CN1906302B - 含有SARS-CoV病毒核苷酸序列的基因修饰的植物和使用它进行免疫抗SARS的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因修饰的植物和其后代，其构成抗严重急性呼吸综合症(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)的可食用的植物衍生的粘膜疫苗和可注射的植物衍生的粘膜疫苗。本发明涉及特别转化，但不限于烟草，番茄和莴苣植物的核和/或质体以产生抗原的重组载体。在特定的实施方案中，表达核苷酸序列的质体转化载体是pCV1，pCV6和pCV8，和其含有具有核苷酸(而不是氨基酸)改变以使密码子使用最适于在植物中表达的S1的衍生物。本发明涉及制备修饰的植物的方法，包括用用于SARS-CoV病毒，其片段，衍生物，类似物，或变体的核表达和/或质体表达的载体转化植物。本发明还涉及免疫抗SARS的方法，和使用由质体和/或核载体转化的植物产生的SARS-CoV抗原进行抗体检测的方法。

Description

含有SARS-CoV病毒核苷酸序列的基因修饰的植物和使用它进行免疫抗SARS的方法

本申请要求2003年12月5日提交的U.S.Serial No.60/527,637的优先权，在此以引用的方式将其内容引入本申请。

在本申请中，某些出版物被作为参考。这些出版物以及其它的相关参考文献的完整引用可在紧邻权利要求之前找到。在此将这些出版物公开的内容引入到本申请中以更充分地描述本文中所描述的和要求保护的发明作出时的现有技术的状况。

发明背景

最近在中国大陆的广东省爆发了非典型性肺炎。在2002年11月到2003年3月之间，报道了792个病例，其中有31例死亡(WHO，Severe Acute Respiratory Syndrome(SARS)，Weekly Epidemiol.Rec.(2003)Vol.78，page 86)。随着这次危机，香港医院管理局增加了对严重非典型性肺炎患者的监控。在此研究的过程中，鉴别出了许多成群的患有该病的卫生保健工作者。此外，在与那些感染者密切接触的人中有成群的肺炎事件。该疾病的严重程度和发展是不寻常的，尽管有对于已知通常与非典型性肺炎有关的细菌病原体的典型的抗生素治疗。本发明的发明人中的某些是参与对这些患者的研究的小组成员。该疾病被简称为严重急性呼吸综合症(Severe Acute RespiratorySyndrome，“SARS”)，其是由称为SARS-CoV病毒的新的冠状病毒引起的(Peiris et al.，2003，Lancet Vol.61，pages 1319-25；Fouchieret al.，2003，Nature Vol，423，page 240)。SARS相关的冠状病毒与以前表征的引起包括人在内的动物的呼吸和肠疾病的冠状病毒科(Coronaviridae)成员不同。

植物作为动物，包括人的营养物质，以及对于用作药物，化妆品等的物质的生产具有重要作用。通过植物核转化产生转基因植物已成功地生产出抗霍乱，诺沃克病毒(Norwalk virus)，乙型肝炎，口蹄疫的粘膜疫苗(Walmsley and Arntzen，2003，Curr.Opin.Biotech.Vol，14，pages 145-150)。在转基因植物中表达的病毒抗原有效诱导动物中的粘膜和血清免疫反应，不管是肠胃外或是口服递送(Daniell etal.，2001，Trends Plant Sci.Vol.6，pages 219-226)。

质体转化对重组DNA技术提供了巨大的好处。在植物细胞中与核基因组相比，存在高达10,000多个拷贝的质体基因组，这确保了质体表达的外源蛋白，或在疫苗生产中，抗原的产量的提高。而且，由于缺少花粉的传播，质体的母性遗传会导致外源基因的保持(Daniell etal.，2002，Trends Plant Sci.Vol，7，pages 84-91)。人生长激素累积达到总可溶性蛋白的7％，这是从核转化的烟草中得到的结果(Staub etal.，2000，Plant Journal Vol.6，pages 547-553)的300倍，而人血清清蛋白累积达到总可溶性蛋白的11.1％，这是从核转化的叶片中得到的结果(Fernandez-San Millan et al.，2003，Plant Biotech Vol.1，pages 71-79)的500倍。霍乱毒素B亚基，首个由质体转化产生的植物衍生的疫苗，在烟草叶片中累积达到总可溶性蛋白的4.1％(Daniellet al.，2001，J.Mol.Biol.Vol.311，pages 1001-1009)。比较而言，核转化植物中外源蛋白的产量很少超过总可溶性蛋白的1％(Daniell etal.，2001，Trends Plant Sci.Vol.6，pages 219-226)。

发明简述

本发明是基于本发明人发现表达SARS-CoV病毒抗原的基因修饰的植物及其后代可以用作抗SARS的疫苗。当基因修饰的植物或其后代被动物摄取时，或者基因修饰的植物或其后代的提取物被注入到动物，优选人中或被其摄食时，产生抗SARS-CoV病毒抗原的抗体。抗SARS-CoV病毒的可食性疫苗，可作为果实(例如番茄)，叶片(例如莴苣)，块茎(例如马铃薯)，种子(例如稻或玉米)，花，茎或根递送，省去了从微生物获得重组疫苗所需的高成本的纯化程序。它进一步的优势在于容易储存，运输以及通过直接摄食给药。而且，果实，叶片，块茎，种子，花，茎或根形式的可食性疫苗可以在发展中国家培育并易于配发，省去了免疫程序的成本，也不需要冷冻和要求受过训练的卫生技术人员进行的通过注射的递送。

根据本发明，植物转化载体被工程化以提供用于引发动物的免疫反应从而预防和治疗SARS的SARS-CoV病毒抗原。所述抗原包括SARS-CoV病毒的蛋白质试剂或分子，其天然或人工变体，或其突变体。含有SARS-CoV病毒序列的植物载体可以被工程化以提供SARS-CoV病毒的一个，两个，三个或更多个核苷酸序列。根据本发明，所述抗原序列可以是来自于所述SARS-CoV病毒，其天然或人工变体，或其突变体。

本发明提供了含有编码SARS-CoV病毒的多肽的片段，衍生物，类似物，或变体的SARS-CoV核苷酸序列的植物转化载体。在特定的实施方案中，本发明提供了转基因的和/或转质体(transplastomic)烟草植物。本发明提供了含有SARS-CoV抗原，包括SARS-CoV病毒的多肽或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的修饰的植物。这些活性包括功能活性以及免疫原性能力。本发明还提供了产生该修饰的植物的方法，包括用含有SARS-CoV病毒序列，其片段，衍生物，类似物，或变体的质体和/或核转化载体转化植物。在优选的实施方案中，本发明提供了表达少于SARS-CoV病毒的完整基因组的修饰的植物。在优选的实施方案中，该修饰的植物提供SARS-CoV病毒完整基因组的少于95％，少于90％，少于85％，少于80％，少于75％，少于70％，少于65％，少于60％，少于55％，少于50％，少于45％，少于40％，少于35％，少于30％，少于25％，少于20％，少于15％，少于10％，少于5％，或少于1％。在优选的实施方案中，该修饰的植物提供SARS-CoV病毒的至少1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12个多肽，片段，衍生物，类似物，和变体。

在另一个特定的实施方案中，本发明提供了抗SARS的疫苗。该疫苗含有该修饰的植物，其蛋白，或提取物。本发明还提供了免疫抗SARS的方法。所述方法包括给动物施用该修饰的植物以在动物中引发抗SARS-CoV病毒抗原的抗体的产生，所述抗原包括SARS-CoV病毒的多肽，或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子。

在另一个特定的实施方案中，工程化植物转化载体以提供SARS-CoV病毒抗原用作血清检测试剂。本发明的一个方面涉及在样品中检测SARS-CoV病毒抗原的抗体的方法，其是通过将植物衍生的SARS-CoV病毒抗原与所述样品培育，检测与该植物衍生的SARS-CoV病毒抗原相结合的抗体的存在来进行的。所述样品可以是生物流体，例如血液，血清，血浆，唾液，尿，粪便，痰，鼻咽吸出物，细胞和组织。对于抗体检测来说，这种植物衍生的抗原将会是那些由感染的细胞系产生的抗原的更便宜的替代物。

在一个实施方案中，本发明涉及含有由转化的植物细胞或植物产生的SARS-CoV病毒抗原的组合物。使用所述组合物检测SARS-CoV病毒抗原的抗体的方法也包括在内。在特定的实施方案中，方法包括使样品与含有由转化的植物细胞或植物产生的SARS-CoV病毒抗原的组合物接触，和检测与SARS-CoV病毒抗原结合的抗体。

在一个特定的实施方案中，本发明提供了含有编码SARS-CoV病毒的多肽的片段，衍生物，类似物，或变体的SARS-CoV病毒的核苷酸序列的质体转化载体。在另一个实施方案中，本发明提供了表达SARS-CoV病毒的多肽，其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的质体转化载体。在特定的实施方案中，没有病毒DNA的载体是pMLVHisA。在特定的实施方案中，本发明提供了通过质体转化载体pCV1，pCV6，或pCV8，和其含有具有核苷酸(而不是氨基酸)变化以使密码子使用最适于在植物中表达的S1的衍生物产生SARS-CoV病毒抗原的方法。

在另一个特定的实施方案中，本发明提供了含有SARS-CoV病毒的核苷酸序列，其片段，衍生物，类似物，或变体的核转化载体。在另一个实施方案中，本发明提供了表达SARS-CoV病毒的多肽，其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的核转化载体。在特定的实施方案中，没有病毒DNA的载体是pSa7。在特定的实施方案中，本发明提供了通过核转化载体pCV2，pCV4，或pCV12，和其含有具有核苷酸(而不是氨基酸)变化以使密码子使用最适于在植物中表达的S1的衍生物产生SARS-CoV病毒抗原的方法。

在特定的实施方案中，本发明进一步提供了其中具有含有来自于稻质体基因psbA的启动子，和终止子的载体的转质体烟草植物。包含含有SARS-CoV病毒的核苷酸序列的载体的植物细胞也是本发明的一个方面。含有表达SARS-CoV多肽，其衍生物，类似物，或变体的细胞的修饰的植物的植物部分，例如果实，叶片，块茎，种子，花，茎或根在本发明中提供。所述植物部分包括从完整植物上分离的或相连于完整植物上的部分。在特定的实施方案中，本发明进一步使用选择标记基因aadA，其具有壮观霉素抗性。在另一个实施方案中，本发明使用重组(His)₅-标记蛋白的起始密码子和rbcL终止子。在优选的实施方案中，所述修饰的植物进一步含有表达蛋白酶抑制蛋白的异源核苷酸序列。

在另一个特定的实施方案中，本发明提供了用于表达SARS-CoV抗原的核转化载体的构建，所述抗原包括SARS-CoV病毒的多肽，或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子。在特定的实施方案中，本发明提供了植物核转化载体pCV2，pCV4和pCV12。

在另一个特定的实施方案中，本发明提供了用于表达SARS-CoV抗原的质体转化载体的构建，所述抗原包括SARS-CoV病毒的多肽，或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子。在特定的实施方案中，本发明提供了植物质体转化载体pCV1，pCV6和pCV8。

在特定的实施方案中，核转化载体用于表达一种或多种SARS-CoV抗原，包括SARS-CoV病毒的多肽，或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子。

在特定的实施方案中，质体转化载体用于表达一种或多种SARS-CoV抗原，包括SARS-CoV病毒的多肽，或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子。

在特定的实施方案中，质体转化载体和核转化载体用于表达一种或多种SARS-CoV抗原，包括SARS-CoV病毒的多肽，或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子。

本发明提供了在植物中产生SARS-CoV病毒抗原的方法，所述抗原包括SARS-CoV病毒的多肽，或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子。所述方法包括用含有与一个或多个SARS-CoV病毒多肽的编码序列可操作连接的启动子，和终止子的载体转化植物。包含含有一个或多个编码SARS-CoV病毒抗原，包括SARS-CoV病毒的多肽，或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的核酸序列的载体的植物细胞也是本发明的一个方面。或者，所述植物细胞可以包含本发明的一个或多个载体。本发明提供了植物部分，例如所述修饰的植物的果实，叶片，块茎，种子，花，茎，根，和其它所有的解剖部分。

本发明提供了引发对SARS-CoV抗原，包括SARS-CoV病毒多肽，或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的免疫反应的疫苗。在一个特定的实施方案中，本发明提供了免疫抗SARS的方法。所述方法包括摄食可食用的转化的植物部分，所述植物部分含有编码SARS-CoV病毒多肽的SARS-CoV病毒序列的核酸分子。在另一个实施方案中，所述方法包括食用所述修饰的植物或静脉注射或摄食所述修饰的植物的提取物，该植物表达SARS-CoV抗原，包括SARS-CoV病毒多肽，或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子。在另一个特定的实施方案中，本发明提供了免疫抗SARS的方法，其是给兔，山羊，牛，猪，绵羊，马，灵长类动物，灵猫，啮齿动物，浣熊，貉，狗，白鼬，鼬獾(ferret Badger)，猫，鸟，或任何其它动物种类，包括人喂食本发明的修饰的植物或注射或摄食本发明的修饰的植物的提取物。本发明进一步提供了从免疫的动物中提取抗体。所述抗体对SARS-CoV抗原，包括SARS-CoV病毒的病毒多肽，或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子是免疫特异的。

附图简述

图1A-1W显示了pCV1的限制性位点。

图2A-2C显示了pCV1(SEQ ID NO：1)的核酸序列。

图3A-3B显示了pCV1上特定限制酶的限制性图谱。

图4显示了衍生出pCV1，pCV6和pCV8的pMLVHisA质体转化载体。侧翼区域rbcL和accD来自于烟草质体基因组，用于在质体转化中进行同源重组。P_psbA代表用于表达插入基因的启动子。T_psbA代表终止子。P_rrn代表驱动壮观霉素抗性标记aadA表达的启动子。T_rbcL代表rbcL终止子。Met代表重组(His)₅-标记蛋白的起始密码子。(A)显示了pCV8的序列(SEQ ID NO：2)和限制性位点。(B)显示了pCV8上特定限制酶的限制性图谱。(C)显示了pCV8上特定限制酶的限制性图谱。(D)显示了pCV8上特定限制酶的限制性图谱。

图5显示了衍生出pCV2和pCV4的pSa7核转化载体。RB和LB代表T(转移)-DNA的右和左边界，用于随机插入植物核基因组中。NOS-Pro代表胭脂碱合酶(NOS)启动子。NOS-ter代表NOS-终止子。NPTII(Kan^R)代表具有卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶。CaMV35S-Pro代表花椰菜花叶病毒35S启动子。SaPIN2a cDNA代表编码少花龙葵(Solanum americanum)蛋白酶抑制剂IIA的cDNA。

图6A-6I显示了SARS病毒的完整核酸序列(SEQ ID NO：7)。

图7A-7LL显示了pCV8的限制性位点。

图8A-8D显示了pCV8的核酸序列(SEQ ID NO：2)。

图9显示了pCV8上特定限制酶的限制性图谱。

图10显示了pCV8上特定限制酶的限制性图谱。

图11显示了pCV8上特定限制酶的限制性图谱。

图12显示了pCV12核转化载体，用于表达由SARS-CoV S1蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)融合组成的融合蛋白。RB和LB代表T(转移)-DNA的右和左边界，用于随机插入植物核基因组中。NOS-ter代表NOS-终止子。CaMV35S-Pro代表花椰菜花叶病毒35S启动子。S1代表SARS-CoV S1蛋白以及GFP，绿色荧光蛋白。

图13A-13B分别显示了M-基因的基因组DNA序列(SEQ ID NO：3)，和M蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

图14A-14B显示了S-基因的基因组DNA序列(SEQ ID NO：5)。

图15显示了S蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。

图16A-16NN显示了由SEQ ID NO：7推定的三个框架的氨基酸序列。星号(＊)表示标志肽末端的终止密码子。

图17A-17NN显示了由SEQ ID NO：7的互补序列推定的三个框架的氨基酸序列。星号(＊)表示标志肽末端的终止密码子。

图18A-D显示了S1：GFP在农杆菌渗入的烟草叶片中的瞬时表达。代表性的烟草叶片表皮细胞在用含有表达S1：GFP融合蛋白的质粒pCV12的根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404(A，C)或含有单独表达GFP的pGDG的LBA4404(B，D)进行农杆菌渗入(Yang Y.et al.，In vivo analysis of plant promoters andtranscription factors by agroinfiltration of tobacco leaves.Plant J.2000；22：543-551)后2天由共焦显微镜显示。横条代表20μm。

图19A-19XX显示了pCV2的限制性位点。

图20A-20E显示了pCV2的核酸序列(SEQ ID NO：8)。

图21A-21NN显示了pCV6的限制性位点。

图22A-22D显示了pCV6的核酸序列(SEQ ID NO：9)。

图23A-23I显示了转化后得到的植物以及对它们的分析。图23A-23E显示了用核转化载体pCV2进行农杆菌介导的对烟草和莴苣的转化后得到的再生的植物幼苗，以及用引物35S和NOS-ter进行PCR然后用³²P-放射性标记的S1探针进行Southern blot分析对这些植物幼苗进行的分析。图23F-23I显示了用质体转化载体pCV1对烟草进行质体转化得到的再生的植物幼苗，用S1引物对这些植物幼苗进行的PCR分析和用³²P-放射性标记的S1探针进行的Northern blot分析。图23A显示了在农杆菌介导的转化之后由烟草叶片再生的植物。图23B显示了PCR分析中使用的再生的烟草嫩芽。图23C显示了在农杆菌介导的转化之后由莴苣子叶再生的植物。图23D显示了PCR分析中使用的再生的莴苣嫩芽。图23E显示了在两个独立的烟草株系(第2和3道)，和两个独立的莴苣株系(第4和5道)中存在2.1-kb的S1杂交条带(标以箭头)，而在野生型烟草(第6道)和野生型莴苣(第7道)中缺乏此条带。另一个烟草株系检测为阴性(第1道)。图23F和23G显示了微粒轰击后由烟草再生的植物幼苗。图23H显示了在再生的烟草(第2道)中有特定的0.7-kb的PCR条带，而在野生型(第1道)中没有。图23I显示了在烟草株系(第2道)中存在2.1-kb的杂交S1 mRNA条带(标以箭头)，而在野生型(第1道)中没有。图23J显示了用检测His-标记的S1蛋白的Ni-NTA缀合物进行的表达S1的转质体烟草western blot分析。箭头指出了预期的73-kDa的(His)₅-S1条带。

图24显示了用抗GFP的抗体进行的Western blot分析，表明在农杆菌渗入之后烟草叶片中S1：GFP的瞬时表达。从烟草叶片中提取的总蛋白(200μg)，用单独表达GFP的质粒pGDG(第1道)，或表达S1：GFP融合蛋白的质粒pCV12渗入(infiltrated)，在8％的SDS-PAGE凝胶上分离，根据Sambrook etal.(1989.MolecularCloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor)印迹到Hybond-C滤膜上，与抗GFP的抗体(Clontech)进行交叉反应。箭头指出了交叉反应的S1：GFP条带(计算大小为99.1kDa)。M，分子量标记。

发明详述

术语的定义：

本文所用的术语“修饰的植物或植物部分”指植物或植物部分，无论其与完整植物相连还是分离。它还包括通过有性或无性繁殖产生的所述修饰的植物或植物部分的后代。

本文所用的术语“变体”指天然存在的SARS-CoV的遗传突变体或SARS-CoV病毒的重组处理导致的变异，其中每种都包括与保藏的SARS-CoV病毒：CCTCC-V200303相比在基因组中的一个或多个突变，CCTCC-V200303的序列如图6A-6I所示(SEQ ID NO：7)。术语“变体”还指给定多肽的天然存在的变异或给定多肽或蛋白质的重组处理导致的变异，其中一个或多个氨基酸残基通过氨基酸的取代，插入，或缺失而被修饰。SARS-CoV的天然变体的序列由于可能会或可能不会导致表型改变的一个或多个天然发生的突变，包括但不限于对基因组序列的点突变，重排，插入，缺失等而与SARS-CoV病毒的基因组序列不同。优选地，所述变体包括相对于所述SARS-CoV病毒少于25个，少于20个，少于15个，少于10个，少于5个，少于4个，少于3个，或少于2个氨基酸的取代，重排，插入，和/或缺失。

在优选的实施方案中，所述变体在一个或多个预测的非必需氨基酸残基(即对于所述病毒的生物学活性，例如感染性，复制能力，蛋白质合成能力，装配能力，和细胞毒性效果的表达不重要的氨基酸残基)上具有保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是指其中所述氨基酸残基被具有类似电荷的侧链的氨基酸残基取代。具有类似电荷侧链的氨基酸残基家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链的(例如赖氨酸，精氨酸，组氨酸)，酸性侧链的(例如天冬氨酸，谷氨酸)，不带电荷的极性侧链的(例如甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，半胱氨酸)，非极性侧链的(例如丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，甲硫氨酸，色氨酸)，β-分支侧链的(例如苏氨酸，缬氨酸，异亮氨酸)，和芳香族侧链的(例如酪氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，组氨酸)氨基酸残基。在另一个实施方案中，所述变体具有非保守性的氨基酸取代，即氨基酸残基被不具有类似电荷侧链的氨基酸取代。

在特定的实施方案中，可用于本发明的SARS-CoV序列包括那些保藏于

的，具有如下登记号的序列：

                                                          NC_004718，AY304495，AY304494，AY304493，AY304492，AY304491，AY304490，AY304489，AY304488，AY304457，AY304486，AY360146，AY278491，AY310120，AY278489，AY362699，AY362698，AY283798，AY283797，AY283796，AY283795，AY283794，AY268070，AY278741，AY340092，AY351680，AP006561，AP006560，AP0065S9，AP006558，AP006557，AY278554，AY348314，AY338175，AY338174，AY323977，AY322199，AY322198，AY322197，AH013000，AY322208，AY322207，AY322206，AY322205，AH012999，AY321118，AY323976，AY323975，AY323974，AY286320，AY290792，AY291315，AY307165，AY279354，AY278490，AY278487，AY297028，AY286402，AY274119，AY291451，AY271716，AY282752，AY278488，AY268049，AY269391，

在此将其全部引入作为参考。

本发明中使用的SARS-CoV病毒核苷酸序列可以是来自于突变SARS-CoV病毒。突变可以在所述SARS-CoV病毒或其变体的编码序列的全长或部分上随机引入，例如通过饱和突变，得到的突变体可以对其生物活性进行筛选以鉴别保留活性的突变体。在优选的实施方案中，突变体多肽不保留野生型多肽的活性。在特定的实施方案中，突变体多肽不保留SARS-CoV病毒的毒性活性．本领域已知的突变技术也可以使用，包括但不限于定点突变，化学突变，体外定点突变，使用，例如

ite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)等。这种修饰的非限制性的实例包括将氨基酸替换成半胱氨酸，以形成二硫键；将氨基酸替换成酪氨酸，然后对所述多肽进行化学处理以形成二酪氨酸键，如本文中详细描述；一个或多个氨基酸取代和/或生物或化学修饰以产生小分子(底物或抑制剂)的结合袋(bindingpocket)，和/或引入侧链特异性标记(例如以表征分子相互作用或捕获蛋白质一蛋白质相互作用配体)。用于本发明的生物修饰包括烷基化，磷酸化，硫酸化，氧化或还原，ADP-核糖基化，羟基化，糖基化，葡糖基磷脂酰肌醇加成，泛素化等。用于本发明的化学修饰包括，例如改变重组病毒的电荷。当带电荷的氨基酸残基被改变为不带电荷的残基时，正电荷或负电荷以化学方法添加到氨基酸残基上。

本文所用的术语“抗体”(“antibody”和“antibodies”)指单克隆抗体，双特异性抗体，多特异性抗体，人抗体，人源化抗体，嵌合抗体，骆驼化抗体，单结构域抗体，单链Fvs(scFv)，单链抗体，Fab片段，F(ab′)片段，二硫化物连接的Fvs(sdFv)，和抗独特型(anti-Id)抗体(包括，例如本发明的抗体的anti-Id抗体)，和上述任一种的表位结合片段。特别地，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性片段，即含有抗原结合位点的分子。免疫球蛋白分子可以是任何类型(例如IgG，IgE，IgM，IgD，IgA和IgY)，类(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA1和IgA2)或小类。

本文所用的术语“免疫特异地结合SARS-CoV病毒的多肽的抗体”指免疫特异地结合SARS-CoV病毒编码的多肽，并且不非特异性结合其它多肽的抗体。免疫特异地结合SARS-CoV病毒的多肽的抗体与其它抗原没有交叉反应。优选地，免疫特异地结合SARS-CoV病毒的多肽的抗体与其它抗原没有交叉反应。免疫特异地结合SARS-CoV病毒的多肽的抗体可以通过，例如免疫检测或所属领域技术人员已知的其它技术鉴别。

本文所用的术语“表位”指在动物，优选哺乳动物，最优选人中具有抗原性或免疫原性活性的SARS-CoV病毒的片段，多肽或蛋白质。具有免疫原性活性的表位是在动物中引起抗体反应的多肽的片段。具有抗原性活性的表位是由本领域公知的任何方法，例如通过本文所述的免疫检测确定的抗体与之免疫特异地结合的多肽或蛋白质的片段。抗原性表位不一定具有免疫原性。

本文所用的术语“抗原性”指物质(例如外源物体，微生物，药物，抗原，蛋白质，肽，多肽，核酸，DNA，RNA等)在特定的生物体，组织，和/或细胞中引发免疫反应的能力。有时，术语“抗原性的”与术语“免疫原性的”含义相同。

本文所用的术语“免疫原性”指物质(例如外源物体，微生物，药物，抗原，蛋白质，肽，多肽，核酸，DNA，RNA等)能在生物体内激发免疫反应的性质。免疫原性部分取决于所述物质的大小，以及部分取决于宿主分子有多么不同于所述物质。高度保守的蛋白质倾向于具有相对较低的免疫原性。

本文所用的术语“在严谨条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件，在这种条件下互相具有至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％相同性的核苷酸序列典型地保持互相杂交。这种杂交条件在，例如但不限于，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6.；Basic Methods in Molecular Biology，Elsevier Science PublishingCo.，Inc.，N.Y.(1986)，pp.75-78，and 84-87；和Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory，N.Y.(1982)，pp.387-389中描述，是本领域技术人员公知的。杂交和/或洗涤可以被实施的条件可以是42-68℃，洗涤缓冲液可以含有从0.1X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，0.5％SDS到6X SSC，0.5％SDS。典型地，杂交可以在65℃(高度严谨条件)，60℃(中度严谨条件)，或55℃(低严谨条件)下进行过夜。滤膜可以用0.1X SSC，0.5％SDS在65℃(高度严谨洗涤)洗涤2x15分钟。滤膜用0.1X SSC，0.5％SDS在63℃(中度严谨洗涤)洗涤2x15分钟。对于低严谨洗涤，滤膜用2X SSC，0.5％SDS在60℃洗涤2x15分钟。严谨杂交条件的一个优选的，非限制性的实例是在大约68℃在6X SSC，0.5％SDS中杂交，然后在室温在2X SSC，0.5％SDS中洗涤一次或多次。严谨杂交条件的另一个优选的，非限制性的实例是在大约45℃在6X SSC中杂交，然后在大约50-65℃在0.2X SSC，0.1％SDS中洗涤一次或多次。

“分离的”或“纯化的”抗体基本不含从中获得该抗体的生物流体中的细胞材料或其它杂质蛋白。用语“基本不含细胞材料”包括抗体的制备物，其中所述抗体与用于分离所述抗体的细胞的细胞组分分离开。因此，基本不含细胞材料的抗体包括具有少于大约30％，20％，10％，5％，2.5％，或1％(按干重)的杂质蛋白的抗体的制备物。在本发明的优选的实施方案中，所述抗体是分离的或是纯化的。

本文所用的术语“具有SARS-CoV病毒的多肽的生物活性”指与SARS多肽或具有如图13B，15，16A-16NN，和17A-17NN所示氨基酸序列的多肽，或其片段具有一般生物学活性，类似或相同的结构域和/或具有足够的氨基酸相同性的多肽或蛋白质的特性。本发明的多肽的这种一般(Common)生物学活性包括抗原性和免疫原性。

本文所用的术语“与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子”指与SARS-CoV病毒的多肽具有类似生物学活性和类似或相同结构域和/或与其具有足够的氨基酸相同性的多肽或蛋白质。这种生物学活性可以包括，但不限于抗原性，免疫原性，细胞毒性，激素活性，结合性质和亲和力，药理学活性，对生长增殖和分化的刺激或抑制，在细胞中诱导变化，抗病毒的，抗细菌的，抗真菌的和抗寄生虫的活性等。在优选的实施方案中，用于本发明的多肽可保留野生型SARS-CoV病毒的至少一种，两种，三种，四种，五种，或更多种生物学活性(例如感染性，复制能力，蛋白质合成能力，组装能力，和细胞毒性效果)。

本文所用的术语“部分”或“片段”指含有相应核酸分子上的长度至少大约

25，30，35，40，45，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1,000，1,050，1,100，1,150，1,200，1,500，2,000，2,500，3,000，3,500，4,000，5,000，6,000，7,000，8,000，9,000，10,000，15,000，20,000，25,000，

或更多个连续核酸，并且具有所述核酸分子的至少一种功能特征(或者所编码的蛋白质具有由所述核酸分子编码的蛋白质的一种功能特征)的核酸分子的片段；或者含有相应蛋白质或多肽的长度至少

5，10，15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，90，100，120，140，160，180，200，220，240，260，280，300，320，340，360，380，400，450，500，600，700，800，900，1,000，2,000，3,000，4,000，5,000，6,000，7,000，8,000，或更多个连续氨基酸残基，并且具有所述蛋白质或多肽的至少一个功能特征的蛋白质或多肽的片段。

本文所用的术语“类似物”在蛋白质试剂(例如蛋白质，多肽，肽，和抗体)的语境中是指与第二种蛋白质试剂(proteinaceous agent)具有类似或相同功能，但是不一定与所述第二种蛋白质试剂具有类似或相同氨基酸序列，或者与所述第二种蛋白质试剂具有类似或相同的结构的蛋白质试剂。在特定的实施方案中，抗体类似物免疫特异性地结合与衍生出所述类似物的原始抗体相同的表位。在另一个实施方案中，抗体类似物免疫特异性地结合与衍生出所述类似物的原始抗体不同的表位。具有类似氨基酸序列的蛋白质试剂指满足至少下述之一的第二种蛋白质试剂：(a)具有与第二种蛋白质试剂的氨基酸序列至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％相同的氨基酸序列的蛋白质试剂；(b)由在严谨条件下与编码至少5个连续氨基酸残基，至少10个连续氨基酸残基，至少15个连续氨基酸残基，至少20个连续氨基酸残基，至少25个连续氨基酸残基，至少40个连续氨基酸残基，至少50个连续氨基酸残基，至少60个连续氨基酸残基，至少70个连续氨基酸残基，至少80个连续氨基酸残基，至少90个连续氨基酸残基，至少100个连续氨基酸残基，至少125个连续氨基酸残基，或至少150个连续氨基酸残基的第二种蛋白质试剂的核苷酸序列杂交的核苷酸序列编码的蛋白质试剂；和(c)由与编码第二种蛋白质试剂的核苷酸序列至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％，至少95％，或至少99％相同的核苷酸序列编码的蛋白质试剂。与第二种蛋白质试剂具有类似结构的蛋白质试剂指与所述第二种蛋白试剂具有类似的二级，三级或四级结构的蛋白质试剂。蛋白质试剂的结构可以通过本领域已知的方法确定，包括但不限于，肽测序，X射线晶体学，核磁共振，圆二色性，和晶体电镜。

为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的相同性百分数，所述序列出于最佳比较的目的被排列(例如可以在第一个氨基酸或核酸序列中引入缺口以与第二个氨基酸或核酸序列进行最佳排列)。然后位于相应氨基酸位置或核苷酸位置的氨基酸残基或核苷酸被比较。当第一个序列中的位置被与第二个序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据的时候，那么所述分子在该位置上就是相同的。两个序列之间的相同性百分数是所述序列共有的相同位置的数目的函数(即％相同性＝相同的重叠位置的数目/位置总数目x100％)。在一个实施方案中，两个序列长度相同。

两个序列之间的相同性百分数还可以用数学算法确定。用于比较两个序列的数学算法的优选的，非限制性的实例是Karlin andAltschul，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.Vol，87，pages 2264-2268的算法，在Karlin and Altschul，1993，Proc.Natl.Acad Sci U.S.A.Vol.90，pages 5873-5877中进行了修改。这种算法被整合到Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.Vol.215，page 403的NBLAST和XBLAST程序中。BLAST核苷酸搜索可以用NBLAST核苷酸程序参数集，例如score＝100，wordlength＝12进行，以得到与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用XBLAST程序参数集，例如score＝50，wordlength＝3进行，以得到与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为得到比较目的的带缺口的排列，可以使用GappedBLAST，如Altschul et al.，1997，Nucleic Acids Res.Vol.25，pages3389-3402中所述。或者，可以使用PSI BLAST进行重复搜索，其发现分子之间的较远的关系(Id.)。当使用BLAST，Gapped BLAST，和PSI Blast程序的时候，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的默认参数(参见，例如NCBI网站)。用于序列比较的数学算法的另一个优选的，非限制性的实例是Myers and Miller，1988，CABIOS Vol.4，pages 11-17的算法。这种算法在ALIGN程序(2.0版)中使用，其是GCG序列比对软件包的一部分。当使用ALIGN程序比较氨基酸序列的时候，可以使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分为12，缺口罚分为4。两个序列之间的相同性百分比可以用与上述类似的技术确定，允许或不允许有缺口。在计算相同性百分数的时候，典型地只有严格匹配被计算。

本文所用的，术语“类似物”在非蛋白质类似物的语境中指与第一种有机或无机分子具有类似或相同的功能，并且与第一种有机或无机分子在结构上类似的第二种有机或无机分子。

本文所用的，术语“衍生物”在蛋白质试剂(例如蛋白质，多肽，肽，和抗体)的语境中指含有通过引入氨基酸残基的取代，缺失，和/或插入而被改变的氨基酸序列的蛋白质试剂。本文所用的术语“衍生物”还指被修饰的蛋白质试剂，即通过任何类型的分子与该蛋白质试剂共价连接。例如，但不限于，抗体可以被修饰，例如通过糖基化，乙酰化，聚乙二醇化(PEGylation)，磷酸化，酰胺化，用已知的保护/阻断基团衍生化，蛋白水解切割，与细胞配体或其它蛋白质连接等。蛋白质试剂的衍生物可以用所述领域技术人员已知的技术通过化学修饰产生，包括但不限于特异性的化学切割，乙酰化，甲酰化，衣霉素的代谢合成等。进一步，蛋白质试剂的衍生物可以含有一个或多个非经典氨基酸。蛋白质试剂的衍生物具有与衍生出它的蛋白质试剂类似的或相同的功能。

本文所用的，术语“衍生物”在非蛋白质衍生物的语境中指基于第一种有机或无机分子的结构形成的第二种有机或无机分子。有机分子的衍生物包括，但不限于，例如通过加上或除去羟基，甲基，乙基，羧基或胺基基团而被修饰的分子。有机分子还可以被酯化，烷基化和/或磷酸化。

本文所用的术语“受试者”和“患者”可以互换使用。本文所用的“受试者”指动物，优选是包括非灵长类(例如兔，山羊，牛，猪，绵羊，马，麝猫，啮齿动物，浣熊，貉，狗，雪貂，鼬獾(ferret Badger)，猫，和禽类物种)和灵长类(例如，猴如猕猴(cynomolgus monkey)和人)在内的哺乳动物，更优选是人。

本文所用的术语“SARS”或“SARS相关症状”包括多种临床适应症和分类。如本文所述的，SARS包括(1)无症状的或轻微的呼吸道疾病；(2)中度呼吸道痰病；或(3)严重呼吸道疾病。

本文所用的术语“载体(carrier)”是用于支持或传递另一种物质例如色素，催化剂，或放射性材料的物质。

本文所用的术语“媒介物(vehicle)”是便于药物，色素，或与之相混的其它物质的使用的物质。

本文所用的术语“赋形剂”指通常用作药物的稀释剂，媒介物，防腐剂，粘合剂，或稳定剂的惰性物质，包括，但不限于蛋白质(例如血清清蛋白等)，氨基酸(例如天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，精氨酸，甘氨酸，组氨酸等)，脂肪酸和磷脂(例如烷基磺酸盐，辛酸盐等)，表面活性剂(例如SDS，聚山梨醇酯，非离子表面活性剂等)，糖类(例如蔗糖，麦芽糖，海藻糖等)和多元醇(例如甘露醇，山梨醇等)。另外参见Remington′s Pharmaceutical Sciences(by Joseph P.Remington，18th ed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA)，在此引入其全文。

本文所用的术语“可操作地结合”或“可操作地连接”指其中调控区域(例如启动子，增强子)和要表达的核酸序列共价连接，并且其位置允许转录，和在合适的条件下，翻译的结合。

优选的实施方案和实验细节：

本发明提供了通过质体和/或核转化载体产生的转基因和转质体植物和它们的后代，从而产生抗SARS-CoV病毒抗原的粘膜疫苗。在转基因植物中表达的病毒抗原在动物中有效诱导粘膜和血清免疫反应，不管是肠胃外或是口服递送。在转基因植物中表达的病毒抗原还用作在血清学检测中进行抗体检测的试剂。本发明设法用含有来自SARS-CoV病毒的核苷酸序列的植物载体转化各种类型的植物，所述核苷酸序列包括但不限于编码SARS-CoV病毒的多肽的片段，衍生物，类似物，或变体的SARS-CoV病毒的核苷酸序列，或其编码与SARS-CoV病毒的多肽，片段，衍生物，类似物，或其变体具有类似活性的表位或蛋白质分子的核苷酸序列。

SARS-相关冠状病毒的基因组序列的分析表明它的十一个预测的开放阅读框架中的四个编码结构蛋白，包括具有1255个推定氨基酸的刺突糖蛋白(spike glycoprotein)(S)和具有221个推定氨基酸的膜糖蛋白(M)；S和M可能结合形成病毒包膜。S糖蛋白，一种I型膜蛋白，其功能是与宿主受体连接，具有N-末端信号序列(S1；氨基酸1-658)和C-末端跨膜区，然后是胞质尾(Marra et al.，2003；Rotaet al，2003)。M的N-末端区域还包括不可切除的信号序列，暴露于病毒表面，而其C-末端位于病毒膜内。虽然S和M都被认为靶定在质膜上，M还被认为是定位于植物细胞的内质网上。在优选的实施方案中，修饰的植物或所述修饰的植物的植物部分或后代含有编码SARS-CoV病毒的刺突蛋白(S或S1)，或其片段，衍生物，类似物，或变体的SARS-CoV病毒序列。在优选的实施方案中，修饰的植物或所述修饰的植物的植物部分或后代含有编码SARS-CoV病毒的刺突蛋白(S)的N-末端区域(S1)和/或膜蛋白(M)，或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与所述SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述植物或植物部分含有SEQID NO：3，5，或7的核苷酸序列，或其片段，或免疫特异性结合具有SEQ ID NO：3，5，或7的核苷酸序列的多肽，或其类似物，衍生物，或片段，和/或由SEQ ID NO：3，5，或7的核苷酸序列编码的多肽，或其片段的核苷酸序列。本发明还涉及产生含有一个或多个质体和/或核转化载体的修饰的植物的方法，所述载体含有一个或多个编码SARS-CoV病毒的多肽的片段，衍生物，类似物或变体的SARS-CoV核苷酸序列。所有植物品种都可以用于本发明。在优选的实施方案中，所述植物是烟草，莴苣，马铃薯，番茄，香蕉，玉米(corn)，稻，谷类，小麦，玉米(maize)，大麦，苹果，梨，草莓，胡萝卜，甜菜，薯蓣，奇异果或菠菜。

转化载体的构建

本发明涉及含有SARS-CoV病毒的一个或多个核苷酸序列，或其片段，衍生物，类似物或变体的植物载体。在优选的实施方案中，所述植物载体是质体和核转化载体。在优选的实施方案中，所述核苷酸序列是SARS-CoV病毒的M-基因和/或S-基因。本发明还涉及含有一个或多个SARS-CoV病毒核苷酸序列，或其片段，衍生物，类似物或人工或天然变体的质体和核转化载体的构建。在特定的实施方案中，本发明提供了含有一个或多个核苷酸序列的植物转化载体，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：7的至少

5，10，15，20，25，30，35，40，45，100，150，200，300，350，400，450，500， 550，600，650，700，750，800，850，900，950，1,000，1,050，1,100，1,150，1,200，2,000，3,000，4,000，5,000，6,000，7,000，8,000，9,000，10,000，11,000，12,000，13,000，14,000，15,000，16,000，17,000，18,000，19,000，20,000，21,000，22,000，23,000，24,000，25,000，26,000，27,000，28,000，29,000，或更多个连续核苷酸，或其互补序列，或含有在严谨条件下与SARS-CoV病毒的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的核苷酸。在特定的实施方案中，本发明提供了含有一个或多个核苷酸序列的植物转化载体，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：3的至少5，10，15，20，25，30，35，40，45，100，150，200，300，350，400，450，500，550，600，650，或更多个连续核苷酸，或含有在严谨条件下与SARS-CoV病毒的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的核苷酸。在特定的实施方案中，本发明提供了含有一个或多个核苷酸序列的植物转化载体，所述核苷酸序列是SEQ ID NO：5的至少5，10，15，20，25，30，35，40，45，100，150，200，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1,000，1,050，1,100，1,150，1,200，2,000，3,000，3,500或更多个连续核苷酸，或含有在严谨条件下与SARS-CoV病毒的核苷酸序列杂交的核苷酸序列的核苷酸。在特定的实施方案中，本发明提供了含有一个或多个核苷酸序列的植物转化载体，所述核苷酸序列编码的多肽是SEQ ID NO：4的至少5，10，15，20，25，30，35，40，45，100，150，200，或更多个连续氨基酸。在特定的实施方案中，本发明提供了含有一个或多个核苷酸序列的植物转化载体，所述核苷酸序列编码的多肽是SEQ ID NO：6的5，10，15，20，25，30，35，40，45，100，150，200，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1,000，1,050，1,100，1,150，1,200，或更多个连续氨基酸。在一个实施方案中，所述植物载体含有编码S的氨基酸14-1195的核苷酸序列。在优选的实施方案中，所述植物载体含有编码S的氨基酸14-1195上长度至少20，30，40，50，60，80，100，200，300，400，500，或更多个连续氨基酸的核苷酸序列。在特定的实施方案中，所述多肽如图16A-16NN和17A-17NN所示，或其片段，衍生物或类似物。在特定的实施方案中，本发明提供了含有一个或多个编码来自于SARS-CoV病毒的任何基因，或其部分，或变体，片段，类似物，或衍生物的核苷酸序列的植物转化载体。这些基因包括，但不限于包膜蛋白(E蛋白)，整体膜蛋白(intergralmembrane protein)(M蛋白)，刺突蛋白(S蛋白)，核衣壳蛋白(N蛋白)，红细胞凝集素酯酶(HE蛋白)，和RNA依赖的RNA聚合酶。特别有用的是那些由重组的SARS-CoV基因组的核酸片段编码的蛋白质物质。优选的是那些在开放阅读框架(ORF)内的，特别是，用于引发SARS-CoV特异性抗体或T细胞反应的，不管是在体内(例如为保护性或治疗性的目的，或为提供诊断抗体)或是体外(例如通过噬菌体展示技术或另一种用于产生合成抗体的技术)。

所述病毒载体可以被工程化以提供抗原性分子，包括SARS-CoV病毒的核苷酸序列，或多肽，包括所述病毒的重组和嵌合形式，或所述病毒的亚基，或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子。本发明进一步提供了制备SARS-CoV抗原的重组或嵌合形式的方法。

在另一个特定的实施方案中，本发明提供了通过单独施用疫苗制备物或SARS-CoV病毒抗体，或与抗病毒剂(例如金刚胺，金刚乙胺，扎那米为(zanamivir)，阿巴卡韦(abacavir)，双汰芝(combivir)，恩曲他滨(emtricitabine)，替诺福韦(tenofovir)，三协维(trizivir)，恩夫韦地(enfuvirtide)，更昔洛韦(gancyclovir)，无环鸟苷，病毒唑，喷昔洛韦(penciclovir)，奥塞米韦(oseltamivir)，膦甲酸齐多夫定(AZT)，去羟肌苷(didanosine，ddI)，拉米夫定(lamivudine，3TC)，扎西他滨(zalcitabine，ddC)，司他夫定(stavudine，d4T)，奈韦拉平(nevirapine)，地拉韦定(delavirdine)，依非韦伦(efavirenz)，fosamprenavir，安普那韦(amprenavir)，阿扎那韦(atazanavir)，kaletra，英地那韦(indinavir)，利托那韦(ritonavir)，阿糖腺苷(vidarabine)，奈非那韦(nelfinavir)，沙奎那韦(saquinavir)，relenza，tamiflu，pleconaril，干扰素等)，类固醇和皮质类固醇如强的松，可的松，氟替卡松(fluticasone)和糖皮质激素，抗生素，镇痛剂，支气管扩张剂(bronchodialaters)，或用于呼吸道和/或病毒感染的其它治疗组合使用，以治疗，改善，控制，或预防SARS的方法。在另一个特定的实施方案中，本发明的方法提供了草本植物，草本植物提取物，中药和其它药物与本发明的修饰的植物组合用于SARS的预防和治疗的用途。

进一步，本发明提供了含有本发明的抗病毒试剂和药学可接受的载体，媒介物或赋形剂的药物组合物。此外，本发明提供了含有脂质体包裹的植物提取物，优选纯化的，或本发明的抗病毒试剂的药物组合物。本发明还提供了含有本发明的药物组合物的试剂盒。

本发明包括编码所述SARS-CoV病毒的嵌合多肽的核苷酸序列的应用。在特定的实施方案中，所述嵌合多肽含有来自SARS-CoV病毒的两个或更多个不同株的氨基酸序列。根据本发明，本发明的修饰的植物进一步含有对于病毒基因组非天然的核苷酸序列。可用于本发明的核苷酸序列包括SARS-CoV病毒序列的部分，其进一步含有异源核苷酸序列。异源核苷酸序列可以来自于病毒，细菌，动物，或植物。在优选的实施方案中，所述异源核苷酸序列编码蛋白酶抑制剂。所述异源核苷酸序列使得所表达的SARS-CoV多肽更加稳定，并且减少了程序性细胞死亡，增加了本发明的修饰的植物的贮藏期限。在特定的实施方案中，所述异源核苷酸序列(例如SaPIN2a或SaPIN2b)使得所表达的SARS-CoV多肽更加稳定以使表达SARS-CoV多肽的修饰的植物可以在摄食，注射，或其它给药方法前被处理。SaPIN2a和SaPIN2b，从少花龙葵(Solanum americanum)，属于茄科的一种草中分离的蛋白酶抑制剂II基因，编码使转基因植物具有昆虫抗性的丝氨酸蛋白醇抑制剂II蛋白(参见2002年11月29日提出的美国临时申请No.60/429,992；和2003年12月1日提出的美国申请No.10/725,829，律师案卷No.9661-043-999，在此引入其每一个的全文作为参考)。SaPIN2a和SaPIN2b在韧皮部高表达，可能参与调节筛管元件的蛋白水解(参见，Xu et al.，2001，Plant Mol Biol.Vol.47，pages727-738；和Xu et al.，2003，Planta Vol.218，pages 623-629，在此引入其每一个的全文作为参考)。

在某些实施方案中，本发明涉及含有编码SARS-CoV病毒的嵌合多肽的核苷酸序列的载体和核酸分子。在特定的实施方案中，载体含有SARS-CoV的异源核苷酸序列。在另一个实施方案中，这种异源核苷酸序列被加入到，插入到天然或非天然序列中或取代之。根据本发明，SARS-CoV病毒的核苷酸序列可以来自于SARS-CoV病毒的不同株或变体。

含有嵌合SARS-CoV病毒序列的植物载体特别可用于产生抗两种或多种病毒的重组疫苗(Tao et al.，J.Virol.72：2955-2961；Durbin etal.，2000，J.Virol.74：6821-6831，Slciadopoulos et al.，1998，J，Virol，72：1762-1768(1998)；Teng et al，，2000，J，Virol.74：9317-9321)。例如，可以想象到含有SARS-CoV病毒核苷酸序列的植物载体可以表达SARS-CoV病毒变体的一个或多个肽，会保护受试者防止受到天然SARS-CoV和所述变体的感染。

根据本发明，所述植物载体可以被工程化以提供抗原性序列，所述抗原性序列在被受试者摄食时防止受到SARS-CoV和其天然变体感染。所述植物载体可以被工程化以提供SARS-CoV病毒的一种或多种抗原性序列。根据本发明，所述抗原性序列可以衍生自相同病毒，衍生自相同类型病毒的不同株或变体，或衍生自不同的病毒。

本发明提供了含有根据本发明的载体的宿主细胞。植物质体或核转化载体包含SARS-CoV病毒的核苷酸序列例如包含SARS-CoV基因组的全长，部分或片段以表达SARS-CoV病毒核酸。这些植物载体可以包含其它序列以产生可能含有SARS-CoV多肽的突变，缺失或插入的嵌合SARS-CoV病毒多肽。编码SARS-CoV病毒，SARS-CoV病毒的多肽的片段，衍生物，类似物，或变体的核苷酸序列包括，但不限于保藏于的，具有如下登记号的序列：

NC_004718，AY304495，AY304494，AY304493，AY304492，AY304491，AY304490，AY304489，AY304488，AY304487，AY304486，AY360146，AY278491，AY310120，AY278489，AY362699，AY362698，AY283798，AY283797，AY283796，AY283795，AY283794，AY268070，AY278741，AY340092，AY351680，AP006561，AP006560，AP006S59，AP006558，AP006557，AY278554，AY348314，AY338175，AY338174，AY323977，AY322199，AY322198，AY322197，AH013000，AY322208，AY322207，AY322206，AY322205，AE012999，AY321118，AY323976，AY323975，AY323974，AY286320，AY290752，AY291315，AY307165，AY279354，AY278490，AY278487，AY297028，AY286402，AY274119，AY291451，AY271716，AY282752，AY278488，AY268049，AY269391，在此全部引入作为参考。

在一个特定的实施方案中，植物细胞可以瞬时或稳定表达SARS-CoV病毒的一个或多个核苷酸序列。植物细胞通过转染(蛋白质或核酸载体)，感染(病毒裁体)或转导(病毒载体)被修饰。所述修饰的植物可以用于通过刺激体液免疫反应，细胞免疫反应，或刺激对抗原的耐受，从而调节受试者的免疫系统。本文所用的受试者是指：人，灵长类动物，兔，山羊，牛，猪，绵羊，马，灵猫，啮齿动物，浣熊，貉，狗，白鼬，鼬獾(ferret Badger)，猫，鸟类，或其它非人动物。

编码SARS-CoV病毒抗原蛋白的核苷酸分子可以通过扩增克隆。术语“扩增”指从单个多核苷酸分子制备所述核酸的多个拷贝的过程。多核苷酸的扩增可以在体外通过本领域技术人员公知的生化过程实施。扩增试剂可以是能实现引物延伸产物的合成的任何化合物或系统，包括酶。为此目的的合适的酶包括，例如，E.coli DNA聚合酶I，Taq聚合酶，E.coli DNA聚合酶I的Klenow片段，T4 DNA聚合酶，其它可获得的DNA聚合酶，聚合酶变体，逆转录酶，连接醇，和其它酶，包括热稳定酶(即在经受了足以引起变性的温度升高之后进行引物延伸的那些酶)。合适的酶会促使核苷酸以适当的方式组合，形成与每个突变核苷酸链互补的引物延伸产物。通常，合成起始于每个引物的3’末端，沿着模板链以5’方向继续，直至合成终止，产生不同长度的分子。但是可能有扩增试剂从5’端起始合成，沿着另一个方向继续，利用与上述相同的过程。在任何情况下，本发明的方法不限于本文所述的扩增的实施方案。

根据本发明可使用的一个体外扩增方法是美国专利No.4,683,202和4,683,195所述的聚合酶链式反应(PCR)。术语“聚合酶链式反应”指使用热稳定DNA聚合酶和两个寡核苷酸引物，来扩增DNA碱基序列的方法，一个引物于要扩增的序列的一端互补于(+)-链，另一个于另一端互补于(-)-链。因为新合成的DNA链随后可作为相同引物序列的另外的模板，连续轮的引物退火，链延长，和分离产生对所希望序列快速的和高度特异性的扩增。聚合酶链式反应用于检测样品中编码细胞因子的多核苷酸的存在。多种聚合酶链式方法是本领域技术人员已知的，可用于本发明的方法中。例如，DNA可以如下所述在温度循环器(thermocycler)中进行30到35个循环的扩增：95℃ 30秒，52-60℃ 1分钟，72℃ 1分钟，最后延伸步骤是72℃ 5分钟。在另一个实例中，DNA可以在温度循环器中进行35个聚合酶链式反应，95℃的变性温度30秒，然后是54-58℃的可变退火温度1分钟，70℃的延伸步骤1分钟，以及70℃的最后延伸步骤。

用于扩增编码SARS-CoV病毒的蛋白质分子，或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的核苷酸序列的引物可以用任何适当的方法制备，例如传统的磷酸三酯和磷酸二酯方法或者其自动化实施方案，只要所述引物能够与感兴趣的多核苷酸杂交。在修饰的固体支持物上合成寡核苷酸的一种方法如美国专利No.4,458,066中所述。引物的准确长度取决于多个因素，包括温度，缓冲液，和核苷酸组成。所述引物在存在扩增诱导试剂的条件下必须起始延伸产物的合成。

根据本发明的方法所使用的引物与要被扩增的核苷酸序列的每一条链互补。术语“互补”表示所述引物在允许聚合反应试剂发挥作用的条件下必须与各自的链杂交。换句话说，与侧翼序列互补的引物与侧翼序列杂交，并允许所述核苷酸序列扩增。优选地，被延伸的引物的3’末端与互补侧翼链具有完全的碱基对互补性。编码所述抗原，SARS-CoV多肽或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的核苷酸序列的引物和探针可以用已知的方法结合本发明公开的内容开发。

本领域普通技术人员知道还可用于增加靶核酸的拷贝数目的各种扩增方法。可用于本发明的多核苷酸可以在溶液中或是在与固体支持物结合以后，通过通常用于特定核酸序列的检测的任何方法例如另一种聚合酶链式反应，寡聚物限制(Saiki et al.，1985，Bio/Technology Vol.3，pages 1008-1012)，等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针分析(Conner et al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.80，page 278)，寡核苷酸连接检测(OLA)(Landegren et al.，1988，Science Vol.241，page 1077)，RNase保护检测(RPA)等，进一步被评估，检测，克隆，测序等。DNA分析的分子技术已有综述(Landegren et al，1988，Science Vol.242，pages 229-237)。在DNA扩增后，反应产物可以通过Southern blot分析检测，不使用放射性探针。在这个过程中，例如，含有得自组织或受试者的多核苷酸的DNA的小样品被扩增，并通过Southern blotting技术分析。非放射性探针或标记的使用由于扩增信号的高水平而便利。

用于扩增编码抗原，SARS-CoV的多肽或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的核苷酸序列的引物的大小是长度为至少10，15，20，25，30个核苷酸。特别地，扩增M-基因或S-基因的引物是最优选的。优选地，G∶C比应当在30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％以上以防止引物形成发夹结构。而且，扩增子应当足够长以使其足以通过标准分子生物学方法检测。优选地，扩增子的长度是至少40，60，100，200，300，400，500，600，800，1000，或更多个碱基对。

可用于本发明的多核苷酸包括具有本文所示的DNA序列的多核苷酸，以及额外包括编码含有相邻的和功能性抗原，SARS-CoV多肽或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒具有类似功能的分子的表位，编码在高度严谨条件下与本发明所示的DNA序列的互补序列杂交的开放阅读框架(ORF)的任何核苷酸序列。作为实例而并非限制，高度严谨杂交条件可以定义如下：滤膜结合的DNA在含有50％去离子甲酰胺，6X SSC，5x Denhardt′s，1％SDS，100μg/ml变性鲑鱼精子DNA的溶液中在42℃杂交过夜(大约4-16小时)，在0.1X SSC，0.1％SDS中在65℃洗涤(Ausubel F.M.et al.，eds.，1989，Current Protocols in Molecular Biology.Vol.I，Green PublishingAssociates，Inc.，and John Wiley&sons，Inc.，New York)并编码功能上等同的基因产物。对于寡核苷酸探针，作为实例而并非限制，高度严谨杂交可以指，例如在6XSSC/0.05％焦磷酸钠中在37℃(对于14个碱基的寡聚物)，48℃(对于17个碱基的寡聚物)，55℃(对于20个碱基的寡聚物)，和60℃(对于23个碱基的寡聚物)洗涤。

此外预期可用于本发明的多核苷酸包括在中度严谨条件下与编码抗原，SARS-CoV的多肽或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的DNA序列的互补序列杂交的任何核苷酸序列。作为实例而非限制，这种中度严谨条件可以包括，例如在0.2X SSC/0.1％SDS中在42℃洗涤(Ausubel et al.，1989，同上)。

此外预期可用于本发明的多核苷酸包括在低严谨条件下与编码抗原，SARS-CoV的多肽或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的DNA序列的互补序列杂交的任何核苷酸序列。作为实例而非限制，使用这种低严谨条件的程序如Shilo and Weinberg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA Vol.78，pages 6789-6792中所述。变体与野生型蛋白相比在蛋白质的氨基酸序列中可含有一个或多个改变，例如通过插入，取代，或缺失一个或多个氨基酸。任何改变应当不破坏所述蛋白行使其功能的能力，但是可以增加或减少这种能力，这取决于所述改变的特性。优选地，氨基酸的改变是保守的。

在各个实施方案中，抗原，SARS-CoV病毒的多肽或片段，变体，类似物，或衍生物可以表达为融合，或嵌合蛋白产物(含有通过肽键与异源蛋白序列(不同蛋白质的)连接的酶，片段，类似物，或衍生物)。这种嵌合基因产物的制备可以通过将编码所希望氨基酸序列的合适的核酸序列用本领域公知的方法以正确的编码框架彼此相连，用本领域公知的方法表达所述嵌合产物。或者，这种嵌合产物的制备可以通过蛋白质合成技术，例如使用肽合成仪。优选地，所述融合蛋白中的酶的片段，类似物，和衍生物保留有行使所述酶的功能的能力。

对于植物核转化载体的构建，SARS-CoV核苷酸序列，基因，其片段，衍生物，类似物或变体的表达可以通过多个调控元件中的任何元件来驱动。例如，病毒启动子例如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子(Brisson et al.，1984，Nature Vol.310，pages 511-514)，或者TMV的外壳蛋白启动子(Takamatsu et al.，1987，EMBO J.Vol.6，pages 307-311)可以被使用；或者，植物启动子例如RUBISCO的小亚基(Coruzzi et al.，1984，EMBO J.Vol.3，pages 1671-1680；Broglieet al.，1984，Science Vol.224，pages 838-843)；或热休克启动子，例如，大豆hspl7.5-E或hspl7.3-B(Gurley et al.，1986，Mol，Cell.Biol.Vol.6，pages 559-565)可以被使用。这些构建体可以用Ti质粒，Ri质粒，植物病毒载体，直接DNA转化，生物弹/微粒轰击，显微注射，电穿孔等引入到植物细胞中。这些技术的综述参见，例如，Weissbach&Weissbach，1988，Methods for Plant Molecular Biology，AcademicPress，New York，Section VIII，pp.421-463；和Grierson&Corey，1988，Plant Molecular Biology，2d Ed.，Blackie，London，Ch.7-9。本文所用的调控元件包括但不限于诱导型和非诱导型启动子，增强子，操纵子和本领域已知的驱动和调控表达的其它元件。优选所述启动子能够指导在所述植物的特定组织中和/或所述植物发育的特定阶段中的表达。所述启动子对于所述植物可以是异源的或是同源的。优选所述启动子指导在果实，例如番茄，叶片，例如莴苣，植物种子的胚乳或植物的根或块茎中的表达。优选的启动子是小麦的高分子量麦谷蛋白(HMWG)基因。其它合适的启动子是技术人员公知的，例如麦醇溶蛋白，分枝酶，ADPG焦磷酸化酶，淀粉合酶和肌动蛋白启动子，例如。

具有表达SARS-CoV抗原包括SARS-CoV病毒的多肽，或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的能力的转化植物可以通过用含有编码抗原，包括SARS-CoV的多肽或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的序列的载体转化植物细胞来构建。在一个实施方案中，植物启动子与编码所希望的抗原的序列可操作结合。本文所用的术语“可操作结合”或“可操作连接”指其中调控区域(例如启动子，增强子)和要表达的核酸序列共价连接，并且其位置允许转录，和在合适的条件下翻译的结合。在本发明的优选实施方案中，用于核转化的结合的启动子是强的并且是非组织或发育特异性的植物启动子(例如在多种或所有植物组织类型中强表达的启动子)。这种强的“组成型”启动子的实例包括，但不限于CaMV 35S启动子(Odell et al，，1985，Nature 313：810-812)，T-DNA甘露氨酸合成酶启动子，以及它们的各种衍生物。在另一种优选的实施方案中，诱导型或阻遏型启动子用于在植物中表达感兴趣的SARS-CoV病毒，例如Weinmann et al.，1994，The Plant Journal 5：559-569中所述的tet操纵子启动子；或McNellis et al，1998，The Plant Journal 14：247-257中所述的糖皮质激素诱导型启动子；或Caddick et al.，1998，NatureBiotechnology 16：177-180中所述的乙醇诱导型启动子。还参见Gatz，1995，Methods In Cell Biology 50：411-424，其中描述了植物的诱导型和阻遏型基因表达系统。

用于质体转化的启动子包括质体表达中的强的和组成型启动子，包括psbA启动子(psbA基因编码光系统II 32kD蛋白质)和16S rRNA操纵子(rrn)启动子，或这些启动子的修饰，其增强了表达(Suzuki etal，，2003，Plant Cell 15：195-205；还参见PCT公开no.WO00/03012)。

在本发明的一个实施方案中，SARS-CoV抗原定位于核表达的质外体空间。当在植物中表达的时候，通过将所述抗原与作为信号或转运体的肽一起表达为融合蛋白以使所述抗原定位于转基因植物的质外体空间，SARS-CoV可导向质外体空间。多种信号或转运肽都可以使用，例如Lund et al.，1992，Plant Molecular Biology 18：47-53中所述的PR1b信号序列；或Pfitzner et al.，1987，Nucleic Acids Research15：4449-4465中所述的PR-1a，b和c信号序列。含有信号或转运肽和SARS-CoV抗原的融合蛋白的构建可以是通过将对每个组分特异性的多核苷酸彼此连接起来(例如所述多核苷酸被连接在框架中)以使当融合的多核苷酸在转基因植物中表达的时候制备了所希望的融合蛋白。技术人员应当知道如何构建用于在转基因植物的质外体空间表达SARS-CoV抗原，包括SARS-CoV多肽或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的多核苷酸。

在本发明的另一个实施方案中，构建具有含有与组织特异性或发育特异性启动子，例如但不限于番茄E8果实特异性启动子，查耳酮合酶(CHS)启动子，patatin启动子可操作结合的编码SARS-CoV抗原，SARS-CoV多肽或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的序列的载体的植物是有利的。

在本发明的另一个实施方案中，用含有与修饰的或人工启动子可操作连接的编码SARS-CoV抗原，SARS-CoV多肽或其片段，衍生物，类似物，或变体，或与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的序列的载体转化植物是有利的。典型地，这种启动子，通过重组不同启动子的结构元件构建，具有独特的天然启动子不具有的表达模式和/或水平。参见，例如Salina et al.，1992，Plant Cell 4：1485-1493，例如将顺式调控元件与启动子核心组合构建人工启动子。

在本发明的另一个实施方案中，SARS-CoV抗原，SARS-CoV多肽或其片段，衍生物，类似物，或变体，或者与SARS-CoV病毒的多肽具有类似活性的分子的表达可以用本领域公知的方法通过提高编码所希望蛋白或多肽的基因的拷贝数目进行工程化。

本发明提供了能指导SARS-CoV病毒核苷酸序列，其片段，衍生物，类似物，或变体在基因修饰的植物或其后代，包括，例如转基因核转质体植物中表达的载体。所述植物载体通过生物技术领域公知的一般重组DNA和克隆技术构建，参见，例如Sambrook et al.，supra；Ausubel et al.，supra。这种多核苷酸构建体典型地含有编码工程化基因产物和一个或多个调控多核苷酸序列的多核苷酸序列。用于本发明的多核苷酸构建体的调控序列包括但不限于，启动子，增强子，内含子，剪接供体，剪接受体，多聚腺苷酸化序列，RNA稳定性调节序列，或者上述任何一个的元件(例如启动子元件包括，但不限于TATA盒)。用于本发明的调控元件能够指导在其中希望表达编码SARS-CoV病毒抗原的核苷酸序列的植物种中的表达。在另一个优选的方面，所述调控元件能够指导在所感兴趣的植物种中希望表达所述工程化基因产物的细胞类型中的表达。

用于本发明的调控元件是本领域技术人员公知的，例如，已知在所感兴趣的细胞类型和植物种中表达的基因的启动子和增强子元件。用于在感兴趣的植物种中表达SARS-CoV病毒抗原的启动子还可以用常规的实验方法分离，例如通过分离已知以所希望方式表达的基因的启动子区域。例如，可以用对已知在感兴趣的植物种中的感兴趣的细胞类型中表达的信使RNA的5’端特异的cDNA探针筛选基因文库。这种5’端cDNA探针优选仅是大约100个碱基对到大约300个碱基对，以使基因文库中鉴别的克隆可能包含基因的5’端，该基因可能包含所述探针对其特异的基因的启动子区域的。所述启动子区域典型地包括转录起始位点上游的大约1,000到大约2,000个碱基对。因此，用于表达所构建的本发明的SARS-CoV核苷酸序列，基因，其片段，衍生物，类似物或变体的表达的启动子是已知在所感兴趣的植物种中的所感兴趣的细胞类型中表达的基因的转录起始位点的上游大约2,000个碱基对到下游大约50个碱基对，或是该多核苷酸的一部分。

为了便于正确处理SARS-CoV病毒抗原，可能需要包括编码这种处理所必需的肽序列的核苷酸序列。例如，被鉴别的在转基因宿主植物中发挥作用，例如，使所述抗原容易进入内质网的肽序列可能是必需的，即，信号序列。

植物和植物细胞的转化

植物和植物细胞核和质体可以用本领域已知的任何方法转化。在本发明的一个实施方案中，在核转化中农杆菌(Agrobacterium)被用于将本发明的载体引入。这种转化优选使用二元农杆菌T-DNA载体(Bevan，1984，Nuc.Acid Res.Vol.12，pages 8711-8721)和共培养步骤(Horsch et al.，1985，Science Vol.227，pages 1229-1231)。通常，农杆菌转化系统用于工程化双子叶植物(Bevan et al.，1982，Ann.Rev.Genet Vol.16，pages 357-384；Rogers et al.，1986，MethodsEnzymol.Vol.118，pages 627-641)。农杆菌转化系统也可以用于将DNA转化，以及转移到单子叶植物和植物细胞中(参见Hernalsteen et al.，1984，EMBOJ.Vol.3：pages 3039-3041；Hooykaas-Van Slogteren etal.，1984，Nature Vol.311，pages 763-764；Grimsley et al.，1987，Nature Vol.325，pages 1677-179；Boulton et al.，1989，Plant Mol.Biol.Vol.12，pages 31-40.；and Gould et al.，1991，Plant Physiol.Vol.95，pages 426-434)。

在其它实施方案中，将重组核酸构建体引入到植物和植物细胞中的各种替代方法也可以使用。这些其它方法特别用于靶是单子叶植物或植物细胞的情况。替代的基因转移和转化方法包括，但不限于，基因枪轰击(particle gun bombardment)(基因枪(biolistics))，通过钙-，聚乙二醇(PEG)-或电穿孔-介导的裸DNA吸收进行的原生质体转化(参见Paszkowski et al.，1984，EMBO J.Vol.3，pages 2717-2722；Potrykus et al.1985，Molec.Gen.Genet.Vol.199，pages 169-177；Fromm et al.，1985，Proc.Nat.Acad.Sci.USA Vol.82，pages5824-5828；和Shimamoto，1989，Nature Vol.338，pages 274-276)和植物组织的电穿孔(D’Halluin et al.，1992，Plant Cell Vol.4，pages1495-1505)。植物细胞转化的其它方法包括显微注射，碳化硅介导的DNA吸收(Kaeppler et al.，1990，Plant Cell Reporter Vol.9，pages415-418)，和微弹轰击(microprojectile bombardment)(参见Klein etal.，1988，Proc.Nat.Acad.Sci.USA Vol.85，pages 4305-4309；和GordonKamm et al.，1990，Plant Cell Vol.2，pages 603-618)。在任何方法中，可以使用选择性标记，至少是在最开始的时候，以确定转化是否实际发生了。可用的选择性标记包括提供对抗生素，例如庆大霉素，潮霉素，卡那霉素等的抗性的酶。或者，可以使用提供通过颜色变化识别的化合物，例如GUS，通过发光识别的化合物，例如荧光素酶的标记。

嵌合基因还可以含有基因开关机制，其决定了在什么条件下或者什么时候所述编码序列被表达。例如，这些基因开关可以是化学诱导的启动子或温度控制的启动子。

在特定的实施方案中，每个质体转化构建体(pCV1，pCV6或pCV8，和其含有具有核苷酸(而不是氨基酸)变化以使密码子使用最适于在植物中表达的S1的衍生物)通过基因枪轰击引入到烟草(Staub and Maliga，1994，Plant Journal Vol.6，pages 547-553)和番茄(Ruf et al.，2001，Nature Biotech Vol.19，pages 870-875)中。在特定的实施方案中，通过核转化产生表达S1或M抗原的转基因烟草和转基因莴苣是用农杆菌介导的转化(Horsch et al.，1985，ScienceVol.227，pages 1227-1231)以及分别使用质粒pCV2[和其含有具有核苷酸(而不是氨基酸)变化以使密码子使用最适于在植物中表达的S1的衍生物]和pCV4实现的。在另一个特定的实施方案中，通过核转化产生表达S1或M抗原的转基因番茄。

根据本发明，多种植物和植物细胞系统可以用本发明的核酸构建体和上述的各种转化方法工程化以具有所希望的生理学和农学特性。在优选的实施方案中，用于工程化的靶植物和植物细胞包括，但不限于，那些单子叶和双子叶植物，例如农作物包括谷类作物(例如小麦，玉米，稻，粟，大麦)，烟草，果实作物(例如番茄，苹果，梨，草莓，橙)，饲料作物(例如苜蓿)，根菜作物(例如胡萝卜，马铃薯，甜菜，薯蓣)，叶菜作物(例如莴苣，菠菜)，开花植物(例如矮牵牛花，玫瑰，菊花)，针叶树和松树(例如冷杉，云杉)；用于植物修复的植物(例如重金属积聚植物)；油料作物(例如向日葵，油菜籽)；和用于实验目的的植物(例如拟南芥(Arabidopsis))。

转化植物和植物细胞的筛选

根据本发明，所希望的植物可以通过将一个或多个表达本文所述的SARS-CoV抗原的载体工程化到多种植物细胞类型，包括但不限于原生质体，组织培养细胞，组织和器官外植体，花粉，胚胎，以及完整植物中获得。在本发明的一个实施方案中，工程化的植物材料用下述步骤和方法选择或筛选转化体(那些掺入或整合了所引入的基因构建体的)。分离的转化体然后可以通过有性或无性繁殖或生长再生成植物及其后代。或者，工程化的植物材料可以在对衍生出的植物进行标记基因性状的选择或筛选之前再生成植物。从植物细胞，组织或器官，在选择或筛选标记基因之前或之后再生植物的步骤是本领域技术人员公知的。

转化的植物细胞，愈伤组织，组织或植物可以通过选择或筛选工程化的植物材料中由转化DNA上存在的标记基因编码的性状被鉴别和分离。例如，选择可以通过在含有抑制量的转化基因提供了针对其的抗性的抗生素或除草剂的介质上培养工程化的植物材料来进行。进一步，转化的植物和植物细胞还可以通过筛选本发明的载体中可能存在的任何可见标记基因(例如β-葡糖醛酸酶，荧光素酶，B或C1基因)的活性被鉴别。这种选择和筛选方法是本领域技术人员公知的。

物理和生化方法还可以用于鉴别含有本发明的基因构建体的植物或植物细胞转化体。这些方法包括但不限于：1)用于检测和确定重组DNA插入物的结构的Southern分析或PCR扩增；2)用于检测和检查所述基因构建体的RNA转录物的Northern blot，S1 RNase保护，引物延伸或反转录酶-PCR扩增；3)用于检测酶活性的酶检测，其中该基因产物由所述基因构建体编码；4)蛋白质凝胶电泳(PAGE)，Western blot技术，免疫沉淀，或酶联免疫检测，其中所述基因构建体产物是蛋白质。其它技术，例如原位杂交，酶染色，和免疫染色，也可以用于检测在特定植物器官和组织中所述重组构建体的存在或表达。进行所有这些检测的方法是本领域技术人员公知的。

在特定的实施方案中，选择标记基因aadA，其赋予壮观霉素抗性，在质体转化中由稻质体16S rRNA操纵子(rrn)启动子驱动。在特定的实施方案中，选择标记基因nptII，其赋予卡那霉素抗性，在核转化中被NOS(胭脂碱合酶)启动子驱动。

本发明涉及表达SARS-CoV病毒的一个或多个表位的转基因和转质体植物。表达SARS-CoV抗原的转基因或转质体植物导致在受试者摄食修饰的植物或植物部分之后，或用本领域已知的方法给受试者施用植物提取物之后，受试者产生抵抗SARS-CoV的抗体。

植物的实例是单子叶植物，双子叶植物，作物植物(即为农业目的，为动物包括人的食物生产的目的培养的任何植物种，典型地以超过大约10株植物成群种植以收获完整植物或所述植物具有的植物部分，例如果实，花或作物的植物，例如烟草，谷物等)，树(即果树，为木材生产培养的树，为装饰培养的树等)，任何种类的花(即为装饰目的培养的植物，例如在收获之后)，仙人掌。

其中SARS-CoV病毒抗原可以被表达的植物的更多实例包括植物界，链形植物(Streptophyta)，有胚植物，维管植物，真叶植物(Euphyllophytes)，种子植物门，木兰门，百合纲(Liliopsida)，鸭跖草亚纲(Commelinidae)，禾本目(Poales)，禾本科(Poaceae)，稻属(Oryza)，水稻(Oryza sativa)，玉蜀黍属(Zea)，玉米(Zea mays)，大麦属(Hordeum)，大麦(Hordeum vulgare)，小麦属，小麦(Triticumaestivum)，真双子叶植物，核心真双子叶分支(Core eudicots)，菊亚纲(Asteridae)，真菊分支(Euasterids)，蔷薇亚纲(Rosidae)，II类真蔷薇分支(Eurosids II)，十字花目(Brassicales)，十字花科，阿布属(Arabidopsis)，木兰纲(Magnoliopsida)，Solananae，茄目(Solanales)，茄科，茄属(Solanum)，和烟草属(Nicotiana)。

还包括，例如，特别感兴趣的农作物包括茄科，包括处理的和新鲜的市售的番茄，胡椒和茄子；多叶植物，包括莴苣和菠菜；芸苔(Brassicas)，包括球花甘蓝，球芽甘蓝，花茎甘蓝，cale，花椰菜，红球甘蓝和白球甘蓝；葫芦科，包括黄瓜，甜瓜，西瓜，绿皮西葫芦和南瓜；大粒种子植物，包括豌豆，菜豆和甜玉米；生根植物，包括胡萝卜和洋葱；无性繁殖植物，包括浆果，葡萄，香蕉，菠萝，奇异果，和蔷薇科果实和坚果作物；和热带作物，包括芒果和木瓜。

因此本发明可应用于很多种植物中，包括，但不限于下述属的种：腰果(Anacardium)，花生(Arachis)，芦笋(Asparagus)，颠茄(Atropa)，燕麦(Avena)，芸苔(Brassica)，柑橘(Citrus)，西瓜(Citrullus)，辣椒(Capsicum)，红花(Carthamus)，椰子(Cocos)，咖啡(Coffea)，甜瓜(Cucumis)，南瓜(Cucurbita)，胡萝卜(Daucus)，油棕(Elaeis)，草莓(Fragaria)，大豆(Glycine)，棉(Gossypium)，向日葵(Helianthus)，Heterocallis，大麦(Hordeum)，天仙子(Hyoscyamus)，莴苣(Lactuca)，亚麻(Linum)，黑麦草(Lolium)，羽扇豆属(Lupinus)，番茄属(Lycopersicon)，苹果属(Malus)，木薯属(Manihot)，Majorana，苜蓿属(Medicago)，烟草属(Nicotiana)，木樨榄属(Olea)，稻属(Oryza)，稷属(Panieum)，Panneserum，鳄梨属(Persea)，菜豆属(Phaseolus)，Pistachia，豌豆属(Pisum)，梨属(Pyrus)，李属(Prunus)，萝卜属(Raphanus)，蓖麻属(Ricinus)，黑麦属(Secale)，千里光属(Senecio)，白芥(Sinapis)，茄属(Solanum)，高粱属(Sorghum)，Theobromus，胡芦巴属(Trigonella)，小麦属(Titicum)，蚕豆属(Vicia)，葡萄属(Vitis)，豇豆属(Vigna)，和玉蜀黍属(Zea)。

疫苗制剂和给药

本发明还提供了含有本发明的修饰的植物的提取物的疫苗制剂，其适合于给药以引发抗特定抗原的保护性的免疫(体液和/或细胞介导的)反应，例如用于SARS的治疗和预防。

这种疫苗的适当的制剂包括注射剂，作为液体溶液或悬液；适合于在注射前配制成液体中的溶液或悬液的固体形式也可以被制备。所述制剂还可以被乳化，或者蛋白质分子被包裹在脂质体中。活性免疫原性成分通常与药学可接受的并且与所述活性成分相容的载体，媒介物或赋形剂混合。合适的赋形剂是，例如，水，盐水，缓冲盐水，右旋糖，甘油，乙醇，无菌等渗含水缓冲液等及其组合。此外，如果希望的话，所述疫苗制剂还可以包括微量的辅助物质例如湿润或乳化试剂，pH缓冲试剂，和/或增强疫苗有效性的佐剂。

可能有效的佐剂的实例包括但不限于：氢氧化铝，N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)，N-乙酰基-正-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺，N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰基氧)-乙胺。

佐剂的有效性可以通过测定抗所注射的用所述特定佐剂配制的修饰的植物的提取物的抗独特型抗体的诱导来确定。

所述组合物可以是液体溶液，悬液，乳剂，片剂，丸剂，胶囊，持续释放制剂，或粉末。口服制剂可以包括标准的载体例如药物级的甘露醇，乳糖，淀粉，硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁。

在另一个实施方案中，所述组合物可以置于囊泡，特别是脂质体(参见Langer，1990，Science 249：1527-1533；Treat et al.，in Liposomesin the Therapy of Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein andFidler(eds.)，Liss，New York，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，ibid.，pp.317-327；一般性地参见上文)中递送。

通常，所述成分以单位剂量形式分离地或混合在一起提供，例如，作为置于密封容器例如指示活性剂数量的安瓿瓶或药囊中的干燥的冻干粉或无水浓缩物。如果所述组合物通过注射给药，可以提供无菌稀释剂的安瓿瓶以使所述成分可以在给药之前混合。

在特定的实施方案中，本发明的冻干的修饰的免疫球蛋白提供于第一个容器中；第二个容器含有由含有50％甘油，0.25％苯酚和防腐剂(例如0.005％亮绿)的水溶液组成的稀释剂。

本发明还提供了含有装有本发明的疫苗制剂的一种或多种成分的一个或多个容器的药物包装或试剂盒。与这些容器一起的可以是由管理药物或生物产品的制造，使用或销售的政府机构所规定的形式的通知，该通知表明该机构对用于人给药的制造，使用或销售的批准。

所述组合物可以，如果希望的话，以包装或分配装置的形式提供，其可以包含一种或多种含有所述活性成分的单位剂量形式。所述包装可以例如含有金属或塑料箔，例如泡罩包装或透皮贴片。所述包装或分配装置可以附加有给药的说明书。含有用相容的药学载体配制的本发明的提取物的组合物还可以被制备，置于合适的容器中，并标明用于治疗指定的病况。

被给予疫苗的受试者优选是哺乳动物，最优选是人，但是还可以是非人动物，包括但不限于兔，山羊，牛，猪，绵羊，马，麝猫，啮齿动物，浣熊，貉，狗，雪貂，鼬獾(ferret Badger)，猫，和禽类。

许多方法可用于输入本发明的疫苗制剂；包括但不限于口服，脑内，皮内，肌肉内，腹膜内，静脉内，皮下，鼻内方式，以及通过划破(通过皮肤表层的划伤，例如用分叉的针)或免疫的任何其它标准方法。在特定的实施方案中，划破(sacrification)被使用。

在所述制剂中使用的修饰的植物的提取物的精确剂量还取决于给药的方式，和患者的状况，应根据专业医生的判断和每个患者的情况依据标准临床技术确定。有效的免疫量是足以在被给予所述疫苗制备物的宿主中产生对SARS-CoV病毒表位的免疫反应(即抗独特型反应)的量。有效剂量还可以从由动物模型检测系统得到的剂量-反应曲线外推。

本发明提供了抗SARS的疫苗接种的方法。所述方法包括给受试者施用整个修饰的植物或植物部分，提取物，以产生抗SARS-CoV病毒抗原的抗体。在优选的实施方案中，所述疫苗通过摄食修饰的植物或注射修饰的植物的提取物给药。在特定的实施方案中，含有用用于表达S抗原的载体转化的修饰的植物的提取物的第一种疫苗可以在含有用用于表达M抗原的载体转化的修饰的植物的提取物的第二种疫苗给药之前，同时，或之后给药。术语“同时”不限于预防或治疗组合物恰好在同一时间给药，还意味着本发明的组合物和其它试剂以一定顺序或在一定时间间隔内被施用给哺乳动物，以使含有多核苷酸的所述组合物可以与其它组合物一起作用以提供比它们用别的方式给药更多的益处。在不同的实施方案中，所述预防或治疗组合物相隔少于1小时，相隔大约1小时，相隔大约1小时到大约2小时，相隔大约2小时到大约3小时，相隔大约3小时到大约4小时，相隔大约4小时到大约5小时，相隔大约5小时到大约6小时，相隔大约6小时到大约7小时，相隔大约7小时到大约8小时，相隔大约8小时到大约9小时，相隔大约9小时到大约10小时，相隔大约10小时到大约11小时，相隔大约11小时到大约12小时，相隔不超过24小时，或相隔不超过48小时给药。在优选的实施方案中，两个或多个组分在同一次患者就医期间给药。

在其它实施方案中，所述预防或治疗组合物在大约30分钟，相隔大约1小时，相隔大约1小时到大约2小时，相隔大约2小时到大约3小时，相隔大约3小时到大约4小时，相隔大约4小时到大约5小时，相隔大约5小时到大约6小时，相隔大约6小时到大约7小时，相隔大约7小时到大约8小时，相隔大约8小时到大约9小时，相隔大约9小时到大约10小时，相隔大约10小时到大约11小时，相隔大约11小时到大约12小时，相隔大约1到2天，相隔大约2到4天，相隔大约4到6天，相隔大约1周，相隔大约1到2周，或相隔超过2周给药。本领域技术人员能够通过确定所给药组合物的半衰期从而确定该时间框架。

在特定的实施方案中，本发明的预防或治疗组合物周期性地给受试者施用。周期性治疗包括施用第一种组合物一段时间，然后施用第二种组合物和/或第三种组合物一段时间，并重复这种顺序给药。周期性治疗可以减少对这些治疗的一种或多种的抗性的发生，避免或降低这些治疗之一的副作用，和/或提高治疗的功效。

在特定的实施方案中，预防或治疗组合物以少于大约3周的周期给药，大约每两周一次，大约每10天一次或大约每周一次。一个周期可以包含通过每个周期超过大约90分钟，每个周期超过大约1小时，每个周期超过大约45分钟的输注进行的预防或治疗组合物的给药。每个周期可以含有至少1周的休息，至少2周的休息，至少3周的休息。给药周期的数目是大约1到大约12个周期，更典型地是大约2到大约10个周期，更典型地是大约2到大约8个周期。

在另一个实施方案中，本发明的预防或治疗组合物以规律定量方案给药，其是通过连续的输注或没有延长的休息期的频繁给药进行。这种规律给药可以包括以没有休息期的以恒定的间隔给药。所述定量方案包括以相对低的剂量长期每天给药达一长段时间。在优选的实施方案中，使用更低剂量可以将毒副作用减至最小，并且可以去掉休息期。在特定的实施方案中，所述预防或治疗组合物以长期低剂量或连续输注大约24小时到大约2天，到大约1周，到大约2周，到大约3周，到大约1个月，到大约2个月，到大约3个月，到大约4个月，到大约5个月，到大约6个月递送。这种剂量方案的时间安排可以由有技术的医生最优化。

本文提供的给药的剂量和频率包括在术语治疗有效和预防有效中。所述剂量和频率进一步典型地根据每个患者的特定因素而变化，这取决于要施用的特定治疗或预防组合物，疾病或失调的严重性和类型，给药的方式，以及患者的年龄，体重，反应，和过去的病史。合适的方案可由本领域技术人员参考这些因素并依据，例如文献中报道的和Physician′s Desk Reference(56^th ed.，2002)中推荐的剂量进行选择。

各种递送系统都是已知的，可用于施用本发明的治疗或预防组合物，例如包裹于脂质体中，微粒，微胶囊，能表达所述抗体或抗体片段的重组细胞，受体介导的胞吞作用(参见，例如Wu and Wu，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987))，将核酸构建为逆转录病毒或其它载体的一部分等。施用本发明的治疗或预防组合物的方法包括但不限于，肠胃外给药(例如皮内，肌肉内，腹膜内，静脉内和皮下)，硬膜外，和粘膜(例如鼻内和口服途径)。在特定的实施方案中，本发明的治疗或预防组合物进行肌肉内，静脉内，或皮下给药。所述治疗或预防组合物可以通过任何方便的方式给药，例如通过输注或弹丸注射，通过上皮或粘膜与皮肤的内层(linings)(例如口腔粘膜，直肠和肠粘膜等)的吸收，可以与其它生物活性试剂一起给药。给药可以是系统性的或是局部的。

在特定的实施方案中，可能希望对需要治疗的区域局部给予本发明的治疗或预防组合物；这可以通过，例如，但不限于局部输注，注射，或通过植入物实现，所述植入物是多孔，非多孔，或凝胶状材料的，包括膜，例如硅橡胶(sialastic)膜，或纤维。

在另一个实施方案中，所述治疗或预防组合物可以用控制释放或持续释放系统递送。在一个实施方案中，泵可用于获得控制或持续释放(参见Langer，supra；Sefton，1987，CRC Crit.Ref，Biomed.Eng.14：20；Buchwald et al.，1980，Surgery 88：507；Saudek et al.，1989，N.Engl，J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，聚合材料可用于获得本发明的治疗或预防组合物的控制或持续释放(参见，例如，Medical Applications of Controlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled DrugBioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen andBall(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger and Peppas，1983，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.23：61；还参见Levy et al.，1985，Science 228：190；During et al.，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard et al.，1989，J.Neurosurg.71：105)；U.S.Patent No.5,679,377；U.S.Patent No.5,916,597；U.S.Patent No.5,912,015；U.S.Patent No.5,989,463；U.S.Patent No.5,128,326；PCT Publication No.WO99/15154；and PCT Publication No.WO99/20253)。用于持续释放制剂的聚合物的实例包括，但不限于聚(2-甲基丙烯酸羟乙酯)，聚(甲基丙烯酸甲酯)，聚(丙烯酸)，聚(醋酸亚乙基-共聚-乙烯酯)，聚(甲基丙烯酸)，聚乙醇酸(PLG)，聚酐，聚(N-乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙烯醇)，聚丙烯酰胺，聚(乙二醇)，聚交酯(PLA)，聚(丙交酯-共聚-乙醇酸)(PLGA)，和聚原酸酯(polyorthoesters)。在优选的实施方案中，用于持续释放制剂的聚合物是惰性的，不含可滤出杂质的，储存稳定的，无菌的，和生物可降解的。在另一个实施方案中，控制或持续释放系统可以置于预防或治疗的靶的附近，因此仅需要系统性剂量的一部分(参见，例如Goodson，in Medical Applicationsof Controlled Release，supra，vol.2，pp.115-138(1984))。

控制释放系统在Langer(1990，Science 249：1527-1533)的综述中有所讨论。本领域技术人员所知的任何技术都可以用于产生含有本发明的一个或多个治疗组合物的持续释放制剂。参见，例如U.S.Patent No.4,526,938，PCT publication WO91/05548，PCT publicationWO96/20698，.Ning et al.，1996，″Intratumoral Radioimmunotheraphyof a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel，″Radiotherapy&Oncology 39：179-189，Song et al.，1995，″AntibodyMediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions，″PDAJournal of Pharmaceutical Science&Technology 50：372-397，Cleek etal.，1997，″Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody forCardiovascular Application，″Pro.Int′l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854，and Lam et al.，1997，″Microencapsulation ofRecombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery，″Proc.Int′l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760，在此引入其中每一个的全文作为参考。

抗体可以在施用本发明的疫苗之后从受试者分离。产生抗SARS的抗体的方法包括给受试者施用有效量的修饰的植物，和过一段时间以后从受试者的样品中分离抗体。所述样品可以是生物流体，例如血液，血清，血浆，唾液，尿，粪便，痰，鼻咽吸出物，细胞和组织。

预防和治疗效用的证明

本发明提供了通过给有需要的受试者施用本发明的修饰的植物，从而预防，治疗，改善，和/或控制SARS的方法。用于本发明的方法的修饰的植物可以通过多种方式筛选或检测治疗或预防SARS的功效。

首先，含有本发明的修饰的植物或植物提取物的疫苗制剂的免疫功效可以通过在用所述疫苗免疫后监测所检测动物的免疫反应确定。体液反应的产生可以作为一般免疫反应的指示，其其它组成成分，特别是细胞介导的免疫，可能对于提供对疾病的保护是重要的。所检测动物可以包括小鼠，兔，黑猩猩，最后是人受试者。本发明中制备的疫苗可以在实验中感染黑猩猩。但是，由于黑猩猩是受保护的生物种，对本发明的疫苗的抗体反应可以首先在许多更小的，较便宜的动物中研究，其目的是为了找到产生SARS-CoV病毒表位的最佳组合的一种或两种最好的候选的修饰的植物以用于黑猩猩的功效研究。

所述疫苗的安全性还可以通过在给所检测的受试者施用疫苗后观察或监测受试者的症状来确定。在特定的实施方案中，SARS-CoV的全基因组用于疫苗中。在优选的实施方案中，所述植物表达SARS-CoV多肽的少于10％，少于20％，少于25％，少于30％，少于35％，少于40％，少于45％，少于50％，少于55％，少于60％，少于65％，少于70％，少于80％，少于90％。

所检测受试者的免疫反应可以通过各种方法进行分析，例如用已知技术，例如酶联免疫吸附检测(ELISA)，免疫印迹，放射性免疫沉淀等检测得到的免疫血清对抗原的反应性；或在免疫的宿主中防止感染和/或减少疾病症状。

作为适当的动物检测的一个实例，本发明的疫苗组合物可以在兔中检测其诱导对SARS病毒抗原的免疫反应的能力。例如，可以使用雄性的无特定病原体(SPF)的年轻成年新西兰白兔。每个检测组的兔子通过任何给药方法，例如摄食修饰的植物或注射修饰的植物提取物，接受有效量的所述疫苗。对照组的兔注射含于1mM Tris-HCl pH9.0中的含有来自相同类型的未修饰的植物的相同种类的植物提取物的疫苗。每一到两周从兔中提取血液样品，用例如放射性免疫检测(Abbott Laboratories)分析血清中对所述病毒抗原特异的抗体。抗体的存在可以用ELISA检测。兔因为其远系繁殖的性质可能会有可变的反应，因此在小鼠中检测所述疫苗可能是有用的。

在一个实施方案中，本发明涉及从通过注射或摄食被施用了修饰的植物和/或植物提取物的受试者中收集的生物材料。所述生物材料可以检测SARS-CoV多肽或其片段的存在。生物材料包括，但不限于，血液，血清，血浆，唾液，尿，粪便，痰，鼻咽吸出物，细胞和组织。所述生物材料可以在施用本发明的修饰的植物和/或植物提取物之后1小时，2小时，6小时，12小时，24小时，2天，3天，或1周后收集。

此外，本发明的修饰的植物可以通过首先给检测受试者，其为动物或人，施用所述修饰的植物，然后分离针对所述病毒抗原的抗独特型反应中产生的抗-抗独特型抗体(即Ab3抗体)来检测。分离的Ab3然后可以检测其结合特定病毒抗原的能力(例如通过本领域已知的任何免疫检测，例如但不限于放射性免疫检测，ELISA，“sandwich”免疫检测，凝胶扩散沉淀反应，免疫扩散检测，western blots，沉淀反应，凝集检测，补体固化检测，免疫荧光检测，蛋白A检测，免疫电泳检测等)。

在一个方面，如果所述疫苗是抗SARS-CoV病毒抗原的，分离的Ab3治疗SARS的功效通过培养来自培养物或患者的SARS-CoV感染的细胞，使所述细胞与要检测的Ab3抗体接触，将接触细胞的增殖或存活与未接触所述Ab3抗体的细胞的增殖或存活相比较来筛选，其中接触细胞的更低水平的增殖或存活表示所述Ab3抗体(用SARS-CoV病毒抗原进行免疫引发的)在患者中有效治疗SARS。本领域中许多标准检测可用于评价这种存活和/或生长；例如，细胞增殖可以通过测定3H-胸腺嘧啶掺入，通过直接细胞计数，通过检测已知基因例如原癌基因(例如fos，myc)或细胞周期标记的转录活性的改变来检测；细胞的生存力可以通过台盼蓝染色评价，分化可以依据形态变化进行视觉评价。

本发明还提供了在给有需要的受试者施用本发明的修饰的植物后得到的抗SARS-CoV病毒的抗体。免疫特异性结合SARS-CoV病毒的抗原的抗体还可以直接在体内检测。为监测本发明的抗体的效果，在施用所述疫苗之前，期间，或之后在适当的时间间隔测定所述抗原的水平。所述抗原的量的任何变化或没有变化可以被鉴别，并与对受试者的治疗效果相关联。

特别地，在SARS的情形中，SARS-CoV抗原的血清水平与SARS的严重程度有直接关系。通常，抗原水平的降低与有效的治疗相关。所治疗的受试者中SARS-CoV抗原的血清水平在给所述受试者施用本发明的修饰的植物和/或植物提取物之后每1小时，2小时，3小时，6小时，12小时，24小时，2天，3天，或1周被检测。

在优选的方面，所述方法可以被实施以确定不同时间点的抗原水平，并将这些值与基线水平相比较。基线水平可以是在正常的无疾病的个体中存在的标记的水平；和/或在治疗前或稳定期间的水平。这些水平然后可以和疾病进程或治疗结果相关联。

抗原的水平可以用本领域公知的任何方法测定。例如SARS-CoV病毒抗原可以用已知的免疫诊断方法例如western blotting，免疫沉淀，并使用抗SARS-CoV抗原的任何抗体来定量。

体内对所述病毒抗原的免疫反应的强度可以用本领域已知的任何方法测定，例如但不限于延迟的超敏皮肤检测和体外细胞溶解T-淋巴细胞活性的检测。

延迟的超敏皮肤检测在整体免疫反应和对抗原的细胞免疫的检测中具有重大价值。皮肤检测的适当技术要求所述抗原无菌储存于4℃，防光并在临使用前重构。25-或27-规格的针保证了抗原的皮内而不是皮下给药。抗原皮内给药后二十四小时和48小时后，用标尺检测最大尺寸的红斑和硬化。对任何给定抗原或抗原组的活动减退(hypoactivity)通过用较高浓度的抗原检测或者，在不确定的情况下，通过用中间检测进行重复检测来证实。

为了检测细胞溶解性T-淋巴细胞的活性，从经免疫的受试者，例如通过Ficoll-Hypaque梯度离心技术分离出的T-淋巴细胞，用具有抗SARS抗原的细胞在含有10％胎牛血清的3ml RPMI介质中再次刺激。在一些实验中，在培养介质中包含33％的二级混合的淋巴细胞培养物上清或IL-2作为T细胞生长因子的来源。为了测定免疫后细胞溶解性T-淋巴细胞的初级反应，分离的T细胞在有或没有具有所述抗原的细胞的条件下培养。六天后，所述培养物用4小时⁵¹Cr-释放检测测定其细胞毒性。如果免疫是有效的，靶的自发的⁵¹Cr-释放应当达到少于20％的水平(Heike et al.，J.Immunotherapy Vol.15，pages15-174)。

所述抗体的功效可以通过给受试者(人受试者或者所述疾病的动物模型)施用所述抗体，然后监测SARS-CoV病毒抗原的水平或特定感染疾病的症状来检测。SARS-CoV病毒抗原的水平可以用本领域已知的用于检测SARS-CoV病毒抗原的水平的任何方法测定，例如病毒滴度，在病毒的情况下，或者细菌水平(例如通过培养来自患者的样品)等。病毒抗原水平的降低或SARS症状数目的消除，改善或减少表示所述抗体是有效的。SARS的症状包括，但不限于，温度高于100.4°F(＞38℃)(根据CDC)，寒战，头痛，不适，身体疼痛，咳嗽，呼吸急促，呼吸困难，和缺氧。肺炎的射线照相证据，呼吸窘迫综合症，和尸检结果也用于确定受试者是否患有，从其康复，或没有SARS。

预防和治疗效用的功效

本发明的预防和/或治疗方案的毒性和功效可以在细胞培养物或实验动物中用标准药学方法测定，例如测定LD₅₀(对群体的50％致命的剂量)和ED₅₀(在群体的50％中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果的剂量比是治疗指数，可以表示为LD₅₀/ED₅的比值。表现出大治疗指数的预防和/或治疗试剂是优选的。虽然表现出毒副作用的预防和/或治疗试剂可以使用，但应当注意要设计将这些试剂靶定到受影响组织部位的递送系统以使对于未感染细胞的损害减至最小，从而减少副作用。

从细胞培养物检测和动物研究获得的数据可以用于配制一定剂量范围内的用于人的预防和/或治疗试剂。这种试剂的剂量优选在包括ED₅₀并且几乎没有或没有毒性在内的循环浓度范围内。所述剂量可以在这个范围内变化，取决于所使用的剂型和所使用的给药方式。对于本发明的方法中使用的任何试剂，治疗有效剂量最初可以从细胞培养物检测来估计。剂量可以在动物模型中制定以获得包括在细胞培养物中测定的IC₅₀实现症状的半数最大抑制的待测化合物浓度)在内的循环血浆浓度范围。这种信息可以用于更精确地确定在人中可用的剂量。血浆中的水平可以，例如通过高效液相色谱检测。

实施例

下述实施例举例说明了含有SARS-CoV病毒的M和/或S1蛋白的转基因或转质体烟草植物的产生。

质粒构建

用于构建这些质体转化载体的骨架是衍生自质粒pVSR326(Reddy et al.，2002，Mol Breeding 9：259-269；PCT internationalapplication no.PCT/EP00/12446，international publication no.WO01/42441)。质粒pVSR326使用跨越rbcL-accD的烟草质体基因组序列，以便将编码β-葡糖醛酸酶(GUS)的报道基因通过同源重组靶向到叶绿体基因组中(Reddy et al.，2002)。GUS的启动子和终止子衍生自稻质体基因psbA；psbA基因编码光系统II的32kD蛋白。选择标记基因aadA，具有壮观霉素抗性，由稻质体16S rRNA操纵子(rrn)启动子驱动，aadA与GUS相邻(Reddy et al.，2002)。在pMLVHis载体中，除了在此区域上的独特的限制性位点，引入起始密码子和(His)₅-tag以便于(His)₅-标记的重组蛋白的克隆和表达。

pCV1，用于表达S1抗原的质体转化载体的构建

来自pCRII-S1的编码去掉其起始密码子和信号肽的S1的2-kbSpeI-NotI片段被克隆到pMLVHisA(图4)的NheI和NotI位点上。质粒pCRII-S1衍生自pCRII(Invitrogen)，含有S1的PCR扩增片段。在得到的称为pCV1(图1)的衍生物中，S1的氨基酸12-658与十七个pMLVHisA衍生的残基，包括‘ATG’起始密码子和(His)₅-tag，框内(in-frame)融合。质粒pMLVHisA设计有(His)₅-tag，使得能在western blot分析中使用抗(His)₅-tag的抗血清识别重组蛋白。而且，(His)₅-tag使得，如果需要的话并且当需要的时候，可以用Ni-NTAAgarose(Qiagen)亲和柱容易地纯化重组蛋白。稻质体psbA启动子驱动所述重组蛋白的表达，终止子也是衍生自psbA。烟草质体基因组上侧翼rbcL和accD序列的存在使得发生同源重组，结果是将S1(和aadA)插入到靶植物的质体基因组中。

由于植物叶绿体基因组序列是高度保守的，相同的构建体用于烟草和番茄，二者都属于同一个家族茄科，的质体转化。

pCV2，用于表达S1抗原的核转化载体的构建

来自pCRII-S1的编码氨基酸1-658的S1的2-kb的BamHI-XhoI片段被克隆到pSa7(图5)，一种植物核转化载体的BamHI和SalI位点上。在该情形中，S1的信号肽(氨基酸1-13)被保留，因为以前的报道提示在植物核-表达的外源蛋白上存在内质网靶定信号会提高蛋白质的稳定性(Richter et al.，2000，Nature Biotech 18：1167-1171；Sojikul et al，，2003，Proc.Natl.Acad，Sci.100：2209-2214)。在得到的质粒，pCV2(图19)中，S1位于强的和组成型花椰菜花叶病毒35S启动子和胭脂碱合酶(NOS)终止子之间。该质粒在存在E.coli帮助株HB101/pRK2013的条件下通过三亲本杂交从大肠杆菌(Escherichia coli)引入到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)株LBA4404中(Horsch et al.，1985，Science 227：1227-1231)。

pCV8，用于表达M抗原的质体转化载体的构建

来自于质粒pCRII-M的编码M的0.7-kb的NcoI-SacI片段被克隆到pMLVHisA(图4)的NcoI和SacI位点上生成pCV7。质粒pCRII-M衍生自pCRII(Invitrogen)，含有M的PCR扩增片段。然后，质粒pCV7用NcoI消化，用退火的寡聚物ML527(5′-CATGGCCGCGCGGGGTTCTCATCATCATCATCATCATGG-3’；SEQ ID NO：10)和ML528(5’-CATGCCATGATGATGATGATGATGAGAACCCCGCGCGGC-3’；SEQ IDNO：11)将(His)₆-tag引入到这个位点，产生pCV8(图7)。得到的从pCV8表达的M是(His)₆-标记的蛋白。

pCV4，用于表达M抗原的核转化载体的构建

来自质粒pCRII-M的编码M的0.7-kb的BamHI片段被克隆到植物核转化载体pSa13的BamHI位点上。质粒pSa13衍生自质粒pSa7(图5)，其是通过去除SaPIN2a cDNA的0.58-kb的SalI片段以后再连接而得到的。

pCV6，，用于共表达S1和M抗原的质体转化载体的构建

来自于质粒pCV3的，由与psbA终止子和rrn启动子融合的M-基因，以这个顺序构成的1.2-kb的部分BamHI片段被克隆到质粒pCV1的BamHI唯一位点上，产生共表达S1和M抗原的质体转化载体pCV6(图21)。质粒pCV3是通过将来自pCRII-M的编码M的0.7-kb的EcoRV-SacI片段克隆到pMLVHisA的StuI-SacI位点上获得的。

通过定点突变使SARS-CoV S1基因的密码子使用最优化

质粒pCRII-S1用作产生密码子使用最优化的衍生物的突变模板。突变是通过PCR使用PfuTurbo DNA聚合酶使用‘QuikChangeMulti site-directed mutagenesis kit’(Stratagene)，根据制造商的说明书实施的。表1显示了用于定点突变的寡核苷酸。扩增程序包括在95℃变性1分钟，然后30个循环的变性(95℃1分钟)，退火(55℃1分钟)和延伸(65℃12分钟)。扩增产物用DpnI处理以除去模板DNA，突变DNA用于转化E.coli XL10-Gold细胞。进行DNA测序分析以证实每个突变。引入到“最优化的”S1中的总共13个核苷酸改变(如表1中总结的)然后用于质体和核转化载体中的克隆。

表1.为使密码子最优化用于S1的定点突变的寡核苷酸

每个质体转化构建体(pCV1，pCV6或pCV8，和其含有具有核苷酸(而不是氨基酸)变化以使密码子使用最适于在植物中表达的S1的衍生物)通过基因枪轰击被引入到烟草(Staub and Maliga，1994，Plant Journal 6：547-553)和番茄(Ruf et al.，2001，Nature Bioteeh19：870-875)中。

番茄(Lycopersicon esculentum)cv.UC82B的质体转化

质体转化根据Ruf et al.，2001进行，用所希望的DNA(pCV1，pCV6或pCV8，和其含有具有核苷酸(而不是氨基酸)变化以使密码子使用最适于在植物中表达的S1的衍生物)包覆的钨颗粒轰击嫩叶。

无菌种子在添加了琼脂(5g/l)和蔗糖(30g/l)的Murashige andSkoog(MS)培养基(Murashige and Skoog，1962，Physiol.Plant.15：473-497)上发芽。为进行轰击，长出的腋生分生组织的嫩叶被置于含有MS盐，6-苯甲基氨基嘌呤(1mg/l)，α-萘乙酸(0.1mg/l)，硫胺(1mg/l)，肌型肌醇(100mg/l)，琼脂(5g/l)，pH5.7和蔗糖(30g/l)的RMOP培养基上离轴侧(abaxial side)面朝上。轰击用微粒递送系统，PDS 1000-He(Bio-Rad)和其配件进行。钨颗粒(M17)用所希望的DNA包裹，叶片被轰击。轰击之后，叶片被切割成小片，置于含有壮观霉素二盐酸盐(250mg/l)的RMOP选择培养基上。黄绿色的愈伤组织在选择培养基上经过少量循环获得含有homoplastomic质体的愈伤组织。从该愈伤组织将获得植物的再生。

烟草(N.tabacum)cv.xanthi的质体转化

质体转化根据Svab and Maliga(Svab et al.，1993，Proc.Natl.Acad.Acad.Sci.USA 90：913-917)进行，用所希望的DNA(pCV1，pCV6或pCV8，和其含有具有核苷酸(而不是氨基酸)变化以使密码子使用最适于在植物中表达的S1的衍生物)包覆的钨颗粒轰击叶子。

无菌种子在添加了琼脂(5g/l)和蔗糖(30g/l)的Murashige andSkoog(MS)培养基(Murashige and Skoog，1962，Physiol.Plant.15：473-497)上发芽。为进行轰击，叶片被置于含有MS盐，6-苯甲基氨基嘌呤(1mg/l)，α-萘乙酸(0.1mg/l)，硫胺(1mg/l)，肌型肌醇(100mg/l)，琼脂(5g/l)，pH5.7和蔗糖(30g/l)的RMOP培养基上离轴侧面朝上。轰击用微粒递送系统，PDS 1000-He(Bio-Rad)和其配件进行。钨颗粒(M17)用所希望的DNA包裹，叶片被轰击。轰击之后，叶片被切割成小片，置于含有壮观霉素二盐酸盐(500mg/l)的RMOP选择培养基上。用载体pCV1(图23F-23G)对烟草进行质体转化得到的再生的幼苗在选择培养基上再经过五个循环传代，以获得含有homoplastomic质体的愈伤组织。显示了用S1引物ML560(5’-CAGAGAGAGTTTCCCGGATTC-3’；SEQ ID NO：25)和ML567(5’-CAACCTATAGATGTAGTTCG-3’；SEQ ID NO：26)进行的PCR分析(图23H)和用³²P-放射性标记的S1探针进行的northern blot分析的结果。图23J显示了在检测His-标记的S1蛋白时使用Ni-NTA缀合物对表达修饰的S1(具有如表1所示的核苷酸变化)的转质体烟草进行的western blot分析。箭头指示出所期望的73-kDa的(His)₅-S1条带。

烟草和莴苣的核转化以表达S1或M抗原

通过核转化产生表达S1或M抗原的转基因烟草和转基因莴苣是用农杆菌介导的转化(Horsch et al.，1985，Science 227：1227-1231)以及分别使用质粒pCV2[和其含有具有核苷酸(而不是氨基酸)变化以使密码子使用最适于在植物中表达的S1的衍生物]和pCV4实现的。

在农杆菌介导的转化之后，烟草(图23A)和莴苣(图23C)的芽生根，再生的芽(图23，B，D)用于用分别位于CaMV 35S启动子和NOS-终止子内部的引物35S和NOS-ter进行PCR分析。用³²P-标记的S1探针对这些PCR扩增的DNA进行的Southern blot分析如图23E所示。2.1-kb的杂交条带证实了含有S1的转基因株系的存在(图23E，2-5道)。

烟草的核转化以表达S1：GFP抗原

表达由SARS-CoV S1蛋白与绿色荧光蛋白(GFP)融合而成的融合蛋白的转基因烟草的产生是通过农杆菌介导的转化(Horsch et al.supra.)并用质粒pCV12实现的。

农杆菌渗入(Agroinfiltration)后两天，选择有代表性的烟草叶片表皮细胞，用共聚焦显微镜观察(Yang Y.et al.，In vivo analysis ofplant promoters and transcription factors by agroinfiltration oftobacco leaves.Plant J.2000；22：543-551)含有表达S1：GFP融合蛋白的质粒pCV12的根癌农杆菌LBA4404(图18，A，C)或含有单独表达GFP的pGDG的LBA4404(图18，B，D)。横条代表20μm。

Western blot分析用抗GFP的抗体进行，显示出在农杆菌渗入之后在烟草叶片中瞬时表达S1：GFP。从用单独表达GFP的质粒pGDG(图23，第1道)或表达融合的S1：GFP融合蛋白的质粒pCV12(图23，第2道)渗入的烟草叶片中提取的总蛋白(200μg)在8％的SDS-PAGE凝胶中分离，根据Sambrook et al.(1989.MolecularCloning：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor)印迹在Hybond-C滤膜上，并与抗GFP的抗体(Clontech)交叉反应。结果如图24所示，其中箭头指示出交叉反应的S1：GFP条带(计算大小为99.1kDa)，M是分子量标记。

本领域技术人员应当认识到，或能够通过不超过常规的实验确定，本文所述的本发明的特定实施方案的许多等同方式。这种等同方式意在包括在下述权利要求的范围内。

本说明书中提及的所有的出版物，专利和专利申请在此以引用的方式引入到说明书中，如同每个单独的出版物，专利或专利申请都特别地和单独地指出以引用的方式引入本文。

本文的参考文献的引证或讨论不应当解释为承认这就是本发明的现有技术。

Claims (31)

1.分离的核酸，其核酸序列如SEQ ID NO：7所示，另外还含有至少一个S1的核苷酸改变，所述核苷酸改变为：碱基52-54CGG突变为AGA；碱基223-225ACG突变为ACT；碱基337-339TCG突变为TCT；碱基505-507TCG突变为TCT；碱基625-627CTA突变为CTT；碱基739-741ACG突变为ACT；碱基1192-1194GCG突变为GCT；碱基1519-1521CCG突变为CCT；碱基1525-1527ACG突变为ACT；碱基1789-1791CTA突变为CTT；碱基1858-1860CGC突变为AGA，其中碱基位置对应于SEQ ID NO：5。

2.分离的核酸，其核酸序列如SEQ ID NO：5所示，另外还含有至少一个S1的核苷酸改变，所述核苷酸改变为：碱基52-54CGG突变为AGA；碱基223-225ACG突变为ACT；碱基337-339TCG突变为TCT；碱基505-507TCG突变为TCT；碱基625-627CTA突变为CTT；碱基739-741ACG突变为ACT；碱基1192-1194GCG突变为GCT；碱基1519-1521CCG突变为CCT；碱基1525-1527ACG突变为ACT；碱基1789-1791CTA突变为CTT；碱基1858-1860CGC突变为AGA，其中碱基位置对应于SEQ ID NO：5。

3.根据权利要求2的核酸，其中所述分离的核酸编码SARS-CoV病毒的S蛋白。

4.根据权利要求2的核酸，其编码如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。

5.一种载体，其含有根据权利要求1-4中任一项的分离的核酸。

6.根据权利要求5的载体，其中所述载体是质体转化载体。

7.根据权利要求6的载体，其中所述载体是pCV1或pCV6，其中pCV1的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，pCV6的核酸序列如SEQID NO：9所示。

8.根据权利要求5的载体，其中所述载体是核转化载体。

9.根据权利要求8的载体，其中所述载体是pCV2或pCV12，其中pCV2的核酸序列如SEQ ID NO：8所示，pCV12的结构如图12所示。。

10.含有根据权利要求1-4中任一项的分离的核酸的植物细胞。

11.根据权利要求10的植物细胞，其中所述植物选自由烟草，莴苣，番茄，马铃薯，香蕉，玉米，稻，小麦，大麦，苹果，梨，草莓，胡萝卜，甜菜，薯蓣，奇异果，或菠菜组成的组的植物。

12.含有根据权利要求5-9中任一项的的载体的植物细胞。

13.一种免疫抗SARS的药品，所述药品中包含植物，其中所述植物含有根据权利要求1-4中任一项的分离的核酸，或所述植物含有根据权利要求5-9中任一项的载体。

14.根据权利要求13的药品，其中所述药品是口服给药的剂型。

15.根据权利要求13的药品，其中所述药品为人服用的剂型。

16.一种免疫抗SARS的药品，其包括根据权利要求5-9中任一项的的载体和可接受的药用载体。

17.根据权利要求16的药品，其中所述药品为人服用的剂型。

18.一种植物在制备免疫抗SARS的药品中的用途，其中所述植物含有如权利要求1-4中定义的核酸。

19.根据权利要求18的用途，其中所述药品是口服给药的剂型。

20.含有由权利要求10的植物细胞产生的SARS-CoV病毒抗原的组合物。

21.含有由权利要求12的植物细胞产生的SARS-CoV病毒抗原的组合物。

22.含有由权利要求18中定义的植物产生的SARS-CoV病毒抗原的组合物。

23.一种用抗体检测样品中的对SAR-CoV病毒抗原的试剂盒，包括：

(a)使所述样品与权利要求20的组合物接触；并

(b)检测与权利要求20的组合物结合的抗体的存在，从而检测对SAR-CoV病毒抗原的抗体。

24.根据权利要求23的试剂盒，其中所述样品是生物流体。

25.根据权利要求24的试剂盒，其中所述生物流体是血液，血清，血浆，唾液，尿，粪便，痰，鼻咽吸出物，细胞或组织。

26.一种用抗体检测样品中的对SAR-CoV病毒抗原的试剂盒，包括：

(a)使所述样品与权利要求21的组合物接触；并

(b)检测与权利要求21的组合物结合的抗体的存在，从而检测对SAR-CoV病毒抗原的抗体。

27.根据权利要求26的试剂盒，其中所述样品是生物流体。

28.根据权利要求27的试剂盒，其中所述生物流体是血液，血清，血浆，唾液，尿，粪便，痰，鼻咽吸出物，细胞或组织。

29.一种用抗体检测样品中的对SAR-CoV病毒抗原的试剂盒，包括：

(a)使所述样品与权利要求22的组合物接触；并

(b)检测与权利要求22的组合物结合的抗体的存在，从而检测对SAR-CoV病毒抗原的抗体。

30.根据权利要求29的试剂盒，其中所述样品是生物流体。

31.根据权利要求30的试剂盒，其中所述生物流体是血液，血清，血浆，唾液，尿，粪便，痰，鼻咽吸出物，细胞或组织。

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