JP2016526884A

JP2016526884A - 植物内のタンパク質産生

Info

Publication number: JP2016526884A
Application number: JP2016519668A
Authority: JP
Inventors: リチャードシー．ピート，; カイロメンス，; ロバートクレチアン，; フアヤン，; 照子大隅
Original assignee: ジェイ．アール．シンプロットカンパニー
Priority date: 2013-06-14
Filing date: 2014-06-13
Publication date: 2016-09-08
Also published as: CN105452470A; EP3008188A1; US20160138033A1; WO2014201321A1; RU2016100762A; AU2014278053A1; JP2017055773A; CA2915122A1; US9803211B2; EP3008188A4; KR20160023703A; BR112015031236A2

Abstract

本開示は、安全かつ制御された様式において植物内で異種ペプチド及びタンパク質を産生するための方法及び構築物に関する。本発明の一態様は、目的のタンパク質又はペプチドをコード化する遺伝子及びマーカー遺伝子、パタチン発現を抑制することができるヌクレオチド配列を、ＣＤ４Ｂ発現を抑制することができるヌクレオチド配列、及び／又はＰ１９を過剰発現することができるヌクレオチド配列と共に含む、発現カセットを使用して、形質転換されたジャガイモ植物内で異種タンパク質を産生する方法を提供する。本発明の別の態様は、目的のタンパク質又はペプチドをコード化する遺伝子、マーカー遺伝子、輸送ペプチド配列、及びＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ発現を抑制することができるヌクレオチド配列を含む、発現カセットを使用して、形質転換されたジャガイモ植物内で異種タンパク質を産生する方法を提供する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、参照により全体が本明細書に組み込まれる、２０１３年６月１４日出願の仮出願である米国出願第６１／８３５，２７４号の優先権を主張する。

（発明の分野）
本開示は、分子生物学、及び植物細胞中のタンパク質合成に関する。より具体的には、本開示は、植物内で目的のペプチド又はタンパク質を産生するための方法及び構築物を提供する。本出願で引用される全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。

近年まで、有機小分子から誘導される抗生物質、鎮痛剤、及びホルモンなどの医薬品は、主に合成的に又は微生物中で産生されていた。しかしながら、ゲノミクス及びプロテオミクスの発展に伴い、新たな薬物療法は、より巨大なタンパク分子を必要とする。タンパク質は細胞生物学及び発達において主要な役割を果たすため、多くのタンパク質が治療的な潜在性を有する。

アミノ酸約３０個の短いペプチド鎖は合成することができるが、より巨大なタンパク質は、生細胞によって産生するのが最良である。現在、多くの巨大タンパク質は、不稔性の微生物及び哺乳動物細胞培養物を使用して産生される。しかしながら、細胞培養系は高価であり維持に手間がかかるため、植物ベースの発現系は、より低い生産コスト、及びより管理しやすい大規模生産を提供する。

本発明の１つの目標は、ジャガイモ植物内で目的の異種ペプチド又はタンパク質を産生するための方法を提供することである。本発明の一態様は、形質転換されたジャガイモ植物内で異種タンパク質を産生する方法であって、（ａ）発現カセットで植物を形質転換する工程であって、該発現カセットが、（ｉ）パタチン発現を抑制することができるヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＣＤ４Ｂ発現を抑制することができるヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）マーカー遺伝子、及び（ｉｖ）目的のタンパク質又はペプチドをコード化する遺伝子を含む、工程と、（ｂ）形質転換された植物を規定条件下で栽培する工程と、（ｃ）目的のタンパク質を抽出する工程と、を含む、方法を提供する。また、パタチン発現を抑制することができるヌクレオチド配列が、配列番号３及び配列４に記載されるパタチンのアンチセンス配列及びセンス配列を含む、方法も提供される。ＣＤ４Ｂ発現を抑制することができるヌクレオチド配列が、配列番号５及び配列番号６に記載されるＣＤ４Ｂのアンチセンス配列及びセンス配列を含む、別の方法もまた提供される。本方法はまた、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＵＳ、ＬＵＸ、ＣＡＨ、ＳＰＴ、ＮＰＴＩＩ、ＨＰＴ、ＡＰＨＩＶ、ＢＡＲ、ＰＡＴ、ＣＨＳ、ＡＨＡＳ、及びフラボノイド合成遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子を含み得る。

また、目的のタンパク質が、インターロイキン−２、ヒルジン、インスリン、インターフェロン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、エリスロポエチン、上皮成長因子、炭疽ワクチン、コレラワクチン、ＤＰＴワクチン、ヒブワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン、ＨＰＶワクチン、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、ＭＭＲワクチン、ＭＭＲＶワクチン、肺炎球菌ワクチン、肺炎球菌多糖体ワクチン、ポリオワクチン、ロタウイルスワクチン、天然痘ワクチン、結核ワクチン、腸チフスワクチン、黄熱ワクチン、パルボウイルスワクチン、ジステンパーワクチン、アデノウイルスワクチン、パラインフルエンザワクチン、ボルデテラワクチン、狂犬病ワクチン、レプトスピラ症ワクチン、ライム病ワクチン、コロナワクチン、回虫／鉤虫ワクチン、駆虫剤ワクチン、ＲＮＦＮワクチン、及びＨＩＶワクチンからなる群から選択される方法も提供される。

本発明の別の態様は、形質転換されたジャガイモ植物内で異種タンパク質を産生する方法であって、（ａ）発現カセットで植物を形質転換する工程であって、該発現カセットが、（ｉ）パタチン発現を抑制することができるヌクレオチド配列、（ｉｉ）Ｐ１９を過剰発現することができるヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）マーカー遺伝子、及び（ｉｖ）目的のタンパク質又はペプチドをコード化する遺伝子を含む、工程と、（ｂ）形質転換された植物を規定条件下で栽培する工程と、（ｃ）目的のタンパク質を抽出する工程と、を含む、方法である。また、パタチン発現を抑制することができるヌクレオチド配列が、配列番号３及び配列４に記載されるパタチンのアンチセンス配列及びセンス配列を含む、方法も提供される。Ｐ１９を過剰発現することができるヌクレオチド配列が、配列番号２に記載されるＰ１９配列を含む、別の方法もまた提供される。本方法はまた、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＵＳ、ＬＵＸ、ＣＡＨ、ＳＰＴ、ＮＰＴＩＩ、ＨＰＴ、ＡＰＨＩＶ、ＢＡＲ、ＰＡＴ、ＣＨＳ、ＡＨＡＳ、及びフラボノイド合成遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子を含み得る。

また、目的のタンパク質が、インターロイキン−２、ヒルジン、インスリン、インターフェロン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、エリスロポエチン、上皮成長因子、炭疽ワクチン、コレラワクチン、ＤＰＴワクチン、ヒブワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン、ＨＰＶワクチン、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、ＭＭＲワクチン、ＭＭＲＶワクチン、肺炎球菌ワクチン、肺炎球菌多糖体ワクチン、ポリオワクチン、ロタウイルスワクチン、天然痘ワクチン、結核ワクチン、腸チフスワクチン、黄熱ワクチン、パルボウイルスワクチン、ジステンパーワクチン、アデノウイルスワクチン、パラインフルエンザワクチン、ボルデテラワクチン、狂犬病ワクチン、レプトスピラ症ワクチン、ライム病ワクチン、コロナワクチン、回虫／鉤虫ワクチン、駆虫剤ワクチン、ＲＮＦＮワクチン、及びＨＩＶワクチンからなる群から選択される、方法も提供される。

本発明の別の態様は、形質転換されたジャガイモ植物内で異種タンパク質を産生する方法であって、（ａ）発現カセットで植物を形質転換する工程であって、該発現カセットが、（ｉ）パタチン発現を抑制することができるヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＣＤ４Ｂ発現を抑制することができるヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）Ｐ１９を過剰発現することができるヌクレオチド配列、（ｉｖ）マーカー遺伝子、及び（ｖ）目的のタンパク質又はペプチドをコード化する遺伝子を含む、工程と、（ｂ）形質転換された植物を規定条件下で栽培する工程と、（ｃ）目的のタンパク質を抽出する工程と、を含む、方法である。また、パタチン発現を抑制することができるヌクレオチド配列が、配列番号３及び配列４に記載されるパタチンのアンチセンス配列及びセンス配列を含む、方法も提供される。ＣＤ４Ｂ発現を抑制することができるヌクレオチド配列が、配列番号５及び配列番号６に記載されるＣＤ４Ｂのアンチセンス配列及びセンス配列を含む、方法もまた提供される。Ｐ１９を過剰発現することができるヌクレオチド配列が、配列番号２に記載されるＰ１９配列を含む、別の方法もまた提供される。本方法はまた、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＵＳ、ＬＵＸ、ＣＡＨ、ＳＰＴ、ＮＰＴＩＩ、ＨＰＴ、ＡＰＨＩＶ、ＢＡＲ、ＰＡＴ、ＣＨＳ、ＡＨＡＳ、及びフラボノイド合成遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子を含み得る。

追加の実施形態では、本発明は、形質転換されたジャガイモ植物内で異種タンパク質を産生する方法であって、（ａ）発現カセットで植物を形質転換する工程であって、該発現カセットが、（ｉ）ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）発現を抑制することができるヌクレオチド配列、（ｉｉ）輸送ペプチド、（ｉｉｉ）マーカー遺伝子、及び（ｉｖ）目的のタンパク質又はペプチドをコード化する遺伝子を含む、工程と、（ｂ）形質転換された植物を規定条件下で栽培する工程と、（ｃ）目的のタンパク質を抽出する工程と、を含む、方法を提供する。

好ましい実施形態では、ＡＧＰ発現を抑制することができるヌクレオチド配列は、配列番号１０及び配列番号１１に記載されるアンチセンス又はセンスＡＧＰ配列を含む。好ましくは、ＡＧＰ発現の抑制は、収束性（convergent）プロモーターによって駆動される。本発明の好ましい態様では、収束性プロモーターは、顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）プロモーター及びＡＧＰプロモーターである。

また、輸送ペプチドが、配列番号８に記載されるＧＢＳＳ輸送ペプチド、又は配列番号９に記載されるＲｕＢｉｓＣｏ輸送ペプチドである、方法も提供される。本発明の方法はまた、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＵＳ、ＬＵＸ、ＣＡＨ、ＳＰＴ、ＮＰＴＩＩ、ＨＰＴ、ＡＰＨＩＶ、ＢＡＲ、ＰＡＴ、ＣＨＳ、ＡＨＡＳ、及びフラボノイド合成遺伝子からなる群から選択されるマーカー遺伝子を含み得る。

好ましくは、目的のタンパク質は、インターロイキン−２、ヒルジン、インスリン、インターフェロン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、エリスロポエチン、上皮成長因子、炭疽ワクチン、コレラワクチン、ＤＰＴワクチン、ヒブワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン、ＨＰＶワクチン、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、ＭＭＲワクチン、ＭＭＲＶワクチン、肺炎球菌ワクチン、肺炎球菌多糖体ワクチン、ポリオワクチン、ロタウイルスワクチン、天然痘ワクチン、結核ワクチン、腸チフスワクチン、黄熱ワクチン、パルボウイルスワクチン、ジステンパーワクチン、アデノウイルスワクチン、パラインフルエンザワクチン、ボルデテラワクチン、狂犬病ワクチン、レプトスピラ症ワクチン、ライム病ワクチン、コロナワクチン、回虫／鉤虫ワクチン、駆虫剤ワクチン、ＲＮＦＮワクチン、及びＨＩＶワクチンからなる群から選択される。

前述の概要並びに詳細な説明は、例示及び説明のためのものであり、特許請求される本発明の更なる説明を提供するものである。本発明の詳細な理解のために、添付の図面と併せた、以下の好ましい実施形態の詳細な説明を参照する。他の目標、利点、及び新規の特徴は、以下の本発明の詳細な説明から当業者にとって容易に明確になるであろう。

ＧＵＳ遺伝子及びＧＵＳ遺伝子サイレンシング構築物ｐＳＩＭ７８９の両方を含有する植物の組織化学的に染色されたタバコ葉パンチ。四角で囲まれた葉試料は、染色されたＧＵＳ陽性対照（上）及び野生型（下）の植物を示す。ジャガイモのカテコールアッセイの結果を示す。ポリフェノールオキシダーゼ５（ＰＰＯ５）遺伝子をサイレンシングするために設計されたサイレンシング構築物を含有するトランスジェニック系統Ｆ１０の塊茎は、非形質転換対照の塊茎（上部の初めの４つの試料）と比較して低減されたポリフェノールオキシダーゼ５活性を示した。非形質転換のジャガイモ（左）、並びにクロロゲン酸、アントシアニン、及びフラボノールの合成の４倍の増加を誘起するクロロゲン酸誘導因子（ＣＡＩ）遺伝子を過剰発現するジャガイモ（右）の塊茎。ＰＰＯ５遺伝子サイレンシングのノーザンブロット解析。ＰＰＯ５遺伝子がサイレンシングされたトランスジェニック植物及び対照の温室栽培された塊茎組織から、全ＲＮＡ（２０μｇ）を単離し、ＰＰＯ５プローブ（上パネル）及び内部基準１８ＳｒＲＮＡプローブ（中パネル）とハイブリダイズした。転写物の予測された大きさは、１．９５−ｋｂであった（Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号Ｕ２２９２１参照）。下パネルは、臭化エチジウム（ＥＢ）で可視化された全ＲＮＡの量を示す。ＥＣ、ＦＣ、ＪＣ、ＧＣ、及びＨＣは、非形質転換の従来の種類の対照試料である。個別のトランスジェニック事象試料は、各レーンの上に標示される。このデータは、黒斑挫傷耐性が、ＰＰＯ５遺伝子の有効なサイレンシングに関連することを実証する（例えば、Ｒｏｍｍｅｎｓ，Ｃ．Ｍ．，Ｙｅ，Ｊ．，Ｒｉｃｈａｅｌ，Ｃ．，Ｓｗｏｒｄｓ，Ｋ．，２００６，ＪＡｇｒｉｃＦｏｏｄＣｈｅｍ５４：９８８２〜９８８７を参照されたい）。トランスジェニックジャガイモ内のＶＴＣ２遺伝子発現のノーザンブロット解析。トランスジェニック事象及び対照の温室栽培された塊茎組織（Ｃ１〜Ｃ８）から全ＲＮＡ（２０μｇ）を単離し、ＶＴＣ２プローブ（上パネル）とハイブリダイズした。下パネルは、臭化エチジウム（ＥＢ）で可視化された全ＲＮＡの量を示す。ジャガイモ茎外植片内のＧＦＰ遺伝子発現。ジャガイモ植物を、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子で形質転換した。強い構成型プロモーターで過剰発現したとき、トランスジェニックジャガイモ植物内で高レベルのＧＦＰ発現を見ることができた。非形質転換のジャガイモの花、葉、及び茎と比較したときの、トランスジェニックジャガイモの花、葉、及び茎内の高レベルのＧＵＳ遺伝子発現。最適な遺伝子発現を支持する部位への目的の遺伝子（例えばＧＦＰ）の転位のための、同時形質転換構築物。制御ベクターｐＳＩＭ１９０３のマップ。Ｔ−ＤＮＡ境界内に２×３５Ｓプロモーター駆動Ｐ１９Ｒ４３（配列番号２）Ｐ１９変異体を含有するベクターｐＳＩＭ１９２７のマップ。選択されたｐＳＩＭ１９２７系統のＧＦＰ定量。Ｐ１９Ｒ４３を過剰発現する３３個の系統を、ｐＳＩＭ１９０３ベクター（図９）で元々形質転換されたＧＦＰ（配列番号７）を過剰発現する親材料から生成した。全系統が、明白な多面発現性効果を伴わずに温室内で正常に成長した。トランスジェニック系統の塊茎特異的ＧＦＰ蓄積について、空ベクター系統（ｐＳＩＭ１３６１）及び親系統（ｐＳＩＭ１９０３）と比較して、視覚的にスクリーニングした。高いＧＦＰ発現を示す１２個の系統を、ＧＦＰ定量のために選択した。空ベクター系統における量と比較して、ＧＦＰ量の２０〜６０％の増加が、１２個のトランスジェニック系統のうちの１０個で検出された。選択されたｐＳＩＭ１９２７系統のウェスタンブロット解析。Ｐ１９Ｒ４３を過剰発現する３３個の系統を、ｐＳＩＭ１９０３ベクター（図９）で元々形質転換されたＧＦＰ（配列番号７）を過剰発現する親材料から生成した。全系統が、明白な多面発現性効果を伴わずに温室内で正常に成長した。トランスジェニック系統の塊茎特異的ＧＦＰ蓄積について、空ベクター系統（ｐＳＩＭ１３６１）及び親系統（ｐＳＩＭ１９０３）と比較して、視覚的にスクリーニングした。高いＧＦＰ発現を示す１２個の系統を、ウェスタンブロット解析のために選択した。空ベクター系統における量と比較して、ＧＦＰ量の２０〜６０％の増加が、１２個のトランスジェニック系統のうちの１０個で検出された。選択されたｐＳＩＭ１９２７系統のノーザンブロット解析。Ｐ１９Ｒ４３を過剰発現する３３個の系統を、ｐＳＩＭ１９０３ベクター（図９）で元々形質転換されたＧＦＰ（配列番号７）を過剰発現する親材料から生成した。全系統が、明白な多面発現性効果を伴わずに温室内で正常に成長した。トランスジェニック系統の塊茎特異的ＧＦＰ蓄積について、空ベクター系統（ｐＳＩＭ１３６１）及び親系統（ｐＳＩＭ１９０３）と比較して、視覚的にスクリーニングした。Ｐ１９遺伝子の発現を確認するため、高いＧＦＰ発現を示す７個の系統からのＲＮＡを、Ｐ１９プローブを用いて分析した。最高のＧＦＰ発現を有する２個の系統を含む３個の系統で、Ｐ１９転写物が検出された。ＲＮＡサイレンシングの変異ｐ１９抑制因子の発現をＧＦＰタンパク質の上昇した発現と関連付けるこれらの結果は、ＲＮＡサイレンシングの抑制因子であるＰ１９の抑制が、植物内のタンパク質産生を向上させることを実証する。パタチン遺伝子サイレンシングカセットを含有するベクターｐＳＩＭ１９３４のマップ。ｐＳＩＭ１９３４系統のＧＦＰ定量。３０個のｐＳＩＭ１９３４トランスジェニック系統を、ｐＳＩＭ１９０３ベクター（図９）で元々形質転換されたＧＦＰ（配列番号７）を過剰発現する親材料から生成した。１３６１とマークされたレーンは空ベクター対照を意味し、１９０３とマークされたレーンはＧＦＰ親対照である。ＧＦＰ蓄積は、ｐＳＩＭ１９３４の実験系統のいずれにおいても観察されなかった。選択されたｐＳＩＭ１９３４系統のＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタン解析。３０個のｐＳＩＭ１９３４トランスジェニック系統を、ｐＳＩＭ１９０３ベクター（図９）で元々形質転換されたＧＦＰ（配列番号７）を過剰発現する親材料から生成した。１９０３とマークされたレーンはＧＦＰ親対照であり、１３６１＋１９０３とマークされたレーンは空ベクター対照とＧＦＰ親対照との組み合わせを意味する。１０個の系統では、過半量のパタチンタンパク質（約４０ｋＤａのバンド）がサイレンシングによって排除された。ＣＤ４Ｂサイレンシングカセットを含有するベクターｐＳＩＭ１９３９のマップ。選択されたｐＳＩＭ１９３９系統のＧＦＰ定量。２６個のｐＳＩＭ１９３９トランスジェニック系統を、ｐＳＩＭ１９０３ベクター（図９）で元々形質転換されたＧＦＰ（配列番号７）を過剰発現する親材料から生成した。１３６１とマークされたレーンは空ベクター対照を意味し、１９０３とマークされたレーンはＧＦＰ親対照である。７個のトランスジェニック系統が、親系統（ｐＳＩＭ１９０３）と比較して２〜３倍のＧＦＰ蓄積の増加を示した。選択されたｐＳＩＭ１９３９系統のノーザンブロット解析。２６個のｐＳＩＭ１９３９トランスジェニック系統を、ｐＳＩＭ１９０３ベクター（図９）で元々形質転換されたＧＦＰ（配列番号７）を過剰発現する親材料から生成した。１３６１とマークされたレーンは空ベクター対照を意味し、１９０３とマークされたレーンはＧＦＰ親対照である。親系統（ｐＳＩＭ１９０３）と比較して２〜３倍のＧＦＰ蓄積の増加を示した７個のトランスジェニック系統のノーザンブロット解析は、いずれの系統においてもＣＤ４Ｂ転写物を検出できず、したがってＣＤ４Ｂ遺伝子サイレンシングを確証した。これらの結果は、ＣＤ４Ｂプロテアーゼのサイレンシングを組み換えタンパク質（ＧＦＰ）産生の２〜３倍の増加と関連付け、ＣＤ４Ｂの塊茎特異的なサイレンシングが組み換えタンパク質産生を向上させるために使用され得ることを実証する。ｐＳＩＭ１９４９−２ｘ３５Ｓ：ＥＧＦＰ遺伝子制御ベクターのマップ。ベクターｐＳＩＭ１９４７のマップ。ｐＳＩＭ１９４７は、２×３５Ｓ：ＧＢＳＳ^ＴＰ−ｅＧＦＰカセット及びＧＢＳＳ−＞ｓＡＧＰ＜−ＡＧＰカセットを担持する。ＧＦＰ発現はＧＢＳＳ輸送ペプチドによって駆動され、ＡＧＰサイレンシングは、１つの方向からＧＢＳＳプロモーターによって、そして反対方向からＡＧＰプロモーターによって駆動される。ベクターｐＳＩＭ１９４８のマップ。ｐＳＩＭ１９４８は、２×３５Ｓ：Ｒｂｃｓ^ＴＰ−ｅＧＦＰカセット及びＧＢＳＳ−＞ｓＡＧＰ＜−ＡＧＰカセットを担持する。ＧＦＰ発現はＲｕＢｉｓＣｏ輸送ペプチドによって駆動され、ＡＧＰサイレンシングは、１つの方向からＧＢＳＳプロモーターによって、そして反対方向からＡＧＰプロモーターによって駆動される。ジャガイモの幼葉内のＧＦＰ発現。ジャガイモ植物を、ｐＳＩＭ１９４７（図２１）又はｐＳＩＭ１９４８（図２２）で形質転換した。ＧＦＰを強く発現するインビトロで成長するトランスジェニック苗条を、蛍光顕微鏡法を使用して選択し、ＧＦＰ発現を、制御ベクターｐＳＩＭ１９４９（図２０）で形質転換された対照系統と比較して評価した。左パネルは、白色光下の葉を示し、右パネルは、ＧＦＰフィルタ有りの葉を示す。強いＧＦＰ発現が、トランスジェニックｐＳＩＭ１９４７小植物の葉内で検出された。ｐＳＩＭ１９４８小植物内のＧＦＰ発現は、対照系統内のＧＦＰ発現よりも僅かに強いのみであった。これらの結果は、同時に起こる、ＧＢＳＳ輸送ペプチドを用いるタンパク質過剰発現、及び収束性プロモーターによるＡＧＰサイレンシングが、組み換えタンパク質産生の向上に有効であることを示す。ＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍパタチンＥＲ輸送ペプチド（Ｎ末端）とＥＲ保留シグナル（Ｃ末端）との間に配置されるヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）の短縮版。ＥＲ−ＩＬ−２カセットを含有し、開始コドンの前にＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩ制限部位を、そして終止コドンの後にＳｐｅＩ部位を有する、ＤＮＡ２．０ベクター。ヒスチジンタグ付きヒトＩＬ発現カセットを含有するベクターｐＳＩＭ１９３６のマップ。ＥＲ標的化したコドン最適化ＩＬ−２変異型を含有するｐＳＩＭ１９３６ベクターで形質転換されたビンチェ（Bintje）ジャガイモ系統の塊茎内のＩＬ−２産生。１９３６−１８レーンは非最適化陽性対照を表す。各変異型について、２５個の独立したトランスジェニック系統を生成した。各色は、形質転換に使用されたコドン最適化ＩＬ−２変異型を表す。各バーは、独立したトランスジェニック系統からの３個の個別の塊茎内のＩＬ−２の平均レベルを表す。結果は、コドン最適化変異型のうちの２つから得られた特定のトランスジェニック系統内で、ＩＬ−２産生が２〜３倍増加したことを示す。ＥＲ標的化したコドン最適化ＩＬ−２変異型を含有するｐＳＩＭ１９３６ベクターで形質転換されたビンチェ（Bintje）ジャガイモ系統の塊茎内のＩＬ−２産生。１９３６−１８レーンは非最適化陽性対照を表す。各変異型について、２５個の独立したトランスジェニック系統を生成した。各色分類は、形質転換に使用されたコドン最適化ＩＬ−２変異型を表す。各バーは、独立したトランスジェニック系統からの３個の個別の塊茎内のＩＬ−２の平均レベルを表す。結果は、異なるコドン変異型から得られた特定のトランスジェニック系統内で、ＩＬ−２産生が２．５倍増加したことを示す。ＧＦＰ発現によって測定される異種タンパク質産生についての、異なるサイレンシング、過剰発現、及び標的化方策の効果を示す。１０個の系統を分析したＣＤ４Ｂサイレンシングを除いて、各方策につき２５個の系統を分析した。各バーは、ＧＦＰ発現について分析された３つの個別の塊茎を表す。各色は、以下のように、異なるサイレンシング、過剰発現、又は標的化方策に対応する：赤色のバー：ＣＤ４Ｂのサイレンシング。橙色のバー：ＣＤ４Ｂ及びパタチンのサイレンシング。黄色のバー：ＣＤ４Ｂ及びパタチンのサイレンシング、並びにＰ１９の過剰発現。緑色のバー：ＧＢＳＳプロモーター及び収束性ＡＧＰプロモーターを使用するＡＧＰのサイレンシング；ＧＦＰ発現は、顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＢＳ）輸送ペプチドによって色素体に標的化された。青色のバー：ＧＢＳＳプロモーター及び収束性ＡＧＰプロモーターを使用するＡＧＰのサイレンシング；ＧＦＰ発現は、ＲｕＢｉｓＣｏ輸送ペプチドによって葉緑体に標的化された。灰色のバー：ＧＢＳＳプロモーター及び収束性ＡＧＰプロモーターを使用するＡＧＰのサイレンシング。オリーブグリーン色のバー：２×３５Ｓ：ＥＧＦＰカセットを担持する対照親系統（ｐＳＩＭ１９０３）。紫色のバー：２×３５Ｓ：ＥＧＦＰカセットを担持する対照系統（ｐＳＩＭ１９４９）。ＣＤ４Ｂ及びパタチン（赤色、黄色、及び橙色のバー）又はＣＤ４Ｂのみのサイレンシングは、ＧＦＰ対照と比較してタンパク質レベルを僅かに向上させただけであった。顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＢＳ）輸送ペプチドでＧＦＰ発現を駆動しながらＧＢＳＳプロモーター及び収束性ＡＧＰプロモーターを使用するＡＧＰのサイレンシング（緑色のバー）は、最大４〜６倍の上昇まで、タンパク質レベルを著しく上昇させた。Ｒｕｂｉｓｃｏ（Ｒｂｃｓ）標的化ペプチドでＧＦＰ発現を駆動しながらのＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）のサイレンシング（青色のバー）は、１個の系統内でのみ、著しいタンパク質の増加をもたらした。ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）のサイレンシング（灰色のバー）は、タンパク質発現の著しい増加をもたらし、系統のうちのいくつかでは３倍の増加があった。

配列表の概要
本出願は、電子形式の配列表と共に提出されている。電子形式の配列表中の情報は本出願の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

配列番号１は、ジャガイモ由来のパタチンの配列を記載する。

配列番号２は、Ｐ１９変異体Ｐ１９Ｒ４３の配列を記載する。

配列番号３は、パタチンＰＡＴＢ１のアンチセンス配列を記載する。

配列番号４は、パタチンＰＡＴＢ１のセンス配列を記載する。

配列番号５は、ＣＤ４Ｂのアンチセンス配列を記載する。

配列番号６は、ＣＤ４Ｂのセンス配列を記載する。

配列番号７は、ＥＧＦＰの配列を記載する。

配列番号８は、ＧＢＳＳ輸送ペプチドの配列を記載する。

配列番号９は、ＲｕＢｉｓＣｏ輸送ペプチドの配列を記載する。

配列番号１０は、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）のアンチセンス配列を記載する。

配列番号１１は、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）のセンス配列を記載する。

以下の説明及び実施例では、いくつかの用語が使用される。そのような用語が用いられる範囲を含む本明細書及び特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するため、以下の定義が提供される。定義が提供されない場合、本明細書で使用される他の技術的及び科学的用語の全ては、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

コード化．本明細書で使用される場合、「コード」又は「コード化」は、遺伝子が、転写及び翻訳の機構を通じて、情報を細胞に提供し、この細胞からの一連のアミノ酸が特異的アミノ酸配列へと組み立てられて活性酵素を産生し得る、プロセスを指す。遺伝コードの縮重度のため、ＤＮＡ配列のある特定の塩基の変化は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させない。したがって、タンパク質の機能的特性に実質的に影響を及ぼさないＤＮＡ配列の改変が企図される。

発現．遺伝子によってコード化されるタンパク質産物の産生を意味する。

過剰発現．正常又は非トランスジェニックの生物内での産生のレベルを超える遺伝子産物の、トランスジェニック生物内での産生を指す。

配列同一性の百分率．最適に整列された２つの配列を比較ウィンドウ上で比較することによって決定される値を指し、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列を最適に整列させるために、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。この百分率は、両方の配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が発生する位置の数を決定して、マッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて、配列同一性の百分率を得ることによって算出される。

植物．本明細書で使用される場合、分化若しくは未分化の植物細胞、プロトプラスト、全植物、植物組織、又は植物器官、又は、葉、茎、根、芽、塊茎、果実、根茎などの植物の任意の構成要素を含む、遺伝子操作され得る任意のセルロース含有植物材料を意味する。

発現制御．本明細書で使用される場合、「発現制御」は、タンパク質をコード化する遺伝子の発現を制御することを意味する。その効果は、野生型生物内で典型的に観察されるその発現レベルと比較した、配列の発現レベルの上昇又は低下のいずれかである。

調節．本明細書で使用される場合、「調節」は、タンパク質をコード化する遺伝子の発現を制御することを含む。その効果は、野生型生物内で典型的に観察されるその発現レベルと比較した、配列の発現レベルの上昇又は低下のいずれかである。

発現カセット．本明細書で使用される場合、「発現カセット」は、１つ又は２つ以上の調節エレメント及び１つ又は２つ以上のコード配列を含む、ポリヌクレオチド配列の組み合わせを指す。例えば、調節エレメントはプロモーターであり得る。

遺伝子発現のセンス抑制．本明細書で使用される場合、「遺伝子発現のセンス抑制」は、ポリヌクレオチドを使用して標的遺伝子の発現を低減又は排除することを指す。このポリヌクレオチドは、「センス」配向の標的メッセンジャーＲＮＡの少なくとも一部に対応するＲＮＡ分子を発現するように設計される。ポリヌクレオチドは、標的遺伝子のコード配列の全部又は一部、標的遺伝子の５’及び／若しくは３’非翻訳領域の全部又は一部、又は、標的遺伝子のコード配列及び非翻訳領域の両方の全部又は一部に対応し得る。典型的には、センス抑制エレメントは、標的遺伝子に対する実質的な配列同一性を有する。例えば、それは、約６５％超の配列同一性、約８５％超の配列同一性、又は約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性であり得る。センス抑制のためのポリヌクレオチドは、標的化配列の抑制を可能にする限り、いかなる長さにおけるものでもよい。例えば、それは、１５、３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、９００個のヌクレオチド、又はそれより長いものを含み得る。Ｈａｍｉｌｔｏｎｅｔａｌ．ＣｕｒｒＴｏｐＭｉｃｒｏｂｉｏｌＩｍｍｕｎｏｌ．１９７：７７〜８９（１９９５）及び米国特許第５，２８３，１８４号を参照されたい。

遺伝子発現のアンチセンス抑制．本明細書で使用される場合、「遺伝子発現のアンチセンス抑制」は、ポリヌクレオチドを使用して標的遺伝子の発現を低減又は排除することを指す。このポリヌクレオチドは、標的メッセンジャーＲＮＡの一部又は全部に対して相補性のＲＮＡ分子を発現するように設計される。それは、標的遺伝子をコード化する配列の補体の全部又は一部、標的遺伝子の５’及び／若しくは３’非翻訳領域の補体の全部又は一部、又は、標的遺伝子のコード配列及び非翻訳領域の両方の補体の全部又は一部に対応し得る。更に、アンチセンス抑制エレメントは、標的遺伝子に対して完全に相補性（即ち、標的配列の補体と１００％の同一性）、又は部分的に相補性（即ち、標的配列の補体と１００％未満の同一性）であり得る。例えば、ポリヌクロチドは、標的遺伝子に対して８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の配列相補性を含み得る。アンチセンス抑制は、同じ植物内の複数のタンパク質の発現を阻害するために使用され得る。例えば、米国特許第５，９４２，６５７号を参照されたい。更に、アンチセンス抑制のためのポリヌクレオチドは、標的遺伝子の一部に対して相補性であってよい。一般的に、少なくとも２５、５０、１００、２００、３００、４００、４５０個のヌクレオチド、又はそれを超えるものの配列が使用され得る。アンチセンス抑制を使用して植物内の内因性遺伝子の発現を阻害するための方法は、Ｌｉｕｅｔａｌ．ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．１２９：１７３２〜１７４３（２００２）並びに米国特許第５，７５９，８２９号及び同第５，９４２，６５７号に記載される。

遺伝子発現のＲＮＡ抑制．本明細書で使用される場合、「遺伝子発現のＲＮＡ抑制」は、一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡを使用して標的遺伝子の発現を低減又は排除することを指す。この一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡは、標的メッセンジャーＲＮＡの全部又は一部を相補するように設計される。それは、標的遺伝子をコード化する配列の補体の全部又は一部、標的遺伝子の５’及び／若しくは３’非翻訳領域の補体の全部又は一部、又は、標的遺伝子のコード配列及び非翻訳領域の両方の補体の全部又は一部に対応し得る。一本鎖若しくは二本鎖のＲＮＡは、標的ＲＮＡ転写物のレベルに影響を与えることによって、又は別法として、翻訳に影響を与え、それによってコード化されたポリペプチドのレベルに影響を及ぼすことによって、標的配列の発現レベルを低減又は排除することができる。例えば、米国特許第７，７１３，７３５号、Ｖｅｒｄｅｌｅｔａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ３０３：６７２〜６７６、Ｐａｌ−Ｂｈａｄｒａｅｔａｌ．（２００４）Ｓｃｉｅｎｃｅ３０３：６６９〜６７２、Ａｌｌｓｈｉｒｅ（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９７：１８１８〜１８１９、Ｖｏｌｐｅｅｔａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９７：１８３３〜１８３７、Ｊｅｎｕｗｅｉｎ（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９７：２２１５〜２２１８、及びＨａｌｌｅｔａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２９７：２２３２〜２２３７を参照されたい。

配列同一性．「同一性」とも称され、２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈において、規定の領域にわたる最大の対応のために整列されるとき同じである２つの配列における残基への参照を含む。配列同一性の百分率がタンパク質に関して使用されるとき、同一でない残基位置は、多くの場合、アミノ酸残基が同様の化学特性（例えば電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、したがって分子の機能的特性を変化させない、保存的なアミノ酸置換によって異なると認識される。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質を補正するように上方に調整され得る。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。典型的には、これは、完全ミスマッチではなく部分的ミスマッチとして保存的置換をスコア化し、それによって配列同一性百分率を上昇させることを伴う。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換にゼロのスコアが与えられる場合、保存的置換にはゼロ〜１のスコアが与えられる。保存的置換のスコア化は、例えば、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）によって実装される、例えば、ＭｅｙｅｒｓａｎｄＭｉｌｌｅｒ，ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，４：１１〜１７（１９８８）のアルゴリズムに従って算出される。

目的のペプチド．ペプチドは、典型的には５０個以下のアミノ酸を含有するアミノ酸配列である。例示的かつ非限定的なペプチドとしては、抗菌性ペプチド、病原体のペプチドエピトープ、ダニアレルゲンのエピトープ、ＩＩ型コラーゲン、アミロイドペプチド、トラスツズマブ結合性ペプチド、及び腫瘍に関連する縦列反復が挙げられる。

目的のタンパク質．タンパク質は、典型的には、巨大ポリペプチドを指し、典型的には５０個を超えるアミノ酸を含有する。本明細書で使用される場合、「タンパク質」は、いかなる目的のタンパク質をも含む。例示的かつ非限定的なタンパク質としては、ヒルジン、インスリン、インターフェロン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、エリスロポエチン、上皮成長因子、抗体、並びにヒト及び動物ワクチン（弱毒ウイルス、コートタンパク質、及び癌ワクチンを含む）が挙げられる。

トランスジェニック植物．宿主植物ゲノムに通常は存在しない遺伝子、通常はＲＮＡへと転写されない、若しくはタンパク質へと翻訳（「発現」）されないＤＮＡ配列、又は、非形質転換の植物への導入が所望される任意の他の遺伝子若しくはＤＮＡ配列、例えば、非形質転換の植物内に通常存在し得るが、遺伝子改変すること、若しくは変更された発現を有することが所望される遺伝子などを含むがこれらに限定されない、核酸配列を組み込んでいる植物を指す。「トランスジェニック植物」の分類は、一次形質転換体、及び、例えば、標準的な遺伝質移入又は別の交配手順によって形質転換体をその系列に含む植物の両方を含む。

視覚的表現型．「視覚的表現型」は、植物内で選択可能マーカー遺伝子を発現することによって得ることができる、視覚的に検出可能な特質（例えば色の変化）を有する植物を指す。例示的な選択可能マーカーとしては、カルコンシンターゼ（ＣＨＳ）遺伝子、アントシアニン合成遺伝子、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）遺伝子、及びフラボノイド合成遺伝子が挙げられる。

塊茎．球茎並びに鱗茎が有する基板及びチュニック様被覆を両方欠く、肥厚性の、通常は地中にある、栄養貯蔵器官。根及び苗条は、塊茎の表面上の「目」と呼ばれる芽から成長する。ジャガイモ塊茎は、Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ、Ｓ．ｄｅｍｉｓｓｕｍ、Ｓ．ａｃａｕｌｅ、Ｓ．ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒｕｍ、Ｓ．ｐｈｕｒｅｊａ、Ｓ．ｇｏｎｉｃａｌｙｘ、Ｓ．ｓｔｅｎｏｔｏｍｕｍ、Ｓ．ｂｅｒｔｈａｕｌｔｉｉ、Ｓ．ｂｒｅｖｉｃａｕｌｅ、Ｓ．ｂｕｋａｓｏｖｉｉ、Ｓ．ｃａｎａｓｅｎｓｅ、Ｓ．ｇｏｕｒｌａｙｉ、Ｓ．ｌｅｐｔｏｐｈｙｅｓ、Ｓ．ｍｕｌｔｉｄｉｓｓｅｃｔｕｍ、Ｓ．ｏｐｌｏｃｅｎｓｅ、Ｓ．ｓｐａｒｓｉｐｉｌｕｍ、Ｓ．ｓｐｅｇａｚｚｉｎｉｉ、Ｓ．ｓｕｃｒｅｎｓｅ、Ｓ．ｖｅｎｔｕｒｉｉ、Ｓ．ｖｅｒｎｅｉから生成される。

一実施形態では、目的のペプチド及びタンパク質は、二倍体ジャガイモ植物よりも大きな葉及び塊茎バイオマスをもたらし、かつより早く成長する、四倍体ジャガイモ植物（例えば、Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）内で産生される。別の実施形態では、目的のペプチド及びタンパク質は、小さく、かつ不揃いの形状及び色をした塊茎を生成する、二倍体（２ｎ）ジャガイモ植物内で産生される。例としては、消費のために商業的に栽培される四倍体（４ｎ）の栽培ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）由来のより大きくより均一な塊茎と誤認され得ない、Ｓｏｌａｎｕｍｃｈａｃｏｅｎｓｅ登録番号４１４１５３、４５８３１２、４５８３１４、４７２８１９、４９８２９８、並びにＳｏｌａｎｕｍｍｉｃｒｏｄｏｎｔｕｍ登録番号５０００３３、５０００３５、５０００３６、５０００３８、及び５５８１００が挙げられる。

同様に、出願人は、目的のペプチド又はタンパク質を過剰発現しながら、少なくとも１つの内因性植物タンパク質、例えばジャガイモ塊茎貯蔵タンパク質などを抑制することを含む、制御された様式において植物内でタンパク質を産生するための方法を考案した。例えば、何ら限定するものではないが、出願人は、目的のペプチド又はタンパク質を過剰発現しながらパタチン遺伝子発現を抑制するための発現カセットを考案した。異なる実施形態では、出願人は、目的のペプチド又はタンパク質を過剰発現しながらＡＧＰ発現を抑制するための発現カセットを考案した。そのような植物のヒトによる消費を防止し、目的のタンパク質を含むトランスジェニック植物の選択を容易にするために、発現カセットは、それに基づいて選択がなされ得る独特な色又は他の独特な特性を付与する選択可能マーカー遺伝子を含み得る。更に、誘導性プロモーターが、タンパク質産生を更に調節するために使用され得る。

選択可能マーカー遺伝子としては、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＵＳ、ＬＵＸ、ＣＡＨ、ＳＰＴ、ＮＰＴＩＩ、ＨＰＴ、ＡＰＨＩＶ、ＢＡＲ、ＰＡＴ、ＣＨＳ、ＡＨＡＳ、及びフラボノイド合成遺伝子が挙げられるが、これらに限定されない。

植物内のタンパク質発現を制御するための別の手段において、出願人は、目的のペプチド又はタンパク質を過剰発現しながらプロテアーゼ遺伝子発現を抑制するための発現カセットを考案した。例えば、何ら限定するものではないが、発現カセットを使用して、それによって、プロテアーゼを抑制し、目的のペプチド又はタンパク質を産生することができる。

同様に、制御された様式において植物内でタンパク質を産生するための別の方法において、出願人は、治療用タンパク質を過剰発現しながら、プロテアーゼを抑制することに加えて、少なくとも１つの内因性植物タンパク質、例えばジャガイモ塊茎貯蔵タンパク質などを抑制するための発現カセットを考案した。例えば、何ら限定するものではないが、発現カセットを使用して、それによって、目的のペプチド又はタンパク質を過剰発現しながら、ＣＤ４Ｂなどのプロテアーゼに加えてパタチン遺伝子発現を抑制することができる。

制御された様式において植物内でタンパク質を産生するための別の方法において、出願人は、治療用タンパク質を過剰発現しながら、少なくとも１つの内因性植物タンパク質、例えばジャガイモデンプン生合成タンパク質などの発現を抑制するための発現カセットを考案した。例えば、何ら限定するものではないが、発現カセットを使用して、それによって、目的のペプチド又はタンパク質を過剰発現しながら、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）発現を抑制することができる。

制御された様式において植物内でタンパク質を産生するための更に別の方法において、出願人は、輸送ペプチドを有する目的のタンパク質を過剰発現しながら、少なくとも１つの内因性植物タンパク質、例えばジャガイモデンプン生合成タンパク質などの発現を抑制するための発現カセットを考案した。例えば、何ら限定するものではないが、発現カセットを使用して、それによって、形質転換されたジャガイモ植物の特異的部位における目的のペプチド又はタンパク質の産生を、ＲｕＢｉｓＣｏ輸送ペプチド又はＧＢＳＳ輸送ペプチドなどの輸送ペプチドで標的化しながら、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）発現を抑制することができる。

目的のペプチド及びタンパク質としては、インターロイキン−２、ヒルジン、インスリン、インターフェロン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、エリスロポエチン、上皮成長因子、炭疽ワクチン、コレラワクチン、ＤＰＴワクチン、ヒブワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン、ＨＰＶワクチン、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、ＭＭＲワクチン、ＭＭＲＶワクチン、肺炎球菌ワクチン、肺炎球菌多糖体ワクチン、ポリオワクチン、ロタウイルスワクチン、天然痘ワクチン、結核ワクチン、腸チフスワクチン、黄熱ワクチン、パルボウイルスワクチン、ジステンパーワクチン、アデノウイルスワクチン、パラインフルエンザワクチン、ボルデテラワクチン、狂犬病ワクチン、レプトスピラ症ワクチン、ライム病ワクチン、コロナワクチン、回虫／鉤虫ワクチン、駆虫剤ワクチン、ＲＮＦＮワクチン、リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）、及びＨＩＶワクチンが挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される技術的用語は全て、生化学、分子生物学、及び農業において一般的に使用される用語であり、本発明が属する技術分野の当業者によって理解され得る。それらの技術的用語は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，３ｒｄｅｄ．，ｖｏｌ．１〜３，ｅｄ．ＳａｍｂｒｏｏｋａｎｄＲｕｓｓｅｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００１、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８８（定期的更新を含む）、ＳｈｏｒｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＣｏｍｐｅｎｄｉｕｍｏｆＭｅｔｈｏｄｓｆｒｏｍＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５^ｔｈｅｄ．，ｖｏｌ．１〜２，ｅｄ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００２、ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｓｉｓ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ｖｏｌ．１〜２，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９７に見出すことができる。植物生物学の技術に関する手法は、本明細書に記載され、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＣｏｕｒｓｅＭａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｍａｌｉｇａｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９５などの論文に詳細に記載される。ＰＣＲを使用する様々な技術が、例えば、Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．，ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＡＧｕｉｄｅｔｏＭｅｔｈｏｄｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，ＳａｎＤｉｅｇｏ，１９９０、及びＤｉｅｆｆｅｎｂａｃｈａｎｄＤｖｅｋｓｌｅｒ，ＰＣＲＰｒｉｍｅｒ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２^ｎｄｅｄ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２００３に記載される。ＰＣＲプライマー対は、その目的のために意図されるコンピュータプログラム、例えば、Ｐｒｉｍｅｒ、バージョン０．５，１９９１、ＷｈｉｔｅｈｅａｄＩｎｓｔｉｔｕｔｅｆｏｒＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡの使用などの既知の技術によって、既知の配列から誘導され得る。核酸の化学合成のための方法は、例えば、ＢｅａｕｃａｇｅａｎｄＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔｓ．２２：１８５９〜１８６２（１９８１）、及びＭａｔｔｅｕｃｃｉａｎｄＣａｒｕｔｈｅｒｓ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）に記述される。

制限酵素消化、リン酸化、ライゲーション、及び形質転換は、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，２^ｎｄｅｄ．（１９８９），ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓに記載されるように行われた。バクテリア細胞の成長及び維持に使用された試薬並びに材料は全て、別段の定めがない限り、ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）、ＤＩＦＣＯＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、又はＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から取得した。

「コード化する」及び「コード化」という用語は、遺伝子が、転写及び翻訳の機構を通じて、活性酵素を産生するために一連のアミノ酸を特異的アミノ酸配列へと組み立てることができる情報を、細胞に提供するプロセスを指す。遺伝コードの縮重度のため、ＤＮＡ配列のある特定の塩基の変化は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させない。したがって、タンパク質の機能的特性に実質的に影響を及ぼさないＤＮＡ配列の改変が企図される。

本説明では、「発現」は、遺伝子によってコード化されるタンパク質産物の産生を意味する。「過剰発現」は、正常又は非トランスジェニックの生物内での産生のレベルを超える遺伝子産物の、トランスジェニック生物内での産生を指す。

本発明の更なる実施形態
上記の例示的な態様及び実施形態に加えて、更なる態様及び実施形態が、以下の説明を検討することによって当業者に明らかとなるであろう。

Ａ．例示的なタンパク質
任意のタンパク質が、本構築物及び手法を使用して発現又は抑制され得る。

任意のタンパク質が、本発明の方法に従って、ＲＮＡｉ、アンチセンス、挿入変異誘発、及び当該技術分野で既知の他の技術などの様々な技術を使用して抑制され得る。特に、出願人は、目的の治療用タンパク質を同時に過剰発現しながら、プロテアーゼ、貯蔵タンパク質、又はデンプン生合成タンパク質を抑制する工程を含む方法を考案した。非限定的な例では、プロテアーゼは、ＲＮＡｉによって抑制され、植物の正常な成長及び発達に不利に干渉しないように、誘導性プロモーターを使用して制御され得る。

例示的なプロテアーゼ配列としては、表１に開示される内因性ジャガイモプロテアーゼ配列が挙げられるが、これらに限定されない。

追加の例示的なプロテアーゼは、ＣＤ４Ｂ、葉緑体に見出されるＡＴＰ依存性プロテアーゼＡＴＰ結合サブユニットｃｌｐＡ相同体である。Ｃｌｐプロテアーゼは、キモトリプシン様活性を有し、ミスフォールディングタンパク質の分解において主要な役割を果たす。Ｄａｎｉｅｌｌｅｔａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１１２Ｌ１５０３〜１５１８（２００６）を参照されたい。本発明によれば、ジャガイモ内のＣＤ４Ｂのサイレンシングは、ＣＤ４Ｂがサイレンシングされていないジャガイモと比較して、より高レベルのタンパク質産生をもたらす。

パタチンは、Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ（配列番号１に記載される配列）に見出される糖タンパク質である。パタチンの主な機能は、貯蔵タンパク質としてのものである。パタチンは、ジャガイモ塊茎内の可溶性タンパク質の最大４０％を構成するが、それよりはるかに低いレベルで他の植物器官内にも存在する。Ｈｏｆｇｅｎｅｔａｌ．ＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，６６：２２１〜２３０，（１９９０）を参照されたい。

本発明によれば、ジャガイモ内のＡＤＰグルコースピロホスホリアラーゼ（ＡＧＰ）のサイレンシングは、ＡＧＰがサイレンシングされていないジャガイモと比較して、より高レベルのタンパク質産生をもたらす。ＡＧＰは、植物内のデンプンの生合成における前駆体であるＡＤＰグルコースを産生する。本発明の構築物は、ＡＧＰのサイレンシングが反対方向から２つのプロモーターによって駆動されるように、２つの収束性プロモーターに作動可能に連結された完全長のＡＧＰ配列又はその断片を含み得る。本発明の特定の態様では、ＧＢＳＳプロモーターが１つの方向からＡＧＰサイレンシングを駆動し、ＡＧＰプロモーターが反対方向からＡＧＰサイレンシングを駆動する。

追加の実施形態では、本発明に従うタンパク質産生は、１つ又は２つ以上の内因性タンパク質、例えばパタチン、ＣＤ４Ｂ、ＡＧＰ、又はそれらの任意の組み合わせなどの発現を抑制しながら、転写後の遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）のウイルス抑制因子を過剰発現することによって、更に向上し得る。好ましいＰＴＧＳのウイルス抑制因子は、タバコブラッシースタントウイルスサイレンシング抑制因子Ｐ１９である。ＰＴＧＳは、ＲＮＡサイレンシングによって遺伝子発現を防止し、ひいては植物内のアグロバクテリウム（Agrobacterium）媒介性形質転換効率を制限する、ヌクレオチド配列特異的ＲＮＡである。本出願の発明者は、驚くべきことに、同時に起こるＰ１９の過剰発現及び１つ又は２つ以上のジャガイモ内因性タンパク質の抑制が、ジャガイモ塊茎内の外因性のタンパク質産生を劇的に向上させることを発見した。

任意のタンパク質が、上記の本発明のサイレンシング構築物を使用して発現又は過剰発現され得る。本発明の好ましい態様では、輸送ペプチドが、形質転換された植物の所望の部位におけるタンパク質産生を向上させるために使用され得る。好適な輸送ペプチドとしては、ＧＢＳＳ輸送ペプチド及びＲｕＢｉｓＣｏ輸送ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、何ら限定するものではないが、本発明の構築物は、１つ又は２つ以上の内因性タンパク質、例えばパタチン、ＣＤ４Ｂ、ＡＧＰ、又はそれらの任意の組み合わせなどの発現を抑制しながら、ジャガイモ植物内の目的のタンパク質又はペプチドを過剰発現する。

例えば、何ら限定するものではないが、本手法及び構築物を使用して発現され得るタンパク質は、インターロイキン−２、ヒルジン、インスリン、インターフェロン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、エリスロポエチン、上皮成長因子、単鎖抗体などの抗体、並びにヒト及び動物ワクチン（弱毒ウイルス、コートタンパク質、及び癌ワクチンを含む）である。

インターロイキン−２は、正常な末梢血リンパ球によって産生されるリンホカインであり、抗原又は他の刺激への曝露後に、抗原又はマイトジェンで刺激されたＴ細胞の増殖を誘導する。Ｍｏｒｇａｎｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ１９３：１００７〜１００８（１９７６）を参照されたい。それは、刺激されたＴリンパ球の増殖を誘導するその能力のため、初期にはＴ細胞成長因子と呼ばれたが、現在は、その成長因子特性に加えて、インビトロ及びインビボで免疫系細胞の様々な機能を調節することが認識され、インターロイキン−２（ＩＬ−２）と新たに命名されている。ＩＬ−２は、免疫細胞の相互作用及び機能を媒介するいくつかのリンパ球産生性メッセンジャー調節分子のうちの１つである。ＩＬ−２は、以下の実施例において例証されるように、本明細書に記載される手法を使用して、植物内で産生され得る。

ヒルジンは、医療用ヒル（例えばＨｉｒｕｄｏｍｅｄｉｃｉｎａｌｉｓなど）の唾液腺内の自然発生ペプチドである。ヒルジンは、抗凝血特性を有し、これは、血管の外側で血液の流動性を保つため、宿主の血液を常食とするヒルの能力にとって必須である。

ヒルジンは、フィブリノーゲンをフィブリンへと変換し、それによって血液凝固を引き起こすトロンビンの最も潜在的な天然の阻害物質である。その抗凝固活性のため、ヒルジンは、血液凝固障害、皮膚血腫、及び表在性静脈瘤を治療するために用いられ得る。しかしながら、大量のヒルジンを天然の供給源から抽出することは困難であることが分かっている。したがって、組み換えＤＮＡ技術によるヒルジンの発現が開発されている。Ｌｅｐｉｒｕｄｉｎ、Ｔｈｒｏｍｂｅｘｘ、Ｒｅｖａｓｃ、及びＩｐｒｉｖａｓｋ（全て酵母細胞由来）を含む、いくつかのヒルジン系抗凝固医薬製品が市販されている。酵母系と比較して、本技術は、より低いコスト、及びより管理しやすい大規模生産を提供する。

インスリンは、肝臓、筋細胞、及び脂肪組織に血液からグルコースを取り込ませることによって炭水化物及び脂肪代謝を調節するホルモンである。グルコースは次に、肝臓及び筋肉中にグリコーゲンとして貯蔵される。身体は、血液から過剰なグルコースを除去するためにインスリンを一定レベルに保つ。糖尿病は、インスリンレベルの制御が機能しないときに生じる。いくつかの形態の糖尿病を治療するために、外部インスリンが医学的に使用され得る。本技術は、より大規模かつより低いコストの生産と共に、医療用途のインスリンを生産する有利なアプローチを提示する。

インターフェロンは、ウイルス、細菌、寄生生物、又は腫瘍細胞などの病原体の存在に応答して、宿主細胞によって放出されるタンパク質である。宿主細胞中のウイルス複製に「干渉する」ことに加えて、インターフェロンはまた、Ｔリンパ球への抗原提示を上方調節し、ウイルスによる新たな感染に抵抗する、感染していない宿主細胞の能力を増加させる。インターフェロンの免疫作用は、日光角化症及び外陰疣贅などのいくつかの疾患を治療するために利用されている。更に、インターフェロン療法は、毛様細胞性白血病、慢性骨髄性白血病、結節性リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫などの白血病及びリンパ腫を含む、多くの癌の治療法として（化学療法及び放射線と組み合わせて）使用される。Ｍｕｌｔｉｆｅｒｏｎ（商標）（ヒト白血球インターフェロン−αとして総称的に知られる）及びＰＥＧ化インターフェロン−αなどのいくつかの異なる種類のインターフェロンが、ヒトにおける使用に承認されている。ＰＥＧ化は、別の分子、通常は薬物又は治療用タンパク質への、ポリエチレングリコールポリマー鎖の共有結合のプロセスである。本技術は、より低いコストで大規模にインターフェロンを生産する方法を提供する。

ラクトトランスフェリンとしても知られるラクトフェリンは、トランスフェリンファミリーの多機能性タンパク質である。ラクトフェリンは、生得性の免疫系に属する。鉄イオンの結合及び輸送というその主な生物学的機能とは別に、ラクトフェリンはまた、抗菌性、抗ウイルス性、抗寄生生物性、触媒的、抗癌性、抗アレルギー性、及び放射線防護性の機能並びに特性を有する。ラクトフェリンは、細菌性バイオフィルムの発達を防止する。ラクトフェリン活性の低下に起因する殺菌活性の損失及びバイオフィルムの形成の増加が、嚢胞性線維症患者に観察される。これらの所見は、ヒト宿主の防衛における、特に肺におけるラクトフェリンの重要な役割を実証する。ヒポチオシアナイトを有するラクトフェリンは、ＦＤＡによって希用薬の資格を与えられている。したがって、より低いコストで大規模にラクトフェリンを生産することができることは非常に望ましい。本技術は、そのような生産方法を提供する。

ヘモグロビンは、全ての脊椎動物の赤血球中の、鉄を含有する酸素輸送金属タンパク質である。酸素に加えて、ヘモグロビンが他の気体の輸送に関与し、それは、身体の呼吸性の二酸化炭素のうちのいくらか（合計の約１０％）を運搬する。ヘモグロビンはまた、グロビンタンパク質チオール基に結合する重要な調節分子である一酸化窒素を運搬し、酸素と同時にそれを放出する。ヘモグロビン欠乏の疾患は、貧血の場合のように、ヘモグロビン分子の量の低下、又は、酸素と同じ分圧で酸素を結合する各分子の能力の低下のいずれかによって引き起こされる場合がある。原因にかかわらず、ヘモグロビン欠乏症は、血中酸素運搬能力を低下させる。身体に外部ヘモグロビンを供給することは、ヘモグロビン欠乏症を治療するための重要なアプローチである。本技術は、より低いコストで大規模にヘモグロビンを生産する方法を提供する。

エリスロポエチン（ヘマトポエチン又はヘモポエチンとも呼ばれる）は、赤血球産生、即ち赤血球の産生を制御する、糖タンパク質ホルモンである。エリスロポエチンは、アポトーシスからこれらの細胞を保護することによって赤血球の生存を促進する。エリスロポエチンはまた、前駆体赤血球の発達に関与する様々な成長因子と協働する。低酸素条件下で、腎臓は、エリスロポエチンを産生及び分泌して、赤血球の産生を増加させる。エリスロポエチンはまた、血管新生の刺激及び平滑筋線維の増殖の誘導に関与する。エリスロポエチンはまた、ヘプシジンホルモンを抑制することによって鉄吸収を増加させることが示されている。医学的に、エリスロポエチンは、慢性腎臓疾患、骨髄異形成、並びに癌治療（化学療法及び放射線）に起因する貧血を治療するために使用されている。本技術は、より低いコストで大規模にエリスロポエチンを生産する方法を提供する。

上皮成長因子（即ちＥＧＦ）は、その受容体ＥＧＦＲに結合することによって、細胞成長、増殖、及び分化の調節において重要な役割を果たす、成長因子である。上皮成長因子は、ヒトの血小板、マクロファージ、尿、唾液、乳汁、及び血漿に見出すことができる。ＥＧＦが、精子形成、正常妊娠の完了、乳腺発達、及び創傷治癒を含む、多くの生理学的プロセスにおいて重要であることが、研究によって示唆されている。ＥＧＦ欠乏症は、おそらく、これらの生理学的プロセスに関連する様々な疾患の病理に寄与する。他の発現系と比較して、より低いコストでより大規模にＥＧＦを生産する見込みがあるアプローチを提供する本技術。

本技術を使用して、植物内で抗体を組み換えで産生することができる。例えば、非限定的に、単鎖抗体がジャガイモ植物内で産生され得る。

Ｂ．ワクチン及び感染症治療／予防
上述の例示的なタンパク質に加えて、本技術は、弱毒ウイルス、コートタンパク質、及び癌ワクチンを含む、ヒト及び動物ワクチンを生産する有利な代替的アプローチも提供する。例えば、本技術は、炭疽ワクチン、コレラワクチン、ＤＰＴ（ジフテリア、百日咳、及び破傷風）ワクチン、ヒブワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）ワクチン、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、ＭＭＲ（麻疹、流行性耳下腺炎、及び風疹）ワクチン、ＭＭＲＶ（麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、及び水痘）ワクチン、肺炎球菌ワクチン、肺炎球菌多糖体ワクチン、ポリオワクチン、ロタウイルスワクチン、天然痘ワクチン、結核ワクチン、腸チフスワクチン、並びに黄熱ワクチンなどのヒトワクチンを生産するために使用され得る。

本技術は、パルボウイルスワクチン、ジステンパーワクチン、アデノウイルスワクチン、パラインフルエンザワクチン、ボルデテラワクチン、狂犬病ワクチン、レプトスピラ症ワクチン、ライム病ワクチン、コロナワクチン、回虫／鉤虫ワクチン、及び駆虫剤ワクチンなどの動物ワクチンを生産するために使用され得る。

癌ワクチンという用語は、発癌性ウイルスへの感染の予防、既存の癌の治療、又はある特定の高リスク個人における癌の発達の予防のいずれかを行うワクチンを指す。いくつかの癌、例えば子宮頸癌及びいくつかの肝癌は、ウイルスによって引き起こされる。これらのウイルスに対する伝統的なワクチン、例えばＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス）ワクチン及びＢ型肝炎ワクチンなどは、これらの癌を予防する。

１．リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）
更に、本技術は、リフトバレー熱ウイルス（ＲＶＦＶ）の治療及び／又は予防のために使用され得る。ＲＶＦＶは蚊媒介性ウイルスであり、その周期的流行は、サハラ以南のアフリカのほぼ全域にわたる家畜頭数に壊滅的な経済的影響を及ぼしている。ヒトにおいては、ＲＶＦＶ感染症は、脳、脊髄、及び髄膜の炎症、視力障害を伴う網膜炎、並びに出血を伴う肝壊死を引き起こす。近年の突発は、著しいヒトの死亡率、並びにアフリカ大陸を出てサウジアラビア及びイエメンに至る増加した地理的フットプリントをもたらし、新たな領域で出現するその能力を実証している。その増加する罹患率、蔓延、ベクター塑性、及びエアロゾル化の容易さに起因して、ＲＶＦＶは、疾病管理センターによって新興感染症及びカテゴリーＡの指定生物剤（select agent）として挙げられている。新興の脅威として認識されているにもかかわらず、ＲＶＦＶの病原性機構については比較的少ししか知られておらず、現在、ＦＤＡに認可されているＲＶＦＶのワクチン又は治療薬はない。新規の抗ウイルス性治療薬を開発するために、ウイルス複製経路、及び宿主細胞に関連する病原の理解をより深めることが緊急に必要とされている。

ＲＶＦＶは主に家畜に影響を及ぼし、成体の動物における熱及び自然流産の症例、並びに若い動物における高い死亡率として顕在化する。ヒトにおいては、このウイルスは、様々な重症度を有する疾患を引き起こし得る。ほとんどの場合、患者は、熱、頭痛、筋肉痛、及び肝臓の異常を伴う軽度の疾病を発症する。少ない割合の症例では、この疾病は、出血熱又は髄膜脳炎に進行し得る。更に、失明を含む、網膜損傷を引き起こす眼の後遺症が発生する場合がある。発症したヒトのうち約１％がこの疾患で死亡するが、近年ではこの割合が、おそらくは医学的処置を求める人々の率の増加に起因して、増加している（４５％近く）。風土性の国の外でのＲＶＦＶの突発は、深刻な健康問題及び農業問題を引き起こすであろう。ＲＶＦＶの意図的な蔓延は国民のバイオセキュリティの深刻な懸念であり、したがってＲＶＦＶは、ＣＤＣ及びＵＳＤＡによってカテゴリーＡの重複指定生物剤（overlap select agent）として分類される。Ｂｉｒｄｅｔａｌ．Ｊ．Ａｍ．ＶｅｔＭｅｄ．Ａｓｓｏｃ．，２３４（７）：８８３〜８９３（２００９）。リババリン（Ｒｉｂａｖａｒｉｎ）がいくつかの症例において治療薬として使用されているが、望ましくない副作用がある。

したがって、本出願は、ＲＶＦＶに対するワクチン接種のための手法及び構築物を企図する。この点で、そして当該技術分野で既知のように、ＲＶＦＶ感染を予防するために、不活化ワクチン、弱毒生ワクチン、及び組み換えワクチンが使用され得る。同様に、組み換えアプローチが、ウイルス複製及び／若しくは転写を阻害又は別様に変更するタンパク質を産生するために使用され得る。そのようなタンパク質は、本明細書に記載される手法のうちのいずれかを使用して、植物内で産生され得る。

２．ＨＩＶ
高活性抗レトロウイルス療法（ＨＡＡＲＴ）が、ＨＩＶ感染症の管理において大きな成果を挙げている。しかしながら、ＨＡＡＲＴ薬物療法は、身体からＨＩＶウイルスを駆除しない。ＨＩＶは身体内で休眠状態でいることができる。患者は、そのＨＡＡＲＴ治療が中断された場合、より症候性かつより感染性になり得る。Ｔａｔタンパク質は、ＨＩＶによって産生され、ＨＩＶｄｓＲＮＡの転写を刺激する。Ｋｉｍ，Ｊ．Ｂ．ａｎｄＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ．ｍ，２７６（１５）：１２３１７〜１２３２３（２００１）。Ｔａｔタンパク質は伝達ドメイン及び核局在シグナルを含有し、したがってこのタンパク質は、細胞及び細胞の核に進入することができる。Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９（４６）：４８１９７〜４８１２０４（２００４）。

したがって、本出願は、ＨＩＶ感染の妨害を含む、ＨＩＶ治療のための手法及び構築物を企図する。例えば、非限定的に、組み換えアプローチが、ウイルス複製及び／若しくは転写を阻害又は別様に変更するタンパク質を産生するために使用され得る。そのようなタンパク質は、本明細書に記載される手法のうちのいずれかを使用して、植物内で産生され得る。

３．Ｃ型肝炎ウイルス
全世界で毎年３５０，０００人を超える人々がＨＣＶ関連肝疾患により死亡すると推定される。Ｐｅｒｚｅｔａｌ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．４５：５２９〜５３８（２００６）。ＨＣＶは、その犠牲者の身体内で繁殖する間、多くの場合彼らに不快感を与えない、気付かれにくい死因（stealthy killer）である。このウイルスは、熱及び疲労などの流感様症状を引き起こしながら緩徐に顕在化し、肝臓を徐々に攻撃し、硬変症又は癌を引き起こす。一般的に、ＨＣＶは、感染した血液によって伝染する。ワクチンは開発中である。

したがって、本出願は、ＨＣＶの治療及び／又は妨害のための手法並びに構築物を企図する。この点で、組み換えアプローチが、ウイルス複製及び／若しくは転写を阻害又は別様に変更するタンパク質を産生するために使用され得る。そのようなタンパク質は、本明細書に記載される手法のうちのいずれかを使用して、植物内で産生され得る。

Ｃ．遺伝子発現の抑制
核酸構築物は、例えば、治療用タンパク質をコード化する、所望のポリヌクレオチドの収束性転写を誘起することによって、標的核酸の転写若しくは翻訳を効率的に低減又は防止するために使用され得る。そのような構築物の特定の特質の１つは、従来のサイレンシング構築物とは対照的に、所望のポリヌクレオチドの３’末端に挿入及び作動可能に連結される機能性ターミネーターがないことである。

例示的な構築物の別の特質は、ターミネーターに直接作動可能に連結されないポリヌクレオチドの１つ又は２つ以上のコピーの収束性転写を、２つの対向するプロモーターによって促進することである。終結シグナルの欠如に起因して、第１及び第２のプロモーターから転写されるＲＮＡ分子のプールの長さは、様々な長さであり得る。例えば、折々、転写機構は、所望のポリヌクレオチド配列の「末端」を示す最後のヌクレオチドを超えて転写し続ける場合がある。したがって、この特定の配置では、転写終結は、例えば、ヘアピン形成を促進する下流配列の弱い若しくは意図的でない作用、又は、トランスファーＤＮＡ統合部位に隣接する植物ＤＮＡ内に位置する意図的でない転写ターミネーターの作用のいずれかによって発生し得る。

したがって、ターミネーターを有しない衝突転写（terminator-free colliding transcription）（ＴＦＣＴ）構築物は、第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結される第１のプロモーターと、第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結される第２のプロモーターと、を含み得、それによって、（１）第１及び第２のポリヌクレオチドは、互いと少なくともいくらかの配列同一性及び標的配列を共有し、（２）第１のプロモーターは、このプロモーターによって開始される転写の方向が第２のプロモーターに向かって進み、かつその逆も同様であるように配向され、（３）該構築物は、概して大きさが異なるＲＮＡ分子を産生し、いくつかの転写物は、ポリヌクレオチドの少なくとも一部のＲＮＡ対応部分を表し、その他は、ポリヌクレオチド及びその逆位相補体の両方のうちの少なくともいくつかの対応部分を含む。例えば、参照により全体が組み込まれる、米国特許第７，７１３，７３５号を参照されたい。

所望のポリヌクレオチドは、プロモーターに対して２つの異なる配向で連結され得る。一方の配向、例えば、「センス」では、結果として生じるＲＮＡ転写物の少なくとも５’部分が、少なくとも１つの標的転写物の少なくとも一部と配列同一性を共有する。「アンチセンス」と指定される他方の配向では、予測される転写物の少なくとも５’部分が、少なくとも１つの標的転写物の逆位相補体の少なくとも一部と同一又は相同性となる。

構築物はまた、所望のポリヌクレオチドのいずれかの側のプロモーターの配置を特徴とする場合がある。したがって、本発明の構築物は、所望のポリヌクレオチドの両方の鎖が転写されるように、１つ又は２つ以上の所望のポリヌクレオチドに隣接するか、又は所望のポリヌクレオチドのコピーに隣接する２つ又は３つ以上のプロモーターを含み得る。即ち、１つのプロモーターは、所望のポリヌクレオチドの５’末端の転写を開始するように配向されてよく、一方で第２のプロモーターは、同じ所望のポリヌクレオチドの３’末端からの転写を開始するように作動可能に配向されてよい。反対に配向されるプロモーターは、所望のポリヌクレオチドの複数のコピーに隣接し得る。したがって、「コピー数」は、構築物が、収束性転写を誘導するように配向されるプロモーターに最終的に隣接される所望のポリヌクレオチドの、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００個、又は１００個を超えるコピー、又はその間の任意の整数を含み得るように、異なり得る。

あるいは、第１のプロモーターは、例えば、「カセットＡ」内の第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結されてよく、第２のプロモーターは、例えば、「カセットＢ」内の第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結されてよい。各カセットのポリヌクレオチドは、同じヌクレオチド配列を含む場合も含まない場合もあるが、目的の標的核酸といくらかの配列同一性の百分率を共有し得る。カセットは、縦一列に並んで、即ち、それらが構築物内で互いに隣接するように配置されてよい。更に、例えば、カセットＢは、カセットＡに対して逆位相補性配向に配向されてよい。したがって、この配置では、カセットＢのプロモーターからの転写は、カセットＡのプロモーターに向かう方向に進む。したがって、カセットは、「収束性転写」を誘導するように配置される。

いずれのカセットもターミネーター配列を含まない場合、そのような構築物は、収束性転写配置のために、異なる長さのＲＮＡ転写物を産生し得る。

したがって、この状況では、それぞれのカセットから転写された所望のポリヌクレオチドの部分的又は完全長の配列を含む、部分的又は完全に転写されたＲＮＡ転写物の亜集団が存在し得る。あるいは、機能性ターミネーターの非存在下で、転写機構は、所望のポリヌクレオチドの末端を超えて進んで、所望のポリヌクレオチドの長さよりも長い転写物を産生することができる。

したがって、ポリヌクレオチドの一方が他方に対して逆位相補性方向に配向される場合も配向されない場合もあり、かつポリヌクレオチドが収束性転写を誘導するようにプロモーターに作動可能に連結され、かつ構築物内に機能性ターミネーターがない、所望のポリヌクレオチドの２つのコピーを含む構築物では、一方の所望のポリヌクレオチドから開始する転写機構は、所望のポリヌクレオチドの他方のコピーを転写するように進み得、その逆も同様である。所望のポリヌクレオチドの複数のコピーは、様々な順列で配向されてよい。所望のポリヌクレオチドの２つのコピーが構築物内に存在する場合では、コピーは、例えば、両方とも同じ方向に、互いに対して逆位配向に、又は、例えば、互いに対して逆位相補性配向に、配向されてよい。

所望のポリヌクレオチドの一方が他方のポリヌクレオチドに対して逆位相補性配向に配向される配置では、第１のポリヌクレオチドの「センス」配列だけでなく第２のポリヌクレオチドからの「アンチセンス」配列も含むＲＮＡ転写物が産生され得る。第１及び第２のポリヌクレオチドが、いくらか又は実質的に同じＤＮＡ配列を含む場合、単一のＲＮＡ転写物は、互いに対して相補性であり、したがってアニールすることができる、２つの領域を含み得る。したがって、そのように転写される単一のＲＮＡ転写物は、部分的又は完全なヘアピン二本鎖構造を形成し得る。

他方では、そのような長い転写物の２つのコピー（各プロモーターから１つ）が産生された場合、それぞれが他方と相補性である配列の領域を共有する、２つのＲＮＡ分子が存在することになる。したがって、第１のＲＮＡ転写物の「センス」領域は、第２のＲＮＡ転写物の「アンチセンス」領域にアニールすることができ、その逆も同様である。したがって、この配置では、単一の自己相補性ＲＮＡ転写物から形成するヘアピン二本鎖とは対照的に、２つの別個のＲＮＡ転写物からなる別のＲＮＡ二本鎖が形成され得る。

あるいは、所望のポリヌクレオチドの２つのコピーは、転写リードスルーの場合、１つのプロモーターから産生される長いＲＮＡ転写物が、例えば、所望のポリヌクレオチドの第１のコピーのセンス配列、及び所望のポリヌクレオチドの第２のコピーのセンス配列をまた含み得るように、同じ方向に配向されてよい。したがって、収束性に配向される他方のプロモーターから産生されるＲＮＡ転写物は、所望のポリヌクレオチドの第２のコピーのアンチセンス配列、及び第１のポリヌクレオチドのアンチセンス配列をまた含み得る。したがって、おそらくいずれのＲＮＡ転写物も正確な相補性の領域を含有せず、したがって、いずれのＲＮＡ転写物もおそらく自らを折りたたんでヘアピン構造を生成することはないであろう。他方では、２つの個別のＲＮＡ転写物は、ＲＮＡ二本鎖を形成するように互いとハイブリダイズ及びアニールすることができる。

したがって、一態様では、本発明は、構築物であって、ターミネーターを欠くか、又は自己スプライシング型リボザイムコード化ＤＮＡ領域が先行するターミネーターを欠くが、第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結される第１のプロモーターと、第２のポリヌクレオチドに作動可能に連結される第２のプロモーターと、を含み、それによって、（１）第１及び第２のポリヌクレオチドが、互いと少なくともいくらかの配列同一性を共有し、（２）第１のプロモーターが、このプロモーターによって開始される転写の方向が第２のプロモーターに向かって進み、かつその逆も同様であるように配向され、（３）この収束性配置が、概して長さが異なる様々なＲＮＡ転写物を産生する、構築物を提供する。

所望のポリヌクレオチドは、互いの完全若しくは不完全な反復であるか、又は互いの完全若しくは不完全な逆位相補性反復であってよい。第１のポリヌクレオチド及び第２のポリヌクレオチドを含む構築物の場合、第２のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドに対してヌクレオチド配列が完全又は部分的に同一であり、かつ第１のポリヌクレオチドに対して直接又は逆位相補性配向に配向されてよい。したがって、第１及び第２のポリヌクレオチドは、互いの完全反復であってよい。他方では、第２のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドの不完全反復であってよく、即ち、第２のポリヌクレオチドは、第１のポリヌクレオチドと配列同一性を共有し得るが、配列が完全又は部分的に同一ではなく、即ち、第２のポリヌクレオチドは不完全反復である。その第２のポリヌクレオチドはまた、第１のポリヌクレオチドに対して直接反復として配向されるか、又は逆位相補性配向に位置してもよい。

本明細書に記載されるポリヌクレオチド、例えば、所望のポリヌクレオチド、又は第１若しくは第２のポリヌクレオチドなどのうちのいずれも、標的配列の少なくとも一部と同一であり得るか、又は標的配列の少なくとも一部と配列同一性を共有し得る。所望のポリヌクレオチドが、標的配列の断片と相同性である配列を含む場合、即ち、それが標的配列の「少なくとも一部」と配列同一性を共有する場合、その断片のヌクレオチド配列が標的遺伝子に特異的であり、かつ／又は、所望のポリヌクレオチド中に存在する標的の部分的完全若しくは不完全配列が、標的特異性を付与するために十分な長さであることが望ましい場合がある。したがって、標的配列の部分と配列同一性を共有する所望のポリヌクレオチドの部分は、典型的には標的配列のイソ型若しくは相同体によって保存される特徴的ドメイン、結合部位、又はヌクレオチド配列を含み得る。したがって、細胞中の標的核酸を標的化するために最適な所望のポリヌクレオチドを設計することが可能である。

別の実施形態では、所望のポリヌクレオチドは、標的核酸のＤＮＡ又はＲＮＡ配列と配列同一性を共有する、好ましくは４〜５，０００個のヌクレオチド、より好ましくは５０〜１，０００個のヌクレオチド、最も好ましくは１５０〜５００個のヌクレオチドの配列を含む。所望のポリヌクレオチドは、配列が標的配列内の配列と１００％同一である、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、５００、若しくは５００個を超える近接するヌクレオチド、若しくはその間の任意の整数と、配列同一性を共有し得るか、又は、所望のポリヌクレオチドは、標的配列の配列と、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％のヌクレオチド配列同一性を共有する配列を含む。換言すれば、所望のポリヌクレオチドは、標的配列の完全長の配列若しくは標的配列のその断片と相同性であるか、又は相同性を共有し得る。

したがって、本発明は、標的配列と相同性を共有し、したがって、ストリンジェント又は中等度のハイブリダイゼーション条件下で本明細書に記載される標的配列の一部とハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子を提供する。ポリヌクレオチドの「一部」とハイブリダイズするポリヌクレオチドによって、基準ポリヌクレオチドの少なくとも約１５個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２０個のヌクレオチド、更により好ましくは少なくとも約３０個のヌクレオチド、より一層好ましくは３０個を超えるヌクレオチドとハイブリダイズする、ポリヌクレオチド（ＤＮＡ又はＲＮＡのいずれか）が意図される。本発明の目的のため、相同性を共有する２つの配列、即ち、所望のポリヌクレオチド及び標的配列は、６倍のＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、５倍のデンハルト（Denhardt）溶液、及び１００ｇの非特異的担体ＤＮＡのハイブリダイゼーション溶液中で、二本鎖の複合体を形成するときにハイブリダイズすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，ｓｅｃｔｉｏｎ２．９，ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２７（１９９４）を参照されたい。そのような配列は、６倍のＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、５倍のデンハルト溶液、及び１００μｇの非特異的担体ＤＮＡのハイブリダイゼーション溶液中で、６０℃の温度として定義される「中等度のストリンジェンシー」でハイブリダイズすることができる。「高ストリンジェンシー」ハイブリダイゼーションでは、６８℃に温度を上昇させる。中等度ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応後、ヌクレオチドを、室温で２倍のＳＳＣに加えて０．０５％のＳＤＳ５倍の溶液中で洗浄し、続けて、６０℃で１時間にわたって、０．１倍のＳＳＣに加えて０．１％のＳＤＳで洗浄する。高ストリンジェンシーでは、典型的には約６８℃の温度に洗浄温度を上昇させる。ハイブリダイズされたヌクレオチドは、１０，０００ｃｐｍ／μｇの特異的放射活性を有する１μｇの放射線標識プローブを使用して検出されるものであり得、ハイブリダイズされたヌクレオチドは、７２時間以下にわたる−７０℃におけるＸ線フィルムへの曝露後に明らかに目に見える。

一実施形態では、本発明の構築物は、該構築物を含有する細胞によって通常発現される標的遺伝子の発現レベルを、該構築物を含有しない細胞と比較して、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、６０％、５９％、５８％、５７％、５６％、５５％、５４％、５３％、５２％、５１％、５０％、４９％、４８％、４７％、４６％、４５％、４４％、４３％、４２％、４１％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２１％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％低下させる核酸を産生する、発現カセットを含み得る。

本発明のいずれのポリヌクレオチドも、「所望のポリヌクレオチド」、「第１の」ポリヌクレオチド、「第２の」ポリヌクレオチドにせよ、標的配列とある特定の配列同一性百分率を共有し得る。本明細書で説明されるように、標的配列は、遺伝子、プロモーター若しくはターミネーターなどの調節エレメント、エクソン、イントロン、非翻訳領域、又は標的ゲノム配列の上流若しくは下流の任意の配列の、部分的若しくは完全長の配列であってよいが、これらに限定されない。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、その配列の長さにわたって、そのような標的配列と同一である配列を含み得る。他方では、本発明のポリヌクレオチドは、そのような標的配列と配列同一性を共有する配列を含み得る。したがって、本発明の所望のポリヌクレオチドは、標的配列の配列と、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％、又は６０％のヌクレオチド配列同一性を共有し得る。

本明細書で使用される場合、２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」又は「同一性」は、規定の領域にわたる最大の対応のために整列されるとき同じである２つの配列における残基への参照を含む。配列同一性の百分率がタンパク質に関して使用されるとき、同一でない残基位置は、多くの場合、アミノ酸残基が同様の化学特性（例えば電荷又は疎水性）を有する他のアミノ酸残基と置換され、したがって分子の機能的特性を変化させない、保存的なアミノ酸置換によって異なると認識される。配列が保存的置換において異なる場合、配列同一性パーセントは、置換の保存的性質を補正するように上方に調整され得る。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」又は「類似性」を有すると言われる。この調整を行うための手段は、当業者に周知である。典型的には、これは、完全ミスマッチではなく部分的ミスマッチとして保存的置換をスコア化し、それによって配列同一性百分率を上昇させることを伴う。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換にゼロのスコアが与えられる場合、保存的置換にはゼロ〜１のスコアが与えられる。保存的置換のスコア化は、例えば、ＰＣ／ＧＥＮＥプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）によって実装される、例えば、ＭｅｙｅｒｓａｎｄＭｉｌｌｅｒ，ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｐｐｌｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．，４：１１〜１７（１９８８）のアルゴリズムに従って算出される。

本明細書で使用される場合、「配列同一性の百分率」は、最適に整列された２つの配列を比較ウィンドウ上で比較することによって決定される値を意味し、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列を最適に整列させるために、参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。この百分率は、両方の配列において同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が発生する位置の数を決定して、マッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて、配列同一性の百分率を得ることによって算出される。

比較のための配列の整列の方法は、当該技術分野において周知である。比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈａｎｄＷａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性整列アルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：２４４４（１９８８）の類似性方法の検索によって、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，Ｃａｌｉｆ．によるＰＣ／遺伝子プログラム内のＣＬＵＳＴＡＬ；ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）内のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ（５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）を含むがこれらに限定されない、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実施によって、行われ得、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、ＨｉｇｇｉｎｓａｎｄＳｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ７３：２３７〜２４４（１９８８）、ＨｉｇｇｉｎｓａｎｄＳｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ５：１５１〜１５３（１９８９）、Ｃｏｒｐｅｔ，ｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１６：１０８８１〜９０（１９８８）、Ｈｕａｎｇ，ｅｔａｌ．，ＣｏｍｐｕｔｅｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓｉｎｔｈｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ８：１５５〜６５（１９９２）、及びＰｅａｒｓｏｎ，ｅｔａｌ．，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ２４：３０７〜３３１（１９９４）によって十分に説明されている。

データベース類似性検索に使用され得るＢＬＡＳＴ群のプログラムとしては、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＮ、タンパク質データベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＸ、タンパク質データベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのＢＬＡＳＴＰ、ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＮ、及びヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチド問い合わせ配列のためのＴＢＬＡＳＴＸが挙げられる。ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｐｔｅｒ１９，Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．，Ｅｄｓ．，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９５）、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０（１９９０）、及び、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３８９〜３４０２（１９９７）を参照されたい。

ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、例えば、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通じて公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードと整列されるときに、いくつかの正値の閾値スコアＴとマッチするか又はそれを満たすかのいずれかである、問い合わせ配列内の長さＷの短いワードを識別することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を初めに識別することを伴う。Ｔは、隣接ワード（neighborhood word）スコア閾値と称される。これらの初期の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するための種の働きをする。次にこのワードヒットを、累積整列スコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に延長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、Ｍ（マッチする残基の対への報酬スコア、常に０超）、及びＮ（ミスマッチの残基へのペナルティスコア、常に０未満）のパラメータを使用して算出される。アミノ酸配列については、スコア化マトリックスを使用して累積スコアを算出する。各方向のワードヒットの延長は、累積整列スコアが、その最大達成値からＸの量低下するとき、累積スコアが、１つ又は２つ以上の負のスコアの残基整列の蓄積のためにゼロ以下になるとき、又はいずれかの配列の末端に達したとき、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、及びＸは、整列の感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両方の鎖の比較を初期設定として使用する。アミノ酸配列については、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコア化マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５を参照のこと）を初期設定として使用する。

配列同一性パーセントを算出することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析も実行する（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．ＡｃａｄＳｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３〜５８７７（１９９３）を参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列の間のマッチが偶然発生する確率の指標を提供する、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））である。

ＢＬＡＳＴ検索は、タンパク質がランダム配列としてモデル化され得ると想定する。しかしながら、現実のタンパク質の多くは、ホモポリマー区域、短期間反復、又は１つ若しくは２つ以上のアミノ酸が濃縮された領域であり得る、非ランダム配列の領域を含む。そのような低複雑性の領域は、タンパク質の他の領域が全体的に異なっていても、無関係のタンパク質間で整列され得る。いくつかの低複雑性フィルタプログラムを用いて、そのような低複雑性の整列を低減させることができる。例えば、ＳＥＧ（ＷｏｏｔｅｎａｎｄＦｅｄｅｒｈｅｎ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．，１７：１４９〜１６３（１９９３））及びＸＮＵ（ＣｌａｖｅｒｉｅａｎｄＳｔａｔｅｓ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．，１７：１９１〜２０１（１９９３））低複雑性フィルタが、単独又は組み合わせて用いられ得る。

配列の複数の整列が、ＣＬＵＳＴＡＬの整列法（ＨｉｇｇｉｎｓａｎｄＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３）を、初期設定パラメータ（ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰＬＥＮＧＴＨＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）と共に使用して実行され得る。ＣＬＵＳＴＡＬ法を使用する対整列の初期設定パラメータは、ＫＴＵＰＬＥ１、ＧＡＰＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、及びＤＩＡＧＯＮＡＬＳＳＡＶＥＤ＝５である。

したがって、何ら限定するものではないが、出願人は、目的のタンパク質をコード化する遺伝子を同時に過剰発現しながら、タンパク質をコード化する内因性植物遺伝子を抑制することを企図する。例えば、同時に、パタチン（主要な塊茎貯蔵タンパク質）を抑制しながらも、目的の治療用タンパク質を過剰発現する、収束性発現カセットが使用され得る。そのような発現カセットは、それに基づいて選択がなされ得る独特な色又は他の独特な特性を付与する選択可能マーカー遺伝子を含み得、それによって選択を容易にし、ヒトによる消費を防止する。更に、タンパク質抑制並びに／又は産生が植物の正常な成長及び発達に干渉しないように、誘導性プロモーターが、タンパク質抑制並びに／又は産生を更に調節するために使用され得る。

Ｄ．核酸構築物内の調節エレメント
本開示は、トランスジェニック植物内のタンパク質産生を調節するための核酸分子及び手法を提供する。一実施形態では、そして上述のように、目的の治療用タンパク質は、ジャガイモ植物内で過剰発現され得る。

発現ベクターは、調節エレメント（例えば、プロモーター）に作動可能に連結される少なくとも１つの遺伝的マーカーを有し、これは、該マーカーを含有する形質転換された細胞が、負の選択、即ち、選択可能マーカー遺伝子を含有しない細胞の成長を阻害すること、又は正の選択、即ち、遺伝的マーカーによってコード化される産物をスクリーニングすることのいずれかによって、回収されることを可能にする。植物形質転換に一般的に使用される選択可能マーカー遺伝子の多くは、形質転換の技術分野で周知であり、例えば、抗生物質若しくは除草剤であり得る選択的な化学剤を代謝的に解毒する酵素をコード化する遺伝子、又は、阻害物質に対して非感受性の変更された標的をコード化する遺伝子を含む。いくつかの正の選択方法がまた、当該技術分野において既知である。

植物形質転換に一般的に使用される選択可能マーカー遺伝子の１つは、植物調節シグナルの制御下でカナマイシンへの耐性を付与する、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子である。Ｆｒａｌｅｙ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：４８０３（１９８３）。一般的に使用される別の選択可能マーカー遺伝子は、抗生物質であるヒグロマイシンへの耐性を付与する、ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子である。ＶａｎｄｅｎＥｌｚｅｎ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５：２９９（１９８５）。

抗生物質への耐性を付与する細菌起源の追加の選択可能マーカー遺伝子としては、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ、及びアミノグリコシド−３’−アデニルトランスフェラーゼ、ブレオマイシン耐性決定因子が挙げられる（Ｈａｙｆｏｒｄ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．，８６：１２１６（１９８８）、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１０：８６（１９８７）、Ｓｖａｂ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：１９７（１９９０）、Ｈｉｌｌｅ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，７：１７１（１９８６））。他の選択可能マーカー遺伝子は、グリホセート、グルホシネート、又はブロモキシニルなどの除草剤への耐性を付与する（Ｃｏｍａｉ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１７：７４１〜７４４（１９８５）、Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２：６０３〜６１８（１９９０）、Ｓｔａｌｋｅｒ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４１９〜４２３（１９８８））。

細菌起源ではない植物形質転換のための選択可能マーカー遺伝子としては、例えば、マウスジヒドロ葉酸レダクターゼ、植物５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ、及び植物アセト乳酸シンターゼが挙げられる（Ｅｉｃｈｈｏｌｔｚ，ｅｔａｌ．，ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌＭｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１３：６７（１９８７）、Ｓｈａｈ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：４７８（１９８６）、Ｃｈａｒｅｓｔ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．，８：６４３（１９９０））。

植物形質転換のための別の種類のマーカー遺伝子は、抗生物質などの毒性物質への耐性のために、形質転換された細胞の直接的な遺伝子選択ではなく、推定的に形質転換された植物細胞のスクリーニングを必要とする。これらの遺伝子は、特定の組織における遺伝子の発現の空間的パターンを定量又は可視化するために特に有用であり、遺伝子発現の調査のために遺伝子又は遺伝子調節配列に融合することができるため、しばしばレポーター遺伝子と称される。推定的に形質転換された細胞をスクリーニングするために一般的に使用される遺伝子としては、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、及びクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼが挙げられる（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，５：３８７（１９８７）、Ｔｅｅｒｉ，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，８：３４３（１９８９）、Ｋｏｎｃｚ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：１３１（１９８７）、ＤｅＢｌｏｃｋ，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，３：１６８１（１９８４））。

植物組織の破壊を必要としないＧＵＳ活性の可視化のためのインビボ方法が利用可能である（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ２９０８，ＩＭＡＧＥＮＥＧＲＥＥＮ，ｐｐ．１〜４（１９９３）、Ｎａｌｅｗａｙ，ｅｔａｌ．，Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，１１５：１５１ａ（１９９１））。しかしながら、ＧＵＳ活性の可視化のためのこれらのインビボ方法は、低い感受性、高い蛍光バックグラウンド、及び選択可能マーカーとしてのルシフェラーゼ遺伝子の使用に関連する制限のため、形質転換された細胞の回収に有用であると証明されていない。

より近年、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコード化する遺伝子が、原核細胞及び真核細胞中の遺伝子発現のマーカーとして用いられている（Ｃｈａｌｆｉｅ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６３：８０２（１９９４））。ＧＦＰ及びＧＦＰの変異体は、スクリーニング可能（screenable）マーカーとして使用され得る。ＧＦＰ変異体の一例は、増加した蛍光性及び光安定性を有する強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）である。

発現ベクター内に含まれる遺伝子は、調節エレメント（例えば、プロモーター）を含むヌクレオチド配列によって駆動されなければならない。いくつかの種類のプロモーターが、単独で又はプロモーターと組み合わせて使用され得る他の調節エレメントと同様に、形質転換の技術分野において周知である。

本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、転写開始から上流にあり、かつ転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼと他のタンパク質との認識及び結合に関与する、ＤＮＡの領域への言及を含む。「植物プロモーター」は、植物細胞内で転写を開始することができるプロモーターである。発生制御下のプロモーターの例としては、葉、根、種、繊維、木部導管、仮導管、又は厚壁組織などのある特定の組織内で転写を優先的に開始するプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターは、「組織好適（tissue-preferred）」であると称される。ある特定の組織内でのみ転写を開始するプロモーターは、「組織特異的」であると称される。「細胞型」特異的プロモーターは、１つ又は２つ以上の器官、例えば、根又は葉内の脈管細胞内の、ある特定の細胞型における発現を主に駆動する。「誘導性」プロモーターは、環境制御下にあるプロモーターである。誘導性プロモーターによる転写に影響を及ぼし得る環境条件の例としては、嫌気性条件又は光の存在が挙げられる。組織特異的、組織好適、細胞型特異的、及び誘導性プロモーターは、「非構成型」プロモーターの分類を構成する。「構成型」プロモーターは、ほとんどの環境条件下で活性であるプロモーターである。

誘導性プロモーター−誘導性プロモーターは、大豆内の発現のための遺伝子に作動可能に連結される。任意に、誘導性プロモーターは、大豆内の発現のための遺伝子に作動可能に連結されるシグナル配列をコード化するヌクレオチド配列に作動可能に連結される。誘導性プロモーターと共に、転写の速度は、誘導剤に応答して上昇する。

任意の誘導性プロモーターが、本発明に使用され得る。Ｗａｒｄ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２：３６１〜３６６（１９９３）を参照されたい。例示的な誘導性プロモーターとしては、銅に応答するＡＣＥＩ系のもの（Ｍｅｔｔ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：４５６７〜４５７１（１９９３））、ベンゼンスルホンアミド除草剤毒性緩和剤（ｓａｆｅｎｅｒ）に応答するトウモロコシ由来のＩｎ２遺伝子（Ｈｅｒｓｈｅｙ，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．ＧｅｎＧｅｎｅｔｉｃｓ，２２７：２２９〜２３７（１９９１）、Ｇａｔｚ，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４３：３２〜３８（１９９４））、又はＴｎ１０由来のＴｅｔ抑制物質（Ｇａｔｚ，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２２７：２２９〜２３７（１９９１））が挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい誘導性プロモーターは、植物が通常は応答しない誘導剤に応答するプロモーターである。例示的な誘導性プロモーターは、ステロイドホルモン遺伝子由来の誘導性プロモーター、グルココルチコイド応答エレメントであり、その転写活性は、グルココルチコイドホルモンによって誘導される（Ｓｃｈｅｎａ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０４２１−１０４２５（１９９１））。

ノパリンシンターゼ及びオクトピンシンターゼ遺伝子のプロモーターなどの他のプロモーターが、細菌種からクローン化され得る。様々な誘導性プロモーターがあるが、典型的には、誘導性プロモーターは、温度感受性プロモーター、化学的に誘導されるプロモーター、又は時間的プロモーターであり得る。具体的には、誘導性プロモーターは、例えば、エタノール、ステノール、糖、エチレン、ＡＢＡ、オーキシン、サイトカイニン、オクトピン、ノパリン、光、酸素、カドミウム、銅、及び他の重金属のうちのいずれによっても誘導され得る。例示的な誘導性プロモーターとしては、Ｈａｈｓｐ１７．７Ｇ４プロモーター、コムギｗｃｓ１２０プロモーター、Ｒａｂ１６Ａ遺伝子プロモーター、α−アミラーゼ遺伝子プロモーター、ｐｉｎ２遺伝子プロモーター、及びカルボキシラーゼプロモーターも挙げられるが、これらに限定されない。

構成型プロモーター−構成型プロモーターは、大豆内の発現のための遺伝子に作動可能に連結されるか、又は、構成型プロモーターは、大豆内の発現のための遺伝子に作動可能に連結されるシグナル配列をコード化するヌクレオチド配列に作動可能に連結される。

多くの異なる構成型プロモーターが、本発明に用いられ得る。例示的な構成型プロモーターとしては、ＣａＭＶ由来の３５Ｓプロモーターなどの植物ウイルス由来のプロモーター（Ｏｄｅｌｌ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１３：８１０〜８１２（１９８５））、並びにイネアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２：１６３〜１７１（１９９０））、ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１２：６１９〜６３２（１９８９）、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８：６７５〜６８９（１９９２））、ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ，ｅｔａｌ．，Ｔｈｅｏｒ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，８１：５８１〜５８８（１９９１））、ＭＡＳ（Ｖｅｌｔｅｎ，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，３：２７２３〜２７３０（１９８４））、及びトウモロコシＨ３ヒストン（Ｌｅｐｅｔｉｔ，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２３１：２７６〜２８５（１９９２）、Ａｔａｎａｓｓｏｖａ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＪｏｕｒｎａｌ，２（３）：２９１〜３００（１９９２））などの遺伝子由来のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。ＡＬＳプロモーター、セイヨウアブラナ（Brassica napus）ＡＬＳ３構造遺伝子に対して５’のＸｂａ１／Ｎｃｏｌ断片（又は該Ｘｂａ１／Ｎｃｏｌ断片に対するヌクレオチド配列類似性）は、特に有用な構成型プロモーターの代表である。ＰＣＴ出願国際公開第９６／３０５３０号を参照されたい。追加の構成型プロモーターとしては、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルスプロモーター、及びＲｕｂｉｓｃｏアクチバーゼ遺伝子の植物プロモーターが挙げられる。

組織特異的又は組織好適プロモーター−組織特異的プロモーターは、大豆内の発現のための遺伝子に作動可能に連結される。任意に、組織特異的プロモーターは、大豆内の発現のための遺伝子に作動可能に連結されるシグナル配列をコード化するヌクレオチド配列に作動可能に連結される。組織特異的プロモーターに作動可能に連結された目的の遺伝子で形質転換された植物は、排他的に、又は優先的に、特異的組織内で導入遺伝子のタンパク質産物を産生する。

任意の組織特異的又は組織好適プロモーターが、本発明に用いられ得る。例示的な組織特異的又は組織好適プロモーターとしては、ファゼオリン遺伝子由来のものなどの根好適プロモーター（Ｍｕｒａｉ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３：４７６〜４８２（１９８３）、Ｓｅｎｇｕｐｔａ−Ｇｏｐａｌａｎ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３３２０〜３３２４（１９８５））、Ｃａｂ若しくはＲｕｂｉｓｃｏ由来のものなどの葉特異的及び光誘導性プロモーター（Ｓｉｍｐｓｏｎ，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，４（１１）：２７２３〜２７２９（１９８５）、Ｔｉｍｋｏ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１８：５７９〜５８２（１９８５））、ＬＡＴ５２由来のものなどの葯特異的プロモーター（Ｔｗｅｌｌ，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１７：２４０〜２４５（１９８９））、Ｚｍ１３由来のものなどの花粉特異的プロモーター（Ｇｕｅｒｒｅｒｏ，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２４４：１６１〜１６８（１９９３））、又はａｐｇ由来のものなどの小胞子好適プロモーター（Ｔｗｅｌｌ，ｅｔａｌ．，Ｓｅｘ．ＰｌａｎｔＲｅｐｒｏｄ．，６：２１７〜２２４（１９９３））が挙げられるが、これらに限定されない。

導入遺伝子によって産生されるタンパク質の、葉緑体、小胞、ペルオキシソーム、グリオキシソーム、細胞壁、若しくはミトコンドリアなどの細胞内区画への、又はアポプラストへの分泌のための輸送は、シグナル配列をコード化するヌクレオチド配列を、目的のタンパク質をコード化する遺伝子の５’及び／又は３’領域に作動可能に連結する手段によって達成される。構造遺伝子の５’及び／又は３’末端の配列を標的化することは、タンパク質合成及び加工中に、コード化されるタンパク質が最終的にどこで区画化されるかを決定し得る。

シグナル配列の存在は、細胞内小器官若しくは細胞内区画のいずれかに、又はアポプラストへの分泌のために、ポリペプチドを導く。多くのシグナル配列が、当該技術分野において既知である。そのような配列の一例は、顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）遺伝子内の輸送ペプチドコード配列である。別の例は、リブロース１，５−二リン酸カルボキシラーゼオキシゲナーゼ（ＲｕＢｉｓＣｏ）遺伝子の小サブユニットから誘導される配列である。他の例については、Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０：４９（１９９２）、Ｋｎｏｘ，Ｃ．，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，９：３〜１７（１９８７）、Ｌｅｒｎｅｒ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．，９１：１２４〜１２９（１９８９）、Ｆｒｏｎｔｅｓ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，３：４８３〜４９６（１９９１）、Ｍａｔｓｕｏｋａ，ｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８８：８３４（１９９１）、Ｇｏｕｌｄ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１０８：１６５７（１９８９）、Ｃｒｅｉｓｓｅｎ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＪ．，２：１２９（１９９１）、Ｋａｌｄｅｒｏｎ，ｅｔａｌ．，Ｃｅｌｌ，３９：４９９〜５０９（１９８４）、Ｓｔｅｉｆｅｌ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，２：７８５〜７９３（１９９０）を参照されたい。

特定の用途に応じて、適切なプロモーター配列が使用されてよい。例えば、プロモーターは、構成型若しくは誘導性プロモーター、又はそれらの順列であってよい。「強い」プロモーターは、例えば、カリフラワーモザイクウイルス、イネタングロバシリフォルム（tungro bacilliform）ウイルス、トウモロコシ線条ウイルス、キャッサバ葉脈ウイルス、ミラビリスウイルス、ピーナッツ萎黄病線条カリモウイルス、ゴマノハグサモザイクウイルス、及びクロレラウイルスなどのウイルスから単離されたものであり得る。一実施形態では、そして当該技術分野で既知のように、出願人は、カリフラワーモザイクウイルス由来の構成型３５Ｓプロモーターを企図する。

Ｅ．遺伝子改変のためのジャガイモ植物
本説明では、「トランスジェニック植物」は、宿主植物ゲノムに通常は存在しない遺伝子、通常はＲＮＡへと転写されない、若しくはタンパク質へと翻訳（「発現」）されないＤＮＡ配列、又は、非形質転換の植物への導入が所望される任意の他の遺伝子若しくはＤＮＡ配列、例えば、非形質転換の植物内に通常存在し得るが、遺伝子改変すること、若しくは変更された発現を有することが所望される遺伝子などを含むがこれらに限定されない、核酸配列を組み込んでいる植物を指す。「トランスジェニック植物」の分類は、一次形質転換体、及び、例えば、標準的な遺伝質移入又は別の交配手順によって形質転換体をその系列に含む植物の両方を含む。

目的のペプチド及びタンパク質は、二倍体及び四倍体ジャガイモ植物（例えば、Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）の両方で産生され得る。「二倍体」及び「四倍体」という用語は、本明細書で使用される場合、各細胞（生殖細胞を除く）中に２対及び４対の各染色体を有するものと定義される。二倍体ジャガイモ植物は、小さく、かつ不揃いの形状及び色をした塊茎を生成した。四倍体ジャガイモ植物は、二倍体ジャガイモ植物よりも大きな葉及び塊茎バイオマスをもたらし、かつより早く成長する。四倍体ジャガイモ植物は、消費のために商業的に栽培される。

Ｆ．遺伝子改変の手法
核酸構築物は、好適な遺伝子改変技術を使用して、任意の植物細胞へと導入され得る。単子葉及び双子葉両方の被子植物又は裸子植物の植物細胞が、当該技術分野に既知である様々な方法で遺伝子改変され得る。例えば、Ｋｌｅｉｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４：５８３〜５９０（１９９３）、Ｂｅｃｈｔｏｌｄｅｔａｌ．，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ３１６：１１９４〜１１９９（１９９３）、Ｂｅｎｔｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２０４：３８３〜３９６（１９８６）、Ｐａｓｚｏｗｓｋｉｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．３：２７１７〜２７２２（１９８４）、Ｓａｇｉｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐ．１３：２６２〜２６６（１９９４）を参照されたい。例示的な手法としては、形質転換、電気穿孔法、粒子銃照射、リン酸カルシウム沈降、及びポリエチレングリコール融合、発芽花粉粒への移入、直接形質転換（Ｌｏｒｚｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１９９：１７９〜１８２（１９８５））、並びに当該技術分野に既知の他の方法が挙げられるが、これらに限定されない。

生物学的及び物理的植物形質転換プロトコルを含む、植物形質転換のための多くの方法が開発されている。例えば、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＧｌｉｃｋａｎｄＴｈｏｍｐｓｏｎＥｄｓ．，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ｐｐ．６７〜８８（１９９３）内のＭｉｋｉ，ｅｔａｌ．，「ＰｒｏｃｅｄｕｒｅｓｆｏｒＩｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇＦｏｒｅｉｇｎＤＮＡｉｎｔｏＰｌａｎｔｓ」を参照されたい。更に、植物細胞又は組織の形質転換並びに植物の再生のための発現ベクター及びインビトロ栽培方法が利用可能である。例えば、ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＰｌａｎｔＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＧｌｉｃｋａｎｄＴｈｏｍｐｓｏｎＥｄｓ．，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，ｐｐ．８９〜１１９（１９９３）内のＧｒｕｂｅｒ，ｅｔａｌ．，「ＶｅｃｔｏｒｓｆｏｒＰｌａｎｔＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」を参照されたい。

アグロバクテリウム媒介性形質転換−植物へと発現ベクターを導入するための１つの方法は、アグロバクテリウムの自然形質転換系に基づく。例えば、Ｈｏｒｓｃｈ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２７：１２２９（１９８５）を参照されたい。アグロバクテリウムツメファシエンス（A. tumefaciens）及びアグロバクテリウムリゾゲネス（A. rhizogenes）は、植物細胞を遺伝的に形質転換する植物病原性土壌細菌である。アグロバクテリウムツメファシエンス並びにアグロバクテリウムリゾゲネスのＴｉ及びＲｉプラスミドは、それぞれ、植物の遺伝的形質転換の原因となる遺伝子を担持する。例えば、Ｋａｄｏ，Ｃ．Ｉ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ＰｌａｎｔＳｃｉ．，１０：１（１９９１）を参照されたい。アグロバクテリウムベクター系及びアグロバクテリウム媒介性の遺伝子移入のための方法の説明は、Ｇｒｕｂｅｒら（上記）、Ｍｉｋｉら（上記）、及びＭｏｌｏｎｅｙ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓ，８：２３８（１９８９）によって提供されている。１９９６年１０月８日交付の米国特許第５，５６３，０５５号（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ及びＴｈｏｍａｓ）も参照されたい。

一実施形態では、アグロバクテリウムツメファシエンス及びアグロバクテリウムリゾゲネスなどのアグロバクテリウム種が、例えば、Ｎａｇｅｌｅｔａｌ．，ＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ６７：３２５（１９９０）に従って使用され得る。簡潔に述べると、アグロバクテリウムは、例えば電気穿孔法によって、植物発現ベクターで形質転換され得、その後アグロバクテリウムは、例えば周知のリーフディスク法によって、植物細胞に導入される。

上述のアグロバクテリウム形質転換方法は、双子葉植物の形質転換に有用であることが知られている。更に、全て参照により組み込まれる、ｄｅｌａＰｅｎａ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２５：２７４〜２７６（１９８７）、Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：２０４〜２０７（１９８８）、及びＳｈｉｍａｍａｔｏ，ｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３２８：２７４〜２７６（１９８９）は、アグロバクテリウムを使用して穀類単子葉植物を形質転換している。アグロバクテリウム媒介性の形質転換のための真空浸潤の使用を示す、Ｂｅｃｈｔｏｌｄ，ｅｔａｌ．，Ｃ．Ｒ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐａｒｉｓ３１６（１９９４）も参照されたい。

一実施形態では、形質転換ベクターは、その５’末端における「左境界」、及びその３’末端における「右境界」を特徴とする、アグロバクテリウム由来のＴ−ＤＮＡエレメントの代替物を含み得る。したがって、代替的なトランスファーＤＮＡは、標的植物ゲノムへと導入される望ましくない核酸の量を最低限に抑えるために、食用植物から単離され得る。そのような植物トランスファーＤＮＡ（Ｐ−ＤＮＡ）はまた、１つのポリヌクレオチドを別のものに移入することを支持する左及び右の境界様配列によって描写される。本目的では、Ｔ−ＤＮＡ又はＰ−ＤＮＡ構築物のいずれかが、所望のポリヌクレオチドを植物細胞へと移入するために使用され得る。当業者であれば、いくつかの場合では、アグロバクテリウム媒介性の形質転換によって植物ゲノムへと導入される望ましくない遺伝的エレメントの量及び数を低減することが望ましいことを理解するであろう。したがって、Ｐ−ＤＮＡ及びその境界様配列は植物ゲノムから単離されるため、当業者は、そのような場合にＰ−ＤＮＡを使用することができる。例えば、米国特許第７，５９８，４３０号及び同第７，９２８，２９２号を参照されたい。

直接遺伝子移入−まとめて直接遺伝子移入と称される植物形質転換のいくつかの方法が、アグロバクテリウム媒介性の形質転換の代替案として開発されている。植物形質転換の一般的に適用可能な方法は、１〜４μｍの寸法の微粒子銃の表面上にＤＮＡが担持される、微粒子銃（microprojectile）媒介性の形質転換である。植物細胞壁及び膜を貫通するために十分である３００〜６００ｍ／秒の速度に微粒子銃を加速する遺伝子銃装置で、発現ベクターを植物組織へと導入する。Ｓａｎｆｏｒｄ，ｅｔａｌ．，Ｐａｒｔ．Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，５：２７（１９８７）、Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．，ＴｒｅｎｄｓＢｉｏｔｅｃｈ．，６：２９９（１９８８）、Ｋｌｅｉｎ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ．，６：５５９〜５６３（１９８８）、Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｃ．，ＰｈｙｓｉｏｌＰｌａｎｔ，７：２０６（１９９０）、Ｋｌｅｉｎ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：２６８（１９９２）。１９９１年５月１４日交付の米国特許第５，０１５，５８０（Ｃｈｒｉｓｔｏｕら）、及び１９９４年６月２１日交付の米国特許第５，３２２，７８３号（Ｔｏｍｅｓら）も参照されたい。

植物へのＤＮＡの物理的送達の別の方法は、標的細胞の超音波処理である。Ｚｈａｎｇ，ｅｔａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：９９６（１９９１）。あるいは、リポソーム及びスフェロプラスト融合が、植物へと発現ベクターを導入するために使用されている。Ｄｅｓｈａｙｅｓ，ｅｔａｌ．，ＥＭＢＯＪ．，４：２７３１（１９８５）、Ｃｈｒｉｓｔｏｕ，ｅｔａｌ．，ＰｒｏｃＮａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：３９６２（１９８７）。ＣａＣｌ_２沈降、ポリビニルアルコール、又はポリ−Ｌ−オルニチンを使用する、プロトプラストへのＤＮＡの直接的な取り込みも報告されている。Ｈａｉｎ，ｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９：１６１（１９８５）及びＤｒａｐｅｒ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ．，２３：４５１（１９８２）。プロトプラスト並びに細胞及び組織全体の電気穿孔法も記載されている（Ｄｏｎｎ，ｅｔａｌ．，ＩｎＡｂｓｔｒａｃｔｓｏｆＶＩＩｔｈＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｎｇｒｅｓｓｏｎＰｌａｎｔＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅＩＡＰＴＣ，Ａ２−３８，ｐ．５３（１９９０）、Ｄ’Ｈａｌｌｕｉｎ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＣｅｌｌ，４：１４９５〜１５０５（１９９２）、及びＳｐｅｎｃｅｒ，ｅｔａｌ．，ＰｌａｎｔＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４：５１〜６１（１９９４））。

的確な植物形質転換の手法は、形質転換のための細胞標的として選択される植物種、及び植物細胞型（例えば、胚軸及び子葉又は胚組織などの実生由来の細胞型）に応じていくらか異なり得る。植物種特異的な形質転換プロトコルは、ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙ４６：ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＣｒｏｐｓＩ（Ｙ．Ｐ．Ｓ．Ｂａｊａｊｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９９）、及びＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｉｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｒｅｓｔｒｙ４７：ＴｒａｎｓｇｅｎｉｃＣｒｏｐｓＩＩ（Ｙ．Ｐ．Ｓ．Ｂａｊａｊｅｄ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮｅｗＹｏｒｋ（２００１）に見出すことができる。

形質転換後、植物細胞が成長し、苗条及び根などの分化組織が出芽すると、成熟植物が再生される。典型的には、複数の植物が再生される。植物を再生する手法は、概して植物種及び細胞型依存性であり、当業者にとって既知である。植物組織培養に関する更なる指針は、例えば、ＰｌａｎｔＣｅｌｌａｎｄＴｉｓｓｕｅＣｕｌｔｕｒｅ，１９９４，ＶａｓｉｌａｎｄＴｈｏｒｐｅＥｄｓ．，ＫｌｕｗｅｒＡｃａｄｅｍｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、及びＰｌａｎｔＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ１１１），１９９９，ＨａｌｌＥｄｓ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓに見出すことができる。

遺伝子改変された植物材料の選択を助けるため、選択可能／スクリーニング可能マーカーが、異種遺伝子を発現しない他の植物又は植物組織特別することを可能にする。スクリーニング手順は、スクリーニング可能マーカー遺伝子によってコード化されるタンパク質の発現のアッセイを必要とする場合がある。そのようなマーカーの例としては、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、及びルシフェラーゼ（ＬＵＸ）遺伝子が挙げられる。同様に、形質転換事象を同定するために、肥料、抗生物質、除草剤、又は毒性化合物への耐性をコード化する遺伝子が使用され得る。選択可能マーカーの例としては、シアナミドヒドラターゼ遺伝子（ＣＡＨ）、ストレプトマイシン耐性をコード化するストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）遺伝子、カナマイシン及びジェネテシン耐性をコード化するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、ヒグロマイシンに対する耐性をコード化するヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ若しくはＡＰＨＩＶ）遺伝子、スルホニル尿素型除草剤に対する耐性をコード化するアセト乳酸シンターゼ（ａ／ｓ）遺伝子、ホスフィノトリシンなどのグルタミンシンターゼの作用を阻害する働きをする除草剤（Ｌｉｂｅｒｔｙ若しくはＢａｓｔａ）に対する耐性をコード化する遺伝子（ＢＡＲ及び／若しくはＰＡＴ）、又は当該技術分野で既知の他の同様の遺伝子が挙げられる。

トランスジェニック植物は、交雑されるか、又は自花受精して、後代植物に所望の遺伝子又はヌクレオチド配列を伝えることができる。この次世代のトランスジェニック植物の実生は、ＰＣＲ、酵素若しくは表現型アッセイ、ＥＬＩＳＡ、又はウェスタンブロット解析などの標準的な技術を使用して、所望のポリヌクレオチドの存在についてスクリーニングされ得る。あるいは、形質転換ベクターが選択可能／スクリーニング可能マーカー（複数可）を含む場合、植物の後代は、特定の物質に対する耐性若しくは許容度、又は、色、毛、若しくは他の独特な特色などの独特な表現型の発現について、選択され得る。

Ｇ．植物内の標的タンパク質の連続産生のための植物の温室栽培
本発明の方法は、自然な作物の成長周期によって課される制限を回避することができる。温室内の環境制御農業を使用して規定の環境条件下でトランスジェニック植物を生産することによって、植物バイオマスの生産を最適化する条件下で、一年のいかなる時でも、トランスジェニック植物が栽培され得る。結果として、本発明の方法は、開放耕地農業システムに関連する季節的中断を伴わずに、目的のタンパク質の連続供給を提供する。目的のタンパク質を含有するトランスジェニック植物が収穫されると、これらの植物は、本発明が継続的に実施され得るように、新たなトランスジェニック植物と直ちに交換される。本システムは、植物バイオマスの効率的かつ連続的な加工を可能にし、それによって、年間のタンパク質生産性率を上昇させ、設備の大きさ及び下流処理に関連する資本コストを最低限に抑える。

Ｈ．タンパク質の単離、精製、及び定量
産生されるタンパク質の種類及びタンパク質の位置に応じて、他のタンパク質抽出プロトコルがまた既知であり、当業者にとって容易に利用可能である。例えば、何ら限定するものではないが、産生されるタンパク質は、植物の葉、茎、又は塊茎内に位置する場合がある。同様に、そしてまた治療用タンパク質の用途に応じて、様々な精製プロトコル及び試薬が既知であり、容易に利用可能である。

ジャガイモ塊茎からの植物由来タンパク質の抽出、単離、及び精製は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｍａｅｌｖｉｌｌｅｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．２４７：３４４５〜３４５３（１９７２）及びＢｒｙａｎｔｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５：３４１８〜３４２４，（１９７６）を参照されたい。典型的には、ジャガイモを皮が無傷なままスライスし、均質化し、フィルタを通して発現する。結果として生じる汁をｐＨ調製し、遠心分離し、分画する。水洗浄及び熱処理によって精製を達成し、それによって澄んだ濾過画分をプール及び凍結乾燥する。凍結乾燥された粉末を水中に懸濁し、それを水に対して透析し、結果として生じる澄んだ濾液を凍結乾燥することによって、粗抽出物を得る。粗抽出物は、ＨＰＬＣ及び質量分析などの様々な技術によって分析され得る。

葉からのタンパク質の抽出、単離、及び精製も、文献中に記載されている。例えば、米国特許第４，４００，４７１号及び同第４，２６８，６３２号を参照されたい。タバコ、ホウレンソウ、大豆、及びアルファルファなどの植物の多肉葉は、典型的には、１０〜２０％の固体からなり、残りの画分は水である。固体部分は、水溶性及び非水溶性部分からなり、この後者は主に葉の線維性構造材料からなる。水溶性部分は、糖、ビタミン、アルカロイド、香味、アミノ酸などの比較的低い分子量（ＭＷ）の化合物、並びに、天然及び組み換えタンパク質などの比較的高いＭＷの他の化合物を含む。植物組織の可溶性部分内のタンパク質は、２つの画分に更に分割され得る。一方の画分は、光合成酵素であるＲｕｂｉｓｃｏを主に含む。Ｒｕｂｉｓｃｏ酵素は、約５５０ｋＤの分子量を有する。この画分は、一般的に、「画分１タンパク質」と称される。Ｒｕｂｉｓｃｏは、葉の全タンパク質含有量の最大２５％、及び葉の固形物の最大１０％を構成するように豊富である。他方の画分は、タンパク質とペプチドとの混合物を含有し、典型的には約３ｋＤ〜約１００ｋＤの範囲の分子量、並びに糖、ビタミン、アルカロイド、及びアミノ酸を含む他の化合物を有する。この画分は、まとめて「画分２タンパク質」と称される。画分２タンパク質は、未変性の宿主材料、異種タンパク質、及びペプチドであり得る。トランスジェニック植物は、１，０００ｋＤ超の分子径を有する植物ウイルス粒子を含有してもよい。

植物タンパク質を単離するための基本的なプロセスは、一般的に、葉組織を分解し、結果として生じるパルプを押圧して、未加工の植物抽出物を生成することから始まる。このプロセスは、典型的には、望ましくない酸化を抑制するために還元剤又は抗酸化剤の存在下で実行される。様々なタンパク質構成成分及び微粒子緑色着色材料を含有する未加工の植物抽出物を、ｐＨ調整及び加熱する。調整後の未加工の植物抽出物の典型的なｐＨ範囲は、約５．３〜約６．０である。この範囲は、画分１タンパク質の単離のために最適化されている。緑色着色材料の凝固を引き起こす加熱は、典型的には５０℃近くに制御される。凝固した緑色着色材料は、次に、中等度の遠心分離によって除去され、二次植物抽出物をもたらし得る。その後、この二次植物抽出物を冷却し、室温以下の温度で貯蔵する。長期間、例えば２４時間後、Ｒｕｂｉｓｃｏを茶色の汁から結晶化する。結晶化された画分１タンパク質は、その後、遠心分離によって液体から分離され得る。画分２タンパク質は液体中に残り、４．５近くのｐＨに更に酸性化されると精製され得る。あるいは、二次植物抽出物からのＲｕｂｉｓｃｏの結晶形成は、冷却の代わりに十分な量のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の添加によって誘導されてもよい。結晶化された画分タンパク質は、他の分析のために、ある特定の緩衝液中に溶解される場合がある。

本トランスジェニック植物は、野生型対照植物と比較して増加した治療用タンパク質の産生を特徴とする。タンパク質の定量的増加は、ウェスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、並びに標準的なＢｒａｄｆｏｒｄアッセイを含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知のいくつかの方法によってアッセイされ得る。

精製されたタンパク質から薬学的製剤が調製され得、そのような製剤は、好適な疾患又は病態を治療するために使用され得る。一般的に、そして当該技術分野で既知のように、精製されたタンパク質は、薬学的に許容される担体又は希釈剤と、治療される患者に対する望ましくない副作用の非存在下で治療上有用な効果を発現するために十分な量で混和される。そのような組成物を配合するためには、タンパク質の重量分画を、治療される病態が改善するように有効な濃度で、選択された担体又は希釈剤中に溶解、懸濁、分散、又は別様に混合する。しかしながら、濃度及び薬用量は、緩和される病態の重症度に従って異なり得ることが理解される。いかなる特定の対象についても、特定の薬物投与法は、製剤を投与するか、又は製剤の投与を監視する個人の個別の判断に従って、経時的に調製され得ることが更に理解される。

薬学的溶液又は分散液は、例えば、無菌希釈剤、例えば水など、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウム、又はカルボキシメチルセルロースを含み得る。使用され得る担体としては、それによって溶液又は分散液を形成するための、水、食塩水溶液、水性ブドウ糖、グリセロール、グリコール、エタノールなどが挙げられる。所望の場合、薬学的組成物は、湿潤剤などの非毒性補助物質、乳化剤、可溶化剤、ベンジルアルコール及びメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸及び亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤、アクテテート、クエン酸、又はリン酸緩衝液などのｐＨ緩衝剤、並びにそれらの組み合わせを含有してもよい。

Ｉ．トランスジェニックジャガイモ内の食用ワクチン産生
植物内で発現されるワクチンタンパク質は、「食用ワクチン」を提供し得、このワクチンを含有する植物のヒトによる摂取は、増加した免疫応答を刺激し、ウイルスに対する免疫付与を提供する。例えば、Ｍａｓｏｎｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１１７４５〜１１７４９（１９９２）を参照されたい。化学的又は発酵ベースのプロセスによって製造される合成ペプチドの生産及び精製の高いコストは、経口ワクチンとしてのそれらの広範な規模の使用を妨げる場合がある。他方では、トランスジェニック植物内での免疫原性タンパク質の産生は、経済的な代替案を提示する。大腸菌及びストレプ卜コッカス変異体の細菌性抗原を発現するトランスジェニック植物を生産する試みが行われている。例えば、Ｃｕｒｔｉｓｓら（国際公開第９０／０２４８号）は、大腸菌ＬＴ−Ｂ遺伝子を用いるヒマワリの形質転換を報告する。また、タバコ及びジャガイモ植物内でのＬＴ−Ｂの発現、並びにそのＧ_Ｍ１結合性ペンタマーへの組み立てが報告されている（Ｈａｑら、１９９５）。更に、Ａｒｎｔｚｅｎら（国際公開第９６／１２８０１号）は、ＳＥＫＤＥＬミクロソーム保留シグナルを任意に含有する、ＬＴ−Ａ及びＬＴ−Ｂの非依存性かつ協調的発現のためのベクターを開示する。

食用ワクチンは、ワクチン遺伝子を含有するベクターでトランスジェニック植物を形質転換することによって産生される。ワクチンの産生は、ウェスタンブロット解析、ＥＬＩＳＡ、並びに標準的なＢｒａｄｆｏｒｄアッセイによって検出され得る。ワクチンを産生するトランスジェニック植物は、加工なしで投与され得る。

あるいは、トランスジェニック植物は、植物材料を凍結乾燥又は脱水して水を除去することによって加工されてもよい。「脱水」は、空気乾燥若しくは噴霧乾燥によって、又は「凍結乾燥」によって実行され得、「凍結乾燥」は、急速凍結及び凍結状態での脱水（昇華と称されることがある）によって乾燥形態の植物組成物を調製することを指す。このプロセスは、約１時間〜７２時間にわたって、約室温の収容容器の周囲温度で凍結した生成物を維持するのに十分な圧力の真空下で、好ましくは約０．０７ｋＰａ未満（約５００ｍＴｏｒｒ）、より好ましくは約０．０３ｋＰａ未満（約２００ｍＴｏｒｒ）、更により好ましくは約０．０００１ｋＰａ未満（約１ｍＴｏｒｒ）で行われ得る。植物材料は、約１時間〜７２時間にわたって約６０℃〜約２００℃の温度のオーブンに植物材料を置くことによって「脱水」され得る。植物材料は、植物材料の重量が経時的に変化しなくなるとき、十分に「凍結乾燥」又は「脱水」されていると見なされる。例えば、上記の温度のオーブンに置かれる植物材料の重量は、水が蒸発するにつれて経時的に減少する。重量が変化しなくなるとき、水の全てが蒸発したことになり、植物材料は「脱水」されていると言うことができる。好ましくは、いずれの乾燥方法が使用されるにしても、最終的な材料は、全ての含水量の少なくとも９０重量％を除去するように十分に脱水される。「凍結乾燥」又は「脱水」された植物材料は、「凍結乾燥」又は「脱水」された植物材料を、薬学的に許容され、かつ避妊ポリペプチドと適合性である賦形剤を用いて乳化することによって、更に「加工」されてよい。好適な賦形剤としては、例えば、水、食塩水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組み合わせが挙げられ、「凍結乾燥」又は「脱水」された植物材料は、少なくとも４０重量％、そして好ましくは少なくとも５０重量％の賦形剤混合物を含む。更に、所望の場合、「凍結乾燥」又は「脱水」された植物材料は、湿潤剤若しくは乳化剤などの少量の補助物質、ｐＨ緩衝剤、又は植物材料の有効性を向上させるアジュバントを含有してもよい。本明細書で使用される場合、「凍結乾燥」又は「脱水」された植物材料は、薬学的に許容されるクリーム、軟膏、膏薬、又は座薬と植物材料を混和することによって更に加工され得、植物材料は、混和物の少なくとも４０重量％、そして好ましくは少なくとも５０重量％を構成する。あるいは、「脱水」された植物材料は、果汁、野菜汁、乳汁、水、又は多価若しくは多成分ワクチンを形成するための他のワクチン製剤などを含むがこれらに限定されない液体を用いて、植物材料を再構成することによって、更に加工され得る。

以下の実施例は、本発明を例示するために提示される。しかしながら、本発明がこれらの実施例に記載される特定の条件又は詳細に限定されないことを理解されたい。本明細書全体にわたって、公的に入手可能な文書へのいかなる参照も、参照により明確に組み込まれる。

方法及び構築物の特定の実施例を以下に提示する。それらは、例示的であり、本発明を限定するものではないよう意図される。

実施例１．ＧＦＰの標的化発現
２つの構築物を生成して、ＧＢＳＳのシグナルペプチドに融合されている（図２１及び配列番号８）か、又はＲｕＢｉｓＣｏのシグナルペプチドに融合されている（図２２及び配列番号９）ＥＧＦＰ遺伝子を使用して、ジャガイモ内でのＧＦＰ発現を比較した。対照として、シグナルペプチドを有しないＥＧＦＰ遺伝子を使用して、制御ベクターｐＳＩＭ１９４９（図２０）を作製した。ＧＦＰを強く発現し、インビトロで成長するトランスジェニック苗条を、蛍光顕微鏡法を使用して選択した。図２３に示されるように、ｐＳＩＭ１９４８小植物内のＧＦＰ発現は、シグナルペプチドを有しないＥＧＦＰ遺伝子を担持する対照構築物のものよりも僅かに強かったが、極度に強いＧＦＰ発現が、トランスジェニックのｐＳＩＭ１９４７小植物の葉内で検出された。これらの結果は、同時に起こる、ＧＢＳＳ輸送ペプチドを用いるタンパク質過剰発現、及び収束性プロモーターによるＡＧＰサイレンシングが、組み換えタンパク質産生の向上に有効であることを示す。

実施例２．パタチンＰＡＴＢ１遺伝子のサイレンシング
出願人は、パタチンＰＡＴＢ１遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号３及び配列番号４）から設計されるプライマーを使用してパタチン遺伝子の発現を抑制する核酸構築物も考案した。塊茎特異的な様式においてＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍパタチン遺伝子をサイレンシングすることを目的に、ｐＳＩＭ１９３４プラスミド（図１４）を構築した。３０個のトランスジェニック系統を、ｐＳＩＭ１９０３ベクター（図９）で元々形質転換されたＧＦＰ（配列番号７）を過剰発現する親材料から生成した。ｐＳＩＭ１９３４の実験系統のうちのいずれも、塊茎内の増加したＧＦＰ発現を示さなかった（図１５）。更に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析は、１０個の実験系統内でサイレンシングによって過半量のパタチンタンパク質（約４０ｋＤａのバンド）が排除されたことを実証した（図１６）。

実施例３．ＣＤ４Ｂプロテアーゼ遺伝子のサイレンシング
出願人は、ジャガイモゲノム配列決定コンソーシアム公開データ（Potato Genome Sequencing Consortium Public Data）におけるｃＤＮＡ配列ＰＧＳＣ０００３ＤＭＧ４０２０１４４７６（配列番号５及び配列番号６）のＣＤ４Ｂ特異的領域を使用して、ＣＤ４Ｂ（ＡＴＰ依存性プロテアーゼＡＴＰ結合サブユニットｃｌｐＡ相同体）の発現を抑制する核酸構築物を考案した。塊茎特異的な様式においてＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍＣＤ４Ｂ遺伝子をサイレンシングすることを目的に、ｐＳＩＭ１９３９プラスミド（図１７）を構築した。２６個のトランスジェニック系統を、ｐＳＩＭ１９０３ベクター（図９）で元々形質転換されたＧＦＰ（配列番号７）を過剰発現する親材料から生成した。塊茎内のＧＦＰ蓄積について分析したとき、７個のトランスジェニック系統が、親系統（ｐＳＩＭ１９０３）と比較して２〜３倍のＧＦＰ蓄積の増加を示した。（図１８）。ＣＤ４Ｂ遺伝子のサイレンシングを確認するため、親系統（ｐＳＩＭ１９０３）と比較して２〜３倍のＧＦＰ蓄積の増加を示した７個のトランスジェニック系統のノーザンブロット解析を実行した。ノーザンブロット解析は、いずれの系統においてもＣＤ４Ｂ転写物を検出できず、したがってＣＤ４Ｂ遺伝子サイレンシングを確証した。これらの結果は、ＣＤ４Ｂプロテアーゼのサイレンシングを組み換えタンパク質（ＧＦＰ）産生の２〜３倍の増加と関連付け、ＣＤ４Ｂの塊茎特異的なサイレンシングが組み換えタンパク質産生を向上させるために使用され得ることを実証する。

実施例４．ジャガイモ内でのヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）の過剰発現
出願人は、ジャガイモ内で目的の遺伝子を過剰発現する核酸構築物を考案した。ジャガイモ植物内でヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）を過剰発現することを目的に、ｐＳＩＭ１９３６プラスミド（図２６）を構築した。発現カセット

ヒトインターロイキン２（ＩＬ−２）遺伝子の短縮版を、ＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍパタチンＥＲ輸送ペプチド（Ｎ末端）とＥＲ保留シグナル（Ｃ末端）との間に配置した（図２４）。ＥＲ輸送ペプチド、ＩＬ−２遺伝子、及びＥＲ保留シグナル（ｖ１〜ｖ４８）を含有するＩＬ−２インサートの４８個のコドン最適化多様体を、ＤＮＡ２．０（ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，ＣＡ，ＵＳＡ）によるクローン化ベクター内で生成した。各変異型は、開始コドンの前にＢａｍＨＩ−ＮｃｏＩ制限部位を、そして終止コドンの後にＳｐｅＩ部位を有した（図２５）。植物発現のため、ＥＲ標的化遺伝子カセット全体を、Ｓｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍユビキチンプロモーター（Ｕｂｉ７）とＳｏｌａｎｕｍｔｕｂｅｒｏｓｕｍユビキチンターミネーター（Ｕｂｉ３Ｔ）の間で、ｐＳＩＭ１９３６プラスミドに挿入した（図２６）。異なるコドン最適化ＩＬ−２インサートを含有する６個の発現ベクターを、１工程３ピースのライゲーションで生成した。各変異型は、異なるコドン最適化ＩＬ−２インサート（ｖ１９、ｖ２１、ｖ３０、ｖ４３、ｖ４５、ｖ４７）を有した。追加のコドン最適化ＩＬ−２インサートを含有する１２個の追加の発現ベクターを、ＰＣＲ変異誘発によって第２のＳｐｅＩ部位が除去された修飾ｐＳＩＭ１９３６プラスミドを使用して、２工程ライゲーションで生成した。プロモーターからターミネーターまで発現カセット全体を含有するＡｐａＩ−ＸｈｏＩ断片（２，５４２ｂｐ）を除去することによって、空ベクター対照を生成した。Ｋｌｅｎｏｗ断片（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏＬａｂｓ，Ｉｎｃ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、続いてＴ４ＤＮＡリガーゼ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇ，ＰＡ，ＵＳＡ）を用いる平滑末端ライゲーションを使用して５’オーバーハングを充填した。

植物の形質転換及び成長
半強度のＭ５１６塩及びビタミン（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＳｈａｗｎｅｅＭｉｓｓｉｏｎ，ＫＳ，ＵＳＡ）、１．５％のスクロース、２．５ｇ／ｌのグルコン酸カルシウム、及び２ｇ／ｌのゲルライト（ｐＨ５．７）を収容するマゼンタボックス内に、ビンチェ母株を維持した。アグロバクテリウム菌株ＬＢＡ４４０４を、５０ｍｇ／ｌのカナマイシン及び１００ｍｇ／ｌのストレプトマイシンを含有するＬＢ培地（２０ｇ／ｌＬＢブイヨン）において、２８℃で一晩成長させた。結果として生じる培養物を、１０分間９，５００ｒｐｍで沈降させ、３％のスクロース（ｐＨ５．７）を含むＭ４０４塩及びビタミン（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中に再懸濁して、ＯＤ６００で０．２の細胞濃度を得た。４〜６ｍｍのビンチェ節間部分を４週齢の母株から切断し、異なる発現ベクター変異型を含有するアグロバクテリウム懸濁液に１０分間感染させ、次に吸引した。次にこの外植片を、共培養培地（１／１０Ｍ４０４、３％のスクロース、及び７ｇ／ｌの寒天（ｐＨ５．７））に２日間移し、その後カルス誘導培地（Ｍ４０４、３％のスクロース、７ｇ／ｌの寒天、２．５ｍｇ／ｌのゼアチンリボシド、０．１ｍｇ／ｌのＮＡＡ、１５０ｍｇ／ｌのチメンチン、及び１００ｍｇ／ｌのカナマイシン（ｐＨ５．７））に移した。１ヶ月後、外植片を、苗条誘導培地（Ｍ４０４、３％のスクロース、７ｇ／ｌの寒天、２．５ｍｇ／ｌのゼアチンリボシド、０．３ｍｇ／ｌのジベレリン酸、１５０ｍｇ／ｌのチメンチン、及び１００ｍｇ／ｌのカナマイシン（ｐＨ５．７））に移した。選択的発根培地（半強度のＭ５１６、１．５％のスクロース、１００ｍｇ／ｌのカナマイシン、１００ｍｇ／ｌのチメンチン、及び２ｇ／ｌのゲルライト（ｐＨ５．７））を使用して、発根アッセイを２回実行した。植物材料を、２４℃で１６時間の光周期下で、Ｐｅｒｃｉｖａｌ成長チャンバ内に維持した。２５個の表現型的に正常な耐カナマイシン性の苗条を、温室内での成長のために選択した。次に、根付いた植物を、ＳｕｎｓｈｉｎｅＭｉｘ＃１（ＳｕｎＧｒｏＨｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｇａｗａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）を含む８リットル（２ガロン）の鉢に配置し、全強度のＭｉｒａｃｌｅＧｒｏｗ（１５ｍｌ／４リットル（１Ｔｂｓ／ガロン）水）を用いて２週間の間隔で３回施肥した。４リットル（１ガロン）の鉢１つ当たり２３７ミリリットル（１カップ）の肥料溶液を使用した（８リットル（２ガロン）の鉢につき４７３ｍｌ（２カップ））。温度制御された（最低１８℃／最高２７℃）温室内での３ヶ月の成長の後、半成熟の塊茎を得た。夏の間、昼光／長さは補足しなかった。

ＩＬ−２定量
ＥＬＩＳＡ及びＩＬ−２産生の決定のため、４ｍｍのコルクボーラーを用いて５０ｍｇの試料を塊茎の中心から抽出した。次にこの試料を、ペレット乳棒を使用して２５０μｌのアッセイ緩衝液を含む１．５ｍｌの遠心管内で均質化した。均質化緩衝液及び試料は、常に氷上に保持し、９５００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心分離した。ＢＤＯｐｔＥＩＡヒトＩＬ−２ＥＬＩＳＡキットＩＩプロトコル（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＳａｎＪｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）に従って、ＥＬＩＳＡを実行した。ＭｕｌｔｉｍｏｄｅＤｅｔｅｃｔｏｒＤＴＸ８８０（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）によって、９６ウェルプレートにおいて試料を読み取った。それぞれの独立した系統全体をスクリーニングするために、単一の塊茎から１つの試料を採取した。次に、ＩＬ−２産生の最高レベルを有する系統を、３つの個別の塊茎から再度試料採取した。吸収度は４５０／８ｎｍで読み取った。

結果
図２７は、試験された６つのコドン最適化ＩＬ−２変異型のうちの３つ（ｖ１９、ｖ２１、及びｖ３０）について、独立して形質転換されたビンチェジャガイモの系統からの塊茎内でのＩＬ−２産生を示す。１９３６−１８は、非最適化陽性対照であった。各変異型について、２５個の独立したトランスジェニック系統を生成した。各色分類は、形質転換に使用されたコドン最適化ＩＬ−２変異型を表す。各バーは、独立したトランスジェニック系統からの３つの個別の塊茎内のＩＬ−２の平均レベルを表す。結果は、異なるコドン変異型から得られた特定のトランスジェニック系統内で、ＩＬ−２産生が２〜３倍増加したことを示す。追加の実験（データは示されない）では、ＩＬ−２産生は、特定のトランスジェニック系統内で最大１１倍増加した。

同様に、図２８は、１２個のコドン最適化ＩＬ−２変異型について、独立して形質転換されたビンチェジャガイモの系統からの塊茎内でのＩＬ−２産生を示す。１９３６−１８は、非最適化陽性対照であった。各変異型について、２５個の独立したトランスジェニック系統を生成した。各色は、形質転換に使用されたコドン最適化ＩＬ−２変異型を表す。各バーは、独立したトランスジェニック系統からの３つの個別の塊茎内のＩＬ−２の平均レベルを表す。結果は、異なるコドン変異型から得られた特定のトランスジェニック系統内で、ＩＬ−２産生が２．５倍増加したことを示す。

実施例５．ジャガイモ内での他の目的の遺伝子の過剰発現
他の実施形態では、出願人は、クロロゲン酸誘導因子（ＣＡＩ）遺伝子の過剰発現が、クロロゲン酸、並びにアントシアニン及びフラボノールの４倍の増加を刺激することを実証した（図３）。

同様に、本発明の方法を使用してジャガイモ内でビタミンＣ生合成（ＶＴＣ２）遺伝子を過剰発現した（図５）。

同様に、強い構成型プロモーターで過剰発現すると、ＧＦＰ遺伝子発現はジャガイモ茎外植片内で著しく増加し（図６）、本発明の方法に従って、ジャガイモの花、葉、及び茎内で高レベルのＧＵＳ遺伝子発現を得ることができる（図７）。

実施例６．ＲＮＡサイレンシングの抑制因子であるＰ１９の過剰発現
トランスジェニック植物内の異種タンパク質の発現は、植物宿主内の転写後の遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）の起動によって減少し得る。Ｐ１９などの遺伝子サイレンシングの植物ウイルス抑制因子の発現は、葉内のこの応答を低減し、異種タンパク質の発現レベルを数倍上昇させることができる（Ｃｉｒｃｅｌｌｉｅｔａｌ，２０１０ＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄＢｕｇｓ１：２２１〜２２４）。驚くべきことに、出願人は、Ｐ１９の発現が塊茎内のＧＦＰの産生も増加させたことを発見した。

Ｔ−ＤＮＡ境界内の２×３５Ｓプロモーター駆動Ｐ１９Ｒ４３（配列番号２）Ｐ１９変異体と共にｐＳＩＭ１９２７プラスミド（図１０）を構築した。Ｐ１９Ｒ４３を過剰発現する３３個の系統を、ｐＳＩＭ１９０３ベクター（図９）で元々形質転換されたＧＦＰ（配列番号７）を過剰発現する親材料から生成した。全系統が、明白な多面発現性効果を伴わずに温室内で正常に成長した。トランスジェニック系統の塊茎特異的ＧＦＰ蓄積について、空ベクター系統（ｐＳＩＭ１３６１）及び親系統（ｐＳＩＭ１９０３）と比較して、視覚的にスクリーニングした。高いＧＦＰ発現を示す１２個の系統を、ＧＦＰ定量、ウェスタンブロット解析、及びノーザンブロット解析のために選択した。空ベクター系統における量と比較して、ＧＦＰ量の２０〜６０％の増加が、１２個のトランスジェニック系統のうちの１０個で検出された（図１１及び図１２）。

Ｐ１９遺伝子の発現を確認するため、高いＧＦＰ発現を示す７個の系統からのＲＮＡを、Ｐ１９プローブを用いて分析した。最高のＧＦＰ発現を有する２個の系統を含む３個の系統で、Ｐ１９転写物が検出された（図１３）。ＲＮＡサイレンシングの変異ｐ１９抑制因子の発現をＧＦＰタンパク質の上昇した発現と関連付けるこれらの結果は、ＲＮＡサイレンシングの抑制因子であるＰ１９の抑制が、植物内のタンパク質産生を向上させることを実証する。

実施例７．同時に起こる、ＧＦＰ及びパタチンの過剰発現並びにＣＤ４Ｂ遺伝子抑制。
パタチン及びＣＤ４Ｂ遺伝子発現を抑制するための構成成分を含む発現カセットを構築した。発現カセットを含有するベクターで、ＧＦＰを過剰発現する親材料を形質転換することによって、約３０個のトランスジェニック系統を生成した。パタチン又はＣＤ４Ｂのいずれかのみが抑制された非形質転換系統及びトランスジェニック系統と比較すると、増加したＧＦＰ産生が、トランスジェニック植物の塊茎内のＧＦＰ蓄積分析によって観察された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析は、過半量のパタチンタンパク質（約４０ｋＤａのバンド）が排除されたことを実証した。ノーザンブロット解析は、ＣＤ４Ｂ転写物が抑制されたことを示した。パタチン及びＣＤ４Ｂの遺伝子発現を同時に抑制することによって、ＧＦＰ産生が向上した。

実施例８．同時に起こる、Ｐ１９及びＧＦＰの過剰発現並びにパタチン遺伝子抑制。
パタチン遺伝子発現を抑制し、かつＰ１９を過剰発現するための構成成分を含む発現カセットを構築した。発現カセットを含有するベクターで、ＧＦＰを過剰発現する親材料を形質転換することによって、約３０個のトランスジェニック系統を生成した。パタチン遺伝子のみが抑制されている非形質転換系統及びトランスジェニック系統と比較すると、トランスジェニック植物の塊茎内でのＧＦＰ産生は増加した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット解析は、パタチン遺伝子抑制を確証した。Ｐ１９遺伝子の発現を確認するため、高いＧＦＰ発現を示す系統からのＲＮＡを、Ｐ１９プローブを用いて分析した。

実施例９．同時に起こる、ＧＦＰ及びＰ１９遺伝子の過剰発現並びにパタチン及びＣＤ４Ｂ遺伝子抑制。
Ｐ１９及びＧＦＰを過剰発現し、かつパタチン及びＣＤ４Ｂ遺伝子の両方を抑制するための構成成分を含む発現カセットを構築した。発現カセットを含有するベクターで、ＧＦＰを過剰発現する親材料を形質転換することによって、約３０個のトランスジェニック系統を生成した。パタチン遺伝子のみが抑制されているか（実施例８）、又はＧＦＰのみが過剰発現されているがＰ１９は過剰発現されていない（実施例７）、非形質転換系統及びトランスジェニック系統と比較すると、トランスジェニック植物の塊茎内でのＧＦＰ産生はトランスジェニック植物の塊茎内で増加した。

実施例１０．ジャガイモ塊茎内でのタンパク質産生に対する遺伝子サイレンシング及び過剰発現方策の効果
ＧＦＰレポーター遺伝子の定量を使用して、ジャガイモ塊茎内での組み換えタンパク質産生に対する様々な遺伝子サイレンシング及び過剰発現方策の効果を決定した。サイレンシング及び過剰発現方策は以下の通りであった。（ａ）ＣＤ４Ｂのみのサイレンシング；ＧＦＰの発現を３５Ｓプロモーターによって駆動した、（ｂ）ＣＤ４Ｂ及びパタチンのサイレンシング；ＧＦＰの発現を３５Ｓプロモーターによって駆動した、（ｃ）ＣＤ４Ｂ及びパタチンのサイレンシング、並びにＰ１９の過剰発現；ＧＦＰの発現を３５Ｓプロモーターによって駆動した、（ｄ）ＡＧＰのサイレンシング；ＧＦＰの発現をＧＢＳＳ輸送ペプチドによって標的化し、３５Ｓプロモーターによって駆動した、（ｅ）ＡＧＰのサイレンシング；ＧＦＰの発現をＲｕｂｉｓｃｏ輸送ペプチドによって標的化し、３５Ｓプロモーターによって駆動した、（ｆ）ＡＧＰのサイレンシング；ＧＦＰの発現を３５Ｓプロモーターによって駆動した。ＧＦＰの発現が３５Ｓプロモーターによって駆動されるＧＦＰｐＳＩＭ１９０３構築物を対照として使用した。これらの方策を表２に要約する。

植物の形質転換及び成長
表２に記載されるように、アグロバクテリウム分散液が異なる構築物を含有したことを除いて、実施例４に記載されるようにビンチェ母株を維持及び形質転換した。ｐＳＩＭ１９０３−２親系統の形質転換については、ヒグロマイシンの選択は５ｍｇ／Ｌで使用した。

タンパク質定量
ＧＦＰ定量のために、１０個の系統を分析した構成型ＣＤ４Ｂサイレンシングを除いて、各変異型について２５個の系統を分析した。４ｍｍのコルクボーラーを用いて５０ｍｇの試料を塊茎の中心から抽出した。次にこの試料を、ペレット乳棒を使用して２５０μｌのアッセイ緩衝液を含む１．５ｍｌの遠心管内で均質化した。均質化緩衝液及び試料は、常に氷上に保持し、９５００ｒｐｍで２０分間４℃で遠心分離した。ＢｉｏＶｉｓｉｏｎキット（＃Ｋ８１５−１００）プロトコル（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎＩｎｃ．，Ｍｉｌｐｉｔａｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）に従ってＧＦＰ定量を実行した。ＭｕｌｔｉｍｏｄｅＤｅｔｅｃｔｏｒＤＴＸ８８０（ＢｅｃｋｍａｎＣｏｕｌｔｅｒ）によって、９６ウェルプレートにおいて試料を読み取った。吸収度は４５０／８ｎｍで読み取った。

結果
図２９は、ＧＦＰ発現によって測定される異種タンパク質産生についての、異なるサイレンシング、過剰発現、及び標的化方策の効果を示す。１０個の系統を分析したＣＤ４Ｂサイレンシングを除いて、各方策につき２５個の系統を分析した。各バーは、ＧＦＰ発現について分析された３つの塊茎を表す。ＣＤ４Ｂのみ、又はＣＤ４Ｂ及びパタチンのサイレンシング（赤色、黄色、及び橙色のバー）は、ＧＦＰ対照と比較してタンパク質レベルを僅かに向上させただけであった。ＧＢＳＳプロモーター及び収束性ＡＧＰプロモーターを使用するＡＧＰのサイレンシング並びに顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＢＳ）輸送ペプチドを用いるＧＦＰ過剰発現（緑色のバー）は、タンパク質レベルの著しい上昇、最大４〜６倍の上昇をもたらした。Ｒｕｂｉｓｃｏ（Ｒｂｃｓ）標的化ペプチドのサイレンシング（青色のバー）は、１個の系統内でのみ、著しいタンパク質の増加をもたらした。ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）のサイレンシング（灰色のバー）は、ＧＦＰ含有量の最大３倍の著しい増加をもたらした。これらの結果は、ジャガイモ塊茎内での異種タンパク質産生が、本発明に従うサイレンシング、過剰発現、及び標的化方策を使用して著しく増加され得ることを明らかに示す。

Claims

形質転換されたジャガイモ植物内で異種タンパク質を産生する方法であって、
ａ．発現カセットで植物を形質転換する工程であって、前記発現カセットが、（ｉ）パタチン発現を抑制することができるヌクレオチド配列、及び（ｉｉ）ＣＤ４Ｂ発現を抑制することができるヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）マーカー遺伝子、及び（ｉｖ）目的のタンパク質又はペプチドをコード化する遺伝子を含む、工程と、
ｂ．前記形質転換された植物を規定条件下で栽培する工程と、
ｃ．前記目的のタンパク質を抽出する工程と、
を含む、方法。
前記パタチン発現を抑制することができるヌクレオチド配列が、配列番号３及び配列４に記載されるパタチンのアンチセンス配列及びセンス配列を含み、前記ＣＤ４Ｂ発現を抑制することができるヌクレオチド配列が、配列番号５及び配列番号６に記載されるＣＤ４Ｂのアンチセンス配列及びセンス配列を含む、請求項１に記載の方法。
前記マーカー遺伝子が、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＵＳ、ＬＵＸ、ＣＡＨ、ＳＰＴ、ＮＰＴＩＩ、ＨＰＴ、ＡＰＨＩＶ、ＢＡＲ、ＰＡＴ、ＣＨＳ、ＡＨＡＳ、及びフラボノイド合成遺伝子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
前記目的のタンパク質が、インターロイキン−２、ヒルジン、インスリン、インターフェロン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、エリスロポエチン、上皮成長因子、炭疽ワクチン、コレラワクチン、ＤＰＴワクチン、ヒブワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン、ＨＰＶワクチン、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、ＭＭＲワクチン、ＭＭＲＶワクチン、肺炎球菌ワクチン、肺炎球菌多糖体ワクチン、ポリオワクチン、ロタウイルスワクチン、天然痘ワクチン、結核ワクチン、腸チフスワクチン、黄熱ワクチン、パルボウイルスワクチン、ジステンパーワクチン、アデノウイルスワクチン、パラインフルエンザワクチン、ボルデテラワクチン、狂犬病ワクチン、レプトスピラ症ワクチン、ライム病ワクチン、コロナワクチン、回虫／鉤虫ワクチン、駆虫剤ワクチン、ＲＮＦＮワクチン、及びＨＩＶワクチンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
形質転換されたジャガイモ植物内で異種タンパク質を産生する方法であって、
ａ．発現カセットで植物を形質転換する工程であって、前記発現カセットが、（ｉ）パタチン発現を抑制することができるヌクレオチド配列、（ｉｉ）Ｐ１９を過剰発現することができるヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）マーカー遺伝子、及び（ｉｖ）目的のタンパク質又はペプチドをコード化する遺伝子を含む、工程と、
ｂ．前記形質転換された植物を規定条件下で栽培する工程と、
ｃ．前記目的のタンパク質を抽出する工程と、
を含む、方法。
前記パタチン発現を抑制することができるヌクレオチド配列が、配列番号３及び配列４に記載されるパタチンのアンチセンス配列及びセンス配列を含み、前記Ｐ１９を過剰発現することができるヌクレオチド配列が、配列番号２に記載されるＰ１９配列を含む、請求項５に記載の方法。
前記マーカー遺伝子が、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＵＳ、ＬＵＸ、ＣＡＨ、ＳＰＴ、ＮＰＴＩＩ、ＨＰＴ、ＡＰＨＩＶ、ＢＡＲ、ＰＡＴ、ＣＨＳ、ＡＨＡＳ、及びフラボノイド合成遺伝子からなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
前記目的のタンパク質が、インターロイキン−２、ヒルジン、インスリン、インターフェロン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、エリスロポエチン、上皮成長因子、炭疽ワクチン、コレラワクチン、ＤＰＴワクチン、ヒブワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン、ＨＰＶワクチン、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、ＭＭＲワクチン、ＭＭＲＶワクチン、肺炎球菌ワクチン、肺炎球菌多糖体ワクチン、ポリオワクチン、ロタウイルスワクチン、天然痘ワクチン、結核ワクチン、腸チフスワクチン、黄熱ワクチン、パルボウイルスワクチン、ジステンパーワクチン、アデノウイルスワクチン、パラインフルエンザワクチン、ボルデテラワクチン、狂犬病ワクチン、レプトスピラ症ワクチン、ライム病ワクチン、コロナワクチン、回虫／鉤虫ワクチン、駆虫剤ワクチン、ＲＮＦＮワクチン、及びＨＩＶワクチンからなる群から選択される、請求項５に記載の方法。
形質転換されたジャガイモ植物内で異種タンパク質を産生する方法であって、
ａ．発現カセットで植物を形質転換する工程であって、前記発現カセットが、（ｉ）パタチン発現を抑制することができるヌクレオチド配列、（ｉｉ）ＣＤ４Ｂ発現を抑制することができるヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）Ｐ１９を過剰発現することができるヌクレオチド配列、（ｉｖ）マーカー遺伝子、及び（ｖ）目的のタンパク質又はペプチドをコード化する遺伝子を含む、工程と、
ｂ．前記形質転換された植物を規定条件下で栽培する工程と、
ｃ．前記目的のタンパク質を抽出する工程と、
を含む、方法。
前記パタチン発現を抑制することができるヌクレオチド配列が、配列番号３及び配列４に記載されるパタチンのアンチセンス配列及びセンス配列を含み、前記ＣＤ４Ｂ発現を抑制することができるヌクレオチド配列が、配列番号５及び配列番号６に記載されるＣＤ４Ｂのアンチセンス配列及びセンス配列を含み、前記Ｐ１９を過剰発現することができるヌクレオチド配列が、配列番号２に記載されるＰ１９配列を含む、請求項９に記載の方法。
前記マーカー遺伝子が、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＵＳ、ＬＵＸ、ＣＡＨ、ＳＰＴ、ＮＰＴＩＩ、ＨＰＴ、ＡＰＨＩＶ、ＢＡＲ、ＰＡＴ、ＣＨＳ、ＡＨＡＳ、及びフラボノイド合成遺伝子からなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
前記目的のタンパク質が、インターロイキン−２、ヒルジン、インスリン、インターフェロン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、エリスロポエチン、上皮成長因子、炭疽ワクチン、コレラワクチン、ＤＰＴワクチン、ヒブワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン、ＨＰＶワクチン、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、ＭＭＲワクチン、ＭＭＲＶワクチン、肺炎球菌ワクチン、肺炎球菌多糖体ワクチン、ポリオワクチン、ロタウイルスワクチン、天然痘ワクチン、結核ワクチン、腸チフスワクチン、黄熱ワクチン、パルボウイルスワクチン、ジステンパーワクチン、アデノウイルスワクチン、パラインフルエンザワクチン、ボルデテラワクチン、狂犬病ワクチン、レプトスピラ症ワクチン、ライム病ワクチン、コロナワクチン、回虫／鉤虫ワクチン、駆虫剤ワクチン、ＲＮＦＮワクチン、及びＨＩＶワクチンからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
形質転換されたジャガイモ植物内で異種タンパク質を産生する方法であって、
ａ．発現カセットで植物を形質転換する工程であって、前記発現カセットが、（ｉ）ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ（ＡＧＰ）発現を抑制することができるヌクレオチド配列、（ｉｉ）輸送ペプチド、（ｉｉｉ）マーカー遺伝子、及び（ｉｖ）目的のタンパク質又はペプチドをコード化する遺伝子を含む、工程と、
ｂ．前記形質転換された植物を規定条件下で栽培する工程と、
ｃ．前記目的のタンパク質を抽出する工程と、
を含む、方法。
前記ＡＧＰ発現を抑制することができるヌクレオチド配列が、配列番号１０及び配列番号１１に記載されるアンチセンス又はセンスＡＧＰ配列を含む、請求項１３に記載の方法。
ＡＧＰ発現の抑制が、収束性プロモーターによって駆動される、請求項１４に記載の方法。
前記収束性プロモーターが、顆粒結合デンプンシンターゼ（ＧＢＳＳ）プロモーター及びＡＧＰプロモーターである、請求項１５に記載の方法。
前記輸送ペプチドが、配列番号８に記載されるＧＢＳＳ輸送ペプチド、又は配列番号９に記載されるＲｕｂｉｓｃｏ輸送ペプチドである、請求項１３に記載の方法。
前記マーカー遺伝子が、ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＵＳ、ＬＵＸ、ＣＡＨ、ＳＰＴ、ＮＰＴＩＩ、ＨＰＴ、ＡＰＨＩＶ、ＢＡＲ、ＰＡＴ、ＣＨＳ、ＡＨＡＳ、及びフラボノイド合成遺伝子からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
前記目的のタンパク質が、インターロイキン−２、ヒルジン、インスリン、インターフェロン、ラクトフェリン、ヘモグロビン、エリスロポエチン、上皮成長因子、炭疽ワクチン、コレラワクチン、ＤＰＴワクチン、ヒブワクチン、Ａ型肝炎ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、Ｃ型肝炎ワクチン、ＨＰＶワクチン、インフルエンザワクチン、日本脳炎ワクチン、ＭＭＲワクチン、ＭＭＲＶワクチン、肺炎球菌ワクチン、肺炎球菌多糖体ワクチン、ポリオワクチン、ロタウイルスワクチン、天然痘ワクチン、結核ワクチン、腸チフスワクチン、黄熱ワクチン、パルボウイルスワクチン、ジステンパーワクチン、アデノウイルスワクチン、パラインフルエンザワクチン、ボルデテラワクチン、狂犬病ワクチン、レプトスピラ症ワクチン、ライム病ワクチン、コロナワクチン、回虫／鉤虫ワクチン、駆虫剤ワクチン、ＲＮＦＮワクチン、及びＨＩＶワクチンからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。