KR20160068313A

KR20160068313A - 신규한 하이포마이크로비움속 미생물 및 이를 이용한 피로로퀴놀린 퀴논의 제조방법

Info

Publication number: KR20160068313A
Application number: KR1020140173838A
Authority: KR
Inventors: 정인화; 장형욱; 정준기; 이인규; 맹창재; 방지훈; 나성숙
Original assignee: 주식회사 성운바이오
Priority date: 2014-12-05
Filing date: 2014-12-05
Publication date: 2016-06-15
Also published as: KR101664608B1; US20160160250A1; JP2016106633A; JP6383346B2

Abstract

본 발명은 피로로퀴놀린 퀴논 (pyrrolo-quinoline quinone) 고생산능을 갖는 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium sp.) 속 변이 균주 SWB-P91 (KCTC12695BP)에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 하이포마이크로비움 속 모균주에 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니틴 (NTG) 및 자외선을 처리하여 돌연변이를 유발하는 단계; 및 상기 돌연변이된 균주를 배지에서 배양하여 피로로퀴놀린 퀴논을 고생산하는 변이주를 선별하는 단계; 를 포함하는 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium sp.) 속 변이 균주 SWB-P91 (KCTC12695BP)의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium sp.) 속 변이 균주 SWB-P91 (KCTC12695BP)를 배양하는 단계; 상기 배양 발효액으로부터 흡착수지를 이용해 발효액 내의 피로로퀴놀린 퀴논을 흡착하는 단계; 및 상기 흡착된 피로로퀴놀린 퀴논을 용리액으로 탈착하는 단계; 및 상기 탈착된 피로로퀴놀린 퀴논 용액을 감압 농축하여 피로로퀴놀린 퀴논을 회수하는 단계;를 포함하는 피로로퀴놀린 퀴논의 대량 생산 방법에 관한 것이다. .

Description

신규한 하이포마이크로비움속 미생물 및 이를 이용한 피로로퀴놀린 퀴논의 제조방법 {NOVEL MICROORGANISM OF HYPHOMICROBIUM SP. AND METHOD OF PRODUCING PYRROLO-QUINOLINE QUINONE USING THE SAME}

본 발명은 피로로퀴놀린 퀴논 (pyrrolo-quinoline quinone) 고생산능을 갖는 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium sp.) 속 변이 균주 SWB-P91 (KCTC12695BP) 및 이의 생산방법 및 피로로퀴놀린 퀴논을 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

피로로퀴놀린퀴논 (pyrrolo-quinoline quinone)은 NAD, FAD에 이은 제3의 산화환원조효소로 1979년에 미생물로부터 구조가 확인 되었다. 메탄, 메탄올 자화균의 메탄올디히드로게나제 (methanol dehydrogenase), 아세트산균의 알코올디히드로게나제 (alcohol dehydrogenase), 글루코노박터 (Gluconobacter) 균주의 글루코오스디히드로게나제 등과의 비공유 결합된 조효소로 작용한다. 사람의 모유를 포함하여 파슬리, 콩, 감자, 키위, 파파야 등 다양한 식품에서 그 존재가 확인되고 있으며, 영양적으로 섭취를 하지 않았을 경우 생육이 저하, 면역기능 손상, 기억력 저하등의 문제를 야기하게 되어 필수 영양원으로 분류되는 새로운 비타민으로 각광을 받고 있다. (비특허문헌 1)

피로로퀴놀린 퀴논에 이용되는 미생물로는 파라코커스 (Paracoccus), 프로타미노박터 (Protaminobacter), 슈도모나스 (Pseudomonas) [미국특허 제4,994,382호], 메틸로박테리움 (Methylobacterium), 안시로박터 (Ancylobacter), 하이포카이크로비움 (Hyphomicrobium), 크잔토박토 (Xanthobacter), 티오바실러스 (Thiobacillus), 마이크로시크러스 (Microcyclus)와 아크로모박터 (Achromobacter) (특허문헌 1) 등이 있으며 하이포마이크로비움과 메틸로박테리움속 미생물의 피로로퀴놀린 퀴논 생산에 관여하는 유전자를 이용하여 유전자 복제 수를 늘려줌으로써 생산량을 증가시키는 방법으로 피로로퀴놀린 퀴논을 생산하기도 한다. (특허문헌 2)

하이포마이크로비움속 미생물을 이용한 피로로퀴놀린 퀴논 생산의 예로 미국등록특허 제5,344,768호 (특허문헌 3)에서는 하이포마이크로비움속 미생물을 메탄올 8g/L을 포함하는 배지에서 2일간 배양하여 배양 상등액에 최대 7mg/L 농도로 피로로퀴놀린 퀴논을 생산하는 방안을 제시하였으며, 또한 Applied and Environmental Microbiology, 55 (5) 1209~1213, 1989 (비특허문헌 2)에 의하면 하이포마이크로비움속 미생물로부터 최대 1.98mg/L까지 생산하였으며, Applied and Environmental Microbiology, 58 (12) 3970~3976, 1992 (비특허문헌 3)에서는 배지내 철 성분의 농도와 마그네슘 성분의 농도를 조절하여 15일간의 배양에서 약 900mg/L까지 피로로퀴놀린 퀴논을 생산한 예를 보여주고 있다.

메탄올을 탄소원으로 이용하는 미생물은 메탄올(Methanol)을 흡수하여 포름알데하이드 (formaldehyde)로 산화된다. 이후 탄소원 동화 기작인 세린회로에 의해 포름알데하이드는 세포내 글리신과 함께 세린으로 전환된다. 세린회로의 첫 번째 기작인 포름알데히드과 글리신의 세린으로의 전환이 세린회로의 율속단계로 작용하게 되어 결국 생육 속도를 조절하게 되고, 미생물의 초기 생육에서 생육유도기 (lag phase)가 길어져 2일간의 생육유도기에 정지하는 문제를 갖고 있다. 또한 메탄올로부터 생성된 포름알데히드는 세포 내 독성성분으로 작용하여 결국 배지 내 메탄올 농도가 높아질 경우 이로부터 생산된 포름알데히드에 의해 생육이 저해를 받게 되어 메탄올 농도 1% 에서부터 생육이 저하되기 시작하고 5% 농도에서 생육이 완전히 저해되는 결과를 보인다.

한편, 피로로퀴놀린 퀴논을 발효공정에 의해 단시간에 대량생산하기 위해서는 생육유도기가 지수증식기로 빨리 전환되어야 하며 이를 위해서는 율속단계인 균체 내 세린형성 단계가 원활하게 시작돼야 하며, 균체의 생육속도 유지를 해기 위해서는 배지 내 메탄올 농도를 고농도로 유지해야 하지만 메탄올이 일정농도 이상일 경우 생육이 저해를 받게 되기 때문에 메탄올을 저농도 (0.1%)로 유지해야 하는 문제를 갖고 있다. 이와 같은 문제로 인해 피로로퀴놀린 퀴논을 대량생산하기에는 제조 단가를 낮추기 어려울 뿐 아니라 장기간의 배양기간을 통해야 대량 생산이 가능하다는 문제점을 갖고 있다.

또한 피로로퀴놀린 퀴논을 정제하기 위하여 디이에이이 세파덱스 A-25 (DEAE-Sephadex A-25) 수지를 이용하여 피로로퀴놀린 퀴논을 흡착 시키고, 이를 1.0M 염화칼륨 용액으로 탈착시키는 과정을 거쳐 정제를 진행하게 된다. 이후 산침전법에 의해 용리액으로부터 피로로퀴놀린 퀴논을 침전 회수하게 된다. 그러나, 이 때 사용하는 디이에이이 (Diethyl aminoethyl) 수지는 고가이기에 대량생산을 위한 조건에 생산단가를 상승시키는 문제가 있어 산업적인 사용에 어려움이 있고 산침전법을 이용하는 경우, 회수 시간이 오래 걸리며 수율이 저하되는 문제점을 갖고 있다.

이에, 본 발명자들은 하이포마이크로부움 (Hyphomicrobium) 속의 미생물을 이용하여 피로로퀴놀린 퀴논을 발효적으로 생산하는데 있어, 상기의 문제점이 개선된 발효공정을 개발하기 위하여 연구를 계속한 결과, 과량의 메탄올 농도에 대한 내성을 갖고, 배양배지 내 메탄올 농도를 고농도로 유지하여도 미생물의 생육이 유지되어 단기간에 대량의 피로로퀴놀린 퀴논을 생산할 수 있는 돌연변이 균주를 확보하여 피로로퀴놀린 퀴논을 대량 생산할 수 있는 방법을 개발하기에 이르렀다.

1. 미국등록특허 제4,994,382호 2. 미국공개특허공보 제2013/0337511호 3. 미국등록특허 제5,344,768호

1. Alternative Medicine Review Volume 14 (3), 268~277, 2009) 2. Applied and Environmental Microbiology, 55 (5) 1209~1213, 1989 3. Applied and Environmental Microbiology, 58 (12) 3970~3976, 1992

본 발명의 목적은 피로로퀴놀린 퀴논 (pyrrolo-quinoline quinone) 고생산능을 갖는 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium sp.) 속 변이 균주 SWB-P91 (KCTC12695BP)를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 피로로퀴놀린 퀴논 (pyrrolo-quinoline quinone) 고생산능을 갖는 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium sp.) 속 변이 균주 SWB-P91 (KCTC12695BP)의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium sp.) 속 변이 균주 SWB-P91 (KCTC12695BP)를 이용해 피로로퀴놀린 퀴논 (pyrrolo-quinoline quinone)의 대량 생산방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 피로로퀴놀린 퀴논 (pyrrolo-quinoline quinone) 고생산능을 갖는 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium sp.) 속 변이 균주 SWB-P91 (KCTC12695BP)를 제공한다.

본 발명의 용어, "유가식 배양"은 회분식 배양과 달리 배양액을 빼내는 일 없이 배지를 연속 혹은 간헐적으로 공급하는 배양법을 말하며, 용어, “회분식 배양”은 초기에 한번 배지를 채운 후 더 이상의 영양 물질의 공급이나 제거없 이 반응기에서 세포를 배양하는 방법을 말한다.

본 발명의 용어, “고생산능”은 본 발명의 변이 균주가 종래 알려진 야생형 미생물이 생산하는 피로로퀴놀린 퀴논에 비해 높은 피로로퀴놀린 퀴논의 생산능을 갖는 것을 말한다.

본 발명은 또한 하이포마이크로비움 속 모균주에 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니틴 (NTG) 및 자외선을 처리하여 돌연변이를 유발하는 단계; 및 상기 돌연변이된 균주를 배지에서 배양하여 피로로퀴놀린 퀴논을 고생산하는 변이주를 선별하는 단계; 를 포함하는 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium sp.) 속 변이 균주 SWB-P91 (KCTC12695BP)의 제조방법을 제공한다.

상기 하이포마이크로비움속 SWB-P91 (KCTC12695BP)의 제조방법은 먼저 하이포마이크로비움속 미생물을 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니틴 (NTG) 및 자외선으로 처리한 후 메탄올을 함유하는 배지에 배양하였다. 이어서 생육한 변이주들을 포름알데히드를 함유하는 배지에서 배양하여 생육속도가 가장 우수한 돌연변이주들을 선별하였으며, 이중 고농도 메탄올 배지에서 피로로퀴놀린 퀴논을 가장 많이 생산하는 돌연변이주를 선별하는 과정으로 제조된 신균주이다.

상기 하이포마이크로비움속 SWB-P91 (KCTC12695BP)은 고농도의 메탄올 및 포름알데히드 농도에서 균체 생장률이 증가하는 것일 수 있다.

상기한 바와 같이 고농도 메탄올에 내성을 나타내는 하이포마이크로비움속 돌연변이 균주를 이용하여 피로로퀴놀린 퀴논을 생산할 때에는 우선 고농도의 메탄올이 존재하는 종균배지에서 균주를 배양하여 내성을 유지시킬 수 있다. 이때 종균배지는 1 내지 5%의 메탄올을 함유할 수 있으며, 포름알데히드 농도 0.06mg/L 내지 30mg/L을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 배양온도는 28내지 31℃가 바람직하고, 배양시간을 48내지 72시간으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 배지 내 세린은 균체 생육유도기를 짧게 하기 위하여 첨가할 수 있으며, 바람직하게 0.1 내지 1g/L의 농도로 첨가하여 지수증식기로 진행되도록 유도할 수 있다.

본 발명은 또한, 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium sp.) 속 변이 균주 SWB-P91 (KCTC12695BP)를 배양하는 단계; 상기 배양 발효액으로부터 흡착수지를 이용해 발효액 내의 피로로퀴놀린 퀴논을 흡착하는 단계; 및 상기 흡착된 피로로퀴놀린 퀴논을 용리액으로 탈착하는 단계; 및 상기 탈착된 피로로퀴놀린 퀴논 용액을 감압 농축하여 피로로퀴놀린 퀴논을 회수하는 단계;를 포함하는 피로로퀴놀린 퀴논의 대량 생산 방법을 제공한다.

상기 피로로퀴놀린 퀴논의 생산에 사용할 수 있는 미생물은 고농도의 메탄올과 고농도의 포름알데히드에 내성을 갖는 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium) 속의 균주이며, 바람직하게는 하이포마이크로비움속 SWB-P91 (KCTC12695BP)를 사용할 수 있다.

상기한 바와 같이 고농도 메탄올에 내성을 나타내는 하이포마이크로비움속 돌연변이 균주를 이용하여 피로로퀴놀린 퀴논을 생산할 때에는 우선 고농도의 메탄올이 존재하는 종균배지에서 균주를 배양하여 내성을 유지시킬 수 있다. 이때 종균배지는 1 내지 5%의 메탄올을 함유할 수 있으며, 배양온도는 28내지 31℃가 바람직하고, 배양시간을 48내지 72시간으로 할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 배지 내 세린은 0.1 내지 1g/L의 농도로 첨가하여 지수증식기로 진행되도록 유도할 수 있다. 상기 세린의 농도가 0.1g/L 미만일 경우 생육이 저하되어 지수증식기로의 진입이 어려우며, 1g/L 초과일 경우 배지 비용이 과다하게 높아질 수 있다.

다음으로 상기 성장한 변이 균주를 주 발효조에 접종하여 생육을 유도한 후 유가식으로 배양하면서 배지중의 메탄올 농도를 조절하고, 균주의 피로로퀴놀린 퀴논의 생산능력 및 대사활성을 발효말기까지 유지시키는 단계를 통해 피로로퀴놀린 퀴논의 생산성을 증가시킬 수 있다. 이때 피로로퀴놀린 퀴논 생산용 배지의 공급속도는 배양액의 메탄올 농도가 0.1 내지 0.5%로 유지하기에 적당한 속도로 공급하는 것이 바람직하며, 28 내지 31℃에서 100 내지 150시간 동안 계속 배양할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 발효액으로부터 퀴놀린 퀴논을 정제 회수하는 공정에서는 먼저 원심분리기를 이용해 균체를 제거하고, 배양액의 상등액을 회수할 수 있다. 이 후, 상기 회수한 배양액은 강산을 이용하여 pH를 1.0내지 3.5로 조정할 수 있다. 이 후, 상기 배양액은 다이아이온 에이치피-20 (DIAION HP-20)에 통과시켜 피로로퀴놀린 퀴논을 흡착시킬 수 있다. 그 이후, 피로로퀴놀린 퀴논이 흡착된 흡착수지는 용리액으로 탈착시킬 수 있다. 바람직하게 상기 용리액은 0.1 내지 0.5N 농도의 암모니아수를 이용하여 사용할 수 있다. 이후 감압농축 방법으로 피로로퀴놀린 퀴논을 대량 회수할 수 있다. 상기의 방법에 의하면 7일 이내에 600mg/L 이상의 피로로퀴놀린 퀴논을 생산할 수 있다.

상기 발효공정에 의해 생산된 피로로퀴놀린 퀴논을 순수 정제하는 과정에서 이용하는 다이아이온 에이치피-20 (DIAION HP-20)수지는 종래의 디이에이이 세파덱스 A-25 (DEAE-Sephadex A-25) 수지에 비해 저가이면서도 효율적으로 발효액 내의 피로로퀴놀린 퀴논을 흡착할 수 있다. 또한, 암모니아수를 이용하여 피로로퀴놀린 퀴논을 탈착함으로써 회수 수율을 향상시킬 수 있으며, 탈착된 피로로퀴놀린 퀴논을 함유하는 암모니아수를 감압 농축함으로써 암모니아수를 제거하고 피로로퀴놀린 퀴논을 회수하는 공정을 통해 공정의 단순화 가능하며, 생산단가를 낮출 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 고농도의 메탄올에서 생육하는 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium) 속의 미생물을 이용해 유가식 발효에 의해 피로로퀴놀린 퀴논을 대량 생산할 수 있었다. 구체적으로, (1) 생장배지 내에 세린을 첨가함으로써 생육유도기를 짧게 하여 주고 지수증식기로 진행할수 있도록 유도하였으며, (2) 고농도 메탄올 내성 변이 균주 및 (3) 고농도 포름알데히드에 내성을 갖는 변이 균주를 선별하였다. 또한 (4) 상기 변이 균주를 피로로퀴놀린 퀴논 생산 주발효조 배지에 접종하여 생산균체를 성장시키고, 배지 중 메탄올 농도를 고농도로 유지하면서 피로로퀴놀린 퀴논의 대량 생산을 유도하였다. 또한, (5) 생산된 발효액으로부터 피로로퀴놀린 퀴논을 정제하는 공정에서 다이아이온 에이치피-20 (DIAION HP-20) 흡착수지를 이용하여 발효액 내의 피로로퀴놀린 퀴논을 흡착시켰으며, 상기 흡착 수지에 암모니아수를 흘려주어 피로로퀴놀린 퀴논을 흡착수지로부터 탈착시켰다. 또한, (6) 탈착된 피로로퀴놀린 퀴논을 함유하는 암모니아수를 감압 농축함으로써 피로로퀴놀린 퀴논을 대량 회수할 수 있었다.

본 발명의 하이포마이크로비움속 SWB-P91 (KCTC12695BP)는 고농도의 메탄올에서 균체 생장량이 증가하고, 단기간에 대량의 피로로퀴놀린 퀴논을 생산할 수 있는 효과를 제공하는 신균주이다. 또한 상기 변이 균주를 이용한 피로로퀴놀린 퀴논 생산방법은 경제적이며, 공정의 단순화가 가능하고, 대량의 피로로퀴놀린 퀴논을 정제할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 세린을 첨가한 배지에서의 지수증식기 진입을 확인하기 위해 배양 후 균체 생육 정도가 OD 값 범위 (그래프 X 축)에 해당되는 실험 수 (그래프 Y 축)를 통해 하이포마이크로비움속 SWB-P91 (KCTC12695BP) 균주의 생육정도를 비교한 그래프이다.
도 2는 세린을 첨가하지 않은 배지에서의 지수증식기 진입을 확인하기 위해 하이포마이크로비움속 SWB-P91 (KCTC12695BP) 균주의 생육정도를 비교한 그래프이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 이 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 1> 하이포마이크로비움속 SWB - P91 ( KCTC12695BP ) 변이 균주의 제조

완전 평판배지(메탄올 0.2%, 황산암모늄 0.3%, 인산수소칼륨 0.14%, 인산이나트륨 0.21%, 세린 0.02%, 황산마그네슘 0.1%, 제1철 구연산염 0.003%, 염화칼슘 0.003%, 황산망간 0.0001%, 황산아연 0.002%, 황산동 0.00001%, 한천1.5% pH7.0)에서 30℃, 72시간 동안 배양된 하이포마이크로비움 속 모균주 Hyphomicrobium denitrificans (ATCC51888)를 완전액체배지에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 본 명세서에서 배지의 농도 중 “%”는 중량%를 의미한다. 배양 후 12000rpm에서 15분 동안 원심분리 한 다음 생리식염수로 2회 수세하였다. 동일한 액으로 균체농도가 약 1 OD (600nm) 가 되도록 적절히 희석한 후 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니틴 (NTG) 250㎍/㎖ 되도록 가하여 30℃에서 30분에서 80분간 처리하였다. 처리된 균체를 생리식염수로 2-3회 수세한 후 메탄올 농도 5%를 포함한 동일배지에 도말한 후 30℃에서 4~7일간 배양하여 성장이 빠른 콜로니를 분리 하였다. 이를 플라스크 배지(메탄올 5%, 황산암모늄 0.3%, 인산수소칼륨 0.14%, 인산이나트륨 0.21%, 세린 0.02%, 황산마그네슘 0.1%, 제1철 구연산염 0.003%, 염화칼슘 0.003%, 황산망간 0.0001%, 황산아연 0.002%, 황산동 0.00001%, pH7.0)에서 30℃에서 72시간 동안 배양하였다. 이렇게 얻은 돌연변이주를 포름알데히드 1mM을 포함하는 상기 한천배지에 도말 후 30℃에서 4~7일간 배양하여 성장이 빠른 콜로니를 분리 하였다. 이를 다시 플라스크 배지(메탄올 5%, 포름알데히드 1mM, 황산암모늄 0.3%, 인산수소칼륨 0.14%, 인산이나트륨 0.21%, 세린 0.02%, 황산마그네슘 0.1%, 제1철 구연산염 0.003%, 염화칼슘 0.003%, 황산망간 0.0001%, 황산아연 0.002%, 황산동 0.00001%, pH7.0) 에서 30℃에서 72시간 동안 배양하였다. 이렇게 배양된 균주를 피로로퀴놀린 퀴논 측정법을 이용하여 피로로퀴놀린 퀴논 생산성이 우수한 균주를 선별한 후 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium) SWB-P91로 명명하였으며, 이를 2014년10월21일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC12695BP를 부여받았다. 또한 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium) SWB-P91의 염기서열을 분석하여, Hyphomicrobium sp. SWB-P91 16S rRNA sequence(서열번호 1)을 동정하였다.

피로로퀴놀린 퀴논 측정법은 Agilent사의 1100 고속액체크로마토그래피와 Shiseido사의 C18 컬럼 (4.6x250mm, 5um)를 사용하고, 이동상으로 acetonitrile-buffer 1:9(v/v)에서 buffer (0.1M KH₂PO₄ and 0.1M HClO₄ : pH 2.2 - 8N NaOH)로 1.0ml/min. 의 유속으로 하고 254nm에서 흡광도를 측정하여 피로로퀴놀린 퀴논을 검출하였다.

표 1 및 표 2에서는, 고농도의 메탄올 및 포름알데히드를 처리하여, 모균주와 본 발명의 변이 균주 SWB-P91의 생육도를 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 변이 균주 SWB-P91의 경우 모균주에 비해 메탄올 농도 0.5 % 이상 및 포름알데히드 농도 1.5 mg/L 의 고농도에서도 증가된 생육도를 보이는 것을 확인하였다.

메탄올 농도 (%)	생육도
메탄올 농도 (%)	모균주	SWB-P91
0.2	+++	+++
0.5	++	+++
1	+	++
5	-	+

+++: 72 시간 배양 후 OD 3.0 이상의 생육을 나타냄.

++: 72 시간 배양 후 OD 2.0~3.0의 생육을 나타냄.

+: 72 시간 배양 후 OD 1.0~2.0의 생육을 나타냄.

-: 72 시간 배양 후 OD 1.0 이하의 생육을 나타냄.

포름알데히드 농도 (mg/L)	생육도
포름알데히드 농도 (mg/L)	모균주	SWB-P91
0.06	++	++
1.5	-	++
6	-	+
30	-	+

+++: 72 시간 배양 후 OD 3.0 이상의 생육을 나타냄.

++: 72 시간 배양 후 OD 2.0~3.0의 생육을 나타냄.

+: 72 시간 배양 후 OD 1.0~2.0의 생육을 나타냄.

-: 72 시간 배양 후 OD 1.0 이하의 생육을 나타냄.

< 실시예 2> 하이포마이크로비움속 SWB - P91 ( KCTC12695BP ) 변이 균주와 모균주의 피로로퀴놀린 퀴논의 생산성 비교

발효 생산배지 (메탄올 1%, 황산암모늄 0.3%, 인산수소칼륨 0.14%, 인산이나트륨 0.21%, 세린 0.02%, 황산마그네슘 0.1%, 제1철 구연산염 0.003%, 염화칼슘 0.003%, 황산망간 0.0001%, 황산아연 0.002%, 황산동 0.00001%, pH7.0) 1.8L를 5L 규모의 소형 발효조에 넣고 121℃, 20분간 살균을 실시한 후 동일배지에서 30℃, 120rpm, 48시간동안 배양된 종균배양액 200ml을 접종하고 500rpm, 1vvm의 조건에서 30℃에서 150시간 발효를 하였다. 발효액 중 pH는 암모니아수로 7로 조절하였으며 추가 메탄올은 발효중 첨가하는 유가식 발효공정으로 균주의 피로로퀴놀린 퀴논 생산성을 측정하였다. 유가식 배양에서 배양액내 메탄올 농도는 0.5%로 유지하였으며 이때 발효 시간 150시간 후 최종 균체 생육도 및 피로로퀴놀린 퀴논 생산성을 모균주와 비교하였다. 모균주는 유가식 배양에서 배지내 메탄올 농도가 0.2% 이상에서 생육이 저해를 받기에 0.1%로 유지하며 동일 조건에서 발효를 진행하였다. 표 3에서와 같이 발효실험에서 본 발명의 변이균주는 모균주에 비하여 배지중 메탄올 농도 0.5%에서 생육이 유지되었으며 모균주에 비해 생산성이 우수한 안정적인 균주임을 확인하였다.

구분	모균주	SWB-P91
발효시간 (시간)	150	150
균체량 (OD600nm)	52	43
피로로퀴놀린 퀴논 (mg/L)	352	613
생산성 (mg/L/hr)	2.3	4.1

< 실시예 3> 배지 내 세린 첨가에 의한 생육 정도 비교

배지 성분에 세린을 첨가에 의하여 생육유도기 (lag phase)로부터 지수증식기로의 진입이 안정적으로 진행되는지를 비교실험을 하였다. 이를 위해 완전액체배지 (메탄올 0.2%, 황산암모늄 0.3%, 인산수소칼륨 0.14%, 인산이나트륨 0.21%, 황산마그네슘 0.1%, 제1철 구연산염 0.003%, 염화칼슘 0.003%, 황산망간 0.0001%, 황산아연 0.002%, 황산동 0.00001%, pH7.0)에 세린을 첨가하지 않은 배지와 세린을 0.002% 로 첨가한 배지 각각 30개 플라스크에 하이포마이크로비움 SWB-P91 균주를 10% 양으로 종균 접종하여 30℃에서 30시간동안 120 rpm으로 배양하여 생육 정도를 비교하였다.

세린을 첨가하지 않은 배지에서는 도 1과 같이 낮은 생육정도를 보이거나 지수증식기로의 진행이 일정치 않게 나타났으며, 세린을 첨가한 배지에서는 도 2와 같이 대체로 안정적인 생육정도와 지수증식기로의 빠른 진행정도를 나타내었다. 이러한 결과는 모균주인 하이포마이크로비움속 균주를 사용한 실험에서도 유사한 결과를 나타내었다. 이로써 메탄올 이용 균주의 탄소원 동화기작중 첫 번째 단계인 세린 형성 단계가 생육유도기에 율속단계로 작용하는 것에 의해 발생하는 초기생육의 불안정성과 지수증식기로의 진행이 지연되는 문제를 세린을 첨가함에 의해 해결할 수 있음을 보여주는 결과다.

< 실시예 4> 피로로퀴놀린 퀴논의 대량 정제

< 실시예 4-1> 다이아이온 에이치피 -20 ( DIAION HP -20)에 의한 피로로퀴놀린 퀴논의 흡착

실시예 2의 발효 배양액으로 피로로퀴놀린 퀴논 정제를 진행하였다. 배양액 0.5L를 윈심분리기를 이용하여 균체를 제거하고 상등액을 5N HCl을 이용 pH1.8로 조정하였다. 이를 다이아이온 에이치피-20 (DIAION HP-20) 수지 100ml이 충진된 컬럼에 흘려 피로로퀴놀린 퀴논을 수지에 흡착시켰다. 흡착이 완료된 컬럼에 pH1.5로 조절된 증류수를 수지량의 3배수로 흘려주어 세정을 실시한 후 0.2N 암모니아수를 이용 탈착을 진행하였다. 암모니아수가 수지에 통과 되면서 피로로퀴놀린 퀴논의 붉은색 띠가 탈착액을 따라 이동하는 것을 보이며 붉은색 부분이 용리되는 부분을 분취하였다. 이후 1N 암모니아수를 이용하여 추가 탈착을 진행하였으나, 더 이상 피로로퀴놀린 퀴논은 용리되지 않았다. 또한 100ml의 디이에이이 세파로스 (DEAE-sepharose) 수지로 충진된 컬럼에 배양 상등액 (pH7.0) 0.5L를 흘려 흡착을 실시하였다. 이 후 0.2M 염화나트륨 용액 3배수로 세정을 실시한 후 0.65M 염화나트륨 용액으로 탈착을 진행하였다. 붉은색 피로로퀴놀린 퀴논 부분이 용리되는 부분을 분취하였다. 이후 1M 염화나트륨 용액으로 재용리를 진행하였으나 더 이상 피로로퀴놀린 퀴논은 용리되지 않았다. 비교 실시한 디이에이이 세파로스 (DEAE-sepharose) 수지를 이용한 피로로퀴놀린 퀴논 분리 정제한 결과는 표4와 같다.

구분	DEAE-sepharose (100ml)	DIAION HP-20 (100ml)
흡착양 (mg)	306	305
용리액 (ml)	39	68
탈착량 (mg)	197	232
회수율 (%)	64.4	76.0

< 실시예 4-1> 감압농축에 의한 피로로퀴놀린 퀴논의 회수

실시예 4-1에서 다이아이온 에이치피-20 (DIAION HP-20) 수지를 이용하여 흡착한 피로로퀴놀린 퀴논 및 0.2N 암모니아수로 용리된 피로로퀴놀린 퀴논 용액에 대해 감압농축을 실시하였다. 감압농축에 의해 전량의 암모니아수를 제거할 수 있었으며 약210mg의 피로로퀴놀린 퀴논을 회수할 수 있었다. 회수율은 68.9%를 나타냈다.

한편, 기존의 디이에이이 세파로스 ((DEAE-sepharose) 수지를 이용하여 용리된 피로로퀴놀린 퀴논 용액으로부터 피로로퀴놀린 퀴논을 회수하기 위하여 강산을 이용하여 pH를 2.5로 조정하여 산침전법을 실시하였다. 이렇게 얻은 피로로퀴놀린 퀴논은 149mg으로 회수율 48.6%이었다. 비교 실시한 결과는 표 5와 같다.

구분	산침전법	감압농축
회수량 (mg)	149	210
총 회수율 (%)	48.6	68.9

한국생명공학연구원

KCTC12695BP

20141021

<110> SungWunbio. CO.,LTD <120> NOVEL MICROORGANISM OF HYPHOMICROBIUM SP. AND METHOD OF PRODUCING PYRROLO-QUINOLINE QUINONE USING THE SAME <130> P14E10D1174 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1125 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hyphomicrobium sp. SWB-P91 16S rRNA sequence <400> 1 nnnnaggggg cggtctacaa tgcagtcgaa cgccccgcaa ggggagtggc agacgggtga 60 gtaacacgtg ggaaccttcc ctatagtacg gaatagccca gggaaacttg gagtaatacc 120 gtatacgccc gaaaggggaa agaatttcgc tataggatgg gcccgcgtag gattagctag 180 ttggtgaggt aatggctcac caaggcgacg atccttagct ggtttgagag aacgaccagc 240 cacactggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgga 300 caatgggcgc aagcctgatc cagccatgcc gcgtgagtga tgaaggcctt agggttgtaa 360 agctcttttg gcggggacga taatgacggt acccgcagaa taagtcccgg ctaacttcgt 420 gccagcagcc gcggtaatac gaaggggact agcgttgttc ggaatcactg ggcgtaaagc 480 gcacgtaggc ggatatgcca gtcaggggtg aaatcccggg gctcaacctc ggaactgccc 540 ttgatacagc atgtcttgag tccgatagag gtgggtggaa ttcctagtgt agaggtgaaa 600 ttcgtagata ttaggaagaa caccggtggc gaaggcggcc cactggatcg gtactgacgc 660 tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaga 720 cgatggatgc tagccgtcgg atagcttgct attcggtggc gcagctaacg cattaagcat 780 cccgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 840 agcggtggag catgtggttt aattcgacgc aacgcgaaga accttaccag ctcttgacat 900 tcactgattg ccggtagaga tgccggagtt ccagcaatgg acagtgggac aggtgctgca 960 tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1020 cgcattagtt gccatcattc agttgggcac tctagtggga ctgccgtgat agcgggagga 1080 aggtggggat gacgtcagtc atcatggccc ttacgggctg ggcta 1125

Claims

피로로퀴놀린 퀴논 (pyrrolo-quinoline quinone) 고생산능을 갖는 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium sp.) 속 변이 균주 SWB-P91 (KCTC12695BP).
하이포마이크로비움 속 모균주에 N-메틸-N'-니트로-N-니트로구아니틴 (NTG) 및 자외선을 처리하여 돌연변이를 유발하는 단계; 및
상기 돌연변이된 균주를 배지에서 배양하여 피로로퀴놀린 퀴논을 고생산하는 변이주를 선별하는 단계; 를 포함하는 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium sp.) 속 변이 균주 SWB-P91 (KCTC12695BP)의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 배지는 세린을 함유하는 것을 특징으로 하는 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium sp.) 속 변이 균주 SWB-P91 (KCTC12695BP)의 제조방법.
제2항에 있어서, 상기 배지는 메탄올 농도 0.5 내지 5 중량% 및 포름알데히드 농도 0.06mg/L 내지 30mg/L을 포함하는 것을 특징으로 하는 하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium sp.) 속 변이 균주 SWB-P91 (KCTC12695BP)의 제조방법.
하이포마이크로비움 (Hyphomicrobium sp.) 속 변이 균주 SWB-P91 (KCTC12695BP)를 배양하는 단계;
상기 배양 발효액으로부터 흡착수지를 이용해 발효액 내의 피로로퀴놀린 퀴논을 흡착하는 단계; 및
상기 흡착된 피로로퀴놀린 퀴논을 용리액으로 탈착하는 단계; 및
상기 탈착된 피로로퀴놀린 퀴논 용액을 감압 농축하여 피로로퀴놀린 퀴논을 회수하는 단계;
를 포함하는 피로로퀴놀린 퀴논의 대량 생산 방법.
제5항에 있어서, 상기 배양은 유가식 배양으로 수행하는 것인 피로로퀴놀린 퀴논의 대량 생산 방법.
제6항에 있어서, 상기 유가식 배양을 통해 배양액의 메탄올 농도를 0.1 내지 0.5 중량%로 유지시키는 것인 피로로퀴놀린 퀴논의 대량 생산 방법.
제5항에 있어서, 상기 용리액은 암모니아수인 것인 피로로퀴놀린 퀴논의 대량 생산 방법.
제5항에 있어서, 상기 흡착수지는 다이아이온 에이치피-20 (DIAION HP-20) 수지인 것인 피로로퀴놀린 퀴논의 대량 생산 방법.