IT202000026236A1 - Composizione oftalmica - Google Patents

Description

COMPOSIZIONE OFTALMICA

DESCRIZIONE

Campo dell'invenzione

La presente invenzione si riferisce a timolo o estratto di pianta appartenente al genere Thymus cos? come ad associazioni, composizioni, formulazioni e kit comprendenti timolo o almeno un estratto di pianta appartenente al genere Thymus e anche al loro uso nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie e/o disturbi oculari.

Stato dell?arte

Il timo (ad esempio, Thymus vulgaris L., Lamiaceae; Hossain, AL-Raqmi, AL-Mijizy, Weli e Al-Riyami, 2013), un arbusto originario delle zone del Mediterraneo, ? una pianta medicinale tradizionalmente impiegata in cucina come erba culinaria e in farmacologia nella cura di diverse patologie quali, ad esempio, affezioni dell?apparato respiratorio (raffreddore, bronchite acuta, asma ecc.), disordini gastro-intestinali (es. ulcere), patologie del sistema cardiocircolatorio (es. ipertensione), patologie a carico del sistema nervoso (disturbi dell?ansia, depressione) in virt? delle sue propriet? sedative, ma anche come agente antisettico, antielmintico e antifungino (vedere, ad esempio, Al-Bayati, F. A. (2008). Synergistic antibacterial activity between Thymus vulgaris and Pimpinella anisum essential oils and methanol extracts. Journal of Ethnopharmacology, 116(3), 403?406; Giordani, R., Hadef, Y., & Kaloustian, J. (2008). Compositions and antifun- gal activities of essential oils of some Algerian aromatic plants. Fitoterapia, 79, 199?203; e Fani, M., & Kohanteb, J. (2017). In vitro antimicrobial activity of Thymus vulgaris essential oil against major oral pathogens. Journal of Evidence- Based Complementary and Alternative Medicine, 22(4), 660?666.).

Dalla letteratura ? anche noto che il timo, in particolare il suo principale principio attivo ossia il timolo, presenta attivit? antimicrobiche, antiparassitarie, antiossidanti, anticarcinogenesi, antinfiammatorie e antispasmodiche, nonch? un potenziale come potenziatore della crescita e immunomodulatore e che pu? incrementare la capacit? di concentrazione e la memoria. Altri studi hanno menzionato l?uso di timo in campo cosmetico e/o terapeutico nel trattamento o prevenzione di condizioni della pelle come ferite, cicatrici, pelle grassa, acne, caduta di capelli ecc., dolori mestruali e problemi menopausali, ritenzione idrica, nausea e affaticamento. Gli studi riportano anche che gli oli essenziali di timo sono tra i principali utilizzati nell'industria alimentare e nei cosmetici come antiossidanti e conservanti (Sharifi-Rad, Salehi, Schnitzler, et al., 2017; Zarzuelo & Crespo, 2002).

Il timo contiene alte concentrazioni di fenoli monoterpenici, incluso il timolo (2-isopropil-5-metilfenolo o 5-metil-2-(1-isopropil)fenolo o iso-propil-metacresolo; C10H14O; 50-64%), il carvacrolo (iso-propil-orto-cresolo; 0,4-20,6%), il p-cimene (9,1?22,2%), le cui strutture sono riportate nel seguito, e altri monoterpeni come 1,8-cineolo (0,2?14,2%), linalolo (2,2?4,8%), borneolo (0,6? 7,5%), ?-pinene (0,9 ?6,6%) e canfora (0?7,3%) (vedere, ad esempio, Amiri, H. (2012) Essential oils composition and antioxidant properties of three Thymus species. Evidence-based Complementary and Alternative Medicine, 2012 (728065), 1?8.; Burt, 2004; Nickavar, Mojab e Dolat-Abadi, 2005). Il timolo, il principale principio attivo del timo, ? un derivato monoterpenico naturale del cimene e il carvacrolo ? il suo isomero.

cimene timolo carvacrolo

Per quanto sopra detto, risulta evidente che l?uso di estratto di timo o timolo in terapia ? particolarmente vantaggioso sia perch? questi presentano numerose propriet? terapeutiche e benefiche sia perch? sono caratterizzati, come la maggior parte dei principi attivi di origine vegetale, da un ottimale profilo di sicurezza, ossia risultano privi di effetti collaterali severi.

Tuttavia, come molti altri estratti e principi attivi di origine vegetale, specialmente quelli fenolici, anche l?estratto di timo e il timolo sono idrofili, pertanto, nonostante le loro marcate propriet? riscontrate in vitro, in vivo mostrano una attivit? pi? bassa o addirittura insignificante. A causa della loro scarsa liposolubilit?, infatti, sono incapaci di attraversare le membrane biologiche, soprattutto quella intestinale e quella corneale, e ci? risulta in scarso assorbimento e quindi scarsa biodisponibilit? dei principi attivi, soprattutto a seguito di somministrazione orale o topica.

Inoltre, siccome il fitocomplesso (ossia l?insieme dei componenti chimici di una pianta, risultante dalla naturale combinazione del principio attivo con altre sostanze, terapeuticamente inattive (per es., cellulosa) o con attivit? diversa, ma che globalmente conferiscono alla pianta le specifiche propriet? terapeutiche per cui viene utilizzata) sembra essere importante per la biodisponibilit? dei principi attivi principali, il problema dello scarso assorbimento viene esacerbato quando il timolo viene somministrato di per s?.

In letteratura ? noto che la biodisponibilit? pu? essere incrementata con l?uso di sistemi di veicolazione (drug delivery systems) quali liposomi, microsfere, nanoparticelle, transferosomi, etosomi ecc., che possono incrementare la velocit? di rilascio cos? come la capacit? di attraversare le biomembrane ricche in lipidi. Tuttavia, detti sistemi presentano diversi svantaggi, ad esempio, sono spesso poco stabili e soggetti a degradazione, e richiedono procedimenti di preparazione complessi e costosi

Pertanto, siccome l?efficacia di qualunque prodotto vegetale (o medicamento) dipende dalla capacit? di veicolare una dose efficacie di principio attivo e visto che i sistemi di drug delivery attualmente disponibili sono spesso costosi e/o di difficile implementazione, ? ancora sentita la necessit? di mettere a punto soluzioni alternative per favorire la veicolazione, specialmente a livello corneale, di principi attivi di origine vegetale e/o estratti vegetali, quali timolo o estratti di timo, che superino gli inconvenienti dei sistemi attualmente disponibili. SOMMARIO DELL'INVENZIONE

Studi effettuati dagli inventori su un modello sperimentale in vitro e in vivo hanno sorprendentemente dimostrato che la somministrazione topica di timolo o estratto di timo sulla superficie oculare pu? risultare anche utile nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie oculari quali ad esempio glaucoma, cataratta, cheratocono, secchezza oculare o occhio secco, allergia congiuntivale, congiuntivite, blefarite, cheratite, cheratite attinica, orzaiolo, danni da esposizione ai raggi UV, maculopatia, uveite, meibomite, trabeculite, ulcere corneali, ad esempio ulcere corneali da infezione o traumatiche, neurite ottica ecc.

Pertanto, la presente invenzione si riferisce a timolo e/o estratto di timo per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie oculari, in particolari quelle sopra dette.

Tuttavia, come sopra anticipato, il principale limite dell?estratto di timo o del timolo per uso topico ? la sua scarsa abilit? di superare la cornea, che risulta sostanzialmente impermeabile alla maggior parte dei principi attivi a causa della presenza di gap-junctions che connettono le cellule dell?epitelio corneale, congiuntiva, sclera e trabecolato, e quindi di raggiungere il sito di interesse in dosi clinicamente rilevanti.

Dopo estensiva sperimentazione, gli inventori hanno trovato che l?associazione di almeno un estratto di pianta appartenente al genere Thymus o timolo, con tocoferolo o suoi derivati, ad esempio sali e/o esteri di tocoferolo, pu? incrementare la biodisponibilit? oculare di timolo o estratto di timo oltre la cornea. Detta associazione garantirebbe dunque il passaggio di principio attivo timolo nel segmento posteriore dell?occhio (camera vitrea) che cos? pu? raggiungere anche la retina e il nervo ottico, fornendo una valida soluzione al problema clinico delle patologie oculari.

Pertanto, la presente invenzione si riferisce a tocoferolo per l?uso come adiuvante e/o potenziatore della biodisponibilit? corneale di timolo in una terapia a base di estratto di almeno una pianta appartenente al genere Thymus oppure timolo. In altre parole, l?invenzione si riferisce all?uso di tocoferolo per incrementare la biodisponibilit? corneale del principio attivo timolo o di un estratto di pianta appartenente al genere Thymus comprendente detto principio attivo.

La presente invenzione si riferisce anche all?associazione di almeno un estratto di pianta appartenente al genere Thymus, oppure timolo, e tocoferolo o suoi derivati.

La presente invenzione si riferisce anche a composizioni, preferibilmente per uso topico, pi? preferibilmente sotto forma di collirio, comprendenti l?associazione di almeno un estratto di pianta appartenente al genere Thymus oppure timolo, tocoferolo o suoi derivati e uno o pi? veicolanti adatti cos? come a kit di parti che comprendono i suddetti composti separati e indipendentemente formulati in adatta forma di dosaggio per somministrazione sequenziale o contemporanea dei diversi composti.

Inoltre, la presente invenzione si riferisce all?uso dell?associazione, delle composizioni e dei kit sopramenzionati nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie oculari quali, ad esempio, glaucoma, cataratta, cheratocono, secchezza oculare o occhio secco, allergia congiuntivale, congiuntivite, blefarite, cheratite, cheratite attinica, orzaiolo, danni da esposizione ai raggi UV, maculopatia, uveite, meibomite, trabeculite, ulcere corneali, ad esempio ulcere corneali da infezione o traumatiche e neurite ottica e/o all?uso non terapeutico o cosmetico dell?associazione, delle composizioni e dei kit sopramenzionati, ad esempio, come lubrificante oculare, lacrime artificiali, liquido per lenti a contatto, liquido per pulizia e/o disinfezione delle palpebre, ad esempio in forma di spray o di bende medicate, liquido per detersione e/o disinfezione di bocca e narici.

Grazie anche alla sinergia dei suoi componenti, l?associazione oggetto della presente invenzione permette di ottenere contemporaneamente la riduzione di diversi sintomi associati alle patologie oculari, quali una riduzione della pressione intraoculare, dell?opacit? della lente, dell?iperemia congiuntivale, della secchezza oculare, della sensazione di corpo estraneo e/o di dolore, di fotofobia, di occhio rosso, della lacrimazione, della secrezione e della visione offuscata, ma soprattutto di ridurre la posologia e il dosaggio giornaliero, con conseguente aumento della compliance da parte del paziente.

Altri vantaggi e caratteristiche della presente invenzione risulteranno evidenti dalla seguente descrizione dettagliata.

Glossario

I termini impiegati nella presente descrizione sono come generalmente compresi dall?esperto della tecnica, salvo ove diversamente indicato.

Con il termine ?estratto?, nel contesto della presente descrizione, si intende qualsiasi prodotto riconducibile ad una droga vegetale compresi tutti i prodotti derivati da trattamenti meccanici (polverizzazione, triturazione, miscelazione e/o altri metodi) o da trattamenti estrattivi (estrazione con solvente, distillazione, macerazione e/o altri metodi specifici) operati su una droga, incluse le tinture madri e gli olii essenziali.

Nel contesto della presente descrizione, il termine ?quantit? efficace? significa quantit? di composto attivo, di associazione o di composizione comprendente i composti dell?invenzione, sufficientemente alta da procurare i benefici desiderati e allo stesso tempo abbastanza bassa da non comportare seri effetti collaterali.

Con la dicitura ?potenziatore della biodisponibilit??, ?potenziatore dell?assorbimento? o ?biopotenziatore?, nel contesto della presente descrizione sono intesi molecole, sostanze, composti o agenti che di per s? possono avere oppure anche non avere una propria attivit? farmacologica ma, quando usati in combinazione con un principio attivo, sono in grado di incrementare l?attivit? di quest?ultimo in diversi modi, ad esempio, incrementandone l?assorbimento attraverso le membrane biologiche, potenziando il principio attivo per interazione conformazionale, agendo come recettore per il principio attivo o rendendo le cellule target pi? ricettive al principio attivo. Un ?biopotenziatore? ? quindi una molecola, sostanza, composto o agente in grado di potenziare la biodisponibilit? e l?efficacia di un particolare principio attivo con cui ? combinato, esercitando, oppure anche senza esercitare, un?attivit? farmacologica di per s?. Possono essere anche essere eccipienti funzionali inclusi nella formulazione per incrementare l?assorbimento di una molecola farmacologicamente attiva. Un biopotenziatore pu? essere quindi impiegato come adiuvante una terapia a base di un determinato principio attivo che beneficia, ad esempio in termini di velocit? ed entit? di assorbimento, biodisponibilit? e/o efficacia, della presenza di detto biopotenziatore. Nel contesto della presente descrizione, con le diciture potenziatore della biodisponibilit? o biopotenziatore ? fatto particolare riferimento a tocoferolo o suoi derivati.

Con le diciture ?tocoferolo o suoi derivati?, ?derivati del tocoferolo? o ?tocoferolo derivati? nel contesto della presente descrizione si intendono derivati o analoghi della vitamina E, in particolare sali ed esteri farmaceuticamente o fisiologicamente accettabili di tocoferolo cos? come prodotti di sostituzione di questo.

Con la dicitura ?drug-extract ratio? oppure con l?abbreviazione ?DER?, nel contesto della presente descrizione, si intende il rapporto tra la quantit? di droga utilizzata e quella di estratto ottenuto. In altre parole, il DER pu? anche essere definito come ?forza estrattiva? perch? rappresenta il rapporto tra il peso del materiale vegetale secco di partenza e il peso (estratto secco) o volume (estratto liquido) della preparazione finale. Il DER pu? anche essere impiegato per il calcolo della dose equivalente. Ad esempio, nel caso in cui la dose giornaliera raccomandata di una sostanza vegetale sia pari a ?1,5 g di sostanza vegetale secca o equivalente? e si disponga di un estratto liquido DER 1:3 della sostanza medesima, bisogner? somministrare 4,5 mL di estratto liquido (1,5 g x 3 = 4,5).

Con il termine ?comprendente?, nel contesto della presente descrizione, si intende anche ?che consiste essenzialmente di? o ?che consiste di?.

Nel contesto della presente descrizione, ?circa? si riferisce all?errore sperimentale che pu? occorrere durante le misurazioni convenzionali. Pi? in particolare quando si riferisce ad un valore indica ? 5% del valore indicato e quando riferito ad un intervallo ? 5% degli estremi di questo.

DESCRIZIONE DETTAGLIATA DELL?INVENZIONE

Come sopra menzionato, la presente invenzione si riferisce ad una associazione che comprende, o che consiste di, timolo o almeno un estratto di pianta appartenente al genere Thymus con tocoferolo o suoi derivati, ove per derivati di tocoferolo si intendono anche sali ed esteri farmaceuticamente e/o fisiologicamente accettabili di tocoferolo.

Con la dicitura ?almeno un estratto di pianta appartenente al genere Thymus? nel contesto della presente descrizione si intende che la composizione pu? comprendere almeno uno o pi? estratti di pianta appartenente al genere Thymus, ossia almeno uno o pi? estratti di timo. L?estratto o gli estratti possono essere scelti, ad esempio, tra estratto di Thymus vulgaris L., estratto di Thymus zygis, estratto di Thymus striatus, estratto di Thymus spinulosus, estratto di Thymus richardii, estratto di Thymus catharinae, estratto di Thymus herbabarona, estratto di Thymus odoratissimus, estratto di Thymus oenipontanus, estratto di Thymus kosteletzkyanus, estratto di Thymus alpestris, estratto di Thymus pulegioides, estratto di Thymus longicaulis, estratto di Thymus praecox, estratto di Thymus thracicus e miscele di questi, ed ? preferibilmente estratto di Thymus vulgaris L.

L?estratto potr? essere un estratto ottenuto per lavorazione di una o pi? parti della pianta, ad esempio parti aeree della pianta, secondo qualunque delle procedure note nello stato della tecnica. Estratti adatti ai fini della presente descrizione possono essere estratti liquidi (acquosi, alcolici o idroalcolici) o secchi, tinture madri, olii essenziali o miscele di questi come, ad esempio, quelli menzionati nella monografia della Agenzia Europea dei Medicinali (EMA) intitolata Community herbal monograph on Thymus vulgaris L. and Thymus zygis L., herba (https://www.ema.europa.eu/en/documents/herbal-monograph/finalcommunity-herbal-monograph-thymus-vulgaris-l-thymus-zygis-l-herba_en.pdf), solo per citarne alcuni:

- estratti liquidi quali, ad esempio, a. estratto liquido (DER 1:1) in etanolo, preferibilmente al 24% (V/V); b. estratto liquido (DER 1:1) in miscela di glicerolo ed etanolo, preferibilmente glicerolo all?85% (m/m) ed etanolo al 25% (m/m), 0,1:2; c. estratto liquido (DER 1:2-2.5) in miscela di soluzione di ammonio, glicerolo, etanolo e acqua, preferibilmente soluzione di ammonio al 10% (m/m) : glicerolo all?85% (m/m) : etanolo al 90% (V/V) : acqua (1:20:70:109) oppure d. estratto liquido (DER 1:4,5) in miscela di soluzione di ammonio al 10% (m/m) : glicerolo al 85% (m/m) : etanolo al 96% (V/V) : acqua (1.2:25:112:113); e. estratto liquido di parti aeree fresche della pianta (DER 1:1.5-2.4) in acqua;

- tinture quali, ad esempio, f. tintura (1:10 oppure 1:5) in etanolo preferibilmente al 70% (V/V);

- estratti secchi quali, ad esempio, g. estratto secco (DER 6-10:1) in etanolo preferibilmente al 70% (v/v); h. estratto secco (DER 1,6-2,4:1) in etanolo preferibilmente al 96% (V/V); i. estratto secco (DER 7-13:1) in acqua; l. estratto secco (DER 1:4) in acqua e

- olii essenziali.

Secondo una forma di realizzazione, l?estratto pu? essere un olio essenziale di timo preparato per estrazione di parti aeree della pianta, in particolare foglie, secche oppure fresche in una miscela etanolo/acqua, preferibilmente ad una temperatura di 22?C. Secondo una forma di realizzazione, l?estratto pu? essere un estratto secco di timo, in particolare di Thymus Vulgaris L., ottenuto per estrazione acquosa (DER 1:4) di parti aeree della pianta, in particolare sommit?, secche oppure fresche, e successiva essiccazione.

Pertanto, la presente invenzione si riferisce anche ad una associazione comprendente estratto di almeno una pianta appartenente al genere Thymus, oppure timolo, e tocoferolo, in cui detto estratto di almeno una pianta appartenente al genere Thymus ? ottenibile per estrazione di parti aeree della pianta, in particolare foglie, secche oppure fresche in una miscela etanolo/acqua, preferibilmente ad una temperatura di 22?C oppure anche per estrazione acquosa (preferibilmente DER 1:4) di parti aeree della pianta, in particolare sommit?, secche oppure fresche, e successiva essiccazione. Come risulter? evidente ad una persona con conoscenze generali nel settore, altre procedure di estrazione note nell?arte sono comunque adatte.

Inoltre, anche se ai fini della presente invenzione risultano particolarmente adatti estratti di timo preparati secondo i metodi su descritti, anche estratti di timo comunemente disponibili in commercio sono comunque adatti, ad esempio, l?olio essenziale di timo commercializzato da ACEF, l?estratto liquido commercializzato con il nome di Thyme herb (tops) fluid extract (22?) (nVh Italia) o l?estratto secco commercializzato con il nome di Thyme tops dry extract D/E 4:1 (nVH Italia).

L?estratto di timo, in particolare l?olio essenziale di timo, sar? preferibilmente titolato in timolo (ossia comprende una concentrazione di 5-metil-2-(1-isopropil)fenolo) tra il 30 e il 60 % p/p, preferibilmente tra il 35 e il 45 % p/p, pi? preferibilmente al 40 - 42,5 % p/p; e/o titolato in, ossia comprendente una concentrazione di, p-cimene tra il 30 e il 60 % p/p, preferibilmente tra il 35 e il 45 % p/p, pi? preferibilmente al 40 - 42,5 % p/p; e/o titolato in alfa-pinene tra il 5 e il 10 % p/p, preferibilmente tra il 6 e il 7 % p/p; e/o titolato in canfene tra l?1 e il 5 % p/p, preferibilmente tra il 2 e il 3 % p/p e/o titolato in terpinolene tra l?1 e il 5 % p/p, preferibilmente tra il 2 e il 3 % p/p; e/o titolato in linalolo tra l?1 e il 5 % p/p, preferibilmente tra il 2 e il 2,5 % p/p; e/o titolato in beta-pinene tra lo 0 e il 2 % p/p, preferibilmente tra lo 0,5 e lo 0,6 % p/p.

Resta anche inteso che se, per la preparazione dell?estratto di timo, sono impiegate non una bens? pi? specie (ad esempio due, tre, quattro, cinque, sei, sette, otto o pi? specie) di pianta appartenente al genere Thymus in miscela tra loro sar? sufficiente che i titoli, in particolare il titolo in timolo, sia soddisfatto per la miscela totale.

Pertanto, la presente invenzione si riferisce anche ad una associazione comprendente estratto di almeno una pianta appartenente al genere Thymus, oppure timolo, e tocoferolo, in cui detto estratto di almeno una pianta appartenente al genere Thymus ? titolato in timolo tra il 30 e il 60 % p/p, preferibilmente tra il 35 e il 45 % p/p, pi? preferibilmente al 40 - 42,5 % p/p.

Nelle forme di realizzazione che prevendono l?impiego di timolo, il timolo pu? essere ottenuto mediante procedimenti di sintesi noti nell?arte, ad esempio per reazione in fase gassosa tra meta cresolo e propene:

oppure per estrazione da una pianta appartenente al genere Thymus, in particolare Thymus vulgaris L., secondo uno qualunque dei convenzionali metodi noti nell?arte, ad esempio uno dei metodi di estrazione descritti sopra e successiva purificazione.

L?estratto di timo, in particolare di Thymus vulgaris L., potr? essere somministrato ad esempio in quantit? compresa tra 0,00005 ?g/mL e 600 ?g/mL, in particolare tra 0,0005 e 500 ?g/mL, preferibilmente in 1-2 somministrazioni separate (ad esempio 0,1 ?g x 2 volte al giorno, oppure 0,2 ?g 1 volta al giorno).

Per ?tocoferolo? nel contesto della presente descrizione si intende tocoferolo o un suo derivato ad esempio un suo sale o estere farmaceuticamente e/o fisiologicamente accettabile.

Tocoferolo derivati particolarmente utili ai fini della presente invenzione sono esteri del tocoferolo con un acido carbossilico quali, ad esempio, tocoferolo succinato, tocoferolo acetato, tocoferolo linoleato e tocoferolo fosfato, ma anche esteri poliossialchilen glicolici di esteri del tocoferolo come, ad esempio, l?alfa tocoferil poliossietilene glicole (1000) succinato (nel seguito anche VE-TPGS). A titolo esemplificativo, ma in alcun modo limitativo, tocoferolo derivati utili ai fini della presente invenzione possono essere scelti tra: esteri poliossietilen glicolici di esteri del tocoferolo con un acido carbossilico, preferibilmente in cui detto estere del tocoferolo con un acido carbossilico ? scelto tra tocoferolo succinato, tocoferolo acetato, tocoferolo linoleato e tocoferolo fosfato e/o preferibilmente in cui la funzione poliossietilenglicolica ha un peso molecolare compreso tra circa 600 Da e circa 6000 Da, preferibilmente compreso tra circa 600 Da e circa 1500 Da. Secondo una forma di realizzazione, l?estere preferito ? l?alfa tocoferil poliossietilene glicole (1000) succinato, ossia un estere poliossietilenglicolico di alfa-tocoferil succinato in cui la frazione poliossietileglicolica della molecola ha un peso molecolare medio di circa 1000 Da.

Pertanto, la presente invenzione si riferisce ad una associazione comprendente estratto di almeno una pianta appartenente al genere Thymus, come sopra definito, oppure timolo, con tocoferolo, in cui detto tocoferolo ? un estere di alfa-tocoferolo, preferibilmente scelto tra tocoferolo succinato, tocoferolo acetato, tocoferolo linoleato e tocoferolo fosfato o miscele di questi. La presente invenzione si riferisce anche ad una associazione comprendente estratto di almeno una pianta appartenente al genere Thymus, come sopra definito, oppure timolo, con tocoferolo, in cui detto tocoferolo ? un estere poliossialchilen glicolico di un estere di alfa-tocoferolo con un acido carbossilico, preferibilmente in cui detto estere di alfa-tocoferolo con un acido carbossilico ? scelto tra tocoferolo succinato, tocoferolo acetato, tocoferolo linoleato e tocoferolo fosfato o miscele di questi. La presente invenzione si riferisce anche ad una associazione comprendente estratto di almeno una pianta appartenente al genere Thymus, come sopra definito, oppure timolo, con tocoferolo, in cui detto tocoferolo ? un estere poliossialchilen glicolico di un estere di alfa-tocoferolo con un acido carbossilico, preferibilmente in cui la funzione poliossietilenglicolica ha un peso molecolare compreso tra circa 600 Da e circa 6000 Da, preferibilmente tra circa 600 Da e circa 1500 Da, ed ? preferibilmente d-alfa-tocoferolopolietilenglicole 1000 succinato (VE-TPGS).

VE-TPGS pu? essere preparato secondo uno qualsiasi dei metodi noti nell?arte ad esempio per esterificazione di alfa-tocoferolo succinato con polietilene glicole 1000 o secondo qualsiasi dei metodi descritti nel brevetto U.S. N. 2,680,749 (Cawley et al.) oppure anche facilmente reperito in commercio, ad esempio, VE-TPGS della ditta Isochem (Isodel<?>).

Il tocoferolo, in particolare VE-TPGS, potr? essere somministrato ad esempio in quantit? compresa tra 0,00001 ?g/mL e 600 ?g/mL, in particolare tra 0,0001 e 500 ?g/mL, preferibilmente in 1-2 somministrazioni separate (ad esempio 0,1 ?g x 2 volte al giorno, oppure 0,2 ?g 1 volta al giorno).

In particolare, gli inventori hanno dimostrato che si possono utilizzare con successo quantit? pari a circa 0,001 ? 0,400 ?g al giorno di tocoferolo, preferibilmente VE-TPGS, in combinazione con timolo oppure con estratto di almeno una pianta appartenente al genere Thymus che comprende timolo come qui descritto ottenendo, tra gli altri effetti benefici, anche un significativo incremento della biodisponibilit? di timolo nei soggetti trattati.

Il tecnico del settore potr? adattare la quantit? degli estratti utilizzati e/o dei composti impiegati nella preparazione delle associazioni e/o composizioni da somministrare a seconda delle esigenze. Il medico curante sapr? inoltre identificare il dosaggio ottimale per il soggetto da trattare in base all?et?, al sesso, al peso, allo stato di salute generale e in base anche alla patologia da trattare. Pertanto, il dosaggio dei singoli componenti pu? essere adattato anche nel corso del periodo di assunzione della associazione o composizione dell?invenzione a seconda dei risultati ottenuti nel tempo.

Seppur non sia una caratteristica essenziale dell?invenzione, gli inventori hanno individuato il rapporto ponderale ottimale tra i componenti dell?associazione. Preferibilmente, il rapporto ponderale tra estratto di almeno una pianta appartenente al genere Thymus, oppure timolo, e tocoferolo ? compreso tra 0,001:4 e 0,01:3, ed ? preferibilmente 0,1.

Principi attivi opzionali che possono essere inclusi nella associazione della presente invenzione secondo una qualunque delle forme di realizzazione qui descritte includono, ma non sono limitati a, le forme racemiche ed enantiomeriche, i sali e gli esteri farmaceuticamente e/o fisiologicamente accettabili dei seguenti composti: beta-bloccanti (ad esempio, betaxololo, timololo, e carteololo); alfa-agonisti (ad esempio, apraclonidina); inibitori dell?anaidrasi carbonica; agonisti e antagonisti dopaminergici; farmaci colinergici (ad esempio, pilocarpina e carbacolo); prostaglandine e prostaglandine derivati; ACE inibitori; steroidi (ad esempio glucocord?ticoidi); bloccanti il canale del calcio; antiipertensivi; antiinfiammatori non steroidei (ad esempio, diclofenac, flurbiprofene, ketorolac, indometacina e ketoprofene); antiinfiammatori steroidei (ad esempio fluorometolone, desametasone, prednisolone, tetraidrocortisolo e triamcinolone); antibiotici quali amminoglicosidi (ad esempio, tobramicina); chinoloni (ad esempio, ciprofloxacina e ofloxacina); betalattamici (ad esempio, cefalosporine quali il cefamandolo); antifunginei, come la nafamicina; antivirali, come l?aciclovir e il ganciclovir; agenti anticataratta; antiossidanti (ad esempio, Vitamina A, Vitamina C, selenio, carotenoidi, licopene, coenzima Q-10, acido lipoico e loro miscele); antistaminici; antimetaboliti (ad esempio, il 5-fluorouracile (5-FU) e metotrexato); immunosoppressori, come la ciclosporina e lenflunimide; fattori di crescita quali EGF, FGF, PDGF; vitamine (ad esempio riboflavina 5 fosfato); profarmaci delle classi di farmaci descritti sopra o miscele di questi.

Pertanto, la presente invenzione si riferisce anche ad una associazione comprendente, o costituita da, estratto di almeno una pianta appartenete al genere Thymus, preferibilmente Thymus vulgaris L., oppure timolo, con tocoferolo o un suo derivato, preferibilmente VE-TPGS, e facoltativamente uno o pi? ulteriori principi attivi come sopra definiti, ovvero scelti nel gruppo costituito da: beta-bloccanti; alfa-agonisti; inibitori dell?anaidrasi carbonica; agonisti e antagonisti dopaminergici; farmaci colinergici; prostaglandine; ACE inibitori; steroidi; bloccanti il canale del calcio; antiipertensivi; antiinfiammatori non steroidei; antiinfiammatori steroidei; antibiotici; antifunginei; antivirali; agenti anticataratta; antiossidanti; antistaminici; antimetaboliti; immunosoppressori; fattori di crescita, vitamine o miscele di questi. Secondo una forma di realizzazione preferita, l?associazione comprende, o ? costituita da, estratto di almeno una pianta appartenete al genere Thymus, preferibilmente Thymus vulgaris L., oppure timolo, con tocoferolo o un suo derivato, preferibilmente VE-TPGS, e riboflavina 5 fosfato, quest?ultima particolarmente utile per la sua azione protettrice nei confronti dei raggi UV .

Secondo una forma di realizzazione, l?associazione comprende almeno un estratto di pianta appartenente al genere Thymus, preferibilmente estratto di Thymus vulgaris L., oppure timolo, tocoferolo e uno o pi? principi attivi come sopra definiti quali unici principi attivi nel trattamento e/o nella prevenzione di patologie oculari in particolare glaucoma, cataratta, cheratocono, secchezza oculare o occhio secco, allergia congiuntivale, congiuntivite, blefarite, cheratite, cheratite attinica, orzaiolo, danni da esposizione ai raggi UV, maculopatia, uveite, meibomite, trabeculite, ulcere corneali, ad esempio ulcere corneali da infezione o traumatiche, neurite ottica ecc. In questa forma di realizzazione, l?associazione pu? eventualmente comprendere anche altri principi attivi, a condizione che detti altri principi attivi non siano indicati nel trattamento di patologie oculari.

Secondo un?altra forma di realizzazione, l?associazione comprende almeno un estratto di pianta appartenente al genere Thymus, preferibilmente estratto di Thymus vulgaris L., oppure timolo, e tocoferolo quali unici principi attivi nel trattamento e/o nella prevenzione di patologie oculari. In questa forma di realizzazione, l?associazione pu? eventualmente comprendere anche altri principi attivi, a condizione che detti altri principi attivi non siano indicati nel trattamento di patologie oculari.

La presente invenzione si riferisce anche a composizioni comprendenti l?associazione secondo una qualunque delle forme di realizzazione qui descritte e uno o pi? veicoli e/o eccipienti adatti.

Gli inventori hanno inoltre osservato che la maggiore efficacia della associazione, anche in virt? della maggior sinergia tra i diversi principi attivi, si ha quando nella composizione:

- l?estratto di pianta appartenente al genere Thymus, oppure timolo, ? presente in una concentrazione compresa tra 0,001 e 1 %p/p , preferibilmente 0,01 e 0,1 %p/p, pi? preferibilmente 0,05 %p/p; e

- tocoferolo o suoi derivati sono presenti in una concentrazione compresa tra 0,01 e 3 %p/p, preferibilmente 0,1 e 2, pi? preferibilmente 0,5 %p/p.

Pertanto, la presente invenzione si riferisce anche ad una composizione in cui l?estratto di pianta appartenente al genere Thymus, oppure timolo, ? presente in una concentrazione compresa tra 0,001 e 1 %p/p , preferibilmente 0,01 e 0,1 %p/p, pi? preferibilmente 0,05 %p/p e/o in cui tocoferolo tocoferolo o suoi derivati sono presenti in una concentrazione compresa tra 0,01 e 3 %p/p, preferibilmente 0,1 e 2, pi? preferibilmente 0,5 %p/p.

Veicoli adatti ai fini della presente invenzione sono quelli comunemente conosciuti nella tecnica come adatti alla somministrazione topica, in particolare oculare ad esempio, una soluzione isotonica tamponata a pH 6,7 ? 7,2.

Secondo una forma di realizzazione, la composizione comprende almeno un estratto di pianta appartenente al genere Thymus, preferibilmente estratto di Thymus vulgaris L., oppure timolo, tocoferolo e, facoltativamente, uno o pi? principi attivi opzionali come sopra definiti, quali unici principi attivi nel trattamento e/o nella prevenzione di patologie oculari. In quest?ultimo caso, la composizione pu? comprendere altri componenti, come ad esempio eccipienti, veicolanti, stabilizzanti, conservanti e simili e/o anche altri principi attivi, a condizione che detti altri principi attivi non siano indicati nel trattamento di patologie oculari.

Le composizioni della presente invenzione possono comprendere altri componenti, ad esempio, eccipienti, veicolanti, aiuti di formulazione quali: tamponi (ad esempio, fosfato, borato e citrato), agenti chelanti (ad esempio EDTA), conservanti, (ad esempio, benzalconio cloruro) agenti di tonicit? (ad esempio, sodio cloruro e mannitolo). Le composizioni della presente invenzione possono anche includere agenti modificanti la viscosit? quali, ad esempio: esteri della cellulosa, (idrossipropilmetilcellulosa (HPMC), idrossietilcellulosa (HEC), etilidrossietilcellulosa, idrossipropilcellulosa, metilcellulosa e carbossimetilcellulosa; carbomeri (Carbopol); polivinilalcol; polivinilpirrolidone; alginati; carragenani; e guar, agarosio, tragacanto e gomma xantana. La concentrazione di detti agenti modificanti la viscosit? pu? variare tra circa 0,1 e circa 5 p %, ma dette formulazioni avranno generalmente una viscosit? tra circa 10 e circa 1000 centipoise.

Le composizioni secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione fornite nella presente descrizione, possono essere formulate in qualsiasi forma e per qualunque via di somministrazione ed associate a qualsiasi altro componente, in una variet? di modi.

Secondo una forma di realizzazione, le composizioni dell?invenzione sono composizioni per uso topico in forma liquida, semiliquida, semisolida oppure solida come, ad esempio, collirio, soluzione, soluzione sterile, sospensione, gocce oculari, spray, bagno oftalmico, gel, pomata, unguento, crema, salvietta medicata, bendaggio occlusivo (ad esempio in forma di garze medicate), inserti oftalmici (ad esempio inserti in idrossipropilcellulosa medicati a rilascio controllato).

Pertanto, la presente invenzione si riferisce anche all?associazione o alla composizione secondo una qualunque delle forme di realizzazione su descritte in forma di collirio, soluzione, soluzione sterile, sospensione, gocce oculari, spray, bagno oftalmico, gel, pomata, unguento, crema, salvietta medicata, bendaggio occlusivo e inserti oftalmici. Secondo una forma realizzativa preferita, la composizione per uso topico di cui alla presente invenzione sar? in forma di collirio ovvero soluzione isotonica tamponata a pH 6,7 ? 7,2.

Secondo un?altra forma di realizzazione, le composizioni dell?invenzione sono composizioni per uso orale in forma solida come ad esempio, capsule, capsule molli, compresse, pillole, pastiglie, gelatine, polveri o granuli oppure liquida come ad esempio emulsioni, soluzioni, sospensioni preparate o estemporanee, sciroppi e elisir. Pertanto, la presente invenzione si riferisce anche all?associazione o alla composizione secondo una qualunque delle forme di realizzazione su descritte in forma solida, preferibilmente in forma di capsule, capsule molli, compresse, pillole, pastiglie, gelatine, polveri o granuli oppure in forma liquida, preferibilmente emulsioni, soluzioni, sospensioni preparate o estemporanee, sciroppi ed elisir. Nel caso di forme solide, gli eccipienti saranno preferibilmente scelti tra, ma non limitati a, i seguenti: a) veicolanti, quali ad esempio citrato di sodio e calcio fosfato, b) riempitivi quali ad esempio amido, lattosio, cellulosa microcristallina, saccarosio, glucosio, mannitolo, trigliceridi e silice colloidale, c) umettanti, quali ad esempio il glicerolo, d) agenti disintegranti, quali alginati, carbonato di calcio, amidi, derivati dell?amido, della cellulosa e del polivinilpirrolidone, silicati e carbonato di sodio e) leganti quali carbossimetilcellulosa, alginati, gelatina, polivinilpirrolidone, saccarosio, derivati polimerici della cellulosa, derivati dell?amido f) agenti ritardanti quali paraffina, polimeri della cellulosa, esteri degli acidi grassi g) acceleratori dell?assorbimento, quali composti di ammonio quaternario, h) agenti bagnanti e tensioattivi quali alcool cetilico e glicerolo monostearato, i) adsorbenti, quali argille bentoniche e caolino, k) lubrificanti quali talco, stearato di calcio, stearato di magnesio, glicol polietilenico, sodio lauril solfato, sodio stearilfumarato j) glidanti quali talco, silice colloidale.

Le forme di dosaggio solide, quali compresse, capsule, capsule molli, gelatine, pillole e granuli, potranno eventualmente essere rivestite con rivestimenti enterici, gastrici o di altro tipo noti nello stato dell?arte eventualmente permettendo il rilascio degli ingredienti attivi soltanto o preferibilmente in un certo tratto dell?intestino, eventualmente, in modo ritardato. Sostanze che possono permettere tale uso ritardato includono, ma non sono ad esse limitate, polimeri e cere.

Nel caso di forme liquide, eccipienti adatti includono in particolare, ma non sono ad essi limitati, diluenti quali acqua o altri solventi, agenti solubilizzanti e emulsificanti scelti fra alcool etilico, polialcoli, glicol propilenico, glicerolo, polietilenglicole e esteri del sorbitano. Queste formulazioni possono anche contenere dolcificanti e aromi.

Preferibilmente, le composizioni di cui alla presente invenzione non contengono eccipienti e/o altri additivi, ma solamente i principi attivi e/o composti secondo una qualsiasi delle forme di realizzazione qui descritte, dissolti o sospesi in un veicolo adatto. Tuttavia, ove necessario, eccipienti adatti possono essere scelti tra quelli normalmente noti nello stato della tecnica e includono, ma non sono ad essi limitati: tensioattivi (ad esempio sodio laurilsolfato e polisorbati), adsorbenti (ad esempio gel di silice, talco, amido, bentonite, caolino), glidanti e anti-aderenti (ad esempio talco, silice colloidale, amido di mais, biossido di silicio), antiossidanti, leganti (ad esempio gomme, amido, gelatina, derivati della cellulosa, saccarosio, sodio alginato), plasticizzanti (ad esempio etilcellulosa ed altri derivati della cellulosa, acrilati e metacrilati, glicerolo e sorbitolo), conservanti (ad esempio parabeni, anidride solforosa, poliesametilene biguanide o PHMB), disodio edetato (EDTA), viscosizzanti, emulsionanti, umettanti, bagnanti, chelanti e loro miscele.

A titolo esemplificativo, la composizione potr? comprendere uno o pi? estratti di timo oppure timolo, tocoferolo e, facoltativamente uno o pi? principi attivi opzionali come sopra definiti, in soluzione isotonica tamponata a pH 7,0, preferibilmente soluzione fisiologica o soluzione salina isotonica a base di cloruro di sodio allo 0,9 %p/v.

La composizione, secondo qualunque forma di realizzazione della presente invenzione sar?, ad esempio, una composizione farmaceutica, nutraceutica, cosmetica, dietetica e/o nutrizionale, un dispositivo medico, un integratore alimentare, un prodotto alimentare, un medicamento, un alimento medicato o un alimento a fini medici speciali.

Le composizioni secondo qualunque delle forme di realizzazione qui descritte potranno essere utilizzate in qualunque soggetto per cui risulta indicata la somministrazione di timolo e/o estratto di timo ma in particolare in qualunque soggetto affetto dalle patologie oculari sopra menzionate, anche in ambito veterinario.

La combinazione dei principi attivi sopra detti potr? essere usata formulata in un?unica composizione secondo le varie forme di realizzazione sopra descritte o in un kit di parti che comprende i diversi ingredienti separati, ad esempio, in composizioni singole formulate in adatta forma di dosaggio per uso topico o orale come sopra definite, per la somministrazione sequenziale o contemporanea dei diversi principi attivi e/o composti.

Pertanto, la presente invenzione si riferisce anche a kit di parti che comprendono i diversi principi attivi dell?associazione secondo una qualunque delle forme di realizzazione qui descritte separati e formulati in adatta forma di dosaggio per somministrazione sequenziale o contemporanea dei diversi principi attivi. La presente invenzione si riferisce, ad esempio, ad un kit di parti comprendente una prima composizione per uso topico o orale che comprende almeno un estratto di pianta appartenente al genere Thymus, oppure timolo, una seconda composizione per uso topico o orale che comprende tocoferolo, preferibilmente alfa-tocoferolo, pi? preferibilmente VE-TPGS, e, facoltativamente, anche una terza composizione per uso topico o orale comprendente uno o pi? dei principi attivi opzionali come sopra definiti, per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie oculari, mediante la somministrazione sequenziale o simultanea di detta prima, seconda, o facoltativamente terza, composizione.

Come risulter? evidente all?esperto della tecnica dagli esempi di seguito forniti, la presente invenzione costituisce un valido sostegno nella riduzione o nella risoluzione della sintomatologia associata alle patologie oculari sopra menzionate, in particolare glaucoma, cataratta, cheratocono, secchezza oculare o occhio secco, allergia congiuntivale, congiuntivite, blefarite, cheratite, cheratite attinica, orzaiolo, danni da esposizione ai raggi UV, maculopatia, uveite, meibomite, trabeculite, ulcere corneali, ad esempio ulcere corneali da infezione o traumatiche, neurite ottica, pi? in particolare maculopatia, uveite, occhio secco, meibomite, trabeculite, ulcere corneali, ad esempio ulcere corneali da infezione o traumatiche, e neurite ottica, grazie all?azione combinata e diversificata dei suoi componenti, ma soprattutto grazie all?azione adiuvante del tocoferolo che agisce come potenziatore della biodisponibilit? di timolo e degli altri attivi compresi in estratto di timo.

Pertanto, la presente invenzione si riferisce anche a tocoferolo o suoi derivati come sopra definiti per l?uso come adiuvante e/o potenziatore della biodisponibilit? corneale di timolo in una terapia a base di estratto di almeno una pianta appartenente al genere Thymus oppure timolo. In altre parole, l?invenzione si riferisce all?uso di tocoferolo per incrementare la biodisponibilit? corneale del principio attivo timolo o di un estratto di pianta appartenente al genere Thymus comprendente detto principio attivo.

L?azione dei singoli componenti e dell?associazione oggetto della presente invenzione ? stata valutata mediante test in vitro e/o in vivo che, oltretutto, hanno evidenziato come la composizione dell?invenzione ? particolarmente efficace nel trattamento di patologie oculari grazie all?azione di rinforzo (sinergica) dei suoi componenti, ma soprattutto grazie all?azione adiuvante del tocoferolo che agisce come potenziatore della biodisponibilit? di timolo e degli altri attivi compresi nell?estratto di timo.

Pertanto, la presente invenzione si riferisce anche all?associazione, alle composizioni e al kit, secondo una qualunque delle forme di realizzazione qui sopra descritte, per l?uso come medicamento.

Inoltre, la presente invenzione si riferisce anche all?associazione, alle composizioni e al kit, in accordo ad una qualunque delle forme di realizzazione qui descritte, per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie oculari, preferibilmente scelte tra glaucoma, cataratta, cheratocono, secchezza oculare o occhio secco, allergia congiuntivale, congiuntivite, blefarite, cheratite, cheratite attinica, orzaiolo, danni da esposizione ai raggi UV, maculopatia, uveite, meibomite, trabeculite, ulcere corneali, ad esempio ulcere corneali da infezione o traumatiche, e neurite ottica, sia nell?uomo che negli animali.

Oltre a ci?, oggetto della presente invenzione ? anche l?uso non terapeutico o cosmetico dell?associazione, composizione o kit secondo qualunque delle forme di realizzazione descritte sopra, ad esempio, come lubrificante oculare, lacrime artificiali, liquido per lenti a contatto, liquido per pulizia e/o disinfezione delle palpebre, ad esempio in forma di spray o di bende medicate, liquido per detersione e/o disinfezione di bocca e narici ecc. L?associazione dei principi attivi sopra detti potr? essere formulata in un?unica composizione o in un kit secondo le varie forme di realizzazione sopra descritte e preparata ad esempio miscelando i principi attivi selezionati in veicolo adatto alla somministrazione topica oculare con eventuali altri principi attivi e/o eccipienti come noto al tecnico del settore.

ESEMPI

Di seguito sono riportati alcuni esempi non limitativi delle composizioni secondo la presente invenzione. Modifiche o variazioni delle forme di realizzazione qui esemplificate, ovvie ad un esperto del ramo, sono ricomprese dalle rivendicazioni annesse.

ESEMPIO 1: collirio, soluzione a base di estratto di Thymus vulgaris L.

Composizione A

Il collirio ? stato preparato secondo il seguente protocollo: aggiungere l?acqua all?interno di un becker poi la riboflavina fino a completa solubilizzazione.

Aggiungere la vitamina E TPGS ed attendere la sua completa solubilizzazione. Aggiungere l?olio essenziale di timo fino a completo incorporamento. A parte preparare un tampone aggiungendo in 100 g di acqua 0,066 g di potassio fosfato dibasico 0,025M e 0,3 g di fosfato monobasico 0,025 M. Misurare il pH ed aggiungere il tampone goccia a goccia fino ad arrivare a pH 7 (~ 0,3 g).

La soluzione risultante ? stata mescolata e poi posta in apposito flaconcino contagocce.

Composizione B

Il collirio ? stato preparato secondo il seguente protocollo: aggiungere l?acqua all?interno di un beacker poi la vitamina E ed attendere la sua completa solubilizzazione. Aggiungere l?olio essenziale di timo fino a completo incorporamento. Misurare il pH ed arrivare a 7 con il tampone preparato come descritto per la composizione A (~ 0,3 g). La soluzione ? stata mescolata e poi posta in apposito flaconcino contagocce.

Composizione C

Il collirio ? stato preparato secondo il seguente protocollo: aggiungere l?acqua all?interno di un beacker poi la riboflavina e attendere la sua completa solubilizzazione. Aggiungere l?olio essenziale di timo fino a completo incorporamento. Misurare il pH ed arrivare fino a pH 7 con il tampone preparato come descritto per la composizione A. La soluzione ? stata mescolata e poi posta in apposito flaconcino contagocce.

Composizione D

Il collirio ? stato preparato secondo il seguente protocollo: aggiungere l?acqua all?interno di un beacker poi aggiungere l?olio essenziale di timo fino a completo incorporamento. Misurare il pH ed arrivare fino a pH 7 con il tampone preparato come descritto per la composizione A. La soluzione ? stata mescolata e poi posta in apposito flaconcino contagocce.

ESEMPIO 2: salviette medicate

Salviette di tessuto non tessuto sono state imbevute in ambiente sterile con la soluzione A), B), C) o D) secondo l?esempio 1 e sigillate in bustine di alluminio.

Evidenze sperimentali

Materiali e metodi

Materiali

Sono state testate le soluzioni A, B, C e D dell?esempio 1 tutte a base di estratto di timo, in particolare olio essenziale (o.e.) di timo, in associazione a ribolflavina 5-fosfato e Vitamina E TPGS (composizione A), in associazione solo a Vitamina E TPGS (composizione B), in associazione solo a ribolflavina 5-fosfato (composizione C) e da solo (composizione D). Acqua distillata Milli-Q deionized (DI) ? stata utilizzata per tutte le preparazioni.

Linea cellulare e condizioni di coltura

I monostrati di cellule di fibroblasti L929 sono altamente rappresentativi del tessuto bersaglio in vivo. Le cellule L929 sono state coltivate in MEM (mezzo essenziale minimo) integrato con siero bovino fetale (10%) e glutammina (4 mM) e incubato in condizioni di coltura standard (37?C, 5% CO2).

Determinazione ex vivo della penetrazione corneale dell?estratto di timo o timolo nelle cellule di diffusione di Franz

L'accumulo corneale della soluzione ? stato valutato utilizzando una cellula di diffusione di tipo Franz modificata (? 9 mm, volume del recettore 5 mL, SES GmbH - Analysesysteme, Bechenheim, DE). Su sette gruppi di 10 cornee umane fornite da Fast Linking (consorzio spin-off Fast Linking, Napoli, Italia), sei sono stati immersi per 20 minuti in una composizione comprendente estratto di timo e VE-TPGS con concentrazioni crescenti di VE-TPGS (composizioni B1 ? B6) ed etichettati da B1 a B6. Un settimo gruppo, etichettato A, usato come gruppo di controllo, ? stato immerso nella stessa soluzione di cui sopra senza VE-TPGS (composizione D?). Le cornee sono state trattate come riportato in Ostacolo, C.; Caruso, C.; Tronino, D.; Troisi, S.; Laneri, S.; Pacente, L.; Del Prete, A.; Sacchi, A. Enhancement of corneal permeation of riboflavin-5?-phosphate through vitamin E TPGS: A promising approach in corneal trans-epithelial cross linking treatment. Int. J. Pharm. 2013, 440, 148?153). Diverse soluzioni acquose iso-osmolari, tamponate a pH 7,2 sono state utilizzate come compartimento donatore. Tutti contenevano lo 0,05% p/p di o.e. di timo e diverse concentrazioni di VE-TPGS, come mostrato nella Tabella 1. La soluzione A conteneva solo o.e. di timo ed era usata come controllo. Tutte le soluzioni da B1 a B6 sono state applicate su cornee epitelizzate al fine di valutare l'accumulo di timolo come riportato in Ostacolo C., Caruso C., Tronino D., Troisi S., Laneri S., Pacente L., Del Prete A., Sacchi A. ?Enhancement of corneal permeation of riboflavin-5'-phosphate through vitamin E TPGS: a promising approach in corneal trans-epithelial cross linking treatment. Int J Pharm.2013;440(2):148?153.)

Analisi HPLC

L'attrezzatura e le impostazioni analitiche erano le stesse usate in [Ostacolo C., Caruso C., Tronino D., Troisi S., Laneri S., Pacente L., Del Prete A., Sacchi A. ?Enhancement of corneal permeation of riboflavin-5'-phosphate through vitamin E TPGS: a promising approach in corneal trans-epithelial cross linking treatment. Int J Pharm. 2013;440(2):148?153.- Vi?as P., Balsalobre N., L?pez-Erroz C., Hern?ndez-C?rdoba M. Liquid chromatographic analysis of riboflavin vitamers in foods using fluorescence detection. J Agric Food Chem.2004;52(7):1789-1794.]. I risultati sono espressi come media ? SEM. I dati ottenuti sono stati analizzati dal test T di Student per rilevanza statistica. Un valore di p ? 0,05 ? stato considerato significativo in questo studio.

Tossicit? in vitro mediante dosaggio MTT

La composizione B (ossia comprendente l?associazione VE TPGS ed estratto di timo) ? stata testata per la sua tossicit? su cellule L929 mediante saggio MTT [Stockert J.C., Horobin R.W., Colombo L.L., Bl?zquez-Castro A. ?Tetrazolium salts and formazan products in Cell Biology: Viability assessment, fluorescence imaging, and labeling perspectives?, Acta Histochem.2018;120(3):159-167.]. In breve, la composizione B comprendente o.e. di timolo 0,05% e VE-TPGS 0,5% ? stata incubata durante la notte in terreno di coltura. Una sospensione cellulare L929 ? stata preparata ad una concentrazione di 4 ? 104 cellule/mL e seminata su piastre di coltura a 96 pozzetti (100 ?L/ogni pozzetto). Le cellule sono state incubate nel mezzo contenente la formulazione o nelle diluizioni successive (1: 2) in terreno di coltura per 24 ore. Il dodecil solfato di sodio (SDS) ? servito da controllo positivo a concentrazioni comprese tra 0,00313 e 0,4 mg/mL, mentre le cellule non trattate nel terreno di coltura sono state utilizzate come controllo negativo. Dopo un contatto di 24 ore, il terreno di coltura ? stato accuratamente rimosso da ciascun pozzetto e le cellule sono state trattate con bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (o MTT) (1 mg/ml) e incubate per 3 ore in condizioni di coltura standard. Dopo questo periodo, la soluzione di MTT ? stata lavata via e il cristallo di formazano ? stato sciolto con 100 ?L di isopropanolo. L'assorbanza (densit? ottica, OD) ? stata determinata spettrofotometricamente a 540 nm di lunghezza d'onda.

Tolleranza oculare in vivo nei conigli

Un totale di dodici (12) conigli femmine di Nuova Zelanda bianchi specifici patogeni liberi (SPF), di circa 11 settimane, sono stati ordinati e forniti da Charles River Italia S.p.A., Calco (Lecco), Italia. Gli animali sono stati assegnati a due gruppi di 5 animali ciascuno, un gruppo di controllo che riceveva solo il placebo e il secondo che riceveva il collirio. La composizione B, comprendente rispettivamente lo 0,5% e lo 0,05% di VE-TPGS e di o.e. di timo ? stata instillata nell'occhio destro, due volte al giorno ad un intervallo di 6 ore. ? stato instillato un volume di 60 ?L del collirio in esame (composizione B) o del collirio di controllo (Composizione C) nel sacco congiuntivale inferiore dell'occhio destro, assicurando che il globo o le congiuntive non fossero danneggiati. L'occhio ? stato quindi tenuto chiuso per alcuni secondi per prevenire la perdita della formulazione e favorire la distribuzione sulle superfici dell'occhio e sulle membrane congiuntivali. Gli occhi di sinistra servivano da controllo. Gli animali sono stati trattati 2 volte al giorno per 7 giorni consecutivi. Gli animali sono stati dosati fino al giorno prima della necroscopia. Entrambi gli occhi di tutti gli animali sono stati esaminati una volta pre-dose e due volte al giorno dopo, prima di ogni somministrazione. A qualsiasi irritazione osservata ? stato assegnato un valore numerico secondo la tabella seguente in base ai metodi descritti da Draize et al.

[Draize J.H., Woodard G., Calvery H.O. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1944; 83, 377-390.]. Lo studio ? stato conforme alla Dichiarazione ARVO per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva e in conformit? con le linee guida della Comunit? Economica Europea per la cura e il benessere degli animali (Legge CEE n. 86/609). Lo studio ha ricevuto l'approvazione dal Comitato etico locale n.21/2019.

Microrganismi

L'attivit? antimicrobica della composizione B, ossia comprendente l?associazione VE-TPGS e o.e. di timo di cui alla presente invenzione, ? stata valutata contro Staphylococcus aureus (ATCC 6538), S. epidermidis, Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 1640 ).

Determinazione di MIC, MBC e MFC

Per determinare le concentrazioni inibitorie minime (MIC) in vitro della composizione B, ossia comprendente l?associazione o.e. di timo e VE-TPGS, i test di diluizione del microbroth sono stati eseguiti in linea con le linee guida CLSI (Clinical & Laboratory Standards Institute) [Wikler, M.A., Clinical and Laboratory Standard Institute. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 18th Informational Supplement. Clinical and Laboratory Standards Institute, 2008. Wayne, PA]. In dettaglio, dalle colture notturne di Mueller ? Hinton Agar (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, USA) i batteri sono stati prima risospesi ad una concentrazione di 1.5 x 10<8 >CFU / mL in soluzione salina sterile e successivamente diluiti ad una concentrazione di ?1,5 ? 10<5 >CFU / mL in brodo Mueller ? Hinton aggiustato per catione (CAMHB, Thermo Scientific Waltham, USA) contenente diverse diluizioni della composizione B, comprendente l?associazione VE-TPGS e o.e. di timo. Le piastre sono state incubate in aria per 24 ore a 37?C.

Allo stesso modo, l'attivit? fungistatica e fungicida della composizione B ? stata testata contro Candida albicans con il metodo di diluizione del micro-brodo in piastre da 96 pozzetti secondo le linee guida riportate nel documento CLSI M27-A3 [Clinical and Laboratory Standards Institute, C.L.S.I, 2008. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts; Approved Standard, third ed. Clinical and Laboratory Standards Institute, Wayne, PA CLSI Document M27-A3]. In dettaglio, le colonie della piastra di agar destrosio di Sabouraud sono state coltivate in terreno RPMI 1640 preriscaldato (con l-glutammina, glucosio al 2%, senza bicarbonato e con rosso fenolo come indicatore di pH) tamponato a pH 7,0 con 0,165 M di morfolina propano solfonico acido (MOPS). Diverse diluizioni della composizione B sono state aggiunte a ciascun pozzetto contenente 2 ? 103 lieviti / ml. La piastra ? stata incubata a 37?C per 24 o 48 ore. La MIC ? stata quindi determinata visivamente come la concentrazione pi? bassa che non mostrava crescita. L'MBC (concentrazione battericida minima) e l'MFC (concentrazione fungicida minima) sono state determinate placcando 20 ?L di ciascun pozzetto su piastre di agar incubate a 37?C per 24 ore o 48 ore. L'MBC e l'MFC sono state identificate come la pi? bassa concentrazione placcata a non mostrare crescita microbica. Ogni dosaggio ? stato eseguito in triplice copia. I rapporti MBC / MIC sono stati calcolati al fine di determinare l'effetto battericida / fungicida (MBC / MIC ? 4 o MFC / MIC ? 4) o batteriostatico / fungistatico (MBC / MIC> 4 o MFC / MIC> 4) di queste composizioni.

Inibizione del biofilm

Un protocollo simile agli esperimenti antimicrobici ? stato utilizzato per determinare la capacit? della composizione B, ossia comprendente l?associazione estratto di timo e VE-TPGS di cui alla presente invenzione, di inibire la formazione di biofilm di batteri. In dettaglio, i batteri dopo incubazione di 24 ore con diverse diluizioni della composizione sono stati lavati due volte con PBS per rimuovere le cellule vagamente aderenti e quindi colorati per 15 minuti con 200 ?L di violetto cristallino (CV, 0,3% p / v). I pozzetti sono stati quindi sciacquati con acqua ed essiccati. La quantit? di biomassa da biofilm ? stata quantificata sciogliendo i cristalli di 200 ?L di acido acetico al 33% e quindi misurando l'assorbanza della soluzione CV in uno spettrofotometro per micropiastre fissato a 600 nm. Le cellule non trattate sono state utilizzate come controllo. Ogni dosaggio ? stato eseguito in triplicato in giorni separati.

Allo stesso modo, al fine di determinare la capacit? della formulazione di inibire la formazione di biofilm di C. albicans, le cellule di lievito sono state inoculate in 7 mL di base di azoto di lievito (YNB) con glucosio 100mM (pH 7,0) e incubate durante la notte a 25?C. La coltura diluita a 107 cellule / mL e aliquotata in una piastra a fondo piatto da 96 pozzetti (0,2 ml / pozzetto). Le cellule di C. albicans sono state lasciate aderire per 90 minuti a 37?C; successivamente, i pozzetti sono stati lavati con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, pH 7,2) per rimuovere le cellule non aderenti. Per consentire alle cellule di lievito aderenti di germinare ed eventualmente formare biofilm, ? stato aggiunto a ciascun pozzetto un nuovo mezzo YNB a pH 7,0 con diversa diluizione (1:10) della composizione e incubato a 37?C. Dopo 48 ore, la massa di biofilm ? stata lavata con PBS, essiccata, colorata con CV per 15 minuti e quantificata ritestando i pozzetti con 200 mL di acido acetico al 33%.

Challenge test

Le propriet? di barriera microbica della composizione sono state valutate da un challenge test in vitro descritto dalla farmacopea europea per stimare potenziali contaminazioni durante il suo utilizzo. La formulazione ? stata testata contro i seguenti batteri e funghi: Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404). In dettaglio, secondo la metodologia standard, la formulazione ? stata suddivisa in aliquote da 10 mL, che sono state inoculate con 106 e 105 unit? formanti colonie (CFU) / mL di batteri e funghi rispettivamente, e incubate tra 20?C e 25?C. I campioni sono stati raccolti in diversi intervalli temporali: 2, 7, 14 e 28 giorni. Aliquote di 1 mL sono state diluite in serie in brodo typtoneazolectina-Tween e placcate in duplicato su agar triptico-soia (per batteri) o agar destrosio Sabouraud (per funghi). Le piastre sono state incubate a una temperatura compresa tra 30?C e 35?C per ? 3 giorni per i batteri e tra 20?C e 25?C per ? 5 giorni per i funghi. I conteggi dei dati non elaborati sono stati convertiti in valori log10.

Risultati

VE-TPGS aumenta l'accumulo corneale di estratto di timo o timolo

Per valutare se questa nuova composizione aumenta la biodisponibilit? di estratto di timo o timolo in tutta la cornea, sono state applicate diverse composizioni comprendenti l?associazione estratto di timo e VE-TPG di cui alla presente invenzione, su cornee umane e analizzate da un sistema di cellule di diffusione di tipo Franz modificato. In particolare, sette gruppi di 10 cornee umane sono stati incubati per circa 20 minuti con o.e. di timo 0,05% p/p e una percentuale crescente (p/p) di VE-TPGS (da 0 a 1), come mostrato nella Tabella 1.

Tabella 1

% p/p %p/p Composizione o.e. di timo VE TPGS

A 0,05

B1 0,05 0,010 B2 0,05 0,050 B3 0,05 0,100 B4 0,05 0,250 B5 0,05 0,500 B6 0,05 1,000

Quindi, le cornee sono state elaborate secondo la procedura riportata e la

permeabilit? dell?o.e. di timo ? stata determinata analizzando la camera del

ricevente nel tempo e quantificando la molecola mediante HPLC [Ostacolo C.,

Caruso C., Tronino D., Troisi S., Laneri S., Pacente L., Del Prete A., Sacchi A.

Enhancement of corneal permeation of riboflavin-5'-phosphate through vitamin E

TPGS: a promising approach in corneal trans-epithelial cross linking treatment.

Int J Pharm.2013;440(2):148?153.]. L'accumulo di o.e. di timo ? stato espresso

come nmol per mg di tessuto corneale come riportato nella Tabella 2. La

soluzione A ? stata usata come controllo.

Tabella 2

Composizione Accumulo o.e. di timo (nmol/mg)

A 0,032 ? 0,017

B1 0,067 ? 0,035

B2 0,184 ? 0,014

B3 0,236 ? 0,021

B4 0,346 ? 0,018

B5 0,398 ? 0,034

B6 0,453 ? 0,013

In tutte le condizioni analizzate, tranne quella denominata B1, abbiamo misurato

una maggiore concentrazione di o.e. di timo rispetto al controllo (A). ?

interessante notare che a concentrazioni crescenti di VE-TPGS si ? verificato un

maggiore accumulo di o.e. di timo fino alla condizione B5 in cui VE-TPGS ? stato utilizzato allo 0,5% (p / p). Non sono state rilevate differenze significative tra le condizioni B5 (0,5% p / p VE-TPGS) e B6 (1% p / p VE-TPGS).

La concentrazione di VE-TPGS non dovrebbe superare la concentrazione critica di micelle (CMC), poich? oltre una certa soglia l'attivit? biocida dei conservanti oftalmici diminuisce significativamente [Deluca P.P., Kostenbauder H.B. Interaction of preservatives with macromolecules IV. Binding of quaternary ammonium compounds by nonionic agents. J Am Pharm Assoc Am Pharm Assoc. 1960;49:430-7.]. Inoltre, una maggiore concentrazione di tensioattivi non ionici potrebbe comportare un potenziale rischio di sicurezza per l'interruzione del film lacrimale precorneale [Maurer N., Wong K.F., Hope M.J., Cullis P.R. Anomalous solubility behavior of the antibiotic ciprofloxacin encapsulated in liposomes: A 1H-NMR study. Biochim Biophys Acta.1998;1374(1-2):9-20.]. Per questi motivi, la composizione B5 ? stata utilizzata per la seguente analisi.

Tossicit? in vitro della composizione VE-TPGS ed estratto di timo

Una volta stabilita una migliore biodisponibilit? di o.e. timo, o timolo, attraverso la cornea, la composizione comprendente VE-TPGS ed estratto di timo ? stata valutata per la sua tossicit? in vitro. Un nuovo collirio viene solitamente testato per essere in grado di stimolare in vitro la crescita delle cellule e per essere compatibile con il loro metabolismo con effetti non citotossici, anche a concentrazioni relativamente elevate. I risultati rappresenterebbero un indice dell'elevata compatibilit? cutanea di un dispositivo medico e suggerirebbero anche un potenziale ruolo del dispositivo stesso nell'accelerare il capovolgimento della pelle su cui i prodotti topici vengono applicati direttamente [Rossi A.B., Bacquey A., Nocera T., Thouvenin M.D. Efficacy and Tolerability of a Medical Device Repairing Emollient Cream Associated with a Topical Corticosteroid in Adults with Atopic Dermatitis: An Open-label, Intra-individual Randomized Controlled Study. Dermatol Ther (Heidelb).2019;9(2):389. -Pinter A., Thouvenin M.D., Bacquey A., Rossi A.B., Nocera T. Tolerability and Efficacy of a Medical Device Repairing Emollient Cream in Children and Adults with Mild to Moderate Atopic Dermatitis. Dermatol Ther (Heidelb).2019; 9(2): 309?319.].

Il test di citotossicit? ? stato eseguito su cellule di fibroblasti L929 che sono state trattate con liquido di macerazione e successive diluizioni 1:2. Il liquido di macerazione ? stato ottenuto dopo incubazione durante la notte la formulazione di VE-TPGS (0,5% p / p) ed o.e. di timo (0,05% p / p) in terreno di coltura. Dopo 24 ore di incubazione, le cellule sono state analizzate mediante saggio MTT. Come mostrato nella Tabella 3, la vitalit? delle cellule post-incubazione con l'estratto (100% liquido di macerazione) ? stata dell'88,4%, suggerendo che questa formulazione non provoca effetti citotossici n? stimola la proliferazione cellulare.

Tabella 3

Studio di tolleranza oculare in vivo su conigli

La tolleranza della associazione estratto di timo e tocoferolo ? stata anche testata in vivo mediante instillazione oculare due volte al giorno di 60 ?L di composizione B nell'occhio destro di sei conigli per 7 giorni presso il Research Toxicology Center (RTC STUDY NO. A3656). L'occhio sinistro di ciascun animale ? rimasto non trattato e ha funzionato come controllo intra-animale. Come gruppo di controllo, un'altra serie di sei conigli ? stata trattata con cloruro di sodio allo 0,9%. Due volte al giorno, in ciascun animale sono stati osservati e registrati i seguenti parametri: segni clinici, peso corporeo, osservazioni oculari (valutazione dell'irritazione oculare due volte al giorno) e osservazioni macroscopiche postmortem grossolane (con particolare attenzione all'occhio e agli annessi). Nessuno dei conigli trattati con l?associazione estratto di timo e tocoferolo ha sviluppato segni di effetti sistemici. Inoltre, l'esame di entrambi gli occhi prima e dopo la dose dell?associazione non ha rivelato alcun effetto correlato al trattamento n? irritazione. In effetti, abbiamo assegnato a ciascun animale un punteggio pari a zero in un intervallo compreso tra 0 e 4, dove 0 corrisponde alla normale fisiologia dell'occhio e 4 ai segni di maggiore irritazione secondo Draize et al. (Draize, J.H.; Woodard, G.; Calvery, H.O. Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J. Pharmacol. Exp. Ther.1944, 83, 377?390). Nessun cambiamento correlato al trattamento ? stato osservato nelle osservazioni macroscopiche post mortem.

Insieme, i risultati suggeriscono fortemente che questa nuova soluzione oftalmica ? ben tollerata dall'occhio del coniglio, in particolare quando somministrata due volte al giorno alla dose di 60 ?L sulla superficie dell'occhio.

Attivit? antimicrobica del collirio estratto di timo, o timolo, e tocoferolo Al fine di verificare se l'attivit? antimicrobica di o.e. di timo combinata con VE-TPGS ? stata preservata, MIC e MBC del collirio sono state valutate contro ceppi di batteri Gram-positivi e negativi (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli) e funghi (Candida albicans). Come mostrato in Tabella 4, tutti i batteri tranne P. aeruginosa e C. albicans sono stati significativamente inibiti nella loro vitalit? e tra questi, l'effetto pi? forte ? stato contro S. aureus con il pi? basso MIC (9 ?L/mL) e MBC (35 ?L/mL) valori (Tabella 4). I rapporti MBC/MIC hanno mostrato che la formulazione ha un effetto battericida e fungicida rispettivamente su S. aureus, S. epidermidis e C. albicans, mentre ? batteriostatica su E. coli perch? il rapporto MBC/MIC ? superiore a 4 (Tabella 4).

Tabella 4

La capacit? della formulazione di prevenire la crescita microbica ? stata testata dal challenge test, in cui la formulazione ? stata inoculata direttamente con S. aureus, P. aeruginosa, C. albicans e A. niger e la loro crescita ? stata monitorata nel tempo contando le loro colonie su piastre di agar. Tra i batteri solo S. aureus ? stato completamente inibito per tutto il tempo, mentre i funghi, C. albicans e A. niger, sono stati ridotti a due giorni di 3 volte e 1 volta rispettivamente e a sette giorni di 5 volte e 3 volte rispettivamente. A 14 giorni C. albicans non si riprese pi?, mentre A. niger mantenne lo stesso tasso di crescita osservato a sette giorni. Queste evidenze suggeriscono che il collirio dell?invenzione, ossia comprendente l?associazione estratto di timo, o timolo, e tocoferolo, in particolare VE-TPGS, soddisfa le esigenze tipiche dei colliri antimicrobici.

In altre parole, questi risultati dimostrano che nonostante le composizioni comprendenti estratto di timo, o timolo, sono efficaci nella prevenzione e nel trattamento di patologie oculari, in particolare infezioni oculari, solo il collirio comprendente l?associazione di cui alla presente invenzione, ossia estratto di timo oppure timolo insieme con tocoferolo, in particolare VE-TPGS, risulta adatto a potenziare la biodisponibilit? di timolo in vivo. Inoltre, gli esperimenti sopra riportati hanno dimostrato che l?incremento di biodisponibilit? ? direttamente proporzionale alla dose di tocoferolo, in particolare VE-TPGS.

Claims (15)

RIVENDICAZIONI

1. Associazione di almeno un estratto di pianta appartenente al genere Thymus oppure timolo con tocoferolo o sali ed esteri di tocoferolo.

2. Associazione secondo la rivendicazione 1, in cui l?estratto di pianta appartenente al genere Thymus ? scelto tra estratto di Thymus vulgaris L., estratto di Thymus zygis, estratto di Thymus striatus, estratto di Thymus spinulosus, estratto di Thymus richardii, estratto di Thymus catharinae, estratto di Thymus herba-barona, estratto di Thymus odoratissimus, estratto di Thymus oenipontanus, estratto di Thymus kosteletzkyanus, estratto di Thymus alpestris, estratto di Thymus pulegioides, estratto di Thymus longicaulis, estratto di Thymus praecox, estratto di Thymus thracicus e miscele di questi, ed ? preferibilmente estratto di Thymus vulgaris L.

3. Associazione secondo la rivendicazione 1 o 2, in cui detto estratto di pianta appartenente al genere Thymus, o dette miscele, sono titolati in timolo tra il 30 e il 60 % p/p, preferibilmente tra il 35 e il 45 % p/p, pi? preferibilmente al 40 - 42,5 % p/p.

4. Associazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 3, in cui detto tocoferolo ? alfa-tocoferolo, preferibilmente un estere poliossialchilen glicolico di un estere di alfa-tocoferolo con un acido carbossilico, in cui preferibilmente detto estere di alfa-tocoferolo con un acido carbossilico ? scelto tra tocoferolo succinato, tocoferolo acetato, tocoferolo linoleato e tocoferolo fosfato e/o in cui preferibilmente la funzione poliossialchilenglicolica di detto estere poliossialchilen glicolico ha un peso molecolare compreso tra circa 600 Da e circa 6000 Da, preferibilmente tra circa 600 Da e circa 1500 Da, ed ? preferibilmente d-alfa-tocoferolo-polietilenglicole 1000 succinato (VE-TPGS).

5. Associazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 4 che comprende ulteriormente un principio attivo, preferibilmente scelto nel gruppo costituito da: beta-bloccanti; alfa-agonisti; inibitori dell?anidrasi carbonica; agonisti e antagonisti dopaminergici; farmaci colinergici; prostaglandine; ACE inibitori; steroidi; bloccanti il canale del calcio; antiipertensivi; antiinfiammatori non steroidei; antiinfiammatori steroidei; antibiotici; antifungini; antivirali; agenti anticataratta; antiossidanti; antistaminici; antimetaboliti; immunosoppressori; fattori di crescita, vitamine, preferibilmente riboflavina 5 fosfato, e miscele di questi.

6. Composizione comprendente l?associazione secondo una qualunque delle rivendicazioni da 1 a 5 e uno o pi? veicoli e/o eccipienti, preferibilmente in cui detto veicolo ? soluzione isotonica tamponata a pH 7.

7. Composizione secondo la rivendicazione 6, in cui l?almeno un estratto di pianta appartenente al genere Thymus, oppure timolo, ? presente in una concentrazione compresa tra 0,001 e 1 %p/p, preferibilmente 0,01 e 0,1 %p/p, pi? preferibilmente 0,05 %p/p; e/o in cui tocoferolo o sali ed esteri di tocoferolo sono presenti in una concentrazione compresa tra 0,01 e 3 %p/p, preferibilmente 0,1 e 2 %p/p, pi? preferibilmente 0,5 %p/p.

8. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 6 a 7, in cui detta composizione ? una composizione farmaceutica, nutraceutica, cosmetica, dietetica e/o nutrizionale, un dispositivo medico, un integratore alimentare, un prodotto alimentare, un medicamento, un alimento medicato o un alimento a fini medici speciali.

9. Composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 6 a 8 per uso topico, preferibilmente in una forma scelta tra: collirio, soluzione, sospensione, gocce oculari, spray, bagno oftalmico, gel, pomata, unguento, crema, salvietta medicata, bendaggio occlusivo e inserti oftalmici oppure per uso orale, preferibilmente in una forma scelta tra: capsule, capsule molli, compresse, pillole, pastiglie, gelatine, polveri, granuli, emulsioni, soluzioni, sospensioni, sciroppi ed elisir.

10. Kit di parti comprendente una prima composizione per uso topico o orale che comprende timolo o almeno un estratto di pianta appartenente al genere Thymus, una seconda composizione per uso topico o orale che comprende tocoferolo, preferibilmente alfa-tocoferolo, pi? preferibilmente VE-TPGS, e facoltativamente una terza composizione per uso topico o orale che comprende uno o pi? dei principi attivi secondo la rivendicazione 5, per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie oculari, mediante la somministrazione sequenziale o simultanea di detta prima, seconda e facoltativamente terza composizione.

11. Associazione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 1 a 5 oppure composizione secondo una qualsiasi delle rivendicazioni da 6 a 9 oppure kit di parti secondo la rivendicazione 10, per l?uso come medicamento, preferibilmente per l?uso nella prevenzione e/o nel trattamento di patologie oculari.

12. Associazione oppure composizione oppure kit di parti per l?uso secondo la rivendicazione 11, in cui dette patologie oculari sono glaucoma, cataratta, cheratocono, secchezza oculare o occhio secco, allergia congiuntivale, congiuntivite, blefarite, cheratite, cheratite attinica, orzaiolo, danni da esposizione ai raggi UV, maculopatia, uveite, meibomite, trabeculite, ulcere corneali e/o neurite ottica.

13. Uso non terapeutico o cosmetico dell?associazione, composizione o kit di parti secondo qualunque delle rivendicazioni precedenti come lubrificante oculare, lacrime artificiali, liquido per lenti a contatto, liquido per pulizia e/o detersione delle palpebre, liquido per detersione e/o disinfezione di bocca e narici.

14. Uso di tocoferolo, preferibilmente VE-TPGS, per incrementare la biodisponibilit? corneale del principio attivo timolo o di un estratto di pianta appartenente al genere Thymus comprendente detto principio attivo.

15. Tocoferolo, preferibilmente VE-TPGS, per l?uso come potenziatore della biodisponibilit? corneale in una terapia a base di timolo e/o a base di estratto di almeno una pianta appartenente al genere Thymus.