KR20160142463A

KR20160142463A - 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20160142463A
Application number: KR1020150078071A
Authority: KR
Inventors: 부용출; 김영미; 서형호; 석진경
Original assignee: 주식회사 루비크라운
Priority date: 2015-06-02
Filing date: 2015-06-02
Publication date: 2016-12-13

Abstract

본 발명은 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물에 관한 것으로서, 죽여 추출물이 첨가된 보호제 1 ~ 30 중량부와, 무기 자외선 차단제 0.1 ~ 25 중량부와, 유기 자외선 차단제 0.1 ~ 25 중량부와, 오일 1 ~ 20 중량부와, 계면활성제 0.1 ~ 10 중량부를 포함하여 이루어짐에 따라 유·무기 자외선 차단제 성분에 의한 피부 손상을 방지하고 자외선 차단 효과를 더욱 증대시키는 이점이 있다.

Description

자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물{COSMETIC COMPOSITION FOR SUN BLOCKING AND PREVENTING SKIN DAMAGE CAUSED BY UV}

본 발명은 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물에 관한 것으로서 더욱 상세하게는 죽여 추출물이 첨가된 보호제를 포함하는 화장료 조성물을 구성함으로써 유·무기 자외선 차단제 성분에 의한 피부 손상을 방지하고 자외선 차단 효과를 더욱 증대시키는 화장료 조성물의 제공에 관한 것이다.

일반적으로, 자외선 차단제는 태양광 중 자외선에 의해 발생하는 피부염증과 흑색화 및 그에 따른 피부노화를 방지하기 위해 사용되는 약제이다.

인간의 피부는 나이가 들어감에 따라 자연스럽게 노화가 진행되는데 이러한 내인성 노화는 시간과 유전적인 영향에 의해 불가피하게 발생하게 된다.

반면, 생활습관이나 환경적인 요인에 의해 발생하는 외인성 노화는 피부변색, 기미, 주근깨, 주름 등을 유발하는 자외선 노출을 최소화하는 습관의 변화만으로도 충분히 극복할 수 있다.

자외선은 세포자살(Apoptosis)을 유도하는 것으로 알려져 있다. 세포자살은 세포들이 수명을 다하기 전에 자발적으로 죽음을 맞는 현상이다. 인체의 발생, 분화와 같은 유전적 과정에서 몸의 형태를 만들거나 세포 갱신, 및 비정상 세포를 제거하는 기능 등을 수행하기위해 자연스럽게 발생하는 현상이다.

그러나, 자외선에 의해 유도된 세포자살은 피부광노화를 유발하는데, 일반적으로 Pro-apoptotic member(Bax, Bak, Bid)와 Bcl-2 단백질 Family(Bcl-2, Bcl-X)의 Anti-apoptotic member의 변화, 및 카스파제(Caspase)의 세포사멸 매개 등을 포함한다.

또한, 자외선은 세포에서 활성산소종(Reactive oxygen species, ROS)의 발생을 증가시키고 항산화제를 감소시켜 산화스트레스를 유도하며, 그 결과 지질, 핵산, 단백질 등의 생체 분자의 산화적 손상이 증가하게 된다.

이와 같이 자외선 노출에 의한 피부광노화는 TYPE Ⅰ콜라겐을 포함해 세포외기질 분자의 전환을 조절하는 Zinc endopeptidases의 그룹인 Matrix metalloproteinases(MMPs)의 활성화를 유발한다. MMPs는 주름 등 광노화된 피부의 여러 표현형의 형성을 유발하는 결합 조직 리모델링을 조절하고 진피의 섬유아세포뿐만 아니라 표피의 각질형성세포(HaCaT) 에서 콜라겐 분해에도 관여하는 것으로 알려져 있다.

상기와 같은 자외선 노출에 의해 유발되는 피부광노화 등의 문제점을 방지하기 위해 최근에는 자외선 차단을 위한 각종 제품들이 개발되어 제공되고 있으며, 대표적인 예로서 등록특허 제10-0749891호를 통하여 그 구체적인 구성을 살펴보면 다음과 같다.

유기 자외선 차단제 또는 무기 자외선 차단제 및 왁스 성분을 포함하는 자외선 차단 화장료 조성물에 있어서, 유기 자외선 차단제 1 내지 20 중량%, 무기 자외선 차단제　1 내지 40 중량%, 왁스 성분　3 내지 10 중량%, 비이온 계면활성제　1 내지 10 중량%, 오일 성분　10 내지 50 중량%, 실리콘 폴리머　1 내지 20 중량%, 및 안료　5 내지 30 중량%를 포함하여 구성된다.

등록특허 제 10 - 0749891 - 0000 호 등록특허 제 10 - 1342292 - 0000 호 등록특허 제 10 - 1455833 - 0000 호 등록특허 제 10 - 1002866 - 0000 호

상기와 같은 종래 기술이 적용되는 자외선 차단 화장료 조성물은 통상의 자외선 차단제와 마찬가지로 유기 자외선 차단제로 이루어진 화학적 차단제와 무기 자외선 차단제로 이루어진 물리적 차단제를 주된 성분으로 포함하는 형태를 취하고 있다.

일반적으로, 상기 유기 자외선 차단제는 태양광 에너지를 분자 내에 가두어 자외선을 흡수해 차단효과를 발휘하며, 상기 무기 자외선 차단제는 자외선을 반사, 분산시키는 물리적 성질을 가진 물질을 이용해 구성된다.

따라서, 자외선 차단 화장료 조성물을 제조시 자외선 차단 효과를 극대화하기 위해 상기 유·무기 자외선 차단제 성분의 함량을 늘리게 되며 상기 종래 기술이 적용된 자외선 차단 화장료 조성물 역시 무기 자외선 차단제의 경우 최대 함량을 총 중량에 대해 40중량% 범위로 기재하고 있다.

그러나, 상기 유기 자외선 차단제는 인공적인 화학성분으로 이루어져 있으므로 피부자극을 유발하여 피부염증 등 각종 피부질환의 발생 원인이 된다. 따라서 민감성 피부를 가진 사람이나 외부 자극에 대한 저항력이 약한 영유아의 경우에는 유기 자외선 차단제 성분을 함유한 제품의 사용을 기피하는 실정이다.

또한, 상기 무기 자외선 차단제 역시 산화아연, 이산화티탄 등으로 이루어지므로 피부를 통해 인체에 축적될 경우 주요 기관의 손상을 유발할 가능성이 있다.

그러므로, 상기 유·무기 자외선 차단제 성분은 그 함량을 제한적으로 사용하는 것이 바람직하며 일반적으로 총 중량에 대해 각각 25중량% 이내 범위로 사용하도록 하고 있다.

그러나, 상술한 바와 같은 종래 자외선 차단 화장료 조성물이 가진 문제점을 극복하기 위해서는 사용한도의 제한과 함께 보다 근본적인 해결을 위한 신규한 방안의 개발이 절실히 요구되는 실정이다.

이에 본 발명에서는 상술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위하여 발명한 것으로서,

죽여 추출물이 첨가된 보호제 1 ~ 30 중량부와, 무기 자외선 차단제 0.1 ~ 25 중량부와, 유기 자외선 차단제 0.1 ~ 25 중량부와, 오일 1 ~ 20 중량부와, 계면활성제 0.1 ~ 10 중량부를 포함하여 이루어지도록 구성함으로써 유·무기 자외선 차단제 성분에 의한 피부 손상을 방지하고 자외선 차단 효과를 더욱 증대시킬 수 있는 목적 달성이 가능하다.

본 발명은 대나무 줄기의 외피를 제거한 속껍질로서 강력한 항산화 작용 특성을 가지는 죽여 추출물을 첨가한 보호제를 포함하여 자외선 흡수에 의한 차단 성능을 더욱 증대시키고, 자외선에 의한 HaCaT 각질세포의 세포자살, 산화스트레스 및 MMP1의 발현을 감소시키는 데 직접적인 영향을 주어 피부광노화를 방지하는 효과가 있다.

특히, 죽여 추출물은 피부 친화성이 우수한 천연원료이므로 저자극적이고 부작용의 발생을 배제하는 이점이 있으며, 죽여 추출물과 함께 항염, 항균 약성을 가진 황금(黃芩) 뿌리 추출물, 및 양제근 추출물을 더 첨가할 경우 그 효과를 더욱 증진시킬 수 있는 이점이 있다.

도 1의 (a)는 본 발명의 실시 예에 따른 죽여 추출물이 첨가된 보호제의 자외선 흡수 스펙트럼 그래프, (b)는 HPLC 그래프.
도 2의 (a)는 본 발명의 실시 예에 따른 죽여 추출물이 첨가된 보호제의 농도에 따른 HaCaT 각질세포 생존율 증가효과에 관한 그래프, (b)는 농도별 죽여 추출물이 첨가된 보호제와 죽여 추출물의 유효성분인 p-CA의 자외선B에 유도된 세포독성에 대한 HaCaT 각질세포 생존율 증가효과 분석 그래프.
도 3의 (a)는 본 발명의 실시 예에 따른 농도별 죽여 추출물이 첨가된 보호제와 p-CA의 처리에 따른 자외선B에 노출된 HaCaT 각질세포에서 caspase-3 효소 발현량 감소효과 분석 그래프, (b)는 자외선B에 노출된 HaCaT 각질세포에서 Bax와 Bcl-2 효소의 발현량 비율 감소효과 분석 그래프.
도 4의 (a)는 본 발명의 실시 예에 따른 농도별 죽여 추출물이 첨가된 보호제와 p-CA의 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 유도된 활성산소종 감소효과 분석 그래프, (b)는 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 의해 유도된 지질과산화 감소효과 분석 그래프.
도 5의 (a), (b)는 본 발명의 실시 예에 따른 농도별 죽여 추출물이 첨가된 보호제와 p-CA의 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 노출시 MMP-1의 발현 감소효과 분석 그래프, (c)는 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 노출시 phospho-JNK 및 JNK의 발현 변화 분석 그래프.

이하, 본 발명에 의한 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

도 1의 (a)는 본 발명의 실시 예에 따른 죽여 추출물이 첨가된 보호제의 자외선 흡수 스펙트럼 그래프, (b)는 HPLC 그래프이고, 도 2의 (a)는 본 발명의 실시 예에 따른 죽여 추출물이 첨가된 보호제의 농도에 따른 HaCaT 각질세포생존율 증가효과에 관한 그래프, (b)는 농도별 죽여 추출물이 첨가된 보호제와 죽여 추출물의 유효성분인 p-CA의 자외선B에 유도된 세포독성에 대한 HaCaT 각질세포 생존율 증가효과 분석 그래프이고, 도 3의 (a)는 본 발명의 실시 예에 따른 농도별 죽여 추출물이 첨가된 보호제와 p-CA의 처리에 따른 자외선B에 노출된 HaCaT 각질세포에서 caspase-3 효소 발현량 감소효과 분석 그래프, (b)는 자외선B에 노출된 HaCaT 각질세포에서 Bax와 Bcl-2 효소의 발현량 비율 감소효과 분석 그래프이고, 도 4의 (a)는 본 발명의 실시 예에 따른 농도별 죽여 추출물이 첨가된 보호제와 p-CA의 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 유도된 활성산소종 감소효과 분석 그래프, (b)는 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 의해 유도된 지질과산화 감소효과 분석 그래프이고, 도 5의 (a), (b)는 본 발명의 실시 예에 따른 농도별 죽여 추출물이 첨가된 보호제와 p-CA의 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 노출시 MMP-1의 발현 감소효과 분석 그래프, (c)는 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 노출시 phospho-JNK 및 JNK의 발현 변화 분석 그래프로서 함께 설명한다.

본 발명의 기술이 적용되는 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물 제조방법은 죽여 추출물이 첨가된 보호제 1 ~ 30 중량부와, 무기 자외선 차단제 0.1 ~ 25 중량부와, 유기 자외선 차단제 0.1 ~ 25 중량부와, 오일 1 ~ 20 중량부와, 계면활성제 0.1 ~ 10 중량부를 포함하여 이루어진다.

죽여(竹茹)는 대나무 줄기의 외피를 제거한 속껍질로서 구체적으로는 화본과에 속한 다년생 상록수 솜대, 청피대나무 등의 외피를 제거한 중간층피이며 약성이 차서 열을 내리고 항염, 항균 등의 효능을 가진다.

상기 보호제에 첨가되는 죽여 추출물은 죽여를 채취하여 건조한 후 용매에 침지해 가열하여 추출할 수 있으며, 추출 용매는 물, 에탄올, 에탄올 수용액, 메탄올, 메탄올 수용액 중에서 선택된 용매로 추출하고 감압 증발 건조하여 분말로 형성한다.

또한 상기 죽여 추출물은 보호제의 총중량에 대하여 죽여 추출물의 함량을 50 중량부 이상으로 구성하여 죽여 추출물의 약성이 보호제 및 본 발명에 따른 조성물에 유효하게 부여되도록 한다.

상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제는 일반적인 자외선 차단제에 함유되는 주성분인 유·무기 자외선 차단제 성분에 의한 각종 피부 손상의 유발을 억제하고 자외선 흡수에 의한 차단 효과를 극대화하는 본 발명에서 가장 핵심되는 주요 성분이 된다. 죽여 추출물이 첨가된 보호제의 효능에 대한 분석은 후술되는 실험 예를 통해서 더욱 상세히 기술하도록 한다.

한편, 상기 보호제에는 죽여 추출물과 함께 황금(黃芩) 뿌리 추출물 및 양제근 추출물을 더 첨가하여 구성한다.

상기 황금은 꿀풀과에 속하는 초본식물로서 주로 그 뿌리를 채취, 건조하여 약재로 이용한다. 죽여와 마찬가지로 약성이 차며 열을 내리므로 피부발적종기 등을 완화하고 항염 및 피부진정작용 등에 효능을 가진다. 여러 임상실험을 통해 임신중인 부인이나 소아에도 복용이 가능한 것으로 알려져 있어 죽여 추출물과 함께 일정 비율로 배합하여 사용하면 더욱 효과적이다.

상기 양제근은 마디풀과의 근연식물인 양제의 뿌리로서 찬 약성을 가지며 어혈을 제거하고 지혈에 우수한 효능을 가지는 것으로만 널리 알려져 있으나 항염, 항균, 독성 제거 효능이 있어 예로부터 피부질환시 양제근을 갈아 환부에 붙여 증상을 완화하는데 사용했다.

따라서, 약성의 궁합이 잘 맞는 황금, 및 양제근을 용매 추출한 추출물을 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제에 첨가하여 유·무기 자외선 차단제 성분에 의한 피부 손상 유발 억제 효과를 더욱 증대시키도록 한다.

상기 무기 자외선 차단제는 피부에 도달하는 자외선을 물리적으로 산란시켜 자외선을 차단하는 기능을 하는데 본 발명에서는 징크옥사이드, 티타늄디옥사이드, 철산화물, 마그네슘산화물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 구성한다.

무기 자외선 차단제는 자외선 차단 효과는 우수하나 백탁현상을 유발하고 피부에 자극적인 등의 부작용이 있으므로 상술한 바와 같이 본 발명의 화장료 조성물의 총 중량에 대해 무기 자외선 차단제의 함량은 0.1 ~ 25 중량부 범위에서 포함되도록 한다.

상기 유기 자외선 차단제는 피부에 도달한 자외선의 에너지를 흡수하여 자외선을 차단하는 기능을 하는데 본 발명에서는 드로메트리졸, 드로메트리졸트리실록산, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에칠아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디에칠헥실부타미도트리아존, 메칠렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 비스에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 옥토크릴렌, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드, 폴리실리콘-15(디메치코디에칠벤잘말로네이트), 호모살레이트, 에칠헥실디메칠파바, 에칠헥실메톡시신나메이트, 에칠헥실살리실레이트, 에칠헥실트리아존, 디갈로일트리올리에이트, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존), 벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 시녹세이트, 4-메칠벤질리덴캠퍼, 페닐벤즈이미다졸설포닉애씨드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 구성한다.

유기 자외선 차단제는 무기 자외선 차단제에 비해 백탁현상 등의 부작용은 없으나 인공적인 화학성분으로 이루어지므로 피부자극을 유발하여 피부염증 등 각종 피부질환의 발생 원인이 된다. 따라서 유기 자외선 차단제의 함량은 상술한 바와 같이 본 발명의 화장료 조성물의 총 중량에 대해 0.1 ~ 25 중량부 범위에서 포함되도록 한다.

이하에서는 전술한 바와 같은 구성으로 이루어지는 본 발명을 포함하는 실험 예를 구성하고 상기 죽여 추출물의 첨가에 따른 자외선 차단 효과 및 피부광노화 억제 효과에 대한 분석결과를 면밀하게 파악하고자 한다.

<실험 예 1>

본 발명의 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물의 자외선 흡수 효능을 확인하기 위해 주요 핵심 성분인 죽여 추출물이 첨가된 보호제를 이용해 자외선 흡수 스펙트럼 측정 및 HPLC 분석 실험을 시행한다.

도 1의 (a)는 본 발명의 실시 예에 따른 죽여 추출물이 첨가된 보호제의 자외선 흡수 스펙트럼 그래프를 도시한 것이고, 도 1의 (b)는 HPLC(High-performance liquid chromatography, 고성능 액체 크로마토그래피) 그래프를 도시한 것이다.

이하의 실험에서 데이터는 셋 또는 그 이상의 독립적인 실험의 평균±SE로 구하였다. 그룹 간 차이의 유사성은 Students t-test를 사용하여 측정하였고 Duncan's multiple-range test는 차이가 Students t-test(p<0.05)로 유의하였을 때 적용된다. 통계적 유의성은 p values<0.05일 때 판단된다.

자외선 흡수 스펙트럼 측정 실험에서는 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제를 10, 30, 100 ㎍/㎖ 농도로 PBS(Phosphate Buffered Saline)에 용해하여 사용하며 자외선 분광광도계를 이용해 200~600nm에서 측정하였다.

HPLC 분석 실험에서는 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제를 1.0 ㎍/㎖ 농도의 수용액 상태로 20㎕를 주입하여 HPLC분석을 진행하였다.

성분 분리는 5mm Hector-MC18 컬럼 (4.6mm x 250mm)에서 수행하였고 이동상(移動相)은 0.5% formic acid 'A'와 acetonitrile 'B'로 구성하였다. 농도 구배는 아래 표 1과 같으며 유속은 0.8㎖/min이고 검출기는 280nm로 설정하였다. 양성 대조군인 p-CA(파라-쿠마릭산)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였고 자외선 감지기는 280nm로 설정하였다.

Time(min)	0~6	6~10	10~35	35~60	60~70	70~80
농도(%)	100	0~12	12~21	21~41	41~100	100
이동상	A	B	B	B	B	B

이상의 실험 예 1에 따른 실험 결과, 도 1에 도시된 바와 같이 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제의 용해 농도가 높을수록 자외선 흡수 스펙트럼이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있다.

또한, HPLC 패턴을 통해 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제에는 p-CA(파라-쿠마릭산)이 1.7% 함유된 것을 확인할 수 있었다.

상기 p-CA는 인체의 멜라닌 세포에서 멜라닌 생성에 주요 촉매작용을 하는 타이로시나제 효소의 작용을 억제하고 자외선의 세포 독성을 경감시키는 것으로 알려져 있다. 따라서 p-CA를 함유하는 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제를 통해 자외선 노출에 의한 홍반형성 및 색소침착 등을 억제하는 효과를 발휘할 것으로 판단된다.

<실험 예 2>

본 발명의 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물의 HaCaT 각질세포 생존율에 대한 효능을 확인하기 위해 주요 핵심 성분인 죽여 추출물이 첨가된 보호제를 이용해 HaCaT 각질세포생존율 및 자외선B에 유도된 세포독성에 대한 HaCaT 각질세포생존율 분석 실험을 시행한다.

도 2의 (a)는 본 발명의 실시 예에 따른 죽여 추출물이 첨가된 보호제의 농도에 따른 HaCaT 각질세포생존율 증가효과에 관한 그래프를 도시한 것이고, 도 2의 (b)는 농도별 죽여 추출물이 첨가된 보호제와 죽여 추출물의 유효성분인 p-CA의 자외선B에 유도된 세포독성에 대한 HaCaT 각질세포 생존율 증가효과 분석 그래프를 도시한 것이다. #p<0.05 vs. 대조군 (Vehicle)

HaCaT 각질세포생존율 분석 실험에서는 HaCaT 각질세포에 농도별로 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제를 24시간 동안 처리하고 MTT법을 통해 세포생존율을 결정하였으며 대조군 백분율로 표시하였다.

상기 HaCaT 각질세포는 10% 태아 소 혈청과 100U/㎖ 페니실린, 0.1mg/㎖ 스트렙토마이신, 0.25g/㎖ 암포테리신 B, 10g/㎖ 하이드로코티손을 포함한 DMEM/F-12 배지에서 배양하였다. HaCaT 각질세포는 5% CO₂와 95% 공기를 포함하는 습한 대기의 37℃ 온도에서 배양하였다.

세포생존율은 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 방법으로 분석하였다. 이는 세포 내 축적된 암청색의 포르마잔(Dark blue formazan) 결정으로 옅은 노란색의 MTT를 감소시키는 생존 세포 내 미토콘드리아 탈수소 효소의 활성에 근거를 둔 것이다.

즉, HaCaT 각질세포를 PBS로 세척하고 1mg/㎖ MTT가 포함된 1㎖의 배양 배지에서 3시간 동안 배양한다. 이후 배지를 버리고 HaCaT 각질세포에 포르마잔이 용해된 iso-프로판올을 처리한다. 용액은 마이크로플레이트(microplate)에 옮기고 포르마잔을 595nm의 흡광도를 측정하여 정량한다. 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제의 세포독성은 10~100 ㎍/㎖ 농도로 24시간 동안 HaCaT 각질세포에 처리하여 비교한다.

자외선B에 유도된 세포독성에 대한 HaCaT 각질세포 생존율 분석 실험에서는 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제를 지정 농도로 처리하고 자외선B 10mJ/cm² 노출시 PBS에 용해된 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제(10, 30, 100㎍/㎖)의 유무에 따라 조사되었다. HaCaT 각질세포는 24시간 동안 배양하고 MTT 실험을 통해 세포생존율을 결정하였으며 대조군 백분율로 표시하였다. #p<0.05 vs. 자외선 비조사 대조군. *p<0.05 vs. 자외선 조사 대조군 (Vehicle).

HaCaT 각질세포는 6-well plate에 well 당 300,000 cells로 접종하여 세포가 well 바닥에 약 80% 이상 부착될 때까지 24시간 동안 배지에 배양하였다. 이후 PBS로 2회 세척하고 자외선B에 노출한다.

자외선B 처리는 자외선B 램프를 사용하여 세포배양 후드 안에서 시행한다. 방사선의 강도는 자외선 조도계를 사용하여 측정하고 자외선은 80W/cm² 의 강도로 배양 플레이트 세포에 처리하며 처리 지속 시간은 자외선B(10mJ/cm²)의 특정 양의 자외선 조사에 맞게 하였다. 처리 후에는 PBS를 버리고 배양 배지로 바꿔준 후 HaCaT 각질세포를 24시간 배양하였다. 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제의 자외선B에 유도된 세포독성은 자외선B에 노출 시 0~100 ㎍/㎖ 농도로 24시간 동안 HaCaT 각질세포에 처리하여 비교한다.

이상의 실험 예 2에 따른 실험 결과, 죽여 추출물이 첨가된 보호제(BCTE)는 도 2에 도시된 바와 같이 100 ㎍/㎖까지 세포독성이 없는 것을 확인할 수 있다.

또한, 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제는 농도 의존적으로 자외선에 노출된 HaCaT 각질세포의 생존율을 증가시켰으며 죽여 추출물이 첨가된 보호제 100㎍/㎖에서 자외선B에 의한 생존 정도를 유의하게 향상시킨 것을 확인할 수 있다. 양성대조군으로 사용한 p-CA 또한 10㎍/㎖에서 보호작용을 나타내었다.

<실험 예 3>

본 발명의 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물의 자외선B에 노출된 HaCaT 각질세포에서 caspase-3, 및 Bax/Bcl-2에 대한 효능을 확인하기 위해 주요 핵심 성분인 죽여 추출물이 첨가된 보호제를 이용해 자외선B에 노출된 HaCaT 각질세포에서 caspase-3, 및 Bax/Bcl-2에 대한 효능 분석 실험을 시행한다. 단백질 분해 효소인 카스파제(caspase-3)의 활성화와 Bax, Bcl-2 유전자의 발현은 모두 세포자살을 야기하는 것으로 알려져 있다.

도 3의 (a)는 본 발명의 실시 예에 따른 농도별 죽여 추출물이 첨가된 보호제와 p-CA의 처리에 따른 자외선B에 노출된 HaCaT 각질세포에서 caspase-3 효소 발현량 감소효과 분석 그래프를 도시한 것이고, 도 3의 (b)는 죽여 추출물이 첨가된 보호제와 p-CA의 자외선B에 노출된 HaCaT 각질세포에서 Bax와 Bcl-2 효소의 발현량 비율 감소효과 분석 그래프를 도시한 것이다. #p<0.05 vs. 자외선 비조사 대조군. *p<0.05 vs. 자외선 조사 대조군 (Vehicle).

HaCaT 각질세포에서 자외선B 10mJ/cm² 노출시 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제(10, 30, 100㎍/㎖)의 유무에 따라 조사되고 HaCaT 각질세포는 24시간 동안 배양하였다.

활성형태인 절단된(cleavage) procaspase-3와 Bax/Bcl-2는 웨스턴블롯(Western blot)을 통해 분석한다. 데이터는 대조군 기준 배수로 나타내었다.

웨스턴블롯의 전체 세포 용해물은 용해 버퍼(10mM Tris-Cl, pH 7.4, 120mM NaCl, 25mM KCl, 2mM EGTA, 1mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 단백질 분해 효소 저해제 혼합물)를 사용하여 준비하였다. 용해물은 단백질을 변성하여 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel 전기영동)을 하였다.

크기별로 분리된 단백질을 PVDF(polyvinylidene fluoride) membranes으로 옮기고 이를 적합한 1차 항체와 4℃에서 하룻밤 동안, HRP(horseradish peroxidase)에 접합된 2차 항체와 실온에서 1시간 배양하였다. 면역반응성 밴드(immunoreactive bands)를 검출하였고 농도계 분석을 진행하였다.

이상의 실험 예 3에 따른 실험 결과, 도 3에 도시된 바와 같이 자외선B는 caspase-3의 절단된 활성 형태와 Bax/Bcl-2를 증가시키며, 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제(BCTE)가 포함된 배지에서는 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있다.

<실험 예 4>

본 발명의 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물의 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 유도된 활성산소종, 및 지질과산화에 대한 효능을 확인하기 위해 주요 핵심 성분인 죽여 추출물이 첨가된 보호제를 이용해 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 유도된 활성산소종, 및 지질과산화에 대한 효능 분석 실험을 시행한다.

도 4의 (a)는 본 발명의 실시 예에 따른 농도별 죽여 추출물이 첨가된 보호제와 p-CA의 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 유도된 활성산소종 감소효과 분석 그래프를 도시한 것이고, 도 4의 (b)는 죽여 추출물이 첨가된 보호제와 p-CA의 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 의해 유도된 지질과산화 감소효과 분석 그래프를 도시한 것이다. #p<0.05 vs. 자외선 비조사 대조군. *p<0.05 vs. 자외선 조사 대조군 (Vehicle).

활성산소종은 인체내 산소의 정상적인 대사작용에 의해 자연스럽게 발생하나 자외선에 노출시 매우 빠르게 증가하여 세포구조 등을 손상시키는데 이를 산화스트레스라고 한다.

지질과산화는 피부에 유해한 대표적인 물질로서 불포화지방산이 산화되어 체내에 축적되면 피부섬유가 취약해져 주름이나 색소침착과 같은 노화현상을 촉진하며 자외선에 의한 영향으로 더욱 가속될 수 있다.

HaCaT 각질세포에서 자외선B 10mJ/cm²에 조사시 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제(10, 30, 100㎍/㎖)의 유무에 따라 조사되고 24시간 동안 배양하였다.

활성산소종의 생성은 산화-민감성 탐침인 DHR 123(dihydrorhodamine 123)을 사용하였다. 세포는 자외선B 조사에 앞서 1.0 micormole DHR 123를 처리하고 DHR 123에서 rhodamine 123으로의 산화에 따른 세포의 형광이미지를 얻었다.

생성된 rhodamine 123는 차가운 70% ethanol/0.1 N HCl을 사용하여 세포로부터 추출한 후, 13000rpm에서 15분간 원심분리하였다. 상등액을 1 M NaHCO₃로 중화한 후 보다 깨끗한 상층액을 얻기 위해 한번 더 원심분리 하였다. 형광 강도는 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 485nm의 파장에서 여기(excitation)하여 590nm로 방출되는 파장을 측정하였다.

지질과산화 분석은 지질과산화 지표물질인 TBARS (2-thiobarbituric acid-reactive substances)를 정량하였다. 세포는 용해 버퍼 (20mM Tris-Cl, 2.5mM EDTA, 1.0% SDS, pH7.5)에 처리하였다. 0.9㎖의 1.0% 인산과 1.0㎖의 0.9% 2-thiobarbituric acid에서 섞은 세포 용해물 (200mg protein in 0.1㎖)을 45분 동안 물중탕(water bath)에서 가열하였다.

말론디알데히드(malondialdehyde)의 전구체인 1,1,3,3-tetramethoxypropane의 표준 용액에 세포 용해물을 같은 방법으로 처리하였다. 냉각한 후 1.5㎖의 1-부탄올을 첨가하고 두 층으로 분리하기 위해 15분 동안 13000rpm으로 혼합물을 원심분리 하였다. 1-부탄올 층의 형광 강도를 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 540nm로 자극 후 방출하는 590nm의 형광을 측정하였다.

이상의 실험 예 4에 따른 실험 결과, 도 4에 도시된 바와 같이 자외선B에 노출된 HaCaT 각질세포에서 활성산소종 생성과 지질과산화가 증가하였고 이를 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제(BCTE)가 농도에 따라 감소시킨 것을 확인할 수 있다.

<실험 예 5>

본 발명의 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물의 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 노출시 MMP-1의 발현 변화와, phospho-JNK 및 JNK의 발현 변화에 대한 효능을 확인하기 위해 주요 핵심 성분인 죽여 추출물이 첨가된 보호제를 이용해 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 노출시 MMP-1의 발현 변화 및 phospho-JNK 및 JNK의 발현 변화에 대한 효능 분석 실험을 시행한다.

MMP-1은 피부 콜라겐 분해를 유도하는 단백질 효소로서 자외선에 의해 증가되어 피부노화를 야기시킨다. JNK 효소 역시 자외선에 의해 활성화되어 세포자살에 관여하는 것으로 알려져 있다.

도 5의 (a), (b)는 본 발명의 실시 예에 따른 농도별 죽여 추출물이 첨가된 보호제와 p-CA의 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 노출시 MMP-1의 발현 감소효과 분석 그래프를 도시한 것이고, 도 5의 (c)는 죽여 추출물이 첨가된 보호제와 p-CA의 HaCaT 각질세포에서 자외선B에 노출시 phospho-JNK 및 JNK의 발현 변화 분석 그래프를 도시한 것이다. #p<0.05 vs. 자외선 비조사 대조군. *p<0.05 vs. 자외선 조사 대조군 (Vehicle).

HaCaT 각질세포에 자외선B를 10mJ/cm²에 조사시 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제(10, 30, 100㎍/㎖)의 유무에 따라 조사되고 24시간 동안 배양하였다.

도 5의 (a)는 MMP1의 mRNA 발현은 qRT-PCR을 통해 측정하였다. β-Actin는 대조 목적으로 사용되었다. 데이터는 대조군 기준 배수로 나타내었다. 도 5의 (b)는 웨스턴블롯으로 MMP1 단백질 발현을 확인하였다. 도 5의 (c)는 자외선B에 의한 시간에 따른 인산화된 JNK의 단백질 발현을 웨스턴블롯으로 확인하였다.

전체 세포의 RNA를 추출하였고 cDNA 준비를 위해 각 분주한 1mg을 역전사하고 PCR 증폭을 수행하였다.

프라이머(primer)의 순서는 MMP1 5'-CAT ATA TGG ACG TTC CCA AAA TCC-3'(forward)와 5'-GTG CGC ATG TAG AAT CTG TCT TTA A-3'(reverse)와 같다.

반응은 다음과 같은 조건으로 수행하였다. 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 이어 해리단계인 40 증폭주기(95℃에서 15초, 60℃에서 1분)를 사용하여 수행하였다. 증폭 산물의 균질성을 알려주는 용융 곡선 분석은 하나의 피크를 보여줬다. β-Actin와 비교하여 mRNA 발현 수준을 상대적 임계 사이클 방법을 사용하여 계산하였다.

이상의 실험 예 5에 따른 실험 결과, 도 5의 (a)에 도시된 바와 같이 자외선B에 의해 증가된 MMP1의 mRNA가 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제(BCTE)의 농도에 의존적으로 감소하였고, 100 ㎍/㎖에서 유의하게 감소시켰으며 양성 대조군으로 사용한 p-CA 또한 10 ㎍/㎖에서 유의하게 MMP1을 감소시켰다.

또한, 도 5의 (b)에 도시된 바와 같이 자외선B에 의해 증가된 MMP1의 단백질이 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제의 농도에 의존적으로 감소하였고 10 ㎍/㎖ 이상의 농도에서 유의하게 감소시켰으며 양성 대조군으로 사용한 p-CA 또한 10 ㎍/㎖에서 유의하게 MMP1을 감소시켰다.

또한, 도 5의 (c)에 도시된 바와 같이 자외선B에 의해 증가했던 인산화된 JNK가 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제 100 ㎍/㎖ 와 양성 대조군으로 사용한 p-CA 10 ㎍/㎖ 농도에서 감소됨을 확인할 수 있다.

<실험 예 6>

본 발명의 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물의 자유라디칼 소거활성에 대한 효능을 확인하기 위해 주요 핵심 성분인 죽여 추출물이 첨가된 보호제를 이용해 ABTS와 DPPH 라디칼 소거활성에 대한 효능 분석 실험을 시행한다.

아래 표 2는 자유라디칼 소거활성을 나타낸 것이다. 본 발명의 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제에 대한 양성 대조군으로 아스코르브산(Ascorbic acid) 및 p-CA를 사용하였다.

반응물질 (Materials)	SC50(㎍/㎖)
반응물질 (Materials)	DPPH	ABTS
죽여 추출물이 첨가된 보호제(BCTE)	293	8.93
Ascorbic acid	3.11	3.04
p-CA	10,000	1.21

자유라디칼은 한 개 또는 그 이상의 비공유전자를 가지고 독립하여 존재할 수 있는 화학종을 말하는데, 비공유전자를 갖는 분자는 일반적으로 불안정하고 다른 것으로부터 전자를 빼앗거나 비공유전자를 그 외 다른 곳으로 주어 안정화되고자 하는 성질이 강하다.

따라서 자유라디칼은 반응성이 풍부하고 여러 가지 화합물을 공격할 수 있으며 생체 내에서 생성된 라디칼에 의한 막지방질, 단백질, 핵산 등의 공격과 질병발생과의 관련이 보고되고 있다.

자유라디칼 소거활성은 2,2'-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS)와 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radial (DPPH)의 양이온 라디칼에 대해 측정하였다.

ABTS 라디칼은 7.4 mM ABTS와 2.6 mM 과황화칼륨(potassium persulfate)을 동량 섞어서 만들었고, 어두운 실온에서 24시간 반응시킨 것으로 진행하였다.

메탄올로 희석시킨 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제의 각 연속적인 희석액 (100㎕)을 메탄올에 녹인 100㎕의 0.2mM ABTS 라디칼과 실온에서 3분간 반응시킨후, 마이크로플레이트 리더를 이용하여 734nm에서 흡광도를 측정하였다.

DPPH 분석을 위하여 각 연속적으로 메탄올에 희석한 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제 100μL와 메탄올에 녹인 0.2mM DPPH를 섞은 혼합물을 3분간 실온에서 반응시킨 후 마이크로플레이트 리더를 이용하여 517nm에서 흡광도를 얻었다.

데이터는 SC₅₀(㎍/㎖)으로 나타냈고 이는 샘플이 50%의 라디칼 소거활성을 보여주는 농도이다.

이상의 실험 예 5에 따른 실험 결과, 상기 표 1에 기재된 바와 같이 아스코르브산은 p-CA보다 훨씬 더 효율적으로 가장 강력한 DPPH 라디칼의 소거활성을 나타낸 것을 확인할 수 있다. 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제(BCTE)는 p-CA보다 좀더 효율적인 DPPH 라디칼 소거활성을 나타내었다. ABTS 라디칼의 경우 p-CA가 가장 소거활성이 강했고 이어서 아스코르브산, 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제 순으로 나타내었다.

이상의 상기 실험 예 1 내지 실험 예 6에서, 본 발명의 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물의 주요 성분인 죽여 추출물이 첨가된 보호제는 자외선의 넓은 흡수 범위를 가지며 배양된 HaCaT 각질세포의 생존율에는 최소한의 영향을 끼치는데 자외선 노출에 의한 HaCaT 각질세포의 사멸을 감소시킨다.

아울러, 자외선B에 유도된 산화스트레스의 지표로 측정된 지질과산화 역시 억제하였으며, 또한 자외선B에 노출된 HaCaT 각질세포에서 증가된 MMP-1의 발현과 인산화된 JNK를 죽여 추출물이 첨가된 보호제가 농도 의존적으로 감소시키면 그의 표준물질인 p-CA 또한 감소시킨다.

다시 말해, 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제는 자외선B의 영향에 의해 활성산소종의 생성 및 과산화지질의 발현에 따른 산화스트레스와, 피부 콜라겐 분해를 유도하는 JNK 효소의 활성화 및 MMP-1의 발현에 따른 콜라겐 대사, 및 Bax/Bcl-2의 증가에 따른 caspaspase-3의 활성화에 의한 세포자살이 야기하는 피부광노화를 억제하는 효능을 가짐을 확인할 수 있다.

그러므로, 상기와 같은 본 발명에 따른 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물은 자외선에 의한 산화스트레스, 염증, 세포 사멸 등으로부터 피부세포를 보호하는데 탁월한 효능을 가지는 상기 죽여 추출물이 첨가된 보호제를 포함해 무기 자외선 차단제, 유기 자외선 차단제 등의 타 성분과 일정 배합비율로 조성하여 구성함으로서 자외선 흡수에 의한 차단 성능을 더욱 증대시키고, 자외선에 의한 피부광노화 및 유·무기 자외선 차단제가 유발하는 각종 피부질환 등의 부작용을 억제하는 효과가 있다.

특히, 피부 친화성이 우수한 천연원료인 죽여 추출물을 이용하므로 저자극적이며, 죽여 추출물과 함께 항염, 항균 약성을 가진 황금(黃芩) 뿌리 추출물, 및 양제근 추출물을 더 첨가할 경우 그 효과를 더욱 증진시킬 수 있는 이점이 있다.

해당 없음.

Claims

죽여 추출물이 첨가된 보호제 1 ~ 30 중량부와, 무기 자외선 차단제 0.1 ~ 25 중량부와, 유기 자외선 차단제 0.1 ~ 25 중량부와, 오일 1 ~ 20 중량부와, 계면활성제 0.1 ~ 10 중량부를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 죽여 추출물은 물, 에탄올, 에탄올 수용액, 메탄올, 메탄올 수용액 중에서 선택된 용매로 추출하고 감압 증발 건조하여 분말로 형성하며;
상기 보호제의 총중량에 대하여 죽여 추출물의 함량이 50 중량부 이상인 것을 특징으로 하는 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 보호제에는 황금(黃芩) 뿌리 추출물을 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 보호제에는 양제근 추출물을 더 첨가하는 것을 특징으로 하는 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 무기 자외선 차단제는 징크옥사이드, 티타늄디옥사이드, 철산화물, 마그네슘산화물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 유기 자외선 차단제는,
드로메트리졸, 드로메트리졸트리실록산, 디소듐페닐디벤즈이미다졸테트라설포네이트, 디에칠아미노하이드록시벤조일헥실벤조에이트, 디에칠헥실부타미도트리아존, 메칠렌비스-벤조트리아졸릴테트라메칠부틸페놀, 비스에칠헥실옥시페놀메톡시페닐트리아진, 옥토크릴렌, 이소아밀-p-메톡시신나메이트, 테레프탈릴리덴디캠퍼설포닉애씨드, 폴리실리콘-15(디메치코디에칠벤잘말로네이트), 호모살레이트, 에칠헥실디메칠파바, 에칠헥실메톡시신나메이트, 에칠헥실살리실레이트, 에칠헥실트리아존, 디갈로일트리올리에이트, 멘틸안트라닐레이트, 벤조페논-3(옥시벤존), 벤조페논-4, 벤조페논-8(디옥시벤존), 부틸메톡시디벤조일메탄, 시녹세이트, 4-메칠벤질리덴캠퍼, 페닐벤즈이미다졸설포닉애씨드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 자외선 차단 및 자외선에 의한 피부 손상 방지용 화장료 조성물.