KR20160023703A - 식물에서의 단백질 생산 - Google Patents
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Abstract
본 명세서는 이종 펩티드 및 단백질을 식물에서 안전하고 제어된 방식으로 생산하기 위한 방법 및 작제물에 관한 것이다. 본 발명의 하나의 태양은 관심대상의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자 및 마커 유전자, 파타틴 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열과 함께 CD4B 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열 및/또는 P19을 과발현할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 사용하여 형질전환된 감자 식물에서 이종 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 다른 태양은 관심대상의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자, 마커 유전자, 수송 펩티드 서열 및 ADP 글루코스 피로포스포릴라제 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 사용하여 형질전환된 감자 식물에서 이종 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
Description
관련 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 그 전문이 본 명세서에 참조로 포함되는, 2013년 6월 14일자로 출원된 미국 가출원 제61/835,274호를 우선권으로 주장한다.
본 명세서는 분자생물학 및 식물 세포에서의 단백질 합성에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 명세서는 식물계에서 관심대상의 펩티드 또는 단백질을 생산하기 위한 방법 및 작제물을 제공한다. 본 출원에서 인용된 모든 간행물은 본원에서 참조로 포함된다.
최근까지, 소형 유기 분자로부터 유래된, 항생제, 진통제 및 호르몬제와 같은 약제는 주로 합성에 의해 또는 미생물에서 생산되었다. 그러나, 유전체학 및 단백체학이 발달함에 따라, 신규한 약물 요법들은 보다 대형 단백질 분자를 수반한다. 단백질은 세포 생물학 및 발달에서 주요 역할을 하기 때문에, 많은 단백질들이 치료적 잠재성을 갖고 있다.
약 30개 아미노산의 짧은 펩티드 쇄는 합성될 수 있지만, 보다 대형 단백질은 살아있는 세포에 의해 가장 잘 생산된다. 현재, 방대한 대형 단백질이 멸균 미생물 및 포유동물 세포 배양을 사용하여 생산된다. 그러나, 세포 배양 시스템은 유지하는데 비용이 많이 들고 힘들기 때문에, 식물-기반 발현 시스템이 낮은 생산 비용 및 보다 관리가능한 대규모 생산을 제공한다.
본 발명의 목적은 감자 식물에서 관심대상의 이종 펩티드 또는 단백질을 생산하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 하나의 태양은, (a) 식물을 (i) 파타틴 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열, (ii) CD4B 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열, (iii) 마커 유전자 및 (iv) 관심대상의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계; (b) 형질전환된 식물을 정의된 조건 하에 재배하는 단계; 및 (c) 관심대상의 단백질을 추출하는 단계를 포함하는, 형질전환된 감자 식물에서 이종 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 또한, 파타틴 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 파타틴의 안티센스 및 센스 서열을 포함하는 방법이 제공된다. CD4B 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 5 및 서열번호 6에 제시된 CD4B의 안티센스 및 센스 서열을 포함하는 다른 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 또한 GFP, EGFP, GUS, LUX, CAH, SPT, NPTII, HPT, APHIV, BAR, PAT, CHS, AHAS 및 플라보노이드 합성 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 마커 유전자를 포함할 수 있다.
관심대상의 단백질이 인터류킨-2, 히루딘, 인슐린, 인터페론, 락토페린, 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 표피 성장 인자, 탄저병 백신, 콜레라 백신, DPT 백신, hib 백신, A형 간염 백신, B형 간염 백신, C형 간염 백신, HPV 백신, 인플루엔자 백신, 일본 뇌염 백신, MMR 백신, MMRV 백신, 폐렴구균 접합 백신, 폐렴구균 다당류 백신, 폴리오 백신, 로타바이러스 백신, 천연두 백신, 결핵 백신, 장티푸스 백신, 황열병 백신, 파보바이러스 백신, 디스템퍼 백신, 아데노바이러스 백신, 파라인플루엔자 백신, 보르데텔라 백신, 광견병 백신, 렙토스피라증 백신, 라임병 백신, 코로나 백신, 회충/십이지장충 백신, 구충제 백신, RNFN 백신 및 HIV 백신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 다른 태양은 (a) 식물을 (i) 파타틴 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열, (ii) P19를 과발현할 수 있는 뉴클레오티드 서열, (iii) 마커 유전자 및 (iv) 관심대상의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계; (b) 형질전환된 식물을 정의된 조건 하에 재배하는 단계; 및 (c) 관심대상의 단백질을 추출하는 단계를 포함하는, 형질전환된 감자 식물에서 이종 단백질을 생산하는 방법이다. 파타틴 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 파타틴의 안티센스 및 센스 서열을 포함하는 방법이 또한 제공된다. P19를 과발현할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 2에 제시된 P19 서열을 포함하는 다른 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 또한 GFP, EGFP, GUS, LUX, CAH, SPT, NPTII, HPT, APHIV, BAR, PAT, CHS, AHAS 및 플라보노이드 합성 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 마커 유전자를 포함할 수 있다.
관심대상의 단백질이 인터류킨-2, 히루딘, 인슐린, 인터페론, 락토페린, 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 표피 성장 인자, 탄저병 백신, 콜레라 백신, DPT 백신, hib 백신, A형 간염 백신, B형 간염 백신, C형 간염 백신, HPV 백신, 인플루엔자 백신, 일본 뇌염 백신, MMR 백신, MMRV 백신, 폐렴구균 접합 백신, 폐렴구균 다당류 백신, 폴리오 백신, 로타바이러스 백신, 천연두 백신, 결핵 백신, 장티푸스 백신, 황열병 백신, 파보바이러스 백신, 디스템퍼 백신, 아데노바이러스 백신, 파라인플루엔자 백신, 보르데텔라 백신, 광견병 백신, 렙토스피라증 백신, 라임병 백신, 코로나 백신, 회충/십이지장충 백신, 구충제 백신, RNFN 백신 및 HIV 백신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양은 (a) 식물을 (i) 파타틴 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열, (ii) CD4B 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열, (iii) P19를 과발현할 수 있는 뉴클레오티드 서열, (iv) 마커 유전자 및 (v) 관심대상의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계; (b) 형질전환된 식물을 정의된 조건 하에 재배하는 단계; 및 (c) 관심대상의 단백질을 추출하는 단계를 포함하는, 형질전환된 감자 식물에서 이종 단백질을 생산하는 방법이다. 파타틴 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 파타틴의 안티센스 및 센스 서열을 포함하는 방법이 또한 제공된다. CD4B 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 5 및 서열번호 6에 제시된 CD4B의 안티센스 및 센스 서열을 포함하는 방법이 또한 제공된다. P19를 과발현할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 2에 제시된 P19 서열을 포함하는 다른 방법이 또한 제공된다. 상기 방법은 GFP, EGFP, GUS, LUX, CAH, SPT, NPTII, HPT, APHIV, BAR, PAT, CHS, AHAS 및 플라보노이드 합성 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 마커 유전자를 또한 포함할 수 있다.
관심대상의 단백질이 인터류킨-2, 히루딘, 인슐린, 인터페론, 락토페린, 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 표피 성장 인자, 탄저병 백신, 콜레라 백신, DPT 백신, hib 백신, A형 간염 백신, B형 간염 백신, C형 간염 백신, HPV 백신, 인플루엔자 백신, 일본 뇌염 백신, MMR 백신, MMRV 백신, 폐렴구균 접합 백신, 폐렴구균 다당류 백신, 폴리오 백신, 로타바이러스 백신, 천연두 백신, 결핵 백신, 장티푸스 백신, 황열병 백신, 파보바이러스 백신, 디스템퍼 백신, 아데노바이러스 백신, 파라인플루엔자 백신, 보르데텔라 백신, 광견병 백신, 렙토스피라증 백신, 라임병 백신, 코로나 백신, 회충/십이지장충 백신, 구충제 백신, RNFN 백신 및 HIV 백신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법이 또한 제공된다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 (a) 식물을 (i) ADP 글루코스 피로포스포릴라제(AGP) 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열; (ii) 수송 펩티드(transit peptide); (iii) 마커 유전자; 및 (iv) 관심대상의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계; (b) 형질전환된 식물을 정의된 조건 하에 재배하는 단계; 및 (c) 관심대상의 단백질을 추출하는 단계를 포함하는, 형질전환된 감자 식물에서 이종 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
바람직한 실시양태에서, AGP 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열은 서열번호 10 및 서열번호 11에 제시된 안티센스 또는 센스 AGP 서열을 포함한다. 바람직하게는, AGP 발현의 억제는 수렴 프로모터(convergent promoter)에 의해 유도된다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 수렴 프로모터는 과립-결합 전분 신타제(GBSS) 프로모터 및 AGP 프로모터이다.
수송 펩티드가 서열번호 8에 제시된 GBSS-수송 펩티드 또는 서열번호 9에 제시된 루비스코(RuBisCo) 수송 펩티드인 방법이 또한 제공된다. 본 발명의 방법은 또한 GFP, EGFP, GUS, LUX, CAH, SPT, NPTII, HPT, APHIV, BAR, PAT, CHS, AHAS 및 플라보노이드 합성 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 마커 유전자를 포함할 수 있다.
바람직하게는, 관심대상의 단백질은 인터류킨-2, 히루딘, 인슐린, 인터페론, 락토페린, 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 표피 성장 인자, 탄저병 백신, 콜레라 백신, DPT 백신, hib 백신, A형 간염 백신, B형 간염 백신, C형 간염 백신, HPV 백신, 인플루엔자 백신, 일본 뇌염 백신, MMR 백신, MMRV 백신, 폐렴구균 접합 백신, 폐렴구균 다당류 백신, 폴리오 백신, 로타바이러스 백신, 천연두 백신, 결핵 백신, 장티푸스 백신, 황열병 백신, 파보바이러스 백신, 디스템퍼 백신, 아데노바이러스 백신, 파라인플루엔자 백신, 보르데텔라 백신, 광견병 백신, 렙토스피라증 백신, 라임병 백신, 코로나 백신, 회충/십이지장충 백신, 구충제 백신, RNFN 백신 및 HIV 백신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
상기 전반적 설명 및 상세한 설명은 예시하거나 설명하는 것이며 청구된 본 발명의 추가 설명을 제공하기 위한 것이다. 본 발명의 상세한 이해를 위해, 하기 바람직한 실시양태의 상세한 설명을 첨부된 도면과 함께 참조한다. 다른 목적, 장점 및 신규 특징은 하기 본 발명의 상세한 설명으로부터 당업자에게 쉽게 자명할 것이다.
도 1. GUS 유전자 및 GUS 유전자 침묵화(silencing) 작제물 pSIM789 둘 다를 함유하는 식물의 조직화학 염색된 담배 잎 펀치. 네모칸으로 표시된 잎 샘플은 염색된 GUS 양성 대조군(상단) 식물 및 야생형(하단) 식물을 도시한다.
도 2는 감자의 카테콜 검정의 결과를 도시한다. 폴리페놀 옥시다제-5(PP05) 유전자를 침묵화시키도록 디자인된 침묵화 작제물을 함유하는 트랜스제닉 계통 F10의 괴경은 비형질전환 대조군의 괴경(상단에서 첫번째 4개 샘플)과 비교해서 감소된 폴리페놀 옥시다제-5 활성을 나타냈다.
도 3. 비형질전환 감자의 괴경(좌측), 및 클로로겐산, 안토시아닌 및 플라보놀의 합성에서 4배 증가를 유발하는 클로로겐산 유도인자(CAI) 유전자를 과발현하는 감자로부터의 괴경(우측).
도 4. PPO5 유전자 침묵화의 노던 블롯 분석. 총 RNA(20㎍)를 PP05 유전자가 침묵화된 트랜스제닉 식물 및 대조군의 온실-성장한 괴경 조직으로부터 단리시키고 PP05 프로브(상부 패널) 및 내부 기준 18S rRNA 프로브(중간 패널)과 하이브리드화시켰다. 예측되는 전사체 크기는 1.95-kb(참조: 진뱅크 등록번호(Genbank Accession) U22921)였다. 하부 패널은 에티듐 브로마이드(EB)로 가시화된 바와 같은 총 RNA의 양을 나타낸다. EC, FC, JC, GC 및 HC는 비형질전환된 통상의 품종으로부터의 대조 샘플이다. 개별적 트랜스제닉 이벤트(event) 샘플은 각 레인 위에 표지화되어 있다. 데이터는 흑반 압상(black spot bruise) 관용성(tolerance)이 PP05 유전자의 효과적 침묵화와 연관됨을 입증한다[참조: 예를 들면, Rommens, CM., Ye, J., Richael, C, Swords, K., 2006, J Agric Food Chem 54:9882-9887].
도 5. 트랜스제닉 감자에서 VTC2 유전자 발현의 노던 블롯 분석. 총 RNA(20㎍)를 트랜스제닉 이벤트 및 대조군(C1-C8)의 온실-성장 괴경 조직으로부터 단리시키고 VTC2 프로브와 하이브리드화시켰다(상부 패널). 하부 패널은 에티듐 브로마이드(EB)로 가시화된 바와 같은 총 RNA의 양을 나타낸다.
도 6. 감자 줄기 외식편에서의 GFP 유전자 발현. 감자 식물을 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자로 형질전환시켰다. 고수준 GFP 발현은 강력한 구성적 프로모터(constitutive promoter)로 과발현시 트랜스제닉 감자 식물에서 볼 수 있었다.
도 7. 비형질전환 감자 꽃, 잎 및 줄기와 비교한 트랜스제닉 감자 꽃, 잎 및 줄기에서의 고수준 GUS 유전자 발현.
도 8. 최적의 유전자 발현을 뒷받침하는 부위로의 관심대상의 유전자(예: GFP)의 전위를 위한 공동형질전환 작제물.
도 9. 대조 벡터 pSIM1903의 지도.
도 10. T-DNA 경계(border) 내에 2x 35S 프로모터-유도된 P19R43(서열번호 2) P19 돌연변이체를 함유하는 벡터 pSIM1927의 지도.
도 11. 선택된 pSIM1927 계통의 GFP 정량. P19R43를 과발현하는 33종의 계통을, 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)를 과발현하는 모체 물질(parent material)로부터 생성시켰다. 모든 계통은 명백한 다면발현 효과없이 온실에서 정상적으로 성장하였다. 상기 트랜스제닉 계통을 공(空)벡터 계통(pSIM1361) 및 모체 계통(parent line)(pSIM1903)과 비교하여 괴경-특이적 GFP 축적에 대해 가시적으로 스크리닝하였다. GFP 정량을 위해 높은 GFP 발현을 나타내는 12종의 계통을 선택하였다. 상기 12종의 트래스제닉 계통 중 10종에서 공벡터 계통에서의 GFP 양과 비교하여 GFP 양의 20 내지 60% 증가가 검출되었다.
도 12. 선택된 pSIM 1927 계통의 웨스턴 블롯 분석. P19R43을 과발현하는 33종의 계통을, 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)을 과발현하는 모체 물질로부터 생성시켰다. 모든 계통은 명백한 다면발현 효과없이 온실에서 정상적으로 성장하였다. 상기 트랜스제닉 계통을 공벡터 계통(pSIM1361) 및 모체 계통(pSIM1903)과 비교하여 괴경-특이적 GFP 축적에 대해 가시적으로 스크리닝하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 높은 GFP 발현을 나타내는 12종의 계통을 선택하였다. 상기 12종의 트래스제닉 계통 중 10종에서 공벡터 계통에서의 GFP 양과 비교하여 GFP 양의 20 내지 60% 증가가 검출되었다.
도 13. 선택된 pSIM1927 계통의 노던 블롯 분석. P19R43을 과발현하는 33종의 계통을 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)을 과발현하는 모체 물질로부터 생성시켰다. 모든 계통은 명백한 다면발현 효과없이 온실에서 정상적으로 성장하였다. 상기 트랜스제닉 계통을 공벡터 계통(pSIM1361) 및 모체 계통(pSIM1903)과 비교하여 괴경-특이적 GFP 축적에 대해 가시적으로 스크리닝하였다. P19 유전자의 발현을 확인하기 위해, 높은 GFP 발현을 나타내는 7종의 계통으로부터의 RNA를 P19 프로브로 분석하였다. P19 전사체는 가장 높은 GFP 발현을 나타내는 2종의 계통을 포함한 3종의 계통에서 검출되었다. RNA 침묵화의 억제인자인 돌연변이된 p19의 발현을 상승된 GFP 단백질 발현과 연관시키는 이러한 결과들은 RNA 침묵화의 억제인자인 P19의 억제가 식물에서의 단백질 생산을 증진시킴을 입증한다.
도 14. 파타틴 유전자 침묵화 카세트를 함유하는 벡터 pSIM1934의 지도.
도 15. pSIM1934 계통의 GFP 정량. 30종의 pSIM1934 트랜스제닉 계통을, 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)을 과발현하는 모체 물질로부터 생성시켰다. 1361로 표시된 레인은 공벡터 대조군을 의미하고 1903으로 표시된 레인은 GFP 모체 대조군이다. GFP 축적은 pSIM1934 실험군 계통 중 어느 것에서도 관찰되지 않았다.
도 16. 선택된 pSIM1934 계통의 SDS-PAGE 및 웨스턴 분석. 30종의 pSIM1934 트랜스제닉 계통을 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)을 과발현하는 모체 물질로부터 생성시켰다. 1903으로 표시된 레인은 GFP 모체 대조군이고, 1361 + 1903으로 표시된 레인은 공벡터 대조군과 GFP 모체 대조군의 조합물을 의미한다. 10개의 레인에서 대다수의 파타틴 단백질(약 40 kDa 밴드)이 침묵화에 의해 제거되었다.
도 17. CD4B 침묵화 카세트를 함유하는 벡터 pSIM1939의 지도.
도 18. 선택된 pSIM1939 계통의 GFP 정량. 26종의 pSIM1939 계통을 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)을 과발현하는 모체 물질로부터 생성시켰다. 1361로 표시된 레인은 공벡터 대조군을 의미하고 1903으로 표시된 레인은 GFP 모체 대조군을 의미한다. 7종의 트랜스제닉 계통은 모체 계통(pSIM1903)과 비교해서 GFP 축적의 2 내지 3배 증가를 나타냈다.
도 19. 선택된 pSIM1939 계통의 노던 블롯 분석. 26종의 pSIM1939 트랜스제닉 계통을 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)을 과발현하는 모체 물질로부터 생성시켰다. 1361로 표시된 레인은 공벡터 대조군이고 1903으로 표시된 레인은 GFP 모체 대조군이다. 모체 계통(pSIM1903)과 비교해서 GFP 축적의 2 내지 3배 증가를 나타낸 7종의 트랜스제닉 계통의 노던 블롯 분석은 어떠한 계통에서도 CD4B 전사체를 검출하지 못하였으며, 따라서 CD4B 유전자 침묵화를 확인시킨다. 이러한 결과들은 CD4B 프로테아제의 침묵화를 재조합 단백질(GFP) 생산의 2 내지 3배 증가와 연관시키며 CD4B의 괴경-특이적 침묵화를 사용하여 재조합 단백질 생산을 증진시킬 수 있음을 입증한다.
도 20. pSIM1949-2x35S::EGFP 유전자 대조 벡터의 지도.
도 21. 벡터 pSIM1947의 지도. pSIM1947은 2x35S: GBSSTP-eGFP 카세트와 GBSS->sAGP<-AGP 카세트를 보유한다. GFP 발현은 GBSS 수송 펩티드에 의해 유도되며, AGP 침묵화는 GBSS 프로모터에 의해 한 방향으로부터 유도되며 AGP 프로모터에 의해 반대 방향으로부터 유도된다.
도 22. 벡터 pSIM1948의 지도. pSIM1948은 2x35S: RbcsTP-eGFP 카세트와 GBSS->sAGP<-AGP 카세트를 보유한다. GFP 발현은 루비스코 수송 펩티드에 의해 유도되며, AGP 침묵화는 GBSS 프로모터에 의해 한 방향으로부터 유도되며 AGP 프로모터에 의해 반대 방향으로부터 유도된다.
도 23. 어린 감자 잎에서의 GFP 발현. 감자 식물을 pSIM1947(도 21) 또는 pSIM1948(도 22)로 형질전환시켰다. GFP를 강력하게 발현하는, 시험관 내에서 성장하는 트랜스제닉 새싹을 형광 현미경을 사용하여 선택하였고, GFP 발현은 대조 벡터 pSIM1949(도 20)로 형질전환된 대조 계통과 비교해 평가하였다. 좌측 패널은 백색광 하의 잎을 도시하고, 우측 패널은 GFP 필터 사용 하의 잎을 도시한다. 강력한 GFP 발현은 트랜스제닉 pSIM1947 소식물체의 잎에서 검출되었다. pSIM1948 소식물체에서의 GFP 발현은 대조 계통에서의 GFP 발현보다 단지 약간만 더 강력하였다. 이러한 결과들은 GBSS 수송 펩티드를 이용한 동시적 단백질 과발현 및 수렴 프로모터에 의한 AGP 침묵화가 재조합 단백질 생산을 증진시키는 데 있어 효과적임을 나타낸다.
도 24. 솔라넘 튜베로섬(Solanum tuberosum) 파타틴 ER 수송 펩티드(N-말단)와 ER 체류 시그널(C-말단) 사이에 위치하는 사람 인터류킨 2(IL-2)의 절두형(truncated version).
도 25. ER-IL-2 카세트를 함유하고 출발 코돈 전의 BamHI-NcoI 제한 부위 및 종결 코돈 후의 SpeI 부위를 갖는 DNA2.0 벡터.
도 26. 히스티딘 태그된 사람 IL-발현 카세트를 함유하는 벡터 pSIM1936의 지도.
도 27. ER 표적화된, 코돈-최적화된 IL-2 변이체를 함유하는 pSIM1936 벡터로 형질전환된 빈취(Bintje) 감자 계통의 괴경에서의 IL-2 생산. 1936-18 레인은 최적화되지 않은 양성 대조군을 나타낸다. 각각의 변이체마다, 25종의 독립적 트랜스제닉 계통이 생성되었다. 각각의 색상은 형질전환을 위해 사용된 코돈-최적화된 IL-2 변이체를 나타낸다. 각각의 막대는 독립적 트랜스제닉 계통으로부터의 3개의 개별적 괴경에서의 평균 IL-2 수준을 나타낸다. 본 결과는 IL-2 생산이 코돈-최적화된 변이체 중 2종으로부터 수득된 특정한 트랜스제닉 계통에서 2 내지 3배 증가되었음을 나타낸다.
도 28. ER 표적화된, 코돈-최적화된 IL-2 변이체를 함유하는 pSIM1936 벡터로 형질전환된 빈취 감자 계통의 괴경에서의 IL-2 생산. 1936-18 레인은 최적화되지 않은 양성 대조군을 나타낸다. 각각의 변이체마다, 25종의 독립적 트랜스제닉 계통이 생성되었다. 각각의 색상 그룹은 형질전환을 위해 사용된 코돈-최적화된 IL-2 변이체를 나타낸다. 각각의 막대는 독립적 트랜스제닉 계통으로부터의 3개의 개별적 괴경에서의 평균 IL-2 수준을 나타낸다. 본 결과는 IL-2 생산이 상이한 코돈 변이체로부터 수득된 특정한 트랜스제닉 계통에서 2.5배 증가되었음을 나타낸다.
도 29는 GFP 발현으로 측정된, 이종 단백질 생산에 미치는 상이한 침묵화, 과발현 및 표적화 전략의 효과를 도시한다. 10종의 계통을 분석한 CD4B 침묵화를 제외하고 25종의 계통을 각 전략에 대해 분석하였다. 각 막대는 GFP 발현에 대해 분석한 3개의 개별적 괴경을 나타낸다. 각 색상은 다음과 같이 상이한 침묵화, 과발현 또는 표적화 전략에 상응한다: 적색 막대: CD4B의 침묵화. 오렌지색 막대: CD4B와 파타틴의 침묵화. 황색 막대: CD4B와 파타틴의 침묵화 및 P19의 과발현. 녹색 막대: GBSS 프로모터 및 수렴 AGP 프로모터를 이용한 AGP의 침묵화; GFP 발현은 과립-결합 전분 신타제(GBBS) 수송 펩티드에 의해 색소체로 표적화되었다. 청색 막대: GBSS 프로모터 및 수렴 AGP 프로모터를 이용한 AGP의 침묵화; GFP 발현은 루비스코 수송 펩티드에 의해 엽록체로 표적화되었다. 회색 막대: GBSS 프로모터 및 수렴 AGP 프로모터를 이용한 AGP의 침묵화. 올리브그린 막대: 2x35S::EGFP 카세트를 보유한 대조 모체 계통(pSIM1903). 자주색 막대: 2x35S::EGFP 카세트를 보유한 대조 계통(pSIM1949). CD4B 및 파타틴의 침묵화(적색, 황색 및 오렌지색 막대) 또는 단독의 CD4B만의 침묵화는 GFP 대조군과 비교해 단백질 수준을 약간만 증진시켰다. GFP 발현을 과립-결합 전분 신타제(GBBS) 수송 펩티드로 유도하면서 GBSS 프로모터 및 수렴 AGP 프로모터를 이용하여 AGP를 침묵화시키는 것(녹색 막대)은 단백질 수준을 최대 4배 내지 6배까지 현저하게 증가시켰다. GFP 발현을 루비스코(Rbcs) 표적화 펩티드로 유도하면서 ADP-글루코스 피로포스포릴라제(AGP)를 침묵화시키는 것(청색 막대)는 오직 한 계통에서만 현저한 단백질 증가를 초래하였다. ADP-글루코스 피로포스포릴라제(AGP)의 침묵화(회색 막대)는 단백질 발현을 현저하게 증가시켰으며, 계통 중 일부에서는 3배 증가하였다.
서열목록의 요약
본 출원은 전자 양식의 서열목록과 함께 출원 중에 있다. 서열목록의 전자양식의 정보는 본 출원의 부분이며 전부 본원에서 참조로 인용된다.
서열번호 1은 감자로부터의 파타틴의 서열을 제시한다.
서열번호 2는 P19 돌연변이체 P19R43의 서열을 제시한다.
서열번호 3은 파타틴 PATB1의 안티센스 서열을 제시한다.
서열번호 4는 파타틴 PATB1의 센스 서열을 제시한다.
서열번호 5는 CD4B의 안티센스 서열을 제시한다.
서열번호 6은 CD4B의 센스 서열을 제시한다.
서열번호 7은 EGFP의 센스 서열을 제시한다.
서열번호 8은 GBSS 수송 펩티드의 서열을 제시한다.
서열번호 9는 루비스코 수송 펩티드의 서열을 제시한다.
서열번호 10은 ADP 글루코스 피로포스포릴라제(AGP)의 안티센스 서열을 제시한다.
서열번호 11은 ADP 글루코스 피로포스포릴라제(AGP)의 센스 서열을 제시한다.
도 2는 감자의 카테콜 검정의 결과를 도시한다. 폴리페놀 옥시다제-5(PP05) 유전자를 침묵화시키도록 디자인된 침묵화 작제물을 함유하는 트랜스제닉 계통 F10의 괴경은 비형질전환 대조군의 괴경(상단에서 첫번째 4개 샘플)과 비교해서 감소된 폴리페놀 옥시다제-5 활성을 나타냈다.
도 3. 비형질전환 감자의 괴경(좌측), 및 클로로겐산, 안토시아닌 및 플라보놀의 합성에서 4배 증가를 유발하는 클로로겐산 유도인자(CAI) 유전자를 과발현하는 감자로부터의 괴경(우측).
도 4. PPO5 유전자 침묵화의 노던 블롯 분석. 총 RNA(20㎍)를 PP05 유전자가 침묵화된 트랜스제닉 식물 및 대조군의 온실-성장한 괴경 조직으로부터 단리시키고 PP05 프로브(상부 패널) 및 내부 기준 18S rRNA 프로브(중간 패널)과 하이브리드화시켰다. 예측되는 전사체 크기는 1.95-kb(참조: 진뱅크 등록번호(Genbank Accession) U22921)였다. 하부 패널은 에티듐 브로마이드(EB)로 가시화된 바와 같은 총 RNA의 양을 나타낸다. EC, FC, JC, GC 및 HC는 비형질전환된 통상의 품종으로부터의 대조 샘플이다. 개별적 트랜스제닉 이벤트(event) 샘플은 각 레인 위에 표지화되어 있다. 데이터는 흑반 압상(black spot bruise) 관용성(tolerance)이 PP05 유전자의 효과적 침묵화와 연관됨을 입증한다[참조: 예를 들면, Rommens, CM., Ye, J., Richael, C, Swords, K., 2006, J Agric Food Chem 54:9882-9887].
도 5. 트랜스제닉 감자에서 VTC2 유전자 발현의 노던 블롯 분석. 총 RNA(20㎍)를 트랜스제닉 이벤트 및 대조군(C1-C8)의 온실-성장 괴경 조직으로부터 단리시키고 VTC2 프로브와 하이브리드화시켰다(상부 패널). 하부 패널은 에티듐 브로마이드(EB)로 가시화된 바와 같은 총 RNA의 양을 나타낸다.
도 6. 감자 줄기 외식편에서의 GFP 유전자 발현. 감자 식물을 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자로 형질전환시켰다. 고수준 GFP 발현은 강력한 구성적 프로모터(constitutive promoter)로 과발현시 트랜스제닉 감자 식물에서 볼 수 있었다.
도 7. 비형질전환 감자 꽃, 잎 및 줄기와 비교한 트랜스제닉 감자 꽃, 잎 및 줄기에서의 고수준 GUS 유전자 발현.
도 8. 최적의 유전자 발현을 뒷받침하는 부위로의 관심대상의 유전자(예: GFP)의 전위를 위한 공동형질전환 작제물.
도 9. 대조 벡터 pSIM1903의 지도.
도 10. T-DNA 경계(border) 내에 2x 35S 프로모터-유도된 P19R43(서열번호 2) P19 돌연변이체를 함유하는 벡터 pSIM1927의 지도.
도 11. 선택된 pSIM1927 계통의 GFP 정량. P19R43를 과발현하는 33종의 계통을, 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)를 과발현하는 모체 물질(parent material)로부터 생성시켰다. 모든 계통은 명백한 다면발현 효과없이 온실에서 정상적으로 성장하였다. 상기 트랜스제닉 계통을 공(空)벡터 계통(pSIM1361) 및 모체 계통(parent line)(pSIM1903)과 비교하여 괴경-특이적 GFP 축적에 대해 가시적으로 스크리닝하였다. GFP 정량을 위해 높은 GFP 발현을 나타내는 12종의 계통을 선택하였다. 상기 12종의 트래스제닉 계통 중 10종에서 공벡터 계통에서의 GFP 양과 비교하여 GFP 양의 20 내지 60% 증가가 검출되었다.
도 12. 선택된 pSIM 1927 계통의 웨스턴 블롯 분석. P19R43을 과발현하는 33종의 계통을, 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)을 과발현하는 모체 물질로부터 생성시켰다. 모든 계통은 명백한 다면발현 효과없이 온실에서 정상적으로 성장하였다. 상기 트랜스제닉 계통을 공벡터 계통(pSIM1361) 및 모체 계통(pSIM1903)과 비교하여 괴경-특이적 GFP 축적에 대해 가시적으로 스크리닝하였다. 웨스턴 블롯 분석을 위해 높은 GFP 발현을 나타내는 12종의 계통을 선택하였다. 상기 12종의 트래스제닉 계통 중 10종에서 공벡터 계통에서의 GFP 양과 비교하여 GFP 양의 20 내지 60% 증가가 검출되었다.
도 13. 선택된 pSIM1927 계통의 노던 블롯 분석. P19R43을 과발현하는 33종의 계통을 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)을 과발현하는 모체 물질로부터 생성시켰다. 모든 계통은 명백한 다면발현 효과없이 온실에서 정상적으로 성장하였다. 상기 트랜스제닉 계통을 공벡터 계통(pSIM1361) 및 모체 계통(pSIM1903)과 비교하여 괴경-특이적 GFP 축적에 대해 가시적으로 스크리닝하였다. P19 유전자의 발현을 확인하기 위해, 높은 GFP 발현을 나타내는 7종의 계통으로부터의 RNA를 P19 프로브로 분석하였다. P19 전사체는 가장 높은 GFP 발현을 나타내는 2종의 계통을 포함한 3종의 계통에서 검출되었다. RNA 침묵화의 억제인자인 돌연변이된 p19의 발현을 상승된 GFP 단백질 발현과 연관시키는 이러한 결과들은 RNA 침묵화의 억제인자인 P19의 억제가 식물에서의 단백질 생산을 증진시킴을 입증한다.
도 14. 파타틴 유전자 침묵화 카세트를 함유하는 벡터 pSIM1934의 지도.
도 15. pSIM1934 계통의 GFP 정량. 30종의 pSIM1934 트랜스제닉 계통을, 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)을 과발현하는 모체 물질로부터 생성시켰다. 1361로 표시된 레인은 공벡터 대조군을 의미하고 1903으로 표시된 레인은 GFP 모체 대조군이다. GFP 축적은 pSIM1934 실험군 계통 중 어느 것에서도 관찰되지 않았다.
도 16. 선택된 pSIM1934 계통의 SDS-PAGE 및 웨스턴 분석. 30종의 pSIM1934 트랜스제닉 계통을 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)을 과발현하는 모체 물질로부터 생성시켰다. 1903으로 표시된 레인은 GFP 모체 대조군이고, 1361 + 1903으로 표시된 레인은 공벡터 대조군과 GFP 모체 대조군의 조합물을 의미한다. 10개의 레인에서 대다수의 파타틴 단백질(약 40 kDa 밴드)이 침묵화에 의해 제거되었다.
도 17. CD4B 침묵화 카세트를 함유하는 벡터 pSIM1939의 지도.
도 18. 선택된 pSIM1939 계통의 GFP 정량. 26종의 pSIM1939 계통을 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)을 과발현하는 모체 물질로부터 생성시켰다. 1361로 표시된 레인은 공벡터 대조군을 의미하고 1903으로 표시된 레인은 GFP 모체 대조군을 의미한다. 7종의 트랜스제닉 계통은 모체 계통(pSIM1903)과 비교해서 GFP 축적의 2 내지 3배 증가를 나타냈다.
도 19. 선택된 pSIM1939 계통의 노던 블롯 분석. 26종의 pSIM1939 트랜스제닉 계통을 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)을 과발현하는 모체 물질로부터 생성시켰다. 1361로 표시된 레인은 공벡터 대조군이고 1903으로 표시된 레인은 GFP 모체 대조군이다. 모체 계통(pSIM1903)과 비교해서 GFP 축적의 2 내지 3배 증가를 나타낸 7종의 트랜스제닉 계통의 노던 블롯 분석은 어떠한 계통에서도 CD4B 전사체를 검출하지 못하였으며, 따라서 CD4B 유전자 침묵화를 확인시킨다. 이러한 결과들은 CD4B 프로테아제의 침묵화를 재조합 단백질(GFP) 생산의 2 내지 3배 증가와 연관시키며 CD4B의 괴경-특이적 침묵화를 사용하여 재조합 단백질 생산을 증진시킬 수 있음을 입증한다.
도 20. pSIM1949-2x35S::EGFP 유전자 대조 벡터의 지도.
도 21. 벡터 pSIM1947의 지도. pSIM1947은 2x35S: GBSSTP-eGFP 카세트와 GBSS->sAGP<-AGP 카세트를 보유한다. GFP 발현은 GBSS 수송 펩티드에 의해 유도되며, AGP 침묵화는 GBSS 프로모터에 의해 한 방향으로부터 유도되며 AGP 프로모터에 의해 반대 방향으로부터 유도된다.
도 22. 벡터 pSIM1948의 지도. pSIM1948은 2x35S: RbcsTP-eGFP 카세트와 GBSS->sAGP<-AGP 카세트를 보유한다. GFP 발현은 루비스코 수송 펩티드에 의해 유도되며, AGP 침묵화는 GBSS 프로모터에 의해 한 방향으로부터 유도되며 AGP 프로모터에 의해 반대 방향으로부터 유도된다.
도 23. 어린 감자 잎에서의 GFP 발현. 감자 식물을 pSIM1947(도 21) 또는 pSIM1948(도 22)로 형질전환시켰다. GFP를 강력하게 발현하는, 시험관 내에서 성장하는 트랜스제닉 새싹을 형광 현미경을 사용하여 선택하였고, GFP 발현은 대조 벡터 pSIM1949(도 20)로 형질전환된 대조 계통과 비교해 평가하였다. 좌측 패널은 백색광 하의 잎을 도시하고, 우측 패널은 GFP 필터 사용 하의 잎을 도시한다. 강력한 GFP 발현은 트랜스제닉 pSIM1947 소식물체의 잎에서 검출되었다. pSIM1948 소식물체에서의 GFP 발현은 대조 계통에서의 GFP 발현보다 단지 약간만 더 강력하였다. 이러한 결과들은 GBSS 수송 펩티드를 이용한 동시적 단백질 과발현 및 수렴 프로모터에 의한 AGP 침묵화가 재조합 단백질 생산을 증진시키는 데 있어 효과적임을 나타낸다.
도 24. 솔라넘 튜베로섬(Solanum tuberosum) 파타틴 ER 수송 펩티드(N-말단)와 ER 체류 시그널(C-말단) 사이에 위치하는 사람 인터류킨 2(IL-2)의 절두형(truncated version).
도 25. ER-IL-2 카세트를 함유하고 출발 코돈 전의 BamHI-NcoI 제한 부위 및 종결 코돈 후의 SpeI 부위를 갖는 DNA2.0 벡터.
도 26. 히스티딘 태그된 사람 IL-발현 카세트를 함유하는 벡터 pSIM1936의 지도.
도 27. ER 표적화된, 코돈-최적화된 IL-2 변이체를 함유하는 pSIM1936 벡터로 형질전환된 빈취(Bintje) 감자 계통의 괴경에서의 IL-2 생산. 1936-18 레인은 최적화되지 않은 양성 대조군을 나타낸다. 각각의 변이체마다, 25종의 독립적 트랜스제닉 계통이 생성되었다. 각각의 색상은 형질전환을 위해 사용된 코돈-최적화된 IL-2 변이체를 나타낸다. 각각의 막대는 독립적 트랜스제닉 계통으로부터의 3개의 개별적 괴경에서의 평균 IL-2 수준을 나타낸다. 본 결과는 IL-2 생산이 코돈-최적화된 변이체 중 2종으로부터 수득된 특정한 트랜스제닉 계통에서 2 내지 3배 증가되었음을 나타낸다.
도 28. ER 표적화된, 코돈-최적화된 IL-2 변이체를 함유하는 pSIM1936 벡터로 형질전환된 빈취 감자 계통의 괴경에서의 IL-2 생산. 1936-18 레인은 최적화되지 않은 양성 대조군을 나타낸다. 각각의 변이체마다, 25종의 독립적 트랜스제닉 계통이 생성되었다. 각각의 색상 그룹은 형질전환을 위해 사용된 코돈-최적화된 IL-2 변이체를 나타낸다. 각각의 막대는 독립적 트랜스제닉 계통으로부터의 3개의 개별적 괴경에서의 평균 IL-2 수준을 나타낸다. 본 결과는 IL-2 생산이 상이한 코돈 변이체로부터 수득된 특정한 트랜스제닉 계통에서 2.5배 증가되었음을 나타낸다.
도 29는 GFP 발현으로 측정된, 이종 단백질 생산에 미치는 상이한 침묵화, 과발현 및 표적화 전략의 효과를 도시한다. 10종의 계통을 분석한 CD4B 침묵화를 제외하고 25종의 계통을 각 전략에 대해 분석하였다. 각 막대는 GFP 발현에 대해 분석한 3개의 개별적 괴경을 나타낸다. 각 색상은 다음과 같이 상이한 침묵화, 과발현 또는 표적화 전략에 상응한다: 적색 막대: CD4B의 침묵화. 오렌지색 막대: CD4B와 파타틴의 침묵화. 황색 막대: CD4B와 파타틴의 침묵화 및 P19의 과발현. 녹색 막대: GBSS 프로모터 및 수렴 AGP 프로모터를 이용한 AGP의 침묵화; GFP 발현은 과립-결합 전분 신타제(GBBS) 수송 펩티드에 의해 색소체로 표적화되었다. 청색 막대: GBSS 프로모터 및 수렴 AGP 프로모터를 이용한 AGP의 침묵화; GFP 발현은 루비스코 수송 펩티드에 의해 엽록체로 표적화되었다. 회색 막대: GBSS 프로모터 및 수렴 AGP 프로모터를 이용한 AGP의 침묵화. 올리브그린 막대: 2x35S::EGFP 카세트를 보유한 대조 모체 계통(pSIM1903). 자주색 막대: 2x35S::EGFP 카세트를 보유한 대조 계통(pSIM1949). CD4B 및 파타틴의 침묵화(적색, 황색 및 오렌지색 막대) 또는 단독의 CD4B만의 침묵화는 GFP 대조군과 비교해 단백질 수준을 약간만 증진시켰다. GFP 발현을 과립-결합 전분 신타제(GBBS) 수송 펩티드로 유도하면서 GBSS 프로모터 및 수렴 AGP 프로모터를 이용하여 AGP를 침묵화시키는 것(녹색 막대)은 단백질 수준을 최대 4배 내지 6배까지 현저하게 증가시켰다. GFP 발현을 루비스코(Rbcs) 표적화 펩티드로 유도하면서 ADP-글루코스 피로포스포릴라제(AGP)를 침묵화시키는 것(청색 막대)는 오직 한 계통에서만 현저한 단백질 증가를 초래하였다. ADP-글루코스 피로포스포릴라제(AGP)의 침묵화(회색 막대)는 단백질 발현을 현저하게 증가시켰으며, 계통 중 일부에서는 3배 증가하였다.
서열목록의 요약
본 출원은 전자 양식의 서열목록과 함께 출원 중에 있다. 서열목록의 전자양식의 정보는 본 출원의 부분이며 전부 본원에서 참조로 인용된다.
서열번호 1은 감자로부터의 파타틴의 서열을 제시한다.
서열번호 2는 P19 돌연변이체 P19R43의 서열을 제시한다.
서열번호 3은 파타틴 PATB1의 안티센스 서열을 제시한다.
서열번호 4는 파타틴 PATB1의 센스 서열을 제시한다.
서열번호 5는 CD4B의 안티센스 서열을 제시한다.
서열번호 6은 CD4B의 센스 서열을 제시한다.
서열번호 7은 EGFP의 센스 서열을 제시한다.
서열번호 8은 GBSS 수송 펩티드의 서열을 제시한다.
서열번호 9는 루비스코 수송 펩티드의 서열을 제시한다.
서열번호 10은 ADP 글루코스 피로포스포릴라제(AGP)의 안티센스 서열을 제시한다.
서열번호 11은 ADP 글루코스 피로포스포릴라제(AGP)의 센스 서열을 제시한다.
바람직한 실시양태의 상세한 설명
하기 설명 및 예에서, 다수의 용어들이 사용된다. 이러한 용어들이 제공하는 범주를 포함하여 본 명세서 및 청구범위의 명료하고 일관된 이해를 제공하기 위해, 하기 정의가 제공된다. 정의가 제공되지 않는다면, 본원에서 사용되는 모든 다른 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
암호화. 본원에서 사용되는 바와 같이, "암호화" 또는 "코딩"은 유전자가 전사 및 해독 기작을 통해 세포에게 정보를 제공하고 이로부터 일련의 아미노산이 특정한 아미노산 서열로 조립되어 활성 효소를 생산할 수 있는 과정을 말한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, DNA 서열에서의 특정 염기 변화는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는다. 따라서, 단백질의 기능적 특성에 사실상 영향을 주지 않는 DNA 서열에서의 변형이 고려된다.
발현. 유전자에 의해 암호화된 단백질 생성물의 생산을 의미한다.
과발현. 정상 또는 비-트랜스제닉 유기체에서의 생산 수준을 초과하는 트랜스제닉 유기체에서의 유전자 생성물의 생산을 말한다.
서열 동일률(%). 최적으로 정렬된 두 서열을 비교 창(comparison window) 전반에 걸쳐서 비교하여 측정된 값을 말하는 것으로, 여기서 비교 창 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부분은 두 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교해서 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비율(%)은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양 서열 내에 존재하는 위치의 수를 결정하여 매칭된 위치의 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교 창 내의 위치의 총 수로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일률(%)을 산출함으로써 계산한다.
식물. 본원에서 사용되는 바와 같이, 분화된 또는 미분화된 식물 세포, 원형질체, 전체 식물, 식물 조직 또는 식물 기관을 포함하나 이에 제한되지 않는, 유전적으로 조작될 수 있는 임의의 셀룰로스-함유 식물 물질 또는 잎, 줄기, 뿌리, 눈(bud), 괴경, 과실, 뿌리줄기 등과 같은 식물의 임의의 성분을 의미한다.
발현 제어. 본원에서 사용되는 바와 같이, "발현 제어"는 단백질을 암호화하는 유전자의 발현의 제어를 의미한다. 그 효과는 야생형 유기체에서 전형적으로 관찰되는 발현 수준과 비교해서 서열의 발현 수준의 증가 또는 감소이다.
조절. 본원에서 사용되는 바와 같이, '조절'은 단백질을 암호화하는 유전자의 발현을 제어함을 포함한다. 그 효과는 야생형 유기체에서 전형적으로 관찰되는 발현 수준과 비교해서 서열의 발현 수준의 증가 또는 감소이다.
발현 카세트. 본원에서 사용되는 바와 같이, '발현 카세트'는 하나 이상의 조절 요소 및 하나 이상의 암호화 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열들의 조합을 말한다. 예를 들면, 조절 요소는 프로모터일 수 있다.
유전자 발현의 센스 억제. '유전자 발현의 센스 억제'는 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하기 위해 폴리뉴클레오티드를 사용함을 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 메신저 RNA의 적어도 일부분에 상응하는 RNA 분자를 '센스' 배향으로 발현하도록 디자인된다. 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자의 암호화 서열의 모두 또는 일부분, 표적 유전자의 5' 및/또는 3' 미해독 영역의 모두 또는 일부분, 또는 표적 유전자의 암호화 서열 및 미해독 영역 둘 다의 모두 또는 일부분에 상응할 수 있다. 전형적으로, 센스 억제 요소는 표적 유전자와 상당한 서열 동일성을 갖는다. 예를 들면, 이는 약 65% 서열 동일성을 초과하거나, 85% 서열 동일성을 초과하거나 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성일 수 있다. 센스 억제를 위한 폴리뉴클레오티드는 표적화된 서열의 억제를 가능케하는 한 어떠한 길이라도 될 수 있다. 예를 들면, 이러한 폴리뉴클레오티드는 15, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 900개 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 함유할 수 있다[참조: See Hamilton et al. Curr Top Microbiol Immunol. 197: 77-89 (1995) 및 미국 특허 제5,283,184호].
유전자 발현의 안티센스 억제. 본원에서 사용되는 바와 같이, "유전자 발현의 안티센스 억제"는 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하기 위해 폴리뉴클레오티드를 사용함을 말한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 메신저 RNA의 모두 또는 일부분에 상보적인 RNA 분자를 발현하도록 디자인된다. 이는 표적 유전자를 암호화하는 서열의 상보체의 모두 또는 일부분, 표적 유전자의 5' 및/또는 3' 미해독 영역의 상보체의 모두 또는 일부분, 또는 표적 유전자의 암호화 서열 및 미해독 영역 둘 다의 상보체의 모두 또는 일부분에 상응할 수 있다. 또한, 안티센스 억제 요소는 표적 유전자에 완전히 상보적(즉, 표적 서열의 상보체와 100% 동일함)일 수 있거나 부분적으로 상보적(즉, 표적 서열의 상보체와 100% 미만으로 동일한)일 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자에 대한 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상보성을 포함할 수 있다. 안티센스 억제를 사용하여 동일 식물에서의 다수 단백질의 발현을 억제할 수 있다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,942,657호]. 게다가, 안티센스 억제를 위한 폴리뉴클레오티드는 표적 유전자의 일부분에 상보적일 수 있다. 일반적으로, 적어도 25, 50, 100, 200, 300, 400, 450개의 뉴클레오티드 또는 그 이상의 서열이 사용될 수 있다. 안티센스 억제를 사용하여 식물에서의 내인성 유전자의 발현을 저해하는 방법은 문헌[Liu et al. Plant Physiol.129: 1732-1743 (2002)] 및 미국 특허 제5,759,829호 및 제5,942,657호에 기술되어 있다.
유전자 발현의 RNA 억제. 본원에서 사용되는 바와 같이, "유전자 발현의 RNA 억제"는 표적 유전자의 발현을 감소시키거나 제거하기 위해 단일가닥 또는 이중가닥 RNA를 사용함을 말한다. 상기 단일가닥 또는 이중가닥 RNA는 표적 메신저 RNA의 모두 또는 일부분에 상보적이도록 디자인된다. 이는 표적 유전자를 암호화하는 서열의 모두 또는 일부분, 표적 유전자의 5' 및/또는 3' 미해독 영역의 상보체의 모두 또는 일부분, 또는 표적 유전자의 암호화 서열 및 미해독 영역 둘 다의 상보체의 모두 또는 일부분에 상응할 수 있다. 단일가닥 또는 이중가닥 RNA는 표적 RNA 전사체의 수준에 영향을 미치거나 또는 대안적으로 해독에 영향을 미쳐서 암호화된 폴리펩티드의 수준에 영향을 줌으로써 표적 서열의 발현 수준을 감소시키거나 제거할 수 있다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제7,713,735호; Verdel et al. (2004) Science 303:672-676; Pal-Bhadra et al. (2004) Science 303:669-672; Allshire (2002) Science 297: 1818-1819; Volpe et al. (2002) Science 297: 1833-1837; Jenuwein (2002) Science 297:2215-2218; 및 Hall et al. (2002) Science 297:2232-2237].
서열 동일성. 두 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 범주에서 "동일성"으로도 지칭되며, 명시된 영역에 걸쳐서 최대로 상응하게 정렬되는 경우에 동일한 두 서열 내의 잔기에 대한 언급을 포함한다. 서열 동일률(%)이 단백질과 관련해서 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치는 흔히 보존적 아미노산 치환에 의해 상이한 것으로 인정되며, 이러한 보존적 아미노산 치환에서 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되고 이에 따라 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는다. 서열이 보존적 치환으로 상이한 경우, 서열 동일률(%)은 치환의 보존적 특성을 교정하기 위해 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는다고 언급된다. 이렇게 조정하는 수단은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 전형적으로, 이는 전체 미스매치보다는 부분적 미스매치로서 보존적 치환에 스코어를 매겨서 서열 동일률(%)을 증가시키는 것을 수반한다. 따라서, 예를 들면, 동일한 아미노산에 1점이 부여되고 비보존적 치환에 0점이 부여될 때, 보존적 치환에 0 내지 1의 스코어가 부여된다. 보존적 치환의 스코어는, 예를 들면, 프로그램 PC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, California, USA)에서 실시된 바와 같이, 문헌[참조; Meyers and Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11 17 (1988)]의 알고리즘에 따라서 계산한다.
관심대상의 펩티드. 펩티드는 전형적으로 50개 미만의 아미노산을 함유하는 아미노산 서열이다. 예시적 및 비제한적 펩티드는 항미생물성 펩티드, 병원체의 펩티드 에피토프, 진드기 알레르겐의 에피토프, II형 콜라겐, 아밀로이드 펩티드, 트라추주맙-결합 펩티드 및 종양 연관 반복 배열(tumor associated tandem repeat)을 포함한다.
관심대상의 단백질. 단백질은 전형적으로 대형 폴리펩티드를 말하며, 전형적으로 50개 초과의 아미노산을 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 단백질은 어떠한 관심대상의 단백질이라도 포함한다. 예시적 및 비제한적 단백질은 히루딘, 인슐린, 인터페론, 락토페린, 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 표피 성장 인자, 항체, 및 사람 및 동물 백신(약독화된 바이러스, 외피 단백질 및 암 백신을 포함함)을 포함한다.
트랜스제닉 식물. 정상적으로는 숙주 식물 게놈 내에 존재하지 않는 유전자, 정상적으로 RNA로 전사되지 않거나 단백질로 해독("발현")되지 않는 DNA 서열, 또는 정상적으로는 비형질전환 식물 내에 존재할 수 있지만 유전적으로 조작하고자 하거나 변형된 발현을 갖도록 하고자 하는 유전자와 같은 비형질전환 식물 내로 도입시키고자 하는 임의의 기타 유전자 또는 DNA 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는 핵산 서열이 포함된 식물을 말한다. "트랜스제닉 식물" 범주는 1차 형질전환체와, 예를 들면 표준 유전자이입 또는 다른 육종 절차에 의한 이의 가계(lineage) 내의 형질전환체를 포함하는 식물 둘 다를 포함한다.
가시적 표현형. "가시적 표현형"은 식물에서 선택 마커 유전자를 발현시켜 수득할 수 있는 가시적으로 검출가능한 특징(예를 들면, 색상 변화)를 갖는 식물을 말한다. 예시적 선택 마커는 칼콘 신타제(CHS) 유전자, 안토시아닌 합성 유전자, 아세토하이드록시산 신타제(AHAS) 유전자 및 플라보노이드 합성 유전자를 포함한다.
괴경. 구경 및 구근이 갖는 기저판 및 외피-유사 커버링 둘 다가 없는, 일반적으로 땅속의 비대한 영양 저장 기관. 뿌리 및 새싹은 괴경의 표면상 상에서 "눈(eye)"으로 지칭되는 성장 눈(growth bud)로부터 성장한다. 감자 괴경은 솔라넘 튜베로섬(Solanum tuberosum), 에스. 데미섬(S. demissum), 에스. 아카울레(S. acaule), 에스. 스톨로니페룸(S. stoloniferum), 에스. 푸레자(S. phureja), 에스. 고니칼릭스(S. gonicalyx), 에스. 스테노토멈(S. stenotomum), 에스. 베르타울티(S. berthaultii), 에스. 브레비카울(S. brevicaule), 에스. 부카소비(S. bukasovii), 에스. 카나센스(S. canasense), 에스. 과를레이(S. gourlayi), 에스. 렙토파이에스(S. leptophyes), 에스. 멀티디섹튬(S. multidissectum), 에스. 오플로센스(S. oplocense), 에스. 스파르시필룸(S. sparsipilum), 에스. 스페가지니(S. spegazzinii), 에스. 슈크렌스(S. sucrense), 에스. 벤투리(S. venturii), 에스. 베르네이(S. vernei)에 의해 생산된다.
하나의 실시양태에서, 관심대상의 펩티드 및 단백질은 이배체 감자 식물보다 많은 잎 및 괴경 바이오매스를 산출하고 보다 빠르게 성장하는 사배체 감자 식물(예: 솔라넘 튜베로섬)에서 생산된다. 다른 실시양태에서, 관심대상의 펩티드 및 단백질은 작고 기묘한 모양과 색상의 괴경을 생산하는 이배체(2n) 감자 식물에서 생산된다. 예는 소비용으로 상업적으로 성장시킨 사배체(4n) 재배 감자(솔라넘 튜베로섬)로부터의 보다 크고 균일한 괴경으로 오인될 수 없는, 솔라넘 카코엔스(Solanum chacoense) 기탁물 414153, 458312, 458314, 472819, 498298 및 솔라넘 마이크로돈텀(Solanum microdontum) 기탁물 500033, 500035, 500036, 500038 및 558100을 포함한다.
마찬가지로, 본 출원인은 관심대상의 펩티드 또는 단백질을 과발현시키면서 감자 괴경 저장 단백질과 같은 적어도 하나의 내인성 식물 단백질을 억제하는 것을 포함하는, 식물에서 제어된 방식으로 단백질을 생산하는 방법을 고안하였다. 예를 들면 그리고 결코 제한하지 않으면서, 본 출원인은 관심대상의 펩티드 또는 단백질을 과발현하면서 파타틴 유전자 발현을 억제하는 발현 카세트를 고안하였다. 상이한 실시양태에서, 본 출원인은 관심대상의 펩티드 또는 단백질을 과발현하면서 AGP 발현을 억제하는 발현 카세트를 고안하였다. 사람이 이러한 식물을 소비하는 것을 방지하고 트랜스제닉 식물의 선택을 가능하게 하기 위해, 발현 카세트는 선택의 기반이 될 수 있는 독특한 색상 또는 다른 독특한 특성을 부여하는 선택 마커 유전자를 포함할 수 있다. 추가로, 유도성 프로모터를 사용하여 단백질 생산을 추가로 조절할 수 있다.
선택 마커 유전자는 GFP, EGFP, GUS, LUX, CAH, SPT, NPTII, HPT, APHIV, BAR, PAT, CHS, AHAS 및 플라보노이드 합성 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
식물에서의 단백질 발현을 제어하기 위한 다른 수단으로서, 본 출원인은 관심대상의 펩티드 또는 단백질을 과발현하면서 프로테아제 유전자 발현을 억제하는 발현 카세트를 고안하였다. 예를 들면 그리고 결코 제한하지 않으면서, 발현 카세트는 프로테아제가 억제되고 관심대상의 펩티드 또는 단백질이 생산되도록 사용될 수 있다.
마찬가지로, 식물에서 제어된 방식으로 단백질을 생산하기 위한 다른 방법으로서, 본 출원인은 치료학적 단백질을 과발현하면서, 프로테아제를 억제하는 것 이외에 감자 괴경 저장 단백질과 같은 적어도 하나의 내인성 식물 단백질을 억제하는 발현 카세트를 고안하였다. 예를 들면 그리고 결코 제한하지 않으면서, 발현 카세트는 관심대상의 펩티드 또는 단백질을 과발현하면서, CD4B와 같은 프로테아제 이외에 파타틴 유전자 발현이 억제되도록 사용될 수 있다.
식물에서 제어된 방식으로 단백질을 생산하기 위한 또 다른 방법에서, 본 출원인은 치료학적 단백질을 과발현하면서 감자 전분 생합성 단백질과 같은 적어도 하나의 내인성 식물 단백질의 발현을 억제하는 발현 카세트를 고안하였다. 예를 들면 그리고 결코 제한하지 않으면서, 발현 카세트는 관심대상의 펩티드 또는 단백질을 과발현하면서 ADP 글루코스 피로포스포릴라제(AGP) 발현이 억제되도록 사용될 수 있다.
식물에서 제어된 방식으로 단백질을 생산하기 위한 또 다른 방법에서, 본 출원인은 관심대상의 단백질을 수송 펩티드로 과발현하면서 감자 전분 생합성 단백질과 같은 적어도 하나의 내인성 식물 단백질의 발현을 억제하는 발현 카세트를 고안하였다. 예를 들면 그리고 결코 제한하지 않으면서, 발현 카세트는, 루비스코 수송 펩티드 또는 GBSS 수송 펩티드와 같은 수송 펩티드로 관심대상의 펩티드 또는 단백질의 생산을 형질전환된 감자 식물의 특정한 부위로 표적화하면서, ADP 글루코스 피로포스포릴라제(AGP) 발현이 억제되도록 사용될 수 있다.
관심대상의 펩티드 및 단백질은 인터류킨-2, 히루딘, 인슐린, 인터페론, 락토페린, 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 표피 성장 인자, 탄저병 백신, 콜레라 백신, DPT 백신, hib 백신, A형 간염 백신, B형 간염 백신, C형 간염 백신, HPV 백신, 인플루엔자 백신, 일본 뇌염 백신, MMR 백신, MMRV 백신, 폐렴구균 접합 백신, 폐렴구균 다당류 백신, 폴리오 백신, 로타바이러스 백신, 천연두 백신, 결핵 백신, 장티푸스 백신, 황열병 백신, 파보바이러스 백신, 디스템퍼 백신, 아데노바이러스 백신, 파라인플루엔자 백신, 보르데텔라 백신, 광견병 백신, 렙토스피라증 백신, 라임병 백신, 코로나 백신, 회충/십이지장충 백신, 구충제 백신, RNFN 백신, 리프트밸리열 바이러스(RVFV) 및 HIV 백신을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 모든 기술 용어는 생화학, 분자생물학 및 농업에서 통상적으로 사용되는 용어이며 본 발명이 속하는 분야의 숙련가에 의해 이해될 수 있다. 이러한 용어들은 문헌[MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3rd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook and Russel, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, ed. Ausubel et al., Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience, New York, 1988 (주기적으로 갱신됨); SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 5th ed., vol. 1-2, ed. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Inc., 2002; GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL, vol. 1-2, ed. Green et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1997]에서 찾아볼 수 있다. 식물 생물학 기술을 수반한 방법은 문헌[METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY: A LABORATORY COURSE MANUAL, ed. Maliga et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1995]과 같은 논문에 상세히 기술되어 있다. PCR을 사용하는 다양한 기술은 예를 들면 문헌[Innis et al., PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, San Diego, 1990 및 Dieffenbach and Dveksler, PCR PRIMER: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2003]에 기술되어 있다. PCR-프라이머쌍은 이러한 목적을 위한 컴퓨터 프로그램, 예를 들면, Primer, Version 0.5, 1991(제조원: Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge, MA)을 사용하는 것과 같은 공지된 기술에 의해 공지된 서열로부터 유래될 수 있다. 핵산의 화학적 합성 방법은 예를 들면 문헌[Beaucage and Caruthers, Tetra. Letts. 22: 1859-1862 (1981), 및 Matteucci and Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)]에 논의되어 있다.
제한 효소 분해, 인산화, 연결 및 형질전환은 문헌[Sambrook et al, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2nd ed. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press]에 기술된 바와 같이 수행하였다. 세균 세포의 성장 및 유지를 위해 사용된 모든 시약 및 재료는 달리 명시하지 않는 한 알드리치 케미칼스(Aldrich Chemicals)(Milwaukee, WI), 디프코 래보러터리(DIFCO Laboratories)(Detroit, MI), 인비트로겐(Invitrogen)(Gaithersburg, MD) 또는 시그마 케미칼 컴퍼니(Sigma Chemical Company)(St. Louis, MO)로부터 입수하였다.
"암호화" 또는 "코딩"이란 용어는 유전자가 전사 및 해독 기작을 통해 세포에게 정보를 제공하고 이로부터 일련의 아미노산이 특정한 아미노산 서열로 조립되어 활성 효소를 생산할 수 있는 과정을 말한다. 유전자 코드의 축퇴성으로 인해, DNA 서열에서의 특정 염기 변화는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는다. 따라서, 단백질의 기능적 특성에 사실상 영향을 주지 않는 DNA 서열에서의 변형이 고려된다.
본 설명에서, "발현"은 유전자에 의해 암호화된 단백질 생성물의 생산을 의미한다. "과발현"은 정상 또는 비-트랜스제닉 유기체에서의 생산 수준을 초과하는 트랜스제닉 유기체에서의 유전자 생성물의 생산을 말한다.
발명의 추가 실시양태
전술한 예시적 태양 및 실시양태 이외에, 추가의 태양 및 실시양태가 하기 설명을 검토함으로써 명백해질 것이다.
A. 예시적 단백질
본 작제물 및 방법을 사용하여 어떠한 단백질이라도 발현시키거나 억제할 수 있다.
RNAi, 안티센스, 삽입 돌연변이유발 및 당업계에 공지된 기타 기술과 같은 각종 기술을 사용하여 본 발명의 방법에 따라서 어떠한 단백질이라도 억제시킬 수 있다. 특히, 본 출원인은 프로테아제, 저장 단백질 또는 전분 생합성 단백질을 억제하면서 동시에 관심대상의 치료학적 단백질을 과발현시키는 단계를 포함하는 방법을 고안하였다. 비제한적 예로서, 프로테아제는 RNAi에 의해 억제할 수 있고 식물의 정상적 성장 및 발달을 불리하게 간섭하지 않도록 유도성 프로모터를 사용하여 제어할 수 있다.
예시적 프로테아제 서열은 표 1에 개시된 내인성 감자 프로테아제 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
[표 1]
추가의 예시적 프로테아제는 엽록체에서 발견되는 ATP-의존적 프로테아제 ATP-결합 서브유닛 clpA 상동체인 CD4B이다. Clp 프로테아제는 키모트립신-유사 활성을 가지며 미스폴딩된 단백질의 분해에서 주요한 역할을 한다[참조: Daniell et al., Theor. Appl. Genet. MIL 1503-1518 (2006)]. 본 발명에 따라서, 감자에서 CD4B의 침묵화는 CD4B가 침묵화되지 않은 감자에 비해서 높은 수준의 단백질 생산을 야기한다.
파타틴은 솔라넘 튜베로섬에서 발견되는 당단백질(서열번호 1에 제시된 서열) 이다. 파타틴의 주요 기능은 저장 단백질로서의 기능이다. 파타틴은 감자 괴경 내의 가용성 단백질의 최대 40%를 구성하지만, 다른 식물 기관에서는 훨씬 낮은 수준으로 존재한다[참조: Hofgen et al. Plant Science, 66:221-230, (1990)].
본 발명에 따라서, 감자에서 ADP 글루코스 피로포스포릴라제(AGP)의 침묵화는 AGP가 침묵화되지 않은 감자에 비해서 높은 수준의 단백질 생산을 야기한다. AGP는 식물의 전분 생합성에서 전구체인 ADP-글루코스를 생산한다. 본 발명의 작제물은 2종의 수렴 프로모터에 작동적으로 연결된 전체길이 AGP 서열 또는 이의 단편을 포함하여, AGP의 침묵화가 상기 2종의 프로모터에 의해 반대 방향으로부터 유도될 수 있다. 본 발명의 특정 태양에서, GBSS 프로모터는 한 방향으로부터 AGP 침묵화를 유도하고, AGP 프로모터는 반대 방향으로부터 AGP 침묵화를 유도한다.
추가의 실시양태에서, 본 발명에 따른 단백질 생산은 파타틴, CD4B, AGP 또는 이들의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 내인성 단백질의 발현을 억제하면서 전사후 유전자 침묵화(PTGS)의 바이러스성 억제인자를 과발현시킴으로써 추가로 증진시킬 수 있다. PTGS의 바람직한 바이러스성 억제인자는 담배 블러시 위축 바이러스(Tobacco blushy stunt virus) 침묵화 억제인자 P19이다. PTGS는 RNA 침묵화에 의해 유전자 발현을 방지하여 식물에서 아그로박테리움-매개성 형질전환 효율을 제한하는 뉴클레오티드 서열-특이적 RNA이다. 본 출원의 발명자들은 놀랍게도 동시적인 P19의 과발현 및 하나 이상의 감자 내인성 단백질의 억제가 감자 괴경에서 외인성 단백질 생산을 극적으로 증진시킨다는 것을 발견하였다.
전술된 본 발명의 침묵화 작제물을 이용하여 어떠한 단백질이라도 발현시키거나 과발현시킬 수 있다. 본 발명의 바람직한 태양에서, 수송 펩티드를 형질전환된 식물의 목적하는 부위에서 단백질 생산을 증진시키기 위해 사용할 수 있다. 적합한 수송 펩티드는 GBSS 수송 펩티드 및 루비스코 수송 펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 예를 들면 그리고 결코 제한하지 않으면서, 본 발명의 작제물은 파타틴, CD4B, AGP 또는 이들의 임의의 조합과 같은 하나 이상의 내인성 단백질의 발현을 억제하면서 감자 식물에서 관심대상의 단백질 또는 펩티드를 과발현시킬 것이다.
예를 들면 그리고 결코 제한하지 않으면서, 본 방법 및 작제물을 사용하여 발현시킬 수 있는 단백질은 인터류킨-2, 히루딘, 인슐린, 인터페론, 락토페린, 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 표피 성장 인자, 단일쇄 항체와 같은 항체, 및 사람 및 동물 백신 (약독화된 바이러스, 외피 단백질 및 암 백신을 포함함)이다.
인터류킨-2는 정상 말초혈 림프구에 의해 생산되는 림포카인이며 항원 또는 기타 자극에 노출 후 항원 또는 미토겐 자극된 T 세포의 증식을 유도한다[참조: Morgan et ah, Science 193: 1007-1008 (1976)]. 이는 자극된 T 림프구의 증식을 유도하는 이의 능력으로 인해 처음에는 T 세포 성장 인자로 지칭되었으며, 현재는 이의 성장 인자 특성 이외에도 시험관내 및 생체내에서 면역계 세포의 다양한 기능을 조절하는 것으로 인정되고 있으며 인터류킨-2(IL-2)로 재명명되었다. IL-2는 면역세포 상호작용 및 기능을 매개하는 몇몇 면역세포-생산 메신저-조절성 분자 중 하나이다. IL-2는 하기 실시예에서 입증된 바와 같이 본원에 기술된 방법을 사용하여 식물에서 생산할 수 있다.
히루딘은 의료용 거머리(예를 들면, 히루도 메디키날리스(Hirudo medicinalis))의 타액선 내의 천연 발생 펩티드이다. 히루딘은 혈액이 혈관 외부를 계속 흐르도록 하기 때문에 숙주의 혈액을 빨아먹는 거머리의 능력에 필수적인 항혈액응고 특성을 갖는다.
히루딘은 피브리노겐을 피브린으로 전환시켜 혈액 응고를 유발하는 트롬빈의 가장 강력한 천연 저해제이다. 히루딘은 이의 항응혈 활성으로 인해 혈액응고 장애, 피부 혈종 및 표재성 정맥류를 치료하는 데 사용될 수 있다. 그러나, 천연 공급원으로부터 다량의 히루딘 추출은 어려운 것으로 드러났다. 따라서, 재조합 DNA 기술을 통한 히루딘의 발현이 개발되었다. 레피루딘(Lepirudin), 트롬벡스(Thrombexx), 레바스크(Revasc) 및 이프리바스크(Iprivask)(모두 효모 세포로부터 유래됨)을 포함하는 몇몇 히루딘-기반 항응혈 약제품이 시판되고 있다. 효모 시스템과 비교하여, 본 기술은 보다 저비용이고 관리가능한 대규모 생산을 제공한다.
인슐린은 간, 근육 세포 및 지방 조직이 혈액으로부터 글루코스를 흡수하도록 함으로써 탄수화물 및 지방 대사작용을 조절하는 호르몬이다. 그 다음, 글루코스는 간과 근육 내에 글리코겐으로서 저장된다. 신체는 혈액으로부터 과량의 글루코스를 제거하기 위해 인슐린을 일정한 수준으로 유지시킨다. 인슐린 수준의 제어가 실패하는 경우 당뇨병이 발생한다. 외부 인슐린을 의학적으로 사용하여 일부 형태의 당뇨병을 치료할 수 있다. 본 기술은 대규모 및 저비용 생산과 함께, 의료용 인슐린을 생산하는 유리한 접근법을 제공한다.
인터페론은 바이러스, 세균, 기생충 또는 종양 세포와 같은 병원체의 존재에 반응하여 숙주 세포에 의해 방출되는 단백질이다. 인터페론은 숙주 세포 내에서의 바이러스 복제를 "간섭"하는 것 이외에도 T 림프구에 대한 항원 제시를 상향조절하고 감염되지 않은 숙주 세포가 새로운 바이러스 감염에 저항하는 능력을 증가시킨다. 인터페론의 면역 효과는 광선각화증 및 외부생식기 사마귀와 같은 몇몇 질환을 치료하기 위해 이용되었다. 추가로, 인터페론 치료요법은 모발상세포백혈병, 만성 골수성 백혈병, 결절성 림프종, 피부 T-세포 림프종과 같은 백혈병 및 림프종을 포함하는 많은 암의 치료법으로서 (화학요법 및 방사선과 병용하여) 사용되고 있다. 멀티페론(Multiferon)™(사람 림프구 인터페론-알파로서 일반적으로 공지됨) 및 페길화된(PEGylated) 인터페론-알파와 같은 인터페론의 몇몇 상이한 유형은 사람에서의 사용이 승인되어 있다. 페길화는 폴리에틸렌 글리콜 중합체 쇄를 다른 분자, 보통 약물 또는 치료학적 단백질에 공유 결합시키는 과정이다. 본 기술은 인터페론을 대규모로 저비용으로 생산하는 방법을 제공한다.
락토트랜스페린으로도 공지된 락토페린은 트랜스페린 계열의 다기능성 단백질이다. 락토페린은 선천 면역계에 속한다. 철 이온의 결합 및 수송의 주요 생물학적 기능 외에도, 락토페린은 항세균, 항바이러스, 항기생충, 효소적, 항암, 항알레르기 및 방사선보호 기능 및 특성도 갖는다. 락토페린은 세균의 생물막 발생을 방지한다. 락토페린 활성 감소로 인한 살미생물 활성의 상실 및 생물막의 형성 증가는 낭성섬유증 환자에서 관찰된다. 이러한 조사결과는 사람 숙주 방어 및 특히 폐에서의 락토페린의 중요한 역할을 입증한다. 락토페린과 하이포티오시아나이트는 FDA에 의해 희귀의약품으로 승인되었다. 따라서, 락토페린은 대규모로 저비용으로 생산할 수 있는 것이 매우 바람직하다. 본 기술은 이러한 생산 방법을 제공한다.
헤모글로빈은 모든 척추동물의 적혈구 내의 철-함유 산소-수송 금속단백질이다. 산소 이외에, 헤모글로빈은 다른 기체의 수송에도 관여한다: 이는 신체의 호흡기 이산화탄소의 일부(전체의 약 10%)를 운반한다. 헤모글로빈은 또한 글루빈 단백질 티올 기에 결합된 중요한 조절성 분자 산화질소를 운반하여 이를 산소와 동시에 방출한다. 헤모글로빈 결핍 질환은 빈혈에서와 같이 헤모글로빈 분자의 양의 감소에 의해 또는 각 분자가 동일한 산소 분압에서 산소에 결합하는 능력의 감소에 의해 유발될 수 있다. 원인에 상관없이, 헤모글로빈 결핍 질환은 혈액 산소 운반능을 감소시킨다. 신체에 외부 헤모글로빈을 공급하는 것은 헤모글로빈 결핍증을 치료하기 위한 중요한 접근법이다. 본 기술은 헤모글로빈을 대규모로 저비용으로 생산하는 방법을 제공한다.
에리트로포이에틴(헤마토포이에틴 또는 헤모포이에틴으로도 지칭됨)은 적혈구형성 또는 적혈구 생산을 제어하는 당단백질 호르몬이다. 에리트로포이에틴은 아폽토시스(apoptosis)로부터 적혈구를 보호함으로써 적혈구 생존을 촉진한다. 에리트로포이에틴은 또한 적혈구 전구체의 발생에 관여하는 다양한 성장 인자와 협조한다. 저산소 조건 하에, 신장은 에리트로포이에틴을 생산하고 분비하여 적혈구의 생산을 증가시킬 것이다. 에리트로포이에틴은 또한 혈관신생의 자극 및 평활근 섬유의 증식의 유도에도 관여한다. 에리트로포이에틴은 또한 호르몬 헵시딘을 억제함으로써 철 흡수를 증가시키는 것으로 나타났다. 의학적으로, 에리트로포이에틴은 만성 신장 질환, 척수형성이상증 및 암 치료(화학요법 및 방사선)에서 비롯된 빈혈을 치료하는 데 사용되었다. 본 기술은 에리트로포이에틴을 대규모로 저비용으로 생산하는 방법을 제공한다.
표피 성장 인자(또는 EGF)는 이의 수용체 EGFR에 결합함으로써 세포 성장, 증식 및 분화의 조절에서 중요한 역할을 하는 성장 인자이다. 표피 성장 인자는 사람 혈소판, 대식세포, 뇨, 타액, 젖 및 혈장에서 발견될 수 있다. 연구는 EGF가 정자형성, 정상 임신의 완료, 유선 발달 및 상처 치유를 포함하는 많은 생리학적 과정에서 중요하다는 것을 제시하였다. EGF 결핍은 이러한 생리학적 과정들과 관련된 다양한 질환의 병리에 기여할 가능성이 있다. 다른 발현 시스템과 비교할 때, 본 기술은 EGF를 대규모로 저비용으로 생산하는 유망한 접근법을 제공한다.
본 기술을 사용함으로써, 항체를 식물에서 재조합에 의해 생산할 수 있다. 예를 들면 그리고 비제한적으로, 단일쇄 항체를 감자 식물에서 생산할 수 있다.
B. 백신 및 감염 치료/예방
상기 논의한 예시적 단백질 이외에, 본 기술은 약독화된 바이러스, 외피 단백질 및 암 백신을 포함하는 사람 및 동물 백신을 생산하기 위한 유리한 대안적 접근법을 또한 제공한다. 예를 들면, 본 기술은 탄저병 백신, 콜레라 백신, DPT(디프테리아, 백일해 및 파상풍) 백신, hib 백신, A형 간염 백신, B형 간염 백신, HPV(사람 파필로마바이러스) 백신, 인플루엔자 백신, 일본 뇌염 백신, MMR(홍역, 볼거리 및 풍진) 백신, MMRV (홍역, 볼거리, 풍진 및 수두) 백신, 폐렴구균 접합 백신, 폐렴구균 다당류 백신, 폴리오 백신, 로타바이러스 백신, 천연두 백신, 결핵 백신, 장티푸스 백신 및 황열병 백신과 같은 사람 백신을 생산하는데 사용될 수 있다.
본 기술은 파보바이러스 백신, 디스템퍼 백신, 아데노바이러스 백신, 파라인플루엔자 백신, 보르데텔라 백신, 광견병 백신, 렙토스피라증 백신, 라임병 백신, 코로나 백신, 회충/십이지장충 백신 및 구충제 백신과 같은 동물 백신을 생산하는데 사용될 수 있다.
암 백신이란 용어는 암-유발 바이러스 감염을 예방하거나 기존의 암을 치료하거나 특정 고위험 개체에서 암의 발생을 예방하는 백신을 말한다. 자궁경부암과 같은 일부 암 및 일부 간암은 바이러스에 의해 유발된다. HPV (사람 파필로마바이러스) 백신 및 B형 간염 백신과 같은, 이러한 바이러스들에 대항하는 종래의 백신은 이러한 암들을 예방할 것이다.
1. 리프트밸리열 바이러스(RVFV)
추가로, 본 기술은 리프트밸리열 바이러스(RVFV)의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다. RVFV는 모기 매개의 바이러스로서, 이의 주기적 유행은 사하라 이남 아프리카의 대부분에 걸쳐서 가축 개체군에 파괴적인 경제적 효과를 미쳤다. 사람에서, RVFV 감염은 뇌, 척수 및 뇌막의 염증, 시각장애를 동반한 망막염, 및 출혈을 동반한 간 괴사를 유발한다. 최근의 발병은 심각한 사람 사망률 및 지리적 발자국(geographic footprint)의 증가를 야기하여 아프리카 대륙에서 벗어나서 사우디 아라비아 및 예멘으로 진입함으로써 새로운 지역에서 출현하는 능력을 입증한다. 이의 증가되는 감수성, 확산, 벡터 가소성(vector plasticity) 및 에어로졸화 용이성으로 인해, RVFV는 질병통제센터에 의해 신흥 감염성 질환 및 카테고리 A 선별 물질(category A select agent)로서 목록에 포함되었다. 신흥 위협으로서 인정되고 있음에도 불구하고, RVFV의 병원성 기작에 관해서 비교적 공지된 것이 없으며, 현재 RVFV에 대한 FDA 허가된 백신 또는 치료제가 없다. 신규 항바이러스 치료제를 개발하기 위해 바이러스 복제 경로 및 숙주 세포 관련 발병기전을 보다 잘 이해하는 것이 절실히 필요하다.
RVFV는 주로 가축에 침범하며 성체 동물에서는 열 및 자연 유산의 사례로서 나타나고 어린 동물에서는 높은 사망률로서 나타난다. 사람에서, 상기 바이러스는 다양한 중증도의 질환을 야기할 수 있다. 대부분의 사례에서, 환자들에서 열, 두통, 근육통 및 간 이상을 동반한 경미한 질환이 발생한다. 적은 비율의 사례에서, 그 질환은 출혈열 또는 수막뇌염으로 진행할 수 있다. 또한, 실명을 포함하여 망막 손상을 야기하는 안구 후유증이 발생할 수 있다. 감염된 사람의 약 1%가 질환으로 사망하였으나, 최근에 이러한 비율은 아마도 치료를 청하는 사람의 발생률 증가로 인해 증가하였을 것이다(대략 45%). 풍토병 국가 밖에서의 RVFV의 발병은 심각한 건강 및 농업 문제를 야기한다. RVFV의 고의적 전파는 국가적 생물보안의 심각한 문제이고 이에 따라 RVFV는 CDC 및 USDA에 의해 카테고리 A 중복 선별 물질로서 분류된다[참조: Bird et al. J. Am. Vet Med. Assoc., 234(7):883-893 (2009)]. 일부 사례에서, 리바바린이 치료제로서 사용되나, 원치 않는 부작용이 있다.
따라서, 본 출원은 RVFV에 대항하는 백신접종을 위한 방법 및 작제물을 고려한다. 이와 관련하여, 당업계에 공지된 바와 같이, 불활성화된, 약독화된 생 및 재조합 백신들이 RVFV 감염을 예방하기 위해 사용될 수 있다. 마찬가지로, 재조합 접근법을, 바이러스 복제 및/또는 전사를 저해하거나 달리 변경하는 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 단백질은 본원에 기술된 방법 중 어느 것이라도 사용하여 식물에서 생산할 수 있다.
2. HIV
고도로 활성인 항레트로바이러스 치료요법(HAART)은 HIV 감염을 관리하는데 있어 매우 성공적이었다. 그러나, HAART 의약은 신체에서 HIV를 없애지 못하였다. HIV는 체내에서 휴면상태를 유지할 수 있다. 환자들은 이들의 HAART 치료가 중단되는 경우 보다 증후성이 되고 보다 감염성이 될 수 있다. Tat 단백질은 HIV에 의해 생산되며 HIV dsRNA의 전사를 자극한다[참조: Kim, J.B. and P.A. Sharp, J. Biol. Che.m, 276 (15): 12317-12323 (2001)]. Tat 단백질은 물질전달 도메인(transduction domain) 및 핵 국재화 시그널을 함유하고 따라서 상기 단백질은 세포 및 세포의 핵으로 진입할 수 있다[참조: Campbell et al., J. Biol. Chem., 279 (46):48197-481204 (2004)].
따라서, 본 출원은 HIV 감염을 지연시키는 것을 포함하는 HIV를 치료하기 위한 방법 및 작제물을 고려한다. 예를 들면 그리고 비제한적으로, 재조합 접근법을 바이러스 복제 및/또는 전사를 저해하거나 달리 변경하는 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 단백질은 본원에 기술된 방법 중 어느 것이라도 사용하여 식물에서 생산할 수 있다.
3. C형 간염 바이러스
전세계에서 350,000명이 넘는 사람들이 매해 HCV-관련 간 질환으로 사망하는 것으로 추정된다[참조: Perz et al. J. Hepatol. 45:529-538 (2006)]. HCV는 흔히 체내에서 증식하는 동안에 이의 희생자들에게 불편함을 야기하지 않는 소리없는 살인자이다. 상기 바이러스는 열 및 피로감과 같은 감기 유사 증상을 천천히 유발하면서 자체로 나타나고 간을 서서히 침범하고 여기서 간경화증 또는 암을 유발한다. 일반적으로 HCV는 감염된 혈액을 통해 전염된다. 백신은 개발 중에 있다.
따라서, 본 출원은 HCV를 치료하고/하거나 지연시키기 위한 방법 및 작제물을 고려한다. 이와 관련하여, 재조합 접근법을 바이러스 복제 및/또는 전사를 저해하거나 달리 변경하는 단백질을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 단백질은 본원에 기술된 방법 중 어느 것이라도 사용하여 식물에서 생산할 수 있다.
C. 유전자 발현의 억제
핵산 작제물은 예를 들면 치료학적 단백질을 암호화하는 목적하는 폴리뉴클레오티드의 수렴 전사(convergent transcription)를 촉발시켜 표적 핵산의 전사 또는 해독을 효과적으로 감소시키거나 방지하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 작제물의 한가지 특정한 특징은 통상의 침묵화 작제물과 달리 기능적 터미네이터가 삽입되지 않아 목적하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단에 작동적으로 연결되지 않는다는 점이다.
예시적 작제물의 다른 특징은 이것이, 서로 대립되는 두 프로모터를 통해, 터미네이터에 작동적으로 직접 연결되거나 연결되지 않은 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 카피의 수렴 전사를 촉진한다는 점이다. 종결 시그널의 부재로 인해, 제1 프로모터 및 제2 프로모터로부터 전사되는 RNA 분자의 풀(pool)의 길이는 다양한 길이일 수 있다. 때때로, 예를 들면, 전사 기구는 목적하는 폴리뉴클레오티드 서열의 "말단"을 의미하는 마지막 뉴클레오티드를 지나서 전사를 계속할 수 있다. 따라서, 이러한 특정한 배열에서, 전사 종결은 예를 들면 헤어핀 형성을 촉진하는 하류 서열의 약하고 의도되지 않은 작용을 통해 또는 전달 DNA 통합 부위에 플랭킹(flanking)된 식물 DNA에 위치하는 의도되지 않은 전사 터미네이터의 작용을 통해 일어날 수 있다.
따라서, 터미네이터 부재 충돌 전사(terminator-free colliding transcription; TFCT) 작제물은 제1 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 제1 프로모터 및 제2 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함할 수 있고, 이에 인해 (1) 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 서로 그리고 표적 서열과 적어도 일부 서열 동일성을 공유하고 (2) 제1 프로모터는 이러한 프로모터에 의해 개시되는 전사의 방향이 제2 프로모터를 향해서 진행되도록 배향되고 그 반대도 또한 그러하고, (3) 상기 작제물은 일반적으로 크기가 상이한 RNA 분자, 폴리뉴클레오티드의 적어도 일부분의 RNA 대응물을 나타내는 일부 전사체 및 폴리뉴클레오티드와 이의 역 상보체 둘 다의 적어도 일부의 대응물을 포함하는 나머지 것들을 생산한다[참조: 미국 특허 제7,713,735호, 이의 전문은 본원에서 참조로 인용된다].
목적하는 폴리뉴클레오티드는 2개의 상이한 배향으로 프로모터에 연결될 수 있다. 하나의 배향, 예를 들면, "센스"에서, 생성된 RNA 전사체의 적어도 5'-부분은 적어도 하나의 표적 전사체의 적어도 일부분과 서열 동일성을 공유할 것이다. "안티센스"로서 지정된 다른 배향에서, 예상되는 전사체의 적어도 5'-부분은 적어도 하나의 표적 전사체의 역 상보체의 적어도 일부분과 동일하거나 상동성일 것이다.
작제물은 또한 목적하는 폴리뉴클레오티드의 양측에서의 프로모터의 배열을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 작제물은, 목적하는 폴리뉴클레오티드의 두 가닥 모두가 전사되도록 하나 이상의 목적하는 폴리뉴클레오티드의 플랭킹되어 있거나 목적하는 폴리뉴클레오티드의 카피에 플랭킹되어 있는 2종 이상의 프로모터를 포함할 수 있다. 즉, 하나의 프로모터는 목적하는 폴리뉴클레오티드의 5'-말단의 전사를 개시하도록 배향될 수 있는 한편, 제2 프로모터는 동일한 목적하는 폴리뉴클레오티드의 3'-말단으로부터 전사를 개시하도록 작동적으로 배향될 수 있다. 반대로 배향된 프로모터들은 목적하는 폴리뉴클레오티드의 다수의 카피에 플랭킹될 수 있다. 따라서, "카피 수"는 작제물이 수렴 전사를 유도하도록 배향된 프로모터에 의해 궁극적으로 플랭킹된 목적하는 폴리뉴클레오티드의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 개 또는 100개 초과의 카피 또는 이 사이의 임의의 정수를 포함할 수 있도록 달라질 수 있다.
대안으로, 제1 프로모터는 예를 들면 "카세트 A" 내의 제1 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결될 수 있고, 제2 프로모터는 예를 들면 "카세트 B" 내의 제2 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결될 수 있다. 각 카세트의 폴리뉴클레오티드는 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있거나 포함할 수 없지만, 관심대상의 표적 핵산 서열과 약간의 서열 동일율(%)을 공유할 수 있다. 상기 카세트들은 일렬로(tandemly) 배열, 즉 작제물 내에서 서로 인접하도록 배열될 수 있다. 게다가, 예를 들면 카세트 B는 카세트 A에 대해 역 상보적 배향으로 배향될 수 있다. 따라서, 이러한 배열에서 카세트 B의 프로모터로부터의 전사는 카세트 A의 프로모터를 향하는 방향으로 진행될 것이다. 따라서, 카세트들은 "수렴 전사"를 유도하도록 배열된다.
카세트가 터미네이터 서열을 포함하지 않는다면, 이러한 작제물은 수렴 전사 배열 때문에 길이가 상이한 RNA 전사체를 생산할 수 있다.
따라서, 이러한 상황에서는, 각 카세트로부터 전사된 목적하는 폴리뉴클레오티드의 부분적 또는 전체길이 서열을 포함하는 부분적으로 또는 완전히 전사된 RNA 전사체의 아집단이 존재할 수 있다. 대안으로, 기능적 터미네이터의 부재 하에, 전사 기구는 목적하는 폴리뉴클레오티드의 마지막 뉴클레오티드를 지나서 진행하여, 목적하는 폴리뉴클레오티드의 길이보다 긴 전사체가 생산될 수 있다.
따라서, 목적하는 폴리뉴클레오티드의 2개 카피를 포함하는 작제물에서, 이 폴리뉴클레오티드들 중 하나가 다른 하나에 대해 역 상보적 방향으로 배향될 수 있거나 배향될 수 없는 경우 및 이 폴리뉴클레오티드들이 수렴 전사를 유도하는 프로모터에 작동적으로 연결되고 작제물 내에 기능적 터미네이터가 없는 경우, 하나의 목적하는 폴리뉴클레오티드로부터 개시되는 전사 기구는 목적하는 폴리뉴클레오티드의 나머지 카피를 전사하도록 진행될 수 있고 그 반대도 또한 그러할 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오티드의 다수의 카피는 다양한 순열로 배향될 수 있다: 목적하는 폴리뉴클레오티드의 2개 카피가 작제물 내에 존재하는 경우, 카피들, 예를 들면, 둘 다는 동일한 방향으로, 서로에 대해 역 배향으로 또는 서로에 대해 역 상보적 배향으로 배향될 수 있다.
목적하는 폴리뉴클레오티드 중 하나가 다른 폴리뉴클레오티드에 대해 역 상보적 배향으로 배향되는 배열에서, 제1 폴리뉴클레오티드의 "센스" 서열뿐만 아니라 제2 폴리뉴클레오티드의 "안티센스" 서열도 포함하는 RNA 전사체가 생산될 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 동일하거나 실질적으로 동일한 DNA 서열을 포함한다면, 단일 RNA 전사체는 서로 상보적이어서 어닐링(annealing)될 수 있는 두 영역을 포함할 수 있다. 따라서, 이렇게 전사된 단일 RNA 전사체는 부분적 또는 완전한 헤어핀 이중체 구조를 형성할 수 있다.
반면에, 이러한 긴 전사체의 2개 카피가 각 프로모터로부터 하나씩 생산되었다면, 각각 나머지와 서열 상보성의 영역을 공유할 수 있는 2개의 RNA 분자가 존재할 것이다. 따라서, 제1 RNA 전사체의 "센스" 영역은 제2 RNA 전사체의 "안티센스" 영역에 어닐링될 수 있고, 그 반대도 또한 그러하다. 따라서, 이러한 배열에서, 단일 자가-상보적 RNA 전사체로부터 형성되는 헤어핀 이중체와 대조적으로 2개의 별개의 RNA 전사체로 이루어진 다른 RNA 이중체가 형성될 수 있다.
대안으로, 목적하는 폴리뉴클레오티드의 2개 카피는, 전사 판독-진행의 경우, 하나의 프로모터로부터 생산되는 긴 RNA 전사체가 예를 들면, 목적하는 폴리뉴클레오티드의 제1 카피의 센스 서열 및 또한 목적하는 폴리뉴클레오티드의 제2 카피의 센스 서열을 포함할 수 있도록 동일한 방향으로 배향될 수 있다. 따라서, 다른 수렴-배향된 프로모터로부터 생산되는 RNA 전사체는 목적하는 폴리뉴클레오티드의 제2 카피의 안티센스 서열 및 또한 제1 폴리뉴클레오티드의 안티센스 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 어느 RNA 전사체도 정확한 상보성의 영역을 함유하지 않을 수 있고 이에 따라 어느 RNA 전사체도 자체로 폴딩되어 헤어핀 구조를 생성시킬 가능성이 없다. 반면에, 2개의 개별적 RNA 전사체는 서로 하이브리드화되고 어닐링되어 RNA 이중체를 형성할 수 있다.
따라서, 하나의 태양에서, 본 발명은 터미네이터가 없거나 자가-스플라이싱 리보자임 암호화 DNA 영역이 선행하는 터미네이터가 없지만, 제1 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되어 있는 제1 프로모터 및 제2 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되어 있는 제2 프로모터를 포함하고, 이에 의해 (1) 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드가 서로 적어도 일부 서열 동일성을 공유하고, (2) 제1 프로모터는 이러한 프로모터에 의해 개시되는 전사의 방향이 제2 프로모터를 향해서 진행되도록 배향되고 그 반대도 또한 그러하고, (3) 이러한 수렴 배열이 전반적으로 길이가 상이한 다양한 RNA 전사체를 생성하는 작제물을 제공한다.
목적하는 폴리뉴클레오티드는 서로의 완전하거나 불완전한 반복체 또는 서로의 완전하거나 불완전한 역 상보적 반복체일 수 있다. 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 작제물의 경우, 제2 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드 서열이 제1 폴리뉴클레오티드와 완전히 또는 부분적으로 동일할 수 있고 제1 폴리뉴클레오티드에 대해 직접적 또는 역 상보적 배향으로 배향될 수 있다. 따라서, 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드는 서로의 완전한 반복체일 수 있다. 반면에, 제2 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드의 불완전한 반복체일 수 있고, 즉, 제2 폴리뉴클레오티드는 제1 폴리뉴클레오티드와 서열 동일성은 공유할 수 있지만, 서열이 완전히 또는 부분적으로 동일하지 않고, 즉 제2 폴리뉴클레오티드는 불완전 반복체이다. 제2 폴리뉴클레오티드는 또한 제1 폴리뉴클레오티드에 대해 직접 반복체(direct repeat)로서 배향될 수 있거나 역 상보적 배향으로 위치될 수 있다.
목적하는 폴리뉴클레오티드 또는 제1 또는 제2 폴리뉴클레오티드와 같이 본원에 기술된 폴리뉴클레오티드 중 어느 것이라도 표적 서열의 적어도 일부분에 동일할 수 있거나 표적 서열의 적어도 일부분과 서열 동일성을 공유할 수 있다. 목적하는 폴리뉴클레오티드가 표적 서열의 단편에 상동성인 서열을 포함하는 경우, 즉 목적하는 폴리뉴클레오티드가 표적 서열의 "적어도 일부분"과 서열 동일성을 공유하는 경우, 단편의 뉴클레오티드 서열이 표적 유전자에 특이적이고/이거나 목적하는 폴리뉴클레오티드 내에 존재하는 표적의 부분적으로 완전하거나 불완전한 서열이 표적-특이성을 부여하기에 충분한 길이인 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 표적 서열의 일부분과 서열 동일성을 공유하는 목적하는 폴리뉴클레오티드의 부분은 전형적으로 특징적인 도메인, 결합 부위 또는 표적 서열의 동종형 또는 상동체에 의해 보존된 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 세포 내의 표적 핵산을 표적화하기 위해 최적인 목적하는 폴리뉴클레오티드를 디자인할 수 있다.
다른 실시양태에서, 목적하는 폴리뉴클레오티드는 표적 핵산의 DNA 또는 RNA 서열과 서열 동일성을 공유하는, 바람직하게는 4 내지 5,000개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 50 내지 1,000개 뉴클레오티드 및 가장 바람직하게는 150 내지 500개 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 목적하는 폴리뉴클레오티드는 표적 서열 내의 서열과 서열이 100% 동일한 적어도 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400, 500개 또는 500개 초과의 연속적 뉴클레오티드 또는 이 사이의 임의의 정수와 서열 동일성을 공유할 수 있거나, 목적하는 폴리뉴클레오티드는 표적 서열의 서열과 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%. 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 8%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 뉴클레오티드 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함한다. 달리 말하면, 목적하는 폴리뉴클레오티드는 표적 서열의 전체길이 서열 또는 표적 서열의 전체길이 서열의 단편에 상동성일 수 있거나 이와 상동성을 공유할 수 있다.
따라서, 본 발명은 표적 서열과 상동성을 공유하고 이에 따라 엄중한(stringent) 또는 중간정도(moderate) 하이브리드화 조건 하에 본원에 기술된 표적 서열의 일부분에 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 폴리뉴클레오티드의 "일부분"에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드란, 참조 폴리뉴클레오티드의 적어도 약 15개 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 적어도 약 20개 뉴클레오티드, 더욱 보다 바람직하게는 적어도 약 30개 뉴클레오티드 및 더욱 보다 바람직하게는 30개 초과의 뉴클레오티드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오티드(DNA 또는 RNA)를 의도한다. 본 발명의 목적상, 상동성을 공유하는 두 서열, 즉 목적하는 폴리뉴클레오티드 및 표적 서열은 이들이 6×SSC, 0.5% SDS, 5×덴하르트 용액 및 100g의 비특이적 운반체 DNA의 하이브리드화 용액 중에서 이중가닥 복합체를 형성하는 경우 하이브리드화할 수 있다[참조: Ausubel et al, section 2.9, supplement 27 (1994)]. 이러한 서열은 6×SSC, 0.5% SDS, 5×덴하르트 용액 및 100㎍의 비특이적 운반체 DNA의 하이브리드화 용액에서 60℃의 온도로서 정의되는 "중간정도 엄중성"에서 하이브리드화할 수 있다. "높은 엄중성" 하이브리드화의 경우, 온도는 68℃로 증가된다. 중간정도 엄중성 하이브리드화 반응에 따라서, 뉴클레오티드를 실온에서 2×SSC와 0.05% SDS 5×의 용액으로 세척하고 후속적으로 60℃에서 1시간 동안 0.1×SSC와 0.1% SDS로 세척한다. 높은 엄중성의 경우, 세척 온도는 전형적으로 약 68℃인 온도로 증가된다. 하이브리드화된 뉴클레오티드는 10,000cpm/ng의 비(比)방사능을 갖는 방사능표지된 프로브 1ng을 이용하여 검출되는 뉴클레오티드일 수 있는데, 여기서 하이브리드화된 뉴클레오티드는 72시간 이하 동안 -70℃에서 X-선 필름에 노출시킨 후 뚜렷하게 보인다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 작제물은, 이 작제물을 함유하는 세포에 의해 정상적으로 발현되는 표적 유전자의 발현 수준을 이 작제물을 함유하지 않는 세포와 비교해서 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61%, 60%, 59%, 58%, 57%, 56%, 55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 감소시키는 핵산을 생성하는 발현 카세트를 포함할 수 있다.
본 발명의 임의의 폴리뉴클레오티드, 즉 "목적하는 폴리뉴클레오티드" "제1" 폴리뉴클레오티드, "제2" 폴리뉴클레오티드는 표적 서열과 특정한 서열 동일률(%)을 공유할 수 있다. 본원에서 설명한 바와 같이, 표적 서열은 유전자의 서열, 부분 또는 전체길이, 프로모터 또는 터미네이터와 같은 조절 요소, 엑손, 인트론, 미해독 영역 또는 표적 게놈 서열의 상류 또는 하류에 있는 임의의 서열일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 그 서열의 길이에 걸쳐서 이러한 표적 서열과 동일한 서열을 포함할 수 있다. 반면에, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이러한 표적 서열과 서열 동일성을 공유하는 서열을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 목적하는 폴리뉴클레오티드는 표적 서열의 서열과 약 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, 80%, 79%, 78%, 77%, 76%, 75%, 74%, 73%, 72%, 71%, 70%, 69%, 68%, 67%, 66%, 65%, 64%, 63%, 62%, 61% 또는 60% 뉴클레오티드 서열 동일성을 공유할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 두 핵산 또는 폴리펩티드 서열의 맥락에서 "서열 동일성" 또는 "동일성"은 특정된 영역에 걸쳐서 최대 상응성으로 정렬되었을 때 동일한 두 서열 내의 잔기에 대한 언급을 포함한다. 서열 동일률(%)가 단백질과 관련하여 사용되는 경우, 동일하지 않은 잔기 위치는 흔히 보존적 아미노산 치환에 의해 상이한 것으로 인정되며, 이러한 보존적 아미노산 치환에서 아미노산 잔기는 유사한 화학적 특성(예: 전하 또는 소수성)을 갖는 다른 아미노산 잔기로 치환되고 이에 따라 분자의 기능적 특성을 변화시키지 않는다. 서열이 보존적 치환으로 상이한 경우, 서열 동일률(%)은 치환의 보존적 성질을 교정하도록 상향 조정될 수 있다. 이러한 보존적 치환에 의해 상이한 서열은 "서열 유사성" 또는 "유사성"을 갖는다고 언급된다. 이렇게 조정하는 수단은 당업자에게 익히 공지되어 있다. 전형적으로, 이는 전체 미스매치보다는 부분적 미스매치로서 보존적 치환에 스코어를 매겨서 서열 동일률(%)을 증가시키는 것을 수반한다. 따라서, 예를 들면, 동일한 아미노산에 1점이 부여되고 비보존적 치환에 0점이 부여될 때, 보존적 치환에 0 내지 1의 스코어가 부여된다. 보존적 치환의 스코어는, 예를 들면, 프로그램 PC/GENE(Intelligenetics, Mountain View, California, USA)에서 실시된 바와 같이, 문헌[Meyers and Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4: 11 17 (1988)]의 알고리즘에 따라서 계산한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "서열 동일률(%)"은 최적으로 정렬된 두 서열을 비교 창 전반에 걸쳐서 비교하여 측정된 값을 의미하는 것으로, 여기서 비교 창 내의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부분은 두 서열의 최적 정렬을 위한 참조 서열(첨가 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교해서 첨가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비율(%)은 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양 서열 내에 존재하는 위치 수를 결정하여 매칭된 위치 수를 산출하고, 매칭된 위치의 수를 비교 창 내의 위치의 총 수로 나눈 다음, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일률(%)을 산출함으로써 계산한다.
비교를 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 익히 공지되어 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 문헌[Smith and Water man, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘; 문헌[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘; 문헌[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444 (1988)]의 유사성 검색 방법; 이들 알고리즘의 컴퓨터화 실시에 의해 수행될 수 있으며, 이들은 PC/유전자 프로그램 내의 CLUSTAL(Intelligenetics, Mountain View, California); GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisc onsin, USA)을 포함하나 이에 제한되지 않으며; CLUSTAL 프로그램은 문헌[Higgins and Sharp, Gene 73:237-244 (1988); Higgin s and Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989); Corpet, et al., Nucleic Acids Research 16:10881-90 (1988); Huang, et al., Computer Application in the Biosciences 8:155-65 (1992),및 Pearson, et al., Methods in Molecular Bio logy 24:307-331 (1994)]에 잘 설명되어 있다.
데이터베이스 유사성 검색을 위해 사용될 수 있는 BLAST 계통의 프로그램은 다음을 포함한다: 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오티드 질의 서열용 BLASTN; 단백질 데이터 베이스 서열에 대한 뉴클레오티드 질의 서열용 BLASTX; 단백질 데이터베이스 서열에 대한 단백질 질의 서열용 BLASTP; 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대한 단백질 질의 서열용 TBLASTN; 및 뉴클레오티드 데이터베이스 서열에 대한 뉴클레오티드 질의 서열용 TBLASTX[참조: Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 19, A usubel, et al., Eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995); Altschul et al, J. Mol. Biol, 215:403-410 (1990); and, Altschul et al, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997)].
BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 예를 들면, 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology-Information)을 통해 공개적으로 이용할 수 있다. 상기 알고리즘은, 먼저 데이터베이스 서열에서 동일한 길이의 워드로 정렬된 경우에 소정의 포지티브 값의 한계 스코어 T와 매칭되거나 만족시키는, 질의 서열에서 길이 W의 짧은 워드를 동정함으로써 높은 스코어링 서열 쌍(high scoring sequence pairs; HSP)을 동정하는 것을 포함한다. T는 인접 워드 스코어 역치로서 언급된다. 이들 초기 인접 워드 히트(hit)는 이것들을 함유하는 보다 긴 HSP를 찾기 위해 검색을 개시시키기 위한 시드(seed) 역할을 한다. 이어서, 워드 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 한, 각각의 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 누적 스코어는 뉴클레오티드 서열에 대해 파라미터 M(한 쌍의 매칭되는 잔기에 대한 보상 스코어는 항상 0보다 크다) 및 N(미스매칭되는 잔기에 대한 페널티 스코어는 항상 0보다 작다)을 사용하여 계산된다. 아미노산 서열의 경우, 스코어링 매트릭스는 누적 스코어를 계산하기 위해 사용된다. 워드 히트의 각 방향으로의 연장은 누적 정렬 스코어가 최대 달성 값에서 수량 X 만큼 하락하는 경우; 하나 이상의 네가티브 스코어링 잔기 정렬의 축적으로 인해 누적 스코어가 0 또는 그 미만이 되는 경우; 또는 어느 한 서열의 말단에 도달되는 경우에 중단된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 민감도 및 정렬의 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오티드 서열에 대한)은 디폴트로서 워드길이(W) 11, 기대값(E) 10, 컷오프 100, M=5, N=4 및 양 가닥의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이(W) 3, 기대값(E) 10 및 BLOSUM 62 스코어링 매트릭스를 사용한다[참조: Henikoff amp; Henikoff(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915].
서열 동일률(%)을 계산하는 것 이외에, BLAST 알고리즘은 또한 두 서열 사이의 유사성을 통계적으로 분석한다[참조예: Karlin ＆ Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787(1993)]. BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성 측정 중 하나는 가능성의 최소 합계 확률(P(N))이며, 이는 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 매칭이 우연히 일어날 수 있는 확률의 지표를 제공한다.
BLAST 검색은 단백질이 무작위 서열로서 모델화될 수 있음을 가정한다. 그러나, 많은 실제 단백질은 동종중합체 트랙, 단기 반복체, 또는 하나 이상의 아미노산이 풍부한 영역일 수 있는 비-무작위 서열의 영역을 포함한다. 이러한 복잡성이 낮은 영역은 단백질의 다른 영역이 전체적으로 유사하지 않다고 하더라도 관련되지 않은 단백질 사이에 정렬될 수 있다. 다수의 낮은 복잡성 필터 프로그램은 이러한 낮은 복잡성 정렬을 감소시키는데 사용될 수 있다. 예를 들면, SEG(Wooten and Federhen, Comput. Chem., 17:149-163(1993)) 및 XNU(Claverie and States, Compu t. Chem., 17:191-201(1993))의 낮은 복잡성 필터가 단독으로 사용되거나 조합하여 사용될 수 있다.
다수의 서열 정렬은 디폴트 파라미터(갭 페널티=1O, 갭 길이 페널티=1O)를 CLUSTAL 정렬 방법[참조: Higgins ＆ Sharp, CABIOS 5:151-153 (1989)]을 사용하여 수행할 수 있다. CLUSTAL 방법을 사용하는 쌍별 정렬(pairwise alignment)을 위한 디폴트 파라미터는 KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WIND0W=5 및 DIAGONALS SAVED=5이다.
따라서, 비제한적으로, 본 출원인은 단백질을 암호화하는 내인성 식물 유전자를 억제하면서 동시에 관심대상의 단백질을 암호화하는 유전자를 과발현하는 것을 고려한다. 예를 들면, 동시에 파타틴(주요 괴경 저장 단백질)을 억제시키지만 관심대상의 치료학적 단백질을 과발현시키는 수렴 발현 카세트를 사용할 수 있다. 이러한 발현 카세트는 선택의 기반이 될 수 있는 독특한 색상 또는 다른 독특한 특성을 부여함으로써 선택을 가능하게 하고 사람 소비를 예방하는 선택 마커 유전자를 포함할 수 있다. 추가로, 유도성 프로모터를 사용하여 단백질 억제 및/또는 생산을 추가로 조절하여 단백질 억제 및/또는 생산이 식물의 정상적 성장 및 발달을 간섭하지 않도록 할 수 있다.
D. 핵산 작제물에서의 조절 요소
본 명세서는 트랜스제닉 식물에서 단백질 생산을 조절하기 위한 핵산 분자 및 방법을 제공한다. 하나의 실시양태에서, 상기 논의된 바와 같이, 관심대상의 치료학적 단백질은 감자 식물에서 과발현될 수 있다.
발현 벡터는 마커를 함유하는 형질전환된 세포 음성 선택, 즉 선택 마커 유전자를 함유하지 않는 세포의 성장을 억제시킴에 의해 또는 양성 선택, 즉 유전자 마커에 의해 암호화된 생성물을 스크리닝함에 의해 회수될 수 있도록 하는, 조절 요소(예: 프로모터)에 작동적으로 연결된 적어도 하나의 유전자 마커를 포함한다. 식물 형질전환을 위해 통상적으로 사용되는 많은 선택 마커 유전자는 형질전환 분야에 익히 공지되어 있고, 예를 들면, 항생제 또는 제초제일 수 있는 선택적 화학적 물질을 대사작용에 의해 해독시키는 효소를 암호화하는 유전자 또는 저해제 비감응성(insensitive)인 변경된 표적을 암호화하는 유전자를 포함한다. 몇가지 양성 선택 방법도 또한 당업계에 공지되어 있다.
식물 형질전환을 위해 통상적으로 사용되는 한가지 선택 마커 유전자는 식물 조절 시그널의 제어 하에 있는 경우 카나마이신에 대한 내성을 부여하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(nptll) 유전자이다. [Fraley, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:4803 (1983)]. 통상적으로 사용되는 다른 선택 마커 유전자는 항생제 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자이다[참조: Vanden Elzen, et al, Plant Mol. Biol, 5:299 (1985)].
항생제 내성을 부여하는 세균 기원의 추가적 선택 마커 유전자는 젠타마이신 아세틸 트랜스퍼라제, 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제 및 아미노글리코시드-3'-아데닐 트랜스퍼라제, 블레오마이신 내성 결정인자[참조: Hayford, et al, Plant Physiol, 86: 1216 (1988); Jones, et al., Mol. Gen. Genet., 210:86 (1987); Svab, et al, Plant Mol. Biol, 14: 197 (1990); Hille, et al, Plant Mol. Biol, 7:171 (1986)]를 포함한다. 다른 선택 마커 유전자는 글리포세이트, 글루포시네이트 또는 브로목시닐과 같은 제초제에 대한 내성을 부여한다[참조: Comai, et al, Nature, 317:741-744(1985); Gordon-Kamm, et al, Plant Cell, 2:603-618 (1990); Stalker, et al, Science, 242:419-423 (1988)].
식물 형질전환을 위한 세균 기원이 아닌 선택 마커 유전자는, 예를 들면, 마우스 디하이드로폴레이트 리덕타제, 식물 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제 및 식물 아세톨락테이트 신타제[참조: Eichholtz, et al, Somatic Cell Mol. Genet., 13:67 (1987); Shah, et al, Science, 233:478 (1986); Charest, et al, Plant Cell Rep., 8:643 (1990)]를 포함한다.
식물 형질전환을 위한 마커 유전자의 다른 부류는, 항생제와 같은 독성 물질에 대한 내성에 대해서, 형질전환된 세포의 직접적인 유전적 선택보다는 추정적으로 형질전환된 식물 세포의 스크리닝을 필요로 한다. 이러한 유전자들은, 특정 조직에서 유전자의 공간적 발현 패턴을 정량하거나 가시화하는데 특히 유용하고, 유전자 발현의 조사를 위한 유전자 또는 유전자 조절 서열에 융합될 수 있기 때문에 리포터 유전자로서 흔히 지칭된다. 추정적으로 형질전환된 세포를 스크리닝하기 위해 통상적으로 사용되는 유전자는 β-글루쿠로니아제(GUS), β-갈락토시다제, 루시퍼라제 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제[참조: Jefferson, R.A., Plant Mol. Biol. Rep., 5:387 (1987); Teeri, et al, EMBO J., 8:343 (1989); Koncz, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 131 (1987); DeBlock, et al, EMBO J., 3: 1681 (1984)]를 포함한다.
식물 조직의 파괴를 필요로 하지 않는 GUS 활성을 가시화하기 위한 생체내 방법이 이용가능하다[참조: Molecular Probes, Publication 2908, IMAGENE GREEN, pp. 1-4 (1993); Naleway, et al., J. Cell Biol, 1 15:151a (1991)]. 그러나, 상기 GUS 활성을 가시화하기 위한 생체내 방법은 낮은 민감도, 높은 형광 배경 및 선택 마커로서 루시퍼라제 유전자의 사용과 연관된 한계로 인해 형질전환된 세포의 회수를 위해 유용하지 않은 것으로 입증되었다.
보다 최근에는, 녹색 형광 단백질(GFP)을 암호화하는 유전자가 원핵 및 진핵 세포에서 유전자 발현을 위한 마커로서 이용되었다[참조: Chalfie, et al., Science, 263:802 (1994)]. GFP 및 GFP 돌연변이체는 스크리닝가능한 마커(screenable marker)로서 사용될 수 있다. GFP 돌연변이체의 한 예는 형광성 및 광안정성이 증가된 증강된 녹색 형광 단백질(EGFP)이다.
발현 벡터에 포함되는 유전자는 조절 요소(예: 프로모터)를 포함하는 뉴클레오티드 서열에 의해 유도되어야 한다. 몇가지 프로모터 유형은 단독으로 또는 프로모터들과 조합하여 사용될 수 있는 다른 조절 요소와 마찬가지로 형질전환 분야에 익히 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "프로모터"는 RNA 폴리머라제 및 전사를 개시하는 기타 단백질의 인식 및 결합에 관여하는, 전사 개시로부터 DNA 상류 영역에 대한 언급을 포함한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 발달 제어 하의 프로모터의 예는 잎, 뿌리, 종자, 섬유질, 목질부 도관, 가도관 또는 후막조직과 같은 특정 조직에서 우선적으로 전사를 개시하는 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 "조직-선호적"으로서 지칭된다. 특정 조직에서만 전사를 개시하는 프로모터는 "조직-특이적"으로서 지칭된다. "세포-유형" 특이적 프로모터는 주로 하나 이상의 기관 내의 특정 세포 유형, 예를 들면, 뿌리 또는 잎 내의 관 세포에서 발현을 유도한다. "유도성" 프로모터는 환경적 제어 하에 있는 프로모터이다. 유도성 프로모터에 의한 전사에 영향을 줄 수 있는 환경 조건의 예는 혐기성 조건 또는 광의 존재를 포함한다. 조직-특이적, 조직-선호적, 세포-유형 특이적 및 유도성 프로모터는 "비-구성적(non-constitutive)" 프로모터의 부류를 구성한다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 조건 하에 활성인 프로모터이다.
유도성 프로모터 - 유도성 프로모터는 대두에서의 발현을 위한 유전자에 작동적으로 연결된다. 임의로, 유도성 프로모터는 대두에서의 발현을 위한 유전자에 작동적으로 연결되는 시그널 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된다. 유도성 프로모터를 사용할 때, 유도제에 반응하여 전사율이 증가된다.
본 발명에서는 어떠한 유도성 프로모터라도 사용될 수 있다[참조: Ward, et al., Plant Mol. Biol., 22:361-366 (1993)]. 예시적 유도성 프로모터는 구리에 반응하는 ACEI 시스템으로부터의 프로모터[참조: Mett, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:4567-4571 (1993)]; 벤젠술폰아미드 제초제 독성완화제에 반응하는 옥수수로부터의 In2 유전자[참조: Hershey, et al., Mol. Gen Genetics, 227:229-237(1991); Gatz, et al, Mol Gen. Genetics, 243:32-38 (1994)]; 또는 Tn1O으로부터의 Tet 리프레서[참조: Gatz, et al, Mol Gen. Genetics, 227:229-237 (1991)]를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 유도성 프로모터는 식물이 정상적으로는 반응하지 않는 유도제에 반응하는 프로모터이다. 예시적 유도성 프로모터는 글루코코르티코이드 호르몬에 의해 전사 활성이 유도되는, 스테로이드 호르몬 유전자, 글루코코르티코이드 반응 요소로부터의 유도성 프로모터이다[참조: Schena, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 10421-10425 (1991)].
노팔린 신타제 및 옥토핀 신타제 유전자의 프로모터와 같은 다른 프로모터는 세균 종으로부터 클로닝될 수 있다. 다양한 유도성 프로모터가 있지만, 전형적으로 유도성 프로모터는 감온성 프로모터, 화학적-유도형 프로모터 또는 시간적 프로모터일 수 있다. 구체적으로, 유도성 프로모터는 예를 들면, 에탄올, 스테롤, 당, 에틸렌, ABA, 옥신, 사이토킨, 옥토핀, 노팔린, 광, 산소, 카드뮴, 구리 및 기타 중금속 중 어느 하나에 의해 유도될 수 있다. 예시적 유도성 프로모터는 또한 Ha hsp17.7 G4 프로모터, 밀 wcsl20 프로모터, Rab 16A 유전자 프로모터, 알파-아밀라제 유전자 프로모터, pin2 유전자 프로모터 및 카복실라제 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
구성적 프로모터 - 구성적 프로모터는 대두에서의 발현을 위한 유전자에 작동적으로 연결되거나, 구성적 프로모터는 대두에서의 발현을 위한 유전자에 작동적으로 연결되는 시그널 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된다.
많은 상이한 구성적 프로모터가 본 발명에서 이용될 수 있다. 예시적 구성적 프로모터는 CaMV로부터의 35S 프로모터[참조: Odell, et al, Nature, 313:810-812 (1985)]와 같은 식물 바이러스로부터의 프로모터 및 벼 액틴[참조: McElroy, et al, Plant Cell, 2: 163-171 (1990)]; 유비퀴틴[참조: Christensen, et al, Plant Mol. Biol, 12:619-632 (1989); Christensen, et al, Plant Mol. Biol, 18:675-689 (1992)]; pEMU[참조: Last, et al, Theor. Appl. Genet., 81:581-588 (1991)]; MAS[참조: Velten, et al, EMBO J., 3:2723-2730 (1984)]; 및 옥수수 H3 히스톤[참조: Lepetit, et al, Mol. Gen. Genetics, 231:276-285 (1992); Atanassova, et al, Plant Journal, 2 (3):291-300(1992)]과 같은 유전자로부터의 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다. ALS 프로모터, 브라시카 나푸스(Brassica napus) ALS3 구조 유전자에 대해 5'인 Xbal/Ncol 단편(또는 상기 Xbal/Ncol 단편과 유사한 뉴클레오티드 서열)은 특히 유용한 구성적 프로모터를 대표한다[참조: PCT 출원 제WO 96/30530호]. 추가적 구성적 프로모터는 컬리플루워 모자이크 바이러스 프로모터, 현삼 모자이크 바이러스 프로모터 및 루비스코(rubisco) 액티바제 유전자의 식물 프로모터를 포함한다.
조직-특이적 또는 조직-선호적 프로모터 - 조직-특이적 프로모터는 대두에서의 발현을 위한 유전자에 작동적으로 연결된다. 임의로, 조직-특이적 프로모터는 대두에서의 발현을 위한 유전자에 작동적으로 연결되는 시그널 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된다. 조직-특이적 프로모터에 작동적으로 연결된 관심대상의 유전자로 형질전환된 식물은 특정 조직에서만 독점적으로 또는 우선적으로 전이 유전자의 단백질 생성물을 생산한다.
본 발명에서 어떠한 조직-특이적 또는 조직-선호적 프로모터라도 이용될 수 있다. 예시적인 조직-특이적 또는 조직-선호적 프로모터는 파세올린 유전자로부터의 프로모터[참조: Murai, et al, Science, 23:476-482 (1983); Sengupta-Gopalan, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3320-3324 (1985)]와 같은 뿌리-선호적 프로모터; cab 또는 루비스코로부터의 프로모터[참조: Simpson, et al, EMBO J, 4(11):2723-2729 (1985); Timko, et al, Nature, 318:579-582 (1985)]와 같은 잎-특이적 및 광-유도형 프로모터; LAT52로부터의 프로모터[참조: Twell, et al., Mol. Gen. Genetics, 217:240-245 (1989)]와 같은 꽃밥-특이적 프로모터; Zm13으로부터의 프로모터[참조: Guerrero, et al., Mol. Gen. Genetics, 244: 161-168 (1993)]와 같은 화분-특이적 프로모터; apg로부터의 프로모터[참조: Twell, et al, Sex. Plant Reprod., 6:217-224 (1993)]와 같은 소포자-선호적 프로모터를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
전이유전자에 의해 생산된 단백질의 엽록체, 액포, 퍼옥시좀, 글리옥시좀, 세포벽 또는 미토콘드리아와 같은 세포하 구획으로 또는 분비를 위해 아포플라스트 내로의 수송은 시그널 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 관심대상의 단백질을 암호화하는 유전자의 5' 및/또는 3' 영역에 작동적으로 연결시킴으로써 달성된다. 구조 유전자의 5' 및/또는 3' 말단에 있는 표적화 서열은 단백질 합성 및 프로세싱 동안 암호화된 단백질이 궁국적으로 구획화되는 곳을 결정할 수 있다.
시그널 서열의 존재는 폴리펩티드를 세포내 소기관 또는 세포하 구획으로 또는 분비를 위해 아포플라스트로 지시한다. 많은 시그널 서열들이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 서열의 한 예는 과립-결합 전분 신타제(GBSS) 유전자 내의 수송 펩티드 암호화 서열이다. 다른 예는 리불로스 1,5-디포스페이트 카복실라제 옥시게나제(루비스코: RuBisCo) 유전자의 작은 서브유닛으로부터 유래된 서열이다.
다른 예에 대해서는 문헌[Becker, et al, Plant Mol. Biol., 20:49 (1992); Knox, C, et al., Plant Mol. Biol, 9:3-17 (1987); Lerner, et al, Plant Physiol, 91: 124-129 (1989); Frontes, et al, Plant Cell, 3:483-496 (1991); Matsuoka, et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 88:834 (1991); Gould, et al, J. Cell. Biol, 108:1657 (1989); Creissen, et al, Plant J., 2: 129 (1991); Kalderon, et al, Cell, 39:499-509 (1984); Steifel, et al, Plant Cell, 2:785-793 (1990)]을 참조한다.
구체적 적용에 따라서, 적절한 프로모터 서열이 사용될 수 있다. 예를 들면, 프로모터는 구성적 또는 유도성 프로모터 또는 이들의 순열일 수 있다. "강력한" 프로모터는 예를 들면 컬리플라워 모자이크 바이러스, 벼 툰그로 간상 바이러스, 옥수수 줄무늬 바이러스(maize streak virus), 카사바 정맥 바이러스(cassava vein virus), 미라빌리스 바이러스, 땅콩 백화 줄무늬 카울리모바이러스(peanut chlorotic streak caulimovirus), 현삼 모자이크 바이러스 및 콜레라 바이러스와 같은 바이러스로부터 단리될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 본 출원인은 컬리플라워 모자이크 바이러스로부터의 구성적 35S 프로모터를 고려한다.
E. 유전공학을 위한 감자 식물
본 설명에서 "트랜스제닉 식물"은 정상적으로는 숙주 식물 게놈 내에 존재하지 않는 유전자, 정상적으로는 RNA로 전사되지 않거나 단백질로 해독("발현")되지 않는 DNA 서열, 또는 비형질전환 식물 내로 도입시키고자 하는 임의의 기타 유전자 또는 DNA 서열, 예를 들면, 정상적으로는 비형질전환 식물 내에 존재할 수 있지만 유전적으로 조작하고자 하거나 변형된 발현을 갖도록 하고자 하는 유전자를 포함하나 이에 제한되지 않는 핵산 서열이 포함된 식물을 말한다. "트랜스제닉 식물" 범주는 1차 형질전환체와, 예를 들면 표준 유전자이입 또는 다른 육종 절차에 의한 이의 가계 내의 형질전환체를 포함하는 식물 둘 다를 포함한다.
관심대상의 펩티드 및 단백질은 이배체 및 사배체 감자 식물(예: 솔라넘 튜베로섬) 둘 다에서 생산될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "이배체" 및 "사배체"란 용어는 각 세포(생식 세포 제외) 내에 각 염색체의 2쌍 및 4쌍을 갖는 것으로서 정의된다. 이배체 감자 식물은 작고 기묘한 모양과 색상의 괴경을 생산하였다. 사배체 감자 식물은 이배체 감자 식물보다 많은 잎 및 괴경 바이오매스를 산출하고 보다 빠르게 성장하였다. 사배체 감자 식물은 소비용으로 상업적으로 성장된다.
F. 유전공학을 위한 방법
핵산 작제물은 적합한 유전공학 기술을 사용하여 임의의 식물 세포내로 도입시킬 수 있다. 단자엽 및 쌍자엽 겉씨(gymnosperm) 또는 속씨(anigiosperm) 식물 세포는 당업계에 공지된 다양한 방식으로 유전적으로 조작될 수 있다. 예를 들면, 문헌[Klein et al, Biotechnology 4:583-590 (1993); Bechtold et al., C. R. Acad. Sci. Paris 316: 1194-1199 (1993); Bent et al., Mol. Gen. Genet. 204:383-396 (1986); Paszowski et al., EMBO J. 3:2717-2722 (1984); Sagi et al, Plant Cell Rep. 13:262-266 (1994)]을 참조한다. 예시적 방법은 형질전환, 전기천공, 입자 건 충격, 인산칼슘 침전 및 폴리에틸렌 글리콜 융합, 발아 화분립으로의 전이, 직접적 형질전환[참조: Lorz et al., Mol. Genet. 199: 179-182 (1985)] 및 당업계에 공지된 기타 방법을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
생물학적 및 물리적 식물 형질전환 프로토콜을 포함하는 수많은 식물 형질전환 방법이 개발되었다[참조: 예를 들면, Miki, et al., "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants," in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 67-88 (1993)]. 또한, 식물 세포 또는 조직 형질전환 및 식물의 재생을 위한 발현 벡터 및 시험관내 배양 방법이 이용가능하다[참조: 예를 들면, Gruber, et al., "Veoctrs for Plant Transformation," in Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Glick and Thompson Eds., CRC Press, Inc., Boca Raton, pp. 89-119 (1993)].
아그로박테리움(Agrobacterium)-매개성 형질전환 - 발현 벡터를 식물 내로 도입하기 위한 한가지 방법은 아그로박테리움의 천연 형질전환 시스템에 기초한다[참조: 예를 들면, Horsch, et al., Science, 227:1229 (1985)]. 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens) 및 에이. 리조게네스(A. rhizogenes)는 식물 세포를 유전적으로 형질전환시키는 식물 병원성 토양 세균이다. 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스의 Ti 및 Ri 플라스미드는 각각 식물의 유전적 형질전환을 담당하는 유전자를 보유한다[참조: 예를 들면, Kado, C.I., Crit. Rev. Plant Sci., 10:1 (1991)]. 아그로박테리움 벡터 시스템, 및 아그로박테리움-매개 유전자 전달 방법의 설명은 문헌[Gruber, et al., 상기 문헌], [Miki, et al., 상기 문헌] 및 [Moloney, et al., Plant Cell Reports, 8:238 (1989)]에 제공되어 있다. 1996년 10월 8일자로 허여된 미국 특허 제5,563,055호(타운센드(Townsend) 및 토마스(Thomas))를 또한 참조한다.
하나의 실시양태에서, 예를 들면, 문헌[Nagel et al, Microbiol Lett 67:325 (1990)]에 따라서 에이. 투메파시엔스 및 에이. 리조게네스와 같은 아그로박테리움 종이 사용될 수 있다. 간략하게 설명하면, 아그로박테리움은 예를 들면 전기 천공법에 의해 식물 발현 벡터로 형질전환될 수 있고, 이후에 아그로박테리움은 익히 공지된 잎-디스크(leaf-disk) 방법에 의해 식물 세포로 도입된다.
상기 논의된 아그로박테리움 형질전환 방법은 쌍자엽 식물을 형질전환시키는데 유용하다고 공지되어 있다. 추가로, 문헌[de Ia Pena et al., Nature 325: 274-276 (1987), Rhodes et al., Science 240: 204-207 (1988)] 및 문헌[Shimamato et al., Nature 328: 274-276 (1989); 모두 본원에서 참조로 인용된다]은 아그로박테리움을 사용하여 곡류 단자엽 식물을 형질전환시켰다. 또한, 아그로박테리움에-매개성 형질전환을 위한 진공 침윤의 사용을 제시하는 문헌[Bechtold et al., CR. Acad. Sci. Paris 316 (1994)]을 참조한다.
하나의 실시양태에서, 형질전환 벡터는 5'-말단에 있는 "좌측 경계" 및 3'-말단에 있는 "우측 경계"를 특징으로 하는, 아그로박테리움-유래의 T-DNA 요소에 대한 대안을 포함할 수 있다. 따라서, 표적 식물 게놈 내로 도입되는 원치 않는 핵산의 양을 최소화하기 위해 대안적 전달 DNA가 식용 식물로부터 단리될 수 있다. 이러한 식물 전달 DNA(P-DNA)는 또한 하나의 폴리뉴클레오티드의 다른 폴리뉴클레오티드로의 전달을 뒷받침하는 좌측 및 우측 경계-유사 서열로 기술된다. 본 목적을 위해, T-DNA 또는 P-DNA 작제물을 사용하여 목적하는 폴리뉴클레오티드를 식물 세포로 전달시킬 수 있다. 당업자라면, 일부 경우에, 아그로박테리움-매개성 형질전환을 통해 식물 게놈 내로 도입되는 원치 않는 유전요소의 양과 수를 감소시키는 것이 바람직하다는 것을 이해할 수 있다. 따라서, 당업자는 이러한 경우에 P-DNA를 이용할 수 있는데, P-DNA 및 이의 경계-유사 서열은 식물 게놈으로부터 단리되기 때문이다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제7,598,430호 및 제7,928,292호].
직접적 유전자 전달 - 직접적인 유전자 전달로 총칭되는 몇몇 식물 형질전환 방법이 아그로박테리움-매개성 형질전환에 대한 대안으로서 개발되었다. 일반적으로 적용가능한 식물 형질전환 방법은 DNA가 1 내지 4㎛ 크기의 미세추진체의 표면 상에서 운반되는 미세추진체-매개성 형질전환이다. 미세추진체를 식물 세포 벽 및 막을 투과하기에 충분한 300 내지 600m/s의 속도로 가속화하는 생체탄도(biolistic) 장치를 이용하여, 발현 벡터를 식물 조직 내로 도입시킨다[참조: Sanford, et al., Part. Sci. Technol., 5:27 (1987); Sanford, J.C., Trends Biotech., 6:299 (1988); Klein, et al., Bio/Tech., 6:559-563 (1988); Sanford, J.C., Physiol Plant, 7:206 (1990); Klein, et al., Biotechnology, 10:268 (1992)]. 또한, 1991년 5월 14일자로 허여된 미국 특허 제5,015,580호(크리스토(Christou) 등) 및 1994년 6월 21일자로 허여된 미국 특허 제5,322,783호(톰스(Tomes) 등)을 또한 참조한다.
DNA를 식물로 물리적으로 전달하는 또 다른 방법은 표적 세포의 초음파처리이다[참조: Zhang, et al., Bio/Technology, 9:996 (1991)]. 대안으로, 리포솜 및 스페로플라스트 융합이 발현 벡터를 식물 내로 도입하는데 사용되었다[참조: Deshayes, et al., EMBO J., 4:2731 (1985); Christou, et al., Proc Natl. Acad. Sci. USA, 84:3962 (1987)]. CaCl2 침전, 폴리비닐 알코올 또는 폴리-L-오르니틴을 사용하는 원형질체 내로의 DNA의 직접적인 흡수가 또한 보고되었다[참조: Hain, et al., Mol. Gen. Genet., 199:161 (1985) 및 Draper, et al., Plant Cell Physiol., 23:451 (1982)]. 원형질체 및 전체 세포 및 조직의 전기천공이 또한 기술되었다[참조: Donn, et al., Abstracts of VIIth International Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990); D'Halluin, et al., Plant Cell, 4:1495-1505 (1992); 및 Spencer, et al., Plant Mol. Biol., 24:51-61 (1994)].
정확한 식물 형질전환 방법은 형질전환을 위한 세포 표적으로서 선택되는 식물 종 및 식물 세포 유형(예: 하배축 및 자엽과 같은 실생묘 유래의 세포 또는 배아 조직)에 따라서 다소 달라질 수 있다. 식물 종 특이적 형질전환 프로토콜은 문헌[Biotechnology in Agriculture and Forestry 46: Transgenic Crops I (Y. P. S. Bajaj ed.), Springer-Verlag, New York (1999) 및 Biotechnology in Agriculture and Forestry 47: Transgenic Crops II (Y. P. S. Bajaj ed.), Springer- Verlag, New York (2001)]에서 찾아볼 수 있다.
형질전환 후, 식물 세포를 성장시키고, 새싹 및 뿌리와 같은 분화하는 조직의 출현시 성숙한 식물을 재생시킨다. 전형적으로, 복수개의 식물을 재생시킨다. 식물을 재생시키는 방법은 일반적으로 식물 종 및 세포 유형 의존적이며 당업계에 공지되어 있다. 식물 조직 배양에 관한 추가 지침은 예를 들면 문헌[Plant Cell and Tissue Culture, 1994, Vasil and Thorpe Eds., Kluwer Academic Publishers; and in: Plant Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Biology 111), 1999, Hall Eds, Humana Press]에서 찾아볼 수 있다.
유전적으로 조작된 식물 물질의 선택을 보조하기 위해, 선택/스크리닝가능한 마커는 이종성 유전자를 발현하지 않는 다른 식물 또는 식물 조직으로부터 구별을 가능케 한다. 스크리닝 절차는 스크리닝가능한 마커 유전자에 의해 암호화된 단백질의 발현에 대한 검정을 필요로 할 수 있다. 이러한 마커의 예는 베타 글루쿠로니다제(GUS) 유전자, 녹색 형광 단백질(GFP) 및 루시퍼라제(LUX) 유전자를 포함한다. 마찬가지로, 비료, 항생제, 제초제 또는 독성 화합물에 대한 내성을 암호화하는 유전자를 사용하여 형질전환 이벤트를 동정할 수 있다. 선택가능한 마커의 예는 시아나미드 하이드라타제 유전자(CAH), 스트렘토마이신 내성을 암호화하는 스트렙토마이신 포스포트랜스퍼라제(SPT) 유전자, 카나마이신 및 제네티신 내성을 암호화하는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NPTII) 유전자, 하이그로마이신에 대한 내성을 암호화하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(HPT 또는 APHIV), 설포닐우레아형 제초제에 대한 내성을 암호화하는 아세톨락테이트 신타제(a/s) 유전자, 포스피노트리신(리버티(Liberty) 또는 바스타(Basta))과 같은 글루타민 신타제의 작용을 저해하는 작용을 하는 제초제에 대한 내성을 암호화하는 유전자(BAR 및/또는 PAT) 또는 당업계에 공지되어 있는 기타 유사 유전자를 포함한다.
트랜스제닉 식물은 목적하는 유전자 또는 뉴클레오티드 서열을 자손 식물에게 전달하기 위해 교배되거나 자가-수정될 수 있다. 이러한 트랜스제닉 식물의 다음 세대의 실생묘는 PCR, 효소 또는 표현형 검정, ELISA 또는 웨스턴 블롯 분석과 같은 표준 기술을 사용하여 목적하는 폴리뉴클레오티드의 존재 여부에 대해 스크리닝할 수 있다. 대안으로, 형질전환 벡터가 선택/스크리닝가능한 마커(들)을 포함하는 경우, 식물 자손을 특정 물질에 대한 내성 또는 관용성(tolerance), 또는 색상, 털 또는 기타 독특한 특질과 같은 독특한 표현형의 발현에 대해 선택할 수 있다.
G. 식물에서의 표적 식물의 연속적 생산을 위한 온실에서의 식물 재배
본 발명의 방법은 천연 작물 성장 사이클에 의해 부여된 한계를 피할 수 있다. 온실에서 제어된 환경 농업을 사용하여 정의된 환경 조건 하에 트랜스제닉 식물을 생산함으로써, 트랜스제닉 식물을 식물 바이오매스의 생산을 최적화하는 조건 하에 연중 어느 때라도 재배할 수 있다. 그 결과, 본 발명의 방법은 공동경작 농업 시스템과 연관된 계절적 중단 없이 관심대상의 단백질의 연속적 공급을 제공한다. 일단 관심대상의 단백질을 함유하는 트랜스제닉 식물이 수확되면, 이들 식물은 새로운 트랜스제닉 식물로 즉시 대체되어, 본 발명이 연속적 방식으로 실시될 수 있다. 이러한 시스템은 연간 단백질 생산성을 증가시키고 장비 크기 및 하류 처리와 연관된 자본비용을 최소화함으로써 식물 바이오매스의 효율적이고 연속적인 처리를 가능케 한다.
H. 단백질 단리, 정제 및 정량
생산되는 단백질 유형 및 단백질의 위치에 따라서, 기타 단백질 추출 프로토콜도 또한 공지되어 있으며 당업자가 용이하게 이용가능하다. 예를 들면 그리고 비제한적 방식으로, 생산되는 단백질은 식물의 잎, 줄기 또는 괴경에 위치할 수 있다. 마찬가지로, 다시 치료학적 단백질의 의도된 용도에 따라서, 각종 정제 프로토콜 및 시약이 공지되어 있고 용이하게 이용가능하다.
감자 괴경으로부터 식물 유래의 단백질의 추출, 단리 및 정제는 당업계에 익히 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Maelville et al., J. Bio. Chem. 247:3445-3453 (1972) and Bryant et al, Biochem. 15:3418-3424, (1976)]. 전형적으로, 감자는 껍질째 얇게 절단하고 균질화시키고 필터를 통해 착즙하였다. 생성된 즙을 pH 조절하고 원심분리하고 분별한다. 물 세척 및 열처리를 통해 정제를 수행하고 이에 의해 청정한 여과된 분획이 모이고 동결건조된다. 동결건조된 분말을 물에 현탁시키고 이를 물에 대해 투석하고 생성된 청정한 여액을 동결건조시켜 조 추출물을 수득한다. 상기 조 추출물은 HPLC 및 질량분광법과 같은 각종 기술로 분석할 수 있다.
잎으로부터 단백질의 추출, 단리 및 정제는 문헌에도 기술되어 있다[참조: 예를 들면, 미국 특허 제4,400,471호 및 제4,268,632호]. 담배, 시금치, 대두 및 알팔파와 같은 식물의 다육성 잎은 전형적으로 10 내지 20% 고형물로 구성되며, 나머지 분획은 물이다. 고체 부분은 수용성 및 수불용성 부분으로 구성되며, 후자는 주로 잎의 섬유성 구조 물질로 구성된다. 수용성 부분은 당, 비타민, 알칼로이드, 향미, 아미노산과 같은 비교적 낮은 분자량(MW)의 화합물 및 천연 및 재조합 단백질과 같은 비교적 높은 MW의 다른 화합물을 포함한다. 식물 조직의 가용성 부분 내의 단백질은 추가로 두 분획으로 나뉠 수 있다. 한 분획은 주로 광합성 효소인 루비스코를 포함한다. 루비스코 효소는 약 550 kD의 분자량을 갖는다. 상기 분획은 통상적으로 "분획 1 단백질"로서 지칭된다. 루비스코는 풍부하고 잎의 총 단백질 함량의 최대 25% 및 잎의 고형 물질의 최대 10%를 차지한다. 나머지 분획은 전형적으로 약 3 kD 내지 약 100 kD 범위의 분자량을 갖는 단백질 및 펩티드의 혼합물 및 당, 비타민, 알칼로이드 및 아미노산을 포함하는 다른 화합물을 함유한다. 상기 분획은 "분획 2 단백질"로서 총칭된다. 분획 2 단백질은 본래의 주 물질(host material)인 이종 단백질 및 펩티드일 수 있다. 트랜스제닉 식물은 또한 분자량이 1,000 kD를 초과하는 식물 바이러스 입자를 함유할 수 있다.
식물 단백질을 단리하기 위한 기본적 과정은 일반적으로 잎 조직을 붕괴시키고 생성된 펄프를 압착시켜 원료 식물 추출물을 생성시키는 것으로 시작한다. 상기 과정은 전형적으로 원치 않는 산화를 억제하는 환원제 또는 항산화제의 존재하에 수행한다. 각종 단백질 성분 및 미립자 녹색 착색 물질을 함유하는 원료 식물 추출물을 pH 조절하고 가열한다. 조절 후 원료 식물 추출물에 대한 전형적인 pH 범위는 약 5.3 내지 약 6.0이다. 상기 범위는 분획 1 단백질의 단리를 위해 최적화되었다. 녹색-착색된 물질의 응집을 유발하는 가열은 전형적으로 거의 50℃로 제어된다. 이어서, 응집된 녹색-착색된 물질을 중간정도의 원심분리에 의해 제거하여 2차 식물 추출물을 생성시킬 수 있다. 후속적으로, 2차 식물 추출물을 냉각시키고 실온 이하의 온도에서 저장한다. 장기간, 예를 들면, 24시간 후, 루비스코는 갈색 즙으로부터 결정화된다. 후속적으로, 결정화된 분획 1 단백질을 원심분리에 의해 액체로부터 분리할 수 있다. 분획 2 단백질은 액체 중에서 유지되고 대략 4.5의 pH로 추가 산성화시 정제될 수 있다. 대안으로, 2차 식물 추출물로부터 루비스코의 결정 형성은 냉각 대신에 충분량의 폴리에틸렌 글리콜(PEG)를 첨가하여 유도할 수 있다. 결정화된 분획 단백질은 다른 분석을 위해 특정 완충액에 용해시킬 수 있다.
본 트랜스제닉 식물은 야생형 대조 식물과 비교하여 증가된 치료학적 단백질 생산을 특징으로 한다. 단백질의 양적 증가는 웨스턴 블롯 분석, ELISA뿐만 아니라 표준 브래드포드 검정을 포함하나 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 몇가지 방법으로 검정할 수 있다.
약제학적 제형은 정제된 단백질로부터 제조될 수 있고, 이러한 제형은 적합한 질환 또는 병태를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 정제된 단백질은 원치 않는 부작용 없이 치료된 환자에게 치료학적으로 유용한 효과를 발휘하기에 충분한 양으로 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 혼합될 것이다. 이러한 조성물을 제형화하기 위해, 단백질의 중량분율을 치료된 병태가 개선되도록 하는 효과적 농도에서 선택된 담체 또는 희석제에 용해시키거나, 현탁시키거나, 분산시키거나 달리 혼합시킨다. 그러나, 농도 및 투여량은 완화되는 병태의 중증도에 따라서 달라질 수 있는 것으로 이해된다. 추가로, 임의의 특정 피험자에 있어, 특정한 투여 용법이 제형의 투여를 관리하거나 감독하는 사람의 개인적 판단에서 따라서 시간에 걸쳐서 조정될 수 있는 것으로 이해된다.
약제학적 용액 또는 현탁액은 예를 들면 물, 락토스, 슈크로스, 인산이칼슘 또는 카복시메틸 셀룰로스와 같은 멸균 희석제를 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 담체는 용액 또는 현탁액이 형성되도록 하는 물, 식염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤, 글리콜, 에탄올 등을 포함한다. 경우에 따라, 약제학적 조성물은 습윤제; 유화제, 가용화제; 벤질 알코올 및 메틸 파라벤과 같은 항미생물제; 아스코르브산 및 중아황산나트륨과 같은 항산화제; 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)와 같은 킬레이트제; 아세테이트, 시트레이트 또는 포스페이트 완충액과 같은 pH 완충제; 및 이들의 조합과 같은 비독성 보조 물질을 또한 함유할 수 있다.
I. 트랜스제닉 감자에서의 식용 백신 생산
식물에서 발현된 백신 단백질은, 백신을 함유하는 식물을 사람이 섭취함으로써 증가된 면역반응을 자극하고 바이러스에 대항하는 면역화를 제공할 수 있는 "식용 백신"을 제공할 수 있다[참조: 예를 들면, Mason et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11745-11749 (1992)]. 화학적 또는 발효 기반 공정에 의해 제조되는 합성 펩티드의 생산 및 정제의 높은 비용은 경구 백신으로서 이의 광범위한 사용을 막을 수 있다. 반면에, 트랜스제닉 식물에서의 면역원성 단백질의 생산은 경제적 대안을 제공한다. 이. 콜라이(E. coli) 및 스트렙토코커스(Streptococcus) 돌연변이체의 세균 항원을 발현하는 트랜스제닉 식물을 생산하고자 하는 시도가 있었다. 예를 들면, 커티스(Curtiss) 등(WO90/0248)은 이. 콜라이 LT-B 유전자를 이용한 해바라기의 형질전환을 보고하고 있다. 또한, 담배 및 감자 식물에서의 LT-B의 발현 및 이의 GM1-결합 오량체로의 조립이 보고되었다[참조; Haq et al. 1995]. 게다가, 안첸(Arntzen) 등(WO96/12801)은 임의로 SEKDEL 미소체 체류 시그널을 함유하는, LT-A 및 LT-B의 독립적 및 조직화된 발현을 위한 벡터를 개시하고 있다.
식용 백신은 트랜스제닉 식물을 백신 유전자를 함유하는 벡터로 형질전환시켜 생산한다. 백신의 생산은 웨스턴 블롯 분석, ELISA뿐만 아니라 표준 브래드포드 검정으로 검출할 수 있다. 백신 생산 트랜스제닉 식물은 가공 없이 투여될 수 있다.
대안으로, 트랜스제닉 식물은 식물 물질을 동결건조시키거나 탈수시켜 물을 제거함으로써 가공할 수 있다. "탈수"는 공기 건조 또는 분무 건조에 의해 또는 "동결건조"에 의해 수행할 수 있으며, 여기서 "동결건조"는 신속한 동결 및 동결된 상태에서의 탈수(때때로 승화로도 지칭됨)에 의한 건조 형태의 식물 조성물의 제조를 말한다. 이러한 과정은 동결된 생성물을 용기의 주위 온도와 함께 약 실온에서 유지시키기에 충분한 압력, 바람직하게는 약 500 mTorr 미만, 보다 바람직하게는 약 200 mTorr 미만, 보다 더욱 바람직하게는 약 1 mTorr 미만에서 약 1시간 내지 72시간 동안 진공 하에 일어날 수 있다. 식물 물질은 이 식물 물질을 온도가 약 6℃ 내지 200℃인 오븐 내에 약 1시간 내지 72시간 동안 위치시켜 "탈수"시킬 수 있다. 식물 물질은 이 식물 물질의 중량이 시간에 따라 변화하는 것을 중단할 때 충분히 "동결건조"되었거나 "탈수"된 것으로 간주된다. 예를 들면, 전술한 온도에서 오븐 내에 위치된 식물 물질의 중량은 물이 증발함에 따라 시간에 걸쳐 감소할 것이다. 중량이 변화하는 것이 중단된 경우, 모든 물이 증발되었고, 식물 물질은 "탈수"된 것으로 언급될 수 있다. 바람직하게는, 어떠한 건조 방법이 사용되든, 최종 물질은 중량을 기준으로 모든 물 함량의 적어도 90%가 제거되기에 충분하게 탈수된다. "동결건조"된 또는 "탈수"된 식물 물질은 이 "동결건조"된 또는 "탈수"된 식물 물질을 약제학적으로 허용되고 피임 폴리펩티드(contraceptive polypeptide)와 양립가능한 부형제로 유화시켜 추가로 "가공"할 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들면, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 및 이들의 조합을 포함하며, 여기서 "동결건조"된 또는 "탈수"된 식물 물질은 부형제 혼합물의 적어도 40중량%, 바람직하게는 적어도 50중량%를 구성한다. 또한, 경우에 따라, "동결건조"된 또는 "탈수"된 식물 물질은 습윤제 또는 유화제, pH 완충제와 같은 보조 물질 또는 식물 물질의 효능을 증진시키는 어쥬번트를 소량으로 함유할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "동결건조"된 또는 "탈수"된 식물 물질은 약제학적으로 허용되는 크림, 연고, 고약 또는 좌제와 혼합하여 추가 가공할 수 있으며, 여기서 식물 물질은 혼합물의 적어도 40중량%, 바람직하게는 적어도 50중량%를 포함한다. 대안으로, "탈수"된 식물 물질은 이 식물 물질을 과즙, 야채즙, 우유, 물 또는 다가 또는 다성분 백신을 형성하는 기타 백신 제형과 같으나 이에 제한되지 않는 액체로 재구성하여 추가 가공할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위해 제공된다. 그러나, 본 발명은 이러한 실시예에서 기술되는 특정 조건 또는 세부 사항으로 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서 전반에 걸쳐서, 공개적으로 이용가능한 모든 및 임의의 참조문헌은 본원에서 구체적으로 참조로 인용된다.
실시예
방법 및 작제물의 구체적 예가 하기에 제시된다. 이는 예시적이며 본 발명을 한정하기 위함이 아니다.
실시예 1. GFP의 표적화된 발현
감자에서의 GFP 발현을 비교하기 위해, GBSS의 시그널 펩티드(도 21 및 서열번호 8)에 융합된 또는 루비스코(RuBisCo)의 시그널 펩티드(도 22 및 서열번호 9)에 융합된 EGFP 유전자를 이용하여 2종의 작제물을 생성시켰다. 대조군으로서 시그널 펩티드 부재하의 EGFP 유전자를 이용하여 대조 벡터 pSIM1949(도 20)를 제조하였다. GFP를 강력하게 발현하는 시험관 내에서 성장하는 트랜스제닉 새싹을 형광 현미경을 사용하여 선택하였다. 매우 강력한 GFP 발현은 트랜스제닉 pSIM1947 소식물체의 잎에서 검출되었으나, SIM1948 소식물체에서의 GFP 발현은, 도 23에 도시한 바와 같이, 시그널 펩티드 부재하의 EGFP 유전자를 보유하는 대조군의 GFP 발현보다 약간 강력하였다. 이러한 결과들은 GBSS 수송 펩티드를 이용한 동시적 단백질 과발현 및 수렴 프로모터에 의한 AGP 침묵화가 재조합 단백질 생산을 증진시키는데 있어 효과적임을 나타낸다.
실시예 2. 파타틴 PATB1 유전자의 침묵화
본 출원인은 또한 파타틴 PATB1 유전자의 뉴클레오티드 서열(서열번호 3 및 서열번호 4)로부터 디자인된 프라이머를 사용하여 파타틴 유전자의 발현을 억제하는 핵산 작제물을 고안하였다. 솔라넘 튜베로섬 파타틴 유전자를 괴경-특이적 방식으로 침묵화시키는 것을 목표로 pSIM1934 플라스미드(도 14)를 작제하였다. 30종의 트랜스제닉 계통을 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)를 과발현하는 모체 물질로부터 생성시켰다. pSIM1934 실험군 계통 중 어느 것도 괴경에서의 GFP 발현 증가를 나타내지 않았다(도 15). 추가로, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯 분석은 대다수의 파타틴 단백질(약 40 kDa 밴드)이 10종의 실험군 계통에서 침묵화에 의해 제거되었음을 입증하였다(도 16).
실시예 3. CD4B 프로테아제 유전자의 침묵화
본 출원인은 감자 유전체 시퀀싱 협회 공개 데이터(Potato Genome Sequencing Consortium Public Data)의 cDNA 서열 PGSC0003DMG402014476(서열번호 5 및 서열번호 6)의 CD4B 특이적 영역을 이용하여 CD4B(ATP-의존적 프로테아제 ATP-결합 서브유닛 clpA 상동체)의 발현을 억제하는 핵산 작제물을 고안하였다. 솔라넘 튜베로섬 CD4B 유전자를 괴경-특이적 방식으로 침묵화시키는 것을 목표로 pSIM1939 플라스미드(도 17)를 작제하였다. 26종의 트랜스제닉 계통을, 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)를 과발현하는 모체 물질로부터 생성시켰다. 괴경에서의 GFP 축적을 분석하였을 때, 7종의 트랜스제닉 계통이 모체 계통(pSIM1903)과 비교해서 GFP 축적의 2 내지 3배 증가를 나타냈다(도 18). CD4B 유전자의 침묵화를 확인하기 위해, 모체 계통(pSIM1903)과 비교해서 GFP 축적의 2 내지 3배 증가를 나타낸 7종의 트랜스제닉 계통의 노던 블롯 분석을 수행하였다. 상기 노던 블롯 분석은 어떠한 계통에서도 CD4B 전사체를 검출하지 못하였으며, 따라서 CD4B 유전자 침묵화를 확인시킨다. 이러한 결과들은 CD4B 프로테아제의 침묵화를 재조합 단백질(GFP) 생산의 2 내지 3배 증가와 연관시키며 CD4B의 괴경-특이적 침묵화를 사용하여 재조합 단백질 생산을 증진시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 4. 감자에서 사람 인터류킨 2(IL-2)의 과발현
본 출원인은 감자에서 관심대상의 유전자를 과발현하는 핵산 작제물을 고안하였다. 감자 식물에서 사람 인터류킨 2(IL-2)을 과발현시키는 것을 목표로 pSIM1936 플라스미드(도 26)를 작제하였다.
발현 카세트
사람 인터류킨 2(IL-2) 유전자의 절두형을 솔라넘 튜베로섬 파타틴 ER 수송 펩티드(N-말단)와 ER 체류 시그널(C-말단) 사이에 위치시켰다(도 24). ER 수송 펩티드, IL-2 유전자 및 ER 체류 시그널(v1 내지 v48)을 함유하는 IL-2 삽입체의 48종의 코돈-최적화된 변이체를 DNA 2.0(Menlo Park, CA, USA)에 의해 클로닝 벡터에서 생성시켰다. 각각의 변이체는 출발 코돈 전의 BamHI-Ncol 제한 부위 및 종결 코돈 후의 SpeI 부위를 갖는다(도 25). 식물 발현을 위해, 전체 ER-표적화된 유전자 카세트를 솔라넘 튜베로섬 유비퀴틴 프로모터(Ubi7)와 솔라넘 튜베로섬 유비퀴틴 터미네이터(Ubi3T) 사이에서 pSIM1936 플라스미드 내로 삽입시켰다(도 26). 상이한 코돈-최적화된 IL-2 삽입체를 함유하는 6종의 발현 벡터를 1단계, 3-피스(piece) 연결로 생성시켰다. 각 변이체는 상이한 코돈-최적화된 IL-2 삽입체(v19, v21, v30, v43, v45, v47)를 가졌다. 추가의 코돈-최적화된 IL-2 삽입체를 함유하는 12종의 추가 발현 벡터를 변형된 pSIM1936 플라스미드를 이용하여 2단계 연결로 생성시켰으며, 이때 제2 Spe I 부위는 PCR 돌연변이유발을 통해 제거되었다. 프로모터부터 터미네이터까지 전체 발현 카세트를 함유하는 ApaI-XhoI 단편(2,542 bp)을 제거하여 공벡터 대조군을 생성시켰다. 5' 돌출부(overhang)를 클레나우 단편(New England BioLabs, Inc, Ipswich, MA, USA)을 사용하여 충전시키고 이어서 T4 DNA 리가제(Thermo Scientific, Pittsburg, PA, USA)를 사용하여 평활-말단 연결시켰다.
식물 형질전환 및 성장
빈취 대목 식물을 절반 농도의 M516 염 및 비타민(PhytoTechnology, Shawnee Mission, KS, USA), 1.5% 슈크로스, 2.5 g/l 칼슘 글루코네이트 및 2 g/l 겔라이트(pH 5.7)를 함유하는 마젠타 박스(Magenta box)에서 유지시켰다. 아그로박테리움 균주 LBA4404를 50 mg/l 카나마이신 및 100 mg/l 스트렙토마이신을 함유하는 LB 배지(20 g/l LB 브로스)에서 28℃로 밤새 성장시켰다. 생성된 배양물을 9,500 rpm에서 10분 동안 침전시키고 M404 염 및 비타민(PhytoTechnology)에 3% 슈크로스(pH 5.7)와 함께 재현탁시켜 0.2의 OD600으로 세포 밀도를 수득하였다. 4 내지 6 mm의 빈취 절간 절편을 4주령 대목 식물로부터 절단하고, 상이한 발현 벡터 변이체를 함유하는 아그로박테리움 현탁액으로 10분 동안 감염시키고 이어서 흡인시켰다. 그 다음, 외식편을 유상조직 유도 배지(M404, 3% 슈크로스, 7 g/l 한천, 2.5 mg/l 제아틴 리보사이드, 0.1 mg/l NAA, 150 mg/l 티멘틴 및 100 mg/l 카나마이신(pH 5.7))로 옮기기 전에 2일 동안 공배양 배지(1/10 M404, 3% 슈크로스 및 7 g/l 한천(pH 5.7))로 옮겼다. 1개월 후, 외식편을 새싹 유도 배지(M404, 3% 슈크로스, 7 g/l 한천, 2.5 mg/l 제아틴 리보사이드, 0.3 mg/l 지베렐린산, 150 mg/l 티멘틴 및 100 mg/l 카나마이신(pH 5.7))로 옮겼다. 발근 검정을 선택적 발근 배지(절반 농도의 M516, 1.5% 슈크로스, 100 mg/l 카나마이신, 100 mg/l 티멘틴 및 2 g/l 겔라이트 (pH 5.7))를 사용하여 2회 수행하였다. 식물 물질을 16시간 광주기 하에 24℃에서 퍼시벌(Percival) 성장 챔버에서 유지시켰다. 온실에서의 성장을 위해 표현형상 정상인 25개의 카나마이신-내성 새싹을 선택하였다. 이어서, 발근된 식물을 선샤인 믹스(Sunshine Mix)#1(Sun Gro Horticulture, Agawam, MA, USA)를 함유하는 2갤런 포트에 위치시키고 완전 농도의 미라클 그로우(Miracle Grow)(1 Tbs/갤런 물) 비료를 2주 간격으로 3회 공급하였다. 1갤런 포트당 1컵의 비료 용액을 사용하였다(2갤런 포트에 대해 2컵). 반성숙 괴경을 온도 제어된(18℃ 최소/27℃ 최대) 온실에서 3개월간 성장시킨 후 수득하였다. 여름 동안은 일광/길이를 보충하지 않았다.
IL-2 정량
ELISA 및 IL-2 생산 측정을 위해, 50 mg 샘플을 4-mm 코르크 보러를 이용하여 괴경의 중심으로부터 추출하였다. 이어서, 샘플을 펠렛 페슬을 이용하여 250㎕의 검정 완충액을 함유하는 1.5 ml 원심분리 튜브에서 균질화시켰다. 균질화 완충액 및 샘플은 항상 얼음 위에서 유지시키고 20분 동안 4℃에서 9500 rpm로 원심분리하였다. ELISA를 BD OptEIA 사람 IL-2 ELISA Kit II 프로토콜(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에 따라서 수행하였다. 샘플을 다중모드 검출기(Multimode Detector) DTX 880(Beckman Coulter)에 의해 96웰에서 판독하였다. 각각의 독립적 계통을 완전히 스크리닝하기 위해, 하나의 샘플을 단일 괴경으로부터 취하였다. 이어서, IL-2 생산 수준이 가장 높은 계통을 3개의 개별적 괴경으로부터 재샘플추출하였다. 흡광도를 450/8 nm에서 판독하였다.
결과
도 27은 시험된 6종의 코돈-최적화된 IL-2 변이체 중 3종(v19, v21 및 v30)에 대한 빈취 감자의 독립적으로 형질전환된 계통으로부터의 괴경에서의 IL-2 생산을 도시한다. 1936-18은 최적화되지 않은 양성 대조군이다. 각각의 변이체마다, 25종의 독립적 트랜스제닉 계통이 생성되었다. 각각의 색상 그룹은 형질전환을 위해 사용된 코돈-최적화된 IL-2 변이체를 나타낸다. 각각의 막대는 독립적 트랜스제닉 계통으로부터의 3개의 개별적 괴경에서의 평균 IL-2 수준을 나타낸다. 본 결과는 IL-2 생산이 상이한 코돈 변이체로부터 수득된 특정 트랜스제닉 계통에서 2 내지 3배 증가되었음을 나타낸다. 또한, 추가의 실험(데이터는 제시하지 않음)에서 IL-2 생산은 특정 계통에서 최대 11배 증가하였다.
유사하게, 도 28은 12종의 코돈-최적화된 IL-2 변이체에 대한 빈취 감자의 독립적으로 형질전환된 계통으로부터의 괴경에서의 IL-2 생산을 도시한다. 1936-18은 최적화되지 않은 양성 대조군이다. 각각의 변이체마다, 25종의 독립적 트랜스제닉 계통이 생성되었다. 각각의 색상은 형질전환을 위해 사용된 코돈-최적화된 IL-2 변이체를 나타낸다. 각각의 막대는 독립적 트랜스제닉 계통으로부터의 3개의 개별적 괴경에서의 평균 IL-2 수준을 나타낸다. 본 결과는 IL-2 생산이 상이한 코돈 변이체로부터 수득된 특이적 트랜스제닉 계통에서 2.5배 증가되었음을 나타낸다.
실시예 5. 감자에서 관심대상의 다른 유전자의 과발현
다른 실시양태에서, 본 출원인은 클로로겐산 유도인자(CAI) 유전자의 과발현이 클로로겐산뿐만 아니라 안토시아닌 및 플라보놀의 4배 증가를 자극한다는 것을 입증하였다(도 3).
유사하게, 비타민 C 생합성(VTC2) 유전자를 본 발명의 방법을 사용하여 감자에서 과발현시켰다(도 5).
마찬가지로, GFP 유전자 발현은 강력한 구성적 프로모터(도 6)를 이용하여 과발현시 감자 줄기 외식편에서 현저하게 증가하고, 고수준 GUS 유전자 발현은 본 발명의 방법에 따라서 감자 꽃, 잎 및 줄기에서 수득될 수 있다(도 7).
실시예 6. RNA 침묵화의 억제인자인 P19의 과발현
트랜스제닉 식물에서의 이종 단백질의 발현은 식물 숙주에서 전사후 유전자 침묵화(PTGS)이 활성화에 의해 감소될 수 있다. P19와 같은 유전자 침묵화의 식물 바이러스 억제인자의 발현은 잎에서의 이러한 반응을 감소시켜 이종 단백질의 발현 수준을 수배 증가시킬 수 있다[참조: Circelli et al, 2010 Bioengineered Bugs 7:221-224]. 놀랍게도, 본 출원인은 P19의 발현이 괴경에서도 GFP의 생산을 증가시켰다는 것을 발견하였다.
T-DNA 경계 내의 2x 35S 프로모터-유도된 P19R43(서열번호 2) P19 돌연변이체를 갖는 pSIM1927 플라스미드(도 10)를 작제하였다. P19R43를 과발현하는 33종의 계통을, 처음에 pSIM1903 벡터(도 9)로 형질전환된 GFP(서열번호 7)를 과발현하는 모체 물질로부터 생성시켰다. 모든 계통들은 명백한 다면발현 효과 없이 온실에서 정상적으로 성장하였다. 트랜스제닉 계통을 공벡터 계통(pSIM1361) 및 모체 계통(pSIM1903)과 비교하여 괴경-특이적 GFP 축적에 대해 가시적으로 스크리닝하였다. GFP 정량, 웨스턴 블롯 분석 및 노던 블롯 분석을 위해 높은 GFP 발현을 나타내는 12종의 계통을 선택하였다. 공벡터 계통에서의 GFP 양과 비교하여 GFP 양의 20 내지 60% 증가가 12종의 트랜스제닉 계통 중 10종에서 검출되었다(도 11 및 도 12).
P19 유전자의 발현을 확인하기 위해, 높은 GFP 발현을 나타내는 7종의 계통으로부터의 RNA를 P19 프로브를 이용하여 분석하였다. P19 전사체는, 가장 높은 GFP 발현을 나타낸 2종의 계통을 포함하는 3종의 계통에서 검출되었다(도 13). RNA 침묵화의 억제인자인 돌연변이된 p19의 발현을 상승된 GFP 단백질 발현과 연관시키는 이러한 결과들은 RNA 침묵화의 억제인자인 P19의 억제가 식물에서의 단백질 생산을 증진시킴을 입증한다.
실시예 7. 동시적인 GFP의 과발현 및 파타틴 및 CD4B 유전자 억제.
파타틴 및 CD4B 유전자 발현을 억제하기 위한 성분을 포함하는 발현 카세트를 작제하였다. GFP를 과발현하는 모체 물질을 상기 발현 카세트를 함유하는 벡터로 형질전환시켜 약 30종의 트랜스제닉 계통을 생성시켰다. 비형질전환 계통 및 단독의 파타틴 또는 CD4B만이 억제된 트랜스제닉 계통과 비교하였을 때 상기 트랜스제닉 식물의 괴경에서의 GFP 축적을 분석하여, 증가된 GFP 생산을 관찰하였다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 분석은 대다수의 파타틴 단백질(약 40 kDa 밴드)가 제거되었음을 입증하였다. 노던 블롯팅 분석은 CD4B 전사체가 억제되었음을 보여주었다. GFP 생산은 파타틴 및 CD4B 유전자의 발현을 동시에 억제시킴으로써 증진되었다.
실시예 8. 동시적인 P19 및 GFP의 과발현 및 파타틴 유전자 억제.
파타틴 유전자 발현을 억제하고 P19를 과발현시키기 위한 성분을 포함하는 발현 카세트를 작제하였다. GFP를 과발현하는 모체 물질을 상기 발현 카세트를 함유하는 벡터로 형질전환시켜 약 30종의 트랜스제닉 계통을 생성시켰다. GFP 생산은 비형질전환 계통 및 단독의 파타틴 유전자만이 억제된 트랜스제닉 계통과 비교하였을 때 상기 트랜스제닉 식물의 괴경에서 증가되었다. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 분석은 파타틴 유전자 억제를 확인시킨다. P19 유전자의 발현을 확인하기 위해, 높은 GFP 발현을 나타내는 계통으로부터의 RNA를 P19 프로브를 사용하여 분석하였다.
실시예 9. 동시적인 GFP 및 P19 유전자의 과발현, 및 파타틴 및 CD4B 유전자 억제
P19 및 GFP를 과발현하고 파타틴 유전자와 CD4B 유전자 둘 다를 억제하는 성분을 포함하는 발현 카세트를 작제하였다. GFP를 과발현하는 모체 물질을 상기 발현 카세트를 함유하는 벡터로 형질전환시켜 약 30종의 트랜스제닉 계통을 생성시켰다. 상기 트랜스제닉 식물의 괴경에서의 GFP 생산은 비형질전환 계통 및 단독의 파타틴 유전자만이 억제된 트랜스제닉 계통(실시예 8) 또는 단독의 GFP만이 과발현되었고 P19는 과발현되지 않은 트랜스제닉 계통(실시예 7)과 비교하였을 때 상기 트랜스제닉 식물의 괴경에서 증가되었다.
실시예 10. 감자 괴경에서의 단백질 생산에 미치는 유전자 침묵화 및 과발현 전략의 효과
GFP 리포터 유전자의 정량을 사용하여 감자 괴경에서의 재조합 단백질 생산에 미치는 각종 유전자 침묵화 및 과발현 전략의 효과를 측정하였다. 침묵화 및 과발현 전략은 다음과 같았다: (a) 단독의 CD4B만의 침묵화; GFP의 발현은 35S 프로모터에 의해 유도되었다; (b) CD4B 및 파타틴의 침묵화; GFP의 발현은 35S 프로모터에 의해 유도되었다; (c) CD4B와 파타틴의 침묵화 및 P19의 과발현; GFP의 발현은 35S 프로모터에 의해 유도되었다; (d) AGP의 침묵화; GFP의 발현은 GBSS 수송 펩티드에 의해 표적화되었으며 35S 프로모터에 의해 유도되었다; (e) AGP의 침묵화; GFP의 발현은 루비스코 수송 펩티드에 의해 표적화되었으며 35S 프로모터에 의해 유도되었다; (f) AGP의 침묵화; GFP의 발현은 35S 프로모터에 의해 유도되었다. GFP의 발현이 35S 프로모터에 의해 유도된 GFP pSIM1903 작제물은 대조군으로서 사용되었다. 이러한 전략들은 하기 표 2에 요약되어 있다.
[표 2]
식물 형질전환 및 성장
빈취 대목 식물을, 아그로박테리움 현탁액이 표 2에 기술된 바와 같은 상이한 작제물을 함유하였다는 점을 제외하고는 실시예 4에 기술된 바와 같이 유지시키고 형질전환시켰다. pSIM1903-2 모체 계통의 형질전환을 위해, 하이그로마이신 선택을 5 mg/L에서 사용하였다.
단백질 정량
10종의 계통을 분석한 구성적 CD4B 침묵화를 제외하고는, GFP 정량을 위해 25종의 계통을 각 변이체마다 분석하였다. 50 mg 샘플을 4-mm 코르크 보러를 이용하여 괴경의 중심으로부터 추출하였다. 이어서, 샘플을 펠렛 페슬을 이용하여 250㎕의 검정 완충액을 함유하는 1.5 ml 원심분리 튜브에서 균질화시켰다. 균질화 완충액 및 샘플을 항상 얼음 위에서 유지시키고 20분 동안 4℃에서 9500 rpm로 원심분리하였다. GFP 정량을 바이오 비젼 키트(Bio Vision Kit)(#K815-100) 프로토콜(Bio Vision Inc., Milpitas, CA, USA)에 따라서 수행하였다. 샘플을 다중모드 검출기 DTX 880(Beckman Coulter)에 의해 96웰에서 판독하였다. 흡광도를 450/8 nm에서 판독하였다.
결과
도 29는 GFP 발현으로 측정된, 이종 단백질 생산에 미치는 상이한 침묵화, 과발현 및 표적화 전략의 효과를 도시한다. 10종의 계통을 분석한 CD4B 침묵화를 제외하고는 각 전략에 대해 25종의 계통을 분석하였다. 각 막대는 GFP 발현에 대해 분석된 3개의 괴경을 나타낸다. 단독의 CD4B만의 침묵화 또는 CD4B 및 파타틴의 침묵화(적색, 황색 및 오렌지색 막대)는 GFP 대조군과 비교해 단백질 생산을 약간만 증진시켰다. GBSS 프로모터 및 수렴 AGP 프로모터를 이용한 AGP의 침묵화 및 과립-결합 전분 신타제(GBBS) 수송 펩티드를 이용한 GFP 과발현(녹색 막대)은 단백질 수준을 최대 4배 내지 6배까지 현저하게 증가시켰다. 루비스코(Rbcs) 표적화 펩티드의 침묵화(청색 막대)는 오직 한 계통에서만 현저한 단백질 증가를 초래하였다. ADP-글루코스 피로포스포릴라제(AGP)의 침묵화(회색 막대)는 GFP 함량을 최대 3배까지 현저하게 증가시켰다. 이러한 결과들은 감자 괴경에서의 이종 단백질 생산이 본 발명에 따르는 침묵화, 과발현 및 표적화 전략을 사용하여 현저하게 증가될 수 있음을 명백하게 보여준다.
SEQUENCE LISTING
<110> J.R. SIMPLOT COMPANY
<120> PROTEIN PRODUCTION IN PLANTS
<130> 2085-109PCT
<140> PCT/US14/042245
<141> 2014-06-13
<150> 61/835,274
<151> 2013-06-14
<160> 11
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1225
<212> DNA
<213> Solanum tuberosum
<400> 1
ataatctgca aatggcacta ctaaatattt tacaatttta atttttatga tgttagcaac 60
tactagttca acatttgcta cattgggaga aatggtgact gttcttagta ttgatggagg 120
tggaattaag ggaatcattc cggctaccat tctcgaattt cttgaaggac aacttcagga 180
agtggacaat aatacagatg caagacttgc agattacttt gatgtaattg gaggaacagg 240
tacaggaggt ttattgactg ctatgataac tactccaaat gaaaacaatc gaccctttgc 300
tgctgctaaa gatattatac ctttttactt cgatcatggc cctaagattt ttgaacctag 360
tggttttcac cttgttgagc caaaatatga tggaaaatat cttatgcaag ttcttcaaga 420
aaaacttgga gaaactcgtg tgcatcaagc tttgacagaa gttgccatct caagctttga 480
catcaaaaca aataagccag taatattcac taagtcaaat ttagcaaaaa ctccagaatt 540
ggatgctaag atgtatgaca tatgttattc cacagcagca gctccaacat attttcctcc 600
acattacttt gctactaata ctagtaatgg agatcaatat gacttcaatc ttgttgatgg 660
cgatgttgct gctgttgatc cgtcgttatt atccattagc gttgcaacga gacttgcaca 720
agaggatcca gcatttgctt caattaagtc attgaattac aaacaaatgt tgttgctctc 780
attaggcact ggcactaatt cagagtttgc taaaaactat acagcagaag aggcagctaa 840
atggggtatt ctacaatgga tgtcaccttt atgggaaatg agaagtgcag caagttctta 900
catgaatgat tattaccttt ctactgtttt tcaagctctt gattcacaaa acaattacct 960
cagggttcaa gaaaatgcat taacaggcac agctactaca tttgatgatg cttctgtggc 1020
taatatgata ttattagtac aagttggtga aaacttattg aagaaatcag tttccgaaga 1080
caatcatgaa acctatgagg tagctctaaa gaggtttgca aaattgctct ctgataggaa 1140
gaaactccga gcaaacaaag cgtcttttta attcaaggtc tcgagttgtg ttagtaacct 1200
tactatgctt aattataagc gcttg 1225
<210> 2
<211> 519
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Binary vector
<400> 2
atggaacgag ctatacaagg aaacgacgct agggaacaag ctaacagtga acgttgggat 60
ggaggatcag gaggtaccac ttctcccttc aaacttcctg acgaaagtcc gagttggact 120
gagtggtggc tacataacga tgagacgaat tcgaatcaag ataatcccct tggtttcaag 180
gaaagctggg gtttcgggaa agttgtattt aagagatatc tcagatacga caggacggaa 240
gcttcactgc acagagtcct tggatcttgg acgggagatt cggttaacta tgcagcatct 300
cgatttttcg gtttcgacca gatcggatgt acctatagta ttcggtttcg aggagttagt 360
atcaccgttt ctggagggtc gcgaactctt cagcatctct gtgagatggc aattcggtct 420
aagcaagaac tgctacagct tgccccaatc gaagtggaaa gtaatgtatc aagaggatgc 480
cctgaaggta ctgagacctt cgaaaaagaa agcgagtaa 519
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<212> DNA
<213> Solanum tuberosum
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gtagcaacac caccatcaac aagattgaac tcatatgtag caccattact agtatgagta 120
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atcttagcat ccaattctgg agactttgct aaatttgact tagtgaatat tactggctta 240
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<212> DNA
<213> Solanum tuberosum
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<212> DNA
<213> Solanum lycopersicum
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Claims (19)
- a. 식물을 (i) 파타틴 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열; (ii) CD4B 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열; (iii) 마커 유전자; 및 (iv) 관심대상의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계;
b. 형질전환된 식물을 정의된 조건 하에 재배하는 단계; 및
c. 관심대상의 단백질을 추출하는 단계
를 포함하는, 형질전환된 감자 식물에서 이종 단백질을 생산하는 방법. - 제1항에 있어서, 상기 파타틴 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 파타틴의 안티센스 및 센스 서열을 포함하고, 상기 CD4B 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 5 및 서열번호 6에 제시된 CD4B의 안티센스 및 센스 서열을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 마커 유전자가 GFP, EGFP, GUS, LUX, CAH, SPT, NPTII, HPT, APHIV, BAR, PAT, CHS, AHAS 및 플라보노이드 합성 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 관심대상의 단백질이 인터류킨-2, 히루딘, 인슐린, 인터페론, 락토페린, 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 표피 성장 인자, 탄저병 백신, 콜레라 백신, DPT 백신, hib 백신, A형 간염 백신, B형 간염 백신, C형 간염 백신, HPV 백신, 인플루엔자 백신, 일본 뇌염 백신, MMR 백신, MMRV 백신, 폐렴구균 접합 백신, 폐렴구균 다당류 백신, 폴리오 백신, 로타바이러스 백신, 천연두 백신, 결핵 백신, 장티푸스 백신, 황열병 백신, 파보바이러스 백신, 디스템퍼 백신, 아데노바이러스 백신, 파라인플루엔자 백신, 보르데텔라 백신, 광견병 백신, 렙토스피라증 백신, 라임병 백신, 코로나 백신, 회충/십이지장충 백신, 구충제 백신, RNFN 백신 및 HIV 백신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- a. 식물을 (i) 파타틴 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열; (ii) P19를 과발현할 수 있는 뉴클레오티드 서열; (iii) 마커 유전자 및 (iv) 관심대상의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계;
b. 형질전환된 식물을 정의된 조건 하에 재배하는 단계; 및
c. 관심대상의 단백질을 추출하는 단계
를 포함하는, 형질전환된 감자 식물에서 이종 단백질을 생산하는 방법. - 제5항에 있어서, 상기 파타틴 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 파타틴의 안티센스 및 센스 서열을 포함하고, 상기 P19를 과발현할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 2에 제시된 P19 서열을 포함하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 마커 유전자가 GFP, EGFP, GUS, LUX, CAH, SPT, NPTII, HPT, APHIV, BAR, PAT, CHS, AHAS 및 플라보노이드 합성 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 관심대상의 단백질이 인터류킨-2, 히루딘, 인슐린, 인터페론, 락토페린, 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 표피 성장 인자, 탄저병 백신, 콜레라 백신, DPT 백신, hib 백신, A형 간염 백신, B형 간염 백신, C형 간염 백신, HPV 백신, 인플루엔자 백신, 일본 뇌염 백신, MMR 백신, MMRV 백신, 폐렴구균 접합 백신, 폐렴구균 다당류 백신, 폴리오 백신, 로타바이러스 백신, 천연두 백신, 결핵 백신, 장티푸스 백신, 황열병 백신, 파보바이러스 백신, 디스템퍼 백신, 아데노바이러스 백신, 파라인플루엔자 백신, 보르데텔라 백신, 광견병 백신, 렙토스피라증 백신, 라임병 백신, 코로나 백신, 회충/십이지장충 백신, 구충제 백신, RNFN 백신 및 HIV 백신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- a. 식물을 (i) 파타틴 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열; (ii) CD4B 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열; (iii) P19를 과발현할 수 있는 뉴클레오티드 서열; (iv) 마커 유전자 및 (v) 관심대상의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계;
b. 형질전환된 식물을 정의된 조건 하에 재배하는 단계; 및
c. 관심대상의 단백질을 추출하는 단계
를 포함하는, 형질전환된 감자 식물에서 이종 단백질을 생산하는 방법. - 제9항에 있어서, 상기 파타틴 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 3 및 서열번호 4에 제시된 파타틴의 안티센스 및 센스 서열을 포함하고, 상기 CD4B 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 5 및 서열번호 6에 제시된 CD4B의 안티센스 및 센스 서열을 포함하고, 상기 P19를 과발현할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 2에 제시된 P19 서열을 포함하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 마커 유전자가 GFP, EGFP, GUS, LUX, CAH, SPT, NPTII, HPT, APHIV, BAR, PAT, CHS, AHAS 및 플라보노이드 합성 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 관심대상의 단백질이 인터류킨-2, 히루딘, 인슐린, 인터페론, 락토페린, 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 표피 성장 인자, 탄저병 백신, 콜레라 백신, DPT 백신, hib 백신, A형 간염 백신, B형 간염 백신, C형 간염 백신, HPV 백신, 인플루엔자 백신, 일본 뇌염 백신, MMR 백신, MMRV 백신, 폐렴구균 접합 백신, 폐렴구균 다당류 백신, 폴리오 백신, 로타바이러스 백신, 천연두 백신, 결핵 백신, 장티푸스 백신, 황열병 백신, 파보바이러스 백신, 디스템퍼 백신, 아데노바이러스 백신, 파라인플루엔자 백신, 보르데텔라 백신, 광견병 백신, 렙토스피라증 백신, 라임병 백신, 코로나 백신, 회충/십이지장충 백신, 구충제 백신, RNFN 백신 및 HIV 백신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- a. 식물을 (i) ADP 글루코스 피로포스포릴라제(AGP) 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열; (ii) 수송 펩티드(transit peptide); (iii) 마커 유전자; 및 (iv) 관심대상의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 유전자를 포함하는 발현 카세트로 형질전환시키는 단계;
b. 형질전환된 식물을 정의된 조건 하에 재배하는 단계; 및
c. 관심대상의 단백질을 추출하는 단계
를 포함하는, 형질전환된 감자 식물에서 이종 단백질을 생산하는 방법. - 제13항에 있어서, 상기 AGP 발현을 억제할 수 있는 뉴클레오티드 서열이 서열번호 10 및 서열번호 11에 제시된 안티센스 또는 센스 AGP 서열을 포함하는 방법.
- 제14항에 있어서, AGP 발현의 억제가 수렴 프로모터(convergent promoter)에 의해 유도되는 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 수렴 프로모터가 과립-결합 전분 신타제(GBSS) 프로모터 및 AGP 프로모터인 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 수송 펩티드가 서열번호 8에 제시된 GBSS-수송 펩티드 또는 서열번호 9에 제시된 루비스코(RubisCo) 수송 펩티드인 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 마커 유전자가 GFP, EGFP, GUS, LUX, CAH, SPT, NPTII, HPT, APHIV, BAR, PAT, CHS, AHAS 및 플라보노이드 합성 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 관심대상의 단백질이 인터류킨-2, 히루딘, 인슐린, 인터페론, 락토페린, 헤모글로빈, 에리트로포이에틴, 표피 성장 인자, 탄저병 백신, 콜레라 백신, DPT 백신, hib 백신, A형 간염 백신, B형 간염 백신, C형 간염 백신, HPV 백신, 인플루엔자 백신, 일본 뇌염 백신, MMR 백신, MMRV 백신, 폐렴구균 접합 백신, 폐렴구균 다당류 백신, 폴리오 백신, 로타바이러스 백신, 천연두 백신, 결핵 백신, 장티푸스 백신, 황열병 백신, 파보바이러스 백신, 디스템퍼 백신, 아데노바이러스 백신, 파라인플루엔자 백신, 보르데텔라 백신, 광견병 백신, 렙토스피라증 백신, 라임병 백신, 코로나 백신, 회충/십이지장충 백신, 구충제 백신, RNFN 백신 및 HIV 백신으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
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