CN116949180A - 用于胰腺导管腺癌的诊断、治疗和预后预测的产品及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药领域,具体涉及用于胰腺导管腺癌的诊断、治疗和预后预测的产品及其应用。本发明公开了lncRNA‑PATB1,基于lncRNA‑PATB1能够实现胰腺导管腺癌的诊断、治疗及预后预测。本发明通过深入的实验,证明了lncRNA‑PATB1与腺导管腺癌增殖、转移、侵袭相关,lncRNA‑PATB1促进胰腺导管腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭,lncRNA‑PATB1能够作为胰腺导管腺癌新的治疗靶点,基于基因lncRNA‑PATB1的表达能够提示胰腺导管腺癌的预后情况。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域,具体涉及用于胰腺导管腺癌的诊断、治疗和预后预测的产品及其应用。
背景技术
胰腺癌是一种恶性程度极高的消化系统肿瘤,预后极差,5年生存率不足9%。
胰腺导管腺癌是胰腺癌最主要的病理类型,约占胰腺癌病例数的90%。根治性手术切除是目前治疗胰腺导管腺癌最有效的方式,但是由于其早期症状隐匿,缺乏特异性诊断手段,大部分患者在就诊时已失去根治性手术机会。即使接受根治性手术治疗,其5年生存率仍不足20%,因此,胰腺导管腺癌已成为癌症相关死亡的第七大原因,并可能在未来超过乳腺癌成为第三大癌症相关死亡原因。
虽然总体发病率不高,却由于其难以早期诊断和进展速度快,仍有较高的死亡率和较差的预后。肿瘤转移是影响胰腺导管腺癌患者预后的一个重要因素。对于无法进行根治性手术的患者,发生肝或腹膜转移的中位生存期较无肝(6.2月vs8.1月)或腹膜转移(5.2月vs7.3月)的患者显著降低。而淋巴转移的发生也显著增加胰腺导管腺癌患者术后复发率(55%vs77%),进而导致术后5年生存率显著下降(27%vs11%)。
长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸,缺乏编码蛋白质能力的一类RNA的总称。lncRNA在包括胰腺导管腺癌在内的多种肿瘤中异常表达,并参与调控肿瘤的发生发展。lncRNAs主要通过与蛋白质、RNA或者DNA分子结合对肿瘤及其微环境进行调控进而介导转移的发生。然而,lncRNAs在胰腺导管腺癌及其来源的外泌体中的作用及调控机制研究较少。
因此,基于长链非编码RNA寻找一种能够有效诊断胰腺导管腺癌增殖、转移、侵袭的生物标记物、基于长链非编码RNA寻找新的治疗靶点以及基于长链非编码RNA改善患者预后预测具有重要的作用。
发明内容
为克服现有技术的不足,本发明主要目的是提供一种生物标记物lncRNA-PATB1,能够实现胰腺导管腺癌的诊断、治疗及预后预测。
为实现上述目的,本发明提供以下技术方案:
本发明第一方面提供了一种用于诊断胰腺导管腺癌转移的产品,所述产品包含有用于检测lncRNA-PATB1表达水平的试剂;
所述lncRNA-PATB1为SEQ ID NO:1所示的RNA序列。
本发明第二方面提供了一种用于治疗胰腺导管腺癌的药物,所述药物包含有降低lncRNA-PATB1表达水平的抑制剂;
所述lncRNA-PATB1为SEQ ID NO:1所示的RNA序列。
本发明第三方面提供了一种用于预测胰腺导管腺癌预后的产品,所述产品包含有用于检测lncRNA-PATB1表达水平的试剂;
所述lncRNA-PATB1为SEQ ID NO:1所示的RNA序列。
本发明第四方面提供了如下任一项应用:
(1)lncRNA-PATB1的抑制剂或包括该抑制剂的药物组合物在制备治疗胰腺导管腺癌的产品中的应用;
(2)检测lncRNA-PATB1表达水平的试剂或包括该试剂的产品在制备诊断胰腺导管腺癌转移/预测胰腺导管腺癌预后的工具中的应用;
(3)lncRNA-PATB1在构建诊断胰腺导管腺癌转移/预测胰腺导管腺癌预后的系统/装置中的应用;
(4)lncRNA-PATB1在构建诊断胰腺导管腺癌转移/预测胰腺导管腺癌预后的计算机可读存储介质中的应用。
具体地,所述lncRNA-PATB1为SEQ ID NO:1所示的RNA序列。
具体地,所述试剂选自特异性识别lncRNA-PATB1基因的寡核苷酸探针、特异性扩增lncRNA-PATB1基因的引物或特异性结合lncRNA-PATB1基因的蛋白。
具体地,所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。
具体地,所述抑制剂包括核酸抑制剂、蛋白抑制剂。
具体地,所述系统/装置包括:
获取单元:用于获取样本中lncRNA-PATB1的表达水平;
处理单元:根据lncRNA-PATB1的表达情况,获得胰腺导管腺癌诊断转移/预后预测结果。
具体地,所述计算机可读存储介质上存储有计算机程序,所述计算机程序被处理器执行时实现前述的系统/装置。
本发明的有益效果:
1.基因lncRNA-PATB1与腺导管腺癌增殖、转移、侵袭相关,lncRNA-PATB1促进胰腺导管腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭。
2.基因lncRNA-PATB1能够作为胰腺导管腺癌新的治疗靶点。
3.lncRNA-PATB1在胰腺导管腺癌中高表达,且与患者不良预后相关。
4.外泌体lncRNA-PATB1的表达与淋巴转移及临床分期相关。
5.基于基因lncRNA-PATB1的表达能够提示胰腺导管腺癌的预后情况。
附图说明
图1为lncRNA-PATB1在胰腺导管腺癌中的表达与患者不良预后相关图;其中,A是高通量测序筛选胰腺导管腺癌进展相关lncRNAs的流程图;B是qRT-PCR检测lncRNA-PATB1在192例胰腺导管腺癌患者肿瘤及癌旁组织中的表达图;C-D是qRT-PCR检测lncRNA-PATB1在不同淋巴结转移状态及临床分期的胰腺导管腺癌肿瘤组织中的表达图,E-F是lncRNA-PATB1的表达水平对胰腺导管腺癌患者总生存期及无病生存期的影响图;*p<0.05,**p<0.01。
图2为lncRNA-PATB1促进胰腺导管腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭图;其中,A-D是CCK-8实验检测敲降或过表达lncRNA-PATB1的表达对胰腺导管腺癌细胞增殖能力的影响图;E-H是Transwell迁移及侵袭实验检测敲降或过表达lncRNA-PATB1的表达对胰腺导管腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响图,*p<0.05,**p<0.01。
图3为动物实验证实lncRNA-PATB1促进胰腺导管腺癌转移图;其中,A-B是PET-CT检测lncRNA-PATB1对小鼠胰腺原位成瘤的影响图;C是小鼠胰腺原位成瘤模型大体解剖图;D是lncRNA-PATB1对小鼠胰腺原位成瘤模型中肝转移的影响图;E是lncRNA-PATB1对胰腺原位成瘤小鼠生存时间的影响图;*p<0.05,**p<0.01。
图4为lncRNA-PATB1募集hnRNPA1介导NF-κB通路激活图;其中,A-B是银染及质谱检测RNApμlldown实验中与lncRNA-PATB1结合的蛋白图;C是FISH及免疫荧光检测lncRNA-PATB1与hnRNPA1在胰腺癌细胞中的共定位情况图;D是RIP实验检测hnRNPA1与lncRNA-PATB1的结合情况图;E-F是qRT-PCR及Western blot检测lncRNA-PATB1过表达对下游靶基因及通路的影响图;G-H是qRT-PCR检测敲降hnRNPA1对IκBα表达的影响图;E-F是qRT-PCR检测敲降hnRNPA1对lncRNA-PATB1过表达介导的IκBα表达的影响图;*p<0.05,**p<0.01。
图5为lncRNA-PATB1在胰腺癌细胞外泌体中高表达图;其中,A-C是透射电子显微镜、NTA及western blot鉴定外泌体图;D是qRT-PCR检测lncRNA-PATB1在胰腺细胞及对应外泌体中的表达图;E-H是qRT-PCR检测沉默或过表达lncRNA-PATB1对其在胰腺癌细胞及对应外泌体中表达的影响图;*p<0.05,**p<0.01。
图6为外泌体lncRNA-PATB1促进淋巴管内皮新生图;*p<0.05,**p<0.01。
图7为外泌体lncRNA-PATB1与SOX18启动子形成DNA-RNA三聚体图;其中,A-B是下调hnRNPA1后胰腺细胞及外泌体中lncRNA-PATB1的表达情况图;C是共聚焦显微镜观察PKH67标记的胰腺癌外泌体被淋巴管内皮细胞摄取的情况图;D-E是外泌体诱导后淋巴管内皮细胞中lncRNA-PATB1表达的改变图;F-G是qRT-PCR检测外泌体lncRNA-PATB1敲降或过表达对淋巴管内皮细胞中SOX18表达的影响图;H-I是ChIRP实验验证外泌体lncRNA-PATB1与SOX18启动子结合图;*p<0.05,**p<0.01。
图8为外泌体lncRNA-PATB1与胰腺导管腺癌淋巴转移相关图;其中,A是qRT-PCR检测lncRNA-PATB1在92例胰腺导管腺癌患者及92例正常人血清外泌体中的表达图;C-D是qRT-PCR检测lncRNA-PATB1在不同淋巴结转移状态及临床分期的胰腺导管腺癌患者血清外泌体中的表达图;*p<0.05,**p<0.01。
图9为外泌体lncRNA-PATB1高表达与患者不良预后相关图;其中,A-B是lncRNA-PATB1在胰腺导管腺癌患者血清外泌体的表达水平对其总生存期及无病生存期的影响图;C是lncRNA-PATB1在患者血清外泌体的表达水平对有淋巴转移的胰腺导管腺癌患者总生存期的影响图;*p<0.05,**p<0.01。
具体实施方式
为了更好地理解本发明,下面结合具体实施例对本发明作进一步的描述,其中实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,不构成对本发明保护范围的限制。
一、实施例的材料与方法
1.组织标本
本发明共采集了192对2013至2018在中山大学孙逸仙纪念医院接受手术治疗的胰腺导管腺癌癌组织、癌旁组织。此外,还采集了92例胰腺患者及92例健康受试者的血液标本。组织标本均经过病理医生诊断证实为胰腺导管腺癌诊断。全部患者在手术切除肿瘤前均已签署知情同意书。所有标本获取均已获得医院伦理委员会同意。所有组织标本在取出后经液氮速冻,放入-80度冰箱保存。血液标本在采集后经2000rpm转速离心15分钟,收集上层血清样本,放入-80度冰箱保存。
2.细胞系及培养
本发明中所使用的胰腺导管腺癌细胞系:AsPC-1、BxPC-3、PANC1和Capan-2,膀胱癌细胞系:UM-UC-3、5637、T24,人正常胰腺导管上皮细胞系HPDE及人正常膀胱上皮细胞系Sv-HUC均购自美国模式菌种收集中心(American Tissue Type Cμlture collection,ATCC)。在本实验中,PANC-1、Capan-2和UM-UC-3细胞系使用含有10%胎牛血清的DMEM培养基(Gibco,美国)进行细胞培养,AsPC-1、BxPC-3、5637、T24及HPDE细胞系使用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(Gibco,美国)进行细胞培养,Sv-HUC细胞系使用含有10%胎牛血清的F12K培养基(Gibco,美国)进行细胞培养。人淋巴管内皮细胞HLECs购自ScienCell研究实验室(美国),并使用含有5%胎牛血清的ECM培养基(ScienCell,美国)进行细胞培养。所有细胞均放置于37℃、二氧化碳含量5%的培养箱中进行培养。
3.抗体
表1实验中使用的抗体
4.实验仪器
表2实验中使用的仪器
5.RNA干扰及细胞转染
常规培养胰腺导管腺癌细胞,用胰酶消化细胞后按每孔1.5×105个细胞接种至六孔板中,加2ml完全培养基后置于培养箱过夜至细胞融合度达50%-60%。将上海吉玛公司(GenePharma,上海)合成的转染用的siRNA或质粒用DEPC水溶解后,每孔取5μl siRNA或5μg质粒加入250μl opti-MEN培养基中,转染质粒时再加入5μl P3000(Life Technologies,美国)试剂,另将5μl/孔转染试剂Lipofectamine 3000(Life Technologies,美国)稀释于250μl opti-MEN培养基中,将siRNA及Lipofectamine 3000稀释溶液混合,常温静置20分钟后,加入待转染细胞中。转染12小时后更换完全培养基。72小时后测定转染效率。
6.慢病毒稳定转染细胞构建
将胰腺导管腺癌细胞接种至10cm培养皿后常规培养至细胞融合度达50%-60%,将7.5μg PAX2、2.5μg MD2和10μg慢病毒质粒加入2.5ml OptiMEN培养基中,再将60μlLipofectamine 3000加入另外2.5ml Opti-MEN培养基中。将上述两种溶液混合,室温静置30分钟。将混合溶液均匀加入培养细胞的培养皿中,放入培养箱培养72小时。收集细胞上清液,在4℃下1000rpm离心5分钟,取上清液-80度冰箱保存。将胰腺导管腺癌细胞接种至6孔板中。培养至细胞融合度达80%。将-80度保存的慢病毒上清液解冻,取1ml与等量完全培养基混合,加入Polybrene溶液。混合液加入六孔板中,置于培养箱中培养,48小时后用嘌呤霉素筛选细胞1周,得到稳定转染的胰腺导管腺癌细胞系。
7.RNA提取及qRT-PCR
将六孔板中细胞培养基完全吸出后,用预冷PBS洗涤细胞2次,加入1ml Trizol溶液,在室温下静置10分钟裂解细胞。将细胞裂解物转移到无酶处理后的EP管中,加入200μl氯仿试剂,剧烈震荡10s,室温下静置5分钟后,于4℃,12000rpm离心15分钟。离心后小心吸取上层液相至新的EP管中,加入等体积的异丙醇,颠倒混匀,室温下静置5分钟后,于4℃,12000rpm离心10分钟。小心吸弃上清,避免吸出沉淀。将1ml 75%乙醇加入EP管中,于4℃,7500rpm离心5分钟。弃去上清,室温下晾干沉淀,将10μlDEPC水加入EP管溶解沉淀,使用Nanodrop测量RNA浓度。
取500ng总RNA,与2μl 5×PrimeScript RT Master Mix(Takara,日本)混合配制成10μl体系并逆转录成cDNA。稀释10倍后,取1μlcDNA加入引物及5μl TBGreen II(Takara,日本)进行qRT-PCR分析。采用比较Ct相对定量的方法计算基因表达差异。以GAPDH为内参,每个样品至少设置3个副孔。本发明中使用的引物列举如下:
表3实验中使用的引物
名称 | 上游引物 | 下游引物 |
lncRNA-PATB1 | TCTCATCCCGTGTCATGTGCC | GTTTCAGGTCTCCATGCCAGTG |
GAPDH | ATCACCATCTTCCAGGAGCGA | CCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC |
U1 | GGGAGATACCATGATCACGAAGGT | CCACAAATTATGCAGTCGAGTTTC |
IL-6 | ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG | CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG |
IκBα | TGGTCAGTGCCTTTTCTTCAT | GGAGTACGAGCAGATGGTCAA |
E2F1 | GGACCTTCGTAGCATTGCAGAC | TCAGGGCACAGGAAAACATCG |
MDM2 | GACGTAGAGGCGAGGATTCC | GCTGGGAGTGCCGTATGTC |
STAT3 | CAGCAGCTTGACACACGGTA | AAACACCAAAGTGGCATGTGA |
TGF-β | TGCCTTCAGCAGAGTGAAGA | GTCTTGGTTCTCAGCTTGGG |
LNMAT2 | GGTTCAGTTGGGCAAAAGGC | TCATTCAGTCACAGGGTGGC |
SOX18 | CTTCATGGTGTGGGCAAAGG | CCGGTACTTGTAGTTGGGGT |
PAI-1 | ACCGCAACGTGGTTTTCTCA | TTGAATCCCATAGCTGCTTG |
IFGBP3 | AGAGCACAGATACCCAGAAC | GGTGATTCAGTGTGTCTTCC |
8.蛋白印迹分析
(1)制胶:将玻璃板紧贴固定于制胶架,按需制备分离胶,从一个角小心灌入分离胶,灌入无水乙醇液封,压胶,室温静置30分钟,后倒出无水乙醇。按需制备浓缩胶,灌入玻璃板中,插入梳子,室温静置30分钟待浓缩胶凝固。
(2)上样:将制好的胶卡入电泳槽内,内槽加入新制备的电泳液。将制好的胶卡入电泳槽内,轻柔地拔出梳子,上样,加入3μl蛋白Marker。
(3)电泳:外槽加入电泳液,电泳槽接电源,调整电压为65V,待溴酚蓝指示带跑至分离胶时,将电压调整为100V,继续电泳至Marker跑到凝胶底部,停止电泳。
(4)电转:剪PVDF膜,浸泡于甲醇中激活10分钟。取下膜,轻轻翘开短玻璃板,小心切下浓缩胶及不需要的最下端部分,将电转夹子浸泡在电转液中,按照白面,海绵垫,滤纸,膜,胶,海绵垫,黑面的顺序夹好,放入电转槽中。加入电转液,将电转槽放入盛满冰的大泡沫箱中。接恒定电流250mA,90分钟。关闭电源,取出膜。
(5)封闭:将膜放入BSA封闭(5%的BSA液,用TBST配),室温慢摇1小时。
(6)一抗孵育:弃去封闭液,按需将膜切成条,放入一抗中,4℃摇床过夜。
(7)二抗孵育:第二天,从一抗中取出膜,用TBST清洗,3次,各10分钟。将膜放入二抗中,慢摇1小时。后续TBST洗涤3次,各10分钟。
(8)曝光:用ECL发光液试剂盒(Millipore,美国)配置发光液,其中AB液1:1混合。在暗房中将发光液加到膜上,盖上X光胶片进行曝光,根据不同发光亮度采用不同压片时间,然后放入洗片机中显影。
9.外泌体的分离提纯
细胞培养上清中外泌体的提取采用超速离心法进行,而患者血清中的外泌体提取则通过外泌体提取试剂盒(Thermo Fisher,美国)进行。对于超速离心法具体如下:收集细胞培养上清后于2000xg下离心15分钟以去除培养基中的细胞及细胞碎片。上清进一步在4℃,10000xg离心30分钟以去除较大的囊泡。将上清液转移至新离心管中并于4℃,120000xg离心70分钟后弃去上清液,加入PBS于4℃,120000xg离心70分钟洗涤外泌体,弃去上清液后自然风干离心管底部的沉淀物,取适量PBS重悬以获得外泌体悬液,保存于-80℃冰箱中以备进一步实验使用。
10.外泌体电镜鉴定
将外泌体用PBS稀释10倍后,加到电子显微镜用网格(PolySciences,美国)上静置沉淀30分钟。用滤纸吸去液体后,用2%戊二醛(SigmaAldrich,美国)固定10分钟。随后用PBS洗涤网格5次,加入2%醋酸铀(SigmaAldrich,美国)染色1min,PBS洗涤后于通风橱风干网格,于透射电子显微镜(日立,日本)下观察、拍照记录。
11.细胞增殖实验
本发明采用CCK-8实验评估细胞的增殖能力。将4×103个转染24小时后的胰腺导管腺癌细胞接种于96孔板中,将其置于37℃5%CO2培养箱中培养。在相应时间点(24小时、48小时、72小时、96小时)取出96孔板,分别加入10μl CCK-8试剂,置于培养箱中孵育2小时。采用酶标仪测量并记录450nm波长的吸光值。
12.细胞侵袭及迁移实验
本发明采用Transwell实验评估细胞的迁移及侵袭能力。将转染48小时后的胰腺导管腺癌细胞从六孔板中消化下来,离心并用不含胎牛血清的培养基进行重悬后计数,取2×105个细胞/孔,并添加无血清培养基至细胞悬液为200μl,将其接种于无铺设或预先铺设基质胶的Transwell小室上室中,下室则加入700μl的完全培养基后将其置于37℃5%CO2培养箱中培养。约16小时后,将小室取出,去除培养基,并用甲醇固定细胞15分钟。用PBS清洗残余的甲醇后,用0.1%的结晶紫染液进行染色15分钟。用PBS洗去残留的染料,并用棉签轻轻拭去小室内面的细胞。于显微镜下观察、拍照记录并比较不同实验组之间细胞迁移的情况。
13.淋巴管生成实验
本发明采用淋巴管生成实验评估淋巴管内皮细胞的增殖能力。将淋巴管内皮细胞用胰酶消化下来后,离心并用无添加血清及生长因子的ECM培养基进行重悬后计数,取1×105个细胞/孔接种于预先铺设基质胶的2孔板中并加入PBS或不同处理组的胰腺癌外泌体。约12小时后,于显微镜下观察、拍照记录并比较不同实验组之间淋巴管形成的情况。
14.裸鼠原位成瘤模型
实验所用的4-5周龄的裸鼠均购买于自北京维通利华实验动物有限公司,饲养于中山大学医学部动物实验中心。用4%水合氯醛(0.1ml/g)将裸鼠麻醉后,将其摆放至右侧卧位,剪开裸鼠左侧胁肋部皮肤,翻开脾脏充分暴露胰腺。将5×106个胰腺导管腺癌细胞自胰尾部向一头部注射进胰腺中,并用5-0缝线缝合裸鼠皮肤。每隔3天记录裸鼠体重。4周后行PET-CT(西门子,德国)检测裸鼠原位成瘤及肝转移情况。解剖裸鼠原位肿瘤组织,记录不同实验组之间肿瘤组织大小。
15.裸鼠腘窝淋巴结转移模型
实验选用4-5周龄的裸鼠。将1×106个荧光素标记的肿瘤细胞注射于裸鼠右侧足垫以建立裸鼠腘窝淋巴结转移模型。待淋巴结长至50mm3,开始予瘤内注射PBS、不同处理组外泌体。每隔3天记录裸鼠体重,每隔1周行活体成像检测裸鼠腘窝淋巴结情况转移情况。观察直至裸鼠死亡,解剖裸鼠足垫肿瘤及腘窝淋巴结组织,记录不同实验组之间淋巴结大小,并将肿瘤及淋巴结组织用福尔马林浸泡后以便进一步的实验分析。
16.RNApμlldown
本实验分为体外转录、生物素探针标记RNA及RNAPμlldown三部分,所有的步骤均按相应试剂盒的生厂商说明书进行。
(1)体外转录:首先解冻试剂,并将NTP/CAP置于冰上,reaction buffer保存于室温。按标准体系配比混合试剂后37℃孵育2小时。加入DNA酶于37℃下孵育15分钟以去模板DNA影响。通过RNA纯化试剂盒提取目的RNA,并保存于-80℃冰箱中以备下一步使用。
(2)生物素探针标记RNA:将PEG及DMSO试剂置于常温,其余试剂于冰上溶解。取目标及对照RNA置于85℃5分钟后再置于冰上5分钟以充分变性RNA。按照标准体系配制混合液后于16℃下孵育过夜。通过酚氯仿提取标记成功的RNA以备进一步使用。
(3)RNAPμlldown:收集胰腺导管腺癌细胞后加入细胞裂解液充分裂解细胞,并于4℃下,3000rpm离心10分钟以获得细胞裂解液上清。准备实验用的磁珠,并将其与标记的RNA混合后室温旋转孵育20分钟使磁珠与RNA充分混合。将细胞裂解产物上清加入处理过的磁珠中并加入核糖核酸酶抑制剂,于4℃下旋转孵育2小时。通过磁力架去除上清,并加入预冷的0.1%SDS溶液及蛋白上样缓冲液重悬磁珠,于98℃下煮10分钟后去除磁珠转移上清至新的EP管中,进一步通过银染及后续质谱或者Westernblot分析实验结果。
17.RNA结合蛋白免疫沉淀(RIP)实验
本实验采用Merck Millipore公司的RIP试剂盒。所有的实验步骤均按生产商提供的说明书进行。首先准备并收集1×107个/组胰腺导管腺癌细胞。将其置于100μl含有0.5μl蛋白酶抑制剂和0.25μl的核糖核酸酶抑制剂的细胞裂解液中冰上充分裂解5分钟。获得的约100μl的裂解产物于-80℃冰箱中保存过夜。配制免疫沉淀磁珠,即取50μl磁珠悬浮液于1.5ml离心管中,并用RIP洗涤缓冲液进行洗涤2遍后加入5μl的目的抗体于室温下孵育30分钟。快速解冻细胞裂解产物并在4℃,14000rpm离心10分钟,取10μl上清液并将其标记为input,其余上清加入含有磁珠抗体复合物的RIP免疫沉淀缓冲液中于4℃下孵育过夜。将免疫沉淀物用RIP洗涤缓冲液洗涤后加入蛋白酶K缓冲液,而input也同样加入蛋白酶K缓冲液进行孵育消化蛋白质。取上清液于新的离心管中,并加入400μL苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)后剧烈震荡15秒,于室温下14000rpm离心10分钟。取其离心后的水相加入无水乙醇及沉淀增强剂于-80℃下保存过夜,以充分沉淀RNA。离心并弃去上清液,自然风干沉淀后,加入无酶水溶解并逆转录后进一步通过qRT-PCR分析实验结果。
18.RNA纯化染色质分离(ChIRP)实验
本实验采用Merck Millipore公司的ChIRP试剂盒。所有的实验步骤均按生产商提供的说明书进行。首先收集2×107个/组胰腺导管腺癌细胞,并用20ml 1%的戊二醛室温固定10分钟后用2ml甘氨酸中和未反应的戊二醛,于4℃,1000rpm离心5分钟并弃去上清,用PBS清洗三遍。根据沉淀质量,加入1ml/100g裂解液充分重悬沉淀后于超声下碎片化DNA片段。取出其中10μl作为DNA input及10μl作为RNAinput。剩余实验样品中分别加入探针,在37℃下杂交4小时。随后加入100μl磁珠悬浮液,并在37℃下孵育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤5次后,加入DNA洗脱液、核糖核酸酶A及蛋白酶K,充分混匀,于55℃温育消化1小时,加入至吸附柱,分离提纯DNA,并进一步通过qRT-PCR分析实验结果。
19.染色质免疫沉淀(ChIP)实验
本实验采用Merck Millipore公司的ChIP试剂盒。所有的实验步骤均按生产商提供的说明书进行。首先收集1×107个/组胰腺导管腺癌细胞,加入37%甲醛至终浓度为1%,室温固定10分钟后用十分之一体积甘氨酸中和未反应的甲醛。于4℃,1000rpm离心5分钟并弃去上清,用PBS清洗三遍。加入1ml裂解液充分重悬沉淀后于超声下碎片化DNA片段。取100μl裂解产物加入900μl稀释缓冲液后,取10μl并将其标记为input,其余加入抗体于4℃下孵育过夜。随后加入磁珠4℃下孵育1小时,分别加入低盐洗涤液、高盐洗涤液、LiCl洗涤液及TE溶液洗涤后,加入100ul洗脱液洗脱2次,加入8ul NaCl 65℃解交联。接交联结束后,分别加入核糖核酸酶A、蛋白酶K处理后,加入至吸附柱分离提纯DNA,并进一步通过qRT-PCR分析实验结果。
20.双荧光素酶报告基因实验
本实验采用promega公司的实验试剂及步骤进行。首先将目标基因构建至荧光素酶质粒中,并将质粒转染至细胞中。转染36小时后弃去六孔板中的培养基并用PBS洗3遍,每个孔加入500μl的裂解液,并将其置于摇床中慢摇15分钟以充分裂解细胞。于96孔板中取20μl的上述细胞裂解液加入其中并加入100μl预先配制混合好的LuciferaseAssay ReagentII试剂于2秒后检测荧光素酶的反应强度。接着再加入100μl预先配制混合好的Stop&GloReagent试剂于2秒后检测海肾荧光素酶反应强度,记录并对比两者的数值。
21.FISH和免疫荧光
(1)原位杂交:将5×104细胞接种于共聚焦小皿中培养过夜。加入1ml 4%多聚甲醛固定,加入0.1%TritonX-100破膜后,分别加入探针、2×SSC、10%甲酰胺和10%右旋糖酐中并在在37℃杂交过夜。最后,用DAPI对细胞核进行染色,在共聚焦显微镜下观察并记录图像。
(2)免疫荧光:取5×104细胞接种于共聚焦小皿中,培养过夜后加入1ml 4%多聚甲醛固定并加入0.1%TritonX-100破膜,用PBST洗涤2次后,加入50μl 1%PBS封闭。然后,将细胞与一抗混合在4℃孵育过夜,随后在室温下孵育二抗30分钟,最后,用DAPI对细胞核进行染色,在共聚焦显微镜下观察并记录图像。
22.外泌体摄取实验
本实验采用PKH67荧光标记试剂盒(SigmaAldrich,美国)对外泌体进行染色。从细胞上清分离外泌体后,加入PKH67染色2分钟后,加入1%PSA终止染色。通过超速离心法分离PKH67标记的外泌体,并加入添加10%去外泌体胎牛血清的培养基重悬。将PKH67标记的外泌体与淋巴管内皮细胞孵育12小时后,用PBS洗涤2次,加入4%多聚甲醛固定细胞。最后,用DAPI对细胞核进行染色,在共聚焦显微镜下观察并记录图像。
23.统计学分析
本发明所有的统计学分析均采用SPSS22.0软件进行,其中p<0.05即认为具有统计学意义。所有的实验均重复执行三次,定量资料采用均数±标准差表示。对于资料的统计分析中,非正态分布资料的分析采用Mann-Whitney U检验,参数变量采用t检验或方差分析,非参数变量采用χ2检验,并通过Kaplan-Meier法评估患者的总生存期和无病生存期,进而通过Cox回归分析影响患者生存预后的因素。
二、实施例实验结果
1.lncRNA-PATB1的筛选与鉴定
本发明通过对8例胰腺导管腺癌组织及4例正常胰腺组织进行基因芯片分析,筛选在其中差异表达的lncRNA-PATB1。其中有26个lncRNAs在胰腺导管腺癌组织中上调5倍以上(图1A)。根据差异倍数挑选了排名前5的lncRNAs,并进一步扩大样本在192例胰腺导管腺癌患者的组织样本中检测它们的表达,结果提示只有lncRNA-PATB1在胰腺导管腺癌组织中的表达高于癌旁组织(图1B)。因此选择lncRNA-PATB1行进一步研究。
2.lncRNA-PATB1与胰腺导管腺癌患者转移和不良预后相关
本发明进一步通过检测lncRNA-PATB1的表达与胰腺导管腺癌患者临床病理特征的关系,发现lncRNA-PATB1的表达与胰腺导管腺癌的淋巴结转移和TNM分期呈正相关(图1C-D,表4)。此外,后续随访结果表明,在lncRNA-PATB1过表达与胰腺导管腺癌患者不良预后呈正相关(图1E-F)。单因素及多因素分析显示,lncRNA-PATB1的表达是影响胰腺导管腺癌患者生存的独立预后因素(表5)。以上结果提示lncRNA-PATB1与胰腺导管腺癌患者转移和不良预后相关。
表4 LncRNA-PATB1的表达与胰腺导管腺癌患者临床病例特征的关系
注:a Chi-square test,*p<0.05,**p<0.01。
表5单因素和多因素分析影响胰腺导管腺癌患者总生存期(OS)的因素(n=192)
注:*p<0.05,**p<0.01
3.体外实验证实lncRNA-PATB1促进胰腺导管腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭
本发明进一步通过体外实验探究lncRNA-PATB1对胰腺导管腺癌细胞功能的影响。CCK-8实验提示,下调lncRNA-PATB1的表达显著抑制胰腺导管腺癌细胞的增殖活性,而lncRNA-PATB1过表达则增强胰腺导管腺癌细胞的增殖活性,提示lncRNA-PATB1促进胰腺导管腺癌的增殖(图2A-D)。此外,本发明通过Transwell迁移及侵袭实验证实,敲降lncRNA-PATB1后,胰腺导管腺癌细胞的迁移和侵袭能力显著下降(图2E-H)。以上体外实验结果表明,lncRNA-PATB1促进胰腺导管腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力。
4.体内实验证实lncRNA-PATB1促进胰腺导管腺癌侵袭转移
本发明进一步通过构建胰腺导管腺癌原位模型研究lncRNA-PATB1对胰腺导管腺癌进展的影响。本发明将20只裸鼠分成两组,每组10只,并分别将稳定转染sh-NC或sh-PATB1#1慢病毒质粒的PANC-1细胞注射到裸鼠胰腺内。通过PET-CT分析显示,sh-PATB1#1组的18F-脱氧葡萄糖(18FDG)摄取率显著降低,提示敲降lncRNA-PATB1的表达抑制胰腺导管腺癌的生长(图3A-B)。与sh-NC组相比,sh-PATB1#1组的肿瘤体积减小(图3C)。此外,lncRNA-PATB1沉默降低了荷瘤小鼠肝脏转移的发生率,提示lncRNA-PATB1促进了胰腺导管腺癌的转移(图3D)。生存分析表明,下调lncRNA-PATB1的表达延长了小鼠的生存时间(图3E)。实验结果提示,lncRNA-PATB1在体内都促进胰腺导管腺癌的侵袭转移。
5.LncRNA-PATB1与hnRNPA1结合介导NF-kB通路激活
RNA与蛋白之间的相互作用是lncRNA发挥功能的主要形式。因此,本发明进一步鉴定胰腺导管腺癌中与lncRNP-PATB1相互作用的蛋白。通过RNA pμlldown及后续银染试验发现,共沉淀后在35-55kDa存在一条明显的差异条带,质谱检测证实为hnRNPA1蛋白(图4A-B)。FISH联合免疫荧光染色显示,lncRNA-PATB1和hnRNPA1在胰腺导管腺癌细胞胞核及胞浆均有共定位(图4C)。RIP实验进一步证实hnRNPA1可特异性富集lncRNP-PATB1,提示LncRNA-PATB1与hnRNPA1直接结合(图4D)。
既往研究报道hnRNPA1参与调控胰腺导管腺癌中NF-κB信号通路的激活。因此,本发明进一步明确lncRNA-PATB1与hnRNPA1结合后是否介导NFκB信号通路的激活。结果证实,lncRNA-PATB1过表达显著下调IκBα的表达,并激活NF-κB信号通路(图4E-F),而敲降hnRNPA1则逆转lncRNA-PATB1对NF-κB信号通路的影响(图4G-J)。以上结果提示,lncRNA-PATB1通过结合hnRNPA1下调IκBα的表达进而激活NF-κB信号通路。
6.鉴定lncRNA-PATB1在胰腺导管腺癌外泌体中高表达
本发明运用超速离心法分离纯化胰腺导管腺癌及正常胰腺导管上皮细胞培养上清中的外泌体,通过透射电镜及纳米颗粒示踪分析鉴定其为大小为30-150nm的杯盘状的外泌体颗粒(图5A-B)。Western blot检测证实其高表达外泌体标记蛋白CD9和CD63(图5C)。进一步通过qRT-PCR检测发现,lncRNA-PATB1在胰腺导管腺癌细胞系来源的外泌体中的表达对比在正常胰腺导管上皮细胞来源的外泌体中的表达显著升高(图5D)。本发明发现,lncRNA-PATB1在胰腺导管腺癌细胞来源的外泌体中的丰度高于与其在细胞中的丰度,提示外泌体介导的lncRNA-PATB1可能在胰腺导管腺癌的进展中发挥着重要功能(图5D)。沉默胰腺导管腺癌细胞中lncRNA-PATB1的表达显著降低胰腺导管腺癌外泌体中lncRNA-PATB1的表达,而过表达细胞中的lncRNA-PATB1则结果相反,提示外泌体lncRNA-PATB1的表达受细胞内lncRNA-PATB1的表达情况影响(图5E-H)。结果提示lncRNA-PATB1在胰腺导管腺癌外泌体中高表达。
7.外泌体lncRNA-PATB1的初步功能
淋巴管内皮新生是肿瘤发生淋巴结转移的过程中重要的限速步骤,肿瘤来源的外泌体可通过介导淋巴管内皮新生促进淋巴转移。因此,本发明进一步探究外泌体lncRNA-PATB1是否能促进淋巴管内皮新生。成管及Transwell实验表明,对比对照组,下调胰腺导管腺癌细胞来源的外泌体中lncRNA-PATB1的表达抑制淋巴管内皮细胞的成管和迁移(图6A-C)。同样的,与过表达lncRNA-PATB1的胰腺导管腺癌外泌体共孵育后,淋巴管内皮细胞的成管和迁移能力显著增强(图6D-F)。以上结果表明,胰腺导管腺癌来源的外泌体lncRNA-PATB1诱导淋巴管内皮新生。
8.外泌体lncRNA-PATB1促进淋巴管新生的初步机制研究
由于外泌体lncRNA-PATB1促进淋巴管内皮新生的发生,进一步研究其中的具体分子机制。首先通过敲降胰腺导管腺癌细胞中hnRNPA1的表达发现胰腺导管腺癌外泌体中lncRNA-PATB1的表达也显著下降而胰腺癌细胞中lncRNA-PATB1无明显改变,证实hnRNPA1参与介导lncRNA-PATB1进入外泌体(图7A-B)。外泌体摄取实验证实,外泌体lncRNA-PATB1可特异性被淋巴管内皮细胞摄取(图7C-E)。qRT-PCR证实,外泌体lncRNA-PATB1促进淋巴管内皮细胞中淋巴管表型关键蛋白SOX18的表达(图7F-G)。进一步ChIRP实验证实外泌体介导的lncRNA-PATB1与SOX18的启动子区直接结合(图7H-I)。因此,胰腺导管腺癌通过分泌外泌体lncRNA-PATB1激活淋巴管内皮细胞中SOX18的转录,进而促进淋巴管内皮新生及淋巴转移。
9.外泌体lncRNA-PATB1与胰腺导管腺癌患者淋巴转移呈正相关
外泌体作为液体活检的重要检测对象,通过对其携带的生物分子进行检测,可运用于多种肿瘤的诊断。因此,为了进一步探讨外泌体lncRNA-PATB1是否可作为胰腺导管腺癌转移的分子标记物,本发明从92例胰腺导管腺癌病人及92例正常人血清标本中分离外泌体并检测lncRNA-PATB1的表达。结果发现,lncRNA-PATB1在胰腺导管腺癌病人外泌体中的表达高于正常人外泌体中的表达(图8A)。进一步分析胰腺导管腺癌患者临床病理特征后发现,外泌体lncRNA-PATB1的表达与淋巴转移及临床分期相关(表6)。qRT-PCR检测证实,相比淋巴转移阴性或临床分期较早的胰腺导管腺癌病人,lncRNA-PATB1在淋巴转移阳性或临床分期较晚的胰腺导管腺癌病人外泌体中的表达更高(图8B-C)。
表6外泌体LncRNA-PATB1的表达与胰腺导管腺癌患者临床病例特征的关系
注:a Chi-square test,*p<0.05,**p<0.01。
10.外泌体lncRNA-PATB1过表达提示胰腺导管腺癌患者预后不良
本发明进一步对92例胰腺导管腺癌患者进行随访,生存分析结果提示胰腺导管腺癌患者外泌体中lncRNA-PATB1高表达与胰腺导管腺癌患者较短的总生存期及无病生存期相关(图9A-B)。进一步通过单因素和多因素分析证实,外泌体lncRNA-PATB1是胰腺导管腺癌患者总生存期的一个独立预后因素(表7)。更重要的是,外泌体lncRNA-PATB1的表达与有淋巴转移的胰腺癌导管腺癌患者的总生存期呈负相关(图9C),进一步提示外泌体lncRNA-PATB1的表达可指示淋巴转移患者的预后情况。
表7单因素和多因素分析影响胰腺导管腺癌患者总生存期(OS)的因素(n=92)
注:*p<0.05,**p<0.01。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (10)
1.如下任一项应用:
(1)lncRNA-PATB1的抑制剂或包括该抑制剂的药物组合物在制备治疗胰腺导管腺癌的产品中的应用;
(2)检测lncRNA-PATB1表达水平的试剂或包括该试剂的产品在制备诊断胰腺导管腺癌转移/预测胰腺导管腺癌预后的工具中的应用;
(3)lncRNA-PATB1在构建诊断胰腺导管腺癌转移/预测胰腺导管腺癌预后的系统/装置中的应用;
(4)lncRNA-PATB1在构建诊断胰腺导管腺癌转移/预测胰腺导管腺癌预后的计算机可读存储介质中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述lncRNA-PATB1为SEQ ID NO:1所示的RNA序列。
3.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述试剂选自特异性识别lncRNA-PATB1基因的寡核苷酸探针、特异性扩增lncRNA-PATB1基因的引物或特异性结合lncRNA-PATB1基因的蛋白。
4.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述产品包括芯片、试剂盒或核酸膜条。
5.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述抑制剂包括核酸抑制剂、蛋白抑制剂。
6.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述系统/装置包括:
获取单元:用于获取样本中lncRNA-PATB1的表达水平;
处理单元:根据lncRNA-PATB1的表达情况,获得胰腺导管腺癌诊断转移/预后预测结果。
7.根据权利要求1或2所述的应用,其特征在于,所述计算机可读存储介质上存储有计算机程序,所述计算机程序被处理器执行时实现权利要求1或6所述的系统/装置。
8.一种用于诊断胰腺导管腺癌转移的产品,其特征在于,所述产品包含有用于检测lncRNA-PATB1表达水平的试剂;
所述lncRNA-PATB1为SEQ ID NO:1所示的RNA序列。
9.一种用于治疗胰腺导管腺癌的药物,其特征在于,所述药物包含有降低lncRNA-PATB1表达水平的抑制剂;
所述lncRNA-PATB1为SEQ ID NO:1所示的RNA序列。
10.一种用于预测胰腺导管腺癌预后的产品,其特征在于,所述产品包含有用于检测lncRNA-PATB1表达水平的试剂;
所述lncRNA-PATB1为SEQ ID NO:1所示的RNA序列。
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