KR20170133498A - 비인간 동물에서의 인간화 t 세포 매개 면역반응 - Google Patents
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Abstract
인간화 T 세포 보조 수용체(예를 들어, 인간화 CD4 및/또는 CD8(예를 들어, CD8α 및/또는 CD8β)), 적어도 하나의 인간 TCR 가변 영역 유전자 단편에 의해 코딩되는 가변 도메인을 포함하는 인간 또는 인간화 T 세포 수용체(TCR) 및/또는 인간화 T 세포 보조 수용체에 결합하는 인간 또는 인간화 주요 조직적합성 복합체(예를 들어, 각각 인간 또는 인간화 MHC II(예를 들어, MHC II α 및/또는 MHC II β 쇄) 및/또는 MHC I(예를 들어, MHC Iα), 및 임의로 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린)를 발현하도록 유전자 조작된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트)가 본 명세서에 개시된다. 또한 상술한 것을 발현하는 배아, 조직 및 세포가 제공된다. 적어도 하나의 인간화 T 세포 보조 수용체(예를 들어, 인간화 CD4 및/또는 CD8), 인간화 T 세포 보조 수용체와 결합하는 적어도 하나의 인간화 MHC(예를 들어, 각각 인간화 MHC II 및/또는 MHC I) 및/또는 인간화 TCR을 발현하는 유전자 조작 동물을 생산하는 방법도 제공된다. 인간 치료제를 개발하기 위해 실질적인 인간화 T 세포 면역반응을 일으키는 유전자 조작 동물을 사용하는 방법도 제공된다.
Description
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 제62/143,687호(2015년 4월 6일자로 출원됨), 미국 가출원 제62/158,804호(2015년 5월 8일자로 출원됨) 및 미국 가출원 제62/186,935호(2015년 6월 30일자로 출원됨)의 우선권을 주장하며, 이들 각각의 출원은 본 명세서에 참조로 포함된다.
서열 목록
서열 목록의 공식 사본은 2016년 4월 6일자로 작성되고 크기가 56.7 킬로바이트인 2016-04-06-10145WO01-SEQ-LIST_ST25.txt의 파일명의 ASCII 포맷 서열 목록으로서 EFS-웹을 통해 전자적으로 제출되며, 본 명세서와 동시에 제출된 것이다. 이러한 ASCII 포맷 문서에 포함된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며, 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.
기술분야
본 발명은 실질적인 인간(화) T 세포 매개 면역반응을 일으켜, (i) 하나 이상의 인간(화) T 세포 보조 수용체(들) (예를 들어, CD4 및/또는 CD8(예를 들어, CD8α 및/또는 CD8β)), (ii) 하나 이상의 인간(화) T 세포 보조 수용체(들)와 결합하는 하나 이상의 인간(화) 주요 조직적합성 복합체(들) (예를 들어, MHC II(예를 들어, MHC α 및/또는 MHC II β) 및/또는 MHC I(예를 들어, MHC I α 및/또는 β2 마이크로글로불린)) 및/또는 (iii) 인간(화) T 세포 수용체(TCR) (예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)를 발현할 수 있는 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트); 비인간 동물로부터 단리된 배아, 조직, 세포 및/또는 핵산; 비인간 동물을 생산하는 방법; 및 인간 치료제 개발을 위해 비인간 동물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
후천성 면역반응에서, 외부 항원은 B 림프구 상의 수용체 분자(예를 들어, 면역글로불린) 및 T 림프구 상의 수용체 분자(예를 들어, TCR로도 지칭되는 T 세포 수용체)에 의해 인식된다. 이들 외부 항원은 일반적으로 주요 조직적합성 복합체(MHC) 분자로 지칭되고, 특히 인간에서 인간 백혈구 항원(HLA)으로 지칭되는 특수한 단백질에 의해 펩타이드 단편으로서 세포 표면에 제시된다. T 세포 매개 반응 시에, MHC 분자에 의해 제시된 항원은 T 세포 수용체에 의해 인식된다. 그러나, 효과적인 면역반응을 위해서는 T 세포 수용체 그 이상으로 MHC-항원 복합체의 인식이 필요하다. MHC의 불변부(invariant portion)에 대한 T 세포 보조 수용체 분자(예를 들면, CD4 또는 CD8)의 결합도 필요하다.
T 세포는 헬퍼 T 세포 및 세포독성 T 세포를 비롯한 여러 종류로 존재한다. 헬퍼 T 세포는, 보조 수용체 CD4를 발현하고, MHC II 분자에 결합된 항원을 인식한다. CD4+ T 세포는 면역계에서 다른 이펙터 세포를 활성화시켜, 예를 들어 MHC II 발현 B 세포를 활성화시켜, 항체를 생성하고, MHC II 발현 대식세포를 활성화시켜 병원체 등을 파괴한다. CD4 및 T 세포 수용체가 동일한 MHC II에 의해 제시된 외부 항원에 결합하면, T 세포가 그 항원에 대한 감수성이 훨씬 더 높아진다.
대조적으로, 세포독성 T 세포(CTL)는 보조 수용체 CD8을 발현하고, MHC I 분자에 결합된 외부 항원을 인식한다. CTL은 이의 자체 막 결합형 TCR에 의해 인식되는 MHC I 결합 펩타이드를 갖는 임의의 세포를 사멸시키도록 특수화되어 있다. 세포가 통상 존재하지 않는 (예를 들어, 바이러스, 종양 또는 기타 비자기(non-self) 기원의) 세포 단백질로부터 유래된 펩타이드를 나타내는 경우, 이러한 펩타이드가 CTL에 의해 인식되고, CTL이 활성화되어, 펩타이드를 나타내는 세포를 사멸시킨다. CD4와 유사하게, CD8이 결합하면, CTL이 MHC I에 의해 제시된 항원에 대하여 더욱 감수성이 높아진다.
모든 항원이 내성 메커니즘으로 인해 T 세포 활성화를 유발하지는 않을 것이다. 그러나, 일부 질환(예를 들면, 암, 자가 면역 질환)에서 자기 단백질로부터 유래된 펩타이드가 면역계의 세포 성분의 표적이 되어, 이러한 펩타이드를 제시하는 세포가 파괴된다. 임상적으로 유의한 항원(예를 들어, 다양한 종류의 암과 관련된 항원) 및/또는 임상적으로 유의한 항원에 결합하는 TCR 서열을 인식하는데 상당한 진보가 이루어졌다. 그러나, 인간 T 세포에서 적절한 반응을 유발할 임상적으로 유의한 펩타이드 및/또는 임상적으로 유의한 항원(예를 들어, 암의 양자 면역 요법, 자가 면역에 대한 T 세포 백신 접종 등에 대한)을 결합할 수 있는 TCR의 동정 및 선택을 개선시키기 위해서는, 인간 면역계의 양상을 모방하는 생체 내 및 시험관 내 시스템이 여전히 요구된다. 따라서, 인간 면역계의 구성성분, 특히 T 세포 면역 반응의 구성성분을 나타낼 수 있는 생체계(예를 들어, 유전자 변형 비인간 동물 및 세포)가 필요하다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 실질적인 인간화 T 세포 면역계를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물의 흉선은 대조군 동물과 유사한 절대수의 흉선 세포 및 CD3+ T 세포를 갖는다. 또한, 이들 세포는 대조군 동물에 상당하는 단일 양성 T 세포로의 발달을 보이며, 항원, 예를 들어 바이러스 항원에 대하여 강한 인간 세포 반응을 일으킬 수 있다. 비인간 동물의 인간 세포 반응은 일반적으로 인간 백혈구 항원(HLA) 세포외 도메인에 의해 형성된 펩타이드 결합 틈(peptide binding cleft)에 제시된 항원을 인식하는 인간 또는 인간화 T 세포 수용체(TCR) 가변 도메인을 발현하는 활성화된 비인간 T 세포를 포함하며, 이는 비인간 항원 제시 세포의 표면에 발현될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 실질적인 인간화 T 세포 면역계는,
(A) (i) T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드가,
(a) 인간 또는 인간화 HLA 분자의 하나 이상의 세포외 도메인(예를 들어, T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드의 결합 부위인 제1 인간 HLA 세포외 도메인 및/또는 예를 들어, 제3 인간 HLA 세포외 도메인과 펩타이드 결합 틈을 형성하는 제2 인간 HLA 세포외 도메인),
(b) 인간 또는 인간화 TCR 가변 도메인의 세포외 도메인(예를 들어, 각각 적어도 하나의 인간 TCRα 및/또는 TCRβ 가변 영역 유전자 단편에 의해 코딩되는 인간 또는 인간화 TCRα 가변 도메인 및/또는 인간 또는 인간화 TCRβ 가변 도메인), 및/또는
(c) 인간 TCR 불변 도메인의 세포외 도메인과 결합할 수 있고/있거나 결합하도록, 인간 T 세포 보조 수용체의 세포외 부분의 일부 또는 전부를 포함하는 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드, 예를 들어 하나 이상의 인간 T 세포 보조 수용체 세포외 도메인을 포함하는 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드, 및
(ii) 적어도 인간 TCR 가변 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 비인간 T 세포; 및 임의로
(B) 인간 HLA와 관련하여 항원을 제시하는 비인간 항원 제시 세포, 예를 들어 2개의 인간 HLA 세포외 도메인에 의해 형성된 펩타이드 결합 틈을 포함하는 적어도 하나의 MHC 분자를 그 세포 표면에 발현하여, 비인간 T 세포를 활성화시킬 수 있고/있거나 활성화시키는 비인간 항원 제시 세포를 포함한다.
한 측면에서, 비인간 T 세포 및 비인간 항원 제시 세포는 동일한 비인간 동물에서 발견되거나 단리된다.
따라서, (A) 인간 또는 인간화 T 세포 보조 수용체(예를 들어, 인간 또는 인간화 CD4 및/또는 인간 또는 인간화 CD8(예를 들어, 인간 또는 인간화 CD8α 및/또는 인간 또는 인간화 CD8β)),
(B) 인간 또는 인간화 T 세포 보조 수용체와 결합하는 인간 또는 인간화 주요 조직적합성 복합체(예를 들어, 인간 또는 인간화 CD4에 결합하는 인간 또는 인간화 MHC II(예를 들어, 인간 또는 인간화 MHC II α 및/또는 인간 또는 인간화 MHC II β) 및/또는 인간 또는 인간화 CD8에 결합하는 인간 또는 인간화 MHC I(예를 들어, 인간 또는 인간화 MHC Iα, 및 임의로 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린)), 및/또는
(C) 인간 또는 인간화 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 유전자 조작된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트); 및
상술한 것을 발현하는 배아, 조직 및 세포, 그리고 상술한 것을 코딩하는 핵산이 본 명세서에 제공된다. 또한, 개시된 비인간 동물을 생산 및 사용하는 방법이 제공된다.
한 측면에서,
(A) 인간화 CD4 보조 수용체 및/또는 인간화 CD8α 폴리펩타이드 및 인간화 CD8β 폴리펩타이드를 포함하는 인간화 CD8 보조 수용체(예를 들어, 비인간 동물은 예를 들어, 그 생식세포 게놈에, 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 및/또는 키메라 인간/비인간 CD8α 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/비인간 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함함)
- 여기서, 각각의 인간화 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드는 비인간 T 세포 보조 수용체의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며, 예를 들어 인간화 CD4 보조 수용체는 비인간 CD4 보조 수용체의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고/하거나, 인간화 CD8 보조 수용체는 비인간 CD8α 및 비인간 CD8β 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함함,
각각의 키메라 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드는 인간 T 세포 보조 수용체의 세포외 부분의 일부 또는 전부, 예를 들어 인간 T 세포 보조 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인, 예를 들어 적어도 HLA 분자와 결합하는 인간 T 세포 보조 수용체의 세포외 도메인을 포함하며, 예를 들어 인간화 CD4 보조 수용체는 MHC II, T 세포 수용체 가변 도메인, T 세포 수용체 불변 도메인 또는 이들의 조합과의 상호작용에 관여하는 인간 CD4의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어 세포외 도메인(들))을 포함하고/하거나, 예를 들어 인간화 CD8 보조 수용체는 MHC I, T 세포 수용체 가변 도메인, T 세포 수용체 불변 도메인 또는 이들의 조합과의 상호작용에 관여하는 인간 CD8α 및 인간 CD8β의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어 세포외 도메인)을 포함함 -;
(B) 인간(화) TCR(예를 들어, 비인간 동물은 예를 들어, 그 생식세포 게놈에, 비인간 TCRα 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체(TCR)α 가변 유전자좌 및/또는 비인간 TCRβ 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌를 포함함); 및 임의로,
(C) 인간화 CD4 보조 수용체와 결합하는 인간(화) MHC II 복합체 및/또는 인간화 CD8 보조 수용체와 결합하는 인간(화) MHC I 복합체(예를 들어, 비인간 동물은 예를 들어, 그 생식세포 게놈에, 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 핵산 서열 및 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 핵산 서열, 및/또는 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함함)
- 여기서, 각각의 키메라 MHC 폴리펩타이드는 단독으로(예를 들어, MHC I) 또는 다른 키메라 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, MHC II α 및 MHC II β(와 복합체로 된 경우, 각각 인간(화) CD8 보조 수용체 또는 인간(화) CD4 보조 수용체와 결합할 수 있고, HLA와 관련하여 펩타이드를 제시할 수 있는 인간 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, HLA 폴리펩타이드)의 적어도 세포외 부분(또는 이의 부분)을 포함하며, 예를 들어 인간화 MHC II 복합체는 (i) 인간 HLA 클래스 II α 폴리펩타이드의 α1 및 α2 도메인 및 비인간 HLA 클래스 II α 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC II α 폴리펩타이드 및 (ii) 인간 HLA 클래스 II β 폴리펩타이드의 β1 및 β2 도메인 및 비인간 HLA 클래스 II β 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC II β 폴리펩타이드를 포함하고/하거나, 인간화 MHC I 복합체는 인간 MHC I 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인, 및 임의로 인간(화) β2 마이크로글로불린을 포함함 - 를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물이 제공된다.
일부 실시 형태에서, 비인간 동물은,
(A) 인간화 CD4 보조 수용체, 및 인간화 CD8α 폴리펩타이드 및 인간화 CD8β 폴리펩타이드를 포함하는 인간화 CD8 보조 수용체(예를 들어, 비인간 동물은 예를 들어, 그 생식세포 게놈에, 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 키메라 인간/비인간 CD8α 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/비인간 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 포함함)
- 여기서, 각각의 인간화 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드는 비인간 T 세포 보조 수용체의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며, 예를 들어 인간화 CD4 보조 수용체는 비인간 CD4 보조 수용체의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 인간화 CD8 보조 수용체는 비인간 CD8α 및 비인간 CD8β 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함함,
각각의 키메라 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드는 인간 T 세포 보조 수용체의 세포외 부분의 일부 또는 전부, 예를 들어 인간 T 세포 보조 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인, 예를 들어 적어도 HLA 분자와 결합하는 인간 T 세포 보조 수용체의 세포외 도메인을 포함하며, 예를 들어 인간화 CD4 보조 수용체는 MHC II, T 세포 수용체 가변 도메인, T 세포 수용체 불변 도메인 또는 이들의 조합과의 상호작용에 관여하는 인간 CD4의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어 세포외 도메인(들))을 포함하고/하거나, 예를 들어 인간화 CD8 보조 수용체는 MHC I, T 세포 수용체 가변 도메인, T 세포 수용체 불변 도메인 또는 이들의 조합과의 상호작용에 관여하는 인간 CD8α 및 인간 CD8β의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어 세포외 도메인)을 포함함 -;
(B) 인간화 TCR(예를 들어, 비인간 동물은 예를 들어, 그 생식세포 게놈에, 비인간 TCRα 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체(TCR)α 가변 유전자좌 및/또는 비인간 TCRβ 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌를 포함함); 및
(C) 인간화 CD4 보조 수용체와 결합하는 인간화 MHC II 복합체 및 인간화 CD8 보조 수용체와 결합하는 인간화 MHC I 복합체(예를 들어, 비인간 동물은 예를 들어, 그 생식세포 게놈에, 키메라 인간/비인간 MHC IIα 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 핵산 서열, 키메라 인간/비인간 MHC IIβ 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 핵산 서열 및 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함함)
- 여기서, 각각의 키메라 MHC 폴리펩타이드는 단독으로(예를 들어, MHC I) 또는 다른 키메라 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, MHC II α 및 MHC II β(와 복합체로 된 경우, 각각 인간화 CD8 보조 수용체 또는 인간화 CD4 보조 수용체와 결합할 수 있고, HLA와 관련하여 펩타이드를 제시할 수 있는 인간 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, HLA 폴리펩타이드)의 적어도 세포외 부분(또는 이의 부분)을 포함하며, 예를 들어 인간화 MHC II 복합체는 (i) 인간 HLA 클래스 II α 폴리펩타이드의 α1 및 α2 도메인 및 비인간 HLA 클래스 II α 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC II α 폴리펩타이드 및 (ii) 인간 HLA 클래스 II β 폴리펩타이드의 β1 및 β2 도메인 및 비인간 HLA 클래스 II β 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 인간/비인간 MHC II β 폴리펩타이드를 포함하고, (iii) 인간화 MHC I 복합체는 인간 MHC I 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인, 및 임의로 인간(화) β2 마이크로글로불린을 포함함(예를 들어, 비인간 동물은 인간 β2 마이크로글로불린 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌 또는 이의 부분을 추가로 포함함) - 를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키메라 T 세포 CD4 보조 수용체 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 CD4 T 세포 보조 수용체 유전자좌에 존재하고/하거나, 키메라 T 세포 CD8α 보조 수용체 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 CD8α T 세포 보조 수용체 유전자좌에 존재하며, 키메라 T 세포 CD8β 보조 수용체 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열은 내인성 CD8β T 세포 보조 수용체 유전자좌에 존재한다. 추가의 실시 형태는 도 5a에 기재된 유전자에 의해 코딩되는 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드(예를 들어, 얻어진 키메라 인간/비인간 CD4 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드의 인간 부분은 적어도 인간 Ig1, 인간 Ig2 및 인간 Ig3 도메인 - 아니면 각각, D1, D2 및 D3 도메인으로도 지칭됨 - 을 포함함) 및/또는 도 5b에 기재된 유전자에 의해 코딩되는 키메라 CD8 보조 수용체(예를 들어, 키메라 CD8 보조 수용체의 인간 부분은 인간 면역글로불린 V (IgV) 유사 α 및 β 도메인을 비롯한, 인간 CD8 폴리펩타이드(예를 들어, CD8α 및/또는 CD8β)의 세포외 부분의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함함)를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 CD4 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 CD4 폴리펩타이드의 하나 이상의 세포외 도메인(예를 들어, D1, D2, D3, D4 또는 이들의 임의의 조합)을 포함하고, 키메라 CD4 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드의 비인간 부분은 비인간 CD4 T 세포 보조 수용체의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며, 키메라 CD8α 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 도메인(예를 들어, IgV 유사 도메인)을 포함하고, 키메라 CD8α 폴리펩타이드의 비인간 부분은 비인간 CD8α 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고/하거나, CD8β 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 도메인(예를 들어, IgV 유사 도메인)을 포함하고, 키메라 CD8β T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드의 비인간 부분은 비인간 CD8β 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 인간(화) MHC II α를 코딩하는 제1 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II α 유전자좌에 존재하고, 인간(화) MHC II β를 코딩하는 제2 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II β 유전자좌에 존재하며/하거나, 인간(화) MHC를 코딩하는 제3 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC I 유전자좌에 존재한다. 한 측면에서, 인간(화) MHC IIα 폴리펩타이드는 인간 MHC IIα 폴리펩타이드(예를 들어, HLA 클래스 IIα 폴리펩타이드)의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 포함하고, 인간(화) MHC IIβ 폴리펩타이드는 인간 MHC IIβ 폴리펩타이드(예를 들어, HLA 클래스 Iβ 폴리펩타이드)의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 포함하고/하거나, 인간(화) MHC I 폴리펩타이드는 인간 MHC I 폴리펩타이드(예를 들어, HLA 클래스 I 폴리펩타이드)의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간화 MHC II α 폴리펩타이드는 인간 MHC II α1 및 α2 도메인을 포함하고, 인간화 MHC II β 폴리펩타이드는 인간 MHC II β1 및 β2 도메인을 포함하고/하거나, 인간화 MHC I 폴리펩타이드는 인간 MHC I α1, α2 및 α3 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 MHC II α 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II α 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현되고, 키메라 인간/비인간 MHC II β 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II β 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현되고/되거나, 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC I 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현된다. 추가의 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 MHC II α 폴리펩타이드의 비인간 부분은 내인성 비인간 MHC II α 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 키메라 인간/비인간 MHC II β 폴리펩타이드의 비인간 부분은 내인성 비인간 MHC II β 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고/하거나, 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드의 비인간 부분은 내인성 비인간 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 실시 형태는 키메라 인간/비인간 MHC II 복합체의 단백질의 인간 부분이 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP로 이루어진 군으로부터 선택되는 대응하는 인간 HLA 클래스 II 단백질로부터 유래되고/되거나, 제3 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드의 인간 부분이 인간 HLA-A, 인간 HLA-B 또는 인간 HLA-C로부터 유래되는 비인간 동물을 포함한다. 비제한적인 예로서, 일부 실시 형태에서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드는 HLA-DRα 단백질, HLA-DQ α 단백질 또는 HLA-DP α 단백질의 세포외 부분 또는 이의 부분을 포함하고, 키메라 MHC II β 폴리펩타이드는 HLA-DRβ 단백질, HLA-DQ β 단백질 또는 HLA-DP β 단백질의 세포외 부분 또는 이의 부분을 포함하고/하거나, 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 인간 HLA-A 단백질, 인간 HLA-B 단백질 또는 인간 HLA-C 단백질의 세포외 부분 또는 이의 부분을 포함한다. 또한, 대응하는 인간 HLA-DR 단백질로부터 유래된 키메라 인간/비인간 MHC II 단백질의 인간 부분, 예를 들어 인간/비인간 MHC II α 폴리펩타이드의 인간 부분이 HLA-DR2의 α 쇄의 α1 및 α2 도메인을 포함하고, 인간/비인간 MHC II β 폴리펩타이드의 인간 부분이 HLA-DR2의 β 쇄의 β1 및 β2 도메인을 포함하고/하거나, MHC I 폴리펩타이드의 인간 부분이 인간 HLA-A 폴리펩타이드로부터 유래되고, 예를 들어 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드의 인간 부분이 인간 HLA-A2 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인, 예를 들어 인간 HLA-A2.1 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함하는 비인간 동물이 제공된다. 또한, MHC II 복합체의 비인간 부분이 뮤린 H-2E 코딩 서열로부터 유래되고/유래되거나, MHC I 폴리펩타이드의 비인간 부분이 뮤린 H-2K 코딩 서열로부터 유래되는 비인간 동물이 제공된다. 예를 들어, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드는 뮤린 H-2E α 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 키메라 MHC II β 폴리펩타이드는 뮤린 H-2E β 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며, 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 뮤린 H-2K 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 TCRα 가변 유전자좌에 존재하며, 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 TCRβ 가변 유전자좌에 존재한다. 일부 측면에서, 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌는 재배열되지 않은 인간 Vα 유전자 단편의 완전한 레퍼토리 및 재배열되지 않은 인간 Jα 유전자 단편의 완전한 레퍼토리를 포함하고/포함하거나, 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌는 재배열되지 않은 인간 Vβ 유전자 단편의 완전한 레퍼토리, 재배열되지 않은 인간 Dβ 유전자 단편의 완전한 레퍼토리 및 재배열되지 않은 인간 Jβ 유전자 단편의 완전한 레퍼토리를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 재배열되지 않은 인간 Vα 및 Jα 유전자 단편은 재배열되어 재배열된 인간 Vα/Jα 서열을 형성할 수 없고/없거나, 재배열되지 않은 인간 Vβ, Dβ 및 Jβ 유전자 단편은 재배열되어 재배열된 인간 Vβ/Dβ/Jβ 서열을 형성한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 T 세포 표면의, 인간 TCRα 가변 영역 및/또는 인간 TCRβ 가변 영역을 포함하는 T 세포 수용체를 발현한다. 일부 실시 형태에서, 내인성 비인간 Vα 및 Jα 세그먼트는 재배열되어 재배열된 Vα/Jα 서열을 형성할 수 없고/없거나, 내인성 비인간 Vβ, Dβ 및 Jβ 세그먼트는 재배열되어 재배열된 Vβ/Dβ/Jβ 서열을 형성할 수 없으며, 예를 들어 상기 동물은 기능적 내인성 비인간 TCRα 가변 유전자좌가 결여될 수 있고/있거나, 상기 동물은 기능적 내인성 비인간 TCRβ 가변 유전자좌가 결여될 수 있으며, 예를 들어 상기 동물은 (a) 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 Vα 유전자 단편의 결실, (b) 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 Jα 유전자 단편의 결실, (c) 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 Vβ 유전자 단편의 결실, (d) 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 Dβ 유전자 단편의 결실, (e) 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 Jβ 유전자 단편의 결실 및/또는 (f) 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 내인성 비인간 TCRα 가변 유전자좌는 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 Vα 유전자 단편이 결여되어 있고/있거나 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 Jα 유전자 단편이 결여되어 있고/있거나; 내인성 비인간 TCRβ 가변 유전자좌는 (a) 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 Vβ 유전자 단편이 결여되어 있거나, (b) 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 Dβ 유전자 단편이 결여되어 있거나, (c) 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 Jβ 유전자 단편이 결여되어 있거나, (d) (a), (b) 및 (c)의 조합을 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 각각 키메라 T 세포 CD4, CD8α 및/또는 CD8β 보조 수용체 폴리펩타이드(들)를 코딩하는 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오타이드 서열(들)은 각각, 내인성 T 세포 보조 수용체 유전자좌, 예를 들어 내인성 CD4, CD8α 및/또는 CD8β 보조 수용체 유전자좌에 존재하고; 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 TCRα 가변 유전자좌에 존재하며; 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 TCRβ 가변 유전자좌에 존재하고/하거나; 각각, 키메라 MHC II α, MHC II β, 및/또는 MHC I 폴리펩타이드(들)를 코딩하는 제1, 제2 및/또는 제3 핵산 서열(들)은 각각, 내인성 MHC 유전자좌; 예를 들어, MHC II α, MHC II β, 및/또는 MHC I 유전자좌에존재한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 T 세포 보조 수용체(들)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(들), 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌, 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌 및/또는 키메라 MHC 분자(들)를 코딩하는 핵산 서열(들)은 비인간 프로모터 및 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 예를 들어, 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 CD4 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현될 수 있고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 CD8α 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현될 수 있고/있거나, 제3 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 CD8β 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현될 수 있고; 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 TCRα (가변) 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현될 수 있고, 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 TCRβ (가변) 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현될 수 있고; 제1 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II α 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현될 수 있고, 제2 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II β 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현될 수 있고, 제3 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC I 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 인간 CD4 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어, D1, D2, D3 및/또는 D4)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간(마우스) CD4 보조 수용체 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어, D1, D2, D3 및/또는 D4)을 코딩하는 서열을 대체하며, 내인성 비인간(마우스) CD4 보조 수용체 유전자좌에서 내인성 비인간(마우스) CD4 막관통 및 세포질 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고; 인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분의 전부 또는 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간(마우스) T 세포 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분의 전부 또는 일부를 코딩하는 서열을 대체하며, 내인성 비인간(마우스) CD8α 유전자좌에서 내인성 비인간(마우스) CD8α 막관통 및 세포질 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고; 인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 도메인의 전부 또는 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간(마우스) T 세포 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 도메인의 전부 또는 일부를 코딩하는 서열을 대체하며, 내인성 CD8β 유전자좌에서 내인성 비인간 CD8β 막관통 및 세포질 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고; 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 비인간(마우스) TCRα 가변 유전자좌에서 하나 이상의 내인성 Vα 및/또는 Jα 유전자 단편을 대체하며; 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 비인간(마우스) TCRβ 가변 유전자좌에서 하나 이상의 내인성 Vβ, Dβ 및/또는 Jα 유전자 단편을 대체하고; 인간 MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어 α1 및 α2 도메인)을 코딩하는 핵산 서열은 내인성 비인간(마우스) MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어 α1 및 α2 도메인)을 코딩하는 서열을 대체하며, 내인성 비인간(마우스) MHC II α 유전자좌에서 내인성 비인간(마우스) MHC II α 막관통 및 세포질 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고; 인간 MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어 β1 및 β2 도메인)을 코딩하는 핵산 서열은 내인성 비인간(마우스) MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어 β1 및 β2 도메인)을 코딩하는 서열을 대체하며, 내인성 비인간(마우스) MHC II β 유전자좌에서 내인성 비인간(마우스) MHC II β 막관통 및 세포질 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있고/있거나; 인간 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어 α1, α2 및/또는 α3 도메인)을 코딩하는 핵산 서열은 내인성 비인간(마우스) MHC I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어 α1, α2 및/또는 α3 도메인)을 코딩하는 서열을 대체하며, 내인성 비인간(마우스) MHC I 유전자좌에서 내인성 비인간(마우스) MHC I 막관통 및 세포질 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 유전자 변형 비인간 동물은 이의 내인성 유전자좌로부터 기능적 내인성 비인간 T 세포 CD4 보조 수용체를 발현하지 않고, 이의 내인성 CD8 유전자좌로부터 기능적 내인성 비인간 T 세포 CD8 보조 수용체를 발현하지 않으며, 내인성 TCRα 가변 유전자좌로부터 기능적 TCRα 가변 도메인을 발현하지 않고, 내인성 TCRβ 가변 유전자좌로부터 기능적 TCRβ 가변 도메인을 발현하지 않으며, 내인성 MHC II 유전자좌로부터(예를 들어, 세포 표면에) 내인성 MHC II 복합체의 세포외 도메인을 발현하지 않고/않거나, 내인성 MHC I 유전자좌로부터(예를 들어, 세포 표면에) 내인성 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 발현하지 않는다.
본 명세서에 개시된 임의의 비인간 동물은 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 비인간 동물은 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현한다. 일부 실시 형태에서, 상기 비인간 동물은 내인성 비인간 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 기능적 내인성 비인간 동물 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 상기 β2 마이크로글로불린 유전자좌는 내인성 비인간 β2 마이크로글로불린 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. 일 실시 형태에서, 상기 β2 마이크로글로불린 유전자좌는 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 엑손 3 및 엑손 4(예를 들어, 엑손 2 내지 엑손 4)에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 임의로, β2 마이크로글로불린 유전자좌는 비인간, 예를 들어 설치류, β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
본 명세서에 제공된 비인간 동물은 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트일 수 있다.
또한, 각각 뮤린 CD4, CD8α, 및 CD8β 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 인간/뮤린 T 세포 CD4, CD8α 및 CD8β 보조 수용체 폴리펩타이드; T 세포 표면의, 인간 TCRα 가변 영역 및 인간 TCRβ 가변 영역을 포함하는 T 세포 수용체; 각각 인간 MHC II α (예를 들어, 인간 HLA 클래스 II α1 및 α2 도메인), MHC II β (인간 HLA 클래스 II β1 및 β2 도메인) 및 MHC I 폴리펩타이드(예를 들어, 인간 HLA 클래스 I α1, α2 및 α3 도메인)의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 인간/뮤린 MHC IIα, MHC IIβ 및 MHC I 폴리펩타이드; 및 임의로 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하는 마우스가 본 명세서에 제공된다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물, 예를 들어 제1 핵산 서열이 키메라 인간/뮤린 HLA-DR/H-2E 폴리펩타이드의 α 쇄를 코딩하고, 제2 뉴클레오타이드 서열이 키메라 HLA-DR/H-2E 폴리펩타이드의 β 쇄를 코딩하며, 제3 핵산 서열이 키메라 인간/뮤린 HLA-A/H-2K 폴리펩타이드를 코딩하는 마우스로서, HLA-A/H-2K 및 HLA-DR/H-2E 단백질을 발현하는 마우스가 본 명세서에 제공된다.
또한 예를 들어, 항원에 대하여 실질적인 인간화 T 세포 면역반응을 일으키는 실질적인 인간화 T 세포 면역계를 포함하는 비인간 동물이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시 형태에서, 실질적인 인간화 T 세포 면역반응은 인간 백혈구 항원(HLA) 세포외 도메인과 관련하여 제시된 항원 및/또는 HLA 세포외 도메인과 관련하여 항원을 제시하는 항원 제시 세포를 인식하는 인간 T 세포 수용체(TCR) 가변 도메인을 발현하는 활성화 T 세포를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 실질적인 인간화 T 세포 면역계는(a) 인간 HLA 분자에 결합하는 인간 T 세포 보조 수용체 도메인을 포함하는 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드 및/또는 적어도 하나의 인간 TCR 가변 영역 유전자 단편에 의해 코딩되는 TCR 가변 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR)를 발현하는 비인간 T 세포; 및 (b) 인간 HLA와 관련하여 항원을 제시하고, 비인간 T 세포를 활성화시키는 비인간 항원 제시 세포를 포함한다.
또한, 본 명세서에 개시된 비인간 동물을 생산 및 사용하는 방법이 제공된다. 일반적으로, 본 명세서에 개시된 유전자 변형 비인간 동물의 생산 방법은 (a) 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, 키메라 CD4 폴리펩타이드)를 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 및/또는 제2 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, 키메라 CD8α 폴리펩타이드)를 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 제3 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, CD8β 폴리펩타이드)를 코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 비인간 동물의 게놈에 도입하는 단계 - 여기서, 각각의 키메라 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드의 비인간 부분은 비인간 T 세포 보조 수용체의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 각각의 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 T 세포 보조 수용체의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어 하나 이상의 도메인)을 포함함 -; (b) 비인간 TCRα 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체(TCR)α 가변 유전자좌 및/또는 비인간 TCRβ 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌를 비인간 동물의 게놈에 삽입하는 단계; 및 임의로 (c) 제1 키메라 인간/비인간 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, 키메라 MHC IIα 폴리펩타이드)를 코딩하는 제1 핵산 서열, 제2 키메라 인간/비인간 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, 키메라 MHC IIβ 폴리펩타이드)를 코딩하는 제2 핵산 서열 및/또는 제3 키메라 인간/비인간 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, 키메라 MHC I 폴리펩타이드)를 코딩하는 제3 핵산 서열을 상기 게놈에 배치시키는 단계 및/또는 (d) 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 비인간 동물의 게놈에 부가하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 비인간 CD4 보조 수용체의 적어도 막관통 및 세포질 도메인에 작동가능하게 연결되는 인간 CD4의 세포외 부분 또는 이의 부분을 코딩하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD8α의 세포외 부분 또는 이의 부분 및 적어도 비인간 CD8α의 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하며, 제3 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD8β의 세포외 부분 또는 이의 부분 및 적어도 비인간 CD8β의 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하고, 제1 핵산 서열은 인간 HLA 클래스 II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분) 및 적어도 비인간 MHC II α 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하며, 제2 핵산 서열은 인간 HLA 클래스 II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분) 및 적어도 비인간 MHC II β 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하고, 제3 핵산 서열은 인간 HLA 클래스 I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분) 및 비인간 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하며, β2 마이크로글로불린 유전자좌는 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
비인간 동물을 생산하는 방법은 (a) 키메라 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드(들)를 코딩하는 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오타이드 서열(들)을 비인간 동물의 게놈에 도입하는 단계가 내인성 CD4 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계 및/또는 내인성 CD8α 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD8α 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/비인간 CD8α 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계 및 내인성 CD8β 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/비인간 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계를 포함하고; (b) 재배열되지 않은 TCRα 유전자좌 및/또는 재배열되지 않은 TCRβ 유전자좌를 상기 동물의 게놈에 삽입하는 단계가 내인성 비인간 TCRα 가변 유전자좌를 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 인간화 TCRα 가변 유전자좌로 치환하여 인간화 TCRα 가변 유전자좌를 생성시키는 단계 - 여기서, 상기 인간화 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 비인간 TCRα 불변 영역에 작동가능하게 연결됨 - 및/또는 내인성 비인간 TCRβ 가변 유전자좌를 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 인간화 TCRβ 가변 유전자좌로 치환하여 인간화 TCRβ 가변 유전자좌를 생성시키는 단계 - 여기서, 상기 인간화 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 비인간 TCRβ 불변 영역에 작동가능하게 연결됨 - 를 포함하며; (c) 키메라 MHC 폴리펩타이드(들)를 코딩하는 제1, 제2 및/또는 제3 핵산 서열(들)을 비인간 동물의 게놈에 배치시키는 단계가 내인성 비인간 MHC II 유전자좌에서, 비인간 MHC II 복합체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/비인간 MHC II 복합체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계 및 내인성 비인간 MHC I 유전자좌에서, 비인간 MHC I 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계를 포함하고/하거나, (d) 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 비인간 동물의 게놈에 부가하는 단계가 내인성 비인간 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서, 비인간 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계를 포함하는 실시 형태를 포함한다.
일부 실시 형태에서, (a) 각각 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오타이드 서열을 비인간 동물의 게놈에 도입하는 단계는 (i) 내인성 CD4 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD4 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 내인성 비인간 CD4 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 인간 CD4 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계, (ii) 내인성 CD8α 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 내인성 비인간 CD8α 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계 및/또는 (iii) 내인성 CD8β 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 내인성 비인간 CD8β 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계를 포함하고; (b) 재배열되지 않은 TCRα 유전자좌 및/또는 재배열되지 않은 TCRβ 유전자좌를 상기 동물의 게놈에 삽입하는 단계는 각각 (i) 내인성 비인간 TCRα 가변 유전자좌를 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 인간화 TCRα 가변 유전자좌로 치환하여 인간화 TCRα 가변 유전자좌를 생성시키는 단계 - 여기서, 상기 인간화 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 비인간 TCRα 불변 영역에 작동가능하게 연결됨 - 및/또는 (ii) 내인성 비인간 TCRβ 가변 유전자좌를 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 인간화 TCRβ 가변 유전자좌로 치환하여 인간화 TCRβ 가변 유전자좌를 생성시키는 단계 - 여기서, 상기 인간화 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 비인간 TCRβ 불변 영역에 작동가능하게 연결됨 - 를 포함하며; (c) 각각 제1, 제2 및/또는 제3 핵산 서열을 비인간 동물의 게놈에 배치시키는 단계는 (i) 내인성 비인간 MHC II α 유전자좌에서, 비인간 MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 내인성 비인간 MHC II α 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 인간 HLA 클래스 II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계, (ii) 내인성 비인간 MHC II β 유전자좌에서, 비인간 MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 내인성 비인간 MHC II β 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 인간 HLA 클래스 II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계 및/또는 (iii) 내인성 비인간 MHC I 유전자좌에서, 비인간 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 내인성 비인간 MHC I 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 인간 HLA 클래스 I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계; 및/또는 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서, 엑손 2 내지 엑손 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 포함하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계를 포함한다.
일 실시 형태에서, 상기 도입하는 단계는 제1 비인간 동물에서 내인성 CD4 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계, 제2 비인간 동물에서 내인성 CD8α 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD8α 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/비인간 CD8α 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계 및 내인성 CD8β 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/비인간 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 도입하는 단계는 제1 비인간 동물에서 내인성 CD4 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD4 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 내인성 비인간 CD4 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 인간 CD4 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계, 제2 비인간 동물에서 내인성 CD8α 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 내인성 비인간 CD8α 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계 및 내인성 CD8β 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 내인성 비인간 CD8β 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 치환하는 단계는 동시에 또는 임의의 순서로 행해진다.
일부 실시 형태에서, 상기 삽입하는 단계는 제3 비인간 동물에서 내인성 비인간 TCRα 가변 유전자좌를 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 인간화 TCRα 가변 유전자좌로 치환하여 인간화 TCRα 가변 유전자좌를 생성시키는 단계 - 여기서, 상기 인간화 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 비인간 TCRα 불변 영역에 작동가능하게 연결됨 -; 제4 비인간 동물에서 내인성 비인간 TCRβ 가변 유전자좌를 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 인간화 TCRβ 가변 유전자좌로 치환하여 인간화 TCRβ 가변 유전자좌를 생성시키는 단계 - 여기서, 상기 인간화 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 비인간 TCRβ 불변 영역에 작동가능하게 연결됨 - 를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 치환하는 단계는 동시에 또는 임의의 순서로 행해진다.
일부 실시 형태에서, 상기 배치시키는 단계는 특별한 순서없이, 제5 비인간 동물에서 내인성 비인간 MHC II 유전자좌에서, 비인간 MHC II 복합체를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/비인간 MHC II 복합체를 코딩하는 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계; 및 제5 비인간 동물에서 내인성 비인간 MHC I 유전자좌에서, 비인간 MHC I 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 배치시키는 단계는 제5 비인간 동물에서 내인성 비인간 MHC II α 유전자좌에서, 비인간 MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 내인성 비인간 MHC II α 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 인간 MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계 및 내인성 비인간 MHC II β 유전자좌에서, 비인간 MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 내인성 비인간 MHC II β 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 인간 MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계; 및 제5 비인간 동물에서 내인성 비인간 MHC I 유전자좌에서, 비인간 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 내인성 비인간 MHC I 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되어 있는 인간 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 치환하는 단계는 동시에 또는 임의의 순서로 행해진다.
일부 실시 형태에서, 상기 부가하는 단계는 제6 비인간 동물에서 내인성 비인간 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서, 비인간 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 엑손 3 및 엑손 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.
본 명세서에 개시된 방법은 본 명세서에 기재된 하나 이상의 유전자 변형을 포함하는 비인간 동물을 나머지 유전자 변형을 포함하는 동일한 종의 다른(또는 그 이상의) 비인간 동물(들)로 육종함으로써, 키메라 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드(들)를 코딩하는 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오타이드 서열(들)을 도입하고; TCRα 유전자좌 및/또는 재배열되지 않은 TCRβ 유전자좌를 삽입하며; 키메라 MHC 폴리펩타이드(들)를 코딩하는 제1, 제2 및/또는 제3 핵산 서열(들)을 배치시키고/시키거나; β2 마이크로글로불린 유전자좌를 부가하는 실시 형태를 포함한다. 비제한적인 실시 형태는 임의의 순서로, 상술한 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 비인간 동물을 육종하는 것을 포함한다.
본 명세서에 개시된 방법은 비인간 배아 줄기(ES) 세포에서의 상동 재조합을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같이 마우스를 생산하는데 사용될 수 있다. 키메라 인간/비인간 CD4, CD8α 및/또는 CD8β T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드, 인간(화) TCRα/β 단백질, 및 키메라 MHC II 복합체 및 MHC I(인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 함유)을 발현하는 비인간 동물은 (a) 먼저, 개별적으로 개별 ES 세포에서의 상동 재조합에 의해 각 개별 인간(화) 유전자를 도입하여, 이러한 ES 세포로부터 각 개별 비인간 동물을 생산하고, 이어서 생산된 각각의 비인간 동물을 임의의 순서로 육종하는 단계, (b) 단일 ES 세포에서의 순차적 상동 재조합에 의해 모든 인간(화) 유전자를 도입한 다음에, 이러한 ES 세포로부터 비인간 동물을 생산하는 단계, 또는 (c) ES 세포의 일부 유전자좌에서의 순차적 상동 재조합과 육종의 조합에 의해 생산될 수 있다. 본 명세서에 개시된 동물은 또한 필요에 따라, 초기 육종의 자손을 다른 동물과 교배시켜 생산될 수 있다. 육종 및/또는 상동 재조합은 임의의 바람직한 순서로 행해질 수 있다.
또한, 항원에 결합하는 T 세포 또는 TCR 단백질을 본 명세서에 제공되거나 본 명세서에 개시된 방법에 따라 생산된 비인간 동물로부터 단리하는 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 인간 TCR 가변 도메인을 비인간 동물로부터 단리하는 방법이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 상기 방법은 항원에 결합하는 TCRα 및/또는 TCRβ 가변 도메인을 코딩하는 제1 및/또는 제2 핵산을 동정하는 단계 및/또는 벡터(들)의 발현을 위한 충분한 조건에서 하나 이상의 벡터를 포함하는 세포를 배양하는 단계 - 여기서, 상기 벡터(들)는 각각 제1 및/또는 제2 핵산과 동일하거나 실질적으로 동일한 제3 및/또는 제4 핵산을 포함하고, 제3 및/또는 제4 핵산은 각각 예를 들어, 인간 TCR 불변 영역 유전자, 예를 들어 TCRα 불변 영역 유전자 및/또는 TCRβ 불변 영역 유전자와 인프레임(in-frame)으로 클로닝됨 - 를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 유전자 변형(재배열된 인간 TCRα 및/또는 TCRβ 가변 영역 유전자를 포함할 수 있음)을 포함하는 조직 및 세포, 및 본 명세서에 기재된 변형된 비인간 동물로부터 단리된 그러한 조직 또는 세포에 의해 발현된 이러한 인간 TCR 가변 도메인을 코딩하는 핵산이 제공된다. 또한, (1) 적절한 인간 TCR 불변 영역 유전자, 예를 들어 각각, TCRα 불변 영역 유전자 또는 TCRβ 불변 영역 유전자에 인프레임으로 클로닝된, 본 명세서에 개시된 인간 TCR 가변 도메인, 예를 들어 재배열된 인간 TCRα 또는 재배열된 인간 TCRβ 가변 영역 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 핵산, 예를 들어 발현 벡터, (2) 이러한 핵산(예를 들어, 발현 벡터)를 포함하는 숙주 세포 및 (3) 숙주 세포에 의해 발현되는 TCR이 포함된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 재조합 핵산은 예를 들어, 각각, 인간 TCRδ 불변 영역 유전자 또는 TCRγ 불변 영역 유전자와 인프레임으로 클로닝된, 본 명세서에 개시된 바와 같이 유전자 변형된 비인간 동물 또는 이로부터 단리된 조직으로부터 유래된 재배열된 인간 TCRδ 가변 영역 유전자 또는 TCRγ 가변 영역 유전자를 포함한다.
또한, 일반적으로 본 명세서에 기재된 유전자 변형되거나 실질적인 인간화 T 세포 면역계를 갖는 비인간 동물을 항원, 예를 들어 인간 항원, 예를 들어 인간 종양 항원, 인간 세균성 병원체, 인간 바이러스성 병원체 등으로 면역화하는 단계를 포함하는, 비인간 동물에서 인간화 T 세포 반응을 유발시키는 방법이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 면역화된 비인간 동물은 모든 기능적 인간 TCRVα 유전자 단편의 50% 이상 및/또는 모든 기능적 인간 TCRVβ 유전자 단편의 50% 이상을 발현시키고/시키거나, 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 인간 TCRVα 유전자 단편 및/또는 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 인간 TCRVβ 유전자 단편을 포함한다.
또한 일반적으로 비인간 동물의 제1 세포의 활성화를 (a) 비인간 동물의 제2 세포와의 접촉 및 (b) 항원과의 인큐베이션 후에 검출하는 단계 - 여기서, 제1 세포는 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체, 및 (i) 키메라 인간/비인간 TCRα 쇄 및 (ii) 키메라 인간/비인간 TCRβ 쇄 중 어느 하나 또는 둘 다를 발현하고, 제2 세포는 키메라 인간/비인간 MHC 폴리펩타이드를 발현함 - 를 포함하는, 항원에 특이적인 인간 TCR을 단리하는 시험관내 방법이 제공된다. 상기 방법은 TCR을 제1 세포, 또는 이를 코딩하는 핵산으로부터 단리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 시험관내 방법에서, 항원은 종양 항원, 바이러스 항원, 자가항원 또는 세균성 항원일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 비인간 동물은 설치류, 예를 들어 래트 또는 마우스이다. 또한, 조직, T 세포, TCR(예를 들어, 가용성 TCR), 또는 본 명세서에 기재된 유전자 변형되거나 실질적인 인간화 T 세포 면역계를 갖는 비인간 동물로부터 단리된 TCR의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산, 이러한 T 세포로부터 유래된 하이브리도마 또는 쿼드로마(quadroma)가 본 명세서에 제공된다.
또한, 예를 들어, 비인간 동물의 제1 세포 및 제2 세포를 포함하며; 상기 제1 세포가 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체 및 임의로, (i) 키메라 인간/비인간 TCRα 쇄 및 (ii) 키메라 인간/비인간 TCRβ 쇄 중 어느 하나 또는 둘 다를 발현하고, 상기 제2 세포가 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체와 결합하는 키메라 인간/비인간 MHC 폴리펩타이드를 발현하는 조성물이 제공된다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 세포는 비인간 T 세포이다. 다른 실시 형태에서, 상기 제2 세포는 비인간 항원 제시 세포이다.
도 1은 인간화 TCR 알파 및 베타 단백질, 인간화 β2 마이크로글로불린과 복합체를 이룬 인간화 MHC 클래스 I, 및 인간화 CD8 이종이량체를 포함하는 인간화 T 세포 수용체 복합체(좌측 패널); 및 인간화 TCR 알파 및 베타 단백질, 인간화 MHC 클래스 II 이종이량체, 및 인간화 CD4를 포함하는 T 세포 수용체 복합체(우측 패널)의 개략도(정확한 축척이 아님)이다. 인간화 MHC에 의해 제시된 항원은 원형으로 표시된다. 마우스 영역은 채워진 형상으로 표시되고, 인간 영역은 줄무늬 형상으로 표시된다.
도 2a 내지 도 2c는 예시적인 키메라 MHC I 및 MHC II 유전자좌, 예를 들어 키메라 HLA-A2/H-2K 유전자좌(도 2a), 키메라 HLA-DR2/H-2E 유전자좌(도 2b) 및 인간화 β2M 유전자좌(도 2c)의 개략도(정확한 축척이 아님)이다. 달리 지시되지 않는 한, 인간 서열은 비어 있는 형상으로 표시되고, 마우스 서열은 채워진 형상으로 표시된다. 줄무늬 형상은 내인성 유전자좌와는 상이한 마우스 계통으로부터 유래된 H-2E의 엑손 1을 나타낸다(실시예 1.3 및 도 3b 참조). 플록스된((floxed)) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 카세트(들)는 적절하게 라벨링된 화살표로 표시된다.
도 3a 내지 도 3c는 인간화 MHC I 및 MHC II 유전자를 포함하는 인간화 MHC 유전자좌를 생성하기 위한 전략을 나타낸다. 도 3a에 나타낸 특정 실시 형태에서, 생산된 마우스의 MHC 유전자좌는 키메라 HLA-A2/H-2K 및 HLA-DR2/H-2E 서열(H2-K+/1666 MHC-II+/6112)을 포함하며, H2-D 서열 (H2-D+/결실) 및 H-2A 서열이 결여되어 있다(유전자 공학 계획에 의해서도 H-2A의 결실을 가져옴, 실시예 1.2 참조). 인간화의 각 단계에서 ES 세포로 도입된 큰 표적화 벡터(LTVEC) 또는 Cre 재조합효소 작제물은 화살표의 우측에 표시되어 있다. MAID 또는 4 자릿수는 변형된 대립유전자 ID 번호를 나타낸다. 도 3b는 예시적인 HLA-DR2/H-2E 큰 표적화 벡터의 개략도(정확한 축척이 아님)이다. 달리 지시되지 않는 한, 인간 서열은 비어 있는 형상으로 표시되고, 마우스 서열은 채워진 형상으로 표시된다. 줄무늬 형상은 내인성 유전자좌와는 상이한 마우스 계통으로부터 유래된 H-2E의 엑손 1을 나타낸다(실시예 1.3 참조). 플록스된 하이그로마이신 카세트는 적절하게 라벨링된 화살표로 표시된다. 도 3c는 키메라 인간/마우스 MHC 유전자좌의 예시적인 유전자형의 개략도(정확한 축척이 아님) (**는 모든 마우스 계통에 존재하지는 않는, 예를 들어 C57BL/6 또는 129 마우스 계통에 존재하지 않는 H-2L 유전자를 나타냄)이며, 여기서 내인성 마우스 H-2K 및 H-2E 유전자좌는 각각, 키메라 인간/마우스 HLA-A2/H-2K 및 HLA-DR2/H-2E 유전자좌(줄무늬 형상)로 치환되고, H-2A 및 H-2D 유전자좌는 결실되며(점선으로 윤곽을 나타낸 비어 있는 형상), 나머지 유전자좌는 내인성 마우스 유전자(실선으로 윤곽을 나타낸 속이 꽉 찬 형상)이다.
도 4a는 마우스 TCRα 유전자좌의 인간화에 대한 점진적 전략을 나타내며(정확한 축척이 아님), 여기서 TCRα 가변 영역 유전자 단편은 결실된 마우스 유전자좌(MAID1540)의 초기 인간화의 상류에 순차적으로 부가된다. 마우스 서열은 채워진 형상으로 표시되고; 인간 서열은 비어 있는 형상으로 표시된다. MAID는 변형 대립유전자 ID 번호를 나타낸다. TRAV=TCR Vα 세그먼트, TRAJ=TCR Jα 세그먼트 (hTRAJ=인간 TRAJ), TRAC=TCR Cα 도메인, TCRD=TCRδ. 도 4b는 마우스 TCRβ 유전자좌의 인간화에 대한 점진적 전략을 나타내며(정확한 축척이 아님), 여기서 TCRβ 가변 영역 유전자 단편은 결실된 마우스 TCRβ 가변 유전자좌에 순차적으로 부가된다. 마우스 서열은 채워진 형상으로 표시되고; 인간 서열은 비어 있는 형상으로 표시된다. MAID는 변형 대립유전자 ID 번호를 나타낸다. TRBV 또는 TCRBV= TCRβ V 세그먼트.
도 5a는 키메라 CD4 유전자좌의 개략도(정확한 축척이 아님)를 나타낸다. 인간 코딩 엑손은 줄무늬 형상으로 표시되고, 마우스 코딩 엑손은 채워진 형상으로 표시되며, 비코딩 엑손은 비어 있는 형상으로 표시된다. 3' 비번역 영역(UTR) 뿐만 아니라, 면역글로불린 유사 도메인(Ig), 막관통(TM), 세포질(CYT) 및 시그널 펩타이드(Signal) 코딩 엑손도 표시되어 있다. 플록스된(loxP) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(Pgk-neo) 카세트는 적절하게 라벨링된 화살표로 표시된다. 도 5b는 키메라 CD8α 및 CD8β 유전자좌의 개략도(정확한 축척이 아님)를 나타낸다. 인간 코딩 엑손은 줄무늬 형상으로 표시되고, 마우스 코딩 엑손은 채워진 형상으로 표시되며, 비코딩 엑손은 비어 있는 형상으로 표시된다. 3' 비번역 영역(UTR) 뿐만 아니라, 면역글로불린 유사 도메인(IgV), 막관통(TM), 세포질(CYT) 및 시그널 펩타이드(Signal) 코딩 엑손도 표시되어 있다. 플록스된(loxP) 하이그로마이신(Hyg) 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(Pgk-neo) 카세트는 적절하게 라벨링된 화살표로 표시된다.
도 6a 내지 도 6c는 단항(singlet) 상에서 게이팅되고, 항 마우스 CD19 및 항 마우스 CD3 항체로 염색된(도 6a), 항 마우스 CD19 및 항 마우스 F4/80 항체로 염색된(도 6 b) 또는 항 마우스 CD8α 및 항 마우스 CD4 항체(좌측 패널) 또는 항 인간 CD8α 및 항 인간 CD4 항체(우측 패널)로 염색된(도 6c) 대조군 마우스, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스로부터 단리된 흉선 세포의 FACS 등고선도이다.
도 7a 내지 도 7g는 CD19+ 세포, F4/80+ 세포 또는 CD3+ 세포 상에서 게이팅되고, 항 인간 B2M 또는 항 마우스 H-2D 항체로 염색된(도 7a, 도 7b); 항 HLA-A2 또는 항 HLA-DR 항체로 염색된(도7c, 도 7d); 항 H-2D 및 항 IAIE 항체로 염색된(도 7e, 도 7f); 또는 항 마우스 CD4 및 항 인간 CD4 항체(상부), 항 마우스 CD8α 및 항 인간 CD8α 항체(중간부), 및 항 마우스 CD8β 및 항 인간 CD8β 항체(하부)로 염색된(도 7g) 대조군 마우스, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스로부터 단리된 흉선 세포의 FACS 등고선도이다.
도 8은 CD3+CD4+ 세포 상에서 게이팅되고, 항 마우스 FoxP3 및 항 마우스 CD25 항체로 염색된 대조군 마우스, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스로부터 단리된 흉선 세포의 FACS 등고선도를 제공한다.
도 9a 내지 도 9e는 단항, CD3+ 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 상에서 게이팅되고, 항 마우스 CD19 및 항 마우스 CD3로 염색된(도 9a), 항 마우스 CD19 및 항 마우스 F4/80 항체로 염색된(도 9b), 항 마우스 CD4 및 항 마우스 CD8α 항체(좌측) 또는 항 인간 CD4 및 항 인간 CD8α 항체(우측)로 염색된(도 9c), 또는 항 마우스 CD44 및 항 마우스 CD62L 항체로 염색된(도 9d, 도 9e) 대조군 마우스, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스로부터 단리된 비장 세포의 FACS 등고선도이다.
도 10a 내지 도 10g는 CD19+ 세포, F4/80+ 세포 또는 CD3+ 세포 상에서 게이팅되고, 항 인간 B2M 또는 항 마우스 H-2D 항체로 염색된(도 10a, 도 10b), 항 HLA-A2 또는 항 HLA-DR 항체로 염색된(도 10c, 도 10d), 항 H-2D 및 항 IAIE 항체로 염색된(도 10e, 도 10f), 또는 항 마우스 CD4 및 항 인간 CD4 항체(상부), 항 마우스 CD8α 및 항 인간 CD8α 항체(중간부), 및 항 마우스 CD8β 및 항 인간 CD8β 항체(하부)로 염색된(도 10g) 대조군 마우스, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스로부터 단리된 비장 세포의 FACS 등고선도이다.
도 11은 CD3+CD4+ 세포 상에서 게이팅되고, 항 마우스 FoxP3 및 항 마우스 CD25 항체로 염색된 대조군 마우스, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스로부터 단리된 비장 세포의 FACS 등고선도를 제공한다.
도 12는 대조군 마우스, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스로부터 단리하여, 펩타이드의 부재(200k 세포 단독; x축) 하에 또는 10 ㎍/ml 또는 1 ㎍/ml MAGE-A3 펩타이드의 존재(x축) 하에 인큐베이션한 후의 효소 결합 면역 흡착 스팟 분석에서 IFN-γ를 생성하는 비장 세포(웰당 스팟(평균 + SD); y축) 수를 제공한다.
도 13a는 대조군, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스에서의 급성 암스트롱(Armstrong) 계통 바이러스 감염의 진행을 나타내고; 실험의 타임라인이 도면의 상부에 표시되어 있으며, 두 마우스 계통에 대한 감염 후 여러 날에 대한 바이러스 역가의 측정이 하부 그래프에 나타나 있다. 도 13b는 대조군, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스에서의 만성 클론 13 계통 바이러스 감염의 진행을 나타내고; 실험의 타임라인이 도면의 상부에 표시되어 있으며, 두 마우스 계통에 대한 감염 후 21일째의 바이러스 역가의 측정이 하부 그래프에 나타나 있다. 감염되지 않거나 만성적으로 감염된 TM I/II B C4/8 또는 대조군 B6 마우스의 T 세포를 항 PD1, 항 Lag3, 및 항 Tim3 항체(도 13c; x축)로 염색하였으며; 도면은 양성 염색 세포(% 양성 세포; y축)의 정량화를 제공한다.
도 14는 이전의 급성 암스트롱 계통 감염 후의 대조군 또는 TM I/II B C4/8 마우스에서의 만성 클론 13 계통 바이러스 감염의 진행을 나타내고; 실험의 타임라인이 도면의 상부에 표시되어 있으며, 감염 후 31일째의 바이러스 역가의 측정이 하부 그래프에 나타나 있다. 모의(mock) 감염된 마우스를 추가의 대조군으로서 실험에 포함시켰다.
도 15a 내지 도 15b는 HLA-A2 제한된(GPC10-18; N69-77; Z49-58), H2Db 제한된(GP33-41), 오브알부민, 또는 인큐베이션 단독인 LCMV 펩타이드에 반응하여 IFN-γ를 생성하여, 대조군 동물(도 15a), 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스(도 15b)로부터 단리한 CD8+ 세포(y축; IFN-γ 양성 세포) 수를 나타내며, 각각 모의 감염(mock; 각 그룹 n=1) 또는 급성 암스트롱 계통 감염(Arm; 각 그룹 n = 3)이 되었다. 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스 또는 대조군 B6 동물에서의 감염 시간 경과(감염 후 일수; x축) 중에 표시된 펩타이드(OVA, GP33, NP69, GPC10, GPC447 또는 Z49)에 의한 자극 후의 IFNγ+ CD8+ 림프구의 %(y축)가 각각, 도 15c 및 도 15d에 나타나 있다.
도 2a 내지 도 2c는 예시적인 키메라 MHC I 및 MHC II 유전자좌, 예를 들어 키메라 HLA-A2/H-2K 유전자좌(도 2a), 키메라 HLA-DR2/H-2E 유전자좌(도 2b) 및 인간화 β2M 유전자좌(도 2c)의 개략도(정확한 축척이 아님)이다. 달리 지시되지 않는 한, 인간 서열은 비어 있는 형상으로 표시되고, 마우스 서열은 채워진 형상으로 표시된다. 줄무늬 형상은 내인성 유전자좌와는 상이한 마우스 계통으로부터 유래된 H-2E의 엑손 1을 나타낸다(실시예 1.3 및 도 3b 참조). 플록스된((floxed)) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 카세트(들)는 적절하게 라벨링된 화살표로 표시된다.
도 3a 내지 도 3c는 인간화 MHC I 및 MHC II 유전자를 포함하는 인간화 MHC 유전자좌를 생성하기 위한 전략을 나타낸다. 도 3a에 나타낸 특정 실시 형태에서, 생산된 마우스의 MHC 유전자좌는 키메라 HLA-A2/H-2K 및 HLA-DR2/H-2E 서열(H2-K+/1666 MHC-II+/6112)을 포함하며, H2-D 서열 (H2-D+/결실) 및 H-2A 서열이 결여되어 있다(유전자 공학 계획에 의해서도 H-2A의 결실을 가져옴, 실시예 1.2 참조). 인간화의 각 단계에서 ES 세포로 도입된 큰 표적화 벡터(LTVEC) 또는 Cre 재조합효소 작제물은 화살표의 우측에 표시되어 있다. MAID 또는 4 자릿수는 변형된 대립유전자 ID 번호를 나타낸다. 도 3b는 예시적인 HLA-DR2/H-2E 큰 표적화 벡터의 개략도(정확한 축척이 아님)이다. 달리 지시되지 않는 한, 인간 서열은 비어 있는 형상으로 표시되고, 마우스 서열은 채워진 형상으로 표시된다. 줄무늬 형상은 내인성 유전자좌와는 상이한 마우스 계통으로부터 유래된 H-2E의 엑손 1을 나타낸다(실시예 1.3 참조). 플록스된 하이그로마이신 카세트는 적절하게 라벨링된 화살표로 표시된다. 도 3c는 키메라 인간/마우스 MHC 유전자좌의 예시적인 유전자형의 개략도(정확한 축척이 아님) (**는 모든 마우스 계통에 존재하지는 않는, 예를 들어 C57BL/6 또는 129 마우스 계통에 존재하지 않는 H-2L 유전자를 나타냄)이며, 여기서 내인성 마우스 H-2K 및 H-2E 유전자좌는 각각, 키메라 인간/마우스 HLA-A2/H-2K 및 HLA-DR2/H-2E 유전자좌(줄무늬 형상)로 치환되고, H-2A 및 H-2D 유전자좌는 결실되며(점선으로 윤곽을 나타낸 비어 있는 형상), 나머지 유전자좌는 내인성 마우스 유전자(실선으로 윤곽을 나타낸 속이 꽉 찬 형상)이다.
도 4a는 마우스 TCRα 유전자좌의 인간화에 대한 점진적 전략을 나타내며(정확한 축척이 아님), 여기서 TCRα 가변 영역 유전자 단편은 결실된 마우스 유전자좌(MAID1540)의 초기 인간화의 상류에 순차적으로 부가된다. 마우스 서열은 채워진 형상으로 표시되고; 인간 서열은 비어 있는 형상으로 표시된다. MAID는 변형 대립유전자 ID 번호를 나타낸다. TRAV=TCR Vα 세그먼트, TRAJ=TCR Jα 세그먼트 (hTRAJ=인간 TRAJ), TRAC=TCR Cα 도메인, TCRD=TCRδ. 도 4b는 마우스 TCRβ 유전자좌의 인간화에 대한 점진적 전략을 나타내며(정확한 축척이 아님), 여기서 TCRβ 가변 영역 유전자 단편은 결실된 마우스 TCRβ 가변 유전자좌에 순차적으로 부가된다. 마우스 서열은 채워진 형상으로 표시되고; 인간 서열은 비어 있는 형상으로 표시된다. MAID는 변형 대립유전자 ID 번호를 나타낸다. TRBV 또는 TCRBV= TCRβ V 세그먼트.
도 5a는 키메라 CD4 유전자좌의 개략도(정확한 축척이 아님)를 나타낸다. 인간 코딩 엑손은 줄무늬 형상으로 표시되고, 마우스 코딩 엑손은 채워진 형상으로 표시되며, 비코딩 엑손은 비어 있는 형상으로 표시된다. 3' 비번역 영역(UTR) 뿐만 아니라, 면역글로불린 유사 도메인(Ig), 막관통(TM), 세포질(CYT) 및 시그널 펩타이드(Signal) 코딩 엑손도 표시되어 있다. 플록스된(loxP) 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(Pgk-neo) 카세트는 적절하게 라벨링된 화살표로 표시된다. 도 5b는 키메라 CD8α 및 CD8β 유전자좌의 개략도(정확한 축척이 아님)를 나타낸다. 인간 코딩 엑손은 줄무늬 형상으로 표시되고, 마우스 코딩 엑손은 채워진 형상으로 표시되며, 비코딩 엑손은 비어 있는 형상으로 표시된다. 3' 비번역 영역(UTR) 뿐만 아니라, 면역글로불린 유사 도메인(IgV), 막관통(TM), 세포질(CYT) 및 시그널 펩타이드(Signal) 코딩 엑손도 표시되어 있다. 플록스된(loxP) 하이그로마이신(Hyg) 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(Pgk-neo) 카세트는 적절하게 라벨링된 화살표로 표시된다.
도 6a 내지 도 6c는 단항(singlet) 상에서 게이팅되고, 항 마우스 CD19 및 항 마우스 CD3 항체로 염색된(도 6a), 항 마우스 CD19 및 항 마우스 F4/80 항체로 염색된(도 6 b) 또는 항 마우스 CD8α 및 항 마우스 CD4 항체(좌측 패널) 또는 항 인간 CD8α 및 항 인간 CD4 항체(우측 패널)로 염색된(도 6c) 대조군 마우스, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스로부터 단리된 흉선 세포의 FACS 등고선도이다.
도 7a 내지 도 7g는 CD19+ 세포, F4/80+ 세포 또는 CD3+ 세포 상에서 게이팅되고, 항 인간 B2M 또는 항 마우스 H-2D 항체로 염색된(도 7a, 도 7b); 항 HLA-A2 또는 항 HLA-DR 항체로 염색된(도7c, 도 7d); 항 H-2D 및 항 IAIE 항체로 염색된(도 7e, 도 7f); 또는 항 마우스 CD4 및 항 인간 CD4 항체(상부), 항 마우스 CD8α 및 항 인간 CD8α 항체(중간부), 및 항 마우스 CD8β 및 항 인간 CD8β 항체(하부)로 염색된(도 7g) 대조군 마우스, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스로부터 단리된 흉선 세포의 FACS 등고선도이다.
도 8은 CD3+CD4+ 세포 상에서 게이팅되고, 항 마우스 FoxP3 및 항 마우스 CD25 항체로 염색된 대조군 마우스, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스로부터 단리된 흉선 세포의 FACS 등고선도를 제공한다.
도 9a 내지 도 9e는 단항, CD3+ 세포, CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포 상에서 게이팅되고, 항 마우스 CD19 및 항 마우스 CD3로 염색된(도 9a), 항 마우스 CD19 및 항 마우스 F4/80 항체로 염색된(도 9b), 항 마우스 CD4 및 항 마우스 CD8α 항체(좌측) 또는 항 인간 CD4 및 항 인간 CD8α 항체(우측)로 염색된(도 9c), 또는 항 마우스 CD44 및 항 마우스 CD62L 항체로 염색된(도 9d, 도 9e) 대조군 마우스, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스로부터 단리된 비장 세포의 FACS 등고선도이다.
도 10a 내지 도 10g는 CD19+ 세포, F4/80+ 세포 또는 CD3+ 세포 상에서 게이팅되고, 항 인간 B2M 또는 항 마우스 H-2D 항체로 염색된(도 10a, 도 10b), 항 HLA-A2 또는 항 HLA-DR 항체로 염색된(도 10c, 도 10d), 항 H-2D 및 항 IAIE 항체로 염색된(도 10e, 도 10f), 또는 항 마우스 CD4 및 항 인간 CD4 항체(상부), 항 마우스 CD8α 및 항 인간 CD8α 항체(중간부), 및 항 마우스 CD8β 및 항 인간 CD8β 항체(하부)로 염색된(도 10g) 대조군 마우스, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스로부터 단리된 비장 세포의 FACS 등고선도이다.
도 11은 CD3+CD4+ 세포 상에서 게이팅되고, 항 마우스 FoxP3 및 항 마우스 CD25 항체로 염색된 대조군 마우스, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스로부터 단리된 비장 세포의 FACS 등고선도를 제공한다.
도 12는 대조군 마우스, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스로부터 단리하여, 펩타이드의 부재(200k 세포 단독; x축) 하에 또는 10 ㎍/ml 또는 1 ㎍/ml MAGE-A3 펩타이드의 존재(x축) 하에 인큐베이션한 후의 효소 결합 면역 흡착 스팟 분석에서 IFN-γ를 생성하는 비장 세포(웰당 스팟(평균 + SD); y축) 수를 제공한다.
도 13a는 대조군, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스에서의 급성 암스트롱(Armstrong) 계통 바이러스 감염의 진행을 나타내고; 실험의 타임라인이 도면의 상부에 표시되어 있으며, 두 마우스 계통에 대한 감염 후 여러 날에 대한 바이러스 역가의 측정이 하부 그래프에 나타나 있다. 도 13b는 대조군, 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스에서의 만성 클론 13 계통 바이러스 감염의 진행을 나타내고; 실험의 타임라인이 도면의 상부에 표시되어 있으며, 두 마우스 계통에 대한 감염 후 21일째의 바이러스 역가의 측정이 하부 그래프에 나타나 있다. 감염되지 않거나 만성적으로 감염된 TM I/II B C4/8 또는 대조군 B6 마우스의 T 세포를 항 PD1, 항 Lag3, 및 항 Tim3 항체(도 13c; x축)로 염색하였으며; 도면은 양성 염색 세포(% 양성 세포; y축)의 정량화를 제공한다.
도 14는 이전의 급성 암스트롱 계통 감염 후의 대조군 또는 TM I/II B C4/8 마우스에서의 만성 클론 13 계통 바이러스 감염의 진행을 나타내고; 실험의 타임라인이 도면의 상부에 표시되어 있으며, 감염 후 31일째의 바이러스 역가의 측정이 하부 그래프에 나타나 있다. 모의(mock) 감염된 마우스를 추가의 대조군으로서 실험에 포함시켰다.
도 15a 내지 도 15b는 HLA-A2 제한된(GPC10-18; N69-77; Z49-58), H2Db 제한된(GP33-41), 오브알부민, 또는 인큐베이션 단독인 LCMV 펩타이드에 반응하여 IFN-γ를 생성하여, 대조군 동물(도 15a), 또는 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스(도 15b)로부터 단리한 CD8+ 세포(y축; IFN-γ 양성 세포) 수를 나타내며, 각각 모의 감염(mock; 각 그룹 n=1) 또는 급성 암스트롱 계통 감염(Arm; 각 그룹 n = 3)이 되었다. 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M(TM I/II B C4/8) 유전자좌를 포함하는 마우스 또는 대조군 B6 동물에서의 감염 시간 경과(감염 후 일수; x축) 중에 표시된 펩타이드(OVA, GP33, NP69, GPC10, GPC447 또는 Z49)에 의한 자극 후의 IFNγ+ CD8+ 림프구의 %(y축)가 각각, 도 15c 및 도 15d에 나타나 있다.
인간화 T 세포 보조 수용체(예를 들어, 인간화 CD4 및/또는 CD8(예를 들어, CD8α 및/또는 CD8β)), 인간화 T 세포 보조 수용체와 결합하는 인간 또는 인간화 주요 조직적합성 복합체(MHC) (예를 들어, 인간 또는 인간화 MHC II(예를 들어, MHC II α 및/또는 MHC II β 쇄) 및/또는 MHC I(예를 들어, MHC Iα), 및 임의로 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린) 및/또는 인간 또는 인간화 T 세포 수용체(TCR)를 발현하도록 유전자 조작된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트), 및 상술한 것을 발현하는 배아, 조직 및 세포가 본 명세서에 개시된다. 본 명세서에 개시된 세포성 면역반응(cellular arm of the immune system)의 진행은 대조군 동물과 유사하며, 예를 들어 흉선 및 비장은 유사한 절대수의 흉선 세포 및 CD3+ 세포를 포함한다. 이것은 인간 TCR(α 및 β) 및 키메라 인간/마우스 MHC I 분자를 포함하도록 변형된 다른 비인간 동물과는 현저한 대조를 이룬다(예를 들어, Li (2010) Nature Medicine 16:1029-1035 및 부교재 참조). 이러한 동물은 동문헌에서 야생형 대조군 동물뿐만 아니라, 인간 TCR만으로 변형된 동물 및 키메라 인간/마우스 MHC I 분자만으로 변형된 동물과 비교하여, T 세포 집단의 감소를 나타냈다. 따라서, 인간화 CD4 보조 수용체 및 인간화 MHC II 및/또는 인간화 CD8 보조 수용체 및 인간화 MHC I, 및 임의로 인간화 TCR을 공발현하도록 조작된 비인간 동물이 본 명세서에 제공된다. 적어도 하나의 인간화 T 세포 보조 수용체(예를 들어, 인간화 CD4 및/또는 CD8), 인간화 T 세포 보조 수용체와 결합하는 적어도 하나의 인간화 MHC(예를 들어, 각각 인간화 CD4 및/또는 CD8과 결합하는 인간화 MHC II 및/또는 MHC I) 및/또는 인간화 TCR을 발현하는 유전자 조작 동물을 생산하는 방법도 제공된다. 인간 치료제를 개발하기 위해 실질적인 인간화 T 세포 면역반응을 일으키는 유전자 조작 동물을 사용하는 방법도 제공된다
실질적인 인간화 T 세포 면역반응
실질적인 인간화 T 세포 면역반응을 일으키도록 유전자 변형된 비인간 동물이 본 명세서에 개시된다. 본 명세서에 개시된 마우스는 적어도 하나의 인간 또는 인간화 T 세포 보조 수용체, 적어도 하나의 인간 또는 인간화 T 세포 보조 수용체와 결합할 수 있는 적어도 하나의 인간 또는 인간화 주요 조직적합성 복합체(MHC), 및/또는 인간 또는 인간화 T 세포 보조 수용체와 결합한 인간 또는 인간화 MHC와 관련하여 제시된 항원을 인식하여, 비인간 세포, 예를 들어 인간 또는 인간화 TCR을 발현하는 비인간 T 세포에 활성화 신호를 제공할 수 있는 인간 또는 인간화 T 세포 수용체(TCR)를 발현한다. 인간 또는 인간화 T 세포 보조 수용체, 인간 또는 인간화 TCR 및/또는 인간 또는 인간화 MHC는 비인간 동물의 게놈에 의해 코딩될 수 있다. 바람직한 실시 형태에서, 항원에 의한 면역화 시에, 비인간 동물은 항원의 HLA 제한된 에피토프를 인간 TCR 유전자 단편, 예를 들어 인간 TCRα V 세그먼트, 인간 TCRα J 세그먼트, 인간 TCRβ V 세그먼트, 인간 TCRβ D 세그먼트 및/또는 인간 TCRβ J 세그먼트로부터 유래된 TCR에 제시한다.
따라서, 본 발명은 게놈이 인간화 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, CD4 또는 CD8 폴리펩타이드)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 (예를 들어, 내인성 유전자좌에) 포함하고, 키메라 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드가 본 명세서에 기재된 아미노산 서열(들)의 보존적 아미노산 치환 및/또는 인간화 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드와 결합하는 인간화 MHC 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 인간화 MHC 폴리펩타이드가 본 명세서에 기재된 아미노산 서열(들)의 보존적 아미노산 치환을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물을 포함한다.
보존적 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 화학적 성질(예를 들어, 전하 또는 소수성)이 유사한 측쇄 R 기를 갖는 다른 아미노산 잔기에 의해 치환됨을 포함한다. 보존적 아미노산 치환은 보존적 치환을 코딩하는 뉴클레오타이드 변화를 도입하도록 뉴클레오타이드 서열을 변형시킴으로써 달성될 수 있다. 일반적으로, 보존적 아미노산 치환은 단백질의 목적하는 기능적 특성, 예를 들어 CD4 또는 CD8이, 예를 들어 각각, MHC II 또는 MHC I에 결합하는 능력을 실질적으로 변화시키지 않을 것이며, 예를 들어 MHC에 의해 제시된 항원에 대한 TCR의 감수성을 증가시킬 수 있다. 화학적 성질이 유사한 측쇄를 갖는 아미노산 그룹의 예로는 글라이신, 알라닌, 발린, 류신 및 아이소류신과 같은 지방족 측쇄; 세린 및 트레오닌과 같은 지방족 하이드록실 측쇄; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드 함유 측쇄; 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판과 같은 방향족 측쇄; 라이신, 아르기닌 및 히스티딘과 같은 염기성 측쇄; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 측쇄; 및 시스테인 및 메티오닌과 같은 황 함유 측쇄를 들 수 있다. 보존적 아미노산 치환 그룹은, 예를 들어 발린/류신/아이소류신, 페닐알라닌/티로신, 라이신/아르기닌, 알라닌/발린, 글루타메이트/아스파르테이트, 및 아스파라긴/글루타민을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 보존적 아미노산 치환은, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이 생성(alanine scanning mutagenesis)에 사용된, 단백질의 임의의 천연 잔기의 알라닌으로의 치환일 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 참조로 포함된 문헌[Gonnet et al. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45)]에 개시된 PAM250 로그 가능도 매트릭스(log-likelihood matrix)에서 양성 값을 갖는 보존적 치환이 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 치환은 PAM250 로그 가능도 매트릭스에서 비음성(nonnegative) 값을 갖는 적당히 보존적인 치환이다.
당업자는 본 명세서에 기재된 인간화 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드, 인간화 MHC 폴리펩타이드, 및/또는 TCR 가변 영역을 코딩하는 핵산 잔기 이외에, 유전자 코드의 축퇴(degeneracy)로 인해, 다른 핵산이 본 발명의 폴리펩타이드를 코딩할 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 인간화 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, CD4 또는 CD8 폴리펩타이드)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 재배열되지 않은 인간 유전자 단편을 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체 가변 유전자좌(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), 및/또는 보존적 아미노산 치환을 갖는 인간화 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 인간화 MHC 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 게놈에 포함하는 유전자 변형 비인간 동물 이외에, 유전자 코드의 축퇴로 인해 본 명세서에 기재된 것과는 상이한, 인간화 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, CD4 또는 CD8 폴리펩타이드)를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 재배열되지 않은 인간 유전자 단편을 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체 가변 유전자좌(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ), 및/또는 인간화 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 인간화 MHC 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 게놈에 포함하는 비인간 동물도 제공된다.
서열의 동일성은 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열 동일성을 측정하는데 사용될 수 있는 당업계에 공지된 다수의 상이한 알고리즘에 의해 결정될 수 있다. 본 명세서에 기술된 일부 실시 형태에서, 동일성은, 10.0의 개방 갭 페널티(open gap penalty), 0.1의 확장 갭 페널티(extend gap penalty)를 사용하는 ClustalW v. 1.83(슬로우(slow)) 정렬 및 고넷 유사성 매트릭스(Gonnet similarity matrix) (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008)를 사용하여 결정된다. 서열의 동일성에 관해 비교되는 서열의 길이는 특정 서열에 좌우될 것이다. 다양한 실시 형태에서, 동일성은 성숙 단백질의 서열을 이의 N 말단으로부터 이의 C 말단까지 비교함으로써 결정된다. 다양한 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 서열을 인간 서열과 비교할 때, 키메라 인간/비인간 서열의 인간 부분(그러나 비인간 부분은 아님)은 인간 서열과 키메라 인간/비인간 서열의 인간 부분 사이의 동일성 레벨을 확인하기 위해 비교하는데 사용된다(예를 들어, 키메라 인간/마우스 단백질의 인간 엑토도메인을 인간 단백질의 인간 엑토도메인과 비교함).
서열, 예를 들어 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 관련하여 용어 "상동성" 또는 "상동성의"란, 최적 정렬 및 비교시, 예를 들어 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 적어도 약 75%, 예를 들어 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 적어도 약 80%, 예를 들어 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 적어도 약 90 내지 95%, 예를 들어 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 97% 이상이 동일한 2개의 서열을 의미한다. 당업자는 최적의 유전자 표적화를 위해, 표적화 작제물이 내인성 DNA 서열과 상동성인 암(즉, "상동성 암(homology arm)")을 포함해야 하며; 따라서, 상동 재조합이 표적화 작제물과 표적화된 내인성 서열 사이에서 발생할 수 있음을 이해할 것이다.
용어 "작동가능하게 연결된"이란, 이와 같이 설명된 구성성분들이 이들의 의도된 방식으로 기능하도록 하는 관계에 있는 병치(juxtaposition)를 의미한다. 이와 같이, 단백질을 코딩하는 핵산 서열이, 적당한 전사 조절을 보유하도록 조절 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일런서(silencer) 서열 등)에 작동가능하게 연결될 수 있다. 또한, 본 발명의 키메라 또는 인간화 단백질의 다양한 부분이, 세포에서 단백질의 적절한 접힘, 가공, 표적화, 발현, 및 다른 기능적 특성을 보유하도록 작동가능하게 연결될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 키메라 또는 인간화 단백질의 다양한 도메인은 서로 작동가능하게 연결된다.
유전자 치환과 관련하여 용어 "치환"은 외인성 유전 물질을 내인성 유전자좌에 배치하여, 내인성 유전자의 전부 또는 일부를 이종상동성(orthologous) 또는 상동성 핵산 서열로 치환하는 것을 의미한다. 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이, 일 실시 형태에서, 마우스 CD4 또는 CD8(CD8α 및/또는 CD8β) 폴리펩타이드의 일부를 코딩하는 내인성 유전자좌의 핵산 서열은 각각, 인간 CD4 또는 CD8(CD8α 및/또는 CD8β) 폴리펩타이드의 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환되었다.
예를 들어 기능적 폴리펩타이드와 관련하여, 본 명세서에 사용된 "기능적"은 천연 단백질과 정상적으로 관련된 적어도 하나의 생물학적 활성을 보유하는 폴리펩타이드를 의미한다. 예를 들어, 본 발명의 일부 실시 형태에서, 내인성 유전자좌에서의 치환(예를 들어, 내인성 비인간 CD4 또는 CD8 유전자좌에서의 치환)은 기능적 내인성 폴리펩타이드를 발현하지 못하는 유전자좌를 초래한다.
인간화 T 세포 보조 수용체(들)
적어도 하나의 인간 또는 인간화 T 세포 보조 수용체, 예를 들어, CD4, CD8α 및/또는 CD8β를 발현하는 비인간 동물이 본 명세서에 개시된다. 따라서, 본 명세서에 개시된 비인간 동물은 각각 인간 또는 인간화 CD4 폴리펩타이드, 인간 또는 인간화 CD8α 폴리펩타이드, 및 인간 또는 인간화 CD8β 폴리펩타이드로부터 선택되는 상이한 인간 또는 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드를 코딩하는 제1, 제2, 및/또는 제3 뉴클레오타이드 서열 중 하나 이상을 포함한다. 본 명세서에서의 제1, 제2, 제3 명칭의 사용은 본 명세서에 개시된 비인간 동물이 임의의 순서로 모든 세가지의 뉴클레오타이드 서열 또는 보조 수용체 뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 존재를 필요로 하는 것처럼 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 따라서, 본 명세서에 개시된 비인간 동물은 인간 또는 인간화 CD4 및/또는 인간 또는 인간화 CD8(예를 들어, 인간 또는 인간화 CD8α 및/또는 CD8β) 폴리펩타이드(들)를 코딩하는 핵산 서열 또는 핵산 서열들을 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 비인간 동물은 인간 또는 인간화 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 비인간 동물은 인간 또는 인간화 CD8α 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 인간 또는 인간화 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 비인간 동물은 인간 또는 인간화 CD8α 및 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 인간 또는 인간화 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다.
인간 또는 인간화 CD4
다양한 실시 형태에서, 본 발명은 일반적으로, 인간 또는 인간화 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 게놈에, 예를 들어 내인성 CD4 유전자좌에 포함하는 유전자 변형 비인간 동물을 제공하며; 그리하여, 상기 동물은 인간 또는 인간화 CD4 폴리펩타이드를 발현한다.
인간 CD4 유전자는 염색체 12에 국한되어 있으며, 10개의 엑손을 포함하는 것으로 여겨진다. CD4 유전자는 유전자의 엑손 2 및 3에 의해 코딩되는 아미노 말단 소수성 시그널 서열을 갖는 단백질을 코딩한다. 상기 단백질은 통상 각각 D1 내지 D4 도메인으로도 지칭되는 4개의 세포외 면역글로불린 유사 도메인, Ig1 내지 Ig4를 포함한다. (문헌[Maddon et al. (1987) Structure and expression of the human and mouse T4 genes, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:9155-59]). D1 도메인은 엑손 3(시그널 펩타이드의 하류 서열) 및 엑손 4에 의해 코딩되는 반면에, D2, D3 및 D4는 각각, 분리된 엑손, 각각의 -- 엑손 5, 6 및 7에 의해 코딩되는 것으로 여겨진다(도 5a 참조: D1, D2, D3 및 D4 도메인은 각각, Ig1, Ig2, Ig3 및 Ig4로 지정된 서열로 코딩됨). 문헌[Littman (1987) The Structure of the CD4 and CD8 Genes, Ann. Rev. Immunol. 5:561-84; Hanna et al. (1994) Specific Expression of the Human CD4 Gene in Mature CD4+CD8- and Immature CD4+CD8+ T cells and in Macrophages of Transgenic Mice, Mol. Cell. Biol. 14(2):1084-94; Maddon et al., 상기 참조]. T 세포와 항원 제시 세포 사이의 접촉 부위와 같은 고 단백질 농도 부위에서, 분자는 대향하는 D4 도메인들 사이의 상호작용을 통해 동종이량체화(homodimerization)되는 경향이 있다. 문헌[Zamoyska (1998) CD4 and CD8: modulators of T cell receptor recognition of antigen and of immune responses? Curr. Opin. Immunol. 10:82-87; Wu et al. (1997) Dimeric association and segmental variability in the structure of human CD4, Nature 387:527; Moldovan et al. (2002) CD4 Dimers Constitute the Functional Component Required for T Cell Activation, J. Immunol. 169:6261-68].
CD4의 D1 도메인은 면역글로불린 가변(V) 도메인과 유사하며, D2 도메인의 일부와 함께, 예를 들어 MHC II 보조 수용체 결합 부위에서 MHC II와 결합하는 것으로 여겨진다. 문헌[Huang et al. (1997) Analysis of the contact sites on the CD4 Molecule with Class II MHC Molecule, J. Immunol. 158:216-25]. 결국, MHC II는 MHC II α2와 β2 도메인 사이의 접합부의 소수성 틈새에서 T 세포 보조 수용체 CD4와 상호작용한다. 문헌[Wang and Reinherz (2002) Structural Basis of T Cell Recognition of Peptides Bound to MHC Molecules, Molecular Immunology, 38:1039-49].
CD4 보조 수용체의 도메인 D3과 D4가, 이들 2개의 도메인의 치환이 CD4가 TCR에 결합하는 능력을 없애기 때문에, TCR-CD3 복합체와 상호작용하는 것으로 여겨진다. 문헌[Vignali et al. (1996) The Two Membrane Proximal Domains of CD4 Interact with the T Cell Receptor, J. Exp. Med. 183:2097-2107]. CD4 분자는 이량체로서 존재하며, 분자의 D4 도메인에서의 잔기가 CD4 이량체화의 원인이 되는 것으로 여겨진다. 문헌[Moldovan et al. (2002) CD4 Dimers Constitute the Functional Components Required for T Cell Activation, J. Immunol. 169:6261-68].
CD4 유전자의 엑손 8은 막관통 도메인을 코딩하는 반면, 나머지 유전자는 세포질 도메인을 코딩한다. CD4 세포질 도메인은 다수의 뚜렷한 기능들을 갖는다. 예를 들어, CD4의 세포질 도메인은 티로신 키나제 Lck를 동원한다. Lck는 CD4 및 CD8 세포질 도메인과 관련된 Src 계열 키나제이며, 보조 수용체와 TCR이 동일한 MHC에 동시 결합하면 TCR 복합체의 CD3와 ζ 쇄의 티로신 인산화가 증가되어, 이것은 결국 T 세포 활성화에 관여하는 다른 인자들의 동원으로 이어진다. 이타노(Itano)와 동료들은 CD4의 세포질 테일(tail)이 또한 형질전환 마우스에서 CD8 세포외 도메인 및 CD4 세포질 테일을 포함하는 하이브리드 단백질의 발현을 설계하고 시험함으로써 CD4+ 계통으로의 CD4+CD8+ T 세포의 분화를 촉진시킨다는 것을 제안하였다. 문헌[Itano et al. (1996) The Cytoplasmic Domain of CD4 Promotes the Development of CD4 Lineage T Cells, J. Exp. Med. 183:731-41]. 하이브리드 단백질의 발현은 MHC I 특이적 CD4 계통 T 세포의 발생을 초래한다. [동문헌 참조].
CD4 보조 수용체는 HIV 바이러스에 대한 일차 수용체이며, CD4+ T 세포 고갈이 질환 진행의 지표인 것으로 보인다. CD4의 세포질 테일은, HIV 유도성 아폽토시스에서 아폽토시스 시그널을 CD4+ T 세포에 전달하는데 필수적인 것으로 보인다. 구체적으로, CD4와 Lck의 상호작용이 이들 세포에서 HIV 유도성 아폽토시스를 증강시키는 것으로 나타났다. 문헌[Corbeil et al. (1996) HIV-induced Apoptosis Requires the CD4 Receptor Cytoplasmic Tail and Is Accelerated by Interaction of CD4 with p56lck, J. Exp. Med. 183:39-48].
T 세포는 흉선에서 발생하여 미성숙 CD4-/CD8-(이중 음성 또는 DN) 흉선 세포에서 CD4+/CD8+(이중 양성 또는 DP) 흉선 세포로 진행하고, 이것은 결국 양성 선택(positive selection)을 거쳐 CD4+ 또는 CD8+(단일 양성 또는 SP) T 세포가 된다. MHC I 제한된 TCR을 통해 시그널을 받는 DP 흉선 세포는 CD8+ T 세포로 분화하는 반면, MHC II 제한된 TCR을 통해 시그널을 받는 DP 흉선 세포는 CD4+ T 세포로 분화한다. CD4+ 또는 CD8+ T 세포로의 분화를 유도하는 DP 세포에 의해 수신된 신호는 여러 연구들의 대상이 되어 왔다. CD4/CD8 계통 선택을 위한 각종 모델들이 제안되었으며, 문헌[Singer et al. (2008) Lineage fate and intense debate: myths, models and mechanisms of CD4- versus CD8- lineage choice, Nat. Rev. Immunol. 8:788-801]에 검토되어 있다.
양성 선택의 결과로서의 특정 T 세포 보조 수용체의 불활성화가 전사 조절의 산물이다. CD4의 경우, CD4의 엑손 1의 13kb 상류에 위치한 인핸서가 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 CD4 발현을 상향조절하는 것으로 나타났다. 문헌[Killeen et al. (1993) Regulated expression of human CD4 rescues helper T cell development in mice lacking expression of endogenous CD4, EMBO J. 12:1547-53]. 뮤린 CD4 유전자의 제1 인트론 내에 위치한 시스 작용성 전사 사일런서(transcriptional silencer)는 CD4+ T 세포 이외의 세포에서 CD4의 발현을 침묵시키는 기능을 한다. 문헌[Siu et al. (1994) A transcriptional silencer control the developmental expression of the CD4 gene, EMBO J. 13:3570-3579].
인간 CD4를 발현하는 사전에 발생된 형질전환 마우스의 몇몇 계통에서는 CD4 계통 선택을 제어하는 중요한 전사 조절인자(예를 들어, 프로모터, 인핸서, 사일런서 등)이 빠져 있기 때문에, 이들 마우스는 정상적인 T 세포 계통 발생을 반복할 수 없었고, CD4를 발현하는 CD4+ T 세포 이외의 면역 세포를 생산하였다. 예를 들어, 문헌[Law et al. (1994) Human CD4 Restores Normal T Cell Development and Function in Mice Deficient in CD4, J. Exp. Med. 179:1233-42 (CD4 expression in CD8+ T cells and B cells); Fugger et al. (1994) Expression of HLA-DR4 and human CD4 transgenes in mice determines the variable region β-chain T-cell repertoire and mediates an HLA-D-restricted immune response, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:6151-55 (CD4 expressed on all CD3+ thymocytes and B cells)]을 참조한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 동물이 T 세포 발생 및 계통 선택을 행할 수 있는 T 세포를 생산할 수 있도록 내인성 마우스 프로모터 및 다른 조절 요소를 보유하는 유전자 변형 동물을 개발하는데 유용할 수 있다.
따라서, 다양한 실시 형태에서, 본 발명은 예를 들어, 내인성 T 세포 보조 수용체 유전자좌(예를 들어, CD4 유전자좌)에, 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물을 제공한다. 일 실시 형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 T 세포 보조 수용체의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어 하나 이상의 세포외 도메인, 예를 들어 적어도 2개의 연속적인 세포외 도메인)의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 일 실시 형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 비인간 부분은 비인간 T 세포 보조 수용체의 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 기능적 키메라 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드를 발현한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명은 내인성 CD4 유전자좌에, 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분이 인간 CD4의 세포외 부분의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함하고, 비인간 부분이 비인간 CD4의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며, 기능적 키메라 CD4 폴리펩타이드를 발현하는 유전자 변형 비인간 동물을 제공한다. 한 측면에서, 상기 비인간 동물은 다만 인간화 CD4 폴리펩타이드, 즉, 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드를 발현하고, 이의 내인성 CD4 유전자좌로부터 기능적 내인성 비인간 CD4 단백질을 발현하지 않는다.
일 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 CD4 폴리펩타이드의 세포외 부분의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 CD4 폴리펩타이드의 MHC II 결합 도메인(예를 들어, 인간 D1 및 D2 도메인의 상당 부분)의 적어도 전부 또는 실질적으로 전부를 포함하고; 일 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 CD4 폴리펩타이드의 D1, D2 및 D3 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함하며; 또 다른 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드의 인간 부분은 CD4의 면역글로불린 유사 도메인, 예를 들어 D1, D2, D3 및 D4로 명명되는 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드의 인간 부분은 이의 인간 부분에, T 세포 수용체의 세포외 부분 및/또는 MHC II와의 상호작용에 관여하는 인간 CD4 서열의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드의 인간 부분은 T 세포 수용체의 가변 도메인 및/또는 MHC II와의 상호작용에 관여하는 인간 CD4의 세포외 부분의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 키메라 CD4 폴리펩타이드의 인간 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD4의 도메인 D1 내지 D2의 코딩 서열(예를 들어, 인간 CD4 유전자의 엑손 3 및 엑손 4 내지 5의 일부)의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함하고; 다른 실시 형태에서, 이것은 인간 CD4의 D1 내지 D3의 코딩 서열(예를 들어, 인간 CD4의 엑손 3 및 엑손 4 내지 6의 일부)의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD4를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD4의 D1 내지 D3 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 키메라 CD4 폴리펩타이드의 인간 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD4 유전자의 D1 내지 D4 도메인의 코딩 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 마우스 CD4 시그널 펩타이드, 예를 들어 마우스 유전자의 엑손 2 내지 3의 부분에 의해 코딩되는 영역을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD4 시그널 펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드는 서열 번호 78에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 서열 번호 78의 아미노산 27 내지 319에 걸쳐 있다(서열 번호 79에 별도로 기재됨).
일 실시 형태에서, 비인간 동물은 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드 서열을 발현한다. 일 실시 형태에서, 키메라 CD4 서열의 인간 부분은 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 변형을 포함한다.
한 측면에서, 인간 CD4 서열과 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 CD4 서열을 발현하는 비인간 동물이 제공된다. 특정 실시 형태에서, 상기 인간 CD4 서열은 실시예에 기재된 인간 CD4 서열과 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 일 실시 형태에서, 상기 인간 CD4 서열은 하나 이상의 보존적 치환을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 인간 CD4 서열은 하나 이상의 비보존적 치환을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키메라 CD4의 일부, 예를 들어 인간 부분은 본 명세서에 나타낸 실질적으로 모든 서열(예를 들어, 본 명세서에 나타낸 실질적으로 모든 단백질 도메인)을 포함할 수 있다. 실질적으로 모든 서열은 일반적으로 단백질의 특정 부분(예를 들어, 특정 기능적 도메인 등)을 나타내는 것으로 여겨지는 아미노산 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 당업자는 기능적 도메인의 경계가 사용된 정렬 및 도메인 예측 방법에 따라 약간 변할 수 있음을 이해할 것이다.
한 측면에서, 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드의 비인간 부분은 비인간 CD4 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. CD4 세포질 도메인에 의해 제공된 중요한 기능으로 인해, 유전자 조작 동물에 내인성 비인간(예를 들어, 마우스) 서열을 보유함으로써, 보조 수용체의 적절한 세포내 시그널 전달 및 다른 기능의 보존이 보장된다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 마우스이고, 비인간 CD4 폴리펩타이드는 마우스 CD4 폴리펩타이드이다. 특정 마우스 CD4 서열이 실시예에 기재되어 있지만, 이로부터 유도된 임의의 적절한 서열, 예를 들어 보존적/비보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열이 본 명세서에 포함된다. 일 실시 형태에서, 키메라 CD4 보조 수용체의 비인간 부분은 인간화되지 않은 내인성 CD4의 임의의 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 비인간 동물은 이의 내인성 유전자좌에, 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 이로써, 내인성 CD4 유전자의 일부가 인간 CD4 폴리펩타이드의 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환된다. 일 실시 형태에서, 이러한 치환은 예를 들어, 비인간 CD4의 세포외 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 내인성 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 비인간 CD4의 제1 면역글로불린 유사 도메인(즉, D1)의 적어도 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 서열(예를 들어, 비인간 CD4의 도메인 D1 내지 D2의 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 서열, 예를 들어 비인간 CD4의 도메인 D1 내지 D3의 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 서열, 예를 들어 비인간 CD4의 도메인 D1 내지 D4의 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 서열)을 상술한 것을 코딩하는 인간 뉴클레오타이드 서열로 치환한 것이다. 일 실시 형태에서, 치환에 의해, T 세포 수용체의 세포외 부분 및/또는 MHC II와의 상호작용에 관여하는 인간 CD4 서열을 포함하는 키메라 단백질이 생성된다. 또 다른 실시 형태에서, 치환에 의해, T 세포 수용체의 가변 도메인 및/또는 MHC II와의 상호작용에 관여하는 인간 CD4 서열을 포함하는 키메라 단백질이 생성된다. 일 실시 형태에서, 상기 치환은 비인간 CD4 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 CD4 서열의 치환을 포함하지 않는다. 따라서, 한 측면에서, 비인간 동물은 내인성 비인간 CD4 유전자좌로부터 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드를 발현한다. 또 다른 실시 형태에서, 치환에 의해, 서열 번호 78에 기재된 폴리펩타이드 서열을 포함하는 단백질이 생성된다.
일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 인간/비인간 CD4 유전자좌(예를 들어, 키메라 인간/설치류 CD4 유전자좌, 예를 들어 키메라 인간/마우스 CD4 유전자좌)의 뉴클레오타이드 서열이 제공된다. 한 측면에서, 키메라 인간/비인간(예를 들어, 인간/설치류, 예를 들어 인간/마우스) CD4 서열이 내인성 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스) CD4 유전자좌에 배치되기 때문에, 제1 CD4 엑손의 상류에 위치한 CD4 인핸서 요소가 유지된다. 일 실시 형태에서, 내인성 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스) CD4 유전자좌에서의 치환은 예를 들어, CD4 폴리펩타이드의 D1을 코딩하는 엑손 3의 일부, 및 D1의 나머지와 D2 내지 D3를 코딩하는 엑손 4 내지 6의 치환을 포함하고; 따라서, 한 측면에서, 키메라 CD4 유전자좌는 비인간(예를 들어, 마우스) CD4 유전자의 인트론 1에 위치한 시스 작용성 사일런서를 보유한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 키메라 유전자좌는 내인성 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스) CD4 프로모터 및 조절 요소를 보유한다. 다른 실시 형태에서, 키메라 유전자좌는 적절한 CD4 발현, CD4+ T 세포 발생, CD4 계통 선택 및 보조 수용체 기능을 가능하게 하는 정도로 인간 프로모터 및 조절 요소를 함유할 수 있다. 따라서, 일부 측면에서, 본 발명의 동물은 T 세포의 적절한 계통 선택 및 발생을 변화시키지 않는 유전자 변형을 포함한다. 한 측면에서, 본 발명의 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스)은 CD4를 정상적으로 발현하는 세포 이외의 면역 세포에 키메라 CD4 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 한 측면에서, 동물은 B 세포 또는 성숙 CD8+ T 세포에 CD4를 발현하지 않는다. 일 실시 형태에서, 치환에 의해, CD4 발현의 적절한 공간적 및 시간적 조절을 가능하게 하는 요소를 보유하게 된다.
다양한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 CD4 유전자좌로부터 기능적 키메라 CD4 단백질을 발현하는 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트)은 세포 표면, 예를 들어, T 세포 표면에 키메라 단백질을 나타낸다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간에서 관찰되는 것과 동일한 세포 분포로 세포 표면에 키메라 CD4 단백질을 발현한다. 한 측면에서, 본 발명의 CD4 단백질은 제2 세포, 예를 들어 항원 제시 세포(APC)의 표면에 발현되는 MHCⅡ 단백질과 상호작용할 수 있다.
인간 또는 인간화 CD8
다양한 실시 형태에서, 본 발명은 일반적으로, 인간 또는 인간화 CD8 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 게놈에, 예를 들어 내인성 CD8 유전자좌에 포함하는 유전자 변형 비인간 동물을 제공하며; 그리하여, 상기 동물은 인간 또는 인간화 CD8 폴리펩타이드를 발현한다. 다양한 실시 형태에서, 본 발명은 인간 또는 인간화 CD8α 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 및/또는 인간 또는 인간화 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 게놈에, 예를 들어, 내인성 CD8 유전자좌에 포함하는 비인간 동물을 제공한다. 따라서, 본 발명의 유전자 변형 비인간 동물은 인간 또는 인간화 CD8α 및/또는 인간 또는 인간화 CD8β 폴리펩타이드(들)를 발현한다.
인간 CD8 단백질은 다이설파이드 결합된 동종이량체 및 동종다량체도 검출되었지만(예를 들어, CD8αα를 발현하는 NK 세포 및 장 γδ T 세포에서), 전형적으로 2개의 폴리펩타이드, CD8α 및 CD8β의 이종이량체로서 세포 표면에 발현된다. 인간 CD8α 및 CD8β를 코딩하는 유전자는 염색체 2에서 서로 아주 근접하게 위치한다. 문헌[Nakayama et al. (1992) Recent Duplication of the Two Human CD8β-chain genes, J. Immunol. 148:1919-27]. CD8α 단백질은 리더(leader) 펩타이드, 면역글로불린 V 유사 영역, 힌지 영역, 막관통 도메인 및 세포질 테일을 포함한다. 문헌[Norment et al. (1989) Alternatively Spliced mRNA Encodes a Secreted Form of Human CD8α. Characterization of the Human CD8α gene, J. Immunol. 142:3312-19]. CD8α 유전자의 엑손/인트론이 도 5b에 개략적으로 도시되어 있다.
인간 CD8β 유전자는 염색체 2의 CD8α 유전자의 상류에 있다. CD8β 유전자의 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 의해 생성된 다수의 아이소폼(isoform)이 보고되었으며, 하나의 아이소폼은 막관통 도메인이 결여되어 있고 분비 단백질을 생성하는 것으로 예측된다. 문헌[Norment et al. (1988) A second subunit of CD8 is expressed in human T cells, EMBO J. 7:3433-39]. CD8β 유전자의 엑손/인트론이 도 5b에 개략적으로 도시되어 있다.
막 결합 CD8β 단백질은 N 말단 시그널 서열, 이어서 면역글로불린 V 유사 도메인, 짧은 세포외 힌지 영역, 막관통 도메인 및 세포질 테일을 포함한다. 문헌[Littman (1987) The structure of the CD4 and CD8 genes, Ann Rev. Immunol. 5:561-84]을 참조한다. 힌지 영역은 광범위한 글리코실화 부위로서, 이의 입체 구조를 유지하여, 프로테아제에 의한 절단으로부터 단백질을 보호하는 것으로 여겨진다. 문헌[Leahy (1995) A structural view of CD4 and CD8, FASEB J. 9:17-25].
CD8 단백질은 통상 세포독성 T 세포에서 발현되며, MHC I 분자와 상호작용한다. 상호작용은 MHC I의 α3 도메인에 대한 CD8 결합을 통해 매개된다. CD8에 대한 MHC 클래스 I의 결합은 MHC 클래스 I에 대한 TCR의 결합보다 약 100배 더 약하지만, CD8 결합은 TCR 결합의 친화도를 향상시킨다. 문헌[Wooldridge et al. (2010) MHC Class I Molecules with Superenhanced CD8 Binding Properties Bypass the Requirement for Cognate TCR Recognition and Nonspecifically Activate CTLs, J. Immunol. 184:3357-3366].
MHC 클래스 I 분자에 대한 CD8 결합은 종 특이적이며; CD8의 마우스 상동체, Lyt-2는 α3 도메인에서 H-2Dd 분자에 결합하는 것으로 나타났지만, HLA-A 분자에는 결합하지 않았다. 문헌[Connolly et al. (1988) The Lyt-2 Molecule Recognizes Residues in the Class I α3 Domain in Allogeneic Cytotoxic T Cell Responses, J. Exp. Med. 168:325-341]. 상이한 결합은 인간과 마우스 사이에 보존되지 않은 CD8 상의 CDR 유사 결정인자 (CDR1 유사 및 CDR2 유사)로 인한 것으로 추정되었다. 문헌[Sanders et al. (1991) Mutations in CD8 that Affect Interactions with HLA Class I and Monoclonal Anti-CD8 Antibodies, J. Exp. Med. 174:371-379; Vitiello et al. (1991) Analysis of the HLA-restricted Influenza-specific Cytotoxic T Lymphocyte Response in Transgenic Mice Carrying a Chimeric Human-Mouse Class I Major Histocompatibility Complex, J. Exp. Med. 173:1007-1015; and, Gao et al. (1997) Crystal structure of the complex between human CD8αα and HLA-A2, Nature 387:630-634]. CD8은 α3 도메인의 보존 영역에서(위치 223 내지 229에서) HLA-A2에 결합하는 것으로 보고되었다. HLA-A에서의 단일 치환(V245A)은 HLA-A에 대한 CD8의 결합을 감소시키며, T 세포 매개된 용해의 큰 감소를 수반하였다. 문헌[Salter et al. (1989), Polymorphism in the α3 domain of HLA-A molecules affects binding to CD8, Nature 338:345-348]. 일반적으로, HLA-A 분자의 α3 도메인에서의 다형성도 CD8에 대한 결합에 영향을 미쳤다. [동문헌 참조]. 마우스에서, H-2Dd의 잔기 227에서의 아미노산 치환이 H-2Dd에 대한 마우스 Lyt-2의 결합에 영향을 미쳤으며, 돌연변이체 H-2Dd로 형질감염된 세포는 CD8+ T 세포에 의해 용해되지 않았다. 문헌[Potter et al. (1989) Substitution at residue 227 of H-2 class I molecules abrogates recognition by CD8-dependent, but not CD8-independent, cytotoxic T lymphocytes, Nature 337:73-75]. 따라서, 인간 또는 인간화 CD8의 발현은 인간 또는 인간화 MHC I에 의해 제시된 항원에 대한 T 세포 반응을 연구하는데 유익할 수 있다.
CD4와 유사하게, CD8의 세포질 도메인은 티로신 키나제 Lck와 상호작용하고, 결국 T 세포 활성화를 유도한다. Lck가 CD8α의 세포질 도메인과 상호작용 하는 것으로 보이지만, CD8β 세포질 도메인의 돌연변이 또는 결실이 CD8α 관련 Lck 활성을 감소시켰기 때문에, 이러한 상호작용은 CD8β의 세포질 도메인의 존재에 의해 조절되는 것으로 보인다. 문헌[Irie et al. (1998) The cytoplasmic domain of CD8β Regulates Lck Kinase Activation and CD8 T cell Development, J. Immunol. 161:183-91]. Lck 활성의 감소는 T 세포 발생의 손상과 관련되었다. [동문헌 참조].
적절한 세포, 예를 들어, 세포독성 T 세포에 대한 CD8의 발현은 CD8 유전자좌 전체에 걸쳐 위치한 각종 인핸서 요소에 의해 엄격히 조절된다. 예를 들어, 종종 조절인자 결합과 관련된 영역인 적어도 4개의 DNAse I 과민성 영역이 CD8 유전자좌에서 확인되었다. 문헌[Hosert et al. (1997) A CD8 genomic fragment that directs subset-specific expression of CD8 in transgenic mice, J. Immunol. 158:4270-81]. CD8 유전자좌에서 이러한 DNAse I 과민성 영역이 발견된 이후, DP, CD8 SP T 세포, 또는 γδTCR을 발현하는 세포를 포함하는 다양한 계통의 T 세포에서 CD8α 및/또는 β의 발현을 조절하는, CD8 유전자좌 전체에 걸쳐 퍼져 있는 5개 이상의 인핸서 요소가 확인되었다. 예를 들어, 문헌[Kioussis et al. (2002) Chromatin and CD4, CD8A, and CD8B gene expression during thymic differentiation, Nature Rev. 2:909-919 and Online Erratum; Ellmeier et al. (1998) Multiple Development Stage-Specific Enhancers Regulate CD8 Expression in Developing Thymocytes and in Thymus-Independent T cells, Immunity 9:485-96]을 참조한다.
따라서, 인간 또는 인간화 CD4 유전자 변형 동물에 대한 내인성 CD4 프로모터 및 조절 요소를 보유함으로써 유도된 이익과 유사하게, 일부 실시 형태에서, 인간 또는 인간화 CD8의 발현을 조절하는 조절 요소와 내인성 마우스 프로모터를 보유하는 유전자 변형 비인간 동물을 개발하는데 유용할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, CD8α 및/또는 β 단백질을 코딩하는 내인성 비인간 서열을 인간 또는 인간화 CD8α 및/또는 β 단백질을 코딩하는 것으로 치환하는 것을 포함하는 유전자 변형 동물을 생산하는데 특히 유용할 수 있다.
다양한 실시 형태에서, 본 발명은 게놈에, 예를 들어 내인성 CD8 유전자좌에, 키메라 인간/비인간 CD8 폴리펩타이드(예를 들어, CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드)를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 폴리펩타이드의 인간 부분이 인간 CD8 폴리펩타이드(예를 들어, CD8α 및/또는 β)의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어 세포외 도메인)의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함하고, 비인간 부분이 비인간 CD8(예를 들어, CD8α 및/또는 β)의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며, 키메라 CD8 폴리펩타이드(예를 들어, CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드)를 발현하는 유전자 변형 비인간 동물을 제공한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명은 내인성 비인간 CD8 유전자좌에, 키메라 인간/비인간 CD8α 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/비인간 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 제1 뉴클레오타이드 서열이 인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분의 전부 또는 실질적으로 전부 및 비인간 CD8α 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열을 포함하고, 제2 뉴클레오타이드 서열이 인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분의 전부 또는 실질적으로 전부 및 비인간 CDβ 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열을 포함하며, 기능적 키메라 인간/비인간 CD8 단백질을 발현하는 유전자 변형 비인간 동물을 제공한다. 한 측면에서, 상기 비인간 동물은 다만 인간화 CD8 폴리펩타이드(예를 들어, 키메라 인간/비인간 CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드)를 발현하고, 내인성 CD8 유전자좌로부터 대응하는 기능적 비인간 CD8 폴리펩타이드(들)를 발현하지 않는다.
일 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD8α 폴리펩타이드는 이의 인간 부분에, 인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 일 실시 형태에서, 키메라 CD8α 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 CD8α 폴리펩타이드의 적어도 MHC I 결합 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 키메라 CD8α 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 CD8α의 면역글로불린 V 유사 도메인의 적어도 전부 또는 실질적으로 전부의 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 키메라 CD8α 폴리펩타이드의 인간 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분을 코딩하는 엑손을 포함한다. 일 실시 형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 적어도 Ig V 유사 도메인을 코딩하는 엑손을 포함한다. 일 실시 형태에서, 인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분은 막관통 또는 세포질 도메인이 아닌 폴리펩타이드의 부분을 포함하는 영역이다. 일 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD8α 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스) CD8α 시그널 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 대안적으로, 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD8α 시그널 서열을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD8α 폴리펩타이드는 서열 번호 88에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 서열 번호 88의 아미노산 28 내지 179에 기재되어 있다(서열 번호 89에 별도로 기재됨).
유사하게, 일 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD8β 폴리펩타이드는 이의 인간 부분에, 인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 일 실시 형태에서, 키메라 CD8β 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 CD8β의 면역글로불린 V 유사 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부의 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 키메라 CD8β 폴리펩타이드의 인간 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분을 코딩하는 엑손을 포함한다. 일 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD8β 폴리펩타이드의 인간 부분을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 인간 CD8β의 IgG V 유사 도메인을 코딩하는 엑손을 포함한다. 일 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스) CD8β 시그널 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 대안적으로, 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD8β 시그널 서열을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD8β 폴리펩타이드는 서열 번호 83에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 서열 번호 83의 아미노산 15 내지 165에 기재되어 있다(서열 번호 84에 별도로 기재됨).
일 실시 형태에서, 비인간 동물은 키메라 인간/비인간 CD8α 및/또는 CD8β 폴리펩타이드를 발현한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드의 인간 부분은 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 변형(들)을 포함한다.
한 측면에서, 각각, 인간 CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드 서열과 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 인간 CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드 서열을 발현하는 비인간 동물이 제공된다. 특정 실시 형태에서, 인간 CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드 서열은 실시예에 기재된 각각의 인간 CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드 서열과 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 일 실시 형태에서, 인간 CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드 서열은 하나 이상의 보존적 치환을 포함한다. 일 실시 형태에서, 인간 CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드 서열은 하나 이상의 비보존적 치환을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 키메라 CD8의 일부, 예를 들어 인간 부분은 본 명세서에 나타낸 실질적으로 모든 서열(예를 들어, 본 명세서에 나타낸 실질적으로 모든 단백질 도메인)을 포함할 수 있다. 실질적으로 모든 서열은 일반적으로 단백질의 특정 부분(예를 들어, 특정 기능적 도메인 등)을 나타내는 것으로 여겨지는 아미노산 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 당업자는 기능적 도메인의 경계가 사용된 정렬 및 도메인 예측 방법에 따라 약간 변할 수 있음을 이해할 것이다.
한 측면에서, 키메라 인간/비인간 CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드의 비인간 부분은 각각, 비인간 CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함한다. CD8 세포질 도메인에 의해 제공된 중요한 기능으로 인해, 유전자 조작 동물에 내인성 비인간(예를 들어, 마우스) 서열을 보유함으로써, 보조 수용체의 적절한 세포내 시그널 전달 및 다른 기능의 보존이 보장된다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 마우스이고, 비인간 CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드는 각각, 마우스 CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드이다. 특정 마우스 CD8α 및 β 서열이 실시예에 기재되어 있지만, 이로부터 유도된 임의의 적절한 서열, 예를 들어 보존적/비보존적 아미노산 치환을 포함하는 서열이 본 명세서에 포함된다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스)은 인간화되지 않은 임의의 내인성 서열을 보유한다.
본 명세서에 기재된 비인간 동물은 이의 내인성 유전자좌에, 키메라 인간/비인간 CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 이로써 내인성 CD8α 유전자의 일부가 인간 CD8α 폴리펩타이드의 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환되고/되거나, 내인성 CD8β 유전자의 일부가 인간 CD8β 폴리펩타이드의 일부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환된다. 일 실시 형태에서, 이러한 치환은 비인간 CD8α 및/또는 β의 세포외 부분의 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 내인성 뉴클레오타이드 서열을 상술한 것을 코딩하는 인간 뉴클레오타이드 서열을 갖는 인간 뉴클레오타이드로 치환한 것이다. 일 실시 형태에서, 이러한 치환은 비인간 CD8α 및/또는 β의 면역글로불린 V 유사 도메인의 적어도 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 서열을 상술한 것을 코딩하는 인간 뉴클레오타이드 서열로 치환한 것이다. 일 실시 형태에서, 상기 치환은 비인간 CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 CD8α 및/또는 β 서열의 치환을 포함하지 않는다. 따라서, 비인간 동물은 내인성 비인간 CD8 유전자좌로부터 키메라 인간/비인간 CD8α 및/또는 β 폴리펩타이드를 발현한다. 또 다른 실시 형태에서, 치환에 의해, 각각 서열 번호 88 및/또는 84에 기재된 폴리펩타이드 서열을 포함하는 CD8α 및/또는 β 단백질이 생성된다.
일 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD8 유전자좌(예를 들어, 키메라 설치류 CD8 유전자좌, 예를 들어, 키메라 마우스 CD8 유전자좌)의 뉴클레오타이드 서열이 제공된다. 한 측면에서, 키메라 인간/비인간(예를 들어, 인간/설치류, 예를 들어, 인간/마우스) CD8α 및/또는 β 서열이 각각의 내인성 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스) CD8α 및/또는 β 유전자좌에 배치되기 때문에, 내인성 CD8α 및/또는 β 프로모터 및 조절 요소를 보유한다. 다른 실시 형태에서, 키메라 유전자좌는 적절한 CD8α 및/또는 β 발현(적절한 공간적 및 시간적 단백질 발현), CD8+ T 세포 발생, CD8 계통 선택 및 보조 수용체 기능을 가능하게 하는 정도로 인간 CD8α 및/또는 β 프로모터 및 조절 요소를 함유할 수 있다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명의 동물은 T 세포의 적절한 계통 선택 및 발생을 변화시키지 않는 유전자 변형을 포함한다. 한 측면에서, 본 발명의 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스)은 CD8을 정상적으로 발현하는 세포 이외의 면역 세포에 키메라 CD8 단백질을 발현하지 않으며, 예를 들어 동물은 B 세포 또는 성숙 CD4+ T 세포에 CD8을 발현하지 않는다. 일 실시 형태에서, 치환에 의해, CD8α 및/또는 β 발현의 적절한 공간적 및 시간적 조절을 가능하게 하는 요소를 보유하게 된다.
다양한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 CD8 유전자좌로부터 기능적 키메라 CD8 단백질(예를 들어, CD8αβ 또는 CD8α)을 발현하는 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트)은 세포 표면에 키메라 단백질을 나타낸다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간에서 관찰되는 것과 동일한 세포 분포로 세포 표면에 키메라 CD8 단백질을 발현한다. 한 측면에서, 본 발명의 CD8 단백질은 제2 세포의 표면에 발현되는 MHC I 단백질과 상호작용할 수 있다.
인간 또는 인간화 T 세포 수용체
실질적인 인간화 T 세포 면역계를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 비인간 동물은 예를 들어, 이의 게놈에, (a) 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 - 여기서, 키메라 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 T 세포 보조 수용체의 세포외 도메인을 코딩하는 서열에 의해 코딩되고, 인간 T 세포 보조 수용체의 세포외 도메인을 코딩하는 서열은 비인간 T 세포 보조 수용체 막관통 및/또는 세포질 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 뉴클레오타이드에 작동가능하게 연결됨 -; (b) 적어도 하나의 인간 V 세그먼트, 임의로 적어도 하나의 인간 D 세그먼트, 및 적어도 하나의 인간 J 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체(TCR) 가변 유전자 영역 - 여기서, TCR 가변 영역 유전자의 재배열되지 않은 V, 임의로 D, 및 J 세그먼트는 재결합하여 비인간 TCR 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 재배열된 유전자를 형성할 수 있음 -; 및 (c) 키메라 인간/비인간 MHC 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열 - 여기서, 키메라 MHC 폴리펩타이드의 인간 부분은 키메라 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드의 인간 부분과 결합하는 인간 MHC 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함함 -을 포함한다. 임의로, 비인간 동물은 또한 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 포함한다.
따라서, 다양한 실시 형태에서, 본 발명은 일반적으로 재배열되지 않은 인간화 TCR 가변 유전자좌, 예를 들어, 재결합하여 재배열된 TCR 가변 유전자 서열을 형성할 수 있는 인간 TCR 가변 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 인간 TCR 가변 유전자 영역을 게놈에 포함하는 유전자 변형 비인간 동물을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 TCR 유전자좌 또는 TCR 유전자좌(예를 들어, TCRα 유전자좌 또는 TCRβ 유전자좌)는 재배열되지 않은 V(D)J 서열, 인핸서 서열, 불변 서열(들) 및 임의의 상류 또는 하류(UTR, 조절 영역 등)를 포함하여 전체 TCR 코딩 영역을 포함한 TCR 코딩 영역을 포함하는 게놈 DNA 또는 개재 DNA 서열(인트론 등)을 말한다. TCR 가변 유전자좌, TCR 가변 영역 또는 TCR 가변 유전자좌(예를 들어, TCRα 가변 유전자좌 또는 TCRβ 가변 유전자좌)는 TCR 가변 영역 세그먼트(V(D)J 영역)를 포함하지만, TCR 불변 서열 및 다양한 실시 형태에서, 인핸서 서열을 제외하는 게놈 DNA를 지칭한다. 다른 서열이 유전자 조작(예를 들어, 선택 카세트, 제한 부위 등)을 위해 TCR 가변 유전자좌에 포함될 수 있으며, 이들은 본 명세서에 포함된다.
T 세포는 주요 조직적합성 복합체(MHC; 마우스에서) 또는 인간 백혈구 항원(HLA; 인간에서) 복합체와 결합하는 항원 제시 세포의 표면의 작은 항원결정기의 에피토프에 결합한다. T 세포는 T 세포 표면의 T 세포 수용체(TCR) 복합체를 통해 이들 에피토프에 결합한다. T 세포 수용체는 두 종류의 쇄로 구성된 이종이량체 구조이다: α(알파) 및 β(베타) 쇄, 또는 γ(감마) 및 δ(델타) 쇄. α 쇄는 α 유전자좌(인간 또는 마우스 염색체 14 상) 내에 위치하는 핵산 서열에 의해 코딩되며, 또한 전체 δ 유전자좌를 포함하고, β 쇄는 β 유전자좌(마우스 염색체 6 또는 인간 염색체 7 상) 내에 위치하는 핵산 서열에 의해 코딩된다. 대다수의 T 세포는 αβ TCR을 가지고 있는 반면에; 소수의 T 세포는 γδ TCR을 가지고 있다. TCR과 MHC 클래스 I(CD8+ T 세포에 제시됨) 및 MHC 클래스 II(CD4+ T 세포에 제시됨) 분자의 상호작용은 도 1에 나타낸다(닫힌 기호는 비인간 서열을 나타내고; 줄무늬 기호는 인간 서열을 나타내며, 본 발명의 TCR 단백질의 하나의 특정 실시 형태를 나타냄).
T 세포 수용체 α 및 β 폴리펩타이드(및 유사하게는 γ 및 δ 폴리펩타이드)는 다이설파이드 결합을 통해 서로 연결된다. TCR을 구성하는 2개의 폴리펩타이드 각각은 불변 영역 및 가변 영역을 포함하는 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 테일(막관통 도메인 및 세포질 테일도 불변 영역의 일부임)을 포함한다. TCR의 가변 영역은 이의 항원 특이성을 결정하며, 면역글로불린과 유사하게, 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 또한 면역글로불린 유전자와 유사하게, T 세포 수용체 가변 유전자좌(예를 들어, TCRα 및 TCRβ 유전자좌)는 다수의 재배열되지 않은 V(D)J 세그먼트(가변(V), 결합(J), 및 TCRβ 및 δ에서, 다양성(D) 세그먼트)를 포함한다. 흉선에서의 T 세포 발생 시에, TCRα 가변 유전자좌는 재배열되어, 얻어진 TCRα 쇄는 VJ 세그먼트(Vα/Jα 서열)의 특정 조합에 의해 코딩되며; TCRβ 가변 유전자좌는 재배열되어, 얻어진 TCRβ 쇄는 VDJ 세그먼트(Vβ/Dβ/Jβ 서열)의 특정 조합에 의해 코딩된다.
흉선 간질과의 상호작용에 의해, 흉선 세포는 다양한 세포 표면 마커의 발현을 특징으로 하는 여러 발달 단계를 거치게 된다. 흉선에 있어서의 여러 발달 단계에서의 특징적인 세포 표면 마커의 개요가 표 1에 기재되어 있다. TCRβ 가변 유전자좌에서의 재배열은 DN2 단계에서 시작하여, DN4 단계 시에 끝나는데, TCRα 가변 유전자좌의 재배열은 DP 단계에서 일어난다. TCRβ 유전자좌 재배열의 완료 후에, 세포는 대체(surrogate) α 쇄, pTα와 함께 세포 표면에서 TCRβ 쇄를 발현한다. 문헌[Janeway's Immunobiology, Chapter 7, 7th Ed., Murphy et al. eds., Garland Science, 2008]을 참조한다.
[표 1]
미감작 CD4+ 및 CD8+ T 세포는 흉선에서 빠져 나와, 말초림프기관(예를 들어, 비장)으로 들어가며, 여기서 이들은 항원에 노출되고 클론으로 확장되어, 다수의 이펙터 T 세포(Teff), 예를 들어 세포독성 T 세포, TREG 세포, TH17 세포, TH1 세포, TH2 세포 등으로 분화되도록 활성화된다. 감염 후에, 다수의 T 세포는 기억 T 세포로 존속되며, 중심 기억 T 세포(Tcm) 또는 이펙터 기억 T 세포(Tem)로 분류된다. 문헌[Sallusto et al. (1999) Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions, Nature 401:708-12 and Commentary by Mackay (1999) Dual personality of memory T cells, Nature 401:659-60]. 살루스토(Sallusto)와 동료들은 초기 감염 후에, Tem 세포가 이펙터 기능을 가진 말초 조직에서 쉽게 이용할 수 있는 항원에 감작된(antigen-primed) 기억 T 세포 풀(pool)을 나타내는 반면에, Tcm 세포가 말초림프기관의 항원에 감작된 T 세포를 나타내며, 이차 챌린지(secondary challenge) 시에 새로운 이펙터 T 세포가 될 수 있다고 제안하였다. 모든 기억 T 세포가 CD45의 CD45RO 아이소폼을 발현하는 반면에(미감작 T 세포는 CD45RA 아이소폼을 발현함), Tcm은 말초림프기관 및 림프절에 대한 결합과, 말초림프기관 및 림프절에서의 시그널 전달에 중요한 L-셀렉틴(CD62L라고도 함) 및 CCR7+의 발현을 특징으로 한다. [동문헌 참조]. 따라서, 말초림프기관에서 발견되는 모든 T 세포(예를 들어, 미감작 T 세포, Tcm 세포 등)는 CD62L을 발현한다. CD45RO 이외에, 모든 기억 T 세포는 다수의 상이한 세포 표면 마커, 예를 들어 CD44를 발현하는 것으로 알려져 있다. T 세포의 다양한 세포 표면 마커의 개요에 대해서는, 문헌[Janeway's Immunobiology, Chapter 10, 상기 참조]을 참조한다.
TCR 가변 도메인이 주로 항원 인식에서 기능을 하지만, TCR의 막관통 및 세포질 도메인뿐만 아니라, 불변 도메인의 세포외 부분도 중요한 기능을 한다. 완전한 TCR 수용체 복합체는 α 및 β, 또는 γ 및 δ 폴리펩타이드보다 많은 것을 필요로 하며; 필요한 추가의 분자는CD3γ, CD3δ 및 CD3ε 뿐만 아니라, ζ 쇄 동종이량체 (ζζ)도 포함한다. TCRβ 재배열 완료 시에, 세포가 TCRβ/pTα를 발현하는 경우, 이러한 예비 TCR 복합체는 세포 표면에 CD3와 함께 존재한다. 세포 표면의 TCRα(또는 pTα)는 이의 막관통 도메인에 2개의 염기성 잔기를 갖고 있으며, 그 중 하나는 CD3γε 이종이량체를 동원하고, 다른 하나는 각각의 산성 잔기를 통해 ζζ를 동원한다. TCRβ는 CD3δε 이종이량체를 동원하는 것으로 여겨지는 이의 막관통 도메인에 추가의 염기성 잔기를 갖는다. 예를 들어, 문헌[Kuhns et al. (2006) Deconstructing the Form and Function of the TCR/CD3 Complex, Immunity 24:133-39; Wucherpfennig et al. (2009) Structural Biology of the T-cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, and Initiation of Signaling, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a005140]을 참조한다. TCRαβ 이종이량체, CD3γε, CD3δε, 및 ζζ를 포함하는 조립 복합체는 T 세포 표면에 발현된다. 막관통 도메인의 극성 잔기는 소포체를 빠져 나오기 위한 퀄리티 컨트롤(quality control)로서 작용하는 것으로 제시되었으며; CD3 서브유닛의 부재 하에, TCR 쇄는 ER에서 유지되고 분해를 타겟으로 하는 것으로 입증되었다. 예를 들어, 문헌[Call and Wucherpfennig (2005) The T Cell Receptor: Critical Role of the Membrane Environment in Receptor Assembly and Function, Annu. Rev. Immunol. 23:101-25]을 참조한다.
조립 복합체의 CD3 및 ζ 쇄는 TCRαβ 이종이량체(또는 TCRγδ 이종이량체) 자체가 시그널 전달 활성이 없기 때문에, TCR 시그널 전달을 위한 구성성분을 제공한다. CD3 쇄는 각각, 1개의 면역 수용체 티로신 기반 활성 모티프(Immune-Receptor-Tyrosine-based-Activation-Motif, ITAM)를 갖는 반면에, ζ 쇄는 3개의 탠덤 ITAM을 포함한다. ITAM은 관련 키나제에 의해 인산화될 수 있는 티로신 잔기를 함유한다. 따라서, 조립 TCR-CD3 복합체는 10개의 ITAM 모티프를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Love and Hayes (2010) ITAM-Mediated Signaling by the T-Cell Antigen Receptor, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:e002485]을 참조한다. TCR 연결(engagement) 후에, ITAM 모티프는 Src 계열 티로신 키나제인 Lck 및 Fyn에 의해 인산화되어, 시그널 전달 캐스케이드를 개시하여, Ras 활성화, 칼슘 동원, 액틴 세포 골격 재배열 및 전사인자의 활성화를 가져오며, 모두 궁극적으로 T 세포 분화, 증식 및 이펙터 작용을 유도한다. [동문헌 참조], 또한, 문헌[Janeway's Immunobiology, 상기 참조]을 참조하며; 이들 모두 본 명세서에 참조로 포함된다.
또한, TCRβ 막관통 및 세포질 도메인은 미토콘드리아 표적화 및 아폽토시스 유발에 관여하는 것으로 여겨지며; 실제로, 자연 발생 N 말단이 절단된 TCRβ 분자가 흉선 세포에 존재한다. 문헌[Shani et al. (2009) Incomplete T-cell receptor--β peptides target the mitochondrion and induce apoptosis, Blood 113:3530-41]. 따라서, 몇몇 중요한 기능은 TCR 불변 영역(다양한 실시 형태에서, 세포외 부분과 막관통 및 세포질 도메인을 포함함)에 의해 제공되며; 다양한 실시 형태에서, 인간화 TCR, 또는 인간화 TCR을 발현하는 유전자 변형 비인간 동물을 설계할 때에, 이러한 영역의 구조가 고려되어야 한다.
재배열된 T 세포 수용체 서열 유전자 도입 마우스가 당업계에 공지되어 있다. 본 발명은 재배열된 인간 가변 도메인 및 비인간(예를 들어, 마우스 또는 래트) 불변 영역을 포함하는 T 세포를 포함하는 동물을 비롯하여, 재배열되어 인간 T 세포 수용체 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 형성할 수 있는 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 T 세포 가변 유전자좌를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물 (예를 들어, 설치류, 예를 들어 래트, 마우스)에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 T 세포 수용체 가변 영역 서열의 다양한 레퍼토리를 생성할 수 있는 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 래트, 마우스)를 제공하며; 따라서, 본 발명은 목적하는 항원에 반응하여 완전 인간 가변 도메인으로 TCR을 발현시키고 목적하는 항원의 에피토프에 결합하는 비인간 동물을 제공한다. 일부 실시 형태에서, APC에 의해 제시되는 항원을 포함하나 이에 한정되지 않는 각종 항원과 반응할 수 있는 다양한 T 세포 수용체 레퍼토리를 생성하는 비인간 동물이 제공된다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 재배열되지 않은 인간 TCR 가변 영역 세그먼트(V(D)J 세그먼트)를 게놈에 포함하며, 재배열되지 않은 인간 TCR 가변 영역 세그먼트가 내인성 비인간(예를 들어, 설치류) TCR 가변 유전자좌 (예를 들어, TCRα, β, δ, 및/또는 γ 가변 유전자좌)에서, 내인성 비인간 TCR 가변 영역 세그먼트를 대체하는, 유전자 변형 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 래트, 마우스)을 제공한다. 일 실시 형태에서, 재배열되지 않은 인간 TCR 가변 유전자좌가 내인성 비인간 TCR 가변 유전자좌를 대체한다.
다른 실시 형태에서, 본 발명은 재배열되지 않은 인간 TCR 가변 영역 세그먼트(V(D)J 세그먼트)를 게놈에 포함하며, 재배열되지 않은 인간 TCR 가변 영역 세그먼트가 비인간 TCR 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되어 인간화 TCR 유전자좌가 생성되고, 인간화 TCR 유전자좌가 내인성 비인간 TCR 유전자좌 이외의 게놈 내의 부위에 존재하는, 유전자 변형 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 래트, 마우스)을 제공한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 비인간 TCR 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 재배열되지 않은 인간 TCR 가변 영역 세그먼트를 포함하는 도입유전자를 포함하는 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스, 래트)도 제공된다.
한 측면에서, 본 발명의 유전자 변형 비인간 동물은 TCR 불변 도메인을 코딩하는 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스, 래트) TCR 불변 유전자 서열(들)을 보유하면서, 인간 TCR 가변 영역 세그먼트를 게놈에 포함한다. 다양한 실시 형태에서, TCR 불변 도메인은 TCR의 막관통 도메인 및 세포질 테일을 포함한다. 따라서, 본 발명의 다양한 실시 형태에서, 유전자 변형 비인간 동물은 내인성 비인간 TCR 막관통 도메인 및 세포질 테일을 보유한다. 다른 실시 형태에서, 비인간 동물은 예를 들어, 비인간 비내인성 TCR 막관통 도메인 및 세포질 테일을 코딩하는 비인간 비내인성 TCR 불변 유전자 서열을 포함한다. 상술한 바와 같이, TCR의 불변 도메인은 항원에 감작된 T 세포 활성화 시에 개시된 시그널 전달 캐스케이드에 관여하며; 그리하여, 내인성 TCR 불변 도메인은 T 세포 내의 다양한 비인간 앵커 및 시그널 전달 단백질과 상호작용한다. 따라서, 한 측면에서, 본 발명의 유전자 변형 비인간 동물은 다양한 내인성 비인간 앵커 또는 시그널 전달 분자, 예를 들어 CD3 분자(예를 들어, CD3γ, CD3δ, CD3ε), ζ 쇄, Lck, Fyn, ZAP-70 등을 동원하는 능력을 보유하는 인간화 T 세포 수용체를 발현한다. TCR 복합체에 동원되는 분자의 비제한적인 목록은 문헌[Janeway's Immunobiology, 상기 참조]에 기재되어 있다. 비인간 동물에서 T 세포 발생 및 T 세포 분화 과정의 진행 및 강력한 면역 반응을 가능하게 하는 능력이 적어도 부분적으로는 내인성 마우스 유전자좌에서의 가변 영역의 배치 및 마우스 불변 도메인의 유지에 기인할 수 있는 것으로 여겨진다.
일부 실시 형태에서, 재배열되지 않은 인간 TCRα 가변 영역 세그먼트를 게놈에 포함하며, 재배열되지 않은 인간 TCRα 가변 영역 세그먼트가 비인간 TCRα 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되어 인간화 TCRα 유전자좌가 생성되는 비인간 동물이 제공된다. 일 실시 형태에서, 인간화 TCRα 유전자좌는 내인성 비인간 TCRα 유전자좌 이외의 게놈 내의 부위에 존재한다. 다른 실시 형태에서, 재배열되지 않은 인간 TCRα 가변 영역 세그먼트는 내인성 비인간 TCRα 불변 영역 유전자 서열(들)을 보유하면서, 내인성 비인간 TCRα 가변 영역 세그먼트를 대체한다. 일 실시 형태에서, 재배열되지 않은 인간 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 비인간 TCRα 가변 유전자좌를 대체한다. 일부 실시 형태에서, 내인성 비인간 TCRα 가변 영역 유전자좌를 재배열되지 않은 인간 TCRα 가변 유전자좌로 치환하는 것은 TCRδ 가변 유전자좌의 결실 또는 불활성화를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 내인성 비인간 TCRα 가변 영역 유전자를 재배열되지 않은 인간 TCRα 유전자좌로 치환하는 것은 내인성 TCRδ 가변 유전자좌를 재배열되지 않은 인간 TCRδ 가변 영역 세그먼트로 치환하는 것을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 동물은 내인성 비인간 TCRβ 가변 영역 및 불변 영역 유전자 서열(들)을 보유한다. 따라서, 동물은 키메라 인간/비인간(즉, 인간화) TCRα 쇄 및 비인간 TCRβ 쇄를 포함하는 TCR을 발현한다.
일부 실시 형태에서, 재배열되지 않은 인간 TCRδ 가변 영역 세그먼트를 게놈에 포함하며, 재배열되지 않은 인간 TCRδ 가변 영역 세그먼트가 비인간 TCRδ 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되어 인간화 TCRδ 유전자좌가 생성되는 비인간 동물이 제공된다. 일 실시 형태에서, 인간화 TCRδ 유전자좌는 내인성 비인간 TCRδ 유전자좌 이외의 게놈 내의 부위에 존재한다. 다른 실시 형태에서, 재배열되지 않은 인간 TCRδ 가변 영역 세그먼트는 내인성 비인간 TCRδ 불변 영역 유전자 서열(들)을 보유하면서, 내인성 비인간 TCRδ 가변 영역 세그먼트를 대체한다. 일 실시 형태에서, 재배열되지 않은 인간 TCRδ 가변 유전자좌는 내인성 비인간 TCRδ 가변 유전자좌를 대체한다.
다른 실시 형태에서, 재배열되지 않은 인간 TCRβ 가변 영역 세그먼트를 게놈에 포함하며, 재배열되지 않은 인간 TCRβ 가변 영역 세그먼트가 비인간 TCRβ 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되어 인간화 TCRβ 유전자좌가 생성되는 비인간 동물이 제공된다. 일 실시 형태에서, 인간화 TCRβ 유전자좌는 내인성 비인간 TCRβ 유전자좌 이외의 게놈 내의 부위에 존재한다. 다른 실시 형태에서, 재배열되지 않은 인간 TCRβ 가변 영역 세그먼트는 내인성 비인간 TCRβ 불변 영역 유전자 서열(들)을 보유하면서, 내인성 비인간 TCRβ 가변 영역 세그먼트를 대체한다. 일 실시 형태에서, 재배열되지 않은 인간 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 비인간 TCRβ 가변 유전자좌를 대체한다. 일부 실시 형태에서, 동물은 내인성 비인간 TCRα 가변 영역 및 불변 영역 유전자 서열(들)을 보유한다. 따라서, 동물은 키메라 인간/비인간(즉, 인간화) TCRβ 쇄 및 비인간 TCRα 쇄를 포함하는 TCR을 발현한다.
일부 특정 실시 형태에서, 본 발명은 게놈에, (a) 내인성 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트) TCRα 불변 유전자 서열(들)에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체(TCR)α 가변 유전자좌, (b) 내인성 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트) TCRβ 불변 영역 유전자 서열(들)에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌, 및/또는 (c) 내인성 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트) TCRδ 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vδ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dδ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jδ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRδ 가변 유전자좌를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트)을 제공한다. 본 명세서에 제공된 다른 비인간 동물은 이의 게놈에, (a) 내인성 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트) TCRα 불변 유전자 서열(들)에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체(TCR)α 가변 유전자좌, (b) 내인성 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트) TCRβ 불변 유전자 서열(들)에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌, (c) 내인성 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트) TCRδ 불변 영역 유전자 서열(들)에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vδ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dδ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jδ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRδ 가변 유전자좌 및/또는 (d) 내인성 비인간 (예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트) TCRγ 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vγ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jγ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRγ 가변 유전자좌를 포함한다.
본 발명의 다양한 실시 형태에서, 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 TCR 가변 유전자좌(예를 들어, TCRα TCRβ 및/또는 TCRδ 가변 유전자좌)는 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트)의 생식세포계열에 포함된다. 다양한 실시 형태에서, TCR V(D)J 세그먼트의 재배열되지 않은 인간 TCR V(D)J 세그먼트(예를 들어, Vα 및 Jα;Vβ 및 Dβ 및 Jβ; Vδ 및 Dδ 및 Jδ; Vγ 및 Jγ 세그먼트)로의 치환은 내인성 비인간 TCR 가변 유전자좌(또는 유전자좌들)에서 일어나며, 여기서 재배열되지 않은 인간 V 및 J 및/또는 V 및 D 및 J 세그먼트는 비인간 TCR 불변 영역 유전자 서열에 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 비인간 동물은 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 TCRα 가변 유전자좌의 2개의 카피, 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 TCRβ 가변 유전자좌의 2개의 카피 및/또는 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 TCRδ 가변 유전자좌의 2개의 카피를 포함한다. 따라서, 비인간 동물은 하나 이상의 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 TCRα, TCRβ 및/또는 TCRδ 가변 유전자좌에 대하여 동형접합성을 나타낸다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 비인간 동물은 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 TCRα 가변 유전자좌의 1개의 카피, 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 TCRβ 가변 유전자좌의 1개의 카피 및/또는 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 TCRδ 가변 유전자좌의 1개의 카피를 포함한다. 따라서, 비인간 동물은 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 TCRα, TCRβ 및/또는 TCRδ 가변 유전자좌에 대하여 이형접합성을 나타낸다. 다른 실시 형태에서, 비인간 동물은 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 TCRγ 가변 유전자좌에 대하여 이형접합성 또는 동형접합성을 나타낸다.
일 실시 형태에서, 인간 가변 영역 세그먼트(예를 들어, 인간 Vα 및 Jα 세그먼트)를 포함하는 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌는 인간 가변 영역 세그먼트가 대응하는 비인간 가변 영역 세그먼트를 대체하도록 비인간 게놈에 위치한다. 일 실시 형태에서, 인간 가변 영역 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 TCRα 가변 유전자좌를 대체한다. 한 측면에서, 내인성 비인간 Vα 및 Jα 세그먼트는 재배열되어 재배열된 Vα/Jα 서열을 형성할 수 없다. 따라서, 한 측면에서, 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌의 인간 Vα 및 Jα 세그먼트는 재배열되어 재배열된 인간 Vα/Jα 서열을 형성할 수 없다.
유사하게, 일 실시 형태에서, 인간 가변 영역 세그먼트(예를 들어, 인간 Vβ, Dβ 및 Jβ 세그먼트)를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌는 인간 가변 영역 세그먼트가 대응하는 비인간 가변 영역 세그먼트를 대체하도록 비인간 게놈에 위치한다. 일 실시 형태에서, 인간 가변 영역 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 TCRβ 가변 유전자좌를 대체한다. 한 측면에서, 내인성 비인간 Vβ, Dβ 및 Jβ 세그먼트는 재배열되어 재배열된 Vβ/Dβ/Jβ 서열을 형성할 수 없다. 따라서, 한 측면에서, 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌의 인간 Vβ, Dβ 및 Jβ 세그먼트는 재배열되어 재배열된 인간 Vβ/Dβ/Jβ 서열을 형성할 수 있다.
일 실시 형태에서, 인간 가변 영역 세그먼트(예를 들어, 인간 Vδ, Dδ 및 Jδ 세그먼트)를 포함하는 재배열되지 않은 TCRδ 가변 유전자좌는 인간 가변 영역 세그먼트가 대응하는 비인간 가변 영역 세그먼트를 대체하도록 비인간 게놈에 위치한다. 일 실시 형태에서, 인간 가변 영역 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRδ 가변 유전자좌는 내인성 TCRδ 가변 유전자좌를 대체한다. 한 측면에서, 내인성 비인간 Vδ, Dδ 및 Jδ 세그먼트는 재배열되어 재배열된 Vδ/Dδ/Jδ 서열을 형성할 수 없다. 따라서, 한 측면에서, 재배열되지 않은 TCRδ 가변 유전자좌의 인간 Vδ, Dδ 및 Jδ 세그먼트는 재배열되어 재배열된 인간 Vδ/Dδ/Jδ 서열을 형성할 수 있다.
일 실시 형태에서, 인간 가변 영역 세그먼트(예를 들어, 인간 Vγ 및 Jγ 세그먼트)를 포함하는 재배열되지 않은 TCRγ 가변 유전자좌는 인간 가변 영역 세그먼트가 대응하는 비인간 가변 영역 세그먼트를 대체하도록 비인간 게놈에 위치한다. 일 실시 형태에서, 인간 가변 영역 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRγ 가변 유전자좌는 내인성 TCRγ 가변 유전자좌를 대체한다. 한 측면에서, 내인성 비인간 Vα 및 Jα 세그먼트는 재배열되어 재배열된 Vγ/Jγ 서열을 형성할 수 없다. 따라서, 한 측면에서, 재배열되지 않은 TCRγ 가변 유전자좌의 인간 Vγ 및 Jγ 세그먼트는 재배열되어 재배열된 인간 Vγ/Jγ 서열을 형성할 수 있다.
또 다른 실시 형태에서, 인간 가변 영역 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRα, β, δ 및/또는 γ 가변 유전자좌는 각각의 내인성 TCRα, β, δ 및 γ 가변 유전자좌를 대체한다. 한 측면에서, 내인성 비인간 Vα 및 Jα 세그먼트는 재배열되어 재배열된 Vα/Jα 서열을 형성할 수 없고, 내인성 비인간 Vβ, Dβ 및 Jβ 세그먼트는 배배열되어 재배열된 Vβ/Dβ/Jβ 서열을 형성할 수 없으며, 내인성 Vδ, Dδ 및 Jδ 세그먼트는 재배열되어 재배열된 Vδ/Dδ/Jδ 서열을 형성할 수 없고/없거나, 내인성 비인간 Vγ 및 Jγ 세그먼트는 재배열되어 재배열된 Vγ /Jγ 서열을 형성할 수 없다. 따라서, 한 측면에서, 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌의 인간 Vα 및 Jα 세그먼트는 재배열되어 재배열된 인간 Vα/Jα 서열을 형성할 수 있고, 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌의 인간 Vβ, Dβ 및 Jβ 세그먼트는 재배열되어 재배열된 인간 Vβ/Dβ/Jβ 서열을 형성할 수 있으며, 재배열되지 않은 TCRδ 가변 유전자좌의 인간 Vδ, Dδ 및 Jδ 세그먼트는 재배열되어 재배열된 인간 Vδ/Dδ/Jδ 서열을 형성할 수 있고/있거나, 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌의 인간 Vγ 및 Jγ 세그먼트는 재배열되어 재배열된 인간 Vγ/Jγ 서열을 형성할 수 있다.
본 발명의 일부 측면에서, 인간화 TCRα, TCRβ 및/또는 TCR δ 유전자좌를 포함하는(재배열되지 않은 인간 TCRα, TCRβ 및/또는 TCR δ 가변 유전자좌를 포함하는) 비인간 동물은 내인성 비인간 TCRα TCRβ 및/또는 TCRδ 가변 유전자좌를 보유한다. 일 실시 형태에서, 내인성 비인간 TCRα, TCRβ 및/또는 TCRδ 가변 유전자좌는 비기능적 유전자좌이다. 일 실시 형태에서, 비기능적 유전자좌는 불활성화 유전자좌, 예를 들어 역위 유전자좌이다(예를 들어, 가변 유전자좌의 코딩 핵산 서열은 불변 영역 서열에 대하여 역방향이므로, 역위 유전자좌로부터의 가변 영역 세그먼트를 사용하여 성공적인 재배열을 할 수 없음). 일 실시 형태에서, 인간화 TCRα, TCRβ 및/또는 TCR δ 가변 유전자좌는 각각, 내인성 비인간 TCRα, TCRβ 및/또는 TCRδ 가변 유전자좌와, 내인성 비인간 TCRα, TCRβ 및/또는 TCRδ 불변 유전자좌 사이에 위치한다. 유사한 염색체 배열이 인간 또는 인간화 TCRγ를 비인간 동물의 게놈에, 예를 들어 TCRγ 유전자좌에 배치시키기 위해 이루어질 수 있다.
인간 및 마우스 TCR 유전자좌의 V 및 J 및/또는 V, D 및 J 세그먼트의 수, 명명법, 위치 및 기타 측면은 IMGT(the International Immunogenetics Information System)의 웹사이트에서 이용할 수 있는 IMGT 데이터베이스를 사용하여 확인될 수 있다. 마우스 TCRα 가변 유전자좌는 약 1.5 메가염기쌍이며, 총 110개의 Vα 및 60개의 Jα 세그먼트를 포함한다. 인간 TCRα 가변 유전자좌는 약 1 메가염기쌍이며, 총 54개의 Vα 및 61개의 Jα 세그먼트를 포함하며, 45개의 Vα 및 50개의 Jα가 기능적인 것으로 추정된다. 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서 전반에 걸쳐서 언급된 인간 V(D)J 세그먼트의 수는 V(D)J 세그먼트의 총수를 나타낸다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 유전자 변형 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트)는 적어도 하나의 인간 Vα 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함한다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 48, 50 또는 54개 이하의 인간 Vα 세그먼트를 포함하는 인간화 TCRα 유전자좌를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간화 TCRα 유전자좌는 2, 8, 23, 35, 48 또는 54개의 인간 Vα 세그먼트를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 비인간 동물의 인간화 TCRα 유전자좌는 인간 Vα 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% 또는 100%를 포함할 수 있고; 일부 실시 형태에서, 인간 Vα 약 2%, 약 3%, 약 15%, 약 65%, 약 90% 또는 100%를 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간 Vα40 내지 Vα41(Vα 세그먼트는 "TRAV" 또는 "TCRAV"로도 지칭됨)의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편 및 61개의 인간 Jα 세그먼트(Jα 세그먼트는 "TRAJ" 또는 "TCRAJ"로도 지칭됨)의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편을 포함하는 인간화 TCRα 유전자좌를 포함한다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간 TRAV35 내지 TRAV41의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편 및 61개의 인간 TRAJ의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편을 포함하는 인간화 TCRα 유전자좌를 포함한다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간 TRAV22 내지 TRAV41의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편 및 61개의 인간 TRAJ의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편을 포함하는 인간화 TCRα 유전자좌를 포함한다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간 TRAV13-2 내지 TRAV41의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편 및 61개의 인간 TRAJ의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편을 포함하는 인간화 TCRα 유전자좌를 포함한다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간 TRAV6 내지 TRAV41 및 61개의 인간 TRAJ의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편을 포함하는 인간화 TCRα 유전자좌를 포함한다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간 TRAV1-1 내지 TRAV 41 및 61개의 인간 TRAJ의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편을 포함하는 인간화 TCRα 유전자좌를 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 인간 TCRα 가변 영역 세그먼트의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편은 또한 제한효소 부위, 선택 카세트, 엔도뉴클레아제 부위, 또는 유전자좌 인간화 과정 시에 클로닝 및 선택을 용이하게 하도록 삽입된 다른 부위를 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 이러한 추가 부위는 TCRα 유전자좌에서의 다양한 유전자의 적절한 기능성화(예를 들어, 재배열, 스플라이싱 등)를 방해하지 않는다.
일 실시 형태에서, 인간화 TCRα 유전자좌는 61개의 인간 Jα 세그먼트 또는 100%의 인간 Jα 세그먼트를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 인간화 TCRα 유전자좌는 8개의 인간 Vα 세그먼트 및 61개의 인간 Jα 세그먼트를 포함하며; 다른 특정 실시 형태에서, 인간화 TCRα 유전자좌는 23개의 인간 Vα 세그먼트 및 61개의 인간 Jα 세그먼트를 포함한다. 다른 특정 실시 형태에서, 인간화 TCRα 유전자좌는 인간 Vα 및 Jα 세그먼트의 완전한 레퍼토리, 즉, α 유전자좌에 의해 코딩되는 모든 인간 가변 α 영역 유전자 단편, 또는 54개의 인간 Vα 및 61개의 인간 Jα 세그먼트를 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 비인간 동물은 TCRα 유전자좌에 내인성 비인간 Vα 또는 Jα 세그먼트를 포함하지 않는다.
마우스 TCRβ 가변 유전자좌는 약 0.6 메가염기쌍이며, 총 33개의 Vβ, 2개의 Dβ 및 14개의 Jβ 세그먼트를 포함한다. 인간 TCRβ 가변 유전자좌는 약 0.6 메가염기쌍이며, 총 67개의 Vβ, 2개의 Dβ 및 14개의 Jβ 세그먼트를 포함한다. 본 발명의 일 실시 형태에서, 유전자 변형 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트)은 적어도 하나의 인간 Vβ, 적어도 하나의 인간 Dβ 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함한다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 48, 50, 55, 60 또는 67개 이하의 인간 Vβ 세그먼트를 포함하는 인간화 TCRβ 유전자좌를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간화 TCRβ 유전자좌는 8, 14, 40, 66 또는 67개의 인간 Vβ 세그먼트를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 비인간 동물의 인간화 TCRβ 유전자좌는 인간 Vβ 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% 또는 100%를 포함할 수 있고; 일부 실시 형태에서, 인간 Vβ 약 20%, 약 60%, 약 15%, 약 98% 또는 100%를 포함할 수 있다.
일 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간 Vβ18 내지 Vβ29-1(Vβ 세그먼트는 "TRBV" 또는 "TCRBV"로도 지칭됨)의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편을 포함하는 인간화 TCRβ 유전자좌를 포함한다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간 TRBV18 내지 TRBV29-1의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편, 인간 Dβ1-Jβ1(즉, 인간 Dβ1-Jβ1-1-Jβ1-6 세그먼트)의 인접한 인간 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편 및 인간 Dβ2-Jβ2(즉, 인간 Dβ2-Jβ2-1-Jβ2-7 세그먼트)의 인접한 인간 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편을 포함하는 인간화 TCRβ 유전자좌를 포함한다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간 TRBV6-5 내지 TRBV29-1의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편, 인간 Dβ1-Jβ1(즉, 인간 Dβ1-Jβ1-1-Jβ1-6 세그먼트)의 인접한 인간 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편 및 인간 Dβ2-Jβ2(즉, 인간 Dβ2-Jβ2-1-Jβ2-7 세그먼트)의 인접한 인간 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편을 포함하는 인간화 TCRβ 유전자좌를 포함한다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간 TRBV1 내지 TRBV29-1의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편, 인간 Dβ1-Jβ1의 인접한 인간 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편 및 인간 Dβ2-Jβ2의 인접한 인간 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편을 포함하는 인간화 TCRβ 유전자좌를 포함한다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간 TRBV1 내지 TRBV29-1의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편, 인간 Dβ1-Jβ1의 인접한 인간 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편, 인간 Dβ2-Jβ2의 인접한 인간 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편 및 인간 TRBV30의 서열을 포함하는 분리된 DNA 단편을 포함하는 인간화 TCRβ 유전자좌를 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 인간 TCRβ 가변 영역 세그먼트의 인접한 인간 서열을 포함하는 DNA 단편은 또한 제한효소 부위, 선택 카세트, 엔도뉴클레아제 부위, 또는 유전자좌 인간화 과정 시에 클로닝 및 선택을 용이하게 하도록 삽입된 다른 부위를 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 이러한 추가 부위는 TCRβ 유전자좌에서의 다양한 유전자의 적절한 기능성화(예를 들어, 재배열, 스플라이싱 등)를 방해하지 않는다.
일 실시 형태에서, 인간화 TCRβ 유전자좌는 14개의 인간 Jβ 세그먼트 또는 100%의 인간 Jβ 세그먼트, 및 2개의 인간 Dβ 세그먼트 또는 100%의 인간 Jβ 세그먼트를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 인간화 TCRβ 유전자좌는 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 예를 들어 14개의 인간 Vβ 세그먼트, 및 모든 마우스 Dβ 및 Jβ 세그먼트를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 인간화 TCRβ 유전자좌는 14개의 인간 Vβ 세그먼트, 2개의 인간 Dβ 세그먼트 및 14개의 인간 Jβ 세그먼트를 포함한다. 다른 특정 실시 형태에서, 인간화 TCRβ 유전자좌는 인간 Vβ, Dβ 및 Jβ 세그먼트의 완전한 레퍼토리, 즉, β 유전자좌에 의해 코딩되는 모든 인간 가변 β 영역 유전자 단편, 또는 67개의 인간 Vβ, 2개의 인간 Dβ 및 14개의 인간 Jβ 세그먼트를 포함한다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 인간화 TCRβ 유전자좌에 1개의(예를 들어, 5') 비인간 Vβ 세그먼트를 포함한다. 다양한 실시 형태에서, 비인간 동물은 TCRβ 유전자좌에 어떠한 내인성 비인간 Vβ, Dβ 또는 Jβ 세그먼트도 포함하지 않는다.
다양한 실시 형태에서, 비인간 동물(예를 들어, 설치류)은 인간 TCRα 및 TCRβ(및 임의로 인간 TCRδ 및 TCRγ) 가변 영역 세그먼트의 레퍼토리(예를 들어, 가변 영역 세그먼트의 완전한 레퍼토리)를 포함하며, 다양한 세그먼트의 레퍼토리(예를 들어, 다양한 세그먼트의 완전한 레퍼토리)는 다양한 항원에 대한 TCR 분자의 다양한 레퍼토리를 생성하기 위해 동물에 의해 이용된다.
다양한 측면에서, 비인간 동물은 재배열되지 않은 인간 게놈 가변 유전자좌에서와 같이 배열된 V, D 및 J, 또는 D 및 J, 또는 V 및 J, 또는 V 세그먼트, 예를 들어 인간 게놈 TCR 가변 유전자좌에서와 같이 배열된 프로모터 서열, 리더 서열, 유전자간 서열, 조절 서열 등을 포함하는 인간 게놈 TCR 가변 유전자좌의 인접한 부분을 포함한다. 다른 측면에서, 다양한 세그먼트는 재배열되지 않은 비인간 게놈 TCR 가변 유전자좌에서와 같이 배열된다. 인간화 TCRα,β, δ 및/또는 γ 유전자좌의 다양한 실시 형태에서, 인간화 유전자좌는 병치된 인간 게놈에 나타나지 않는 2개 이상의 인간 게놈 세그먼트, 예를 들어 인간 가변 유전자좌의 상류 말단의 인간 게놈에 위치하는 인간 가변 유전자좌의 V 세그먼트의 단편과 병치된, 불변 영역에 인접한 인간 게놈에 위치하는 인간 가변 유전자좌의 V 세그먼트의 단편을 포함할 수 있다.
마우스 및 인간 모두에서, TCRδ 유전자 단편은 TCRα 유전자좌에 위치한다(도 4a, 상단, 박스로 된 TCRD 영역 참조). TCRδ J 및 D 세그먼트는 Vα와 Jα 세그먼트 사이에 위치하는 반면에, TCRδ V 세그먼트는 TCRα 유전자좌 전체에 산재되어 있으며, 대다수는 다양한 Vα 세그먼트 사이에 위치한다. 다양한 TCRδ 세그먼트의 수와 위치는 IMGT 데이터베이스로 결정될 수 있다. TCRα 유전자좌 내의 TCRδ 유전자 단편의 게놈 배열로 인해, TCRα 유전자좌에서의 성공적인 재배열로, TCRδ 유전자 단편이 결실되거나 불활성화될 수 있다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 재배열되지 않은 인간 TCRα 가변 유전자좌를 포함하는 비인간 동물은 또한 적어도 하나의 인간 Vδ 세그먼트, 예를 들어 최대로 인간 Vδ 세그먼트의 완전한 레퍼토리를 포함한다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 내인성 TCRα 가변 유전자좌의 치환에 의해, 적어도 하나의 비인간 Vδ 세그먼트가 인간 Vδ 세그먼트로 치환된다. 다른 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 재배열되지 않은 인간화 TCRα 유전자좌에 인간 Vδ, Dδ 및 Jδ 세그먼트의 완전한 레퍼토리를 포함하며; 또 다른 실시 형태에서, 비인간 동물은 재배열되지 않은 인간화 TCRα 유전자좌(즉, 인간 가변 영역 세그먼트뿐만 아니라, 인간 인핸서 및 불변 영역도 포함하는 TCRδ 유전자좌)에 완전한 재배열되지 않은 인간 TCRδ 유전자좌를 포함한다. 완전한 재배열되지 않은 TCRδ 유전자좌를 포함하는 재배열되지 않은 인간화 TCRα 유전자좌를 작제하기 위한 예시적인 실시 형태는 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제9,113,616호에 기재되어 있다.
또 다른 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물은 재배열되지 않은 인간화 TCRγ 유전자좌, 예를 들어 적어도 하나의 인간 Vγ 및 적어도 하나의 인간 Jγ 세그먼트(예를 들어, 인간 Vγ 및 인간 Jγ 가변 영역 세그먼트의 완전한 레퍼토리)를 포함하는 TCRγ 유전자좌를 추가로 포함한다. 인간 TCRγ 유전자좌는 인간 염색체 7 상에 존재하는 반면에, 마우스 TCRγ 유전자좌는 마우스 염색체 13 상에 존재한다. TCRγ 유전자좌에 대한 보다 상세한 사항은 IMGT 데이터베이스를 참조한다.
한 측면에서, 본 명세서에 기재된 인간화 TCRα 및 β 가변 유전자좌(및 임의로, 인간화 TCRδ/γ 가변 유전자좌)를 포함하는 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트)은 T 세포 표면에, 인간 가변 영역 및 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트) 불변 영역을 포함하는 인간화 T 세포 수용체를 발현한다. 일부 측면에서, 비인간 동물은 다양한 제시된 항원을 인식하는 인간화 T 세포 수용체의 다양한 레퍼토리를 발현하거나 발현할 수 있다.
본 발명의 다양한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 인간화 T 세포 수용체 폴리펩타이드는 인간 리더 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 인간화 TCR 수용체 핵산 서열은 인간화 TCR 폴리펩타이드가 비인간 리더 서열을 포함하도록 조작된다.
본 명세서에 기재된 인간화 TCR 폴리펩타이드는 내인성 비인간 조절 요소(예를 들어, 설치류 조절 요소), 예를 들어 프로모터, 사일런서, 인핸서 등의 제어 하에 발현될 수 있다. 본 명세서에 기재된 인간화 TCR 폴리펩타이드는 선택적으로 인간 조절 요소의 제어 하에 발현될 수 있다. 다양한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 인간 게놈에서 원위치에 통상 발견되는 모든 조절 및 다른 서열을 추가로 포함한다.
다양한 실시 형태에서, 인간화 TCR 단백질의 인간 가변 영역은 동일한 세포 또는 다른 세포의 표면의 다양한 단백질과 상호작용할 수 있다. 일 실시 형태에서, 인간화 TCR의 인간 가변 영역은 제2 세포, 예를 들어 항원 제시 세포(APC)의 표면에 항원을 제시하는 MHC 단백질(예를 들어, MHC 클래스 I 또는 II 단백질)과 상호작용한다. 일부 실시 형태에서, MHC I 또는 II 단백질은 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트) 단백질이다. 다른 실시 형태에서, MHC I 또는 II 단백질은 인간(화) 단백질이다. 한 측면에서, 제2 세포, 예를 들어 APC는 인간 또는 인간화 MHC 분자를 발현하는 내인성 비인간 세포이다. 다른 실시 형태에서, 제2 세포는 인간 MHC 분자를 발현하는 인간 세포이다.
한 측면에서, 비인간 동물은 T 세포 표면에, 비인간 불변 영역을 갖는 인간화 T 세포 수용체를 발현하며, 상기 수용체는 비인간 분자, 예를 들어 T 세포에서 발현된 앵커 또는 시그널 전달 분자(예를 들어, CD3 분자, ζ 쇄, 또는 CD3 분자 또는 ζ 쇄를 통해 TCR에 고정된 기타 단백질)와 상호작용할 수 있다. 따라서, 한 측면에서, (a) (i) 본 명세서에 기재된 인간화 TCRα 쇄 및 본 명세서에 기재된 인간화 TCRβ 쇄를 포함하는 TCR 및 (ii) 본 명세서에 기재된 키메라 보조 수용체를 발현하는 비인간 T 세포 및 (b) 본 명세서에 기재된 키메라 MHC I 및/또는 키메라 MHC II에 결합된 항원을 포함하는 비인간 항원 제시 세포를 포함하는 세포 복합체가 제공된다. 일 실시 형태에서, 비인간 불변 TCRα 및 TCRβ 쇄는 비인간 제타(ζ) 쇄 동종이량체 및 CD3 이종이량체와 복합체를 형성한다. 일 실시 형태에서, 상기 세포 복합체는 생체 내 세포 복합체이다. 일 실시 형태에서, 상기 세포 복합체는 시험관 내 세포 복합체이다.
다양한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트)은 DN1으로부터 DN2, DN3, DN4, DP까지, 그리고 CD4 또는 CD8 SP T 세포까지 진행하는 흉선 발달을 거칠 수 있는 T 세포를 생산한다. 본 발명의 비인간 동물의 이러한 T 세포는 흉선 발달의 특정 단계 시에 T 세포에 의해 통상적으로 생산되는 세포 표면 분자(예를 들어, CD25, CD44, Kit, CD3, pTα 등)을 발현한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 흉선 발달의 DN3 단계에서, TCRβ와 복합체를 형성한 pTα를 발현할 수 있다. 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 흉선 발달을 거쳐 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 생산할 수 있는 T 세포를 발현한다.
다양한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 말초에서 T 세포 분화를 거칠 수 있는 T 세포를 생산한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 이펙터 T 세포, 예를 들어 CTL(세포독성 T 림프구), TH1, TH2, TREG, TH17 등의 레퍼토리를 생산할 수 있다. 따라서, 이들 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 특정한 T 세포형에 전형적인 다양한 기능을 수행하는, 예를 들어 외부 항원을 인식하고, 이에 결합하여, 이에 반응하는 이펙터 T 세포를 생산한다. 다양한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 MHC I 분자와 관련하여 발현되는 세포질 병원체의 펩타이드 단편을 나타내는 세포를 사멸하고; 세포내 소포에서 분해되고 MHC II 분자에 의해 대식세포 표면에 제시된 항원으로부터 유래된 펩타이드를 인식하여, 대식세포가 미생물을 사멸하도록 유도하고; B 세포 분화를 촉진시키는 사이토카인을 생산하고; B 세포를 활성화시켜 옵소닌 항체(opsonizing antibody)를 생산하고; 호중구를 감염 부위에 동원하는 케모카인을 상피 세포가 생산하도록 유도하는 등을 행하는 이펙터 T 세포를 생산한다.
추가의 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 말초, 예를 들어 비장에 CD3+ T 세포를 포함한다. 다른 측면에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 목적하는 항원에 반응하여 기억 T 세포 집단을 생산할 수 있다. 예를 들어, 비인간 동물은 항원, 예를 들어 목적하는 항원(예를 들어, 백신 개발 등을 위해 시험된 항원)에 대한 중심 기억 T 세포(Tcm)와 이펙터 기억 T 세포(Tem) 둘 다를 생산한다.
충분한 신호(예를 들면, 노치 신호)를 수신하지 못하는 DN1 및 DN2 세포는 B 세포, 골수 세포(예를 들면, 수지상 세포), 비만 세포 및 NK 세포로 발달할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Yashiro-Ohtani et al. (2010) Notch regulation of early thymocyte development, Seminars in Immunology 22:261-69]을 참조한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 B 세포, 골수 세포(예를 들어, 수지상 세포), 비만 세포 및 NK 세포를 발달시킨다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 흉선에서 수지상 세포 집단을 발달시킨다.
T 세포의 표면에서 발현되는 T 세포 수용체의 우세형은 TCRα/β이고, 상기 세포의 소수는 TCRδ/γ를 발현한다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 인간화 TCRα 및/또는 β 유전자좌를 포함하는 비인간 동물의 T 세포는 TCRα/β 및 TCRδ/γ 유전자좌의 이용, 예를 들어 야생형 동물과 유사한 TCRα/β 및 TCRδ/γ 유전자좌의 이용을 나타낸다(예를 들어, 본 명세서에 기재된 비인간 동물의 T 세포는 야생형 동물에 의해 발현되는 것에 상당하는 비율로 TCRα/β 및 TCRδ/γ 단백질을 발현한다). 따라서, 일부 실시 형태에서, 인간화 TCRα/β 및 내인성 비인간 TCRδ/γ 유전자좌를 포함하는 비인간 동물은 모든 유전자좌의 이용을 나타낸다.
인간 또는 인간화 MHC 분자
다양한 실시 형태에서, 적어도 하나의 인간화 T 세포 보조 수용체, 인간화 T 세포 보조 수용체와 결합하는 적어도 하나의 인간화 MHC, 및 임의로, 인간화 MHC에 의해 제시된 펩타이드의 인식 및 결합 시에, 인간화 보조 수용체와 함께, 인간화 TCR 및 키메라 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드를 발현하는 세포에 활성화 신호를 제공하는 인간화 TCR을 공발현하는 유전자 변형 비인간 동물이 제공된다. 따라서, 본 명세서에 개시된 비인간 동물은 각각 인간 또는 인간화 MHC II α 폴리펩타이드, 인간 또는 인간화 MHC II β 폴리펩타이드, 및 인간 또는 인간화 MHC I α 폴리펩타이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 상이한 인간 또는 인간화 MHC 폴리펩타이드를 코딩하는 제1, 제2, 및/또는 제3 핵산 서열 중 적어도 하나를 포함하며; 상기 비인간 동물은 또한 임의로 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 포함한다. 본 명세서에서의 제1, 제2, 제3 명칭의 사용은 본 명세서에 개시된 비인간 동물을 임의의 특정 순서로 모든 세가지의 핵산 서열, 또는 인간 또는 인간화 MHC 폴리펩타이드 중 어느 하나의 존재를 필요로 하는 것으로서 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
따라서, 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 비인간 동물은 예를 들어, 예컨대 인간 또는 키메라 CD8α 폴리펩타이드 및 인간 또는 키메라 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열, 비인간 TCRα 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체(TCR)α 가변 유전자좌 및/또는 비인간 TCRβ 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌, 및 임의로, 예를 들어 인간 또는 인간화 MHC I α 폴리펩타이드 및 인간 또는 인간화 β2-마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 및 제2 핵산 서열을 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 비인간 동물은 예를 들어, 예컨대 키메라 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열; 비인간 TCRα 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체(TCR)α 가변 유전자좌 및/또는 비인간 TCRβ 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌; 및 임의로, 예를 들어 인간 또는 인간화 MHC II α 폴리펩타이드 및 인간 또는 인간화 MHC II β 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 및 제2 핵산 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 비인간 동물은 예를 들어, 예컨대, 키메라 CD4 폴리펩타이드, 키메라 CD8α 폴리펩타이드 및 키메라 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열; 비인간 TCRα 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체(TCR)α 가변 유전자좌 및/또는 비인간 TCRβ 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌; 및 임의로, 예를 들어 인간 또는 인간화 MHC II α 폴리펩타이드, 인간 또는 인간화 MHC II β 폴리펩타이드, 인간 또는 인간화 MHC I α 폴리펩타이드, 및 인간 또는 인간화 β2-마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 제1, 제2, 제3 및 제4 핵산 서열을 포함할 수 있다.
다양한 실시 형태에서, 인간 또는 인간화 MHC I 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열 및/또는 인간 또는 인간화 MHC II 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 게놈에 포함하는 유전자 변형 비인간 동물, 예를 들어 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트)가 본 명세서에 제공된다. MHC I 핵산 서열은 부분적으로 인간이면서 부분적으로 비인간인 MHC I 폴리펩타이드, 예를 들어 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드를 코딩할 수 있으며, MHC II 핵산 서열은 부분적으로 인간이면서 부분적으로 비인간인 MHC II 단백질, 예를 들어 키메라 인간/비인간 MHC II 단백질(예를 들어, 키메라 인간/비인간 MHC II α 및 β 폴리펩타이드를 포함함)을 코딩할 수 있다. 일부 측면에서, 상기 동물은 내인성 MHC I 및/또는 내인성 MHC II 폴리펩타이드, 예를 들어, 기능적 내인성 MHC I 및/또는 MHC II 폴리펩타이드를 세포 표면에 발현하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 동물의 세포 표면에 발현된 유일한 MHC I 및/또는 MHC II 분자는 키메라 MHC I 및/또는 MHC II 분자이다.
키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 게놈, 예를 들어 내인성 유전자좌에 포함하는 유전자 변형 비인간 동물이 본 명세서에 전체적으로 참조로 포함되는 미국 특허 공개 제20130111617호 및 제20130185819호에 개시되어 있다. 인간화, 예를 들어 키메라 인간/비인간 MHC II 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 게놈, 예를 들어 내인성 유전자좌에 포함하는 유전자 변형 비인간 동물이 각각, 본 명세서에 전체적으로 참조로 포함되는 미국 특허 제8,847,005호 및 미국 특허 공개 제20130185820호에 개시되어 있다. 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 게놈에, 예를 들어 내인성 유전자좌에 포함하고, 인간화, 예를 들어 키메라 인간/비인간 MHC II 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 게놈에, 예를 들어 내인성 유전자좌에 포함하는 유전자 변형 비인간 동물이 본 명세서에 전체적으로 참조로 포함되는 미국 특허 공개 제20140245467호에 개시되어 있다.
다양한 실시 형태에서, 게놈, 예를 들어 하나 이상의 내인성 MHC 유전자좌에, 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 핵산 서열 - 여기서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어, 하나 이상의 세포외 도메인)을 포함함 -; 키메라 인간/비인간 MHC II α 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 핵산 서열 - 여기서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어, 하나 이상의 세포외 도메인)을 포함함 -; 및/또는 키메라 인간/비인간 MHC II β 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 핵산 서열 - 여기서, 키메라 MHC II β 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어, 하나 이상의 세포외 도메인)을 포함함 - 을 포함하며; 내인성 비인간 MHC 유전자좌로부터 기능적 키메라 인간/비인간 MHC I 및 MHC II 단백질을 발현시키는 유전자 변형 비인간 동물이 본 명세서에 제공된다. 일 실시 형태에서, 제1, 제2, 및/또는 제3 핵산 서열은 각각, 내인성 비인간 MHC I, MHC II α 및 MHC II β 유전자좌에 위치한다. 일 실시 형태에서, 상기 비인간 동물은 마우스이며, 제1, 제2, 및/또는 제3 핵산 서열은 마우스 염색체 17 상의 내인성 마우스 MHC 유전자좌에 위치한다. 일 실시 형태에서, 제1 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC I 유전자좌에 위치한다. 일 실시 형태에서, 제2 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II α 유전자좌에 위치한다. 일 실시 형태에서, 제3 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II β 유전자좌에 위치한다.
일 실시 형태에서, 비인간 동물은 내인성 비인간 MHC 유전자좌로부터 다만 키메라 인간/비인간 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC β II 폴리펩타이드를 발현하며, 내인성 비인간 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, 기능적 내인성 MHC I, II α 및/또는 II β 폴리펩타이드)를 발현하지 않는다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 동물은 기능적 키메라 MHC I 및 기능적 키메라 MHC II를 세포, 예를 들어 항원 제시 세포 등의 표면에 발현한다. 일 실시 형태에서, 동물에 의해 세포 표면에 발현된 유일한 MHC I 및 MHC II는 키메라 MHC I 및 키메라 MHC II이며, 동물은 어떠한 내인성 MHC I 및 MHC II도 세포 표면에 발현하지 않는다.
일 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드는 이의 인간 부분에, 예를 들어 인간 MHC I 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 틈을 포함한다. 한 측면에서, 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC I의 세포외 부분을 포함한다. 이러한 실시 형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC I의 α 쇄의 세포외 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC I의 α1 및 α2 도메인을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC I의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함한다.
한 측면에서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드의 인간 부분 및/또는 키메라 MHC II β 폴리펩타이드의 인간 부분은 각각, 인간 MHC II α 폴리펩타이드 및/또는 인간 MHC II β 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 도메인을 포함한다. 한 측면에서, 키메라 MHC II α 및/또는 β 폴리펩타이드의 인간 부분은 각각, 인간 MHC II α 및/또는 β 폴리펩타이드의 세포외 부분을 포함한다. 일 실시 형태에서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC II α 폴리펩타이드의 α1 도메인을 포함하며; 다른 실시 형태에서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC II α 폴리펩타이드의 α1 및 α2 도메인을 포함한다. 추가의 실시 형태에서, 키메라 MHC II β 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC II β 폴리펩타이드의 β1 도메인을 포함하며; 다른 실시 형태에서, 키메라 MHC II β 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC II β 폴리펩타이드의 β1 및 β2 도메인을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 인간 또는 인간화 MHC I 폴리펩타이드는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F 또는 HLA-G 유전자좌 중 어느 하나에 의해 코딩되는 기능적 인간 HLA 분자로부터 유래될 수 있다. 인간 또는 인간화 MHC II 폴리펩타이드는 HLA-DP, -DQ 및 -DR 유전자좌 중 어느 하나에 의해 코딩되는 기능적 인간 HLA 분자로터 유래될 수 있다. 통상 사용되는 HLA 항원 및 대립유전자의 목록은 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Shankarkumar et al. ((2004) The Human Leukocyte Antigen (HLA) System, Int. J. Hum. Genet. 4(2):91-103)]에 기재되어 있다. 샨카르쿠마르(Shankarkumar) 등은 또한 당업계에서 사용된 HLA 명명법에 대한 간략한 설명을 제시하고 있다. HLA 명명법 및 다양한 HLA 대립유전자에 관한 추가 정보는 문헌[Holdsworth et al. (2009) The HLA dictionary 2008: a summary of HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, and DQB1 alleles and their association with serologically defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens, Tissue Antigens 73:95-170], 및 최신 업데이트된 문헌[Marsh et al. (2010) Nomenclature for factors of the HLA system, 2010, Tissue Antigens 75:291-455]에서 발견될 수 있으며, 둘 다 본 명세서에 참조로 포함된다. 일부 실시 형태에서, MHC I 또는 MHC II 폴리펩타이드는 임의의 기능적 인간 HLA-A, B, C, DR 또는 DQ 분자로부터 유래될 수 있다. 따라서, 인간 또는 인간화 MHC I 및/또는 II 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 임의의 기능적 인간 HLA 분자로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면에 발현되는 모든 MHC I 및 MHC II 폴리펩타이드는 인간 HLA 분자로부터 유래된 부분을 포함한다.
특히 대상으로 하는 것은 다수의 인간 질환, 예를 들어 인간 자가면역질환과 관련된 것으로 알려진 인간 HLA 분자, 특이적 다형성 HLA 대립유전자이다. 실제로, 류머티스성 관절염, 1형 당뇨병, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 그레이브스병(Graves' disease), 전신성 홍반성 루프스, 셀리악병, 크론병, 궤양성 대장염 및 다른 자가면역질환의 발생과 관련이 있는 HLA 유전자좌의 특이적 다형성이 확인되었다. 예를 들어, 문헌[Wong and Wen (2004) What can the HLA transgenic mouse tell us about autoimmune diabetes?, Diabetologia 47:1476-87; Taneja and David (1998) HLA Transgenic Mice as Humanized Mouse Models of Disease and Immunity, J. Clin. Invest. 101:921-26; Bakker et al. (2006), A high-resolution HLA and SNP haplotype map for disease association studies in the extended human MHC, Nature Genetics 38:1166-72 and Supplementary Information; and International MHC and Autoimmunity Genetics Network (2009) Mapping of multiple susceptibility variants within the MHC region for 7 immune-mediated diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106:18680-85]을 참조한다. 따라서, 인간 또는 인간화 MHC I 및/또는 II 폴리펩타이드는 특정 질환, 예를 들어 자가면역질환과 관련된 것으로 알려진 인간 HLA 분자로부터 유래될 수 있다.
하나의 특정 측면에서, 인간 또는 인간화 MHC I 폴리펩타이드는 인간 HLA-A로부터 유래된다. 특정 실시 형태에서, HLA-A 폴리펩타이드는 HLA-A2 폴리펩타이드(예를 들어, HLA-A2.1 폴리펩타이드)이다. 일 실시 형태에서, HLA-A 폴리펩타이드는 HLA-A*0201 대립유전자, 예를 들어 HLA-A*02:01:01:01 대립유전자에 의해 코딩되는 폴리펩타이드이다. HLA-A*0201 대립유전자는 통상적으로 북아메리카 집단에서 사용된다. 본 발명의 실시예가 이러한 특정 HLA 서열을 기재하지만, 임의의 적절한 HLA-A 서열이 본 명세서에 포함되는데, 예를 들어 인간 집단에서 나타나는 HLA-A2의 다형성 변이체, 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 변형을 갖는 서열, 유전자 코드의 축퇴로 인해 본 명세서에 기재된 서열과 상이한 핵산 서열 등이 있다.
다른 특정 측면에서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 인간 부분은 HLA-B 및 HLA-C로부터 선택되는 인간 MHC I로부터 유래된다. 한 측면에서, HLA-B, 예를 들어 HLA-B27로부터 유래된다. 다른 측면에서, HLA-A3, -B7, -Cw6 등으로부터 유래된다.
하나의 특정 측면에서, 본 명세서에 기재된 인간화 MHC II α 및 β 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 HLA-DR, 예를 들어 HLA-DR2로부터 유래된다. 전형적으로, HLA-DR α 쇄는 단형성(monomorphic)이며, 예를 들어, HLA-DR 복합체의 α 쇄는 HLA-DRA 유전자(예를 들어, HLA-DRα*01 유전자)에 의해 코딩된다. 한편, HLA-DR β 쇄는 다형성이다. 따라서, HLA-DR2는 HLA-DRA 유전자에 의해 코딩되는 α 쇄 및 HLA-DR1β*1501 유전자에 의해 코딩되는 β 쇄를 포함한다. 본 발명의 실시예가 이러한 특정 HLA 서열을 기재하지만, 임의의 적절한 HLA-DR 서열이 본 명세서에 포함되는데, 예를 들어 인간 집단에서 나타나는 다형성 변이체, 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 변형을 갖는 서열, 유전자 코드의 축퇴로 인해 본 명세서에 기재된 서열과 상이한 핵산 서열 등이 있다.
키메라 MHC II α 및/또는 β 폴리펩타이드의 인간 부분은 통상의 인간 질환과 관련된 것으로 알려진 HLA 대립유전자의 핵산 서열에 의해 코딩될 수 있다. 이러한 HLA 대립유전자는 HLA-DRB1*0401, -DRB1*0301, -DQA1*0501, -DQB1*0201, DRB1*1501, -DRB1*1502, -DQB1*0602, -DQA1*0102, -DQA1*0201, -DQB1*0202, -DQA1*0501 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. HLA 대립유전자/질환 관련의 개요에 대해서는, 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Bakker et al. (2006), 상기 참조]을 참조한다.
한 측면에서, 키메라 인간/비인간 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드(들)의 비인간 부분은 각각, 내인성 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스, 래트 등) MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드(들)의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함한다. 따라서, 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드의 비인간 부분은 내인성 비인간 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 MHC II α 폴리펩타이드의 비인간 부분은 내인성 비인간 MHC II α 폴리펩타이드의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 키메라 인간/비인간 MHC II β 폴리펩타이드의 비인간 부분은 내인성 비인간 MHC II β 폴리펩타이드의 막관통 및/또는 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 비인간 동물은 마우스이며, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 비인간 부분은 마우스 H-2K 단백질로부터 유래된다. 한 측면에서, 상기 동물은 마우스이며, 키메라 MHC II α 및 β 폴리펩타이드의 비인간 부분은 마우스 H-2E 단백질로부터 유래된다. 따라서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 비인간 부분은 마우스 H-2K로부터 유래된 막관통 및 세포질 도메인을 포함할 수 있으며, 키메라 MHC II α 및 βδ폴리펩타이드의 비인간 부분은 마우스 H-2E 단백질로부터 유래된 막관통 및 세포질 도메인을 포함할 수 있다. 특정 H-2K 및 H-2E 서열이 실시예에서 고려되지만, 임의의 적절한 서열, 예를 들어 다형성 변이체, 보존적/비보존적 아미노산 치환 등이 본 명세서에 포함된다. 한 측면에서, 비인간 동물이 마우스이며, 마우스는 이의 H-2D 유전자좌로부터 기능적 내인성 MHC 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 마우스는 내인성 H-2D 유전자좌의 전부 또는 일부가 결실되도록 조작된다. 다른 측면에서, 마우스는 어떠한 기능적 내인성 마우스 MHC I 및 MHC II도 세포 표면에 발현하지 않는다.
키메라 인간/비인간 폴리펩타이드는 인간 또는 비인간 리더(시그널) 서열을 포함하도록 될 수 있다. 일 실시 형태에서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 내인성 MHC I 폴리펩타이드의 비인간 리더 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드는 내인성 MHC II α 폴리펩타이드의 비인간 리더 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 키메라 MHC II β 폴리펩타이드는 내인성 MHC II β 폴리펩타이드의 비인간 리더 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 키메라 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드(들)는 각각, 다른 비인간 동물, 예를 들어 다른 설치류 또는 다른 마우스 계통 유래의 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드(들)의 비인간 리더 서열을 포함한다. 따라서, 키메라 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열은 각각, 비인간 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 리더 서열을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 또 다른 실시 형태에서, 키메라 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드(들)는 각각, 인간 MHC I, 인간 MHC II α 및/또는 인간 MHC II β 폴리펩타이드의 인간 리더 서열(예를 들어, 각각, 인간 HLA-A2, 인간 HLA-DRα 및/또는 인간 HLA-DRβ1*1501의 리더 서열)을 포함한다.
키메라 인간/비인간 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드는 각각, 이의 인간 부분에, 인간 MHC I, 인간 MHC II α 및/또는 인간 MHC II β 폴리펩타이드의 완전한 또는 실질적으로 완전한 세포외 도메인을 포함할 수있다. 따라서, 인간 부분은 인간 MHC I, 인간 MHC II α 및/또는 인간 MHC II β 폴리펩타이드(예를 들어, 인간 HLA-A2, 인간 HLA-DRα 및/또는 인간 HLA-DRβ1*1501)의 세포외 도메인을 코딩하는 아미노산을 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 보다 바람직하게는 적어도 90%, 예를 들어, 95% 이상 포함할 수 있다. 일례를 들면, 인간 MHC I, 인간 MHC II α 및/또는 인간 MHC II β 폴리펩타이드의 실질적으로 완전한 세포외 도메인에는 인간 리더 서열이 결여되어 있다. 다른 예에서, 키메라 인간/비인간 MHC I, 키메라 인간/비인간 MHC II α 및/또는 키메라 인간/비인간 MHC II β 폴리펩타이드는 인간 리더 서열을 포함한다.
게다가, 키메라 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드는 각각, 내인성 비인간 프로모터 및 조절 요소, 예를 들어 마우스 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β 조절 요소에 작동가능하게 연결될 수 있다(예를 들어, 이의 조절 제어 하에 발현될 수 있음). 이러한 배열은 비인간 동물에서, 예를 들어 비인간 동물에서의 면역반응 시에 키메라 MHC I 및/또는 MHC II 폴리펩타이드의 적절한 발현을 촉진시킬 것이다.
추가의 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물, 예를 들어 설치류, 예를 들어 마우스는 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 핵산 서열을(예를 들어, 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에) 포함한다. β2 마이크로글로불린 또는 MHC 클래스 I 복합체의 경쇄(또한 "β2M"으로 약칭됨)는 주로 MHC I α 쇄를 안정화시키는 기능을 하는 저분자(12 kDa) 비당화 단백질이다. 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 동물의 생산은 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 제20130111617호에 상세히 기재되어 있다.
인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 전체 인간 β2 마이크로글로불린 유전자에 대응하는 핵산 잔기를 포함할 수 있다. 대안적으로, 뉴클레오타이드 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 단백질의 아미노산 21 내지 119에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 잔기(즉, 성숙 인간 β2 마이크로글로불린에 대응하는 아미노산 잔기)를 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 단백질의 아미노산 23 내지 115에 기재된 아미노산 서열, 예를 들어 인간 β2 마이크로글로불린 단백질의 아미노산 23 내지 119에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 잔기를 포함할 수 있다. 인간 β2 마이크로글로불린의 핵산 및 아미노산 서열은 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Gussow et al., 상기 참조]에 기재되어 있다.
따라서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는 인간 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드의 아미노산 23 내지 115에 기재된 아미노산 서열, 예를 들어 인간 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드의 아미노산 23 내지 119에 기재된 아미노산 서열, 예를 들어 인간 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드의 아미노산 21 내지 119에 기재된 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 β2 마이크로글로불린은 인간 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드의 아미노산 1 내지 119를 포함할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 대안적으로, 뉴클레오타이드 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이러한 실시 형태에서, 엑손 2, 3 및 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열은 유전자의 정상적인 전사 및 번역을 허용하도록 작동가능하게 연결된다. 따라서, 일 실시 형태에서, 인간 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 대응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 인간 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 4 다음에 약 267 bp의 엑손 2에 대응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 특정 실시 형태에서, 인간 서열은 약 2.8 kb의 인간 β2 마이크로글로불린 유전자를 포함한다.
따라서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는 인간 β2 마이크로글로불린의 엑손 2 내지 엑손 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 엑손 4에 대응하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 대안적으로, 폴리펩타이드는 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다. 특정 실시 형태에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 4 다음에 약 267 bp의 엑손 2에 대응하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다. 다른 특정 실시 형태에서, 인간 또는 인간화 폴리펩타이드는 약 2.8 kb의 인간 β2 마이크로글로불린 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다. β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 4가 5' 비번역 영역을 포함하기 때문에, 인간 또는 인간화 폴리펩타이드는 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 및 3을 포함하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩될 수 있다.
유전자 조작 동물을 생산하기 위한 특정 핵산 및 아미노산 서열이 본 명세서에 기재되어 있지만, 하나 이상의 보존적 또는 비보존적 아미노산 치환의 서열, 또는 유전자 코드의 축퇴로 인해 본 명세서에 기재된 서열과 상이한 서열도 제공된다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
따라서, β2 마이크로글로불린 서열이 인간 β2 마이크로글로불린 서열과 적어도 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한, 인간 β2 마이크로글로불린 서열을 발현하는 비인간 동물이 제공된다. 특정 실시 형태에서, 상기 β2 마이크로글로불린 서열은 본 명세서에 기재된 인간 β2 마이크로글로불린 서열과 적어도 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하다. 일 실시 형태에서, 인간 β2 마이크로글로불린 서열은 하나 이상의 보존적 치환을 포함한다. 일 실시 형태에서, 인간 β2 마이크로글로불린 서열은 하나 이상의 비보존적 치환을 포함한다.
또한, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 비인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1에 기재된 뉴클레오타이드 서열도 포함하는 비인간 동물이 제공된다. 따라서, 특정 실시 형태에서, 비인간 동물은 이의 게놈에, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하며, 상기 뉴클레오타이드 서열은 비인간 β2 마이크로글로불린의 엑손 1 및 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 포함한다. 따라서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는 비인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1 및 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4(예를 들어, 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 및 3)에 의해 코딩된다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스)은 키메라 CD8 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열 이외에, 인간 또는 인간화 MHC I 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하므로, 상기 동물의 T 세포 표면에 발현되는 키메라 CD8 단백질은 제2 세포, 예를 들어 항원 제시 세포의 표면에 발현되는 인간 또는 인간화 MHC I과 회합, 결합 및/또는 상호작용할 수 있다. 일 실시 형태에서, MHC I 단백질은 인간 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 동물은 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 인간 또는 인간화 MHC I 폴리펩타이드 및/또는 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하는 예시적인 유전자 변형 동물이 모두 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 제20130111617호 및 제20130185819호에 기재되어 있다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 CD8 단백질을 포함하는 동물은 인간화 MHC I 복합체를 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 인간화 MHC I 복합체는 (1) 인간화 MHC I 폴리펩타이드(예를 들어, 인간화 MHC I 폴리펩타이드는 인간 MHC I 세포외 도메인 및 내인성(예를 들어, 마우스) MHC I의 막관통 및 세포질 도메인을 포함함(예를 들어, 인간화 MHC I은 인간 MHC I 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함함)) 및 (2) 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드(예를 들어, 상기 동물은 인간 β2 마이크로글로불린의 엑손 2, 3 및 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 게놈에 포함함)를 포함한다. 한 측면에서, 인간화 MHC I 및 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는 모두 각각, 내인성 MHC I 및 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 위치한 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되며; 한 측면에서, 상기 동물은 기능적 내인성 MHC I 및 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 따라서, 상기 동물에 의해 발현되는 MHC I은 키메라 인간/비인간, 예를 들어 인간/설치류(예를 들어, 인간/마우스) MHC I 폴리펩타이드일 수 있다. 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 인간 부분은 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C, 예를 들어 HLA-A2, HLA-B27, HLA-B7, HLA-Cw6, 또는 인간 집단에 존재하는 임의의 다른 HLA 클래스 I 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 HLA 클래스 I 단백질로부터 유래될 수 있다. 상기 동물이 마우스인 실시 형태에서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 비인간(즉, 마우스) 부분은 H-2D, H-2K 및 H-2L로부터 선택되는 마우스 MHC I 단백질로부터 유래될 수 있다.
일 실시 형태에서, 본 발명의 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스)은 인간 또는 인간화 MHC II 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하므로, 상기 동물의 T 세포 표면에 발현되는 키메라 CD4 단백질은 제2 세포, 예를 들어 항원 제시 세포의 표면에 발현되는 인간 또는 인간화 MHC II와 상호작용할 수 있다. 일 실시 형태에서, MHC II 단백질은 인간 MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 도메인 및 인간 MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함한다. 인간 또는 인간화 MHC II 폴리펩타이드를 발현하는 예시적인 유전자 변형 동물은 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함되는, 2014년 9월 30일자로 특허 허여된 미국 특허 제8,847,005호 및 미국 특허 공개 제20130185820호에 기재되어 있다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 CD4 단백질을 포함하는 동물은 인간화 MHC II 단백질을 추가로 포함할 수 있으며, 여기서 상기 인간화 MHC II 단백질은 (1) 인간 MHC II α 세포외 도메인 및 내인성, 예를 들어 마우스, MHC II의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 인간화 MHC II α 폴리펩타이드 - 여기서, 인간 MHC II α 세포외 도메인은 인간 MHC II α의 α1 및 α2 도메인을 포함함 - 및 (2) 인간 MHC II β 세포외 도메인 및 내인성, 예를 들어 마우스, MHC II의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 인간화 MHC II β 폴리펩타이드 - 여기서, 인간 MHC II β 세포외 도메인은 인간 MHC II β의 β1 및 β2 도메인을 포함함 - 를 포함한다. 한 측면에서, 인간화 MHC II α 및 β 폴리펩타이드는 모두 각각, 내인성 MHC II α 및 β 유전자좌에 위치한 핵산 서열에 의해 코딩되며; 한 측면에서, 상기 동물은 기능적 내인성 MHC II α 및 β 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 따라서, 상기 동물에 의해 발현되는 MHC II는 키메라 인간/비인간, 예를 들어 인간/설치류(예를 들어, 인간/마우스) MHC II 단백질일 수 있다. 키메라 MHC II 단백질의 인간 부분은 HLA-DR, HLA-DQ 및 HLA-DP, 예를 들어 HLA-DR4, HLA-DR2, HLA-DQ2.5, HLA-DQ8, 또는 인간 집단에 존재하는 임의의 다른 HLA 클래스 II 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간 HLA 클래스 II 단백질로부터 유래될 수 있다. 상기 동물이 마우스인 실시 형태에서, 키메라 MHC II 폴리펩타이드의 비인간(즉, 마우스) 부분은 H-2E 및 H-2A로부터 선택되는 마우스 MHC II 단백질로부터 유래될 수 있다.
유전자 변형 비인간 동물, 예를 들어 설치류, 예를 들어 래트 또는 마우스의 다양한 다른 실시 형태는 본 발명 및 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 제20130111617호, 제20130185819호 및 제20130185820호, 및 미국 특허 제8,847,005 호의 개시 내용으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
다양한 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자 변형 비인간 동물은 세포 표면에 인간 또는 인간화 MHC I 및 II를 갖는 세포, 예를 들어 APC를 만들고, 결과적으로 복합체의 실질적으로 모든 구성성분이 인간 또는 인간화되어 있기 때문에, T 세포에 대한 에피토프로서 인간 유사 방법으로 펩타이드를 제시한다. 본 발명의 유전자 변형 비인간 동물은 인간화 동물의 인간 면역계의 기능을 연구하고; 예를 들어, 백신 개발에 사용하기 위해, 면역반응을 유도하는 항원 및 항원 에피토프(예를 들어, T 세포 에피토프, 예를 들어 특이 인간 암 에피토프)의 동정을 위해; 백신 후보 물질 및 기타 백신 전략 평가를 위해; 인간 자가면역 연구를 위해; 인간 전염병 연구를 위해; 그렇지 않으면, 인간 MHC 발현에 기초한 더 나은 치료 전략을 고안하기 위해 사용될 수 있다.
비인간 동물, 조직 및 세포
본 발명의 유전자 변형 비인간 동물은 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 소(예를 들어, 암소, 황소, 버팔로), 사슴, 양, 염소, 닭, 고양이, 개, 흰족제비, 영장류(예를 들어, 마모셋, 붉은털 원숭이)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다. 적절한 유전자 변형가능한 ES 세포를 용이하게 입수할 수 없는 비인간 동물의 경우, 유전자 변형을 포함하는 비인간 동물을 생산하는데 다른 방법이 사용될 수 있다. 그러한 방법은 예를 들어, 비 ES(non-ES) 세포 게놈(예를 들어, 섬유아세포 또는 유도 만능성 세포)을 변형시키는 단계, 변형된 게놈을 핵이식을 이용하여 적절한 세포, 예를 들어 난모세포에 이식시키는 단계 및 변형된 세포(예를 들어, 변형된 난모세포)를 적절한 조건 하에 비인간 동물에 임신시켜, 배아를 생성시키는 단계를 포함한다.
한 측면에서, 비인간 동물은 포유류이다. 한 측면에서, 비인간 동물은 예를 들어, 뛰는쥐상과(Dipodoidea) 또는 쥐상과(Muroidea)의 소형 포유류이다. 일 실시 형태에서, 유전자 변형 동물은 설치류이다. 일 실시 형태에서, 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 설치류는 쥐상과로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 유전자 변형된 동물은 칼로미스쿠스과(Calomyscidae)(예를 들어, 마우스라이크 햄스터(mouse-like hamster)), 비단털쥐과(Cricetidae)(예를 들어, 햄스터, 뉴월드(New World) 래트 및 마우스, 들쥐), 쥐과(Muridae)(트루(true) 마우스 및 래트, 게르빌루스쥐(gerbil), 가시쥐(spiny mouse), 돌기 래트(crested rat)), 붉은숲쥐과(Nesomyidae)(클라이밍(climbing) 마우스, 락(rock) 마우스, 흰꼬리쥐(white-tailed rat), 마다카스카르 래트 및 마우스), 가시겨울잠쥐과(Platacanthomyidae)(예를 들어, 가시겨울잠쥐(spiny dormouse)) 및 소경쥐과(Spalacidae)(예를 들어, 뒤쥐(mole rat), 대나무쥐 및 조커(zokor))로부터 선택되는 과에서 유래된다. 특정 실시 형태에서, 유전자 변형 설치류는 트루 마우스 또는 래트(쥐과), 게르빌루스쥐, 가시쥐 및 돌기 래트로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 유전자 변형 마우스는 쥐과의 구성원으로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 동물은 설치류이다. 특정 실시 형태에서, 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 마우스이다.
특정 실시 형태에서, 비인간 동물은 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr 및 C57BL/Ola로부터 선택되는 C57BL 계통의 마우스인 설치류이다. 다른 실시 형태에서, 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1(예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6(129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2인 계통으로 이루어진 군으로부터 선택되는 129 계통이다(예를 들어, 문헌[Festing et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836]을 참조하고, 또한 문헌[Auerbach et al (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines]을 참조함). 일 실시 형태에서, 유전자 변형 마우스는 상술한 129 계통과 상술한 C57BL/6 계통의 혼합체이다. 다른 특정 실시 형태에서, 마우스는 상술한 129 계통의 혼합체, 또는 상술한 BL/6 계통의 혼합체이다. 특정 실시 형태에서, 혼합체의 129 계통은 129S6(129/SvEvTac) 계통이다. 다른 실시 형태에서, 마우스는 BALB 계통, 예를 들어 BALB/c 계통이다. 또 다른 실시 형태에서, 마우스는 BALB 계통과 상술한 다른 계통의 혼합체이다. 본 명세서에 제공된 비인간 동물은 상술한 계통의 임의의 조합에 유래하는 마우스일 수 있다.
일 실시 형태에서, 비인간 동물은 래트이다. 일 실시 형태에서, 래트는 위스타(Wistar) 래트, LEA 계통, 스프라그 돌리(Sprague Dawley) 계통, 피셔(Fischer) 계통, F344, F6 및 다크 아구티(Dark Agouti)로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 래트 계통은 위스타, LEA, 스프라그 돌리, 피셔, F344, F6 및 다크 아구티로 이루어진 군으로부터 선택되는 둘 이상의 계통의 혼합체이다.
따라서, 본 발명의 일 실시 형태에서, 유전자 변형 마우스로서, 예를 들어 게놈, 예를 들어 생식세포 게놈에, (a) 제1 키메라 인간/뮤린 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, CD4)를 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 키메라 인간/뮤린 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, CD8α)를 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및/또는 제3 키메라 인간/뮤린 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드(예를 들어, CD8β)를 코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열 - 여기서, 각각의 키메라 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드의 뮤린 부분은 뮤린 T 세포 보조 수용체의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 각각의 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 T 세포 보조 수용체의 세포외 부분(또는 이의 부분, 예를 들어, 하나 이상의 세포외 도메인)을 포함하며, 상기 마우스는 제1, 제2 및/또는 제3 키메라 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드를 발현함 -; (b) 뮤린 TCRα 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체(TCR)α 가변 유전자좌, 및/또는 뮤린 TCRβ 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌; 및 임의로, (c) 제1 키메라 인간/뮤린 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, MHC II α(를 코딩하는 제1 핵산 서열, 제2 키메라 인간/뮤린 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, MHC II β(를 코딩하는 제2 핵산 서열 및/또는 제3 키메라 인간/뮤린 MHC 폴리펩타이드(예를 들어, MHC I)를 코딩하는 제3 핵산 서열 및 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌 - 여기서, 각각의 키메라 MHC 폴리펩타이드의 인간 부분은 제1, 제2 및/또는 제3 키메라 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드와 결합하는 인간 MHC 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함함(예를 들어, 키메라 MHC II 복합체(예를 들어, 인간화 MHC II α 및 β 폴리펩타이드)의 인간 부분은 키메라 CD4 폴리펩타이드와 결합하고/하거나, 키메라 MHC I 폴리펩타이드(또는 MHC I 복합체, 예를 들어 인간화 MHC Iα 및 인간(화) β2 마이크로글로불린)의 인간 부분은 키메라 CD8 보조 수용체(예를 들어, 인간화 CD8α 및 β 폴리펩타이드)와 결합함) -를 포함하는 유전자 변형 마우스가 제공된다.
게놈, 예를 들어 내인성 CD4 유전자좌에, 키메라 인간/마우스 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 변형 마우스로서, 상기 키메라 폴리펩타이드의 마우스 부분이 마우스 CD4 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 상기 마우스가 키메라 인간/마우스 CD4를 발현하는 유전자 변형 마우스가 제공된다. 일 실시 형태에서, 상기 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 CD4 폴리펩타이드의 세포외 도메인의 적어도 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 CD4 단백질의 D1 도메인의 적어도 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 CD4 단백질의 D1 내지 D2 도메인의 적어도 전부 또는 실질적으로 전부, 예를 들어 인간 CD4 단백질의 D1 내지 D3 도메인의 적어도 전부 또는 실질적으로 전부, 예를 들어 인간 CD4 단백질의 D1 내지 D4 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 마우스는 내인성 CD4 유전자좌에, 인간 CD4 유전자의 엑손 4, 5 및 6의 적어도 전부 또는 실질적으로 전부를 포함하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 인간 CD4의 D1 도메인의 일부를 코딩하는 인간 CD4 유전자의 엑손 3 및 인간 CD4 유전자의 엑손 4 내지 6의 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 마우스는 내인성 CD4 유전자좌에, T 세포 수용체의 세포외 부분 및/또는 MHC II와의 상호작용에 관여하는 인간 CD4 서열을 포함하는 키메라 인간/마우스 CD4를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 마우스는 내인성 CD4 유전자좌에, T 세포 수용체의 가변 도메인 및/또는 MHC II와의 상호작용에 관여하는 인간 CD4 서열을 포함하는 키메라 인간/마우스 CD4를 포함한다. 일 실시 형태에서, 뉴클레오타이드 서열은 마우스 CD4 시그널 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 마우스는 마우스 CD4 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 CD4 세포외 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 것을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 마우스는 마우스 CD4 D1 도메인의 적어도 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 마우스 CD4 D1 내지 D2 도메인의 적어도 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 마우스 CD4 D1 내지 D3 도메인의 적어도 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 상술한 것을 코딩하는 인간 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 것을 포함한다. 일 실시 형태에서, 키메라 CD4 폴리펩타이드의 도메인은 도 5a에 개략적으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다.
일 실시 형태에서, 마우스는 내인성 마우스 CD4 유전자좌로부터 기능적 내인성 마우스 CD4를 발현하지 않는다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 마우스는 마우스의 생식세포계열에 키메라 인간/마우스 CD4 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일 실시 형태에서, 마우스는 인간화되지 않은 임의의 내인성 서열을 보유하며, 예를 들어, 마우스가 D1 내지 D3 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 치환을 포함하는 실시 형태에서, 마우스는 마우스 CD4 D4 도메인을 코딩하는 내인성 뉴클레오타이드 서열 및 마우스 CD4의 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 보유한다.
한 측면에서, 키메라 인간/마우스 CD4 단백질을 발현하는 마우스는 마우스 CD4 프로모터 및 조절 서열을 보유하며, 예를 들어, 키메라 인간/마우스 CD4를 코딩하는 마우스의 뉴클레오타이드 서열은 내인성 마우스 CD4 프로모터 및 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 측면에서, 본 발명의 유전자 조작 동물에 보유된 이러한 마우스 조절 서열은 T 세포 발생 시에 적절한 단계에서 키메라 단백질의 발현을 조절하는 서열을 포함한다. 따라서, 한 측면에서, 마우스는 B 세포 또는 성숙 CD8+ T 세포에 키메라 CD4를 발현하지 않는다. 한 측면에서, 마우스는 또한 통상 내인성 CD4를 발현하지 않는 임의의 세포형, 예를 들어 임의의 면역 세포형에 키메라 CD4를 발현하지 않는다.
본 명세서에 개시된 유전자 변형 마우스는 게놈, 예를 들어 내인성 CD8 유전자좌에, 키메라 인간/마우스 CD8α 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 인간/마우스 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분의 전부 또는 실질적으로 전부 및 마우스 CD8α 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열을 포함하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분의 전부 또는 실질적으로 전부 및 마우스 CD8β 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열을 포함하며, 상기 마우스는 기능적 키메라 인간/마우스 CD8 단백질을 발현한다. 일 실시 형태에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD8α 폴리펩타이드의 적어도 면역글로불린 V 유사 도메인을 코딩하는 서열 및 마우스 CD8α 폴리펩타이드의 나머지 서열을 포함하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD8β 폴리펩타이드의 적어도 면역글로불린 V 유사 도메인을 코딩하는 서열 및 마우스 CD8β 폴리펩타이드의 나머지 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD8α 폴리펩타이드의 적어도 MHC I 결합 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 제1 및 제2 뉴클레오타이드 서열은 각각, 적어도 인간 CD8α 폴리펩타이드 및/또는 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분을 코딩하는 엑손을 포함한다. 일 실시 형태에서, 인간 CD8α 폴리펩타이드 및/또는 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분은 막관통 또는 세포질 도메인이 아닌 인간 CD8α 폴리펩타이드 및/또는 CD8β 폴리펩타이드의 부분을 포함하는 영역이다. 일 실시 형태에서, 키메라 CD8α 폴리펩타이드의 도메인은 도 5b에 개략적으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다. 일 실시 형태에서, 키메라 CD8β 폴리펩타이드의 도메인은 도 5b에 개략적으로 나타낸 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩된다. 일 실시 형태에서, 키메라 인간/마우스 CD8α 폴리펩타이드 및/또는 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 각각, 마우스 CD8α 및/또는 CD8β 시그널 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 대안적으로, 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD8α 및/또는 CD8β 시그널 서열을 코딩하는 서열을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 마우스는 마우스 CD8α 및/또는 CD8β 세포외 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 각각, 인간 CD8α 및/또는 CD8β 세포외 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 것을 포함한다.
일 실시 형태에서, 마우스는 내인성 CD8 유전자좌로부터 기능적 내인성 마우스 CD8α 및/또는 CD8β 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 마우스는 생식세포계열에 키메라 인간/마우스 CD8 서열을 포함한다.
한 측면에서, 키메라 인간/마우스 CD8α 및/또는 CD8β 폴리펩타이드를 발현하는 마우스는 마우스 CD8α 및/또는 CD8β 프로모터 및 조절 서열을 보유하며, 예를 들어, 키메라 인간/마우스 CD8을 코딩하는 마우스의 뉴클레오타이드 서열은 내인성 마우스 CD8 프로모터 및 조절 서열에 작동가능하게 연결된다. 한 측면에서, 마우스에 보유된 이러한 조절 서열은 T 세포 발생의 적절한 단계에서 CD8 단백질 발현을 조절하는 서열을 포함한다. 한 측면에서, 유전자 변형 마우스는 B 세포 또는 성숙 CD4+ T 세포, 또는 통상 내인성 CD8을 발현하지 않는 임의의 세포, 예를 들어 면역 세포에 키메라 CD8을 발현하지 않는다.
본 발명은 또한 게놈에 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 TCR 가변 유전자좌, 예를 들어, TCRα, TCRβ, TCRδ, 및/또는 TCRγ 가변 유전자좌를 포함하는 유전자 변형 마우스를 제공한다. 일부 실시 형태에서, 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 TCR 가변 유전자좌는 내인성 마우스 TCR 가변 유전자좌를 대체한다. 다른 실시 형태에서, 재배열되지 않은 인간 또는 인간화 TCR 가변 유전자좌는 대응하는 내인성 마우스 TCR 유전자좌 이외의 게놈 내의 부위에 존재한다. 일부 실시 형태에서, 인간 또는 재배열되지 않은 인간화 TCR 가변 유전자좌는 마우스 TCR 불변 영역에 작동가능하게 연결된다.
일 실시 형태에서, 마우스 TCRα 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체(TCR)α 가변 유전자좌, 및 마우스 TCRβ 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌를 게놈에 포함하는 유전자 변형 마우스가 제공된다. 하나의 특정 실시 형태에서, 마우스는 마우스 TCRα 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 인간 Vα 세그먼트의 완전한 레퍼토리 및 인간 Jα 세그먼트의 완전한 레퍼토리를 포함하는 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌, 및 마우스 TCRβ 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 인간 Vβ 세그먼트의 완전한 레퍼토리, 인간 Dβ 세그먼트의 완전한 레퍼토리 및 인간 Jβ 세그먼트완전한 레퍼토리를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌를 게놈에 포함한다.
일부 실시 형태에서, 인간 TCRα 가변 영역 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 마우스 TCRα 가변 유전자좌를 대체하고, 인간 TCRβ 가변 영역 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 마우스 TCRβ 가변 유전자좌를 대체한다. 일부 실시 형태에서, 내인성 마우스 Vα 및 Jα 세그먼트는 재배열되어 재배열된 Vα/Jα 서열을 형성할 수 없고, 내인성 마우스 Vβ, Dβ 및 Jβ 세그먼트는 재배열되어 재배열된 Vβ/Dβ/Jβ 서열을 형성할 수 없다. 일부 실시 형태에서, 인간 Vα 및 Jα 세그먼트는 재배열되어 재배열된 인간 Vα/Jα 서열을 형성하고, 인간 Vβ, Dβ 및 Jβ 세그먼트는 재배열되어 재배열된 인간 Vβ/Dβ/Jβ 서열을 형성한다.
본 발명은 또한 키메라 MHC 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 게놈에 포함하며, 키메라 MHC 폴리펩타이드의 인간 부분이 본 명세서에 개시된 키메라 T 세포 보조 수용체의 인간 세포외 도메인과 결합하는 유전자 변형 마우스에 관한 것이다. 본 명세서에 개시된 유전자 변형 마우스는 키메라 인간/마우스 MHC I을 코딩하는 제1 핵산 서열, 키메라 인간/마우스 MHC II α를 코딩하는 제2 핵산 서열 및/또는 키메라 인간/마우스 MHC II β 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함할 수 있다. 키메라 MHC I, MHC II α 및/또는 MHC II β의 인간 부분은 각각, 인간 MHC I, MHC II α 및 MHC II β의 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 마우스는 내인성 마우스 MHC 유전자좌로부터 기능적 키메라 인간/마우스 MHC I, MHC II α 및 MHC II β 폴리펩타이드를 발현한다. 일 실시 형태에서, 마우스는 내인성 마우스 MHC 유전자좌로부터 기능적 마우스 MHC 폴리펩타이드, 예를 들어 기능적 마우스 MHC I, MHC II α 및 MHC II β 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 다른 실시 형태에서, 세포 표면에 마우스에 의해 발현되는 유일한 MHC I 및 MHC II는 키메라 MHC I및 II이다.
일 실시 형태에서, 키메라 인간/마우스 MHC I 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC I(예를 들어, 인간 HLA-A, 예를 들어, 인간 HLA-A2, 예를 들어, 인간 HLA-A2.1)의 펩타이드 결합 도메인 또는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 마우스는 내인성 마우스 MHC I 유전자좌로부터 내인성 마우스 MHC I 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 발현하지 않는다. 인간 MHC I의 펩타이드 결합 도메인은 α1 및 α2 도메인을 포함할 수 있다. 대안적으로, 인간 MHC I의 펩타이드 결합 도메인은 α1, α2 및 α3 도메인을 포함할 수 있다. 한 측면에서, 인간 MHC I의 세포외 도메인은 인간 MHC I α 쇄의 세포외 도메인을 포함한다. 일 실시 형태에서, 내인성 마우스 MHC I 유전자좌는 H-2K(예를 들어, H-2Kb) 유전자좌이며, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 마우스 부분은 마우스 H-2K(예를 들어, H-2Kb) 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명의 마우스는 내인성 마우스 MHC I 유전자좌에, 키메라 인간/마우스 MHC I을 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 HLA-A2(예를 들어, HLA-A2.1) 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 포함하고, 마우스 부분은 마우스 H-2K(예를 들어, H-2Kb) 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며, 마우스는 키메라 인간/마우스 HLA-A2/H-2K 단백질을 발현한다. 다른 실시 형태에서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 마우스 부분은 다른 마우스 MHC I, 예를 들어 H-2D, H-2L 등으로부터 유래될 수 있으며; 키메라 MHC I 폴리펩타이드의 인간 부분은 다른 인간 MHC I, 예를 들어 HLA-B, HLA-C 등으로부터 유래될 수 있다. 한 측면에서, 마우스는 내인성 마우스 H-2K 유전자좌로부터 기능적 내인성 H-2K 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 일 실시 형태에서, 마우스는 H-2D 유전자좌로부터 기능적 내인성 MHC 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 마우스는 내인성 H-2D 유전자좌의 전부 또는 일부가 결실되도록 조작된다. 다른 실시 형태에서, 세포 표면에 마우스에 의해 발현되는 유일한 MHC I 폴리펩타이드는 키메라 인간/마우스 MHC I 폴리펩타이드이다.
일 실시 형태에서, 키메라 인간/마우스 MHC II α 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC II α 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 포함하며, 키메라 인간/마우스 MHC II β 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC II β 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 마우스는 내인성 마우스 유전자좌 (예를 들어, H-2A 및/또는 H-2E 유전자좌)로부터 내인성 마우스 α 및/또는 β 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 또는 세포외 도메인을 발현하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 마우스는 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2, H-2Ea 및 이들의 조합을 포함하는 기능적 MHC 클래스 II 분자를 코딩하는 유전자가 결여된 게놈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 세포 표면에 마우스에 의해 발현되는 유일한 MHC II 폴리펩타이드는 키메라 인간/마우스 MHC II 폴리펩타이드이다. 인간 MHC II α 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 도메인은 α1 도메인을 포함할 수 있고, 인간 MHC II β 폴리펩타이드의 펩타이드 결합 도메인은 β1 도메인을 포함할 수 있으며; 따라서, 키메라 MHC II 복합체의 펩타이드 결합 도메인은 인간 α1 및 β1 도메인을 포함할 수 있다. 인간 MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 도메인은 α1 및 α2 도메인을 포함할 수 있고, 인간 MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 도메인은 β1 및 β2 도메인을 포함할 수 있으며; 따라서, 키메라 MHC II 복합체의 세포외 도메인은 인간 α1, α2, β1 및 β2 도메인을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 키메라 MHC II 복합체의 마우스 부분은 마우스 MHC II, 예를 들어 마우스 H-2E의 막관통 및 세포질 도메인(예를 들어, 마우스 H-2E α 및 β 쇄의 막관통 및 세포질 도메인)을 포함한다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 발명의 마우스는 내인성 마우스 MHC II 유전자좌에, 키메라 인간/마우스 MHC II α를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 키메라 MHC II α 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC II의 α 쇄(예를 들어, HLA-DR2의 α 쇄)로부터 유래된 세포외 도메인을 포함하고, 마우스 부분은 마우스 MHC II(예를 들어, H-2E)의 α 쇄로부터 유래된 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며; 마우스는 내인성 마우스 MHC II 유전자좌에, 키메라 인간/마우스 MHC II β를 코딩하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 키메라 MHC II β 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 MHC II의 β 쇄(예를 들어, HLA-DR2의 β 쇄)로부터 유래된 세포외 도메인을 포함하고, 마우스 부분은 마우스 MHC II(예를 들어, H-2E)의 β 쇄로부터 유래된 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며; 예를 들어, 마우스는 키메라 인간/마우스 HLA-DR2/H-2E 단백질을 발현한다. 다른 실시 형태에서, 키메라 MHC II 단백질의 마우스 부분은 다른 마우스 MHC II, 예를 들어 H-2A 등으로부터 유래될 수 있고; 키메라 MHC II 단백질의 인간 부분은 다른 인간 MHC II, 예를 들어 HLA-DQ 등으로부터 유래될 수 있다. 한 측면에서, 마우스는 내인성 마우스 유전자좌로부터 기능적 내인성 H-2A and H-2E 폴리펩타이드를 발현하지 않는다(예를 들어, 마우스는 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 및 H-2Ea 폴리펩타이드를 발현하지 않음). 일부 실시 형태에서, 마우스는 세포 표면에 어떠한 내인성 MHC I 또는 MHC II 분자도 발현하지 않는다.
다양한 측면에서, 유전자 변형 비인간 동물, 또는 비인간 동물로부터 유래된 세포, 배아 또는 조직에 의해 발현되는 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린은 내인성 및/또는 인간 β2 마이크로글로불린의 모든 기능적 측면을 보존한다. 예를 들어, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린이 MHC I 폴리펩타이드(예를 들어, 내인성 비인간 또는 인간 MHC I 폴리펩타이드)의 α 쇄에 결합하는 것이 바람직하다. 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는 내인성 비인간 및/또는 인간 β2 마이크로글로불린(예를 들어, HFE 등)과 결합하는 임의의 다른 분자, 예를 들어 수용체, 앵커 또는 시그널 전달 분자에 결합하거나, 이를 동원하거나, 아니면 이것과 회합할 수 있다.
유전자 변형 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트) 이외에, 본 명세서에 기재된 비인간 동물로부터 유래되며, 이종 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열, 즉, 뉴클레오타이드 및/또는 아미노산 서열을 포함하는 조직 또는 세포도 제공된다. 일 실시 형태에서, 이종 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열은 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 서열이다. 바람직하게는, 상기 세포는 유핵 세포이다. 상기 세포는 MHC I 복합체를 발현하는 것으로 알려진 임의의 세포, 예를 들어 항원 제시 세포일 수 있다. 상기 세포에 의해 발현되는 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는 내인성 비인간 MHC I(예를 들어, 설치류 MHC I)과 상호작용하여, 기능적 MHC I 복합체를 형성할 수 있다. 얻어진 MHC I 복합체는 T 세포, 예를 들어 세포독성 T 세포와 상호작용할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물로부터 유래된 세포와 T 세포의 시험관내 복합체도 제공된다.
또한 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 서열, 및 추가의 인간 또는 인간화 서열, 예를 들어 본 명에 개시된 키메라 MHC I 폴리펩타이드를 포함하는 비인간 세포가 제공된다. 이러한 경우에, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드는 예를 들어, 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드와 상호작용할 수 있으며, 기능적 MHC I 복합체가 형성될 수 있다. 일부 측면에서, 이러한 복합체는 T 세포, 예를 들어 인간 또는 비인간 T 세포의 TCR과 상호작용할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물로부터 유래된 세포와 인간 또는 비인간 T 세포의 시험관내 복합체도 제공된다.
본 발명의 다른 측면은 본 명세서에 기재된 이종 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열을 포함하는 설치류 배아(예를 들어, 마우스 또는 래트 배아)이다. 일 실시 형태에서, 상기 배아는 이종 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열을 포함하는 ES 도너(donor) 세포, 및 숙주 배아 세포를 포함한다. 이종 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열은 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열이다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 비인간 동물의 염색체 또는 이의 단편(예를 들어, 염색체 또는 이의 단편은 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함함)을 포함하는 비인간 세포를 포함한다. 비인간 세포는 본 명세서에 기재된 비인간 동물의 핵을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 비인간 세포는 핵 이식의 결과로서 염색체 또는 이의 단편을 포함한다.
한 측면에서, 이종 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열을 포함하는 비인간 유도 만능성 세포가 제공된다. 일 실시 형태에서, 상기 유도 만능성 세포는 본 명세서에 기재된 비인간 동물로부터 유래된다. 일 실시 형태에서, 이종 β2 마이크로글로불린 유전자 또는 β2 마이크로글로불린 서열은 인간 또는 인간화 유전자 또는 서열이다.
본 발명의 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 마우스는 마우스의 프로페셔널(professional) 항원 제시 세포, 예를 들어 B 세포, 단핵구/대식세포, 및/또는 수지상 세포에만 키메라 인간/마우스 MHC II를 발현한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 마우스는 하나 이상의 인간 항원에 대한 면역반응, 예를 들어 세포 면역반응을 유도한다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 마우스는 하나 이상의 인간 항원에 대한 인간화 T 세포 반응을 유도한다.
유전자 조작 비인간 동물 이외에, 또한 비인간 배아(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트 배아)가 제공되며, 배아는 본 명세서에 기재된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예컨대 마우스 또는 래트)로부터 유래되는 도너 ES 세포를 포함한다. 한 측면에서, 상기 배아는 키메라 CD4 유전자, 키메라 CD8(예를 들어, CD8α 및/또는 CD8β) 유전자, 인간화 MHC I(예를 들어, MHC I α) 핵산 서열, 인간화 MHC II(예를 들어, MHC II α 및/또는 MHC II β) 핵산 서열, 재배열되지 않은 인간화 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ, 또는 TCRδ 및/또는 TCRγ) 유전자좌 및/또는 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 유전자 서열을 포함하는 ES 도너 세포 및 숙주 배아 세포를 포함한다.
또한, 본 명세서에 기재된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트)로부터 유래되며, 키메라 CD4 단백질, 키메라 CD8 단백질(예를 들어, 키메라 CD8α 및/또는 CD8β 단백질), 인간화 TCR 폴리펩타이드(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ, 또는 TCRδ 및/또는 TCRγ 폴리펩타이드), 인간화 MHC I 폴리펩타이드(예를 들어, MHC I α), 인간화 MHC II 폴리펩타이드(예를 들어, MHC II α 및/또는 MHC II β 폴리펩타이드) 및/또는 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린을 발현하는 조직이 제공된다.
한 측면에서, 단일 세포에서 본 명세서에 기재된 뉴클레오타이드 작제물로부터 키메라 CD4 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 키메라 인간/비인간 CD4 분자의 제조 방법이 제공된다. 일 실시 형태에서, 뉴클레오타이드 작제물은 바이러스 벡터이고; 특정 실시 형태에서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일 실시 형태에서, 상기 세포는 CHO, COS, 293, HeLa 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예를 들어, PERC.6™ 세포)로부터 선택된다.
한 측면에서, 키메라 CD4 단백질을 발현하는 세포가 제공된다. 일 실시 형태에서, 상기 세포는 본 명세서에 기재된 키메라 CD4 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 세포는 CHO, COS, 293, HeLa, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예를 들어, PERC.6™ 세포)로부터 선택된다.
또한, 본 명세서에 기재된 비인간 동물에 의해 제조된 키메라 CD4 분자가 제공되며, 일 실시 형태에서, 키메라 CD4 분자는 인간 CD4 단백질의 세포외 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부, 및 비인간 CD4 단백질, 예를 들어 마우스 CD4 단백질의 적어도 막관통 및 세포질 도메인의 아미노산 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물에 의해 제조된 키메라 CD4 분자가 제공되며, 여기서 키메라 CD4 분자는 인간 CD4의 D1 도메인의 적어도 전부 또는 실질적으로 전부, 예를 들어 인간 CD4의 D1 내지 D2 도메인의 적어도 전부 또는 실질적으로 전부, 예를 들어 인간 CD4의 D1 내지 D3 도메인의 적어도 전부 또는 실질적으로 전부의 아미노산 서열, 예를 들어 TCR의 MHC II 및/또는 세포외 도메인과의 결합에 관여하는 인간 CD4의 아미노산 서열, 예를 들어 TCR의 MHC II 및/또는 가변 도메인과의 결합에 관여하는 인간 CD4의 아미노산 서열을 포함하고; 나머지 단백질(예를 들어, 막관통 도메인, 세포질 도메인, 또는 인간화되지 않은 세포외 도메인의 임의의 부분)은 내인성 비인간 단백질 서열로부터 유래된다. 예시적인 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드는 서열 번호 78에 기재된 아미노산 서열을 포함하고, 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 서열 번호 78의 아미노산 27 내지 319에 걸쳐 있다(서열 번호 79에 별도로 기재됨).
한 측면에서, 단일 세포에서 본 명세서에 기재된 뉴클레오타이드 작제물(들)로부터 키메라 CD8 폴리펩타이드(들)를 발현시키는 단계를 포함하는 키메라 인간/비인간 CD8 분자(예를 들어, CD8α 및/또는 CD8β)의 제조 방법이 제공된다. 일 실시 형태에서, 뉴클레오타이드 작제물은 바이러스 벡터이고; 특정 실시 형태에서, 상기 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 일 실시 형태에서, 세포는 CHO, COS, 293, HeLa, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예를 들어, PERC.6™ 세포)로부터 선택된다.
한 측면에서, 키메라 CD8 단백질을 발현하는 세포가 제공된다. 일 실시 형태에서, 상기 세포는 본 명세서에 기재된 키메라 CD8 서열(들)을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 세포는 CHO, COS, 293, HeLa, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예를 들어, PERC.6™ 세포)로부터 선택된다.
또한, 본 명세서에 기재된 비인간 동물에 의해 제조된 키메라 CD8 분자가 제공되며, 상기 키메라 CD8 분자는 인간 CD8 단백질(예를 들어, CD8α 및/또는 CD8β)의 세포외 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부, 및 비인간 CD8 단백질, 예를 들어 마우스 CD8 단백질의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 예시적인 키메라 CD8α 폴리펩타이드는 서열 번호 88에 기재되어 있으며, 예시적인 키메라 CD8β 단백질은 서열 번호 83에 기재되어 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트)에 의해 제조된 인간화 TCR 단백질이 제공되며, 상기 인간화 TCR 단백질은 인간 가변 영역 및 비인간 불변 영역을 포함한다. 따라서, 인간화 TCR 단백질은 가변 도메인의 인간 상보성 결정 영역(즉, 인간 CDR1, 2 및 3) 및 비인간 불변 영역을 포함한다. 또한, 본 명세서에 기재된 비인간 동물에 의해 생성된 인간 TCR 가변 도메인을 코딩하는 핵산이 제공된다.
또한, 본 명세서에 기재된 비인간 동물로부터 단리된 비인간 세포가 제공된다. 일 실시 형태에서, 상기 세포는 ES 세포이다. 일 실시 형태에서, 상기 세포는 T 세포, 예를 들어 CD4+ T 세포이다. 일 실시 형태에서, 상기 세포는 헬퍼 T 세포(TH 세포)이다. 일 실시 형태에서, TH 세포는 이펙터 TH 세포, 예를 들어 TH1 세포 또는 TH2 세포이다. 일 실시 형태에서, 상기 세포는 CD8+ T 세포이다. 일 실시 형태에서, 상기 세포는 세포독성 T 세포이다. 또한, 인간 가변 영역 및 비인간 불변 영역을 포함하는 TCR 단백질을 발현하는 비인간 세포가 제공된다. TCR 단백질은 TCRα, TCRβ 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 상기 세포는 T 세포, 예를 들어 CD4+ 또는 CD8+ T 세포이다. 또한, 본 명세서에 제공된 비인간 T 세포는 이의 세포 표면에, (a) 비인간 T 세포 보조 수용체 막관통 및/또는 세포내 도메인에 작동가능하게 연결되는 인간 T 세포 보조 수용체 세포외 도메인을 포함하는 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체, 예를 들어 키메라 CD4 폴리펩타이드 또는 키메라 CD8 폴리펩타이드; 및 (b) 인간 가변 영역 및 비인간 불변 영역을 포함하는 TCR 단백질을 발현할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 상기 세포는 항원 제시 세포이다. 일 실시 형태에서, 항원 제시 세포는 인간화 MHC I 분자 상에 항원을 제시한다. 다른 실시 형태에서, 항원 제시 세포는 프로페셔널 항원 제시 세포, 예를 들어 B 세포, 수지상 세포 및 대식세포이다. 다른 실시 형태에서, 항원 제시 세포는 인간화 MHC I 및/또는 인간화 MHC II 분자 상에 항원을 제시한다.
한 측면에서, 키메라 인간/비인간 MHC I 및 MHC II 단백질(예를 들어, HLA-A2/H-2K 및 HLA-DR2/H-2E 단백질)을 발현하는 세포가 제공된다. 한 측면에서, 상기 세포는 H-2D 유전자좌로부터 기능적 내인성 MHC 폴리펩타이드를 발현하지 않는 마우스 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 내인성 H-2D 유전자좌의 전부 또는 일부가 결실되도록 조작된 마우스 세포이다. 일부 실시 형태에서, 상기 세포는 표면에 어떠한 기능적 내인성 MHC I 및 MHC II 폴리펩타이드도 발현하지 않는 마우스 세포이다. 일 실시 형태에서, 상기 세포는 본 명세서에 기재된 키메라 MHC 클래스 I 서열 및 키메라 MHC 클래스 II 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 일 실시 형태에서, 상기 세포는 CHO, COS, 293, HeLa, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 망막 세포(예를 들어, PERC.6™ 세포)로부터 선택된다.
본 명세서에 기재된 HLA-DR2의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 MHC II 복합체는 항 HLA-DR 항체에 의해 검출될 수 있다. 따라서, 키메라 인간/비인간 MHC II 폴리펩타이드를 나타내는 세포는 항 HLA-DR 항체를 사용하여 검출 및/또는 선택될 수 있다. 본 명세서에 기재된 HLA-A2의 세포외 도메인을 포함하는 키메라 MHC I 복합체는 항 HLA-A, 예를 들어 항 HLA-A2 항체를 사용하여 검출될 수 있다. 따라서, 키메라 인간/비인간 MHC I 폴리펩타이드를 나타내는 세포는 항 HLA-A 항체를 사용하여 검출 및/또는 선택될 수 있다. 다른 HLA 대립유전자를 인식하는 항체는 시판되거나 생산될 수 있으며, 검출/선택에 사용될 수 있다.
하기 실시예는 게놈이 마우스 H-2K, 및 H-2A 및 H-2E 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 각각, 키메라 인간/마우스 HLA-A2/H-2K 및 HLA-DR2/H-2E 단백질을 코딩하는 핵산 서열로 치환하는 것을 포함하는 유전자 조작 동물을 기술하고 있지만, 당업자는 유사한 전략이 다른 인간 MHC I 및 II 유전자(다른 HLA-A, HLA-B 및 HLA-C; 및 다른 HLA-DR, HLA-DP 및 HLA-DQ 유전자)를 포함하는 키메라를 도입하는데 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 내인성 MHC 유전자좌에 다수의 키메라 인간/비인간(예를 들어, 인간/설치류, 예를 들어, 인간/마우스) MHC I 및 MHC II 유전자를 포함하는 이러한 동물도 제공된다. 이러한 키메라 MHC I 및 MHC II 단백질의 예는 각각, 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 제20130111617호, 제20130185819호, 제20130185820호 및 제20140245467호, 및 미국 특허 제8,847,005호에 기재되어 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 비인간 동물의 염색체 또는 이의 단편을 포함하는 비인간 세포가 제공된다. 일 실시 형태에서, 비인간 세포는 본 명세서에 기재된 비인간 동물의 핵을 포함한다. 일 실시 형태에서, 비인간 세포는 핵 이식의 결과로서 염색체 또는 이의 단편을 포함한다.
한 측면에서, 본 명세서에 기재된 키메라 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자, 키메라 CD8 폴리펩타이드(예를 들어, CD8α 및/또는 CD8β 폴리펩타이드)를 코딩하는 유전자, 인간화 MHC I 폴리펩타이드(예를 들어, MHC I α 및/또는 β2 마이크로글로불린)를 코딩하는 유전자, 인간화 MHC II 폴리펩타이드(예를 들어, MHC II α 및/또는 MHC II β)를 코딩하는 유전자 및/또는 인간화 TCRα 및/또는 TCRβ 폴리펩타이드를 코딩하는 재배열되지 않은 인간화 TCR 유전자좌를 포함하는 비인간 유도 만능성 세포가 제공된다. 일 실시 형태에서, 상기 유도 만능성 세포는 본 명세서에 기재된 비인간 동물로부터 유래된다.
한 측면에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물의 세포로부터 유래된 하이브리도마 또는 쿼드로마가 제공된다. 일 실시 형태에서, 비인간 동물은 마우스 또는 래트이다.
실질적인 인간화 T 세포 면역반응을 일으키는 유전자 변형 비인간 동물의 생산
또한 본 명세서에 기재된 유전자 조작 비인간 동물(예를 들어, 유전자 조작 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트)을 생산하는 방법이 제공된다. 일반적으로, 상기 방법은 (a) 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 제2 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및/또는 제3 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 비인간 동물의 게놈에 도입하는 단계 - 여기서, 각각의 키메라 T 세포 보조 수용체 폴리펩타이드의 비인간 부분은 비인간 T 세포 보조 수용체의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 각각의 키메라 폴리펩타이드의 인간 부분은 인간 T 세포 보조 수용체의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 포함함 -; (b) 비인간 TCRα 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체(TCR)α 가변 유전자좌 및/또는 비인간 TCRβ 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌를 비인간 동물의 게놈에 삽입하는 단계; 및 임의로 (c) 제1 키메라 인간/비인간 MHC 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 핵산 서열, 제2 키메라 인간/비인간 MHC 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 핵산 서열 및/또는 제3 키메라 인간/비인간 MHC 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 핵산 서열을 상기 게놈에 배치시키는 단계 및/또는 (d) 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 비인간 동물의 게놈에 부가하는 단계를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 도입하는 단계, 삽입하는 단계 및/또는 배치시키는 단계는 T 세포 보조 수용체의 세포외 도메인(들), TCR의 가변 도메인(들), MHC 폴리펩타이드의 세포외 도메인(들), 또는 β2 마이크로글로불린의 일부를 코딩하는 서열을 표적화하고, 상기 서열을 각각, 인간 T 세포 보조 수용체 세포외 도메인(들), 인간 TCR 가변 도메인, 인간 MHC 세포외 도메인(들), 및/또는 β2 마이크로글로불린의 인간 부분을 코딩하는 서열로 치환하는 것을 포함한다.
다른 실시 형태에서, 도입하는 단계, 삽입하는 단계, 배치시키는 단계 및/또는 부가하는 단계는 동종의 동물을 육종, 예를 들어 교배시키는 것을 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 도입하는 단계, 삽입하는 단계, 배치시키는 단계 및/또는 부가하는 단계는 ES 세포에서의 순차적 상동 재조합을 포함한다. 일부 실시 형태에서, ES 세포는 하나 이상이나 전체가 아닌 원하는 유전자 변형을 포함하도록 유전자 변형된 비인간 동물로부터 유래되며, 이러한 ES 세포에서의 상동 재조합에 의해 유전자 변형이 달성된다. 다른 실시 형태에서, 도입하는 단계, 삽입하는 단계, 배치시키는 단계 및/또는 부가하는 단계는 ES 세포의 육종과 상동 재조합의 조합, 예를 들어 한 동물을 동종의 다른(또는 그 이상의) 동물로 육종하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 동물의 일부 또는 전체는 단일 상동 재조합 또는 순차적 상동 재조합 이벤트를 통해 유전자 변형된 ES 세포로부터 생산될 수 있고, 일부 ES 세포는 본 명세서에 개시된 하나 이상의 유전자 변형을 포함하는 비인간 동물로부터 단리될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법은 벨로시진(VELOCIGENE)® 기술을 사용하여 제조된 표적화 작제물을 이용하여, 실시예에 기술된 바와 같이, 작제물을 ES 세포에 도입하고, 표적화된 ES 세포 클론을 벨로시마우스(VELOCIMOUSE)® 기술을 사용하여 마우스 배아에 도입한다. 표적화 작제물은 치환될 내인성 서열을 표적으로 하는 5' 및/또는 3' 상동성 암, 삽입 서열(내인성 서열을 대체함) 및 하나 이상의 선택 카세트를 포함할 수 있다. 선택 카세트는 목적하는 표적화 작제물이 통합된 세포(예를 들어, ES 세포)의 선택을 용이하게 하기 위해 표적화 작제물에 삽입된 뉴클레오티드 서열이다. 다수의 적합한 선택 카세트가 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 선택 카세트는 특정 항생제(예를 들어, Neo, Hyg, Pur, CM, SPEC 등)의 존재 하에 양성 선택을 가능하게 한다. 또한, 선택 카세트는 재조합 부위가 플랭킹(flanking)될 수 있으며, 이는 재조합효소 처리 시에 선택 카세트가 결실되게 한다. 통상적으로 사용되는 재조합 부위는 각각, Cre 및 Flp 효소에 의해 인식되는 loxP 및 Frt이지만, 다른 것들도 당업계에 공지되어 있다. 선택 카세트는 코딩 영역 외부의 작제물 내의 어느 곳에나 위치할 수 있다. 일 실시 형태에서, 선택 카세트는 인간 DNA 단편의 5' 말단에 위치한다. 다른 실시 형태에서, 선택 카세트는 인간 DNA 단편의 3' 말단에 위치한다. 다른 실시 형태에서, 선택 카세트는 인간 DNA 단편 내에 위치한다. 다른 실시 형태에서, 선택 카세트는 인간 DNA 단편의 인트론 내에 위치한다. 다른 실시 형태에서, 선택 카세트는 인간 DNA 단편과 마우스 DNA 단편의 접합부에 위치한다.
일 실시 형태에서, 유전자 조작 비인간 동물을 생산하는 방법에 의해, 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 내인성 CD4 유전자좌에 포함하는 동물이 생산된다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 키메라 인간/비인간 CD4 폴리펩타이드를 발현하도록 비인간 동물의 CD4 유전자좌를 변형시키는 방법을 포함한다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 비인간 동물, 예를 들어 마우스의 내인성 CD4 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/마우스 CD4 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 도입, 예를 들어 치환하는 것을 포함하는, 키메라 인간/마우스 CD4 폴리펩타이드를 발현하도록 마우스의 CD4 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공한다. 상기 방법의 한 측면에서, 키메라 인간/마우스 CD4 폴리펩타이드는 인간 CD4 폴리펩타이드의 세포외 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부 및 내인성 마우스 CD4 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다. 상기 방법의 다른 측면에서, 키메라 인간/마우스 CD4 폴리펩타이드는 인간 CD4 폴리펩타이드의 D1 내지 D2 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 키메라 인간/마우스 CD4 폴리펩타이드는 인간 CD4 폴리펩타이드의 D1 내지 D3 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 키메라 인간/마우스 CD4 폴리펩타이드는 T 세포 수용체의 세포외 도메인 및/또는 MHC II와의 상호작용에 관여하는 인간 CD4의 아미노산 서열의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, 키메라 인간/마우스 CD4 폴리펩타이드는 T 세포 수용체의 가변 도메인 및/또는 MHC II와의 상호작용에 관여하는 인간 CD4의 아미노산 서열의 전부 또는 실질적으로 전부를 포함한다.
따라서, 키메라 인간/비인간 CD4를 포함하는 유전자 변형 동물을 생산하기 위한 뉴클레오타이드 작제물이 제공된다. 한 측면에서, 뉴클레오타이드 서열은 5' 및 3' 상동성 암, 인간 CD4 유전자 서열(예를 들어, 인간 CD4 세포외 도메인 유전자 서열, 예를 들어 인간 CD4의 도메인 D1 내지 D2의 전부 또는 실질적으로 전부의 유전자 서열, 예를 들어 인간 CD4의 도메인 D1 내지 D3 및/또는 D2 내지 D3의 전부 또는 실질적으로 전부의 유전자 서열, 예를 들어 인간 CD4의 도메인 D1 내지 D4의 전부 또는 실질적으로 전부의 유전자 서열)을 포함하는 DNA 단편, 및 재조합 부위가 플랭킹된 선택 카세트를 포함한다. 일 실시 형태에서, 인간 CD4 유전자 서열은 인간 CD4의 인트론 및 엑손을 포함하는 게놈 서열이다. 일 실시 형태에서, 상동성 암은 비인간 (예를 들어, 마우스) CD4 게놈 서열과 상동성을 나타낸다. 예시적인 본 발명의 작제물은 도 5a에 나타낸다.
일부 실시 형태에서, 상기 방법에 의해, 키메라 인간/비인간 CD8α 및/또는 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 내인성 CD8 유전자좌에 포함하는 동물이 생산된다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 키메라 인간/비인간 CD8 폴리펩타이드를 발현하도록 비인간 동물의 CD8 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 비인간 동물, 예를 들어 마우스의 내인성 CD8 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD8 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 키메라 인간/마우스 CD8 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 도입, 예를 들어 치환하는 것을 포함하는, 키메라 인간/마우스 CD8 폴리펩타이드를 발현하도록 마우스의 CD8 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공한다. CD8 폴리펩타이드는 CD8α, CD8β 및 이들의 조합으로부터 선택될 수 있다. 한 측면에서, 키메라 폴리펩타이드는 인간 CD8 폴리펩타이드의 세포외 도메인의 전부 또는 실질적으로 전부 및 내인성 마우스 CD8 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함한다.
따라서, 인간/비인간 CD8을 포함하는 유전자 변형 동물을 생산하기 위한 뉴클레오타이드 작제물도 제공된다. 한 측면에서, 뉴클레오타이드 작제물의 서열은 5' 및 3' 상동성 암, 인간 CD8α 또는 CD8β 서열을 포함하는 DNA 단편, 및 재조합 부위가 플랭킹된 선택 카세트를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 인간 서열은 인간 CD8α 또는 CD8β의 인트론 및 엑손, 예를 들어 각각, 인간 CD8α 또는 CD8β의 세포외 도메인을 코딩하는 엑손을 포함한다. 일 실시 형태에서, 상동성 암은 비인간 CD8α 또는 CD8β 서열과 상동성을 나타낸다. CD8α 및 CD8β에 대한 예시적인 작제물은 도 5b에 나타낸다.
CD8α 및 CD8β를 코딩하는 유전자의 근접한 염색체 국재화(close chromosomal localization)때문에, 두 유전자의 순차적 표적화가 성공적인 인간화의 기회를 향상시킨다. 일 실시 형태에서, 표적화 전략은 본 명세서에 기재된 키메라 CD8β 작제물을 ES 세포에 도입하고, 표적화된 ES 세포로부터 마우스를 생산하고, 상기 마우스로부터 유전자 변형 ES 세포를 유도하고, 본 명세서에 기재된 키메라 CD8α 작제물을 상기 유전자 변형 ES 세포에 도입하는 것을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 표적화 전략은 본 명세서에 기재된 키메라 CD8β 작제물을 ES 세포에 도입하고, 키메라 CD8β 작제물을 혼입한 세포를 선택하고, 본 명세서에 기재된 CD8α 작제물을 키메라 CD8β 작제물을 혼입하여 보유하고 있는 ES 세포에 도입하고, 키메라 CD8β 및 CD8α 둘 다를 혼입한 세포를 선택하는 것을 포함한다. 이러한 실시 형태의 한 측면에서, 선택 단계는 다양한 선택 마커를 사용하여 행해진다. 다른 실시 형태에서, CD8α 인간화가 먼저 행해질 수 있다. 유전자 표적화가 완료되면, 유전자 변형 비인간 동물의 ES 세포를 당업계에 공지된 다양한 방법(예를 들어, 문헌[Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659]에 기재된 대립유전자 검정의 변형)에 의해 스크리닝하여, 목적하는 외인성 뉴클레오타이드 서열의 성공적인 혼입 또는 외인성 폴리펩타이드의 발현을 확인할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 유전자 변형 비인간 동물을 생산하는 방법에 의해, 게놈이 재배열되지 않은 인간화 TCR 유전자좌(예를 들어, 재배열되지 않은 인간화 TCRα, TCRβ, TCRδ 및/또는 TCRγ 유전자좌)를 포함하는 동물이 생산된다. 일 실시 형태에서, 인간 가변 영역 및 비인간(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트) 불변 영역을 포함하는 T 세포 수용체를 T 세포 표면에 발현하는 유전자 변형 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트)을 생산하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 제1 비인간 동물에서 내인성 비인간 TCRα 가변 유전자좌를 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 인간화 TCRα 가변 유전자좌로 삽입, 예를 들어 치환하는 단계- 여기서, 상기 인간화 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 TCRα 불변 영역에 작동가능하게 연결됨 -; 예를 들어, 제2 비인간 동물에서 내인성 비인간 TCRβ 가변 유전자좌를 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 인간화 TCRβ 가변 유전자좌로 삽입, 예를 들어 치환하는 단계 - 여기서, 상기 인간화 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 TCRβ 불변 영역에 작동가능하게 연결됨 -; 및 제1 및 제2 비인간 동물을 육종하여, 인간 가변 영역 및 비인간 불변 영역을 포함하는 T 세포 수용체를 발현하는 비인간 동물을 얻는 단계를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 본 발명은 게놈이 재배열되지 않은 인간화 TCRα 유전자좌를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물, 또는 게놈이 재배열되지 않은 인간화 TCRβ 유전자좌를 포함하는 비인간 동물을 생산하는 방법을 제공한다. 다양한 실시 형태에서, 상기 치환은 내인성 유전자좌에서 행해진다. 다양한 실시 형태에서, 상기 방법은 추가의 가변 영역 세그먼트를 포함하는 작제물이 인간화의 각 후속 단계에서 ES 세포로 도입되어, 궁극적으로 인간 가변 영역 세그먼트의 완전한 레퍼토리를 포함하는 마우스를 생산하는 점진적인 인간화 전략을 포함한다(예를 들어, 도 4a 및 도 4b 참조).
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 인간화 TCR 단백질을 발현하도록 비인간 동물의 TCR 가변 유전자좌(예를 들어, TCRα, TCRβ, TCRδ, 및/또는 TCRγ 유전자좌)를 변형시키는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 비인간 동물에서 내인성 비인간 TCR 가변 유전자좌를 재배열되지 않은 인간화 TCR 가변 유전자좌로 삽입, 예를 들어 치환하는 단계를 포함하는, 인간화 TCR 단백질을 T 세포 표면에 발현하도록 TCR 가변 유전자좌를 변형시키는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, TCR 가변 유전자좌는 TCRα 가변 유전자좌이며, 재배열되지 않은 인간화 TCR 가변 유전자좌는 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함한다. 일 실시 형태에서, TCR 가변 유전자좌는 TCRβ 가변 유전자좌이며, 재배열되지 않은 인간화 TCR 가변 유전자좌는 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함한다. 다양한 측면에서, 재배열되지 않은 인간화 TCR 가변 유전자좌는 대응하는 내인성 비인간 TCR 불변 영역에 작동가능하게 연결된다.
따라서, 인간화 TCR 가변 영역 유전자를 포함하는 유전자 변형 동물을 생산하기 위한 뉴클레오타이드 작제물도 제공된다. 한 측면에서, 뉴클레오타이드 작제물은 5' 및 3' 상동성 암, 인간 TCR 가변 영역 유전자 단편(들)을 포함하는 인간 DNA 단편, 및 재조합 부위가 플랭킹된 선택 카세트를 포함한다. 일 실시 형태에서, 인간 DNA 단편은 TCRα 유전자 단편이며, 적어도 하나의 인간 TCRα 가변 영역 세그먼트를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 인간 DNA 단편은 TCRβ 단편이며, 적어도 하나의 인간 TCRβ 가변 영역 유전자 단편을 포함한다. 한 측면에서, 적어도 하나의 상동성 암은 비인간 상동성 암이며, 비인간 TCR 유전자좌(예를 들어, 비인간 TCRα 또는 TCRβ 유전자좌)와 상동성을 나타낸다.
본 발명의 다양한 측면에서, 키메라 인간/비인간 MHC I 및 MHC II 폴리펩타이드를 코딩하는 서열(들)은 내인성 비인간 MHC 유전자좌(예를 들어, 마우스 H-2K 및/또는 H-2E 유전자좌)에 위치한다. 일 실시 형태에서, 이리하여, 내인성 MHC 유전자(들) 또는 이의 부분이 인간 또는 인간화 MHC I 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열(들)로 배치, 예를 들어 치환된다. MHC I, MHC II α 및 MHC II β 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열이 염색체 상에서 서로 근접하게 위치하기 때문에, 한 동물에서 MHC I과 MHC II 둘 다의 인간화에서 최대 성공을 달성하기 위해서는, MHC I 및 MHC II 유전자좌는 순차적으로 표적화되어야 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 키메라 인간/비인간 MHC I, MHC II α 및 MHC II β 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물을 생산하는 방법도 본 명세서에 제공된다.
따라서, 키메라 인간/비인간 MHC를 포함하는 유전자 변형 동물을 생산하기 위한 뉴클레오타이드 작제물이 제공된다. 한 측면에서, 핵산 작제물은 5' 및 3' 비인간 상동성 암, 인간 MHC 유전자 서열(예를 들어, 인간 HLA-A2 또는 인간 HLA-DRs 유전자 서열)을 포함하는 인간 DNA 단편, 및 재조합 부위가 플랭킹된 선택 카세트를 포함한다. 일 실시 형태에서, 인간 DNA 단편은 인간 MHC 유전자(예를 들어, 인간 HLA-A2 또는 HLA-DR2 유전자)의 인트론과 엑손을 모두 포함하는 게놈 단편이다. 일 실시 형태에서, 비인간 상동성 암은 비인간 MHC 유전자좌(예를 들어, MHC I 또는 MHC II 유전자좌)와 상동성을 나타낸다.
일 실시 형태에서, 5' 및 3' 비인간 상동성 암은 각각, 내인성 비인간(예를 들어, 뮤린) MHC 클래스 I 또는 클래스 II 유전자좌의 5' 및 3' 위치(예를 들어, 제1 리더 서열의 5' 및 마우스 MHC I 유전자의 α3 엑손의 3', 또는 마우스 H-2Ab1 유전자의 상류 및 마우스 H-2Ea 유전자의 하류)에 게놈 서열을 포함한다. 일 실시 형태에서, 내인성 MHC 클래스 I 유전자좌는 마우스 H-2K, H-2D 및 H-2L로부터 선택된다. 특정 실시 형태에서, 내인성 MHC 클래스 I 유전자좌는 마우스 H-2K이다. 일 실시 형태에서, 내인성 MHC II 유전자좌는 마우스 H-2E 및 H-2A로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 조작된 MHC II 작제물에 의해, 마우스 H-2E 및 H-2A 유전자 둘 다를 치환할 수 있다. 일 실시 형태에서, 마우스는 H-2D 유전자좌로부터 기능적 내인성 MHC 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 마우스는 내인성 H-2D 유전자좌의 전부 또는 일부가 결실되도록 조작된다. 다른 실시 형태에서, 마우스는 세포 표면에 어떠한 기능적 내인성 MHC I 및 MHC II 폴리펩타이드도 발현시키지 않는다. 일 실시 형태에서, 세포 표면에 마우스에 의해 발현되는 유일한 MHC I 및 MHC II는 키메라 인간/마우스 MHC I 및 MHC II이다.
본 발명은 또한 게놈이 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함하는 유전자 조작 비인간 동물(예를 들어, 유전자 조작 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트)을 생산하는 방법을 제공한다. 한 측면에서, 상기 방법에 의해, 게놈이 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에 포함하는 유전자 조작 설치류, 예를 들어 마우스가 생산된다. 경우에 따라, 마우스는 내인성 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 기능적 마우스 β2 마이크로글로불린을 발현하지 않는다. 일부 측면에서, 상기 방법은 예를 들어, 벨로시진® 기술을 사용하여 제조된 표적화 작제물을 이용하여, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 상기 작제물을 ES 세포에 도입하고, 표적화된 ES 세포 클론을 예를 들어, 벨로시마우스® 기술을 사용하여 마우스 배아에 도입한다.
또한, 유전자 조작 비인간 동물을 생산하는데 사용되는 뉴클레오타이드 작제물이 제공된다. 뉴클레오타이드 작제물은 5' 및 3' 비인간 상동성 암, 인간 β2 마이크로글로불린 서열을 포함하는 인간 DNA 단편, 및 재조합 부위가 플랭킹된 선택 카세트를 포함할 수 있다. 일 실시 형태에서, 인간 DNA 단편은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 인트론과 엑손을 모두 포함하는 게놈 단편이다. 일 실시 형태에서, 비인간 상동성 암은 비인간 β2 마이크로글로불린 유전자좌와 상동성을 나타낸다. 게놈 단편은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4를 포함할 수 있다. 일례로서, 게놈 단편은 5'에서 3' 방향으로, 모두 인간 β2 마이크로글로불린 서열의 엑손 2, 인트론, 엑손 3, 인트론 및 엑손 4를 포함한다. 선택 카세트는 β2 마이크로글로불린 코딩 영역 외부의 작제물 내의 어느 곳에나 위치할 수 있으며, 예를 들어 인간 β2 마이크로글로불린의 엑손 4의 3'에 위치할 수 있다. 5' 및 3' 비인간 상동성 암은 각각, 내인성 비인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 게놈 서열 5' 및 3'을 포함할 수 있다. 다른 실시 형태에서, 5' 및 3' 비인간 상동성 암은 각각, 내인성 비인간 유전자의 엑손 2의 게놈 서열 5' 및 엑손 4의 게놈 서열 3'을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 본 명세서에 기재된 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하도록 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트)의 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 변형시키는 방법에 관한 것이다. 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하도록 비인간 동물, 예를 들어 마우스의 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 변형시키는 한 가지 방법은 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서, 마우스 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 것을 포함한다. 이러한 방법의 일 실시 형태에서, 비인간 동물, 예를 들어 마우스는 내인성 비인간, 예를 들어 마우스 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 기능적 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하지 않는다. 일부 특정 실시 형태에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2 내지 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 다른 실시 형태에서, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 3 및 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본 명세서에 기재된 인간화 유전자좌의 다양한 예시적인 실시 형태가 도 2 내지 도 5에 제시되어 있다.
유전자 표적화가 완료되면, ES 세포 또는 유전자 변형 비인간 동물을 스크리닝하여, 목적하는 외인성 뉴클레오티드 서열의 성공적인 혼입 또는 외인성 폴리펩타이드의 발현을 확인한다. 다수의 기법이 당업자에게 공지되어 있으며, 서던 블롯팅(Southern blotting), 긴 PCR, 정량적 PCR(예를 들어, 태크만(TAQMAN)®을 사용하는 실시간 PCR), 형광 동소 하이브리드화(fluorescence in situ hybridization), 노던 블롯팅(Northern blotting), 유세포 분석, 웨스턴 분석, 면역세포화학, 면역조직화학 등을 포함한다(그러나 이에 제한되지 않음). 일례에서, 목적하는 유전자 변형을 갖는 비인간 동물(예를 들어, 마우스)은, 문헌[Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659]에 기술된 대립유전자 검정의 변형을 사용하여 마우스 대립유전자의 손실 및/또는 인간 대립유전자의 획득에 대해 스크리닝함으로써 동정될 수 있다. 유전자 변형된 동물에서 특정 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 동정하는 다른 검정은 당업자에게 공지되어 있다.
일부 실시 형태에서, 동물은 본 명세서에서 육종에 의해 생산된다.
하나의 비제한적인 측면에서, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 키메라 인간/비인간 CD8 및 인간화 MHC I 및/또는 β2 마이크로글로불린을 포함하는 비인간 동물은 본 명세서에 기재된 키메라 CD8 유전자좌(예를 들어, 키메라 CD8α 및/또는 β 유전자좌)를 포함하는 동물을 인간화 MHC I 및/또는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함하는 동물과 교배시켜 생산될 수 있다. 동물은 또한 예를 들어, 내인성 CD8 유전자좌(예를 들어, 키메라 CD8α 및/또는 β 유전자좌)에서의 치환을 위해, 인간화 MHC I 및/또는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함하는 동물의 ES 세포에 키메라 CD8(예를 들어, 키메라 CD8α 및/또는 β)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 도입하거나; 키메라 CD8 유전자좌(예를 들어, 키메라 CD8α 및/또는 β 유전자좌)를 포함하는 동물의 ES 세포에 인간화 MHC I 및/또는 β2 마이크로글로불린을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열(들)을 도입함으로써 생산될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 키메라 CD8 유전자좌를 포함하는 동물을 먼저, 인간화 TCR 가변 유전자좌를 포함하는 동물과 교배시켜, 인간화 CD8 및 TCR 가변 영역 유전자좌를 포함하는 동물을 생산한 다음에, 인간화 MHC I 및/또는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함하는 동물과 교배시켜, 인간화 MHC I, TCR 가변 유전자 및/또는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함하는 동물을 생산할 수 있다. 대안적으로, 인간화 MHC I 및/또는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함하는 동물을 먼저, 인간화 TCR 가변 유전자좌를 포함하는 동물과 교배시켜, 인간화 MHC I 및 TCR 가변 영역 유전자좌를 포함하는 동물을 생산한 다음에, 키메라 CD8 유전자좌를 포함하는 동물과 교배시켜, 각각, 인간화 MHC I, TCR 가변 유전자 및/또는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함하는 동물을 생산할 수 있다.
한 측면에서, 키메라 인간/비인간 CD4 및 인간화 MHC II를 포함하는 비인간 동물은 본 명세서에 기재된 키메라 CD4 유전자좌를 포함하는 동물을 인간화 MHC II 유전자좌를 포함하는 동물과 교배시켜 생산될 수 있다. 동물은 또한 예를 들어, 내인성 CD4 유전자좌에서의 치환을 위해, 인간화 MHC II 유전자좌를 포함하는 동물의 ES 세포에 키메라 CD4를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 도입하거나; 키메라 CD4 유전자좌를 포함하는 동물의 ES 세포에 인간화 MHC II를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 도입함으로써 생산될 수 있다.
일부 실시 형태에서, 키메라 CD4 유전자좌를 포함하는 동물을 먼저, 인간화 TCR 가변 유전자좌를 포함하는 동물과 교배시켜, 인간화 CD4 및 TCR 가변 영역 유전자좌를 포함하는 동물을 생산한 다음에, 인간화 MHC II 유전자좌를 포함하는 동물과 교배시켜, 인간화 CD4, MHC II 및 TCR 가변 유전자좌를 포함하는 동물을 생산할 수 있다. 대안적으로, 인간화 MHC II 유전자좌를 포함하는 동물을 먼저, 인간화 TCR 가변 유전자좌를 포함하는 동물과 교배시켜, 인간화 MHC II 및 TCR 가변 영역 유전자좌를 포함하는 동물을 생산한 다음에, 키메라 CD4 유전자좌를 포함하는 동물과 교배시켜, 각각, 인간화 MHC II, TCR 가변 유전자 및/또는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 포함하는 동물을 생산할 수 있다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 키메라 인간/비인간 CD8 및 인간화 MHC I 및/또는 β2 마이크로글로불린을 포함하는 비인간 동물을 본 명세서에 기재된 키메라 CD4 유전자좌를 포함하는 동물 및 인간화 MHC II 유전자좌를 포함하는 동물과 교배시켜, 키메라 CD4 및 CD8 폴리펩타이드, 및 인간화 MHC I(및/또는 β2 마이크로글로불린) 및 MHC II 분자를 포함하는 동물을 생산한다. 일부 실시 형태에서, 키메라 인간/비인간 CD4 및 CD8 폴리펩타이드, 및 인간화 MHC I 및 MHC II 분자를 포함하는 동물을 인간화 TCR 가변 도메인을 포함하는 동물과 교배시켜, 실질적인 인간화 T 세포 면역계, 예를 들어 키메라 인간/비인간 CD4 및 CD8 폴리펩타이드, 인간화 MHC I(및/또는 β2 마이크로글로불린) 및 MHC II 분자, 및 인간화 TCR 가변 도메인을 포함하는 동물을 생산한다.
본 명세서에 기재된 유전자 변형 비인간 동물(예를 들어, 마우스) 중 어느 것도 키메라 인간/비인간 CD8(예를 들어, CD8α 및/또는 CD8β); 키메라 인간/비인간 CD4; 인간 또는 인간화 MHC Iα 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린; 인간 또는 인간화 MHC II(예를 들어, MHC IIα 및/또는 MHC IIβ); 및 인간 또는 인간화 TCR(예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ)을 코딩하는 유전자의 1 또는 2개의 카피를 포함할 수 있다. 따라서, 동물은 이러한 유전자 중 어느 하나 또는 모든 유전자에 대하여 이형접합성 또는 동형접합성일 수 있다.
실질적인 인간화 T 세포 면역반응을 일으키는 유전자 변형 비인간 동물의 용도
인간화 CD4와 MHC II, 또는 인간화 CD8과 MHC I(및 β2 마이크로글로불린), 또는 둘 다를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물, 예를 들어 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트는 인간과 유사한 방식으로 펩타이드를 T 세포(각각, CD4+ 또는 CD8+ T 세포)에 제시하는데, 그 이유는 복합체의 구성성분 중 실질적으로 전부가 인간 또는 인간화되기 때문이다. 본 발명의 유전자 변형 비인간 동물은 인간화 동물의 인간 면역계의 기능을 연구하고; 예를 들어, 백신 개발에 사용하기 위해, 면역반응을 유도하는 항원 및 항원 에피토프(예를 들어, T 세포 에피토프, 예를 들어 특이 인간 암 에피토프)의 동정을 위해; 예를 들어, 적응성 T 세포 요법에 사용하기 위해, 인간 병원체 또는 암 항원(즉, 인간 MHC I 복합체와 관련하여 높은 결합력으로 항원에 결합하는 T 세포)에 대한 고친화성 T 세포의 동정을 위해; 백신 후보 물질 및 기타 백신 전략 평가를 위해; 인간 자가면역 연구를 위해; 인간 전염병 연구를 위해; 그렇지 않으면, 인간 MHC 및 CD4/CD8 발현에 기초한 더 나은 치료 전략을 고안하기 위해 사용될 수 있다.
따라서, 다양한 실시 형태에서, 본 발명의 유전자 조작 동물은 그 중에서도 특히, 인간에서 면역반응을 개시하는 항원의 능력을 평가하고, 다양한 항원을 생성하고, 인간 백신 개발에 사용될 수 있는 특이 항원을 동정하는데 유용하다.
한 측면에서, 본 명세서에 기재된 유전자 변형 비인간 동물을 펩타이드에 노출시켜, 상기 비인간 동물이 면역반응을 일으키도록 하며, 상기 비인간 동물에서 본 명세서에 기재된 키메라 인간/비인간 MHC I 또는 II 분자에 의해 제시된 펩타이드의 서열에 결합하는 세포(예를 들어, 각각, 인간 CD8 또는 CD4를 포함하는 CD8+ 또는 CD4+ T 세포)를 검출하는 것을 포함하는, 펩타이드가 인간에서 세포 면역반응을 유발할 것인지를 결정하는 방법이 제공된다. 일 실시 형태에서, 노출 후 비인간 동물은 펩타이드에 결합하는 MHC 클래스 I 제한된 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTL)를 포함한다. 다른 실시 형태에서, 노출 후 비인간 동물은 펩타이드에 결합하는 MHC II 제한된 CD4+ T 세포를 포함한다.
한 측면에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물을 추정 T 세포 에피토프를 포함하는 항원에 노출시키고, 상기 비인간 동물이 면역반응을 일으키게 하고, 상기 비인간 동물로부터 에피토프에 결합하는 MHC 클래스 I- 또는 MHC 클래스 II 제한된 T 세포를 단리하고, 상기 T 세포에 의해 결합된 에피토프를 동정하는 것을 포함하는, 인간 T 세포 에피토프를 동정하는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 추정 항원을 본 명세서에 기재된 마우스에 노출시키고, 상기 마우스가 면역반응을 일으키게 하고, HLA 클래스 I- 또는 클래스 II 제한된 분자에 의해 결합된 항원을 동정하는 것을 포함하는, 인간에서 T 세포 반응을 일으키는 항원을 동정하는 방법이 제공된다.
한 측면에서, 본 명세서에 기재된 마우스를 추정 항원에 노출시키고, 상기 마우스에서 항원 특이적 HLA 클래스 I- 또는 HLA 클래스 II 제한된 면역반응을 측정하는 것을 포함하는, 추정 항원이 인간 면역계에 노출 시에 HLA 클래스 I- 또는 클래스 II 제한된 면역반응을 일으키는 에피토프를 함유하는지를 결정하는 방법이 제공된다.
또한, 본 명세서에 기재된 유전자 조작 비인간 동물은 목적하는 항원, 예를 들어 종양 또는 기타 질환 항원을 인식하는 T 세포 수용체, 예를 들어 고결합성 T 세포 수용체의 동정에 유용할 수 있다. 상기 방법은 본 명세서에 기재된 비인간 동물을 항원에 노출시키고, 상기 비인간 동물이 항원에 대한 면역반응을 일으키게 하고, 인간 또는 인간화 MHC I 또는 MHC II에 의해 제시된 항원에 결합하는 T 세포 수용체를 포함하는 T 세포를 비인간 동물로부터 단리하고, 상기 T 세포 수용체의 서열을 결정하는 것을 포함할 수 있다.
기능적 인간 TCR V(D)J 유전자 단편의 다양한 레퍼토리를 발현하는 비인간 동물은 인간 질환의 연구에 유용할 수 있다. 따라서, 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자 조작 비인간 동물은 인간에서 발현되는 TCR 레퍼토리와 실질적으로 유사한 TCR 레퍼토리를 발현할 수 있으며, 예를 들어 본 명세서에 개시된 비인간 동물의 TCR 레퍼토리는 모든 기능적 인간 TCRα, TCRβ, TCRγ 및/또는 TCRδ 유전자 단편의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%로부터 유래될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 비인간 동물은,
(i) 모든 기능적 인간 TCR Vα 유전자 단편의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%;
(ii) 모든 기능적 인간 TCR Jα 유전자 단편의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%;
(iii) 모든 기능적 인간 TCR Vβ 유전자 단편의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%;
(iv) 모든 기능적 인간 TCR Dβ 유전자 단편의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%; 및/또는
(v) 모든 기능적 인간 TCR Jβ 유전자 단편의 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 97% 또는 적어도 약 99%로부터 유래된 TCR 레퍼토리를 발현한다.
일 실시 형태에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 인간 TCR Vα 유전자 단편 및 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 인간 TCR Vβ 유전자 단편을 포함하는 T 세포 레퍼토리를 생산한다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 제공된 마우스는 각각, 인간의 인간 T 세포에 의해 이용되는 인간 TCR Vα 및/또는 Vβ 유전자의 빈도와 유사한 빈도를 갖는 인간 TCR Vα 및/또는 Vβ 유전자를 이용한다. 비인간 동물의 TCR 레퍼토리에서 발현되는 유전자 단편을 검출하는 방법은 예를 들어, 유세포 분석 및/또는 시퀀싱 방법(예를 들어, 실시간 PCR, 차세대 시퀀싱 등)을 포함한다.
일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자 변형 동물을 추정 인간 치료제에 노출시키고(또는 예를 들어, 이러한 동물의 인간 또는 인간화 MHC II- 또는 MHC I 발현 세포를 추정 치료제의 펩타이드 서열에 노출시킴), 인간 또는 인간화 MHC/펩타이드 복합체를 나타내는 유전자 변형 동물의 세포를 유전자 변형 동물의 세포에 결합할 수 있는 키메라 인간/비인간(예를 들어, 인간/마우스) CD4 또는 CD8을 포함하는 T 세포에 노출시키고, 유전자 변형 동물의 펩타이드 표시 세포에 의해 유도되는 T 세포의 활성화를 측정하는 것을 포함하는, 추정 인간 치료제에 의한 T 세포 활성화를 측정하는 방법이 제공된다.
인간 병원체 또는 신생물로부터 항원 및 항원 에피토프를 동정할 수 있는 능력 이외에, 본 발명의 유전자 변형 동물은 인간 자가면역질환, 예를 들어, 1형 당뇨병, 다발성 경화증 등과 관련이 있는 자가항원을 동정하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 유전자 변형 동물은 인간 자가면역질환의 다양한 측면을 연구하는데 사용될 수 있으며, 자가면역질환 모델로서 이용될 수 있다.
다양한 실시 형태에서, 본 발명의 유전자 변형 비인간 동물은 T 세포 표면에 인간화 TCR 분자를 갖는 T 세포를 생산하고, 결과적으로 인간과 유사한 방식으로 MHC 복합체에 의해 T 세포에 제시된 폴리펩타이드를 인식할 것이다. 본 명세서에 기재된 유전자 변형 비인간 동물은 인간 T 세포의 발생 및 기능, 및 면역 내성의 과정을 연구하고, 인간 백신 후보물질을 시험하고, TCR 유전자 요법에 대한 특정한 특이도를 갖는 TCR을 생산하고, 질환 관련 항원(예를 들어, 종양 관련 항원(tumor associated antigen: TAA)에 대한 TCR 라이브러리를 생성하는데 사용될 수 있다.
T 세포(예를 들어, 세포독성 T 세포)가 목적하는 항원, 예를 들어, 바이러스 항원, 세균성 항원, 종양 항원 등 또는 이를 제시하는 세포를 공격하고 파괴하도록 유도될 수 있기 때문에, 당업계에서 T 세포 요법에 대한 관심이 높아지고 있다. 암 T 세포 요법에서의 초기 연구는 종양 세포 덩어리로부터의 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte: TIL; 종양 항원에 대하여 반응성인 T 세포를 포함하는 것으로 추정되는 종양 덩어리 중의 림프구 집단)를 단리하고, T 세포 성장 인자를 사용하여 이를 시험관내에서 증식시키고, 양자 T 세포 이입(adoptive T cell transfer)이라 불리는 과정에서 환자에게 이를 다시 이식하는 것을 목표로 하였다. 예를 들어, 문헌[Restifo et al. (2012) Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the cell response, Nature Reviews 12:269-81; Linnermann et al. (2011) T-Cell Receptor Gene Therapy: Critical Parameters for Clinical Success, J. Invest. Dermatol. 131:1806-16]을 참조한다. 그러나, 이러한 요법의 성공은 지금까지 흑색종 및 신장 세포암에 제한되어 왔으며, TIL 양자 이입은 특별히 규정된 종양 관련 항원(TAA)을 대상으로 하지 않는다. 문헌[Linnermann et al., 상기 참조].
T 세포가, 목적하는 항원, 예를 들어 TAA를 표적화하기 위해 선택되거나 프로그래밍된 TCR 유전자 요법을 개시하기 위한 시도가 이루어졌다. 현행 TCR 유전자 요법은 특이적 항원, 예를 들어 종양 관련 항원에 대한 TCR의 서열의 동정에 의존한다. 예를 들어, 로젠베르크(Rosenberg)와 동료들은 흑색종 관련 항원 MART-1 에피토프에 특이적인 TCRα 및 β 쇄를 코딩하는 유전자를 갖는 흑색종 환자로부터 유래된 말초 혈액 림프구를 형질 도입하고 양자 T 세포 요법을 위해 얻어진 증식된 림프구를 사용한 몇몇 연구를 발표하였다. 문헌[Johnson et al. (2009) Gene therapy with human and mouse T-cell receptors mediates cancer regression and targets normal tissues expressing cognate antigen, Blood 114:535-46; Morgan et al. (2006) Cancer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes, Science 314:126-29]. 상기 MART-1 특이적 TCR을 TIL 요법 후에 따른 종양 퇴행을 경험한 환자로부터 단리하였다. 그러나, 이러한 TCR, 특히 고결합성 TCR(치료에 가장 유용할 것 같음)의 동정은 대부분의 종양 항원이 자가항원이고, 이들 항원을 표적화하는 TCR이 종종 결실되거나, 주로 면역 내성으로 인해 차선의 친화력을 갖는다는 사실에 의해 복잡하게 된다.
다양한 실시 형태에서, 본 발명은 재배열되지 않은 인간 TCR 가변 유전자좌를 게놈에 포함하는 유전자 조작 비인간 동물을 제공함으로써 이러한 문제점을 해결한다. 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 인간화 T 세포 수용체의 다양한 레퍼토리를 갖는 T 세포를 생산할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 인간화 T 세포 수용체, 예를 들어 양자 T 세포 이입에 사용하기 위한 고결합성 인간화 T 세포 수용체의 다양한 레퍼토리의 공급원일 수 있다.
따라서, 일 실시형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비인간 동물(예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트)을 목적하는 항원으로 면역시키고, 상기 동물이 면역반응을 일으키게 하고, 상기 목적하는 항원에 대한 특이성을 갖는 활성화 T 세포를 상기 동물로부터 단리하고, 상기 항원 특이적 T 세포에 의해 발현되는 T 세포 수용체의 핵산 서열을 결정하는 것을 포함하는, 인간 항원에 대한 T 세포 수용체를 제조하는 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비인간 동물을 목적하는 항원(예를 들어, 질환 관련 항원)으로 면역시키고; 상기 동물이 면역반응을 일으키게 하고; 상기 목적하는 항원에 대하여 반응성인 T 세포를 상기 동물로부터 단리하고; 상기 T 세포에 의해 발현되는 인간 TCR 가변 영역의 핵산 서열을 결정하고; 상기 인간 TCR 가변 영역을 인간 TCR 불변 영역의 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 작제물에 클로닝하여 상기 인간 TCR 가변 영역이 상기 인간 TCR 불변 영역에 작동가능하게 연결되도록 하고; 상기 작제물로부터 상기 목적하는 항원에 대하여 특이적인 인간 T 세포 수용체를 발현시키는 것을 포함하는, 목적하는 항원에 대하여 특이적인 인간 T 세포 수용체의 제조 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, T 세포를 단리하는 단계, 상기 T 세포에 의해 발현되는 인간 TCR 가변 영역의 핵산 서열을 결정하는 단계, 상기 인간 TCR 가변 영역을 인간 TCR 불변 영역의 핵산 서열을 포함하는 뉴클레오타이드 작제물에 클로닝하는 단계 및 인간 T 세포 수용체를 발현시키는 단계는 당업자에게 공지된 표준 기술을 사용하여 수행된다.
일 실시 형태에서, 목적하는 항원에 대한 특이적인 T 세포 수용체를 코딩하는 핵산 서열은 세포에서 발현된다. 일 실시 형태에서, TCR을 발현하는 세포는 CHO, COS, 293, HeLa, PERC.6™ 세포 등으로부터 선택된다.
목적하는 항원은 질환 또는 병태를 일으키거나 이와 관련되는 것으로 공지되어 있는 임의의 항원, 예를 들어 종양 관련 항원, 바이러스, 세균성 또는 기타 병원성 기원의 항원 등일 수 있다. 다수의 종양 관련 항원은 당업계에 공지되어 있다. 종양 관련 항원의 선택은 암 면역(A Journal of the Cancer Research Institute) 펩타이드 데이터베이스(archive.cancerimmunity.org/peptidedatabase/Tcellepitopes.htm)에 제시되어 있다. 본 발명의 일부 실시 형태에서, 목적하는 항원은 인간 항원, 예를 들어 인간 종양 관련 항원이다. 일부 실시 형태에서, 상기 항원은 세포형 특이적 세포내 항원이며, T 세포 수용체는 상기 항원을 발현하는 세포를 사멸시키는데 사용된다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비인간 동물을 목적하는 항원으로 면역시키고, 상기 동물이 면역반응을 일으키게 하고, 상기 항원에 대하여 특이성을 갖는 T 세포를 상기 비인간 동물로부터 단리하는 것을 포함하는, 목적하는 항원, 예를 들어, 종양 관련 항원에 대하여 특이성을 갖는 T 세포를 동정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 양자 T 세포 요법에 대한 신규 방법을 제공한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물을 질환 또는 병태와 관련된 항원으로 면역시키고, 상기 동물이 면역반응을 일으키게 하고, 항원 특이적 T 세포 집단을 상기 동물로부터 단리하고, 단리된 항원 특이적 T 세포를 피험자에게 주입하는 것을 포함하는, 피험자(예를 들어, 포유동물 피험자, 예를 들어, 인간 피험자)에서 질환 또는 병태(예를 들어, 암)를 치료하거나 개선시키는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일 실시 형태에서, 본 발명은 본 명세서에 기재된 비인간 동물을 목적하는 항원(예를 들어, 질환 또는 병태 관련 항원, 예를 들어, 종양 관련 항원)으로 면역시키고, 상기 동물이 면역반응을 일으키게 하고, 항원 특이적 T 세포 집단을 상기 동물로부터 단리하고, T 세포 수용체의 핵산 서열(예를 들어, 재배열된 인간 TCRα 및/또는 재배열된 인간 TCRβ 가변 영역 유전자를 코딩하는 제1 및/또는 제2 핵산 서열); 항원 특이적 T 세포에 의해 발현되는 재배열된 인간 TCRδ 가변 영역 유전자 또는 TCRγ 가변 영역 유전자를 코딩하는 제3 및/또는 제4 핵산 서열을 결정하고, T 세포 수용체의 핵산 서열, 예를 들어 각각, 재배열된 인간 TCRα 가변 영역 유전자, 재배열된 인간 TCRβ 가변 영역 유전자, TCRδ 가변 영역 유전자 또는 TCRγ 가변 영역 유전자를 코딩하는 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 핵산 서열을 발현 벡터(예를 들어, 레트로바이러스 벡터)에 클로닝하고(예를 들어, 임의로 여기서 각각, 재배열된 인간 TCRα 가변 영역 유전자, 재배열된 인간 TCRβ 가변 영역 유전자, TCRδ 가변 영역 유전자 또는 TCRγ 가변 영역 유전자를 코딩하는 제1, 제2, 제3 및/또는 제4 핵산 서열은 각각, 인간 TCRα 불변 유전자, 인간 TCRβ 불변 유전자, TCRδ 불변 유전자 또는 TCRγ 불변 유전자와 인프레임으로 클로닝됨), 상기 벡터를 피험자로부터 유래된 T 세포에 도입하여, 상기 T 세포가 항원 특이적 T 세포 수용체를 발현하도록 하고, 상기 T 세포를 피험자에게 주입하는 것을 포함하는, 인간 피험자의 질환 또는 상태를 치료하거나 개선시키는 방법을 제공한다. 일 실시 형태에서, T 세포 수용체 핵산 서열은 피험자로부터 유래된 T 세포에 도입하기 전에 추가로 인간화되는데, 예를 들어, 비인간 불변 영역을 코딩하는 서열을 변형시켜, 인간 TCR 불변 영역(예를 들어, 비인간 불변 영역을 인간 불변 영역으로 치환함)과 더욱 유사하도록 한다. 일부 실시 형태에서, 상기 질환 또는 병태는 암이다. 일부 실시 형태에서, 항원 특이적 T 세포 집단은 피험자에게 주입되기 전에 증식된다. 일부 실시 형태에서, 피험자의 면역 세포는 항원 특이적 T 세포의 주입 전에 면역고갈된다. 일부 실시 형태에서, 항원 특이적 TCR은 고결합성 TCR, 예를 들어, 종양 관련 항원에 대한 고결합성 TCR이다. 일부 실시 형태에서, 상기 T 세포는 세포독성 T 세포이다. 다른 실시 형태에서, 상기 질환 또는 병태는 바이러스 또는 세균에 의해 발생된다.
다른 실시 형태에서, 상기 질환 또는 병태는 또는 자가면역질환이다. TREG 세포는 자가항원에 대한 내성을 유지하고, 병리학적 자가반응성을 방지하는 T 세포의 소집단이다. 따라서, 또한 본 명세서에 기재된 본 발명의 비인간 동물에서 항원 특이적 TREG 세포의 생산에 의존하는 자가면역질환의 치료 방법이 본 명세서에 제공된다.
또한, 피험자의 질환 또는 병태(예를 들어, 암 세포)에 의해 영향을 받은 세포를 비인간 동물에 도입하고, 상기 동물이 상기 세포에 대한 면역반응을 일으키게 하고, 상기 세포에 대하여 반응성인 T 세포 집단을 상기 동물로부터 단리하고, T 세포에 의해 발현되는 T 세포 수용체 가변 도메인의 핵산 서열을 결정하고, T 세포 수용체 가변 도메인 코딩 서열을 벡터(예를 들어, 인간 TCR 불변 유전자에 인프레임으로 작동가능하게 연결됨)에 클로닝하고, 상기 벡터를 상기 피험자로부터 유래된 T 세포에 도입하고, 상기 T 세포 수용체를 포함하는 상기 피험자의 T 세포를 상기 피험자에게 주입하는 것을 포함하는, 피험자의 질환 또는 병태(예를 들어, 암)를 치료하거나 개선시키는 방법이 본 명세서에 제공된다.
또한 인간 TCR 가변 도메인(예를 들어, TCRα 및/또는 β 가변 도메인)을 코딩하는 핵산 서열을 제조하기 위한 본 명세서에 기재된 비인간 동물의 용도가 본 명세서에 제공된다. 일 실시 형태에서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물을 목적하는 항원으로 면역시키고, 상기 비인간 동물이 상기 목적하는 항원에 대한 면역반응을 일으키게 하고, 이로부터 상기 목적하는 항원에 결합하는 인간 TCR 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 수득하는 것을 포함하는, 인간 TCR 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 제조하는 방법이 제공된다. 일 실시 형태에서, 상기 방법은 T 세포를 본 명세서에 기재된 비인간 동물로부터 단리하여, 이로부터 비인간 불변 영역 TCR 불변 영역에 연결되는 TCR 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 수득하고, TCR 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열(들)(예를 들어, 각각, 재배열된 인간 TCRα 가변 영역 유전자, 재배열된 인간 TCRβ 가변 영역 유전자, TCRδ 가변 영역 유전자 또는 TCRγ 가변 영역 유전자를 코딩하는 제1, 제2, 제3 또는 제4 핵산 서열)을 적절한 인간 불변 영역(예를 들어, 각각, 인간 TCRα 불변 영역 유전자, 인간 TCRβ 불변 영역 유전자, TCRδ 불변 영역 유전자 또는 TCRγ 가변 영역 유전자)과 인프레임으로 클로닝하는 것을 포함하는, 비인간 TCR 불변 영역에 작동가능하게 연결되는 인간 TCR 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 제조하는 단계를 추가로 포함한다.
따라서, TCR 가변 영역 핵산 서열, 예컨대 재배열된 TCR 가변 핵산 서열, 예를 들어 본 명세서에 기재된 비인간 동물에서 생성되고, 각각, 예를 들어 재배열된 인간 Vα/Jα 유전자 서열 및 재배열된 인간 VβDβJβ 유전자 서열에 의해 코딩되는 재배열된 TCRα 및/또는 TCRβ 가변 영역 핵산 서열이 본 명세서에 제공된다. 또한, 이러한 재배열된 TCR 가변 영역 핵산 서열에 의해 코딩되는 TCR 가변 영역 아미노산 서열이 제공된다. 본 명세서에 기재된 비인간 동물에서 수득된 이러한 재배열된 TCR 가변 영역 핵산 서열(TCRα 및/또는 TCRβ 가변 영역 핵산 서열)은 인간 TCR 불변 영역(TCRα 및/또는 TCRβ 불변 영역)과 작동가능한 연결로 클로닝될 수 있으며, 인간에서 예를 들어, 인간 치료제로서 본 명세서에 기재된 다양한 용도에 사용될 수 있다.
또한, 본 명세서에 기재된 비인간 동물을 목적하는 항원(예를 들어, 종양 관련 항원)으로 면역시키고, 상기 비인간 동물이 면역반응을 일으키게 하고, 상기 동물로부터 상기 목적하는 항원에 대하여 반응성인 T 세포를 수득하고, 상기 T 세포로부터 상기 목적하는 항원에 결합하는 인간화 TCR 단백질 또는 인간 TCR 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열(들)을 수득하고, 인간화 TCR 단백질 또는 인간 TCR 가변 도메인을 코딩하는 핵산 서열(들)을 인간 치료제에 사용하는 것을 포함하는, 인간 치료제를 제조하기 위한 비인간 동물의 용도가 본 명세서에 제공된다.
따라서, 본 명세서에 기재된 비인간 동물을 목적하는 항원으로 면역시키고, 상기 비인간 동물이 면역반응을 일으키게 하고, 상기 동물로부터 상기 목적하는 항원에 대해 반응성인 T 세포를 수득하고, 상기 T 세포로부터 상기 목적하는 항원에 결합하는 인간화 T 세포 수용체를 코딩하는 핵산 서열(들)을 수득하고, 상기 인간화(또는 완전 인간) T 세포 수용체를 인간 치료제에 사용하는 것을 포함하는, 인간 치료제의 제조 방법이 제공된다.
일 실시 형태에서, 상기 인간 치료제는 목적하는 핵산 서열(예를 들어, 목적하는 핵산으로 형질감염 또는 형질도입되거나, 아니면 도입됨)을 포함하는 T 세포(예를 들어, 인간 T 세포, 예를 들어, 인간 피험자로부터 유래된 T 세포)이므로, T 세포가 목적하는 항원에 대한 친화력을 갖는 인간화 TCR 단백질을 발현한다. 한 측면에서, 치료제가 사용되는 피험자는 특정한 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하고, 상기 항원은 상기 질환 또는 병태와 관련된다. 한 측면에서, 상기 T 세포는 세포독성 T 세포이고, 상기 항원은 종양 관련 항원이고, 상기 질환 또는 병태는 암이다. 한 측면에서, 상기 T 세포는 피험자로부터 유래된다.
다른 실시 형태에서, 상기 인간 치료제는 T 세포 수용체이다. 일 실시 형태에서, 치료 수용체는 가용성 T 세포 수용체이다. 치료제로 사용하기 위한 가용성 T 세포 수용체 또는 TCR 가변 영역을 생산하기 위해 수많은 노력을 기울여 왔다. 가용성 T 세포 수용체의 생산은 재배열된 TCR 가변 영역을 수득하는데에 좌우된다. 하나의 접근법은 TCRα 및 TCRβ를 포함하는 단일 쇄 TCR을 설계하고, scFv 면역글로불린 포맷과 유사하게, 링커를 통해 함께 이들을 융합하는 것이다(예를 들어, 국제 특허 공개 제WO 2011/044186호 참조). 생성된 scTv는 scFv와 유사하지만 열에 안정한 가용성 형태의 TCRα/β 결합 단백질을 제공할 것이다. 대체 접근법은 TCRβ 불변 도메인을 갖는 가용성 TCR을 설계하고(예를 들어, 문헌[Chung et al., (1994) Functional three-domain single-chain T-cell receptors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:12654-58] 참조); 변성 다이설파이드 결합을 TCR 불변 도메인 사이의 계면에 조작하는 것(문헌[Boulter and Jakobsen (2005) Stable, soluble, high-affinity, engineered T cell receptors: novel antibody-like proteins for specific targeting of peptide antigens, Clinical and Experimental Immunology 142:454-60]에 게재됨; 또한, 미국 특허 제7,569,664호를 참조함)을 포함한다. 가용성 T 세포 수용체의 다른 포맷이 설명되어 있다. 본 명세서에 기재된 비인간 동물은 목적하는 항원에 고친화력으로 결합하는 T 세포 수용체의 서열을 결정하고, 이어서 상기 서열에 기초하여 가용성 T 세포 수용체를 설계하는데 사용될 수 있다.
상기 비인간 동물에 의해 발현되는 TCR 수용체 서열로부터 유래된 가용성 T 세포 수용체는 목적하는 단백질, 예를 들어 바이러스, 세균성 또는 종양 관련 단백질의 기능을 차단하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 가용성 T 세포 수용체는 감염 또는 암 세포, 예를 들어, 세포독성 분자(예를 들면, 화학요법제), 독소, 방사성 핵종, 프로드럭, 항체 등을 사멸시킬 수 있는 부분에 융합될 수 있다. 가용성 T 세포 수용체는 또한 면역조절 분자, 예를 들어, 사이토카인, 케모카인 등에 융합될 수 있다. 가용성 T 세포 수용체는 또한 면역억제 분자, 예를 들어, T 세포에 의해 인식된 항원을 포함하는 다른 세포를 T 세포가 사멸시키는 것을 억제하는 분자에 융합될 수 있다. 면역억제 분자에 융합된 이러한 가용성 T 세포 수용체는, 예를 들어, 자가면역을 차단하는데 사용될 수 있다. 가용성 T 세포 수용체에 융합될 수 있는 각종 면역억제 분자의 예는 본 명세서에 참조로 포함되는 문헌[Ravetch and Lanier (2000) Immune Inhibitory Receptors, Science 290:84-89]에 게재되어 있다.
본 발명은 또한 인간 TCR 재배열, T 세포 발생, T 세포 활성화, 면역 내성 등을 포함한 인간 TCR과 관련한 면역반응을 연구하기 위한 방법을 제공한다.
백신 후보물질을 시험하는 방법도 제공된다. 일 실시 형태에서,백신이 면역반응(예를 들어, T 세포 증식, 사이토카인 방출 등)을 활성화시켜, 이펙터 및 기억 T 세포(예를 들어, 중심 기억 T 세포 및 이펙터 기억 T 세포)의 생산을 유도하는지를 결정하는 방법이 본 명세서에 제공된다.
한 측면에서, 그 표면에 키메라 CD8 단백질을 갖는 T 세포 및 키메라 CD8에 결합하는 제2 세포를 포함하는 시험관내 조합액(in vitro preparation)이 제공된다. 일 실시 형태에서, 제2 세포는 MHC I 폴리펩타이드, 예를 들어, 키메라 인간/비인간 MHC I 단백질을 발현하는 세포이다. 일 실시 형태에서, 제1 세포 표면의 키메라 CD8은 제2 세포 표면의 키메라 MHC I과 상호작용한다. 일 실시 형태에서, 키메라 CD8 단백질은 내인성 세포질 분자, 예를 들어, 내인성 세포질 시그널 전달 분자(예를 들어, 내인성 Lck 등)과의 상호작용을 유지한다.
한 측면에서, 그 표면에 키메라 CD4 단백질을 갖는 T 세포 및 키메라 CD4에 결합하는 제2 세포를 포함하는 시험관내 조합액이 제공된다. 일 실시 형태에서, 제2 세포는 MHC II 폴리펩타이드, 예를 들어, 키메라 인간/비인간 MHC II 단백질을 발현하는 세포, 예를 들어, APC이다. 일 실시 형태에서, 제1 세포 표면의 키메라 CD4는 제2 세포 표면의 키메라 MHC II와 상호작용한다. 일 실시 형태에서, 키메라 CD4 단백질은 내인성 세포질 분자, 예를 들어, 내인성 세포질 시그널 전달 분자(예를 들어, 내인성 Lck 등)과의 상호작용을 유지한다.
본 명세서에 기재된 유전자 변형 동물, 즉, 인간 또는 인간화 T 세포 보조 수용체(예를 들어, 키메라 인간/비인간 CD4 또는 CD8), 임의로 추가로 인간 또는 인간화 MHC II 또는 I 단백질을 포함하는 동물이 본 발명으로부터 명백해질 것이다.
실시예
하기 실시예는 당업자에게 본 발명의 방법 및 조성물을 어떻게 제조하고 사용하는지를 설명하기 위해 제공되는 것이며, 본 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것의 범주를 제한하려고 하는 것은 아니다. 사용된 숫자(예를 들어, 양, 온도 등)와 관련하여 정확성을 확보하기 위한 노력이 이루어졌으나, 일부 실험 오차 및 편차가 고려되어야 한다. 실시예는 당업자에게 잘 알려진 통상적인 방법(분자 클로닝 기술 등)에 대한 상세한 설명을 포함하지 않는다. 달리 명시되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 평균 분자량이고, 온도는 섭씨로 표시되며, 압력은 대기압 또는 대기압 부근이다.
실시예 1: 인간화 MHC 마우스의 생산
대응하는 추가의 내인성 MHC I 및 MHC II 유전자좌 결실(HLA-A2/H-2K, HLA-DR2/H-2E, H-2A-del, H-2D-del)과 함께, 인간화 MHC I 및 MHC II 유전자좌를 포함하는 마우스의 조작에 관련된 다양한 단계가 도 3a에 도시된다. 상기 단계에 대한 상세한 설명은 하기에 나타낸다.
실시예 1.1: 인간화 MHC I 마우스의 생산 및 특성 평가
인간화 MHC I 마우스의 생산에 대해서는 이전에, 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 제20130111617호에 기재되어 있다. 간략하게, 마우스 H-2K 유전자는 벨로시진® 기술을 사용하여 인간 및 마우스 세균 인공 염색체(BAC) DNA로부터 특이적 표적화 벡터를 작제함으로써 단일 단계로 인간화하였다(예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 문헌[Valenzuela et al. (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nat. Biotech. 21(6): 652-659] 참조). 마우스 BAC 클론 RP23-173k21(인비트로겐(Invitrogen))의 DNA를 상동 재조합에 의해 변형시켜, 마우스 H-2K 유전자의 α1, α2 및 α3 도메인을 코딩하는 게놈 DNA를, 인간 HLA-A 유전자의 α1, α2 및 α3 서브유닛을 코딩하는 인간 게놈 DNA로 치환하였다(도 2a).
구체적으로, 마우스 H-2K 유전자의 α1, α2 및 α3 서브유닛을 코딩하는 게놈 서열은 5' 비번역 영역(UTR)을 포함하는 마우스 H-2K 유전자좌의 서열 5'을 포함하는 5' 마우스 상동성 암 및 마우스 H-2K α3 코딩 서열의 게놈 서열 3'을 포함하는 3' 마우스 상동성 암을 갖는 oxP 부위가 플랭킹된 하이그로마이신 카세트를 포함하는 표적화 벡터를 사용하여, 단일 표적화 이벤트에서 인간 HLA-A*0201 유전자의 α1, α2 및 α3 도메인을 코딩하는 인간 게놈 DNA로 치환되었다.
5'에서 3'으로의 내인성 H-2K 유전자좌를 표적화하기 위한 최종 작제물은 (1) 5'UTR을 포함하는 내인성 H-2K 유전자의 마우스 게놈 서열 5' 약 200 bp를 포함하는 5' 상동성 암, (2) HLA-A*0201 리더 서열, HLA-A*0201 리더/α1 인트론, HLA-A*0201 α1 엑손, HLA-A*0201 α1-α2 인트론, HLA-A*0201 α2 엑손, α2-α3 인트론의 5' 말단 약 316 bp를 포함하는 인간 게놈 서열 약 1339 bp, (3) 5' loxP 부위, (4) 하이그로마이신 카세트, (5) 3' loxP 부위, (6) α2 내지 α3 인트론의 3' 말단 약 304 bp, HLA-A*0201 α3 엑손을 포함하는 인간 게놈 서열 약 580 bp, 및 (7) 마우스 H-2K α3와 막관통 코딩 서열 사이의 인트론을 포함하는 마우스 게놈 서열 약 200 bp를 포함하는 3' 상동성 암을 포함하였다. 표적화 벡터의 5'에서의 마우스/인간 서열의 접합부의 149개의 뉴클레오타이드의 서열은 서열 번호 90에 기재되어 있으며, 표적화 벡터의 3'에서의 인간/마우스 서열의 접합부의 159개의 뉴클레오타이드의 서열은 서열 번호 91에 기재되어 있다. 이러한 표적화 벡터에 의한 상동 재조합은 내인성 마우스 H-2K 막관통 및 세포질 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결되는 HLA-A*0201 유전자의 α1, α2 및 α3 도메인을 코딩하는 인간 게놈 DNA를 포함하는 변형된 마우스 H-2K 유전자좌를 생성하였으며, 번역 시에, 키메라 인간/마우스 MHC 클래스 I 단백질을 형성시킨다. 표적화 작제물에 존재하는 선택 카세트는 추후에 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 제거될 수 있다.
표적화된 BAC DNA를 사용하여 마우스 F1H4 ES 세포를 전기천공하여, 유핵 세포(예를 들어, T 및 B 림프구, 대식세포, 호중구)의 표면에 키메라 MHC 클래스 I 단백질을 발현하는 마우스를 생산하기 위해 변형된 ES 세포를 제조하였다(예를 들어, 도 3a에 도시된 도식의 단계 1을 참조함). 인간 HLA 서열의 삽입을 포함하는 ES 세포를 정량적 태크만™ 분석(문헌[Valenzuela et al. (2003)], 상기 참조)에 의해 동정하였다.
키메라 MHC I을 발현하는 마우스를 생산하기 위해, 본 명세서에 기재된 표적화된 ES 세포를 도너 ES 세포로 사용하여, 벨로시마우스® 방법에 의해 8세포기의 마우스 배아에 도입하였다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 문헌[Poueymirou et al. (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99] 참조). 독립적으로 키메라 MHC 클래스 I 유전자를 갖는 벨로시마우스®(완전히 도너 ES 세포에서 유래된 F0 마우스)를 특이적 인간 HLA-A*0201 유전자 서열의 존재를 검출하는 대립유전자 분석(문헌[Valenzuela et al., 상기 참조])의 변형을 이용하여 유전자형 결정에 의해 동정하였다. 이러한 방법으로 생산된 이형접합성 마우스를 동형접합성으로 육종하였다. 키메라 HLA-A2/H-2K의 발현을 HLA-A 및 H-2K에 특이적인 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 확인하였다.
키메라 HLA-A2/H-2K를 포함하는 상술한 표적화된 ES 세포를 실시예 1.2 내지 1.3에 기재된 추가의 유전자 조작 단계에 사용하여, 인간화 MHC I 및 MHC II 유전자좌를 포함하고 내인성 MHC I 및 MHC II 유전자좌가 결여된 마우스를 생산하였다(도 3a 참조).
실시예 1.2: MHC I 및 MHC II 유전자좌 결실을 포함하는 마우스 ES 세포의 생산
내인성 MHC II 유전자좌의 결실은 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 출원 제20130111616호에 기재되어 있다. 간략하게, 내인성 MHC 클래스 II H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 및 H-2Ea 유전자의 결실을 도입하기 위한 표적화 벡터를 벨로시진® 유전자 공학 기술을 사용하여 제조하였다(예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 문헌[Valenzuela et al., 상기 참조] 참조). 세균 인공 염색체(BAC) RP23-458i22(인비트로겐) DNA를 변형시켜, 내인성 MHC 클래스 II 유전자 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 및 H-2Ea를 결실시켰다.
구체적으로, 상류 및 하류 상동성 암을 각각, H-2Ab1 유전자의 위치 5' 및 H-2Ea 유전자의 위치 3'으로부터 마우스 BAC DNA의 PCR에 의해 유도하였다. 이들 상동성 암을 사용하여, 세균 상동 재조합(BHR)에 의해 MHC 클래스 II 유전자좌의 유전자 H-2Ab1, H-2Aa, H-2Eb1, H-2Eb2 및 H-2Ea를 포함하는 RP23-458i22 약 79 kb를 결실한 카세트를 제조하였다. 이러한 영역을 lox2372 부위가 플랭킹된 네오마이신 카세트로 치환하였다. 5'에서 3'으로의 최종 표적화 벡터는 내인성 MHC 클래스 II 유전자좌의 H-2Ab1 유전자의 마우스 게놈 서열 5'을 포함하는 26 kb 상동성 암, 5' lox2372 부위, 네오마이신 카세트, 3' lox2372 부위, 및 내인성 MHC 클래스 II 유전자좌의 H-2Ea 유전자의 마우스 게놈 서열 3'을 포함하는 63 kb 상동성 암을 포함하였다.
BAC DNA 표적화 벡터(상기에 기재됨)를 사용하여 인간화 MHC I 유전자좌를 포함하는 마우스 ES 세포를 천공하여(상기 실시예 1.1; 예를 들어, 도 3a의 단계 2 참조), 내인성 MHC 클래스 II 유전자좌의 결실(H-2A 및 H-2E 둘 다가 결실됨)을 포함하는 변형된 ES 세포를 제조하였다. 결실된 내인성 MHC 클래스 II 유전자좌를 포함하는 양성 ES 세포를 태크만™ 프로브를 사용하여 정량적 PCR 분석에 의해 동정하였다(문헌[Lie and Petropoulos (1998) Curr. Opin. Biotechnology 9:43-48]). 결실된 유전자좌의 상류 영역을 프라이머 5111U F(CAGAACGCCAGGCTGTAAC; 서열 번호 1) 및 5111U R(GGAGAGCAGGGTCAGTCAAC; 서열 번호 2) 및 프로브 5111U P(CACCGCCACTCACAGCTCCTTACA; 서열 번호 3)를 사용하여 PCR에 의해 확인하는 반면에, 결실된 유전자좌의 하류 영역을 프라이머 5111D F(GTGGGCACCATCTTCATCATTC; 서열 번호 4) 및 5111D R(CTTCCTTTCCAGGGTGTGACTC; 서열 번호 5) 및 프로브 5111D P(AGGCCTGCGATCAGGTGGCACCT; 서열 번호 6)를 사용하여 확인하였다. 표적화 벡터로부터의 네오마이신 카세트의 존재를 프라이머 NEOF(GGTGGAGAGGCTATTCGGC; 서열 번호 7) 및 NEOR(GAACACGGCGGCATCAG;서열 번호 8) 및 프로브 NEOP(TGGGCACAACAGACAATCGGCTG; 서열 번호 9)를 사용하여 확인하였다. 상류 결실점(서열 번호 10)에 대한 뉴클레오타이드 서열은 하기를 포함하였으며, 이는 상기 결실점에 존재하는 카세트 서열에 인접하게 연결된 결실점(하기 괄호 내에 포함됨)의 상류에 내인성 마우스 서열을 나타낸다: (TTTGTAAACA AAGTCTACCC AGAGACAGAT GACAGACTTC AGCTCCAATG CTGATTGGTT CCTCACTTGG GACCAACCCT) ACCGGTATAA CTTCGTATAA GGTATCCTAT ACGAAGTTAT ATGCATGGCC TCCGCGCCGG. 하류 결실점(서열 번호 11)에 대한 뉴클레오타이드 서열은 하기를 포함하였으며, 이는 상기 결실점(하기 괄호 내에 포함됨)의 하류에 내인성 마우스 서열과 인접한 카세트 서열을 나타낸다: CGACCTGCAG CCGGCGCGCC ATAACTTCGT ATAAGGTATC CTATACGAAG TTATCTCGAG (CACAGGCATT TGGGTGGGCA GGGATGGACG GTGACTGGGA CAATCGGGAT GGAAGAGCAT AGAATGGGAG TTAGGGAAGA).
상술한 MHC I 인간화 및 내인성 MHC II 결실을 모두 포함하는 ES 세포의 생성에 이어서, CRE를 사용하여 loxed 네오마이신 카세트를 제거하였다(예를 들어, 도 3a의 단계 3 참조). 구체적으로, Cre 재조합효소를 코딩하는 플라스미드를 ES 세포에 전기천공하여 네오마이신 카세트를 제거하였다. Neo 카세트는 또한 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 제거될 수 있다.
마우스 H-2D 유전자좌를 결실시키기 위해, BHR을 사용하여 마우스 BAC 클론 bMQ-218H21(생어 인스티튜트(Sanger Institute))을 변형시켰는데, 3756 bp의 H2-D 유전자(ATG 개시 코돈에서 TGA 종결 코돈의 3 bp 하류에 이르기까지, 마우스 H-2D의 엑손 1 내지 8)를 5'에서 3'으로, 5' loxp 부위, UbC 프로모터, 네오마이신 유전자 및 3' loxp 부위와 인프레임으로 된 LacZ 유전자를 포함하는 6,085 bp 카세트로 치환되었다.
BAC DNA 표적화 벡터(상기에 기재됨)를 사용하여 상술한 인간화 MHC I 유전자좌 및 마우스 MHC II의 결실을 포함하는 마우스 ES 세포를 전기천공하였다(예를 들어, 도 3a의 단계 4 참조). 결실된 내인성 H-2D 유전자좌를 포함하는 양성 ES 세포를 상술한 바와 같이, 정량적 PCR 분석에 의해 동정하였다. 표 2는 정량적 PCR 분석에 사용되는 프라이머 및 프로브를 포함한다.
[표 2]
실시예 1.3: 키메라 인간/마우스 MHC II 유전자좌의 도입
인간화 HLA-DR2/H-2E를 포함하는 벡터를 생성하기 위해, 우선 마우스 H-2Ea 유전자를 본 명세서에 참조로 포함되는 2014년 9월 30일자로 특허 허여된 미국 특허 제8,847,005호의 설명에 따라 변형시켜, 키메라 H-2Ea/HLA-DRA1*01 단백질을 코딩하는 서열을 포함하는 벡터를 생성하였다.
마우스 H-2Eb 유전자에 대해서는, 합성된 인간 HLA-DR2 β 쇄(DRB1*1501)를 사용하여 DRβ1*02(1501) 엑손 및 인트론을 포함하는 벡터를 생성하고, 세균 상동 재조합을 사용하여 키메라 H-2Ea/HLA-DRA1*01 단백질을 포함하는 벡터로 교환하였다. H-2Eb1 유전자를 기본적으로 각각, 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 제20130185820호 및 미국 특허 제8,847,005호에 기재된 바와 같이 변형시켰다. 하이그로마이신 선택 카세트를 사용하였다.
생성된 HLA-DR2/H-2E 큰 표적화 벡터(LTVEC)를 도 2b 및 도 3b에 나타내었다. 생성된 LTVEC의 각종 뉴클레오타이드 서열 접합부(예를 들어, 마우스/인간 서열 접합부, 인간/마우스 서열 접합부, 또는 마우스 또는 인간 서열과 선택 카세트의 접합부)가 하기 표3에 요약되고, 서열 목록에 기재되어 있으며; 이들의 위치를 도 3b의 개략도에 나타내었다. 하기 표 3에서, 별표(*, 표 범례 참조)로 표시된 서열을 제외하고는, 마우스 서열은 일반 글꼴로 되어 있고; 인간 서열은 괄호 안에 있으며; Lox 서열은 이탤릭체로 되어 있고; 클로닝 단계 시에 도입된 제한 부위 및 다른 벡터 기반 서열(예를 들어, 다중 클로닝 부위 등)은 볼드체로 되어 있다.
[표 3]
상술한 표적화된 BAC DNA를 사용하여 MHC II 및 H-2D 결실뿐만 아니라, 인간화 MHC I(HLA-A2)을 포함하는 마우스 ES 세포를 전기천공하여, 키메라 MHC I 및 MHC II 유전자를 발현하고, 기능적 내인성 마우스 H-2E, H-2A, H-2K 및 H-2D 유전자좌가 결여된 마우스를 생산하기 위한 변형된 ES 세포를 생성하였다(예를 들어, 도 3a의 단계 5 참조). 인간 HLA 서열의 삽입을 포함하는 ES 세포를 표 4의 프라이머 및 프로브를 사용하여, 정량적 PCR(태크만™) 분석에 의해 동정하였다.
[표 4]
선택 카세트는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제거될 수 있다. 예를 들어, 키메라 인간/마우스 MHC 클래스 I 유전자좌를 갖는 ES 세포는 표적화 작제물의 삽입에 의해 도입된 "loxed" 선택 카세트를 제거하기 위해 Cre를 발현하는 작제물로 형질감염될 수 있다(예를 들어,도 3a의 단계 6 참조). 선택 카세트는 Cre 재조합효소를 발현하는 마우스로 육종함으로써 선택적으로 제거될 수 있다. 선택적으로, 선택 카세트는 마우스에 보유된다.
본 명세서에 기재된 모든 변형(도 3a의 HLA-A2/H-2K, HLA-DR2/H-2E, H-2A-del, H-2D-del)을 포함하는 표적화된 ES 세포를 각각의 변형에 대하여 본 명세서에 기재된 프라이머/프로브 세트를 사용하여 상술한 정량적 태크만® 분석을 사용하여 확인하였다. 추가의 프라이머/프로브 세트를 사용하여, 카세트 결실 단계 시에 반대 방향으로 존재하는 lox 부위로 인해 역위 클론이 생성되지 않았음을 확인하였다.
상술한 표적화된 ES 세포를 도너 ES 세포로 사용하여, 벨로시마우스® 방법에 의해 8세포기의 마우스 배아에 도입하였다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 문헌[Poueymirou et al. (2007), 상기 참조] 참조). 독립적으로 키메라 MHC 클래스 I 및 MHC II 유전자를 갖는 벨로시마우스®(완전히 도너 ES 세포에서 유래된 F0 마우스)를 특이적 인간 유전자 서열의 존재를 검출하는 대립유전자 분석(문헌[Valenzuela et al., 상기 참조])의 변형을 이용하여 유전자형 결정에 의해 동정하였다. 생산된 마우스에서의 MHC 유전자좌의 유전자형의 개략도를 도 3c에 나타내었다(**는 모든 마우스 계통에 존재하지 않는 H-2L 유전자를 나타냄). 키메라 인간/마우스 MHC I 및 MHC II 단백질의 발현을 인간 HLA-DR2 및 HLA-A2에 특이적인 항체를 사용하여 확인하였다. 이형접합성 마우스를 동형접합성으로 육종하였다.
실시예 1.4: 인간화 β2 마이크로글로불린 마우스의 생산
β2 마이크로글로불린 마우스의 생산에 대해서는 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 제20130111617호에 기재되어 있다. 간략하게, 마우스 β2 마이크로글로불린(β2m) 유전자는 벨로시진® 기술을 사용하여 인간 및 마우스 세균 인공 염색체(BAC) DNA로부터 특이적 표적화 벡터를 작제함으로써 단일 단계로 인간화하였다(예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 문헌[Valenzuela et al., 상기 참조] 참조).
구체적으로, RPCI-23 라이브러리(인비트로겐)의 BAC 클론 89C24로부터의 마우스 β2m 상류 및 하류 상동성 암을 포함하는 세균 상동 재조합에 의해 표적화 벡터를 생성하였다. 마우스 상동성 암을 조작하여, 엑손 2에서 비코딩 엑손 4의 약 267개의 뉴클레오타이드 하류까지 연장된 2.8kb 인간 β2m DNA 단편을 플랭킹하였다(도 2c). 재조합효소 인식 부위(예를 들어, loxP 부위)가 플랭킹된 약물 선택 카세트(네오마이신)를 표적화 벡터 내로 조작하여, 후속 선택을 가능하게 하였다. 최종 표적화 벡터를 선형화시켜, F1H4 마우스 ES 세포주에 전기천공시켰다(문헌[Valenzuela et al., 상기 참조]).
약물 카세트가 제거된(Cre 재조합효소의 도입에 의해) 표적화된 ES 세포 클론을 벨로시마우스® 방법에 의해 8세포기의 마우스 배아에 도입하였다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 문헌[Poueymirou et al., 상기 참조] 참조). 인간화 β2m 유전자를 갖는 벨로시마우스®(완전히 도너 ES 세포에서 유래된 F0 마우스)를 대립유전자 분석(문헌[Valenzuela et al., 상기 참조])의 변형을 사용하여 마우스 대립유전자의 손실 및 인간 대립유전자의 획득을 스크리닝함으로써 동정하였다. 이형접합성 마우스를 동형접합성으로 육종하였다. 인간 β2 마이크로글로불린의 발현을 인간 β2 마이크로글로불린에 특이적인 항체를 사용하여 유세포 분석에 의해 확인하였다.
실시예 2: 인간화 T 세포 수용체 마우스의 생산
내인성 TCR (α 또는 β) 가변 유전자좌의 결실 및 내인성 V 및 J 또는 V, D 및 J 세그먼트의 치환을 포함하는 마우스를 벨로시진® 유전자 공학 기술을 사용하여 생산하였으며(예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 문헌[Valenzuela, D.M., et al. (2003), 상기 참조] 참조), 여기서 세균 상동 재조합을 사용하여 BAC 라이브러리로부터 유래된 인간 서열을 사용하여, 표적화 암이 플랭킹된 인간 TCR 가변 유전자좌의 게놈 단편을 포함하는 큰 표적화 벡터(LTVEC)를 제조하여, LTVEC를 마우스 ES 세포의 내인성 마우스 TCR 가변 유전자좌로 표적화하였다. TCR 알파 및 베타 유전자좌의 인간화에 대한 상세한 설명은 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 제9,113,616호에 기재되어 있다. LTVEC를 문헌[Valenzuela et al]에 따라 선형화하여, 마우스 ES 세포주에 전기천공하였다. ES 세포를 하이그로마이신 또는 네오마이신 내성에 대하여 선택하고, 마우스 대립유전자의 손실 또는 인간 대립유전자의 획득에 대하여 스크리닝하였다.
표적화된 ES 세포 클론을 벨로시마우스® 방법에 의해 8세포기(또는 그 이전)의 마우스 배아에 도입하였다(문헌[Poueymirou, W.T. et al. (2007, 상기 참조])). 인간화 TCR 유전자좌를 갖는 벨로시마우스®(완전히 도너 ES 세포에서 유래된 F0 마우스)를 대립유전자 분석(문헌[Valenzuela et al., 상기 참조])의 변형을 사용하여 내인성 TCR 가변 대립유전자의 손실 및 인간 대립유전자의 획득을 스크리닝함으로써 동정하였다. F0 새끼들을 유전자형으로 하여, 동형접합성으로 육종하였다. 인간화 TCRα 및/또는 TCRβ 가변 유전자좌에 동형접합성인 마우스를 본 명세서에 기재된 바와 같이 생산하였다.
실시예 2.1: TCR 알파 유전자좌의 인간화
110 V 및 60 J 마우스 세그먼트에 대응하는 마우스 TCRα 유전자좌에서의 DNA 1.5 메가염기쌍을 도 4a에 요약되고 미국 특허 제9,113,616호에 기재된 점진적 인간화 전략을 이용하여, 인간 TCRα의 54V 및 61J 세그먼트에 대응하는 DNA 1 메가염기쌍으로 치환하였다. TCRα 유전자좌의 점진적 인간화 전략에 사용된 각종 표적화 벡터의 접합부 핵산 서열은 표 5에 요약되어 있고, 서열 목록에 포함되어 있다.
[표 5]
우선, 마우스 BAC 클론 RP23-6A14(인비트로겐)의 DNA를 상동 재조합에 의해 변형시키고, 표적화 벡터로서 사용하여, 내인성 마우스 TCRα 유전자좌의 TCRAJ1 내지 TCRAJ28 영역을 Ub-하이그로마이신 카세트, 이어서 loxP 부위로 치환하였다. 마우스 BAC 클론 RP23-117i19(인비트로겐)의 DNA를 상동 재조합에 의해 변형시키고, 표적화 벡터로서 사용하여, 내인성 마우스 TCRα 및 δ 유전자좌의 TCRAV1을 둘러싼(포함하는) 약 15kb 영역을 PGK-네오마이신 카세트, 이어서 loxP 부위로 치환하였다. 이중 표적화 염색체(즉, 이들 두 표적화 벡터로 표적화된 단일 내인성 마우스 TCRα 유전자좌)를 갖는 ES 세포를 당업계에 공지된 핵형 분석 및 스크리닝 방법(예를 들어, 태크만™)에 의해 확인하였다. 변형된 ES 세포를 CRE 재조합효소로 처리함으로써, 2개의 loxP 부위 사이의 영역(즉, TCRAV1 내지 TCRAJ1의 내인성 마우스 TCRα 유전자좌로 이루어진 영역)의 결실을 매개하여, 단일 loxP 부위, 네오마이신 카세트 및 마우스 불변 및 인핸서 영역 만을 남겨 두었다. 이러한 전략에 의해, 결실된 마우스 TCRα/δ 유전자좌(MAID 1540, 도 4a, 제2 다이어그램)를 생산하였다.
TCRα에 대한 최초의 인간 표적화 벡터는 최초 2개의 연속적인 인간 TCRα V 유전자 단편(TRAV40 및 41) 및 61개의 TCRαJ(50개의 기능적) 유전자 단편을 포함하는 CTD2216p1 및 CTD2285m07 BAC 클론(인비트로겐)의 인간 DNA 191,660 bp를 갖고 있었다. 이러한 BAC를 3' 마우스 상동성 암의 라이게이션을 위한 TCRαJ1 유전자 단편 하류(3')의 Not1 부위 403 bp 및 5' 마우스 상동성 암의 라이게이션을 위한 5' AsiSI 부위를 포함하도록 상동 재조합에 의해 변형시켰다. 이러한 인간 단편에 라이게이션하기 위해 2개의 상이한 상동성 암을 사용하였다: 3' 상동성 암은 RP23-6A14 BAC 클론의 내인성 마우스 TCRα 서열을 포함하고, 5' 상동성 암은 마우스 BAC 클론 RP23-117i19 유래의 마우스 TCRαV의 내인성 TCRα 서열 5'을 포함하였다. 이러한 마우스-인간 키메라 BAC를 마우스 TCRα 유전자좌에서 인간 TCRα 유전자 단편과 상류 loxp-ub-하이그로마이신-loxp 카세트의 초기 삽입을 행하기 위한 표적화 벡터(MAID 1626)로서 사용하였다. MAID 1626 표적화 벡터에 대한 접합부 핵산 서열(서열 번호 46 내지 48)은 표 5에 기재되어 있다.
이어서, loxP-네오마이신-loxP 및 loxP-하이그로마이신-loxP(또는 MAID 1979의 경우, frt-하이그로마이신-frt) 선택 카세트가 교대로 있는 마우스 BAC 클론 RP23-117i19 유래의 마우스 TCRαV의 내인성 TCRα 서열 5'을 포함하는 동일한 마우스 5' 암을 사용하여 일련의 인간 표적화 벡터를 제조하였다. 특이적 작제물은 표 5 및 서열 목록에 포함된 각각의 삽입부에 대한 접합부 서열과 함께, 도 4a 뿐만 아니라, 미국 특허 제9,113,616호에 기재되어 있다. 최종 TCRα 유전자좌는 5' loxp-ub-네오마이신-loxP 카세트와, 마우스 TCRα 불변 유전자 및 인핸서에 작동가능하게 연결되는 총 54개의 인간 TCRαV(45개의 기능적) 및 61개의 인간 TCRαJ 유전자 단편을 포함하였다. TMAID 1771 표적화 벡터에 대한 접합부 핵산 서열(서열 번호 57 및 58)은 표 5에 기재되어 있다.
점진적 인간화 단계들 중 어느 단계에서, 선택 카세트는 Cre 또는 Flp 재조합효소에 의한 결실에 의해 제거된다. 또한, 인간 TCRδ 유전자좌는 TCR 알파 서열에 재도입될 수 있다.
실시예 2.2: TCRβ 가변 유전자좌의 인간화
33 V, 2 D 및 14 J 마우스 세그먼트에 대응하는 마우스 TCRβ 유전자좌에서의 DNA 0.6 메가염기쌍을 도 4b에 요약되고 미국 특허 제9,113,616호에 상세히 기재된 점진적 인간화 전략을 이용하여, 인간 TCRβ의 67 V, 2D 및 14 J 세그먼트에 대응하는 DNA 0.6 메가염기쌍으로 치환하였다. TCRβ 유전자좌의 점진적 인간화 전략에 사용된 각종 표적화 벡터의 접합부 핵산 서열은 표 6에 요약되어 있고, 서열 목록에 포함되어 있다.
[표 6]
구체적으로, 마우스 BAC 클론 RP23-153p19(인비트로겐)의 DNA를 상동 재조합에 의해 변형시키고, 표적화 벡터로서 사용하여, 내인성 마우스 TCRβ 유전자좌의 3' 트립시노겐(TRY) 유전자 클러스터 바로 상류의 17kb 영역(TCRBV30 포함)을 PGK-neo 카세트, 이어서 loxP 부위로 치환하였다. 마우스 BAC 클론 RP23-461h15(인비트로겐)의 DNA를 상동 재조합에 의해 변형시키고, 표적화 벡터로서 사용하여, 내인성 마우스 TCRβ 유전자좌의 5' 트립시노겐 (TRY) 유전자 클러스터 하류의 8355 bp 영역(TCRBV2 및 TCRBV3 포함)을 Ub-하이그로마이신 카세트, 이어서 loxP 부위로 치환하였다. 이중 표적화 염색체(즉, 두 표적화 벡터로 표적화된 단일 내인성 마우스 TCRβ 유전자좌)를 갖는 ES 세포를 당업계에 공지된 핵형 분석 및 스크리닝 방법(예를 들어, 태크만™)에 의해 확인하였다. 변형된 ES 세포를 CRE 재조합효소로 처리함으로써, 5' loxP 부위와 3' loxP 부위 사이의 영역(TCRBV2 내지 TCRBV30의 내인성 마우스 TCRβ 유전자좌로 이루어짐)의 결실을 매개하여, 단일 loxP 부위, 하이그로마이신 카세트 및 마우스 TCRBD, TCRBJ, 불변 및 인핸서 서열 만을 남겨 두었다. 도 4b에 나타낸 바와 같이, 하나의 마우스 TCRVβ가 트립시노겐 유전자의 5' 클러스터의 상류에 남았고, 하나의 마우스 TCRVβ가 마우스 Eβ의 하류에 남았다.
TCRβ에 대한 최초의 인간 표적화 벡터는 최초 14개의 연속적인 인간 TCRβV 유전자 단편(TRBV18-TRBV29-1)을 포함하는 CTD2559j2 BAC 클론(인비트로겐)의 인간 DNA 125,781 bp를 가졌으며; MAID 1625 표적화 벡터에 대한 접합부 핵산 서열(서열 번호 59 내지 61)은 표 6에 기재되어 있다.
마우스 TCRβ D 및 J 세그먼트를 인간 TCRβ D 및 J 세그먼트로 치환하기 위해, 마우스 BAC 클론 RP23-302p18(인비트로겐) 및 인간 BAC 클론 RP11-701D14(인비트로겐)의 DNA를 표적화 벡터(MAID 1715)로서 사용하여, 상동 재조합에 의해 상술한 TCRβV mini-유전자좌(즉, MAID 1625)를 포함한 ES 세포로 변형시켰다. 이러한 변형에 의해, 내인성 마우스 TCRβ 유전자좌의 약 18540 bp 영역(3' 트립시노겐 유전자의 폴리A의 100 bp 하류로부터, 마우스 TCRBD1-J1, 마우스 불변 1 및 마우스 TCRBD2-J2를 포함한 D2 클러스터의 J 세그먼트로부터의 100 bp 하류까지)이 인간 TCRBD1-J1, loxP Ub-하이그로마이신-loxP 카세트, 마우스 불변 1, 인간 TCRBD2-J2를 포함하는 서열 약 25425 bp로 치환되었다. 이중 표적화 염색체(즉, 두 표적화 벡터로 표적화된 단일 내인성 마우스 TCRβ 유전자좌)를 갖는 ES 세포를 당업계에 공지된 핵형 분석 및 스크리닝 방법(예를 들어, 태크만™)에 의해 확인하였다. 변형된 ES 세포를 CRE 재조합효소로 처리함으로써, 하이그로마이신 카세트의 결실을 매개하여, D1J 클러스터의 인간 J 세그먼트로부터의 단일 loxP 부위 만을 남겨 두었다. MAID 1715 표적화 벡터에 대한 접합부 핵산 서열(서열 번호 62 내지 66)은 표 6에 기재되어 있다.
이어서, 선택 카세트가 교대로 있는 마우스 BAC 클론 RP23-461h15 유래의 상류 마우스 트립시노겐 유전자를 둘러싸는 내인성 TCRβ 서열을 포함하는 동일한 마우스 5' 암을 사용한 일련의 인간 표적화 벡터를 제조하였다. 특이적 작제물은 표 6 및 서열 목록에 포함된 각각의 삽입부에 대한 접합부 서열과 함께, 도 4b 뿐만 아니라, 미국 특허 제9,113,616호에 기재되어 있다.
최종적으로, 마우스 TCRβ 불변 유전자 및 인핸서에 작동가능하게 연결되는 총 66개의 인간 TCRβV(47개의 기능적) 및 인간 TCRβ D 및 J 세그먼트를 포함하는 인간 TCRβ mini-유전자좌(MAID 1792)가 생성되었다. TMAID 1792 표적화 벡터에 대한 접합부 핵산 서열(서열 번호 69 및 70)은 표 6에 기재되어 있다.
마우스 TCRBV31은 TCRBC2(제2 TCRB 불변 영역 서열)의 약 9.4 kb 3'에 위치하고, 다른 TCRBV 세그먼트에 반대 방향으로 되어 있다. 동등한 인간 V 세그먼트는 TCRBV30이며, 인간 TCRB 유전자좌의 유사한 위치에 위치된다. TCRBV31을 인간화하기 위해, 마우스 TCRBV31을 포함하는 마우스 BAC 클론을 세균 상동 재조합에 의해 변형시켜, LTVEC MAID 6192를 제조하였다. 엑손 1의 개시 코돈에서 시작하는 전체 코딩 영역, 인트론, 3' UTR 및 TCRBV31의 재조합 시그널 서열(RSS)을 상동성 인간 TCRBV30 서열로 치환하였다. 도 4b는 hTCRBV30 유전자의 엑손 1과 엑손 2 사이의 인트론에 위치한 선택 카세트를 도시한다.
TMAID 6192 표적화 벡터에 대한 접합부 핵산 서열(서열 번호 71 및 72)은 표 6에 기재되어 있다. MAID 6192 DNA를 MAID1792 ES 세포에 전기천공하고, 마우스 TCRB31 대립유전자의 손실 및 인간 TCRB30 대립유전자의 획득에 대하여 세포를 스크리닝하였다.
남아 있는 5' 마우스 TCRβ V 세그먼트를 임의로 결실시키기 위해 유사한 유전자 조작 전략을 사용한다.
상기 단계들 중 어느 단계에서, 선택 카세트는 Cre 또는 Flp 재조합효소에 의한 결실에 의해 제거된다.
인간화 TCRα 가변 유전자좌에 동형접합성인 마우스를 인간화 TCRβ 가변 유전자좌에 동형접합성인 마우스와 교배시켜, 인간화 TCRα 및 TCRβ 가변 유전자좌를 포함하는 자손을 생산하였다. 자손을 인간화 TCRα 및 인간화 TCRβ 유전자좌에 대하여 동형접합성으로 육종하였다.
인간화 TCRα 및 TCRβ 가변 유전자좌를 포함하는 마우스는 정상적인 T 세포 발생이 행해지고 다양한 가변 유전자 단편으로부터 유래된 가변 도메인을 발현하는 T 세포 수용체를 포함하는 것으로 확인된다.
실시예 3: T 세포 보조 수용체 유전자좌의 인간화
CD4 및 CD8 유전자좌(CD8 알파 및 CD8 베타 유전자좌 모두)의 인간화는 본 명세서에 그 전체가 참조로 포함되는 미국 특허 출원 공개 제20140245466호에 상세히 기재되어 있다.
실시예 3.1: CD4 유전자좌의 인간화
구체적으로, 마우스 CD4 유전자좌는 벨로시진® 기술을 사용하여 인간 및 마우스 세균 인공 염색체(BAC) DNA로부터 특이적 표적화 벡터를 작제함으로써 단일 단계로 인간화하였다(예를 들어, 미국 특허 제6,586,251호 및 문헌[Valenzuela et al. (2003), 상기 참조] 참조). 표적화 벡터를 생성하기 위해, 미국 특허 출원 공개 제20140245466호에 상세히 기술된 바와 같이, 세균 인공 염색체(BAC) DNA를 사용하는 일련의 세균 상동 재조합(BHR) 및 다른 유전자 조작 단계를 행하였다.
인간 CD4 표적화 벡터를 NotI로 선형화시켜, F1H4 마우스 ES 세포에 전기천공시켰다. 인간화 CD4 유전자좌를 갖는 표적화된 ES 세포를 네오마이신 카세트 및 인간 CD4 유전자, 및 마우스 CD4 유전자의 1개의 카피의 존재를 검출하는 대립유전자 분석(Valenzuela et al.)의 변형을 이용하여 유전자형 결정에 의해 동정하였다.
인간화 CD4 표적 벡터의 ES 세포로의 성공적인 혼입으로부터 유래된 최종 인간화 CD4 유전자좌가 도 5a에 도시된다. 인간 인트론 3 - lox-neo 카세트 접합부(카세트의 5' 말단)에 대한 서열은 서열 번호 75에 기재되어 있고, lox-neo 카세트 - 인간 인트론 3 접합부(카세트의 3' 말단)에 대한 서열은 서열 번호 76에 기재되어 있으며, 두 서열은 또한 표 7에 기재되어 있다. 도 5a에 나타낸 pgk-neo 카세트를 포함하는 인간화 CD4 부분의 완전한 핵산 서열이 서열 번호 77에 기재되어 있다. pgk-neo 카세트는 서열 번호 77의 잔기 307 내지 2176에 걸쳐 있고, 2개의 lox 부위는 잔기 267 내지 300, 및 2182 내지 2215에 위치하는 반면에, 인간 서열은 잔기 1 내지 234 및 2222 내지 18263에 걸쳐 있다. 완전한 인간화 CD4 단백질의 아미노산 서열은 서열 번호 78에 기재되어 있으며, 인간 서열은 아미노산 27 내지 319에 걸쳐 있다(서열 번호 79에 기재됨).
[표 7]
플록스된 네오마이신 내성 카세트는 Cre 재조합효소를 발현하는 플라스미드를 인간화 CD4 유전자좌를 포함하는 ES 세포에 전기천공함으로써 제거되었다.
내성 마커가 없는 인간화 CD4 유전자좌를 갖는 표적화된 ES 세포를 네오마이신 카세트의 부재, 인간 CD4 유전자의 1개의 카피의 존재 및 마우스 CD4 유전자의 1개의 카피의 존재를 검출하는 유전자형 결정에 의해 동정하였다.
상술한 표적화된 ES 세포를 도너 ES 세포로 사용하여, 벨로시마우스® 방법에 의해 8세포기의 마우스 배아에 도입하였다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 문헌[Poueymirou et al. (2007), 상기 참조] 참조). 독립적으로 키메라 CD4 유전자를 갖는 벨로시마우스®(완전히 도너 ES 세포에서 유래된 F0 마우스)를 특이적 인간 CD4 유전자 서열의 존재를 검출하는 대립유전자 분석(문헌[Valenzuela et al., 상기 참조])의 변형을 이용하여 유전자형 결정에 의해 동정하였다. T 세포 표면의 인간화 CD4 단백질의 발현을 항 인간 CD4 항체를 사용하여 검출하였다. 본 명세서에 기재된 인간화 CD4 단백질에 이형접합성인 마우스를 동형접합성으로 육종하였다.
실시예
3.2: CD8
유전자좌의
인간화
CD8α 및 CD8β 유전자는 게놈에서, 예를 들어 마우스 염색체 6 상에 공국재화(colocalization)되며, 이들은 서로 약 37 kb 떨어져 위치한다. 밀접한 관련으로 인해, 먼저 하나의 유전자, 예를 들어 CD8β를 도입한 후에, 다른 하나의 유전자, 예를 들어 CD8α를 도입함으로써 순차적 표적화가 행해진다. 인간화에 대한 구체적인 세부 단계는 본 명세서에 참조로 포함되는 미국 특허 공개 제20140245466호에 기재되어 있다.
간략하게, 마우스 CD8β 유전자좌는 벨로시진® 기술을 사용하여 마우스 세균 인공 염색체(BAC) DNA로부터 특이적 표적화 벡터를 작제함으로써 단일 단계로 인간화하였다. BAC RP23-431M6로부터의 DNA를 BHR로 변형시켜, 큰 표적화 벡터(LTVEC), MAID 1737을 생성시켜, CD8 세포외 도메인(인트론 1의 5' 접합부에서 인트론 3의 3' 접합부까지)을 코딩하는 마우스 엑손 2 내지 3을 상동성 인간 서열로 치환하는 것을 포함시켰다(도 5b). loxp-Ub-Hyg 카세트를 인트론 3의 3' 접합부에 삽입하였다. 생성된 벡터의 다양한 접합부에서의 뉴클레오타이드 서열이 표 8에 열거되어 있으며, 서열 목록에 기재되어 있다. 인간화 CD8β 단백질의 완전한 아미노산 서열은 서열 번호 83에 기재되어 있으며; 인간 서열은 아미노산 15 내지 165(서열 번호 84에 기재됨)에 걸쳐 있다.
[표 8]
표적화 벡터를 F1H4 마우스 ES 세포에 전기천공하였다. 인간화 CD8β 유전자좌를 갖는 표적화된 ES 세포를 인간 CD8βδ 유전자의 존재를 검출하는 대립유전자 분석(Valenzuela et al.)의 변형을 이용하여 유전자형 결정에 의해 동정하였다.
마우스 CD8α 유전자좌는 벨로시진® 기술을 사용하여 마우스 세균 인공 염색체(BAC) DNA로부터 특이적 표적화 벡터를 작제함으로써 단일 단계로 인간화하였다. BAC RP23-431M6로부터의 DNA를 BHR로 변형시켜, 큰 표적화 벡터(LTVEC), MAID 1738을 생성시켜, CD8α 세포외 도메인(마우스 엑손 1의 Ala 코돈 27에서의 5' 접합부에서 마우스 인트론 2의 3' 접합부까지)을 코딩하는 마우스 엑손 1 내지 2를 상동성 인간 서열(인간 엑손 2의 5' 접합부에서 인트론 3의 3' 접합부까지(도 5a))로 치환하는 것을 포함시켰다. 이것은 엑손 1의 시작 부분에 마우스 리더 서열을 보유한다. lox2372-Ub-Neo 카세트를 인간/마우스 서열의 3' 접합부에 삽입하였다. 생성된 벡터의 다양한 접합부에서의 뉴클레오타이드 서열이 표 9에 열거되어 있으며, 서열 목록에 기재되어 있다. 인간화 CD8α 폴리펩타이드의 완전한 아미노산 서열은 서열 번호 88에 기재되어 있으며, 인간 서열은 아미노산 28 내지 179에 걸쳐 있다(서열 번호 89에 기재됨).
[표 9]
상술한 인간화 CD8α 표적화 벡터를 인간화 CD8b 유전자좌를 포함하는 마우스 ES 세포에 전기천공시켜, 인간화 CD8b 및 CD8a 유전자좌를 포함하는 변형된 ES 세포를 생성하였다(도 5b). 인간화 CD8a 및 CD8b 유전자좌를 갖는 표적화된 ES 세포를 대립유전자 분석(Valenzuela et al.)의 변형을 이용하여 유전자형 결정에 의해 동정하였다.
상술한 표적화된 ES 세포를 도너 ES 세포로 사용하여, 벨로시마우스® 방법에 의해 8세포기의 마우스 배아에 도입하였다(예를 들어, 미국 특허 제7,294,754호 및 문헌[Poueymirou et al., 상기 참조] 참조). 키메라 CD8b 유전자 및 키메라 CD8a 유전자를 갖는 벨로시마우스®(완전히 도너 ES 세포에서 유래된 F0 마우스)를 특이적 인간 CD8b 및 CD8a 유전자 서열의 존재를 검출하는 대립유전자 분석(문헌[Valenzuela et al., 상기 참조])의 변형을 이용하여 유전자형 결정에 의해 동정하였다.
CD8α 및 CD8β 유전자좌의 선택 카세트는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제거될 수 있다. 본 명세서에 기재된 인간화 CD8α 및 CD8β 유전자좌에 이형접합성인 마우스를 동형접합성으로 육종하였다. T 세포 표면의 인간화 CD8α 및 CD8β의 발현을 항 인간 CD8 항체를 사용하여 검출하였다.
실시예 4: 인간화 세포 면역계 구성성분을 포함하는 마우스의 생산
인간화 세포 면역계 구성성분을 포함하는 마우스를 생산하기 위해, 다양한 구성성분, 예를 들어, MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M의 인간화에 동형접합성인 마우스를 임의의 조합으로 교배시켜, 인간화된 T 세포 면역반응의 다양한 구성성분을 갖는 마우스를 생산할 수 있다. 예를 들어, 인간화 MHC I을 포함하는 마우스를 인간화 β2M을 포함하는 마우스와 교배시켜, 인간화 MHC I/β2M을 발현하는 마우스를 생산할 수 있다. 다양한 구성성분, 예를 들어, MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M의 인간화에 동형접합성인 마우스를 당업계에 공지된 방법을 사용하여 교배하여, 모든 9가지의 인간화를 포함하는 마우스("TM I/II B C4/8" 마우스)를 수득하였다. 마우스를 당업계에 공지된 방법을 사용하여 동형접합성으로 육종하였다. 대안적으로, 각각의 인간화 유전자를 포함하는 표적화 벡터를 순차적 표적화를 통해 동일한 ES 세포에 도입하여, 모든 9가지의 인간화를 포함하는 ES 세포를 수득할 수 있으며, 생성된 ES 세포를 상기 실시예 1 내지 3에 기재된 벨로시마우스® 방법에 의해 8세포기의 마우스 배아에 도입하였다.
실시예
5: 인간화 세포 면역계 구성성분을 포함하는 마우스의 특성 평가
인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β에 동형접합성인 마우스 및 인간화 β2M에 동형접합성인 마우스를 특성 평가하였다. 구체적으로, 마우스로부터 비장 및 흉선을 채취하여, 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 현탁액을 4℃에서 5분간 1200 rpm으로 원심분리하여, 세포를 펠릿화하고, 각 조직으로부터의 세포를 ACK 용해 완충액(집코(GIBCO)) 4 mL로 적혈구를 용해시켰다. 세포를 세포 여과기로 여과하고, 원심분리하여 펠릿화하고, 배지에 재현탁시켜 계수 하였다.
도 6a 내지 도 6c 및 도 9a 내지 도 9c에 도시된 CD19, CD3, CD4 및 CD8α의 세포 표면 발현을 형광색소 결합 항체를 사용하여 FACS로 분석하였다: 항 마우스 CD3(17A2, BD), 항 마우스 CD19(1D3, BD), 항 마우스 F4/80(BM8, 바이오레전드(Biolegend)), 항 마우스 CD8α(53-6.7, BD), 항 마우스 CD4(RM4-5, 이바이오사이언스(eBioscience)), 항 인간 CD8α(SK1, BD) 및 항 인간 CD4(RPA-T4, BD). 도 7a 내지 도 7f 및 도 10a 내지 도 10f의 마우스 H2Db, 인간 HLA 분자(HLA-A2, B2m 및 HLA-DR) 및 마우스 MHC IAIE 분자의 세포 표면 발현을 형광색소 결합 항체를 사용하여 FACS로 분석하였다: 항 마우스 CD19(6D5, 바이오레전드), 항 마우스 F4/80(BM8, 바이오레전드), 항 마우스 H2Db(KH95, 바이오레전드), 항 인간 HLA-A2(BB7.2, BD), 항 인간 HLA-DR(G46-6, BD), 항 인간 B2-마이크로글로불린(2M2, 바이오레전드) 및 항 마우스 IAIE(M5/114.15.2, 이바이오사이언스). 도 7g 및 도 10g의 마우스 및 인간 CD4 및 CD8의 세포 표면 발현을 형광색소 결합 항체를 사용하여 FACS로 분석하였다: 항 마우스 CD3(17A2, 바이오레전드), 항 마우스 CD4(GK1.5, 이바이오사이언스), 항 마우스 CD8α(53-6.7, BD 2), 항 마우스CD8β(H35-17.2, 이바이오사이언스), 항 인간 CD4(OKT4, 이바이오사이언스), 항 인간 CD8α (RPA-T8, BD 6), 항 인간 CD8β(2ST8.5H7, BD). 도 8 및 도 11에 도시된 FoxP3 및 CD25의 세포 표면 발현을 FACS 항 FoxP3 (FJK-16s, 이바이오사이언스) 및 항 CD25 (PC61, 바이오레전드)로 분석하였다. 도 9d 내지 도 9e에 도시된 CD44 및 CD62L의 세포 표면 발현을 항 CD44(IM7, BD) 및 항 CD62L(MEL-14, 바이오레전드)을사용하여 분석하였다.
모든 유세포 분석을 BD 포르테사(BD Fortessa)를 사용하여 행하였다. 데이터를 플로조(FlowJo)를 사용하여 분석하였다.
흉선에서의 발현은 도 6a 내지 도 6c, 도 7a 내지 7g, 및 도 8에 도시되어 있다. 흉선 세포 및 CD3+ 세포의 절대수 및 전반적인 흉선 T 세포 발생은 대조군 마우스 및 인간화 TM I/II B C4/8 마우스(데이터는 나타내지 않음)와 비교할만 하였다. 도 6a는 인간화 세포 면역계(TM I/II B C4/8)를 갖는 마우스의 흉선에서의 B 세포 및 T 세포의 비율이 대조군 마우스에서 발견된 비율과 유사함을 나타낸다. TM I/II B C4/8 마우스의 흉선에서의 F4/80 세포의 빈도 및 수를 대조군 마우스와 비교하였다(도 6b, 데이터는 나타내지 않음). 또한, 인간화 CD4 및 CD8은 비인간화 대조군 마우스에서의 마우스 CD4 및 CD8의 발현과 유사하게, 모든 9가지의 세포 면역 유전자(TM I/II B C4/8)에 대하여 인간화된 마우스의 흉선 세포에 발현되었다(도 6c). 인간화 β2M은 인간화 TM I/II B C4/8 마우스의 B 세포 및 대식세포의 표면에 발현되는 반면에, 그 발현은 대조군 마우스의 B 세포 및 대식세포에는 존재하지 않았다(도 7a 및 도 7b). 유사하게, 인간화 MHC I 및 II는 인간화 TM I/II B C4/8 마우스의 B 세포 및 대식세포의 표면에 존재하지만(도 7c 및 도 7d), 마우스 MHC 클래스 I 및 II 분자는 검출 불가능하였다(도 7e 및 도 7f). 인간화 CD4, CD8α 및 CD8β는 인간화 TM I/II B C4/8 마우스로부터 수득한 CD3+ 흉선 세포의 표면에 발현되지만, 대조군 마우스의 CD3+ 흉선 세포에는 존재하지 않았다(도 7g). 인간화 TM I/II B CD4/8은 조절 T 세포(Treg) (도 8), NK 세포(CD335+CD3-) 및 단핵구(CD11b+)(데이터는 나타내지 않음)를 발현하였다.
비장에서의 발현은 도 9a 내지 도 9d, 및 도 10a 내지 도 10g에 도시되어 있다. 세포 면역계 구성성분에 대하여 인간화된 마우스(TM I/II B CD4/8)의 비장은 동등한 절대수의 CD3+ 세포 및 거의 정상 비율의 B 및 T 세포를 포함하였다(도 9a, 데이터는 나타내지 않음). TM I/II B C4/8 마우스의 비장에서의 F4/80 세포의 빈도 및 수를 대조군 마우스와 비교하였다(도 9b, 데이터는 나타내지 않음). 세포 면역계 구성성분에 대하여 인간화된 마우스(TM I/II B CD4/8)는 CD3+ 비장 세포 상에 인간화 CD4 및 CD8α를 발현하였다(도 9c). 인간화 TM I/II/ B CD4/8 마우스는 기억 이펙터(CD44+CD62L-) CD4+ 및 CD8+ T 세포 및 중심 기억(CD44+ CD62L+) CD8+ T 세포를 포함하였다(도 9d 및 도 9e).
도 10a 및 도 10b에 도시된 바와 같이, 인간화 β2M은 인간화 TM I/II B C4/B 마우스의 비장에서 B 세포 및 대식세포의 표면에 발현되는 반면에, 그 발현 및 마우스 MHC 분자의 발현은 대조군 마우스의 비장의 B 세포 및 대식세포에는 존재하지 않았다. 유사하게, 인간화 MHC I 및 II는 인간화 TM I/II B C4/B 마우스의 비장에서의 B 세포 및 대식세포의 표면에 존재하지만(도 10c 및 도 10d), 마우스 MHC 클래스 I 및 II 분자는 검출 불가능하였다(도 10e 및 도 10f). 인간화 CD4, CD8α 및 CD8β는 인간화 TM I/II B C4/8 마우스로부터 수득한 CD3+ 비장 세포의 표면에 발현되지만, 대조군 마우스의 CD3+ 비장 세포에는 존재하지 않았다(도 10g). TM I/II B C4/8 마우스는 대조군 마우스와 비교하여, 비장 조절 T 세포의 정상 발현에 가깝고(도 11), 비장 NK 세포(CD335+CD3-) 및 단핵구(CD11b+)를 발현하였다.
실시예 6: 인간 펩타이드에 의한 T 세포의 제시 및 활성화의 평가
인간화 세포 면역계 구성성분을 포함하는 마우스가 인간화 T 세포 면역반응을 나타내는지를 결정하기 위해, 세포 면역계 구성성분에 대하여 인간화된 마우스(TM I/II B CD4/8)의 비장 세포가 인간 HLA-A2에 의해 특이적으로 제시되는 펩타이드인 MAGE-A3를 제시하고 이에 반응하는 능력을 시험하였다.
인간 HLA-A2에 의해 특이적으로 제시되는 펩타이드인 MAGE-A3를 합성하여(Celtek Biosciences), PBS로 희석하고, 완전 프로인트 애주번트(Complete Freund's Adjuvant(CFA); 콘드렉스 인코퍼레이티드(Chondrex, Inc.))와 동일한 부피로 혼합하여, 200 ㎍의 MAGE-A3가 200 μl 에멀젼에 함유되었다. 50 μl의 에멀젼을 각 동물의 4개의 스팟에 주사하였다. 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M에 동형접합성인 마우스(TM I/II B CD4/8) 또는 내인성 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M을 발현하는 대조군 마우스에서 각각, 뒷 옆구리에 2개의 스팟 및 어깨 근처의 2개의 스팟이었다.
면역화 마우스로부터의 비장 현탁액을 수득하여 해리시켰다. 적혈구를 ACK 용해 완충액(라이프 테크놀러지즈(Life Technologies))에서 용해시키고, 비장 세포를 RPMI 완전 배지에 현탁시켰다. 10 ㎍/mL 또는 1 ㎍/mL의 희석된 MAGE-A3 펩타이드의 존재 또는 부재 하에서, 5 ㎍/mL의 마우스 IFN-γ 포획 항체(BD Biosciences)로 코팅된 PVDF 플레이트(Millipore)의 웰에 대하여 단리된 2×105개의 비장 세포를 ELISPOT 분석으로 시험하였다. 펩타이드와 함께 16 내지 20시간 인큐베이션한 후에, 플레이트를 세척하여, 비오틴화 검출 항체(BD Biosciences)와 함께 인큐베이션하고, 세척하여, 스트렙타비딘(Streptavidin)-HRP(MabTech)으로 처리하고, 세척하여, TMB 기질(Mabtech)로 발현시켜, AID 엘리스팟 리더(Elispot reader)로 계수하였다.
각 유전자형에 대하여 단 1마리의 마우스가 제시되지만, 각 유전자형에 대하여 여러 마리의 마우스를 테스트하고, 모든 샘플에 대하여 3회 실시하여, 표준편차를 오차막대로 표시하였다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 인간화 MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M에 동형접합성인 각 마우스(TM I/II B CD4/8)의 샘플 만이 HLA-A2-특이적 펩타이드 MAGE-A3로 처리한 후에 IFN-γ를 분비하여 반응하였는데, 이것은 이들 마우스의 T 세포가 인간화 HLA-A2에 의한 MAGE-A3의 제시 후에 활성화되었음을 나타낸다.
실시예 7: LCMV 감염 모델을 이용한 T 세포 기능 평가
인간화 세포 면역계 구성성분을 포함하는 마우스가 감염에 대한 정상 반응을 나타내는지를 결정하기 위해, 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV)를 제거하는 인간화 마우스의 능력을 시험하였다. LCMV는 마우스 지향성(mouse tropic) 바이러스이며, 감염의 운명은 바이러스 계통에 좌우된다. 암스트롱 계통에의 노출은 급성 감염을 초래하며, 마우스는 신속하게 바이러스에 대한 T 세포 반응을 일으킬 수 있고, 약 1주 후에 감염을 제거할 수 있다. 반면에, 클론 13 바이러스는 제거될 수 없고, T 세포가 "고갈"(T 세포 고갈과 관련된 마커, 예를 들어 PD1, Lag3, Tim3 발현)되어, 만성 감염이 확립된다. 암스트롱 계통을 갖는 CD8 고갈 또는 MHC 클래스 I 결손 마우스의 감염이 높은 바이러스 역가를 유지하는 것으로 밝혀졌다(문헌[J. Virol. 68:8056-63 (1994)]). 따라서, 바이러스 감염이 T 세포 활성에 좌우되기 때문에, LCMV는 T 세포 기능을 시험하는 이상적인 모델이다.
인간화 세포 면역계 구성성분, 예를 들어, MHC I, MHC II α 및 β, TCRα 및 β, CD4, CD8α 및 β, 및 β2M을 포함하는 마우스가 정상적인 T 세포 기능을 나타내는지를 결정하기 위해, 대조군 마우스와 인간화(TM I/II B C4/8) 마우스 둘 다를 0일째에 2x105 ffu의 암스트롱 바이러스 균주로 복강내 감염시켰다. 3, 6, 9 및 12일째에, 장기를 채취하여, 바이러스 역가를 측정하였다. 도 13a에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스와 인간화 마우스 둘 다는 암스트롱 감염을 제거할 수 있었다.
대조군 마우스와 인간화 마우스 둘 다를 또한 0일째에 4.5×105 ffu의 클론 13 바이러스로 정맥내 감염시키고, 21일째에 장기를 채취하여, 바이러스 역가를 측정하였다. 도 13b에 나타낸 바와 같이, 두 마우스 계통은 만성 LCMV 감염이 확립될 수 있었다. T 세포 고갈의 마커인 PD1, Lag3 및 Tim3를 발현시키는 인간화 마우스의 능력도 측정되었다. 감염 3주 후에 감염되지 않은 마우스와 감염된 인간화 마우스에서 혈액을 채취하고, 유세포 분석을 사용하여 PE-Cy7 결합 항 PD1 항체(바이오레전드), PerCpCy5.5 결합 Lag3 항체(바이오레전드) 및 PE 결합 Tim3 항체(R&D Systems)로 염색하였다. 도 13c의 데이터는 표시된 수용체에 대하여 양성인 세포 염색의 정량화를 나타낸다. 인간화(TM I/II B C4/8) 마우스와 대조군 B6 마우스 둘 다는 만성 LCMV 클론 13 균주로 감염된 지 3주 후에 세가지의 T 세포 고갈의 마커를 모두 발현하였다.
세포 면역계 구성성분에 대하여 인간화된 마우스의 기억 T 세포 반응을 평가하기 위해, 5 마리의 대조군 마우스와 4 마리의 인간화 마우스를 2×105 ffu의 암스트롱 균주로 감염시키고, 17일째에 4.5×105 ffu의 클론 13 균주로 중복감염시켰다(인간화 및 대조군 마우스 각각의 2마리를 추가의 대조군으로서 모의감염시켰다). 초기 감염 후 31일째에, 장기를 채취하여, 바이러스 역가를 분석하였다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 이어서 급성 LCMV 감염을 경험한 5/5 대조군 마우스 및 3/4 인간화 마우스가 만성 LCMV 감염으로부터 보호되었는데, 이는 이들 동물에서 손상되지 않은 기억 T 세포 반응을 입증한다.
세포 반응의 특성을 분석하기 위해, 0 일째에 대조군 마우스와 인간화 마우스를 2×105 ffu의 암스트롱 바이러스 균주로 감염시켰다. 10일째에(도 15a 내지 도 15b) 또는 감염 후 지시된 시점에(도 15c 내지 도 15d), 인간 CD8+ T 세포(GPC10-18, N69-77 또는 Z49-58)를 활성화시키는 것으로 알려진 3개의 HLA-A2 제한된 펩타이드(문헌[Botten et al. (2007) J. Virol. 81:2307-17] 참조), 또는 H-2Db 백그라운드에서 마우스에 의해 인식되는 면역우성 LCMV 펩타이드인 gp33을 사용하여 세포 반응의 특이성을 분석하였다. 특히, CD8+ T 세포를 채취된 비장으로부터 단리하여, 펩타이드로 펄스(pulse)하였다. 인터페론-γ(IFNγ)을 생성하는 CD8+ 세포를 엘리스팟(도 15a 내지 도 15b) 또는 세포내 IFNγ 염색(도 15c 내지 도 15d)에 의해 측정하였다.
대조군 동물로부터 단리된 CD8+ T 세포는 gp33 펩타이드에 의해 특이적으로 활성화되는 반면에(도 15a), 인간화 동물로부터 단리된 CD8+ T 세포는 HLA-A2 제한된 펩타이드에 의해 활성화되었다(도 15b). 펩타이드로 자극되었을때 IFNγ를 발현하는 능력에 의해 모니터되는 CD8+ T 세포 활성화의 경시변화에 의하면, 대조군 마우스와 인간화 마우스에서, CD8+ T 세포가 감염 후 처음 2주간 증식되고, 바이러스가 제거된 후에는 검출할 수 없음을 보여준다(도 15c 내지 도 15d). gp33 펩타이드에 대한 반응이 대조군 동물에서 더 강하게 나타났지만, gp33은 알려진 면역우성 LCMV 에피토프이며, 면역우성 HLA-A2 제한된 LCMV 에피토프는 동정되지 않았음을 주목해야 한다. 결론적으로, 인간화 또는 실질적인 인간화 T 세포 면역계를 포함하는 동물은 LCMV 발현된 단백질을 처리하여 인간화 MHC 분자 상에 제시하고 인간화 T 세포 수용체를 통해 T 세포를 활성화시킬 수 있다.
균등물
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 본 발명의 특정 실시 형태의 많은 균등물을 인식하거나 확인 가능할 것이다. 이러한 균등물은 하기 청구범위에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 전반에 걸쳐 인용된 모든 비특허 문헌, 특허 출원 및 특허의 전체 내용은 전체적으로 본 명세서에 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> REGENERON PHARMACEUTICALS, INC.
<120> HUMANIZED T CELL MEDIATED IMMUNE RESPONSES IN NON-HUMAN ANIMALS
<130> 10145WO01
<150> US 62/143,687
<151> 2015-04-06
<150> US 62/158,804
<151> 2015-05-08
<150> US 62/186,935
<151> 2015-06-30
<160> 91
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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cagaacgcca ggctgtaac 19
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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ggagagcagg gtcagtcaac 20
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<211> 24
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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caccgccact cacagctcct taca 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
<400> 4
gtgggcacca tcttcatcat tc 22
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<211> 22
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cttcctttcc agggtgtgac tc 22
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aggcctgcga tcaggtggca cct 23
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<223> synthetic
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ggtggagagg ctattcggc 19
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<211> 17
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<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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tgggcacaac agacaatcgg ctg 23
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<211> 140
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 10
tttgtaaaca aagtctaccc agagacagat gacagacttc agctccaatg ctgattggtt 60
cctcacttgg gaccaaccct accggtataa cttcgtataa ggtatcctat acgaagttat 120
atgcatggcc tccgcgccgg 140
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<211> 140
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 11
cgacctgcag ccggcgcgcc ataacttcgt ataaggtatc ctatacgaag ttatctcgag 60
cacaggcatt tgggtgggca gggatggacg gtgactggga caatcgggat ggaagagcat 120
agaatgggag ttagggaaga 140
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<211> 17
<212> DNA
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cgaggagccc cggtaca 17
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<223> synthetic
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aagcgcacga actccttgtt 20
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<223> synthetic
<400> 14
ctctgtcggc tatgtgg 17
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<211> 22
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 15
ggactcccag aatctcctga ga 22
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<211> 25
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<223> synthetic
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gagtcatgaa ccatcactgt gaaga 25
<210> 17
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<223> synthetic
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tggtgggttg ctggaa 16
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<220>
<223> synthetic
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ctgtttcttc cctaactccc attctatgct cttccatccc gaccgcggcc caatctctct 60
ccactacttc ctgcctacat gtatgtaggt 90
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caaggtttcc tcctatgatg cttgtgtgaa actcggggcc ggccagcatt taacagtaca 60
gggatgggag cacagctcac 80
<210> 20
<211> 80
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 20
gaaagcagtc ttcccagcct tcacactcag aggtacaaat ccccattttc atattagcga 60
ttttaattta ttctagcctc 80
<210> 21
<211> 80
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 21
tcttccctaa ctcccattct atgctcttcc atcccgaccg cggcccaatc tctctccact 60
acttcctgcc tacatgtatg 80
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<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 22
gagttcctcc atcacttcac tgggtagcac agctgtaact gtccagcctg tcctgggctg 60
caggtggtgg gcgttgcggg tggggccggt taaggttcca 100
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<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 23
tcccacatcc tattttaatt tgctccatgt tctcatctcc atcagcacag ctcgagataa 60
cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat atgcatggcc 100
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<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 24
atacgaagtt atgctagtaa ctataacggt cctaaggtag cgagtggctt acaggtaggt 60
gcgtgaagct tctacaagca cagttgcccc ctgggaagca 100
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 25
tgcggccgat cttagcc 17
<210> 26
<211> 18
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<223> synthetic
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ttgaccgatt ccttgcgg 18
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
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<220>
<223> synthetic
<400> 27
acgagcgggt tcggcccatt c 21
<210> 28
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 28
ccccacagca cgtttcct 18
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 29
cgtcccattg aagaaatgac act 23
<210> 30
<211> 15
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 30
tggcagccta agagg 15
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<211> 18
<212> DNA
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<220>
<223> synthetic
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ccccacagca cgtttcct 18
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<211> 17
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 32
acccgctccg tcccatt 17
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 33
agcctaagag ggagtgtc 18
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 34
agaccctggt gatgctggaa 20
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 35
cgcttgggtg ctccactt 18
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 36
tcgaagtgga gaggttta 18
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 37
tggaatggag tgagcagctt t 21
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<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 38
gcacggtccc cttcttagtg 20
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<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 39
tgacttccta aatttctc 18
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 40
ctggcggctt gaagaatttg g 21
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 41
catgatttcc aggttggctt tgtc 24
<210> 42
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 42
cgatttgcca gctttgaggc tcaagg 26
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 43
cctcacttgg gaccaaccct a 21
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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ttgtcccagt caccgtccat 20
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 45
tgcatctcga gcacaggcat ttgg 24
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<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 46
atggagtagt cagaacacac tcttcagaag ggactcctga tttcaaaggg ggtaccgggc 60
cccccctcga ggtcgacata acttcgtata gcatacatta 100
<210> 47
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 47
ggccatgcat ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttataccggt gcgatcgcgc 60
gcttccctct tctaaccact aattcaaaaa ggattgtaag taatgttt 108
<210> 48
<211> 145
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 48
agacagaccc ctaaacacct ccaaattaaa agcggcaaag agataaggtt ggagctccac 60
cgcggtggcg gccgccaccg cggtggagct cgaggtttcc ggtacttaac aacagagcac 120
agatttagtg gtgagggact ctctc 145
<210> 49
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 49
atggagtagt cagaacacac tcttcagaag ggactcctga tttcaaaggg ggtaccgggc 60
cccccctcga ggtcgacata acttcgtata gcatacatta 100
<210> 50
<211> 109
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 50
ggccatgcat ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttataccggt gcgatcgctc 60
aagcatgcaa gggtaacata tgttatgaga ttatattttc tttatctca 109
<210> 51
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 51
atggagtagt cagaacacac tcttcagaag ggactcctga tttcaaaggg gggtaccggg 60
ccccccctcg agaagttcct attccgaagt tcctattctc 100
<210> 52
<211> 108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 52
gttcctattc cgaagttcct attctctaga aagtatagga acttcctagg gcgatcgctc 60
ctctccaggc tcgaattagt attacagttg aggcacgttg tcctcccg 108
<210> 53
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 53
atggagtagt cagaacacac tcttcagaag ggactcctga tttcaaaggg ggtaccgggc 60
cccccctcga ggtcgacata acttcgtata gcatacatta 100
<210> 54
<211> 108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 54
ggccatgcat ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttataccggt gcgatcgccg 60
cctccatttc cttcatagga aacatgaagt gaatggggct gtgtgtgt 108
<210> 55
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 55
atggagtagt cagaacacac tcttcagaag ggactcctga tttcaaaggg ggtaccgggc 60
cccccctcga ggtcgacata acttcgtata gcatacatta 100
<210> 56
<211> 108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 56
ggccatgcat ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttataccggt gcgatcgctg 60
ggagcacgtt ccattattat aacaactttc tgaacacaag agggcagt 108
<210> 57
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 57
atggagtagt cagaacacac tcttcagaag ggactcctga tttcaaaggg ggtaccgggc 60
cccccctcga ggtcgacata acttcgtata gcatacatta 100
<210> 58
<211> 108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 58
ggccatgcat ataacttcgt atagcataca ttatacgaag ttataccggt gcgatcgctt 60
taaggtgagg aggcaggcaa taccccctct ccaccgcatt ctcaatcc 108
<210> 59
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 59
gggggggtgg ggtggaggag gagggtacag catctcctct ccttcctctc tggtaccgaa 60
gttcctattc cgaagttcct attctctaga aagtatagga 100
<210> 60
<211> 108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 60
gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttcctaggg tttcaccggt gcgatcgcgt 60
gaatatacta aaaaccactt aattatatat ttgaaagggt ggatgtta 108
<210> 61
<211> 108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 61
ctctctccta cccagctcct ctcacacgag cctgaaggcc ctgccaaggt ggcgcgcctt 60
tcaaattgtt gttgagttca aagtgggcaa cagaaaaggg ggtgtgag 108
<210> 62
<211> 130
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 62
aataaatagt aaatttctgt agaatcataa tgaggtctag acccccgggc tcgataacta 60
taacggtcct aaggtagcga aatggcgcgt aatcaagccc agctcttcat gctgcatttt 120
tatcttcttt 130
<210> 63
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 63
ttgactcggg ggtgcctggg tttgactgca atgatcagtt gctgggaagg accggtataa 60
cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat atgcatggcc 100
<210> 64
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 64
ccggcgcgcc ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgtcgac ataaggtaag 60
acagagtcgt cccttcccat ctggaaccct ctacctttct 100
<210> 65
<211> 107
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 65
gttgatgaat cataaaagaa gagatattca agaaaaggat ggccacactg cggccgcaga 60
ggtattcaag gaaaatgcag actcttcacg taagagggat gaggggc 107
<210> 66
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 66
tccccggagt cggagggtgg accggagctg gaggagctgc cgcggtggcg gccgatgcca 60
tttcattacc tctttctccg cacccgacat agataaagct 100
<210> 67
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 67
gggggggtgg ggtggaggag gagggtacag catctcctct ccttcctctc tggtaccgaa 60
gttcctattc cgaagttcct attctctaga aagtatagga 100
<210> 68
<211> 108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 68
gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttcctaggg tttcaccggt gcgatcgcga 60
agcaattaac tgcccctggt ccagttgcct cctctgataa tgcattgt 108
<210> 69
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 69
gggggggtgg ggtggaggag gagggtacag catctcctct ccttcctctc tggtaccgaa 60
gttcctattc cgaagttcct attctctaga aagtatagga 100
<210> 70
<211> 108
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 70
gaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttcctaggg tttcaccggt gcgatcgcgt 60
tatctagtag acttaattaa ggatcgatcc ggcgcgccaa tagtcatg 108
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 71
gttttccaga cttcaacttg actatcagcc agaaattcag tggcaaaccc ccacccagtc 60
cctaagtgaa ggcccctggg gagtatggtt agggctcagg 100
<210> 72
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 72
cacccaccaa agaaagtgcc caggagaagg gcaaggagag agcagagcat agttcaagat 60
ggtctttgtc taggcttgtc tactctgcac ttgtacttcc 100
<210> 73
<211> 202
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 73
aggggaaacc cgcaaaggat gggacatagg gagacagctg ttaacatctg aaacatgacc 60
ttcttttctg tgcagcacaa ctcctagctg tcactcaagg gaagaaagtg gtgctgggca 120
aaaaagggga tacagtggaa ctgacctgta cagcttccca gaagaagagc atacaattcc 180
actggaaaaa ctccaaccag at 202
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
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ctggtcacct ggatgaagtg agggagggcc ctctgggttt ggggctggtt ttgaactgag 60
acatccatga gccagcctgg ggctggcttc actgaagatc atctatgtcg ggtgcggaga 120
aagaggtaat gaaatggcac atgctatgta caaactctat tgctgagcag cacccagtcc 180
tgagctggct ctgaattgag ggtgaaattc acacattctc ccccaacatc tataatctgg 240
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> synthetic
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tatggagtga aagcctttgg tgtctgagat ctggtcttag ttaaactctg ggatcggcgc 60
gccgaattcc tgcagcccgg gctcgagata acttcgtata atgtatgcta tacgaagtta 120
tatgcatccg ggtaggggag gcgcttttcc c 151
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<212> DNA
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<220>
<223> synthetic
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agtattgttt tgccaagttc taattccatc agacctcgac ctgcagccct agataacttc 60
gtataatgta tgctatacga agttatccta ggccagaggg cttgggttga cagaaactca 120
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<222> (2957)..(2957)
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<220>
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<223> n = A,T,C or G
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aagaaagtgg tgctgggcaa aaaaggggat acagtggaac tgacctgtac agcttcccag 60
aagaagagca tacaattcca ctggaaaaac tccaaccaga taaagattct gggaaatcag 120
ggctccttct taactaaagg tagggttgcc tggctcccca tccagggagg aaaacacact 180
atggagtgaa agcctttggt gtctgagatc tggtcttagt taaactctgg gatcggcgcg 240
ccgaattcct gcagcccggg ctcgagataa cttcgtataa tgtatgctat acgaagttat 300
atgcatccgg gtaggggagg cgcttttccc aaggcagtct ggagcatgcg ctttagcagc 360
cccgctgggc acttggcgct acacaagtgg cctctggcct cgcacacatt ccacatccac 420
cggtaggcgc caaccggctc cgttctttgg tggccccttc gcgccacctt ctactcctcc 480
cctagtcagg aagttccccc ccgccccgca gctcgcgtcg tgcaggacgt gacaaatgga 540
agtagcacgt ctcactagtc tcgtgcagat ggacagcacc gctgagcaat ggaagcgggt 600
aggcctttgg ggcagcggcc aatagcagct ttgctccttc gctttctggg ctcagaggct 660
gggaaggggt gggtccgggg gcgggctcag gggcgggctc aggggcgggg cgggcgcccg 720
aaggtcctcc ggaggcccgg cattctgcac gcttcaaaag cgcacgtctg ccgcgctgtt 780
ctcctcttcc tcatctccgg gcctttcgac ctgcagccaa ttgttgacaa ttaatcatcg 840
gcatagtata tcggcatagt ataatacgac aaggtgagga actaaaccat gggatcggcc 900
attgaacaag atggattgca cgcaggttct ccggccgctt gggtggagag gctattcggc 960
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caggggcgcc cggttctttt tgtcaagacc gacctgtccg gtgccctgaa tgaactgcag 1080
gacgaggcag cgcggctatc gtggctggcc acgacgggcg ttccttgcgc agctgtgctc 1140
gacgttgtca ctgaagcggg aagggactgg ctgctattgg gcgaagtgcc ggggcaggat 1200
ctcctgtcat ctcaccttgc tcctgccgag aaagtatcca tcatggctga tgcaatgcgg 1260
cggctgcata cgcttgatcc ggctacctgc ccattcgacc accaagcgaa acatcgcatc 1320
gagcgagcac gtactcggat ggaagccggt cttgtcgatc aggatgatct ggacgaagag 1380
catcaggggc tcgcgccagc cgaactgttc gccaggctca aggcgcgcat gcccgacggc 1440
gatgatctcg tcgtgaccca tggcgatgcc tgcttgccga atatcatggt ggaaaatggc 1500
cgcttttctg gattcatcga ctgtggccgg ctgggtgtgg cggaccgcta tcaggacata 1560
gcgttggcta cccgtgatat tgctgaagag cttggcggcg aatgggctga ccgcttcctc 1620
gtgctttacg gtatcgccgc tcccgattcg cagcgcatcg ccttctatcg ccttcttgac 1680
gagttcttct gaggggatcc gctgtaagtc tgcagaaatt gatgatctat taaacaataa 1740
agatgtccac taaaatggaa gtttttcctg tcatactttg ttaagaaggg tgagaacaga 1800
gtacctacat tttgaatgga aggattggag ctacgggggt gggggtgggg tgggattaga 1860
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ggatatcata atttaaacaa gcaaaaccaa attaagggcc agctcattcc tcccactcat 1980
gatctataga tctatagatc tctcgtggga tcattgtttt tctcttgatt cccactttgt 2040
ggttctaagt actgtggttt ccaaatgtgt cagtttcata gcctgaagaa cgagatcagc 2100
agcctctgtt ccacatacac ttcattctca gtattgtttt gccaagttct aattccatca 2160
gacctcgacc tgcagcccta gataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttatcctag 2220
gccagagggc ttgggttgac agaaactcag tggcattctt atccagagtt tctctacacc 2280
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catgaactta ttttagtgag ttttagaaca atcactatca cttaaaaccc gtgatttctt 2400
gagtattgtt gctacagacc tatgtagata atactttgca cagtgactca tatgtataat 2460
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ctgaacaaca tagtgagact ctgtctctat gaaaaaaaat atatatatat tttttttgga 2580
gacaaggtct agttctatca cccaggctcc agtgcagtgg tgtgatctcg gctcactgca 2640
atctccacct cccaggctca agtcatcatc ccacctcagc ctcccaagta gctgggacta 2700
caggcatgca ccaccatgcc aggctaattt ttgtattttt tatagagaca gggtttcacc 2760
atgttggcca ggctggtctc gaactcatga gctcaagtga tccactcacc ttggcctctc 2820
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aaaaaaaaaa ggccggctgt agtggctcac acctgtaatc cagaactttg ggagtttgag 2940
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gtctctacta aaaatacaaa aattagccag gtgtgggggt gcagtcctgt acttccagct 3060
actcaggagg ctgaggcagg agactcgctt gaacctggga ggcaaaggct gcagtgagct 3120
gagattgcac cactgcactc cagcctgggt gacagagcaa gacttcatct caaaaaaaaa 3180
aaaaaagctg canatttatt attattatta ttagtttatt tatttatttt tttgagacag 3240
agtctcgttc tgtcgcccag gctggagtgc ggtggcgtga tcttggctca ttgcaacctc 3300
cacctcccgg gttcaagtga ttctcctgcc tcagcctccc gagtagctgg gactacaggc 3360
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ctgggattac aggcgtgagt cactgtgccc ggcccagaat catttttttc tacttttttt 3540
tttttgaggc aaactctcga tctgttgccc aggctggagt gcagtgggca tgatcttggc 3600
tcactgcaag ctctgcctcc caggttcaag caattctcct gcctcagcct cctgagtagc 3660
tgggactaca ggcgtgtgcc accatgcccg gctaatttgc gtatttttag tagagaccgg 3720
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tttaaaacta ttatatgctc attacaaaat atttggtcaa tgaagaaaag aatatggaag 3900
aaaatcaaat gcatgcatac ttctatcact cagagatatc ctctgctaac attttgattg 3960
attttcttcc aatctttttt tttttttttc tttttgagac agggtctcac tctgctgccc 4020
aggctggagt acagtggcat gaccacaaca catcacagcc tcaagtgatc ttcccacttc 4080
agccttccca gtagctggga ctacaggtgc acgccaccat gttcacctaa ttttttactt 4140
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gatcttcccg ctttggcctc ccaaagtgct gggattatag gtatgagcca ctgcatgtgg 4260
cctattttct tccactgttg ttcggcgtgg agaatattat atacataatt acgtaaatga 4320
tatcatactg tatatacctt ttttcctact ccttccttaa gttatatcat aatgagacta 4380
ccaattatta gacttttttt cttttttttg agacggagtc tcggtctgtc acctaggctg 4440
gagtgcaatg gcgcgatctc agctcgctgc aacctctgcc tcccaggttc aagcaattct 4500
gcctcagcct cccgagtagc tgggactaca gacacgtgcc accatgccca gctaactttt 4560
ttattttttt attagagaca gggttccacc atgctagcag gatggtctca atctctcgac 4620
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ttgcactcca gcctgagtga cagagtgaga ctccatcaca aaaaataaat aaataaataa 5460
ataaaatata aataagtaaa taaaggtcag gagtggtggc tcacgcctgt aatcccagca 5520
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gaaaaatgaa ataaaaggaa aactgatcag aaagaaagaa ataaaactgt tcctatttgt 6060
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aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa agaaaagaaa agaaaagaaa agaaaaagaa agagagaaag 6900
aaatacttag gtgtaaatct aaaaaacatg cgtagggcca ggtgcagtgg ctcatgcctg 6960
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tatacacata caggtgaata gatgtatata catctattta ttgtgaatat acatctatac 7920
acacacgtgt gtgtacacat atatttaaaa tttattttta tttatttatt tatttttgag 7980
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ggttgcctgg gcaacagagc gagaccctat atcaaaaaag aagaataata agaaaagaca 8160
gtttacagaa tataagaaaa tatattcaca atccacatac ttagcaaagg actggtatct 8220
agaatatgat aaacaactct caaaactcaa aaccaaaaaa atgaacaatt caattagaaa 8280
acaggccgaa aaggacatac agttggcaaa taagcacatg aaaagttgtt caacatcatt 8340
aatcattagg gatatgtaca ttaaaaccac aataggctat cactaaacct atcagaatgg 8400
ctaaatacaa aattggaaca ccaccaaatg ctgatgagga tgtggagaaa ctgggtcatt 8460
cttccaatat tggtgggagg ctaaaatggc aaagccactc tggaaaacag tttgatagtt 8520
tcttataaaa caaaacatgc ggccgggcgc ggtagctcac gcctgtaatc ccagcacttt 8580
gggaggccga ggcgggtgga tcacgaggtc aggagatcga gaccatcctg gctaacacgg 8640
tgaaaccctg tctctactaa aaatacaaaa aattagccgg gcgtggtggc gggcgcctgt 8700
agtcccagct actcgggagg ctgaggcagg agaatggtgt gaacccggga ggcggagctt 8760
gcagtgagcc gagatcgcgc cattgcactc caacctggga gacggaggga gactccgtct 8820
caaaaaaaca aaaacaaaca aacaaaaaac atgcaacaat ccagcaatat tgcaccccta 8880
ggcatttatc ctagagcaat gaagacttat gcccacacaa aaagctgcac acaaatgttc 8940
atagcagctt tattcatggt agccaacaat tagaaacaat ctagatgtcc ttcaactggt 9000
gaatgattac atccatacca cgaaatactt ttcagcaata aaaaggatga atcatagtac 9060
acaccacaac ctggatgaat ctccagggaa ttatgctgag tgaaaaaaag ccaatctcaa 9120
aaggtaatat actgtattaa tccatttata taacattctt aaaataacta attatagaaa 9180
tggagaacag atgagtgatt gccaggggtt aaggggctca gggatgggga ggggaagggg 9240
tatggctaca aaaagcaaca accttatggc gccggaaatg ttctgtattc tgattgtgtc 9300
aatgtgagca tactggttga gatatagtgc tacagttttg caagttatta ccatcagagt 9360
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tacaattatc tcaaaataat aagtttagtt taatgctagg cgtggtggct cacatctgta 9480
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cttcttttta aaaagccaag agcttacttc tgtaagtaaa gattatctta agacaactta 10260
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aagttttttt aaaaagtgtg aaactgaagg tgtggggtgg attgggtgcc tgccgtgctc 12600
tgaggaagct tggggcaact gtgtgctgag gctgtgaggt tgtctggaag gggctcctgg 12660
acagtaagag ctgagcagtg gggaagagga ctgtgtggtc tggaagagga gagaaaggag 12720
agtgagtgac tgaactggta tccaggctcc cacaccaagg cagaaagagg gagaggacct 12780
gggcatctca gggaggcaga ggcagtacca agcagggtga gaggctttag tcttagccac 12840
ctttgcccca ttcctccaaa tatacattct aagtaaaaac aaaacaaaac agaactgttt 12900
gctatgtaaa tttagcttct aaagccctgt tctacagaga ttttggagct tccactgcac 12960
ccagaaaatg cacagctaaa gagaaaactt cccttggtga tggttattag attttacaag 13020
aagaggccaa aggagacaca tacttatgcc agaagaactt tccagagata gcattgcata 13080
gcgaaatagc ctgaattatt tttatttttt aaaacatttt ttcttttctt ttttcttttc 13140
tttttctttt tttttttttt tttttgagac agagtctcac tctgtcaccc aggctggagt 13200
gcagtggcgt gatcttggct cactgcaatc tccacctccc gggttcaagc cattctcctc 13260
cctcagcctc ccaagtagct gggattacag gcatgcgtca ctatgctctg gctaattttt 13320
tttttctttt tttttttggt atttttagta gagatggggt ttcaccatgt tggccaggct 13380
ggtcttgaac tcctgacctc aagtgatcca ccgccttggc ctcccaaagt gctgggattt 13440
caggcgtgag ccaccgcacc cggccaaaaa tttcttttct ttaagatgag gcctcactct 13500
gttgcccagg ctggagtgca gtgttacaat catagctcac tgtaactttg aactcctggg 13560
ctcaagtgat cctcctgctt cagcctctca agtagctggg attacaggca tgtgccacca 13620
cacccagcta atttttttta aaataatttt ttttagagac gagggtctcg attggctgcc 13680
taggttggtc ccagactcct gacgggctgc attttaatcc tagctccacc acttacggga 13740
gtcaaaattc aaaagataga aaagggcata taggctgggt gcagtggctc acacctgcaa 13800
tcccagcaat ttgggaggct gaggtgggcg ggttgcttga ggtcaggagt tcgagatcag 13860
cctgggcaac atggcaaaac ttgtatctac taaaaataca aaaattagcc agatgtggtg 13920
gtgtacacct gtaatcccag ctactccgaa ggctgaggca agagaatccc ttgaactcag 13980
gaggcagagg ttacaatgag cagagatcga acactcgact ccataaaaac aaacaaacaa 14040
aaaaagaaag caggctgggt gtggtggctc acgcctgtaa ccccagcact tcgggaggcc 14100
aaggcgagcg gatcacctga ggttgggcat tcgagaccag cctgaccaac aaggagaaac 14160
cctgtctcta ctgaaaatac aaaattagcc gggcttggtt gcgcatgcct gtaatctcag 14220
ctactcggga ggcagaggca agataattgc ttgaacccgg gaggcggagg ttgcggtgag 14280
ccaagatcat gccattgcac tccaacctgg gcaacaatag cgaaactcca tctcaaaaaa 14340
aaaaaagcaa agggcatata gtgaaaagct ttcttcctac acatgagtat tcacttcctc 14400
ttcctagagg caaccaaggt tatttttgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 14460
tgttttggga cagtctcact ctctcaccaa ggctggaatg cagtggtgcg atctcactgc 14520
aaactctgcc tcccagtctc aagcgatctt gtgcctcagc ctcccagttt ttttttcttt 14580
taaatggggt ctcattctgt cgcccagggt ggagtgcagt ggcatgatca tagctcactg 14640
cagcctcgac ctcctgggtc aggttatcct cccacctcag cctccggcat agctggggct 14700
actggcatgc accaccacac tcagttaatt ttttttcttt tttgagacag agtctcactc 14760
tgtcacctag actggagtgc agtggtgcca tctcatttgt ttcactgcaa cctttgactt 14820
ctgggctcaa gtgattctcc cacctcagcc tcccaaggcg gctaattaaa aaaaattttt 14880
tttttttttt ttttagagat ggggtttcgc catgttgccc aggctgatct cgaactcctg 14940
ggcacaaaca atctttccac ctcgatcttt caaagagctg ggatgagaga tttccaccat 15000
gcctggcctc attttctttt ttaatttttt tttagacatt atagctcttt ttaatggcct 15060
cattttctta tgtttaattc gagaattatt cttttcatat acaaagaata tattttctcc 15120
acctttaaaa acaaatagta gactgtttaa catctcgctt tattcagtta gtgatgtttc 15180
ttagatacgg gtccaaatta gtacacaaag cacttcctca ttcctctctt acggctgcat 15240
agcagtccac tgaatgggtg agctatgatc tatttaacct attctttatt gatggacatt 15300
tggttttgta tatacatttg taattctgta tagattacaa atcaccatcc aaagaaattg 15360
tactggttta ttctcctaca atgtgtgaga gttgggtaat tacttaatct caatatgtga 15420
gagtttaggc agttacctaa tctctctgag tctcagtttc tctatctgca aaataaacaa 15480
aacagtgttg acagtatcta tttctcggaa ttattgtgga gattactgag atgatgcctg 15540
taaagtattt ggcatgtagg agttggtgct ctccaaataa ggatatgatt ttatttgtat 15600
ttgtgagcta ctgtcccagc caggtaaatg gatatgatga gacctccttg ccagaccggg 15660
tttctctgat tagaacgagg agcagatgtt gcaggaaatt agcaactgat atcagaagag 15720
ccgtgggcat tctcttgcca gaggtgccct gtctccaggg cgcctcagtc cccccccata 15780
tgtcttctgc tcccaggtcc atccaagctg aatgatcgcg ctgactcaag aagaagcctt 15840
tgggaccaag gaaactttcc cctgatcatc aagaatctta agatagaaga ctcagatact 15900
tacatctgtg aagtggagga ccagaaggag gaggtgcaat tgctagtgtt cggatgtgag 15960
tggggcaggt ggggatgagg atacctcctg cctggttccc ttccccacta ctcccacccc 16020
tgcaccaaat ccagcctgag ctggtgatac cgcagcagcc ccaagaggac caggctgtca 16080
aactggcctc caaatgtctt aaaacccttc ttgatcaggt gagggatgct ggtgggcgga 16140
ggagggaaga ggccttggga aaaggaaaga aaagggaagg aggcaaggga aggagggaga 16200
gagactgggg aagagaggat gaggggagag gaggaaagaa gagagagagg aggggagagg 16260
gaaaccctat cttggctggg ggtgcgcagc tgggtgctgg gaggaaggag atgttgggac 16320
ggcgataatg gagagatgtt gttggtttcc tgttgtctgc ccttctcctt ggggatggta 16380
tgtgtgtgac acagctggcc tttccctcca cagtgactgc caactctgac acccacctgc 16440
ttcaggggca gagcctgacc ctgaccttgg agagcccccc tggtagtagc ccctcagtgc 16500
aatgtaggag tccaaggggt aaaaacatac agggggggaa gaccctctcc gtgtctcagc 16560
tggagctcca ggatagtggc acctggacat gcactgtctt gcagaaccag aagaaggtgg 16620
agttcaaaat agacatcgtg gtgctaggta agggaagccc ctcttcgcgc agtctcctcc 16680
ctgccccagg ggctgacagc ccctccctct gctctgactg ccctgtttct ggttctggtg 16740
ctgggaggtc aggagtggag aagactaggt cccctagagc tgaggcctgt cttgaaggac 16800
tcactggggc cctcatcctc agggggctga ttggcagcca cccctcagtg tggtggacat 16860
ggagaaagga aaggctgggg aaggtaagga tgctagaggc ccgagtctcc tttggaggcc 16920
ccaaaggagg aatgtcaggg agcttacttt ctttgttgcc tcagctccac acccctacca 16980
agttggcaaa tccacttact cagggacact aacaccagta agccaaccct gatgatgttc 17040
tatgttgtac ctctggacct ctaagccagg ccactgtggg gagaccaagg tcctacccca 17100
gatcctgtcc cctgggtgct tatgtgactt aaggtagaca taaggtagtg tgccagttta 17160
gtgcatgtac gctgattgaa atcctggttc tgccacaacc atgtgacctt gggtgagtta 17220
ctaaacctct ctgcaccttg gtttcagcct ctgtgaaatg gggatgatgt taactgccat 17280
agtgactacc tcgtattaag ttgaggactg atatacgtaa ggcactgaaa atggtgcctg 17340
gcacagagta agccctagtt aagtgttcgc tgttattttg tgaagggtga tgaatacgcc 17400
tctaaggagt ggaggccaaa tggcttctgt ggtccaggaa tcctaaggac agcaaggatc 17460
ccctgtggct gggctgctct gtgatggctt ccgggaggag ggaggtggcc tgctgtagga 17520
aaatgctggg tggaagaagg gagagaaggc tggagaggta ggaaggaact gaagtatctg 17580
aagtgacaag gtgggtgtct ggactcgtcg ggtccccttc catctccctg ctgcctccac 17640
atgccaaccc cactcgtgca ccctcatctt cctatctcct cacccagggt ctctcccttc 17700
ccacctccag ctttccagaa ggcctccagc atagtctata agaaagaggg ggaacaggtg 17760
gagttctcct tcccactcgc ctttacagtt gaaaagctga cgggcagtgg cgagctgtgg 17820
tggcaggcgg agagggcttc ctcctccaag tcttggatca cctttgacct gaagaacaag 17880
gaagtgtctg taaaacgggt tacccaggac cctaagctcc agatgggcaa gaagctcccg 17940
ctccacctca ccctgcccca ggccttgcct cagtatgctg gctctggaaa cctcaccctg 18000
gcccttgaag cgaaaacagg aaagttgcat caggaagtga acctggtggt gatgagaggt 18060
gaggggccag gccagggagg ggtgggcagg ggaaggagtt ggaggggcct ggcccagggc 18120
tccctctgag gcaagccagg ccccaagagg ggatgcctag gccctggtca cctggatgaa 18180
gtgagggagg gccctctggg tttggggctg gttttgaact gagacatcca tgagccagcc 18240
tggggctggc ttcactgaag atc 18263
<210> 78
<211> 458
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 78
Met Cys Arg Ala Ile Ser Leu Arg Arg Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Gln Leu Leu Ala Val Thr Gln Gly Lys Lys Val Val Leu Gly
20 25 30
Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gln Lys Lys
35 40 45
Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn Gln Ile Lys Ile Leu Gly
50 55 60
Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro Ser Lys Leu Asn Asp Arg
65 70 75 80
Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln Gly Asn Phe Pro Leu Ile
85 90 95
Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp Thr Tyr Ile Cys Glu Val
100 105 110
Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu Val Phe Gly Leu Thr Ala
115 120 125
Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr Leu
130 135 140
Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val Gln Cys Arg Ser Pro Arg
145 150 155 160
Gly Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu Ser Val Ser Gln Leu Glu
165 170 175
Leu Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr Val Leu Gln Asn Gln Lys
180 185 190
Lys Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val Leu Ala Phe Gln Lys Ala
195 200 205
Ser Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu Gln Val Glu Phe Ser Phe
210 215 220
Pro Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr Gly Ser Gly Glu Leu Trp
225 230 235 240
Trp Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys Ser Trp Ile Thr Phe Asp
245 250 255
Leu Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg Val Thr Gln Asp Pro Lys
260 265 270
Leu Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His Leu Thr Leu Pro Gln Ala
275 280 285
Leu Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu Thr Leu Ala Leu Glu Ala
290 295 300
Lys Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn Leu Val Val Met Arg Val
305 310 315 320
Ala Gln Leu Asn Asn Thr Leu Thr Cys Glu Val Met Gly Pro Thr Ser
325 330 335
Pro Lys Met Arg Leu Thr Leu Lys Gln Glu Asn Gln Glu Ala Arg Val
340 345 350
Ser Glu Glu Gln Lys Val Val Gln Val Val Ala Pro Glu Thr Gly Leu
355 360 365
Trp Gln Cys Leu Leu Ser Glu Gly Asp Lys Val Lys Met Asp Ser Arg
370 375 380
Ile Gln Val Leu Ser Arg Gly Val Asn Gln Thr Val Phe Leu Ala Cys
385 390 395 400
Val Leu Gly Gly Ser Phe Gly Phe Leu Gly Phe Leu Gly Leu Cys Ile
405 410 415
Leu Cys Cys Val Arg Cys Arg His Gln Gln Arg Gln Ala Ala Arg Met
420 425 430
Ser Gln Ile Lys Arg Leu Leu Ser Glu Lys Lys Thr Cys Gln Cys Pro
435 440 445
His Arg Met Gln Lys Ser His Asn Leu Ile
450 455
<210> 79
<211> 293
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 79
Lys Lys Val Val Leu Gly Lys Lys Gly Asp Thr Val Glu Leu Thr Cys
1 5 10 15
Thr Ala Ser Gln Lys Lys Ser Ile Gln Phe His Trp Lys Asn Ser Asn
20 25 30
Gln Ile Lys Ile Leu Gly Asn Gln Gly Ser Phe Leu Thr Lys Gly Pro
35 40 45
Ser Lys Leu Asn Asp Arg Ala Asp Ser Arg Arg Ser Leu Trp Asp Gln
50 55 60
Gly Asn Phe Pro Leu Ile Ile Lys Asn Leu Lys Ile Glu Asp Ser Asp
65 70 75 80
Thr Tyr Ile Cys Glu Val Glu Asp Gln Lys Glu Glu Val Gln Leu Leu
85 90 95
Val Phe Gly Leu Thr Ala Asn Ser Asp Thr His Leu Leu Gln Gly Gln
100 105 110
Ser Leu Thr Leu Thr Leu Glu Ser Pro Pro Gly Ser Ser Pro Ser Val
115 120 125
Gln Cys Arg Ser Pro Arg Gly Lys Asn Ile Gln Gly Gly Lys Thr Leu
130 135 140
Ser Val Ser Gln Leu Glu Leu Gln Asp Ser Gly Thr Trp Thr Cys Thr
145 150 155 160
Val Leu Gln Asn Gln Lys Lys Val Glu Phe Lys Ile Asp Ile Val Val
165 170 175
Leu Ala Phe Gln Lys Ala Ser Ser Ile Val Tyr Lys Lys Glu Gly Glu
180 185 190
Gln Val Glu Phe Ser Phe Pro Leu Ala Phe Thr Val Glu Lys Leu Thr
195 200 205
Gly Ser Gly Glu Leu Trp Trp Gln Ala Glu Arg Ala Ser Ser Ser Lys
210 215 220
Ser Trp Ile Thr Phe Asp Leu Lys Asn Lys Glu Val Ser Val Lys Arg
225 230 235 240
Val Thr Gln Asp Pro Lys Leu Gln Met Gly Lys Lys Leu Pro Leu His
245 250 255
Leu Thr Leu Pro Gln Ala Leu Pro Gln Tyr Ala Gly Ser Gly Asn Leu
260 265 270
Thr Leu Ala Leu Glu Ala Lys Thr Gly Lys Leu His Gln Glu Val Asn
275 280 285
Leu Val Val Met Arg
290
<210> 80
<211> 142
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 80
tgtttgcctg tgacatgaac tcattgtgac acaaaccact gtgctagggg ggatccacta 60
gtaacggccg ccagtgtgct ggaattcgcc ctcgcaaggg ccaggcatat aagtacacaa 120
taaacaaatg gcagctctct cc 142
<210> 81
<211> 99
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 81
cccctccttc cttccccagg cactttccaa gtgtcaactc tagagcctat cgcggccgca 60
ccggtataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttat 99
<210> 82
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 82
ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttatgtcgac gtagcctatt tctctagatc 60
caaaatgatg acaacaaaag gtaccttgtg 90
<210> 83
<211> 210
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 83
Met Gln Pro Trp Leu Trp Leu Val Phe Ser Met Lys Leu Ala Val Leu
1 5 10 15
His Gly Asn Ser Val Leu Gln Gln Thr Pro Ala Tyr Ile Lys Val Gln
20 25 30
Thr Asn Lys Met Val Met Leu Ser Cys Glu Ala Lys Ile Ser Leu Ser
35 40 45
Asn Met Arg Ile Tyr Trp Leu Arg Gln Arg Gln Ala Pro Ser Ser Asp
50 55 60
Ser His His Glu Phe Leu Ala Leu Trp Asp Ser Ala Lys Gly Thr Ile
65 70 75 80
His Gly Glu Glu Val Glu Gln Glu Lys Ile Ala Val Phe Arg Asp Ala
85 90 95
Ser Arg Phe Ile Leu Asn Leu Thr Ser Val Lys Pro Glu Asp Ser Gly
100 105 110
Ile Tyr Phe Cys Met Ile Val Gly Ser Pro Glu Leu Thr Phe Gly Lys
115 120 125
Gly Thr Gln Leu Ser Val Val Asp Phe Leu Pro Thr Thr Ala Gln Pro
130 135 140
Thr Lys Lys Ser Thr Leu Lys Lys Arg Val Cys Arg Leu Pro Arg Pro
145 150 155 160
Glu Thr Gln Lys Gly Leu Thr Cys Ser Leu Thr Thr Leu Ser Leu Leu
165 170 175
Val Val Cys Ile Leu Leu Leu Leu Ala Phe Leu Gly Val Ala Val Tyr
180 185 190
Phe Tyr Cys Val Arg Arg Arg Ala Arg Ile His Phe Met Lys Gln Phe
195 200 205
His Lys
210
<210> 84
<211> 151
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 84
Val Leu His Gly Asn Ser Val Leu Gln Gln Thr Pro Ala Tyr Ile Lys
1 5 10 15
Val Gln Thr Asn Lys Met Val Met Leu Ser Cys Glu Ala Lys Ile Ser
20 25 30
Leu Ser Asn Met Arg Ile Tyr Trp Leu Arg Gln Arg Gln Ala Pro Ser
35 40 45
Ser Asp Ser His His Glu Phe Leu Ala Leu Trp Asp Ser Ala Lys Gly
50 55 60
Thr Ile His Gly Glu Glu Val Glu Gln Glu Lys Ile Ala Val Phe Arg
65 70 75 80
Asp Ala Ser Arg Phe Ile Leu Asn Leu Thr Ser Val Lys Pro Glu Asp
85 90 95
Ser Gly Ile Tyr Phe Cys Met Ile Val Gly Ser Pro Glu Leu Thr Phe
100 105 110
Gly Lys Gly Thr Gln Leu Ser Val Val Asp Phe Leu Pro Thr Thr Ala
115 120 125
Gln Pro Thr Lys Lys Ser Thr Leu Lys Lys Arg Val Cys Arg Leu Pro
130 135 140
Arg Pro Glu Thr Gln Lys Gly
145 150
<210> 85
<211> 100
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 85
tgaacctgct gctgctgggt gagtcgatta tcctggggag tggagaagct aggccgagcc 60
agttccgggt gtcgccgctg gatcggacct ggaacctggg 100
<210> 86
<211> 90
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 86
atgccaggga cagccctgat actgtaggta gagtcaaggg ctgtccaagt accggtataa 60
cttcgtataa ggtatcctat acgaagttat 90
<210> 87
<211> 89
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 87
ataacttcgt ataaggtatc ctatacgaag ttatctcgac ctgatcttgg agggagacct 60
ggaccgggag acgtgctggg ggcagggtt 89
<210> 88
<211> 243
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 88
Met Ala Ser Pro Leu Thr Arg Phe Leu Ser Leu Asn Leu Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Glu Ser Ile Ile Leu Gly Ser Gly Glu Ala Arg Pro Ser Gln Phe
20 25 30
Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr Trp Asn Leu Gly Glu Thr Val Glu
35 40 45
Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser Asn Pro Thr Ser Gly Cys Ser Trp
50 55 60
Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala Ala Ser Pro Thr Phe Leu Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala Ala Glu Gly Leu Asp Thr Gln Arg
85 90 95
Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp Thr Phe Val Leu Thr Leu Ser Asp
100 105 110
Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys Ser Ala Leu Ser Asn
115 120 125
Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys
130 135 140
Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
145 150 155 160
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
165 170 175
Gly Gly Ala Val Lys Gly Thr Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
180 185 190
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Ile Cys Val Ala Leu Leu Leu Ser Leu
195 200 205
Ile Ile Thr Leu Ile Cys Tyr His Arg Ser Arg Lys Arg Val Cys Lys
210 215 220
Cys Pro Arg Pro Leu Val Arg Gln Glu Gly Lys Pro Arg Pro Ser Glu
225 230 235 240
Lys Ile Val
<210> 89
<211> 152
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 89
Arg Pro Ser Gln Phe Arg Val Ser Pro Leu Asp Arg Thr Trp Asn Leu
1 5 10 15
Gly Glu Thr Val Glu Leu Lys Cys Gln Val Leu Leu Ser Asn Pro Thr
20 25 30
Ser Gly Cys Ser Trp Leu Phe Gln Pro Arg Gly Ala Ala Ala Ser Pro
35 40 45
Thr Phe Leu Leu Tyr Leu Ser Gln Asn Lys Pro Lys Ala Ala Glu Gly
50 55 60
Leu Asp Thr Gln Arg Phe Ser Gly Lys Arg Leu Gly Asp Thr Phe Val
65 70 75 80
Leu Thr Leu Ser Asp Phe Arg Arg Glu Asn Glu Gly Tyr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ser Ala Leu Ser Asn Ser Ile Met Tyr Phe Ser His Phe Val Pro Val
100 105 110
Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
115 120 125
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
130 135 140
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
145 150
<210> 90
<211> 149
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence of the chimeric human/mouse MHC I locus at the 5'
junction of mouse/human sequences
<400> 90
agtgtcgccg cggacgctgg atataaagtc cacgcagccc gcagaactca gaagtcgcga 60
atcgccgaca ggtgcgatgg ccgtcatggc gccccgaacc ctcgtcctgc tactctcggg 120
ggctctggcc ctgacccaga cctgggcgg 149
<210> 91
<211> 159
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Sequence of the chimeric human/mouse MHC I locus at the 3'
junction of human/mouse sequences
<400> 91
ggtggtgcct tctggacagg agcagagata cacctgccat gtgcagcatg agggtttgcc 60
caagcccctc accctgagat ggggtaagga gagtgtgggt gcagagctgg ggtcagggaa 120
agctggagct ttctgcagac cctgagctgc tcagggctg 159
Claims (70)
- (a) 키메라 CD4 보조 수용체, 및/또는 키메라 CD8α 폴리펩타이드 및 키메라 CD8β 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 CD8 보조 수용체
- 여기서, 키메라 CD4 보조 수용체는 제1 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되고, 키메라 CD8α 폴리펩타이드는 제2 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되며, 키메라 CD8β 폴리펩타이드는 제3 뉴클레오타이드 서열에 의해 코딩되고,
키메라 CD4 보조 수용체는 인간 CD4의 세포외 부분 또는 이의 부분 및 비인간 CD4 보조 수용체의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며,
키메라 CD8α 폴리펩타이드는 인간 CD8α의 세포외 부분 또는 이의 부분 및 비인간 CD8α의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고,
키메라 CD8β 폴리펩타이드는 인간 CD8β의 세포외 부분 또는 이의 부분 및 비인간 CD8β의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함함 -;
(b) 인간화 TCRα 쇄 및 인간화 TCRβ 쇄
- 여기서, 인간화 TCRα 쇄는 비인간 TCRα 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체(TCR)α 가변 유전자좌로부터 유래되고, 인간화 TCRβ 쇄는 비인간 TCRβ 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌로부터 유래됨 -; 및 임의로,
(c) 키메라 MHC II α 폴리펩타이드 및 키메라 MHC II β 폴리펩타이드를 포함하는 키메라 MHC II 복합체, 및/또는 키메라 MHC I 폴리펩타이드
- 여기서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드는 제1 핵산 서열에 의해 코딩되고, 키메라 MHC II β 폴리펩타이드는 제2 핵산 서열에 의해 코딩되며, 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 제3 핵산 서열에 의해 코딩되고,
키메라 MHC II α 폴리펩타이드는 인간 HLA 클래스 II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분) 및 비인간 MHC II α 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며,
키메라 MHC II β 폴리펩타이드는 인간 HLA 클래스 II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분) 및 비인간 MHC II β 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고,
키메라 MHC I 폴리펩타이드는 인간 HLA 클래스 I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분) 및 비인간 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하며,
키메라 MHC II 복합체는 키메라 CD4 보조 수용체와 결합하고/하거나, 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 키메라 CD8 보조 수용체와 결합함 - 를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물. - 제1항에 있어서, 생식세포 게놈에,
(a) 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열;
(b) 비인간 TCRα 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 재배열되지 않은 T 세포 수용체(TCR)α 가변 유전자좌 및 비인간 TCRβ 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌; 및
(c) 제1, 제2 및 제3 핵산 서열을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물. - 제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 CD4 T 세포 보조 수용체 유전자좌에 존재하고/하거나, 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 CD8α T 세포 보조 수용체 유전자좌에 존재하며, 제3 뉴클레오타이드 서열은 내인성 CD8β T 세포 보조 수용체 유전자좌에 존재하는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 CD4 폴리펩타이드는 인간 CD4 폴리펩타이드의 D1, D2 및 D3 도메인을 포함하고/하거나, 키메라 CD8α 폴리펩타이드는 인간 CD8α 폴리펩타이드의 IgV 유사 도메인을 포함하며, 키메라 CD8β 폴리펩타이드는 인간 CD8β 폴리펩타이드의 IgV 유사 도메인을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II α 유전자좌에 존재하고, 제2 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II β 유전자좌에 존재하고/하거나, 제3 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC I 유전자좌에 존재하는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드는 인간 HLA 클래스 II α1 및 α2 도메인을 포함하고, 키메라 MHC II β 폴리펩타이드는 인간 HLA 클래스 II β1 및 β2 도메인을 포함하고/하거나, MHC I 폴리펩타이드는 인간 HLA 클래스 I α1, α2 및 α3 도메인을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II α 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현되고, 제2 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II β 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현되고/되거나, 제3 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC I 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현되는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드는 내인성 비인간 MHC II α 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고, 키메라 MHC II β 폴리펩타이드는 내인성 비인간 MHC II β 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고/하거나, 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 내인성 비인간 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드는 인간 HLA-DRα 단백질, 인간 HLA-DQ α 단백질 또는 인간 HLA-DP α 단백질의 세포외 부분 또는 이의 부분을 포함하고,
키메라 MHC II β 폴리펩타이드는 인간 HLA-DRβ 단백질, 인간 HLA-DQ β 단백질 또는 인간 HLA-DP β 단백질의 세포외 부분 또는 이의 부분을 포함하고/하거나,
키메라 MHC I 폴리펩타이드는 인간 HLA-A 단백질, 인간 HLA-B 단백질 또는 인간 HLA-C 단백질의 세포외 부분 또는 이의 부분을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드는 인간 HLA-DRα 단백질의 세포외 부분 또는 이의 부분을 포함하고,
키메라 MHC II β 폴리펩타이드는 인간 HLA-DRβ 단백질의 세포외 부분 또는 이의 부분을 포함하고/하거나,
키메라 MHC I 폴리펩타이드는 인간 HLA-A 폴리펩타이드의 세포외 부분 또는 이의 부분을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물. - 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 인간 HLA-A2 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 MHC I 폴리펩타이드는 인간 HLA-A2.1 폴리펩타이드의 α1, α2 및 α3 도메인을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 MHC II α 폴리펩타이드는 뮤린 H-2E α 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고,
키메라 MHC II β 폴리펩타이드는 뮤린 H-2E β 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하고/하거나,
키메라 MHC I 폴리펩타이드는 뮤린 H-2K 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물. - 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌는 인간 Vα 유전자 세그먼트의 완전한 레퍼토리 및 인간 Jα 유전자 세그먼트의 완전한 레퍼토리를 포함하고/하거나, 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌는 인간 Vβ 유전자 세그먼트의 완전한 레퍼토리, 인간 Dβ 유전자 세그먼트의 완전한 레퍼토리 및 인간 Jβ 유전자 세그먼트의 완전한 레퍼토리를 포함하는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Vα 및 Jα 유전자 세그먼트는 재배열되어 재배열된 인간 Vα/Jα 서열을 형성하고/형성하거나, 인간 Vβ, Dβ 및 Jβ 유전자 세그먼트는 재배열되어 재배열된 인간 Vβ/Dβ/Jβ 서열을 형성하는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 표면의, 인간 TCRα 가변 영역 및/또는 인간 TCRβ 가변 영역을 포함하는 T 세포 수용체를 발현하는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 비인간 Vα 및 Jα 세그먼트가 재배열되어 재배열된 Vα/Jα 서열을 형성할 수 없고/없거나, 내인성 비인간 Vβ, Dβ 및 Jβ 세그먼트가 재배열되어 재배열된 Vβ/Dβ/Jβ 서열을 형성할 수 없는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 기능적 내인성 비인간 TCRα 가변 유전자좌가 결여되어 있고/있거나, 기능적 내인성 비인간 TCRβ 가변 유전자좌가 결여되어 있는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 비인간 TCRα 가변 유전자좌는 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 Vα 유전자 세그먼트가 결여되어 있고/있거나, 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 Jα 유전자 세그먼트가 결여되어 있고/있거나;
내인성 비인간 TCRβ 가변 유전자좌는 (a) 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 Vβ 유전자 세그먼트가 결여되어 있거나, (b) 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 Dβ 유전자 세그먼트가 결여되어 있거나, (c) 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 Jβ 유전자 세그먼트가 결여되어 있거나, (d) (a), (b) 및 (c)의 임의의 조합인 유전자 변형 비인간 동물. - 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 CD4 T 세포 보조 수용체 유전자좌에 존재하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 CD8α T 세포 보조 수용체 유전자좌에 존재하며, 제3 뉴클레오타이드 서열은 내인성 CD8β T 세포 보조 수용체 유전자좌에 존재하고;
재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 TCRα 가변 유전자좌에 존재하고, 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 TCRβ 가변 유전자좌에 존재하며;
제1 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II α 유전자좌에 존재하고, 제2 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II β 유전자좌에 존재하며, 제3 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC I 유전자좌에 존재하는 유전자 변형 비인간 동물. - 제20항에 있어서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 CD4 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현되고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 CD8α 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현되며, 제3 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 CD8β 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현되고;
재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 TCRα 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현되고, 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 TCRβ 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현되며;
제1 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II α 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현되고, 제2 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC II β 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현되며, 제3 핵산 서열은 내인성 비인간 MHC I 프로모터 및 조절 요소의 조절 제어 하에 발현되는 유전자 변형 비인간 동물. - 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
(a) 인간 CD4 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 서열은 내인성 비인간 CD4 보조 수용체 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 서열을 대체하고, 내인성 비인간 CD4 보조 수용체 유전자좌에서 내인성 비인간 CD4 막관통 및 세포질 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 제1 뉴클레오타이드 서열을 형성하고,
인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 서열은 내인성 비인간 T 세포 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 서열을 대체하고, 내인성 비인간 CD8α 유전자좌에서 내인성 비인간 CD8α 막관통 및 세포질 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 제2 뉴클레오타이드 서열을 형성하고/하거나,
인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 내인성 비인간 T 세포 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 서열을 대체하고, 내인성 CD8β 유전자좌에서 내인성 비인간 CD8β 막관통 및 세포질 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 제3 뉴클레오타이드 서열을 형성하고;
(B) 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 TCRα 가변 유전자좌에서 하나 이상의 내인성 Vα 및/또는 Jα 유전자 세그먼트를 대체하고, 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 TCRβ 가변 유전자좌에서 하나 이상의 내인성 Vβ, Dβ 및/또는 Jβ 유전자 세그먼트를 대체하고/대체하거나;
(C) 인간 HLA 클래스 II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 서열은 내인성 비인간 MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 서열을 대체하고, 내인성 비인간 MHC II α 유전자좌에서 내인성 MHC II α 폴리펩타이드 막관통 및 세포질 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 제1 핵산 서열을 형성하고,
인간 HLA 클래스 II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 서열은 내인성 비인간 MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 서열을 대체하고, 내인성 비인간 MHC II β 유전자좌에서 내인성 MHC II β 폴리펩타이드 막관통 및 세포질 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 제2 핵산 서열을 형성하고/하거나,
인간 HLA 클래스 I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 서열은 내인성 비인간 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 서열을 대체하고, 내인성 비인간 MHC I 유전자좌에서 내인성 MHC I 폴리펩타이드 막관통 및 세포질 도메인 코딩 서열에 작동가능하게 연결되어 제3 핵산 서열을 형성하는 유전자 변형 비인간 동물. - 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 표면에 (a) 각각, 내인성 CD4 및/또는 CD8 보조 수용체 유전자좌로부터 기능적 내인성 비인간 CD4 및/또는 CD8 보조 수용체, (b) 내인성 TCRα 유전자좌로부터 내인성 TCRα 가변 도메인, (c) 내인성 TCRβ 유전자좌로부터 내인성 TCRβ 가변 도메인 및/또는 (d) 내인성 MHC 유전자좌로부터 내인성 MHC 폴리펩타이드의 세포외 도메인을 발현하지 않는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 β2 마이크로글로불린 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 추가로 포함하며, 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 비인간 β2 마이크로글로불린 유전자좌로부터 기능적 내인성 비인간 동물 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하지 않는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 β2 마이크로글로불린 유전자좌는 내인성 비인간 β2 마이크로글로불린 조절 요소에 작동가능하게 연결되는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β2 마이크로글로불린 유전자좌는 인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 2, 엑손 3 및 엑손 4에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 β2 마이크로글로불린 유전자좌는 비인간 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 설치류 β2 마이크로글로불린 유전자의 엑손 1에 기재된 뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함하는 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류인 유전자 변형 비인간 동물.
- 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 마우스인 유전자 변형 비인간 동물.
- 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동물이 마우스이며, 마우스가,
각각, CD4, CD8α 및 CD8β 뮤린 막관통 및 세포질 도메인을 포함하는 키메라 T 세포 CD4, CD8α 및 CD8β 보조 수용체 폴리펩타이드;
T 세포 표면의, 인간 TCRα 가변 영역 및 인간 TCRβ 가변 영역을 포함하는 T 세포 수용체;
각각, 인간 HLA 클래스 IIα, HLA 클래스 IIβ 및 HLA 클래스 I 폴리펩타이드의 세포외 부분을 포함하는 키메라 MHC IIα, MHC IIβ 및 MHC I 폴리펩타이드; 및 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 발현하는 유전자 변형 비인간 동물. - 제31항 또는 제32항에 있어서, 제1 핵산 서열은 키메라 인간/뮤린 HLA-DR/H-2E 폴리펩타이드의 α 쇄를 코딩하고, 제2 뉴클레오타이드 서열은 키메라 인간/뮤린 HLA-DR/H-2E 폴리펩타이드의 β 쇄를 코딩하며, 제3 핵산 서열은 키메라 인간/뮤린 HLA-A/H-2K 폴리펩타이드를 코딩하고, 마우스는 HLA-A/H-2K 및 HLA-DR/H-2E 단백질을 발현하는 유전자 변형 비인간 마우스.
- (a) 키메라 CD4 보조 수용체를 코딩하는 제1 뉴클레오타이드 서열, 및/또는 키메라 CD8α 보조 수용체를 코딩하는 제2 뉴클레오타이드 서열 및 키메라 CD8β 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 뉴클레오타이드 서열을 유전자 변형 비인간 동물의 게놈에 도입하는 단계
- 여기서, 제1 뉴클레오타이드 서열은 비인간 CD4 보조 수용체의 적어도 막관통 및 세포질 도메인에 작동가능하게 연결되는 인간 CD4의 세포외 부분 또는 이의 부분을 코딩하고,
제2 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD8α의 세포외 부분 또는 이의 부분 및 비인간 CD8α의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하며,
제3 뉴클레오타이드 서열은 인간 CD8β의 세포외 부분 또는 이의 부분 및 비인간 CD8β의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 코딩함 -;
(b) 비인간 TCRα 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 T 세포 수용체(TCR)α 가변 유전자좌 및/또는 비인간 TCRβ 불변 유전자 서열에 작동가능하게 연결되는 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌를 상기 비인간 동물의 게놈에 삽입하는 단계; 및 임의로,
(c) 키메라 MHC II α 폴리펩타이드를 코딩하는 제1 핵산 서열, 키메라 MHC II β 폴리펩타이드를 코딩하는 제2 핵산 서열 및/또는 키메라 MHC I 폴리펩타이드를 코딩하는 제3 핵산 서열을 상기 비인간 동물의 게놈에 배치시키는 단계
- 여기서, 제1 핵산 서열은 인간 HLA 클래스 II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분) 및 비인간 MHC II α 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하고,
제2 핵산 서열은 인간 HLA 클래스 II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분) 및 비인간 MHC II β 폴리펩타이드의 적어도 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하며,
제3 핵산 서열은 인간 HLA 클래스 I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분) 및 비인간 MHC I 폴리펩타이드의 막관통 및 세포질 도메인을 코딩함 -; 및/또는
(d) 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 상기 비인간 동물의 게놈에 부가하는 단계를 포함하는, 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 유전자 변형 비인간 동물을 생산하는 방법. - 제34항에 있어서,
(a) 제1, 제2 및/또는 제3 뉴클레오타이드 서열을 상기 비인간 동물의 게놈에 도입하는 단계는 각각, (i) 내인성 CD4 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD4 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 CD4 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하여, 인간 CD4 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 비인간 CD4 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되도록 하는 단계, (ii) 내인성 CD8α 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하여, 인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 비인간 CD8α 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되도록 하는 단계 및/또는 (iii) 내인성 CD8β 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하여, 인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 비인간 CD8β 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되도록 하는 단계를 포함하고;
(b) 재배열되지 않은 TCRα 유전자좌 및/또는 재배열되지 않은 TCRβ 유전자좌를 상기 동물의 게놈에 삽입하는 단계는 각각, (i) 내인성 비인간 TCRα 가변 유전자좌를 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRα 가변 유전자좌로 치환하여 인간화 TCRα 가변 유전자좌를 생성시키는 단계 - 여기서, 인간화 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 비인간 TCRα 불변 영역에 작동가능하게 연결됨 - 및/또는 (ii) 내인성 비인간 TCRβ 가변 유전자좌를 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 TCRβ 가변 유전자좌로 치환하여 인간화 TCRβ 가변 유전자좌를 생성시키는 단계 - 여기서, 인간화 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 비인간 TCRβ 불변 영역에 작동가능하게 연결됨 - 를 포함하며;
(c) 제1, 제2 및/또는 제3 핵산 서열을 상기 비인간 동물의 게놈에 배치시키는 단계는 각각, (i) 내인성 비인간 MHC II α 유전자좌에서, 비인간 MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 HLA 클래스 II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하여, 인간 HLA 클래스 II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 비인간 MHC II α 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되도록 하는 단계, (ii) 내인성 비인간 MHC II β 유전자좌에서, 비인간 MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 HLA 클래스 II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하여, 인간 HLA 클래스 II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 비인간 MHC II β 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되도록 하는 단계 및/또는 (iii) 내인성 비인간 MHC I 유전자좌에서, 비인간 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 HLA 클래스 I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하여, 인간 HLA 클래스 I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 비인간 MHC I 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되도록 하는 단계를 포함하고/하거나;
(d) 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 β2 마이크로글로불린 유전자좌를 상기 비인간 동물의 게놈에 부가하는 단계는 내인성 비인간 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서, 비인간 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계를 포함하는 방법. - 제35항에 있어서, 상기 치환하는 단계는 비인간 ES 세포(들)의 게놈에 임의의 순서로, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열을 도입하고; 재배열되지 않은 TCRα 유전자좌 및 재배열되지 않은 TCRβ 유전자좌를 삽입하며; 제1, 제2 및 제3 핵산 서열을 배치시키고; β2 마이크로글로불린 유전자좌를 부가하도록 비인간 ES 세포(들)에서의 상동 재조합을 포함하는 방법.
- 제36항에 있어서, 비인간 ES 세포(들)로부터 비인간 동물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제34항 또는 제35항에 있어서,
상기 도입하는 단계는 임의의 순서로,
제1 비인간 동물에서 내인성 CD4 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD4 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 CD4 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하여, 인간 CD4 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 비인간 CD4 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되도록 하는 단계,
제2 비인간 동물에서 내인성 CD8α 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하여, 인간 CD8α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 비인간 CD8α 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되도록 하는 단계 및 내인성 CD8β 유전자좌에서, 내인성 비인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하여, 인간 CD8β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 비인간 CD8β 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되도록 하는 단계를 포함하고;
상기 삽입하는 단계는 임의의 순서로,
제3 비인간 동물에서 내인성 비인간 TCRα 가변 유전자좌를 적어도 하나의 인간 Vα 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jα 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 인간화 TCRα 가변 유전자좌로 치환하여 인간화 TCRα 가변 유전자좌를 생성시키는 단계 - 여기서, 인간화 TCRα 가변 유전자좌는 내인성 비인간 TCRα 불변 영역에 작동가능하게 연결됨 -,
제4 비인간 동물에서 내인성 비인간 TCRβ 가변 유전자좌를 적어도 하나의 인간 Vβ 세그먼트, 적어도 하나의 인간 Dβ 세그먼트 및 적어도 하나의 인간 Jβ 세그먼트를 포함하는 재배열되지 않은 인간화 TCRβ 가변 유전자좌로 치환하여 인간화 TCRβ 가변 유전자좌를 생성시키는 단계 - 여기서, 인간화 TCRβ 가변 유전자좌는 내인성 비인간 TCRβ 불변 영역에 작동가능하게 연결됨 - 를 포함하며;
상기 배치시키는 단계는 임의의 순서로,
제5 비인간 동물에서 내인성 비인간 MHC II α 유전자좌에서, 비인간 MHC II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 HLA 클래스 II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하여, 인간 HLA 클래스 II α 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 비인간 MHC II α 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되도록 하는 단계,
제5 비인간 동물에서 내인성 비인간 MHC II β 유전자좌에서, 비인간 MHC II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 HLA 클래스 II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하여, 인간 HLA 클래스 II β 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 비인간 MHC II β 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되도록 하여 제7 비인간 동물을 생산하는 단계, 및
제5 비인간 동물에서 내인성 비인간 MHC I 유전자좌에서, 비인간 MHC I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 HLA 클래스 I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하여, 인간 HLA 클래스 I 폴리펩타이드의 세포외 부분(또는 이의 부분)을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열이 내인성 비인간 MHC I 막관통 및 세포질 도메인을 코딩하는 서열과 작동가능하게 연결되도록 하여 제8 비인간 동물을 생산하는 단계를 포함하고/하거나;
상기 부가하는 단계는,
제6 비인간 동물에서 내인성 비인간 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서, 비인간 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 인간 또는 인간화 β2 마이크로글로불린 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열로 치환하는 단계를 포함하며;
임의의 순서로 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 비인간 동물을 육종하여 상기 비인간 동물의 게놈에, 제1, 제2 및 제3 뉴클레오타이드 서열을 도입하고; 재배열되지 않은 TCRα 유전자좌 및 재배열되지 않은 TCRβ 유전자좌를 삽입하며; 제1, 제2 및 제3 핵산 서열을 배치시키고/시키거나; β2 마이크로글로불린 유전자좌를 부가하는 방법. - 제38항에 있어서, 내인성 CD4 유전자좌에서의 치환은 제1 비인간 ES 세포에서 내인성 CD4 유전자좌에서의 상동 재조합을 포함하고,
내인성 CD8α 및 CD8β 유전자좌에서의 치환은 제2 비인간 ES 세포에서 임의의 순서로 내인성 CD8α 및 CD8β 유전자좌에서의 순차적 상동 재조합을 포함하며,
내인성 TCRα 가변 유전자좌에서의 치환은 제3 비인간 ES 세포에서 내인성 TCRα 가변 유전자좌에서의 상동 재조합을 포함하고,
내인성 TCRβ 가변 유전자좌에서의 치환은 제4 비인간 ES 세포에서 내인성 TCRβ 가변 유전자좌에서의 상동 재조합을 포함하며,
내인성 MHC II α, MHC II β 및 MHC I 유전자좌에서의 치환은 제5 비인간 ES 세포에서 임의의 순서로 내인성 MHC II α, MHC II β 및 MHC I 유전자좌에서의 상동 재조합을 포함하고,
β2 마이크로글로불린 유전자좌에서의 치환은 제6 비인간 ES 세포에서 내인성 β2 마이크로글로불린 유전자좌에서의 상동 재조합을 포함하는 방법. - 제38항에 있어서, 각각, 육종하기 전에 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 비인간 ES 세포로부터 제1, 제2, 제3, 제4, 제5 및 제6 비인간 동물을 생산하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비인간 동물은 마우스인 방법.
- 항원에 결합하는 T 세포 또는 TCR 단백질을 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 비인간 동물 또는 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 비인간 동물로부터 단리하는 단계를 포함하는, 항원에 특이적인 인간 TCR 가변 도메인을 비인간 동물로부터 수득하는 방법.
- 제42항에 있어서, TCRα 가변 도메인을 코딩하는 제1 핵산 및/또는 TCRβ 가변 도메인을 코딩하는 제2 핵산을 동정하는 단계를 추가로 포함하며, 이들 각각의 가변 도메인이 T 세포에 의해 발현되거나 TCR 단백질의 항원 결합 부위의 일부를 형성하는 방법.
- 제43항에 있어서, 제43항에서 동정한 제1 핵산과 동일하거나 실질적으로 동일한 제3 핵산 및/또는 제43항에서 동정한 제2 핵산과 동일하거나 실질적으로 동일한 제4 핵산의 발현을 위한 충분한 조건에서 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하며, 제3 및 제4 핵산이 동일하거나 상이한 발현 벡터 상에 존재하는 방법.
- (a) 비인간 동물의 비인간 항원 제시 세포와의 접촉 및 (b) 항원과의 인큐베이션 후에 비인간 T 세포의 활성화를 검출하는 단계를 포함하며; 비인간 T 세포가 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체 및 (i) 키메라 인간/비인간 TCRα 쇄 및 (ii) 키메라 인간/비인간 TCRβ 쇄 중 어느 하나 또는 둘 다를 발현하고, 비인간 항원 제시 세포가 키메라 인간/비인간 MHC 폴리펩타이드를 발현하는, 항원에 특이적인 인간 TCR 가변 도메인을 생성하는 시험관 내 방법.
- 제45항에 있어서, 인간 TCRα 가변 도메인 및/또는 인간 TCRβ 가변 도메인을 상기 T 세포; 또는 각각, 인간 TCRα 가변 도메인을 코딩하는 제1 핵산 및/또는 인간 TCRβ 가변 도메인을 코딩하는 제2 핵산으로부터 단리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 종양 항원인 방법.
- 제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 바이러스 항원인 방법.
- 제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비인간 동물은 마우스인 방법.
- 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항의 방법에 따라 단리되거나 검출된 T 세포로부터 생성된 하이브리도마.
- 제42항 내지 제49항 중 어느 한 항의 방법에 따라 수득되거나 생성된 인간 T 세포 수용체 가변 도메인.
- 제43항, 제44항 및 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항의 방법에 따라 단리된 핵산.
- 제52항의 핵산과 동일하거나 실질적으로 동일한 핵산을 포함하는 세포.
- 제52항의 핵산을 포함하며, 상기 핵산이 인간 TCRα 가변 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터.
- 제54항에 있어서, 인간 TCRα 가변 도메인을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 TCRα 불변 유전자를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터.
- 제52항의 핵산을 포함하며, 상기 핵산이 인간 TCRβ 가변 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터.
- 제56항에 있어서, 인간 TCRβ 가변 도메인을 코딩하는 핵산에 작동가능하게 연결되는 TCRβ 불변 유전자를 코딩하는 서열을 추가로 포함하는 발현 벡터.
- 비인간 동물의 제1 세포 및 제2 세포를 포함하며; 상기 제1 세포가 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체 및 임의로, (i) 키메라 인간/비인간 TCRα 쇄 및 (ii) 키메라 인간/비인간 TCRβ 쇄 중 어느 하나 또는 둘 다를 발현하고, 상기 제2 세포가 키메라 인간/비인간 T 세포 보조 수용체와 결합하는 키메라 인간/비인간 MHC 폴리펩타이드를 발현하는 조성물.
- 제58항에 있어서, 상기 제1 세포는 비인간 T 세포인 조성물.
- 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 제2 세포는 비인간 항원 제시 세포인 조성물.
- 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 항원을 추가로 포함하는 조성물.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 비인간 동물 또는 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 비인간 동물로부터 단리된 세포.
- 제62항에 있어서, T 세포인 세포.
- 제62항에 있어서, 항원 제시 세포인 세포.
- 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항의 세포로부터 단리되며, TCR 가변 도메인 또는 MHC 세포외 도메인을 코딩하는 서열을 포함하는 핵산 서열.
- 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 따른 비인간 동물 또는 제34항 내지 제41항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 비인간 동물을 항원으로 면역화시키는 단계를 포함하는, 비인간 동물에서 인간화 T 세포 반응을 일으키는 방법.
- 제66항에 있어서, 상기 항원은 인간 항원 또는 인간 종양 항원인 방법.
- 제66항 또는 제67항에 있어서, 비인간 동물은 모든 기능적 인간 TCRVα 유전자 세그먼트의 50% 이상 및/또는 모든 기능적 인간 TCRVβ 유전자 세그먼트의 50% 이상을 발현하는 방법.
- 제66항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 비인간 동물의 T 세포 수용체 레퍼토리는 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 인간 TCRVα 유전자 세그먼트 및/또는 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 인간 TCRVβ 유전자 세그먼트를 포함하는 방법.
- 제55항 또는 제57항에 있어서, TCRα 불변 영역 유전자 또는 TCRβ 불변 영역 유전자는 각각, 인간 TCRα 불변 영역 유전자 또는 인간 TCRβ 불변 영역 유전자인 발현 벡터.
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