ES2745092T3 - Métodos de uso de O-metiltransferasa para la producción biosintética de pterostilbeno - Google Patents

Métodos de uso de O-metiltransferasa para la producción biosintética de pterostilbeno Download PDF

Info

Publication number
ES2745092T3
ES2745092T3 ES14858679T ES14858679T ES2745092T3 ES 2745092 T3 ES2745092 T3 ES 2745092T3 ES 14858679 T ES14858679 T ES 14858679T ES 14858679 T ES14858679 T ES 14858679T ES 2745092 T3 ES2745092 T3 ES 2745092T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
gene
preparing
resveratrol
cellular system
biosynthetic method
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14858679T
Other languages
English (en)
Inventor
Mohammad Bhuiya
Yechun Wang
Xiaodan Yu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Conagen Inc
Original Assignee
Conagen Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Conagen Inc filed Critical Conagen Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2745092T3 publication Critical patent/ES2745092T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1003—Transferases (2.) transferring one-carbon groups (2.1)
    • C12N9/1007—Methyltransferases (general) (2.1.1.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y203/00—Acyltransferases (2.3)
    • C12Y203/01—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
    • C12Y203/01095—Trihydroxystilbene synthase (2.3.1.95)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01012—4-Coumarate-CoA ligase (6.2.1.12)

Abstract

Un método biosintético para preparar pteroestilbeno que comprende: expresar una 4-cumarato:coenzima A ligasa (4CL) en un sistema celular; expresar una estilbeno sintasa (STS) en el sistema celular; expresar una resveratrol O-metiltransferasa (ROMT) en el sistema celular; alimentar ácido p-cumárico al sistema celular; cultivar el sistema celular en un medio; y producir pteroestilbeno.

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de uso de O-metiltransferasa para la producción biosintética de pterostilbeno
Campo técnico
Esta descripción tiene aplicabilidad en las industrias alimentarias, médicas y farmacéuticas. Esta descripción se refiere, generalmente, a métodos para la producción biosintética de pteroestilbeno con el uso de O-metiltransferasa (ROMT). Antecedentes de ladescripción
Técnicaanterior: El pteroestilbeno es un estilbenoide relacionado químicamente con el resveratrol y se encuentra en los arándanos y las uvas. Pertenece al grupo de fitoalexinas, agentes producidos por plantas para combatir infecciones. Basándose en estudios con animales, se cree que tiene propiedades antineoplásicas, antihipercolesterolémicas, antihipertriglicéridémicas, así como la capacidad de combatir y revertir el declive cognitivo. Se cree que el compuesto también tiene propiedades antidiabéticas, pero hasta el momento se ha estudiado muy poco sobre este problema.
Schmidlin y col. han informado que la resveratrol O-metiltransferasa (ROMT) podría catalizar la conversión directa de resveratrol en pteroestilbeno (Schmidli y col, 2008). (N.° de registro: FM178870). El pteroestilbeno se produce por la acción de la 4-cumarato-CoA ligasa (4CL), estilbeno sintasa (STS) y resveratrol O-metiltransferasa (ROMT) (Figura 1). La publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2009/124966 A2 describe un método para preparar un estilbeno, por ejemplo, reservatrol o piceatanol.
La publicación de solicitud de patente internacional n.° WO 2008/009728 A1 describe un microorganismo genéticamente modificado que tiene una ruta metabólica funcional que produce cinamoil-CoA y su uso para producir pinosilvina a partir de los mismos por acción de una estilbeno sintasa.
Watts y col., 2006, BMC Biotechnology 6:22, páginas 1 a 12 describen la biosíntesis de policétidos de estilbeno específicos de plantas en Escherichiacoli metabólicamente modificada.
En la presente memoria, los solicitantes demuestran que la ROMT puede expresarse en un sistema celular junto con 4CL y STS para convertir el resveratrol en pteroestilbeno.
Breve resumende la descripción
La presente invención se refiere al objeto definido en las reivindicaciones adjuntas.
La descripción resuelve el problema técnico de producir pteroestilbeno en un sistema celular, tal como levadura o bacterias. Los solicitantes han aislado exclusivamente los genes de 4-cumarato:coenzima A ligasa (4CL), estilbeno sintasa (STS) y resveratrol O-metiltransferasa (ROMT) y los expresan en un sistema celular que facilita la producción del pteroestilbeno. Esta descripción proporciona la producción industrial de resveratrol y pteroestilbeno. La presente descripción es un método biosintético para producir pteroestilbeno que comprende expresar una 4-cumarato:coenzima A ligasa (4CL) en un sistema celular, expresar una estilbeno sintasa (STS) en el sistema celular, expresar una resveratrol O-metiltransferasa (ROMT) en el sistema celular, alimentar el ácido p-cumárico al sistema celular, cultivar el sistema celular en un medio y, de ese modo, producir pteroestilbeno.
Otra realización es un método biosintético de preparar pteroestilbeno que comprende expresar una resveratrol O-metiltransferasa (ROMT) en el sistema celular, alimentar resveratrol al sistema celular, cultivar el sistema celular en un medio, y producir pteroestilbeno.
Otra realización es un método biosintético de producir resveratrol que comprende expresar una 4-cumarato:coenzima A ligasa (4CL) en un sistema celular, expresar una estilbeno sintasa (STS) en el sistema celular, alimentar ácido p-cumárico al sistema celular, cultivar el sistema celular en un medio, y producir resveratrol.
Otra realización es un método biosintético para fabricar pteroestilbeno que comprende expresar una 4-cumarato: coenzima A ligasa (4CL) en un primer sistema celular, expresar una estilbeno sintetasa (STS) exógena en el primer sistema celular, alimentar ácido p-cumárico al primer sistema celular, cultivar el primer sistema celular en un medio, producir resveratrol, expresar una resveratrol O-metiltransferasa (ROMT) en un segundo sistema celular, alimentar el resveratrol producido al segundo sistema celular, cultivar el segundo sistema celular en un medio, y producir pteroestilbeno.
Breve descripción de los dibujos
Para una mejor comprensión de la presente descripción, se puede hacer referencia a los dibujos adjuntos en los que: La Figura 1 muestra la ruta biosintética de pteroestilbeno.
La Figura 2 muestra los perfiles de HPLC de tres patrones (ácido p-cumárico, resveratrol y pteroestilbeno).
La Figura 3 muestra perfiles de HPLC de extractos de células de E. co lique expresan el gen de fusión 4CL::STS. La Figura 4 muestra perfiles de HPLC de extractos de células de E. coli que expresan el gen ROMT.
La Figura 5 muestra perfiles de HPLC de extractos de células de E. coli que expresan simultáneamente los genes 4CL::STS y ROMT.
La Figura 6 muestra perfiles de HPLC de extractos de células de levadura que expresan el gen de fusión 4CL::STS. La Figura 7 muestra perfiles de HPLC de extractos de células de levadura que expresan el gen ROMT.
La Figura 8 muestra perfiles de HPLC de extractos de células de levadura que expresan simultáneamente los genes 4CL::STS y ROMT.
La Figura 9 muestra un modelo de ROMT representado por cintas. Los sustratos se representan mediante un modelo de palotes en color gris oscuro. Los restos de unión al sustrato se representan mediante un modelo de palotes en color negro. F167A, D174A, W258A, H261A (H261 es un aminoácido clave) son los cambios realizados. Todos son aminoácidos clave para la actividad de H261 que es lo más importante.
La Figura 10 muestra perfiles de HPLC de extractos de células de E. coli que expresan el gen ROMT natural y el ROMT mutante.
Aunque la descripción es susceptible de diversas modificaciones y formas alternativas, las realizaciones específicas de las mismas se han mostrado a manera de ejemplo en los dibujos, y se describirán con detalle en la presente memoria. Debe entenderse, sin embargo, que los dibujos y la descripción detallada presentada en la presente memoria no pretenden limitar la descripción a la realización particular descrita.
Descripciones detalladas de la descripción
Definición
Sistema celular
El sistema celular es cualquier célula que proporcione la expresión de proteínas ectópicas. Incluye bacterias, levaduras, células vegetales y células animales. Incluye tanto células procariotas como eucariotas. También incluye la expresión in vitro de proteínas basadas en componentes celulares, tales como ribosomas.
Cultivo del sistema celular
El cultivo incluye proporcionar un medio que permita a las células multiplicarse y dividirse. También incluye proporcionar recursos de manera que las células o componentes celulares puedan traducir y fabricar proteínas recombinantes.
Transfección
La transfección es el proceso de introducir deliberadamente ácidos nucleicos en células. El término se usa, frecuentemente, para métodos no víricos en células eucariotas. También puede referirse a otros métodos y tipos de células, aunque se prefieren otros términos: “transformación” se usa con mayor frecuencia para describir la transferencia de ADN no vírico a bacterias, células eucariotas no animales, que incluyen células vegetales. En células animales, transfección es el término preferido ya que transformación también se usa para referirse a la progresión a un estado canceroso (carcinogénesis) en estas células. Transducción se usa, frecuentemente, para describir la transferencia de ADN mediada por virus. La transformación, transducción e infección vírica se incluyen en la definición de transfección para esta solicitud.
Aminoácidos modificados
Un aminoácido modificado es aquel que se ha modificado químicamente y se puede incorporar como parte de una secuencia de polipéptidos. El aminoácido puede modificarse de una manera postraduccional o antes de su incorporación a la secuencia del polipéptido durante la traducción.
El 4-cumarato:coenzima A ligasa se expresa a partir de un gen 4CL clonado de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia-0). En otra realización, la 4-cumarato coenzima A ligasa se expresa a partir de un gen que tiene una identidad de secuencia de al menos 66 % con un gen 4CL clonado de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia-0). En otra realización, el 4-cumarato:coenzima A ligasa se expresa a partir de un gen que tiene una similitud de secuencia de al menos 90 % con un gen 4CL clonado de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia-0).
STS
La estilbeno sintasa se expresa a partir de un gen STS clonado a partir de uva (Vitis vinifera). En otra realización, la estilbeno sintasa se expresa a partir de un gen que tiene una identidad de secuencia de al menos 66 % con un gen STS clonado a partir de uva (Vitis vinifera). En otra realización, la estilbeno sintetasa se expresa a partir de un gen que tiene una secuencia de al menos 90 % de similitud con un gen STS clonado a partir de uva (Vitis vinifera).
ROMT
La resveratrol O-metiltransferasa se expresa a partir de un gen clonado de uva (Vitis vinifera). En otra realización, la resveratrol O-metiltransferasa se expresa a partir de un gen que tiene una identidad de secuencia de al menos 66 % con un gen ROMT clonado a partir de uva (Vitis vinifera). En otra realización, la resveratrol O-metiltransferasa se expresa a partir de un gen que tiene una similitud de secuencia de al menos 90 % con un gen ROMT clonado a partir de uva (Vitis vinifera).
Una realización de la presente descripción es un método biosintético para producir pteroestilbeno que incluye expresar una 4-cumarato:coenzima A ligasa (4CL) en un sistema celular, expresar una estilbeno sintasa (STS) en el sistema celular, expresar una resveratrol O-metiltransferasa (ROMT) en el sistema celular, alimentar el ácido pcumárico al sistema celular, cultivar el sistema celular en un medio y producir pteroestilbeno.
En una realización, expresar la 4-cumarato:coenzima A ligasa y expresar la estilbeno sintasa comprende transfectar un gen de fusión 4CL::STS. En otra realización, expresar la 4-cumarato:coenzima A ligasa comprende transfectar un gen 4CL y expresar la estilbeno sintasa comprende transfectar un gen STS independiente. Expresar la resveratrol O-metiltransferasa comprende transfectar un gen ROMT.
El sistema celular se selecciona del grupo que consiste en al menos bacterias, levaduras, y una combinación las mismas. En otra realización, el sistema celular permite una reacción biosintética ectópica.
Una realización adicional es un método biosintético de preparar pteroestilbeno que comprende expresar una resveratrol O-metiltransferasa (ROMT) en el sistema celular, alimentar resveratrol al sistema celular, cultivar el sistema celular en un medio, y producir pteroestilbeno.
Una realización adicional es un método biosintético de producir resveratrol que comprende expresar una 4-cumarato:coenzima A ligasa (4CL) en un sistema celular, expresar una estilbeno sintasa (STS) en el sistema celular, alimentar ácido p-cumárico al sistema celular, cultivar el sistema celular en un medio, y producir resveratrol.
Una realización adicional es un método biosintético para fabricar pteroestilbeno que comprende expresar una 4-cumarato: coenzima A ligasa (4CL) en un primer sistema celular, expresar una estilbeno sintetasa (STS) exógena en el primer sistema celular, alimentar ácido p-cumárico al primer sistema celular, cultivar el primer sistema celular en un medio, producir resveratrol, expresar una resveratrol O-metiltransferasa (ROMT) en un segundo sistema celular, alimentar el resveratrol al segundo sistema celular, cultivar el segundo sistema celular en un medio, y producir pteroestilbeno.
Materiales y métodos
Cepas, plásmidos y condiciones de cultivo
Se usaron Hl-Control 10G y DH5a para la clonación del plásmido, y se usó BL21 (DE3) (Invitrogen) para la expresión de proteínas recombinantes en E. coli. La cepa pWat11 se utilizó para la expresión de proteínas en levadura. Los patrones de ácido p-cumárico, resveratrol y el pteroestilbeno se adquirieron de Sigma. El vector pETite N-His SUMO Kan se adquirió de Lucigen (Middleton, WI). El plásmido pETDuet-1 se adquirió de Novagen y se usó para expresar proteínas recombinantes.
Manipulación del ADN
Todas las manipulaciones del ADN se realizaron de acuerdo con los procedimientos estándar. Las enzimas de restricción y la T4 ADN ligasa se adquirieron de New England Biolabs. Todas las reacciones de amplificación por PCR y clonación se llevaron a cabo utilizando ADN polimerasa Phusion® High-Fidelity de New England Biolabs.
Extracción de ARN y síntesis de ADNc
ROMT (resveratrol O-metiltransferasa), 4CL (4-cumarato:coenzima A ligasa) y STS (estilbeno sintasa) se clonaron a partir de varias especies de plantas. El ARN total vegetal se extrajo de uva (Vitis vinifera) para la clonación de ROMT y STS y de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia-0) para la clonación de 4CL con el kit de purificación de ARN Trizol Plus (Invitrogen Inc). La síntesis de ADNc se llevó a cabo con el sistema de transcripción inversa Im Prom-II™ de Promega Inc. según el manual del fabricante. Los genes se amplificaron a partir del ADNc sintetizado con el kit New England Biolabs Phusion PCR con los cebadores relacionados en la Tabla 1.
Ejemplo 1
Construcción del vector de expresión bacteriano
El producto de la PCR de ROMT se clonó en el vector pETite N-His SUMO Kan (LucigenInc) según el manual del fabricante. El plásmido resultante con la inserción correcta se confirmó mediante secuenciación, especialmente Sumo-ROMT, y se transformó en BL21 (DE3) para la expresión del gen heterogéneo.
Para construir el gen de fusión 4CL::STS, se fusionaron At4CL y VvSTS mediante una estrategia de amplificación por PCR. Se eliminó el codón de terminación de 4CL y se introdujo un conector de tres aminoácidos (Gly-Ser-Gly) entre el marco de lectura abierto de 4CL y STS. Esta construcción dio como resultado un constructo de genes fusionado de 2,87 kb que codifica 4CL, el enlazador tripeptídico, y STS. El gen de fusión 4CL::STS clonado en el vector de entrada Gateway usando el Kit de clonación pCR8/GW/TOPO TA (Invitrogen) se transformó en células E. coli One Shot, y a continuación se secuenciaron. El gen de fusión 4CL::STS se amplificó y clonó en el sitio de clonación múltiple del vector pETDuet-1 mediante BamHI/hindlll, de nombre pETDuet-4CLSTS. Los cebadores de todas las reacciones de clonación se encuentran disponibles en la Tabla 1.
Ejemplo 2
Construcción del vector de expresión de levadura
El gen 4CL::STS se introdujo en el vector de destino pAG304GPD-ccdB de Advanced Gateway de S. cerevisiae (Addgene, Boston, MA), y el gen ROMT se intercambió en otro vector de destino de Gateway, el pAG305GPD - ccdB (Addgene) por de LR clonase II de mezcla enzimática de kit (de Invitrogen). Los plásmidos resultantes se denominaron pAG304GPD-4CLSTS y pAG304GPD-ROMT. Los vectores contienen un lado de recombinación integradora y un casete de expresión bajo el control de un promotor constitutivo (GPD). Estos vectores se transformaron en WAT11 para los ensayos de fermentación.
Transformación de levadura
Los constructos pAG304GPD-4CLSTS y pAG304GPD-ROMT, junto con los vectores pAG304GPD-ccdB y pAG305GPD- ccdB como controles, se transformaron en células WAT11 con el kit de transformación Frozen-EZ Yeast Transformation II (Zymo Research, Orange, CA). Los vectores, pAG304GPD-4CLSTS y pAG304GPD-ROMT, se transformaron simultáneamente en células de levadura WAT 11.
Modelado de homología y acoplamiento para predecir los restos de unión al sustrato de ROMT
Según el conocimiento de los solicitantes, no hay ninguna estructura terciaria de ROMT que pueda utilizarse para el análisis de los sitios de unión al sustrato. Para analizar el sitio de unión al sustrato, los solicitantes generaron un modelo de ROMT (Figura 9) con el programa informático I-TASSER (Ambrishyco/.,2010).
Los solicitantes aplican un método combinado de biología molecular y biología estructural para la evolución y desarrollo en laboratorio de ROMT mejorada. El sitio de unión al sustrato se pronosticó acoplando el resveratrol al modelo de ROMT usando el programa informático SWISDOCK (Grosdidieryco/.,2011).
Bioconversión de ácido p-cumárico en resveratrol con la proteína de la proteína de fusión 4CL::STS en E. coli y S. cerevisiae
Una colonia individual de la cepa de E. coli se cultivó en 3 ml de medio LB con 100 pg/ml de ampicilina durante la noche a 37 0C, y a continuación el cultivo sembrado se transfirió a 50 ml de medio modificado M9 con 100 pg/ml de ampicilina. E.coli BL21(DE3) que contenía el vector pETDuet-4CLSTS se mantuvo en agitación a 200 rpm a 37 °C en medio M9 modificado hasta que la DO600 alcanzó un valor de 0,6, a continuación se añadió IPTG 1 mM, después de 2 horas de inducción con IPTG, se añadió ácido p-cumárico disuelto en etanol al 100 % al cultivo a 0,5 g/l. El cultivó se mantuvo en agitación en la misma condición de cultivo, y se tomaron muestras en el intervalo para análisis por HPLC.
Las células Wat11 que contenían el plásmido pAG304GPD-4CLSTS se cultivaron en medio de goteo SD a 30 °C hasta que la DO600 alcanzó un valor de 0,2, después se añadió ácido p-cumárico (0,5 g/l). El cultivó se mantuvo en agitación durante 4 días en la misma condición de cultivo, y se tomaron muestras en el intervalo para análisis por HPLC.
Bioconversión de resveratrol a pteroestilbeno con la proteína de RQMT en E.coli y S. cerevisiae
E.coli BL21(DE3) que contenía el vector SUMO-RMOT se cultivó en medio M9 modificado a 37 0C hasta que la DO600 alcanzó un valor de 0,6, a continuación se añadió IPTG 1 mM, después de 2 horas de inducción con IPTG, se añadió resveratrol disuelto en DMSO al cultivo a 0,228 g/ml. El medio M9 se modificó añadiendo extracto de levadura (1,25 g/l) y glicerol (0,5 % v/v) en medio M9 estándar. El cultivó se mantuvo en agitación en la misma condición de cultivo, y se tomaron muestras en el intervalo para análisis por HPLC.
Las células Wat11 que contenían el plásmido pAG305GPD-RMOT se cultivaron en medio estándar de goteo de levadura a 30 0C hasta que la DO600 alcanzó un valor de 0,2, después se añadió ácido resveratrol (0,228 g/l).
El cultivó se mantuvo en agitación en la misma condición de cultivo, y se tomaron muestras en el intervalo para análisis por HPLC.
Bioconversión de ácido p-cumárico en pteroestilbeno con la proteína de ROMT y la proteína de fusión 4CL::STS en E. coli y S. cerevisiae
E.coli BL21(DE3) que contenía los vectores pETDuet-4CLSTS y SUMO-ROMT se cultivó en medio M9 modificado a 37 0C hasta que la DO600 alcanzó un valor de 0,6, a continuación se añadió IPTG 1 mM, después de 2 horas de inducción con IPTG, se añadió ácido p-cumárico disuelto en 100 % etanol al cultivo a 0,5 g/l. El cultivó se mantuvo en agitación en la misma condición de cultivo, y se tomaron muestras en el intervalo para análisis por HPLC.
Las células Wat11 que contenían los plásmidos pAG304GPD-4CLSTS y pAG305GPD-ROMT se cultivaron en medio de goteo SD a 300C hasta que la DO600 alcanzó un valor de 0,2, después se añadió ácido p-cumárico (0,5 g/l). El cultivó se mantuvo en agitación en la misma condición de cultivo, y se tomaron muestras en el intervalo para análisis por HPLC.
Extracción de productos
Se extrajeron alícuotas de cultivos (400 ul) con 800 ul de acetato de etilo. Los extractos se evaporaron a sequedad en un Eppendorf Vacufuge (Eppendorf Scientific Westbury, NY) a temperatura ambiente y se volvieron a disolver en 200 ul de metanol al 80 % (v/v).
Análisis por HPLC.
El análisis por HPLC de resveratrol y pteroestilbeno se llevó a cabo con el sistema Dionex Ultimate 3000. Los productos intermedios se separaron mediante cromatografía en fase inversa en una columna Phenomenex Kinetex C18 (tamaño de partícula 2,6 piq; 150 x 4,6 mm) con 0,1 % (vol/vol) de ácido fórmico (solución A) y 100 % de acetonitrilo (solución B). Las muestras se diluyeron en metanol al 80 % y se usó el siguiente procedimiento de gradiente: 10 % de solución B durante 2 min; un gradiente lineal de 10 % a 70 % de solución B durante 18 min; de 70 % a 30 % de solución B durante 1 min; de 30 % a 10 % de solución B durante 2 min; 10 % de solución B durante 5 min a un caudal de 0,8 ml/min. Para la cuantificación, todos los productos intermedios se calibraron con patrones externos. Los compuestos se identificaron por sus tiempos de retención, así como sus espectros correspondientes, que se identificaron con un detector de matriz de diodos en el sistema.
Resultados
Bioconversión del ácido p-cumárico en resveratrol con la proteína de fusión de 4CL y STS
Se analizaron tres patrones mediante HPLC, lo que demuestra que estaban bien separados (Figura 2). Con la estrategia de amplificación por PCR, se fusionaron 4CL y STS con un enlace de Gly-Ser-Gly entre 4CL y STS. Los solicitantes estudiaron la conversión de ácido p-cumárico en resveratrol con la cepa BL21(DE3) de E. coli que contenía el plásmido pETDuet-4CLSTS en un medio M9 modificado en los matraces. Según muestra la Figura 3, el ácido p-cumárico podría convertirse en resveratrol en un medio M9 modificado.
Para el ensayo de levadura in vivo, colonias de levadura fresca que contenían pAG304GPD-4CLSTS se cultivaron a 30 0C en 3 ml de medio de goteo de levadura que contenía 0,5 g/l de ácido p-cumárico durante 4 días. Los extractos se analizaron por HPLC. Según muestra la Figura 6, casi todo el ácido p-cumárico se convirtió en resveratrol en un plazo de 4 días. En comparación con E. coli, la eficiencia de conversión en levadura fue mucho mejor.
Bioconversión de resveratrol a pteroestilbeno con la proteína de ROMT
Según muestra la Figura 4, el resveratrol alimentado al cultivo de E. coli con la expresión de ROMT se convirtió en pteroestilbeno en el matraz. El análisis por HPLC indica que el resveratrol se puede convertir en pteroestilbeno en el matraz. Sin embargo, aparece otro pico desconocido, que probablemente es el que tiene un grupo metilo añadido al resveratrol. También se obtuvieron resultados similares con levadura (Figura 7).
Bioconversión del ácido p-cumárico en pteroestilbeno con expresión simultánea de 4CL::STS y ROMT
Se alimentó ácido p-cumárico al cultivo de E. coli y S. cerevisiae con la expresión simultánea de 4CL::STS y ROMT, según muestra la Figura 5 y la Figura 8, el ácido p-cumárico se convirtió en resveratrol y pteroestilbeno en el matraz según la HPLC en 24 h en E. coli y S. cerevisiae. Se obtuvieron los perfiles de HPLC con la condición en un plazo de 96 horas.
Mutagénesis convencional y de saturación de ROMT
Después de haber analizado cuidadosamente el sitio de unión al sustrato, los restos de aminoácido 167, 174, 258, y 261 se seleccionan para mutagénesis de saturación para mejorar la actividad de ROMT. Los solicitantes ya habían realizado la mutagénesis convencional para construir los mutantes de ROMT denominados F167A, D174A, W258A, y H261A, para conocer su efecto sobre la actividad enzimática. Ninguno de ellos muestra actividad salvo D174A, que mostró actividad muy baja (Figura 10). Este resultado sugiere que los restos de aminoácido en los sitios 167, 174, 258 y 261 son importantes para la unión al sustrato y la actividad catalítica. Por tanto, la siguiente etapa de los solicitantes será la mutagénesis de saturación dirigida al sitio para mejorar la actividad enzimática de ROMT. La mutagénesis de saturación permite cambiar un aminoácido por otro de los 19 restos de aminoácidos alternativos. Los solicitantes realizarán la mutagénesis de saturación en el sitio 167, 174, 258, y 261 de ROMT siguiendo la estrategia de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, CA) con el uso de cebadores degenerados NNK (N representa la mezcla de A, T, G, C y K por G/T). El codón NNK tiene una capacidad de degeneración de 32 veces, y codifica los 20 aminoácidos sin codones raros. La mezcla de PCR (25 pl) compuesta de tampón Phusion HF que contenía 60 ng de la plantilla de ADN Sumo-ROMT, dNTPS200 pM, cebadores directos 0,5 pM, cebadores inversos 0,5 pM, DMSO al 5 % y 0,3 pl de polimerasa. La PCR se realizó mediante desnaturalización al 98 0C durante 20 s, hibridación a 58 0C durante 30 s y seguido de alargamiento a 72 0C durante 2 min 30 s durante 25 ciclos. Los productos de PCR QuikChange se examinaron por electroforesis en gel de agarosa y después se digirieron 15 pl de productos de la PCR con 1 pl de Dpnl (New England BioLabs) a 37° durante 4 horas para eliminar el plásmido de plantilla. Se añadió una alícuota de (2 pl) de los productos de digestión a digestivos 50 pl de células competentes BL21 (DE3) (Stratagene, CA), se mantuvieron en hielo durante 30 min. Después de esto, se realizó un choque térmico a 42 0C durante 20 s, se mantuvieron sobre hielo durante 2 min y después se añadieron 500 pl de medio SOC y las células se cultivaron a 37 0C durante 1 h. Las células se centrifugaron a 5000 rpm durante min, se descartaron 450 pl de sobrenadante y las células se suspendieron con el resto del medio SOC y se inocularon en placas de agar Luria-Bertani (LB) que contenían kanamicina (50 pg/ml). Los inventores aislarán el plásmido y secuenciarán el ADN para confirmar el mutante. Los inventores confirmarán la calidad de la biblioteca mediante secuenciación del ADN.
Tabla 1. Cebadores usados en este estudio
Nombre Secuencia (5'-3')
SumoROMTF CGC GAA CAG ATT GGA GGT GAT TTG GCA AAC GGT GTG ATA TCA GC
SumoROMTR GTG GCG GCC GCT CTA TTA TCA AGG ATA AAC CTC AAT GAG GGA CC
ROMTF ATG GAT TTG GCA AAC GGT GTG ATA TC ROMTR TCA AGG ATA AAC CTC AAT GAG GGA CC
4CL-F ATG GCG CCA CAA GAA CAA GCA GTT TC
4CLSTS-LinkF GAG GGC AAA ACT AGC AAA TGG ATT GGG ATC TGG CAT GGC TTC AGT CGA GGA ATT TAG AA 4CLSTS-LinkR TTC TAA ATT CCT CGA CTG AAG CCA TGC CAG ATC CCA ATC CAT TTG CTA GTT TTG CCC TC STS-R TTA ATT TGT AAC CAT AGG AAT GCT ATG
4CL-BamHIF CGG GAT CCA TGG CGC CAC AAG AAC AAG CAG TTT C
STS-HindlllR CCC AAG CTT TTA ATT TGT AAC CAT AGG AAT GCT ATG
OligodT (22) TTT TTTTTTTTTTTTTTT TTV N_______________________________________________________
Identidad y similitud
La identidad es la fracción de aminoácidos que son iguales entre un par de secuencias después de un alineamiento de las secuencias (que pueden realizarse exclusivamente mediante el uso de información de secuencias o información estructural o alguna otra información, pero que habitualmente está basada solamente en la información de la secuencia) y la similitud es la puntuación asignada en función de una alineación con el uso de alguna matriz de similitud. El índice de similitud puede ser uno cualquiera de los siguientes BLOSUM62, PAM250, o GONNET, o cualquier matriz usada por el experto en la técnica para el alineamiento de secuencias de proteínas.
La identidad es el grado de correspondencia entre dos subsecuencias (sin huecos entre las secuencias). Una identidad de 25 % o mayor implica la similitud de funciones, mientras que 18-25 % implica similitud de estructura o función. Se debe tener en cuenta que dos secuencias completas no relacionadas o aleatorias (con más de 100 restos) pueden tener una identidad mayor del 20 %. La similitud es el grado de semejanza entre dos secuencias cuando se comparan entre sí. Esto depende de su identidad.
Como es evidente a partir de la descripción anterior, ciertos aspectos de la presente descripción no están limitados por los detalles particulares de los ejemplos ilustrados en la presente memoria descriptiva y, por tanto, se contempla que los expertos en la técnica idearán otras modificaciones y aplicaciones, o equivalentes de las mismas.
Además, salvo que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende normalmente el experto en la técnica a la que pertenece la descripción. Aunque cualquier método y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente memoria se pueden usar en la práctica o ensayos de la presente descripción, los métodos y materiales preferidos se han descrito anteriormente.
Referencias
Schmidlin L, Poutaraud A, Claudel P, Mestre P, Prado E, Santos-Rosa M, Wiedemann-Merdinoglu S, Karst F, Merdinoglu D, Hugueney P (2008) A stress-inducible resveratrol O-methyltransferaseinvolved in thebiosynthesisofpterostilbene in grapevine. Plant Physiol. 148(3): 1630-1639.
Ambrish R, Alper K, Yang Z (2010) I-TASSER: a unified platform for automated protein structure and function prediction. NatureProtocols, 5:725-738.
Grosdidier A, Zoete V, Michielin O. (2011) SwissDock, a protein-small molecule docking web service based on EADockDSS.JNucleic Acids Res. 39:W270-277.

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Un método biosintético para preparar pteroestilbeno que comprende:
    expresar una 4-cumarato:coenzima A ligasa (4CL) en un sistema celular;
    expresar una estilbeno sintasa (STS) en el sistema celular;
    expresar una resveratrol O-metiltransferasa (ROMT) en el sistema celular;
    alimentar ácido p-cumárico al sistema celular;
    cultivar el sistema celular en un medio; y
    producir pteroestilbeno.
  2. 2. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 1, en donde la 4-cumarato:coenzima A ligasa se expresa a partir de un gen 4CL clonado de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia-0).
  3. 3. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 2, en donde la 4-cumarato:coenzima A ligasa se expresa a partir de un gen que tiene una identidad de secuencia de al menos 66 % con el gen 4CL clonado de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia- 0) representado gráficamente en la Id. de sec. n.°:14.
  4. 4. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 2, en donde la 4-cumarato:coenzima A ligasa se expresa a partir de un gen que tiene una similitud de secuencia de al menos 90 % con el gen 4CL clonado de Arabidopsis thaliana (ecotipo Columbia- 0) representado gráficamente en la Id. de sec. n.°:14.
  5. 5. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 1, en donde la estilbeno sintasa se expresa a partir de un gen STS clonado de uva (Vitis vinifera).
  6. 6. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 5, en donde la estilbeno sintasa se expresa a partir de un gen que tiene una identidad de secuencia de al menos 66 % con el gen STS clonado de uva (Vitis vinifera) representado gráficamente en la Id. de sec. n.°:16.
  7. 7. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 5, en donde la estilbeno sintasa se expresa a partir de un gen que tiene una similitud de secuencia de al menos 90 % con el gen STS clonado de uva (Vitis vinifera) representado gráficamente en la Id. de sec. n.°:16.
  8. 8. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 1, en donde la resveratrol O-metiltransferasa se expresa a partir de un gen clonado de uva (Vitis vinifera).
  9. 9. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 8, en donde la resveratrol O-metiltransferasa se expresa a partir de un gen que tiene una identidad de secuencia de al menos 66 % con el gen ROMT clonado de uva (Vitis vinifera) representado gráficamente en la Id. de sec. n.°:12.
  10. 10. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 8, en donde la resveratrol O-metiltransferasa se expresa a partir de un gen que tiene una similitud de secuencia de al menos 90 % con el gen ROMT clonado de uva (Vitis vinifera) representado gráficamente en la Id. de sec. n.°:12.
  11. 11. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 8, en donde la resveratrol O-metiltransferasa expresada se modifica en uno o más de sus restos seleccionados de la lista que consiste en los restos 167, 174, 258, 261 de la Id. de sec. n.°: 13, y una combinación de los mismos, por un aminoácido alternativo o un aminoácido modificado, y en donde la resveratrol O-metiltransferasa modificada presenta mayor actividad para convertir el resveratrol en pteroestilbeno con respecto a una resveratrol O-metiltransferasa no modificada.
  12. 12. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 1, en donde la expresión de la 4-cumarato:coenzima A ligasa y la expresión de la estilbeno sintasa comprende transfectar un gen de fusión 4CL::STS.
  13. 13. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 1, en donde la expresión de la 4-cumarato:coenzima A ligasa comprende transfectar un gen 4CL.
  14. 14. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 1, en donde la expresión de la estilbeno sintasa comprende transfectar un gen STS.
  15. 15. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 1, en donde la expresión de resveratrol O-metiltransferasa comprende transfectar un gen ROMT.
  16. 16. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 1, en donde el sistema celular se selecciona del grupo que consiste en al menos bacterias, levaduras, células vegetales, células animales y una combinación de las mismas.
  17. 17. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 1, en donde el sistema celular permite una reacción biosintética ectópica.
  18. 18. El método biosintético para preparar pteroestilbeno de la reivindicación 1, en donde el sistema celular comprende un sistema de traducción in vitro.
ES14858679T 2013-11-01 2014-11-03 Métodos de uso de O-metiltransferasa para la producción biosintética de pterostilbeno Active ES2745092T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361898899P 2013-11-01 2013-11-01
PCT/US2014/063682 WO2015066609A1 (en) 2013-11-01 2014-11-03 Methods of using o-methyltransferase for biosynthetic production of pterostilbene

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2745092T3 true ES2745092T3 (es) 2020-02-27

Family

ID=53005254

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14858679T Active ES2745092T3 (es) 2013-11-01 2014-11-03 Métodos de uso de O-metiltransferasa para la producción biosintética de pterostilbeno

Country Status (12)

Country Link
US (1) US10370683B2 (es)
EP (1) EP3062607B1 (es)
JP (1) JP6522640B2 (es)
KR (1) KR102350425B1 (es)
CN (1) CN106102454B (es)
BR (1) BR112016009734A2 (es)
CA (1) CA2963219C (es)
DK (1) DK3062607T3 (es)
ES (1) ES2745092T3 (es)
HU (1) HUE045463T2 (es)
MX (1) MX369206B (es)
WO (1) WO2015066609A1 (es)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102018422B1 (ko) * 2017-05-31 2019-09-04 이화여자대학교 산학협력단 재조합 벡터, 형질전환체 및 이를 이용한 테로스틸벤의 생산 방법
CA3126985A1 (en) * 2019-01-21 2020-07-30 Food For Future S.R.L. Societa Benefit Methylation process
CN110804618B (zh) * 2019-11-25 2022-11-11 东北电力大学 定向进化构建高效转化白藜芦醇生产松芪的romt突变体
CN112410356B (zh) * 2020-11-10 2023-07-18 杭州鑫旺途科技有限公司 来源于三叶青的白藜芦醇合酶基因rs及其应用
CN114807183B (zh) * 2021-12-06 2023-06-02 西藏自治区农牧科学院农业研究所 一种青稞矢车菊素氧甲基转移酶基因的新用途

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5689046A (en) 1987-09-30 1997-11-18 Bayer Aktiengesellschaft Stilbene synthase gene
GB0503657D0 (en) 2005-02-22 2005-03-30 Fluxome Sciences As Metabolically engineered cells for the production of resveratrol or an oligomeric or glycosidically-bound derivative thereof
GB0614442D0 (en) 2006-07-20 2006-08-30 Fluxome Sciences As Metabolically engineered cells for the production of pinosylvin
GB0806592D0 (en) 2008-04-11 2008-05-14 Fluxome Sciences As Conversion of stilbenoids
CN102120996A (zh) 2010-12-03 2011-07-13 西北农林科技大学 葡萄白藜芦醇-氧-甲基转移酶催化白藜芦醇生成紫檀芪的方法
KR101520912B1 (ko) 2012-09-26 2015-05-18 한국생명공학연구원 Ｒｏｍｔ 및 ｓｔｓ 유전자를 이용한 식물의 스틸벤 함량을 증가시키고 화색을 변화시키는 방법
EP3039132A2 (en) * 2013-08-30 2016-07-06 Evolva SA A method for producing modified resveratrol
CN103773704B (zh) 2013-12-25 2015-10-28 无锡新和源发酵技术研究院有限公司 一种利用o-甲基转移酶生物合成紫檀芹的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2963219C (en) 2022-11-15
KR102350425B1 (ko) 2022-01-11
JP6522640B2 (ja) 2019-05-29
JP2017502685A (ja) 2017-01-26
US20160273006A1 (en) 2016-09-22
HUE045463T2 (hu) 2019-12-30
CN106102454A (zh) 2016-11-09
WO2015066609A1 (en) 2015-05-07
BR112016009734A2 (pt) 2017-09-12
CN106102454B (zh) 2020-07-31
MX369206B (es) 2019-10-31
EP3062607A1 (en) 2016-09-07
CA2963219A1 (en) 2015-05-07
EP3062607A4 (en) 2017-03-22
DK3062607T3 (da) 2019-09-23
KR20160079865A (ko) 2016-07-06
EP3062607B1 (en) 2019-06-26
MX2016005717A (es) 2017-02-08
US10370683B2 (en) 2019-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2745092T3 (es) Métodos de uso de O-metiltransferasa para la producción biosintética de pterostilbeno
CN109666658B (zh) 用于制备nmn的烟酰胺磷酸核糖转移酶、编码基因、重组载体及应用
Lee et al. Versatile PCR-mediated insertion or deletion mutagenesis
CN109593126A (zh) 多肽、其生产方法和用途
WO2021170097A1 (zh) 新型黄酮羟基化酶、合成黄酮碳苷类化合物的微生物及其应用
EP3752607A1 (en) Engineered cas9 systems for eukaryotic genome modification
CN104450746A (zh) 一种向蛋白质定点引入非天然氨基酸的方法
CN110408636B (zh) 多重标签串联的dna序列及其在蛋白质表达纯化系统的应用
CN113481226B (zh) 信号肽相关序列及其在蛋白质合成中的应用
EP3330282A1 (en) Cipa, cipb and pixa as scaffolds to organize proteins into crystalline inclusions
WO2014097733A1 (ja) ヒト上皮細胞増殖因子の製造方法
WO2021036901A1 (zh) 支链α-酮酸脱氢酶复合体在制备丙二酸单酰辅酶A中的应用
CN107099559A (zh) 生物技术制备甲基化的肉桂酸和肉桂酸酯、甲基化的苯乙胺和其偶联产物的方法
KR20240032944A (ko) 람노스가 고도로 특이적인 글리코실트랜스퍼라제 및 이의 응용
CN101928719A (zh) 用于筛选蛋白可溶性表达的t载体及其构建方法和应用
ES2856951T3 (es) Variante de O-acetilhomoserina sulfidrilasa y método para producir L-metionina mediante el uso de la misma
BR112019014116A2 (pt) S-cianidrina liase altamente ativa e aplicação da mesma
US20220135629A1 (en) Zinc Finger Protein-Superoxide Dismutase Fusion Protein With Cell Membrane Penetrating Property
CN111926000B (zh) 绞股蓝糖基转移酶及其应用
CN102719463B (zh) 一种生产重组混合l-阿拉伯糖异构酶的方法
ES2948496T3 (es) Nuevos aminoácidos que tienen un resto de norborneno
CN108148824B (zh) 一种耐有机溶剂高效半乳糖苷酶及其应用
ES2769500T3 (es) Proceso de preparación y purificación de la proteína oncostatina M humana recombinante
WO2018216841A1 (ko) 항산화 활성 및 피부 세포 증식 효과가 증가한 열 충격 단백질 10과 브라제인 단백질의 융합단백질 및 이를 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물
BR122022018007B1 (pt) Micro-organismo do gênero corynebacterium e método de preparação, composição para produzir l-leucina e método de produção