KR20160013198A

KR20160013198A - 화학적 화합물

Info

Publication number: KR20160013198A
Application number: KR1020157036820A
Authority: KR
Inventors: 나딤 악타; 로버트 휴 브래드버리; 데이비드 버터; 고든 스튜어트 커리; 사비 크리스토퍼 데; 크레이그 사무엘 도날드; 리차드 알버트 노르만; 매튜 오스본; 알프레드 아서 라보우; 헤더 마리 레드피언; 헬렌 엘리자베스 윌리엄스; 네다 야바리
Original assignee: 아스트라제네카 아베
Priority date: 2013-05-28
Filing date: 2014-05-27
Publication date: 2016-02-03
Also published as: RU2015151502A; US20160136140A1; EP3360875A1; US20140357661A1; AU2014272856B2; WO2014191726A1; RS56678B1; UY35590A; MX361538B; US10130617B2; BR112015029455A8; DOP2015000274A; MX2015016428A; US20170326115A1; TN2015000516A1; SG11201509393VA; PH12015502615B1; RU2664109C2; AU2014272856A1; ES2654161T3

Abstract

본 발명은 하기 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염; 그의 제조 방법, 그를 함유하는 약학 조성물, 및 세포 증식석 장애 치료에서의 그의 용도에 관한 것이다:

상기 식에서,
R¹ 내지 R⁵는 명세서에서 본원 상기에서 정의된 의미 중 임의의 것을 가진다.

Description

화학적 화합물{CHEMICAL COMPOUNDS}

본 발명은 항암 활성을 가지며, 따라서, 잠재적으로는 인체 또는 동물체 치료 방법에서 유용한 특정의 신규한 인돌 유도체, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 인돌 유도체 제조 방법, 상기 인돌 유도체를 함유하는 약학 조성물, 및 치료 방법에서의 그의 용도, 예를 들어, 온혈 동물, 예컨대, 암 예방 또는 치료에서의 사용을 비롯한, 인간에서의 암 예방용 또는 치료용 의약의 제조에서의 그의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 에스트로겐 수용체의 선택적 하향 조절제인 인돌 유도체에 관한 것이다.

에스트로겐 수용체 알파(ERα, ESR1, NR3A) 및 에스트로겐 수용체 베타(ERβ, ESR2, NR3b)는 거대 핵 수용체 패밀리의 구성원인 스테로이드 호르몬 수용체이다. 모든 핵 수용체와 구조상 유사한 ERa는 (A-F로 명명되는) 6개의 기능성 도메인으로 구성되어 있으며(문헌 [Dahlman-Wright, et al., Pharmacol . Rev., 2006, 58:773-781]), 그의 특이적인 리간드인 여성 성 스테로이드 호르몬 17b 에스트라디올(E2)과의 회합 후, 복합체는 에스트로겐 수용체 요소(ERE: Estrogen Receptor Element)로 명명되는 게놈 서열에 결합하고, 공동 조절제와 상호작용하여 표적 유전자의 전사를 조절하는 바, 리간드 의존성 전사 인자로서 분류된다. ERα 유전자는 6q25.1 상에 위치하고, 595AA 단백질을 코딩하며, 선택적 스플라이싱 및 번역 출발 부위에 기인하여 다중 이소폼이 제조될 수 있다. DNA 결합 도메인(도메인 C) 및 리간드 결합 도메인(도메인 E) 이외에도, 수용체는 N 말단(A/B) 도메인, C 및 E 도메인을 연결하는 힌지(D) 도메인, 및 C 말단 연장부(F 도메인)를 함유한다. ERa 및 ERb의 C 및 E 도메인은 A/B와 매우 보존적인 보존성을 띠는 반면(각각 96% 및 55%의 아미노산 동일성), D 및 F 도메인은 불충분하다(30% 미만의 아미노산 동일성). 두 수용체 모두 여성 생식관의 조절 및 발생에 관여하고, 추가로 중추 신경계, 심혈관계에서 및 골 대사에서도 중요한 역할을 한다. ER의 게놈 작용은 수용체가 직접적으로(직접적인 활성화 또는 고전적 경로) 또는 간접적으로(간접적인 활성화 또는 비고전적 경로) ERE에 결합할 때, 세포의 핵에서 이루어진다. 리간드 부재시, ER은 열 충격 단백질인 Hsp90 및 Hsp70과 회합되고, 회합된 샤페론 기구는 리간드 결합 도메인(LBD: ligand binding domain)을 안정화시켜 리간드에 접근가능하게 만든다. 리간드가 있는 ER은 열 충격 단백질로부터 해리되고, 이로써 수용체의 입체형태적 구조 변화가 일어나고, 이는 이량체화, DNA 결합, 공동 활성 인자 또는 공동 억제 인자와의 상호작용 및 표적 유전자 발현 조절을 허용한다. 비고전적 경로에서, AP-1 및 Sp-1은 유전자 발현을 조절하기 위해 수용체의 두 이소폼에 의해 사용되는 대체 조절 DNA 서열이다. 상기 일례에서, ER은 DNA과 직접적으로 상호작용하지 않지만, 다른 DNA 결합 전사 인자, 예컨대, c-Jun 또는 c-Fos와의 회합을 통해 상호작용한다(문헌 [Kushner et al., Pure Applied Chemistry 2003, 75:1757-1769]). ER이 유전자 전사에 영향을 미치는 정확한 기전에 대해서는 충분한 이해가 이루어지고 있지는 않지만, DNA 결합 수용체에 의해 동원되는 다수의 핵 인자에 의해 매개되는 것으로 보인다. 공동 조절제의 동원은 주로 두 단백질 표면인, 각각 E 도메인 및 A/B 도메인에 위치하는 AF2 및 AF1에 의해 매개된다. AF1은 성장 인자에 의해 조절되고, 그의 활성은 세포성 및 프로모터 환경에 의존하는 반면, AF2는 전적으로 활성을 위한 리간드 결합에 의존한다. 비록 두 도메인이 독립적으로 작용할 수는 있기는 하지만, 최대 ER 전사 활성은 두 도메인을 통한 시너지 상호작용을 통해 달성된다(문헌 [Tzukerman, et al., Mol . Endocrinology, 1994, 8:21-30]). 비록 ER이 전사 인자인 것으로 간주되기는 하지만, 이는 게놈이 작용하기에는 너무 빠른 것으로 간주되는 기간에 E2 투여 후 조직에서의 빠른 ER 효과에 의해 입증된 바와 같이, 비게놈 기전을 통해 작용할 수 있다. 에스트로겐의 빠른 작용을 담당하는 수용체가 같은 핵 ER인지 또는 상이한 G 단백질 커플링된 스테로이드 수용체인지 여부는 여전히 불명확하지만(문헌 [Warner, et al., Steroids 2006 71:91-95]). 예컨대, MAPK/ERK 경로 및 내피 산화질소 신타제의 활성화 및 PI3K/Akt 경로와 같은 다수의 E2 유도성 경로가 점점 계속해서 확인되고 있다. 리간드 의존적 경로 이외에도, ERα는 예컨대, 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1: insulin like growth factor 1) 및 표피 성장 인자(EGF: epidermal growth factor)와 같은 성장 인자 신호전달을 통한 MAPK의 자극과 관련된 AF-1을 통해 이루어지는 리간드 비의존적 활성을 가지는 것으로 나타났다. AF-1의 활성은 Ser118의 인산화에 의존하고, ER과 성장 인자 신호전달 사이의 상호 간섭 작용의 일례는 성장 인자, 예컨대, IGF-1 및 EGF에 대한 반응으로 이루어지는 MAPK에 의한 Ser 118의 인산화이다(문헌 [Kato, et al., Science, 1995, 270:1491-1494]).

구조상 상이한 다수의 화합물이 ER에 결합하는 것으로 나타났다. 일부 화합물, 예컨대, 내인성 리간드 E2는 수용체 효능제로서 작용하는 반면, 다른 것은 E2 결합을 경쟁적으로 억제시키고, 수용체 길항제로서 작용한다. 상기 화합물은 그의 기능적 효과에 의존하여 두 부류로 분류될 수 있다. 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM: selective estrogens receptor modulator), 예컨대, 타목시펜은 세포성 및 프로모터 환경 뿐만 아니라, 표적화되는 ER 이소폼에 의존하여 수용체 효능제 및 길항제, 둘 모두로서 작용할 수 있는 능력을 가진다. 예를 들어, 타목시펜은 유방에서는 길항제로서 작용하지만, 뼈, 심혈관계 및 자궁에서는 부분적인 효능제로서 작용한다. 모든 SERM은 AF2 길항제로서 작용하고, AF1을 통해 그의 부분적인 효능제 특징을 유도하는 것으로 보인다. 그 일례로는 풀베스트란트가 있는 두번째 군은 완전한 길항제로서 분류되고, 이는 화합물 결합시 리간드 결합 도메인(LBD: ligand binding domain)의 독특한 입체형태 구조 변화의 유도를 통하여 AF1 및 AF2 도메인의 완전한 억제에 의해 에스트로겐 활성을 차단할 수 있으며, 상기와 같은 입체형태 구조 변화를 통해 헬릭스 12와 LBD 나머지 부분 사이의 상호작용은 완전하게 폐기되어 보조 인자의 동원은 차다된다(문헌 [Wakeling, et al., Cancer Res., 1991, 51:3867-3873]; [Pike, et al., Structure, 2001, 9:145-153]).

ERα의 세포내 수준은 E2의 존재 하에서 유비퀴틴/프로테오솜(Ub/26S) 경로를 통해 하향 조절된다. 리간드가 있는 ERα의 폴리유비퀴틴화는 3개 이상의 효소에 의해 촉매화되며; 유비퀴틴 활성화 효소 E1 활성화된 유비퀴틴은 E3 유비퀴틴 리가제에 의한 이소펩티드 결합을 통하여 E2에 의해 리신 잔기와 컨쥬게이트되고, 이어서, 폴리유비퀴틴화된 ERα는 분해를 위해 프로테오솜으로 유도된다. 비록 ER 의존적 전사 조절 및 ER의 프로테오솜 매개 분해가 연관이 있기는 하지만(문헌 [Lonard, et al., Mol . Cell, 2000 5:939-948]), 전사 그 자체가 ERα 분해를 위해 요구되는 것은 아니며, 핵 프로테오솜 분해를 위해 ERα를 표적화하는 데 전사 개시 복합체의 조립이면 충분하다. 이러한 E2 유도 분해 프로세스는 세포 증식, 분화 및 대사를 위한 요건에 대한 반응으로 전사를 빠르게 활성화시킬 수 있는 그의 능력을 위해 필요한 것으로 여겨진다(문헌 [Stenoien, et al., Mol . Cell Biol., 2001, 21:4404-4412]). 풀베스트란트는 또한 26S 프로테오솜 경로를 통해 ERα의 빠른 하향 조절을 유도할 수도 있는 길항제의 서브세트인, 선택적 에스트로겐 수용체 하향 조절제(SERD: selective estrogen receptor down-regulator)로도 분류된다. 대조적으로, SERM, 예컨대, 타목시펜은 비록 전사에 대해 미치는 효과는 SERD에 대해 관찰된 것과 유사하기는 하지만, ERα 수준을 증가시킬 수 있다.

유방암 중 대략 70%는 ER 및/또는 프로게스테론 수용체를 발현하며, 이는 이러한 종양 세포가 성장을 위해 호르몬에 의존한다는 것을 암시한다. 다른 암, 예컨대, 난소암 및 자궁내막암 또한 성장을 위해 ERα 신호전달에 의존하는 것으로 여겨진다. 상기 환자를 위해 요법은, 예컨대, 폐경 이전 및 이후 환경, 둘 모두에서 조기 및 진행성 ER 양성 유방암을 치료하는 데 사용되는 타목시펜과 같이, ER에의 리간드 결합을 길항시킴으로써; 예컨대, 여성에서 타목시펜 또는 아로마타제 억제제를 이용하는 요법에도 불구하고 진행된 유방암을 치료하는 데 사용되는 풀베스트란트와 같이, ERα를 길항시키고, 하향 조절시킴으로써; 또는 예컨대, 조기 및 진행성 ER 양성 유방암을 치료하는 데 사용되는 아로마타제 억제제와 같이, 에스트로겐 합성을 차단시킴으로써 ER 신호전달을 억제시킬 수 있다. 비록 상기 요법들이 유방암 치료에 있어 대단히 큰 긍정적 영향을 미치기는 하지만, 종양이 ER을 발현하는 상당수의 환자들은 현존 ER 요법에 대해 새로운(de novo) 저항을 보이거나, 시간이 경과함에 따라 상기 요법에 대한 저항을 발생시킨다. 최초 타목시펜 요법에 대한 저항을 설명하기 위해 주로, 해당 보조인자의 과다 발현에 의해 상쇄되는 타목시펜-ERα 복합체에의 상기 특정 보조인자 결합의 더 낮은 친화도를 통해서, 또는 보통은 타목시펜-ERα 복합체에 결합하지 않는 보조인자와의 상기 복합체와의 상호작용을 촉진시키는 제2 부위의 형성을 통해서 이루어지는 길항제로서 작용하는 타목시펜으로부터 효능제로서 작용하는 것으로의 전환을 포함하는, 수개의 상이한 기전들이 기술되어 왔다. 그러므로, 저항은 타목시펜-ERα 활성을 구동시키는 특이 보조인자를 발현하는 세포의 성장의 결과로서 일어날 수 있다. 또한 다른 성장 인자 신호전달 경로가 리간드 신호전달과는 독립적으로 세포 증식을 구동시키도록 ER 수용체 또는 공동 활성 인자를 직접 활성화시킬 가능성도 존재한다.

더욱 최근에는, 17-25%의 다양한 빈도로 전이성 ER 양성 환자 유래 종양 샘플 및 환자 유래 이종이식편 모델(PDX: patient-derived xenograft model)에서의 가능상 저항 기전으로서 ESR1의 돌연변이가 확인되었다. 리간드-결합 도메인 중에서 상기 돌연변이가 주로 돌연변이화된 기능성 단백질을 유도하지만, 전적으로 그러한 것은 아니며; 아미노산 변이의 예로는 Ser463Pro, Val543Glu, Leu536Arg, Tyr537Ser, Tyr537Asn 및 Asp538Gly를 포함하며, 아미노산 537 및 538에서의 변이가 현재 기술되는 변이의 대다수를 구성한다. 이전에는 캔서 게놈 아틀라스(암 Genome Atlas) 데이터베이스에서 특징화된 원발성 유방 샘플로부터의 게놈 중에서는 상기 돌연변이는 검출되지 않았었다. ER 발현에 대하여 양성인 390개의 원발성 유방암 샘플 중 ESR1에서는 단일 돌연변이가 검출되지 않았다(문헌 [Cancer Genome Atlas Network, 2012 Nature 490: 61-70]). 상기 돌연변이체 수용체가 에스트라디올의 부재 하에서 기초 전사 활성을 보여주는 바, 리간드 결합 도메인 돌연변이는 아로마타제 억제제 내분비성 요법에 대한 저한 반응으로서 발생된 것으로 여겨진다. 아미노산 537 및 538에서 돌연변이화된, ER의 결정 구조는 두 돌연변이체 모두 헬릭스 12의 위치를 이동시켜 공동 활성 인자 동원을 허용함으로써, 그리고, 이로써 효능제 활성화된 야생형 ER을 모방함으로써 ER의 효능제 입체형태 구조를 촉진시킨 것으로 나타났다. 공개된 데이터를 통해 내분비성 요법, 예컨대, 타목시펜 및 풀베스트란트는 여전히 ER 돌연변이체에 결합할 수 있고, 어느 정도까지 전사 활성화를 억제시킬 수 있으며, 풀베스트란트는 Try537Ser을 분해시킬 수 있는 있지만, 완전한 수용체 억제를 위해서는 더 높은 고용량이 필요할 수 있는 것으로 나타났다(문헌 [Toy et al., Nat. Genetics 2013, 45: 1439-1445]; [Robinson et al., Nat. Genetics 2013, 45: 144601451]; [Li, S. et al. Cell Rep. 4, 1116-1130 (2013)]). 그러므로, 비록 상기 단계에서 ESR1 돌연변이가 변경된 임상적 결과와 관련이 있는지 그 여부에 대해서는 알려져 있지는 않지만, 화학식(I)의 특정 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이 돌연변이체 ER을 하향 조절할 수 있고, 그를 길항시킬 수 있을 것이라는 실현 가능성이 존재한다.

저항 기전 또는 기전의 조합의 발생 여부와는 상관없이, 다수는 여전히 ER 의존성 활성에 의존하며, SERD 기전을 통한 수용체의 제거는 세포로부터 ERα 수용체를 제거할 수 있는 최상의 방법을 제공한다. 현재 풀베스트란트가 임상적 용도로 허용받은 유일의 SERD이지만, 그의 기계론적인 특성에도 불구하고, 약물의 약리학적 특성은 500 mg의 월간 용량이라는 현 제한에 기인하여 그의 효능은 제한되어 왔고, 그 결과로서, 시험관내 유방 세포주 실험에서 관찰된 수용체의 완전한 하향 조절과 비교하여 환자 샘플에서 50% 미만의 수용체 교체가 이루어졌다(문헌 [Wardell, et al., Biochem. Pharm., 2011, 82:122-130]). 그러므로, 조기, 전이성 및 후천성 저항 환경에서 증진된 이점을 제공할 수 있는 필요한 약학 특성 및 SERD 기전을 가지는 새로운 ER 표적화제가 요구되고 있다.

본 발명의 화합물이 악성 질환으로부터 유발된 비조절성 세포 증식을 억제시키는 데 유용한, 강력한 항종양 활성을 가지는 것으로 밝혀졌다. 본 발명의 화합물은 최소한 SERD로서 작용함으로써 항종양 효과를 제공한다.

본 발명의 한 측면에 따라, 하기 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다:

상기 식에서,

R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 H 또는 F이고;

R³은 H 또는 메틸이고;

a) R⁴는 H이고, R⁵는 F이거나; 또는

b) R⁴는 F이고, R⁵는 H이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라서, 상기 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물을 제공한다.

화학식(I)의 화합물은 1, 2, 또는 3개의 키랄 중심을 가지고, 본 발명은 순수한 키랄 형태 또는 임의 비율로 그의 혼합물을 포함한다. 광학적으로 활성인 형태의 합성은 당업계에 주지된 유기 화학의 표준 기법에 의해, 예를 들어, 광학적으로 활성인 출발 물질로부터의 합성에 의해 또는 라세믹 형태의 분할에 의해 수행될 수 있다. 유사하게, 상기 언급된 활성은 표준 실험실 기법을 사용함으로써 평가할 수 있다.

본원에 기술된 화합물의 특정 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체는 같은 화합물의 다른 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체보다 더 큰 활성을 띨 수 있다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, ≥ 95, ≥ 98% 또는 ≥ 99%의 거울상 이성질체 과량(%ee)으로 존재하는 단일 거울상 이성질체인, 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다. 편의상, 단일 거울상 이성질체는 ≥ 99%의 거울상 이성질체 과량(%ee)으로 존재한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께, ≥ 95, ≥ 98% 또는 ≥ 99%의 거울상 이성질체 과량(%ee)으로 존재하는 단일 거울상 이성질체인 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 편의상, 단일 거울상 이성질체는 ≥ 99%의 거울상 이성질체 과량(%ee)으로 존재한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, ≥ 95, ≥ 98% 또는 ≥ 99%의 부분입체 이성질체 과량(%de)으로 존재하는 단일 부분입체 이성질체인, 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다. 편의상, 단일 부분입체 이성질체는 ≥ 99%의 부분입체 이성질체 과량(%de)으로 존재한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께, ≥ 95, ≥ 98% 또는 ≥ 99%의 부분입체 이성질체 과량(%de)으로 존재하는 단일 부분입체 이성질체인 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 편의상, 단일 부분입체 이성질체는 ≥ 99%의 부분입체 이성질체 과량(%de)으로 존재한다.

한 특정 측면에서, 화학식(I)의 화합물은 하기 화학식(IA)의 화합물이다:

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본 발명의 또 다른 측면에서, 화학식(I)의 화합물은 하기 화학식(IB)의 화합물이다:

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달리 언급하지 않는 한, 본원에서는 화학식(I)의 화합물을 언급하는 것은 화학식(IA)의 화합물 및/또는 화학식(IB)의 화합물을 언급하는 것으로 이해하여야 한다.

예를 들어, 실시예 1의 화합물, (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산은 화학식(IA)의 화합물의 일례이다.

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그의 이성질체인, (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1S,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산은 화학식(IB)의 화합물의 일례이다.

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상기 두 이성질체 모두 화학식(I)의 화합물의 일례인 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산의 일례이다.

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일부 화학식(I)의 화합물은 결정질일 수 있고, 1 초과의 결정질 형태를 가질 수 있다. 본 발명은 이하 기술되는 표준 테스트에 의해 SERD 활성에 대하여 결정질 또는 비정질 형태의 효능을 측정하는 방법이 당업계에 주지되어 있는, SERD 활성에서 유용한 특성을 가지는 형태인 것인 임의의 결정질 또는 비정질 형태, 또는 그의 혼합물을 포함한다는 것을 이해하여야 한다.

일반적으로 결정질 물질은 종래 기법, 예컨대, X선 분말 회절(이하, XRPD: X-Ray Powder Diffraction) 분석법, 시차 열량 분석법(이하, DSC: Differential Scanning Calorimetry), 열 중량 측정 분석법(이하, TGA: Thermal Gravimetric Analysis), 확신 반사 적외선 푸리에 변환 (DRIFT: Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform) 분광법, 근적외선(NIR: Near Infrared) 분광법, 용액 및/또는 고체 상태 핵 자기 공명 분광법을 사용하여 분석될 수 있다는 것은 공지되어 있다. 상기 결정질 물질의 수분 함량은 칼 피셔(Karl Fischer) 분석법에 의해 측정할 수 있다.

일례로서, 실시예 7의 화합물은 결정도를 보이고, 한 결정질 형태가 확인되었다.

따라서, 본 발명의 추가의 측면은 (E)-3-(4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산의 A형이다(실시예 7).

본 발명의 추가의 측면에 따라, 약 2 쎄타 = 4.5°에서 1 이상의 특이 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴을 가지는 실시예 7의 A형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 약 2 쎄타 = 10.8 °에서 1 이상의 특이 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴을 가지는 실시예 7의 A형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 약 2 쎄타 = 4.5 및 10.8 °에서 2개 이상의 특이 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴을 가지는 실시예 7의 A형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 약 2 쎄타 = 4.5, 4.8, 6.1, 7.9, 9.9, 10.8, 13.4, 14.0, 14.3 및 18.5 °에서 특이 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴을 가지는 실시예 7의 A형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명에 따라, 도 1에 제시된 X선 분말 회절 패턴과 실질적으로 동일한 X선 분말 회절 패턴을 가지는 실시예 7의 A형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 약 2 쎄타 = 4.5° ± 0.2° 2 쎄타에서 1 이상의 특이 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴을 가지는 실시예 7의 A형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 약 2 쎄타 = 10.8 ° ± 0.2° 2 쎄타에서 1 이상의 특이 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴을 가지는 실시예 7의 A형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 약 2 쎄타 = 4.5 및 10.8 ° ± 0.2° 2 쎄타에서 2개 이상의 특이 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴을 가지는 실시예 7의 A형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 약 2 쎄타 = 4.5, 4.8, 6.1, 7.9, 9.9, 10.8, 13.4, 14.0, 14.3 및 18.5 ° ± 0.2° 2 쎄타에서 특이 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴을 가지는 실시예 7의 A형인, 결정질 형태를 제공한다.

추가로, 실시예 1 또한 결정도를 나타낸다.

본 발명에 따라, 약 2 쎄타 = 8.4°에서 1 이상의 특이 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴을 가지는 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산의 B형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명에 따라, 약 2 쎄타 = 10.9°에서 1 이상의 특이 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴을 가지는 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산의 B형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명에 따라, 약 2 쎄타 = 8.4° 및 10.9°에서 2개 이상의 특이 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴을 가지는 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산의 B형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명에 따라, 약 2 쎄타 = 8.4, 10.9, 18.3, 24.0 및 14.0°에서 특이 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴을 가지는 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산의 B형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명에 따라, 약 2 쎄타 = 8.4, 10.9, 18.3, 24.0, 14.0, 19.0, 14.4, 13.0, 15.3, 20.6°에서 특이 피크를 가지는 X선 분말 회절 패턴을 가지는 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산의 B형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명에 따라, 도 2에 제시된 X선 분말 회절 패턴과 실질적으로 동일한 X선 분말 회절 패턴을 가지는 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산의 B형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명에 따라, 2 쎄타 = 8.4° ± 0.2° 2 쎄타에서 1 이상의 특이 피크를 가지는 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산의 B형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명에 따라, 2 쎄타 = 10.9° ± 0.2° 2 쎄타에서 1 이상의 특이 피크를 가지는 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산의 B형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명에 따라, 2 쎄타 = 8.4° 및 10.9°(여기서, 상기 값은 ± 0.2° 2 쎄타일 수 있다)에서 2개 이상의 특이 피크를 가지는 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산의 B형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명에 따라, 약 2 쎄타 = 8.4, 10.9, 18.3, 24.0 및 14.0°(여기서, 상기 값은 ± 0.2° 2 쎄타일 수 있다)에서 특이 피크를 가지는 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산의 B형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명에 따라, 2 쎄타 = 8.4, 10.9, 18.3, 24.0, 14.0, 19.0, 14.4, 13.0, 15.3, 20.6°(여기서, 상기 값은 ± 0.2° 2 쎄타일 수 있다)에서 특이 피크를 가지는 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산의 B형인, 결정질 형태를 제공한다.

본 발명이 실시예 1의 B형인 결정질 형태에 관한 것이라고 언급할 때, 결정도는 편리하게는 약 60% 초과, 더욱 편리하게는 약 80% 초과, 바람직하게 약 90% 초과, 및 더욱 바람직하게 약 95% 초과이다. 가장 바람직하게 결정도는 약 98% 초과이다.

추가로, 실시예 1의 B형인 결정질 형태에 관한 것이라고 언급할 때, 물질은 바람직하게 실질적으로 다른 결정질 형태 또는 비정질 물질을 함유하지 않는다. 본 발명자들은 "실질적으로 ~을 함유하지 않는다"는 것은 편리하게는 약 60% 초과, 더욱 편리하게는 약 80% 초과, 바람직하게 약 90% 초과, 더욱 바람직하게 약 95% 초과 및 가장 바람직하게 약 98% 초과의 단일 다형체를 의미한다.

X선 분말 회절 패턴의 2 쎄타 값은 기계마다, 또는 샘플마다 약간씩 달라질 수 있으며, 따라서, 제시된 상기 값은 절대적인 것으로 해석되지 않아야 함을 이해할 것이다.

X선 분말 회절 패턴은 측정 조건(예컨대, 사용되는 장비 또는 기계)에 따라 하나 이상의 측정 오차를 가지는 것으로 수득될 수 있다는 것은 공지되어 있다. 특히, X선 분말 회절 패턴의 강도는 측정 조건에 따라 변동될 수 있다는 것은 공지되어 있다. 그러므로, 달리 언급되지 않는 한, 상기 기술된 본 발명의 결정질 형태는 관련 도면에 제시된 X선 분말 회절 패턴과 동일한 X선 분말 회절 패턴을 제공하는 결정으로 한정되지 않으며, 상기 도면에 제시된 것과 실질적으로 동일한 X선 분말 회절 패턴을 제공하는 임의의 결정은 본 발명의 범주 내에 포함된다는 것을 이해하여야 한다. X선 분말 회절 분야의 당업자는 X선 분말 회절 패턴의 실질적인 동일성을 판단할 수 있다.

X선 분말 회절 분야의 당업자는 또한 피크의 상대적인 강도가 예를 들어, 크기가 30 ㎛ 초과인 그레인 및 비단일적 종횡비에 의해 영향을 받을 수 있으며, 이는 샘플 분석에 영향을 줄 수 있다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 또한 반사 위치는 샘플이 회절 분석기에 놓여 있는 정확한 높이 및 회절 분석기의 영점 조정에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 샘플의 표면 평면도 또한 작은 영향을 미칠 수 있다. 그러므로, 제시되는 회절 패턴 데이터가 절대치인 것으로 간주되지 않아야 한다(문헌 [Jenkins, R & Snyder, R.L. 'Introduction to X-Ray Powder Diffractometry' John Wiley & Sons 1996]; [Bunn, C.W. (1948), Chemical Crystallography, Clarendon Press, London]; [Klug, H. P. & Alexander, L. E. (1974), X-Ray Diffraction Procedures] 참조).

일반적으로, X선 분말 회절 패턴(diffractogram)에서 회절각의 측정 오차는 대략 ± 0.2° 2 쎄타이고, X선 분말 회절 데이터를 고려할 때에는 상기와 같은 측정 오차 정도를 참작하여야 한다. 추가로, 강도는 실험 조건 및 샘플 제조(바람직한 배향)에 따라 변동될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

본 발명의 특정 화합물은 실시예의 각각의 것이며, 그들은 각각 본 발명의 추가의 비의존적인 측면을 제공한다. 본 발명의 추가의 특정 화합물은 실시예의 각각의 것의 약학적으로 허용되는 염(들)이며, 그들은 각각 본 발명의 추가의 비의존적인 측면을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 본원에 개시된 바와 같이 실시예들 중 임의의 것에 따라 수득될 수 있는, 화학식(I)의 화합물을 제공한다.

추가의 특징은 본원에서 정의된 범주들 중 임의의 것이되, 단, 구체적인 실시예, 예컨대, 실시예 1, 2, 3 등은 개별적으로 포기한다.

특정 화학식(I)의 화합물은 비대칭적으로 치환된 탄소 원자를 함유하고, 따라서, 광학적으로 활성인 라세믹 형태로 존재할 수 있고, 그러한 것으로 분리될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 일부 화학식(I)의 화합물은 다형성을 나타낼 수 있다. 본 발명은 (예를 들어, 재결정화 기법에 의한 라세믹 형태의 분할에 의해, 광학적으로 활성인 출발 물질로부터의 합성에 의해, 키랄 합성에 의해, 효소적 분할에 의해, 생체내 변환에 의해, 또는 키랄 고정상을 이용하는 크로마토그래프 분리에 의해) 광학적으로 활성인 형태를 제조하는 방법, 및 이하 기술되는 표준 테스트에 의해 SERD로서의 효능을 측정하는 방법이 당업계에 주지되어 있는, SERD 활성에서 유용한 특성을 가지는 형태인 것인 라세믹, 광학적으로 활성인, 다형체 또는 입체이성질체 형태, 또는 그의 혼합물을 포함한다는 것을 이해하여야 한다.

상기 정의된 특정 화학식(I)의 화합물은 호변 이성질 현상을 보일 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 본 발명은 SERD 활성을 가지는, 임의의 상기 호변 이성질체 형태, 또는 그의 혼합물을 그의 정의에 포함하며, 단순히 화학식 도면에서 사용되거나, 또는 실시예에서 명명된 임의의 한 호변 이성질체 형태로 한정되지 않음을 이해하여야 한다. 일반적으로, 임의의 상기 호변 이성질체 중 단 하나만이 하기의 실시예에서 명명되거나, 또는 하기의 임의의 관련 화학식 도면에서 제시된다.

본 발명은 본 화합물에 존재하는 원자의 모든 동위원소를 포함하는 것으로 한다. 동위원소는 원자 번호는 갖지만, 질량수가 다른 원자를 포함하는 것으로 이해할 것이다. 예를 들어, 수소의 동위원소로는 삼중 수소 및 중수소를 포함한다. 탄소의 동위원소로는 ¹³C 및 ¹⁴C를 포함한다. 실시예 1의 중수소화된 버전이 실시예 10에 기술되어 있다.

화학식(I)의 화합물의 적합한 약학적으로 허용되는 염은 예를 들어, 알칼리 금속 염 또는 알칼리토 금속 염, 예컨대, 나트륨, 칼슘 또는 마그네슘 염, 또는 암모늄 염, 또는 예컨대, 예컨대, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 피페리딘, 모르폴린 또는 트리스-(2-하이드록시에틸)아민과 같은 유기 염기와의 염이다. 화학식(I)의 화합물의 추가의 적합한 약학적으로 허용되는 염은 다른 금속 염, 예컨대, 칼륨, 아연, 또는 당업계에 공지된 다른 상기와 같은 금속 양이온일 수 있다. 본 발명의한 측면에서, 화학식(I)의 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 금속 양이온과의 염, 암모늄 염, 또는 유기 염기와의 염이다.

화학식(I)의 화합물의 추가의 적합한 약학적으로 허용되는 염은 예를 들어, 화학식(I)의 화합물의 투여 후 인체 또는 동물체 내에서 형성된 염이다.

화학식(I)의 화합물의 적합한 약학적으로 허용되는 염은 또한 예를 들어, 화학식(I)의 화합물의 산 부가염, 예를 들어, 강한 무기산 또는 유기산, 예컨대, 염산, 브롬화수소산, 황산 또는 트리플루오로아세트산과의 산 부가염일 수 있다. 화학식(I)의 화합물의 다른 잠재적 적합한 약학적으로 허용되는 염 또한 실시예 1에 대하여 하기에 기술되는 바와 같을 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 화학식(I)의 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 산 부가염이다.

화학식(I)의 화합물의 염 형성을 검토하는 실험을 통해 결정질 염을 형성할 수 있는 실시예 1 ((E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산)에 대한 잠재능을 조사하였다. 하기 산 및 염기가 시험되었다:

아세트산, 아디프산, 벤젠 술폰산, 벤조산, 신남산, 시트르산, D,L-락트산, 에탄 디술폰산, 에탄 술폰산, 푸마르산, 염산, L-타르타르산, 말레산, 말산, 말론산, 메탄 술폰산, 나파디실릭산, 인산, 사카린, 숙신산, 황산, 톨루엔술폰산, 아세트산 칼슘, 디에틸아민, 에탄올아민, 에틸렌디아민, 하이드록시에틸피롤리딘, 아세트산 마그네슘, 메글루민, 피페라진, 수산화칼륨, 수산화나트륨, t-부틸아민, 트리에탄올아민, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(트리스) 및 N,N-디에틸에탄올아민.

상기 산 및 염기 중, 분리가능한 고체 염은 사용된 실험 조건에서 항상 수득가능한 것은 아니거나, 또는 결정질 형태로 수득가능한 것은 아니었다. 실시예 1의 바람직한 염으로는 결정질 형태로 분리될 수 있는 것, 예를 들어, 벤젠 술폰산 염(베실레이트 염), 숙신산 염(숙시네이트 염) 및 말레산 염(말레에이트 염).을 포함한다.

한 측면에서, 실시예 1의 적합한 염으로는 베실레이트, 숙시네이트 및 말레에이트를 포함할 수 있다. 또 다른 측면에서, 실시예 1의 적합한 염은 실시예 11에 기술되어 있는 말레에이트 염일 수 있다.

화학식(I)의 화합물의 적합한 약학적으로 허용되는 공-결정 또한 본 발명의 측면을 형성한다는 것을 추가로 이해하여야 한다. 의심을 피하기 위해, 공-결정(또는 공결정)이라는 용어는 호스트 API(활성 약학 성분: active pharmaceutical ingredient) 분자 및 분자들 및 게스트(또는 공-형성제) 분자 및 분자들이 존재하는 다성분계를 의미한다. 공-결정에서, API 분자 및 게스트(또는 공-형성제) 분자, 그 둘은 모두 (용매화물 또는 수화물과 공-결정을 구별하기 위해) 그의 순수한 형태로 단독으로 존재할 때 실온에서 고체로서 존재한다. API 분자와 게스트 분자 사이에 상당한 또는 완전한 양성자 교환이 일어나는 염은 본 특정 정의에서 배제된다. 공-결정에서, API 및 공-형성제 분자는 수소 결합 및 가능하게는 다른 비공유 상호작용에 의해 상호작용한다. 약학적으로 허용되는 공-형성제로는 중성 분자, 예컨대, 니코틴아미드, 레조르시놀 및 크실레놀 뿐만 아니라, 이온화 가능한 분자, 예컨대, 옥살산, 3,5-디하이드록시벤조산 및 이소퀴놀린을 포함한다(양성자 교환 정도가 염 또는 공-결정 형성 여부를 결정짓는다). 공-결정은 그 자체가 수화물을 비롯한 용매화물을 형성할 수 있다는 것에 주목할 수 있다.

화학식(I)의 화합물의 적합한 약학적으로 허용되는 용매화물 또한 본 발명의 측면을 형성한다는 것을 추가로 이해하여야 한다. 적합한 약학적으로 허용되는 용매화물은 예를 들어, 수화물 예컨대, 반수화물, 일수화물, 이수화물 또는 삼수화물 또는 그의 대체 수량이다.

화학식(I)의 화합물의 적합한 약학적으로 허용되는 프로드럭 또한 본 발명의 측면을 형성한다는 것을 추가로 이해하여야 한다. 따라서, 본 발명의 화합물은, 인체 또는 동물체에서 분해되어 본 발명의 화합물을 유리시키는 프로드럭 형태로 투여될 수 있다. 프로드럭은 본 발명의 화합물의 물리적 특성 및/또는 약동학적 특성을 변경시키는 데 사용될 수 있다. 프로드럭은, 본 발명의 화합물이 특성 변형 기가 부착될 수 있는 적합한 기 또는 치환기를 함유할 때 형성될 수 있다. 프로드럭의 예는 화학식(I)의 화합물 중 카복시 기에서 형성될 수 있는 생체내 절단가능한 에스테르 유도체를 포함한다.

따라서, 본 발명은 유기 합성법에 의해 이용가능할 때, 및 그의 프로드럭의 절단에 의해 인체 또는 동물체 내에서 이용가능할 때, 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물을 포함한다. 따라서, 본 발명은 유기 합성 수단에 의해 제조되는 화학식(I)의 화합물 및 또한 전구체 화합물의 대사에 의해 인체 또는 동물체에서 제조된 상기와 같은 화합물을 포함하며, 화학식(I)의 화합물은 합성에 의해 제조된 화합물 또는 대사적으로 제조된 화합물일 수 있다.

화학식(I)의 화합물의 적합한 약학적으로 허용되는 프로드럭은 합리적인 의학적 판단에 기초하여 바람직하지 못한 약리학적 활성 없이, 및 과도한 독성 없이, 인체 또는 동물체에게 투여되는 데 적합한 것으로 간주되는 것이다.

예를 들어, 하기 문헌에 다양한 프로드럭 형태가 기술되었다: -

a) [Methods in Enzymology, Vol. 42, p. 309-396, edited by K. Widder, et al. (Academic Press, 1985)];

b) [Design of Pro-drugs, edited by H. Bundgaard, (Elsevier, 1985)];

c) [A Textbook of Drug Design and Development, edited by Krogsgaard-Larsen] 및 [H. Bundgaard, Chapter 5 "Design and Application of Pro-drugs", by H. Bundgaard p. 113-191 (1991)];

d) [H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8, 1-38 (1992)];

e) [H. Bundgaard, et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 77, 285 (1988)];

f) [N. Kakeya, et al., Chem . Pharm . Bull., 32, 692 (1984)];

g) [T. Higuchi and V. Stella, "Pro-Drugs as Novel Delivery Systems", A.C.S. Symposium Series, Volume 14]; 및

h) [E. Roche (editor), "Bioreversible Carriers in Drug Design", Pergamon Press, 1987].

카복시 기를 가지는 화학식 I의 화합물의 적합한 약학적으로 허용되는 프로드럭은 예를 들어, 그의 생체내 절단가능한 에스테르이다. 카복시 기를 함유하는 화학식 I의 화합물의 생체내 절단가능한 에스테르는 예를 들어, 인체 또는 동물체에서 절단되어 모체 산을 제조하는 약학적으로 허용되는 에스테르이다. 카복시에 대한 적합한 약학적으로 허용되는 에스테르로는 (1-6C)알킬 에스테르, 예컨대, 메틸, 에틸 및 tert-부틸, (1-6C)알콕시메틸 에스테르, 예컨대, 메톡시메틸 에스테르, (1-6C)알카노일옥시메틸 에스테르, 예컨대, 피발로일옥시메틸 에스테르, 3-프탈리딜 에스테르, (3-8C)사이클로알킬카보닐옥시-(1-6C)알킬 에스테르, 예컨대, 사이클로펜틸카보닐옥시메틸 및 1-사이클로헥실카보닐옥시에틸 에스테르, 2-옥소-1,3-디옥솔레닐메틸 에스테르, 예컨대, 5-메틸-2-옥소-1,3-디옥솔렌-4-일메틸 에스테르 및 (1-6C)알콕시카보닐옥시-(1-6C)알킬 에스테르, 예컨대, 메톡시카보닐옥시메틸 및 1-메톡시카보닐옥시에틸 에스테르를 포함한다.

카복시 기를 가지는 화학식 I의 화합물의 적합한 약학적으로 허용되는 프로드럭은 예를 들어, 생체내 절단가능한 아미드 예컨대, N-C_1- ₆알킬 및 N,N-디-(C_1-6알킬)아미드 예컨대, N-메틸, N-에틸, N-프로필, N,N-디메틸, N-에틸-N-메틸 또는 N,N-디에틸아미드이다.

화학식(I)의 화합물의 생체내 효과는 부분적으로는, 화학식(I)의 화합물의 투여 후 인체 또는 동물체 내에서 형성되는 하나 이상의 대사 산물에 의해 발휘될 수 있다. 본원 상기에서 언급된 바와 같이, 화학식(I)의 화합물의 생체내 효과는 또한 전구체 화합물(프로드럭)의 대사에 의해 발휘될 수 있다.

하기 제시되는 바와 같은 것인 시험관내 인간 시스템으로부터 실시예 1의 2가지 이성질체 활성 대사 산물이 확인되었고(여기서, 이성질체는 *로 표시된 탄소에 존재하는 두 입체배열 모두의 결과로서 부분입체 이성질체성이다), 두 이성질체 모두의 합성은 본원 실시예 14A 및 B에 기재되어 있다:

.

추가로, 하기 화합물은 일부 종, 예컨대, 마우스에서 활성 대사 산물인 것으로 간주된다:

.

상기 활성 대사 산물이 본 발명의 추가의 비의존적 측면을 형성한다.

의심을 피하기 위해, 본 명세서에서 한 군이 '본원 상기에서 정의된'('hereinbefore defined' 또는 'defined hereinbefore') 것으로 자격이 주어지는 경우, 상기 군은 최초로 존재하고, 가장 광범위한 정의 뿐만 아니라, 상기 군에 대한 각각의 및 모든 특정 정의를 포함한다는 것을 이해하여야 한다.

본 발명의 특정의 신규한 화합물은 달리 언급되지 않는 한, 예를 들어, R¹ 및 R²가 각각 본원 상기에서 정의되거나, 또는 하기 언급에서 정의된 의미 중 임의의 것을 가지는 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다:

한 측면에서, R¹은 수소이다. 또 다른 측면에서, R¹은 플루오로이다.

한 측면에서, R²는 수소이다. 또 다른 측면에서, R²는 플루오로이다.

한 측면에서, R¹ 및 R², 둘 모두 수소이다. 또 다른 측면에서, R¹ 및 R², 둘 모두 플루오로이다. 또 다른 측면에서, R¹은 수소이고, R²는 플루오로이다.

한 측면에서, R³은 수소이다. 또 다른 측면에서, R³은 메틸이다.

한 측면에서, R⁴는 수소이고, R⁵는 플루오로이다. 또 다른 측면에서, R⁵는 수소이고, R⁴는 플루오로이다.

본 발명의 특정 화합물은 예를 들어, 본원 하기에 기재되는 실시예 범위 내에서 개시되는 화학식(I)의 화합물이다.

예를 들어, 본 발명의 특정 화합물은 하기 중 어느 하나로부터 선택되는 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다:-

(E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;

(E)-3-(4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;

(E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;

(E)-3-(4-((1R,3R)-2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;

(E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;

(E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;

(E)-3-(4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;

(E)-3-(4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;

(E)-3-(3-플루오로-4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산.

본 발명의 추가의 특정 화합물은 하기 중 어느 하나로부터 선택되는 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다:-

(E)-3-(3,5-디플루오로-4(1R)-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;

(E)-3-(3,5-디플루오로-4(1R)-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;

(E)-3-(4(1R)-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;

(E)-3-(4(1R)-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;

(E)-3-(3-플루오로-4(1R)-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산; 및

(E)-3-[4-[(1R,3R)-1-듀테리오-2-(2-플루오로-2-메틸-프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-1-일]-3,5-디플루오로-페닐]프로프-2-엔산.

본 발명의 특정의 약학적으로 허용되는 염은 (1R,3R)-1-{4-[(E)-2-카복시에테닐]-2,6-디플루오로페닐}-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-베타-카볼린-2-이움 말레에이트.

본 발명의 특정 측면은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제조하는 방법을 제공한다. 적합한 방법은 달리 언급되지 않는 한, R¹내지 R⁵가 본원 상기에서 정의된 의미 중 임의의 것을 가지는 것인, 하기 대표적인 방법 변이형에 의해 예시된다. 필요한 출발 물질은 유기 화학의 표준 방법에 의해 수득될 수 있다. 상기 출발 물질의 제조법은 하기 대표적인 방법 변이형과 함께 첨부된 실시예 범위 내에서 기술되어 있다. 별법으로, 필요한 출발 물질은 유기 화학자의 숙련된 기술 범위 내에 있는, 예시된 것과 유사한 방법에 의해 수득될 수 있다.

화학식(I)의 화합물은 편리하게는 하기 화학식(II)의 에스테르 유도체의 가수분해에 의해 제조된다(여기서, R⁶은 (1-6C) 알킬, 예컨대, 메틸이다). 가수분해는 편리하게는 염기의 존재 하에서, 예컨대, 적합한 용매(예컨대, 수성 THF 및 MeOH(또는 또 다른 유사한 알콜), 또는 예컨대, 수성 알콜, 예를 들어, 수성 이소프로판올) 중 수산화나트륨을 사용하여, 및 적합한 온도, 편리하게 실온에서 수행된다.

.

화학식(III)의 화합물은 예를 들어,

a) 픽텟-슈펭글러(Pictet-Spengler) 반응에 적합한 것으로 당업계에 알려져 있는 조건 하에서(예컨대, 산(예컨대, 아세트산)의 존재 하에서 및 적합한 용매(예를 들어, 톨루엔) 중에서 및 적합한 온도(예컨대, 80℃)에서)의 하기 화학식(III)의 화합물의 하기 화학식(IV)의 화합물과의 반응에 의해:

; 또는

b) 염기(예를 들어, 아민 염기, 예컨대, N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민)의 존재 하에 및 적합한 극성 용매(예컨대, 디옥산) 중 적합한 온도(예컨대, 실온 내지 90℃)에서 하기 화학식(V)의 화합물의 하기 화학식(VI)의 화합물과의 반응에 의해 제조될 수 있다:

(상기 식에서, LG는 당업계에 공지된 이탈기, 예컨대, 할라이드 또는 트리플루오로메탄술포네이트(트리플레이트), 편리하게는 트리플레이트이다).

화학식(III)의 화합물은 상기 화학식(V)의 화합물과 화학식(VI)의 화합물의 반응에 대하여 기술된 바와 같은 조건 하에서 하기 화학식(VII)의 화합물의 화학식(VI)의 화합물과의 반응에 의해 제조될 수 있다:

화학식(IV)의 화합물은 헤크(Heck) 반응에 대해 당업계에 공지된 공지된 조건 하에서; 즉, 아릴 포스핀(예컨대, 트리-o-톨릴포스핀), 팔라듐 촉매(예컨대, 팔라듐 (II) 아세테이트) 및 염기(예컨대, 트리에틸아민)의 존재 하에 및 적합한 용매(예컨대, DMA) 중 적합한 온도(예컨대, 80℃)에서 하기 화학식(VIII)의 화합물의 알킬 아크릴레이트 에스테르(예컨대, R⁶이 메틸일 때, 메틸 아크릴레이트)와의 반응에 의해 제조될 수 있다:

화학식(V)의 화합물은 상기 화학식(III)의 화합물과 화학식(IV)의 화합물의 반응에 대하여 기술된 것과 유사한 조건 하에서 화학식(VII)의 화합물의 화학식(IV)의 화합물과의 반응에 의해 제조될 수 있다.

화학식(VI)의 화합물(여기서, LG는 트리플레이트이다)은 하기 반응식 1 및 2에 제시된 바와 같이 제조될 수 있다. 화학식(VI)의 다른 화합물(여기서, LG는 트리플레이트 이외의 것이다)은 당업계에 공지된 유사 방법에 의해 제조될 수 있다.

반응식 1

단계 1: 플루오르화제, 예컨대, N,N-디에틸-1,1,2,3,3,3-헥사플루오로프로판-1-아민/DCM/RT, 이어서, 환원제, 예컨대, 수소화알루미늄리튬/THF/RT.

단계 2: 트리플루오로메탄술폰산 무수물/염기, 예컨대, 2,6-루티딘/DCM/0℃.

반응식 2

단계 1: 환원제, 예컨대, 수소화알루미늄리튬/에테르/0℃.

단계 2: 트리플루오로메탄술폰산 무수물/염기, 예컨대, 2,6-루티딘/DCM/-10℃.

화학식(I)의 화합물은 키랄이다. 입체선택적 반응을 사용하여 원하는 이성질체를 수득할 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 별법으로, 입체화학은 적합한 수단, 예컨대, 본원의 실시예 4에 예시된 바와 같이(및 예를 들어, 문헌 [J. Org. Chem. 2009, 74, 2771-2779]에 기술된 바와 같이) 보호된 아민 기를 이용한 중간체의 산성화를 통한 시스에서 트랜스 이성질체로의 에피머화에 의해 조정될 수 있다.

본 발명의 추가의 측면에서, 편리하게는 염기의 존재 하에서 화학식(II)의 화합물의 가수분해를 포함하는, 화학식(I)의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다.

상기 기술된 방법 변이형에서 방법 단계의 다른 순서의 변환 또한 가능하다는 것을 이해하여야 한다.

본원 상기에서 기술된 방법들 중 임의의 것에 의해 수득된 임의의 화학식(I)의 화합물은 필요할 경우, 또 다른 화학식(I)의 화합물로 전환될 수 있다는 것을 이해하여야 한다.

화학식(I)의 화합물의 약학적으로 허용되는 염이 필요할 경우, 이는 예를 들어, 상기 화합물과 적합한 염기와의 반응에 의해 수득될 수 있다.

화학식(I)의 화합물의 약학적으로 허용되는 프로드럭이 필요할 경우, 이는 종래 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 화학식(I)의 화합물의 생체내 절단가능한 에스테르는 예를 들어, 카복시 기를 함유하는 화학식(I)의 화합물의 약학적으로 허용되는 알콜과의 반응에 의해 수득될 수 있다. 프로드럭에 관한 추가 정보는 본원 상기에서 제공되어 있다.

본원 상기에서 언급된 반응 중 일부에서는 화합물 중 임의의 감응성 기를 보호하는 것이 필요하거나, 또는 바람직할 수 있다는 것 또한 이해할 것이다. 보호가 필요하거나, 또는 바람직할 수 있는 경우, 및 적합한 보호 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 표준 관행에 따라 종래 보호기가 사용될 수 있다(예시를 위해, 문헌 [T.W. Green, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, 1991] 참조). 따라서, 반응 물질이 기, 예컨대, 아미노, 카복시 또는 하이드록시를 포함한다면, 본원에서 언급된 반응 중 일부에서는 기를 보호하는 것이 바람직할 수 있다.

아미노 또는 알킬아미노 기에 대해 적합한 보호기는 예를 들어, 아실 기, 예를 들어, 알카노일 기, 예컨대, 아세틸, 알콕시카보닐 기, 예를 들어, 메톡시카보닐, 에톡시카보닐 또는 t-부톡시카보닐 기, 아릴메톡시카보닐 기, 예를 들어, 벤질옥시카보닐, 또는 아로일 기, 예를 들어, 벤조일이다. 상기 보호기에 대한 탈보호화 조건은 필수적으로 보호기 선택에 따라 달라진다. 따라서, 예를 들어, 아실 기, 예컨대, 알카노일 또는 알콕시카보닐 기 또는 아로일 기는 예를 들어, 적합한 염기, 예컨대, 알칼리 금속 수산화물, 예를 들어, 수산화리튬 또는 수산화나트륨을 이용한 가수분해에 의해 제거될 수 있다. 별법으로, 아실 기, 예컨대, t-부톡시카보닐 기는 예를 들어, 적합한 산, 예컨대, 염산, 황산, 또는 인산 또는 트리플루오로아세트산을 이용한 처리에 의해 제거될 수 있고, 아릴메톡시카보닐 기, 예컨대, 벤질옥시카보닐 기는 예를 들어, 촉매, 예컨대, 탄소상 팔라듐 상에서의 수소화에 의해, 또는 루이스 산, 예를 들어, 보론 트리스(트리플루오로아세테이트)를 이용한 처리에 의해 제거될 수 있다. 1급 아미노 기에 대해 적합한 대체 보호기로는 예를 들어, 알킬아민, 예를 들어, 디메틸아미노프로필아민을 이용한, 또는 하이드라진을 이용한 처리에 의해 제거될 수 있는 프탈로일 기가 있다.

하이드록시 기에 대해 적합한 보호기는 예를 들어, 아실 기, 예를 들어, 알카노일 기, 예컨대, 아세틸, 아로일 기, 예를 들어, 벤조일, 또는 아릴메틸 기, 예를 들어, 벤질이다. 상기 보호기에 대한 탈보호화 조건은 필수적으로 보호기 선택에 따라 달라질 것이다. 따라서, 예를 들어, 아실 기, 예컨대, 알카노일 또는 아로일 기는 예를 들어, 적합한 염기, 예컨대, 알칼리 금속 수산화물, 예를 들어, 수산화리튬 또는 수산화나트륨을 이용한 가수분해에 의해 제거될 수 있다. 별법으로 아릴메틸 기, 예컨대, 벤질 기는 예를 들어, 촉매, 예컨대, 탄소상 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 제거될 수 있다.

카복시 기에 대해 적합한 보호기는 예를 들면, 예를 들어, 염기, 예컨대, 수산화나트륨을 이용한 가수분해에 의해 제거될 수 있는 에스테르화 기, 예를 들어, 메틸 또는 에틸 기, 또는 예를 들면, 예를 들어, 산, 예를 들어, 유기산, 예컨대, 트리플루오로아세트산을 이용한 처리에 의해 제거될 수 있는 t-부틸 기, 또는 예를 들면, 예를 들어, 촉매, 예컨대, 탄소상 팔라듐 상에서의 수소화에 의해 제거될 수 있는 벤질 기이다.

보호기는 화학 분야에 주지된 종래 기법을 사용하여 합성 중 임의의 편리한 단계에서 제거될 수 있다.

본원에서 정의된 중간체 중 특정의 것(화학식 II, III, IV, V, VI, VII 및 VIII의 화합물, 특히, 화학식 II, III 및/또는 V의 화합물)은 신규한 것이고, 이는 본 발명의 추가의 특징으로서 제공된다.

생물학적 검정법-

하기 검정법을 사용하여 본 발명의 화합물의 효과를 측정하였다.

ERα 결합 검정법

란타스크린(LanthaScreen)™ 시분해 형광 공명 에너지 전달(TR-FRET: Time-Resolved Fluorescence Resonance Energy Transfer) 검출 종점을 이용하여 경쟁 검정법으로 단리된 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인(ER 알파 - LBD(Estrogen Receptor Alpha Ligand binding domain)(GST))에 결합할 수 있는 화합물의 능력을 평가하였다. 란타스크린 TR-FRET 종점을 위해, 적합한 형광단(플루오르몬(Fluormone) ES2, 제품 코드 P2645) 및 재조합 인간 에스트로겐 수용체 알파 리간드 결합 도메인(제품 코드 PV4543)은 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 구입하였고, 이를 사용하여 화합물 결합을 측정하였다. 검정 원리는 ER 알파-LBD(GST)를 형광성 리간드에 부가하여 수용체/형광단 복합체를 형성하는 것이다. 테르븀 표지화된 항GST 항체(제품 코드 PV3551)를 사용하여 그의 GST 태그에의 결합에 의해 수용체를 간접적으로 표지화하고, 경쟁적 결합은 Tb-항GST 항체와 트레이서 사이의 TR-FRET 신호의 손실을 일으키는 형광성 리간드를 치환시킬 수 있는 테스트 화합물의 능력에 의해 검출될 수 있다. 검정법은 하기와 같이 실시되었으며, 모든 시약 첨가는 베크만 쿨터 바이오RAPTR FRD(Beckman Coulter BioRAPTR FRD) 마이크로플루이딕 워크스테이션을 사용하여 수행되었다:-

1. 120 nl의 테스트 화합물을 검은색 저부피 384 웰 검정용 플레이트에 음향적으로 분배한다.

2. ES2 스크리닝 완충제 중에서 1x ER 알파-LBD/Tb-항GST Ab를 제조하고, 20분 동안 인큐베이션시킨다.

3. 사용 전 1x 형광단을 ER 알파-LBD/Tb-항GST Ab 용액에 첨가한다.

4. 12 ㎕의 1x AR-LBD/Tb-항GST Ab/형광단 시약을 검정용 플레이트의 각 웰 내로 분배한다.

5. 시약을 빛 및 증발로부터 보호하기 위해 검정용 플레이트를 덮고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시킨다.

6. 337 nm에서 여기시키고, BMG 페라STAR(BMG PheraSTAR)을 이용하여 490 nm 및 520 nm에서 각 웰의 형광 방출 신호를 측정한다.

일련으로 희석된 화합물을 함유하는 화합물 공급원 마이크로플레이트(각각 10 mM, 0.1 mM, 1 mM 및 10 nM 최종 화합물을 함유하는 4개의 웰)로부터 직접 화합물을 랩사이트 에코 550(Labcyte Echo 550)을 이용하여 검정용 마이크로플레이트로 투약하였다. 에코 550은 DMSO 화합물 용액을 직접 마이크로플레이트에서 마이크로플레이트로 전달하는 것을 수행하는 데 음향 기술을 이용하는 액체 핸들이고, 상기 시스템은 다중의 소량의 nL 부피의 화합물을 상이한 공급원 플레이트 웰로부터 전달하여 검정에서 화합물의 원하는 일련의 희석액을 제공한 후, 이어서, 희석 범위 간에 DMSO 농도를 정규화하기 위해 다시 충전시킬 수 있도록 프로그램화될 수 있다. 총 120 nL의 화합물 + DMSO를 각 웰에 첨가하고, 화합물을 각각 100, 29.17, 10.42, 2.083, 1, 0.292, 0.104, 0.02083, 0.01, 0.002917, 0.001042, 0.0001 μM의 최종 화합물 농도 범위에 걸쳐 12점 농도 반응 형태로 테스트하였다. 각 화합물을 이용하여 수득된 TR-FRET 용량 반응 데이터를 적합한 소프트웨어 패키지(예컨대, 오리진(Origin) 또는 진데이터(Genedata))로 송출하여 곡선 피팅 분석을 실시하였다. 경쟁적 ER 알파 결합을 IC₅₀ 값으로 표시하였다. 이는 ER 알파-LBD에의 트레이서 화합물 결합을 50% 감소시키는 데 필요한 화합물의 농도를 계산함으로써 측정되었다.

MCF -7 ER 하향 조절 검정법

MCF-7 인간 유관 암종 유방 세포주를 이용하여 세포 기반 면역 형광 검정법으로 에스트로겐 수용체(ER) 개수를 하향 조절할 수 있는 화합물의 능력을 평가하였다. 2 mM L-글루타민을 함유하는 검정용 배지(페놀 레드 무함유 둘베코스 변형 이글스 배지(DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's medium))(시그마(Sigma) D5921) 중에서 냉동바이알(대략 5 x 10⁶ 세포)로부터 직접 MCF-7 세포를 소생시키고, 5% (v/v) 차콜/덱스트란 처리된 우태아 혈청 세포를 멸균 18G x 1.5 인치(1.2 x 40mm) 광궤 니들을 이용하여 주사하고, 쿨터 계수기(베크만)를 이용하여 세포 밀도를 측정하였다. 세포를 검정용 배지 중에서 3.75x10⁴개의 세포/ml의 밀도로 추가로 희석시키고, 써모 사이언티픽 매트릭스 웰메이트(Thermo Scientific Matrix WellMate) 또는 써모 멀티드롭(Thermo Multidrop)을 이용하여 투명 바닥, 검은색, 조직 배양 처리 384 웰 플레이트(코스타(Costar) 번호 3712)에 40 ㎕/웰을 첨가하였다. 세포를 시딩한 후, 플레이트를 37℃, 5% CO₂(리코닉(Liconic) 캐러셀 인큐베이터)에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. (인터그레이티드 에코 2(Integrated Echo 2) 워크셀)의 일부인 랩사이트 에코® 모델 555 화합물 리포맷터를 이용하여 테스트 데이터를 생성하였다. 테스트 화합물의 10 mM 화합물 스톡 용액을 사용하여 384 웰 화합물 투약 플레이트(랩사이트 P-05525-CV1)를 생성하였다. 각 10 mM 화합물 스톡 용액 40 ㎕씩을 제1 분위수 웰에 분배한 후, 하이드라 II(Hydra II)(매트릭스 UK(MATRIX UK)) 액체 핸들링 유니트를 이용하여 DMSO 중 1:100의 단계식의 일련의 희석을 수행하여 40 ㎕의 희석된 화합물을 각각 분위수 웰 2(0.1 mM), 3(1 μM) 및 4(0.01 μM)에 제공하였다. 공급원 플레이트 상의 P 열의 웰에 첨가된 40 ㎕의 DMSO를 용량 범위 간의 DMSO 정규화시킨다. 대조군 웰에 투약하기 위해 40 ㎕의 DMSO를 O1 열에 첨가하고, DMSO 중의 100 μM 파슬로덱스(Faslodex)® 40 ㎕를 화합물 공급원 플레이트 상의 O3 열에 첨가하였다. 에코는 DMSO 화합물 용액을 직접 마이크로플레이트에서 마이크로플레이트로 검정용 플레이트에 전달하는 것을 수행하는 데 음향 기술을 사용한다. 상기 시스템은 마이크로플레이트 간에 다중 증분으로 2.5 nL만큼 낮은 저부피를 전달하도록 프로그램화될 수 있고, 이를 수행함으로써 검정용 플레이트 중에서 화합물의 일련의 희석액을 생성하고, 이어서, 이는 희석 범위 간에 DMSO 농도를 정규화하기 위해 다시 충전된다. 인터그레이티드 에코 2 워크셀을 사용함으로써 상기 기술된 바와 같이 제조된 화합물 공급원 플레이트를 사용하여 세포 플레이트 상에 화합물을 분배하여 3배 희석액 내지 하나의 최종 10배 희석액을 포함하는 3 μM 내지 3 pM 용량 범위의 12 pt 복제물을 수득하였다. 이에 따라, 최대 신호 대조군 웰에 DMSO를 투약하여 최종 농도가 0.3%가 되도록 만들고, 최소 신호 대조군 웰에는 파슬로덱스®을 투약하여 최종 농도가 100 nM이 되도록 만들었다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂에서 18-22시간 동안 추가로 인큐베이션시킨 후, (포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate buffered saline) 중) 20 ㎕의 11.1% (v/v) 포름알데히드 용액을 첨가하여 고정시킴으로써 3.7% (v/v)의 최종 포름알데히드 농도를 얻었다. 세포를 실온에서 20 min 동안 고정시킨 후, 바이오테크(BioTek) 플레이트 세척기를 이용하여 250 ㎕의 PBS/프로클린(Proclin)(바이오사이드(Biocide) 보존제를 포함하는 PBS)으로 2회에 걸쳐 세척하고, 이어서, 40 ml의 PBS/프로클린을 모든 웰에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 보관하였다. 인터그레이티드 에코 2 워크셀에서 상기 기술된 고정 방법을 수행하였다. 자동 오토엘리사(AutoElisa) 워크셀을 사용하여 면역염색을 수행하였다. 모든 웰로부터 PBS/프로클린을 흡인하고, 실온에서 1시간 동안 0.5% 트윈(Tween)™ 20 (v/v)을 함유하는 40 ㎕의 PBS를 이용하여 세포를 투과시켰다. 플레이트를 프로클린을 포함하는 PBS/0.05% (v/v) 트윈 20(바이오사이드 보존제를 포함하는 PBST) 250 ㎕ 중에서 3회에 걸쳐 세척한 후, PBS/트윈™/3% (w/v) 우혈청 알부민 중 1:1,000으로 20 ㎕의 ERα(SP1) 토끼 단일클론 항체(써모피셔(Thermofisher))를 첨가하였다. 플레이트를 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후(리코닉 캐러셀 인큐베이터), 이어서, 프로클린을 포함하는 PBS/0.05% (v/v) 트윈™ 20(PBST) 250 ㎕ 중에서 3회에 걸쳐 세척하였다. 이어서, 플레이트를 실온에서 1 hr 동안 PBS/트윈™/3% (w/v) 우혈청 알부민 중 1:5,000으로 훽스트(Hoechst)와 20 ㎕/웰의 염소 항토끼 IgG 알렉사플루오르(AlexaFluor) 594 또는 염소 항토끼 알렉사플루오르 488 항체(몰레큘라 프로브스(Molecular Probes))를 함께 인큐베이션시켰다. 이어서, 플레이트를 프로클린을 포함하는 PBS/0.05% (v/v) 트윈™ 20(바이오사이드 보존제를 포함하는 PBST) 250 ㎕ 중에서 3회에 걸쳐 세척하였다. 20 ㎕의 PBS를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 검은색 플레이트 실로 덮고, 4℃에서 보관한 후, 판독하였다. 594 nm(24 hr 시점) 또는 488 nm(5 hr 시점) 형광을 판독하는 셀로믹스 어레이스캔(Cellomics Arrayscan)을 사용하여 플레이트를 판독하여 각 웰 중 ERα 수용체 수준을 측정하였다. 세포 개수에 대하여 평균 총 강도를 정규화하여 세포당 총 강도를 수득하였다. 데이터를 적합한 소프트웨어 패키지(예컨대, 오리진)로 송출하여 곡선 피팅 분석을 실시하였다. ERα 수용체의 하향 조절을 IC₅₀ 값으로 표시하였고, 이는 평균 최대 총 강도(Total Intensity) 신호를 50% 감소시키는 데 필요한 화합물의 농도를 계산함으로써 측정되었다.

비록 화학식(I)의 화합물의 약리학적 특성은 예상대로 구조 변화에 따라 달라질 수는 있지만, 일반적으로는 화학식(I)의 화합물의 활성은 상기 테스트 중 하나 이상의 것에서의 하기 농도 또는 용량에서 입증될 수 있다.

실시예에 대하여 하기 데이터가 생성되었다(하기 데이터는 단일 실험으로부터의 결과이거나, 또는 다회 반복 실시된 실험의 평균값일 수 있다):

<표 A>

단일 작용제로서의, 및 mTOR 억제제와 조합된 실시예 1을 이용한 MCF -7 생체내 이종이식편 연구

각 마우스에 0.5 mg/21일 에스트로겐 펠릿(이노베이티브 리서치(Innovative Research: 미국))을 외과적으로 이식한 다음날 MCF7 세포(100 ㎕의 RPMI 세포 배지 중에 현탁된 5 x 10⁶개의 세포)를 면역약화된(SCID) 마우스의 뒷 옆구리에 피하로 이식하였다. 매주 2회에 걸쳐 종양을 측정하고, 양측 버니어(Vernier) 캘리퍼 측정(길이 x 너비)(여기서, 종양을 가로지르는 가장 긴 직경을 길이인 것으로 측정하였고, 상응하는 수선을 너비인 것으로 측정하였다)에 의해 종양 부피 변화 및 성장 억제를 측정하였다. 종양 부피는 공식

을 사용하여 계산하였다.

세포 이식 후 13일 경과하였을 때 종양을 측정하여 마우스를 시험군으로 무작위화시켰다. 그 다음날(즉, 세포 이식 후 14일째) 화합물을 이용한 치료를 시작하였다.

mTOR 억제제 AZD2014를 10 g당 0.1 ml의 부피로 매일 1일 1회에 걸쳐 경구적으로(p.o.) 15 mg/kg으로 상이한 마우스 군에 투약하였다. 실시예 1은 0.1 ml/10 g으로 1일 1회에 걸쳐 경구적으로 5 mg/kg으로 투약하였다. 대조군으로서의 역할을 하는 한 동물 군에는 비히클을 p.o.로 투약하였다. 대조군을 위한 활성제에 대하여 군당 9마리의 마우스를 사용하였다.

본 연구로부터 수득된 데이터는 도 10에 제시되어 있다.

화학식(I)의 화합물과 PI3Kα/δ 억제제와의 조합물의 효과는 상기 mTOR 억제제와의 조합물과 유사한 방식으로 연구될 수 있다.

HCC1428 장기간 에스트로겐 결핍( HCC1428 LTED : HCC1428 long term estrogen deprived) 이종이식편 효능 연구

적합한 기간 동안의 세포 배양 후, 난소 절제술을 받은 암컷인 면역약화된 NSG 마우스(잭슨 랩스(Jackson Labs: 미국))의 뒷 옆구리에 HCC1428 LTED 세포(1 x 10⁶)를 피하로 이식하였다. 매주 2회에 걸쳐 종양을 측정하고, 양측 버니어 캘리퍼 측정(길이 x 너비)(여기서, 종양을 가로지르는 가장 긴 직경을 길이인 것으로 측정하였고, 상응하는 수선을 너비인 것으로 측정하였다)에 의해 종양 부피 변화 및 성장 억제를 측정하였다. 종양 부피는 공식

을 사용하여 계산하였다. 종양 평균 크기가 150 ㎣에 도달할 때까지 세포 이식 후 매주 1회에 걸쳐 종양을 측정하였고, 상기 시점에 마우스를 무작위화된 시험군으로 배치하였으며, 각 군은 마우스 10마리씩 포함하였다. 그 다음날(본 연구 62일째) 화합물을 이용한 치료를 시작하고, 계속 매주 1회에 걸쳐 종양을 측정하였다. 실시예 1을 10 g당 0.1 ml의 부피로 매일 1일 1회에 걸쳐 경구적으로(p.o.) 25 mg/kg으로 투약하였다. 대조군으로서의 역할을 하는 또 다른 동물 군에는 비히클을 p.o.로 투약하였다.

투약 후 28일 경과하였을 때, 대조군 처리된 종양은 220 ㎣(기하 평균값 사용)만큼 성장한 반면, 실시예 1에 의해 처리된 마우스로부터의 종양은 크기가 46 ㎣만큼 감소하였으며, 이는 종양 성장이 121% 억제된 것을 나타낸다(독립 t 검정에 의한 P<0.001).

이종이식편 종양 중 에스트로겐 수용체 단백질의 수준을 측정하기 위해, 최종 용량의 비히클 또는 실시예 1 처리 후 24 hr째에 종양 샘플을 수확하고, 액체 질소 중에서 급냉시켰다. 단백질 추출을 위해, wt 얼음상에서 2 ml 샘플 튜브 중 시그마 포스파타제 억제제(번호 2(P5726) 및 3(P0044), 1/100 희석) 및 로슈 컴플 리트(Roche Complete)(11836145001) 프로테아제 억제제(1 정제/50 ml), 1 mM 디티오트레이톨(DTT)이 첨가된 700 ul의 인비트로겐 세포 추출용 완충제(FNN0011)에 종양 단편을 첨가하였다. 믹서밀(Mixermill)(레벨 27/sec) 및 균질화 사이클 3 x 2 min을 이용하여 샘플을 균질화시켰다. 샘플을 짧게 회전시켜 종양이 확실히 완전하게 균질화될 수 있도록 하였다. 균질액을 10초 동안 초음파 처리한 후, 15 min 동안 최고 속도(13,000 rpm)의 원심분리기에서 하향 회전시켰다. 상청액 중의 단백질 수준을 측정하고, 표준 방법을 사용하여 15 웰 비스-트리스 겔즈(Bis-Tris Gels)(4-12% 겔즈) 상에서 대략 45 ug의 단백질을 전개시켰다. 단백질을 분리하고, 니트로셀룰로스 필터로 옮긴 후, 에스트로겐 수용체 68 kDa: 써모피셔 SP1 #9101S 항체를 첨가하고, 밀크/PBS/T 중에 1:400으로 희석시키고, 4℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. ~20 ml의 TBS/T 0.05% 중에서 3 x 5 min으로 필터를 세척하고, 2차 항토끼 검출 항체를 TBS/T 중 5% 마벨 중에 1:2,000으로 희석시키고, RT에서 1 hr 동안 인큐베이션시켰다. 화학발광성 슈퍼시그널 웨스터 듀라(SuperSignal West Dura) 장수명화 기질을 사용하여 신호를 검출하고, 신진(Syngene) 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다. 마벨 중 1:10,000으로 희석된 V931 시그마 및 항마우스 검출 항체를 사용하여 로딩 대조군으로서 빈쿨린 단백질 수준을 측정하였다. 도 11 및 12의 결과는, 비히클 대조군과 비교하여 실시예 1을 이용하여 처리하였을 때 ER 수준이 60% 감소한 것이 관찰되었다는 것을 나타낸다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

정제 제제에 적합한 약학적으로 허용되는 부형제로는 예를 들어, 불활성 희석제, 과립화제 및 붕해제, 결합제, 윤활제, 보존제 및 항산화제를 포함한다. 추가의 적합한 약학적으로 허용되는 부형제는 킬레이팅제일 수 있다. 정제 제제는 위장관 내에서 그의 붕해와 활성 성분의 후속적인 흡수를 조절하기 위해, 또는 그의 안정성 및/또는 외관을 개선하기 위해, 어느 경우에든 당업계에 주지된 종래 코팅제 및 방법을 이용하여 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있다.

경구용 조성물은 별법으로 활성 성분이 불활성 고체 희석제와 혼합된 경질 젤라틴 캡슐 형태, 또는 활성 성분이 물 또는 오일과 혼합한 연질 젤라틴 캡슐제와 같은 것일 수 있다.

수성 현탁제는 일반적으로 하나 이상의 현탁화제, 분산제 또는 습윤제와 함께 미세 분말 형태의 활성 성분을 함유한다. 수성 현탁제는 또한 하나 이상의 보존제, 항산화제, 착색제, 향미제 및/또는 감미제를 함유할 수 있다.

오일성 현탁제는 식물성 오일 또는 광물성 오일 중에 활성 성분을 현탁시킴으로써 제제화될 수 있다. 오일성 현탁제는 또한 증점제를 함유할 수 있다. 상기에 기술된 것과 같은 감미제, 및 향미제는 맛이 좋은 경구 제제를 제공하기 위해 첨가될 수 있다. 상기 조성물은 항산화제의 첨가에 의해 보존될 수 있다.

물을 첨가하여 수성 현탁제를 제조하는 데 적합한 분산성 분제 및 과립제는 일반적으로 분산제 또는 습윤제, 현탁화제 및 하나 이상의 보존제와 함께 활성 성분을 함유한다. 추가의 부형제, 예컨대, 감미제, 향미체, 및 착색제 또한 존재할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 또한 수중유 에멀젼 형태일 수 있다. 오일상은 식물성 오일 또는 광물성 오일 또는 상기 중 임의의 것의 혼합물일 수 있다. 에멀젼은 또한 감미제, 향미제 및 보존제를 함유할 수 있다.

시럽제 및 엘릭시르제는 감미제와 제제화될 수 있고, 이는 또한 자극 완화제, 보존제, 향미제 및/또는 착색제를 함유할 수 있다.

약학 조성물은 또한, 상기에서 언급된 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제 중 하나 이상의 것을 이용하여 공지된 방법에 따라 제제화될 수 있는 멸균 주사 가능한 수성 또는 오일성 현탁제 형태일 수 있다. 멸균 주사 가능한 제제는 또한 비독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 시스템 중의 멸균 주사 가능한 액제 또는 현탁제일 수 있다.

흡입 투여용 조성물은 미분된 고체를 함유하는 액적으로서 또는 액체 액적으로서 활성 성분을 분배하도록 배열된 종래 가압식 에어로졸 형태의 것일 수 있다. 종래 에어로졸 추진제, 예컨대, 휘발성 플루오르화된 탄화수소, 또는 탄화수소가 사용될 수 있으며, 에어로졸 장치는 계랑된 양의 활성 성분을 분배하는 데 편리하도록 배열된다. 건식 분말 흡입기 또한 적합할 수 있다.

제제화에 대한 추가 정보를 위해, 판독자는 문헌 [Chapter 25.2 in Volume 5 of Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990]을 참조할 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, 상기 기술된 약학 조성물은 실시예 1의 화합물인 [(E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산], 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 편의상, 실시예 1의 화합물은 결정질 B형으로서 본원에 기술된 그의 다형체로 존재한다.

실시예 1에 기술된 바와 같은 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산을 합성하는 방법은 분해 생성물이 형성되지 못하도록 하기 위해 상기 방법이 빛의 부재 하에 질소 대기 하에서 수행되는 것을 권장한다.

(R,E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-2-이움-1-일)페닐)아크릴레이트인, 언급된 분해 생성물은 하기 구조를 가지며:

이는 자유 라디칼 연쇄 메커니즘을 통한 대기에서의 자가 산화에 의해 실시예 1 [(E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산]으로부터 형성될 수 있는 것으로 간주된다. 의심을 피하기 위해, 상기 분해 생성물은 유의적인 SERD 활성을 가지는 것으로 간주되지 않는다.

상기 화합물은 또한 (E)-3-[3,5-디플루오로-4-[(3R)-2-(2-플루오로-2-메틸-프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-2-이움-1-일]페닐]프로프-2-에노에이트로서도 지칭될 수 있고, 그를 제조하는 합성 방법은 실시예 13에 제시되어 있다.

제약의 안전한 제조와 보관을 위해서는 분해 생성물 형성을 제어하는 것이 필수적이라는 것을 당업자는 이해할 것이다. 또한, 특정 화합물은 보관시 분해될 수 있고, 심지어 약학 조성물로 제제화된 이후에도 상기 분해는 일부 경우에서, 약학 조성물 중 적절한 부형제의 사용에 의해, 및/또는 최종 생성물의 적절한 패키징에 의해 제어될 수 있다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 상업적 용도로 개발되는 최종 제제는 화학적 안정성 뿐만 아니라, 예를 들어, 물리적 안정성 및 용해 특징을 비롯한 다수의 특징을 위해 최적화되어야 한다는 것을 당업자는 추가로 이해할 것이다. 그러므로, 다수의 상이한 인자의 균형을 유지시키기 위해 상기와 같은 제제가 개발될 것이다.

적합하게, (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 조성물은 항산화제로서 작용하는 화합물을 포함한다.

약학 조성물에 사용하는 데 적합한 항산화제 화합물은 당업계에 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 아세톤 아황산수소나트륨; 알파 리포산; 알파 토코페롤; 아스코르브산; 아스코빌 팔미테이트; 부틸화된 하이드록시아니솔; 부틸화된 하이드록시톨루엔; 카로틴; 시트르산 일수화물; 도데실 갈레이트; 에리토르브산; 푸마르산; 글루타티온; 히스티딘; 하이포아인산; 락토비온산; 리포산; 말산; 멜라토닌; 메티오닌; d-만노스; 모노티오글리세롤; 옥실 갈레이트; 메타중아황산칼륨; 프로피온산; 프로필갈레이트; 아스코르브산나트륨; 아황산수소나트륨; 소듐 포름알데히드 술폭실레이트; 메타중아황산나트륨; 아황산나트륨; 티오황산나트륨; 염화 제1 주석; 이산화황; 티몰; 토코페롤; 토코트리에놀; 유비퀴놀; 요산; 비타민 E; 및 비타민 E 폴리에틸렌 글리콜 숙시네이트를 포함한다. 상기 화합물은 다양한 기전에 의해 그의 항산화제 효과를 발휘할 수 있고, 이들 기전 중 하나 이상의 것이 임의의 특정 화합물에 대하여 다른 것보다도 더욱 효과적일 수 있다. 일부 항산화제 화합물, 예컨대, BHA는 자유 라디칼 스캐빈저로서의 역할을 한다. 다른 항산화제, 예컨대, 메타중아황산나트륨 및 아스코르브산은 쉽게 산화되며, 이로써, 활성 성분보다 더 우선적으로 산화될 수 있다.

예를 들어, 금속 유도성 퍼옥시드 형성이 산화 기전에 관여하는 경우, 킬레이팅제, 예컨대, EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)를 사용하는 것이 임의의 금속 오염 물질을 제거하고, 이로써, 안정화 효과를 간접적으로 달성하는 데 유용할 수 있다. 다른 금속 킬레이팅제가 당업계에 공지되어 있고, 이는 예를 들어, 베타덱스 술포부틸 에테르 소듐; 아세트산 칼슘; 시트르산 일수화물; 사이클로덱스트린; 디소듐 에데테이트; 에데트산; 푸마르산; 갈락토스; 글루탐산; 히스티딘; 하이드록시프로필베타덱스; 말산; 펜테틴산; 피토켈라틴; 폴리(메틸 비닐 에테르/말레산 무수물); 시트르산 칼륨; 시트르산 나트륨 이수화물; 제2인산나트륨; 제1인산나트륨; 타르타르산; 및 트레할로스를 포함한다.

실시예 1의 예시적인 제제화에서 예를 들어, 프로필갈레이트, 메타중아황산나트륨, 아스코르브산 및 부틸화된 하이드록시아니솔이 포함되었다. EDTA 또한 포함되었다. 상기 제제화의 일례는 실시예 12에 제공되어 있다. 다수의 상이한 열 및 습도 조건 하에서 4주간의 보관 이후, 상기의 것들 중 메타중아황산나트륨을 함유하는 조성물이 항산화제를 함유하지 않는 것보다 덜 안정적인 것으로 보였다. (액체 크로마토그래피 분석법, 예컨대, UHPLC에 의해 측정된 바) 다수의 상이한 열 및 습도 조건 하에서 4주간의 보관 이후, 아스코르브산을 함유하는 조성물이 가장 안정적인 것으로 보였다.

실시예 1의 화합물을 포함하는 제제에 대해 추가로 적합한 첨가제는 금속 함량이 낮은 부형제, 퍼옥시드 함량이 낮은 부형제, 자유 라디칼 스캐빈저인 부형제, 예컨대, 만닛톨 뿐만 아니라, 충전제를 사용하는 것을 포함한다. 상기 제제를 제조하는 방법은 또한 안정성에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 일부 활성 성분의 경우, 확실하게 최대로 안정화시키는 데 있어서 활성 성분이 확실히 안정성 유도 부형제와 함께 긴밀하게 혼합되도록 하는 것이 중요할 수 있다. 긴밀하게 혼합하는 것은 예를 들어, 혼합 속도, 입자 크기, 및 습식 또는 건식 혼합/과립화 방법에 의해 영향을 받을 수 있다. 활성 성분을 항산화제와 함께 과립화시킨 후, 다른 부형제와 함께 혼합할 수 있다. 또한, 항산화제를 약학 조성물의 겉면 상의 임의의 코팅에 첨가할 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, 1 이상의 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 한 측면에서, (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하고, 또한 항산화제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 적합하게, 아스코르브산이 항산화제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 한 측면에서, (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하고, 또한 금속 킬레이팅제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 적합하게, EDTA가 금속 킬레이팅제로서 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 항산화제를 포함하고, 임의적으로 금속 킬레이팅제를 추가로 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 1 이상의 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물로서, 여기서, 상기 조성물은 5% w/w 미만의 (R,E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-2-이움-1-일)페닐)아크릴레이트를 함유하는 것인, 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 1 이상의 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물로서, 여기서, 상기 조성물은 2% w/w 미만의 (R,E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-2-이움-1-일)페닐)아크릴레이트를 함유하는 것인, 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 1 이상의 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물로서, 여기서, 상기 조성물은 1% w/w 미만의 (R,E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-2-이움-1-일)페닐)아크릴레이트를 함유하는 것인, 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 1 이상의 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물로서, 여기서, 상기 조성물은 0.5% w/w 미만의 (R,E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-2-이움-1-일)페닐)아크릴레이트를 함유하는 것인, 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 1 이상의 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물로서, 여기서, 상기 조성물은 0.1% w/w 미만의 (R,E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-2-이움-1-일)페닐)아크릴레이트를 함유하는 것인, 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 1 이상의 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물로서, 여기서, 상기 조성물은 0.05% w/w 미만의 (R,E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-2-이움-1-일)페닐)아크릴레이트를 함유하는 것인, 약학 조성물을 제공한다.

상기 측면에서, 조성물이 5% w/w, 2% w/w, 1% w/w, 0.5% w/w, 0.1% w/w 또는 0.05% w/w 미만의 (R,E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-2-이움-1-일)페닐)아크릴레이트를 함유하는 것으로 기술되는 경우, 이는 조성물 중에 존재하는 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산의 중량과 비교하여 % 중량/중량을 의미하고자 하는 것임을 당업자는 이해할 것이다.

그러므로, 분해 생성물인 (R,E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-2-이움-1-일)페닐)아크릴레이트는 실시예 1의 화합물, 또는 그를 함유하는 약학 조성물의 안정성을 모니터링하는 분석 기법, 예컨대, HPLC에서 참조 마커 또는 참조 표준으로서 사용될 수 있다.

하나 이상의 부형제와 함께 조합되어 단일 투여 형태로 제조되는 활성화 성분의 양은 필수적으로 치료받는 주체 및 특정 투여 경로에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 인간에게 경구적으로 투여되는 경우, 일반적으로, 전체 조성물의 약 3 내지 약 98%중량로 달라질 수 있는 적합하고 편리한 양의 부형제와 함께 제제화되는, 예를 들어, 1 mg 내지 2 g의 활성제(더욱 적합하게, 100 mg 내지 2 g, 예를 들어, 250 mg 내지 1.8 g, 예컨대, 500 mg 내지 1.8 g, 특히, 500 mg 내지 1.5 g, 편리하게는 500 mg 내지 1 g)가 투여되어야 할 것이다. 다량의 투여량이 필요한 경우, 다중 투여 형태, 예를 들어, 편리하게는 투여 형태 사이에 분할된 용량의 활성 성분을 가지는 2개 이상의 정제 또는 캡슐제가 필요할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 비록 단위 투여 형태가 최대 1 g을 함유할 수는 있지만, 전형적으로는 단위 투여 형태는 약 10 mg 내지 0.5 g의 본 발명의 화합물을 함유할 것이다. 편의상, 단일 고체 투여 형태는 1 내지 300 mg의 활성 성분을 함유할 수 있다. 다량의 투여량이 필요한 경우, 복수 제형, 예를 들어, 제형 사이에 편리하게 분리되는 활성 성분의 투여량을 갖는 2개 이상의 정제 또는 캡슐이 요구될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 편리하게는, 단일 고체 제형은 활성 성분 1 내지 300 mg을 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물의 치료 또는 예방 목적을 위한 용량의 크기는 당연하게는 주지된 의약 원리에 따라, 질환 상태의 성질 및 증증도, 동물 또는 환자의 연령 및 성별 및 투여 경로에 따라 달라질 것이다.

치료 또는 예방 목적으로 본 발명의 화합물을 사용하는 데 있어서, 일반적으로는 예를 들어, 1 mg/kg(체중) 내지 100 mg/kg(체중) 범위의 1일 용량, 필요한 경우, 분할된 용량으로 받도록 투여될 것이다. 일반적으로, 비경구 경로가 사용될 때에는 보다 소량의 저용량이 투여될 것이다. 따라서, 예를 들어, 정맥내 투여의 경우, 예를 들어, 1 mg/kg(체중) 내지 25 mg/kg(체중) 범위의 용량이 일반적으로 사용될 것이다. 유사하게, 흡입에 의한 투여의 경우, 예를 들어, 1 mg/kg(체중) 내지 25 mg/kg(체중) 범위의 용량이 사용될 것이다. 그러나, 경구 투여는 특히 정제 형태에서 바람직하다.

본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염은 10 mg 내지 100 mg의 화학식(I)의 화합물(또는 그의 약학적으로 허용되는 염)을 포함하는 정제로서 투여되며, 여기서, 하나 이상의 정제는 원하는 용량을 달성하기 위해 그의 필요에 따라 투여된다.

상기에 언급한 바와 같이, ERα를 통한 신호전달이 암 및 다른 세포의 증식을 매개하고, 혈관신생 이벤트를 매개하며, 암세포의 운동성, 이동 및 침습을 매개하는 효과 중 하나 이상의 것에 의해 종양 발생을 유발한다는 것이 알려져 있다. 본 발명자들은 본 발명의 화합물이 종양 세포의 증식과 생존 및 전이성 종양 세포의 침습 및 이동능을 일으키는 신호 전달 단계에 관여하는 ERα의 길항작용 및 하향 조절에 의해 수득되는 것으로 간주되는 강력한 항종양 활성을 가진다는 것을 발견하게 되었다.

따라서, 본 발명의 화합물은 항종양제로서, 특히, 종양 성장과 생존의 억제 및 전이성 종양 성장의 억제를 일으키는 포유동물 암 세포의 증식, 생존, 운동성, 파종 및 침습의 선택적 억제제로서 가치가 있을 수 있다. 특히, 본 발명의 화합물은 고형 종양 질환의 억제 및/또는 치료에서 항증식제 및 항침습제로서 가치가 있을 수 있다. 특히, 본 발명의 화합물은 종양 세포의 증식과 생존 및 전이성 종양 세포의 이동능 및 침습을 일으키는 신호 전달 단계에 관여하는 ERα 억제에 감수성인 종양 예방 또는 치료에 유용할 수 있다. 추가로, 본 발명의 화합물은 단독으로 또는 부분적으로 ERα의 길항작용 및 하향 조절에 의해 매개되는 종양의 예방 또는 치료에 유용할 수 있고, 즉, 본 화합물은 상기 치료를 필요로 하는 온혈 동물에서 ERα 억제 효과를 생성하는 데 사용될 수 있다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 의약으로서 사용하기 위한 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 항증식성 효과를 생성하는 데 사용하기 위한 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 고형 종양 질환의 억제 및/또는 치료에 항침습제로서 사용하기 위한 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 항증식성 효과를 생성하기 위한 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 항증식성 효과를 생성하는 데 사용하기 위한 의약의 제조에서 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 고형 종양 질환의 억제 및/또는 치료에 항침습제로서 사용하기 위한 의약의 제조에서 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 항증식성 효과 생성을 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에게 유효량의 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 항증식성 효과 생성을 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 항증식성 효과를 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 고형 종양 질환의 억제 및/또는 치료에 의한 항침습성 효과 생성을 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에게 유효량의 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 항침습성 효과 생성을 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 고형 종양 질환의 억제 및/또는 치료에 의해 항침습성 효과를 생성하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서의 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서의 암 예방용 또는 치료용 의약의 제조에서 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 암 예방 또는 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에게 유효량의 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 고형 종양 질환의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 고형 종양 질환의 예방용 또는 치료용 의약의 제조에서 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 고형 종양 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에게 유효량의 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 고형 종양 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 고형 종양 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 종양 세포의 증식, 생존, 침습 및 이동능을 일으키는 신호 전달 단계에 관여하는 ERα의 억제에 감수성인 종양의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 종양 세포의 증식, 생존, 침습 및 이동능을 일으키는 신호 전달 단계에 관여하는 ERα의 억제에 감수성인 종양의 예방용 또는 치료용 의약의 제조에서 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 상기 동물에게 유효량의 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 종양 세포의 증식, 생존, 침습 및 이동능을 일으키는 신호 전달 단계에 관여하는 ERα의 억제에 감수성인 종양을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, ERα 억제 효과를 제공하는 데 사용하기 위한 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, ERα 억제 효과를 제공하는 데 사용하기 위한 의약 제조에서 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 또한 유효량의 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, ERα 억제 효과를 제공하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, ERα에 대한 선택적 억제 효과를 제공하는 데 사용하기 위한 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, ERα에 대한 선택적 억제 효과를 제공하는 데 사용하기 위한 의약의 제조에서 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 유효량의 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, ERα에 대한 선택적 억제 효과를 제공하는 방법 또한 제공한다.

본원에서는 ERα 리간드 결합 도메인에 결합할 수 있고, 선택적 에스트로겐 수용체 분해제인 화합물을 기술한다. 생화학적 및 세포 기반 검정법에서, 본 발명의 화합물은 강력한 에스트로겐 수용체 결합제이고, ERα의 세포 수준을 감소시키는 것으로 보이며, 그러므로, 에스트로겐 감수성 질환 또는 병증(내분비성 요법에 대하여 저항을 발생시킨 질환 포함) 치료에, 즉, 유방암 및 부인과 암(자궁내막암, 난소암, 및 자궁경부암 포함) 및 새로운 돌연변이일 수 있거나, 또는 이전 내분비성 요법, 예컨대, 아로마타제 억제제를 이용한 치료의 결과로서 유발된 ERα 돌연변이화된 단백질을 발현하는 암 치료에 사용하는 데 유용할 수 있다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 유방암 또는 부인과 암 치료에 사용하기 위한 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 유방암, 자궁내막암, 난소암 또는 자궁경부암 치료에 사용하기 위한 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 유방암 치료에 사용하기 위한 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 암이 하나 이상의 다른 내분비성 요법에 대하여 저항을 발생시킨 것인 유방암 치료에 사용하기 위한 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 유효량의 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 유방암 또는 부인과 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 유효량의 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 유방암, 자궁내막암, 난소암 또는 자궁경부암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 유효량의 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 유방암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 유효량의 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 암이 하나 이상의 다른 내분비성 요법에 대하여 저항을 발생시킨 것인 유방암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 유방암 또는 부인과 암 치료용 의약의 제조에서 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 유방암, 자궁내막암, 난소암 또는 자궁경부암 치료용 의약의 제조에서 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 유방암 치료용 의약의 제조에서 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 암이 하나 이상의 다른 내분비성 요법에 대하여 저항을 발생시킨 것인 유방암 치료용 의약의 제조에서 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 한 특징에서, 치료하고자 하는 암은 유방암이다. 본 특징의 추가의 측면에서, 유방암은 에스트로겐 수용체 +ve(ER+ve)이다. 상기 측면의 한 실시양태에서, 화학식(I)의 화합물은 또 다른 항암제, 예컨대, 본원에서 정의된 바와 같은 항호르몬제와 함께 조합하여 투약된다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, ER+ve 유방암 치료에 사용하기 위한 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 유효량의 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, ER+ve 유방암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, ER+ve 유방암 치료용 의약의 제조에서 본원 상기에서 정의된 바와 같은 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본원 상기에서 언급된 바와 같이, 화학식(I)의 화합물의 생체내 효과는 부분적으로는 화학식(I)의 화합물의 투여 후 인체 또는 동물체 내에서 형성되는 하나 이상의 대사 산물에 의해 발휘될 수 있다.

그러므로, 본 발명은 또한 환자에서 ERα를 억제시키는 데 효과적인 일정양으로 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 ERα를 억제시키는 방법을 고려한다.

상기의 모든 용도 및 방법에서, 적합한 화학식(I)의 화합물은 실시예 1, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다. 한 측면에서, 실시예 1은 본원에 기술된 바와 같은 결정질 B형의 것이다.

본원에 정의된 항암 치료는 단일 요법으로서 적용될 수 있거나, 또는 본 발명의 화합물 이외에도 종래 수술 또는 방사선 요법 또는 화학요법을 포함할 수 있다. 상기 화학요법은 하기 항종양제 카테고리들 중 하나 이상의 것을 포함할 수 있다:-

(i) 종양 의학에 사용되는 다른 항증식제/항신생물제 및 그의 조합, 예컨대, 알킬화제(예를 들어, 시스-플라틴, 옥살리플라틴, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 질소 머스타드, 멜팔란, 클로람부실, 부술판, 테모졸라미드 및 니트로소우레아); 항대사물질(예를 들어, 겜시타빈 및 엽산 길항제, 예컨대, 5-플루오로우라실 및 테가푸르와 같은 플로오로피리미딘, 랄티트렉세드, 메토트렉세이트, 시토신 아라비노시드, 및 하이드록시우레아); 항종양 항생제(예를 들어, 안트라시클린, 예컨대, 아드리아마이신, 블레오마이신, 독소루비신, 다우노마이신, 에피루비신, 이다루비신, 마이토마이신 C, 닥티노마이신 및 미트라마이신); 항유사분열제(예를 들어, 빈카 알카로이드, 예컨대, 빈크리스틴, 빈블라시틴, 빈데신 및 비노렐빈, 및 탁소이드, 예컨대, 탁솔 및 탁소텔, 및 폴로키나아제 억제제); 및 토포이소머라제 억제제(예를 들어, 에피포도필로톡신, 예컨대, 에토포시드 및 테니포시드, 암사크린, 토포테칸 및 캄토테신);

(ii) 항호르몬제, 예컨대, 항에스트로겐제(예를 들어, 타목시펜, 풀베스트란트, 토레미펜, 랄록시펜, 드롤록시펜, 및 요오독시펜), 프로게스토겐제(예를 들어, 메게스트롤 아세테이트), 아로마타제 억제제(예를 들어, 아나스트로졸, 레트로졸, 보라졸 및 엑세메스탄);

(iii) 성장 인자 기능 및 그의 하류 신호전달 경로의 억제제: 임의의 성장 인자 또는 성장 인자 수용체 표적의 Ab 조절제가 포함되고(문헌 [Stern et al. Critical Reviews in Oncology/ Haematology, 2005, 54, pp11-29]에 의해 리뷰); 또한 상기 표적의 소분자 억제제, 예를 들어, 키나제 억제제도 포함된다-예로는 항erbB2 항체 트라스투주맙[허셉틴(Herceptin)™], 항EGFR 항체 파니투무맙, 항EGFR 항체 세툭시맙[얼비툭스(Erbitux), C225] 및 erbB 수용체 패밀리의 억제제를 비롯한 티로신 키나제 억제제, 예컨대, 표피 성장 인자 패밀리 수용체(EGFR/erbB1) 티로신 키나제 억제제, 예컨대, 제피티닙 또는 엘로티닙, erbB2 티로신 키나제 억제제, 예컨대, 라파티닙, 및 혼합형 erb1/2 억제제, 예컨대, 아파타닙이 포함된다; 다른 부류의 성장 인자 및 그의 수용체, 예를 들어, C-met 및 론(ron)을 비롯한, 간세포 성장 인자 패밀리 또는 그의 수용체의 억제제에 대하여 유사한 전략법이 이용가능하다; 인슐린 및 인슐린 성장 인자 패밀리 또는 그의 수용체(IGFR, IR)의 억제제, 혈소판 유래 성장 인자 패밀리 또는 그의 수용체(PDGFR)의 억제제, 및 다른 수용체 티로신 키나제, 예를 들어, c-kit, AnLK, 및 CSF-1R에 의해 매개된 신호전달의 억제제가 포함된다;

또한 PI3-키나제 신호전달 경로에서 신호전달 단백질을 표적화하는 조절제, 예를 들어, PI3-키나제 이소폼, 예컨대, PI3K-α/β/γ 및 ser/thr 키나제, 예컨대, AKT, mTOR(예컨대, AZD2014), PDK, SGK, PI4K 또는 PIP5K의 억제제가 포함된다; 상기에 열거되지 않은 세린/트레오닌 키나제 억제제, 예를 들어, raf 억제제, 예컨대, 베무라페닙, MEK 억제제, 예컨대, 셀루메티닙(AZD6244), Abl 억제제, 예컨대, 이마티닙 또는 닐로티닙, Btk 억제제, 예컨대, 이브루티닙, Syk 억제제, 예컨대, 포스타마티닙, 오로라 키아제 억제제(예를 들어, AZD1152), 다른 ser/thr 키나제, 예컨대, JAK, STAT 및 IRAK4의 억제제, 및 사이클린 의존성 키나제 억제제, 예컨대, 팔보시클립 또한 포함된다; iv) DNA 손상 신호전달 경로의 조절제, 예를 들어, PARP 억제제(예컨대, 올라파립), ATR 억제제 또는 ATM 억제제; v) 아포프토시스 및 세포 사멸 경로의 조절제, 예컨대, Bcl 패밀리 조절제(예컨대, ABT-263/나비토클락스(Navitoclax)(ABT-199));

(vi) 항혈관신생제, 예컨대, 혈관 내피 성장 인자의 효과를 억제하는 것[예를 들어, 항혈관 내피 세포 성장 인자 항체 베바시주맙(아바스틴(Avastin)™) 및 예를 들어, VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제, 예컨대, 소라페닙, 악시티닙, 파조 파닙, 수니티닙 및 반데타닙(및 다른 기전에 의해 작용하는 화합물(예를 들어, 리노미드, 인테그린 αvβ3 기능의 억제제 및 안지오스타틴)];

(vii) 혈관 손상제, 예컨대, 콤브레타스타틴 A4;

(viii) 항침습제, 예를 들어, c-Src 키나제 패밀리 억제제, 예컨대, 다사티닙(문헌 [J. Med . Chem ., 2004, 47, 6658-6661])및 보수티닙(SKI-606), 및 메탈로프로테아제 억제제, 예컨대, 마리마스타트, 유로키나제 플라스미노겐 활성인자 수용체 기능의 억제제 또는 헤파라나제에 대한 항체];

(ix) 면역요법 접근법, 예를 들어, 환자 종양 세포의 면역원성을 증가시키는 생체외 및 생체내 접근법을 포함하며, 예컨대, 인터류킨 2, 인터류킨 4 또는 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자와 같은 사이토카인으로의 형질감염, T 세포 아네르기를 감소시키는 접근법, 형질감염된 면역 세포, 예컨대, 사이토카인 형질감염된 수지상 세포를 이용한 접근법 및 사이토카인 형질감염된 종양 세포주를 이용하는 접근법, 및 항이디오타입 항체를 이용하는 접근법. 구체적인 예로는 PD-1을 표적화하는 단일클론 항체(예컨대, BMS -936558) 또는 CTLA4(예컨대, 이필리무맙 및 트레멜리무맙)을 포함한다;

(x) 안티센스 또는 RNAi 기반 요법, 예를 들어, 열거된 표적에 대한 대한 것.

(xi) 유전자 요법 접근법, 예를 들어, 비정상적인 유전자, 예컨대, 비정상적인 p53 또는 비정상적인 BRCA1 또는 BRCA2, GDEPT(유전자 지정된 효소 프로드럭 요법: gene-directed enzyme pro-drug therapy)를 대체하는 접근법, 시토신 데아미나제, 티미딘 키나제 또는 박테리아 니트로리덕타제 효소를 이용하는 것과 같은 접근법, 및 화학요법 또는 방사선요법에 대한 환자 관용을 증가시키는 요법, 예컨대, 다중 약물 내성 유전자 요법을 포함한다.

본 발명의 상기 측면에 따라, 본원에 정의한 바와 같은 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 및 또 다른 항종양제, 특히 상기 (i) - (xi) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제 중 어느 하나를 포함하는, 암 치료에 사용하는 데 적합한 조합물을 제공된다. 특히, 상기 (i) - (xi) 하에 열거된 항종양제는 치료하고자 하는 특정 암을 위한 표준 치료이다; 당업자는 "표준 치료"의 의미를 이해할 것이다. 한 측면에서, 본 발명의 화합물은 실시예 1, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다.

그러므로, 본 발명의 추가의 측면에서, 또 다른 항종양제, 특히 본원 상기 (i) - (xi) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합되는 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 또 다른 항종양제, 특히 본원 상기 (i) - (xi) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합되는 실시예 1 [(E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산] 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 또 다른 항종양제, 특히 상기 (i) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합되는 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 본원 상기에 정의된 바와 같은 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 및 상기 (i) 하에 열거된 항종양제 중 어느 하나를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 상기 (i) 하에 열거된 항종양제 중 어느 하나와 함께 조합되는 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 본원 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 및 탁소이드, 예컨대, 탁솔 또는 탁소텔, 편리하게는 탁소텔을 포함하는, 암 치료에 사용하는 데 적합한 조합물을 제공한다. 예를 들어, 탁소이드, 예컨대, 탁솔 또는 탁소텔, 편리하게는 탁소텔과 함께 조합되는 데 적합한 본 발명의 화합물은 실시예 1, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다.

본 발명의 추가의 측면에서, 또 다른 항종양제, 특히 본원 상기 (ii) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합되는 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 본원 상기에서 정의된 바와 같은 본 발명의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 및 상기 (ii) 하에 열거된 항호르몬제 중 어느 하나, 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 항에스트로겐제 중 어느 하나, 또는 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 아로마타제 억제제를 포함하는, 암 치료에 사용하는 데 적합한 조합물을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 및 상기 (ii) 하에 열거된 항호르몬제 중 어느 하나, 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 항에스트로겐제 중 어느 하나, 또는 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 아로마타제 억제제를 포함하는, 암 치료에 사용하는 데 적합한 조합물을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 mTOR 억제제, 예컨대, 하기 AZD2014(예를 들어, WO2008/023161 참조)를 포함하는, 암 치료에 사용하는 데 적합한 조합물을 제공한다:

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본 발명의 추가의 측면에서, 실시예 1, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 PI3Kα 억제제, 예컨대, 본 발명자들의 공동 계류 중에 있는 PCT 출원 PCT/GB2014/050163의 해당 PI3K α/δ 억제제를 포함하는, 암 치료에 사용하는 데 적합한 조합물을 제공한다. 적합한 PI3K α/δ 억제제의 일례는 화합물 1-(4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1-에틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-일)-3-하이드록시프로판-1-온인, PCT/GB2014/050163으로부터의 실시예 3, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염이다. PCT/GB2014/050163의 실시예 3을 제조하는 방법은 본원 참조 실시예 1에 기재되어 있다.

본 발명의 추가의 측면에서, 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 팔보시클립을 포함하는, 암 치료에 사용하는 데 적합한 조합물을 제공한다.

한 측면에서, 상기 (ii)에 열거된 항종양제, 또는 mTOR 억제제(예컨대, AZD2014), 또는 PI3K-α 억제제(예컨대, 본 발명자들의 공동 계류 중에 있는 PCT 출원 PCT/GB2014/050163의 해당 PI3K α/δ 억제제, 특히, 상기 문헌 중의 실시예 3) 또는 팔보시클립과 함께 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 특히, 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 상기 조합물이 유방암 또는 부인과 암, 예컨대, 유방암, 자궁내막암, 난소암, 또는 자궁경부암, 특히, 유방암, 예컨대, ER+ve 유방암 치료에 사용하는 데 적합하다.

본원에서, "조합"이라는 용어가 사용되는 경우, 이는 동시, 개별 또는 순차적 투여를 의미하는 것으로 이해하여야 한다. 본 발명의 한 측면에서, "조합"은 동시 투여를 의미한다. 본 발명의 또 다른 측면에서, "조합"은 개별 투여를 의미한다. 본 발명의 추가의 측면에서, "조합"은 순차적 투여를 의미한다. 순차적 또는 개별 투여의 경우, 제2 성분을 투여하는 데 있어서 지연은 예컨대, 조합의 유익한 효과를 잃지 않는 정도가 되어야 한다. 2개 이상의 성분으로 이루어진 조합물이 개별적으로 또는 순차적으로 투여되는 경우, 각 성분에 대한 투여 요법은 다른 성분과 다를 수 있고, 그와는 독립적일 수 있다는 것을 이해할 것이다. 편의상, 본 발명의 화합물은 1일 1회 투약된다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 본원 상기 (i) - (xi) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합하여 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 본원 상기 (i) - (xi) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합하여 실시예 1 [(E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산] 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 상기 (ii) 하에 열거된 항호르몬제 중 어느 하나, 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 항에스트로겐제 중 어느 하나, 또는 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 아로마타제 억제제와 함께 조합하여 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 상기 (ii) 하에 열거된 항호르몬제 중 어느 하나, 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 항에스트로겐제 중 어느 하나, 또는 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 아로마타제 억제제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 mTOR 억제제, 예컨대, AZD2014(예를 들어, WO2008/023161 참조)를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 실시예 1, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 PI3Kα 억제제, 예컨대, 본 발명자들의 공동 계류 중에 있는 PCT 출원 PCT/GB2014/050163의 해당 PI3K α/δ 억제제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 적합한 PI3K α/δ 억제제의 일례는 본원 상기에서 기술된 바와 같이, PCT/GB2014/050163으로부터의 실시예 3이다.

본 발명의 추가의 측면에서, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 팔보시클립을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

한 측면에서, 상기 (ii)에 열거된 항종양제, 또는 mTOR 억제제(예컨대, AZD2014), 또는 PI3K-α 억제제(예컨대, 본 발명자들의 공동 계류 중에 있는 PCT 출원 PCT/GB2014/050163의 해당 PI3K α/δ 억제제, 특히, 상기 문헌 중의 실시예 3) 또는 팔보시클립과 함께 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 특히, 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염으로 이루어진 상기 약학 조성물이 유방암 또는 부인과 암, 예컨대, 유방암, 자궁내막암, 난소암, 또는 자궁경부암, 특히, 유방암, 예컨대, ER+ve 유방암 치료에 사용하는 데 적합하다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 암 치료에 사용하기 위한, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 본원 상기 (i) - (xi) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합하여 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 암 치료에 사용하기 위한, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 상기 (ii) 하에 열거된 항호르몬제 중 어느 하나, 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 항에스트로겐제 중 어느 하나, 또는 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 아로마타제 억제제와 함께 조합하여 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 암 치료에 사용하기 위한, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 본원 상기 (i) - (xi) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합하여 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 암 치료에 사용하기 위한, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 상기 (ii) 하에 열거된 항호르몬제 중 어느 하나, 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 항에스트로겐제 중 어느 하나, 또는 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 아로마타제 억제제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 암 치료에 사용하기 위한, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 mTOR 억제제, 예컨대, AZD2014(예를 들어, WO2008/023161 참조)를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 암 치료에 사용하기 위한, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 실시예 1, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 PI3Kα 억제제, 예컨대, 본 발명자들의 공동 계류 중에 있는 PCT 출원 PCT/GB2014/050163의 해당 PI3K α/δ 억제제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 적합한 PI3K α/δ 억제제의 일례는 본원 상기에서 기술된 바와 같이, PCT/GB2014/050163으로부터의 실시예 3이다.

본 발명의 추가의 측면에서, 암 치료에 사용하기 위한, 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체와 함께 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염 및 팔보시클립을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따라, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서의 암 치료용 의약 제조에서 본원 상기 (i) - (xi) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합된 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 또 다른 특징에 따라, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서의 암 치료용 의약 제조에서 본원 상기 (i) - (xi) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합된 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서의 암 치료용 의약 제조에서 상기 (ii) 하에 열거된 항호르몬제 중 어느 하나, 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 항에스트로겐제 중 어느 하나, 또는 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 아로마타제 억제제와 함께 조합된 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서의 암 치료용 의약 제조에서 상기 (ii) 하에 열거된 항호르몬제 중 어느 하나, 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 항에스트로겐제 중 어느 하나, 또는 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 아로마타제 억제제와 함께 조합된 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서의 암 치료용 의약 제조에서 mTOR 억제제, 예컨대, AZD2014(예를 들어, WO2008/023161 참조)와 함께 조합된 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서의 암 치료용 의약 제조에서 PI3Kα 억제제, 예컨대, 본 발명자들의 공동 계류 중에 있는 PCT 출원 PCT/GB2014/050163의 해당 PI3K α/δ 억제제와 함께 조합된 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다. 적합한 PI3K α/δ 억제제의 일례는 본원 상기에서 기술된 바와 같이, PCT/GB2014/050163으로부터의 실시예 3이다.

본 발명의 추가의 측면에서, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서의 암 치료용 의약 제조에서 팔보시클립과 함께 조합된 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다.

한 측면에서, 상기 (ii)에 열거된 항종양제, 또는 mTOR 억제제(예컨대, AZD2014), 또는 PI3K-α 억제제(예컨대, 본 발명자들의 공동 계류 중에 있는 PCT 출원 PCT/GB2014/050163의 해당 PI3K α/δ 억제제, 특히, 상기 문헌 중의 실시예 3) 또는 팔보시클립과 함께 조합된 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 특히, 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 상기 용도는 유방암 또는 부인과 암, 예컨대, 유방암, 자궁내막암, 난소암, 또는 자궁경부암, 특히, 유방암, 예컨대, ER+ve 유방암 치료용 의약 제조에 사용하는 데 적합하다.

그러므로, 본 발명의 추가의 특징에서, 암 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에게 본원 상기 (i) - (xi) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합하여 유효량의 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 암 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에게 본원 상기 (i) - (xi) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합하여 유효량의 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 암 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에게 상기 (ii) 하에 열거된 항호르몬제 중 어느 하나, 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 항에스트로겐제 중 어느 하나, 또는 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 아로마타제 억제제와 함께 조합하여 유효량의 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 유효량의 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 암 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에게 상기 (ii) 하에 열거된 항호르몬제 중 어느 하나, 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 항에스트로겐제 중 어느 하나, 또는 예를 들어, 상기 (ii)에 열거된 아로마타제 억제제와 함께 조합하여 유효량의 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 유효량의 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 암 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에게 mTOR 억제제, 예컨대, AZD2014(예를 들어, WO2008/023161 참조)와 함께 조합하여 유효량의 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 암 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에게 PI3Kα 억제제, 예컨대, 본 발명자들의 공동 계류 중에 있는 PCT 출원 PCT/GB2014/050163의 해당 PI3K α/δ 억제제와 함께 조합하여 유효량의 실시예 1, 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 암을 치료하는 방법을 제공한다. 적합한 PI3K α/δ 억제제의 일례는 본원 상기에서 기술된 바와 같이, PCT/GB2014/050163으로부터의 실시예 3이다.

본 발명의 추가의 측면에서, 암 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에게 팔보시클립과 함께 조합하여 유효량의 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 암 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 암을 치료하는 방법을 제공한다.

한 측면에서, 상기 암 치료 방법은 유방암 또는 부인과 암, 예컨대, 유방암, 자궁내막암, 난소암, 또는 자궁경부암, 특히, 유방암, 예컨대, ER+ve 유방암 치료 방법이다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 본원 상기 (i) - (xi) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합하여 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 본원 상기 (i) 또는 (ii) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합하여 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라,

a) 제1 단위 투여 형태의 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염;

b) 제2 단위 투여 형태의 본원 상기 (i) - (xi) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제; 및

c) 상기 제1 및 제2 투여 형태를 함유하기 위한 용기 수단을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라,

b) 제2 단위 투여 형태의 본원 상기 (i) - (ii) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제; 및

본 발명의 추가의 측면에 따라, 본원 상기 (i) - (xi) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합하여 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라, 본원 상기 (i) 또는 (ii) 하에 열거된 것으로부터 선택되는 항종양제와 함께 조합하여 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에 따라,

a) 제1 단위 투여 형태의 실시예 1 또는 그의 약학적으로 허용되는 염;

본 발명의 추가의 측면에 따라,

b) 제2 단위 투여 형태의 AZD2014, PI3Kα 억제제(예컨대, 본 발명자들의 공동 계류 중에 있는 PCT 출원 PCT/GB2014/050163의 해당 PI3K α/δ 억제제) 및 팔보시클립으로부터 선택되는 항종양제; 및

상기의 모든 방법, 용도 및 다른 측면에서, 실시예 1의 화합물이 사용되는 경우, 이는 적합하게는 결정질 B형으로서 사용된다.

전형적으로 그의 일반적으로 처방 스케줄에 따라 수행되는 표준 치료 요법 이외에도 상기 기술된 바와 같은 조합 요법이 부가될 수 있다.

비록 화학식(I)의 화합물이 주로 온혈 동물(인간 포함)에서 사용하기 위한 치료제로서 가치가 있기는 하지만, 이는 또한 ERα 억제가 필요할 때에는 언제든 유용하다. 따라서, 이는 새로운 생물학적 테스트 개발에서, 및 새로운 약리학적 작용제 검색에서 사용하기 위한 약리학적 표준으로서 유용하다.

개인 맞춤형 건강 관리

본 발명의 또 다른 측면은 ERα를 코딩하는 유전자의 상태와 화학식(I)의 화합물을 이용한 치료법에 대한 잠재적인 감수성 사이의 관계를 확인하는 것에 기초한다. 특히, 부분적으로 일부 ERα 돌연변이가 현존 치료법에 대한 저항 기전으로서 유발될 수 있다고 간주되는 바, ERα 유전자 상태는 환자가 현존 호르몬 요법(예컨대, 아로마타제 억제제)에 대해 반응할 가능성이 적다는 것을 시사할 수 있다. 이어서, SERD, 특히, 과도한 불편 없이 잠재적으로는 더 많은 용량으로 경구적으로 투여될 수 있는 SERD는 이롭게는 다른 요법에 대하여 저항성을 띨 수 있는, ERα 돌연변이를 가지는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 그러므로, 이는 화학식(I)의 화합물을 이용하는 치료법에 대한 환자를, 특히, 암 환자를 선별할 수 있는 기회, 방법, 및 도구를 제공한다. 본 발명은 환자 선별 도구 및 방법(개인 맞춤형 의약 포함)에 관한 것이다. 선별은 치료하고자 하는 종양 세포가 야생형 또는 돌연변이체 ERα 유전자를 가지는지 여부에 기초한다. 그러므로, ERα 유전자 상태는 SERD를 이용하는 선별 치료법이 이로울 수 있는지 여부를 시사하는 바이오마커로서 사용될 수 있다. 의심을 피하기 위해, 본원에 기술된 바와 같은 화학식(I)의 화합물은 야생형 및 돌연변이체 ERα 유전자, 적어도 본 출원의 출원일 당시 확인된 ERα 유전자 중의 돌연변이에 대하여 유사하게 활성을 띠는 것으로 간주된다.

그의 종양이 SERD, 예컨대, 화학식(I)의 화합물을 이용하는 치료법에 대하여 반응하게 되는 환자를 강화시키거나, 또는 그를 선별하는 바이오마커가 명백하게 요구되고 있다. 또 다른 작용제에 비하여 한 작용제에 대해 반응할 가능성이 가장 큰 환자를 확인하는 환자 선별 바이오마커는 상기 작용제의 잠재적인 부작용에 대해 종양은 반응하지 않으면서, 환자의 불필요한 치료를 감소시키는 바, 암 치료에 있어 이상적이다.

바이오마커는 "일반 생물학적 프로세스, 발병 과정, 또는 치료학적 개입에 대한 약리학적 반응의 지표로서 객관적으로 측정되고, 평가되는 특징"인 것으로 기술될 수 있다. 바이오마커는, 바이오마커의 존재 여부 또는 그의 수준과, 병증 또는 질환의 특정 측면(병증 또는 질환의 존재, 그의 수준 또는 수준 변화, 그의 유형, 그의 단계, 그에 대한 감수성, 또는 그를 치료하는 데 사용되는 약물에 대한 반응성) 사이에 상관관계가 존재하는 특정 병증 또는 질환과 관련된 임의의 확인가능하고, 측정가능한 지표이다. 상관관계는 정질적, 정량적, 또는 저질 및 정량, 둘 모두일 수 있다. 전형적으로, 바이오마커는 화합물, 화합물 단편 또는 화합물 군이다. 상기 화합물은 단백질(및 펩티드), 핵산 및 다른 화합물을 비롯한, 유기체에서 발견되거나, 그에 의해 제조되는 임의의 화합물일 수 있다.

바이오마커는 예측력을 가질 수 있으며, 따라서, 특정 병증 또는 질환의 존재, 수준, 유형 또는 단계(특정 미생물 또는 독소의 존재 또는 수준 포함), 특정 병증 또는 질환에 대한 감수성(유전적 감수성 포함), 또는 특정 치료법(약물 치료법 포함)에 대한 반응을 예측 또는 검출하는 데 사용될 수 있다. 바이오마커는 연구 및 개발 프로그램의 효율을 개선시킴으로써 미래의 약물 발견 및 개발에서 점증적으로 중요한 역할을 할 것으로 간주된다. 바이오마커는 진단제, 질환 진행의 모니터, 치료 모니터, 및 임상 결과의 예측 인자로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 특정 암의, 및 특정 심혈관 질환 및 면역학적 질환의 마커를 확인하기 위하여 각종 바이오마커 연구 과제가 시도되고 있다. 검증된 새로운 바이오마커의 개발을 통해 건강 관리 및 약물 개발 비용을 현저히 감소시킬 수 있고, 매우 다양한 질환 및 병증에 대한 치료법을 현저히 개선시킬 수 있을 것으로 여겨진다.

임상 시험을 최적으로 디자인하고, 상기 시험으로부터 가장 많은 정보를 획득하기 위해, 바이오마커가 요구될 수 있다. 마커는 대용물 및 종양 조직에서 측정가능할 수 있다. 이상적으로, 상기 마커는 또한 효능과 상관관계가 있을 수 있으며, 따라서, 궁극적으로는 환자 선별에 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명의 상기와 같은 측면의 기초를 이루는 기술상의 문제는 화학식(I)의 화합물을 이용하는 치료법에 대하여 환자를 계층화하기 위한 수단 확인이다. 기술상의 문제는 본원 청구범위 및/또는 명세서에 특징화된 실시양태를 제공함으로써 해소된다.

야생형 ERα를 함유하는 종양은 예를 들어, 제1선의 치료법으로서 화학식(I)의 화합물을 사용하는 치료법에 대하여 감수성인 것으로 여겨진다. 종양은 또한 제2선, 제3선 또는 후속 요법으로서 화학식(I)의 화합물을 사용하는 치료법에 대해 반응할 수 있고, 이는 특히 종양이 돌연변이체 ERα를 함유하고, 따라서, 현존 요법, 예컨대, AI에 대해 저항성을 띨 수 있는 경우에 유용할 수 있다. 저항성인 환경하에서는 야생형 종양에서보다도 더 높은 투여량의 화학식(I)의 화합물이 필요할 수 있다.

본 발명은 화학식(I)의 화합물에 대한 세포의 감수성을 측정하는 방법을 제공한다. 본 방법은 상기 세포에서 ERα 유전자의 상태를 측정하는 단계를 포함한다. 화학식(I)의 화합물이 (세포 증식의 억제를 통해 및/또는 세포 사멸 증가를 통해) 세포 성장 검정법에서 세포 개수 증가를 억제시킨다면, 세포는 화학식(I)의 화합물에 대하여 감수성인 것으로 정의된다. 본 발명의 방법은 성장 억제에 의해 어느 세포가 화학식(I)의 화합물에 대하여 반응할 가능성이 더욱 큰지 예측하는 데 유용하다.

"종양을 나타내는" 샘플은 단리된 실제 종양 샘플일 수 있거나, 또는 추가로 프로세싱된 샘플, 예컨대, 종양 샘플로부터 PCR 증폭된 핵산의 샘플일 수 있다.

정의:

상기 개인 맞춤형 건강 관리 섹션에서:

"대립 유전자"란, 그의 특정 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 의해 다른 형태와 구별되는, 유전적 유전자좌의 특정 형태를 의미한다.

"증폭 반응"은 비표적 핵산에 비하여 표적 핵산의 특이적인 증폭을 일으키는 핵산 반응이다. 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction)이 주지된 증폭 반응이다.

본원에서 사용되는 바, "암"이란 세포 형질전환으로부터 신생물성 표현형을 유발하는 신생물성 성장을 의미한다. 상기와 같은 세포 형질전환은 대개 유전적 돌연변이를 포함한다.

"유전자"는 프로모터, 에손, 인트론, 및 발현을 제어하는 (유전자의 전사되는 부위내가 아닌) 5' 또는 3' 측면 영역 내에 위치할 수 있는 다른 서열 요소를 포함하는, RNA 생성물의 조절된 생합성을 위한 모든 정보를 포함하는 DNA 세그먼트이다.

"유전자 상태"는 유전자가 야생형인지 아닌지(즉, 돌연변이체인지) 여부를 의미한다.

"표지"란 검정 샘플 중 표적 폴리뉴클레오티드의 존재를 나타내는 검출가능한 신호를 발생시킬 수 있는 조성물을 의미한다. 적합한 표지로는 방사성 동위원소, 뉴클레오티드 발색산, 효소, 기질, 형광성 분자, 화학 발광성 모이어티, 자기 입자, 생체 발광성 모이어티 등을 포함한다. 따라서, 표지는 분광, 광화학, 생화학, 면역화학, 전기, 광학, 또는 화학적 수단에 의해 검출가능한 임의의 조성물이다.

"비동의적 변이"란 상이한 (변경된) 폴리펩티드 서열을 생산하는 유전자의 코딩 서열 중의, 또는 그와 중첩되는 변이(variation)(변이(variance))를 의미한다. 이러한 변이는 단백질의 기능에 영향을 줄 수 있거나, 또는 그렇지 않을 수 있고, (또 다른 것 대신 한 아미노산을 치환하는) 미스센스 변이체, (미성숙 종결 코돈의 생성에 기인하여 절두된 폴리펩티드를 생성하는) 넌센스 변이체, 및 삽입/결실 변이체를 포함한다.

"동의적 변이"란 코딩된 폴리펩티드의 서열에 영향을 주지 않는 유전자의 코딩 서열 중의 변이(변이)를 의미한다. 상기 변이는 (예를 들어, 유전자의 발현을 변경시킴으로써) 간접적으로 단백질 기능에 영향을 줄 수는 있지만, 반대되는 증거가 없다면, 일반적으로는 무해한 것으로 간주된다.

"핵산"은 단일 가닥 또는 이중 가닥 DNA 및 RNA 분자를 의미하고, 이는 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 자연에서 발견되는 천연 핵산 및/또는 변형된 골격 또는 염기를 가지는 변형된, 인공 핵산을 포함한다.

"프라이머"란 카피시키고자 하는 핵산 가닥에 상보적인 프라이머 연장 생성물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있는 단일 가닥 DNA 올리고뉴클레오티드 서열을 의미한다. 프라이머의 길이 및 서열은 연장 생성물의 합성을 프라이밍할 수 있는 길이 및 서열이어야 한다. 전형적인 프라이머는 표적 서열에 실질적으로 상보적인 서열로서, 그 길이는 약 7개 이상의 뉴클레오티드인 길이이지만, 약간 더 긴 장쇄의 프라이머가 바람직하다. 일반적으로, 프라이머는 약 15-26개의 뉴클레오티드를 함유하지만, 그보다 더 길거나, 더 짧은 프라이머 또한 사용될 수 있다.

"다형체 부위"는 집단 중 2개 이상의 대체 서열에서 발견되는 유전자좌 내의 위치이다.

"다형성"이란 개체에서 다형체 부위에서 관찰되는 서열 변이를 의미한다. 다형성은 뉴클레오티드 치환, 삽입, 결실 및 초위성체를 포함하고, 유전자 발현 또는 단백질 기능에 있어 검출가능한 차이를 가져올 수 있지만, 반드시 그러한 것은 아니다. 발현 또는 단백질 기능에 대해 미치는 효과에 관한 증거가 없는 경우, 비동의적 변이체를 비롯한 일반 다형성은 일반적으로 야생형 유전자 서열의 정의에 포함되는 것으로 간주된다. 인간 다형성, 및 입증, 관찰된 빈도, 및 질환 관계를 비롯한, 관련 주해에 관한 카탈로그는 NCBI (dbSNP: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)에 의해 보존되고 있다. 유전자 서열과 관련하여 사용될 때 "다형성"이라는 용어는, 화합물의 결정질 또는 비정질 성질인, 화합물의 고체 상태 형태와 관련하여 사용될 때의 "다형성"이라는 용어와 혼동하지 않도록 주의하여야 한다. 당업자는 그 맥락에 의해 의도하는 의미를 이해할 것이다.

"프로브"는 검출하고자 하는 대립 유전자의 표적 서열에 정확하게 상보적인 서열을 가지는 단일 가닥 서열 특이 올리고뉴클레오티드를 의미한다.

"반응"이란 환자를, 부분적인 반응 또는 안정적인 질환을 보이는 군, 및 진행성 질환의 징후를 보이는 군인, 2개의 주요 군으로 분류하는 것을 포함하는 고형 종양에서의 반응 평가 기준(RECIST: Response Evaluation Criteria in Solid Tumours)에 따라 측정되는 척도로 정의된다.

"엄격한 하이브리드화 조건"이란 50% 포름아미드, 5x SSC (750 mM NaCl, 75 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨(pH 7.6), 5x 덴하르트(Denhardt's) 용액, 10% 덱스트란 술페이트, 및 20 pg/ml 변성된, 전단 연어 정자 DNA를 포함하는 용액 중에서 42℃에서 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 약 65℃에서 필터를 0.1 x SSC 중에서 세척하는 것을 의미한다.

"생존"은 환자의 전체 생존 및 무진행 생존을 포함한다.

"전체 생존 기간"(OS: Overall survival)이란 약물 투여 개시 시점부터 임의 원인에 의한 사망 시점까지의 기간으로서 정의된다. "무진행 생존 기간"(PFS: Progression-free survival)이란 약물 투여 개시 시점부터 질행성 질환의 최소 발현 시점 또는 임의 원인에 의한 사망 시점까지의 기간으로서 정의된다.

본 발명의 한 측면에 따라, 환자로부터 종양 세포를 함유하는 샘플을 제공하는 단계; 환자의 종양 세포를 함유하는 샘플 중 ERα 유전자가 야생형인지 또는 돌연변이체인지 여부를 측정하는 단계; 및 그에 기초하여 화학식(I)의 화합물을 이용하는 치료법에 대하여 환자를 선별하는 단계를 포함하는, 화학식(I)의 화합물을 이용하는 치료법에 대하여 환자를 선별하는 방법을 제공한다.

본 방법은 실제 환자 샘플 단리 단계를 포함하거나, 또는 배제시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 한 측면에 따라, 앞서 환자로부터 단리된 종양 세포를 함유하는 샘플 중 ERα 유전자가 야생형인지 또는 돌연변이체인지 여부를 측정하는 단계; 및 그에 기초하여 화학식(I)의 화합물을 이용하는 치료법에 대하여 환자를 선별하는 단계를 포함하는, 화학식(I)의 화합물을 이용하는 치료법에 대하여 환자를 선별하는 방법을 제공한다.

한 실시양태에서, 종양 세포 DNA가 돌연변이체 ERα 유전자를 가지고 있다면, 환자를 화학식(I)의 화합물을 이용하는 치료법에 대한 것으로 선택한다. 다른 실시양태에서, 그의 종양 세포 DNA가 야생형 ERα 유전자를 가지는 환자를 화학식(I)의 화합물을 이용하는 치료법에 대한 것으로 선택한다.

본 발명의 목적을 위해, 야생형의 유전자 상태는 유전자의 정상적인 또는 적절한 발현 및 코딩된 단백질의 정상적인 기능을 나타내는 것을 의미한다. 반대로, 돌연변이체 상태는 (본원에 기술된 바와 같이) 암에서의 돌연변이체 ERα 유전자의 공지된 역할과 일치하는, 기능이 변경된 단백질 발현을 나타내는 것을 의미한다. 돌연변이, 증폭, 결실, 게놈 재배열, 또는 메틸화 프로파일 변화를 포함하나, 이에 한정되지 않는, 임의 개수의 유전적 또는 후생학적 변경의 결과로서 돌연변이체 상태가 일어날 수 있다. 그러나, 그럼에도 불구하고 상기와 같은 변경이 정상적인 단백질, 또는 기능상 등가인 변이체를 적절한 발현시킨다면, 이때 유전자 상태는 야생형인 것으로 간주된다. 전형적으로 기능적 돌연변이체 유전자 상태를 초래하지 않는 변이체의 예로는 동의적 코딩 변이체 및 일반 다형성(동의적 또는 비동의적)을 포함한다. 하기 논의되는 바와 같이, 유전자 상태는 기능적 검정법에 의해 평가될 수 있거나, 또는 검출된 참조 서열로부터의 편차의 성질로부터 추론될 수 있다.

특정 실시양태에서, ERα 유전자의 야생형 또는 돌연변이체 상태는 유전자 중 비동의적 핵산 변이의 존재 또는 부재에 의해 측정된다. 주해가 달린 기능적 효과가 없는 공지된 일반 다형성에 상응하는 관찰된 비동의적 변이는 돌연변이체의 유전자 상태에 기여하지 않는다.

돌연변이체 상태를 나타내는 ERα 유전자 중의 다른 변이로는 프리mRNA에서 mRNA로 프로세싱되는 동안 인트론/엑손 접합부의 인식을 감소시키는 스플라이스 부위 변이를 포함한다. 그 결과 엑손 스키핑이 일어날 수 있거나, 또는 스플라이싱된 mRNA에 일반 인트로 서열이 포함될 수 있다(인트론 잔류 또는 잠재 스플라이스 접합부 이용). 결과적으로는 정상 단백질과 비교하여 삽입 및/또는 결실을 포함하는 비정상적인 단백질이 제조될 수 있다. 따라서, 다른 실시양태에서, 인트론/엑손 접합부에서 스플라이스 부위 인식 서열을 변경시키는 변이체가 존재한다면, 유전자는 돌연변이체 상태를 가지는 것이다.

ESR1의 경우, 참조 서열은 유전자(진뱅크(GenBank) 수탁 번호: NG_008493), mRNA(진뱅크 수탁 번호: NM_000125), 및 단백질(진뱅크 수탁 번호: NP_000116 또는 스위스-프로트(Swiss-Prot) 수탁: P03372)에 대하여 이용가능하다. 당업자는 야생형과의 DNA 또는 단백질 서열 비교에 기초하여 ESR1 유전자 상태를, 즉, 특정 ESR1 유전자가 야생형인지 또는 돌연변이체인지 여부를 측정할 수 있을 것이다.

ERα 유전자에 대해 개시된 유전자 및 mRNA 서열은 대표적인 서열이라는 것은 자명할 것이다. 정상적인 개체에서는 약간 서열 차이가 있을 수 있는, 모계 카피 및 부계 카피인, 각 유전자에 대해 2개의 카피가 존재하며, 더욱이 집단 내에서도 유전자 서열의 대립 유전자 변이체가 다수 존재할 것이다. 야생형인 것으로 간주되는 다른 서열은 핵산 서열에 대하여 하나 이상의 동의적 변이를 가지는 것(상기 변이는 코딩되는 단백질 서열을 변경시키지 않는다), 단백질 서열은 변경시키지만, 단백질 기능에는 영향을 미치지 않는 비동의적 일반 다형성(예컨대, 생식 계열 다형성), 및 인트론성 비스플라이스 부위 서열 변이를 포함한다.

ERα의 유전자 상태를 측정하는 다수의 기법이 당업자에게 이용가능하다. 유전자 상태는 핵산 서열을 측정함으로써 측정될 수 있다. 이는 전장의 유전자의 직접적인 서열분석을 통해, 또는 유전자 내의 특정 부위, 예컨대, 일반적으로 돌연변이화된 부위의 분석을 통해 이루어질 수 있다.

샘플

유전자 상태에 대하여 테스트하고자 하는 환자의 샘플은 개체로부터 수득된 또는 수득될 수 있는 임의의 종양 조직 또는 종양 세포 함유 샘플일 수 있다. 테스트 샘플은 편리하게는 혈액, 구강 도말, 생검, 또는 개체로부터 수득된 다른 체액 또는 조직 샘플이다. 특정 예로는 순환성 종양 세포, 혈장 또는 혈청 중 순환성 DNA, 난소암 환자의 복수 체액으로부터 단리된 세포, 폐내에 종양이 있는 환자의 경우, 폐 객담, 유방암 환자로부터의 미세 바늘 흡입물, 뇨, 말초 혈액, 세포 스크랩핑, 모낭, 스킨 펀치, 또는 볼 샘플을 포함한다.

테스트 샘플은 동일하게 테스트 샘플 중 서열에 상응하는 핵산 서열일 수 있고, 즉, 다시 말해, 분석하기 전에 샘플 핵산 중 영역 모두 또는 그의 일부를 먼저 임의의 편리한 기법, 예컨대, 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 증폭시킬 수 있다는 것을 이해할 것이다. 핵산은 게놈 DNA 또는 분획화된 또는 전체 세포 RNA일 수 있다. 특정 실시양태에서, RNA는 전체 세포 RNA이고, 이는 랜덤 프라이머 또는 폴리 A 프라이머를 사용하여 제1 가닥 cDNA를 표지화하기 위한 주형으로서 직접적으로 사용된다. 테스트 샘플 중 핵산 또는 단백질은 표준 방법에 따라 샘플로부터 추출될 수 있다(문헌 [Green & Sambrook, Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2012, 4th edition, Vol. 1-3, ISBN 9781936113422), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조).

본 발명의 진단 방법은 앞서 개체 또는 환자로부터 채취된 샘플을 사용하여 착수될 수 있다. 상기 샘플은 냉동에 의해 보존될 수 있거나, 또는 포르말린-파라핀 또는 다른 매질 중에 고정 및 포매될 수 있다. 별법으로, 신선한 종양 세포를 함유하는 샘플이 수득되고, 사용될 수 있다.

본 발명의 방법은 임의의 종양으로부터의 세포를 사용하여 적용될 수 있다. 화학식(I)의 화합물을 이용하는 치료법에 적합한 종양은 본원 상기에 기술되어 있다.

핵산 검출 방법

본 발명과 관련하여 약물 치료법을 선택하기 위해 돌연변이체 ERα 핵산의 검출을 사용할 수 있다. 상기 유전자 중의 돌연변이는 DNA 수준으로 존재하기 때문에, 본 발명의 방법은 게놈 DNA의 돌연변이 또는 변이 뿐만 아니라, 전사체 및 단백질 그 자체의 검출에 기초할 수 있다. 검출된 돌연변이가 실제로 피험체에서 발현되는지 확인하기 위해서는 전사체 및/또는 폴리펩티드를 분석함으로써 게놈 DNA 중 돌연변이를 확인하는 것이 바람직할 수 있다.

유전자 중 하나 이상의 위치에 변이체 뉴클레오티드의 존재 또는 부재를 검출하는 데 사용될 수 있는 분석 방법이 다수 존재한다는 것은 당업자에게는 자명할 것이다. 일반적으로, 대립 유전자 변이 검출은 돌연변이 식별 기법, 임의적으로 증폭 반응(예컨대, 중합효소 연쇄 반응에 기반한 것) 및 임의적으로 신호 발생 시스템을 필요로 한다. 당업계에서 이용가능한 돌연변이 검출 기법이 다수 존재하며, 이는 신호 발생 시스템과 함께 사용될 수 있으며, 상기 신호 발생 시스템 중 다수가 당업계에서 이용가능하다. 다수의 대립 유전자 변이 검출 방법이 문헌 [Nollau et al., Clin . Chem., 1997, 43, 1114-1120]; [Anderson SM. Expert Rev Mol Diagn., 2011, 11, 635-642]; [Meyerson M. et al., Nat Rev Genet., 2010, 11, 685-696]에 의해; 및 표준 교재, 예를 들어, ["Laboratory Protocols for Mutation Detection", Ed. by U. Landegren, Oxford University Press, 1996] and ["PCR", 2^nd Edition by Newton & Graham, BIOS Scientific Publishers Limited, 1997]에 리뷰되어 있다.

상기 언급된 바와 같이, 암 환자의 ERα 유전자 중 특정의 한 변이 또는 복수 개의 변이의 존재 또는 부재를 측정하는 것은 다양한 방법으로 수행될 수 있다. 상기 테스트는 일반적으로 생물학적 샘플, 예컨대, 조직 생검, 소변, 대변, 객담, 혈액, 세포, 조직 찰과 표본, 유방 흡인물 또는 다른 세포 물질로부터 수집된 DNA 또는 RNA를 사용하여 수행되며, PCR, 대립 유전자 특이 프로브와의 하이브리드화, 효소 돌연변이 검출, 미스매치의 화학적 절단, 질량 분석법 또는 미니서열분석을 비롯한, DNA 서열분석을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다.

적합한 돌연변이 검출 기법으로는 증폭 불응 돌연변이 시스템(ARMS(amplification refractory mutation system)™), 증폭 불응 돌연변이 시스템 선형 연장(ALEX(amplification refractory mutation system linear extension)™), 경쟁적 올리고뉴클레오티드 프라이밍 시스템(COPS: competitive oligonucleotide priming system), 택맨(Taqman), 분자 비콘(Molecular Beacons), 제한 단편 길이 다형성(RFLP: restriction fragment length polymorphism), 및 제한 부위 기반 PCR 및 형광 공명 에너지 전달(FRET) 기법을 포함한다.

특정 실시양태에서, 바이오마커 유전자 내의 뉴클레오티드(들)를 측정하는 데 사용되는 방법은 대립 유전자 특이 증폭(대립 유전자 특이 PCR) - 예컨대, 증폭 불응 돌연변이 시스템(ARMS), 서열분석, 대립 유전자 식별 검정법, 하이브리드화, 제한 단편 길이 다형성(RFLP) 또는 올리고뉴클레오티드 결찰 검정법(OLA: oligonucleotide ligation assay)으로부터 선택된다.

특정 실시양태에서, 대립 유전자 특이 프로브와의 하이브리드화는 (1) 예를 들어, 다수의 DNA 칩 적용에서와 같이, 용액 중 표지화된 샘플과 함께 고체 상(예컨대, 유리, 실리콘, 나일론 막)에 결합된 대립 유전자 특이 올리고뉴클레오티드; 또는 (2) 결합된 샘플(대개 클로닝된 DNA 또는 PCR 증폭된 DNA) 및 용액 중 표지화된 올리고뉴클레오티드(하이브리드화에 의한 서열 분석이 이루어질 수 있도록 대립 유전자 특이적이거나, 또는 단쇄)에 의해 수행될 수 있다. 진단 테스트는 대개 고체 지지체 상의 변이 패널을 포함할 수 있으며, 이를 통해 1 초과의 변이를 동시에 측정할 수 있다. 상기 하이브리드화 프로브는 당업계에 주지되어 있고(예컨대, 문헌 [Green & Sambrook, Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2012, 4th edition, Vol. 1-3, ISBN 9781936113422), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조), 이는 2개 이상의 변이 부위에 걸쳐 있을 수 있다.

따라서, 한 실시양태에서, 1 이상의 돌연변이의 존재 또는 부재의 검출은 추정 돌연변이 부위를 함유하는 ERα 핵산을 1 이상의 핵산 프로브와 접촉시키는 것을 제공한다. 프로브는 선택적 하이브리드화 조건 하에서 우선적으로, 변이 부위를 포함하고, 변이 부위에 상보적인 뉴클레오티드 염기를 함유하는 핵산 서열과 하이브리드화한다. 하이브리드화는 당업자에게 공지된 표지를 사용하여 검출가능한 표지로 검출될 수 있다. 상기 표지로는 방사성, 형광성, 염료, 및 효소 표지를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

또 다른 실시양태에서, 1 이상의 돌연변이의 존재 또는 부재의 검출은 추정 돌연변이 부위를 함유하는 ERα 핵산을 1 이상의 핵산 프라이머와 접촉시키는 것을 제공한다. 프라이머는 선택적 하이브리드화 조건 하에서 우선적으로, 변이 부위를 포함하고, 변이 부위에 상보적인 뉴클레오티드 염기를 함유하는 핵산 서열과 하이브리드화한다.

특이적인 증폭을 위한 프라이머로서 사용되는 올리고뉴클레오티드는 분자 중심에 관심의 대상이 되는 돌연변이로 상보적인 뉴클레오티드 염기를 운반할 수 있거나(이로써, 증폭은 차별적인 하이브리드화에 의존한다; 예컨대, 문헌 [Gibbs, et al., 1989. Nucl . Acids Res., 17, 2437-248] 참조), 또는 한 프라이머의 3' 말단 최단부에 상기와 같이 상보적인 뉴클레오티드 염기를 운반할 수 있으며, 이 경우, 적절한 조건 하에서 미스매치는 중합효소 연장을 막거나, 감소시킬 수 있다(예컨대, 문헌 [Prossner, 1993, Tibtech, 11 238]).

추가의 또 다른 실시양태에서, 1 이상의 돌연변이의 존재 또는 부재의 검출은 1 이상의 핵산 서열을 서열분석하고, 수득된 서열을 공지된 야생형 핵산 서열과 비교하는 것을 포함한다.

별법으로, 1 이상의 돌연변이의 존재 또는 부재는 1 이상의 핵산 서열의 질량 분석적 측정을 포함한다.

한 실시양태에서, 1 이상의 핵산 변이의 존재 또는 부재의 검출은 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하는 것을 포함한다. 가상 변이를 함유하는 표적 핵산 서열을 증폭시키고, 증폭된 핵산의 뉴클레오티드 서열을 측정한다. 증폭된 핵산의 뉴클레오티드 서열을 측정하는 것은 1 이상의 핵산 세그먼트를 서열분석하는 것을 포함한다. 별법으로, 자동 및 수동 겔 전기영동 등을 비롯한, 증폭 생성물을 그의 크기에 따라 분리할 수 있는 임의의 방법을 사용하여 증폭 생성물을 분석할 수 있다.

게놈 핵산 중 돌연변이는 이롭게는 증폭된 핵산 단편의 이동 시프트에 기반한 기법에 의해 검출된다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., Anal Biochem 1996, 239, 61-9]에는 경쟁적 이동 시프트 검정법에 의한 단일 염기 돌연변이 검출이 기술되어 있다. 또한, 문헌 [Marcelino et al., BioTechniques 1999, 26, 1134-1148]의 기법에 기반한 검정법이 상업적으로 이용가능하다.

특정 일례에서, 모세관 이종이중체 분석을 사용함으로써 미스매치의 존재의 결과로서 모세관 시스템 중 이중체 핵산의 이동 시프트에 기반하여 돌연변이의 존재를 검출할 수 있다.

샘플로부터 분석하기 위해 핵산을 생성하는 것은 일반적으로 핵산 증폭을 필요로 한다. 다수의 증폭 방법은 효소 연쇄 반응(예컨대, 중합효소 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응, 또는 자가 유지 서열 복제), 또는 벡터 모두 또는 그의 일부로 클로닝되는 그의 복제에 의존한다. 바람직하게, 본 발명에 따른 증폭은 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응에 의해 나타나는 바와 같은 지수적 증폭이다.

문헌 [Landegren, U., et al., Science, 1988 242, 229-237] 및 [Lewis, R., Genetic Engineering News 1990, 10, 54-55]에서의 상기 방법에 관한 일반적인 리뷰와 같이, 다수의 표적 및 신호 증폭 방법은 문헌에 기술되어 있다. 상기 증폭 방법은 본 발명자들의 발명의 방법에서 사용될 수 있으며, 이는 중합효소 연쇄 반응(PCR), 계내 PCR, 리가제 증폭 반응(LAR: ligase amplification reaction), 리가제 하이브리드화, Qβ 박테리오파지 레플리카제, 전사 기반 증폭 시스템(TAS: transcription-based amplification system), 전사체 서열분석을 동반한 게놈 증폭(GAWTS: genomic amplification with transcript sequencing), 핵산 서열 기반 증폭(NASBA: nucleic acid sequence-based amplification) 및 계내 하이브리드화를 포함한다. 다양한 증폭 기법에서 사용하는 데 적합한 프라이머는 당업계에 공지된 방법에 따라 제조될 수 있다.

중합효소 연쇄 반응(PCR) PCR은 특히 미국 특허 번호 제4,683,195호 및 제4,683,202호에 기술되어 있는 핵산 증폭 방법이다. PCR은 DNA 폴리머라제 생성 프라이머 연장 반응의 반복된 사이클로 구성된다. 표적 DNA가 열 변성시키고, 증폭시키고자 하는 DNA의 반대쪽 가닥 상의 표적 서열을 브래킷하는 두 올리고뉴클레오티드를 하이브리드화시킨다. 상기 올리고뉴클레오티드는 DNA 폴리머라제와 함께 사용하기 위한 프라이머가 된다. DNA는 프라이머 연장에 의해 카피되어 상기 두 가닥 모두의 제2 카피가 제조된다. 열 변성 사이클, 프라이머 하이브리드화 및 연장을 반복함으로써, 표적 DNA는 약 2 내지 4시간 경과 후 백만 배 이상으로 증폭될 수 있다. PCR은 분자 생물학 도구이며, 이는 증폭 결과를 측정하는 검출 기법과 함께 사용되어야 한다. PCR의 장점은 대략 4시간 경과 후 표적 DNA의 양을 백만 배 내지 10억 배만큼 증폭시킴으로써 감도를 증가시킨다는 점이다. PCR은 진단 맥락에서 임의의 공지된 핵산을 증폭시키는 데 사용될 수 있다(문헌 [Mok et al., Gynaecologic Oncology, 1994, 52: 247-252]).

대립 유전자 특이 증폭 기법, 예컨대, 증폭 불응 돌연변이 시스템(ARMS™)(문헌 [Newton et al., Nucleic Acids Res., 1989, 17, 2503-2516) 또한 단일 염기 돌연변이를 검출하는 데 사용될 수 있다. 적절한 PCR 증폭 조건 하에서, 프라이머의 3' 단부에 위치하는 단일 염기 미스매치는 완벽하게 매칭되는 대립 유전자를 우선적으로 증폭시키는 데 충분하며(문헌 [Newton et al., 1989, 상기 문헌 동일]), 이를 통해서 매우 밀접한 관계가 있는 종을 식별할 수 있다. 상기 기술된 프라이머를 사용하는 증폭 시스템의 기본 원리는 3' 잔기가 미스매칭되는 올리고뉴클레오티드는 적절한 조건 하에서는 PCR에서 프라이머로서 작용하지 못하게 된다는 것이다. 상기 증폭 시스템을 통해서는 단지 아가로스 겔 전기영동 후 반응 혼합물을 검사하는 것으로도 유전자형을 분석할 수 있다.

자동 및 수동 겔 전기영동, 질량 분석법 등을 비롯한, 증폭 생성물을 그의 크기에 따라 분리할 수 있는 임의의 방법을 사용하여 증폭 생성물을 분석할 수 있다.

핵산 단리, 증폭, 및 분석 방법은 당업자에게는 통상적인 것이며, 프로토콜의 예는 예를 들어, 문헌 [Green & Sambrook, Eds., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (2012, 4th edition, Vol. 1-3, ISBN 9781936113422), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)]에서 살펴볼 수 있다. PCR 증폭에 사용되는 방법에 대하여 특히 유용한 프로토콜 공급원은 문헌 [PCR (Basics: From Background to Bench) by M. J. McPherson, S. G. Mailer, R. Beynon, C. Howe, Springer Verlag; 1st edition (October 15, 2000), ISBN: 0387916008]이다.

본 발명은 또한 ERα 유전자 중 표적 핵산을 증폭시키기 위한 축퇴성 프라이머, 및 증폭 프로토콜 및 결과 분석을 포함하는 사용 설명서를 포함하는, 예측용 및 진단용 키트를 제공한다. 별법으로, 키트는 또한 증폭 생성물의 증폭 및 분석 수행을 위한 완충제, 효소, 및 용기를 포함할 수 있다. 키트는 또한 예컨대, DNA 마이크로어레이, 또는 다른 지지체와 같은 다른 도구를 포함하는 스크리닝용, 또는 진단용 키트의 구성 성분일 수 있다. 바람직하게, 키트는 또한 하나 이상의 대조군 주형, 예컨대, 정상적인 조직 샘플, 및/또는 참조 유전자 중 상이한 변이를 나타내는 일련의 샘플로부터 단리된 핵산을 제공한다.

한 실시양태에서, 키트는, 각 쌍이 참조 (ERα) 유전자의 상이한 영역(각 영역은 잠재적인 변이 부위)을 증폭시킬 수 있으며, 이로써, 1회 반응으로 또는 수회에 걸친 동시 수행되는 반응으로 생물학적 샘플 중 수개의 유전자 변이의 발현을 분석하는 키트를 제공할 수 있는, 2개 이상의 프라이머 쌍을 제공한다.

키트 중 프라이머는 증폭 생성물의 검출, 및 핵산 변이의 결과 분석이 용이하게 이루어질 수 있도록 하기 위해 표지화, 예를 들어, 형광 표지될 수 있다. 키트는 또한 1 초과의 변이를 1회 분석으로 검출할 수 있다. 그러므로, 조합형 키트는 참조 유전자의 상이한 세그먼트를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 포함할 것이다. 프라이머는 변이 사이의 식별을 위해 예를 들어, 상이한 형광성 표지를 사용하여 차별적으로 표지화될 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 환자의 종양 세포 중 ERα 유전자의 돌연변이체 또는 야생형 상태를 측정하는 단계, 및 ERα 유전자가 돌연변이체일 경우, 암 환자에게 유효량의 화학식(I)의 화합물을 투여하는 단계를 포함하는, 암 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

본원에서 사용되는 바, "유효한" 및 "유효성"라는 용어는 약리학적 유효성 및 생리학적 안전성, 둘 모두를 포함한다. 약리학적 유효성이란, 환자에서 원하는 생물학적 효과를 일으킬 수 있는 치료법의 능력을 의미한다. 생리학적 안전성이란, 치료법 수행으로 일어나게 되는, 세포, 기관 및/또는 유기체 수준에서의 독성, 또는 다른 유해한 생리학적 효과(대개는 부작용으로 지칭)의 수준을 의미한다. "효과가 더 낮은"이라는 것은, 치료법 수행 결과, 치료학상 유의적인 더 낮은 수준의 약리학적 유효성 및/또는 치료학상 더 큰 수준의 유해한 생리학성 효과가 일어난다는 것을 의미한다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 그의 종양 세포가 돌연변이체 ERα 유전자를 가지는 것으로 확인된 암 환자를 치료하기 위한 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서 화학식(I)의 화합물은 실시예 1이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 돌연변이체 ERα 유전자를 포함하는 것으로 확인된 종양 세포를 가지는 암을 치료하기 위한 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다. 한 실시양태에서 화학식(I)의 화합물은 실시예 1이다.

본 발명의 또 다른 측면에 따라, 유효량의 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 돌연변이체 ERα 유전자를 포함하는 것으로 확인된 종양 세포를 가지는 암을 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서 화학식(I)의 화합물은 실시예 1이다.

추가의 다른 실시양태에서, 본 발명은 돌연변이체 ERα 유전자를 포함하는 것으로 확인된 종양 세포를 가지는 암을 예방 및 치료하는 데 사용하기 위한 화학식(I)의 화합물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 한 실시양태에서 화학식(I)의 화합물은 실시예 1이다.

상기의 모든 측면에서, 측정된/확인된 ERα의 돌연변이체 형태는 유전자 전역에 걸쳐 모든 위치에 존재한다.

상기의 모든 측면에서, 종양, 예컨대, 일례로서, 유방암을 사용할 경우, 측정된/확인된 ERα의 특정 돌연변이체 형태는 위치 Ser463Pro, Val543Glu, Leu536Arg, Tyr537Ser, Tyr537Asn 및 Asp538Gly의 것이다.

도면의 간단한 설명
도 1은 실시예 7 A형의 X선 분말 회절 패턴을 보여주는 것이다.
도 2는 실시예 1 B형의 X선 분말 회절 패턴을 보여주는 것이다.
도 3은 실시예 1 B형의 DSC 온도 기록도를 보여주는 것이다.
도 4는 실시예 1 A형의 X선 분말 회절 패턴을 보여주는 것이다.
도 5는 실시예 1 A형의 TGA 온도 기록도를 보여주는 것이다.
도 6은 실시예 1 C형의 X선 분말 회절 패턴을 보여주는 것이다.
도 7은 실시예 1 C형의 TGA 온도 기록도를 보여주는 것이다.
도 8은 실시예 11의 X선 분말 회절 패턴을 보여주는 것이다.
도 9는 실시예 11의 DSC 트레이스를 보여주는 것이다.
도 10은 실시예 1 및 AZD2014를 이용한 MCF-7 이종이식편 연구의 결과를 보여주는 것이다.
도 11 및 12는 실시예 1을 이용한 HCC1428 장기간 에스트로겐 결핍(LTED) 이종이식편 효능 연구의 결과를 보여주는 것이다.

실시예

본 발명은 이제 하기 실시예에서 예시될 것이며, 여기서 일반적으로:

(i) 달리 언급하지 않는 한, 주변 온도, 즉, 17 내지 25℃ 범위에서, 및 질소와 같은 불활성 기체 대기 하에서 실험을 실시하였다;

(ii) 회전식 증발에 의해 또는 진공에서 진백(Genevac) 장치 또는 바이오테이지(Biotage) v10 증발기를 사용하여 증발을 수행하고, 여과에 의해 잔류 고체를 제거한 후 후처리 과정을 수행하였다;

(iii) 프리패킹된 레디셉 Rf 골드(RediSep Rf Gold)™ 실리카 칼럼(20-40 ㎛, 구형 입자), 그레이스리졸브™ 카트리지즈(GraceResolv™ Cartridges)(다비실(Davisil)® 실리카) 또는 실리사이클(Silicycle) 카트리지(40 - 63 ㎛)를 이용하여 자동 텔레다인 이스코 콤비플래쉬(Teledyne Isco CombiFlash)® Rf 또는 텔레다인 이스코 콤비플래쉬® 컴패니온(Companion)® 상에서 플래쉬 크로마토그래피 정제를 수행하였다.

(iv) 자외선 수집이 수행되는 길손 프렙(Gilson prep) HPLC 장치 상에서 분취용 크로마토그래피를 수행하였다;

(v) 자외선 수집이 수행되는(233 주입기/분획 수집기, 333 & 334 펌프, 155 UV 검출기) 길손 장치 상에서, 또는 길손 305 주입과 함께 작동되는 펌프가 있는 베리안 프렙 스타(Varian Prep Star) 장치(2 x SD1 펌프, 325 UV 검출기, 701 분획 수집기) 상에서 키랄 분취용 크로마토그래피를 수행하였다;

(vi) 수율은, 존재할 경우, 반드시 최대로 달성 가능할 필요는 없다;

(vii) 일반적으로, 화학식 I의 최종 생성물의 구조는 핵 자기 공명(NMR: nuclear magnetic resonance) 분광법에 의해 확인하였다; NMR 화학적 시프트 값은 델타 스케일로 측정하였다[양성자 자기 공명 스펙트럼은 브루커 아방스 500(Bruker Avance 500)(500 MHz) 또는 브루커 아방스 400(400 MHz) 장치를 사용하여 측정하였다]; 달리 명시하지 않는 한, 주변 온도에서 측정하였다; 하기 약어를 사용하였다: s, 단일항; d, 이중항; t, 삼중항; q, 사중항; m, 다중항; dd, 이중항의 이중항; ddd, 이중항의 이중항의 이중항; dt, 삼중항의 이중항; bs, 광범위 신호;

(viii) 일반적으로, 화학식 I의 최종 생성물은 또한 액체 크로마토그래피한 후 질량 분광법(LCMS 또는 UPLC)에 의해 특징을 규명하였다; 워터스(Waters) SQ 질량 분석기(칼럼 온도 40, UV = 220-300 nm, 질량 분석기 = 양성/음성 스위칭이 이루어지는 ESI)가 장착된 워터스 UPLC를 사용하고, 1.50 min에 걸쳐 97% A + 3% B에서 3% A 내지 97% B의 용매 시스템을 사용하여 1 ml/min의 유속으로(다시 출발 조건으로의 평형 등을 포함하는 총 실시 시간 1.70 min)(여기서, A = (산성 실험인 경우) 물 중 0.1% 포름산 또는 (염기성 실험인 경우) 물 중 0.1% 암모니아, B = 아세토니트릴) UPLC를 수행하였다. 산성 분석을 위해 사용된 칼럼은 워터스 액퀴티(Waters Acquity) HSS T3 1.8 ㎛ 2.1 x 50 mm였고, 염기성 성 분석을 위해 사용된 칼럼은 워터스 액퀴티 BEH 1.7 ㎛ 2.1 x 50 mm였다; 워터스 ZQ ESCi 질량 분석기 및 페노메넥스 게미니 -NX (50 x 2.1mm 5 ㎛) 칼럼이 장착된 워터스 얼라이언스(Waters Alliance) HT(2795)를 사용하여 1.1 ml/min 유속으로 0.5 min 동안 중단하면서 4 min 동안에 걸쳐 95% A에서 95% B로 LCMS를 수행하였다. 산성 방법인지 또는 염기성 방법인지 여부에 따라 개질제를 일정한 5% C(50:50 아세토니트릴:물 0.1% 포름산) 　또는 D(50:50 아세토니트릴:물 0.1% 수산화암모늄(0.88 SG)로 유지시킨다.

(ix) 이온 교환 정제는 일반적으로 SCX-2(바이오테이지, 프로필술폰산 관능화된 실리카, 삼작용성 실란을 사용하여 제조, 말단 캡핑되지 않음) 카트리지를 사용하여 수행하였다.

(x) 중간체 순도는 박층 크로마토그래피, 질량 스펙트럼, HPLC(고성능 액체 크로마토그래피: high performance liquid chromatography) 및/또는 NMR 분석에 의해 평가하였다;

(xi) 실시예 7의 XRPD 분석을 위해, 샘플을 영점 배경 실리콘 와퍼 상에 탑재하고, 패날리티칼 큐빅스 프로(PANalytical CubiX Pro) 회절 분석기(l = 1.5418 Å)를 사용하여 분석하였다. 샘플을 회전시켜 계수 통계를 개선시켰다. 0.025067°증분량당 25초 노출로 스캔 범위 2° 내지 40° 2 쎄타에 걸쳐 쎄타 - 2쎄타 입체배열의 반사 기하학적 구조로 데이터를 수집하였다.　X선은 45 kV 및 40mA에서 작동되는 길고 가는 구리 초점 튜브에 의해서 생성되었다. X선 분말 회절 분야의 당업자는 피크의 상대 강도는 예를 들어, 크기가 30 ㎛ 초과인 그레인 및 샘플 분석에 영향을 줄 수 있는 비단일적 종횡비에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 당업자는 또한 반사 위치는 샘플이 회절 분석기에 놓여 있는 정확한 높이 및 회절 분석기의 영점 조정에 의해 영향을 받을 수 있다는 것을 이해할 것이다. 샘플의 표면 평면도 또한 작은 영향을 미칠 수 있다. 그러므로, 제시되는 회절 패턴 데이터가 절대치인 것으로 간주되지 않아야 한다;

(xii) 실시예 1의 XRPD 분석을 위해, 결정질 물질의 샘플을 패날리티칼(Panalytical) 단일 실리콘 결정(SSC: single silicon crystal) 와퍼 마운트에 탑재하고, 현미경 슬라이드를 이용하여 샘플을 박층으로 전개시켜 X선 분말 회절 패턴을 측정하였다. (계수 통계를 개선시키기 위해) 분당 30회전으로 샘플을 회전시키고, 1.5418 Å 파장으로 45 kV 및 40 mA에서 작동되는 길고 가는 구리 초점 튜브에 의해서 생성된 X선을 조사하였다. X선 빔을 0.04 rad 솔러 슬릿을 통과시킨 후, 20 mm으로 설정된 자동 가변 발산 슬릿을 통과시키고, 최종적으로 20 mm 빔 마스크를 통과시켰다. 반사된 방사선은 20 mm 산란 방지 슬릿 및 0.04 rad 솔러 슬릿을 통해 향하게 하였다. 쎄타-쎄타 모드로 2° 내지 40° 2 쎄타 범위에 걸쳐 0.0025067° 2 쎄타 증분량당 1.905초 동안(연속 스캔 모드) 샘플을 노출시켰다. 장치는 장착된 X-셀러레이터 검출기였다. 엑스퍼트 인더스트리(X'pert Industry) 소프트웨어로 구동되는 델 펜티엄(Pentium) 4HT 워크스테이션에 의해 제어 및 데이터 포착이 이루어졌다. 자료 캡쳐하였다.

(xiii) 시차 열량 분석법: 분석 장치: TA 인스트루먼츠(TA Instruments) Q1000 DSC. 전형적으로 뚜껑이 있는 표준 알루미늄 팬에 담겨진 5 mg 미만의 물질을 분당 10℃의 일정한 가열 속도로 하여 25℃ 내지 300℃ 온도 범위로 가열하였다. 질소를 이용한 퍼지 가스를 분당 50 mL의 유속으로 사용하였다.

(xiv) 열 중량 측정 분석법 분석 장치: TA 인스트루먼츠 Q5000 TGA. 전형적으로, 10 mg 미만의 물질을 100 ㎕ 백금 팬 상에 놓고, 분당 10℃의 일정한 가열 속도로 하여 30℃ 내지 150℃ 온도 범위로 가열한다.

(xv) 하기 약어가 사용되었다:-

aq. 수성

CDCl₃ 중수소클로로포름

Conc. 진한

DCM 디클로로메탄

DMA N,N-디메틸아세트아미드

DMSO 디메틸 술폭시드

DSC 시차 열량 분석법,

EtOH 에탄올

EtOAc 에틸 아세테이트

IPA/iPrOH 이소프로필 알콜

MeCN 아세토니트릴

MTBE 메틸tert부틸 에테르

rt/RT 실온

sat. 포화

sol. 용액

THF 테트라하이드로푸란

TFA 트리플루오로아세트산

TGA 열 중량 측정 분석법

실시예 1: (E)-3-(3,5- 디플루오로 -4-(( 1R,3R )-2-(2- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산

광 분해 생성물인 [(R,E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-2-이움-1-일)페닐)아크릴레이트]가 형성될 수 있는 바, 하기 방법은 빛 부재 하에 질소 대기 하에서 수행되어야 한다.

(E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(350 g, 766.69 mmol)를 5 L 고정 베쓸에 충전시켰다. 이소프로필 알콜(2.80 L)을 베쓸에 첨가하였다. 수산화나트륨(5 M, 460 ml, 2.30 mol)을 1회분 첨가하고, 혼합물을 21℃에서 16 hr 동안 교반하였다. 검은색 용액을 필터를 통해 스크리닝하여 미립자를 제거하였다. 여액을 다시 반응기 베쓸로 복귀시켰다. 필터 및 여액 수집용 베쓸을 이소프로판올(700 ml)로 세척하고, 세액을 반응기 베쓸에 첨가하였다. 반응 혼합물을 교반하고, 물(1.75 L)을 첨가하였다. 진한 염산(37% w/w, 165 ml, 1.92 mol)을 베쓸에 충전시켰다. 추가 염산(21.5 ml)을 베쓸에 첨가하여 pH를 4.0 내지 4.5로 조정하였다. 용액을 50℃로 가열하였다. 내부 온도를 50-53℃로 유지시키면서 1시간 동안에 걸쳐 물(1.92 L)을 베쓸에 첨가하였다. 첨가하는 동안 반응기 온도를 상기 범위로 유지시키기 위하여 재킷 온도를 70℃로 승온시켰다. 물 첨가 완료 10분 이내에 혼합물 그 자체를 시딩하였고, 혼합물은 결정화되기 시작하였다. 혼합물을 50-52℃에서 1.5시간 동안(재킷 설정 온도 58℃) 유지시켰다. 생성된 황색 현탁액을 6시간 동안에 걸쳐 5℃(재킷 온도)로 냉각시켰다. 슬러리를 5℃(재킷 온도)에서 11 hr 동안 유지시켰다. 생성된 황색 고체를 여과에 의해 분리하였다. 스패튤라를 이용하여 케이크를 페이스팅하여 케이크가 균열되지 않도록 방지하였다. 베쓸을물(1.05 L)로 세척하였다. 세액을 사용하여 케이크를 세척하였다. 케이크를 대기 건조시킨 후, 진공 건조시켜 4일 동안에 걸쳐 항량으로 유지시켰다(오븐 온도 = 30℃). 이로써, 황색 결정질 고체로서 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산인, "B형" (319.45 g, 94%)가 분리되었다.

B형 결정질 물질을 형성하는, 실시예 1을 합성하는 대체 방법은 하기와 같다:

(상기 기술된 바와 같은) 광 분해 생성물이 형성될 수 있는 바, 하기 방법은 빛 부재 하에 질소 대기 하에서 수행되어야 한다. (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(50.0 g; 109.53 mmol)를 이소프로필 알콜(450 ml) 중에서 교반하였다. 수산화나트륨(68.34 g, 65.72 ml, 328.58 mmol)을 1회분 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 16 hr 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물(250 ml)로 희석하고, conc. 염산(27.28 ml, 317.63 mmol)을 이용하여 pH를 pH 4로 조정하고, 혼합물을 50℃로 가열하였다. 온도를 45℃ 초과로 유지시키면서, 30분 동안에 걸쳐 추가 물(225 ml)을 첨가하였다. 첨가하는 동안, 물질은 결정화되기 시작하였다. 혼합물을 5시간 동안에 걸쳐 50℃에서 5℃로 냉각시킨 후, 현탁액을 추가로 11시간 동안 0℃에서 유지시켰다. 여과에 의해 황색 고체를 분리하였다. 필터 케이크를 물(100 ml)로 세척하고, 필터 상에서 추가로 20분 동안 건조시킨 후, 진공 오븐에서 16시간 동안 항량(30℃, 공기 블리드)으로 건조시켜 결정질 고체로서 표제 화합물(46.52 g)(B형)을 수득하였다.

결정질 형태 B는 또한 에탄올/물 혼합물 및 에탄올/MTBE 혼합물로부터 분리될 수 있다.

본 발명의 추가의 측면에서, 이소프로판올/물 혼합물로부터 분리된, 실시예 1의 결정질 형태 B를 제공한다.

본 발명의 추가의 측면에서, 이소프로필 알콜 및 염기 중에서 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트를 가수분해시킨 후, 산성화시키고, 수성 이소프로판올로부터 결정질 생성물을 분리시키는 것을 포함하는, 실시예 1의 결정질 형태 B를 분리시키는 방법을 제공한다.

실시예 1 B형은 CuKα 방사를 사용하여 측정하였을 때 하기 2q 값: 8.4 및 10.9 중 적어도 하나를 제공하는 것을 특징으로 한다. 실시예 1 B형은 실질적으로 도 2에 제시된 바와 같은, X선 분말 회절 패턴을 제공하는 것을 특징으로 한다. 10개의 X선 분말 회절 피크가 하기 표 A에 제시되어 있다:

<표 A>

실시예 1 B형의 DSC 분석 결과, 흡열 반응이 188.6℃에서 용융 개시를 보이는, 용융점이 높은 고체인 것으로 나타났다(도 3). 실시예 1은 용융 개시에서의 변동을 유도할 수 있는 용융을 거친 분해를 나타내며, 따라서, 188.6℃라는 값은 절대적인 값으로 간주되지 않아야 한다.

실시예 1의 두 용해화된 형태 또한 관찰되었다.

A형은 메틸 3급 부틸 에테르 단일 용매화물이다. X선 분말 회절 패턴은 도 4에 제시되어 있다. TGA 결과, 55-150℃에서 그와 관련된 14.7% w/w의 중량 손실이 있는 것으로 나타났다(도 5). 단일 메틸 3급 부틸 에테르 용매화물에 대한 손실량의 이론치는 16.6%인 것으로 계산된다.

C형은 아세톤 단일 용매화물이며, X선 분말 회절 패턴은 도 6에 제시되어 있다. TGA 결과, 50-150℃에서 그와 관련된 10.0% w/w의 중량 손실이 있는 것으로 나타났다(도 7). 단일 아세톤 용매화물에 대한 손실량의 이론치는 11.0%인 것으로 계산된다.

출발 물질로서 사용된 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트는 하기와 같이 제조하였다:-

2- 플루오로 -2- 메틸프로필트리플루오로메탄술포네이트 제조

질소 대기 하에, 2-플루오로-2-메틸-프로판-1-올(1,000 g, 10.86 moles)을 20 L 베쓸에 충전시켰다. DCM(8.5 L)을 베쓸에 첨가하였다. 혼합물을 교반하고, 1℃로 냉각시켰다. 2,6-루티딘(1,395 g, 13.02 moles)을 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물의 온도를 5℃ 미만으로 유지시키면서, DCM(1 L) 중의 트리플루오로메탄술폰산 무수물(3,220 g; 11.41 moles) 용액을 1시간 동안에 걸쳐 첨가하였다(첨가하는 동안 재킷 설정 온도를 -20℃로 하강시켰다). 첨가 베쓸 및 라인을 DCM(0.5 L)으로 세척하고, 세액을 1회분 베쓸에 첨가하였다. 혼합물을 0℃에서 1시간 동안 교반하여 적색 용액을 수득하였다.

진한 염산 용액(1.23 L, 37% w/w, 16.3 moles)을 물(7 L)에 첨가하였다. 묽은 염산 용액을 적색 용액에 첨가하고, 교반된 혼합물을 25℃로 가온시켰다. 층을 분리시키고, 수성인 상층은 폐기하였다. 유기층을 물(2 x 5 L)로 세척하였다. 유기 용액을 감압하에 농축시켜 적색 오일을 수득하였다. 와이핑된 필름 증발기(4.5 mbar, 재킷 온도 50℃, 응축기 온도 4℃)를 사용하여 증류시킴으로써 적색 오일을 정제하여 옅은 적색 오일로서 2-플루오로-2-메틸프로필트리플루오로메탄술포네이트(1.69 Kg, 69%)를 수득하였다.

(R)-N-(1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)-2- 플루오로 -2- 메틸 프로판 -1- 아민 제조

(2R)-1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-아민(3.81 kg, 21.21 moles)을 질소 대기 하에 100 L 유리 라이닝된 재킷이 부착된 베쓸에 첨가하였다. 1,4-디옥산(23 L)을 첨가하고, 교반기 스위치를 켰다. 디이소프로필에틸아민(5.55 L; 31.82 moles)을 교반된 현탁액에 첨가하고, 이어서, (2-플루오로-2-메틸-프로필)트리플루오로메탄술포네이트(5.55 kg, 23.77 moles)를 첨가하였다. 1,4-디옥산(4 L)을 베쓸에 첨가하고, 혼합물을 75℃로 가열하였다. 24시간 동안 계속해서 가열한 후, 혼합물을 25℃로 냉각시켰다. 물(30.5 L)을 베쓸에 첨가한 후, 이어서, 톨루엔(30.5 L)을 첨가하였다. 40분 후, 교반기 스위치를 끄고, 층을 분리시켰다. 수성층을 제거하고, 물(30.5 L)을 유기 용액에 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 교반시킨 후, 층을 분리시켰다. 수성층을 베쓸로부터 제거하였다. 대략 27 L의 증류액이 제거될 때까지 진공 증류(재킷 온도 65℃, 110 mbar 압력)에 의해 유기 용액을 농축시켰다. 베쓸 내 남아 있는 용액을 냉각시켜 톨루엔 중 용액으로서(33% w/w)(R)-N-(1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)-2-플루오로-2-메틸프로판-1-아민(15.4 Kg, 97%)을 수득하였다.

소듐 {2,6- 디플루오로 -4-[(1 E )-3- 메톡시 -3- 옥소프로프 -1-엔-1-일]페닐}( 하이 드록시)메탄술포네이트 제조

2,6-디플루오로-4-브로모벤즈알데히드(1,000 g, 4.39 mol) 및 1,1-비스(디-tert-부틸포스피노)페로센 팔라듐 디클로라이드(57.2 g; 87.76 mmol)를 20 L 베쓸에 충전시켰다. 테트라-n-부틸암모늄 클로라이드(122 g, 438.97 mmol)를 참가한 후, 디메틸아세트아미드(5 L)를 첨가하였다. 베쓸을 질소 가스 스트림으로 퍼지시켰다. 디이소프로필에틸아민(1.5 L, 8.78 mol)을 베쓸에 첨가한 후, 메틸 아크릴레이트(0.435 L, 4.82 mol)를 첨가하였다. 혼합물을 교반하고, 60℃로 가열하였다. 혼합물을 상기 온도에서 20시간 동안 유지시켰다. 에틸 아세테이트(10 L)를 혼합물에 첨가하고, 가열 스위치를 껐다. 물(5 L)을 베쓸에 첨가하였다. 교반된 혼합물을 25℃로 냉각시키고, 10분 동안 계속해서 교반시켰다. 교반을 중단하고, 층을 분리시켰다. 수성층을 제거하고, 폐기하였다. 유기층을 염산(2.2 M, 6L) 및 물(5 L)로 연속하여 세척하였다. 포스포닉스 SPM32 스캐빈저(Phosphonics SPM32 Scavenger)(1,050 g, 1,050 mol)를 베쓸에 첨가하고, 혼합물을 25℃에서 3일 동안 교반하였다. 여과에 의해 고체 물질을 제거하였다. 케이크를 에탄올(5 L)로 세척하고, 혼합된 여액을 감압하에 농축시켜 고체를 수득하였다. 고체를 에탄올(9 L)에 용해시키고, 용액을 20 L 베쓸에서 교반하였다. 용액을 50℃로 가열하였다. 물(2.5 L) 중 아황산수소나트륨(460 g, 4.42 mol) 용액을 30분 동안에 걸쳐 첨가하였다. 진한 슬러리가 생성되었고, 이를 50℃에서 4시간 동안 교반하였다. 슬러리를 20시간 동안에 걸쳐 20℃로 냉각시켰다. 여과에 의해 고체를 분리시키고, 베쓸 및 필터 케이크 케이크를 MTBE(2 x 3 L)로 세척하였다. 생성된 고체를 진공에서 건조시켜 옅은 갈색 고체로서 소듐 {2,6-디플루오로-4-[(1E)-3-메톡시-3-옥소프로프-1-엔-1-일]페닐}(하이드록시)메탄술포네이트(1,035 g, 71%)를 수득하였다.

(E)- 메틸 3-(3,5- 디플루오로 -4- 포르밀페닐 ) 아크릴레이트 제조

질소 대기 하에, 소듐 {2,6-디플루오로-4-[(1E)-3-메톡시-3-옥소프로프-1-엔-1-일]페닐}(하이드록시)메탄술포네이트(1.211 kg, 3.52 mol)를 100 L 베쓸에 충전시킨 후, 탄산칼륨(0.974 kg, 7.05 mol)을 충전시켰다. 물(9.1 L)을 첨가하고, 교반기 작동을 개시시켰다. 에틸 아세테이트(9.1 L)를 첨가하였다. 혼합물을 25℃에서 5시간 동안 교반하였다. 교반기를 중단시키고, 혼합물을 25℃에서 14시간 동안 정치시켰다. 수성의 하층을 제거하고, 폐기하였다. 유기 상층을 감압하에 농축시켜 옅은 갈색 고체를 수득하였다. 고체를 진공에서 건조시켜 갈색 고체로서 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-포르밀페닐)아크릴레이트(608g, 76%)를 수득하였다.

(E)- 메틸 3-(3,5- 디플루오로 -4-(( 1R,3R )-2-(2- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3- 메틸 -2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트 제조

질소 대기 하에, (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-포르밀페닐)아크릴레이트(0.606 kg, 2.65 mol) 및 (R)-N-(1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)-2-플루오로-2-메틸프로판-1-아민(톨루엔 중 33% w/w 용액, 2.0 kg, 2.65 mol)을 20 L 베쓸에 충전시킨 후, 톨루엔(4.22 L)을 충전시켰다. 아세트산(304 ml, 5.31 mol)을 베쓸에 첨가하였다. 혼합물을 교반하고, 80℃로 가열하였다. 혼합물을 80℃에서 밤새도록 교반시킨 후, 20℃로 냉각시켰다. 물(3.3 L) 중 탄산칼륨(0.916 kg, 6.63 mol) 용액을 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반시킨 후, 교반기 스위치를 끄고, 층을 분리시켰다. 수성층을 제거하고, 폐기하였다. 물(3.3 L)을 반응기에 충전시켰다. 혼합물을 10분 동안 교반시킨 후, 10분 동안 교반시켰다. 수성의 하층을 제거하고, 유기층을 실온에서 밤새도록 정치시켰다. 배치를 80℃로 가열하였다. 헵탄(4.61 L)을 35분 동안에 걸쳐 뜨거운 용액에 첨가하였다. 교반된 혼합물을 대략 80℃에서 1시간 동안 유지시켰다. 혼합물을 2시간 동안에 걸쳐 30℃로 냉각시켰고, 그 시간 동안 생성물은 결정화되었다. 슬러리를 30℃에서 2.5시간 동안 교반시켰다. 고체를 여과에 의해 분리시켰다. 반응기 베쓸 벽을 헵탄으로 세척하고, 세액을 사용하여 필터 케이크를 세척하였다. 고체를 진공에서 건조시켜 분홍색 고체로서 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(0.763 kg, 61%)를 수득하였다.

실시예 1: (E)-3-(3,5- 디플루오로 -4-(( 1R,3R )-2-(2- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산의 대체 제조법

7.5 M 수산화나트륨(32.9 ml, 247.10 mmol)을 THF(143 ml) 및 메탄올(71.4 ml) 중 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(11.28 g, 24.71 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 4 h 동안 교반하였다. 2 N HCl 용액을 첨가하여 수성물의 pH를 ~6.5로 조정한 후, 용액을 디에틸 에테르(3 x 150 ml)로 추출하였다. 혼합된 유기물을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 조 생성물을 DCM 중 용리 구배 0 내지 20% 메탄올로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하여 황색 고체를 수득하였다. 아세톤/헵탄을 이용하여 연마를 시도하였지만, 예상 용해도보다 높았기 때문에 실패하였다. 용매를 제거하여 황색 고체를 수득하고, 디에틸 에테르 몇 방울을 이용하여 이소헥산(50 ml) 중에서 연마하고, 생성된 고체를 여과하고, 건조시켜 황색 분말로서 조 생성물(11.14 g)을 수득하였다. 고체를 암실에서 질소 하에 에탄올(100 ml) 중에 용해시켰다. 이어서, 용액을 암실에서 62℃에서 진공 펌프를 이용하여 5 mBar로 증발시켰다. 상기 절차를 2회 반복하고, 생성된 생성된 황색 유리를 스패튤라를 이용하여 미세 분말로 스크래칭하고, 62℃에서 60 min 동안 진공 펌프를 이용하여 5 mBar에 가하여 황색 분말을 수득하였다. 이어서, 분말을 진공 오븐 중 P₂O₅ 상에서 62℃에서 밤새도록 300 mBar에 방치하여 옅은 황색 고체로서 표제 생성물(9.77 g, 89%)을 수득하였다.

2- 플루오로 -2- 메틸프로판 -1-올 제조

수소화알루미늄리튬(3.37 g, 88.56 mmol)을 0℃에서 15 min 동안에 걸쳐 디에틸 에테르(184 ml) 중 에틸 2-플루오로-2-메틸프로파노에이트(9.9 g, 73.80 mmol)의 냉각된 용액에 소량씩 첨가하였다. 반응물을 1 hr 동안 교반한 후, 물(3.3 ml), 이어서, 15% NaOH 용액(3.3 ml) 및 물(6.7 ml)을 연속적으로 첨가하였다. 현탁액을 15 min 동안 교반한 후, 여과하고, 고체를 디에틸 에테르로 세척하였다. 여액을 증발시켜 무색 오일로서 2-플루오로-2-메틸프로판-1-올(5.90 g, 87%)을 수득하였다.

2- 플루오로 -2- 메틸프로필트리플루오로메탄술포네이트의 대체 제조법

트리플루오로메탄술폰산 무수물(12.06 ml, 71.24 mmol), 이어서, 2,6-루티딘(11.42 ml, 81.42 mmol)을 -10℃에서 DCM(146 ml) 중 2-플루오로-2-메틸프로판-1-올(6.25 g, 67.85 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 1 hr 동안 교반시킨 후, 2 N HCl(2 x 100 ml) 및 포화 NaHCO₃ 용액(2 x 100 ml)으로 세척하였다. 이어서, 유기상을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켜 적색 오일로서 2-플루오로-2-메틸프로필트리플루오로메탄술포네이트(12.89 g, 85%)를 수득하였다.

상기 중간체를 진공 증류에 의해 정제할 수 있다. DSC 분석 결과, 물질은 자가 가열될 수 있는 잠재능을 가지는 것으로 나타났다. 방법 안전성 이유에서 와이핑된 필름 증발기 또는 유사물이 배치 증류보다 바람직할 수 있다.

(R)-N-(1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)-2- 플루오로 -2- 메틸프로판 -1- 아민의 대체 제조법

2-플루오로-2-메틸프로필트리플루오로메탄술포네이트(8.04 g, 35.87 mmol)를 디옥산(50 ml) 중 (R)-1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-아민(5.00 g, 28.70 mmol) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민 (7.44 ml, 43.04 mmol) 의 용액에 첨가하였다. 반응물을 3 h 동안 90℃로 가열하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 반응물을 EtOAc(200 ml)로 희석시키고, NaHCO₃ 포화 용액(2 x 100 ml)으로 세척하였다. 수성상을 EtOAc(150 ml)로 추출한 후, 혼합된 유기물을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 조 생성물을 용리 구배 100% EtOAc로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 갈색 오일로서 (R)-N-(1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)-2-플루오로-2-메틸프로판-1-아민(6.49 g, 91%)을 수득하였다.

(E)- 메틸 3-(3,5- 디플루오로 -4- 포르밀페닐 ) 아크릴레이트의 대체 제조법

4-브로모-2,6-디플루오로벤즈알데히드(9.99 g, 45.20 mmol) 및 메틸 아크릴레이트(6.14 ml, 67.81 mmol)를 완전하게 탈기된 DMA(100 ml)에 용해시키고, 트리-o-톨릴포스핀(1.376 g, 4.52 mmol), 팔라듐(II) 아세테이트(0.507 g, 2.26 mmol) 및 트리에틸아민(12.60 ml, 90.41 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 교반하고, 6시간 동안 80℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 셀라이트 층을 통해 여과하고, 메탄올(50 ml)로 세척하였다. 조 생성물을 실리카 상에 미리 흡수시키고, 0-10% 디에틸 에테르/디클로로메탄으로 용리시키면서 흡입 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 증발시키고, 디에틸 에테르(50 ml)로 연마시켜 황색 고체를 수득하고, 이를 물(50 ml)로 연마시키고, 높은 진공하에 50℃에서 건조시켜 황색 고체로서 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-포르밀페닐)아크릴레이트(8.85 g, 87%)를 수득하였다.

(E)- 메틸 3-(3,5- 디플루오로 -4-(( 1R,3R )-2-(2- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3- 메틸 -2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트의 대체 제조법

(E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-포르밀페닐)아크릴레이트(6.58 g, 29.09 mmol)를 톨루엔(51.1 ml) 및 아세트산(2.78 ml, 48.48 mmol) 중 (R)-N-(1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)-2-플루오로-2-메틸프로판-1-아민(6.02 g, 24.24 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 반응물을 5시간 동안 80℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 SCX-2칼럼을 이용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 7 M NH₃/메탄올을 사용하여 칼럼으로부터 원하는 생성물을 용리시키고, 순수한 분획을 증발 건조시켜 갈색 고체를 수득하였다. 헵탄 중 용리 구배 0 내지 30% EtOAc로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 조 생성물을 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 황색 고체 표제 생성물(7.52 g, 68.0%)을 수득하였다.

실시예 2: (E)-3-(4-(( 1R,3R )-2-(2- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3- 메틸 -2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산

7.5 M 수산화나트륨 용액(0.983 ml, 7.37 mmol)을 메탄올(5 ml) 중의 (E)-메틸 3-(4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(310 mg, 0.74 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. SCX-2 칼럼을 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 반응 혼합물을 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 7 M NH₃/메탄올을 이용하여 칼럼으로부터 용리시키고, 순수한 분획을 증발 건조시켜 황색 고체를 수득하였다. 용리제로서 점감적으로 극성인, 물(0.1% 포름산 함유) 및 MeCN의 혼합물을 이용하여 분취용 HPLC(워터스 선파이어(Waters SunFire) 칼럼, 5 μ 실리카, 50 mm 직경, 100 mm 길이)에 의해 조 생성물을 정제하였다. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 증발 건조시킨 후, SCX-2 칼럼 상에 로딩하고, 메탄올 중 7 N 암모니아를 이용하여 용리시켜 황색 고체로서 표제 생성물(63.0 mg, 21.02%)을 수득하였다.

출발 물질로서 사용된 (E)-메틸 3-(4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트는 하기와 같이 제조하였다:-

(E)- 메틸 3-(4- 포르밀페닐 ) 아크릴레이트 제조

4-브로모벤즈알데히드(30 g, 162.15 mmol) 및 메틸 아크릴레이트(20.94 g, 243.22 mmol)를 완전하게 탈기된 DMA(300 ml) 중에 용해시키고, 트리-o-톨릴포스핀 (4.94 g, 16.21 mmol), 팔라듐(II) 아세테이트(1.820 g, 8.11 mmol) 및 트리에틸아민(45.2 ml, 324.29 mmol)로 처리하고, 16시간 동안 110℃로 가열하였다. 상기 시간 후 반응이 완료된 것으로 보였다. 반응 혼합물을 물(4 L)에 붓고, 생성된 침전물을 여과하고, 건조시켰다. 고체를 100% 헵탄 내지 헵탄 중 30% EtOAc로 용리시키면서, 실리카 상에서 크로마토그래피하였다. 관련된 분획을 혼합시키고, 증발 건조시켜 황색 고체 생성물을 수득하고, 이를 헵탄으로 연마하고, 여과하고, 냉 헵탄으로 세척하였다. 고체를 건조시켜 황색 결정질 생성물로서 (E)-메틸 3-(4-포르밀페닐)아크릴레이트(25.6 g, 83%)를 수득하였다.

(E)- 메틸 3-(4-(( 1R,3R )-2-(2- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3- 메틸 -2,3,4,9- 테트라하이드로 -1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트 제조

(실시예 1, 출발 물질 제조에 기술된 바와 같이 수득된) (R)-N-(1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)-2-플루오로-2-메틸프로판-1-아민(450 mg, 1.81 mmol) 및 (E)-메틸 3-(4-포르밀페닐)아크릴레이트(345 mg, 1.81 mmol)를 톨루엔(15 ml) 중에 용해시키고, 아세트산(5 ml) 및 분자체를 첨가하였다. 반응물을 질소 하에 110℃에서 16시간 동안 교반한 후, 실온으로 냉각시켰다. SCX-2 칼럼을 이용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 조 생성물을 정제하였다. 원하는 생성물을 7 M NH₃/메탄올을 이용하여 칼럼으로부터 용리시키고, 순수한 분획을 증발 건조시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 헵탄 중 0 내지 30% EtOAc 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 황색 고체로서 (E)-메틸 3-(4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(317 mg, 41.6%)를 수득하였다.

실시예 3: (E)-3-(3,5- 디플루오로 -4-(( 1R,3R )-2-((S)-3- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산

2 M 수산화나트륨(3.0 ml, 6.00 mmol)을 THF(1.5 ml)/메탄올(1.5 ml) 중의 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(275 mg, 0.60 mmol) 중의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3 h 동안 교반하였다. EtOAc(15 ml) 및 물(15 ml)을 첨가한 후, 2 N HCl을 첨가하여 수성물의 pH를 ~7로 조정하였다. 층을 분리하고, 수성물을 EtOAc(15 ml)로 추출하였다. 혼합된 유기물을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0 내지 10% 메탄올 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 옅은 황색 고체로서 표제 생성물(250 mg, 94%)을 수득하였다.

출발 물질로서 사용된 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트를 하기와 같이 제조하였다:-

(S)-3- 플루오로 -2- 메틸프로판 -1-올 제조

N,N-디에틸-1,1,2,3,3,3-헥사플루오로프로판-1-아민(18.25 ml, 100.57 mmol)을 DCM(77 ml) 중의 (R)-메틸 3-하이드록시-2-메틸프로파노에이트(9.25 ml, 83.81 mmol)의 용액에 적가하였다(반응물은 ~40℃로 가온). 반응물을 주변 온도에서 1 h 동안 교반한 후, 4 h 동안 환류 가온시킨 후, 밤새도록 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 얼음 상에 붓고, 층을 분리시켰다. 수성물을 DCM(2 x 150 ml)으로 추출한 후, 혼합된 유기물을 건조시키고, 주의하여 농축시켰다. 잔류물을 THF(200 ml) 중에 용해시키고, 얼음 배쓰 중에서 냉각시켰다. 수소화알루미늄리튬(6.45 g, 167.61 mmol)을 15 min 동안에 걸쳐 소량씩 첨가하였다. 반응물을 0℃에서 1 h 동안 교반하고, 추가로 1 h 동안 실온으로 가온시켰다. 얼음 배쓰 중에서 냉각시킨 후, 물(7 ml)을 첨가한 후, 15% NaOH(7 ml)를 첨가하고, 마지막으로 물(21 ml)을 첨가하여 반응물을 켄칭시켰다. 과립형 고체가 형성될 때까지 MgSO₄를 첨가하였다. 고체를 셀라이트를 통해 여과하고, 고체를 디에틸 에테르(50 ml)로 세척하였다. 여액을 2 N HCl(2 x 100 ml)로 세척한 후, 유기상을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0 내지 10% EtOAc 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 담황색 오일로서 (S)-3-플루오로-2-메틸프로판-1-올(6.42 g, 83%)을 수득하였다.

(S)-3- 플루오로 -2- 메틸프로필트리플루오로메탄술포네이트 제조

0℃에서 DCM(140 ml) 중의 (S)-3-플루오로-2-메틸프로판-1-올(7.9 g, 85.77 mmol)의 교반된 용액에 트리플루오로메탄술폰산 무수물(17.31 ml, 102.92 mmol)을 적가한 후, 2,6-디메틸피리딘(11.95 ml, 102.92 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 45 min 동안, 및 실온에서 30 min 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM(60 ml)으로 희석시키고, 1 M HCl(3 x 100 ml), 중탄산나트륨 포화 용액(100 ml) 및 포화 염수(50 ml)로 연속하여 세척하였다. 유기층을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 거의 건조될 때까지 증발시켰다. 용액을 실리카 플러그를 통해 여과시키고, DCM(50 ml)을 통해 세척하고, 증발시켜 갈색 오일로서 (S)-3-플루오로-2-메틸프로필트리플루오로메탄술포네이트(14.38 g, 74.8%)를 수득하였다.

(S)-N-((R)-1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)-3- 플루오로 -2- 메틸 프로판 -1- 아민 제조

(S)-3-플루오로-2-메틸프로필트리플루오로메탄술포네이트(666 mg, 2.97 mmol)를 1,4-디옥산(6.05 ml) 중의 (R)-1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-아민(470 mg, 2.7 mmol) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(0.700 ml, 4.05 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1 h 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc(20 ml)로 희석시키고, 물(20 ml)로 세척하였다. 수성물을 EtOAc(2 x 20 ml)로 추출한 후, 혼합된 유기물을 건조시키고(MgSO₄), 농축시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0 내지 10% 메탄올 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 갈색 오일로서 (S)-N-((R)-1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)-3-플루오로-2-메틸프로판-1-아민(590 mg, 88%)을 수득하였다.

(E)- 메틸 3-(3,5- 디플루오로 -4-(( 1R,3R )-2-((S)-3- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트 제조

아세트산(2.0 ml)을 톨루엔(8.0 ml) 중의 (S)-N-((R)-1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)-3-플루오로-2-메틸프로판-1-아민(273 mg, 1.10 mmol) 및 (실시예 1, 출발 물질 제조에 기술된 바와 같이 수득된) (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-포르밀페닐)아크릴레이트(226 mg, 1 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 2.5 h 동안 95℃으로 가온시켰다. 진공하에서 휘발성 물질을 제거한 후, 잔류물을 SCX-2 칼럼을 통해 통과시켰다. 이어서, 칼럼을 7 M NH₃/메탄올로 용리시켜 생성물을 유리시켰다. 여액을 농축시키고, 조 생성물을 DCM 중 0 내지 10% 메탄올 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 옅은 황색 고체로서 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(282 mg, 61.8%)를 수득하였다.

실시예 4: (E)-3-(4-(( 1R,3R )-2-((S)-3- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3- 메틸 -2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산

7.5 M 수산화나트륨 용액(0.904 ml, 6.78 mmol)을 메탄올(3 ml) 중의 (E)-메틸 3-(4-((1R,3R)-2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(285 mg, 0.68 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 20℃에서 2시간 동안 교반하였다. SCX-2 칼럼을 이용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 반응 혼합물을 정제하였다. 원하는 생성물을 함유하는 분획을 7 M NH₃/메탄올을 사용하여 칼럼으로부터 용리시키고, 순수한 분획을 증발 건조시켜 황색 고체를 수득하였다. 용리제로서 점감적으로 극성인, 물(1% NH₃ 함유) 및 MeCN의 혼합물을 이용하여 LCMS(페노메넥스 게미니-NX 엑시아 프렙 C18 OBD 칼럼(Phenomenex Gemini-NX axia Prep C18 OBD column), 5 μ 실리카, 50 mm 직경, 100 mm 길이)에 의해 조 생성물을 정제하였다. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 증발 건조시켜 황색 고체로서 표제 생성물(80 mg, 29.0%)을 수득하였다.

출발 물질로서 사용된 (E)-메틸 3-(4-((1R,3R)-2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트는 하기와 같이 제조하였다:-

(E)- 메틸 3-(4-(( 1S,3R )-3- 메틸 -2,3,4,9- 테트라하이드로 -1H- 피리도[3,4-b]인돌 -1-일)페닐)아크릴레이트 제조

(실시예 2, 출발 물질 제조에 기술된 바와 같이 수득된) (E)-메틸 3-(4-포르밀페닐)아크릴레이트(18.56 g, 97.57 mmol)를 질소 하에 23℃에서 아세트산(250 ml) 중의 (R)-1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-아민(17 g, 97.57 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 생성된 용액을 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발 건조시키고, DCM(500 ml) 중에 다시 용해시키고, 포화 NaHCO₃(300 ml x 2), 2 M NaOH(aq)(300 ml), 물(300 ml), 및 포화 염수(300 ml)로 연속하여 세척하였다. 유기층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 DCM 1 내지 7% 메탄올 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 베이지색 기포로서 (E)-메틸 3-(4-((1S,3R)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(25.1 g, 74.3%)를 수득하였다. 생성물은 대부분, 분리불가능한 약 12% 트랜스 이성질체를 함유하는, 시스 이성질체였다.

(E)- 메틸 3-(4-(( 1S,3R )-2-알릴-3- 메틸 -2,3,4,9- 테트라하이드로 -1H- 피리 도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트 제조

(E)-메틸 3-(4-((1S,3R)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(35 g, 101.03 mmol), 3-브로모프로프-1-엔(9.62 ml, 111.14 mmol) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(19.36 ml, 111.14 mmol)을 아세토니트릴(160 ml) 중에 현탁시키고, 5 min 동안 질소를 버블링한 후, 혼합물을 마이크로웨이브 튜브 내로 실링하였다. 반응물을 마이크로웨이브 반응기 중에서 3.5시간 동안 140℃로 가열하고, 실온으로 냉각시켰다.

반응 혼합물을 증발 건조시키고, DCM(100 ml) 중에 다시 용해시키고, 1 M 시트르산(100 ml), 물(100 ml), 및 포화 염수(100 ml)로 연속하여 세척하였다. 유기층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 헵탄 중 0 내지 20% EtOAc 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 옅은 황색 고체로서 (E)-메틸 3-(4-((1R,3R)-2-알릴-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트:(E)-메틸 3-(4-((1S,3R)-2-알릴-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트 50:50 혼합물(10.00 g, 25.6%)을 수득하였다. m/z: ES+ [M+H]+ 387.

(E)- 메틸3 -(4-(( 1R,3R )-2-알릴-3- 메틸 -2,3,4,9- 테트라하이드로 -1H- 피리도[3,4-b]인돌 -1-일)페닐)아크릴레이트 제조

트리플루오로아세트산(5.59 ml, 75.29 mmol)을 질소 하에 20℃에서 DCM(100 ml) 중 (E)-메틸 3-(4-((1S,3R)-2-알릴-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(9.7 g, 25.10 mmol)에 첨가하였다. 생성된 용액을 20℃에서 3일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 NaHCO₃ 용액(250 ml)으로 주의하여 희석시키고, DCM 층을 물(250 ml) 및 포화 염수(250 ml)로 연속하여 세척하였다. 유기층을 MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 헵탄 중 10 내지 20% EtOAc 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 분획을 증발 건조시켜 옅은 황색 고체로서 (E)-메틸 3-(4-((1R,3R)-2-알릴-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트: (E)-메틸 3-(4-((1S,3R)-2-알릴-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트 65:35 혼합물(7.99 g, 82%)을 수득하였다. m/z: ES+ [M+H]+ 387

(E)- 메틸 3-(4-(( 1R,3R )-3- 메틸 -2,3,4,9- 테트라하이드로 -1H- 피리도[3,4-b]인돌 -1-일)페닐)아크릴레이트 제조

65:35 (E)-메틸 3-(4-((1R,3R)-2-알릴-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트:(E)-메틸 3-(4-((1S,3R)-2-알릴-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(2.00 g, 5.17 mmol)로 이루어진 7개의 별개의 배치를 하기와 같이 반응시켰다.

(E)-메틸 3-(4-((1R,3R)-2-알릴-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(2.00 g, 5.17 mmol) 및 클로로트리스(트리페닐포스핀)로듐(I)(윌킨슨 촉매(Wilkinson's catalyst))(2.346 g, 2.54 mmol)을 아세토니트릴(12 ml) 및 물(2.4 ml) 중에 현탁시키고, 5 min 동안에 걸쳐 질소를 버블링시킨 후, 마이크로웨이브 튜브 내로 실링하였다. 반응물을 마이크로웨이브 반응기에서 60 min 동안 100℃로 가열하고, 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 혼합하고, 증발 건조시키고, DCM(200 ml) 중에 다시 용해시키고, NaHCO₃ 포화 용액(200 ml)을 첨가하였다. 유기층을 물(200 ml) 및 포화 염수(200 ml)로 연속하여 세척한 후, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 증발시켜 조 생성물을 수득하였다. 조 생성물을 DCM 중 0 내지 5% 메탄올 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 옅은 황색 고체로서 (E)-메틸 3-(4-((1R,3R)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(7.02 g, 55.9%)를 수득하였다.

(E)- 메틸 3-(4-(( 1R,3R )-2-((S)-3- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3- 메틸 -2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트 제조

(실시예 3, 출발 물질 제조에 기술된 바와 같이 수득된) (S)-3-플루오로-2-메틸프로필트리플루오로메탄술포네이트(291 mg, 1.30 mmol)를 1,4-디옥산(5 ml) 중 (E)-메틸 3-(4-((1R,3R)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(300 mg, 0.87 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.226 ml, 1.30 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 90℃에서 1시간 동안 교반한 후, 혼합물을 증발 건조시키고, 잔류물을 DCM(30 ml) 및 물(30 ml) 사이에 분배하였다. 수성층을 DCM(30 ml)으로 추출하고, 추출물을 유기층과 혼합하였다. 혼합된 추출물을 상 분리 용지를 통해 여과시키고, 증발시켰다. 용리 용매 헵탄 중 15% EtOAc로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 잔류물을 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 회백색 고체로서 (E)-메틸 3-(4-((1R,3R)-2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(314 mg, 86%)를 수득하였다.

실시예 5: (E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산(이성질체 1)*

수산화나트륨(184 mg, 4.61 mmol)을 THF(1 ml)/메탄올(1 ml) 중의 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1)(217 mg, 0.46 mmol)에 첨가하였다. 생성된 용액을 20℃에서 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 물(10 ml)로 희석시키고, 2 N HCl을 첨가하여 pH를 7로 조정하였다. 용액을 EtOAc(2 x 20 ml)로 추출하였다. 혼합된 유기물을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 조 생성물을 헵탄 중 0 내지 50% EtOAc 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발시켜 조 물질을 수득하였다. 디에틸 에테르/이소헥산 혼합물을 사용하여 조 생성물을 연마하여 황색 고체로서 표제 생성물(53.0 mg, 25.2%)을 수득하였다.

* 다른 실시예와의 유추에 의해 비정의된 중심에서 (R)인 것으로 추론되는 입체화학, 즉, (E)-3-(3,5-디플루오로-4-(1R)-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산인 것으로 추론되는 화합물.

출발 물질로서 사용된 3-(3,5-디플루오로-4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1)는 하기와 같이 제조하였다:-

(E)- 메틸 3-(4-(3,3-디메틸-2,3,4,9- 테트라하이드로 -1H- 피리도[3,4-b]인돌 -1-일)-3,5-디플루오로페닐)아크릴레이트 제조

1-(1H-인돌-3-일)-2-메틸프로판-2-아민(807 mg, 4.29 mmol) 및 (실시예 1, 출발 물질 제조에 기술된 바와 같이 수득된) (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-포르밀페닐)아크릴레이트(970 mg, 4.29 mmol)를 아세트산(15 ml) 중에서 혼합하고, 혼합물을 2시간 동안 80℃로 가열하였다. SCX-2 칼럼을 이용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 반응 혼합물을 정제하였다. 메탄올 중 2 M NH₃을 사용하여 칼럼으로부터 원하는 생성물을 용리시키고, 분획을 함유하는 생성물을 증발 건조시켜 황색 기포로서 (E)-메틸 3-(4-(3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)-3,5-디플루오로페닐)아크릴레이트(1,610 mg, 95%)를 수득하였다.

(E)- 메틸 3-(3,5- 디플루오로 -4-(2-((S)-3- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3,3- 디메 틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1) 제조

(실시예 3, 출발 물질 제조에 기술된 바와 같이 수득된) (S)-3-플루오로-2-메틸프로필트리플루오로메탄술포네이트(0.339 g, 1.51 mmol)를 1,4-디옥산(2 ml) 중 (E)-메틸 3-(4-(3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)-3,5-디플루오로페닐)아크릴레이트(0.3 g, 0.76 mmol) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(0.458 ml, 2.65 mmol)의 용액에 첨가하였다. 24시간 동안 계속해서 교반한 후, 이어서, 진공하에서 휘발성 물질을 제거한 후, 조 생성물을 헵탄 중 0 내지 25% EtOAc 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 흰색 고체로서 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(0.202 g, 36%)를 수득하였다. 물질을 또 다른 배치(0.36 g)와 혼합하고, 80 ml/min으로(4회 주입) 분취용 HPLC(키랄팩(Chiralpak) IA 칼럼, 20 ㎛ 실리카, 20 mm 직경, 250 mm 길이), 헵탄:IPA 70:30에 의해 정제하였다. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 증발시켜 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1, 맨 처음 용리, 217 mg) 및 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 2, 두번째로 용리, 165 mg)를 수득하였다. 2 ml/min으로 키랄팩 IA 칼럼, 5 ㎛ 실리카, 4.6 mm 직경, 50 mm 길이, 헵탄:IPA 70:30에서 분석을 수행하였다.

실시예 6: (E)-3-(3,5- 디플루오로 -4-(2-(2- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산(이성질체 1)*

2 M 수산화나트륨(1.6 ml, 3.20 mmol)을 THF(0.8 ml)/메탄올(0.8 ml) 중 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1)(148 mg, 0.31 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 3 h 동안 교반하였다. EtOAc(15 ml) 및 물(15 ml)을 첨가하고, 2 N HCl을 첨가하여 수성물의 pH를 ~7로 조정하였다. 층을 분리하고, 수성물을 EtOAc(15 ml)로 추출하였다. 혼합된 유기물을 Na₂SO₄ 상에서 건조시키고_, 농축시켰다. 조 생성물을 헵탄 중 25 내지 100% EtOAc 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 옅은 황색 고체로서 표제 생성물(이성질체 1)(124 mg, 86%)을 수득하였다.

* 다른 실시예와의 유추에 의해 비정의된 중심에서 (R)인 것으로 추론되는 입체화학.

출발 물질로서 사용된 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1)는 하기와 같이 제조하였다:-

(E)- 메틸 3-(3,5- 디플루오로 -4-(2-(2- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1) 제조

(실시예 1, 출발 물질 제조에 기술된 바와 같이 수득된)2-플루오로-2-메틸프로필트리플루오로메탄술포네이트(679 mg, 3.03 mmol)를 1,4-디옥산(2.5 ml) 중 (실시예 5, 출발 물질 제조에 기술된 바와 같이 수득된) (E)-메틸 3-(4-(3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)-3,5-디플루오로페닐)아크릴레이트(600 mg, 1.51 mmol) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(0.915 ml, 5.30 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1 h 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 88시간 동안 105℃로 가열하였다. 진공하에서 휘발성 물질을 제거한 후, 조 생성물을 헵탄 중 0 내지 50% EtOAc 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 흰색 고체로서 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(430 mg, 60.4%)를 수득하였다. 라세믹 생성물을 90 ml/min으로 분취용 HPLC(키랄팩 AD 칼럼, 20 ㎛ 실리카, 50 mm 직경, 250 mm 길이), 헵탄:에탄올 90:10에 의해 정제하였다. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 증발 건조시켜 크림색 고체로서 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1, 맨 처음 용리, 149 mg, 34.6%) 및 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 2, 두번째로 용리, 143 mg, 33.3%)를 수득하였다.

실시예 7: (E)-3-(4-(2-((S)-3- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산(이성질체 1)*

2 M 수산화나트륨 용액(20.42 ml, 40.85 mmol)을 메탄올(100 ml), THF(100 ml) 및 물(75 ml) 중 (E)-메틸 3-(4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1)(3.55 g, 8.17 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 16시간 동안 40℃에서 가열하였다. 혼합물을 물(100 ml)로 희석시키고, 진공 농축시켜 유기 용매를 제거하였다. 2 M HCl을 이용하여 생성된 수성 용액을 pH 6으로 산성화시켰다. 생성된 수성 현탁액을 DCM(500 ml)으로 추출하고(염수를 첨가하여 형성된 에멀젼의 분리를 도왔다), 상 분리 용지를 통해 여과시키고, MgSO₄ 상에서 건조시킨 후, 셀라이트를 통해 여과하고, 증발시켜 ~3.5 g의 옅은 황색 고체를 수득하였다. 조 생성물을 디에틸 에테르/DCM(1:1, 150 ml)으로 처리하고, 초음파 처리하였다. 형성된 미세 현탁액을 실리카 패드(~100 g)를 통해 여과시키고, 실리카를 디에틸 에테르(~2 L)로 용리시켰다. 분획을 함유하는 생성물을 혼합하고, 증발시키고, 50℃에서 진공하에 건조시켜 베이지색 고체로서 표제 생성물(2.305 g, 64.5%)을 수득하였다.

생성물(9.0 g, 21.40 mmol)을 암실에서 질소 하에 마개가 있는 250 ml 둥근 바닥 플라스크 중 아세토니트릴(150 ml)에서 1시간 동안 슬러리화하였다. 혼합물을 실온에서 주말 동안에 걸쳐 교반한 후, 여과하고, 냉 아세토니트릴(60 ml)로 세척하여 흰색 고체를 수득하고, 이를 높은 진공하에 40℃에서 5시간 동안 건조시켜 표제 생성물의 결정질 A형(7.81 g, 87%)을 수득하였다.

결정질 A형의 XRPD 트레이스는 하기 피크를 포함하고, 이는 도 1에 제시되어 있다.

출발 물질로서 사용된 (E)-메틸 3-(4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1) 는 하기와 같이 제조하였다:-

(E)- 메틸 3-(4-(3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(라세메이트) 제조

(실시예 2, 출발 물질 제조에 기술된 바와 같이 수득된) (E)-메틸 3-(4-포르밀페닐)아크릴레이트(41.8 g, 219.62 mmol)를 질소 하에 아세트산(314 ml) 중 1-(1H-인돌-3-일)-2-메틸프로판-2-아민(43.8 g, 219.62 mmol)에 1회분 첨가하였다. 생성된 용액을 80℃에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 진공에서 농축시켰다. 톨루엔(200 ml)을 첨가하고, 잔류물을 증발 건조시켰다. 공비 혼합물 처리를 2회 이상 반복하여 갈색 고체를 수득하였다. 이를 1:1 EtOAc/헵탄(500 ml) 중에서 30 min 동안 교반한 후, 여과시키고, 1:1 EtOAc/헵탄으로 세척하였다. 화합물을 대기 건조시켜 흰색 고체를 수득하였다. 조 물질을 2-메틸 테트라하이드로푸란(750 ml) 중에 현탁시키고, 중탄산나트륨 포화 용액을 10 min 동안에 걸쳐 교반된 혼합물(비등)에 첨가하고, 물질이 용해될 때까지 혼합물을 교반하고, 수성 상은 염기성인 상태 그대로 유지되었다. 상을 분리하고, 유기상을 염수로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공에서 농축시켜 옅은 황색 기포(~78 g)를 수득하였다. 물질을 디에틸 에테르(200 ml) 중에 용해시키고, 농축 건조시켰다(2회 반복). 2차 첨가시, 적절한 고체가 수득되었다. 이를 디에틸 에테르 중에서 교반하고, 증발 건조시켜 (E)-메틸 3-(4-(3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(라세메이트)(73.6 g, 89%)를 수득하였다.

(E)- 메틸 3-(4-(3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1) 제조

(E)-메틸 3-(4-(3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(라세메이트)(65 g)를 하기와 같이 7회 주입으로 정제하였다.

라세믹 물질을 분취용 HPLC(키랄팩 OD 칼럼, 20 ㎛ 실리카, 100 mm 직경, 250 mm 길이), 헵탄:IPA 50:50에 의해 정제하였다. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 증발 건조시켜 (E)-메틸 3-(4-(3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1, 맨 처음 용리, 30.3 g, 93%) 및 (E)-메틸 3-(4-(3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 2, 두번째로 용리, 28.2 g, 86%)를 수득하였다.

(E)- 메틸 3-(4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1) 제조

(실시예 3, 출발 물질 제조에 기술된 바와 같이 수득된) (S)-3-플루오로-2-메틸프로필트리플루오로메탄술포네이트(5.32 g, 21.36 mmol)를 1,4-디옥산(17.5 ml) 중 (E)-메틸 3-(4-(3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1)(3.5 g, 9.71 mmol) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(6.34 ml, 36.41 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 22℃에서 3일 동안 교반하였다. 혼합물을 증발시키고, 잔류물을 DCM(150 ml) 및 물(150 ml) 사잉 분배하였다. 수성층을 DCM(50 ml)으로 추출하고, 추출물을 유기층과 혼합하였다. 혼합된 추출물을 상 분리 용지를 통해 여과시키고, 증발시켰다. 잔류물을 용리 용매 헵탄 중 15% EtOAc로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 상당량의 생성물을 함유하는 분획은 결정을 형성하기 시작하였고; 튜브를 교반하여 추가로 더 결정화되도록 촉진시켰다. 결정을 여과하여 수집하고, 소량의, 헵탄 중 15% EtOAc로 세척하여 흰색 결정질 고체로서 (E)-메틸 3-(4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1)(2.91 g, 69.0%)를 수득하였다. 결정화로부터의 액체, 및 다른 생성물을 함유하는 분획을 혼합하고, 증발시켰다. EtOAc/헵탄으로부터 잔류물을 재결정화시켜 흰색 결정질 고체로서 추가의 3-(4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1)(635 mg, 15.1%)를 수득하였다.

실시예 8: (E)-3-(4-(2-(2- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3,3-디메틸-2,3,4,9- 테트라하이드로 -1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산(이성질체 1)*

2 M 수산화나트륨 용액(0.782 ml, 1.56 mmol)을 메탄올(5 ml), THF(5.00 ml) 및 물(5.00 ml) 중 (E)-메틸 3-(4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1)(68 mg, 0.16 mmol)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 22℃에서 40시간 동안 교반하였다. 유기 용매 모두가 제거될 수 있도록 혼합물을 일정 부피로 농축시키고, 2 M HCl을 이용하여 pH 6으로 산성화시켰다. 진한 수성 암모니아(2 방울)를 첨가한 후, 메탄올(~2 ml)을 첨가하여 옅은 황색 용액을 수득하였다. 용리제로서 점감적으로 극성인, 물(1% NH₃ 함유) 및 MeCN의 혼합물을 이용하여 분취용 HPLC(워터스 X브릿지 프렙 C18 OBD 칼럼(Waters XBridge Prep C18 OBD column), 5 μ 실리카, 50 mm 직경, 100 mm 길이)에 의해 조 생성물을 정제하였다. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 증발 건조시켜 황색 고체로서 표제 생성물(이성질체 1)(50.0 mg, 76%)을 수득하였다.

출발 물질로서 사용된 (E)-메틸 3-(4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1)는 하기와 같이 제조하였다:-

(E)- 메틸 3- (4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필) -3,3-디메틸-2,3,4,9- 테트라하이드로 -1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1) 제조

(실시예 1, 출발 물질 제조에 기술된 바와 같이 수득된) 2-플루오로-2-메틸프로필트리플루오로메탄술포네이트(389 mg, 1.73 mmol)를 1,4-디옥산(1.25 ml) 중 (실시예 7, 출발 물질 제조에 기술된 바와 같이 수득된) (E)-메틸 3-(4-(3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(라세메이트)(250 mg, 0.69 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(0.453 ml, 2.60 mmol) 1,4-디옥산(1.25 ml)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 95℃에서 64시간 동안 교반한 후, DCM(30 ml) 및 물(30 ml) 사이에 분배하였다. 수성층을 DCM(20 ml)으로 추출하고, 추출물을 유기층과 혼합하였다. 혼합된 추출물을 상 분리 용지를 통해 여과시키고, 증발시켰다. 잔류물을 용리 용매 헵탄 중 15% EtOAc로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 베이지색 고체로서 (E)-메틸 3-(4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(라세메이트)(178 mg, 59.1%)를 수득하였다. 라세믹 생성물을 분취용 HPLC(키랄팩 AD 칼럼, 20 ㎛ 실리카, 50 mm 직경, 250 mm 길이), 헵탄:에탄올: 80:20에 의해 정제하였다. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 증발 건조시켜 (E)-메틸 3-(4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1, 맨 처음 용리, 70 mg) 및 (E)-메틸 3-(4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 2, 두번째로 용리, 66 mg)를 수득하였다.

실시예 9: (E)-3-(3- 플루오로 -4-(2-((S)-3- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산(이성질체 1)*

2 M 수산화나트륨(3.31 ml, 6.63 mmol)을 메탄올(5 ml) 및 THF(20 ml) 중 (E)-메틸 3-(3-플루오로-4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(600 mg, 1.33 mmol)(부분입체 이성질체의 혼합물)의 용액에 첨가하고, 혼합물을 주변 온도에서 4시간 동안 교반하였다. 유기 용매 모두가 제거될 수 있도록 혼합물을 일정 부피로 농축시키고, 묽은 HCl을 이용하여 pH 6으로 산성화시키고, 에틸 아세테이트(2 x 50 ml)로 추출하였다. 추출물을 혼합하고, 감압하에 증발시켰다. 잔류물을 80 ml/min으로 분취용 HPLC(키랄팩 IA 칼럼, 20 ㎛ 실리카, 20 mm 직경, 250 mm 길이), 헵탄:IPA 90:10에 의해 정제하였다. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 혼합하고, 분석하여 (E)-3-(3-플루오로-4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산(이성질체 1, 맨 처음 용리, 130 mg, 22.36%) 및 (E)-3-(3-플루오로-4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산(이성질체 2, 두번째로 용리, 30.0 mg, 5.16%)을 수득하였다.

출발 물질로서 사용된 (E)-메틸 3-(3-플루오로-4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(부분입체 이성질체의 혼합물)는 하기와 같이 제조하였다:-

(E)- 메틸 3-(3- 플루오로 -4- 포르밀페닐 ) 아크릴레이트 제조

4-브로모-2-플루오로벤즈알데히드(20.88 g, 102.87 mmol) 및 메틸 아크릴레이트(13.98 ml, 154.30 mmol)를 완전하게 탈기된 DMA(150 ml)에 용해시키고, 트리-o-톨릴포스핀(3.13 g, 10.29 mmol), 팔라듐(II) 아세테이트(1.155 g, 5.14 mmol) 및 트리에틸아민(28.7 ml, 205.74 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 교반하고, 16시간 동안 100℃로 가열하였다. 추가의 트리-o-톨릴포스핀(3.13 g, 10.29 mmol) 및 팔라듐(II) 아세테이트(1.155 g, 5.14 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 추가의 2시간 동안 110℃로 가열하였다. 물(1 L)을 첨가하고, 반응 혼합물을 DCM(2 x 500 ml)으로 추출하였다. 혼합된 유기 물질을 건조시키고(MgSO₄), 여과하고, 증발시켜 갈색 고체를 수득하였다. 조 생성물을 헵탄 중 0 내지 25% EtOAc 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 황색 고체로서 (E)-메틸 3-(3-플루오로-4-포르밀페닐)아크릴레이트(15.20 g, 71.0%)를 수득하였다.

(E)- 메틸 3-(4-(3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)-3-플루오로페닐)아크릴레이트(라세메이트) 제조

1-(1H-인돌-3-일)-2-메틸프로판-2-아민(1 g, 5.31 mmol) 및 아세트산(15 ml) 중 (E)-메틸 3-(3-플루오로-4-포르밀페닐)아크릴레이트(1.106 g, 5.31 mmol)를 질소 하에 80℃에서 2시간 동안 교반하였다. SCX-2 칼럼을 사용하여 이온 교환 크로마토그래피에 의해 조 생성물을 정제하였다. 7 M NH₃/메탄올을 사용하여 칼럼으로부터 원하는 생성물을 용리시키고, 순수한 분획을 증발 건조시켜 (E)-메틸 3-(4-(3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)-3-플루오로페닐)아크릴레이트(라세메이트)(2.,000 g, 99%)를 수득하였다.

(E)- 메틸 3-(3- 플루오로 -4-(2-((S)-3- 플루오로 -2- 메틸프로필 )-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(부분입체 이성질체의 혼합물) 제조

(실시예 3, 출발 물질 제조에 기술된 바와 같이 수득된) (S)-3-플루오로-2-메틸프로필트리플루오로메탄술포네이트(1.259 g, 5.62 mmol)를 1,4-디옥산(5 ml) 중 (E)-메틸 3-(4-(3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)-3-플루오로페닐)아크릴레이트(라세메이트)(850 mg, 2.25 mmol) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(1.467 ml, 8.42 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 4시간 동안 가열한 후, 주변 온도에서 12시간 동안 교반하였ㄷ. 혼합물을 에틸 아세테이트(25 ml) 및 물(25 ml) 사이에 분배하였다. 수성층을 에틸 아세테이트(2 x 25 ml)로 추출하고, 추출물을 유기층과 혼합하였다. 혼합된 추출물을 진공하에 증발시켰다. 잔류물을 용리 용매 헵탄 중 10% EtOAc로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 (E)-메틸 3-(3-플루오로-4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(부분입체 이성질체의 혼합물)(600 mg, 59.0%)를 수득하였다. m/z: ES+ [M+H]+ 453.

실시예 10: (E)-3-[4-[(1R,3R)-1-듀테리오-2-(2-플루오로-2-메틸-프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-1-일]-3,5-디플루오로-페닐]프로프-2-엔산

메틸 (E)-3-[4-[(1R,3R)-1-듀테리오-2-(2-플루오로-2-메틸-프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-1-일]-3,5-디플루오로-페닐]프로프-2-에노에이트(4.70 g, 10.27 mmol)를 iPrOH(42.8 ml) 중에 용해시키고, 5 M 수산화나트륨 용액(6.16 ml, 30.82 mmol)을 1회분 첨가한 후, 이어서, 반응물을 실온에서 4시간 동안 교반하였다. 물(100 ml)을 첨가하고, 2 N HCl을 첨가하여 pH를 ~5로 만들었다. 용액을 EtOAc(x2)로 추출하고, 혼합된 유기물을 건조시키고(MgSO₄), 진공에서 농축시켰다. 1차로 DCM으로, 이어서, DCM 중 5% 이하의 MeOH으로 용리시키면서, 잔류물을 실리카 플러그를 통해 여과시켰다. 생성물을 함유하는 분획을 증발시켜 황색 고체(~4.2 g)를 수득하였다. 잔류물(4.2g)을 EtOH(20 ml) 중에 용해시키고, 35℃로 가온시켰다. 물(30 ml)을 ~40 min 동안에 걸쳐 천천히 첨가하였다. 이어서, 혼합물을 또 다른 30분 동안 교반한 후, 실온으로 천천히 냉각시켰다. 추가의 물(30 ml)을 첨가한 후, 반응물을 0℃로 냉각시켰다. 혼합물을 여과하고, 고체를 물로 세척한 후, 진공하에 35℃에서 밤새도록 건조시켜 옅은 황색 고체로서 (E)-3-[4-[(1R,3R)-1-듀테리오-2-(2-플루오로-2-메틸-프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-1-일]-3,5-디플루오로-페닐]프로프-2-엔산(3.34 g, 73.3%)을 수득하였다.

별법으로 상기 화합물은 (E)-3-[4-[(1R,3R)-1-듀테리오-2-(2-플루오로-2-메틸-프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-1-일]-3,5-디플루오로-페닐]아크릴산으로 명명될 수 있다.

(4- 브로모 -2,6- 디플루오로 -페닐)- 디듀테리오 -메탄올 제조

리튬 보로듀테라이드(0.497 g, 17.25 mmol)를 THF(46.0 ml) 중 메틸 4-브로모-2,6-디플루오로벤조에이트(2.89 g, 11.5 mmol)의 용액에 소량씩 첨가하였다. 반응물을 2시간 동안 50℃로 가열하였다. 냉각시킨 후, (30 ml) 2 N HCl을 조심스럽게 첨가하였다. 층을 분리하고, 수성물을 EtOAc(2x50 ml)로 추출하였다. 혼합된 유기물을 염수로 세척하고, 건조시키고(MgSO₄), 농축시켜 흰색 고체로서 (4-브로모-2,6-디플루오로-페닐)-디듀테리오-메탄올(2.250 g, 87%)을 수득하였다.

4- 브로모 -2,6- 디플루오로 -1- 듀테로벤즈알데히드 제조

실온에서 데스 마틴(Dess-Martin) 시약(4.98 g, 11.73 mmol)을 DCM(39.1 ml) 중 (4-브로모-2,6-디플루오로-페닐)-디듀테리오-메탄올(2.20 g, 9.78 mmol)에 첨가하였다. 반응물을 1시간 동안 교반한 후, 10% 티오황산나트륨을 함유하는 (50 ml) sat. NaHCO₃을 첨가하여 켄칭시켰다. 층을 분리하고, 수성 상을 DCM(2x50 ml)으로 추출하였다. 유기물을 건조시키고(MgSO₄), 농축시키고, 조 생성물을 헵탄 중 0 내지 25% EtOAc 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 흰색 고체로서 4-브로모-2,6-디플루오로-1-듀테로벤즈알데히드(2.040 g, 94%)를 수득하였다.

메틸 (E)-3-(4- 듀테리오카보닐 -3,5- 디플루오로 -페닐) 프로프 -2- 에노에이트 제조

4-브로모-2,6-디플루오로-1-듀테로벤즈알데히드(3.33 g, 15.0 mmol), 트리에틸아민(4.18 ml, 30.00 mmol), 팔라듐(II) 아세테이트(0.168 g, 0.75 mmol) 및 트리톨릴포스핀(0.457 g, 1.50 mmol)을 탈기된 DMF(36.6 ml) 중에 용해시켰다. 이어서, 메틸 아크릴레이트(2.026 ml, 22.50 mmol)를 첨가하고, 반응물을 4시간 동안 80℃로 가열하였다. 냉각시킨 후, 혼합물을 물(150 ml)에 첨가하고, EtOAc(2 x 150 ml)로 추출하였다. 혼합된 유기물을 2 N HCl(100 ml), 이어서, 염수(100 ml)로 세척한 후, 건조시키고(MgSO4) 농축시켰다. 조 생성물을 헵탄 중 0 내지 40% EtOAc 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 황색 고체로서 메틸 (E)-3-(4-듀테리오카보닐-3,5-디플루오로-페닐)프로프-2-에노에이트(2.93 g, 86%)를 수득하였다.

(R)-N-(1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)-2-플루오로-2-메틸프로판-1-아민

(2R)-1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-아민(3.81 kg, 21.21 moles)을 질소 대기 하에 100 L 유리 라이닝된 재킷이 부착된 베쓸에 첨가하였다. 1,4-디옥산(23 L)을 첨가하고, 교반기 스위치를 켰다. 디이소프로필에틸아민(5.55 L; 31.82 moles)을 교반된 현탁액에 첨가한 후, (2-플루오로-2-메틸-프로필)트리플루오로메탄술포네이트(5.55 kg, 23.77 moles)를 첨가하였다. 1,4-디옥산(4 L)을 베쓸에 첨가하고, 혼합물을 75℃로 가열하였다. 24시간 동안 계속해서 가열한 후, 혼합물을 25℃로 냉각시켰다. 물(30.5 L)을 베쓸에 첨가한 후, 톨루엔(30.5 L)을 첨가하였다. 40분 후, 교반기 스위치를 끄고, 층을 분리시켰다. 수성층을 제거하고, 물(30.5 L)을 유기 용액에 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 교반시킨 후, 층을 분리시켰다. 수성층을 베쓸로부터 제거하였다. 대략 27 L의 증류액이 제거될 때까지 진공 증류(재킷 온도 65℃, 110 mbar 압력)에 의해 유기 용액을 농축시켰다. 베쓸 중 남은 용액을 냉각시켜 톨루엔 중 용액으로서 (R)-N-(1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)-2-플루오로-2-메틸프로판-1-아민(33% w/w)(15.4 Kg, 97%)을 수득하였다.

메틸 (E)-3-[4-[(1R,3R)-1-듀테리오-2-(2-플루오로-2-메틸-프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-1-일]-3,5-디플루오로-페닐]프로프-2-에노에이트 제조

(R)-N-(1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)-2-플루오로-2-메틸프로판-1-아민[톨루엔 중 33% w/w](11.26 g, 14.97 mmol) 및 (E)-3-(4-듀테리오카보닐-3,5-디플루오로-페닐)프로프-2-에노에이트(3.40 g, 14.97 mmol)를 톨루엔(55.6 ml)/아세트산(4.28 ml, 74.83 mmol) 중에서 80℃에서 5 hr 동안 가열하였다. 냉각시킨 후, 진공하에서 휘발성 물질을 제거하였다. 잔류물을 DCM(200 ml) 중에 용해시키고, sat. NaHCO₃ 용액(200 ml)으로 세척하였다. 수성 상을 DCM(100 ml)으로 추출한 후, 혼합된 유기물을 염수로 세척하고, 건조시키고, 진공에서 농축시켰다. 조 물질을 SCX-2 칼럼에 로딩하고, 메탄올로 용리시키면서 비반응 알데히드를 제거하였다. 이어서, 칼럼을 7 M NH₃-MeOH로 용리시켜 생성물을 유리시켰다. 염기성 여액을 증발시키고, 조 생성물을 헵탄 중 0 내지 40% EtOAc 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 옅은 황색 고체로서 메틸 (E)-3-[4-[(1R,3R)-1-듀테리오-2-(2-플루오로-2-메틸-프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-1-일]-3,5-디플루오로-페닐]프로프-2-에노에이트(4.70 g, 68.6%)를 수득하였다.

실시예 11: ( 1R,3R )-1-{4-[(E)-2- 카복시에테닐 ]-2,6- 디플루오로페닐 }-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-베타-카볼린-2-이움 말 레에이트 제조

아세톤(15 ml) 중 말레산(1.31 g, 11.29 mmol)의 용액을 질소 하에 교반하였다. 아세톤(25 ml) 중 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산 (실시예 1)(5.00 g, 11.3 mmol)의 용액을 말레산 용액에 첨가하여 황색 용액을 수득하였다. 반응 베쓸을 호일로 덮어 빛으로부터 보호하고, 용매가 증발될 때까지 밤새도록 질소 가스 스트림으로 퍼지시켰다. 고체를 수득하고, 이를 2시간 동안 진공에서 건조시켜 크림색 고체로서 표제 화합물(6.23 g, 98%)을 수득하였다.

상기 말레에이트 염의 XRPD 트레이스는 도 8에 제시되어 있고, DSC 트레이스는 도 9에 제시되어 있다.

실시예 12

습식 과립화 방법을 사용하여 75 g 규모로 실시예 1의 예시적인 조성물을 제조하였다. 활성 성분, 만닛톨, 미세결정질 셀룰로스 및 소듐 전분 글리콜레이트의 하기 표에 작성된 양으로 측량하고, 디오스나(Diosna) P1-6혼합기-과립기로 옮기고, 600 rpm으로 6분 동안 (절단하면서) 혼합하였다. 조성물 A의 경우, 분취물 사이의 혼합을 중지시키면서 초당 대략 1 mL의 비율로 두 분취물에 30 mL 물을 첨가하면서 계속해서 혼합한 반면, 조성물 B의 경우에는, 필요한 양의 EDTA를 교반하여 용액을 제조하고, 유사한 방법을 사용하여 (빛으로부터의 보호하에) 50℃에서 20분 동안 20 mL 물과 함께 아스코르브산을 첨가하였고, 본 경우에서 제2 분취물은 대략 10 mL의 세정액을 포함하였다. 총 1.5분 동안 계속해서 습식 혼합을 수행하였다. 1.5 mm 스크린을 통해 습식 과립을 통과시킨 후, 수분 함량이 < 2% w/w가 될 때까지 진공하에 50 - 60℃에서 건조시켰다. 1 mm 스크린을 사용하여 생성된 과립을 밀링한 후, 터블러(Turbula) 블렌더를 이용하여 32 rpm으로 5분 동안 윤활제와 함께 혼합하였다. 6 mm 일반 오목 공구가 장착된 리바 미니-프레스(Riva Mini-press)를 사용하여 과립을 공칭 100 mg 압착 중량으로 압착시킴으로써 10 mg의 활성 성분을 함유하는 정제를 제조하였다.

하기 표로 작성된 바와 같이, 감응 실링된 75 cc HDPE 병에 패킹되거나, 또는 페트리 접시에서 대기에 노출되고, 조절된 온도 및 습도하에 암실에서 보관된, 정제에 대하여 분해물 형성(여기서,"분해물"은 (R,E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-2-이움-1-일)페닐)아크릴레이트를 의미한다)과 관련하여 조성물 A 및 B의 안정성을 평가하였다. 킬레이팅제 및 항산화제, 둘 모두를 함유하는 조성물 B가 표준 정제 제제인 조성물 A보다 화학적 분배에 대하여 더 안정적이라는 것은 자명하다.

실시예 13: (E)-3-[3,5-디플루오로-4-[(3R)-2-(2-플루오로-2-메틸-프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-2-이움-1-일]페닐]프로프-2-에노에이트

실온에서 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산(200 mg, 0.45 mmol)을 아세토니트릴(6 ml)/물(1.500 ml) 중 세륨 암모늄 니트레이트의 용액에 첨가하였다. 반응물을 2 hr 동안 교반하고, 추가의 세륨 암모늄 니트레이트(248 mg, 0.45 mmol)를 첨가하였다. 용액을 25℃에서 추가로 15분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 2 M HCl(3 ml)로 산성화시키고, DCM(2x10 ml)으로 추출하였다. 이어서, 유기물을 진공에서 농축시키고, 용리제로서 점감적으로 극성인, 물(0.1% 포름산 함유) 및 MeCN의 혼합물을 이용하여 분취용 HPLC(워터스 선파이어 칼럼, 5 μ 실리카, 50 mm 직경, 100 mm 길이)에 의해 조 생성물을 정제하였다. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 증발 건조시켜 오렌지색 유리로서 (R,E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-2-이움-1-일)페닐)아크릴레이트(35.0 mg, 17.58%)를 수득하였다.

(E)-3-[3,5- 디플루오로 -4-[2-(2- 플루오로 -2- 메틸 -프로필)-3- 메틸 -9H- 피리도[ 3,4-b]인돌-2-이움-1-일]페닐]프로프-2-에노에이트 제조

(E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산(0.500 g, 1.13 mmol)을 DMSO(10 mL) 중에 용해시키고, 대기 및 빛 존재 하에 16 h 동안 120℃로 가열하였다. 이어서, 반응물을 2.5 h 동안 180℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 냉각시키고, 용리제로서 점감적으로 극성인, 물(1% NH₃ 함유) 및 MeCN의 혼합물을 이용하여 분취용 HPLC(워터스 X브릿지 프렙 C18 OBD 칼럼, 5 μ 실리카, 50 mm 직경, 100 mm 길이)에 의해 정제하였다. 원하는 화합물을 함유하는 분획을 증발 건조시켜 오렌지색 고체로서 (E)-3-[3,5-디플루오로-4-[2-(2-플루오로-2-메틸-프로필)-3-메틸-9H-피리도[3,4-b]인돌-2-이움-1-일]페닐]프로프-2-에노에이트(0.047 g, 9.40%)를 수득하였다.

실시예 14A: (E)-3-[3,5-디플루오로-4-[(1R,3R)-2-(2-플루오로-3-하이드록시-2-메틸-프로필)-3-메틸-1,3,4,9-테트라하이드로피리도[3,4-b]인돌-1-일]페닐]프로프-2-엔산(이성질체 1) 제조

2 M 수산화나트륨(1.27 mL, 2.54 mmol)을 THF(0.635 mL)/메탄올(0.635 mL) 중 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-3-하이드록시-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트 - 이성질체 1(120 mg, 0.25 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1 h 동안 교반한 후, EtOAc 및 물로 희석시켰다. 2 M HCl을 첨가하여 수성물을 pH 6으로 조정하고, 층을 분리시켰다. 수성층을 EtOAc로 추출한 후, 혼합된 유기물을 건조시키고(MgSO₄), 진공에서 농축시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0 내지 10% MeOH 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 베이지색 고체로서 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-3-하이드록시-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산 - 이성질체 1(85 mg, 72.9%)을 수득하였다.

실시예 14B: (E)-3-[3,5-디플루오로-4-[(1R,3R)-2-(2-플루오로-3-하이드록시-2-메틸-프로필)-3-메틸-1,3,4,9-테트라하이드로피리도[3,4-b]인돌-1-일]페닐]프로프-2-엔산(이성질체 2) 제조

2 M 수산화나트륨(1.27 mL, 2.54 mmol)을 THF(0.529 mL)/메탄올(0.529 mL) 중 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-3-하이드록시-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트 - 이성질체 2(110 mg, 0.23 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1 h 동안 교반한 후, EtOAc 및 물로 희석시켰다. 2 M HCl을 첨가하여 수성물을 pH 6으로 조정하고, 층을 분리시켰다. 수성층을 EtOAc로 추출한 후, 혼합된 유기물을 건조시키고(MgSO₄), 진공에서 농축시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0 내지 10% MeOH 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 베이지색 고체로서 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-3-하이드록시-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산 - 이성질체 2(81 mg, 76%)를 수득하였다.

출발 물질로서 사용된 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-3-하이드록시-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1 및 2)를 하기와 같이 제조하였다:-

2-플루오로-2-메틸프로판-1,3-디올

LiAlH₄(0.741 g, 19.25 mmol)를 THF(35.0 ml) 중 디에틸 2-플루오로-2-메틸말로네이트(1.345 g, 7.00 mmol)의 냉각된 용액에 소량씩 첨가하였다. 반응물을 1 h 동안에 걸쳐 실온으로 가온시켰다. 0℃로 냉각시킨 후, 물(0.75 mL), 15% NaOH (0.75 mL), 이어서, 물(1.5 mL)을 첨가하여 반응물을 켄칭시켰다. 현탁액을 30 min 동안 교반한 후, 여과하고, 고체를 THF로 세척하였다. 여액을 증발시켜 무색 오일로서 2-플루오로-2-메틸프로판-1,3-디올(0.745 g, 98%)을 수득하였다.

3-(((R)-1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)아미노)-2- 플루오로 -2- 메틸프로판 -1- ol

트리플루오로메탄술폰산 무수물(1.151 ml, 6.80 mmol)을 0℃에서 DCM(17.85 ml) 중 2-플루오로-2-메틸프로판-1,3-디올(0.70 g, 6.47 mmol)의 용액에 첨가한 후, 2,6-루티딘(0.908 ml, 7.77 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 30 min 동안에 걸쳐 실온으로 가온시킨 후, 2 M HCl로 세척하였다. 유기상을 상 분리기 카트리지를 통해 통과시키고, 진공에서 농축시켰다. 잔류물을 디옥산(12 mL) 중에 용해시킨 후, (R)-1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-아민(1.128 g, 6.47 mmol) 및 DIPEA(1.678 ml, 9.71 mmol)를 첨가하고, 반응물을 2 h 동안 90℃로 가열하였다. 냉각시킨 후, 반응물을 DCM으로 희석시키고, 물로 세척하였다. 수성물을 DCM으로 추출한 후, 유기물을 진공에서 농축시켰다. 조 생성물을 DCM 중 0 내지 10% MeOH 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 갈색 검으로서 3-(((R)-1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)아미노)-2-플루오로-2-메틸프로판-1-올(0.815 g, 47.6%)을 수득하였다. m/z (ES+), [M+H]+ = 265.

(E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-3-하이드록시-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1 및 2)

(E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-포르밀페닐)아크릴레이트(565 mg, 2.50 mmol)를 톨루엔(11.3 ml)/아세트산(1.25 ml) 중 3-(((R)-1-(1H-인돌-3-일)프로판-2-일)아미노)-2-플루오로-2-메틸프로판-1-올(661 mg, 2.50 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 반응물을 5 h 동안 90℃로 가열하였다. 냉각시킨 후, 진공하에서 휘발성 물질을 제거한 후, 잔류물을 SCX-2 칼럼을 통해 통과시키고, 메탄올로 용리시키면서 비반응 알데히드를 제거하였다. 이어서, 칼럼을 NH₃/MeOH로 용리시켜 생성물을 유리시켰다. 염기성 여액을 증발시킨 후, 이어서, 조 생성물을 헵탄 중 0 내지 50% EtOAc 용리 구배로 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 황색 고체로서 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-3-하이드록시-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 1 - 122 mg, 10.3%) 및 황색/오렌지색 고체로서 (E)-메틸 3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-3-하이드록시-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴레이트(이성질체 2 - 129 mg, 11%)를 수득하였다.

참조 실시예 1: 1-(4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1-에틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-일)-3-하이드록시프로판-1-온

피리딘 4-메틸벤젠술포네이트(11.62 g, 46.24 mmol)를 질소 하에 메탄올(1 L) 중 1-(4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1-에틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-일)-3-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)프로판-1-온(128 g, 231.19 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 5분 경과 후 혼합물은 가용성이었다. 혼합물을 밤새도록 50℃에서 유지시켰고, 그 시간 동안 침전물이 형성되었다. 고체 물질을 여과에 의해 분리시키고, 물 및 아세토니트릴로 세척하였다. 상기 물질은 이전 단계로부터 소량의 불순물을 여전히 함유하였고, 추가 정제를 필요로 하였다. 물질을 디클로로메탄 중에 용해시키고, 실리카 겔 상에서 플래쉬 크로마토그래피(0% 메탄올/DCM　내지 10% 메탄올/DCM)에 의해 정제하였다. 이로써, 원하는 생성물인 1-(4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1-에틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-일)-3-하이드록시프로판-1-온(참조 실시예 1)(92 g, 85%)을 크림색 고체(A형)로서 단리시켰다:

1-(4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1-에틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-일)-3-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)프로판-1-온은 하기와 같이 제조하였다:

1,8-디아자비사이클로[5.4.0]운덱-7-엔(76 mL, 511.14 mmol)을 2-메틸 THF(1.2 L) 중 tert-부틸 4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-카복실레이트(150 g, 319.46 mmol)의 현탁액에 첨가하였다. 요오도에탄(46 mL, 575.03 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 35℃에서 16시간 동안 교반하였다. 추가의 요오도에탄(46 mL, 575.03 mmol)　및 1,8-디아자비사이클로[5.4.0]운덱-7-엔(76 mL, 511.14 mmol)을 첨가하고, 35℃에서 24시간 동안 계속해서 교반하였다. 혼합물을 물에 붓고, 불용성 물질을 여과에 의해 분리시키고, 물 및 MTBE로 세척하고, 진공에서 건조시켜 황색 고체로서 tert-부틸 4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1-에틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-카복실레이트(116 g, 73.0%)를 수득하였다.　여액을 DCM으로 추출하고, 유기 용액을 황산 마그네슘으로 건조시키고, 여과시키고, 감압하에서 농축시켰다. 잔류물을 구배 용리(30% MTBE/헵탄　내지 100% MTBE)를 사용하여 실리카 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 이로써, 원하는 생성물의 2차 수확물(12 g, 24.12 mmol, 7.55%)을 황색　고체로서 단리시키고, 이후 1차 수확물과 함께 혼합하였다.

DCM(9 L) 중의 tert-부틸 4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1-에틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-카복실레이트(3,009.5 g, 6.05 mol)의 현탁액을 N₂하에서 5-10℃로 냉각시켰다. 온도를 30℃로 유지시키면서, TFA(9 L)를 상기 현탁액에 소량씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1h 동안 교반하였다. 혼합물을 농축시키고, 생성된 잔류물을 물(30 L) 중에 용해시키고, 0-5℃에서 35% 수성 암모니아 용액(12 L)에 천천히 첨가하였다. 현탁액을 30 min 동안 교반한 후, 생성물을 여과하고, 물(2 x 6L)로 세척하였다. 생성물을 진공하에 50℃에서 2일 동안 건조시켜 3-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-5-(1-에틸-3-(피페리딘-4-일)-1H-1,2,4-트리아졸-5-일)피라진-2-아민(2,496 g)을 수득하였다:

질소 하에 RT에서 THF(552 mL) 중 3-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시) 프로판산(HATU, 48.80 g, 0.2774 mol) 및 N-에틸-N-이소프로필프로판-2-아민(86.96 mL, 0.4993 mol)의 용액에 O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(115.73 g, 0.3051 mol)를 소량씩 첨가하였다. 생성된 혼합물을 20 min 동안 교반한 후, 3-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-5-(1-에틸-3-(피페리딘-4-일)-1H-1,2,4-트리아졸-5-일)피라진-2-아민(122.5 g (110.25 g 활성), 0.2774 mol)을 1 h 동안에 걸쳐 소량씩 첨가하였다. 3.5 h 후, 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 실온에서 15 min 동안 MeCN(275 mL) 중에서 슬러리화시켰다. 생성물을 여과시키고, MeCN(3 x 110 mL)으로 세척하고, 진공하에 50℃에서 밤새도록 건조시켰다. 이를 통해 1-(4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1-에틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-일)-3-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)프로판-1-온(131.9 g, 96%)을 수득하였다.

참조 실시예 1의 대체 제조법

N2하에 메탄올(1045 mL) 중 1-(4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1-에틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-일)-3-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)프로판-1-온(131.9 g, 0.2382 mol)의 현탁액에 피리디늄 p-톨루엔술포네이트(11.97 g, 47.7 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃에서 5.5 h 동안, 이어서, 50℃에서 밤새도록 교반하였다. 반응 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 고체를 여과시켰다. 생성물을 실온에서 20 min 동안 물(250 mL) 중에서 슬러리화시키고, 여과시키고, 물(3x40 mL)로 세척하고, 진공하에 50℃에서 건조시켰다. 이를 통해 A형으로서 1-(4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1-에틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-일)-3-하이드록시프로판-1-온(21.4 g)을 수득하였다(하기 참조).

메탄올 액체를 농축시키고, 생성된 고체를 실온에서 20 min 동안 물(0.6 L) 중에서 슬러리화시켰다. 고체를 여과에 의해 분리시키고, 물(3x100 mL)로 세척하였다. 필터 케이크를 추가로 20분 동안 물(0.5 L) 중에서 2차로 재차 슬러리화시켰다. 생성물을 여과에 의해 분리시켰다, 물(100 mL)로 세척하고, 진공하에 50℃에서 건조시켰다. 이를 통해 A형으로서 81.9 g 1-(4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1-에틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-일)-3-하이드록시프로판-1-온(81.9g)을 수득하였다.

두 수확물 모두를 혼합하고(103.3 g), B형(16.68 g)을 시딩하고, 실온에서 밤새도록 MeCN(826 mL) 중에서 슬러리화시켰다. 이를 통해 옅은 황색 고체로서 117.4 g의 1-(4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1-에틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-일)-3-하이드록시프로판-1-온(117.4g), B형(하기 참조)을 수득하였다. 1시간 동안 헵탄(7.5 rel vols) 중에서 슬러리화시켜 상기 물질을 추가로 정제하였다. 혼합물을 여과시키고, 필터 상에서 건조시키고, 진공 오븐에서 50℃에서 밤새도록 건조시켜 B형으로서 1-(4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1-에틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-일)-3-하이드록시프로판-1-온(102.5g)을 수득하였다.

B형은 또한 시딩하지 않고, MeCN 중에서 A형을 슬러리화시킴으로써 제조될 수 있다.

A형 또는 B형은 또한 하기와 같이 C형으로 전환될 수 있다:

고체가 용해될 때까지, IPA(12 vol) 중 1-(4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1-에틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-일)-3-하이드록시프로판-1-온(예컨대, 상기에 개요된 방법에 의해 제조된 B형)의 현탁액을 환류 가열시켰다. 용액을 열 여과시킨 후, 실온으로 냉각시켰다. 이를 통해 옅은 황색 고체로서 C형인 1-(4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1-에틸-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-일)-3-하이드록시프로판-1-온(99.3g, 97%)을 수득하였다.

C형은 또한 하기와 같이 B형으로 전환될 수 있다:

10 L 플랜지 플라스크에서, MIBK(7,900 mL) 중 C형(377.8 g, 1회분)을 110-115℃로 가열하여 용액을 수득하였다. 용액을 97-103℃로 냉각시키고, -15℃에서 교반시키면서, 아세토니트릴(8,220 mL) 중 B형 시드(0.8 g)를 함유하는 50 L 베쓸 내로 즉시 연마 여과시켰다. 첨가하는 동안, 재킷 냉각에 의해 50 L 베쓸 온도를 -15 내지 25℃ 사이로 유지시켰다. MIBK 중에 용해된 화합물 추가의 3회 분량을 유사한 방법에 의해 첨가하였다. 생성된 슬러리에 B형 시드(0.8 g)를 첨가한 후, 혼합물을 10-20℃에서 밤새도록 교반하였다. 제조 중 분석 결과, 원하는 형태(B형)에서는 C형 또는 비정질이 관찰되지 않았다는 것을 확인할 수 있었다. 혼합물을 여과하고, 아세토니트릴(3,340 mL)로 세척하였다. 항량을 수득할 때까지 고체를 2일 동안 오븐 건조시켰다(분말, 및 크기가 ~1 mm 내지 ~3-4 mm인 작은 덩어리의 혼합물로 건조시키는 동안 고체는 분해되었다). 수율 =1,532.8 g(93.5%)

3-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)프로판산은 하기와 같이 제조하였다:

질소 하에 0℃에서 메탄올(2.4 L)　및 진한 황산(44.4 mL, 832.61 mmol)의 교반된 용액에 베타-프로피오락톤(175 mL, 2.78 mol)을 적가하였다. 상기 용액을 실온에서 2일 동안 교반시켰다. 반응 혼합물을 10℃로 냉각시킨 후, 중탄산나트륨(145 g, 1.72 mol)을 소량씩 첨가하고, 생성된 현탁액을 실온에서 75분 동안 교반하였다. 상기 용액을 여과시키고, 필터 케이크를 메탄올(800 mL)로 세척하였다. 여액을 증발시켜 오일을 수득하고, 이를 디클로로메탄(1.2 L) 중에 다시 용해시키고, 60분 동안 교반한 후, 다시 여과시켰다. 상기 용액을 여과시킨 후, 증발시켜 오일로서, 메틸 3-하이드록시프로파노에이트(219 g, 76%)를 수득하였다.

피리디늄 p-톨루엔술포네이트(7.65 g, 30.45 mmol)를 질소 하에 실온에서 디클로로메탄(650 mL)　중 메틸 3-하이드록시프로파노에이트(63.4 g, 609.00 mmol)　및 3,4-디하이드로-2H-피란(78 mL, 852.60 mmol)의 투명 용액에 첨가하여 혼탁한 용액을 수득하였다. 이를 실온에서 밤새도록 교반시켰다. 반응 혼합물을 물(250 mL) 및 염수(250 mL)로 세척한 후, 건조시키고(MgSO₄), 증발시켜 오일을 수득하였다. 상기 조 생성물을 헵탄 중 15　내지 30% EtOAc 용리 구배로 플래쉬 실리카　크로마토그래피에 의해 정제하였다. 순수한 분획을 증발 건조시켜 무색　오일로서 메틸 3-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)프로파노에이트(67.7 g, 59.0%)를 수득하였다:

수산화나트륨(2 M, 349 mL, 697.58 mmol)을 실온에서 THF(680 mL)　중 메틸 3-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)프로파노에이트(67.68 g, 359.58 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. THF를 진공에서 제거한 후, 수성층을 에틸 아세테이트(260 mL)로 세척한 후, 0℃로 냉각시키고, 염산(2 M)을 첨가함으로써 pH 5로 주의하여 산성화시켰다. 생성물을 에틸 아세테이트(3 x 250 mL)로 추출한 후, 건조시키고(MgSO₄), 증발시켜 투명 오일로서 3-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)프로판산(57.0 g, 91%)을 수득하였다. 상기 물질을 에틸 아세테이트(750 mL) 중에 용해시킨 후, 물(3 x 250 mL) 및 염수(250 mL)로 세척하여 남은 아세트산을 제거하였다. 유기 용액을 건조시키고(MgSO₄), 증발시켜 무색 오일로서 3-(테트라하이드로-2H-피란-2-일옥시)프로판산(45.67g, 72.9%)을 수득하였다:

tert-부틸 4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-카복실레이트는 하기와 같이 제조하였다:

하이드라진 수화물(23.59 mL, 480.75 mmol)을 EtOH(2 L) 중 메틸 3-아미노-6-브로모피라진-2-카복실레이트(100 g, 418.04 mmol)의 교반된 호합물에 적가하였다. 혼합물을 질소 하에 50℃에서 가열하였다. 생성된 진한 현탁액을 50℃에서 16시간 동안 교반하였다. 추가의 하이드라진(2.5 mL)을 1회분 추가하고, 현탁액을 50℃에서 추가의 24시간 동안 교반하였다. 에탄올(500 mL)을 상기 진한 반응 혼합물에 충전시키고, 혼합물을 실온으로 냉각시켰다. 생성된 현탁액을 여과하고, 고체를 에탄올(1 L)로 세척하고, 진공에서 건조시켜 크림색 고체로서 3-아미노-6-브로모피라진-2-카보히드라지드(98 g, 정량)를 수득하였다:

피발산 무수물(165 mL, 815.38 mmol)을 아세토니트릴(1.8 L) 중 3-아미노-6-브로모피라진-2-카보히드라지드(172 g, 741.26 mmol)의 교반된 혼합물에 첨가하고, 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 가열하였다. 반응물을 16시간 동안 교반하였다. 필요한 황색 고체 물질을 여과에 의해 분리시켰다.　여액을 EtOAc(2 L) 및 수성 중탄산나트륨(2 L) 사이에 분배하였다. 유기층을 포화 염수로 세척하고, MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 용액을 여과하고, 농축시켜 오렌지색 점성 고체를 수득하고, 이를 MTBE(250 mL)로 연마시켰다. 불용성 황색 고체를 여과에 의해 분리시키고, 상기 물질은 제1 고체와 동일한 것으로 나타났다. 혼합된 고체를 진공 오븐에서 50℃에서 3일 동안 건조시켜 황색 고체로서 3-아미노-6-브로모-N'-피발로일피라진-2-카보히드라지드(224 g, 96%)를 수득하였다:

50℃에서 30 min인 기간에 걸쳐 MeCN(10.8 L) 중 3-아미노-6-브로모-N'-피발로일피라진-2-카보히드라지드(2,301 g, 7.28 mol)에 DIPEA(3.044 L, 17.48 mol) 및 p-톨루엔술포닐 클로라이드(1,665 g, 8.73 mol)를 소량씩(~280 g x 6) 첨가하였다. 첨가 속도를 조절함으로써 반응 온도를 65-70℃로 유지시켰다. 첨가 종료 후, 반응 혼합물을 70℃에서 1 h 동안 교반하였다. 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 5% NaHCO₃(수성, 24.2 L)로 켄칭시켰다. 생성된 현탁액을 30 min 동안 교반한 후, 여과시켰다. 생성물을 물(14.8 L)로 세척하고, 50℃에서 16 h 동안 건조시켰다. 생성물을 DCM(12 L) 중에 용해시키고, 상을 분리시켰다. 유기상을 실리카 패드(6 kg) 상에 로딩하고, 생성물을 20% EtOAc/DCM(8 x 10 L)로 용리시켰다. 생성물을 함유하는 분획을 농축시키고, 5-브로모-3-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-아민(36 g, 17%)의 HPLC에 의해 99.8% 순도의 1,987 g(92% 수율)을 수득하였다:

질소 가스 스트림을 20분 동안 DMA(1.2 L) 중 5-브로모-3-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-아민(89.35 g, 239.75 mmol) 용액을 통해 통과시켰다. 디사이클로헥실(2',4',6'-트리이소프로필비페닐-2-일)포스핀(11.43 g, 23.98 mmol), 　트리스(디벤질리덴아세톤)디팔라듐(0)(5.49 g, 5.99 mmol), 아연(1.568 g, 23.98 mmol)　및 디시아노아연(16.89 g, 143.85 mmol)을 연속하여 교반된 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 100℃로 가열하고, 1시간 동안 교반하였다. 혼합물을 냉각시키고, DCM(3 L) 및 물(1 L) 사이에 분배하였다. 　검은색 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 유기층을 분리하였다. 용액을 물, 이어서, 염수로 세척하였다. 용액을 황산 마그네슘으로 건조시키고, 감압하에서 농축시켰다. 잔류물을 MTBE로 연마시키고, 여과에 의해 분리시키고, MTBE로 세척하였다. 필터 케이크를 진공에서 건조시켜 옅은 오렌지색 고체로서 5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-카보니트릴(55.7 g, 95%)을 수득하였다:

하이드라진 수화물(82 mL, 1.69 mol)을 IPA(200 mL) 중 5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-카보니트릴(55 g, 225.18 mmol)에 첨가하고, 혼합물을 질소 하에 50℃에서 16시간 동안 가열하였다. 혼합물을 얼음 배쓰에서 냉각시켰다. 생성된 침전물을 여과에 의해 수집하고, IPA 및 디에틸 에테르로 세척하고, 항량을 수득할 때까지 건조시켜 황색 고체로서 (Z)-5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-카보하이드라존아미드(49.2 g, 79%)를 수득하였다:

O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(74.3 g, 195.44 mmol)를 DMA(800 mL) 중 N-BOC-이소니페코트산(41.1 g, 179.15 mmol)　및 4-메틸모르폴린(35.9 mL, 325.74 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 10분 동안 교반한 후, (Z)-5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-카보하이드라존아미드(45 g, 162.87 mmol)를 1회분 상기 용액에 첨가하였다(22℃에서 27℃로의 발열 반응이 관찰되었다). 수분 경과 후, 반응 혼합물로부터 생성물이 결정화되었다. 반응 혼합물을 베쓸로부터 제거하고, 소결체를 통해 여과하였다. 추가의 DMA를 첨가하여 베쓸(150 mL) 측면으로부터 생성물을 세척하고, 이를 필터 케이크에 부었다. 이소프로판올(600 mL)을 베쓸에 첨가하고, 왕성한 교반을 사용하여 베쓸 중 생성물 잔류물을 상기 용매 중에 현탁시켰다. 일단 흡입에 의해 DMA를 제거하고 나면, 이소프로판올 현탁액을 사용하여 필터 케이크를 세척하였다. 필터 케이크를 흡인 건조시킨 후, MTBE로 세척하고, 다시 한번 흡인 건조시켰다. 필터 케이크를 진공에서 건조시켜 황색 고체로서 (Z)-tert-부틸 4-(2-(아미노(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)메틸렌)하이드라진카보닐)피페리딘-1-카복실레이트(76 g, 95%)를 수득하였다:

대체 제조법에서, N-BOC-이소니페코트산은 하기와 같이 계내에서 제조될 수 있다:

이소니페코트산(858g, 3.74 mol)을 DMA(25.3 L) 중에 용해시키고, 4-메틸모르폴린(393 mL, 3.74 mol)을 첨가하였다. 5 min 동안 교반시키고, 이소부틸 클로로포름에이트(489 mL, 3.74 mol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 2 h 동안 교반하고, 15℃로 냉각시킨 후, (Z)-5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-카보하이드라존아미드(940 g, 3.4 mol)를 10 min 동안에 걸쳐 소량씩 첨가하였다. 반응 혼합물을 15℃에서 1-2 h 동안 교반하였다. 물(20.5 L)을 1 h 동안에 걸쳐 소량씩 첨가하고, 추가로 1 h 동안 교반한 후, 여과하였다. 이어서, 필터 케이크를 물(4 x 4 L)로 세척하고, 필터 상에서 건조시키고, 건조될 때까지 진공 오븐에서 50℃에서 건조시켜 원하는 생성물을 수득하였다.

3 L의 고정된 이중 재킷이 부착된 베쓸 중 디옥산(500 mL)에 아세트산(200 mL)을 첨가하고, 질소 하에 용액을 70℃로 가열하였다. (Z)-tert-부틸 4-(2-(아미노(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)메틸렌)하이드라진카보닐)-피페리딘-1-카복실레이트(74.5 g, 152.80 mmol)를 가온 혼합물에 소량씩 첨가하였다. 10분 후, 온도를 100℃로 승온시켰다(약간 환류). 반응 혼합물을 100℃에서 1.5시간 동안 교반하고(현탁시키고), 이어서, 80℃에서 밤새도록 유지시켰다(밤새도록 유지된 후 용액이 형성되었다). 생성된 용액을 감압하에 농축시킨 후, 톨루엔으로 희석시키고, 증발 건조시키고, 톨루엔으로 용해시키고, 다시 농축시켰다. 남은 오일을 약간의 에틸 아세테이트와 혼합하고, 농축 건조시켰다. 용액으로부터 고체가 결정화되었고, 이를 MTBE(200 mL)로 연마하고, 여과에 의해 분리하였다. 필터 케이크를 물 및 MTBE로 세척하여 회색 고체로서 tert-부틸 4-(5-(5-아미노-6-(5-tert-부틸-1,3,4-옥사디아졸-2-일)피라진-2-일)-1H-1,2,4-트리아졸-3-일)피페리딘-1-카복실레이트(50 g, 70%)를 수득하였다.

여액을 감압하에 농축시켜 황색 고체를 수득하였다. 상기 물질을 MTBE로 연마하고, 여과하였다. 필터 케이크를 에틸 아세테이트, 및 이어서, MTBE로 세척하여 옅은 황색 고체로서 2차 수확물(4.93g, 7%)을 수득하였다. 상기 물질은 1차 수확물과 동일하였다:

Claims

하기 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:

상기 식에서,
R¹ 및 R²는 각각 독립적으로 H 또는 F이고;
R³은 H 또는 메틸이고;
a) R⁴는 H이고, R⁵는 F이거나; 또는
b) R⁴는 F이고, R⁵는 H이다.
제1항에 있어서, 화합물이 하기 화학식(IA)의 화합물인 것인, 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염:

.
제1항 또는 제2항에 있어서, R³이 수소인 것인, 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
제1항 또는 제2항에 있어서, R³이 메틸인 것인, 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R⁴가 수소이고, R⁵가 플루오로인 것인, 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R⁵가 수소이고, R⁴가 플루오로인 것인, 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
제1항에 있어서, 화합물이
(E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;
(E)-3-(4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;
(E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;
(E)-3-(4-((1R,3R)-2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;
(E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;
(E)-3-(3,5-디플루오로-4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;
(E)-3-(4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;
(E)-3-(4-(2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산;
(E)-3-(3-플루오로-4-(2-((S)-3-플루오로-2-메틸프로필)-3,3-디메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산; 및
(E)-3-[4-[(1R,3R)-1-듀테리오-2-(2-플루오로-2-메틸-프로필)-3-메틸-4,9-디하이드로-3H-피리도[3,4-b]인돌-1-일]-3,5-디플루오로-페닐]프로프-2-엔산으로부터 선택되는 것인, 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
제7항에 있어서, (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산인 것인, 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
실질적으로 도 2에 제시된 바와 같은 XRPD를 가지는 결정질 형태의 화합물 (E)-3-(3,5-디플루오로-4-((1R,3R)-2-(2-플루오로-2-메틸프로필)-3-메틸-2,3,4,9-테트라하이드로-1H-피리도[3,4-b]인돌-1-일)페닐)아크릴산.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 온혈 동물, 예컨대, 인간에서의 암 예방 또는 치료에 사용하기 위한 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 유방암 또는 부인과 암 치료에 사용하기 위한 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염.
암 예방 또는 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에게 유효량의, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 청구된 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 투여하는 단계를 포함하는, 암 예방 또는 치료를 필요로 하는 온혈 동물, 예컨대, 인간에서 암을 예방 또는 치료하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 청구된 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 및 약학적으로 허용되는 희석제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물.
제14항에 있어서, 화학식(I)의 화합물이 제8항 또는 제9항에 따른 화합물이고, 여기서, 조성물이 항산화제를 추가로 포함하고, 임의적으로 금속 킬레이팅제를 추가로 포함하는 것인 약학 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에서 청구된 화학식(I)의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염, 및 또 다른 항종양제를 포함하는, 암 치료에 사용하는 데 적합한 조합물.