KR20160079865A

KR20160079865A - 프테로스틸벤의 생합성 제조를 위한 o-메틸트랜스퍼라제의 사용 방법

Info

Publication number: KR20160079865A
Application number: KR1020167014617A
Authority: KR
Inventors: 모하마드 와두드 부이야; 예춘 왕; 샤오단 유
Original assignee: 코나겐 인크.
Priority date: 2013-11-01
Filing date: 2014-11-03
Publication date: 2016-07-06
Also published as: CA2963219C; KR102350425B1; JP6522640B2; JP2017502685A; US20160273006A1; HUE045463T2; CN106102454A; WO2015066609A1; BR112016009734A2; CN106102454B; MX369206B; EP3062607A1; CA2963219A1; EP3062607A4; DK3062607T3; EP3062607B1; MX2016005717A; US10370683B2; ES2745092T3

Abstract

본 발명은 세포 시스템에서 4-쿠마레이트조효소 A 리가제 (4CL)를 발현시키는 것, 세포 시스템에서 스틸벤 신타제 (STS)를 발현시키는 것, 세포 시스템에서 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제 (ROMT)를 발현시키는 것, p-쿠마르산을 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것, 및 프테로스틸벤을 생성시키는 것을 포함하는, 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법에 관한 것이다.

Description

프테로스틸벤의 생합성 제조를 위한 O-메틸트랜스퍼라제의 사용 방법{METHODS OF USING O-METHYLTRANSFERASE FOR BIOSYNTHETIC PRODUCTION OF PTEROSTILBENE}

[관련 출원의 상호-참조]

본 개시내용은 발명의 명칭 [Method of Using O- methyltransferase for Biosynthetic Production of Pterostilbene]의 PCT 특허 출원이다. 본 출원은 2013년 11월 1일자 US 특허 가출원 제61/898899호의 우선권을 주장하며, 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.

[기술 분야]

본 개시내용은 식품, 의약 및 약물학 산업에 이용가능성을 갖는다. 본 개시내용은 일반적으로 O-메틸트랜스퍼라제 (ROMT)를 이용한 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법에 관한 것이다.

배경 기술: 프테로스틸벤은 레스베라트롤과 화학적으로 관련되어 있는 스틸베노이드(stilbenoid)로서, 블루베리 및 포도에서 발견된다. 이는 감염에 대항하기 위하여 식물에 의해 생성되는 작용제인 피토알렉신(phytoalexin)의 군에 속한다. 동물 연구에 따르면, 이는 항-암, 항-고콜레스테롤혈증, 항-고트리글리세리드혈증 특성은 물론, 인지 저하를 극복하여 반전시키는 능력을 나타내는 것으로 생각된다. 상기 화합물은 또한 항-당뇨병 특성도 가지고 있는 것으로 여겨지나, 이 문제에 대해서는 지금까지 연구된 것이 매우 적다.

슈미들린(Schmidlin) 등은 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제 (ROMT)가 레스베라트롤의 프테로스틸벤으로의 직접적인 전환을 촉매촉진할 수 있다고 보고하고 있다 (문헌 [Schmidli et al., 2008]) (등재 번호: FM178870). 프테로스틸벤은 4-쿠마레이트-CoA 리가제 (4CL), 스틸벤 신타제 (STS) 및 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제 (ROMT)의 작용에 의해 생성된다 (도 1).

본 발명에서, 출원인은 레스베라트롤을 프테로스틸벤으로 전환시키기 위하여, ROMT가 4CL 및 STS와 함께 세포 시스템에서 발현될 수 있음을 입증한다.

[발명의 개요]

본 개시내용은 효모 또는 박테리아와 같은 세포 시스템에서 프테로스틸벤을 제조하는 것에 관련한 기술적 문제를 해소한다. 본 출원인은 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제 (4CL), 스틸벤 신타제 (STS) 및 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제 (ROMT)의 유전자를 독자적으로 단리하고, 프테로스틸벤의 제조를 촉진하는 세포 시스템에서 이를 발현시켰다. 본 개시내용은 레스베라트롤 및 프테로스틸벤의 산업적 제조를 제공한다.

본 개시내용은 세포 시스템에서 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제 (4CL)를 발현시키는 것, 세포 시스템에서 스틸벤 신타제 (STS)를 발현시키는 것, 세포 시스템에서 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제 (ROMT)를 발현시키는 것, p-쿠마르산을 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것, 및 이들에 의해 프테로스틸벤을 생성시키는 것을 포함하는, 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법이다.

또 다른 실시양태는 세포 시스템에서 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제 (ROMT)를 발현시키는 것, 레스베라트롤을 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것, 및 프테로스틸벤을 생성시키는 것을 포함하는, 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법이다.

또 다른 실시양태는 세포 시스템에서 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제 (4CL)를 발현시키는 것, 세포 시스템에서 스틸벤 신타제 (STS)를 발현시키는 것, p-쿠마르산을 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것, 및 레스베라트롤을 생성시키는 것을 포함하는, 레스베라트롤의 생합성 제조 방법이다.

또 다른 실시양태는 제1 세포 시스템에서 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제 (4CL)를 발현시키는 것, 제1 세포 시스템에서 스틸벤 신타제 (STS)를 발현시키는 것, p-쿠마르산을 제1 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 제1 세포 시스템을 성장시키는 것, 레스베라트롤을 생성시키는 것, 제2 세포 시스템에서 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제 (ROMT)를 발현시키는 것, 상기 생성된 레스베라트롤을 제2 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 제2 세포 시스템을 성장시키는 것, 및 프테로스틸벤을 생성시키는 것을 포함하는, 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법이다.

본 개시내용의 보다 우수한 이해를 위하여, 첨부 도면을 참조할 수 있는 바, 하기와 같다:
도 1은 프테로스틸벤의 생합성 경로를 나타낸다.
도 2는 3종 표준물 (p-쿠마르산, 레스베라트롤 및 프테로스틸벤)의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 3은 4CL::STS 융합 유전자를 발현하는 이. 콜라이(E. coli ) 세포 유래 추출물의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 4는 ROMT 유전자를 발현하는 이. 콜라이 세포 유래 추출물의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 5는 4CL::STS 및 ROMT 유전자를 공동-발현하는 이. 콜라이 세포 유래 추출물의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 6은 4CL::STS 융합 유전자를 발현하는 효모 세포 유래 추출물의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 7은 ROMT 유전자를 발현하는 효모 세포 유래 추출물의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 8은 4CL::STS 및 ROMT 유전자를 공동-발현하는 효모 세포 유래 추출물의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 9는 리본으로 표시되는 ROMT의 모델을 나타낸다. 기질은 짙은 회색의 막대 모델로 표시되어 있다. 기질 결합 잔기는 흑색 색상의 막대 모델로 표시되어 있다. F167A, D174A, W258A, H261A (H261이 핵심 아미노산임)가 수행된 변경이다. 이들은 모두 활성에 있어서 핵심 아미노산이며, H261이 가장 중요하다.
도 10은 야생형 ROMT 및 ROMT-돌연변이를 발현하는 이. 콜라이 세포 유래 추출물의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
본 개시내용이 다양한 변형 및 대안적인 형태의 여지가 있는 한편, 그의 구체적인 실시양태들을 도면에 예로써 나타내며, 이는 본원에서 상세하게 기술될 것이다. 그러나, 본원에서 제시되는 도면 및 상세한 설명이 본 개시내용을 개시된 특정 실시양태로 제한하고자 하는 것은 아니며, 오히려 반대로, 첨부된 청구범위에 의해 한정되는 바와 같은 본 개시내용의 기술사상 및 영역 내에 속하는 모든 변형, 등가물 및 대안들을 포괄하고자 하는 것임이 이해되어야 한다.

[정의]

세포 시스템

세포 시스템은 전위 단백질 (ectopic protein)의 발현을 제공하는 임의의 세포이다. 여기에는 박테리아, 효모, 식물 세포 및 동물 세포가 포함된다. 여기에는 원핵 및 진핵 세포 모두가 포함된다. 여기에는 또한 리보솜과 같은 세포 구성요소들을 바탕으로 하는 시험관 내 단백질 발현이 포함된다.

세포 시스템의 성장

성장시키는 것에는 세포가 증식 및 분할 가능하게 하는 배지를 제공하는 것이 포함된다. 여기에는 또한 자원을 제공함으로써 세포 또는 세포 구성요소가 재조합 단백질을 번역하여 생성시킬 수 있도록 하는 것이 포함된다.

형질감염

형질감염은 의도적으로 핵산을 세포에 도입하는 과정이다. 상기 용어는 종종 진핵 세포에서의 비-바이러스적 방법에 사용된다. 이는 다른 방법 및 세포 유형을 지칭할 수도 있기는 하지만, 하기의 다른 용어가 바람직하다: 박테리아, 식물 세포를 포함한 비-동물 진핵 세포에서의 비-바이러스적 DNA 전달을 기술하는 데에는 "형질전환"이 좀 더 자주 사용됨. 동물 세포에서는, 형질감염이 바람직한 용어인데, 형질전환은 해당 세포에서의 암성 상태로의 진행 (발암)을 지칭하는 데에도 사용되기 때문이다. 바이러스-매개 DNA 전달을 기술하는 데에는 종종 형질도입이 사용된다. 본 출원에서는, 형질전환, 형질도입 및 바이러스 감염이 형질감염의 정의하에 포함된다.

변형된 아미노산

변형된 아미노산은 화학적으로 변형된 것이며, 폴리펩티드 서열의 일부로서 혼입될 수 있다. 아미노산은 번역-후 방식으로, 또는 폴리펩티드 서열에의 혼입 전에 번역 동안 변형될 수 있다.

4CL

4-쿠마레이트:조효소 A 리가제는 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) (생태형 컬럼비아(Columbia)-O)로부터 클로닝된 4CL 유전자로부터 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제는 아라비돕시스 탈리아나 (생태형 컬럼비아-O)로부터 클로닝된 4CL 유전자와 66 % 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자로부터 발현된다. 다른 실시양태에서, 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제는 아라비돕시스 탈리아나 (생태형 컬럼비아-O)로부터 클로닝된 4CL 유전자와 90 % 이상의 서열 유사성을 갖는 유전자로부터 발현된다.

STS

스틸벤 신타제는 포도 (비티스 비니페라 ( Vitis vinifera ))로부터 클로닝된 STS 유전자로부터 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 스틸벤 신타제는 포도 (비티스 비니페라)로부터 클로닝된 STS 유전자와 66 % 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자로부터 발현된다. 다른 실시양태에서, 스틸벤 신타제는 포도 (비티스 비니페 라)로부터 클로닝된 STS 유전자와 90 % 이상의 서열 유사성을 갖는 유전자로부터 발현된다.

ROMT

레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제는 포도 (비티스 비니페라)로부터 클로닝된 유전자로부터 발현된다. 또 다른 실시양태에서, 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제는 포도 (비티스 비니페라)로부터 클로닝된 ROMT 유전자와 66 % 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자로부터 발현된다. 다른 실시양태에서, 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제는 포도 (비티스 비니페라)로부터 클로닝된 ROMT 유전자와 90 % 이상의 서열 유사성을 갖는 유전자로부터 발현된다.

본 개시내용의 실시양태는 세포 시스템에서 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제 (4CL)를 발현시키는 것, 세포 시스템에서 스틸벤 신타제 (STS)를 발현시키는 것, 세포 시스템에서 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제 (ROMT)를 발현시키는 것, p-쿠마르산을 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것, 및 프테로스틸벤을 생성시키는 것을 포함하는, 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법이다.

일 실시양태에서, 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제를 발현시키는 것 및 스틸벤 신타제를 발현시키는 것은 4CL :: STS 융합 유전자를 형질감염시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제를 발현시키는 것은 4CL 유전자를 형질감염시키는 것을 포함하며, 스틸벤 신타제를 발현시키는 것은 별도의 STS 유전자를 형질감염시키는 것을 포함한다. 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제를 발현시키는 것은 ROMT 유전자를 형질감염시키는 것을 포함한다.

세포 시스템은 적어도 박테리아, 효모 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택된다. 또 다른 실시앙태에서, 세포 시스템은 전위 생합성 반응을 가능케 한다.

다른 실시양태는 세포 시스템에서 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제 (ROMT)를 발현시키는 것, 레스베라트롤을 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것, 및 프테로스틸벤을 생성시키는 것을 포함하는, 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법이다.

다른 실시양태는 세포 시스템에서 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제 (4CL)를 발현시키는 것, 세포 시스템에서 스틸벤 신타제 (STS)를 발현시키는 것, p-쿠마르산을 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것, 및 레스베라트롤을 생성시키는 것을 포함하는, 레스베라트롤의 생합성 제조 방법이다.

다른 실시양태는 제1 세포 시스템에서 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제 (4CL)를 발현시키는 것, 제1 세포 시스템에서 스틸벤 신타제 (STS)를 발현시키는 것, p-쿠마르산을 제1 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 제1 세포 시스템을 성장시키는 것, 레스베라트롤을 생성시키는 것, 제2 세포 시스템에서 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제 (ROMT)를 발현시키는 것, 레스베라트롤을 제2 세포 시스템에 공급하는 것, 배지 중에서 제2 세포 시스템을 성장시키는 것, 및 프테로스틸벤을 생성시키는 것을 포함하는, 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법이다.

[ 실시예 ]

재료 및 방법

균주, 플라스미드 및 배양 조건

플라스미드 클로닝에는 HI-컨트롤(control) 10G 및 DH5α를 사용하였으며, 이. 콜라이에서의 재조합 단백질 발현에는 BL21(DE3) (인비트로겐(Invitrogen) 사)을 사용하였다. 효모에서의 단백질 발현에는 Wat11 균주를 사용하였다. p-쿠마르산, 레스베라트롤 및 프테로스틸벤 표준물은 모두 시그마(Sigma) 사로부터 구매하였다. pETite N-His SUMO Kan 벡터는 루시젠(Lucigen) 사 (위스콘신 미들턴 소재)로부터 구매하였다. 플라스미드 pETDuet-1은 노바겐(Novagen) 사로부터 구매하여, 재조합 단백질 발현 목적으로 사용하였다.

DNA 조작

모든 DNA 조작은 표준 절차에 따라 수행하였다. 제한 효소 및 T4 DNA 리가제는 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs) 사로부터 구매하였다. 모든 PCR 증폭 및 클로닝 반응은 푸숀(Phusion)® 하이-피델리티(High-Fidelity) DNA 폴리머라제 뉴 잉글랜드 바이오랩스를 사용하여 수행하였다.

RNA 추출 및 cDNA 합성

다양한 식물 종들로부터 ROMT (레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제), 4CL (4-쿠마레이트:조효소 A 리가제) 및 STS (스틸벤 신타제)를 클로닝하였다. 트리졸 플러스(Trizol Plus) RNA 정제 키트 (인비트로겐 인크)를 사용하여, ROMT 및 STS의 클로닝을 위해 포도 (비티스 비니페라)로부터, 그리고 4CL의 클로닝을 위해 아라비돕시스 탈리아나 (생태형 컬럼비아-O)로부터 식물 총 RNA를 추출하였다. cDNA의 합성은 프로메가 인크(Promega Inc.)의 Im Prom-II™ 역전사 시스템을 사용하여 제조자의 매뉴얼에 따라 수행하였다. 뉴 잉글랜드 바이오랩스 푸숀 PCR 키트를 사용하고 하기 표 1에 열거되어 있는 프라이머들을 사용하여, 합성된 cDNA로부터 유전자들을 증폭하였다.

실시예 1

박테리아 발현 벡터의 구축

ROMT의 PCR 생성물을 제조자의 매뉴얼에 따라 pETite N-His SUMO Kan 벡터 (루시젠 인크)에 클로닝하였다. 서열분석에 의해 올바른 삽입물을 포함하는 생성 플라스미드, 즉 Sumo-ROMT를 확인한 후, 이질 유전자 발현을 위해 BL21(DE3)으로 형질전환시켰다.

4CL::STS 융합 유전자를 구축하기 위해, PCR 증폭 전략을 사용하여 At4CL과 VvSTS를 융합시켰다. 4CL의 중지 코돈을 제거하고, 4CL과 STS의 오픈 리딩 프레임 사이에 3개 아미노산 링커 (Gly-Ser-Gly)를 도입하였다. 이와 같은 구축은 4CL, 트리펩티드 링커 및 STS를 코딩하는 2.87 kb의 융합 유전자 구축물로 이어졌다. pCR8/GW/TOPO TA 클로닝 키트 (인비트로겐 사)를 사용하여 게이트웨이(Gateway) 진입 벡터에 클로닝된 융합 유전자 4CL::STS를 원샷(One Shot) 이. 콜라이 세포로 형질전환시킨 다음, 서열분석하였다. 4CL::STS 융합 유전자를 증폭하고, BamHI/HindIII를 통하여 pETDuet-1 벡터의 다중 클로닝 부위로 클로닝하였고, pETDuet-4CLSTS로 명명하였다. 모든 클로닝 반응을 위한 프라이머들은 표 1에서 볼 수 있다.

실시예 2

효모 발현 벡터의 구축

LR 클로나제 II 효소 혼합물 키트 (인비트로겐 사)에 의해, 4CL::STS 유전자를 에스 . 세레비시아에 (S. cerevisiae ) 어드밴스드 게이트웨이 목표 벡터(destination vector) pAG304GPD-ccdB (애드진(Addgene) 사, 매사추세츠 보스톤 소재)에 도입하고, ROMT 유전자를 또 다른 게이트웨이 목표 벡터 pAG305GPD-ccdB (애드진 사)에 교환하였다. 생성 플라스미드를 pAG304GPD-4CLSTS 및 pAG304GPD-ROMT로 명명하였다. 상기 벡터들은 구성적 프로모터 (GPD) 제어하의 통합 재조합 부위 및 발현 카세트를 포함한다. 발효 검정을 위하여, 이들 벡터를 WAT11로 형질전환시켰다.

효모 형질전환

프로즌(Frozen)-EZ 효모 형질전환 II 키트 (자이모 리서치(Zymo Research) 사, 캘리포니아 오렌지 소재)를 사용하여, 상기 구축물 pAG304GPD-4CLSTS 및 pAG304GPD-ROMT를 대조군으로서의 pAG304GPD-ccdB 및 pAG305GPD-ccdB 벡터와 함께 WAT11 세포로 형질전환시켰다. 벡터들, pAG304GPD-4CLSTS 및 pAG304GPD-ROMT를 효모 WAT11 세포에 공동-형질전환시켰다.

ROMT의 기질 결합 잔기 예측을 위한 상동성 모델링 및 도킹

본 출원인이 아는 바에 따르면, 기질 결합 부위의 분석에 사용될 수 있는 ROMT의 삼차 구조는 존재하지 않는다. 기질 결합 부위를 분석하기 위하여, 출원인은 컴퓨터 프로그램 I-TASSER (문헌 [Ambrish et al., 2010])를 사용하여 ROMT용 모델 (도 9)을 구축하였다. 출원인은 강화된 ROMT의 실험실 진화 및 개발에 분자 생물학과 구조 생물학의 조합된 방법을 적용한다. 기질 결합 부위는 컴퓨터 프로그램 SWISDOCK (문헌 [Grosdidier et al., 2011])을 사용하여 레스베라트롤을 ROMT 모델과 도킹시키는 것에 의해 예측하였다.

이. 콜라이 및 에스 . 세레비시아에 에서의 4CL :: STS 융합 단백질의 단백질을 사용한 p -쿠마르산의 레스베라트롤로의 생물전환

이. 콜라이 균주의 단일 집락을 100 ㎍/mL의 암피실린을 포함하는 3 mL의 LB 배지에서 37 ℃로 밤새 성장시킨 다음, 100 ㎍/mL의 암피실린을 포함하는 50 mL의 M9 변형 배지로 시드 배양물을 옮겼다. pETDuet-4CLSTS 벡터를 포함하는 이. 콜라이 BL21(DE3)을 변형 M9 배지에서 OD600이 0.6에 도달할 때까지 37 ℃, 200 rpm으로 진탕하면서 유지한 다음, 1 mM의 IPTG를 첨가하고, IPTG를 사용한 2시간 유도 후, p-쿠마르산을 100 % 에탄올에 용해시켜 0.5 g/L로 배양물에 첨가하였다. 배양물을 동일한 배양 조건하에 진탕하여 유지하면서, HPLC 분석을 위한 간격으로 샘플을 채취하였다.

pAG304GPD-4CLSTS 플라스미드를 포함하는 Wat11 세포를 OD600이 0.2에 도달할 때까지 SD 적하(drop out) 배지에서 30 ℃로 성장시킨 다음, p-쿠마르산 (0.5 g/L)을 첨가하였다. 배양물을 동일한 배양 조건하에 4일 동안 진탕 유지하면서, HPLC 분석을 위한 간격으로 샘플을 채취하였다.

이. 콜라이 및 에스 . 세레비시아에 에서의 ROMT 단백질을 사용한 레스베라트롤의 프테로스틸벤으로의 생물전환

SUMO-RMOT 벡터를 포함하는 이. 콜라이 BL21(DE3)을 변형 M9 배지에서 OD600이 0.6에 도달할 때까지 37 ℃로 성장시킨 다음, 1 mM의 IPTG를 첨가하고, IPTG를 사용한 2시간 유도 후, DMSO에 용해시킨 레스베라트롤을 0.228 g/L로 배양물에 첨가하였다. M9 배지는 표준 M9 배지에의 효모 추출물 (1.25 g/L) 및 글리세롤 (0.5 % v/v)의 첨가에 의해 변형시켰다. 배양물을 동일한 배양 조건하에 진탕하여 유지하면서, HPLC 분석을 위한 간격으로 샘플을 채취하였다.

pAG305GPD-RMOT 플라스미드를 포함하는 Wat11 세포를 OD600이 0.2에 도달할 때까지 표준 효모 적하 배지에서 30 ℃로 성장시킨 다음, 레스베라트롤산 (0.228 g/L)을 첨가하였다. 배양물을 동일한 배양 조건하에 진탕하여 유지하면서, HPLC 분석을 위한 간격으로 샘플을 채취하였다.

이. 콜라이 및 에스 . 세레비시아에 에서의 ROMT와 4CL :: STS 융합 단백질의 단백질을 사용한 p -쿠마르산의 프테로스틸벤으로의 생물전환

pETDuet-4CLSTS 및 SUMO-ROMT 벡터를 포함하는 이. 콜라이 BL21(DE3)을 변형 M9 배지에서 OD600이 0.6에 도달할 때까지 37 ℃로 성장시킨 다음, 1 mM의 IPTG를 첨가하고, IPTG를 사용한 2시간 유도 후, 100 % 에탄올에 용해시킨 p-쿠마르산을 0.5 g/L로 배양물에 첨가하였다. 배양물을 동일한 배양 조건하에 진탕하여 유지하면서, HPLC 분석을 위한 간격으로 샘플을 채취하였다.

pAG304GPD-4CLSTS 및 pAG305GPD-ROMT 플라스미드를 포함하는 Wat11 세포를 OD600이 0.2에 도달할 때까지 SD 적하 배지에서 30 ℃로 성장시킨 다음, p-쿠마르산 (0.5 g/L)을 첨가하였다. 배양물을 동일한 배양 조건하에 진탕하여 유지하면서, HPLC 분석을 위한 간격으로 샘플을 채취하였다.

생성물의 추출

800 ul의 에틸 아세테이트를 사용하여 배양물 분취량 (400 ul)을 추출하였다. 실온에서 에펜도르프 배큐퓨지(Eppendorf Vacufuge) (에펜도르프 사이언티픽(Eppendorf Scientific) 사, 뉴욕 웨스트베리 소재)를 사용하여 추출물을 증발시켜 건조하고, 80 % (v/v) 메탄올 200 ul에 재-용해시켰다.

HPLC 분석

레스베라트롤 및 프테로스틸벤의 HPLC 분석은 디오넥스 얼티메이트(Dionex Ultimate) 3000 시스템을 사용하여 수행하였다. 중간체는 0.1 % (vol/vol) 포름산 (용액 A) 및 100 % 아세토니트릴 (용액 B)을 사용하는 페노메넥스 키네텍스(phenomenex Kinetex) C18 컬럼 (입자 크기 2.6 ㎛; 150×4.6 mm)에서의 역상 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 샘플은 80 % 메탄올에 희석하였으며, 하기의 구배 절차를 사용하였다: 0.8 ml/분의 유량으로, 2분 동안 용액 B 10 %; 18분 동안 용액 B 10 %로부터 70 %로의 선형 구배; 1분 동안 용액 B 70 %로부터 30 %로; 2분 동안 용액 B 30 %로부터 10 %로; 5분 동안 용액 B 10 %. 정량을 위하여, 모든 중간체는 외부 표준을 사용하여 보정하였다. 화합물들은 그의 체류 시간은 물론, 시스템 내 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 확인되는 상응 스펙트럼에 의해 확인하였다.

결과

4CL과 STS의 융합 단백질을 사용한 p -쿠마르산의 레스베라트롤로의 생물전환

3종의 표준물을 HPLC로 전개하였는데, 그들이 우수하게 분리되었음을 나타내었다 (도 2). PCR 증폭 전략을 사용하여, 4CL과 STS 사이의 Gly-Ser-Gly 링커와 함께 4CL과 STS를 융합시켰다. 출원인은 플라스크 내 변형 M9 배지에서 pETDuet-4CLSTS 플라스미드를 포함하는 이. 콜라이 BL21(DE3) 균주를 사용하여 p-쿠마르산의 레스베라트롤로의 전환을 시험하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, p-쿠마르산은 변형 M9 배지 중에서 레스베라트롤로 전환될 수 있었다.

생체내 효모 검정을 위하여, pAG304GPD-4CLSTS를 포함하는 새로운 효모 집락을 0.5 g/L의 p-쿠마르산을 함유하는 3 ml의 효모 적하 배지에서 30 ℃로 4일 동안 성장시켰다. 추출물을 HPLC에 의해 분석하였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 거의 모든 p-쿠마르산이 4일 이내에 레스베라트롤로 전환되었다. 이 . 콜라이와 비교할 때, 효모에서의 전환 효율이 훨씬 더 우수하였다.

ROMT 단백질을 사용한 레스베라트롤의 프테로스틸벤으로의 생물전환

도 4에 나타낸 바와 같이, ROMT의 발현과 함께 이. 콜라이의 배양물에 공급된 레스베라트롤은 플라스크에서 프테로스틸벤으로 전환되었다. HPLC 분석은 레스베라트롤이 플라스크에서 프테로스틸벤으로 전환될 수 있음을 표시하고 있다. 그러나, 또 다른 미지의 피크가 존재하는데, 레스베라트롤상에 부가된 메틸 기 중 하나일 가능성이 있다. 유사한 결과가 효모에서도 수득되었다 (도 7).

4CL :: STS 및 ROMT 공동-발현을 사용한 p-쿠마르산의 프테로스틸벤으로의 생물전환

4CL::STS와 ROMT의 공동-발현과 함께 이. 콜라이 및 에스 . 세레비시아에의 배양물에 p-쿠마르산을 공급하였는데, 도 5 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 이. 콜라이 및 에스. 세레비시아에에서의 24시간을 사용한 HPLC에 의하면 p-쿠마르산이 플라스크에서 레스베라트롤 및 프테로스틸벤으로 전환되었다. HPLC의 프로파일은 96시간 이내 조건하에서 수득하였다.

ROMT의 통상적 및 포화 돌연변이유발

기질 결합 부위에 대한 신중한 분석 후, 아미노산 잔기 167, 174, 258 및 261을 ROMT의 활성을 향상시키기 위한 포화 돌연변이유발용으로 선택하였다. 본 출원인은 효소 활성에 대한 그의 효과를 알아보기 위하여 ROMT의 F167A, D174A, W258A 및 H261A 돌연변이를 구축하기 위한 통상적 돌연변이유발을 미리 수행하였다. 매우 낮은 활성을 나타내었던 D174A를 제외하고는, 그들 중 어느 것도 활성을 나타내지 않았다 (도 10). 이와 같은 결과는 부위 167, 174, 258 및 261의 아미노산 잔기가 기질 결합 및 촉매 활성에 중요하다는 것을 시사한다. 따라서, 다음 단계에서, 출원인은 ROMT의 효소 활성을 향상시키기 위한 부위-지정 포화 돌연변이유발을 수행할 것이다. 포화 돌연변이유발은 일 아미노산을 다른 대안적인 19종 아미노산 잔기로 변경하는 것을 가능케 한다. 출원인은 NNK 축중성 프라이머 (N은 A, T, G, C의 혼합물을, K는 G/T를 표시함)를 사용하는 변형된 퀵체인지(QuickChange) 부위-지정 돌연변이유발 전략 (스트라타진(Stratagene) 사, 캘리포니아 소재)에 따르는 것에 의해, ROMT의 부위 167, 174, 258 및 261에서의 포화 돌연변이유발을 수행할 것이다. 상기 코돈 NNK는 32-배의 축중성을 가지며 희귀 코돈 없이 20종의 아미노산 모두를 코딩한다. PCR 혼합물 (25 μl)은 60 ng의 Sumo-ROMT DNA 주형, 200 μM의 dNTPS, 0.5 μM의 정방향 프라이머, 0.5 μM의 역방향 프라이머, 5 % DMSO 및 0.3 μl의 폴리머라제를 함유하는 푸숀 HF 완충제로 이루어졌다. PCR은 25 주기에 걸쳐 98 ℃에서 20초 동안 변성시키고, 58 ℃에서 30초 동안 어닐링한 후, 이어서 72 ℃에서 2분 30초 동안 신장시키는 것에 의해 수행하였다. 아가로스 겔 전기영동에 의해 퀵체인지 PCR 생성물을 조사한 다음, 37 ℃에서 4시간 동안 1 μl의 DpnI (뉴 잉글랜드 바이오랩스 사)를 사용하여 15 μl의 PCR 생성물을 분해함으로써, 주형 플라스미드를 제거하였다. 분취량 (2 μl)의 분해 생성물을 50 μl의 BL21(DE3) 적격 세포 (스트라타진 사, 캘리포니아 소재)에 첨가하고, 얼음상에서 30분 동안 유지하였다. 이후, 42 ℃에서 20초 동안 열 충격을 수행하고, 얼음상에서 2분 동안 유지한 다음, 500 μl의 SOC 배지를 첨가하고, 37 ℃에서 1시간 동안 세포를 성장시켰다. 세포를 5000 rpm으로 몇 분 동안 원심분리하고, 450 μl의 상청액을 폐기한 후, 나머지 SOC 배지를 사용하여 세포를 재현탁하고, 카나마이신 (50 ㎍/ml)을 함유하는 루리아-베르타니(Luria-Bertani) (LB) 아가 플레이트상에 접종하였다. 플라스미드를 단리하고 DNA를 서열분석함으로써, 돌연변이를 확인할 것이다. DNA 서열분석에 의해 라이브러리의 품질을 확인할 것이다.

<표 1> 본 연구에 사용된 프라이머

동일성 및 유사성

동일성은 서열 정렬 (서열 정보만, 또는 구조 정보 또는 소정의 다른 정보를 사용하여 수행될 수 있지만, 보통은 서열 정보만을 바탕으로 함) 후 서열 쌍 사이에서 동일한 아미노산의 비율이며, 유사성은 소정의 유사성 행렬을 사용한 정렬을 바탕으로 하여 할당되는 점수이다. 유사성 지수는 BLOSUM62, PAM250 또는 GONNET, 또는 단백질 서열 정렬에 통상의 기술자가 사용하는 임의의 행렬에 따르는 임의의 것일 수 있다.

동일성은 2종 하위-서열들 사이의 대응 정도이다 (서열들 사이에 갭 없음). 25 % 이상의 동일성은 기능의 유사성을 시사하는 한편, 18-25 %는 구조 또는 기능의 유사성을 시사한다. 2종의 완전히 무관하거나 무작위인 서열들 (100개 잔기 초과)이 20 %를 초과하는 동일성을 가질 수 있다는 것에 유념해야 한다. 유사성은 그들이 비교되었을 경우의 2종 서열 사이의 유사 정도이다. 이것은 그의 동일성에 의존한다.

전기의 상세한 설명에서 드러나는 바와 같이, 본 개시내용의 소정 측면들이 본원에서 예시되는 예들의 구체적인 세부사항에 의해 제한되는 것은 아니며, 그에 따라 그의 다른 변형 및 적용 또는 등가물들이 통상의 기술자에게 고려될 것으로 생각된다. 따라서, 청구범위는 본 개시내용의 기술사상 및 영역에서 벗어나지 않는 모든 그와 같은 변형 및 적용들을 포괄하고자 한다.

또한, 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 바람직한 방법 및 물질들이 상기에서 기술되기는 하였지만, 본 개시내용의 실시 또는 시험에는, 본원에서 기술되는 것들과 유사하거나 그에 등가인 어떠한 방법 및 물질들도 사용될 수 있다.

본 개시내용의 다른 측면, 목적 및 장점들은 도면, 개시내용 및 첨부된 청구범위의 연구로부터 얻을 수 있다.

[참고문헌]

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Vitis vinifera <400> 17 Met Ala Ser Val Glu Glu Phe Arg Asn Ala Gln Arg Ala Lys Gly Pro 1 5 10 15 Ala Thr Ile Leu Ala Ile Gly Thr Ala Thr Pro Asp His Cys Val Tyr 20 25 30 Gln Ser Asp Tyr Ala Asp Tyr Tyr Phe Lys Val Thr Lys Ser Glu His 35 40 45 Met Thr Ala Leu Lys Lys Lys Phe Asn Arg Ile Cys Asp Lys Ser Met 50 55 60 Ile Lys Lys Arg Tyr Ile His Leu Thr Glu Glu Met Leu Glu Glu His 65 70 75 80 Pro Asn Ile Gly Ala Tyr Met Ala Pro Ser Leu Asn Ile Arg Gln Glu 85 90 95 Ile Ile Thr Ala Glu Val Pro Lys Leu Gly Lys Glu Ala Ala Leu Lys 100 105 110 Ala Leu Lys Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile Thr His Leu Val 115 120 125 Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Glu Met Pro Gly Ala Asp Tyr Lys Leu 130 135 140 Ala Asn Leu Leu Gly Leu Glu Pro Ser Val Arg Arg Val Met Leu Tyr 145 150 155 160 His Gln Gly Cys Tyr Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg Thr Ala Lys Asp 165 170 175 Leu Ala Glu Asn Asn Ala Gly Ala Arg Val Leu Val Val Cys Ser Glu 180 185 190 Ile Thr Val Val Thr Phe Arg Gly Pro Ser Glu Asp Ala Leu Asp Ser 195 200 205 Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ser Ala Ala Val Ile Val 210 215 220 Gly Ser Asp Pro Asp Ile Ser Ile Glu Arg Pro Leu Phe Gln Leu Val 225 230 235 240 Ser Ala Ala Gln Thr Phe Ile Pro Asn Ser Ala Gly Ala Ile Ala Gly 245 250 255 Asn Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr Phe His Leu Trp Pro Asn Val Pro 260 265 270 Thr Leu Ile Ser Glu Asn Val Glu Lys Cys Leu Thr Gln Ala Phe Asp 275 280 285 Pro Leu Gly Ile Ser Asp Trp Asn Ser Leu Phe Trp Ile Ala His Pro 290 295 300 Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Ala Val Glu Ala Lys Leu Asn Leu Asp 305 310 315 320 Lys Lys Lys Leu Glu Ala Thr Arg His Val Leu Ser Glu Tyr Gly Asn 325 330 335 Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Leu Asp Glu Met Arg Lys Lys 340 345 350 Ser Leu Lys Gly Glu Arg Ala Thr Thr Gly Glu Gly Leu Asp Trp Gly 355 360 365 Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Ile Glu Thr Val Val Leu 370 375 380 His Ser Ile Pro Met Val Thr Asn 385 390 <210> 18 <211> 2871 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion gene <400> 18 atggcgccac aagaacaagc agtttctcag gtgatggaga aacagagcaa caacaacaac 60 agtgacgtca ttttccgatc aaagttaccg gatatttaca tcccgaacca cctatctctc 120 cacgactaca tcttccaaaa catctccgaa ttcgccacta agccttgcct aatcaacgga 180 ccaaccggcc acgtgtacac ttactccgac gtccacgtca tctcccgcca aatcgccgcc 240 aattttcaca aactcggcgt taaccaaaac gacgtcgtca tgctcctcct cccaaactgt 300 cccgaattcg tcctctcttt cctcgccgcc tccttccgcg gcgcaaccgc caccgccgca 360 aaccctttct tcactccggc ggagatagct aaacaagcca aagcctccaa caccaaactc 420 ataatcaccg aagctcgtta cgtcgacaaa atcaaaccac ttcaaaacga cgacggagta 480 gtcatcgtct gcatcgacga caacgaatcc gtgccaatcc ctgaaggctg cctccgcttc 540 accgagttga ctcagtcgac aaccgaggca tcagaagtca tcgactcggt ggagatttca 600 ccggacgacg tggtggcact accttactcc tctggcacga cgggattacc aaaaggagtg 660 atgctgactc acaagggact agtcacgagc gttgctcagc aagtcgacgg cgagaacccg 720 aatctttatt tccacagcga tgacgtcata ctctgtgttt tgcccatgtt tcatatctac 780 gctttgaact cgatcatgtt gtgtggtctt agagttggtg cggcgattct gataatgccg 840 aagtttgaga tcaatctgct attggagctg atccagaggt gtaaagtgac ggtggctccg 900 atggttccgc cgattgtgtt ggccattgcg aagtcttcgg agacggagaa gtatgatttg 960 agctcgataa gagtggtgaa atctggtgct gctcctcttg gtaaagaact tgaagatgcc 1020 gttaatgcca agtttcctaa tgccaaactc ggtcagggat acggaatgac ggaagcaggt 1080 ccagtgctag caatgtcgtt aggttttgca aaggaacctt ttccggttaa gtcaggagct 1140 tgtggtactg ttgtaagaaa tgctgagatg aaaatagttg atccagacac cggagattct 1200 ctttcgagga atcaacccgg tgagatttgt attcgtggtc accagatcat gaaaggttac 1260 ctcaacaatc cggcagctac agcagagacc attgataaag acggttggct tcatactgga 1320 gatattggat tgatcgatga cgatgacgag cttttcatcg ttgatcgatt gaaagaactt 1380 atcaagtata aaggttttca ggtagctccg gctgagctag aggctttgct catcggtcat 1440 cctgacatta ctgatgttgc tgttgtcgca atgaaagaag aagcagctgg tgaagttcct 1500 gttgcatttg tggtgaaatc gaaggattcg gagttatcag aagatgatgt gaagcaattc 1560 gtgtcgaaac aggttgtgtt ttacaagaga atcaacaaag tgttcttcac tgaatccatt 1620 cctaaagctc catcagggaa gatattgagg aaagatctga gggcaaaact agcaaatgga 1680 ttgggatctg gcatggcttc agtcgaggaa tttagaaacg ctcaacgtgc caagggtccg 1740 gccaccatcc tagccattgg cacagctacc cccgaccact gtgtctacca gtctgattat 1800 gctgattact atttcaaggt cactaagagc gagcacatga ctgcgttgaa gaagaagttc 1860 aatcgcatat gtgacaaatc catgatcaag aagcgttaca ttcatttgac cgaagaaatg 1920 cttgaggagc acccaaacat tggtgcttat atggctccat ctcttaacat acgccaagag 1980 attatcactg ctgaggtacc caagctcggt aaggaagcag cattgaaggc tcttaaagag 2040 tggggtcagc ctaaatcgaa gatcacccac cttgtatttt gtaccacctc aggtgtagaa 2100 atgcctggtg cagattataa actcgctaat cttttaggcc tcgaaccatc tgtcagaaga 2160 gtgatgttgt accatcaagg gtgctatgca ggtggaactg tccttcgaac cgctaaggat 2220 cttgcagaga ataatgcagg agcacgagtt cttgtggtgt gctctgagat cacagttgtt 2280 acatttcgcg gcccttccga agatgctttg gactctttag ttggccaagc cctttttggt 2340 gatggttctg cagctgtaat cgtaggatca gatccggata tctcaattga acgaccactc 2400 ttccagcttg tctcagcagc ccaaacattt attcctaatt ctgcaggtgc cattgcagga 2460 aacttacgtg aggtgggact cacctttcat ttgtggccca atgtgcccac tttaatttct 2520 gagaacgtag agaaatgttt gactcaggct tttgacccac ttggtattag cgattggaac 2580 tcgttatttt ggattgctca cccaggtggc cctgcaattc ttgatgcagt tgaagcaaaa 2640 ctcaatttag ataaaaagaa actcgaagca acgaggcatg tgttaagtga gtatggaaac 2700 atgtcaagtg catgtgtgtt gtttattttg gatgagatga gaaagaaatc ccttaagggg 2760 gagagggcca ccacgggtga aggattggat tggggagtat tattcggttt tggaccaggc 2820 ttgactattg aaactgttgt gttgcatagc attcctatgg ttacaaatta a 2871 <210> 19 <211> 956 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion protein <400> 19 Met Ala Pro Gln Glu Gln Ala Val Ser Gln Val Met Glu Lys Gln Ser 1 5 10 15 Asn Asn Asn Asn Ser Asp Val Ile Phe Arg Ser Lys Leu Pro Asp Ile 20 25 30 Tyr Ile Pro Asn His Leu Ser Leu His Asp Tyr Ile Phe Gln Asn Ile 35 40 45 Ser Glu Phe Ala Thr Lys Pro Cys Leu Ile Asn Gly Pro Thr Gly His 50 55 60 Val Tyr Thr Tyr Ser Asp Val His Val Ile Ser Arg Gln Ile Ala Ala 65 70 75 80 Asn Phe His Lys Leu Gly Val Asn Gln Asn Asp Val Val Met Leu Leu 85 90 95 Leu Pro Asn Cys Pro Glu Phe Val Leu Ser Phe Leu Ala Ala Ser Phe 100 105 110 Arg Gly Ala Thr Ala Thr Ala Ala Asn Pro Phe Phe Thr Pro Ala Glu 115 120 125 Ile Ala Lys Gln Ala Lys Ala Ser Asn Thr Lys Leu Ile Ile Thr Glu 130 135 140 Ala Arg Tyr Val Asp Lys Ile Lys Pro Leu Gln Asn Asp Asp Gly Val 145 150 155 160 Val Ile Val Cys Ile Asp Asp Asn Glu Ser Val Pro Ile Pro Glu Gly 165 170 175 Cys Leu Arg Phe Thr Glu Leu Thr Gln Ser Thr Thr Glu Ala Ser Glu 180 185 190 Val Ile Asp Ser Val Glu Ile Ser Pro Asp Asp Val Val Ala Leu Pro 195 200 205 Tyr Ser Ser Gly Thr Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Met Leu Thr His 210 215 220 Lys Gly Leu Val Thr Ser Val Ala Gln Gln Val Asp Gly Glu Asn Pro 225 230 235 240 Asn Leu Tyr Phe His Ser Asp Asp Val Ile Leu Cys Val Leu Pro Met 245 250 255 Phe His Ile Tyr Ala Leu Asn Ser Ile Met Leu Cys Gly Leu Arg Val 260 265 270 Gly Ala Ala Ile Leu Ile Met Pro Lys Phe Glu Ile Asn Leu Leu Leu 275 280 285 Glu Leu Ile Gln Arg Cys Lys Val Thr Val Ala Pro Met Val Pro Pro 290 295 300 Ile Val Leu Ala Ile Ala Lys Ser Ser Glu Thr Glu Lys Tyr Asp Leu 305 310 315 320 Ser Ser Ile Arg Val Val Lys Ser Gly Ala Ala Pro Leu Gly Lys Glu 325 330 335 Leu Glu Asp Ala Val Asn Ala Lys Phe Pro Asn Ala Lys Leu Gly Gln 340 345 350 Gly Tyr Gly Met Thr Glu Ala Gly Pro Val Leu Ala Met Ser Leu Gly 355 360 365 Phe Ala Lys Glu Pro Phe Pro Val Lys Ser Gly Ala Cys Gly Thr Val 370 375 380 Val Arg Asn Ala Glu Met Lys Ile Val Asp Pro Asp Thr Gly Asp Ser 385 390 395 400 Leu Ser Arg Asn Gln Pro Gly Glu Ile Cys Ile Arg Gly His Gln Ile 405 410 415 Met Lys Gly Tyr Leu Asn Asn Pro Ala Ala Thr Ala Glu Thr Ile Asp 420 425 430 Lys Asp Gly Trp Leu His Thr Gly Asp Ile Gly Leu Ile Asp Asp Asp 435 440 445 Asp Glu Leu Phe Ile Val Asp Arg Leu Lys Glu Leu Ile Lys Tyr Lys 450 455 460 Gly Phe Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ala Leu Leu Ile Gly His 465 470 475 480 Pro Asp Ile Thr Asp Val Ala Val Val Ala Met Lys Glu Glu Ala Ala 485 490 495 Gly Glu Val Pro Val Ala Phe Val Val Lys Ser Lys Asp Ser Glu Leu 500 505 510 Ser Glu Asp Asp Val Lys Gln Phe Val Ser Lys Gln Val Val Phe Tyr 515 520 525 Lys Arg Ile Asn Lys Val Phe Phe Thr Glu Ser Ile Pro Lys Ala Pro 530 535 540 Ser Gly Lys Ile Leu Arg Lys Asp Leu Arg Ala Lys Leu Ala Asn Gly 545 550 555 560 Leu Gly Ser Gly Met Ala Ser Val Glu Glu Phe Arg Asn Ala Gln Arg 565 570 575 Ala Lys Gly Pro Ala Thr Ile Leu Ala Ile Gly Thr Ala Thr Pro Asp 580 585 590 His Cys Val Tyr Gln Ser Asp Tyr Ala Asp Tyr Tyr Phe Lys Val Thr 595 600 605 Lys Ser Glu His Met Thr Ala Leu Lys Lys Lys Phe Asn Arg Ile Cys 610 615 620 Asp Lys Ser Met Ile Lys Lys Arg Tyr Ile His Leu Thr Glu Glu Met 625 630 635 640 Leu Glu Glu His Pro Asn Ile Gly Ala Tyr Met Ala Pro Ser Leu Asn 645 650 655 Ile Arg Gln Glu Ile Ile Thr Ala Glu Val Pro Lys Leu Gly Lys Glu 660 665 670 Ala Ala Leu Lys Ala Leu Lys Glu Trp Gly Gln Pro Lys Ser Lys Ile 675 680 685 Thr His Leu Val Phe Cys Thr Thr Ser Gly Val Glu Met Pro Gly Ala 690 695 700 Asp Tyr Lys Leu Ala Asn Leu Leu Gly Leu Glu Pro Ser Val Arg Arg 705 710 715 720 Val Met Leu Tyr His Gln Gly Cys Tyr Ala Gly Gly Thr Val Leu Arg 725 730 735 Thr Ala Lys Asp Leu Ala Glu Asn Asn Ala Gly Ala Arg Val Leu Val 740 745 750 Val Cys Ser Glu Ile Thr Val Val Thr Phe Arg Gly Pro Ser Glu Asp 755 760 765 Ala Leu Asp Ser Leu Val Gly Gln Ala Leu Phe Gly Asp Gly Ser Ala 770 775 780 Ala Val Ile Val Gly Ser Asp Pro Asp Ile Ser Ile Glu Arg Pro Leu 785 790 795 800 Phe Gln Leu Val Ser Ala Ala Gln Thr Phe Ile Pro Asn Ser Ala Gly 805 810 815 Ala Ile Ala Gly Asn Leu Arg Glu Val Gly Leu Thr Phe His Leu Trp 820 825 830 Pro Asn Val Pro Thr Leu Ile Ser Glu Asn Val Glu Lys Cys Leu Thr 835 840 845 Gln Ala Phe Asp Pro Leu Gly Ile Ser Asp Trp Asn Ser Leu Phe Trp 850 855 860 Ile Ala His Pro Gly Gly Pro Ala Ile Leu Asp Ala Val Glu Ala Lys 865 870 875 880 Leu Asn Leu Asp Lys Lys Lys Leu Glu Ala Thr Arg His Val Leu Ser 885 890 895 Glu Tyr Gly Asn Met Ser Ser Ala Cys Val Leu Phe Ile Leu Asp Glu 900 905 910 Met Arg Lys Lys Ser Leu Lys Gly Glu Arg Ala Thr Thr Gly Glu Gly 915 920 925 Leu Asp Trp Gly Val Leu Phe Gly Phe Gly Pro Gly Leu Thr Ile Glu 930 935 940 Thr Val Val Leu His Ser Ile Pro Met Val Thr Asn 945 950 955

Claims

세포 시스템에서 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제 (4CL)를 발현시키는 것;
세포 시스템에서 스틸벤 신타제 (STS)를 발현시키는 것;
세포 시스템에서 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제 (ROMT)를 발현시키는 것;
p-쿠마르산을 세포 시스템에 공급하는 것;
배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것; 및
프테로스틸벤을 생성시키는 것
을 포함하는, 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제가 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana) (생태형 컬럼비아(Columbia)-O)로부터 클로닝된 4CL 유전자로부터 발현되는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제2항에 있어서, 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제가 아라비돕시스 탈리아나 (생태형 컬럼비아-O)로부터 클로닝된 4CL 유전자와 66 % 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자로부터 발현되는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제2항에 있어서, 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제가 아라비돕시스 탈리아나 (생태형 컬럼비아-O)로부터 클로닝된 4CL 유전자와 90 % 이상의 서열 유사성을 갖는 유전자로부터 발현되는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, 스틸벤 신타제가 포도 (비티스 비니페라 ( Vitis vinifera ))로부터 클로닝된 STS 유전자로부터 발현되는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제5항에 있어서, 스틸벤 신타제가 포도 (비티스 비니페라)로부터 클로닝된 STS 유전자와 66 % 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자로부터 발현되는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제5항에 있어서, 스틸벤 신타제가 포도 (비티스 비니페라)로부터 클로닝된 STS 유전자와 90 % 이상의 서열 유사성을 갖는 유전자로부터 발현되는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제가 포도 (비티스 비니페 라)로부터 클로닝된 유전자로부터 발현되는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제8항에 있어서, 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제가 포도 (비티스 비니페 라)로부터 클로닝된 ROMT 유전자와 66 % 이상의 서열 동일성을 갖는 유전자로부터 발현되는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제8항에 있어서, 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제가 포도 (비티스 비니페 라)로부터 클로닝된 ROMT 유전자와 90 % 이상의 서열 유사성을 갖는 유전자로부터 발현되는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제8항에 있어서, 발현되는 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제가 잔기 167, 174, 258, 261 및 이들의 조합으로 이루어진 목록에서 선택되는 그의 잔기들 중 하나 이상에서 대안적인 아미노산 또는 변형된 아미노산으로 변형되며, 변형된 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제는 레스베라트롤을 프테로스틸벤으로 전환시키는 데에 있어서 변형되지 않은 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제에 비해 증가된 활성을 나타내는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제를 발현시키는 것 및 스틸벤 신타제를 발현시키는 것이 4CL :: STS 융합 유전자를 형질감염시키는 것을 포함하는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제를 발현시키는 것이 4CL 유전자를 형질감염시키는 것을 포함하는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, 스틸벤 신타제를 발현시키는 것이 STS 유전자를 형질감염시키는 것을 포함하는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제를 발현시키는 것이 ROMT 유전자를 형질감염시키는 것을 포함하는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, 세포 시스템이 적어도 박테리아, 효모, 식물 세포, 동물 세포 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, 세포 시스템이 전위 생합성 반응을 가능케 하는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
제1항에 있어서, 세포 시스템이 시험관내 번역 시스템을 포함하는 것인 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
세포 시스템에서 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제 (ROMT)를 발현시키는 것;
레스베라트롤을 세포 시스템에 공급하는 것;
배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것; 및
프테로스틸벤을 생성시키는 것
을 포함하는, 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.
세포 시스템에서 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제 (4CL)를 발현시키는 것;
세포 시스템에서 스틸벤 신타제 (STS)를 발현시키는 것;
p-쿠마르산을 세포 시스템에 공급하는 것;
배지 중에서 세포 시스템을 성장시키는 것; 및
레스베라트롤을 생성시키는 것
을 포함하는, 레스베라트롤의 생합성 제조 방법.
제1 세포 시스템에서 4-쿠마레이트:조효소 A 리가제 (4CL)를 발현시키는 것,
제1 세포 시스템에서 스틸벤 신타제 (STS)를 발현시키는 것,
p-쿠마르산을 제1 세포 시스템에 공급하는 것,
배지 중에서 제1 세포 시스템을 성장시키는 것,
레스베라트롤을 생성시키는 것,
제2 세포 시스템에서 레스베라트롤 O-메틸트랜스퍼라제 (ROMT)를 발현시키는 것,
레스베라트롤을 제2 세포 시스템에 공급하는 것,
배지 중에서 제2 세포 시스템을 성장시키는 것, 및
프테로스틸벤을 생성시키는 것
을 포함하는, 프테로스틸벤의 생합성 제조 방법.