WO2017051888A1 - 抗garp抗体 - Google Patents
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Definitions
- the present invention relates to an antibody that binds to GARP useful as a therapeutic agent for tumors, and a method for treating tumors using the antibodies.
- Treg Regulatory T cells
- Glycoprotein-A Repetitions Predominant is a protein with a single transmembrane structure [Non-Patent Document 2], expressed on the cell surface of activated Treg, and latent TGF- ⁇ (an important molecule for inducing tolerance) A complex with a certain TGF- ⁇ precursor) [Non-Patent Document 3].
- Non-patent Documents 4 and 5 Due to cell-cell interaction between Treg and the target cells that Treg provides immunosuppression, mature TGF- ⁇ is secreted from latent TGF- ⁇ that is retained on the Treg cell surface via GARP, and TGF - ⁇ immunosuppressive signal is directly transmitted to target cells [Non-patent Documents 4 and 5]. It has been shown that the expression of GARP on the cell membrane is necessary for the maturation of TGF- ⁇ [Non-Patent Document 5]. On the other hand, soluble GARP lacking the transmembrane region is used as a CD4-positive T cell.
- Non-patent Document 6 Even when added directly, the proliferation of CD4-positive T cells is suppressed [Non-patent Document 6], and therefore the existence of an immunosuppressive mechanism by GARP that does not involve a TGF- ⁇ maturation mechanism on the cell membrane cannot be denied.
- GARP is expressed in peripheral blood-derived activated Treg, and clinically, Treg [Tumor Infiltrating Tcells] infiltrating tumor affected areas of cancer patients [7] and ascites Expression in Treg [Non-patent Document 8] present in the patient or Treg present in the peripheral blood of patients [Non-patent Document 9].
- Non-Patent Document 10 As a report examining the influence on the Treg function when suppressing the expression of GARP, inhibition of the growth suppression function against T helper T cells was observed in Treg introduced with siRNA for GARP. [Non-Patent Document 10].
- anti-GARP antibodies MHG-8, LHG-10) obtained using TGF- ⁇ maturation inhibition as an index are helpers of the Treg A1 cell line [Non-patent Document 11] established from hemochromatosis patients. Inhibition of growth-suppressing function against T cells [Patent Document 1, Non-Patent Document 12].
- the antibody effectively shows the inhibitory effect on Treg in a tumor microenvironment is unknown, and no anti-GARP antibody having such an effect has been reported so far.
- Treg An antibody that recognizes both GARP and TGF- ⁇ is also known [Patent Document 2].
- Treg in addition to tumors, excessive presence and activation of Treg in patients with malaria and HIV infection correlate with their disease status [Non-patent Documents 13 and 14], and mouse pathology The model shows that removal of Treg results in remission of the disease [Non-Patent Documents 15 and 16].
- An object of the present invention is to provide an antibody that becomes a pharmaceutical agent having a therapeutic effect by inhibiting the function of Treg in a tumor, a method for treating a tumor using the antibody, and the like.
- the present invention includes the following inventions.
- an antibody having the following characteristics (A) binding specifically to Glycoprotein-A Repetitions Predominant (GARP) (b) having an inhibitory activity on the immunosuppressive function of regulatory T cells, (C) has antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity, and (d) has anti-tumor activity in vivo.
- GARP is a molecule consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
- the antibody according to (1) or (2), which binds to (4) For binding to GARP (A) a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 3, (B) a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 and a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5, (C) a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25 and a light chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 27, or (d) a heavy chain consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 31 A light chain comprising the described amino acid sequence,
- the antibody according to any one of (1) to (4) above, wherein the tumor is cancer.
- Cancer is lung cancer, renal cancer, urothelial cancer, colon cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, stomach cancer, esophageal cancer, or blood cancer
- CDRH2 consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 50 to 66 in SEQ ID NO: 2 and amino acid numbers 99 to 99 in SEQ ID NO: 2.
- CDRH3 consisting of the amino acid sequence described in 107, CDRL1 consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 23 to 36 in SEQ ID NO: 3, CDRL2 consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 52 to 58 in SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 3 CDRL3 consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 91 to 101 in (B) CDRH1 consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 26 to 35 in SEQ ID NO: 4, CDRH2 consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 50 to 66 in SEQ ID NO: 4 and amino acid numbers 99 to 112 in SEQ ID NO: 4 CDRH3 consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, CDRL1 consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 23 to 36 in SEQ ID NO: 5, CDRL2 consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 52 to 58 in SEQ ID NO: 5 and amino acid number in SEQ ID NO: 5 CDRL3 consisting of the amino acid sequence described in
- CDRL2 consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 70 to 76 in SEQ ID NO: 31 and the amino acid sequence described in amino acid numbers 109 to 117 in SEQ ID NO: 31 CDRL3, The antibody according to any one of (1) to (6) above, wherein (8) (a) a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 1-118 in SEQ ID NO: 2 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 1-112 in SEQ ID NO: 3, (B) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 123 in SEQ ID NO: 4 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of amino acid numbers 1 to 111 in SEQ ID NO: 5, (C) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of amino acid numbers 20 to 136 in SEQ ID NO: 25 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of amino acid numbers 21 to 129 in SEQ ID NO: 27, or (d) the sequence A heavy chain variable region
- the antibody of claim 11 having (13) (a) a heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 20 to 136 in SEQ ID NO: 33 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 21 to 129 in SEQ ID NO: 37; (B) a heavy chain variable region comprising the amino acid sequence of amino acid numbers 20 to 136 in SEQ ID NO: 35 and a light chain variable region comprising the amino acid sequence of amino acid numbers 21 to 129 in SEQ ID NO: 39, or (c) the sequence A heavy chain variable region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 21 to 139 in No. 41 and a light chain variable region consisting of the amino acid sequence of amino acid numbers 21 to 129 in SEQ ID No.
- the antibody according to (11) or (12) above having (14) (a) a heavy chain having the amino acid sequence of amino acid numbers 20 to 466 in SEQ ID NO: 33, a heavy chain having the amino acid sequence of amino acid numbers 20 to 466 in SEQ ID NO: 35, and an amino acid in SEQ ID NO: 41 A heavy chain selected from the group consisting of a heavy chain having the amino acid sequence of Nos. 20 to 469, and (b) a light chain having the amino acid sequence of amino acids 21 to 234 in SEQ ID No.
- CDRL1 polynucleotide comprising the nucleotide sequence of nucleotide numbers 67 to 108 in SEQ ID NO: 7, and a nucleotide number of 154 to 174 in SEQ ID NO: 7
- a polynucleotide of CDRL2 comprising the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 7, and a polynucleotide of CDRL3 comprising the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7 according to nucleotide numbers 271 to 303
- B a polynucleotide encoding CDRH1 consisting of the nucleotide sequence set forth in nucleotide numbers 76 to 105 in SEQ ID NO: 8
- a polynucleotide of CDRH2 consisting of the nucleotide sequence set forth in nucleotide numbers 148 to 198 in SEQ ID NO: 8 and SEQ ID NO: 8
- CDRH3 polynucleotide comprising the
- a light chain polynucleotide, consisting of Light chain of polynucleotides selected from that group The polynucleotide according to (16), (17), (20) or (21) above, (23) (a) a heavy chain polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in nucleotide numbers 58 to 1398 in SEQ ID NO: 32, and a light chain polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in nucleotide numbers 61 to 702 in SEQ ID NO: 36 , (B) a heavy chain polynucleotide consisting of the nucle
- (25) A host cell transformed with the expression vector according to (24) above.
- (26) A method for producing the antibody or the fragment, comprising a step of culturing the host cell according to (25) above, and a step of collecting a target antibody from the culture obtained in the step.
- (27) An antibody obtained by the production method of (26) above.
- Cancer is lung cancer, renal cancer, urothelial cancer, colon cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, stomach cancer, esophageal cancer, or blood cancer
- the pharmaceutical composition according to the above (35), wherein (37) A method for treating a tumor, comprising administering at least one of the antibodies described in (1) to (15) and (27) to (32) to an individual. (38) The method according to (37) above, wherein the tumor is cancer.
- Cancer is lung cancer, renal cancer, urothelial cancer, colon cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, stomach cancer, esophageal cancer, or blood cancer
- a cancer therapeutic agent containing an antibody having antitumor activity by binding to GARP and having a Treg inhibitory effect through ADCC activity.
- the presence and activation of Treg in patients with malaria and HIV infection correlate with these disease states, and in the mouse pathological model, removal of Treg results in remission of the disease state. Effective inhibition can be expected to have a therapeutic effect even in intractable infectious diseases such as malaria and HIV.
- FIG. 1 shows the amino acid sequence of GARP (SEQ ID NO: 1).
- FIG. 2 shows the amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of the 105F antibody heavy chain.
- FIG. 3 shows the amino acid sequence of the 105F antibody light chain (SEQ ID NO: 3).
- FIG. 4 is a view showing an amino acid sequence (SEQ ID NO: 4) of a 110F antibody heavy chain.
- FIG. 5 shows the amino acid sequence of the 110F antibody light chain (SEQ ID NO: 5).
- FIG. 6 shows the nucleotide sequence of the 105F antibody heavy chain (SEQ ID NO: 6).
- FIG. 7 shows the nucleotide sequence of the 105F antibody light chain (SEQ ID NO: 7).
- FIG. 8 shows the nucleotide sequence (SEQ ID NO: 8) of the 110F antibody heavy chain.
- FIG. 9 shows the nucleotide sequence of the 110F antibody light chain (SEQ ID NO: 9).
- FIG. 10 is a view showing binding of an antibody to GARP. The 105F antibody and the 110F antibody showed binding to GARP by ELISA.
- FIG. 11 shows GARP-specific binding of antibodies. The 105F antibody did not bind to HEK293T cells into which only the vector was introduced, but only bound to cells in which GARP was transiently expressed in HEK293T cells.
- FIG. 12 shows GARP-specific binding of antibodies. The 105F antibody showed binding activity to L428 cells that endogenously express GARP.
- FIG. 13 is a diagram showing GARP-specific binding of antibodies.
- the 105F antibody showed binding activity to activated Treg.
- FIG. 14 is a diagram showing the ADCC ability of an antibody. When targeting L428 cells that endogenously express GARP, enhancement of ADCC activity was observed depending on the antibody concentration of the 105F antibody.
- FIG. 15 shows the ability of antibodies to inhibit Treg function.
- the 105F antibody (50 ⁇ g / mL) inhibited the growth-suppressing function for helper T cells by Treg.
- FIG. 16 shows the ability of antibodies to inhibit Treg function.
- the 105F antibody (10 ⁇ g / mL) inhibited the growth-suppressing function for helper T cells by Treg.
- FIG. 17 shows the amino acid sequence of the c151D antibody heavy chain (SEQ ID NO: 25).
- FIG. 18 shows the amino acid sequence of the c151D antibody light chain (SEQ ID NO: 27).
- FIG. 19 shows the amino acid sequence of the heavy chain of c198D antibody (SEQ ID NO: 29).
- FIG. 20 shows the amino acid sequence of the c198D antibody light chain (SEQ ID NO: 31).
- FIG. 21 shows the amino acid sequence of the h151D-H1 heavy chain (SEQ ID NO: 33).
- FIG. 22 shows the amino acid sequence of the h151D-L1 light chain (SEQ ID NO: 37).
- FIG. 23 shows the amino acid sequence of the h151D-H4 heavy chain (SEQ ID NO: 35).
- FIG. 24 shows the amino acid sequence of the h151D-L4 light chain (SEQ ID NO: 39).
- FIG. 25 shows the amino acid sequence of the h198D-H3 heavy chain (SEQ ID NO: 41).
- FIG. 26 shows the amino acid sequence of the h198D-L4 light chain (SEQ ID NO: 43).
- FIG. 27 shows the nucleotide sequence of the c151D antibody heavy chain (SEQ ID NO: 24).
- FIG. 28 shows the nucleotide sequence of the c151D antibody light chain (SEQ ID NO: 26).
- FIG. 29 shows the nucleotide sequence of the c198D antibody heavy chain (SEQ ID NO: 28).
- FIG. 30 shows the nucleotide sequence of the c198D antibody light chain (SEQ ID NO: 30).
- FIG. 31 shows the nucleotide sequence of the h151D-H1 heavy chain (SEQ ID NO: 32).
- FIG. 32 shows the nucleotide sequence of the h151D-L1 light chain (SEQ ID NO: 36).
- FIG. 33 shows the nucleotide sequence of the h151D-H4 heavy chain (SEQ ID NO: 34).
- FIG. 34 shows the nucleotide sequence of the h151D-L4 light chain (SEQ ID NO: 38).
- FIG. 35 shows the nucleotide sequence of the h198D-H3 heavy chain (SEQ ID NO: 40).
- FIG. 36 shows the nucleotide sequence of the h198D-L4 light chain (SEQ ID NO: 42).
- FIG. 37 is a diagram showing binding of each antibody to GARP-expressing cells. h151D-H1L1, h151D-H4L4 and h198D-H3L4 showed specific binding activity to GARP.
- FIG. 38 is a view showing binding of each antibody to GARP-TGF ⁇ 1 co-expressing cells.
- the 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4 and h198D-H3L4 antibodies were shown to bind to both GARP and GARP variants co-expressed with TGF ⁇ 1, and the known antibodies MHG8 and LHG10 GARP showed binding activity to different regions.
- FIG. 39 shows the binding of each antibody to L428 cells.
- Each of the antibodies h151D-H1L1, h151D-H4L4 and h198D-H3L4 showed binding activity to endogenously expressed GARP.
- FIG. 40 shows the binding of each antibody to Treg.
- Each antibody of h151D-H1L1, h151D-H4L4 and h198D-H3L4 showed binding activity against FoxP3-positive Treg.
- FIG. 41 is a diagram showing ADCC activity of each antibody.
- Each antibody of h151D-H1L1, h151D-H4L4 and h198D-H3L4 showed ADCC activity.
- FIG. 42 shows the Treg function inhibitory activity of each antibody.
- FIG. 43 is a diagram showing suppression of CTL target cell lytic activity by Treg.
- FIG. 44 shows the enhancement of antitumor activity by each antibody.
- the 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, and h198D-H3L4 antibodies inhibited the suppression of CTL cell activity by Treg and enhanced antitumor activity.
- FIG. 45 is a graph showing the in vivo antitumor activity of each antibody.
- the 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, and h198D-H3L4 antibodies exhibited antitumor activity in an in vivo model.
- cancer and “tumor” are used interchangeably.
- the term “gene” includes not only DNA but also mRNA, cDNA and cRNA thereof.
- polynucleotide is used in the same meaning as nucleic acid, and includes DNA, RNA, probe, oligonucleotide, and primer.
- polypeptide and “protein” are used without distinction.
- cell includes cells in an individual animal and cultured cells.
- GARP has the same meaning as GARP protein.
- cytotoxicity refers to pathological changes in cells in some form, not just direct trauma, but also DNA cleavage, base dimer formation, chromosomes. This refers to any structural or functional damage to cells, such as cleavage of cells, damage to cell division apparatus, or reduction of various enzyme activities.
- cytotoxic activity refers to causing the above cytotoxicity.
- antibody-dependent cellular cytotoxicity in the present specification means “antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) activity”. means.
- the “epitope” means a partial peptide or partial tertiary structure of GARP to which a specific anti-GARP antibody binds.
- the epitope which is a partial peptide of GARP can be determined by a method well known to those skilled in the art such as immunoassay, for example, the following method.
- various partial structures of the antigen are prepared. In preparing the partial structure, a known oligopeptide synthesis technique can be used.
- the epitope can be determined by synthesizing shorter peptides and examining their reactivity with those peptides.
- an epitope which is a partial three-dimensional structure of an antigen to which a specific antibody binds can be determined by specifying amino acid residues of the antigen adjacent to the antibody by X-ray structural analysis.
- an antibody that binds to the same epitope means a different antibody that binds to a common epitope. If the second antibody binds to the partial peptide or the three-dimensional structure to which the first antibody binds, it can be determined that the first antibody and the second antibody bind to the same epitope. In addition, by confirming that the second antibody competes for the binding of the first antibody to the antigen (that is, the second antibody prevents the binding of the first antibody and the antigen), a specific epitope is determined. Even if the sequence or structure of is not determined, it can be determined that the first antibody and the second antibody bind to the same epitope.
- the second antibody when the first antibody and the second antibody bind to the same epitope and the first antibody has a special effect such as antitumor activity, the second antibody is expected to have the same activity. it can. Therefore, if the second anti-GARP antibody binds to the partial peptide to which the first anti-GARP antibody binds, it can be determined that the first antibody and the second antibody bind to the same epitope of GARP. In addition, by confirming that the second anti-GARP antibody competes with the binding of the first anti-GARP antibody to GARP, the first antibody and the second antibody bind to the same epitope of GARP. Can be determined.
- CDR in this specification means a complementarity determination region (Complemetarity deterring region). It is known that there are three CDRs in each of the heavy and light chains of the antibody molecule. CDRs, also called hypervariable domains, are sites in the variable regions of the heavy and light chains of antibodies that have particularly high primary structure variability, and are heavy and light chain polypeptide chains. In the primary structure of each, it is separated into three locations.
- CDRH1, CDRH2, CDRH3 from the amino terminal side of the heavy chain amino acid sequence
- CDRL1 from the amino terminal side of the light chain amino acid sequence.
- CDRL2 CDRL3
- hybridize under stringent conditions means to hybridize at 68 ° C. in a commercially available hybridization solution ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech) or use a filter on which DNA is fixed. After hybridization at 68 ° C in the presence of 0.7-1.0M NaCl, 0.1-2 fold SSC solution (1 fold concentration SSC consists of 150 mM NaCl and 15 mM sodium citrate) at 68 ° C. Hybridization under conditions that can be identified by washing or equivalent conditions.
- GARP GARP used in the present invention can be used by directly purifying from GARP-expressing cells of humans and non-human mammals (rats, mice, etc.), or by preparing a cell membrane fraction of the cells, It can be obtained by synthesizing GARP in vitro or by producing it in a host cell by genetic manipulation. Specifically, in genetic manipulation, GARP cDNA is incorporated into a vector that can be expressed and then synthesized in a solution containing enzymes, substrates and energy substances necessary for transcription and translation, or other prokaryotic or eukaryotic organisms. The protein can be obtained by expressing GARP by transforming a host cell of an organism. The amino acid sequence of human GARP is described in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
- GARP includes a protein having an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, and / or added in the amino acid sequence of GARP, and having biological activity equivalent to that protein.
- the mature human GARP from which the signal sequence has been removed corresponds to an amino acid sequence consisting of the 20th to 662nd amino acid residues of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
- amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing or an amino acid sequence obtained by subtracting, deleting, or adding one or several amino acids in the amino acid sequence obtained by removing the signal sequence from these sequences,
- a protein having a biological activity equivalent to that of GARP is also included in GARP.
- it consists of an amino acid sequence encoded by a splicing variant transcribed from the human GARP locus, or an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, or added, and is equivalent to GARP. Proteins having biological activity are also included in GARP.
- the antibody against GARP of the present invention examples include an anti-GARP human antibody, and the anti-GARP human antibody means a human antibody having only the gene sequence of an antibody derived from a human chromosome.
- the anti-GARP human antibody is obtained by a method using a human antibody-producing mouse having a human chromosome fragment containing heavy and light chain genes of a human antibody (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, p. 133. Kuroiwa, Y. et.al., Nucl.Acids Res. (1998) 26, p.3447-3448; Yoshida, H.
- the endogenous immunoglobulin heavy chain and light chain loci are disrupted, and instead of the human immunoglobulin via a yeast artificial chromosome (Yeast artificial chromosome, YAC) vector or the like.
- yeast artificial chromosome Yeast artificial chromosome, YAC
- Genetically modified animals into which heavy and light chain loci have been introduced can be produced by creating knockout animals and transgenic animals, and crossing these animals together.
- eukaryotic cells are transformed with cDNA encoding each heavy chain and light chain of such a human antibody, preferably a vector containing the cDNA, to produce a gene recombinant human monoclonal antibody.
- the antibody can also be obtained from the culture supernatant by culturing the transformed cells.
- host cells eukaryotic cells, preferably CHO cells, mammalian cells such as lymphocytes and myeloma can be used.
- a method for obtaining a human antibody derived from phage display selected from a human antibody library (Wormstone, IM et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), p.
- a phage display method (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105) in which a variable region of a human antibody is expressed on a phage surface as a single chain antibody (scFv) and a phage that binds to an antigen is selected. -1116) can be used.
- the DNA sequence encoding the variable region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
- an IgG expression vector having the sequence is prepared by ligating the DNA sequence of the antibody constant region, and introduced into a suitable host to express it.
- Antibodies can be obtained (WO92 / 01047, WO92 / 20791, WO93 / 06213, WO93 / 11236, WO93 / 19172, WO95 / 01438, WO95 / 15388, Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p.433- 455, Nature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116).
- the antibody against GARP of the present invention is obtained by immunizing an animal with any polypeptide selected from GARP or an amino acid sequence of GARP using a conventional method, and collecting and purifying the antibody produced in vivo. Obtainable.
- the species of GARP as an antigen is not limited to humans, and animals can be immunized with GARP derived from animals other than humans such as mice and rats.
- an antibody applicable to a human disease can be selected by testing the cross-reactivity between the obtained antibody that binds to a heterologous GARP and human GARP.
- Hybridomas can be established by fusing antibody-producing cells that produce antibodies against GARP and myeloma cells to obtain monoclonal antibodies.
- GARP as an antigen can be obtained by causing a host cell to produce a GARP gene by genetic manipulation.
- a vector capable of expressing the GARP gene may be prepared, introduced into a host cell to express the gene, and the expressed GARP may be purified.
- a method for obtaining an antibody against GARP will be specifically described.
- Antigens for preparing anti-GARP antibodies include GARP or a polypeptide comprising at least 6 consecutive partial amino acid sequences thereof, or derivatives obtained by adding any amino acid sequence or carrier thereto. Can be mentioned.
- GARP can be used by directly purifying from human tumor tissue or tumor cells, or can be obtained by synthesizing GARP in vitro or by producing it in a host cell by genetic manipulation.
- GARP cDNA is incorporated into a vector that can be expressed and then synthesized in a solution containing enzymes, substrates, and energy substances necessary for transcription and translation, or other prokaryotic organisms or true organisms.
- An antigen can be obtained by expressing GARP by transforming a nuclear host cell.
- an antigen as a secreted protein by expressing a fusion protein in which an extracellular region of GARP, which is a membrane protein, and an antibody constant region are linked in an appropriate host / vector system.
- GARP cDNA is, for example, a polymerase chain reaction (hereinafter referred to as “PCR”) using a cDNA library expressing GARP cDNA as a template and primers that specifically amplify GARP cDNA (Saiki, R. K. , Et al., Science (1988) 239, p.487-489).
- PCR polymerase chain reaction
- RTS rapid translation system
- prokaryotic cell hosts examples include Escherichia coli and Bacillus subtilis.
- the host cell is transformed with a plasmid vector containing a replicon or origin of replication from a species compatible with the host and regulatory sequences.
- the vector preferably has a sequence capable of imparting phenotypic (phenotypic) selectivity to transformed cells.
- Eukaryotic host cells include cells such as vertebrates, insects and yeasts, and examples of vertebrate cells include COS cells (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650), mouse fibroblast NIH3T3 (ATCC No.CRL-1658) and Chinese hamster ovary cells (CHO cells, ATCC CCL-61) (Hrlaub, G. et al.). and Chasin, LA Proc.Natl.Acad.Sci.USA (1980) 77, p.4126-4220) are well used, but are not limited thereto.
- COS cells Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p. 175-182, ATCC CRL-1650
- mouse fibroblast NIH3T3 ATCC No.CRL-1658
- Chinese hamster ovary cells CHO cells, ATCC CCL-61) (Hrlaub, G. et al.). and Chasin, LA Proc.Natl.
- the transformant obtained as described above can be cultured according to a conventional method, and the target polypeptide is produced inside or outside the cell by the culture.
- the medium used for the culture various commonly used media can be appropriately selected depending on the host cells employed.
- an antibiotic such as ampicillin or IPMG can be added to the LB medium as necessary. It can be added and used.
- Recombinant protein produced inside or outside of the transformant by the above culture can be separated and purified by various known separation methods utilizing the physical and chemical properties of the protein. it can.
- the method include various liquid chromatography such as treatment with an ordinary protein precipitating agent, ultrafiltration, molecular sieve chromatography (gel filtration), adsorption chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like. , Dialysis methods, combinations thereof and the like.
- a histidine tag consisting of 6 residues
- it can be efficiently purified with a nickel affinity column.
- it can be efficiently purified on a protein A column by linking the IgG Fc region to the recombinant protein to be expressed.
- the target polypeptide can be easily produced in large quantities with high yield and high purity.
- a method for producing a monoclonal antibody will be described in detail according to the above steps, but the method for producing the antibody is not limited thereto, and for example, antibody-producing cells other than spleen cells and myeloma can also be used.
- a membrane fraction prepared from a GARP-expressing recombinant cell, or a GARP-expressing recombinant cell itself, and a partial peptide of the protein of the present invention chemically synthesized using a method well known to those skilled in the art are used as antigens. You can also
- step (B) Preparation of antibody-producing cells
- the antigen obtained in step (a) is mixed with Freund's complete or incomplete adjuvant, or an adjuvant such as potassium alum, and an experimental animal is immunized as an immunogen.
- an animal used in a known hybridoma production method can be used without any problem. Specifically, for example, mice, rats, goats, sheep, cows, horses and the like can be used. However, from the viewpoint of easy availability of myeloma cells to be fused with the extracted antibody-producing cells, it is preferable to use mice or rats as immunized animals.
- mice there are no particular restrictions on the mouse and rat strains actually used.
- rats for example, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN Fischer or the like can be used.
- mice and rats can be obtained from, for example, laboratory animal breeders and distributors such as Nippon Clare and Nippon Charles River.
- the BALB / c strain is particularly preferable for mice, and the Wistar and Low strains are particularly preferable for rats.
- mice with reduced biological mechanisms for removing autoantibodies that is, autoimmune disease mice.
- the age at the time of immunization of these mice or rats is preferably 5 to 12 weeks, and more preferably 6 to 8 weeks.
- a membrane protein fraction that is an antigen or a cell in which the antigen is expressed is administered intradermally or intraperitoneally in an animal.
- the combination of both is preferable.
- the immune efficiency can be particularly enhanced.
- the antigen administration schedule varies depending on the type of animal to be immunized, individual differences, and the like, but in general, the number of antigen administrations is preferably 3 to 6 times, and the administration interval is 2 to 6 weeks. More preferably 4 weeks.
- the dose of antigen varies depending on the kind of animal and individual differences, but is generally 0.05 to 5 mg, preferably about 0.1 to 0.5 mg.
- the booster immunization is performed 1 to 6 weeks after the antigen administration as described above, preferably 2 to 4 weeks, and more preferably 2 to 3 weeks.
- the dose of antigen for booster immunization varies depending on the type and size of the animal, but generally 0.05 to 5 mg, preferably 0.1 to 0.5 mg, more preferably 0.1 to 0.2 mg in the case of mice, for example. To the extent.
- Spleen cells or lymphocytes containing antibody-producing cells are aseptically removed from the immunized animal 1 to 10 days after the booster, preferably 2 to 5 days, and more preferably 2 to 3 days later. In this case, if the antibody titer is measured and an animal having a sufficiently high antibody titer is used as a source of antibody-producing cells, the efficiency of subsequent operations can be increased.
- Examples of the antibody titer measurement method used here include, but are not limited to, the RIA method and the ELISA method.
- the measurement of the antibody titer in the present invention can be performed according to the procedure described below, for example, according to the ELISA method.
- a purified or partially purified antigen is adsorbed on a solid phase surface such as a 96-well plate for ELISA, and a solid phase surface on which no antigen is adsorbed is a protein unrelated to the antigen, such as bovine serum albumin (hereinafter referred to as “BSA”). ), And the surface is washed and then contacted with a serially diluted sample (eg, mouse serum) as the first antibody, and the antibody in the sample is bound to the antigen.
- a serially diluted sample eg, mouse serum
- an antibody against a mouse antibody labeled with an enzyme as a second antibody is added and bound to the mouse antibody. After washing, the substrate of the enzyme is added, and the change in absorbance due to color development based on the decomposition of the substrate is measured. calculate.
- Separation of antibody-producing cells from spleen cells or lymphocytes of the immunized animal can be performed by a known method (for example, Kohler et al., Nature (1975) 256, p. 495, Kohler et al., Eur. J. Immunol). (1977) 6, p. 511,; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550, Walsh, Nature, (1977) 266, p. 495).
- a general method of separating antibody-producing cells by chopping the spleen and filtering the cells through a stainless mesh and then suspending them in Eagle's minimum essential medium (MEM) can be employed. .
- MEM Eagle's minimum essential medium
- myeloma Preparation of myeloma cells (hereinafter referred to as “myeloma”)
- Myeloma cells used for cell fusion are not particularly limited and can be appropriately selected from known cell lines. However, in consideration of convenience when selecting hybridomas from the fused cells, it is preferable to use a HGPRT (Hypoxanthine-GUANINE phosphoribosyl transferase) deficient strain in which the selection procedure has been established.
- HGPRT Hydropoxanthine-GUANINE phosphoribosyl transferase
- X63-Ag8 X63
- NS1-ANS / 1 NS1
- P3X63-Ag8. U1 (P3U1)
- X63-Ag8.653 X63.653
- SP2 / 0-Ag14 SP2 / 0
- MPC11-45.6TG1.7 45.6TG
- FO S149 / 5XXO
- BU. 1st 210 derived from rats.
- human-derived U266AR SKO-007
- GM1500 / GTG-A12 UC729-6
- LICR-LOW-HMy2 HMy2
- 8226AR / NIP4-1 NP41
- 8-azaguanine in an appropriate medium such as 8-azaguanine medium [RPMI-1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, and fetal calf serum (hereinafter referred to as “FCS”). Added medium], Iscove's Modified Dulbecco's Medium (hereinafter referred to as “IMDM”), or Dulbecco's Modified Eagle Medium (hereinafter referred to as “DMEM”). Passage culture is performed in a normal medium [for example, ASF104 medium (manufactured by Ajinomoto Co., Inc.) containing 10% FCS] 4 days before, and a cell number of 2 ⁇ 10 7 or more is secured on the day of fusion.
- RPMI-1640 medium supplemented with glutamine, 2-mercaptoethanol, gentamicin, and fetal calf serum hereinafter referred to as “FCS”). Added medium
- IMDM Iscove's Modified Dulbecco
- a chemical method of mixing antibody-producing cells and myeloma cells in a high-concentration polymer solution such as polyethylene glycol, a physical method using electrical stimulation, or the like can be used.
- a high-concentration polymer solution such as polyethylene glycol, a physical method using electrical stimulation, or the like
- specific examples of the chemical method are as follows. That is, when polyethylene glycol is used as the high-concentration polymer solution, the antibody-producing cells can be used in a polyethylene glycol solution having a molecular weight of 1500 to 6000, preferably 2000 to 4000 at a temperature of 30 to 40 ° C., preferably 35 to 38 ° C. Mix with myeloma cells for 1-10 minutes, preferably 5-8 minutes.
- the selection method of the hybridoma obtained by the cell fusion is not particularly limited, but is usually a HAT (hypoxanthine / aminopterin / thymidine) selection method (Kohler et al., Nature (1975) 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977) 266, p. 550).
- HAT hyperxanthine / aminopterin / thymidine
- This method is effective when a hybridoma is obtained using HGPRT-deficient myeloma cells that cannot survive with aminopterin.
- hybridomas having resistance to aminopterin can selectively remain and grow.
- cloning a method for cloning a hybridoma
- a known method such as a methyl cellulose method, a soft agarose method, a limiting dilution method, or the like can be used (for example, Barbara, B. M. and Stanley, MS: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980)).
- a three-dimensional culture method such as a methylcellulose method is particularly suitable.
- a hybridoma group formed by cell fusion is suspended and cultured in a methylcellulose medium such as ClonaCell-HY Selection Medium D (manufactured by StemCell Technologies, # 03804), and the formed hybridoma colonies are recovered to obtain a monoclonal hybridoma. Can be obtained.
- a hybridoma strain that shows a stable antibody titer in the obtained hybridoma culture supernatant is selected as a GARP monoclonal antibody-producing hybridoma strain.
- hybridoma strains thus established include GARP hybridomas 151D and 198D.
- the antibody produced by GARP hybridomas 151D and 198D is referred to as “151D antibody” or “198D antibody” or simply “151D” or “198D”.
- the heavy chain variable region of the 151D antibody has the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 in the sequence listing.
- the light chain variable region of the 151D antibody has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing.
- the amino acid sequence of the heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 14 in the sequence listing.
- the amino acid sequence of the light chain variable region shown in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 16 in the sequence listing.
- the heavy chain variable region of the 198D antibody has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 in the sequence listing.
- the light chain variable region of the 198D antibody has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 21 in the sequence listing.
- the amino acid sequence of the heavy chain variable region shown in SEQ ID NO: 19 in the sequence listing is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing.
- the amino acid sequence of the light chain variable region shown in SEQ ID NO: 21 in the sequence listing is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 20 in the sequence listing.
- a method known per se can be used for this screening.
- the measurement of the antibody titer in the present invention can be performed by, for example, the ELISA method described in the item (b) above.
- the hybridoma obtained by the above method can be stored in a frozen state in liquid nitrogen or in a freezer at ⁇ 80 ° C. or lower.
- the hybridoma After completion of cloning, the hybridoma is cultured by changing the medium from HT medium to normal medium.
- Mass culture is performed by rotary culture using a large culture bottle or spinner culture.
- a monoclonal antibody that specifically binds to the protein of the present invention can be obtained by purifying the supernatant in this mass culture using a method well known to those skilled in the art, such as gel filtration.
- ascites containing a large amount of the monoclonal antibody of the present invention can be obtained by injecting a hybridoma into the abdominal cavity of a mouse of the same strain (for example, the above-mentioned BALB / c) or Nu / Nu mouse and allowing the hybridoma to grow. Can be obtained.
- mineral oil such as 2,6,10,14-tetramethylpentadecane (pristane) should be administered in advance (3-7 days ago). More ascites can be obtained.
- Monoclonal antibodies obtained by the above method are described in, for example, Weir, D. et al. M. : Handbook of Experimental Immunology, Vol. It can be purified by the method described in I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978).
- the monoclonal antibody thus obtained has a high antigen specificity for GARP.
- examples of the identification method include an ochterlony method, an ELISA method, and an RIA method.
- Octelrony method is simple, but concentration is necessary when the concentration of monoclonal antibody is low.
- the culture supernatant is directly reacted with the antigen-adsorbed solid phase, and further, antibodies corresponding to various immunoglobulin isotypes and subclasses are used as secondary antibodies. Isotypes and subclasses can be identified.
- a commercially available identification kit for example, mouse typer kit; manufactured by Bio-Rad
- a commercially available identification kit for example, mouse typer kit; manufactured by Bio-Rad
- F105 antibody, F110 antibody, 151D-derived antibody humanized 151D antibody
- an antibody having characteristics equivalent to those of a 198D-derived antibody humanized 198D antibody
- an antibody that binds to the same epitope as each of the above antibodies can be mentioned.
- the F105 antibody recognizes amino acid numbers 366 to 377, 407 to 445 and 456 to 470 in the amino acid sequence of GARP (SEQ ID NO: 1)
- the F110 antibody recognizes amino acid numbers 54 to 112 and 366 to 392 in the sequence.
- the epitope the region in the amino acid sequence of GARP can be cited as an epitope. If a newly produced monoclonal antibody binds to a partial peptide or a three-dimensional structure to which the F105 antibody or the like binds, it can be determined that the monoclonal antibody binds to the same epitope as the antibody such as the F105 antibody.
- the monoclonal antibody competes for binding of the antibody such as the F105 antibody to GARP (that is, the monoclonal antibody prevents the binding of the antibody such as the F105 antibody and GARP) Even if the sequence or structure of a specific epitope is not determined, it can be determined that the monoclonal antibody binds to the same epitope as the antibody such as the F105 antibody. When it is confirmed that the epitopes are the same, it is strongly expected that the monoclonal antibody has characteristics equivalent to those of the antibody such as the F105 antibody.
- the antibodies of the present invention include genetically engineered antibodies that have been artificially modified for the purpose of reducing heteroantigenicity against humans, such as chimeric (Chimeric ) Antibodies, humanized antibodies, and human antibodies as described above. These antibodies can be produced using known methods.
- the obtained antibody can be purified to homogeneity. Separation and purification of antibodies may be carried out using separation and purification methods used for ordinary proteins. For example, antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining column chromatography, filter filtration, ultrafiltration, salting out, dialysis, preparative polyacrylamide gel electrophoresis, isoelectric focusing, etc. (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R.Marshak et al.eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual.Ed Harlow and David Lane, Cold Labane, 1988) However, it is not limited to these.
- chromatography examples include affinity chromatography, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration chromatography, reverse phase chromatography, adsorption chromatography and the like. These chromatography can be performed using liquid chromatography such as HPLC or FPLC.
- Examples of the column used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
- a protein A column Hyper D, POROS, Sepharose F. et al. F. (Pharmacia) and the like.
- the obtained antibody can be evaluated for its ability to bind to an antigen by the method described in the Examples below, and a suitable antibody can be selected.
- DSC Differential scanning calorimetry
- Tm thermal denaturation midpoint
- a suitable antibody can be selected using stability as an index.
- Other indicators for selecting antibodies include high yields in suitable host cells and low aggregation in aqueous solutions. For example, since the antibody with the highest yield does not necessarily exhibit the highest thermal stability, it is necessary to select the most suitable antibody for human administration based on a comprehensive judgment based on the above-mentioned indicators. .
- anti-GARP human antibody of the present invention examples include antibodies obtained by the above-mentioned phage display method, preferably 105F antibody and 110F antibody having the following structure.
- the heavy chain of the 105F antibody has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing.
- the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 118 is a variable region
- the amino acid sequence consisting of amino acid residues 119 to 448 is a constant region.
- the variable region has CDRH1 composed of the amino acid sequence described in 26 to 35, CDRH2 composed of the amino acid sequence described in 50 to 66, and CDRH3 composed of the amino acid sequence described in 99 to 107 in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing. .
- the sequence of SEQ ID NO: 2 is shown in FIG.
- the light chain of the 105F antibody has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
- the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 112 is a variable region
- the amino acid sequence consisting of amino acid residues 113 to 217 is a constant region.
- the variable region has CDRL1 consisting of the amino acid sequence described in 23 to 36
- CDRL2 consisting of the amino acid sequence described in 52 to 58
- CDRL3 consisting of the amino acid sequence described in 91 to 101 in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
- the sequence of SEQ ID NO: 3 is shown in FIG.
- the heavy chain of the 110F antibody has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing.
- the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 123 is a variable region
- the amino acid sequence consisting of amino acid residues 124 to 453 is a constant region.
- the variable region has CDRH1 composed of the amino acid sequence described in 26 to 35, CDRH2 composed of the amino acid sequence described in 50 to 66, and CDRH3 composed of the amino acid sequence described in 99 to 112 in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. .
- the sequence of SEQ ID NO: 4 is shown in FIG.
- the light chain of the 110F antibody has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
- the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 111 is a variable region
- the amino acid sequence consisting of amino acid residues 112 to 216 is a constant region.
- the variable region has CDRL1 consisting of the amino acid sequence described in 23 to 36
- CDRL2 consisting of the amino acid sequence described in 52 to 58
- CDRL3 consisting of the amino acid sequence described in 91 to 100 in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing. .
- the sequence of SEQ ID NO: 5 is described in FIG.
- the 105F antibody heavy chain amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing.
- the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 354 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 of the Sequence Listing encodes the heavy chain variable region of the 105F antibody, and the nucleotide sequence consisting of nucleotides 355 to 1344 is the 105F antibody. Of the heavy chain constant region.
- the nucleotide sequence encoding the variable region is the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence described in nucleotide numbers 76 to 105 encoding CDRH1 in SEQ ID NO: 6, and the nucleotide sequence described in nucleotide numbers 148 to 198 encoding CDRH2. And a polynucleotide comprising the nucleotide sequence set forth in nucleotide numbers 295 to 321 encoding CDRH3. The sequence of SEQ ID NO: 6 is described in FIG.
- the 105F antibody light chain amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
- the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 336 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7 of the Sequence Listing encodes the light chain variable region of the 105F antibody, and the nucleotide sequence consisting of nucleotides 337 to 651 is the 105F antibody. Of the light chain constant region.
- the nucleotide sequence encoding the variable region is a polynucleotide consisting of the nucleotide sequence described in nucleotide numbers 67 to 108 encoding CDRL1 in SEQ ID NO: 7, and the nucleotide sequence described in nucleotide numbers 154 to 174 encoding CDRL2. And a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of nucleotide numbers 271 to 303 encoding CDRL3.
- the sequence of SEQ ID NO: 7 is described in FIG.
- the 110F antibody heavy chain amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing.
- the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 369 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 of the Sequence Listing encodes the heavy chain variable region of the 110F antibody, and the nucleotide sequence consisting of nucleotides 370 to 1359 is the 110F antibody. Of the heavy chain constant region.
- the nucleotide sequence encoding the variable region is the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence described in nucleotide numbers 76 to 105 encoding CDRH1, and the nucleotide sequence described in nucleotide numbers 148 to 198 encoding CDRH2, in SEQ ID NO: 8. And a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of nucleotide numbers 295 to 336 encoding CDRH3.
- the sequence of SEQ ID NO: 8 is described in FIG.
- the 110F antibody light chain amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 in the sequence listing.
- the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 333 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 of the Sequence Listing encodes the light chain variable region of the 110F antibody, and the nucleotide sequence consisting of nucleotides 334 to 648 is the 110F antibody. Of the light chain constant region.
- the nucleotide sequence encoding the variable region is the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence described in nucleotide numbers 67 to 108 encoding CDRL1 in SEQ ID NO: 9, and the nucleotide sequence described in nucleotide numbers 154 to 174 encoding CDRL2. And a polynucleotide comprising the nucleotide sequence of nucleotide numbers 271 to 300 encoding CDRL3.
- the sequence of SEQ ID NO: 9 is shown in FIG.
- the antibody of the present invention has cytotoxic activity equivalent to that of the 105F antibody or 110F antibody even when the antibody is separately obtained by a method other than the above antibody obtaining method. It is possible to acquire the antibody which has.
- An example of such an antibody is an antibody that binds to the same epitope as the 105F antibody or the 110F antibody. If the newly prepared antibody binds to the partial peptide or partial conformation to which the 105F antibody or 110F antibody binds, it can be determined that the antibody binds to the same epitope as the 105F antibody or 110F antibody.
- the antibody competes with the binding of 105F antibody or 110F antibody to GARP (that is, the antibody prevents binding of 105F antibody or 110F antibody to GARP)
- the antibody prevents binding of 105F antibody or 110F antibody to GARP
- it can be determined that the antibody binds to the same epitope as the 105F antibody or the 110F antibody.
- the epitope is the same, it is strongly expected that the antibody has a cytotoxic activity equivalent to that of the 105F antibody or the 110F antibody.
- the antibodies of the present invention include artificially modified recombinant antibodies. These antibodies can be produced using known methods.
- the antibody is preferably an antibody having at least all six CDRs of the heavy chain and light chain of the 105F antibody or 110F antibody, and having an inhibitory activity against ADCC activity and Treg immunosuppressive function, As long as it has characteristics, it is not limited to a specific antibody. More preferably, the antibody has the heavy chain variable region and the light chain variable region of the 105F antibody or 110F antibody.
- each heavy chain amino acid sequence and light chain amino acid sequence of the 105F antibody or the 110F antibody it is possible to select an antibody having an activity equivalent to that of the antibody.
- Such homology is generally 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, most preferably 99% or more.
- Homology where each CDR is the same as each antibody above.
- the above-mentioned heavy chain or light chain amino acid sequence may be combined with an amino acid sequence in which one to several amino acid residues are substituted, deleted, or added. It is possible to select an antibody having an activity equivalent to that of the antibody.
- the anti-GARP antibody according to the present invention include the following chimeric antibody and humanized antibody.
- chimeric antibody examples include antibodies in which the variable region and the constant region of the antibody are different from each other, for example, a chimeric antibody in which the variable region of a mouse or rat-derived antibody is joined to a human-derived constant region (Proc. Natl. Acad. Sci.U.S.A., 81, 6851-6855, (1984)).
- the chimeric antibody derived from the rat anti-human GARP antibody 151D has a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 117 of SEQ ID NO: 15 and a residue of amino acids 1 to 109 of SEQ ID NO: 17.
- An antibody comprising a light chain comprising a light chain variable region comprising an amino acid sequence comprising a group and may have a constant region derived from any human.
- the chimeric antibody derived from rat anti-human GARP antibody 198D comprises a heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 120 of SEQ ID NO: 19 and 1st to 109th of SEQ ID NO: 21.
- An antibody comprising a light chain comprising a light chain variable region comprising an amino acid sequence comprising amino acid residues and may have any human-derived constant region.
- a heavy chain having an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 466 of SEQ ID NO: 25 in the sequence listing and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 234 of SEQ ID NO: 27 An antibody consisting of a light chain, a heavy chain having an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 469 of SEQ ID NO: 29 in the sequence listing, and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 234 of SEQ ID NO: 31 Mention may be made of antibodies consisting of light chains.
- amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 19 is a signal sequence
- amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 136 is a variable region
- amino acid sequence consisting of amino acid residues 137 to 466 is a constant region.
- the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 20 is a signal sequence
- the amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 129 is a variable region.
- the amino acid sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues is a constant region.
- the amino acid sequence consisting of amino acid residues 1 to 19 is a signal sequence
- the amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 139 is a variable region.
- the amino acid sequence consisting of the 140th to 469th amino acid residues is a constant region.
- the amino acid sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues is a signal sequence
- the amino acid sequence consisting of the 21st to 129th amino acid residues is the variable region
- the amino acid sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues is a constant region.
- the heavy chain amino acid sequence of the c151D antibody shown in SEQ ID NO: 25 in the sequence listing is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24 in the sequence listing.
- the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 57 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 24 of the sequence listing encodes the heavy chain signal sequence of the c151D antibody
- the nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 408 is the nucleotide sequence of the c151D antibody. It encodes the heavy chain variable region
- the nucleotide sequence consisting of nucleotides 409 to 1398 encodes the heavy chain constant region of the c151D antibody.
- the light chain amino acid sequence of the c151D antibody shown in SEQ ID NO: 27 in the sequence listing is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 in the sequence listing.
- the nucleotide sequence consisting of the 1st to 60th nucleotides of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26 of the Sequence Listing encodes the light chain signal sequence of the c151D antibody
- the nucleotide sequence consisting of the 61st to 387th nucleotides is the nucleotide sequence of the c151D antibody. It encodes the light chain variable region
- the nucleotide sequence consisting of nucleotides 388 to 702 encodes the light chain constant region of the c151D antibody.
- the heavy chain amino acid sequence of the c198D antibody shown in SEQ ID NO: 29 in the sequence listing is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28 in the sequence listing.
- the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 57 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 28 of the Sequence Listing encodes the heavy chain signal sequence of c198D antibody, and the nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 417 is that of c198D antibody.
- the heavy chain variable region is encoded, and the nucleotide sequence consisting of nucleotides 418 to 1407 encodes the heavy chain constant region of the c198D antibody.
- the light chain amino acid sequence of the c198D antibody shown in SEQ ID NO: 31 in the sequence listing is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30 in the sequence listing.
- the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 60 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 30 of the Sequence Listing encodes the light chain signal sequence of c198D antibody, and the nucleotide sequence consisting of nucleotides 61 to 387 is the nucleotide sequence of c198D antibody. It encodes the light chain variable region, and the nucleotide sequence consisting of nucleotides 388 to 702 encodes the light chain constant region of the c198D antibody.
- a humanized antibody an antibody in which only a complementarity determining region (CDR) is incorporated into a human-derived antibody (see Nature (1986) 321, p.522-525), the CDR sequence is obtained by CDR grafting.
- an antibody International Publication Pamphlet WO 90/07861 in which amino acid residues of some frameworks are grafted to a human antibody can be mentioned.
- the heavy chain variable region of the 151D antibody consists of CDRH1 (GFTFSNYYMA) consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 26 to 35 in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing, and amino acid residues 50 to 59 in SEQ ID NO: 15. It possesses CDRH2 (SIGTVGGNTY) consisting of an amino acid sequence consisting of a group and CDRH3 (EDYGGFPH) consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues of amino acid numbers 99 to 106 in SEQ ID NO: 15.
- CDRH1 GTFSNYYMA
- SIGTVGGNTY amino acid sequence consisting of an amino acid sequence consisting of a group
- CDRH3 EDYGGFPH
- the light chain variable region of the 151D antibody consists of CDRL1 (KASQNVGTNVD) consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 24 to 34 in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing, and amino acid residues 50 to 56 in SEQ ID NO: 17. It possesses CDRL2 (GASNRYT) consisting of an amino acid sequence consisting of a group, and CDRL3 (LQYKYNPYT) consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues of amino acid numbers 89 to 97 in SEQ ID NO: 17.
- CDRL1 KASQNVGTNVD
- GSNRYT amino acid sequence consisting of a group
- CDRL3 LQYKYNPYT
- the heavy chain variable region of the 198D antibody consists of CDRH1 (GFSLTSFHVS) consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 26 to 35 in SEQ ID NO: 19 in the sequence listing, and amino acid residues 50 to 58 in SEQ ID NO: 19.
- CDRH2 TISSGGGTY
- CDRH3 ISGWGHYYVMDV
- the light chain variable region of the 198D antibody consists of CDRL1 (QASEDIYSGLA) consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 24 to 34 in SEQ ID NO: 21 in the sequence listing, and amino acid residues 50 to 56 in SEQ ID NO: 21. It possesses CDRL2 (GAGSLQD) consisting of an amino acid sequence consisting of a group, and CDRL3 (QQGLKFPLT) consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues of amino acid numbers 89 to 97 in SEQ ID NO: 21.
- CDRL1 QSEDIYSGLA
- CDRL2 GAGSLQD
- CDRL3 QQGLKFPLT
- Examples of the humanized antibody of rat antibody 151D include (1) an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 136 of SEQ ID NO: 33 (h151D-H1) or 35 (h151D-H4) in the sequence listing, (2) An amino acid sequence having at least 95% homology to the sequence of the framework region other than each CDR sequence in the sequence of (1) above, and (3) a framework other than each CDR sequence in the sequence of (1) above A heavy chain comprising a heavy chain variable region consisting of any one of amino acid sequences in which one or several amino acids are deleted, substituted or added in the region sequence, and (4) SEQ ID NO: 37 (h151D-L1) or 39 (h151D-L4) amino acid sequence consisting of the 21st to 129th amino acid residues, (5) at least 95% homology to the sequence of the framework region other than each CDR sequence in the sequence of (4) above An amino acid sequence having And (6) a light chain variable region comprising any one of amino acid sequences in which one or several amino acids are deleted, substituted
- a heavy chain having a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 136 of SEQ ID NO: 33 and 21 to 21 of SEQ ID NO: 37 An antibody comprising a light chain having a light chain variable region comprising an amino acid sequence comprising the 129th amino acid residue, and a heavy comprising a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence comprising the 20th to 136th amino acid residues of SEQ ID NO: 35
- An antibody consisting of a light chain having a light chain variable region consisting of a chain and an amino acid sequence consisting of amino acid residues 21 to 129 of SEQ ID NO: 39 can be mentioned.
- Further preferred combinations include an antibody (h151D-H1L1) comprising a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 33 and a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37, and a heavy chain and sequence having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 35
- An antibody (h151D-H4L4) consisting of a light chain having the amino acid sequence of No. 39 can be mentioned.
- a heavy chain having a heavy chain variable region consisting of an amino acid sequence consisting of amino acid residues 20 to 139 of SEQ ID NO: 41 and 21 to 21 of SEQ ID NO: 43 An antibody comprising a light chain having a light chain variable region comprising an amino acid sequence comprising the 129th amino acid residue can be mentioned.
- a further preferred combination is an antibody (h198D-H3L4) comprising a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 41 and a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 43.
- an antibody having cytotoxic activity equivalent to that of each of the above antibodies By combining the heavy chain amino acid sequence and the light chain amino acid sequence with a sequence having high homology, it is possible to select an antibody having cytotoxic activity equivalent to that of each of the above antibodies. Such homology is generally 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, most preferably 99% or more. Homology. An antibody having cytotoxic activity equivalent to that of each of the above antibodies by combining an amino acid sequence in which 1 to several amino acid residues are substituted, deleted or added to the amino acid sequence of a heavy chain or light chain Can be selected. In this specification, “several” means 1 to 10, 1 to 9, 1 to 8, 1 to 7, 1 to 6, 1 to 5, 1 to 4, Means 3 or 1 or 2;
- amino acid substitution in the present specification, conservative amino acid substitution is preferable.
- Conservative amino acid substitutions are those that take place within a group of amino acids that are related to an amino acid side chain.
- Such amino acid substitution is preferably performed within a range that does not deteriorate the properties of the substance having the original amino acid sequence.
- the homology between the two amino acid sequences is Blast algorithm version 2.2.2 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997). ), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Blast algorithm can also be used by accessing www.ncbi.nlm.nih.gov/blast on the Internet. The homology between the nucleotide sequence of the antibody of the present invention and the nucleotide sequence of another antibody can also be determined by Blast algorithm.
- the amino acid sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues is a signal sequence, and the 20th to 136th amino acids
- the amino acid sequence consisting of residues is a variable region, and the amino acid sequence consisting of amino acid residues 137 to 466 is a constant region.
- the amino acid sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues is a signal sequence, and the 21st to 129th amino acids
- the amino acid sequence consisting of residues is a variable region, and the amino acid sequence consisting of amino acid residues 130 to 234 is a constant region.
- the amino acid sequence consisting of the 1st to 19th amino acid residues is a signal sequence, and the 20th to 139th amino acid residues
- the amino acid sequence consisting of is the variable region, and the amino acid sequence consisting of the 140th to 469th amino acid residues is the constant region.
- the amino acid sequence consisting of the 1st to 20th amino acid residues is a signal sequence, and the 21st to 129th amino acid residues
- the amino acid sequence consisting of is the variable region, and the amino acid sequence consisting of the 130th to 234th amino acid residues is the constant region.
- the heavy chain amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 33 or 35 in the sequence listing for the humanized 151D antibody is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 32 or 34 in the sequence listing, respectively.
- the sequence of SEQ ID NO: 33 is shown in FIG. 21, the sequence of SEQ ID NO: 35 is shown in FIG. 23, the sequence of SEQ ID NO: 32 is shown in FIG. 31, and the sequence of SEQ ID NO: 34 is shown in FIG.
- nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 57 in each nucleotide sequence encodes the heavy chain signal sequence of humanized 151D antibody
- nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 408 is variable in the heavy chain of humanized 151D antibody antibody
- nucleotide sequence consisting of nucleotides 409 to 1398 encodes the heavy chain constant region of the humanized 151D antibody.
- the heavy chain amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 41 of the sequence listing relating to the humanized 198D antibody is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 40 of the sequence listing.
- the sequence of SEQ ID NO: 41 is described in FIG. 25, and the sequence of SEQ ID NO: 40 is described in FIG.
- nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 57 of the nucleotide sequence encodes the heavy chain signal sequence of the humanized 198D antibody
- nucleotide sequence consisting of nucleotides 58 to 417 is the heavy chain variable region of the humanized 198D antibody antibody
- nucleotide sequence consisting of nucleotides 418 to 1407 encodes the heavy chain constant region of the humanized 198D antibody.
- the light chain amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 37 or 39 of the sequence listing relating to the humanized 151D antibody is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 36 or 38 of the sequence listing, respectively.
- the sequence of SEQ ID NO: 37 is shown in FIG. 22
- the sequence of SEQ ID NO: 39 is shown in FIG. 24
- the sequence of SEQ ID NO: 36 is shown in FIG. 32
- the sequence of SEQ ID NO: 38 is shown in FIG.
- nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 60 of each nucleotide sequence encodes the light chain signal sequence of humanized 151D antibody
- nucleotide sequence consisting of nucleotides 61 to 387 is the light chain variable region of humanized 151D antibody
- nucleotide sequence consisting of nucleotides 388 to 702 encodes the light chain constant region of the humanized 151D antibody.
- the light chain amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43 of the sequence listing relating to the humanized 198D antibody is encoded by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 42 of the sequence listing.
- the sequence of SEQ ID NO: 43 is described in FIG. 26, and the sequence of SEQ ID NO: 42 is described in FIG.
- the nucleotide sequence consisting of nucleotides 1 to 60 of the nucleotide sequence encodes the light chain signal sequence of humanized 198D antibody
- the nucleotide sequence consisting of nucleotides 61 to 387 is the light chain variable region of humanized 198D antibody.
- the nucleotide sequence consisting of nucleotides 388 to 702 encodes the light chain constant region of the humanized 198D antibody.
- the homology between these nucleotide sequences and the nucleotide sequences of other antibodies can also be determined by Blast algorithm.
- Examples of the antibody of the present invention further include human antibodies that bind to the same epitope as humanized 151D antibody or humanized 198D antibody.
- An anti-GARP human antibody means a human antibody having only the gene sequence of an antibody derived from a human chromosome. Anti-GARP human antibodies can be obtained by the method described above.
- the human antibody becomes the same epitope as the humanized 151D antibody or humanized 198D antibody. It can be determined to be combined. Also, confirm that the human antibody competes for binding of humanized 151D antibody or humanized 198D antibody to GARP (ie, the human antibody prevents binding of humanized 151D antibody or humanized 198D antibody to GARP). Thus, even if the sequence or structure of a specific epitope is not determined, it can be determined that the human antibody binds to the same epitope as the humanized 151D antibody or humanized 198D antibody. When it is confirmed that the epitope is the same, it is strongly expected that the human antibody has a cytotoxic activity equivalent to that of the humanized 151D antibody or the humanized 198D antibody.
- the chimeric antibody, humanized antibody, or human antibody obtained by the above method can be evaluated for binding to an antigen by the method shown in the Examples described later, and a suitable antibody can be selected.
- the present invention also includes modified antibodies.
- the modified product means a product obtained by chemically or biologically modifying the antibody of the present invention.
- Chemical modifications include chemical modifications to the amino acid backbone, chemical modifications of N-linked or O-linked carbohydrate chains, and the like.
- Biological modifications include post-translational modifications (eg, glycosylation to N- or O-links, N- or C-terminal processing, deamidation, aspartic acid isomerization, methionine oxidation) And those in which a methionine residue is added to the N-terminal by expression using a prokaryotic host cell.
- those modified to allow detection or isolation of the antibody or antigen of the present invention for example, an enzyme label, a fluorescent label, and an affinity label are also included in the meaning of such a modified product.
- Such a modified product of the antibody of the present invention is useful for improving the stability and blood retention of the original antibody of the present invention, reducing the antigenicity, and detecting or isolating such an antibody or antigen.
- WO99 / 54342, WO00 / 61739, WO02 / 31140, and the like are known as techniques for regulating antibody sugar chain modification, but are not limited thereto.
- the antibody of the present invention includes an antibody whose sugar chain modification is regulated.
- an antibody gene When an antibody gene is once isolated and then introduced into an appropriate host to produce an antibody, a combination of an appropriate host and an expression vector can be used.
- Specific examples of the antibody gene include a combination of a gene encoding the heavy chain sequence of the antibody described herein and a gene encoding the light chain sequence.
- the heavy chain sequence gene and the light chain sequence gene When transforming a host cell, the heavy chain sequence gene and the light chain sequence gene can be inserted into the same expression vector, or can be inserted into separate expression vectors. is there.
- eukaryotic cells animal cells, plant cells, and eukaryotic microorganisms can be used. In particular, as animal cells, mammalian cells such as COS cells (Gluzman, Y. Cell (1981) 23, p.
- ATCC CRL-1650 which are monkey cells, mouse fibroblast NIH3T3 (ATCC: No CRL-1658) and Chinese hamster ovary cells (CHO cells, ATCC CCL-61) dihydrofolate reductase deficient strain (Urlaub, G. and Chasin, LA Proc. Natl. Acad. Sci. US (A. (1980) 77, p. 4126-4220).
- the antibody of the present invention comprises a step of culturing the transformed host cell and a step of collecting the target antibody from the culture obtained in the step.
- the antibody obtained by is also included.
- the present invention includes antibodies having such modifications, including deletions in which one or two amino acids have been deleted at the heavy chain carboxyl terminus, and the amidated deletions (for example, at the carboxyl terminal site).
- Heavy chain in which a proline residue is amidated is not limited to the above type.
- the two heavy chains constituting the antibody according to the present invention may be either one of the full length and the heavy chain selected from the group consisting of the above-mentioned deletion forms, or a combination of any two of them. It may be a thing.
- the amount ratio of each deletion can be influenced by the type and culture conditions of cultured mammalian cells producing the antibody according to the present invention, but the main component of the antibody according to the present invention is the carboxyl in both of the two heavy chains. A case where one terminal amino acid residue is deleted can be mentioned.
- Examples of the isotype of the antibody of the present invention include IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) and the like, and preferably IgG1 or IgG2.
- Antibody functions generally include antigen binding activity, activity that neutralizes antigen activity, activity that enhances antigen activity, ADCC activity, antibody-dependent cell-mediated phagocytosis (ADCP) activity, and complement dependency
- ADCP antibody-dependent cell-mediated phagocytosis
- CDC cytotoxicity
- the function which the antibody which concerns on this invention has is the binding activity with respect to GARP, Preferably it is ADCC activity, More preferably, Treg function inhibitory activity through ADCC activity Is cytotoxic activity (antitumor activity).
- the antibody of the present invention may have ADCP activity and / or CDC activity in addition to ADCC activity.
- ADCP activity occurs through cells and that CDC activity is induced through complement, it suppresses the growth of tumor cells (J Clin Oncol 28: 4390-4399. (2010)).
- Clin Cancer Res; 16 (1); 11-20. (2010)) the ADCP activity of the anti-GARP antibody according to the present invention is reported as the activity of a drug containing an existing anti-tumor antibody. At least the present inventors do not know.
- the antibody of the present invention may be an antibody having increased affinity for an antigen by multimerization.
- the antibody that multiplies may be one type of antibody or a plurality of antibodies that recognize multiple epitopes of the same antigen. Examples of the method for increasing the number of antibodies include binding between an IgG CH3 domain and two scFvs (single-chain antibodies), binding with streptavidin, and introduction of a helix-turn-helix motif.
- the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody which is a mixture of a plurality of types of anti-GARP antibodies having different amino acid sequences.
- An example of a polyclonal antibody is a mixture of a plurality of types of antibodies having different CDRs. As such a polyclonal antibody, a mixture of cells producing different antibodies can be cultured, and an antibody purified from the culture can be used (see WO2004 / 061104).
- An antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used as a modified antibody.
- PEG polyethylene glycol
- the antibody of the present invention may be one in which these antibodies and other drugs form conjugates (Immunoconjugate).
- immunoconjugate examples include those in which the antibody is bound to a radioactive substance or a compound having a pharmacological action (Nature Biotechnology (2005) 23, p. 1137-1146).
- Medicament containing anti-GARP antibody Since the antibody obtained by the method described in the above section "2. Production of anti-GARP antibody” shows cytotoxic activity against Treg, it is used as a medicine, particularly cancer and infection. It can be used as a therapeutic agent for infectious diseases (particularly malaria and HIV infection).
- the cell killing activity by antibodies in vitro can be measured by the activity of inhibiting cell proliferation.
- cancer cell lines overexpressing GARP can be cultured, antibodies can be added to the culture system at various concentrations, and the inhibitory activity against focus formation, colony formation and spheroid growth can be measured.
- the therapeutic effect on cancer of antibodies using experimental animals in vivo can be measured, for example, by administering antibodies to nude mice transplanted with tumor cell lines that highly express GARP and measuring changes in cancer cells .
- Types of cancer include lung cancer, renal cancer, urothelial cancer, colon cancer, prostate cancer, glioblastoma multiforme, ovarian cancer, pancreatic cancer, breast cancer, melanoma, liver cancer, bladder cancer, stomach cancer, esophageal cancer, blood cancer
- the present invention is not limited to these as long as cancer cells to be treated express GARP.
- a substance used for a formulation acceptable in the pharmaceutical composition of the present invention a substance which is non-toxic to a person who receives the pharmaceutical composition at a dosage or administration concentration is preferable.
- the pharmaceutical composition of the present invention changes or maintains pH, osmotic pressure, viscosity, transparency, color, isotonicity, sterility, stability, dissolution rate, sustained release rate, absorption rate, and penetration rate. Can be included for the formulation.
- Substances for formulation may include, but are not limited to: amino acids such as glycine, alanine, glutamine, asparagine, arginine or lysine, antibacterial agents, ascorbic acid, sodium sulfate or sodium bisulfite Antioxidants, phosphoric acid, citric acid, boric acid buffer, sodium bicarbonate, buffer such as Tris-Hcl solution, filler such as mannitol and glycine, chelate such as ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Agents, caffeine, polyvinylpyrrolidine, complexing agents such as ⁇ -cyclodextrin and hydroxypropyl- ⁇ -cyclodextrin, bulking agents such as glucose, mannose or dextrin, other carbohydrates such as monosaccharides and disaccharides, coloring agents, Flavoring agents, diluents, emulsifiers and hydrophilic polymers such as polyvinylpyrrolidine Low molecular weight polypeptides
- the amount of these substances for preparation is preferably added 0.001 to 100 times, particularly 0.1 to 10 times the weight of the anti-GARP antibody.
- the composition of a suitable pharmaceutical composition in the preparation can be appropriately determined by those skilled in the art depending on the disease to be applied, the route of administration and the like.
- the excipient or carrier in the pharmaceutical composition may be liquid or solid.
- Appropriate excipients and carriers may be water for injection, physiological saline, artificial cerebrospinal fluid and other substances commonly used for parenteral administration.
- Neutral physiological saline or physiological saline containing serum albumin can also be used as a carrier.
- the pharmaceutical composition may comprise a Tris buffer pH 7.0-8.5, an acetate buffer pH 4.0-5.5, and a citrate buffer pH 3.0-6.2. These buffers may also contain sorbitol and other compounds.
- the pharmaceutical composition of the present invention can include a pharmaceutical composition comprising an anti-GARP antibody, and a pharmaceutical composition comprising an anti-GARP antibody and at least one cancer therapeutic agent, the pharmaceutical composition of the present invention being a selected composition As a drug having the required purity, it is prepared as a freeze-dried product or liquid.
- a pharmaceutical composition containing an anti-GARP antibody and a pharmaceutical composition containing an anti-GARP antibody and at least one cancer therapeutic agent can also be molded as a lyophilized product using a suitable excipient such as sucrose.
- the cancer therapeutic agent contained together with the anti-GARP antibody may be administered to the individual simultaneously or separately with the anti-GARP antibody, or may be administered at different administration intervals. Also good.
- cancer therapeutic agents include abraxane, carboplatin, cisplatin, gemcitabine, irinotecan (CPT-11), paclitaxel, pemetrexed, sorafenib, vinblastin, or a drug described in WO2003 / 038043, and an LH-RH analog ( Leuprorelin, goserelin, etc.), estramustine phosphate, estrogen antagonists (tamoxifen, raloxifene, etc.), aromatase inhibitors (anastrozole, letrozole, exemestane, etc.), etc., but antitumor activity If it is a chemical
- the individual to be administered is not particularly limited, but preferably includes mammals,
- the pharmaceutical composition of the present invention can be prepared for parenteral administration or for oral digestive tract absorption.
- the composition and concentration of the preparation can be determined by the administration method, and the affinity of the anti-GARP antibody for GARP, that is, the dissociation constant (Kd value) for GARP, contained in the pharmaceutical composition of the present invention.
- Kd value dissociation constant
- the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention for humans can be determined. it can.
- the human anti-GARP antibody is administered to a human, about 0.001 to 100 mg / kg may be administered once or several times at intervals of 1 to 180 days.
- Examples of the form of the pharmaceutical composition of the present invention include injections containing infusions, suppositories, nasal agents, sublingual agents, and transdermal absorption agents.
- Example 1 Acquisition of antibody 1) -1 Separation of anti-GARP Fab by panning on Phage display n-CoDeR Fab phage library (BioInvent) was used for separation of Fab binding to GARP.
- GARP R & D Systems
- EZ-Link NHS-Chomogenic-Biotin reagent Thermo Scientific.
- biotinylated GARP is immobilized on Dynabeads Streptavidin M-280 (Life Technologies), phages are added, and unbound phages are washed using a magnet stand (DynaMag-2, Life Technologies). Removed.
- the phage bound to GARP was recovered by trypsin (Sigma-Aldrich) treatment, and the phage was amplified using Escherichia coli. Panning was performed three times in total, and a DNA fragment encoding Fab was excised from a polyclonal phagemid with a restriction enzyme, transferred to an expression vector for E. coli, and transformed into E. coli TOP10F '(Life Technologies). Fab was expressed in the presence of IPTG (Sigma-Aldrich) and subjected to screening by ELISA.
- HRP Horseradish peroxidase
- Primer A 5′-GAA ACA GCT ATG AAA TAC CTA TTG C-3 ′ (SEQ ID NO: 10)
- Primer B 5′-GCC TGA GCA GTG GAA GTC C-3 ′ (SEQ ID NO: 11)
- Primer C 5'-TAG GTA TTT CAT TAT GAC TGT CTC-3 '(SEQ ID NO: 12)
- Primer D 5′-CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG-3 ′ (SEQ ID NO: 13)
- nucleotide sequences of the variable regions of the 105F antibody and 110F antibody genes were determined.
- the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of the 105F antibody is a sequence consisting of nucleotides 1 to 354 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 of the Sequence Listing, and the nucleotide sequence of the light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 7 of the Sequence Listing. It was a sequence consisting of nucleotides 1 to 336 of the nucleotide sequence shown.
- the nucleotide sequence of the heavy chain variable region of the 110F antibody is a sequence consisting of nucleotides 1 to 369 of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 of the Sequence Listing, and the nucleotide sequence of the light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 9 of the Sequence Listing. It was a sequence consisting of nucleotides 1 to 333 of the nucleotide sequence shown.
- nucleotide sequence also the light chain variable region constant region nucleotide sequence of the light chain of human IgG 1 of the (CL: sequence Listing SEQ ID NO: 3 113 to 217 th amino acid sequence of the amino acid sequence shown in ) was then linked to an animal cell expression vector such as pcDNA3.3 (Invitrogen) to construct an animal cell IgG expression vector.
- the base sequence of the constructed IgG expression vector was reanalyzed, and the nucleotide sequence of the full length heavy chain of the 105F antibody was the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the sequence listing, and the nucleotide sequence of the full length light chain was SEQ ID NO: 7 in the sequence listing.
- nucleotide sequence is as shown in FIG. Further, it was confirmed that the nucleotide sequence of the full length of the heavy chain of the 110F antibody was the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 in the sequence listing, and the nucleotide sequence of the full length of the light chain was the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9 of the sequence listing. . Further, from the nucleotide sequence, the amino acid sequence of the full length heavy chain and light chain of the 105F antibody encoded by the sequence and the amino acid sequence of the full length heavy chain and light chain of the 110F antibody were determined.
- the amino acid sequence of the heavy chain of the 105F antibody was the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, and the amino acid sequence of the light chain was the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 in the sequence listing.
- the amino acid sequence of the heavy chain of the 110F antibody was the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing, and the amino acid sequence of the light chain was the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the sequence listing.
- IgG of 105F antibody or 110F antibody is transiently expressed by inserting the above IgG expression vector for animal cells into FreeStyle 293F cells (Life Technologies), and if necessary, Protein A Affinity column (HiTrap Mab Select SuRe After purification at GE Healthcare), the buffer solution in which IgG was dissolved was replaced with PBS by vivasin-20 (7 kMWCO, GE Healthcare) and subjected to the following step “1) -5”.
- the HRP-labeled anti-human Fc antibody (R & D Systems) diluted 5000 times with PBS was added to the mouse anti-GARP antibody and mouse IgG addition group for the 105F antibody, 110F antibody and human IgG addition group.
- HRP-labeled anti-mouse Fc antibody (R & D Systems) diluted 5000 times with PBS and allowed to react at room temperature for 1 hour.
- 0.1 mL of SuperSignal Pico ELISA Chemiluminescent substrate was added, and chemiluminescence after 10 minutes was measured with a plate reader (Envision 2104 Multilabel Reader, Perkin Elmer).
- a plate reader Envision 2104 Multilabel Reader, Perkin Elmer
- Example 2 Binding to antigen gene-expressing cells As a GARP expression vector, a human GARP cDNA clone (Origene) was purchased and cloned into a pcDNA3.1 (+) vector (Invitrogen) according to a conventional method. It was confirmed. HEK-293T cells (ATCC: CRL-11268) were transfected with a GARP expression vector and a pcDNA3.1 vector as a control using Lipofectamin 2000 (Invitrogen).
- FITC Fluorescein isothiocyanate
- Example 3 Binding to endogenous GARP-expressing cells 3) -1 Flow cytometric analysis using L428 cells A 105F antibody fluorescent label was prepared using Alexa Fluor 647 Monoclonal antibody labeling kit (Invitrogen). L428 cells (obtained from DSMZ) were washed twice with MACS buffer, suspended in the same solution, labeled 105F antibody was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes. After washing twice with MACS buffer and cell fixation with 1% PFA, detection was performed using a flow cytometer (Facs Canto II, Becton Dickinson).
- PBMC peripheral blood mononuclear cells
- a tissue fixing solution obtained by diluting 4% Paraformaldehyde phosphate buffer solution (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) twice with D-PBS (Invitrogen) was added and allowed to stand at 4 ° C. for 15 minutes or longer.
- FACS buffer After washing the cells with FACS buffer, the cells were measured with a flow cytometer (Facs Canto II: Becton Dickinson) and analyzed with FlowJo (Tree Star). As a result, it was shown that the 105F antibody binds to FoxP3-positive Treg like the commercially available anti-GARP antibody (FIG. 13).
- PBMCs were isolated from fresh peripheral blood of healthy individuals by the method 3) -2 above.
- NK cells were purified from PBMC using NK cell isolation kit (Miltenyi Biotec). The obtained NK cells were conditioned and cultured overnight in RP-F10 medium (Invitrogen) containing 100 IU / mL rhIL-2 (Novartis). The number of viable cells was counted by trypan blue dye exclusion test, and resuspended in RP-F10 medium so that the viable cell density was 2 ⁇ 10 5 cells / mL to obtain effector cells.
- Cell lysis rate (%) (AB) / (CB) ⁇ 100
- A: Count of sample well B: Average value of spontaneous release (well without antibody / effector cells) count (n 3). 50 ⁇ L and 100 ⁇ L of RP-F10 medium was added when the antibody was added and when the effector cells were added. Otherwise, the same operation as in the sample well was performed.
- Treg function inhibitory activity 4) -2-1 Preparation of Treg, Teff (effector T cell: CD4 positive CD25 negative helper T cell) and accessory cell 4) CD4 T from PBMC prepared in the same manner as 1-1-1.
- CD4 positive T cells are isolated using cell ISOLATION Kit (Miltenyi Biotec), FITC-labeled anti-CD4 antibody (Miltenyi Biotec) and APC-labeled anti-CD25 antibody (Miltenyi Biotec) are added, and the mixture is allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes. I put it.
- the culture medium includes Penicillin Streptomycin (Invitrogen), 1 ⁇ MEM NEAA (Invitrogen), 1 ⁇ Sodium pyruvate (Invitrogen), 5 mM Hepes and 5% Human RPMI1640 medium (Invitrogen) containing male AB serum (Sigma) was used. Teff (2000 cells / well) and accessory cells (20000 cells / well) were mixed in each well of a 96-well U-bottom microplate, and Treg was added and seeded at 500 cells / well. A group without Treg was also prepared.
- Anti-CD3 antibody, anti-CD28 antibody, and 105F antibody were added at a final concentration of 50 or 10 ⁇ g / mL, and cultured at 37 ° C. under 5% CO 2 for 5 days. Thereafter, [ 3 H] -thymidine (PerkinElmer) was adjusted to 18.5 kBq / mL, added at 20 ⁇ L / well, and further cultured for 18 hours. Cells were collected in Filtermat A (PerkinElmer) using a cell harvester (Mach II, Tomtech), and [ 3 H] -thymidine uptake value in each well using a scintillation counter (MicroBeta, PerkinElmer) was measured as a corrected count per minute (CCPM).
- CCPM corrected count per minute
- the human IgG1 anti-GARP antibodies (MHG8 and LHG10) prepared based on the sequence information described in Patent Document 1 were also used in this test system.
- FIG. 15 shows the Treg function inhibition results (inhibition rate 72.6%) of the 105F antibody at 50 ⁇ g / mL
- FIG. 16 shows the 10 ⁇ g / mL results for the 105F antibody, MHG-8 and LHG-10 antibodies.
- MHG-8 and LHG-10 antibodies did not show Treg function inhibitory activity (inhibition rate 0.8%, 0.0%), but 105F antibody significantly inhibited Treg function (inhibition rate 65.8%).
- the inhibition rate by Treg introduced with siRNA against GARP described in [Non-patent Document 10] is estimated by measuring the graph value of CD4 + CD25 ⁇ (Teff): Treg of 4: 1 in FIG. 5A. , About 15%.
- Example 5 Preparation of rat antibody 5) -1 Preparation of GARP expression vector
- the expression vector described in Example 2 was used, and for large-scale preparation, EndoFree Plasmid Giga Kit (QIAGEN) was used.
- OPD coloring solution OPD solution (0.05 M trisodium citrate, 0.1 M disodium hydrogenphosphate, 12 water pH 4.5).
- OPD solution 0.05 M trisodium citrate, 0.1 M disodium hydrogenphosphate, 12 water pH 4.5.
- o-Phenylenediamine dihydrochloride Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
- H 2 O 2 dissolved in 0.4 mg / ml and 0.6% (v / v), respectively, were added at 50 ⁇ l / well.
- the color development reaction was performed with occasional stirring, and 1 M HCl was added at 50 ⁇ l / well to stop the color development reaction, and then the absorbance at 490 nm was measured with a plate reader (ENVISION: PerkinElmer).
- HEK-293T cells (obtained from ATCC) should be 5 ⁇ 10 4 cells / cm 2 The cells were seeded in a cm 2 flask (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) and cultured overnight in a DMEM medium containing 10% FBS at 37 ° C. and 5% CO 2 . On the next day, a GARP expression vector and a pcDNA3.1 (+) vector as a negative control were introduced into HEK-293T cells using Lipofectamine 2000, and further cultured overnight at 37 ° C. and 5% CO 2 .
- expression vector-introduced HEK-293T cells were treated with TrypLE Express (Life Technologies), washed with DMEM medium containing 10% FBS, and then suspended in PBS containing 5% FBS. The resulting cell suspension was used for flow cytometry analysis.
- Example 5 The binding specificity of the antibody produced by the hybridoma determined to be positive by Cell-ELISA in Example 5) -4-2 to human GARP was further confirmed by flow cytometry analysis.
- Example 5 The suspension of transiently expressed HEK-293T cells prepared in -5-1 was centrifuged, and the supernatant was removed. Then, the hybridoma culture supernatant was added to each of the suspensions, and suspended at 4 ° C. Left for 1 hour.
- a histogram of FITC fluorescence intensity of live cells was prepared.
- a production hybridoma (113 clones) was selected.
- Hybridomas of 8-9 ⁇ 10 7 cells were seeded in 1272 cm 2 flasks (Corning) and cultured for 7 days.
- the main culture supernatant was collected by centrifugation, passed through a 0.8 ⁇ m filter, and further sterilized through a 0.45 ⁇ m filter (Corning).
- the antibody was purified from the culture supernatant of the hybridoma prepared in Example 5) -6-1 by Protein G affinity chromatography.
- the antibody was adsorbed onto a Protein G column (GE Healthcare Bioscience), and the column was washed with PBS and then eluted with 0.1 M glycine / hydrochloric acid aqueous solution (pH 2.7). After adjusting the pH to 7.0-7.5 by adding 1M Tris-HCl (pH 9.0) to the eluate, the buffer was replaced with PBS by dialysis (Thermo Scientific, Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette).
- the antibody was concentrated with Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (fractionated molecular weight UF30K, Sartorius) to prepare an antibody concentration of 0.7 mg / mL or more. Finally, it was filtered through a Minisart-Plus filter (Sartorius) to obtain a purified sample.
- VIVASPIN20 fractionated molecular weight UF30K, Sartorius
- Example 6 Cloning of Rat Antibody and Production of Human Chimeric Antibody 6) -1 Cloning of cDNA of rat antibody 151D and sequencing 6) -1-1 Preparation of total RNA from 151D-producing hybridoma cDNA containing 151D variable region For amplification, total RNA was prepared from 151D-producing hybridomas using TRIzol Reagent (Ambion).
- Example 6 -1-2 Amplification of cDNA containing 151D heavy chain variable region and determination of sequence by 5'-RACE PCR Amplification of cDNA containing heavy chain variable region was carried out in total in Example 6) -1-1. This was performed using about 1 ⁇ g of RNA and SMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech). As primers for PCR amplification of 151D heavy chain variable region cDNA, designed from UPM (Universal Primer A Mix: SMARTer RACE cDNA Amplification Kit) and known rat heavy chain constant region sequences Primers were used.
- the cDNA containing the heavy chain variable region amplified by 5'-RACE PCR was cloned into a plasmid, and then the sequence analysis of the nucleotide sequence of the heavy chain variable region cDNA was performed.
- the nucleotide sequence of the cDNA encoding the determined variable region of the 151D heavy chain is shown in SEQ ID NO: 14, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 15.
- Example 6 Cloning and sequencing of rat antibody 198D cDNA The sequence was determined in the same manner as in Example 2) -1.
- the nucleotide sequence of the cDNA encoding the determined variable region of the heavy chain of 198D is shown in SEQ ID NO: 18, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 19.
- the nucleotide sequence of the cDNA encoding the light chain variable region is shown in SEQ ID NO: 20, and the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 21.
- pCMA-LK Obtained by digesting plasmid pcDNA3.3-TOPO / LacZ (Invitrogen) with restriction enzymes XbaI and PmeI Using an In-Fusion Advantage PCR Cloning Kit (CLONTECH), a DNA fragment containing a DNA sequence encoding the human light chain signal sequence shown in SEQ ID NO: 22 and the human ⁇ chain constant region is bound to the approximately 5.4 kb fragment.
- PcDNA3.3 / LK was prepared.
- pCMA-LK was constructed by removing the neomycin expression unit from pcDNA3.3 / LK.
- Example 6 Same as Example 6) -3-3, using the cDNA encoding the variable region of the rat antibody 198D heavy chain obtained in -2 as a template A human chimeric 198D heavy chain expression vector was constructed by the method described above. The nucleotide sequence of the human chimeric 198D heavy chain and the amino acid sequence of the heavy chain are shown in SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 29, respectively.
- Example 6 -3-6 Construction of human chimeric 198D light chain expression vector Example 6)-Method similar to Example 6) -3-3 using the cDNA encoding the variable region of 198D light chain obtained in -2 as a template A human chimeric 198D light chain expression vector was constructed.
- the nucleotide sequence of the human chimeric 198D light chain and the amino acid sequence of the light chain are shown in SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 31, respectively.
- the human chimeric 151D antibody obtained by combining the human chimeric 151D heavy chain expression vector and the human chimeric 151D light chain expression vector is named “c151D”, and the human chimeric obtained by combining the human chimeric 198D heavy chain expression vector and the human chimeric 198D light chain expression vector.
- the 198D antibody was named “c198D”.
- Example 6 -4-2 Purification of chimeric antibody
- the culture supernatant obtained in Example 6) -4-1 was purified in one step of rProtein A affinity chromatography.
- the culture supernatant was applied to a column (manufactured by GE Healthcare Bioscience) filled with MabSelectSuRe equilibrated with PBS, and then the column was washed with PBS twice the column volume. Next, elution was performed with a 2M arginine hydrochloride solution (pH 4.0), and fractions containing the antibody were collected.
- a 2M arginine hydrochloride solution pH 4.0
- the fraction was subjected to buffer replacement with PBS using Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (fraction molecular weight UF30K, Sartorius) and the antibody was concentrated to prepare an antibody concentration of 1 mg / mL or more. Finally, it was filtered through a Minisart-Plus filter (Sartorius) to obtain a purified sample.
- VIVASPIN20 fraction molecular weight UF30K, Sartorius
- Example 7 Production of humanized antibody 7) -1 Molecular modeling of variable region of c151D antibody
- Molecular modeling of the variable region of c151D antibody is a method generally known as homology modeling (Methods in Enzymology, 203, 121-153). (1991)). Primary sequence of variable region of human immunoglobulin registered in Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 28, 235-242 (2000)) (Three-dimensional structure derived from X-ray crystal structure is available) was compared to the variable region of the c151D antibody. The three dimensional structure of the variable region was created by combining the coordinates of a model with high sequence homology to the heavy and light chains of the c151D antibody and their interface to obtain a “framework model”. A representative conformation for each CDR was then incorporated into the framework model. Finally, an energy minimization calculation was performed to eliminate the interatomic contact that is disadvantageous in terms of energy. The above procedure was performed using Discovery Studio (Dassault Systèmes).
- arginine residue at amino acid number 35 of the c151D heavy chain shown in SEQ ID NO: 25 in the sequence listing is left as a glycine residue.
- the 37th lysine residue is the leucine residue
- the 38th lysine residue is the arginine residue
- the 42nd serine residue is the alanine residue
- the 61th threonine residue is the glycine residue.
- the 62nd glutamine residue is the lysine residue
- the 68th alanine residue is the serine residue
- the 80th arginine residue is the alanine residue
- the 94th alanine residue is the serine residue
- 96 The serine residue is the asparagine residue
- the 103rd aspartic acid residue is the asparagine residue
- the 107th serine residue is the alanine residue
- the 112th threonine residue is the valine residue
- the valine residue of threonine and the 131st methionine residue It involves replacing the thin residues designed humanized 151D heavy chain was designated "h151D-H1-type heavy chain".
- the mature heavy chain from which the signal sequence is excised is a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 58 to 1398, which encodes the variable region.
- the constant region is encoded by a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 409 to 1398.
- variable region in SEQ ID NO: 32 in the sequence listing is a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 133 to 162 encoding CDRH1, a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 205 to 234 encoding CDRH2, and nucleotide numbers 352 to 375 encoding CDRH3. It has a nucleotide sequence consisting of In the amino acid sequence of the h151D-H1 type heavy chain (SEQ ID NO: 33), the mature heavy chain from which the signal sequence was excised is an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 20 to 466, and the variable region is based on amino acid numbers 20 to 136.
- the constant region is an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 137 to 466.
- the variable region is, in SEQ ID NO: 33 of the Sequence Listing, CDRH1 consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 45 to 54, CDRH2 consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 69 to 78, and amino acids described in amino acid numbers 118 to 125 It has CDRH3 consisting of the sequence. Furthermore, the sequences of SEQ ID NOs: 32 and 33 are also described in FIGS. 31 and 21, respectively.
- arginine residue at amino acid number 35 of the c151D heavy chain shown in SEQ ID NO: 25 in the sequence listing is the glycine residue, the 37th lysine residue is the leucine residue, 38 The lysine residue is the arginine residue, the 42nd serine residue is the alanine residue, the 61th threonine residue is the glycine residue, the 62nd glutamine residue is the lysine residue, the 94th Alanine residue as serine residue, 103rd aspartic acid residue as asparagine residue, 107th serine residue as alanine residue, 112th threonine residue as valine residue, 130th valine
- the humanized 151D heavy chain designed to replace the residue with a threonine residue and the 131st methionine residue with a leucine residue was named “h151D_H4 type heavy chain”.
- the mature heavy chain from which the signal sequence has been excised is a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 58 to 1398, which encodes the variable region.
- the constant region is encoded by a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 409 to 1398.
- variable region in SEQ ID NO: 34 in the sequence listing is a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 133 to 162 encoding CDRH1, a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 205 to 234 encoding CDRH2, and nucleotide numbers 352 to 375 encoding CDRH3. It has a nucleotide sequence consisting of Further, in the amino acid sequence of the h151D-H4 type heavy chain (SEQ ID NO: 35), the mature heavy chain from which the signal sequence was excised is an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 20 to 466, and the variable region consists of amino acid numbers 20 to 136.
- variable region is an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 137 to 466.
- the variable region is, in SEQ ID NO: 35 of the sequence listing, CDRH1 consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 45 to 54, CDRH2 consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 69 to 78, and amino acids described in amino acid numbers 118 to 125 It has CDRH3 consisting of the sequence. Further, the sequences of SEQ ID NOs: 34 and 35 are also described in FIGS. 33 and 23, respectively.
- the 31st methionine residue is the leucine residue
- the 32nd phenylalanine residue is the alanine residue
- the 33rd isoleucine residue is the valine residue
- the 35th valine residue is the leucine residue
- the 37th asparagine Acid residue as glutamic acid residue 39th valine residue as alanine residue
- 41st methionine residue as isoleucine residue 60th threonine residue as proline residue
- 83th threonine residue Group as serine residue
- 103rd leucine residue as valine residue 120th threonine residue as Number 124 on the glutamine residue
- the designed humanized 151D light chain was named “h151D_L1-type light chain”.
- the mature light chain with the signal sequence excised is the nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 61 to 702, which encodes the variable region.
- the constant region is encoded by a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 388 to 702.
- variable region in SEQ ID NO: 36 in the sequence listing is a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 130 to 162 encoding CDRH1, a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 208 to 228 encoding CDRH2, and nucleotide numbers 325 to 351 encoding CDRH3. It has a nucleotide sequence consisting of In the amino acid sequence of the h151D_L1 type light chain (SEQ ID NO: 37), the mature light chain from which the signal sequence was excised is an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 21 to 234, and the variable region is an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 21 to 129.
- the constant region is an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 130 to 234.
- the variable region is, in SEQ ID NO: 37 of the sequence listing, CDRH1 consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 44 to 54, CDRH2 consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 70 to 76, and amino acids described in amino acid numbers 109 to 117 It has CDRH3 consisting of the sequence. Further, the sequences of SEQ ID NOs: 36 and 37 are also described in FIGS. 32 and 22, respectively.
- threonine residue at amino acid number 29 of the c151D light chain shown in SEQ ID NO: 27 of the sequence listing is the serine residue, the 31st methionine residue is the leucine residue, the 32nd phenylalanine residue is the 33rd position of the serine residue
- the isoleucine residue of the amino acid is the alanine residue, the 41st methionine residue is the isoleucine residue, the 60th threonine residue is the proline residue, the 62nd glutamine residue is the lysine residue, and the 83rd threonine residue.
- the humanized 151D light chain designed to replace the 127th asparagine residue with a lysine residue and the 129th alanine residue with a threonine residue is called ⁇ h151D-L4 type light chain ''. Named.
- the mature light chain from which the signal sequence has been excised is a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 61 to 702, which encodes the variable region.
- the constant region is encoded by a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 388 to 702.
- variable region in SEQ ID NO: 38 of the Sequence Listing is a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 130 to 162 encoding CDRH1, a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 208 to 228 encoding CDRH2, and nucleotide numbers 325 to 351 encoding CDRH3. It has a nucleotide sequence consisting of In the amino acid sequence of the h151D-L4 type light chain (SEQ ID NO: 39), the mature light chain from which the signal sequence was excised is an amino acid sequence consisting of amino acids 21 to 234, and the variable region is composed of amino acids 21 to 129.
- variable region is an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 130 to 234.
- the variable region is, in SEQ ID NO: 39 of the Sequence Listing, CDRH1 consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 44 to 54, CDRH2 consisting of the amino acid sequence described in amino acid numbers 70 to 76, and amino acids described in amino acid numbers 109 to 117 It has CDRH3 consisting of the sequence. Further, the sequences of SEQ ID NOs: 38 and 39 are also described in FIGS. 34 and 24, respectively.
- variable region of c198D was carried out by a method generally known as homology modeling (Methods in Enzymology, 203, 121-153, (1991)). . Primary sequence of variable region of human immunoglobulin registered in Protein Data Bank (Nuc. Acid Res. 28, 235-242 (2000)) (Three-dimensional structure derived from X-ray crystal structure is available) was compared to the variable region of the c198D antibody. The three-dimensional structure of the variable region was created by combining the coordinates of a model with high sequence homology to the heavy and light chains of the c198D antibody and their interface to obtain a “framework model”. A representative conformation for each CDR was then incorporated into the framework model. Finally, an energy minimization calculation was performed to eliminate the interatomic contact that is disadvantageous in terms of energy. The above procedure was performed using Discovery Studio (Dassault Systèmes).
- the mature heavy chain from which the signal sequence has been excised is a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 58 to 1407, which encodes the variable region.
- the constant region is encoded by a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 418 to 1407.
- the variable region in SEQ ID NO: 40 in the sequence listing is a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 130 to 162 encoding CDRH1, a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 205 to 231 encoding CDRH2, and nucleotide numbers 349 to 384 encoding CDRH3. It has a nucleotide sequence consisting of In the amino acid sequence of the h198D-H3 type heavy chain (SEQ ID NO: 41), the mature heavy chain from which the signal sequence was excised is an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 20 to 469, and the variable region consists of amino acid numbers 20 to 139.
- the constant region is an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 140 to 469. Further, the sequences of SEQ ID NOs: 40 and 41 are also described in FIGS. 35 and 25, respectively.
- the 33rd glycine residue is the alanine residue
- the 35th leucine residue is the valine residue
- the 37th glutamic acid residue is the aspartic acid residue
- the 38th threonine residue is the arginine residue
- 42nd glutamine residue as threonine residue 65th glutamine residue as lysine residue
- 85th glycine residue as serine residue 92nd serine residue as threonine residue
- 94th position Lysine residues as threonine residues 98th methionine residue as leucine residue
- Threonine residue 120th serine residue as glutamine residue
- 124th leucine residue as valine residue 129th alanine residue as threonine residue.
- the humanized 198D light chain was named
- the mature light chain from which the signal sequence has been excised is a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 61 to 702, which encodes the variable region.
- the constant region is encoded by a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 388 to 702.
- variable region in SEQ ID NO: 42 of the Sequence Listing is a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 130 to 162 encoding CDRH1, a nucleotide sequence consisting of nucleotide numbers 208 to 228 encoding CDRH2, and nucleotide numbers 325 to 351 encoding CDRH3. It has a nucleotide sequence consisting of Further, in the amino acid sequence of the h198D_L4 type light chain (SEQ ID NO: 43), the mature light chain from which the signal sequence was excised is an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 21 to 234, and the variable region is an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 21 to 129. The constant region is an amino acid sequence consisting of amino acid numbers 130 to 234. Further, the sequences of SEQ ID NOs: 42 and 43 are also described in FIGS. 36 and 26, respectively.
- a DNA fragment containing a sequence encoding the h151D-L1 type light chain represented by nucleotide numbers 61 to 704 of the nucleotide sequence of the h151D-L1 type light chain represented by SEQ ID NO: 9 in the sequence listing was synthesized (GENEART Artificial gene synthesis service).
- An h151D-L1 type heavy chain expression vector was constructed from the synthesized DNA fragment according to the protocol of Bioliga (registered trademark) CHOK1SV Technology of Lonza. The constructed expression vector was named “GSV-h151D-L1”.
- the MACA-1511a expression vector was constructed from the constructed expression vectors “GSV-h151D-H1” and “GSV-h151D-L1” according to the Bioliga® and Lonza's Potelligent® CHOK1SV Technology protocol. did.
- the obtained expression vector was designated as “DGV-h151D-H1L1-GS”.
- a MACA-1514a expression vector was constructed according to the protocol of BioWa and Lonza's Potelligent (registered trademark) CHOK1SV Technology.
- the obtained expression vector was designated as “DGV-h151D-H4L4-GS”.
- a MACA-1983a expression vector was constructed according to the protocol of BioWa and Lonza's Potelligent (registered trademark) CHOK1SV Technology.
- the obtained expression vector was designated as “DGV-h198D-H3L4-GS”.
- Example 7) -10-1-2 Production of humanized anti-human GARP antibody h151D-H4L4 producing cells
- the resulting production strain was named “MAC2-1”.
- Example 7 Humanized anti-human constructed in Example 7) -9-3 in the same manner as in 10-1-1
- the resulting production strain was named “MAC3-1”.
- Example 7) Prepared in 10-1-1
- the humanized anti-human GARP antibody h151D-H1L1 production strain “MAC1-1” was cultured using a culture apparatus Wave reactor (GE Healthcare Japan).
- the production strain “MAC1-1” was thawed using Dsp04B (JX Energy) medium and cultured at 37 rpm in a 5% CO 2 incubator at 120 rpm.
- the obtained culture broth was diluted with C36 (JX Energy) medium and expanded at 120 rpm in a 37 ° C., 5% CO 2 incubator.
- the obtained culture broth was diluted with C36 medium to a cell density of 30 ⁇ 10 4 cells / mL and charged into WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience), 37 ° C, 5% CO 2 , air supply amount 0.3 L / Min., Rocking 18-24 rpm, angle 6-8 ° for 13 days.
- FM4Ae2 medium self-prepared was added daily for 6% of the charged amount per day.
- the obtained culture solution was roughly filtered with a depth filter Millistak MC0HC054H1 (Merck Millipore) and then filtered with a 0.22 ⁇ m filter (Sartorius) attached to Flexboy Bags. This filtrate was named “MACA-1511a culture supernatant”.
- Example 7 -10-2-2 Culture of cells producing humanized anti-human GARP antibody h151D_H4L4 Similar to Example 7) -10-2-1, humanized anti-human prepared in Example 7) -10-1-2
- the GARP antibody h151D-H4L4 production strain “MAC2-1” was cultured and expanded, and fed-batch culture was performed using a culture apparatus Wave reactor (GE Healthcare Japan). The cells were diluted with C36 medium to a cell density of 30 ⁇ 104 cells / mL, charged into WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience), and cultured for 13 days. The obtained culture solution was filtered, and this filtrate was named “MACA-1514a culture supernatant”.
- Example 7) -10-2-3 Culture of humanized anti-human GARP antibody h198D-H3L4 producing cells As in Example 7) -10-2-1, humanization prepared in Example 7) -10-1-3
- the anti-human GARP antibody h198D-H3L4 production strain “MAC3-1” was cultured and expanded, and fed-batch culture was performed using a culture apparatus Wave reactor (GE Healthcare Japan). The cells were diluted with C36 medium to a cell density of 30 ⁇ 10 4 cells / mL, charged into WAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience), and cultured for 13 days. The obtained culture broth was filtered, and this filtrate was named “MACA-1983a culture supernatant”.
- Example 7) “MACA- The “1511a culture supernatant” was purified in three steps: rProtein A affinity chromatography, anion exchange chromatography, and cation exchange chromatography. First, the culture supernatant was applied to rProtein A affinity chromatography resin equilibrated with PBS. After all of the culture solution entered the column, the column was washed with PBS, a buffer solution containing arginine, and PBS. Next, elution was performed with an acetate buffer, and an absorption peak at 280 nm was collected.
- the recovered solution was neutralized with Tris buffer, roughly filtered with a glass fiber filter AP20 (Merck Millipore), and then filtered with Stericup-GV (Merck Millipore), which is a 0.22 ⁇ m filter, to obtain an rProteinA purification pool.
- Tris buffer roughly filtered with a glass fiber filter AP20 (Merck Millipore), and then filtered with Stericup-GV (Merck Millipore), which is a 0.22 ⁇ m filter, to obtain an rProteinA purification pool.
- the rProteinA purified pool was then applied to an anion exchange chromatographic resin equilibrated with PBS. After all of the Apply solution entered the column, PBS was passed through. An absorption peak at 280 nm when the flow-through fraction and PBS were passed was collected. The pH of the recovered solution was adjusted with acetic acid, roughly filtered with a glass fiber filter AP20 (Merck Millipore), and then filtered with Stericup-GV (Merck Millipore), which is a 0.22 ⁇ m filter, to obtain an AEX purification pool. The AEX purification pool was then applied to a cation exchange chromatographic resin equilibrated with acetate buffer.
- the column was washed with an acetate buffer. Next, elution was performed using an acetic acid buffer containing high-concentration NaCl, and an absorption peak at 280 nm was collected.
- the recovered liquid was roughly filtered with a glass fiber filter AP20 (Merck Millipore) and then filtered with a Stericup-GV (Merck Millipore), which is a 0.22 ⁇ m filter, to obtain a CEX purification pool.
- the purified CEX pool was concentrated with Pellicon 3 Cassette 30 kDa (Merck Millipore) to an antibody concentration of 25 mg / mL, and then replaced with histidine buffer (25 mM Histidine, 5% Sorbitor, pH 6.0). Finally, after roughly filtering with a glass fiber filter AP20 (Merck Millipore), filtered with Stericup-GV (Merck Millipore), which is a 0.22 ⁇ m filter, was used as a purified sample. The purified sample was named “h151D-H1L1”.
- Example 7 -10-3-2 Purification of humanized anti-human GARP antibody h151D-H4L4 In the same manner as in Example 7) -10-3-1, "MACA-" obtained in Example 7) -10-2-2 The “1514a culture supernatant” was purified in three steps: rProtein A affinity chromatography, anion exchange chromatography, and cation exchange chromatography. The purified sample was named “h151D-H4L4”.
- Example 7 -10-3-3 Purification of humanized anti-human GARP antibody h198D-H3L4
- the “MACA- The “1983a culture supernatant” was purified in three steps: rProtein A affinity chromatography, anion exchange chromatography, and cation exchange chromatography.
- the purified sample was named “h198D-H3L4”.
- Example 7 -11 Evaluation of binding of humanized anti-human GARP antibody to human GARP
- Example 7 Measurement of dissociation constants of humanized anti-human GARP antibodies h151D-H1L1, h151D-H4L4 and h151D-H3L4 prepared in Example 10 and GARP was performed by a capture method using Biacore T200 (GE Healthcare Biosciences Co., Ltd.), capturing (capturing) an antibody with immobilized Protein A as a ligand, and measuring the antigen as an analyte.
- HBS-EP + GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.
- Protein A GE Healthcare Bioscience Co., Ltd.
- Example 8 Binding to antigen gene-expressing cells 8) -1 Binding to GARP
- a HEK-293T cell suspension into which a human GARP expression vector and a control vector were introduced was prepared by the method described in Example 2.
- h151D-H1L1, h151D-H4L4, and h198D-H3L4 and control human IgG human IgG: Eureka Therapeutics
- h151DH-1L1, h151D-H4L4, and h198D-_H3L4 showed a fluorescence intensity histogram similar to that of control IgG (denoted as Mock vector-transfected HEK293T in the figure).
- the histograms of h151D-H1L1, h151D-H4L4, and h198D_H3L4 have strong fluorescence intensity compared to the fluorescence intensity histogram of control human IgG. I confirmed that it was shifting to the side. From the above results, it was revealed that h151D-H1L1, h151D-H4L4 and h198D-H3L4 specifically bind to GARP.
- 105F To the obtained cell suspension, 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, and h198D-H3L4 according to the present invention, and a known antibody (human IgG1 anti-GARP antibody: MHG8 prepared based on the sequence information described in Patent Document 1) And LHG10) and control human IgG (Eureka Therapeutics) were added and allowed to stand at 4 ° C. for 15 minutes. After washing twice with FACS buffer, PE-labeled anti-IgG antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories) and Horizon FVS450 (Becton Dickinson) were added and suspended, and the mixture was further allowed to stand at 4 ° C. for 15 minutes.
- a known antibody human IgG1 anti-GARP antibody: MHG8 prepared based on the sequence information described in Patent Document 1 And LHG10
- PE-labeled anti-IgG antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories
- Horizon FVS450 Becton Dickinson
- MHG8 and LHG10 had a fluorescence intensity histogram similar to that of control IgG, indicating that they did not bind to the GARP mutant as described in [Non-patent Document 12]. From the above results, it was shown that each antibody of 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, and h198D-H3L4 binds to both GARP and GARP variants co-expressed with TGF ⁇ 1, and MHG8 and LHG10 antibodies It was found that GARP binds to different regions.
- Example 9 Binding to endogenous GARP-expressing cells 9) -1 Flow cytometry analysis using L428 cells L428 cells were washed twice with FACS buffer, suspended in the same solution, h151D-H1L1, h151D-H4L4, H198D_H3L4 and control human IgG (human IgG: Eureka Therapeutics) were added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 15 minutes. After washing twice with FACS buffer, a PE-labeled anti-IgG antibody (Jackson ImmunoResearch Laboratories) was added and suspended, and the mixture was further allowed to stand at 4 ° C. for 15 minutes.
- h151D-H1L1, h151D-H4L4, H198D_H3L4 and control human IgG human IgG: Eureka Therapeutics
- the subsequent analysis method using a flow cytometer was carried out in the same manner as described in Example 3, and a histogram of PE fluorescence intensity was created.
- the histograms added with h151D-H1L1, h151D-H4L4, and h198D_H3L4 antibodies were observed to shift to the strong fluorescence intensity side, h151D-H1L1 H151D-H4L4 and h198D-H3L4 were confirmed to bind to endogenously expressed GARP (FIG. 39).
- FITC-labeled anti-IgG antibody Jackson ImmunoResearch Laboratories
- Horizon FVS450 Becton Dickinson
- FACS buffer After washing the cells again with FACS buffer, cells were prepared using FoxP3 Staining Buffer Set (Miltenyi Biotec), PE-labeled anti-Foxp3 antibody (Miltenyi Biotec) was added, and the mixture was allowed to stand at 4 ° C. for 30 minutes.
- Example 10 Properties of anti-GARP antibody 10) -1 ADCC activity h151D-H1L1, h151D-H4L4, and h198D-H3L4 and known antibodies (human IgG1 anti-GARP antibody prepared based on sequence information described in Patent Document 1: The ADCC activity of each antibody of MHG8 and LHG10) and each antibody of control human IgG (Sigma) was measured by the method described in Example 4.
- the h151D-H1L1, h151D-H4L4, and h198D-H3L4 antibodies showed cytolytic activity against L428 cells in an antibody concentration-dependent manner (FIG. 41A).
- Treg function inhibitory activity of each antibody of h151D-H1L1, h151D-H4L4, and h198D-H3L4 was measured by the method described in Example 4.
- Figure shows the Treg function inhibitory activity (h151D-H1L1 inhibition rate 81.5%, h151D-H4L4 inhibition rate 80.4%, h198D-H3L4 inhibition rate 70.8%) of h151D-H1L1, h151D-H4L4, and h198D-H3L4 at a final concentration of 1 ⁇ g / mL Shown in 42.
- h151D-H1L1, h151D-H4L4, and h198D-H3L4 antibodies were shown to have Treg function inhibitory activity.
- CTL Cytotoxic T lymphocyte
- MU28 CD8B35 Clone # 7 obtained from Mie University
- NY-ESO-1 specific T cell receptor were prepared according to Mie University protocol. ⁇ 10 5 cells / 25 cm 2 flask (Sumitomo Bakelite) in the presence of anti-CD3 antibody (OKT3: Imgenex), IL-2 (Novartis), and feeder cells, 10% Human male AB serum (Sigma For 7 days in RPMI1640 medium (Invitrogen).
- the feeder cell group was CD8-depleted PBMC (7.5 ⁇ 10 6 cells / 25 cm 2 ) obtained by removing CD8 positive cells from PBMC thawed frozen human PBMC (Cellular Technology) according to the protocol using CD8 MicroBeads (Miltenyi Biotech). Flask), and 103-LCL cells (obtained from RIKEN BioResource Center) (1.5 ⁇ 10 6 cells / 25 cm 2 flask) subjected to X-ray irradiation using an X-ray irradiation device (Hitachi Medical Corporation) It was used.
- Treg obtained by the method shown in 2-1 was added at the start of the main culture (1.5 ⁇ 10 5 cells / 25 cm 2 flask) to evaluate the inhibitory effect of Treg on CTL cell activity.
- Treg (7.5 ⁇ 10 4 cells / 25 cm 2 flask) obtained by the same method and each antibody of 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, h198D-H3L4, and human IgG1 (Enzo) were cultured.
- the antitumor activity of each antibody was evaluated by adding (10 ⁇ g / ml) at the start.
- CTL cells were prepared by purifying and isolating CD8 positive cells using CD8 + T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotech) and used for activity evaluation.
- Target cell preparation SK-MEL-52 cells expressing NY-ESO-1 in a human melanoma cell line (obtained from Mie University: Proc Natl Acad Sci US A. 1980 Jul; 77 (7): 4260-4) was cultured in 10% FBS-containing RPMI1640 medium (Invitrogen). Labeling with 51 Cr was carried out in the same manner as in Example 4) -1-2, and 2 ⁇ 10 4 cells. / mL was used as a target cell.
- PBS control 1 administered on days 6, 10, 14, 18, 22, 26, human PBMC (Lot: 20140707) administered on days 6, 14, 22, 105F antibody: 5 mg / kg on days 6, 10, 14, 18, 22, 26 Administration, administration of human PBMC (Lot: 20140707) on day 6, 14, 22
- PBS control 2 administration on day 6, 10, 14, 18, 22; administration of human PBMC (Lot: 20150924) on day 6, 14, 22 h151D-H1L1 antibody : 1 mg / kg administered on Day 6, 10, 14, 18, 22; human PBMC (Lot: 20150924) administered on Day 6, 14, 22 h151D-H4L4 antibody: 1 mg / kg on Day 0, 6, 10, 14, 18, 22 Administration, administration of human PBMC (Lot: 20150924) on Day 6, 14, 22 h198D-H3L4 antibody: administration of 1 mg / kg on Day 0, 6, 10, 14, 18, 22; human PBMC (Lot: 20150924 on Day 6, 14, 22) Administration
- Each antibody was diluted and prepared with PBS (Invitrogen) and administered from the tail vein (10 mL / kg).
- Human PBMC was prepared by thawing frozen human PBMC (Cellular Technology) according to the protocol to 1 ⁇ 10 7 cells / mL, and 0.2 mL was administered via the tail vein.
- the major axis (mm) and minor axis (mm) of the tumor were measured over time with an electronic digital caliper (manufactured by Mitutoyo Corporation), and the tumor volume was calculated using the following formula.
- Tumor volume (mm3) 1/2 ⁇ [tumor major axis] ⁇ [tumor minor axis] ⁇ [tumor minor axis] FIG.
- each antibody of 105F, h151D-H1L1, h151D-H4L4, and h198D-H3L4 showed antitumor activity against L428 cells compared to the control group administered with PBMC alone, and showed a significant difference (105F: t test, h151D-H1L1, h151D-H4L4, and h198D-H3L4: Dunnett's multiple comparison test) were observed.
- Example 11 Epitope analysis of anti-GARP antibodies
- the epitopes of anti-human GARP antibodies were analyzed by hydrogen deuterium exchange mass spectrometry. Equal amounts of 7 mg / mL anti-human GARP antibody and 3 mg / mL human GARP (R & D Systems) or blank buffer were mixed, and 9 equivalents of light or heavy water was added to this solution. After 30 seconds, 480 seconds, 6000 seconds, or overnight, an equal amount of 100 mM phosphoric acid, 4M Gdn ⁇ HCl, 150 mM TCEP, pH 2.5 was added to the sample to replace with heavy water.
- the sample substituted with heavy water was injected into the HPLC under cooling, and sent to an immobilized pepsin column with a 0.1% TFA solution.
- Peptide fragments obtained by digestion of human GARP in a pepsin column were retained in a C18 trap column and subsequently eluted with a linear gradient of water and acetonitrile with 0.1% formic acid and 0.025% TFA to obtain C18.
- the separated peptide fragment was subjected to mass spectrometry using a time-of-flight mass spectrometer.
- the heavy water substitution rate was calculated from the mass of each peptide, and peptide fragments in which a significant decrease in the heavy water substitution rate was recognized by addition of the anti-human GARP antibody were identified as epitope fragments.
- 105F suppression of the heavy water substitution rate was observed at the human GARP residues 366-377, 407-445, and 456-470 shown in SEQ ID NO: 1, and it was identified as an epitope.
- 110F suppression of the heavy water substitution rate was recognized at residues 54-112 and 366-392 of human GARP shown in SEQ ID NO: 1, and it was identified as an epitope.
- h151D-H1L1 suppression of the heavy water substitution rate was observed at residues 352 to 392 of human GARP shown in SEQ ID NO: 1, and the epitope was identified as an epitope.
- h198D-H3L4 suppression of the heavy water substitution rate was observed at residues 18-112 of human GARP shown in SEQ ID NO: 1, and it was identified as an epitope.
- the anti-GARP antibody of the present invention has antitumor activity due to Treg function inhibitory activity via ADCC activity, and a pharmaceutical composition containing the anti-GARP antibody can be an anticancer agent.
- Treg in patients with malaria and HIV infection correlate with these disease states, and in the mouse pathological model, removal of Treg results in remission of the disease state. Effective inhibition can be expected to have therapeutic effects even in intractable infections such as malaria and HIV.
- SEQ ID NO: 1-GARP amino acid sequence SEQ ID NO: 2-105F antibody heavy chain amino acid sequence SEQ ID NO: 3-105F antibody light chain amino acid sequence SEQ ID NO: 4-110F antibody heavy chain amino acid sequence SEQ ID NO: 5-110F antibody light chain Amino acid sequence SEQ ID NO: 6-nucleotide sequence SEQ ID NO: 7-105F antibody light chain nucleotide sequence SEQ ID NO: 8-110F antibody heavy chain nucleotide sequence SEQ ID NO: 9-110F antibody light chain nucleotide sequence SEQ ID NO: 10- Primer A SEQ ID NO: 11—Primer B SEQ ID NO: 12—Primer C SEQ ID NO: 13—Primer D SEQ ID NO: 14-nucleotide sequence of cDNA encoding 151D heavy chain variable region SEQ ID NO: 15-amino acid sequence of 151D heavy chain variable region SEQ ID NO: 16-nucleotide sequence of cDNA encoding 151D light chain variable region SEQ ID
Abstract
Description
Glycoprotein-A Repetitions Predominant(GARP)は、1回膜貫通構造を有する蛋白質であり[非特許文献2]、活性化したTregの細胞表面に発現し、latent TGF-β(免疫寛容誘導の重要分子であるTGF-βの前駆体)との複合体を形成する[非特許文献3]。
Tregと、Tregが免疫抑制をもたらす標的細胞との、細胞-細胞間相互作用により、GARPを介してTregの細胞表面に留められているlatent TGF-βから成熟化TGF-βが分泌され、TGF-βの免疫抑制シグナルが標的細胞へ直接伝達される[非特許文献4、5]。このTGF-βの成熟化にはGARPの細胞膜上での発現が必要であることが示されている[非特許文献5]が、一方で膜貫通領域を欠損した可溶性GARPをCD4陽性T細胞に直接添加した場合にもCD4陽性T細胞の増殖が抑制される[非特許文献6]ことから、細胞膜上でのTGF-β成熟化機構を介さない、GARPによる免疫抑制メカニズムの存在も否定できない。
GARPは、末梢血由来活性化Tregに発現が認められる他に、臨床的には癌患者の腫瘍患部へ浸潤したT細胞(Tumor Infiltrating Tcells)中に存在するTreg[非特許文献7]、及び腹水中に存在するTreg[非特許文献8]、又は患者末梢血中に存在するTregでの発現が認められる[非特許文献9]。
GARPの発現を抑制した際のTreg機能への影響を検討した報告として、GARPに対するsiRNAを導入したTregでは、ヘルパーT細胞に対する増殖抑制機能の阻害が認められたが、当該阻害効果は部分的であった[非特許文献10]。
一方、TGF-β成熟化の阻害能を指標に獲得された抗GARP抗体(MHG-8、LHG-10)は、ヘモクロマトーシス患者から樹立したTreg A1細胞株[非特許文献11]の、ヘルパーT細胞に対する増殖抑制機能を阻害した[特許文献1、非特許文献12]。しかしながら、当該抗体が腫瘍微小環境下のTregに対して当該阻害効果を有効に示すか否かは不明であり、またこれまでにそのような効果を有する抗GARP抗体の報告はない。なおGARP及びTGF-βの両者を認識する抗体も知られている[特許文献2]。
Tregについては、腫瘍の他にも、マラリア、HIV感染症の各患者でのTregの過剰な存在と活性化がそれら病勢との相関関係を示すこと[非特許文献13、14]、及びマウス病態モデルではTregの除去が病状の寛解をもたらすこと[非特許文献15、16]が示されている。
(1)以下の特性を有することを特徴とする抗体;
(a)Glycoprotein-A Repetitions Predominant (GARP)に特異的に結合する
(b)制御性T細胞の免疫抑制機能に対する阻害活性を有する、
(c)抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性を有する、及び
(d)in vivoで抗腫瘍活性を有する。
(2)GARPが配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる分子である上記(1)に記載の抗体。
(3)(a)配列番号1においてアミノ酸番号366乃至377、407乃至445及び456乃至470
(b)配列番号1においてアミノ酸番号54乃至112及び366乃至392
(c)配列番号1においてアミノ酸番号352乃至392、又は
(d)配列番号1においてアミノ酸番号18乃至112
に結合する上記(1)又は(2)に記載の抗体。
(4)GARPへの結合に対して、
(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号5に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
(c)配列番号25に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号27に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は
(d)配列番号29に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号31に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
を有する抗体と競合阻害活性を有する上記(1)乃至(3)のいずれか一項に記載の抗体。
(5)腫瘍が癌である上記(1)乃至(4)のいずれか1項に記載の抗体。
(6)癌が肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、又は血液癌である上記(5)に記載の抗体。
(7)(a)配列番号2においてアミノ酸番号26乃至35に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2においてアミノ酸番号50乃至66に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号2においてアミノ酸番号99乃至107に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配列番号3においてアミノ酸番号23乃至36に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号3においてアミノ酸番号52乃至58に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号3においてアミノ酸番号91乃至101に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
(b)配列番号4においてアミノ酸番号26乃至35に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号4においてアミノ酸番号50乃至66に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4においてアミノ酸番号99乃至112に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配列番号5においてアミノ酸番号23乃至36に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号5においてアミノ酸番号52乃至58に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号5においてアミノ酸番号91乃至100に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
(c)配列番号25においてアミノ酸番号45乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号25においてアミノ酸番号69乃至78に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号25においてアミノ酸番号118乃至125に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配列番号27においてアミノ酸番号44乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号27においてアミノ酸番号70乃至76に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号27においてアミノ酸番号109乃至117に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、又は
(d)配列番号29においてアミノ酸番号45乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号29においてアミノ酸番号69乃至77に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号29においてアミノ酸番号117乃至128に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配列番号31においてアミノ酸番号44乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号31においてアミノ酸番号70乃至76に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号31においてアミノ酸番号109乃至117に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
を有する上記(1)乃至(6)のいずれか1項に記載の抗体。
(8)(a)配列番号2においてアミノ酸番号1乃至118に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号3においてアミノ酸番号1乃至112に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(b)配列番号4においてアミノ酸番号1乃至123に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号5においてアミノ酸番号1乃至111に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(c)配列番号25においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号27においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は
(d)配列番号29においてアミノ酸番号20乃至139に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号31においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
を有する上記(1)乃至(7)のいずれか1項に記載の抗体。
(9)定常領域がヒト由来定常領域である上記(1)乃至(8)のいずれか1項に記載の抗体。
(10)(a)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
(b)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号5に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
(c)配列番号25においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号27においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は
(d)配列番号29においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号31においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
を有する上記(1)乃至(9)のいずれか1項に記載の抗体。
(12)(a)配列番号33においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列、
(b)配列番号35においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列、
(c)配列番号41においてアミノ酸番号20乃至139に記載のアミノ酸配列、
(d)(a)乃至(c)の配列において各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95%以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び
(e)(a)乃至(c)の配列における各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、並びに
(f)配列番号37においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列、
(g)配列番号39においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列、
(h)配列番号43においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列、
(i)(f)乃至(h)の配列において各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95%以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び
(j)(f)乃至(h)の配列における各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
を有する請求項11に記載の抗体。
(13)(a)配列番号33においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号37においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(b)配列番号35においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号39においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は
(c)配列番号41においてアミノ酸番号21乃至139に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号43においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
を有する上記(11)又は(12)に記載の抗体。
(14)(a)配列番号33においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、配列番号35においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号41においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、からなる群から選択される重鎖、並びに
(b)配列番号37においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、配列番号39においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号43においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、からなる群から選択される軽鎖、
を有する上記(11)乃至(13)のいずれか1項に記載の抗体。
(15)(a)配列番号33においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号37においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、
(b)配列番号35においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号39においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
(c)配列番号41においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号43においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、
を有する上記(11)乃至(14)のいずれか1項に記載の抗体。
(16)上記(1)乃至(15)のいずれか1項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
(b)配列番号8においてヌクレオチド番号76乃至105に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH1をコードするポリヌクレオチド、配列番号8においてヌクレオチド番号148乃至198に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH2のポリヌクレオチド及び配列番号8においてヌクレオチド番号295乃至336に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH3のポリヌクレオチド、並びに配列番号9においてヌクレオチド番号67乃至108に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL1のポリヌクレオチド、配列番号9においてヌクレオチド番号154乃至174に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL2のポリヌクレオチド及び配列番号9においてヌクレオチド番号271乃至300に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL3のポリヌクレオチド、
(c)配列番号24においてヌクレオチド番号133乃至162に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH1のポリヌクレオチド、配列番号24においてヌクレオチド番号205乃至234に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH2のポリヌクレオチド及び配列番号24においてヌクレオチド番号352乃至375に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH3のポリヌクレオチド、並びに配列番号26においてヌクレオチド番号130乃至162に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL1のポリヌクレオチド、配列番号26においてヌクレオチド番号208乃至228に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL2のポリヌクレオチド及び配列番号26においてヌクレオチド番号325乃至351に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL3のポリヌクレオチド、又は
(d)配列番号28においてヌクレオチド番号133乃至162に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH1のポリヌクレオチド、配列番号28においてヌクレオチド番号205乃至231に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH2のポリヌクレオチド及び配列番号28においてヌクレオチド番号349乃至384に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH3のポリヌクレオチド、並びに配列番号30においてヌクレオチド番号130乃至162に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL1のポリヌクレオチド、配列番号30においてヌクレオチド番号208乃至228に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL2のポリヌクレオチド及び配列番号30においてヌクレオチド番号325乃至351に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL3のポリヌクレオチド、
を有する上記(16)に記載のポリヌクレオチド。
(18)(a)配列番号6においてヌクレオチド番号1乃至354に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域のポリヌクレオチド及び配列番号7においてヌクレオチド番号1乃至336に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域のポリヌクレオチド、
(b)配列番号8においてヌクレオチド番号1乃至369に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域のポリヌクレオチド及び配列番号9においてヌクレオチド配列番号1乃至333に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域のポリヌクレオチド、
(c)配列番号24においてヌクレオチド番号58乃至408に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域及び配列番号26においてヌクレオチド番号61乃至387に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域、又は
(d)配列番号28においてヌクレオチド番号58乃至417に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域及び配列番号30においてヌクレオチド番号61乃至387に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域、
を有する上記(16)又は(17)に記載のポリヌクレオチド。
(19)(a)配列番号6に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド及び配列番号7に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、
(b)配列番号8に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド及び配列番号9に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド
(c)配列番号24においてヌクレオチド番号58乃至1398に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド及び配列番号26においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、又は
(d)配列番号28においてヌクレオチド番号58乃至1407に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド及び配列番号30においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、
を有する上記(16)乃至(18)のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
(20)(a)配列番号32においてヌクレオチド番号58乃至408に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域、配列番号34においてヌクレオチド番号58乃至408に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号40においてヌクレオチド番号58乃至417に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域、からなる群から選択される重鎖可変領域、並びに
(b)配列番号36においてヌクレオチド番号61乃至387に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域、配列番号38においてヌクレオチド番号61乃至387に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域、及び配列番号42においてヌクレオチド番号61乃至387に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域、からなる群から選択される軽鎖可変領域、
を有する上記(16)又は(17)に記載のポリヌクレオチド。
(b)配列番号34においてヌクレオチド番号58乃至408に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域及び配列番号38においてヌクレオチド番号61乃至387に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域、又は
(c)配列番号40においてヌクレオチド番号58乃至417に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域及び配列番号42においてヌクレオチド番号61乃至387に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域、
を有する上記(16)、(17)又は(20)に記載のポリヌクレオチド。
(22)(a)配列番号32においてヌクレオチド番号58乃至1398に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド、配列番号34においてヌクレオチド番号58乃至1398に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド、及び配列番号40においてヌクレオチド番号58乃至1407に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド、からなる群から選択される重鎖のポリヌクレオチド、並びに
(b)配列番号36においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、配列番号38においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、及び配列番号42においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、からなる群から選択される軽鎖のポリヌクレオチド、
を有する上記(16)、(17)、(20)又は(21)に記載のポリヌクレオチド。
(23)(a)配列番号32においてヌクレオチド番号58乃至1398に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド、及び配列番号36においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、
(b)配列番号34においてヌクレオチド番号58乃至1398に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド、及び配列番号38においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、又は
(c)配列番号40においてヌクレオチド番号58乃至1407に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド、及び配列番号42においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、
を有する上記(16)、(17)及び(20)乃至(22)のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
(24)上記(16)乃至(23)のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター。
(25)上記(24)に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
(26)上記(25)に記載の宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体を採取する工程を含むことを特徴とする当該抗体又は当該断片の製造方法。
(27)上記(26)の製造方法により得られることを特徴とする抗体。
(28)N-結合への糖鎖付加、O-結合への糖鎖付加、N末のプロセッシング、C末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、N末にメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化及びカルボキシル末端において1つ又は2つのアミノ酸が欠失した重鎖からなる群より選択される1又は2以上の修飾を含む上記(1)乃至(15)及び(27)のいずれか1項に記載の抗体。
(29)重鎖のカルボキシル末端において1つ又は2つのアミノ酸が欠失している上記(28)に記載の抗体。
(31)重鎖のカルボキシル末端のプロリン残基が更にアミド化されている上記(28)乃至(30)のいずれか1項に記載の抗体。
(32)抗体依存性細胞傷害活性を増強させるために糖鎖修飾が調節されている上記(1)乃至(15)及び(27)乃至(31)のいずれか1項に記載の抗体。
(33)上記(1)乃至(15)及び(27)乃至(32)に記載の抗体の少なくとも一つを含有することを特徴とする医薬組成物。
(34)腫瘍治療用である上記(33)に記載の医薬組成物。
(35)腫瘍が癌である上記(34)に記載の医薬組成物。
(36)癌が肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、又は血液癌である上記(35)に記載の医薬組成物。
(37)上記(1)乃至(15)及び(27)乃至(32)に記載の抗体の少なくとも一つを個体に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。
(38)腫瘍が癌である上記(37)に記載の治療方法。
(39)癌が肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、又は血液癌である上記(38)に記載の治療方法。
本明細書中における「抗体依存性細胞傷害活性」とは、「antibody dependent cellular cytotoxicity(ADCC)活性」のことであり、NK細胞が抗体を介して腫瘍細胞等の標的細胞を傷害する作用活性を意味する。
本明細書における「同一のエピトープに結合する抗体」とは、共通のエピトープに結合する異なる抗体を意味している。第一の抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に第二の抗体が結合すれば、第一の抗体と第二の抗体が同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、第一の抗体の抗原に対する結合に対して第二の抗体が競合する(即ち、第二の抗体が第一の抗体と抗原の結合を妨げる)ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、第一の抗体と第二の抗体が同一のエピトープに結合すると判定することができる。さらに、第一の抗体と第二の抗体が同一のエピトープに結合し、かつ第一の抗体が抗腫瘍活性等の特殊な効果を有する場合、第二の抗体も同様の活性を有することが期待できる。従って、第一の抗GARP抗体の結合する部分ペプチドに第二の抗GARP抗体が結合すれば、第一の抗体と第二の抗体がGARPの同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、第一の抗GARP抗体のGARPに対する結合に対して第二の抗GARP抗体が競合することを確認することによって、第一の抗体と第二の抗体がGARPの同一のエピトープに結合する抗体と判定することができる。
本発明で用いるGARPは、ヒト、非ヒト哺乳動物(ラット、マウス等)のGARP発現細胞から直接精製して使用するか、あるいは当該細胞の細胞膜画分を調製して使用することができ、また、GARPをin vitroにて合成する、あるいは遺伝子操作により宿主細胞に産生させることによって得ることができる。遺伝子操作では、具体的には、GARP cDNAを発現可能なベクターに組み込んだ後、転写と翻訳に必要な酵素、基質及びエネルギー物質を含む溶液中で合成する、あるいは他の原核生物、又は真核生物の宿主細胞を形質転換させることによってGARPを発現させることにより、当該蛋白質を得ることができる。
ヒトGARPのアミノ酸配列は配列表の配列番号1に記載されている。また、配列番号1の配列は図1に記載されている。
また、上記GARPのアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、当該蛋白質と同等の生物活性を有する蛋白質もGARPに含まれる。
本発明のGARPに対する抗体としては、抗GARPヒト抗体を挙げることができ、抗GARPヒト抗体とは、ヒト染色体由来の抗体の遺伝子配列のみを有するヒト抗体を意味する。
抗GARPヒト抗体は、ヒト抗体の重鎖と軽鎖の遺伝子を含むヒト染色体断片を有するヒト抗体産生マウスを用いた方法(Tomizuka,K.et al.,Nature Genetics(1997)16,p.133-143,;Kuroiwa,Y.et.al.,Nucl.Acids Res.(1998)26,p.3447-3448;Yoshida,H.et.al.,Animal Cell Technology:Basic and Applied Aspects vol.10,p.69-73(Kitagawa,Y.,Matsuda,T.and Iijima,S.eds.),Kluwer Academic Publishers,1999.;Tomizuka,K.et.al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2000)97,p.722-727等を参照)によって取得することができる。
また、ヒト抗体ライブラリーより選別したファージディスプレイ由来のヒト抗体を取得する方法(Wormstone,I.M.et.al,Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7),p.2301-2308;Carmen,S.et.al.,Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002),1(2),p.189-203;Siriwardena,D.et.al.,Ophthalmology(2002)109(3),p.427-431等参照。)により得ることができる。例えば、ヒト抗体の可変領域を一本鎖抗体(scFv)としてファージ表面に発現させて、抗原に結合するファージを選択するファージディスプレイ法(Nature Biotechnology(2005),23,(9),p.1105-1116)を用いることができる。
抗GARP抗体を作製するための抗原としては、GARP又はその少なくとも6個の連続した部分アミノ酸配列からなるポリペプチド、あるいはこれらに任意のアミノ酸配列や担体が付加された誘導体を挙げることができる。
GARPと特異的に結合する抗体の例として、GARPと特異的に結合するモノクローナル抗体を挙げることができるが、その取得方法は、以下に記載する通りである。
すなわち、
(a)抗原として使用する生体高分子の精製、
(b)抗原を動物に注射することにより免疫した後、血液を採取しその抗体価を検定して脾臓摘出の時期を決定してから、抗体産生細胞を調製する工程、
(c)骨髄腫細胞(以下「ミエローマ」という)の調製、
(d)抗体産生細胞とミエローマとの細胞融合、
(e)目的とする抗体を産生するハイブリドーマ群の選別、
(f)単一細胞クローンへの分割(クローニング)、
(g)場合によっては、モノクローナル抗体を大量に製造するためのハイブリドーマの培養、又はハイブリドーマを移植した動物の飼育、
(h)このようにして製造されたモノクローナル抗体の生理活性、及びその結合特異性の検討、あるいは標識試薬としての特性の検定、等である。
抗原としては、前記したような方法で調製したGARP又はその一部を使用することができる。
工程(a)で得られた抗原と、フロインドの完全又は不完全アジュバント、又はカリミョウバンのような助剤とを混合し、免疫原として実験動物に免疫する。実験動物は公知のハイブリドーマ作製法に用いられる動物を支障なく使用することができる。具体的には、たとえばマウス、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ等を使用することができる。ただし、摘出した抗体産生細胞と融合させるミエローマ細胞の入手容易性等の観点から、マウス又はラットを被免疫動物とするのが好ましい。
これらのマウス及びラットは例えば日本クレア、日本チャ-ルスリバー、等実験動物飼育販売業者より入手することができる。
これらの免疫法のうち、本発明において好適な方法を具体的に示せば、たとえば以下のとおりである。
細胞融合に用いるミエローマ細胞には特段の制限はなく、公知の細胞株から適宜選択して用いることができる。ただし、融合細胞からハイブリドーマを選択する際の利便性を考慮して、その選択手続が確立しているHGPRT(Hypoxanthine-GUANINE phosphoribosyl transferase)欠損株を用いるのが好ましい。
抗体産生細胞とミエローマ細胞との融合は、公知の方法(Weir,D.M.,Handbookof Experimental Immunology, Vol.I.II.III.,Blackwell Scientific Publications,Oxford(1987)、Kabat,E.A.and Mayer,M.M.,Experimental Immunochemistry,Charles C Thomas Publisher Springfield,Illinois(1964)等)に従い、細胞の生存率を極度に低下させない程度の条件下で適宜実施することができる。
すなわち、高濃度ポリマー溶液としてポリエチレングリコールを用いる場合には、分子量1500~6000、好ましくは2000~4000のポリエチレングリコール溶液中で、30~40℃、好ましくは35~38℃の温度で抗体産生細胞とミエローマ細胞とを1~10分間、好ましくは5~8分間混合する。
上記細胞融合により得られるハイブリドーマの選択方法は特に制限はないが、通常HAT(ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン)選択法(Kohler et al.,Nature(1975)256,p.495;Milstein et al.,Nature(1977)266,p.550)が用いられる。
ハイブリドーマのクローニング法としては、例えばメチルセルロース法、軟アガロース法、限界希釈法等の公知の方法を用いることができる(例えばBarbara, B.M.and Stanley,M.S.:Selected Methods in Cellular Immunology,W.H.Freeman and Company, San Francisco(1980)参照)。子れらの方法のうち、特にメチルセルロース法などの三次元培養法が好適である。例えば、細胞融合により形成されたハイブリドーマ群をClonaCell-HY Selection Medium D(StemCell Technologies社製、#03804)等のメチルセルロース培地に懸濁して培養し、形成されたハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマの取得が可能である。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、得られたハイブリドーマ培養上清中に安定して抗体価の認められたものをGARPモノクローナル抗体産生ハイブリドーマ株として選択する。
151D抗体の重鎖可変領域は、配列表の配列番号15に示されるアミノ酸配列を有する。また、151D抗体の軽鎖可変領域は、配列表の配列番号17に示されるアミノ酸配列を有する。なお、配列表の配列番号15に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号14に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。また、配列表の配列番号17に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号16に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。
198D抗体の重鎖可変領域は、配列表の配列番号19に示されるアミノ酸配列を有する。また、198D抗体の軽鎖可変領域は、配列表の配列番号21に示されるアミノ酸配列を有する。なお、配列表の配列番号19に示される重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号18に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。また、配列表の配列番号21に示される軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列表の配列番号20に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。
このようにして選択されたハイブリドーマは、これを培養することにより、モノクローナル抗体を効率よく得ることができるが、培養に先立ち、目的とするモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをスクリーニングすることが望ましい。
得られたモノクローナル抗体のアイソタイプ及びサブクラスの決定は以下のように行うことができる。
新たに作製されたモノクローナル抗体が、上記F105抗体等の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に結合すれば、当該モノクローナル抗体が上記F105抗体等の抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、上記F105抗体等の抗体のGARPに対する結合に対して当該モノクローナル抗体が競合する(即ち、当該モノクローナル抗体が、上記F105抗体等の抗体とGARPの結合を妨げる)ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、当該モノクローナル抗体が上記F105抗体等の抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。エピトープが同一であることが確認された場合、当該モノクローナル抗体が上記F105抗体等の抗体と同等の特性を有していることが強く期待される。
本発明の抗体には、上記GARPに対するモノクローナル抗体に加え、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ(Chimeric)抗体、ヒト化(Humanized)抗体、及び上記のヒト抗体等も含まれる。これらの抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。
これらのクロマトグラフィーは、HPLCやFPLC等の液体クロマトグラフィーを用いて行うことができる。
また抗原を固定化した担体を用いて、抗原への結合性を利用して抗体を精製することも可能である。
得られた抗体は、後述の実施例に示された方法等によって抗原に対する結合性を評価し、好適な抗体を選抜することができる。
新たに作製された抗体が、105F抗体又は110F抗体の結合する部分ペプチド又は部分立体構造に結合すれば、当該抗体が105F抗体又は110F抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。また、105F抗体又は110F抗体のGARPに対する結合に対して当該抗体が競合する(即ち、当該抗体が、105F抗体又は110F抗体とGARPの結合を妨げる)ことを確認することによって、具体的なエピトープの配列又は構造が決定されていなくても、当該抗体が105F抗体又は110F抗体と同一のエピトープに結合すると判定することができる。エピトープが同一であることが確認された場合、当該抗体が105F抗体又は110F抗体と同等の細胞傷害活性を有していることが強く期待される。
また本発明に係る抗GARP抗体としては、下記のキメラ抗体及びヒト化抗体を挙げることができる。
また、ラット抗ヒトGARP抗体198D由来のキメラ抗体は、配列番号19の1乃至120番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む重鎖及び配列番号21の1乃至109番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む軽鎖からなる抗体であり、任意のヒト由来の定常領域を有していて良い。
なお、配列表の配列番号25に示される重鎖配列中で、1乃至19番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、20乃至136番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、137乃至466番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。
更に、配列表の配列番号29に示される重鎖配列中で、1乃至19番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、20乃至139番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、140乃至469番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。
また、配列表の配列番号31に示される軽鎖配列中で、1乃至20番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、21乃至129番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、130乃至234番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。
また、配列表の配列番号27に示されるc151D抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号26に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号26に示されるヌクレオチド配列の1乃至60番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はc151D抗体の軽鎖シグナル配列をコードしており、61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はc151D抗体の軽鎖可変領域をコードしており、そして388乃至702番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はc151D抗体の軽鎖定常領域をコードしている。
また、配列表の配列番号31に示されるc198D抗体の軽鎖アミノ酸配列は、配列表の配列番号30に示されるヌクレオチド配列によってコードされている。配列表の配列番号30に示されるヌクレオチド配列の1乃至60番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はc198D抗体の軽鎖シグナル配列をコードしており、61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はc198D抗体の軽鎖可変領域をコードしており、そして388乃至702番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はc198D抗体の軽鎖定常領域をコードしている。
なお、151D抗体の重鎖可変領域は、配列表の配列番号15においてアミノ酸番号26乃至35のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるCDRH1(GFTFSNYYMA)、配列番号15においてアミノ酸番号50乃至59のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるCDRH2(SIGTVGGNTY)、及び配列番号15においてアミノ酸番号99乃至106のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるCDRH3(EDYGGFPH)を保有している。
また、151D抗体の軽鎖可変領域は、配列表の配列番号17においてアミノ酸番号24乃至34のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるCDRL1(KASQNVGTNVD)、配列番号17においてアミノ酸番号50乃至56のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるCDRL2(GASNRYT)、及び配列番号17においてアミノ酸番号89乃至97のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるCDRL3(LQYKYNPYT)を保有している。
更に、198D抗体の重鎖可変領域は、配列表の配列番号19においてアミノ酸番号26乃至35のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるCDRH1(GFSLTSFHVS)、配列番号19においてアミノ酸番号50乃至58のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるCDRH2(TISSGGGTY)、及び配列番号19においてアミノ酸番号98乃至109のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるCDRH3(ISGWGHYYVMDV)を保有している。
また、198D抗体の軽鎖可変領域は、配列表の配列番号21においてアミノ酸番号24乃至34のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるCDRL1(QASEDIYSGLA)、配列番号21においてアミノ酸番号50乃至56のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるCDRL2(GAGSLQD)、及び配列番号21においてアミノ酸番号89乃至97のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列からなるCDRL3(QQGLKFPLT)を保有している。
また、ラット抗体198Dのヒト化抗体の実例としては、(1)配列表の配列番号41(h198D-H3)の20乃至139番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、(2)上記(1)の配列において各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95%以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び(3)上記(1)の配列における各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列のいずれか一つからなる重鎖可変領域を含む重鎖、並びに(4)配列番号43(h198D-L4)の21乃至129番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列、(5)上記(4)の配列において各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95%以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び(6)上記(4)の配列における各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列のいずれか一つからなる軽鎖可変領域を含む軽鎖の任意の組合せを挙げることができる。
なお、本明細書中における「数個」とは、1乃至10個、1乃至9個、1乃至8個、1乃至7個、1乃至6個、1乃至5個、1乃至4個、1乃至3個、又は1若しくは2個を意味する。
また、ヒト化151D抗体に係る配列表の配列番号37又は39に示される軽鎖アミノ酸配列中で、1乃至20番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、21乃至129番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、130乃至234番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。
また、ヒト化198D抗体に係る配列表の配列番号43に示される軽鎖アミノ酸配列中で、1乃至20番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列はシグナル配列であり、21乃至129番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は可変領域であり、130乃至234番目のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列は定常領域である。
各ヌクレオチド配列の1乃至57番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はヒト化151D抗体の重鎖シグナル配列をコードしており、58乃至408番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はヒト化151D抗体抗体の重鎖可変領域をコードしており、そして409乃至1398番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はヒト化151D抗体の重鎖定常領域をコードしている。
ヌクレオチド配列の1乃至57番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はヒト化198D抗体の重鎖シグナル配列をコードしており、58乃至417番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はヒト化198D抗体抗体の重鎖可変領域をコードしており、そして418乃至1407番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はヒト化198D抗体の重鎖定常領域をコードしている。
各ヌクレオチド配列の1乃至60番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はヒト化151D抗体の軽鎖シグナル配列をコードしており、61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はヒト化151D抗体の軽鎖可変領域をコードしており、そして388乃至702番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はヒト化151D抗体の軽鎖定常領域をコードしている。
ヌクレオチド配列の1乃至60番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はヒト化198D抗体の軽鎖シグナル配列をコードしており、61乃至387番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はヒト化198D抗体の軽鎖可変領域をコードしており、そして388乃至702番目のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列はヒト化198D抗体の軽鎖定常領域をコードしている。
また、本発明の抗体に結合している糖鎖修飾を調節すること(グリコシル化、脱フコース化等)によって、抗体依存性細胞傷害活性を増強することが可能である。抗体の糖鎖修飾の調節技術としては、WO99/54342、WO00/61739、WO02/31140等が知られているが、これらに限定されるものではない。本発明の抗体には当該糖鎖修飾を調節された抗体も含まれる。
真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、真核微生物を用いることができる。特に動物細胞としては、哺乳類細胞、例えば、サルの細胞であるCOS細胞(Gluzman,Y.Cell(1981)23,p.175-182、ATCC CRL-1650)、マウス線維芽細胞NIH3T3(ATCC:No.CRL-1658)やチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞(CHO細胞、ATCC CCL-61)のジヒドロ葉酸還元酵素欠損株(Urlaub,G.and Chasin,L.A.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1980)77,p.4126-4220)を挙げることができる。
これらの細胞に目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された細胞をin vitroで培養することにより抗体が得られる。当該培養においては抗体の配列によって収量が異なる場合があり、同等な結合活性を持つ抗体の中から収量を指標に医薬としての生産が容易なものを選別することが可能である。よって、本発明の抗体には、上記形質転換された宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体を採取する工程を含むことを特徴とする当該抗体の製造方法により得られる抗体も含まれる。
なお、哺乳類培養細胞で生産される抗体の重鎖のカルボキシル末端のリジン残基が欠失することが知られており(Journal of Chromatography A,705:129-134(1995))、また、同じく重鎖カルボキシル末端のグリシン、リジンの2アミノ酸残基が欠失し、新たにカルボキシル末端に位置するプロリン残基がアミド化されることが知られている(Analytical Biochemistry,360:75-83(2007))。しかし、これらの重鎖配列の欠失及び修飾は、抗体の抗原結合能及びエフェクター機能(補体の活性化や抗体依存性細胞障害作用など)には影響を及ぼさない。従って、本発明には当該修飾を受けた抗体も含まれ、重鎖カルボキシル末端において1又は2つのアミノ酸が欠失した欠失体、及びアミド化された当該欠失体(例えば、カルボキシル末端部位のプロリン残基がアミド化された重鎖)等を挙げることができる。但し、抗原結合能及びエフェクター機能が保たれている限り、本発明に係る抗体の重鎖のカルボキシル末端の欠失体は上記の種類に限定されない。本発明に係る抗体を構成する2本の重鎖は、完全長及び上記の欠失体からなる群から選択される重鎖のいずれか一種であっても良いし、いずれか二種を組み合わせたものであっても良い。各欠失体の量比は本発明に係る抗体を産生する哺乳類培養細胞の種類及び培養条件に影響を受け得るが、本発明に係る抗体の主成分としては2本の重鎖の双方でカルボキシル末端の1つのアミノ酸残基が欠失している場合を挙げることができる。
抗体の機能としては、一般的には抗原結合活性、抗原の活性を中和する活性、抗原の活性を増強する活性、ADCC活性、抗体依存性細胞媒介食作用(ADCP)活性及び補体依存性細胞傷害(CDC)活性等を挙げることができるが、本発明に係る抗体が有する機能は、GARPに対する結合活性であり、好ましくはADCC活性であり、より好ましくはADCC活性を介したTreg機能阻害活性による細胞傷害活性(抗腫瘍活性)である。更に、本発明の抗体は、ADCC活性に加えて、ADCP活性及び/又はCDC活性を併せ持っていても良い。特に既存の抗腫瘍抗体を含有する医薬については、腫瘍細胞に直接的に働きかけ増殖シグナルを遮断すること、腫瘍細胞に直接的に働きかけ細胞死シグナルを誘導すること、血管新生を抑制すること、NK細胞を介してADCC活性を起こすこと、及び補体を介してCDC活性を誘導することにより腫瘍細胞の増殖を抑制することが報告されているが(J Clin Oncol 28:4390-4399.(2010)、Clin Cancer Res; 16(1); 11-20.(2010))、本願発明に係る抗GARP抗体が有するADCP活性については、既存の抗腫瘍抗体を含有する医薬の活性として報告されていることを少なくとも本発明者らは知らない。
本発明の抗体は、アミノ酸配列が異なる複数種類の抗GARP抗体の混合物である、ポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体の一例としては、CDRが異なる複数種類の抗体の混合物を挙げることができる。そのようなポリクローナル抗体としては、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、当該培養物から精製された抗体を用いることが出来る(WO2004/061104号参照)。
上述の「2.抗GARP抗体の製造」の項に記載された方法で得られる抗体は、Tregに対して細胞傷害活性を示すことから、医薬として、特に癌及び感染症(特にマラリア及びHIV感染症)に対する治療剤として用いることができる。
投与対象となる個体としては、特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはヒトを挙げることができる。
1)-1 Phage displayにおけるパニングによる抗GARP Fabの分離
n-CoDeR Fab phage library (BioInvent社)をGARPに結合するFabの分離に用いた。EZ-Link NHS-Chomogenic-Biotin試薬 (Thermo Scientific社)を用いて、GARP(R&D Systems社)をビオチン化した。液相パニングは、Dynabeads Streptavidin M-280 (Life Technologies社)にビオチン化GARPを固相化後、ファージを添加し、結合しないファージをマグネットスタンド(DynaMag-2、Life Technologies社)を用いた洗浄操作により除去した。その後、GARPに結合したファージをトリプシン(Sigma-Aldrich社)処理により回収し、大腸菌を用いてファージを増幅した。計3回のパニングを実施し、ポリクローナルなファージミドから、FabをコードするDNA断片を制限酵素で切り出し、大腸菌用の発現ベクターに載せ換えた後、大腸菌TOP10F‘(Life Technologies社)を形質転換し、IPTG(Sigma-Aldrich社)存在下でFabを発現させ、ELISAによるスクリーニングに供した。
384ウエルMaxi-sorp plate (Black、Nunc社)にPBS(0.138 M塩化ナトリウム、0.0027 M塩化カリウムを含有する0.01 M リン酸緩衝生理食塩水(pH 7.4)、Sigma-Aldrich社)で2μg/mLに希釈したGARPを50μLずつ添加し、4℃で一晩静置し固相化した。又は、384ウエルMaxi-sorp plateにPBSで1μg/mLに希釈したNeutrAvidin(Life Technologies社)を50μLずつ添加することで固相化(4℃、一晩静置)した後、ELISAバッファー(0.05% Tween-20(Bio-RAD社)を含むPBS(Sigma-Aldrich社))で3回洗浄後、ビオチン化GARPを添加(1pmol/50μL PBS/ウエル)して1時間室温で振とうした。ELISAバッファーで3回洗浄後、Blocker Casein(Thermo Scientific社)を用いてブロッキングし、さらにELISAバッファーで3回洗浄した。その後、Fabを発現させた大腸菌の培養液を添加し、室温にて1時間振とう反応させた。ELISAバッファーで3回洗浄後、2500倍希釈したHorseradish peroxidase(HRP)標識抗ヒトF(ab’)2抗体(R&D Systems社)を50μL添加し、さらに室温で1時間振とう反応させた。ELISAバッファーで3回洗浄後、SuperSignal Pico ELISA Chemiluminescent substrate(Thermo Scientific社)を添加し、10分後の化学発光をプレートリーダー(Envision 2104 Multilabel Reader、Perkin Elmer)で測定し、GARP結合Fabを分離した。
ELISA陽性クローン(105F、110F)の重鎖及び軽鎖可変領域のヌクレオチド配列の解析は、Dye Terminator法(BigDye(登録商標)Terminator v3.1、Life Technologies社)で実施した。配列解析に用いた主要なプライマーの配列は、以下の通りである。
Primer B: 5’-GCC TGA GCA GTG GAA GTC C-3’(配列番号11)
Primer C: 5' -TAG GTA TTT CAT TAT GAC TGT CTC-3’(配列番号12)
Primer D: 5’-CCC AGT CAC GAC GTT GTA AAA CG-3’(配列番号13)
105F抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号6に示されるヌクレオチド配列の1乃至354番目のヌクレオチドからなる配列であり、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号7に示されるヌクレオチド配列の1乃至336番目のヌクレオチドからなる配列であった。
110F抗体の重鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号8に示されるヌクレオチド配列の1乃至369番目のヌクレオチドからなる配列であり、軽鎖可変領域のヌクレオチド配列は配列表の配列番号9に示されるヌクレオチド配列の1乃至333番目のヌクレオチドからなる配列であった。
105F及び110Fを含むELISA陽性クローンの完全長IgG化は以下の方法で実施した。
Fabをコードするヌクレオチド配列を決定後、上記1)-3で特定した各抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域に相当するヌクレオチド配列を特定した。
常法により上記重鎖の可変領域のヌクレオチド配列をヒトIgG1の重鎖の定常領域(CH1 + Fc領域:配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列の119乃至448番目のアミノ酸配列)をコードするヌクレオチド配列と連結し、また、上記軽鎖の可変領域のヌクレオチド配列をヒトIgG1の軽鎖の定常領域(CL:配列表の配列番号3に示されるアミノ酸配列の113乃至217番目のアミノ酸配列)をコードするヌクレオチド配列と連結後、pcDNA3.3(Invitrogen)等の動物細胞用発現ベクターに挿入し、動物細胞用IgG発現ベクターを構築した。
構築したIgG発現ベクターの塩基配列を再解析し、105F抗体の重鎖全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号6に示されるヌクレオチド配列であり、軽鎖全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号7に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。
また、110F抗体の重鎖全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号8に示されるヌクレオチド配列であり、軽鎖全長のヌクレオチド配列は配列表の配列番号9に示されるヌクレオチド配列であることを確認した。
また、上記ヌクレオチド配列から、当該配列がコードする105F抗体の重鎖及び軽鎖全長のアミノ酸配列、並びに110F抗体の重鎖及び軽鎖全長のアミノ酸配列を決定した。
105F抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号2に示されるアミノ酸配列であり、軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号3に示されるアミノ酸配列であった。
110F抗体の重鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号4に示されるアミノ酸配列であり、軽鎖のアミノ酸配列は配列表の配列番号5に示されるアミノ酸配列であった。
96ウエルMaxi-sorp plate (Black、Nunc社)にPBSで1μg/mLに希釈したヒトGARP(R&D Systems社、型番:6055-LR)を100μLずつ添加し、4℃で一晩静置し固相化した。
ELISAバッファーで3回洗浄後、Blocker Caseinを用いて1時間室温でブロッキングし、さらにELISAバッファーで3回洗浄後、50 nMの105F抗体、50 nMの110F抗体、50 nMのヒトIgG(Jackson Immuno Research社)、50 nMのマウス抗GARP抗体(Plato-1、ENZO Life Science社)及び50 nMのマウスIgG(Jackson Immuno Research社)を100μLずつ添加し、1時間室温で振とう反応させた。
ELISAバッファーで3回洗浄後、105F抗体、110F抗体及びヒトIgG添加群には、PBSで5000倍希釈したHRP標識抗ヒトFc抗体(R&D Systems社)を、マウス抗GARP抗体とマウスIgG添加群には、PBSで5000倍希釈したHRP標識抗マウスFc抗体(R&D Systems社)を100μLずつ添加し、室温で1時間振とう反応させた。
ELISAバッファーで5回洗浄後、SuperSignal Pico ELISA Chemiluminescent substrateを0.1 mL添加し、10分後の化学発光をプレートリーダー(Envision 2104 Multilabel Reader、Perkin Elmer)で測定した。
その結果、105F抗体と110F抗体は、市販の抗GARP抗体同様に、GARPに結合することが示された(図10)。
GARP発現ベクターは、ヒトGARPのcDNAクローン(Origene社製)を購入し、常法に従いpcDNA3.1(+)ベクター(Invitrogen社)へクローニングして塩基配列を確認した。
HEK-293T細胞(ATCC:CRL-11268)へ、GARP発現ベクター及びコントロールとしてpcDNA3.1ベクターをLipofectamin2000(Invitrogen社)を用いて遺伝子導入した。10%ウシ胎児血清(FBS、Hyclone社)含有DMEM培地(Invitrogen社)中で5% CO2の条件下37℃で一晩培養した後、TrypLE Express(Invitrogen社)処理により細胞をプレートから回収し、MACSバッファー(0.5%BSA、2mM EDTA、含有PBS、Miltenyi Biotec社)で2回洗浄後、同溶液に懸濁した。得られた細胞懸濁液へ105F抗体及びコントロールヒトIgG(ENZO Life Science社)を添加し、15分間4℃で静置した。MACSバッファーで2回洗浄後、Fluorescein isothiocyanate(FITC)標識抗IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories社)を加えて懸濁し、さらに15分間4℃で静置した。再びMACSバッファーで2回洗浄後、1% PFA(Paraformaldehyde 32% 溶液(ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES社)より調製)で細胞を固定し、フローサイトメーター(Facs Canto II:Becton Dickinson社)を用いて検出を行った。データ解析はFlowjo(TreeStar社)で行い、Horizon FVS450(Becton Dickinson社)を用いて死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。
ベクターのみを導入したHEK-293T細胞では、105F抗体はコントロールIgG同様の蛍光強度ヒストグラムを示した。一方、GARP発現HEK-293T細胞では、コントロールIgGの蛍光強度ヒストグラムに対して105F抗体のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしていることを確認した(図11)。以上の結果から、105F抗体がHEK-293T細胞に発現させたGARPに特異的に結合することが明らかになった。
3)-1 L428細胞を用いたフローサイトメトリー解析
Alexa Fluor 647 Monoclonal antibody labeling kit (Invitrogen社)を用いて105F抗体の蛍光ラベル体を作製した。L428細胞(DSMZより入手)をMACSバッファーで2回洗浄後、同溶液に懸濁し、ラベル化105F抗体を添加して30分間4℃で静置した。MACSバッファーで2回洗浄し、1% PFAで細胞固定後にフローサイトメーター(Facs Canto II、Becton Dickinson社)を用いて検出を行った。データ解析はFlowjo(TreeStar社)で行い、Horizon FVS450を用いて死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。L428細胞の蛍光強度ヒストグラムに対して、105F抗体を加えたヒストグラムの強蛍光強度側へのシフトを認め、105F抗体が内因性に細胞に発現しているGARPに結合することを確認した(図12)。
健常人の末梢血単核球(PBMC)はFicoll-Paque PLUS (GE Healthcare社)を用いて 分離し、10% FBSを添加したRPMI1640培地(Invitrogen社)(以下、RP-F10培地という)を用いて、低付着性24ウエルプレート(Costar社)を用いて2×106 cells/mLで播種した。抗CD3抗体(BD Pharmingen社)と抗CD28抗体(BD Pharmingen社)を添加して20時間培養後、細胞をFACSバッファー(10 mM Hepes(Invtrogen社)、2 mM EDTA(Invitrogen社)、2%FBSを添加したHBSS(Invitrogen社))に懸濁し、3)-1で調製したラベル化105F抗体及びAlexa Fluor 647標識抗GARP抗体(G14D9、eBioscience社)を添加して、30分間氷中に静置した。再びFACSバッファーで細胞を洗浄後、Fixsation/Permeabilization working solution(eBioscience社)を添加しさらに30分間氷中で静置し、Permeabilization buffer(eBioscience社)を用いて細胞を洗浄後、2%ラット血清(eBioscience社)を添加した。室温にて15分間の静置後、PE標識抗Foxp3抗体(eBioscience社)を添加してさらに室温で30分間静置した。細胞洗浄後、4% Paraformaldehyde phosphate buffer solution(和光純薬社)をD-PBS(Invitrogen社)で2倍に希釈した組織固定液を添加して15分以上4℃にて静置した。FACSバッファーで細胞を洗浄後、フローサイトメーター(Facs Canto II:Becton Dickinson社)を用いて測定し、FlowJo(Tree Star社)にて解析した。その結果、105F抗体は、市販の抗GARP抗体同様に、FoxP3陽性Tregに結合することが示された(図13)。
4)-1 ADCC活性
4)-1-1 エフェクター細胞の調製
健常人の新鮮末梢血よりPBMCを上記3)-2の方法により分離した。PBMCよりNK細胞をNK cell isolation kit(Miltenyi Biotec社)を用いて精製した。得られたNK細胞を100 IU/mL rhIL-2(Novartis社)を含むRP-F10培地(Invitrogen社)中で一晩馴化培養した。生細胞数をトリパンブルー色素排除試験にて計測し、生細胞密度で2×105細胞/mLになるようRP-F10培地で再懸濁しエフェクター細胞とした。
実施例3)-1に記載したL428細胞を、10% FBS含有RPMI1640培地(Invitrogen社)中に0.6×106個に対して、Chromium-51(51Cr)を30μL(1110kBq)混合し、37℃、5% CO2の条件下で2時間培養することで細胞をラベルした。ラベルした細胞を10% FBS含有RPMI1640培地(Invitrogen社)で3回洗浄し、RP-F10培地で4×104細胞/mLになるよう再懸濁し標的細胞とした。
アッセイ終濃度が1、10、100、1000ng/mLとなるようRP-F10培地で希釈調製した105F抗体を96ウエルU底マイクロプレート(Costar社)へ50μL/ウェルずつ分注し、標的細胞を添加(50μL/ウェル)して30分4℃にて静置した。次いで、エフェクター細胞を添加(100μL/ウエル)し、5% CO2の条件下で4時間37℃にて培養したのち、上清50μL/ウェルをLumaPlate(PerkinElmer社)に回収し、ガンマカウンターで放出されたガンマ線量を測定した。ADCC活性による細胞溶解率は次式で算出した。
A:サンプルウェルのカウント
B:自然放出(抗体・エフェクター細胞非添加ウェル)カウントの平均値(n=3)。抗体添加時とエフェクター細胞添加時にそれぞれRP-F10培地を50μL、100μL添加した。それ以外はサンプルウェルと同様の操作を行った。
測定結果を図14に示す。105F抗体は、L428細胞に対して抗体濃度依存的に細胞溶解活性を示した。一方コントロールヒトIgGについては細胞溶解活性を認めなかった。このことから、105F抗体は内因性GARPを発現しているL428細胞に対してADCC活性を有することが示された。なお、特許文献1に記載の配列情報に基づき作製したヒトIgG1抗GARP抗体(MHG8及びLHG10)にはADCC活性は認められなかった。
4)-2-1 Treg、Teff(エフェクターT細胞:CD4陽性CD25陰性ヘルパーT細胞)及びアクセサリー細胞の調製
4)-1-1同様に調製したPBMCより、CD4 T cell ISOLATION Kit(Miltenyi Biotec社)を用いてCD4陽性T細胞を分離し、FITC標識抗CD4抗体(Miltenyi Biotec社)及びAPC標識抗CD25抗体(Miltenyi Biotec社)を添加して30分間4℃で静置した。細胞洗浄後、MACSバッファーで懸濁し、FACS Aria IIu(Becton Dickinson社)を用いてCD4陽性CD25陰性細胞(Teff)及びCD4陽性CD25強陽性細胞(Treg)を分離した。
一方、PBMCからCD3 Microbeads(Miltenyi Biotec社)を用いてCD3陽性細胞を除去後、X線照射装置(日立メディコ社)を用いて照射線量1 C/kg(吸収線量38.76 Gy/kg(3876 Rad/kg))のX線を照射してアクセサリー細胞を調製した。
培養培地には、Penicillin Streptomycin(Invitrogen社)、1× MEM NEAA(Invitrogen社)、1× Sodium pyruvate(Invitrogen社)、5mM Hepes及び5% Human male AB serum(Sigma社)を含有するRPMI1640培地(Invitrogen社)を用いた。96ウエルU底マイクロプレートの各ウエルに、Teff(2000 cells/well)とアクセサリー細胞(20000 cells/well)を混合し、さらにTregを500 cells/wellとなるように添加播種した。また、Tregを添加しない群も調製した。抗CD3抗体及び抗CD28抗体、並びに105F抗体を終濃度50又は10 μg/mLで添加し、37℃、5% CO2の条件下で5日間培養した。その後、[3H]-thymidine(PerkinElmer社)を18.5 kBq/mLに調製し20 μL/ウエルずつ添加し、さらに18時間培養を継続した。セルハーベスター(Mach II、Tomtech社)を用いて細胞をFiltermat A(PerkinElmer社)に回収し、シンチレーションカウンター(MicroBeta、PerkinElmer社)を用いて各ウェルの[3H]-thymidineの細胞内取込値を1分間あたりの補正計数値(CCPM、corrected count per minute)として計測した。
各共培養条件の3ウェルの平均値を算出し、Teffのみ増殖活性値に比べて、Tregを加えた共培養系で減じられたTeff増殖活性値を「TregによるTeffに対する増殖抑制率」(=1-[共培養のCCPM/TeffのみのCCPM])とした。
抗体非添加時のTregによる抑制率に対して、それぞれの抗体を添加した際に阻害された抑制率(=[抗体非添加時の抑制率]-[各抗体添加時の抑制率])を各抗体のTreg機能の阻害活性とした。なお、当該阻害活性は、各実験に供与された検体毎に算出される結果である。
105F抗体50μg/mLのTreg機能阻害結果(阻害率72.6%)を図15に、105F抗体、MHG-8及びLHG-10抗体の10μg/mLの結果を図16に示す。MHG-8、LHG-10抗体にはTreg機能阻害活性が認められない(阻害率0.8%、0.0%)が、105F抗体は顕著にTreg機能を阻害(阻害率65.8%)することが示された。なお、[非特許文献10]に記載のある、GARPに対するsiRNAを導入したTregによる上記阻害率を図5AのCD4+CD25-(Teff):Tregが4:1のグラフ値を計測して概算すると、15%程度であった。
5)-1 GARP発現ベクターの調製
GARP発現ベクターは実施例2に記載した発現ベクターを用い、大量調製には、EndoFree Plasmid Giga Kit(QIAGEN社)を用いた。
免疫にはWKY/Izmラットの雌 (日本エスエルシー社) を使用した。まずラット両足下腿部をHyaluronidase (SIGMA-ALDRICH社) にて前処理後、同部位にGARP発現ベクターを筋注した。続けて、ECM830 (BTX社) を使用し、2ニードル電極を用いて、同部位にインビボエレクトロポレーションを実施した。二週間に一度、同様のインビボエレクトロポーレーションを繰り返した後、ラットのリンパ節又は脾臓を採取しハイブリドーマ作製に用いた。
リンパ節若しくは脾臓細胞とマウスミエローマSP2/0-ag14細胞 (ATCC, No.CRL-1581) とをLF301 Cell Fusion Unit (BEX社) を用いて電気細胞融合し、ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies社) に希釈して培養した。出現したハイブリドーマコロニーを回収することでモノクローンハイブリドーマを作製した。回収された各ハイブリドーマコロニーを培養し、得られたハイブリドーマ培養上清を用いて抗GARP抗体産生ハイブリドーマのスクリーニングを行った。
5)-4-1 Cell-ELISA用抗原遺伝子発現細胞の調製
293α細胞 (インテグリンαv及びインテグリンβ3を発現するHEK-293細胞(ATCC:CRL-1573)由来の安定発現細胞株) を10% FBS含有DMEM培地(Invitrogen社)中7.5×105細胞/mLになるよう調製した。それに対し、Lipofectamine 2000 (Life Technologies社) を用いた形質移入手順に従い、GARP発現ベクター又は陰性コントロールとしてpcDNA3.1(+)ベクターを導入し、96-Half area well plate (Corning社) に50 μlずつ分注し、10% FBS含有DMEM培地中で37°C、5% CO2の条件下で24から27時間培養した。得られた導入細胞を接着状態のまま、Cell-ELISAに使用した。
実施例5)-4-1で調製した発現ベクター導入293α細胞の培養上清を除去後、GARP発現ベクター又はpcDNA3.1(+)ベクター導入293α細胞のそれぞれに対しハイブリドーマ培養上清を添加し、4°Cで1時間静置した。well中の細胞を5% FBS含有PBS (+) で1回洗浄後、5% FBS含有PBS (+) で500倍に希釈したAnti-Rat IgG-Peroxidase antibody produced in rabbit (SIGMA社) を加えて、4°Cで1時間静置した。well中の細胞を5% FBS含有PBS (+) で3回洗浄した後、OPD発色液 (OPD溶解液 (0.05 M クエン酸3ナトリウム、0.1M リン酸水素2ナトリウム・12水 pH4.5) にo-フェニレンジアミン二塩酸塩 (和光純薬社)、H2O2をそれぞれ0.4mg/ml、0.6% (v/v) になるように溶解) を50μl/wellで添加した。時々攪拌しながら発色反応を行い、1M HClを50μl/wellで添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー (ENVISION:PerkinElmer社) で490nmの吸光度を測定した。細胞膜表面上に発現するヒトGARPに特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを選択するため、コントロールのpcDNA3.1(+)導入293α細胞と比較しGARP発現ベクター導入293α細胞の方でより高い吸光度を示す培養上清を産生するハイブリドーマを抗ヒトGARP抗体産生陽性として選択した。
5)-5-1 フローサイトメトリー解析用抗原遺伝子発現細胞の調製
HEK-293T細胞(ATCCより入手)を5×104細胞/cm2になるよう225 cm2フラスコ (住友ベークライト社) に播種し、10% FBS含有DMEM培地中で37°C、5% CO2の条件下で一晩培養した。翌日、GARP発現ベクター、陰性コントロールとしてpcDNA3.1(+)ベクターをそれぞれHEK-293T細胞にLipofectamine 2000を用いて導入し、37°C、5% CO2の条件下でさらに一晩培養した。翌日、発現ベクター導入HEK-293T細胞をTrypLE Express (Life Technologies社) で処理し、10% FBS含有DMEM培地で細胞を洗浄した後、5% FBS含有PBSに懸濁した。得られた細胞懸濁液をフローサイトメトリー解析に使用した。
実施例5)-4-2のCell-ELISAで陽性と判定されたハイブリドーマが産生する抗体のヒトGARPに対する結合特異性をフローサイトメトリー解析によりさらに確認した。
実施例5)-5-1で調製した一過性発現HEK-293T細胞の懸濁液を遠心し、上清を除去した後、それぞれに対しハイブリドーマ培養上清を加えて懸濁し、4°Cで1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、5% FBS含有PBSで500倍に希釈したAnti-Rat IgG FITC conjugate (SIGMA社製) を加えて懸濁し、4°Cで1時間静置した。5% FBS含有PBSで2回洗浄した後、2μg/ml 7-aminoactinomycin D (Molecular Probes社) を含む5% FBS含有PBSに再懸濁し、フローサイトメーター (FC500:BeckmanCoulter社製) で検出を行った。データ解析はFlowjo (TreeStar社製) で行った。7-aminoactinomycin D陽性の死細胞をゲートで除外した後、生細胞のFITC蛍光強度のヒストグラムを作成した。コントロールであるpcDNA3.1ベクター導入HEK-293T細胞の蛍光強度ヒストグラムに対しGARP発現ベクター導入HEK-293T細胞のヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしている抗体を産生するハイブリドーマをヒトGARPに結合する抗体産生ハイブリドーマとして(113クローン)選択した。
5)-6-1 ハイブリドーマ151D、198Dの培養
5) -5-2で取得されたラット抗ヒトGARP抗体産生ハイブリドーマの中から、ヒトGARPに強く結合することが示唆された151D、198Dを選抜した。
ラット抗GARPモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養上清から精製した。
まず、ラット抗GARPモノクローナル抗体産生ハイブリドーマをClonaCell-HY Selection Medium Eで十分量まで増殖させ、Ultra Low IgG FBS (Life Technologies社) を20%添加したHybridoma SFM (Life Technologies社) に培地交換した後、8~9×107細胞のハイブリドーマを1272 cm2フラスコ (Corning社) に播種し7日間培養した。本培養上清を遠心により回収し0.8 μmのフィルターを通した後、さらに0.45μmのフィルター(Corning社) を通して滅菌した。
実施例5)-6-1で調製したハイブリドーマの培養上清から抗体をProtein Gアフィニティークロマトグラフィーで精製した。Protein Gカラム (GE Healthcare Bioscience社) に抗体を吸着させ、PBSでカラムを洗浄後に0.1M グリシン/塩酸水溶液(pH2.7) で溶出した。溶出液に1M Tris-HCl (pH9.0) を加えてpH7.0~7.5に調整した後に、透析(Thermo Scientific社、Slide-A-Lyzer Dialysis Cassette) によりPBSへのバッファー置換を行った。Centrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (分画分子量UF30K、Sartorius社) で抗体を濃縮し、抗体濃度を0.7mg/mL 以上に調製した。最後にMinisart-Plus filter (Sartorius社) でろ過し、精製サンプルとした。
6)-1 ラット抗体151DのcDNAのクローニングと配列の決定
6) -1-1 151D産生ハイブリドーマからのtotal RNAの調製
151Dの可変領域を含むcDNAを増幅するため、151D産生ハイブリドーマよりTRIzol Reagent (Ambion社) を用いてtotal RNAを調製した。
重鎖可変領域を含むcDNAの増幅は、実施例6)-1-1で調製したtotal RNAの約1μgとSMARTer RACE cDNA Amplification Kit (Clontech社) を用いて実施した。
151Dの重鎖遺伝子の可変領域のcDNAをPCRで増幅するためのプライマーとして、UPM (Universal Primer A Mix:SMARTer RACE cDNA Amplification Kitに付属)、及び公知のラット重鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。
5’-RACE PCRで増幅した重鎖の可変領域を含むcDNAをプラスミドにクローニングし、次に重鎖の可変領域のcDNAのヌクレオチド配列のシークエンス解析を実施した。
決定された151Dの重鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列番号14に示し、アミノ酸配列を配列番号15に示した。
実施例6)-1-2と同様の方法で実施した。ただし、151Dの軽鎖遺伝子の可変領域のcDNAをPCRで増幅するためのプライマーとして、UPM (Universal Primer A Mix:SMARTer RACE cDNA Amplification Kitに付属)、及び公知のラット軽鎖の定常領域の配列から設計したプライマーを用いた。
決定された151Dの軽鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列番号16に示し、アミノ酸配列を配列番号17に示した。
実施例2)-1と同様の方法で配列を決定した。
決定された198Dの重鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列番号18に示し、アミノ酸配列を配列番号19に示した。軽鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列を配列番号20に示し、アミノ酸配列を配列番号21に示した。
6)-3-1 ヒトキメラ軽鎖発現ベクターpCMA-LKの構築
プラスミドpcDNA3.3-TOPO/LacZ (Invitrogen社) を制限酵素XbaI及びPmeIで消化して得られる約5.4kbのフラグメントと、配列番号22に示すヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域をコードするDNA配列を含むDNA断片をIn-Fusion Advantage PCRクローニングキット (CLONTECH社) を用いて結合して、pcDNA3.3/LKを作製した。
pcDNA3.3/LKからネオマイシン発現ユニットを除去することによりpCMA-LKを構築した。
pCMA-LKをXbaI及びPmeIで消化して軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域を取り除いたDNA断片と、配列番号23で示されるヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG1定常領域のアミノ酸をコードするDNA配列を含むDNA断片をIn-Fusion Advantage PCRクローニングキット (CLONTECH社) を用いて結合して、pCMA-G1を構築した。
実施例2)-1で得られたラット抗体151D重鎖の可変領域をコードするcDNAをテンプレートとして、In-fusionクローニング用に設計したプライマーでPCRを行うことにより重鎖の可変領域をコードするcDNAを含むDNA断片を増幅した。pCMA-G1を制限酵素BIpIで切断した箇所に、In-Fusion HD PCRクローニングキット (Clontech社) を用いて、増幅したDNA断片を挿入することによりヒトキメラ151D重鎖発現ベクターを構築した。
ヒトキメラ151D重鎖のヌクレオチド配列及び該重鎖のアミノ酸配列を、配列番号24及び配列番号25にそれぞれ示す。
実施例6)-1で得られた151軽鎖の可変領域をコードするcDNAをテンプレートとして、In-fusionクローニング用に設計したプライマーでPCRを行うことにより軽鎖の可変領域をコードするcDNAを含むDNA断片を増幅した。pCMA-LKを制限酵素BsiWIで切断した箇所に、In-Fusion HD PCRクローニングキット (Clontech社) を用いて、増幅したDNA断片を挿入することによりヒトキメラ151D軽鎖発現ベクターを構築した。
ヒトキメラ151D軽鎖のヌクレオチド配列及び該軽鎖のアミノ酸配列を、配列番号26及び配列番号27にそれぞれ示す。
実施例6)-2で得られたラット抗体198D重鎖の可変領域をコードするcDNAをテンプレートとして、実施例6)-3-3と同様の方法でヒトキメラ198D重鎖発現ベクターを構築した。
ヒトキメラ198D重鎖のヌクレオチド配列及び該重鎖のアミノ酸配列を、配列番号28及び配列番号29にそれぞれ示す。
実施例6)-2で得られた198D軽鎖の可変領域をコードするcDNAをテンプレートとして、実施例6)-3-3と同様の方法でヒトキメラ198D軽鎖発現ベクターを構築した。
ヒトキメラ198D軽鎖のヌクレオチド配列及び該軽鎖のアミノ酸配列を、配列番号30及び配列番号31にそれぞれ示す。
6)-4-1 ヒトキメラ抗体の生産
FreeStyle 293F細胞 (Invitrogen社) はマニュアルに従い、継代、培養をおこなった。対数増殖期の1×108個のFreeStyle 293F細胞 (Invitrogen社) を250 mL Fernbach Erlenmeyer Flask (CORNING社) に播種し、FreeStyle293 expression medium (Invitrogen社) で希釈して2.0×106細胞/mLに調製した。
5 mLのOpti-Pro SFM培地 (Invitrogen社) に20μgの重鎖発現ベクターと30μgの軽鎖発現ベクターと150μgのPolyethyleneimine (Polyscience #24765) を加えて穏やかに攪拌し、さらに5分間放置した後にFreeStyle 293F細胞に添加した。
37℃、8% CO2インキュベーターで4時間、125rpmで振とう培養後に50mLのEX-CELL VPRO培地 (SAFC Biosciences社)、0.36mLのGlutaMAX I (GIBCO社)、及び2.5mLのYeastolate Ultrafiltrate (GIBCO社) を添加し、37℃、8%CO2インキュベーターで7日間、125rpmで振とう培養して得られた培養上清を250mL Filter System (CORNING社 #431096) でろ過した。
ヒトキメラ151D重鎖発現ベクターとヒトキメラ151D軽鎖発現ベクターの組み合わせで取得されたヒトキメラ151D抗体を「c151D」 と命名し、ヒトキメラ198D重鎖発現ベクターとヒトキメラ198D軽鎖発現ベクターの組み合わせで取得されたヒトキメラ198D抗体を「c198D」と命名した。
実施例6)-4-1で得られた培養上清をrProtein Aアフィニティークロマトグラフィーの1段階工程で精製した。培養上清をPBSで平衡化したMabSelectSuReが充填されたカラム (GE Healthcare Bioscience社製) にアプライしたのちに、カラム容量の2倍以上のPBSでカラムを洗浄した。次に2Mアルギニン塩酸塩溶液 (pH4.0) で溶出し、抗体の含まれる画分を集めた。当該画分をCentrifugal UF Filter Device VIVASPIN20 (分画分子量UF30K、Sartorius社) にてPBSへのバッファー置換を行うとともに抗体の濃縮を行い、抗体濃度を1 mg/mL 以上に調製した。最後にMinisart-Plus filter (Sartorius社) でろ過し、精製サンプルとした。
実施例6)-4で作製したc151D及びc198DとヒトGARPとの解離定数測定は、Biacore T200 (GE Healthcare Bioscience社製) を使用し、固定化したProtein Aに抗体をリガンドとして捕捉 (キャプチャー) し、抗原(リコンビナントヒトGARP:R&D Systems社)をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。ランニングバッファーとしてHBS-EP+ (GE Healthcare Bioscience社製)、センサーチップとしてProtein A (GEヘルスケアバイオサイエンス (株) ) を用いた。
チップ上に1μg/mLのヒトキメラ化抗体を10μL/minで20秒間添加した後、抗原の希釈系列溶液 (8~128nM) を流速30μl/分で120秒間添加し、引き続き480秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、Glycine 1.5 (GE Healthcare Bioscience社製) を流速20μl/分で30秒間添加した。
データの解析には1:1結合モデルを用いて、結合速度定数ka、解離速度定数kd及び解離定数 (KD;KD=kd/ka) を算出した。
結果を表1に示す。
7)-1 c151D抗体の可変領域の分子モデリング
c151D抗体の可変領域の分子モデリングは、相同性モデリングとして一般的に公知の方法 (Methods in Enzymology,203,121-153,(1991)) によって実行された。
Protein Data Bank (Nuc.Acid Res.28,235-242 (2000) ) に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の1次配列 (X線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である) を、c151D抗体の可変領域と比較した。
可変領域の三次元構造は、c151D抗体の重鎖及び軽鎖並びにそれら界面に対して高い配列相同性を有するモデルの座標を組み合わせ、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。
次いで、それぞれのCDRについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。
最後に、エネルギーの点で不利な原子間接触を除くためのエネルギー最小化計算を行った。上記手順は、Discovery Studio (ダッソー・システムズ(株)) を使用して行った。
ヒト化151D抗体の構築を、CDRグラフティング (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033 (1989) ) として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて選択された。
c151D抗体のフレームワーク領域の配列を、ヒトのサブグループ・コンセンサス配列のフレームワーク領域と比較した。結果として、KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda,MD. (1991) ) において既定されたヒトγ鎖サブグループ3のコンセンサス配列とヒトκ鎖サブグループ1及びヒトκ鎖サブグループ4のコンセンサス配列が、そのフレームワーク領域において高い配列相同性に有することに起因して、アクセプターとして選択された。
ヒトγ鎖サブグループ3のコンセンサス配列とヒトκ鎖サブグループ1及びヒトκ鎖サブグループ4のコンセンサス配列についてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、c151D抗体についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上記7)-1で構築されたc151D抗体の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Queen et al. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033 (1989) ) によって与えられる基準によって選択された。
選択された幾つかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化h151Dの配列を以下の実施例に記載されるように構築した。
7)-3-1 h151D-H1タイプ重鎖
配列表の配列番号25に示されるc151D重鎖のアミノ酸番号35番目のアルギニン残基をグリシン残基に、37番目のリシン残基をロイシン残基に、38番目のリシン残基をアルギニン残基に、42番目のセリン残基をアラニン残基に、61番目のトレオニン残基をグリシン残基に、62番目のグルタミン残基をリシン残基に、68番目のアラニン残基をセリン残基に、80番目のアルギニン残基をアラニン残基に、94番目のアラニン残基をセリン残基に、96番目のセリン残基をアスパラギン残基に、103番目のアスパラギン酸残基をアスパラギン残基に、107番目のセリン残基をアラニン残基に、112番目のトレオニン残基をバリン残基に、130番目のバリン残基をトレオニン残基に、131番目のメチオニン残基をロイシン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化151D重鎖を「h151D-H1タイプ重鎖」と命名した。
h151D-H1タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列(配列番号32)において、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398からなるヌクレオチド配列であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408からなるヌクレオチド配列であり、定常領域をコードするのはヌクレオチド番号409乃至1398からなるヌクレオチド配列である。当該可変領域は、配列表の配列番号32において、CDRH1をコードするヌクレオチド番号133乃至162からなるヌクレオチド配列、CDRH2をコードするヌクレオチド番号205乃至234からなるヌクレオチド配列及びCDRH3をコードするヌクレオチド番号352乃至375からなるヌクレオチド配列を有する。
また、h151D-H1タイプ重鎖のアミノ酸配列(配列番号33)において、シグナル配列が切除された成熟重鎖はアミノ酸番号20乃至466からなるアミノ酸配列であり、、可変領域はアミノ酸番号20乃至136からなるアミノ酸配列であり、定常領域はアミノ酸番号137乃至466からなるアミノ酸配列である。当該可変領域は、配列表の配列番号33において、アミノ酸番号45乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、アミノ酸番号69乃至78に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及びアミノ酸番号118乃至125に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を有する。
更に、配列番号32及び33の配列は、それぞれ図31及び21にも記載されている。
配列表の配列番号25に示されるc151D重鎖のアミノ酸番号35番目のアルギニン残基をグリシン残基に、37番目のリシン残基をロイシン残基に、38番目のリシン残基をアルギニン残基に、42番目のセリン残基をアラニン残基に、61番目のトレオニン残基をグリシン残基に、62番目のグルタミン残基をリシン残基に、94番目のアラニン残基をセリン残基に、103番目のアスパラギン酸残基をアスパラギン残基に、107番目のセリン残基をアラニン残基に、112番目のトレオニン残基をバリン残基に、130番目のバリン残基をトレオニン残基に、131番目のメチオニン残基をロイシン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化151D重鎖を「h151D_H4タイプ重鎖」と命名した。
h151D-H4タイプ重鎖をコードするヌクレオチド配列(配列番号34)において、シグナル配列が切除された成熟重鎖をコードするのはヌクレオチド番号58乃至1398からなるヌクレオチド配列であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号58乃至408からなるヌクレオチド配列であり、定常領域をコードするのはヌクレオチド番号409乃至1398からなるヌクレオチド配列である。当該可変領域は、配列表の配列番号34において、CDRH1をコードするヌクレオチド番号133乃至162からなるヌクレオチド配列、CDRH2をコードするヌクレオチド番号205乃至234からなるヌクレオチド配列及びCDRH3をコードするヌクレオチド番号352乃至375からなるヌクレオチド配列を有する。
また、h151D-H4タイプ重鎖のアミノ酸配列(配列番号35)において、シグナル配列が切除された成熟重鎖はアミノ酸番号20乃至466からなるアミノ酸配列であり、可変領域はアミノ酸番号20乃至136からなるアミノ酸配列であり、定常領域はアミノ酸番号137乃至466からなるアミノ酸配列である。当該可変領域は、配列表の配列番号35において、アミノ酸番号45乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、アミノ酸番号69乃至78に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及びアミノ酸番号118乃至125に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を有する。
更に、配列番号34及び35の配列は、それぞれ図33及び23にも記載されている。
7)-4-1 h151D-L1タイプ軽鎖
配列表の配列番号27に示されるc151D軽鎖のアミノ酸番号29番目のトレオニン残基をアスパラギン酸残基に31番目のメチオニン残基をロイシン残基に32番目のフェニルアラニン残基をアラニン残基に33番目のイソロイシン残基をバリン残基に35番目のバリン残基をロイシン残基に、37番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に、39番目のバリン残基をアラニン残基に、41番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に、60番目のトレオニン残基をプロリン残基に、83番目のトレオニン残基をセリン残基に、97番目のアスパラギン残基をセリン残基に、98番目のメチオニン残基をロイシン残基に、103番目のロイシン残基をバリン残基に、120番目のトレオニン残基をグルタミン残基に、124番目のロイシン残基をバリン残基に、126番目のロイシン残基をイソロイシン残基に、127番目のアスパラギン残基をリシン残基に、129番目のアラニン残基をトレオニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化151D軽鎖を「h151D_L1タイプ軽鎖」と命名した。
h151D-L1タイプ軽鎖をコードするヌクレオチド配列(配列番号36)において、シグナル配列が切除された成熟軽鎖をコードするのはヌクレオチド番号61乃至702からなるヌクレオチド配列であり、可変領域をコードするのはヌクレオチド番号61乃至387からなるヌクレオチド配列であり、定常領域をコードするのはヌクレオチド番号388乃至702からなるヌクレオチド配列である。当該可変領域は、配列表の配列番号36において、CDRH1をコードするヌクレオチド番号130乃至162からなるヌクレオチド配列、CDRH2をコードするヌクレオチド番号208乃至228からなるヌクレオチド配列及びCDRH3をコードするヌクレオチド番号325乃至351からなるヌクレオチド配列を有する。
また、h151D_L1タイプ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号37)において、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はアミノ酸番号21乃至234からなるアミノ酸配列であり、可変領域はアミノ酸番号21乃至129からなるアミノ酸配列であり、定常領域はアミノ酸番号130乃至234からなるアミノ酸配列である。当該可変領域は、配列表の配列番号37において、アミノ酸番号44乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、アミノ酸番号70乃至76に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及びアミノ酸番号109乃至117に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を有する。
更に、配列番号36及び37の配列は、それぞれ図32及び22にも記載されている。
配列表の配列番号27に示されるc151D軽鎖のアミノ酸番号29番目のトレオニン残基をセリン残基に31番目のメチオニン残基をロイシン残基に32番目のフェニルアラニン残基をセリン残基に33番目のイソロイシン残基をアラニン残基に41番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に、60番目のトレオニン残基をプロリン残基に、62番目のグルタミン残基をリシン残基に、83番目のトレオニン残基をセリン残基に、97番目のアスパラギン残基をセリン残基に、98番目のメチオニン残基をロイシン残基に、100番目のアラニン残基をプロリン残基に、103番目のロイシン残基をフェニルアラニン残基に、105番目のバリン残基をトレオニン残基に、120番目のトレオニン残基をグルタミン残基に、124番目のロイシン残基をバリン残基に、126番目のロイシン残基をイソロイシン残基に、127番目のアスパラギン残基をリシン残基に、129番目のアラニン残基をトレオニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化151D軽鎖を「h151D-L4タイプ軽鎖」と命名した。
また、h151D-L4タイプ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号39)において、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はアミノ酸番号21乃至234からなるアミノ酸配列であり、可変領域はアミノ酸番号21乃至129からなるアミノ酸配列であり、定常領域はアミノ酸番号130乃至234からなるアミノ酸配列である。当該可変領域は、配列表の配列番号39において、アミノ酸番号44乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、アミノ酸番号70乃至76に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及びアミノ酸番号109乃至117に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3を有する。
更に、配列番号38及び39の配列は、それぞれ図34及び24にも記載されている。
c198D抗体の可変領域の分子モデリングは、相同性モデリングとして一般的に公知の方法 (Methods in Enzymology,203,121-153, (1991) ) によって実行された。Protein Data Bank (Nuc.Acid Res.28,235-242 (2000) ) に登録されるヒト免疫グロブリンの可変領域の1次配列 (X線結晶構造から誘導される三次元構造が入手可能である) を、c198D抗体の可変領域と比較した。
可変領域の三次元構造は、c198D抗体の重鎖及び軽鎖並びにそれら界面に対して高い配列相同性を有するモデルの座標を組み合わせ、「フレームワークモデル」を得ることによって作製された。
次いで、それぞれのCDRについての代表的なコンホメーションがフレームワークモデルに組み込まれた。
最後に、エネルギーの点で不利な原子間接触を除くためのエネルギー最小化計算を行った。上記手順は、Discovery Studio (ダッソー・システムズ (株)) を使用して行った。
ヒト化198D抗体の構築を、CDRグラフティング (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033 (1989) ) として一般的に公知の方法によって行った。アクセプター抗体は、フレームワーク領域内のアミノ酸相同性に基づいて選択された。
c198D抗体のフレームワーク領域の配列を、ヒトのサブグループ・コンセンサス配列のフレームワーク領域と比較した。結果として、KABAT et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service National Institutes of Health, Bethesda,MD. (1991)) において既定されたヒトγ鎖サブグループ2のコンセンサス配列とヒトκ鎖サブグループ1のコンセンサス配列が、そのフレームワーク領域において高い配列相同性に有することに起因して、アクセプターとして選択された。また、重鎖の一部の残基には、ヒトγ鎖サブグループ3のコンセンサス配列の残基を移入した。
一部ヒトγ鎖サブグループ3のコンセンサス配列を含むヒトγ鎖サブグループ2のコンセンサス配列とヒトκ鎖サブグループ1のコンセンサス配列についてのフレームワーク領域のアミノ酸残基を、c198D抗体についてのアミノ酸残基と整列させ、異なるアミノ酸が使用される位置を同定した。これらの残基の位置は、上記7)-5で構築されたc198D抗体の三次元モデルを使用して分析され、そしてアクセプター上にグラフティングされるべきドナー残基が、Queen et al. (Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029-10033 (1989) ) によって与えられる基準によって選択された。
選択された幾つかのドナー残基をアクセプター抗体に移入することによって、ヒト化h198Dの配列を以下の実施例に記載されるように構築した。
7)-7-1 h198D-H3タイプ重鎖
配列表の配列番号29に示されるc198D重鎖のアミノ酸番号20番目のグルタミン残基をグルタミン酸残基に24番目のアルギニン残基をバリン残基に28番目のプロリン残基をグリシン残基に32番目のグルタミン残基をリシン残基に61番目のグルタミン酸残基をグリシン残基に、80番目のセリン残基をプロリン残基に、81番目のアラニン残基をセリン残基に、86番目のロイシン残基をバリン残基に、87番目のセリン残基をトレオニン残基に、95番目のセリン残基をアスパラギン残基に、98番目のフェニルアラニン残基をセリン残基に、101番目のメチオニン残基をロイシン残基に、103番目のトレオニン残基をセリン残基に、104番目のロイシン残基をバリン残基に、105番目のグルタミン残基をトレオニン残基に、106番目のトレオニン残基をアラニン残基に、107番目のグルタミン酸残基をアラニン残基に、111番目のメチオニン残基をバリン残基に、113番目のフェニルアラニン残基をチロシン残基に、133番目のアラニン残基をトレオニン残基に、134番目のセリン残基をロイシン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化198D重鎖を「h198D_H3タイプ重鎖」と命名した。
また、h198D-H3タイプ重鎖のアミノ酸配列(配列番号41)において、シグナル配列が切除された成熟重鎖はアミノ酸番号20乃至469からなるアミノ酸配列であり、可変領域はアミノ酸番号20乃至139からなるアミノ酸配列であり、定常領域はアミノ酸番号140乃至469からなるアミノ酸配列である。
更に、配列番号40及び41の配列は、それぞれ図35及び25にも記載されている。
7)-8-1 h198D-L4タイプ軽鎖
配列表の配列番号31に示されるc198D軽鎖のアミノ酸番号29番目のアラニン残基をセリン残基に33番目のグリシン残基をアラニン残基に35番目のロイシン残基をバリン残基に、37番目のグルタミン酸残基をアスパラギン酸残基に、38番目のトレオニン残基をアルギニン残基に、42番目のグルタミン残基をトレオニン残基に、65番目のグルタミン残基をリシン残基に、85番目のグリシン残基をセリン残基に、92番目のセリン残基をトレオニン残基に、94番目のリシン残基をトレオニン残基に、98番目のメチオニン残基をロイシン残基に、100番目のトレオニン残基をプロリン残基に、103番目のグルタミン酸残基をフェニルアラニン残基に、104番目のグリシン残基をアラニン残基に、105番目のバリン残基をトレオニン残基に、120番目のセリン残基をグルタミン残基に、124番目のロイシン残基をバリン残基に、129番目のアラニン残基をトレオニン残基に置き換えることを伴い設計されたヒト化198D軽鎖を「h198D-L4タイプ軽鎖」と命名した。
また、h198D_L4タイプ軽鎖のアミノ酸配列(配列番号43]において、シグナル配列が切除された成熟軽鎖はアミノ酸番号21乃至234からなるアミノ酸配列であり、可変領域はアミノ酸番号21乃至129からなるアミノ酸配列であり、定常領域はアミノ酸番号130乃至234からなるアミノ酸配列である。
更に、配列番号42及び43の配列は、それぞれ図36及び26にも記載されている。
7)-9-1 ヒト化抗ヒトGARP抗体h151D-H1L1発現ベクターの構築
配列表の配列番号1に示されるh151D-H1タイプ重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号58乃至1398に示されるh151D-H1タイプ重鎖をコードする配列を含むDNA断片を合成した (GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。合成したDNA断片を用い、BioWa社及びLonza社のPotelligent(登録商標) CHOK1SV Technologyのプロトコールに準じてh151D-H1タイプ重鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「GSV-h151D-H1」と命名した。
次に、配列表の配列番号9に示されるh151D-L1タイプ軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号61乃至704に示されるh151D-L1タイプ軽鎖をコードする配列を含むDNA断片を合成した (GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。
合成したDNA断片をBioWa社及びLonza社のPotelligent(登録商標) CHOK1SV Technologyのプロトコールに準じて、h151D-L1タイプ重鎖発現ベクターを構築した。構築した発現ベクターを「GSV-h151D-L1」と命名した。
次に、構築した発現ベクター「GSV-h151D-H1」及び「GSV-h151D-L1」から、BioWa社及びLonza社のPotelligent(登録商標) CHOK1SV Technologyのプロトコールに準じて、MACA-1511a発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「DGV-h151D-H1L1-GS」と命名した。
実施例7)-9-1と同様に、配列表の配列番号34に示されるh151D-H4タイプ重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号58乃至1398に示されるh151D-H4タイプ重鎖をコードする配列を含むDNA断片と配列表の配列番号15に示されるh151D-L4タイプ軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号61乃至704に示されるh151D-L4タイプ軽鎖をコードする配列を含むDNA断片を合成した (GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。
合成したDNA断片を用い、BioWa社及びLonza社のPotelligent(登録商標) CHOK1SV Technologyのプロトコールに準じて、MACA-1514a発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「DGV-h151D-H4L4-GS」と命名した。
実施例4)-9-1と同様に、配列表の配列番号40に示されるh198D-_H3タイプ重鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号58乃至1407に示されるh198D-H3タイプ重鎖をコードする配列を含むDNA断片と配列表の配列番号42に示されるh198D-L4タイプ軽鎖のヌクレオチド配列のヌクレオチド番号61乃至704に示されるh198D-L4タイプ軽鎖をコードする配列を含むDNA断片を合成した (GENEART社 人工遺伝子合成サービス)。
合成したDNA断片を用い、BioWa社及びLonza社のPotelligent(登録商標) CHOK1SV Technologyのプロトコールに準じて、MACA-1983a発現ベクターを構築した。得られた発現ベクターを「DGV-h198D-H3L4-GS」と命名した。
7)-10-1 ヒト化抗ヒトGARP抗体生産細胞の作製
7)-10-1-1 ヒト化抗ヒトGARP抗体h151D-H1L1生産細胞の作製
BioWa社及びLonza社のPotelligent(登録商標) CHOK1SV Technologyのプロトコールに準じて、実施例7)-9-1で構築したヒト化抗ヒトGARP抗体h151D-H1L1発現ベクター、DGV-h151D-H1L1-GSをPotelligent CHOK1SV細胞 (BioWa社及びLonza社) にトランスフェクションし、ヒト化抗ヒトGARP抗体h151D-H1L1生産株を構築した。得られた生産株を「MAC1-1」と命名した。
実施例7)-10-1-1と同様に、実施例4)-9-2で構築したヒト化抗ヒトGARP抗体h151D-H4L4発現ベクター、DGV-h151D-H4L4-GSをPotelligent CHOK1SV細胞 (BioWa社及びLonza社) にトランスフェクションし、ヒト化抗ヒトGARP抗体h151D-H4L4生産株を構築した。得られた生産株を「MAC2-1」と命名した。
実施例7)-10-1-1と同様に、実施例7)-9-3で構築したヒト化抗ヒトGARP抗体h198D_H3L4発現ベクター、DGV-h198D_H3L4-GSをPotelligent CHOK1SV細胞 (BioWa社及びLonza社) にトランスフェクションし、ヒト化抗ヒトGARP抗体h151D-H4L4生産株を構築した。得られた生産株を「MAC3-1」と命名した。
7)-10-2-1 ヒト化抗ヒトGARP抗体h151D-H1L1生産細胞の培養
実施例7)-10-1-1で作製したヒト化抗ヒトGARP抗体h151D-H1L1生産株「MAC1-1」の培養は、培養装置Wave reactor (GEヘルスケア・ジャパン社) を用いて実施した。生産株「MAC1-1」をDsp04B (JXエネルギー社) 培地を用いて解凍し、37℃、5% CO2インキュベーター内にて120rpmで培養した。得られた培養液をC36 (JXエネルギー社) 培地で希釈し、37℃、5% CO2インキュベーター内にて120rpmで拡大培養した。
得られた培養液を細胞密度30×104cells/mLとなるようにC36培地で希釈してWAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience社) に仕込み、37℃、5% CO2、エアー供給量0.3L/分、揺動18-24rpm、角度6-8°で13日間培養した。
培養開始3日目よりFM4Ae2培地 (自家調製) を1日あたり、仕込み量の6%分を毎日添加した。得られた培養液をデプスフィルターMillistak MC0HC054H1 (Merck Millipore社) で粗ろ過後、Flexboy Bagsに付属の0.22μmフィルター (Sartorius社) でろ過した。このろ過液を「MACA-1511a 培養上清」と命名した。
実施例7)-10-2-1と同様に、実施例7)-10-1-2で作製したヒト化抗ヒトGARP抗体h151D-H4L4生産株「MAC2-1」を培養、拡大し、培養装置Wave reactor (GEヘルスケア・ジャパン社) を用いてフェッドバッチ培養を実施した。細胞密度30×104cells/mLとなるようにC36培地で希釈してWAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience社) に仕込み、13日間培養した。得られた培養液をろ過し、このろ過液を「MACA-1514a 培養上清」と命名した。
実施例7)-10-2-1と同様に、実施例7)-10-1-3で作製したヒト化抗ヒトGARP抗体h198D-H3L4生産株「MAC3-1」を培養、拡大し、培養装置Wave reactor (GEヘルスケア・ジャパン社) を用いてフェッドバッチ培養を実施した。細胞密度30×104cells/mLとなるようにC36培地で希釈してWAVE CELLBAG (GE Healthcare Bioscience社) に仕込み、13日間培養した。得られた培養液をろ過し、このろ過液を「MACA-1983a 培養上清」と命名した。
7)-10-3-1 ヒト化抗ヒトGARP抗体h151D-H1L1の精製
実施例7)-10-2-1で得られた「MACA-1511a 培養上清」を、rProteinAアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーの三段階工程で精製した。
最初に、培養上清を、PBSで平衡化したrProteinAアフィニティークロマト樹脂にアプライした。培養液がカラムに全て入ったのち、PBS、アルギニンを含む緩衝液、PBSでカラムを洗浄した。次に、酢酸緩衝液で溶出し、280nmの吸収ピークを回収した。回収液をTris緩衝液で中和し、グラスファイバーフィルター AP20 (Merck Millipore社) で粗ろ過後、0.22μmフィルターであるステリカップ-GV (Merck Millipore社) でろ過したものをrProteinA精製プールとした。
次に、AEX精製プールを、酢酸緩衝液で平衡化した陽イオン交換クロマト樹脂にアプライした。アプライ液がカラムに全て入ったのち、酢酸緩衝液でカラムを洗浄した。次に高濃度のNaClを含む酢酸緩衝液を用いて溶出し、280nmの吸収ピークを回収した。回収液をグラスファイバーフィルター AP20 (Merck Millipore社) で粗ろ過後、0.22μmフィルターであるステリカップ-GV (Merck Millipore社) でろ過したものをCEX精製プールとした。
CEX精製プールを、Pellicon 3 Cassette 30kDa (Merck Millipore社) にて抗体濃度25mg/mLに濃縮した後、ヒスチジンバッファー(25mM Histidine、5% Sorbitor、pH6.0) に置換した。最後にグラスファイバーフィルター AP20 (Merck Millipore社) で粗ろ過後、0.22μmフィルターであるステリカップ-GV (Merck Millipore社) でろ過したものを精製サンプルとした。精製サンプルを「h151D-H1L1」と命名した。
実施例7)-10-3-1と同様に、実施例7)-10-2-2で得られた「MACA-1514a 培養上清」を、rProteinAアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーの三段階工程で精製した。精製サンプルを「h151D-H4L4」と命名した。
実施例7)-10-3-1と同様に、実施例7)-10-2-3で得られた「MACA-1983a 培養上清」を、rProteinAアフィニティークロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーの三段階工程で精製した。精製サンプルを「h198D-H3L4」と命名した。
実施例7)-10で作製したヒト化抗ヒトGARP抗体h151D-H1L1、h151D-H4L4及びh151D-H3L4とGARPとの解離定数測定は、Biacore T200 (GEヘルスケアバイオサイエンス (株)) を使用し、固定化したProtein Aに抗体をリガンドとして捕捉 (キャプチャー) し、抗原をアナライトとして測定するキャプチャー法にて行った。ランニングバッファーとしてHBS-EP+ (GEヘルスケアバイオサイエンス (株) )、センサーチップとしてProtein A (GEヘルスケアバイオサイエンス (株)) を用いた。
チップ上に1μg/mLのヒトキメラ化抗体を10μL/minで20秒間添加した後、抗原の希釈系列溶液 (8~128nM) を流速30μl/分で120秒間添加し、引き続き480秒間の解離相をモニターした。再生溶液として、Glycine 1.5 (GEヘルスケアバイオサイエンス (株)) を流速20μl/分で30秒間添加した。
データの解析には1:1結合モデルを用いて、結合速度定数ka、解離速度定数kd及び解離定数 (KD;KD=kd/ka) を算出した。
8)-1 GARPへの結合
実施例2に記載した方法により、ヒトGARP発現ベクター及びコントロールベクターを導入したHEK-293T細胞懸濁液を調製した。得られた細胞懸濁液へh151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4、ならびにコントロールヒトIgG(human IgG: Eureka Therapeutics社)を添加し、15分間4℃で静置した。
FACSバッファー(3% FBS含有PBS(Invitrogen社))で2回洗浄後、R-Phycoerythrin(PE)標識抗IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories社)及びHorizon FVS450(Becton Dickinson社)を加えて懸濁し、さらに15分間4℃で静置した。以降のフローサイトメーター解析方法は実施例2に記載した内容と同様に実施し、PE蛍光強度のヒストグラムを作成した(図37)。
コントロールベクターを導入したHEK-293T細胞では、h151DH-1L1、h151D-H4L4、及びh198D-_H3L4はコントロールIgG同様の蛍光強度ヒストグラムを示した(図中にはMock vector-transfected HEK293Tと表記)。
一方、GARP発現HEK-293T細胞(図中にはhGARP-transfected HEK293Tと表記)では、コントロールhuman IgGの蛍光強度ヒストグラムに対してh151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D_H3L4のそれぞれのヒストグラムが強蛍光強度側にシフトしていることを確認した。
以上の結果から、h151D-H1L1、h151D-H4L4及びh198D-H3L4は、GARPに特異的に結合することが明らかになった。
8)-2-1 ヒトGARP変異体発現ベクターの構築
ヒトGARP発現ベクター(Origene社)を鋳型として、プライマーF(cacggcaacctgctggagcggctgctgggggagg)(配列番号44)、プライマーR(caggctgttcccagacaggtccag)(配列番号45)、及びKOD-Plus-Mutagenesis Kit(Toyobo社)を用いて、ヒトGARPアミノ酸配列(配列番号:1)のアミノ酸配列番号137-139のYSGをHGNに変換した、ヒトGARP変異体発現ベクターを構築して塩基配列を確認した。
ヒトTGFβ1発現ベクター(Sino Biological社)を、ヒトGARP発現ベクター又はヒトGARP変異体発現ベクターと共に、HEK-293T細胞へLipofectamin2000(Invitrogen社)を用いて遺伝子導入した。
10%FBS含有DMEM培地(Invitrogen社)中で5% CO2の条件下37℃で一晩培養した後、TrypLE Express(Invitrogen社)処理により細胞をプレートから回収し、FACSバッファーで2回洗浄後、同溶液に懸濁した。
得られた細胞懸濁液へ本願発明に係る105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4、ならびに公知抗体(特許文献1に記載の配列情報に基づき作製したヒトIgG1抗GARP抗体:MHG8、及びLHG10)の各抗体、及びコントロールヒトIgG(Eureka Therapeutics社)を添加し、15分間4℃で静置した。
FACSバッファーで2回洗浄後、PE標識抗IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories社)及びHorizon FVS450(Becton Dickinson社)を加えて懸濁し、さらに15分間4℃で静置した。以降のフローサイトメーター解析方法は実施例2に記載した内容と同様に実施し、PE蛍光強度のヒストグラムを作成した(図38)。
TGFβ1とGARPを共導入したHEK-293T細胞では、全ての抗体がコントロールIgGの蛍光強度ヒストグラムに対して強蛍光強度側にシフトしていることを確認した(図38)。
一方、TGFβ1とGARP変異体を共導入したHEK-293T細胞では、105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4の各抗体では同様な強蛍光強度側へのシフトが認められたが、MHG8、及びLHG10についてはコントロールIgGと同様の蛍光強度ヒストグラムとなり、[非特許文献12]に記載のとおりGARP変異体には結合しないことが示された。
以上の結果から、105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4の各抗体は、TGFβ1と共発現したGARP及びGARP変異体の両方に結合することが示され、MHG8及びLHG10抗体とは、GARPにおいて異なった領域に結合することが明らかになった。
9)-1 L428細胞を用いたフローサイトメトリー解析
L428細胞をFACSバッファーで2回洗浄後、同溶液に懸濁し、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D_H3L4、ならびにコントロールヒトIgG(human IgG: Eureka Therapeutics社)をそれぞれ添加して15分間4℃で静置した。FACSバッファーで2回洗浄後、PE標識抗IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories社)を加えて懸濁し、さらに15分間4℃で静置した。以降のフローサイトメーターでの解析方法は実施例3に記載した内容と同様に実施し、PE蛍光強度のヒストグラムを作成した。
コントロールIgGを添加したL428細胞の蛍光強度ヒストグラムに比べて、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D_H3L4の各抗体を添加したヒストグラムは強蛍光強度側へシフトしていることが認められ、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4が内因性に発現しているGARPに結合することが確認された(図39)。
PBMCは、凍結ヒトPBMC(Cellular Technology社)をプロトコールに従って解凍し、10% FBS含有RPMI1640(Invitrogen社)を用いて24ウエルプレート(住友ベークライト社)に2×106 cells/mLで播種した。
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28(Life technologies社)を添加して48時間培養後、細胞をFACSバッファーに懸濁し、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4の各抗体、ならびにコントロールヒトIgG(human IgG:Eureka Therapeutics社)をAPC標識抗CD4抗体(Becton Dickinson社)と共に添加して、10分間4℃に静置した。
FACSバッファーで細胞を洗浄後、FITC標識抗IgG抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories社)及びHorizon FVS450(Becton Dickinson社)を加えて懸濁し、さらに15分間4℃で静置した。
再びFACSバッファーで細胞を洗浄後、FoxP3 Staining Buffer Set(Miltenyi Biotec社)を用いて細胞を調製した後、PE標識抗Foxp3抗体(Miltenyi Biotec社)を添加して4℃で30分間静置した。
細胞洗浄後、フローサイトメーター(Facs Canto II:Becton Dickinson社)を用いて測定し、Horizon FVS450により死細胞を除去したCD4陽性細胞について、FlowJo(Tree Star社)で解析した。
その結果、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4の各抗体は、FoxP3陽性Tregに結合することが示された(図40)。
10)-1 ADCC活性
h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4、ならびに公知抗体(特許文献1に記載の配列情報に基づき作製したヒトIgG1抗GARP抗体:MHG8、及びLHG10)の各抗体、及びコントロールヒトIgG(Sigma社)の各抗体のADCC活性を実施例4に記載の方法により測定した。
h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4抗体は、L428細胞に対して抗体濃度依存的に細胞溶解活性を示した(図41A)。
一方、MHG8及びLHG10は、実施例4に記載したとおり、コントロールヒトIgG同様に細胞溶解活性を認めなかった(図41B)。
以上のことから、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4の各抗体はADCC活性を有することが示された。
h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4の各抗体のTreg機能阻害活性を実施例4に記載の方法により測定した。h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4の終濃度1μg/mLのTreg機能阻害活性(h151D-H1L1阻害率81.5%、h151D-H4L4阻害率80.4%、h198D-H3L4阻害率70.8%)を図42に示す。
h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4抗体は、Treg機能阻害活性を有することが示された。
10)-3-1 Cytotoxic T lymphocyte (CTL) の調製
NY-ESO-1特異的なT細胞受容体を有するCTL細胞(MU28 CD8B35 Clone #7:三重大学より入手)を三重大学のプロトコールに従い、3×105細胞/25 cm2フラスコ (住友ベークライト社)で抗CD3抗体(OKT3:Imgenex社)、IL-2(Novartis社)、ならびにフィーダー細胞群の存在下で、10% Human male AB serum(Sigma社)含有RPMI1640培地(Invitrogen社)中で7日間培養した。
フィーダー細胞群は、凍結ヒトPBMC(Cellular Technology社)をプロトコールに従って解凍したPBMCからCD8 MicroBeads(Miltenyi Biotech社)を用いてCD8陽性細胞を除去したCD8-depleted PBMC(7.5×106細胞/25 cm2フラスコ)、ならびに103-LCL細胞(理化学研究所バイオリソースセンターより入手)(1.5×106細胞/25 cm2フラスコ)にX線照射装置(日立メディコ社)を用いてX-線照射を施したものを使用した。
実施例4)-2-1に示した方法で得たTregを本培養開始時に添加(1.5×105細胞/25 cm2フラスコ)することで、CTL細胞活性のTregによる抑制効果を評価した。また、同法で得たTreg(7.5×104細胞/25 cm2フラスコ)と、105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4、ならびにヒトIgG1(Enzo社)の各抗体を本培養開始時に添加(10μg/ml)することで、各抗体の抗腫瘍活性を評価した。
各培養後、CD8+ T Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotech社)を用いてCD8陽性細胞を精製分離することでCTL細胞を調製し、活性評価に用いた。
ヒトメラノーマ細胞株でNY-ESO-1を発現するSK-MEL-52細胞(三重大学より入手:Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Jul; 77(7): 4260-4)は10%FBS含有RPMI1640培地(Invitrogen社)を用いて培養し、51Crによるラベル化については、実施例4)-1-2と同様の方法で実施し、2×104細胞/mLに調製して標的細胞とした。
96ウエルU底マイクロプレート(Costar社)へ標的細胞を分注(50μL/ウェル)した。
次いで、CTL細胞数が標的細胞の16、8、4、2倍(CTL細胞:標的細胞=16:1、8:1、4:1、2:1)になるように、CTL細胞を添加(100μL/ウエル)し、5%CO2の条件下で4時間37℃にて培養した。以降は実施例4)-1-3の方法に従った。なお、当該阻害活性は、各実験に供与された検体毎に算出される結果である。また、当該CTL細胞はNY-ESO-1を発現しない細胞に対しては細胞溶解を示さないことを確認している。
測定結果を図43、44に示す。
SK-MEL-52に対するCTL細胞の細胞溶解活性は、Tregにより抑制された(図43)。
一方、105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4の各抗体を添加したCTL細胞では、CTL細胞数の増加に伴ってSK-MEL-52細胞に対する細胞溶解率の上昇が見られ、かつ、その効果はコントロールIgGを添加した各細胞比での溶解率に比べて明らかに高かった(図44)。
従って105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4の各抗体は、CTL細胞活性のTregによる抑制を阻害して、抗腫瘍活性を増強させることが示された。
L428細胞を移植したNOD/Shi-scid, IL-2Rγnull (NOG)マウスへヒトPBMCを移入することで、ADCC活性を有するキメラ抗体の抗腫瘍効果を評価可能であることが知られている(J Immunol. 2009 Oct 1;183(7):4782-91)。
RPMI1640培地(Invitrogen社)とマトリゲル(Becton Dickinson社)1:1の混液にて1x107cells/mLに懸濁したL428細胞(DSMZ)をNOGマウス(雌性、In vivo science社)の腋窩部皮下に0.1 mL移植し、移植した日をDay0とした。Day6に腫瘍体積値を用いて群分けを行い(各群n=6)、次の投与群を設定した。
105F抗体:Day6, 10, 14, 18, 22, 26に5mg/kg投与、Day6, 14, 22にヒトPBMC(Lot:20140707)投与
PBSコントロール2:Day6, 10, 14, 18, 22に投与、Day6, 14, 22にヒトPBMC(Lot:20150924)投与
h151D-H1L1抗体:Day6, 10, 14, 18, 22に1mg/kg投与、Day6, 14, 22にヒトPBMC(Lot:20150924)投与
h151D-H4L4抗体:Day0, 6, 10, 14, 18, 22に1mg/kg投与、Day6, 14, 22にヒトPBMC(Lot:20150924)投与
h198D-H3L4抗体:Day0, 6, 10, 14, 18, 22に1mg/kg投与、Day6, 14, 22にヒトPBMC(Lot:20150924)投与
ヒトPBMCは、凍結ヒトPBMC(Cellular Technology社)をプロトコールに従って解凍したものを1x107cells/mLに調製して0.2 mLを尾静脈内より投与した。
経時的に腫瘍の長径(mm)及び短径(mm)を電子デジタルノギス(株式会社ミツトヨ製)で計測し、以下に示す計算式により腫瘍体積を算出した。
腫瘍体積(mm3)=1/2×[腫瘍長径]×[腫瘍短径]×[腫瘍短径]
各群の腫瘍体積の平均値±標準誤差(SE)の変化を図45に示す。
105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4の各抗体は、PBMCのみを投与したコントロール群に比べて、L428細胞に対する抗腫瘍活性を示し、コントロール群に対する有意差(105F:t検定、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4:Dunnett型多重比較検定)が認められた。各投与群の測定最終日(105F:Day31、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4:Day25)における有意差検定結果(P値)を図中に併記する。
従って、105F、h151D-H1L1、h151D-H4L4、及びh198D-H3L4の各抗体は、in vivoモデルにおいても抗腫瘍活性を示すことが明らかになった。
抗ヒトGARP抗体(105F、110F、h151D-H1L1、及びh198D-H3L4)のエピトープは、水素重水素交換質量分析法により解析された。
7 mg/mLの抗ヒトGARP抗体と3mg/mLのヒトGARP(R&D Systems社)又はブランク緩衝液を等量混合し、この溶液に9等量の軽水又は重水を添加した。30秒、480秒、6000秒後、又は一晩後、試料に100mM リン酸、4M Gdn・HCl、150 mM TCEP、pH 2.5を等量加えて重水置換させた。重水置換した試料は冷却下でHPLCへと注入され、0.1%TFA溶液で固定化ペプシンカラムへと送液された。
ペプシンカラム内でヒトGARPが消化されることで得られたペプチド断片は、C18トラップカラムに保持され、続いて0.1%ギ酸及び0.025%TFAを添加した水及びアセトニトリルのリニアグラジエント勾配によって溶出されてC18分析カラムで分離された。分離されたペプチド断片は、飛行時間型質量分析計によって質量分析された。
各ペプチドの質量から重水置換率が算出され、抗ヒトGARP抗体の添加により重水置換率の顕著な低下が認められたペプチド断片をエピトープ断片として同定した。
105Fでは配列番号1に示されるヒトGARPの366-377、407-445、456-470残基で重水置換率の抑制が認められ、エピトープとして同定された。
110Fでは配列番号1に示されるヒトGARPの54-112、366-392残基で重水置換率の抑制が認められ、エピトープとして同定された。
h151D-H1L1では配列番号1に示されるヒトGARPの352-392残基で重水置換率の抑制が認められ、エピトープとして同定された。
h198D-H3L4では配列番号1に示されるヒトGARPの18-112残基で重水置換率の抑制が認められ、エピトープとして同定された。
配列番号2 - 105F抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号3 - 105F抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号4 - 110F抗体重鎖のアミノ酸配列
配列番号5 - 110F抗体軽鎖のアミノ酸配列
配列番号6 - 105F抗体重鎖のヌクレオチド配列
配列番号7 - 105F抗体軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号8 - 110F抗体重鎖のヌクレオチド配列
配列番号9 - 110F抗体軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号10 - プライマーA
配列番号11 - プライマーB
配列番号12 - プライマーC
配列番号13 - プライマーD
配列番号14 - 151Dの重鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列
配列番号15 - 151Dの重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号16 - 151Dの軽鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列
配列番号17 - 151Dの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号18 - 198Dの重鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列
配列番号19 - 198Dの重鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号20 - 198Dの軽鎖の可変領域をコードするcDNAのヌクレオチド配列
配列番号21 - 198Dの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列
配列番号22 - ヒト軽鎖シグナル配列及びヒトκ鎖定常領域のアミノ酸をコードする配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号23 - ヒト重鎖シグナル配列及びヒトIgG1定常領域のアミノ酸をコードする配列を含むDNA断片のヌクレオチド配列
配列番号24 - ヒトキメラ抗体c151D重鎖のヌクレオチド配列
配列番号25 - ヒトキメラ抗体c151D重鎖のアミノ酸配列
配列番号26 - ヒトキメラ抗体c151D軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号27 - ヒトキメラ抗体c151D軽鎖のアミノ酸配列
配列番号28 - ヒトキメラ抗体c198D重鎖のヌクレオチド配列
配列番号29 - ヒトキメラ抗体c198D重鎖のアミノ酸配列
配列番号30 - ヒトキメラ抗体c198D軽鎖のヌクレオチド配列
配列番号31 - ヒトキメラ抗体c198D軽鎖のアミノ酸配列
配列番号32 - ヒト化抗体h151D-H1のヌクレオチド配列
配列番号33 - ヒト化抗体h151D-H1のアミノ酸配列
配列番号34 - ヒト化抗体h151D-H4のヌクレオチド配列
配列番号35 - ヒト化抗体h151D-H4のアミノ酸配列
配列番号36 - ヒト化抗体h151D-L1のヌクレオチド配列
配列番号37 - ヒト化抗体h151D-L1のアミノ酸配列
配列番号38 - ヒト化抗体h151D-L4のヌクレオチド配列
配列番号39 - ヒト化抗体h151D-L4のアミノ酸配列
配列番号40 - ヒト化抗体h198D-H3のヌクレオチド配列
配列番号41 - ヒト化抗体h198D-H3のアミノ酸配列
配列番号42 - ヒト化抗体h198D-L4のヌクレオチド配列
配列番号43 - ヒト化抗体h198D-L4のアミノ酸配列
配列番号44 - プライマーF
配列番号45 - プライマーR
Claims (39)
- 以下の特性を有することを特徴とする抗体;
(1)Glycoprotein-A Repetitions Predominant (GARP)に特異的に結合する
(2)制御性T細胞の免疫抑制機能に対する阻害活性を有する、
(3)抗体依存性細胞傷害(ADCC)活性を有する、及び
(4)in vivoで抗腫瘍活性を有する。 - GARPが配列番号1に記載のアミノ酸配列からなる分子である請求項1に記載の抗体。
- (1)配列番号1においてアミノ酸番号366乃至377、407乃至445及び456乃至470、
(2)配列番号1においてアミノ酸番号54乃至112及び366乃至392、
(3)配列番号1においてアミノ酸番号352乃至392、又は
(4)配列番号1においてアミノ酸番号18乃至112、
に結合する請求項1又は2に記載の抗体。 - GARPへの結合に対して、
(1)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
(2)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号5に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
(3)配列番号25に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号27に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は
(4)配列番号29に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号31に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
を有する抗体と競合阻害活性を有する請求項1乃至3のいずれか一項に記載の抗体。 - 腫瘍が癌である請求項1乃至4のいずれか1項に記載の抗体。
- 癌が肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、又は血液癌である請求項5に記載の抗体。
- (1)配列番号2においてアミノ酸番号26乃至35に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号2においてアミノ酸番号50乃至66に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号2においてアミノ酸番号99乃至107に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配列番号3においてアミノ酸番号23乃至36に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号3においてアミノ酸番号52乃至58に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号3においてアミノ酸番号91乃至101に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
(2)配列番号4においてアミノ酸番号26乃至35に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号4においてアミノ酸番号50乃至66に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号4においてアミノ酸番号99乃至112に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配列番号5においてアミノ酸番号23乃至36に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号5においてアミノ酸番号52乃至58に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号5においてアミノ酸番号91乃至100に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
(3)配列番号25においてアミノ酸番号45乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号25においてアミノ酸番号69乃至78に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号25においてアミノ酸番号118乃至125に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配列番号27においてアミノ酸番号44乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号27においてアミノ酸番号70乃至76に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号27においてアミノ酸番号109乃至117に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、又は
(4)配列番号29においてアミノ酸番号45乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRH1、配列番号29においてアミノ酸番号69乃至77に記載のアミノ酸配列からなるCDRH2及び配列番号29においてアミノ酸番号117乃至128に記載のアミノ酸配列からなるCDRH3、並びに配列番号31においてアミノ酸番号44乃至54に記載のアミノ酸配列からなるCDRL1、配列番号31においてアミノ酸番号70乃至76に記載のアミノ酸配列からなるCDRL2及び配列番号31においてアミノ酸番号109乃至117に記載のアミノ酸配列からなるCDRL3、
を有する請求項1乃至6のいずれか1項に記載の抗体。 - (1)配列番号2においてアミノ酸番号1乃至118に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号3においてアミノ酸番号1乃至112に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(2)配列番号4においてアミノ酸番号1乃至123に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号5においてアミノ酸番号1乃至111に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(3)配列番号25においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号27においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は
(4)配列番号29においてアミノ酸番号20乃至139に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号31においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
を有する請求項1乃至7のいずれか1項に記載の抗体。 - 定常領域がヒト由来定常領域である請求項1乃至8のいずれか1項に記載の抗体。
- (1)配列番号2に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号3に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
(2)配列番号4に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号5に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
(3)配列番号25においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号27においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、又は
(4)配列番号29においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列からなる重鎖及び配列番号31においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖、
を有する請求項1乃至9のいずれか1項に記載の抗体。 - ヒト化されている請求項1乃至10のいずれか1項に記載の抗体。
- (a)配列番号33においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列、
(b)配列番号35においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列、
(c)配列番号41においてアミノ酸番号20乃至139に記載のアミノ酸配列、
(d)(a)乃至(c)の配列において各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95%以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び
(e)(a)乃至(c)の配列における各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる重鎖の可変領域、並びに
(f)配列番号37においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列、
(g)配列番号39においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列、
(h)配列番号43においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列、
(i)(f)乃至(h)の配列において各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列に対して少なくとも95%以上の相同性を有するアミノ酸配列、及び
(j)(f)乃至(h)の配列における各CDR 配列以外のフレームワーク領域の配列において1又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列、からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる軽鎖の可変領域、
を有する請求項11に記載の抗体。 - (1)配列番号33においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号37においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
(2)配列番号35においてアミノ酸番号20乃至136に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号39においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、又は
(3)配列番号41においてアミノ酸番号21乃至139に記載のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域及び配列番号43においてアミノ酸番号21乃至129に記載のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域、
を有する請求項11又は12に記載の抗体。 - (1)配列番号33においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、配列番号35においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、及び配列番号41においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列を有する重鎖、からなる群から選択される重鎖、並びに
(2)配列番号37においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、配列番号39においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、及び配列番号43においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、からなる群から選択される軽鎖、
を有する請求項11乃至13のいずれか1項に記載の抗体。 - (1)配列番号33においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号37においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、
(2)配列番号35においてアミノ酸番号20乃至466に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号39においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、又は
(3)配列番号41においてアミノ酸番号20乃至469に記載のアミノ酸配列を有する重鎖及び配列番号43においてアミノ酸番号21乃至234に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖、
を有する請求項11乃至14のいずれか1項に記載の抗体。 - 請求項1乃至15のいずれか1項に記載の抗体をコードするポリヌクレオチド。
- (1)配列番号6においてヌクレオチド番号76乃至105に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH1のポリヌクレオチド、配列番号6においてヌクレオチド番号148乃至198に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH2のポリヌクレオチド及び配列番号6においてヌクレオチド番号295乃至321に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH3のポリヌクレオチド、並びに配列番号7においてヌクレオチド番号67乃至108に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL1のポリヌクレオチド、配列番号7においてヌクレオチド番号154乃至174に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL2のポリヌクレオチド及び配列番号7においてヌクレオチド番号271乃至303に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL3のポリヌクレオチド、
(2)配列番号8においてヌクレオチド番号76乃至105に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH1のポリヌクレオチド、配列番号8においてヌクレオチド番号148乃至198に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH2のポリヌクレオチド及び配列番号8においてヌクレオチド番号295乃至336に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH3のポリヌクレオチド、並びに配列番号9においてヌクレオチド番号67乃至108に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL1のポリヌクレオチド、配列番号9においてヌクレオチド番号154乃至174に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL2のポリヌクレオチド及び配列番号9においてヌクレオチド番号271乃至300に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL3のポリヌクレオチド、
(3)配列番号24においてヌクレオチド番号133乃至162に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH1のポリヌクレオチド、配列番号24においてヌクレオチド番号205乃至234に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH2のポリヌクレオチド及び配列番号24においてヌクレオチド番号352乃至375に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH3のポリヌクレオチド、並びに配列番号26においてヌクレオチド番号130乃至162に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL1のポリヌクレオチド、配列番号26においてヌクレオチド番号208乃至228に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL2のポリヌクレオチド及び配列番号26においてヌクレオチド番号325乃至351に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL3のポリヌクレオチド、又は
(4)配列番号28においてヌクレオチド番号133乃至162に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH1のポリヌクレオチド、配列番号28においてヌクレオチド番号205乃至231に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH2のポリヌクレオチド及び配列番号28においてヌクレオチド番号349乃至384に記載のヌクレオチド配列からなるCDRH3のポリヌクレオチド、並びに配列番号30においてヌクレオチド番号130乃至162に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL1のポリヌクレオチド、配列番号30においてヌクレオチド番号208乃至228に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL2のポリヌクレオチド及び配列番号30においてヌクレオチド番号325乃至351に記載のヌクレオチド配列からなるCDRL3のポリヌクレオチド、
を有する請求項16に記載のポリヌクレオチド。 - (1)配列番号6においてヌクレオチド番号1乃至354に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域のポリヌクレオチド及び配列番号7においてヌクレオチド番号1乃至336に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域のポリヌクレオチド、
(2)配列番号8においてヌクレオチド番号1乃至369に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域のポリヌクレオチド及び配列番号9においてヌクレオチド番号1乃至333に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域のポリヌクレオチド、
(3)配列番号24においてヌクレオチド番号58乃至408に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域及び配列番号26においてヌクレオチド番号61乃至387に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域、又は
(4)配列番号28においてヌクレオチド番号58乃至417に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域及び配列番号30においてヌクレオチド番号61乃至387に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域、
を有する請求項16又は17に記載のポリヌクレオチド。 - (1)配列番号6に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド及び配列番号7に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、
(2)配列番号8に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド及び配列番号9に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド
(3)配列番号24においてヌクレオチド番号58乃至1398に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド及び配列番号26においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、又は
(4)配列番号28においてヌクレオチド番号58乃至1407に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド及び配列番号30においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、
を有する請求項16乃至18のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。 - (1)配列番号32においてヌクレオチド番号58乃至408に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域、配列番号34においてヌクレオチド番号58乃至408に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域、及び配列番号40においてヌクレオチド番号58乃至417に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域、からなる群から選択される重鎖可変領域、並びに
(2)配列番号36においてヌクレオチド番号61乃至387に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域、配列番号38においてヌクレオチド番号61乃至387に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域、及び配列番号42においてヌクレオチド番号61乃至387に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域、からなる群から選択される軽鎖可変領域、
を有する請求項16又は17に記載のポリヌクレオチド。 - (1)配列番号32においてヌクレオチド番号58乃至408に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域及び配列番号36においてヌクレオチド番号61乃至387に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域、
(2)配列番号34においてヌクレオチド番号58乃至408に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域及び配列番号38においてヌクレオチド番号61乃至387に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域、又は
(3)配列番号40においてヌクレオチド番号58乃至417に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖可変領域及び配列番号42においてヌクレオチド番号61乃至387に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖可変領域、
を有する請求項16、17又は20に記載のポリヌクレオチド。 - (1)配列番号32においてヌクレオチド番号58乃至1398に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド、配列番号34においてヌクレオチド番号58乃至1398に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド、及び配列番号40においてヌクレオチド番号58乃至1407に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド、からなる群から選択される重鎖のポリヌクレオチド、並びに
(2)配列番号36においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、配列番号38においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、及び配列番号42においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、からなる群から選択される軽鎖のポリヌクレオチド、
を有する請求項16、17、20又は21に記載のポリヌクレオチド。 - (1)配列番号32においてヌクレオチド番号58乃至1398に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド、及び配列番号36においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、
(2)配列番号34においてヌクレオチド番号58乃至1398に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド、及び配列番号38においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、又は
(3)配列番号40においてヌクレオチド番号58乃至1407に記載のヌクレオチド配列からなる重鎖のポリヌクレオチド、及び配列番号42においてヌクレオチド番号61乃至702に記載のヌクレオチド配列からなる軽鎖のポリヌクレオチド、
を有する請求項16、17及び20乃至22のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。 - 請求項16乃至23のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含有する発現ベクター
- 請求項24に記載の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 請求項25に記載の宿主細胞を培養する工程、及び当該工程で得られた培養物から目的の抗体を採取する工程を含むことを特徴とする当該抗体又は当該断片の製造方法。
- 請求項26の製造方法により得られることを特徴とする抗体。
- N-結合への糖鎖付加、O-結合への糖鎖付加、N末のプロセッシング、C末のプロセッシング、脱アミド化、アスパラギン酸の異性化、メチオニンの酸化、N末にメチオニン残基の付加、プロリン残基のアミド化及びカルボキシル末端において1つ又は2つのアミノ酸が欠失した重鎖からなる群より選択される1又は2以上の修飾を含む請求項1乃至15及び27のいずれか1項に記載の抗体。
- 重鎖のカルボキシル末端において1つ又は2つのアミノ酸が欠失している請求項28に記載の抗体。
- 2本の重鎖の双方でカルボキシル末端において1つのアミノ酸が欠失している請求項29に記載の抗体。
- 重鎖のカルボキシル末端のプロリン残基が更にアミド化されている請求項28乃至30のいずれか1項に記載の抗体。
- 抗体依存性細胞傷害活性を増強させるために糖鎖修飾が調節されている請求項1乃至15及び27乃至31のいずれか1項に記載の抗体。
- 請求項1乃至15及び27乃至32に記載の抗体の少なくとも一つを含有することを特徴とする医薬組成物。
- 腫瘍治療用である請求項33に記載の医薬組成物。
- 腫瘍が癌である請求項34に記載の医薬組成物。
- 癌が肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、又は血液癌である請求項35に記載の医薬組成物。
- 請求項1乃至15及び27乃至32に記載の抗体の少なくとも一つを個体に投与することを特徴とする腫瘍の治療方法。
- 腫瘍が癌である請求項37に記載の治療方法。
- 癌が肺癌、腎癌、尿路上皮癌、大腸癌、前立腺癌、多形神経膠芽腫、卵巣癌、膵癌、乳癌、メラノーマ、肝癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、又は血液癌である請求項38に記載の治療方法。
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