KR20120106398A - 백리향 추출물을 함유하는 항산화 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항산화 효과을 갖는 백리향 추출물 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 물 또는 에탄올(ethanol)을 추출용매로 하는 백리향 추출물의 추출방법과 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 백리향 추출물은 천연물 유래 물질로써 독성 및 부작용이 없으며 탁월한 항산화 효과를 나타내므로, 활성 산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 노화 및 질환의 억제 또는 치료에 안전하고 효과적으로 이용될 수 있다.

Description

백리향 추출물을 함유하는 항산화 조성물{Antioxidant composition comprising Thymus quinquecostatus extracts}

본 발명은 항산화 효과가 있는 백리향 추출물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항산화 효과가 있는 백리향 추출물과 물 또는 에탄올(ethanol)을 추출용매로 하는 백리향 추출물의 제조방법 및 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물에 관한 것이다.

산소는 지구상에서 가장 많은 원소로서(53.8%) 건조대기 중의 21%를 차지하고 있으며, 모든 생물체들은 산소를 이용하여 생명 유지에 필요한 에너지를 발생하게 된다. 그러나 이와 같이 생명 유지에 절대적으로 필요한 산소이지만 안정한 분자상태인 기저삼중항산소(ground state triplet oxygen)가 체내 효소계, 환원대사, 화학약품, 공해물질, 광화학반응 등의 각종 물리적, 화학적, 환경적 요인 등에 의하여 수퍼옥사이드 라디칼(superoxide radical, O₂?), 하이드록실 라디칼(hydroxyl radical, HO?), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂), 일중항산소(singlet oxygen, O?)와 같은 반응성이 매우 큰 활성산소(active oxygen)로 전환되면 생체에 치명적인 산소 독성을 일으키는 양면성을 지니고 있다. 즉, 이들 활성산소는 세포구성 성분들인 지질, 단백질, 당, DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴 작용을 함으로써 노화는 물론 암을 비롯하여 뇌졸중, 파킨슨병 등의 뇌혈관 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 염증, 류마티스, 자기면역질환 등의 각종 질병을 일으키는 것으로 알려져 있다(Halliwell B. 1991. Drug antioxidant effects. Drugs 42: 596-605). 또한, 이들 활성산소에 의한 지질과산화 결과 생성되는 지질과산화물을 비롯하여 여러 가지 체내 과산화물도 세포에 대한 산화적 파괴로 인한 각종 기능장애를 야기함으로써 노화와 질병의 원인이 되기도 한다.

한편, 정상적인 세포에서도 대사과정 중 어느 정도의 자유 라디칼(free radical)과 기타 활성산소 및 과산화물이 생성되고 있으나, 생체 내에는 이들에 대한 방어기구로서 SOD(superoxide dismutase), 퍼옥시다제(peroxidase), 카탈레이즈(catalase) 등의 항산화효소와 함께 비타민 E, 비타민 C, 글루타티온(glutathione), 유비퀴논(ubiquinone, 코엠자임 Q10), 요산 등과 같은 항산화물질이 존재하여 스스로를 보호하고 있다. 그러나 이와 같은 생체방어기구에 이상이 초래되거나 각종 물리적, 화학적 요인들에 의하여 활성산소의 생성이 생체방어계의 용량을 초과하게 될 경우 산화적 스트레스가 야기된다. 따라서, 이와 같은 자유 라디칼을 소거할 수 있는 화합물 또는 과산화물 생성 억제물질과 같은 항산화제들은 이들 산화물들에 기인하는 노화 및 각종 질환의 억제 또는 치료제로서 기대된다.

항산화제에 대한 연구는 1969년 McCord와 Fridovich가 수퍼옥사이드 라디칼을 소거하는 효소인 SOD를 발견한 것을 계기로 본격적으로 진행되었으며, 최근에는 노화나 성인병 등의 질환이 활성산소의 존재에 의한 것으로 알려져, 활성산소를 조절할 수 있는 항산화제에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. 항산화제로는 효소계인 SOD, 카탈레이즈 외에 BHT(tert-butylhydroxytoluene), BHA(tert-butylhydroxyanisol) 등과 같은 합성 항산화제 및 토코페롤(tocopherol), 아스코르브산(ascorbic acid), 탄닌, 카로테노이드(carotenoids), 플라보노이드(flavonoids) 등과 같은 일부 천연 항산화제가 있으며, 그 외에도 다양한 종류의 항산화제 개발이 이루어지고 있다(Kitahara K., Matsumoto Y., Ueda H.A. and Ueoka R. 1992. Chem. Pharm. Bull. 40: 2208-2209; Hatano T. 1995. Natural Medicines 49: 357-363).

그러나, 이들 항산화제는 독성, 저활성 및 용도의 한계성 등의 여러 가지 문제로 인하여 사용에 제한을 받고 있다.

이에 본 발명자들은 독성 및 부작용이 거의 없으면서 탁월한 항산화 효과를 갖는 천연물 유래 항산화제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 본 발명의 백리향 추출물이 우수한 항산화 효과가 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국 본 발명의 목적은, 항산화 효과가 있는 백리향 추출물과, 이를 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물 및 백리향 추출물을 제조하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 백리향 추출물을 함유하는 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 노화 및 각종 질환의 억제 또는 치료에 안전하고 효과적인 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 물 또는 에탄올을 추출용매로 하여 추출한 백리향 추출물을 제공한다.

또한, 본 발명은 백리향 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물을 제공한다.

상기 항산화 조성물은 자유라디칼 소거 효능을 가지므로 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 노화 및 각종 질환의 치료 및 예방에 우수한 효과를 나타내며, 특히, 노화, 만성알콜중독, 죽상동맥경화증, 암, 관상심장질환, 백내장, 당뇨병, 다운증후군, 간염, 허혈이나 재관류성 손상, 류마티스성 관절염, 관절염, 신부전증, 염증반응, 각종 퇴행성 신경질환, 뇌졸중 발작 및 심근경색 등의 이상을 개선함으로써 상기 질환의 치료 및 예방이 가능하다.

또한, 본 발명은 백리향 추출물을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 백리향 추출물은 자유 라디칼 소거능이 우수하여 탁월한 항산화 효과를 나타내므로, 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 노화 및 각종 질환의 억제 또는 치료에 효과적이다.

또한 본 발명의 백리향 추출물은 천연물에서 유래한 물질로서 독성 및 부작용 없이 안전하게 사용될 수 있다.

도 1 은 본 발명 백리향 추출물의 환원력을 측정하여, BHT와 비교한 것을 나타낸 것이다.
도 2 는 본 발명 백리향 추출물(농도;1mg/ml)의 지질 과산화 억제 효과를 나타낸 것이다.(A) ferric thiocyanate(FTC), (B) thiobarbabituric acid method(TBA)
도 3 은 본 발명 백리향 추출물(물을 추출용매로 한 추출물)의 산화적 스트레스로 인한 DNA 손실에 대한 DNA 보호능력을 측정한 전기영동 사진이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 항산화 효과를 갖는 백리향 추출물을 제공한다.

본 발명의 백리향은 꿀풀과의 식물로 한국, 일본, 중국, 몽골, 인도 등의 높은 산꼭대기나 바닷가의 바위틈에 자라며 우리나라가 원산지이다. 높이 3 ~ 15cm이며, 원줄기는 땅위에 퍼져나가고, 어린 가지가 비스듬히 서며, 향기가 난다. 잎은 마주나고, 긴 타원형이거나 바소꼴이며, 길이 5 ~ 12 mm, 나비 3 ~ 8 mm이다. 양면에 선점(腺點)이 있으며, 가장자리는 밋밋하거나 물결 모양의 톱니가 있고 털이 난다. 백리향의 잎과 줄기는 우리나라에서 민간요법으로 발한제(diaphoretic), 항고창제(antiflatulent), 진해제(antitussive), 향료 등의 용도로 사용되고 있었다.

본 발명에서 백리향 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 극성용매를, 바람직하게는 에탄올을 첨가하여 추출하고, 가장 바람직하게는 물 또는 70% 에탄올을 첨가하여 추출한다.

또한, 본 발명에서 상기 "추출물"은 추출액, 정제물, 희석액, 농축액 및 건조물을 모두 포함한다.

본 발은 또한 백리향 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물을 제공한다.

본 발명의 백리향 추출물은 DPPH 라디칼, 하이드록실 라디칼, 알킬 라디칼, ABTS 라디칼 소거능 실험 및 FRAP 분석 등을 통해 항산화 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명의 백리향 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물은 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 노화 및 각종 질환, 바람직하게는 노화, 만성알콜중독, 죽상동맥경화증, 암, 관상심장질환, 백내장, 당뇨병, 다운증후군, 간염, 허혈이나 재관류성 손상, 류마티스성 관절염, 관절염, 신부전증, 염증반응, 각종 퇴행성 신경질환, 뇌졸중 발작 및 심근경색 등에서 선택되는 1종 이상의 질환을 억제 또는 치료하기 위한 의약품, 건강보조제, 화장료, 식품, 식품 첨가제 등에 유용하게 이용될 수 있으며, 이에 의해 제한되지는 않는다.

본 발명의 조성물이 의약품으로 이용될 경우에는 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용되는 제형으로 제조될 수 있다.

상기 담체 또는 부형제로는 물, 덱스트린(dextrin), 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 락토스(galactose), 프로필렌글리콜(propylene glycol), 파라핀(paraffin), 생리식염수, 덱스트로스(dextrose), 수크로즈(sucrose), 솔비톨(sorbitol), 만니톨(mannitol), 자이리톨(xylitol), 에리스리톨(erythritol), 말리톨(malitol), 전분(starch), 젤라틴(gelatin), 칼슘 포스페이트(calcium phosphate), 칼슘 실리케이트(calcium silicate), 셀룰로즈(cellulose), 메틸셀룰로즈(methyl cellulose), 폴리비닐피릴리돈(polyvinyl pyrrolidone), 메틸하이드록시벤조에이트(methylhydroxybenzoate), 프로필하이드록시벤조에이트(propylhydroxybenzoate), 탈크(talc), 마그네슘 스테라레이트(magnesium stearate) 및 광물류(minerals)가 있으며, 이들은 1종 이상 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며 통상의 담체 및 부형제는 모두 사용 가능하다.

또한, 항산화 조성물을 약제화 하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 또는 방부제 등을 더 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료로 이용될 경우에는 주름개선 및 미백 기능성 화장품, 유연화장수, 영양화장수, 아이크림, 영양크림, 맛사지크림, 클렌징크린, 에센스 등의 제형으로 제조될 수 있으며, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 백리향 추출물을 포함하여 주름개선 및 미백 원료 또는 통상의 화장료 원료로서 이외의 성분들을 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명은 또한, 백리향 추출물의 제조방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 백리향 추출물 제조방법은 (1)물을 추출용매로 한 경우, 백리향 건조시료에 대해 10배(w/v)의 물을 가하고, 약 2시간 동안 끓여 여과하고 감압농축한 다음 그 농축액을 동결건조하고, (2)70% 에탄올을 추출용매로 하는 경우, 백리향 건조시료에 대해 10배(w/v)의 70% 에탄올을 가하고, 24시간 동안 37℃에서 2회 추출하고, 회전식 진공농축기로 감압농축시킨 후 동결건조하여 백리향 추출물을 수득할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 이들 실시예 및 실험예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예1. 실험준비

본 발명에서 사용하는 5,5-디메틸-1-피롤린-N-옥시드(5,5-dimethyl-1-pyrroline N-oxide, DMPO), 2,2-아조비스(2-아미디노프로판)하이드로클로라이드(2,2-azobis(2-amidinopropane)hydrochloride, AAPH), 2,2-다이페닐-2-피그릴하이드라질(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH), α-4-피리딜-1-옥시드-N-3가-부틸니트론(4-pyridyl-1-oxide-N-tert-butylnitrone,4-POBN), 리놀레익산(Linoleic acid), 암모늄 티오시아네이트(ammonium thiocyanate), 2,6-디-3가-부틸-메틸페놀(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol, BHT), 3-(2-피리딜)-5,6-비스(4-페닐-설포닉엑시드)-1,2,4-트리아진(3-(2-pyridyl)-5,6-bis(4-phenyl-sulfonicacid)-1,2,4-triazine, ferrozine), 카테킨(catechin)은 Sigma Chemical Co.(St.Louis, MO, USA)에서 구매하였다.

실시예2. 물을 용매로 한 백리향 추출물의 제조

자양농장(충주, 한국)에서 구입한 백리향을 건조시켜 마쇄기로 분말화한 후, 그 건조시료에 대해 10배(w/v)의 물을 가하고, 2시간 동안 끓여 여과하고 감압농축한 다음 그 농축액을 동결건조하여 백리향 추출물을 수득하였다.

실시예3. 에탄올을 용매로 한 백리향 추출물의 제조

자양농장(충주, 한국)에서 구입한 백리향을 건조시켜 마쇄기로 분말화한 후, 그 시료에 대해 10배(w/v)의 70% 에탄올을 가하고, 24시간 동안 37℃에서 2회 추출하였고, 회전식 진공농축기로 감압농축시킨 후 동결건조하여 백리향 추출물을 수득하였다.

실험예 1. 총폴리페놀함량 및 총플라보노이드함량 결정

1-1. 총폴리페놀 함량은 폴린-시오칼토(Folin-Ciocalteu) 분석법(Aline et al., 2005)을 사용하여 측정하였다.

구체적으로, 실시예 2 및 3에 의한 백리향 추출물 시료 1mg을 탈이온수(deionic water, DW) 1mL에 용해시키고, 50% 폴린-시오칼토시약 2mL를 넣은 후 3분간 실온에서 방치한 다음 20% Na₂CO₃ 20mL를 첨가하여 혼합하였다. 그 후 30분간 실온에서 방치하고, UV-VIS 분광 광도계(UVIKON_XS, SECOMAM, 프랑스)를 사용하여 760nm에서 흡광도를 측정하였다. 이 때, 갈릭산(gallic acid)을 이용한 표준곡선은 최종농도가 0, 12.5, 25, 50, 100, 200 μg/mL가 되도록 작성하여 이 검량곡선으로부터 시료 중의 폴리페놀 함량을 구하였다.(mg GAE/g extract)

1-2. 총플라보노이드 함량은 실시예 2 및 3에 의한 백리향 추출물 시료 1mg 250uL , 탈이온수 1.25mL를 섞은 후 5% NaNO₂ 75uL 추가하고 실온에서 5분간 방치한 다음에 10% AlCl₃?H₂O 150uL 추가하고 10분간 실온에서 방치한 하였다. 그 후 1M NaOH 500uL와 탈이온수 275uL를 첨가하여 잘 섞은 다음 UV-VIS 분광 광도계를 사용하여 510nm에서 흡광도를 측정하였다. 카테킨(catechin)을 이용해서 표준곡선을 작성하여 검량곡선으로부터 시료 중의 총플라보노이드 함량을 구하였다.(mg CE/g extract)

그 결과를 표 1에 나타내었다.

Sample	Extraction yield (% w/w)	Total phenolic content (mg GAE/g extract)	Total flavonoid content (mg CE/g extract)
Water	18.93	156 ±1.40	193 ± 2.41
70% ethanol	14.18	105 ±1.55	111 ± 1.07

garlic acid equivalents(GAE), catechin equivalents(CE)

실험예 2. DPPH 라디칼 소거능을 이용한 항산화 효과 확인

본 발명에 따른 백리향 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 전자스핀공명기기(ESR spectrometer, JES-FA machine, JEOL, Tokyo, 일본)를 이용하여 DPPH 라디칼의 소거능을 측정하였다.

DPPH는 짙은 자주색을 나타내며, 그 자체가 질소 중심의 라디칼로서, 라디칼 전자의 비편재화에 의해 안정화된 상태로 존재하는데, ESR을 이용한 DPPH 라디칼 소거능 측정방법은 다음과 같다.

구체적으로, 에탄올에 용해시킨 60μM의 DPPH 60μL와 실시예 2 및 3에서 제조한 농도별로 준비한 백리향 추출물 60μL를 혼합한 다음, 10초간 강하게 볼텍스(vortex)하였다. 이후 정확히 2분간 실온에 방치한 다음 모세관 튜브(capillary tube)에 옮겨 ESR 스펙트로미터에서 측정하였다.[측정조건 - central field: 3,475 G, modulation frequency: 100 kHz, modulation amplitude: 2 G, microwave power: 5 mW, gain: 6.3×10⁵ , 온도: 298 K]

본 발명의 백리향 추출물에 대한 결과는 표 2에 나타낸 바와 같다.

하기 표 2에서 알 수 있듯이, 본 발명의 백리향 추출물은 농도 의존적으로 DPPH 라디칼을 소거하였으며, 실시예 2 및 실시예 3에 의해 제조한 백리향 추출물은 비타민 C(IC₅₀값 : 11㎍/mL)와 유사한 DPPH 라디칼 소거능을 보였다. 이 때 실시예 2에 의한 백리향 추출물의 IC₅₀값은 3㎍/mL이고, 실시예 3에 의한 백리향 추출물의 IC₅₀값은 10㎍/mL이었다.

실험예 3. 알킬 라디칼 소거능을 이용한 항산화 효과 확인

본 발명에 따른 백리향 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 2에서 사용한 전자스핀공명기(ESR spectrometer)를 이용해 알킬 라디칼 소거능을 측정하였다

알킬 라디칼은 APPH에 의해 생성되며, 소거능은 POBN과의 반응물의 양으로 측정할 수 있는데, ESR를 이용한 알킬 라디칼 소거능 측정법은 다음과 같다.

본 발명에서는 인산염 완충액(phosphate buffered saline, PBS, pH 7.4) 20μL에 실시예 2 및 3에서 제조한 농도별로 준비한 백리향 추출물 20μL, 40mM AAPH 20μL, 40mM 4-POBN 20μL를 차례로 첨가한 후 30분간 37℃의 수욕조(water bath)에서 반응시킨 다음 모세관 튜브로 옮겨 ESR 스펙트로미터에서 측정하였다.[측정조건 - central field: 3,475 G, modulation frequency: 100 kHz, modulation amplitude: 2 G, microwave power: 1 mW, gain: 6.3×10⁵ , 온도: 298 K]

그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 2 및 3에 의한 백리향 추출물은 비타민 C(IC₅₀값 : 11㎍/mL)보다 현저히 높은 알킬 라디칼 소거능을 보였다. 이때 실시예 2에 의한 백리향 추출물의 IC₅₀값은 6㎍/mL이고, 실시예 3에 의한 백리향 추출물의 IC₅₀값은 18㎍/mL이었다.

실험예 4. 하이드록실 라디칼 소거능을 이용한 항산화 효과 확인

본 발명에 따른 백리향 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 상기 실험예 2에서 사용한 전자스핀공명기(ESR spectrometer)를 이용해 하이드록실 라디칼 소거능을 측정하였다.

하이드록실 라디칼 소거능은 철 이온과 과산화수소가 반응하는 펜톤(Fenton) 반응에 의거해 하이드록실 라디칼을 생성시켜 DMPO(5,5-디메틸-1-피롤린 N-옥사이드)-OH의 양을 측정하여 하이드록실 라디칼 소거율을 측정하였다.

구체적으로, 실시예 2 및 3에서 제조한 농도별로 준비한 백리향 추출물 20μL에 0.3M DMPO 20μL, 10mM FeSO₄ 20uL, 10mM H₂O₂ 20μL를 넣어 반응시키고, 반응 혼합물을 정확히 2분 30초 후 모세관 튜브로 옮겨 ESR 스펙트로미터에서 측정하였다.[측정조건 - central field: 3,475 G, modulation frequency: 100 kHz, modulation amplitude: 2 G, microwave power: 1 mW, gain: 6.3×10⁵ , 온도: 298 K]

그 결과, 표 2에서 나타난 바와 같이 하이드록실 라디칼 소거능에서는 비타민 C(IC₅₀값 : 21㎍/mL)가 본 발명의 실시예 2 및 3에 의한 백리향 추출물보다 높은 것으로 나타났다. 이때, 실시예 2에 의한 백리향 추출물의 IC₅₀값은 300㎍/mL이고, 실시예 3에 의한 백리향 추출물의 IC₅₀값은 453㎍/mL이었다.

Sample	DPPH radical scavenging activity (IC50 mg/mL)	Alkyl radical scavenging activity (IC50 mg/mL)	Hydroxyl radical scavenging activity (IC50 mg/mL)
Water	0.003 ± 0.001	0.006 ± 0.002	0.300 ± 0.001
70% ethanol	0.010 ± 0.002	0.018 ± 0.001	0.453 ± 0.001
Vitamin C	0.003 ± 0.001	0.011 ± 0.003	0.021 ± 0.002

실험예 5. ABTS 라디칼 소거능을 이용한 항산화 효과 확인

본 발명에 따른 백리향 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, ABTS(2,2'-azinbis-(3-ethyl-benzothiazoline-6-sulfonic acid) 라디칼을 이용한 항산화력 측정은 ABTS cation decolourisation assy 방법에 의하여 시행하였다.

7.4mM의 ABTS와 2.6mM의 과황산칼륨(potassium persulfate)을 혼합하여 실온인 암소에서 약 15시간 방치하여 ABTS

를 형성시킨 후에 414nm에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 에탄올(99.5%)로 희석하였다. 희석한 용액 3mL에 실시예 2 및 3에서 제조한 농도별로 준비한 백리향 추출물 150μL를 첨가하여 10초간 강하게 볼텍스(voltex)하고 실온에서 90분간 방치한 다음 414nm에서 흡광도를 측정하였다.

표준물질로 트롤록스(trolox)를 사용하였으며, 상기에서 사용한 백리향 추출물 시료와 동일한 농도로 조제하여 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여 시료 1g 중의 트롤록스 당량(trolox equivalent, mM trolosx eq./mg extract)으로 나타내었다.

본 발명의 백리향 추출물에 대한 결과는 표 3에 나타낸 바와 같다.

하기 표 3에서 알 수 있듯이, 본 발명의 백리향 추출물의 ABRS 라디칼 소거능이 대조군인 BHT(TEAC value, 1.461±0.02)와 유사한 것으로 나타났다. 한편, 실시예 2에 의한 백리향 추출물(TEAC value, 1.108±0.03)의 ABTS 라디칼 소거능이 실시예 3에 의한 백리향 추출물(TEAC value, 0.741±0.04)보다 높은 것으로 나타났다.

실험예 6. FRAP 분석을 이용한 항산화 효과 확인

본 발명 백리향 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, FRAP 분석법(ferric reducing antioxidant power assay)을 이용하였다. FRAP의 측정은 Benzie와 Strain의 방법(Benzie IFF & Strain JJ, Analytical Biochemistry, 239, 70-76, 1996)으로 하였다.

구체적으로, 300mM 아세테이트 완충용액(acetate buffer, pH 3.6), 40mM 염산(HCl)에 용해한 10mM TPTZ 및 20mM FeCl₃ ? 6H₂O를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하여 FRAP 시약을 제조하였다.

실시예 2 및 3에 의해 제조한 백리향 추출물 시료량이 1mg ~ 5mg이 되도록 희석한 시료액 0.15mL과 3mL의 FRAP 시약을 혼합하고, 37℃에서 5분간 반응시킨 후 593nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 FeSO₄?7H₂O를 표준물질로 하여 시료 1mg 중에 들어있는 FeSO₄ 양(mM FeSO₄ eq./mg extract)으로 표시하였다.

그 결과는 표 3에 나타난 바와 같이, 본 발명의 실시예 2(2.903±0.01) 및 3(1.843± 0.26)에 의한 백리향 추출물은 대조군인 BHT(1.284±0.16)보다 현저히 높은 FRAP 항산화 효과를 보였다.

Extract	TEAC (mM Trolox eq./mg extract)	FRAP (mM FeSO4 eq./mg extract)
Water	1.108 ± 0.03	2.903 ± 0.01
70% EtOH	0.741 ± 0.04	1.843 ± 0.26
BHT	1.461 ± 0.02	1.284 ± 0.16

실험예 7. 환원력 분석을 이용한 항산화 효과 확인

본 발명 백리향 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 환원력 분석법(Reducing power assay)을 이용하였다. 환원력은 Chung 등의 방법(Chung YC, Chen SJ, Hsu CK, Chang CT, Chou ST, Food Chemistry, 91, 419-424, 2005)에 의해 측정하였다.

구체적으로, 실시예 2 및 3에 의해 제조한 농도별로 준비한 백리향 추출물(0.1, 0.5, 1mg/mL) 250uL에 0.2M 포스페이트 완충액(phosphate buffer, pH 6.6) 250uL, 1% 포타슘 페리시아나이드(potassium ferricyanide(K₃Fe(CN)₆)) 250uL를 각각 혼합하여 50℃에서 20분 동안 반응시킨 후 1% 트리클로로아세트 산(trichloroacetic acid(CCl₃COOH, w/v))을 가하여 반응을 중지시켰다.

위 반응액을 13,000rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액 500ul에 증류수 500uL를 혼합하고, 0.1% 페릭 클로라이드(ferric chloride(FeCl₃?6H₂O)) 100uL를 가하여 반응액의 흡광도 값을 700nm에서 측정하였다.

또한, BHT의 경우도 상기 실험방법과 동일한 조건에서 환원력을 측정하였다.

그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 백리향 추출물은 농도 의존적으로 환원력을 보였다. 실시예 2에 의한 백리향 추출물의 흡광도는 0.1mg/mL 농도에서 0.248(±0.076), 0.5mg/mL농도에서 1.213(±0.040), 1mg/mL 농도에서 2.153(±0.002)를 나타내었고, 실시예 3에 의한 백리향 추출물의 흡광도는 0.1mg/mL 농도에서 0.063(±0.01), 0.5mg/mL 농도에서 0.83(±0.024), 1mg/mL 농도에서 1.553(±0.02)를 나타내었다.

따라서 본 발명의 실시예 2 및 3에 의한 백리향 추출물의 농도가 1mg/mL인 경우 환원력이 2.153~1.553에 해당하므로, BHT의 농도가 0.1~1mg/mL인 경우(0.939~0.025)보다 현저히 높은 것으로 나타났다.

실험예 8. FTC 분석을 이용한 항산화 효과의 확인

본 발명에 따른 백리향 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, FTC 방법(Ferric thiocyanate method, FTC)을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다.

구체적으로, 실시예 2 및 3에 의해 제조한 농도별로 준비한 백리향 추출물 (0.1, 0.5, 1mg/mL) 4mL에 2.51% 리놀레익산 4.1mL, 50mM 인산 완충용액(pH 7.0) 8mL, 증류수 3.9mL를 첨가하여 용액을 잘 혼합한 후 40℃ 어두운 곳에서 항온 처리하여 과산화를 유도하였다. 이 혼합용액 0.1mL, 75% 에탄올(ethanol) 9.7mL, 30% 암모늄 티오시안산염(ammoninum thiocyanate) 0.1mL를 순서대로 첨가한 후 잘 섞은 후 20mM 염화 제일철(ferrous chloride, 3.5% HCl에 녹인 것)를 0.1mL 첨가하여 잘 섞이도록 한 후 정확히 3분 후에 UV-VIS 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 도 2(A)에 나타낸 바와 같이, 백리향 추출물이 0.1~1mg/mL 사이의 농도에서 농도 의존적으로 항산화 활성을 보였다.

1mg/mL의 농도에서 백리향 추출물은 동일한 농도의 비타민 E 및 비타민 C 보다 현저히 우수한 항산화 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 이때, 백리향 추출물이 과산화를 억제하는 비율은 실시예 2에 의한 백리향 추출물은 95.02(±0.80)%, 실시예 3에 의한 백리향 추출물은 92.14(±0.35)%인 것으로 나타났다. 이때 비타민 E와 비타민 C 각각 78.19(±0.68)%, 26.21(±0.28)%로 나타났다.

실험예 9. TBA 분석을 이용한 항산화 효과 확인

본 발명에 따른 백리향 추출물의 항산화 효과를 확인하기 위하여, 티오바비트루산 방법(Thiobarbituric acid method, TBA)을 이용하여 항산화 활성을 측정하였다. TBA 방법은 지방의 산패도를 측정하는 방법으로서, 지방(유지)은 산소를 만나거나 가열을 통하여 산화에 의한 알데하이드가 생성되는데 TBA가(value)는 이러한 알데하이드 중 말론알데하이드가 TBA 시약에 반응하여 적색을 나타내는 원리를 이용하여 하는 분석방법이다.

구체적으로, 실시예 2 및 3에 의해 제조한 농도별로 준비한 백리향 추출물 (0.1, 0.5, 1mg/mL) 4mL에 2.51% 리놀레익산 4.1mL, 50mM 인산 완충용액(pH 7.0) 8mL, 증류수 3.9mL를 첨가하여 용액을 잘 혼합한 후 40℃ 어두운 곳에서 항온 처리하여 일정한 간격으로 측정하였다. 먼저 각 시료용액 1mL에 20% 트리클로로아세트산(trichlorocaetic acid, TCA) 2mL, 0.67% 2-thiobarbituric acid(TCA) 2mL를 가하여 혼합한 후 열탕조에서 10분간 가열처리하고 흐르는 물에 냉각시켰다. 그 후 5℃ 3,000rpm에서 20분간 원심분리하고 그 상층액을 532nm에서 측정하여 TBA가를 측정하였다.

그 결과, 도 2(B)에 나타난 바와 같이 실시예 2 및 3에 의한 백리향 추출물은 1mg/mL의 농도에서 동일한 농도의 비타민 C 및 비타민 E보다 리놀레익산의 과산화를 억제하는 효과가 현저히 우수한 것으로 나타났다.

이때, 백리향 추출물이 지질과산화를 억제하는 비율은 실시예 2에 의한 백리향 추출물은 88.17(±0.50)%, 실시예 3에 의한 백리향 추출물은 86.77(±0.41)%인 것으로 나타났다. 이때 비타민 E와 비타민 C 각각 72.96(±0.36)%, 15.78(±0.62)%로 나타났다.

실험예 10. 하이드록실 라디칼에 의해 유도된 손상으로부터의 DNA 보호 효과 측정 실험

본 발명에 따른 백리향 추출물의 자유 라디칼로부터의 DNA 보호 효과를 알아보기 위해 플라스미드 DNA를 이용한 전기영동(electrophoresis)을 실시하여 하이드록실 라디칼에 의해 유도된 충격으로부터의 DNA 보호 효과를 측정하였다.

정상 플라스미드 DNA를 전기영동하면 초나선 DNA(supercoiled DNA), 선형 DNA(linear DNA), 고리열림 DNA(open circular DNA)로 나뉘어지며, 초나선 DNA가 가장 많은 양을 차지한다. 여기에 펜톤(Fenton) 반응을 가하여 DNA에 손상을 가하면 DNA는 손실을 입고 초나선 DNA가 고리열림 DNA로 변화하므로, 초나선 DNA양의 감소로 DNA 손실여부를 알 수 있게 된다. 본 실험예는 하이드록실 라디칼 소거 효과가 뛰어났던 실시예 3에 의한 백리향 추출물을 가지고 DNA 보호 효과를 측정하였으며, 실험 방법은 하기와 같다.

즉, 0.5 ㎍의 pBR 322 DNA, 3㎕의 탈이온수, 3㎕의 0.04mM FeSO₄, 2 ㎕의 농도별 백리향 추출물 및 4 ㎕의 30% H₂O₂를 혼합하여 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 반응액을 EtBr로 염색된 0.8% 아가로스 겔 전기영동을 실시하여 밴드를 관찰하였다.

그 결과는 도 3에 나타낸 바와 같이, 정상 플라스미드 DNA(레인 1)와 비교하여 30% H₂O₂를 처리한 대조군은 펜톤 반응 하에서 초나선 DNA가 완전히 고리열림 DNA로 전환된 것을 볼 수 있었다(레인 2). 본 발명의 백리향 추출물은 0.1, 0.5, 1 ㎎/mL의 농도에서 농도 의존적으로 DNA 보호 효과를 나타내었다.(레인 3,4,5)

상기에서 실시한 실험에 의한 분석결과의 데이터(data)는 3번을 반복한 측정값들의 평균치± 표준편차(mean±standard deviation)로 나타내었다. 각 샘플들간의 유의성은 student's t-tests(SPSS for Windows, Version 15)를 이용하여 p < 0.05 수준에서 변량분석(analysis of variance, ANOVA)에 의해 분석하였다.

그 결과, 본 발명에 따른 백리향 추출물은 DPPH 및 알킬 라디칼 소거능 측정에서 비타민 C와 유사하거나 더 높은 항산화 효과를 보였고, FRAP 분석과 환원력 분석에서 BHT보다 현저히 우수한 항산화 효과가 있는 것으로 확인되었다.

특히, FTC, TBA 방법에 의하면 백리향 추출물은 지질 과산화 억제와 관련하여, 비타민 C, 비타민 E보다 현저하게 우수한 효과를 나타내었다.

또한, 실시예 2에 의한 백리향 추출물은 하이드록실 라디칼에 의해 손상된 DNA를 보호하는 효과도 있었다.

상기와 같은 결과를 고려해볼 때 백리향 추출물에 포함된 폴리페놀과 플라보노이드가 항산화 효과에 기여하는 것으로 판단되고, 백리향 추출물은 강력한 천연 항산화 물질인 것으로 볼 수 있다.

따라서 본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 노화 및 각종 질환의 억제 또는 치료에 효과적이다. 또한 본 발명의 백리향 추출물은 천연물에서 유래한 물질로서 독성 및 부작용이 없이 안전하게 사용될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

1. 항산화 물질로 폴리페놀 및 플라보노이드를 함유하는 백리향 추출물.
   
2. 상기 제 1 항의 백리향 추출물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 항산화 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 항산화 조성물은 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 질환의 치료 및 예방을 위하여 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 항산화 조성물은 약학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 더 포함하여 활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 질환의 치료 및 예방을 위한 의약품으로 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
   활성산소에 의해 생성되는 산화물들에 기인하는 질환은 노화, 만성알콜중독, 죽상동맥경화증, 암, 관상심장질환, 백내장, 당뇨병, 다운증후군, 간염, 허혈이나 재관류성 손상, 류마티스성 관절염, 관절염, 신부전증, 염증반응, 각종 퇴행성 신경질환, 뇌졸중 발작 및 심근경색 등에서 선택되는 1종 이상의 질환을 치료 및 예방하기 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
6. 제 2 항 또는 제 3항에 있어서,
   상기 항산화 조성물은 식품학적으로 허용되는 추출물, 영양성분 또는 식품보조첨가제 중 하나 이상을 더 포함하여 건강기능식품으로 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
7. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서,
   상기 항산화 조성물은 화장료, 식품첨가제로 사용되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   

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