報所製作的人類IgG1抗GARP抗體(MHG8及LHG10)，亦同樣供給至本試驗系統。
4)-2-3 抑制活性的算出
算出各共培養條件之3孔的平均值，相較於Teff單獨的增殖活性值，將加入Treg的共培養系中被減少的Teff增殖活性值作為「因Treg造成之對Teff的增殖抑制率」(=1-[共培養之CCPM/Teff單獨的CCPM])。
相對於抗體未添加時之因Treg造成之抑制率，將在添加各自的抗體時被抑制的抑制率(=[抗體未添加時的抑制率]-[各抗體添加時的抑制率])作為各抗體之Treg機能的抑制活性。另外，該抑制活性係針對每個供與至各實驗的檢體所算出的結果。
將105F抗體50μg/mL的Treg機能抑制結果(抑制率72.6%)示於第15圖，將105F抗體、MHG-8及LHG-10抗體之10μg/mL的結果示於第16圖。於MHG-8、LHG-10抗體並未觀察到Treg機能抑制活性(抑制率0.8%、0.0%)，但105F抗體係顯示顯著地抑制Treg機能(抑制率65.8%)。另外，將[非專利文獻10]有記載之因導入有對GARP的siRNA之Treg造成之上述抑制率，以第5A圖之CD4+CD25-(Teff)：Treg為4：1的圖值計量而估計時，則為15%左右。
實施例5：大鼠抗體的製作
5)-1 GARP表現載體的製備
GARP表現載體係使用實施例2所記載的表現載體，於大量製備係使用EndoFree Plasmid Giga Kit(QIAGEN公司)。
5)-2 大鼠免疫
免疫係使用WKY/Izm大鼠的雌性(Japan SLC公司)。首先將大鼠兩足小腿部以玻尿酸酶(SIGMA-ALDRICH公司)前處理後，於同部位肌肉注射GARP表現載體。接著，使用ECM830(BTX公司)，並使用2針狀電極，於同部位實施活體內電穿孔。於兩週間重複一次同樣的活體內電穿孔後，採取大鼠的淋巴結或脾臓，用於融合瘤製作。
5)-3融合瘤的製作
使用LF301細胞融合裝置(LF301 Cell Fusion Unit)(BEX公司)將淋巴結或脾臓細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0-ag14細胞(ATCC，No.CRL-1581)進行電細胞融合，於ClonaCell-HY選擇培養基D(ClonaCell-HY Selection Medium D)(StemCell Technologies公司)稀釋而培養。藉由回收出現的融合瘤群落而製作單殖株融合瘤。培養所回收的各融合瘤群落，使用所獲得的融合瘤培養上清液進行抗GARP抗體產生融合瘤的篩選。
5)-4 利用細胞-ELISA(Cell-ELISA)法之抗體篩選
5)-4-1 Cell-ELISA用抗原基因表現細胞的製備
將293α細胞(源自表現整合素(integrin)αv及整合素β3的HEK-293細胞(ATCC：CRL-1573)之穩定表現細胞株)以於含有10% FBS的DMEM培養基(Invitrogen公司)中成為7.5×105細胞/mL的方式製備。按照使用Lipofectamine 2000(Life Technologies公司)的轉染程序，對其導入GARP表現載體或作為陰性對照組的pcDNA3.1(+)載體， 各自分注50μl於96-孔半區培養盤(96-Half area well plate)(Corning公司)，於含有10% FBS的DMEM培養基中，在37℃、5% CO2的條件下培養24~27小時。將獲得的導入細胞維持接著狀態使用於Cell-ELISA。
5)-4-2 Cell-ELISA
除去實施例5)-4-1所製備之導入有表現載體的293α細胞之培養上清液後，對於導入有GARP表現載體或pcDNA3.1(+)載體的293α細胞各自添加融合瘤培養上清液，於4℃靜置1小時。將孔中的細胞以含有5% FBS的PBS(+)洗淨1次後，加入以含有5% FBS的PBS稀釋成500倍之於兔子製作的抗大鼠IgG-過氧化酶抗體(Anti-Rat IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit)(SIGMA公司)，於4℃靜置1小時。將孔中的細胞以含有5% FBS的PBS(+)洗淨3次後，以50μl/孔添加OPD呈色液(使o-苯二胺二鹽酸鹽(和光純藥公司)、H2O2各自以成為0.4mg/ml、0.6%(v/v)的方式溶解於OPD溶解液(0.05M檸檬酸三鈉、0.1M磷酸氫二鈉‧12水pH4.5))。一邊不時攪拌一邊進行呈色反應，以50μl/孔添加1M HCl使呈色反應停止後，以盤式分析儀(ENVISION：PerkinElmer公司)測定490nm的吸光度。為了選擇產生特異性地結合於表現在細胞膜表面上的人類GARP之抗體的融合瘤，與導入有對照組的pcDNA3.1(+)293α細胞比較，於導入有GARP表現載體的293α細胞，將產生顯示更高吸光度的培養上清液之融合瘤作為抗人類GARP抗體產生陽性而選擇。
5)-5 利用流動式細胞測量術法之抗體篩選
5)-5-1 流動式細胞測量術解析用抗原基因表現細胞的製備
將HEK-293T細胞(由ATCC取得)以成為5×104細胞/cm2的方式接種於225cm2燒瓶(Sumitomo Bakelite公司)，於含有10% FBS的DMEM培養基中，在37℃、5% CO2的條件下培養一晚。翌日，將GARP表現載體、作為陰性對照組的pcDNA3.1(+)載體各自使用Lipofectamine 2000而導入至HEK-293T細胞，在37℃、5% CO2的條件下進一步培養一晚。翌日，將導入有表現載體的HEK-293T細胞以TrypLE Express(Life Technologies公司)處理，以含有10% FBS的DMEM培養基將細胞洗淨後，懸浮於含有5% FBS的PBS。將所獲得的細胞懸浮液使用於流動式細胞測量術解析。
5)-5-2 流動式細胞測量術解析
將於實施例5)-4-2之Cell-ELISA被判定為陽性的融合瘤所產生的抗體之對人類GARP的結合特異性，藉由流動式細胞測量術解析進一步確認。
將實施例5)-5-1所製備之暫時性表現HEK-293T細胞的懸浮液離心，除去上清液後，對各自添加融合瘤培養上清液而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，加入以含有5% FBS的PBS稀釋成500倍的抗大鼠IgG FITC結合物(Anti-Rat IgG FITC conjugate)(SIGMA公司製)而懸浮，於4℃靜置1小時。以含有5% FBS的PBS洗淨2次後，再懸浮於包含2μg/ml 7-胺基放線菌素D(7-aminoactinomycin D)(Molecular Probes公司)之含有5% FBS的PBS，以流式細胞儀(FC500：BeckmanCoulter公司製)進行檢測。數據解析係以Flowjo(TreeStar公司製)進行。以閘將7-胺基放線菌素D陽性的死細胞除外後，作成活細胞之FITC螢光強度的分佈圖。相對於導入有作為對照組的pcDNA3.1載體之HEK-293T細胞的螢光強度分佈圖，將產生導入有GARP表現載體之HEK-293T細胞的分佈圖位移至強螢光強度側的抗體之融合瘤，選擇作為結合於人類GARP的抗體產生融合瘤(113殖株)。
5)-6 單株抗體的製備
5)-6-1 融合瘤151D、198D的培養
自5)-5-2所取得的大鼠抗人類GARP抗體產生融合瘤之中，選出暗示強烈結合於人類GARP之151D、198D。
大鼠抗GARP單株抗體係自融合瘤培養上清液純化。
首先，將大鼠抗GARP單株抗體產生融合瘤以ClonaCell-HY選擇培養基E(ClonaCell-HY Selection Medium E)使其增殖至充足量，培養基交換成添加有超低IgG FBS(Ultra Low IgG FBS)(Life Technologies公司)20%的Hybridoma SFM(Life Technologies公司)後，將8~9×107細胞的融合瘤接種於1272cm2燒瓶(Corning公司)培養7日。將本培養上清液藉由離心而回收，並通過0.8μm的過濾器後，進一步通過0.45μm的過濾器(Corning公司)進行滅菌。
5)-6-2 單株抗體的純化
自實施例5)-6-1所製備的融合瘤之培養上清液，將抗體以蛋白質G親和性層析純化。使抗體吸附於蛋白質G管柱(GE Healthcare Bioscience公司)，以PBS洗淨管柱後，以0.1M甘胺酸/鹽酸水溶液(pH2.7)進行溶析。於溶析液中加入1M Tris-HCl(pH9.0)而調整成pH7.0~7.5後，藉由透析(Thermo Scientific公司，Slide-A-Lyzer透析卡匣(Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette))而進行緩衝液取代成PBS。以離心式UF過濾裝置VIVASPIN20(Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20)(分劃分子量UF30K，Sartorius公司)濃縮抗體，將抗體濃度製備成0.7mg/mL以上。最後，以Minisart-Plus過濾器(Minisart-Plus filter)進行過濾，作為純化樣本。
實施例6 大鼠抗體的選殖與人類嵌合抗體的製作
6)-1 大鼠抗體151D之cDNA的選殖與序列的確定
6)-1-1 自151D產生融合瘤之總RNA(total RNA)的製備
為了增幅包含151D之可變區的cDNA，使用TRIzol試劑(Ambion公司)由151D產生融合瘤製備總RNA。
6)-1-2 利用5’-RACE PCR之包含151D的重鏈可變區之cDNA的增幅與序列的確定
包含重鏈可變區之cDNA的增幅係使用由實施例6)-1-1所製備的總RNA之約1μg與SMARTer RACE cDNA增殖套組(SMARTer RACE cDNA Amplification Kit)(Clontech公司)而實施。
作為用於以PCR增幅151D的重鏈基因之可變區的cDNA之引子，係使用自UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMARTer RACE cDNA增殖套組)、及周知的大鼠重鏈之恒定區的序列所設計的引子。
將以5’-RACE PCR增幅之包含重鏈可變區之cDNA選殖至質體，接著實施重鏈可變區之cDNA的核苷酸序列之序列解析。
將經確定之編碼151D的重鏈可變區之cDNA的核苷酸序列示於序列識別號14，將胺基酸序列示於序列識別號15。
6)-1-3 利用5’-RACE PCR之包含151D的輕鏈可變區之cDNA的增幅與序列的決定
以與實施例6)-1-2同樣的方法實施。惟，作為用於以PCR增幅151D的輕鏈基因之可變區的cDNA之引子，係使用自UPM(Universal Primer A Mix：附屬於SMARTer RACE cDNA增殖套組)、及周知的大鼠輕鏈之恒定區的序列所設計的引子。
將經確定之編碼151D的輕鏈可變區之cDNA的核苷酸序列示於序列識別號16，將胺基酸序列示於序列識別號17。
6)-2 大鼠抗體198D之cDNA的選殖與序列的確定
以與實施例2)-1同樣的方法確定序列。
將經確定之編碼198D的重鏈可變區之cDNA的核苷酸序列示於序列識別號18，將胺基酸序列示於序列識別 號19。將編碼輕鏈可變區之cDNA的核苷酸序列示於序列識別號20，將胺基酸序列示於序列識別號21。
6)-3 人類嵌合抗體表現載體的製作
6)-3-1 人類嵌合輕鏈表現載體pCMA-LK的構築
將以限制酶XbaI及PmeI消化質體pcDNA3.3-TOPO/LacZ(Invitrogen公司)所得之約5.4kb的片段、與序列識別號22所示之包含編碼人類輕鏈訊息序列及人類κ鏈恒定區的DNA序列之DNA片段，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司)而結合，製作pcDNA3.3/LK。
藉由自pcDNA3.3/LK除去新黴素表現單元，而構築pCMA-LK。
6)-3-2 人類嵌合IgG1型重鏈表現載體pCMA-G1的構築
將以XbaI及PmeI消化pCMA-LK而去掉輕鏈訊息序列及人類κ鏈恒定區的DNA片段、與序列識別號23所示之包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1恒定區之胺基酸的DNA序列之DNA片段，使用In-Fusion Advantage PCR選殖套組(CLONTECH公司)而結合，構築pCMA-G1。
6)-3-3 人類嵌合151D重鏈表現載體的構築
藉由將實施例2)-1所得之編碼大鼠抗體151D重鏈可變區的cDNA作為模板，以設計為In-fusion選殖用的引子進行PCR，而增幅包含編碼重鏈可變區的cDNA之DNA片段。藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)將增幅的DNA片段插入至將pCMA-G1以限制酶BIpI切斷 處，而構築人類嵌合151D重鏈表現載體。
將人類嵌合151D重鏈的核苷酸序列及該重鏈的胺基酸序列各自示於序列識別號24及序列識別號25。
6)-3-4 人類嵌合151D輕鏈表現載體的構築
藉由將實施例6)-1所得之編碼151輕鏈可變區的cDNA作為模板，以設計為In-fusion選殖用的引子進行PCR，而增幅包含編碼輕鏈可變區的cDNA之DNA片段。藉由使用In-Fusion HD PCR選殖套組(Clontech公司)將增幅的DNA片段插入至將pCMA-LK以限制酶BsiWI切斷處，而構築人類嵌合151D輕鏈表現載體。
將人類嵌合151D輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈的胺基酸序列各自示於序列識別號26及序列識別號27。
6)-3-5 人類嵌合198D重鏈表現載體的構築
將實施例6)-2所得之編碼大鼠抗體198D重鏈可變區的cDNA作為模板，以與實施例6)-3-3同樣的方法構築人類嵌合198D重鏈表現載體。
將人類嵌合198D重鏈的核苷酸序列及該重鏈的胺基酸序列各自示於序列識別號28及序列識別號29。
6)-3-6 人類嵌合198D輕鏈表現載體的構築
將實施例6)-2所得之編碼198D輕鏈可變區的cDNA作為模板，以與實施例6)-3-3同樣的方法構築人類嵌合198D輕鏈表現載體。
將人類嵌合198D輕鏈的核苷酸序列及該輕鏈的胺基酸序列各自示於序列識別號30及序列識別號31。
6)-4 人類嵌合抗體的製備
6)-4-1 人類嵌合抗體的生產
FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)係按照手冊進行繼代、培養。將對數增殖期的1×108個FreeStyle 293F細胞(Invitrogen公司)接種於250mL Fernbach Erlenmeyer燒瓶(Fernbach Erlenmeyer Flask)(CORNING公司)，以FreeStyle293表現培養基(FreeStyle293 expression medium)(Invitrogen公司)稀釋而製備成2.0×106細胞/mL。
於5mL的Opti-Pro SFM培養基(Invitrogen公司)中加入20μg的重鏈表現載體、30μg的輕鏈表現載體、及150μg的聚乙亞胺(Polyethyleneimine)(Polyscience #24765)並緩緩攪拌，在進一步放置5分鐘後，添加FreeStyle 293F細胞。
於37℃、8% CO2培養箱以125rpm振盪培養4小時後，添加50mL的EX-CELL VPRO培養基(SAFC Biosciences公司)、0.36mL的GlutaMAX I(GIBCO公司)、及2.5mL的Yeastolate Ultrafiltrate(GIBCO公司)，於37℃、8% CO2培養箱以125rpm振盪培養7日，將所獲得的培養上清液以250mL過濾系統(Filter System)(CORNING公司#431096)過濾。
將藉由人類嵌合151D重鏈表現載體與人類嵌合151D輕鏈表現載體之組合所取得的人類嵌合151D抗體命名為「c151D」，將藉由人類嵌合198D重鏈表現載體與人類嵌合198D輕鏈表現載體之組合所取得的人類嵌合198D抗體命名為「c198D」。
6)-4-2 嵌合抗體的純化
將實施例6)-4-1所得的培養上清液以rProtein A親和性層析之1階段步驟進行純化。將培養上清液施用於經PBS平衡化之填充有MabSelectSuRe的管柱(GE Healthcare Bioscience公司製)後，以管柱容量2倍以上的PBS將管柱洗淨。接著，以2M精胺酸鹽酸鹽溶液(pH4.0)進行溶析，收集含有抗體的劃份。將該劃份以離心式UF過濾裝置VIVASPIN20(分劃分子量UF30K，Sartorius公司)進行緩衝液取代成PBS，並進行抗體的濃縮，將抗體濃度製備成1mg/mL以上。最後以Minisart-Plus過濾器(Sartorius公司)過濾，作為純化樣本。
6)-5 人類嵌合抗體之對人類GARP的結合性評價
實施例6)-4所製作的c151D及c198D與人類GARP的解離常數測定，係使用Biacore T200(GE Healthcare Bioscience公司製)，藉由將抗體作為配位體而捕捉(capture)於經固定化的蛋白質A，並將抗原(重組人類GARP：R & D Systems公司)作為分析物而測定的捕捉法來進行。使用HBS-EP+(GE Healthcare Bioscience公司製)作為電泳緩衝液(running buffer)，使用蛋白質A(GE Healthcare Bio-Sciences(股))作為感測晶片(sensor chip)。
在晶片上以10μL/min添加1μg/mL的人類嵌合化抗體20秒鐘後，以流速30μl/分鐘添加抗原的稀釋系列溶液(8~128nM)120秒鐘，接著監測480秒鐘的解離相。作為再生溶液，係以流速20μl/分鐘添加甘胺酸1.5(Glycine 1.5)(GE Healthcare Bioscience公司製)30秒 鐘。
於數據的解析係使用1：1結合模式，算出結合速率常數ka、解離速率常數kd及解離常數(KD；KD=kd/ka)。
將結果示於表1。
實施例7 人源化抗體的製作
7)-1 c151D抗體之可變區的分子模擬
c151D抗體之可變區的分子模擬係藉由就同源性模擬而言一般周知的方法(Methods in Enzymology,203,121-153,(1991))來實行。
將登錄於蛋白質資料庫(Protein Data Bank)(Nuc.Acid Res.28,235-242(2000))之人類免疫球蛋白之可變區的一級序列(可取得自X射線結晶構造所誘導的三維構造)，與c151D抗體的可變區比較。
可變區的三維構造係藉由組合相對於c151D抗體的重鏈及輕鏈以及此等界面具有高序列同源性之模型的座標，得到「框架模型(framework model)」而製作。
接著，將關於各自之CDR之代表性的構形(conformation)組入框架模型。
最後，進行用以除去於能量的點不利的原子間 接觸之能量最小化計算。上述程序係使用Discovery Studio(Dassault Systèmes(股))進行。
7)-2 對人源化151D抗體之胺基酸序列的設計
藉由就CDR接枝(CDR-grafting)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))而言一般周知的方法，進行人源化151D抗體的構築。受體抗體(acceptor antibody)係基於框架區內的胺基酸同源性而選擇。
將c151D抗體之框架區的序列與人類之子群(subgroup)‧共通(consensus)序列的框架區比較。就結果而言，由於在KABAT et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Se rvice National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))中既定的人類γ鏈子群3的共通序列、與人類κ鏈子群1及人類κ鏈子群4的共通序列係於其框架區具有高序列同源性，而被選擇作為受體。
使關於人類γ鏈子群3的共通序列、與人類κ鏈子群1及人類κ鏈子群4的共通序列之框架區的胺基酸殘基，與關於c151D抗體的胺基酸殘基並列，鑑定使用相異胺基酸的位置。此等殘基的位置係使用上述7)-1所構築之c151D抗體的三維模型而分析，而應接枝於受體上的供體殘基(donor residue)，係藉由依據Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))所給予的基準而被選擇。
藉由將所選擇的幾個供體殘基移入至受體抗體，而如以下的實施例所記載地構築人源化h151D的序列。
7)-3 人源化151D重鏈h151D-H的設計
7)-3-1 h151D-H1型重鏈
將伴隨下述所設計的人源化151D重鏈命名為「h151D-H1型重鏈」：將序列表之序列識別號25所示的c151D重鏈之胺基酸編號第35號的精胺酸殘基置換成甘胺酸殘基，將第37號的離胺酸殘基置換成白胺酸殘基，將第38號的離胺酸殘基置換成精胺酸殘基，將第42號的絲胺酸殘基置換成丙胺酸殘基，將第61號的蘇胺酸殘基置換成甘胺酸殘基，將第62號的麩醯胺酸殘基置換成離胺酸殘基，將第68號的丙胺酸殘基置換成絲胺酸殘基，將第80號的精胺酸殘基置換成丙胺酸殘基，將第94號的丙胺酸殘基置換成絲胺酸殘基，將第96號的絲胺酸殘基置換成天冬醯胺酸殘基，將第103號的天冬胺酸殘基置換成天冬醯胺酸殘基，將第107號的絲胺酸殘基置換成丙胺酸殘基，將第112號的蘇胺酸殘基置換成纈胺酸殘基，將第130號的纈胺酸殘基置換成蘇胺酸殘基，將第131號的甲硫胺酸殘基置換成白胺酸殘基。
於編碼h151D-H1型重鏈的核苷酸序列(序列識別號32)中，編碼切除訊息序列之成熟重鏈者係由核苷酸編號58至1398構成的核苷酸序列，編碼可變區者係由核苷酸編號58至408構成的核苷酸序列，編碼恒定區者係由核苷酸編號409至1398構成的核苷酸序列。該可變區係具有於序列表之序列識別號32中編碼CDRH1之由核苷酸編號133至162構成的核苷酸序列、編碼CDRH2之由核苷酸編號205至234構成的核苷酸序列及編碼CDRH3之由核苷 酸編號352至375構成的核苷酸序列。
又，於h151D-H1型重鏈的胺基酸序列(序列識別號33)中，切除訊息序列之成熟重鏈係由胺基酸編號20至466構成的胺基酸序列，，可變區係由胺基酸編號20至136構成的胺基酸序列，，恒定區係由胺基酸編號137至466構成的胺基酸序列。該可變區係具有序列表之序列識別號33中由胺基酸編號45至54所記載的胺基酸序列構成的CDRH1、由胺基酸編號69至78所記載的胺基酸序列構成的CDRH2及由胺基酸編號118至125所記載的胺基酸序列構成的CDRH3。
再者，序列識別號32及33之序列亦各自記載於第31及21圖。
7)-3-2 h151D_H4型重鏈
將伴隨下述所設計的人源化151D重鏈命名為「h151D_H4型重鏈」：將序列表之序列識別號25所示的c151D重鏈之胺基酸編號第35號的精胺酸殘基置換成甘胺酸殘基，第37號的離胺酸殘基置換成白胺酸殘基，第38號的離胺酸殘基置換成精胺酸殘基，第42號的絲胺酸殘基置換成丙胺酸殘基，第61號的蘇胺酸殘基置換成甘胺酸殘基，第62號的麩醯胺酸殘基置換成離胺酸殘基，第94號的丙胺酸殘基置換成絲胺酸殘基，第103號的天冬胺酸殘基置換成天冬醯胺酸殘基，第107號的絲胺酸殘基置換成丙胺酸殘基，第112號的蘇胺酸殘基置換成纈胺酸殘基，第130號的纈胺酸殘基置換成蘇胺酸殘基，第131號的甲硫胺酸殘基置換成白胺酸殘基。
於編碼h151D-H4型重鏈的核苷酸序列(序列識別號34)中，編碼切除訊息序列之成熟重鏈者係由核苷酸編號58至1398構成的核苷酸序列，編碼可變區者係由核苷酸編號58至408構成的核苷酸序列，編碼恒定區者係由核苷酸編號409至1398構成的核苷酸序列。該可變區係具有序列表之序列識別號34中編碼CDRH1之由核苷酸編號133至162構成的核苷酸序列、編碼CDRH2之由核苷酸編號205至234構成的核苷酸序列及編碼CDRH3之由核苷酸編號352至375構成的核苷酸序列。
又，於h151D-H4型重鏈的胺基酸序列(序列識別號35)中，切除訊息序列之成熟重鏈係由胺基酸編號20至466構成的胺基酸序列，可變區係由胺基酸編號20至136構成的胺基酸序列，恒定區係由胺基酸編號137至466構成的胺基酸序列。該可變區係具有序列表之序列識別號35中由胺基酸編號45至54所記載的胺基酸序列構成的CDRH1、由胺基酸編號69至78所記載的胺基酸序列構成的CDRH2及由胺基酸編號118至125所記載的胺基酸序列構成的CDRH3。
再者，序列識別號34及35之序列亦各自記載於第33及23圖。
7)-4 人源化151D輕鏈h151D_L的設計
7)-4-1 h151D-L1型輕鏈
將伴隨下述所設計的人源化151D輕鏈命名為「h151D_L1型輕鏈」：將序列表之序列識別號27所示的c151D輕鏈之胺基酸編號第29號的蘇胺酸殘基置換成天 冬胺酸殘基，第31號的甲硫胺酸殘基置換成白胺酸殘基，第32號的苯丙胺酸殘基置換成丙胺酸殘基，第33號的異白胺酸殘基置換成纈胺酸殘基，第35號的纈胺酸殘基置換成白胺酸殘基，第37號的天冬胺酸殘基置換成麩胺酸殘基，第39號的纈胺酸殘基置換成丙胺酸殘基，第41號的甲硫胺酸殘基置換成異白胺酸殘基，第60號的蘇胺酸殘基置換成脯胺酸殘基，第83號的蘇胺酸殘基置換成絲胺酸殘基，第97號的天冬醯胺酸殘基置換成絲胺酸殘基，第98號的甲硫胺酸殘基置換成白胺酸殘基，第103號的白胺酸殘基置換成纈胺酸殘基，第120號的蘇胺酸殘基置換成麩醯胺酸殘基，第124號的白胺酸殘基置換成纈胺酸殘基，第126號的白胺酸殘基置換成異白胺酸殘基，第127號的天冬醯胺酸殘基置換成離胺酸殘基，第129號的丙胺酸殘基置換成蘇胺酸殘基。
於編碼h151D-L1型輕鏈的核苷酸序列(序列識別號36)中，編碼切除訊息序列之成熟輕鏈者係由核苷酸編號61至702構成的核苷酸序列，編碼可變區者係由核苷酸編號61至387構成的核苷酸序列，編碼恒定區者係由核苷酸編號388至702構成的核苷酸序列。該可變區係具有序列表之序列識別號36中編碼CDRH1之由核苷酸編號130至162構成的核苷酸序列、編碼CDRH2之由核苷酸編號208至228構成的核苷酸序列及編碼CDRH3之由核苷酸編號325至351構成的核苷酸序列。
又，於h151D_L1型輕鏈的胺基酸序列(序列識別號37)中，切除訊息序列之成熟輕鏈係由胺基酸編號21 至234構成的胺基酸序列，可變區係由胺基酸編號21至129構成的胺基酸序列，恒定區係由胺基酸編號130至234構成的胺基酸序列。該可變區係具有序列表之序列識別號37中由胺基酸編號44至54所記載的胺基酸序列構成的CDRH1、由胺基酸編號70至76所記載的胺基酸序列構成的CDRH2及由胺基酸編號109至117所記載的胺基酸序列構成的CDRH3。
再者，序列識別號36及37之序列亦各自記載於第32及22圖。
7)-4-2 h151D-L4型輕鏈：
將伴隨下述所設計的人源化151D輕鏈命名為「h151D-L4型輕鏈」：將序列表之序列識別號27所示的c151D輕鏈之胺基酸編號第29號的蘇胺酸殘基置換成絲胺酸殘基，第31號的甲硫胺酸殘基置換成白胺酸殘基，第32號的苯丙胺酸殘基置換成絲胺酸殘基，第33號的異白胺酸殘基置換成丙胺酸殘基，第41號的甲硫胺酸殘基置換成異白胺酸殘基，第60號的蘇胺酸殘基置換成脯胺酸殘基，第62號的麩醯胺酸殘基置換成離胺酸殘基，第83號的蘇胺酸殘基置換成絲胺酸殘基，第97號的天冬醯胺酸殘基置換成絲胺酸殘基，第98號的甲硫胺酸殘基置換成白胺酸殘基，第100號的丙胺酸殘基置換成脯胺酸殘基，第103號的白胺酸殘基置換成苯丙胺酸殘基，第105號的纈胺酸殘基置換成蘇胺酸殘基，第120號的蘇胺酸殘基置換成麩醯胺酸殘基，第124號的白胺酸殘基置換成纈胺酸殘基，第126號的白胺酸殘基置換成異白胺酸殘基， 第127號的天冬醯胺酸殘基置換成離胺酸殘基，第129號的丙胺酸殘基置換成蘇胺酸殘基。
於編碼h151D-L4型輕鏈的核苷酸序列(序列識別號38)中，編碼切除訊息序列之成熟輕鏈者係由核苷酸編號61至702構成的核苷酸序列，編碼可變區者係由核苷酸編號61至387構成的核苷酸序列，編碼恒定區者係由核苷酸編號388至702構成的核苷酸序列。該可變區係具有序列表之序列識別號38中編碼CDRH1之由核苷酸編號130至162構成的核苷酸序列、編碼CDRH2之由核苷酸編號208至228構成的核苷酸序列及編碼CDRH3之由核苷酸編號325至351構成的核苷酸序列。
又，h151D-L4型輕鏈的胺基酸序列(序列識別號39)中，切除訊息序列之成熟輕鏈係由胺基酸編號21至234構成的胺基酸序列，可變區係由胺基酸編號21至129構成的胺基酸序列，恒定區係由胺基酸編號130至234構成的胺基酸序列。該可變區係具有序列表之序列識別號39中由胺基酸編號44至54所記載的胺基酸序列構成的CDRH1、由胺基酸編號70至76所記載的胺基酸序列構成的CDRH2及由胺基酸編號109至117所記載的胺基酸序列構成的CDRH3。
再者，序列識別號38及39的序列亦各自記載於第34及24圖。
7)-5 c198D之可變區的分子模擬
c198D抗體之可變區的分子模擬係藉由就同源性模擬而言一般周知的方法(Methods in Enzymology,203, 121-153,(1991))來實行。將登錄於蛋白質資料庫(Nuc.Acid Res.28,235-242(2000))之人類免疫球蛋白之可變區的一級序列(可取得自X射線結晶構造所誘導的三維構造)，與c198D抗體的可變區比較。
可變區的三維構造係藉由組合相對於c198D抗體的重鏈及輕鏈以及此等界面具有高序列同源性之模型的座標，得到「框架模型」而製作。
接著，將關於各自之CDR之代表性的構形組入框架模型。
最後，進行用以除去於能量的點不利的原子間接觸之能量最小化計算。上述程序係使用Discovery Studio(Dassault Systèmes(股))進行。
7)-6 對人源化198D之胺基酸序列的設計
藉由就CDR接枝(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))而言一般周知的方法，進行人源化198D抗體的構築。受體抗體係基於框架區內的胺基酸同源性而選擇。
將c198D抗體之框架區的序列與人類之子群.共通序列的框架區比較。就結果而言，由於在KABAT et al.(Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))中既定的人類γ鏈子群2的共通序列、與人類κ鏈子群1的共通序列係於其框架區具有高序列同源性，而被選擇作為受體。又，於重鏈之一部分的殘基中，移入人類γ鏈子群3的共通序列之殘基。
使關於包含一部分人類γ鏈子群3的共通序列之人類γ鏈子群2的共通序列、與人類κ鏈子群1的共通序列之框架區的胺基酸殘基，與關於c198D抗體的胺基酸殘基並列，鑑定使用相異胺基酸的位置。此等殘基的位置係使用上述7)-5所構築之c198D抗體的三維模型而分析，而應接枝於受體上的供體殘基，係藉由依據Queen et al.(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033(1989))所給予的基準而被選擇。
藉由將所選擇的幾個供體殘基移入至受體抗體，而如以下的實施例所記載地構築人源化h198D的序列。
7)-7 人源化198D重鏈h198D-H的設計
7)-7-1 h198D-H3型重鏈
將伴隨下述所設計的人源化198D重鏈命名為「h198D_H3型重鏈」：將序列表之序列識別號29所示的c198D重鏈之胺基酸編號第20號的麩醯胺酸殘基置換成麩胺酸殘基，第24號的精胺酸殘基置換成纈胺酸殘基，第28號的脯胺酸殘基置換成甘胺酸殘基，第32號的麩醯胺酸殘基置換成離胺酸殘基，第61號的麩胺酸殘基置換成甘胺酸殘基，第80號的絲胺酸殘基置換成脯胺酸殘基，第81號的丙胺酸殘基置換成絲胺酸殘基，第86號的白胺酸殘基置換成纈胺酸殘基，第87號的絲胺酸殘基置換成蘇胺酸殘基，第95號的絲胺酸殘基置換成天冬醯胺酸殘基，第98號的苯丙胺酸殘基置換成絲胺酸殘基，第101號的甲硫胺酸殘基置換成白胺酸殘基，第103號的蘇胺酸殘基置換成絲胺酸殘基，第104號的白胺酸殘基置換成纈 胺酸殘基，第105號的麩醯胺酸殘基置換成蘇胺酸殘基，第106號的蘇胺酸殘基置換成丙胺酸殘基，第107號的麩胺酸殘基置換成丙胺酸殘基，第111號的甲硫胺酸殘基置換成纈胺酸殘基，第113號的苯丙胺酸殘基置換成酪胺酸殘基，第133號的丙胺酸殘基置換成蘇胺酸殘基，第134號的絲胺酸殘基置換成白胺酸殘基。
於編碼h198D-H3型重鏈的核苷酸序列(序列識別號40)中，編碼切除訊息序列之成熟重鏈者係由核苷酸編號58至1407構成的核苷酸序列，編碼可變區者係由核苷酸編號58至417構成的核苷酸序列，編碼恒定區者係由核苷酸編號418至1407構成的核苷酸序列。該可變區係具有序列表之序列識別號40中編碼CDRH1之由核苷酸編號130至162構成的核苷酸序列、編碼CDRH2之由核苷酸編號205至231構成的核苷酸序列及編碼CDRH3之由核苷酸編號349至384構成的核苷酸序列。
又，於h198D-H3型重鏈的胺基酸序列(序列識別號41)中，切除訊息序列之成熟重鏈係由胺基酸編號20至469構成的胺基酸序列，可變區係由胺基酸編號20至139構成的胺基酸序列，恒定區係由胺基酸編號140至469構成的胺基酸序列。
再者，序列識別號40及41之序列亦各自記載於第35及25圖。
7)-8 人源化198D輕鏈h198D-L的設計
7)-8-1 h198D-L4型輕鏈
將伴隨下述所設計的人源化198D輕鏈命名為「 h198D-L4型輕鏈」：將序列表之序列識別號31所示的c198D輕鏈之胺基酸編號第29號的丙胺酸殘基置換成絲胺酸殘基，第33號的甘胺酸殘基置換成丙胺酸殘基，第35號的白胺酸殘基置換成纈胺酸殘基，第37號的麩胺酸殘基置換成天冬胺酸殘基，第38號的蘇胺酸殘基置換成精胺酸殘基，第42號的麩醯胺酸殘基置換成蘇胺酸殘基，第65號的麩醯胺酸殘基置換成離胺酸殘基，第85號的甘胺酸殘基置換成絲胺酸殘基，第92號的絲胺酸殘基置換成蘇胺酸殘基，第94號的離胺酸殘基置換成蘇胺酸殘基，第98號的甲硫胺酸殘基置換成白胺酸殘基，第100號的蘇胺酸殘基置換成脯胺酸殘基，第103號的麩胺酸殘基置換成苯丙胺酸殘基，第104號的甘胺酸殘基置換成丙胺酸殘基，第105號的纈胺酸殘基置換成蘇胺酸殘基，第120號的絲胺酸殘基置換成麩醯胺酸殘基，第124號的白胺酸殘基置換成纈胺酸殘基，第129號的丙胺酸殘基置換成蘇胺酸殘基。
於編碼h198D-L4型輕鏈的核苷酸序列(序列識別號42)中，編碼切除訊息序列之成熟輕鏈者係由核苷酸編號61至702構成的核苷酸序列，編碼可變區者係由核苷酸編號61至387構成的核苷酸序列，編碼恒定區者係由核苷酸編號388至702構成的核苷酸序列。該可變區係具有序列表之序列識別號42中編碼CDRH1之由核苷酸編號130至162構成的核苷酸序列、編碼CDRH2之由核苷酸編號208至228構成的核苷酸序列及編碼CDRH3之由核苷酸編號325至351構成的核苷酸序列。
又，於h198D_L4型輕鏈的胺基酸序列(序列識別號43]中，切除訊息序列之成熟輕鏈係由胺基酸編號21至234構成的胺基酸序列，可變區係由胺基酸編號21至129構成的胺基酸序列，恒定區係由胺基酸編號130至234構成的胺基酸序列。
再者，序列識別號42及43之序列亦各自記載於第36及26圖。
7)-9 人源化抗體之表現載體的構築
7)-9-1人源化抗人類GARP抗體h151D-H1L1表現載體的構築
合成包含編碼序列表之序列識別號1所示的h151D-H1型重鏈的核苷酸序列之核苷酸編號58至1398所示的h151D-H1型重鏈之序列的DNA片段(GENEART公司人工基因合成服務)。使用所合成的DNA片段，按照BioWa公司及Lonza公司之Potelligent® CHOK1SV Technology的規程(protocol)，而構築h151D-H1型重鏈表現載體。將所構築的表現載體命名為「GSV-h151D-H1」。
接著，合成包含編碼序列表之序列識別號9所示的h151D-L1型輕鏈的核苷酸序列之核苷酸編號61至704所示的h151D-L1型輕鏈之序列的DNA片段(GENEART公司 人工基因合成服務)。
將所合成的DNA片段，按照BioWa公司及Lonza公司之Potelligent® CHOK1SV Technology的規程，而構築h151D-L1型重鏈表現載體。將構築的表現載體命名為 「GSV-h151D-L1」。
接著，自所構築的表現載體「GSV-h151D-H1」及「GSV-h151D-L1」，按照BioWa公司及Lonza公司之Potelligent® CHOK1SV Technology的規程，而構築MACA-1511a表現載體。將獲得的表現載體命名為「DGV-h151D-H1L1-GS」。
7)-9-2 人源化抗人類GARP抗體h151D_H4L4表現載體的構築
與實施例7)-9-1同樣地，合成包含編碼序列表之序列識別號34所示的h151D-H4型重鏈的核苷酸序列之核苷酸編號58至1398所示的h151D-H4型重鏈之序列的DNA片段、與包含編碼序列表之序列識別號15所示的h151D-L4型輕鏈的核苷酸序列之核苷酸編號61至704所示的h151D-L4型輕鏈之序列的DNA片段(GENEART公司人工基因合成服務)。
使用所合成的DNA片段，按照BioWa公司及Lonza公司之Potelligent® CHOK1SV Technology的規程，而構築MACA-1514a表現載體。將獲得的表現載體命名為「DGV-h151D-H4L4-GS」。
7)-9-3 人源化抗人類GARP抗體h198D_H3L4表現載體的構築
與實施例4)-9-1同樣地，合成包含編碼序列表之序列識別號40所示的h198D-_H3型重鏈的核苷酸序列之核苷酸編號58至1407所示的h198D-H3型重鏈之序列的DNA片段、與包含編碼序列表之序列識別號42所示的 h198D-L4型輕鏈的核苷酸序列之核苷酸編號61至704所示的h198D-L4型輕鏈之序列的DNA片段(GENEART公司人工基因合成服務)。
使用所合成的DNA片段，按照BioWa公司及Lonza公司之Potelligent® CHOK1SV Technology的規程，而構築MACA-1983a表現載體。將獲得的表現載體命名為「DGV-h198D-H3L4-GS」。
7)-10 人源化抗人類GARP抗體的製備
7)-10-1 人源化抗人類GARP抗體生產細胞的製作
7)-10-1-1 人源化抗人類GARP抗體h151D-H1L1生產細胞的製作
按照BioWa公司及Lonza公司之Potelligent® CHOK1SV Technology的規程，將實施例7)-9-1所構築的人源化抗人類GARP抗體h151D-H1L1表現載體DGV-h151D-H1L1-GS，轉染至Potelligent CHOK1SV細胞(BioWa公司及Lonza公司)，構築人源化抗人類GARP抗體h151D-H1L1生產株。將獲得的生產株命名為「MAC1-1」。
7)-10-1-2 人源化抗人類GARP抗體h151D-H4L4生產細胞的製作
與實施例7)-10-1-1同樣地，將實施例4)-9-2所構築的人源化抗人類GARP抗體h151D-H4L4表現載體DGV-h151D-H4L4-GS，轉染至Potelligent CHOK1SV細胞(BioWa公司及Lonza公司)，構築人源化抗人類GARP抗體h151D-H4L4生產株。將獲得的生產株命名為「MAC2-1」。
7)-10-1-3 人源化抗人類GARP抗體h198D-H3L4生產細胞的製作
與實施例7)-10-1-1同樣地，將實施例7)-9-3所構築的人源化抗人類GARP抗體h198D_H3L4表現載體DGV-h198D_H3L4-GS，轉染至Potelligent CHOK1SV細胞(BioWa公司及Lonza公司)，構築人源化抗人類GARP抗體h151D-H4L4生產株。將獲得的生產株命名為「MAC3-1」。
7)-10-2 人源化抗人類GARP抗體生產細胞的培養
7)-10-2-1 人源化抗人類GARP抗體h151D-H1L1生產細胞的培養
實施例7)-10-1-1所製作的人源化抗人類GARP抗體h151D-H1L1生產株「MAC1-1」的培養，係使用培養裝置Wave reactor(GE Healthcare Japan公司)來實施。將生產株「MAC1-1」使用Dsp04B(JX Energy公司)培養基進行解凍，於37℃、5% CO2培養箱內以120rpm進行培養。將獲得的培養液以C36(JX Energy公司)培養基稀釋，於37℃、5% CO2培養箱內以120rpm進行擴大培養。
將獲得的培養液以C36培養基稀釋使其成為細胞密度30×104細胞/mL，裝入WAVE CELLBAG(GE Healthcare Bioscience公司)，以37℃、5% CO2、空氣供給量0.3L/分鐘、搖動18-24rpm、角度6-8°培養13日。
由培養開始第3日起，以每1日、裝入量之6%份，每日添加FM4Ae2培養基(自家製備)。將獲得的培養 液以深層過濾器(depth filter)Millistak MC0HC054H1(Merck Millipore公司)粗過濾後，以附屬於Flexboy Bags的0.22μm過濾器(Sartorius公司)進行過濾。將此濾液命名為「MACA-1511a培養上清液」。
7)-10-2-2 人源化抗人類GARP抗體h151D_H4L4生產細胞的培養
與實施例7)-10-2-1同樣地，培養、擴大實施例7)-10-1-2所製作的人源化抗人類GARP抗體h151D-H4L4生產株「MAC2-1」，使用培養裝置Wave reactor(GE HEALTHCARE JAPAN公司)實施分批補料培養(fed-batch culture)。以C36培養基稀釋使其成為細胞密度30×104細胞/mL，裝入WAVE CELLBAG(GE Healthcare Bioscience公司)，培養13日。將獲得的培養液過濾，將此濾液命名為「MACA-1514a培養上清液」。
7)-10-2-3 人源化抗人類GARP抗體h198D-H3L4生產細胞的培養
與實施例7)-10-2-1同樣地，培養、擴大實施例7)-10-1-3所製作的人源化抗人類GARP抗體h198D-H3L4生產株「MAC3-1」，使用培養裝置Wave reactor(GE HEALTHCARE JAPAN公司)實施分批補料培養。以C36培養基稀釋使其成為細胞密度30×104細胞/mL，裝入WAVE CELLBAG(GE Healthcare Bioscience公司)，培養13日。將獲得的培養液過濾，將此濾液命名為「MACA-1983a培養上清液」。
7)-10-3 人源化抗人類GARP抗體的純化
7)-10-3-1 人源化抗人類GARP抗體h151D-H1L1的純化
將實施例7)-10-2-1所得之「MACA-1511a培養上清液」以rProteinA親和性層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析之三階段步驟來純化。
最初，將培養上清液施用於經PBS平衡化之rProteinA親和性層析樹脂。使培養液全部進入管柱後，以PBS、包含精胺酸的緩衝液、PBS將管柱洗淨。接著，以乙酸緩衝液進行溶析，回收280nm的吸收峰。將回收液以Tris緩衝液中和，以玻璃纖維過濾器AP20(Merck Millipore公司)粗過濾後，將經為0.22μm過濾器之Stericup-GV(Merck Millipore公司)過濾者作為rProteinA純化庫(purification pool)。
接著，將rProteinA純化庫施用於經PBS平衡化之陰離子交換層析樹脂。使施用液全部進入管柱後，使PBS通液。回收直接通過之劃份及PBS通液時之280nm的吸收峰。將回收液以乙酸作pH調整，以玻璃纖維過濾器AP20(Merck Millipore公司)粗過濾後，將經為0.22μm過濾器之Stericup-GV(Merck Millipore公司)過濾者作為AEX純化庫。
接著，將AEX純化庫施用於經乙酸緩衝液平衡化之陽離子交換層析樹脂。使施用液全部進入管柱後，以乙酸緩衝液將管柱洗淨。接著使用包含高濃度NaCl的乙酸緩衝液進行溶析，回收280nm的吸收峰。將回收液以玻璃纖維過濾器AP20(Merck Millipore公司)粗過濾後 ，將經為0.22μm過濾器之Stericup-GV(Merck Millipore公司)過濾者作為CEX純化庫。
將CEX純化庫以Pellicon 3 Cassette 30kDa(Merck Millipore公司)濃縮成抗體濃度25mg/mL後，取代成組胺酸緩衝液(25mM組胺酸、5%山梨糖醇(Sorbitor)、pH6.0)。最後以玻璃纖維過濾器AP20(Merck Millipore公司)粗過濾後，將經為0.22μm過濾器之Stericup-GV(Merck Millipore公司)過濾者作為純化樣本。將純化樣本命名為「h151D-H1L1」。
7)-10-3-2 人源化抗人類GARP抗體h151D-H4L4的純化
與實施例7)-10-3-1同樣地，將實施例7)-10-2-2所得之「MACA-1514a培養上清液」以rProteinA親和性層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析之三階段步驟來純化。將純化樣本命名為「h151D-H4L4」。
7)-10-3-3 人源化抗人類GARP抗體h198D-H3L4的純化
與實施例7)-10-3-1同樣地，將實施例7)-10-2-3所得之「MACA-1983a培養上清液」以rProteinA親和性層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析之三階段步驟來純化。將純化樣本命名為「h198D-H3L4」。
7)-11 人源化抗人類GARP抗體之對人類GARP的結合性評價
實施例7)-10所製作的人源化抗人類GARP抗體h151D-H1L1、h151D-H4L4及h151D-H3L4與GARP的解離常數測 定，係以使用Biacore T200(GE Healthcare Bioscience(股))，將抗體作為配位體而捕捉(capture)於經固定化的蛋白質A，並將抗原作為分析物而測定的捕捉法來進行。使用HBS-EP+(GE Healthcare Bioscience(股))作為電泳緩衝液，使用蛋白質A(GE Healthcare Bio-Sciences(股))作為感測晶片。
在晶片上以10μL/min添加1μg/mL的人類嵌合化抗體20秒鐘後，以流速30μl/分鐘添加抗原的稀釋系列溶液(8~128nM)120秒鐘，接著監測480秒鐘的解離相。作為再生溶液，係以流速20μl/分鐘添加甘胺酸1.5(Glycine 1.5)(GE Healthcare Bioscience(股))30秒鐘。
於數據的解析係使用1：1結合模式，算出結合速率常數ka、解離速率常數kd及解離常數(KD；KD=kd/ka)。
將結果示於表2。
實施例8：對抗原基因表現細胞之結合
8)-1 對GARP之結合
藉由實施例2所記載的方法，而製備導入有人類GARP表現載體及對照組載體之HEK-293T細胞懸浮液。 對所獲得的細胞懸浮液添加h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4、以及對照組人類IgG(human IgG：Eureka Therapeutics公司)，於4℃靜置15分鐘。
以FACS緩衝液(含有3% FBS的PBS(Invitrogen公司))洗淨2次後，加入R-藻紅素(PE)標識抗IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)及Horizon FVS450(Becton Dickinson公司)而懸浮，進一步於4℃靜置15分鐘。之後的流式細胞儀解析方法係與實施例2所記載的內容同樣地實施，作成PE螢光強度的分佈圖(第37圖)。
於導入有作為對照組載體之HEK-293T細胞，h151DH-1L1、h151D-H4L4、及h198D-_H3L4係顯示與對照組IgG同樣的螢光強度分佈圖(圖中係標記為經Mock載體轉染的HEK293T)。
另一方面，於GARP表現HEK-293T細胞(圖中係標記為經hGARP轉染的HEK293T)，確認h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D_H3L4之各自的分佈圖相對於對照組人類IgG的螢光強度分佈圖，係位移至強螢光強度側。
自以上的結果，可知h151D-H1L1、h151D-H4L4及h198D-H3L4係特異性地結合至GARP。
8)-2 對GARP-TGFβ1之結合
8)-2-1 人類GARP變異體表現載體的構築
將人類GARP表現載體(Origene公司)作為模板，使用引子F(cacggcaacctgctggagcggctgctgggggagg)(序列識別號44)、引子R(caggctgttcccagacaggtccag)(序列識別號45) 、及KOD-Plus-突變誘發套組(KOD-Plus-Mutagenesis Kit)(Toyobo公司)，確認構築將人類GARP胺基酸序列(序列識別號：1)之胺基酸序列編號137-139的YSG變換成HGN之人類GARP變異體表現載體的鹼基序列。
8)-2-2 GARP-TGFβ1的共表現
使用Lipofectamin2000(Invitrogen公司)，將人類TGFβ1表現載體(Sino Biological公司)與人類GARP表現載體或人類GARP變異體表現載體一起基因導入至HEK-293T細胞。
於含有10%FBS的DMEM培養基(Invitrogen公司)中，在5% CO2的條件下以37℃培養一晚後，藉由TrypLE Express(Invitrogen公司)處理而自盤回收細胞，以FACS緩衝液洗淨2次後，懸浮於同溶液。
對所獲得的細胞懸浮液添加本案發明之105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4、以及周知抗體(基於專利文獻1所記載的序列情報所製作的人類IgG1抗GARP抗體：MHG8、及LHG10)之各抗體、及對照組人類IgG(Eureka Therapeutics公司)，於4℃靜置15分鐘。
以FACS緩衝液洗淨2次後，加入PE標識抗1gG抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)及Horizon FVS450(Becton Dickinson公司)而懸浮，進一步於4℃靜置15分鐘。之後的流式細胞儀解析方法係與實施例2所記載的內容同樣地實施，作成PE螢光強度的分佈圖(第38圖)。
於共導入有TGFβ1與GARP之HEK-293T細胞， 確認全部的抗體相對於對照組IgG的螢光強度分佈圖，係位移至強螢光強度側(第38圖)。
另一方面，共導入有TGFβ1與GARP變異體之HEK-293T細胞，雖觀察到105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4之各抗體同樣位移至強螢光強度側，但關於MHG8、及LHG10則成為與對照組IgG同樣的螢光強度分佈圖，如[非專利文獻12]所記載，顯示未結合於GARP變異體。
自以上的結果，可知105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4之各抗體係顯示結合於與TGFβ1共表現的GARP及GARP變異體之兩者，MHG8及LHG10抗體係結合於GARP中之不同的區域。
實施例9：對內源性GARP表現細胞之結合
9)-1 使用L428細胞的流動式細胞測量術解析
將L428細胞以FACS緩衝液洗淨2次後，懸浮於同溶液，各自添加h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D_H3L4、以及對照組人類IgG(human IgG：Eureka Therapeutics公司)，於4℃靜置15分鐘。以FACS緩衝液洗淨2次後，加入PE標識抗IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)而懸浮，進一步於4℃靜置15分鐘。之後的藉由流式細胞儀之解析方法係與實施例3所記載的內容同樣地實施，作成PE螢光強度的分佈圖。
相較於添加對照組人類IgG的L428細胞之螢光強度分佈圖，添加h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D_H3L4之各抗體的分佈圖被觀察到位移至強螢光 強度側，確認h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D_H3L4係結合於內源性表現的GARP(第39圖)。
9)-2 使用人類Treg的流動式細胞測量術解析
PBMC係將冷凍人類PBMC(Cellular Technology公司)按照規程解凍，使用含有10% FBS的RPMI1640(Invitrogen公司)，以2×106細胞/mL接種於24孔盤(Sumitomo Bakelite公司)。
添加Dynabeads人類T-活化體CD3/CD28(Dy nabeads Human T-Activator CD3/CD28)(Life technologies公司)，培養48小時後，將細胞懸浮於FACS緩衝液，將h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4之各抗體、以及對照組人類IgG(human IgG：Eureka Therapeutics公司)，與APC標識抗CD4抗體(Becton Dickinson公司)一起添加，於4℃靜置10分鐘。
以FACS緩衝液將細胞洗淨後，加入FITC標識抗IgG抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratories公司)及Horizon FVS450(Becton Dickinson公司)而懸浮，進一步於4℃靜置15分鐘。
再次以FACS緩衝液將細胞洗淨後，使用FoxP3染色緩衝液組(FoxP3 Staining Buffer Set)(Miltenyi Biotec公司)而製備細胞後，添加PE標識抗Foxp3抗體(Miltenyi Biotec公司)，於4℃靜置30分鐘。
細胞洗淨後，使用流式細胞儀(Facs Canto II：Becton Dickinson公司)測定，針對藉由Horizon FVS450除去死細胞的CD4陽性細胞，以FlowJo(Tree Star公司) 進行解析。
其結果，h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4之各抗體係顯示結合於FoxP3陽性Treg(第40圖)。
實施例10：抗GARP抗體的性質
10)-1 ADCC活性
將h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4、以及周知抗體(基於專利文獻1所記載的序列情報而製作的人類IgG1抗GARP抗體：MHG8、及LHG10)之各抗體、及對照組人類IgG(Sigma公司)之各抗體的ADCC活性，藉由實施例4所記載的方法測定。
h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4抗體對L428細胞係顯示抗體濃度依賴性細胞溶解活性(第41圖A)。
另一方面，MHG8及LHG10係如實施例4所記載，與對照組人類IgG同樣未觀察到細胞溶解活性(第41圖B)。
由以上係顯示h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4之各抗體具有ADCC活性。
10)-2 Treg機能抑制活性
將h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4之各抗體的Treg機能抑制活性，藉由實施例4所記載的方法測定。將h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4之最終濃度1μg/mL的Treg機能抑制活性(h151D-H1L1抑制率81.5%、h151D-H4L4抑制率80.4%、h198D-H3L4抑制率 70.8%)示於第42圖。
顯示h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4抗體具有Treg機能抑制活性。
10)-3 抗腫瘤活性(活體外)
10)-3-1 胞毒型T淋巴球(Cytotoxic T lymphocyte)(CTL)的製備
將具有NY-ESO-1特異性T細胞受體的CTL細胞(MU28 CD8B35 Clone #7：由三重大學取得)按照三重大學的規程，以3×105細胞/25cm2燒瓶(Sumitomo Bakelite公司)，在抗CD3抗體(OKT3：Imgenex公司)、IL-2(Novartis公司)、以及餵養細胞(feeder cell)群的存在下，於含有10%人類雄性AB血清(Sigma公司)的RPMI1640培養基(Invitrogen公司)中培養7日。
餵養細胞群係使用對CD8-depleted PBMC(7.5×106細胞/25cm2燒瓶)、以及103-LCL細胞(由Institute of Physical and Chemical Research,BioResource Center取得)(1.5×106細胞/25cm2燒瓶)使用X射線照射裝置(Hitachi Medical公司)施加X射線照射者，該CD8-depleted PBMC係自按照規程解凍的冷凍人類PBMC(Cellular Technology公司)之PBMC，使用CD8 MicroBeads(Miltenyi Biotech公司)除去CD8陽性細胞者。
藉由在本培養開始時添加以實施例4)-2-1所示的方法獲得的Treg(1.5×105細胞/25cm2燒瓶)，而評價CTL細胞活性之因Treg造成的抑制効果。又，藉由在本培養開始時添加以同方法獲得的Treg(7.5×104細胞/25 cm2燒瓶)、與105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4、以及人類IgG1(Enzo公司)之各抗體(10μg/ml)，而評價各抗體的抗腫瘤活性。
各培養後，藉由使用CD8+ T細胞分離套組(CD8+ T Cell Isolation Kit)(Miltenyi Biotech公司)將CD8陽性細胞純化分離，而製備CTL細胞，用於活性評價。
10)-3-2 標的細胞的製備
為人類黑色素瘤細胞株且表現NY-ESO-1的SK-MEL-52細胞(由三重大學取得：Proc Natl Acad Sci U S A.1980 Jul；77(7)：4260-4)，係使用含有10%FBS的RPMI1640培養基(Invitrogen公司)培養，關於利用51Cr之標識化，係以與實施例4)-1-2同樣的方法實施，製備成2×104細胞/mL，作為標的細胞。
10)-3-3 51Cr釋放分析
將標的細胞分注(50μL/孔)至96孔U型底微量盤(Costar公司)。
接著，以CTL細胞數成為標的細胞之16、8、4、2倍(CTL細胞：標的細胞=16：1、8：1、4：1、2：1)的方式，添加CTL細胞(100μL/孔)，在5% CO2的條件下，以37℃培養4小時。之後係按照實施例4)-1-3的方法。另外，該抑制活性係依每個供與至各實驗的檢體而算出的結果。又，確認該CTL細胞對於未表現NY-ESO-1的細胞不顯示細胞溶解。
將測定結果示於第43、44圖。
對SK-MEL-52之CTL細胞的細胞溶解活性，係 藉由Treg而被抑制(第43圖)。
另一方面，於添加105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4之各抗體的CTL細胞，伴隨CTL細胞數的增加，觀察到對SK-MEL-52細胞之細胞溶解率的上升，且相較於在添加對照組IgG之各細胞比的溶解率，其效果明顯較高(第44圖)。
因此，顯示105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4之各抗體，係抑制CTL細胞活性之因Treg造成的抑制，使抗腫瘤活性增強。
10)-4 抗腫瘤活性(活體內)
已知藉由將人類PBMC移入經移植L428細胞的NOD/Shi-scid,IL-2Rγnull(NOG)小鼠，而可評價具有ADCC活性之嵌合抗體的抗腫瘤効果(J Immunol.2009 Oct 1；183(7)：4782-91)。
將以RPMI1640培養基(Invitrogen公司)與Matrigel(Becton Dickinson公司)1：1的混合溶液懸浮成1x107細胞/mL之L428細胞(DSMZ)，移植0.1mL於NOG小鼠(雌性，In vivo science公司)的腋窩部皮下，將移植日設為第0日。於第6日使用腫瘤體積值進行分組(各組n=6)，設定以下的投予組。
PBS對照組1：於第6、10、14、18、22、26日投予，於第6、14、22日投予人類PBMC(Lot：20140707)
105F抗體：於第6、10、14、18、22、26日投予5mg/kg，於第6、14、22日投予人類PBMC(Lot：20140707)
PBS對照組2：於第6、10、14、18、22日投予，於第6、14、22日投予人類PBMC(Lot：20150924)
h151D-H1L1抗體：於第6、10、14、18、22日投予1mg/kg，於第6、14、22日投予人類PBMC(Lot：20150924)
h151D-H4L4抗體：於第0、6、10、14、18、22日投予1mg/kg，於第6、14、22日投予人類PBMC(Lot：20150924)
h198D-H3L4抗體：於第0、6、10、14、18、22日投予1mg/kg，於第6、14、22日投予人類PBMC(Lot：20150924)
各抗體係以PBS(Invitrogen公司)稀釋製備，由尾靜脈內投予(10mL/kg)。
人類PBMC係將冷凍人類PBMC(Cellular Technology公司)按照規程解凍者製備成1x107細胞/mL而由尾靜脈內投予0.2mL。
經時地以電子數位卡尺(Mitutoyo股份有限公司製)計量腫瘤的長徑(mm)及短徑(mm)，藉由以下所示計算式來算出腫瘤體積。
腫瘤體積(mm3)=1/2×[腫瘤長徑]×[腫瘤短徑]×[腫瘤短徑]
將各組之腫瘤體積的平均值±標準差(SE)的變化示於第45圖。
相較於僅投予PBMC的對照組，105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4之各抗體係 顯示對L428細胞之抗腫瘤活性，且觀察到相對於對照組之顯著差異(105F：t檢定，h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4：Dunnett型多重比較檢定)。將各投予組之測定最終日(105F：第31日，h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4：第25日)中之顯著差異檢定結果(P值)一併記於圖中
因此，可知105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及h198D-H3L4之各抗體於活體內模式亦顯示抗腫瘤活性。
實施例11 抗GARP抗體的抗原決定區解析
抗人類GARP抗體(105F、110F、h151D-H1L1、及h198D-H3L4)的抗原決定區，係藉由氫氘交換質譜法(hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry)解析。
將7mg/mL的抗人類GARP抗體與3mg/mL的人類GARP(R & D Systems公司)或空白(blank)緩衝液等量混合，於此溶液中添加9等量的輕水或重水。在30秒鐘、480秒鐘、6000秒鐘後、或一晚後，於試料中加入等量100mM磷酸、4M Gdn‧HCl、150mM TCEP、pH 2.5，進行重水取代。經重水取代的試料係在冷卻下被注入HPLC，以0.1%TFA溶液對固定化胃蛋白酶管柱進行送液。
在胃蛋白酶管柱內人類GARP被消化所得的胜肽片段，被保持於C18捕捉管柱(trap column)，接著藉由添加有0.1%甲酸及0.025%TFA的水及乙腈之線狀梯度進行溶析而於C18分析管柱分離。分離的胜肽片段係藉由飛行時間質譜儀進行質譜分析。
自各胜肽的質量算出重水取代率，將藉由抗人類GARP抗體的添加而被觀察到重水取代率顯著降低之胜肽片段，鑑定作為抗原決定區片段。
於105F，序列識別號1所示的人類GARP之366-377、407-445、456-470殘基被觀察到重水取代率的抑制，被鑑定作為抗原決定區。
於110F，序列識別號1所示的人類GARP之54-112、366-392殘基被觀察到重水取代率的抑制，被鑑定作為抗原決定區。
於h151D-H1L1，序列識別號1所示的人類GARP之352-392殘基被觀察到重水取代率的抑制，被鑑定作為抗原決定區。
於h198D-H3L4，序列識別號1所示的人類GARP之18-112殘基被觀察到重水取代率的抑制，被鑑定作為抗原決定區。
[產業上之可利用性]
本發明之抗GARP抗體係具有利用經由ADCC活性的Treg機能抑制活性之抗腫瘤活性，包含該抗GARP抗體的醫藥組成物可作為抗癌劑。
又，因為在瘧疾、HIV感染症的各患者中之Treg的過量存在及活化係顯示與此等病勢具有相關性，及在小鼠病態模式中Treg的去除係導致病狀的緩解，所以Treg機能之有效抑制在瘧疾及HIV等難治性感染症亦可期待治療效果
[序列表非關鍵詞文字]
序列識別號1-GARP的胺基酸序列
序列識別號2-105F抗體重鏈的胺基酸序列
序列識別號3-105F抗體輕鏈的胺基酸序列
序列識別號4-110F抗體重鏈的胺基酸序列
序列識別號5-110F抗體輕鏈的胺基酸序列
序列識別號6-105F抗體重鏈的核苷酸序列
序列識別號7-105F抗體輕鏈的核苷酸序列
序列識別號8-110F抗體重鏈的核苷酸序列
序列識別號9-110F抗體輕鏈的核苷酸序列
序列識別號10-引子A
序列識別號11-引子B
序列識別號12-引子C
序列識別號13-引子D
序列識別號14-編碼151D之重鏈可變區的cDNA之核苷酸序列
序列識別號15-151D之重鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號16-編碼151D之輕鏈可變區的cDNA之核苷酸序列
序列識別號17-151D之輕鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號18-編碼198D之重鏈可變區的cDNA之核苷酸序列
序列識別號19-198D之重鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號20-編碼198D之輕鏈可變區的cDNA之核苷酸序列
序列識別號21-198D之輕鏈可變區的胺基酸序列
序列識別號22-包含編碼人類輕鏈訊息序列及人類κ鏈恒定區之胺基酸的序列之DNA片段的核苷酸序列
序列識別號23-包含編碼人類重鏈訊息序列及人類IgG1恒定區之胺基酸的序列之DNA片段的核苷酸序列
序列識別號24-人類嵌合抗體c151D重鏈的核苷酸序列
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序列識別號43-人源化抗體h198D-L4的胺基酸序列
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序列識別號45-引子R
<110> 第一三共股份有限公司
<120> 抗GARP抗體
<130> FP1628
<150> JP2015-187488
<151> 2015-09-24
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<170> PatentIn 3.5版
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Claims (39)

  1. 一種抗體，其特徵係具有以下之特性；(1)特異性地結合於以醣蛋白-A為主的重複結構(Glycoprotein-A Repetitions Predominant(GARP))、(2)具有對於調節性T細胞(regulatory T cell)的免疫抑制機能之抑制活性、(3)具有抗體依賴性細胞毒殺(ADCC)活性、及(4)於活體內具有抗腫瘤活性。
  2. 如請求項1之抗體，其中GARP為包含序列識別號1所記載的胺基酸序列的分子。
  3. 如請求項1或2之抗體，其結合於(1)序列識別號1中之胺基酸編號366至377、407至445及456至470、(2)序列識別號1中之胺基酸編號54至112及366至392、(3)序列識別號1中之胺基酸編號352至392、或(4)序列識別號1中之胺基酸編號18至112。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體，其對於對GARP之結合，具有與具有下列重鏈及輕鏈的抗體之競爭性抑制活性：(1)包含序列識別號2所記載的胺基酸序列的重鏈及包含序列識別號3所記載的胺基酸序列的輕鏈、(2)包含序列識別號4所記載的胺基酸序列的重鏈及包含序列識別號5所記載的胺基酸序列的輕鏈、(3)包含序列識別號25所記載的胺基酸序列的重鏈及包含序列識別號27所記載的胺基酸序列的輕鏈、 或(4)包含序列識別號29所記載的胺基酸序列的重鏈及包含序列識別號31所記載的胺基酸序列的輕鏈。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體，其中腫瘤為癌症。
  6. 如請求項5之抗體，其中癌症為肺癌、腎癌、尿道上皮癌(urothelial carcinoma)、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、或血液癌(hematological malignancy)。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗體，其具有(1)包含序列識別號2中之胺基酸編號26至35所記載的胺基酸序列之CDRH1、包含序列識別號2中之胺基酸編號50至66所記載的胺基酸序列之CDRH2及包含序列識別號2中之胺基酸編號99至107所記載的胺基酸序列之CDRH3、以及包含序列識別號3中之胺基酸編號23至36所記載的胺基酸序列之CDRL1、包含序列識別號3中之胺基酸編號52至58所記載的胺基酸序列之CDRL2及包含序列識別號3中之胺基酸編號91至101所記載的胺基酸序列之CDRL3、(2)包含序列識別號4中之胺基酸編號26至35所記載的胺基酸序列之CDRH1、包含序列識別號4中之胺基酸編號50至66所記載的胺基酸序列之CDRH2及包含序列識別號4中之胺基酸編號99至112所記載的胺基酸序列之CDRH3、以及包含序列識別號5中之胺基酸編號23至36所記載的胺基酸序列之CDRL1、包含序列識別號5中之胺基酸編號52至58所記載的胺 基酸序列之CDRL2及包含序列識別號5中之胺基酸編號91至100所記載的胺基酸序列之CDRL3、(3)包含序列識別號25中之胺基酸編號45至54所記載的胺基酸序列之CDRH1、包含序列識別號25中之胺基酸編號69至78所記載的胺基酸序列之CDRH2及包含序列識別號25中之胺基酸編號118至125所記載的胺基酸序列之CDRH3、以及包含序列識別號27中之胺基酸編號44至54所記載的胺基酸序列之CDRL1、包含序列識別號27中之胺基酸編號70至76所記載的胺基酸序列之CDRL2及包含序列識別號27中之胺基酸編號109至117所記載的胺基酸序列之CDRL3、或(4)包含序列識別號29中之胺基酸編號45至54所記載的胺基酸序列之CDRH1、包含序列識別號29中之胺基酸編號69至77所記載的胺基酸序列之CDRH2及包含序列識別號29中之胺基酸編號117至128所記載的胺基酸序列之CDRH3、以及包含序列識別號31中之胺基酸編號44至54所記載的胺基酸序列之CDRL1、包含序列識別號31中之胺基酸編號70至76所記載的胺基酸序列之CDRL2及包含序列識別號31中之胺基酸編號109至117所記載的胺基酸序列之CDRL3。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體，其具有(1)包含序列識別號2中之胺基酸編號1至118所記載的胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號3中之胺基酸編號1至112所記載的胺基酸序列之輕鏈 可變區、(2)包含序列識別號4中之胺基酸編號1至123所記載的胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號5中之胺基酸編號1至111所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區、(3)包含序列識別號25中之胺基酸編號20至136所記載的胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號27中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區、或(4)包含序列識別號29中之胺基酸編號20至139所記載的胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號31中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
  9. 如請求項1至8中任一項之抗體，其中恒定區為源自人類的恒定區。
  10. 如請求項1至9中任一項之抗體，其具有(1)包含序列識別號2所記載的胺基酸序列之重鏈及包含序列識別號3所記載的胺基酸序列之輕鏈、(2)包含序列識別號4所記載的胺基酸序列之重鏈及包含序列識別號5所記載的胺基酸序列之輕鏈、(3)包含序列識別號25中之胺基酸編號20至466所記載的胺基酸序列之重鏈及包含序列識別號27中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈、或(4)包含序列識別號29中之胺基酸編號20至469所記載的胺基酸序列之重鏈及包含序列識別號31中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗體，其係經人源化(humanized)。
  12. 如請求項11之抗體，其具有下列重鏈可變區及輕鏈可變區；含有選自包含下列之群組之胺基酸序列的重鏈可變區：(a)序列識別號33中之胺基酸編號20至136所記載的胺基酸序列、(b)序列識別號35中之胺基酸編號20至136所記載的胺基酸序列、(c)序列識別號41中之胺基酸編號20至139所記載的胺基酸序列、(d)於(a)至(c)的序列中，對於各CDR序列以外之框架區(framework region)的序列具有至少95%以上同源性的胺基酸序列、及(e)於(a)至(c)的序列中之各CDR序列以外的框架區序列中經缺失、取代或附加一或數個胺基酸的胺基酸序列；以及含有選自包含下列之群組之胺基酸序列的輕鏈可變區：(f)序列識別號37中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列、(g)序列識別號39中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列、(h)序列識別號43中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列、 (i)於(f)至(h)的序列中，對於各CDR序列以外之框架區的序列具有至少95%以上同源性的胺基酸序列、及(j)於(f)至(h)的序列中之各CDR序列以外的框架區序列中經缺失、取代或附加一或數個胺基酸的胺基酸序列。
  13. 如請求項11或12之抗體，其具有(1)包含序列識別號33中之胺基酸編號20至136所記載的胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號37中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區、(2)包含序列識別號35中之胺基酸編號20至136所記載的胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號39中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區、或(3)包含序列識別號41中之胺基酸編號21至139所記載的胺基酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號43中之胺基酸編號21至129所記載的胺基酸序列之輕鏈可變區。
  14. 如請求項11至13中任一項之抗體，其具有(1)選自包含下列之群組之重鏈：具有序列識別號33中之胺基酸編號20至466所記載的胺基酸序列之重鏈、具有序列識別號35中之胺基酸編號20至466所記載的胺基酸序列之重鏈、及具有序列識別號41中之胺基酸編號20至469所記載的胺基酸序列之重鏈、以及 (2)選自包含下列之群組之輕鏈：具有序列識別號37中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈、具有序列識別號39中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈、及具有序列識別號43中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈。
  15. 如請求項11至14中任一項之抗體，其具有(1)具有序列識別號33中之胺基酸編號20至466所記載的胺基酸序列之重鏈及具有序列識別號37中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈、(2)具有序列識別號35中之胺基酸編號20至466所記載的胺基酸序列之重鏈及具有序列識別號39中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈、或(3)具有序列識別號41中之胺基酸編號20至469所記載的胺基酸序列之重鏈及具有序列識別號43中之胺基酸編號21至234所記載的胺基酸序列之輕鏈。
  16. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至15中任一項之抗體。
  17. 如請求項16之多核苷酸，其具有(1)包含序列識別號6中之核苷酸編號76至105所記載的核苷酸序列之CDRH1的多核苷酸、包含序列識別號6中之核苷酸編號148至198所記載的核苷酸序列之CDRH2的多核苷酸及包含序列識別號6中之核苷酸編號295至321所記載的核苷酸序列之CDRH3的多核苷酸、以及包含序列識別號7中之核苷酸編號67至108所記載的核苷酸序列之CDRL1的多核苷酸、包含序列識別號7中之核苷酸編號154至174所記載的 核苷酸序列之CDRL2的多核苷酸及包含序列識別號7中之核苷酸編號271至303所記載的核苷酸序列之CDRL3的多核苷酸、(2)包含序列識別號8中之核苷酸編號76至105所記載的核苷酸序列之CDRH1的多核苷酸、包含序列識別號8中之核苷酸編號148至198所記載的核苷酸序列之CDRH2的多核苷酸及包含序列識別號8中之核苷酸編號295至336所記載的核苷酸序列之CDRH3的多核苷酸、以及包含序列識別號9中之核苷酸編號67至108所記載的核苷酸序列之CDRL1的多核苷酸、包含序列識別號9中之核苷酸編號154至174所記載的核苷酸序列之CDRL2的多核苷酸及包含序列識別號9中之核苷酸編號271至300所記載的核苷酸序列之CDRL3的多核苷酸、(3)包含序列識別號24中之核苷酸編號133至162所記載的核苷酸序列之CDRH1的多核苷酸、包含序列識別號24中之核苷酸編號205至234所記載的核苷酸序列之CDRH2的多核苷酸及包含序列識別號24中之核苷酸編號352至375所記載的核苷酸序列之CDRH3的多核苷酸、以及包含序列識別號26中之核苷酸編號130至162所記載的核苷酸序列之CDRL1的多核苷酸、包含序列識別號26中之核苷酸編號208至228所記載的核苷酸序列之CDRL2的多核苷酸及包含序列識別號26中之核苷酸編號325至351所記載的核苷酸序列之CDRL3的多核苷酸、或(4)包含序列識別號28中之核苷酸編號133至162 所記載的核苷酸序列之CDRH1的多核苷酸、包含序列識別號28中之核苷酸編號205至231所記載的核苷酸序列之CDRH2的多核苷酸及包含序列識別號28中之核苷酸編號349至384所記載的核苷酸序列之CDRH3的多核苷酸、以及包含序列識別號30中之核苷酸編號130至162所記載的核苷酸序列之CDRL1的多核苷酸、包含序列識別號30中之核苷酸編號208至228所記載的核苷酸序列之CDRL2的多核苷酸及包含序列識別號30中之核苷酸編號325至351所記載的核苷酸序列之CDRL3的多核苷酸。
  18. 如請求項16或17之多核苷酸，其具有(1)包含序列識別號6中之核苷酸編號1至354所記載的核苷酸序列之重鏈可變區的多核苷酸及包含序列識別號7中之核苷酸編號1至336所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區的多核苷酸、(2)包含序列識別號8中之核苷酸編號1至369所記載的核苷酸序列之重鏈可變區的多核苷酸及包含序列識別號9中之核苷酸編號1至333所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區的多核苷酸、(3)包含序列識別號24中之核苷酸編號58至408所記載的核苷酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號26中之核苷酸編號61至387所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區、或(4)包含序列識別號28中之核苷酸編號58至417所記載的核苷酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號30中之核苷酸編號61至387所記載的核苷酸序列之輕 鏈可變區。
  19. 如請求項16至18中任一項之多核苷酸，其具有(1)包含序列識別號6所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸及包含序列識別號7所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸、(2)包含序列識別號8所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸及包含序列識別號9所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸、(3)包含序列識別號24中之核苷酸編號58至1398所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸及包含序列識別號26中之核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸、或(4)包含序列識別號28中之核苷酸編號58至1407所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸及包含序列識別號30中之核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸。
  20. 如請求項16或17之多核苷酸，其具有(1)選自包含下列之群組之重鏈可變區：包含序列識別號32中之核苷酸編號58至408所記載的核苷酸序列之重鏈可變區、包含序列識別號34中之核苷酸編號58至408所記載的核苷酸序列之重鏈可變區、及包含序列識別號40中之核苷酸編號58至417所記載的核苷酸序列之重鏈可變區、以及(2)選自包含下列之群組之輕鏈可變區：包含序列識別號36中之核苷酸編號61至387所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區、包含序列識別號38中之核苷酸編 號61至387所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區、及包含序列識別號42中之核苷酸編號61至387所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區。
  21. 如請求項16、17或20之多核苷酸，其具有(1)包含序列識別號32中之核苷酸編號58至408所記載的核苷酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號36中之核苷酸編號61至387所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區、(2)包含序列識別號34中之核苷酸編號58至408所記載的核苷酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號38中之核苷酸編號61至387所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區、或(3)包含序列識別號40中之核苷酸編號58至417所記載的核苷酸序列之重鏈可變區及包含序列識別號42中之核苷酸編號61至387所記載的核苷酸序列之輕鏈可變區。
  22. 如請求項16、17、20或21之多核苷酸，其具有(1)選自包含下列之群組之重鏈的多核苷酸：包含序列識別號32中之核苷酸編號58至1398所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸、包含序列識別號34中之核苷酸編號58至1398所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸、及包含序列識別號40中之核苷酸編號58至1407所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸、以及(2)選自包含下列之群組之輕鏈的多核苷酸：包含序列識別號36中之核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸、包含序列識別號38中之 核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸、及包含序列識別號42中之核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸。
  23. 如請求項16、17及20至22中任一項之多核苷酸，其具有(1)包含序列識別號32中之核苷酸編號58至1398所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸、及包含序列識別號36中之核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸、(2)包含序列識別號34中之核苷酸編號58至1398所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸、及包含序列識別號38中之核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸、或(3)包含序列識別號40中之核苷酸編號58至1407所記載的核苷酸序列之重鏈的多核苷酸、及包含序列識別號42中之核苷酸編號61至702所記載的核苷酸序列之輕鏈的多核苷酸。
  24. 一種表現載體(vector)，其含有如請求項16至23中任一項之多核苷酸。
  25. 一種宿主細胞，其係藉由如請求項24之表現載體而被轉形(transformation)。
  26. 一種抗體或斷片的製造方法，其特徵係含有培養如請求項25之宿主細胞的步驟、及自該步驟所得之培養物採取目的之抗體的步驟。
  27. 一種抗體，其特徵係藉由如請求項26之製造方法而獲得。
  28. 如請求項1至15及27中任一項之抗體，其含有選自包含下列之群組之1或2種以上的修飾：對N-鍵結之醣苷化(glycosylation)、對O-鍵結之醣苷化、N末端加工(N-terminal processing)、C末端加工(C-terminal processing)、脫醯胺化、天冬胺酸的異構化、甲硫胺酸的氧化、於N末端之甲硫胺酸殘基的添加、脯胺酸殘基的醯胺化及於羧基末端經缺失1個或2個胺基酸的重鏈。
  29. 如請求項28之抗體，其於重鏈的羧基末端缺失1個或2個胺基酸。
  30. 如請求項29之抗體，其2條重鏈雙方於羧基末端缺失1個胺基酸。
  31. 如請求項28至30中任一項之抗體，其重鏈的羧基末端之脯胺酸殘基進一步被醯胺化。
  32. 如請求項1至15及27至31中任一項之抗體，其調節糖鏈修飾用以增強抗體依賴性細胞毒殺活性。
  33. 一種醫藥組成物，其特徵為含有如請求項1至15及27至32之抗體之至少一種。
  34. 如請求項33之醫藥組成物，其係腫瘤治療用。
  35. 如請求項34之醫藥組成物，其中腫瘤為癌症。
  36. 如請求項35之醫藥組成物，其中癌症為肺癌、腎癌、尿道上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、或血液癌。
  37. 一種腫瘤的治療方法，其特徵為將如請求項1至15及27至32之抗體之至少一種投予至個體。
  38. 如請求項37之治療方法，其中腫瘤為癌症。
  39. 如請求項38之治療方法，其中癌症為肺癌、腎癌、尿道上皮癌、大腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、或血液癌。
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