TWI653235B - 作為抗癌劑之吲哚衍生物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於式(I)化合物
或其醫藥學上可接受之鹽，其中R1至R5具有以下說明書中所定義之任一含義；其製備方法；含有其之醫藥組合物；及其用於治療細胞增殖性病症之用途。

Description

作為抗癌劑之吲哚衍生物
本發明係關於某些新穎吲哚衍生物或其醫藥學上可接受之鹽，其具有抗癌活性且因此潛在地適用於治療人類或動物體之方法中。本發明亦關於製造該等吲哚衍生物之方法、含有其之醫藥組合物，及其用於治療方法中之用途，例如用於製造用以預防或治療溫血動物(諸如人類)之癌症的藥劑，包括用於預防或治療癌症。
本發明亦關於作為雌激素受體之選擇性向下調節劑的吲哚衍生物。
雌激素受體α(ERα、ESR1、NR3A)及雌激素受體β(ERβ、ESR2、NR3b)為類固醇激素受體，其為核受體大家族之成員。與所有核受體結構類似，ERa係由六個功能域(稱為A至F)組成(Dahlman-Wright，等人，Pharmacol.Rev.,2006,58：773-781)且歸類為配位體依賴性轉錄因子，原因在於其與特定配位體(雌性類固醇激素17b雌二醇(E2))結合之後，複合物結合至基因組序列(稱為雌激素受體元件(ERE))且與共調節劑相互作用以調節目標基因之轉錄。ERα基因位於6q25.1上且編碼595AA蛋白且由於替代性拼接及轉譯起始位點而可產生多種同功異型物。除DNA結合域(C域)及配位體結合域(E域)之外，受體亦含有N末端(A/B)域、使C域與E域連接的鉸鏈(D)域及C末端延伸部分(F域)。雖然ERa及ERb之C域及E域相當保守(胺基酸一致性分別為96%及55%)，但A/B、D及F域的保守性不良(胺基酸一致性低於30%)。兩種受體均參與雌性生殖道之調節及發育且另外在中樞神經 系統、心血管系統中及在骨骼代謝中起作用。當受體直接(直接活化或經典路徑)或間接(間接活化或非經典路徑)結合ERE時，ER基因組在細胞核中起作用。配位體不存在時，ER與熱休克蛋白Hsp90及Hsp70結合，且所結合之伴隨蛋白機構使配位體結合域(LBD)穩定化，從而使其可接近配位體。結合配位體的ER與熱休克蛋白分離，引起受體發生構型變化，從而允許發生二聚合、DNA結合、與共活化劑或共抑制劑之相互作用及目標基因表現之調節。在非經典路徑中，AP-1及Sp-1為受體之兩種同功異型物用於調節基因表現的替代調節性DNA序列。在此實例中，ER不直接與DNA相互作用，而是經由與其他DNA結合轉錄因子(例如c-Jun或c-Fos)結合而相互作用(Kushner等人，Pure Applied Chemistry 2003,75：1757-1769)。ER藉以影響基因轉錄的準確機制不詳，但似乎由結合DNA之受體所募集之多種核因子介導。共調節劑之募集主要由分別位於E域及A/B域中的兩種蛋白表面AF2及AF1介導。AF1由生長因子調節且其活性取決於細胞及啟動子環境，而AF2的活性完全依賴於配位體結合。雖然兩個域可獨立地起作用，但最大ER轉錄活性係經由兩個域的協同性相互作用達成(Tzukerman，等人，Mol.Endocrinology,1994,8：21-30)。雖然ER被視為轉錄因子，但其亦可經由非基因組機制起作用，如E2投與之後組織中的快速ER作用(依對於基因組作用視為過快的時間標度)所證明。仍不清楚導致雌激素之快速作用的受體為相同核ER抑或不同G蛋白偶合類固醇受體(Warner，等人，Steroids 2006 71：91-95)，但已鑑別出愈來愈多的E2誘導路徑，例如MAPK/ERK路徑及內皮氧化氮合成酶活化及PI3K/Akt路徑。除配位體依賴性路徑之外，ERα已顯示可經由AF-1具有配位體非依賴性活性，AF-1與經由生長因子(例如胰島素樣生長因子1(IGF-1)及表皮生長因子(EGF))信號傳導刺激MAPK有關。AF-1活性取決於Ser118之磷酸化且ER與生長因子信號傳導之間的串音實例為 MAPK回應於諸如IGF-1及EGF之生長因子而使Ser 118磷酸化(Kato，等人，Science,1995,270：1491-1494)。
多種不同結構化合物已顯示可結合至ER。一些化合物(諸如內源性配位體E2)充當受體促效劑，而其他化合物競爭性抑制E2結合且充當受體拮抗劑。此等化合物根據其功能性作用可分成2類。選擇性雌激素受體調節劑(SERM)(諸如他莫昔芬(tamoxifen))能夠同時充當受體促效劑與拮抗劑，此取決於細胞及啟動子環境以及所靶向之ER同功異型物。舉例而言，他莫昔芬在乳房中充當拮抗劑，但在骨骼、心血管系統及子宮中充當部分促效劑。所有SERM似乎均可充當AF2拮抗劑且經由AF1衍生出其部分促效劑特徵。第二組(氟維司群(fulvestrant)為一實例)歸類為完全拮抗劑且能夠阻斷雌激素活性，該阻斷係經由誘導配位體結合域(LBD)在化合物結合時之獨特構形變化來完全抑制AF1及AF2域，，由此完全消除LBD之螺旋12與其餘部分之間的相互作用，從而阻斷輔因子募集來實現(Wakeling，等人，Cancer Res.,1991,51：3867-3873；Pike，等人，Structure,2001,9：145-153)。
在E2存在下，細胞內ERα含量經由泛素/蛋白酶體(Ub/26S)路徑而受到下調。結合配位體之ERα之聚泛素化係藉由至少三種酶催化；經泛素活化酶E1活化之泛素藉由E2、藉由E3泛素連接酶、經由異肽鍵而與離胺酸殘基結合且聚泛素化ERα接著靶向蛋白酶體用於降解。雖然ER依賴性轉錄調節與蛋白酶體介導之ER降解有關(Lonard，等人，Mol.Cell,2000 5：939-948)，但轉錄本身並非ERα降解所必需的且轉錄起始複合物之組合體足以靶向ERα用於核蛋白酶體降解。此E2誘導降解過程咸信為其能夠回應於細胞增殖、分化及代謝之需要而快速活化轉錄所必需的(Stenoien，等人，Mol.Cell Biol.,2001,21：4404-4412)。氟維司群亦歸類為選擇性雌激素受體向下調節劑(SERD)，此 調節劑為亦可經由26S蛋白酶體路徑誘導ERα快速下調之拮抗劑子類。相比之下，諸如他莫昔芬之SERM可使ERα含量增加，但對轉錄的作用類似於SERD所經歷之作用。
約70%乳癌表現ER及/或孕激素受體，此表示此等腫瘤細胞之生長具有激素依賴性。其他癌症(諸如卵巢及子宮內膜癌)的生長亦認為是依賴於ERα信號傳導。此等患者之療法可如下抑制ER信號傳導：拮抗配位體結合至ER，例如在絕經前與絕經後背景下，他莫昔芬用於治療早期及晚期ER陽性乳癌；拮抗及下調ERα，例如氟維司群用於治療儘管已用他莫昔芬或芳香酶抑制劑治療但進展之婦女乳癌；或阻斷雌激素合成，例如芳香酶抑制劑用於治療早期及晚期ER陽性乳癌。 雖然此等療法已對乳癌治療產生非常積極的影響，但腫瘤表現ER的大量患者對現有ER療法顯示原發抗性或隨著時間流逝而對此等療法發展抗性。可解釋針對第一次他莫昔芬療法之抗性的若干不同機制已有描述，其主要包括充當拮抗劑之他莫昔芬轉換為促效劑，此轉換係經由某些輔因子結合至他莫昔芬-ERα複合物之較低親和力被此等輔因子之過度表現所彌補，或經由形成第二位點，此等第二位點促進他莫昔芬-ERα複合物與通常不結合至該複合物之輔因子相互作用。抗性因此可作為表現特定輔因子之細胞的增生結果而產生，此等特定輔因子驅動他莫昔芬-ERα活性。亦有可能的是，其他生長因子信號傳導路徑直接活化ER受體或共活化劑以驅動獨立於配位體信號傳導的細胞增殖。
最近，已在轉移性ER陽性患者源腫瘤樣品及患者源異種移植模型(PDX)中鑑別出ESR1中之突變為可能的抗性機制，此等突變之頻率為17%至25%不等。此等突變主要(然而並非排他地)存在於配位體結合域中，從而引起功能蛋白突變；胺基酸變異之實例包括Ser463Pro、Val543Glu、Leu536Arg、Tyr537Ser、Tyr537Asn及 Asp538Gly，其中位於胺基酸537及538之變異在當前所述之變異中佔大多數。先前在癌症基因組圖譜資料庫(Cancer Genome Atlas database)之來自原發乳癌樣品之特徵化基因組中尚未偵測到此等突變。在對ER表現呈陽性的390個原發乳癌樣品中，未偵測到ESR1中存在單一突變(Cancer Genome Atlas Network,2012 Nature 490：61-70)。 配位體結合域突變被認為已發展成為針對芳香酶抑制劑內分泌療法的抗性反應，因為此等突變型受體在雌二醇不存在時顯示基底轉錄活性。胺基酸537及538突變之ER晶體結構顯示，兩種突變型藉由轉換螺旋12之位置而促成促效劑構形，以允許共活化劑募集，從而模擬促效劑活化之野生型ER。公開資料已顯示，內分泌療法，諸如他莫昔芬及氟維司群，仍可結合至ER突變體且在某種程度上抑制轉錄性活化，且氟維司群能夠使Try537Ser降解，但受體完全抑制可能需要較高劑量(Toy等人，Nat.Genetics 2013,45：1439-1445；Robinson等人，Nat.Genetics 2013,45：144601451；Li,S.等人Cell Rep.4,1116-1130(2013)。因此可能的是，雖然此階段不知ESR1突變是否與改變的臨床結果有關，但式(I)之某些化合物或其醫藥學上可接受之鹽能夠下調且拮抗突變型ER。
不管以何種抗性機制或機制組合發生，多者仍取決於ER依賴性活性且經由SERD機制移除受體可提供自細胞移除ERα受體的最佳方式。氟維司群為當前唯一獲准臨床使用的SERD，儘管其存在力學特性，但該藥物之藥理學特性已限制其功效，原因在於當前存在每月500mg劑量限制，與活體外乳房細胞株實驗中所見之受體完全下調相比，此限制導致患者樣品中之受體的小於50%轉換率(Wardell，等人，Biochem.Pharm.,2011,82：122-130)。因此，需要新潁的ER靶向藥劑，其具有所必需的醫藥特性及SERD機制，以在早期、轉移性及後天抗性背景下提供增強的益處。
已發現本發明化合物具有強抗腫瘤活性，適用於抑制起因於惡性病的不可控細胞增殖。本發明化合物藉由至少充當SERD而提供抗腫瘤作用。
根據本發明之一個態樣，提供一種式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽
其中：R1及R2各獨立地為H或F；R3為氫或甲基；a)R4為H且R5為氟；或b)R4為氟且R5為H。
在本發明之另一個態樣中，提供如上文定義的式(I)化合物。
式(I)化合物具有一、兩或三個對掌性中心且本發明包涵純對掌性形式或其任何比例之混合物。光學活性形式可藉由此項技術中熟知的標準有機化學技術合成，例如用光學活性起始物質合成或解析外消旋形式。類似地，上述活性可使用標準實驗室技術評估。
本文所述化合物之特定對映異構體或非對映異構體的活性可大於相同化合物之其他對映異構體或非對映異構體。
根據本發明之另一態樣，提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其為對映異構體過量95、98%或99%的單一對映異構體。單一對映異構體宜以99%之對映異構體過量(% ee)存在。
根據本發明之另一態樣，提供醫藥組合物，其包含以95、98%或99%之對映異構體過量(% ee)存在之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，以及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。單一對映異構體宜以99%之對映異構體過量(% ee)存在。
在一個特定態樣中，式(I)化合物為式(IA)化合物：
在另一個態樣中，式(I)化合物為式(IB)化合物：
除非另有說明，否則本文中提及式(I)化合物應理解為提及式(IA)及/或(IB)化合物。
一些式(I)化合物可為晶體且可具有超過一種晶形。應瞭解，本發明包涵任何晶形或非晶形，或其混合物，此形式具有適用於SERD活性的特性，此項技術中已熟知如何藉由下文中所述的標準測試測定晶形或非晶形對於SERD活性的功效。
通常已知可使用習知技術分析晶體材料，諸如X射線粉末繞射 (下文中稱XRPD)分析、差示掃描量熱法(下文中稱DSC)、熱解重量分析(下文中稱TGA)、漫反射紅外傅里葉轉換(Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform，DRIFT)光譜學、近紅外(NIR)光譜學、溶液及/或固態核磁共振譜法。此等晶體材料之水含量可藉由卡爾-費歇爾分析(Karl Fischer analysis)測定。
舉例而言，實例7之化合物展現結晶性且已鑑別出一種晶形。
因此，本發明之另一態樣為(E)-3-(4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸之形式A(實例7)。
根據本發明之另一態樣，提供實例7之晶形：形式A，其具有其中至少一個特定峰位於約2θ=4.5的X射線粉末繞射圖案。
根據本發明之另一態樣，提供實例7之晶形：形式A，其具有其中至少一個特定峰位於約2θ=10.8的X射線粉末繞射圖案。
根據本發明之另一態樣，提供實例7之晶形：形式A，其具有其中至少兩個特定峰位於約2θ=4.5及10.8的X射線粉末繞射圖案。
根據本發明之另一態樣，提供實例7之晶形：形式A，其具有其中特定峰位於約2θ=4.5、4.8、6.1、7.9、9.9、10.8、13.4、14.0、14.3及18.5的X射線粉末繞射圖案。
根據本發明，提供實例7之晶形：形式A，其具有與圖1所示之X射線粉末繞射圖案實質上相同的X射線粉末繞射圖案。
此外，實例1亦顯示結晶性。
根據本發明，提供(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸之晶形：形式B，其具有其中至少一個特定峰位於約2θ=8.4°的X射線粉末繞射圖案。
根據本發明，提供(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙 基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸之晶形：形式B，其具有其中至少一個特定峰位於約2θ=10.9°的X射線粉末繞射圖案。
根據本發明，提供(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸之晶形：形式B，其具有其中至少兩個特定峰位於約2θ=8.4°及10.9°的X射線粉末繞射圖案。
根據本發明，提供(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸之晶形：形式B，其具有其中特定峰位於約2θ=8.4、10.9、18.3、24.0、14.0、19.0、14.4、13.0、15.3、20.6°。
根據本發明，提供(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸之晶形：形式B，其具有與圖2所示之X射線粉末繞射圖案實質上相同的X射線粉末繞射圖案。
根據本發明，提供(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸之晶形：形式B，其具有其中至少一個特定峰位於2θ=8.4°加或減0.2° 2θ的X射線粉末繞射圖案。
根據本發明，提供(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸之晶形：形式B，其具有其中至少一個特定峰位於2θ=10.9°加或減0.2° 2θ的X射線粉末繞射圖案。
根據本發明，提供(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸之晶形：形式B，其具有其中至少兩個特定峰位於2θ=8.4°及10.9°的X射線 粉末繞射圖案，其中該等值可加或減0.2° 2θ。
根據本發明，提供(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸之晶形：形式B，其具有其中特定峰位於2θ=8.4、10.9、18.3、24.0、14.0、19.0、14.4、13.0、15.3、20.6°的X射線粉末繞射圖案，其中該等值可加或減0.2° 2θ。
當稱本發明係關於實例1之晶形：形式B時，結晶度宜大於約60%、更宜大於約80%，較佳大於約90%且更佳大於約95%。結晶度最佳大於約98%。
此外，當稱本發明係關於實例1之晶形：形式B時，該物質較佳實質上不含其他晶形或非晶形物質。「實質上不含」意謂單一多晶形物宜大於約60%，更宜大於約80%，較佳大於約90%，更佳大於約95%且最佳大於約98%。
應瞭解，X射線粉末繞射圖案之2θ值可因量測機器不同或因樣品不同而稍微變化，且因此所列值不視為絕對的。
已知所得X射線粉末繞射圖案可具有一或多個量測誤差，此視量測條件(諸如所用設備或機器)而定。特定而言，通常已知X射線粉末繞射圖案中之強度可根據量測條件而波動。因此，應瞭解，除非另有說明，否則本發明之上述晶形不限於X射線粉末繞射圖案與相關圖中所示之X射線粉末繞射圖案相同的晶體，且X射線粉末繞射圖案與此等圖中所示實質上相同的任何晶體屬於本發明範疇內。熟習X射線粉末繞射技術者能夠判斷X射線粉末繞射圖案之實質性身分。
熟習X射線粉末繞射技術者亦認識到，相對峰強度可受例如尺寸超過30微米且具有非單一縱橫比的晶粒影響，此可能影響樣品之分析。熟習此項技術者亦認識到，反射位置可受樣品置放於繞射儀中之準確高度及繞射儀之零點校準的影響。樣品之表面平坦度亦可具有較 小的影響。因此，所呈現之繞射圖案資料不視為絕對值(參見Jenkins,R及Snyder,R.L.『Introduction to X-Ray Powder Diffractometry』John Wiley & Sons 1996；Bunn,C.W.(1948),Chemical Crystallography,Clarendon Press,London；Klug,H.P.及Alexander,L.E.(1974),X-Ray Diffraction Procedures)。
一般而言，X射線粉末繞射圖中繞射角之量測誤差為約加或減0.2° 2θ，且在考慮X射線粉末繞射資料時，應考慮此量測誤差度。此外，應瞭解強度可根據實驗條件及樣品製備(較佳取向)而波動。
本發明之特定化合物為各實例，其各提供本發明之另一獨立態樣。本發明之其他特定化合物為各實例之醫藥學上可接受之鹽，其各提供本發明之另一獨立態樣。
根據本發明之另一態樣，提供式(I)化合物，其可依循如本文所揭示之任一實例獲得。
另一特徵為本文定義之任一範疇，限制條件為特定實例(諸如實例1、2、3等)個別地放棄權益。
熟習此項技術者將瞭解，某些式(I)化合物含有經不對稱取代之碳原子，且因此可以光學活性形式及外消旋形式存在及分離。一些式(I)化合物可展現多晶型。應瞭解，本發明包涵任何外消旋、光學活性、多晶或立體異構形式，或其混合物，此形式具有適用作SERD的特性，在此項技術中已熟知如何製備光學活性形式(例如藉由再結晶技術解析外消旋形式、用光學活性起始物質合成、對掌性合成、酶促解析、生物轉化，或利用對掌性固定相進行層析分離)及如何藉由下文中所述的標準測試測定作為SERD的功效。
應瞭解，上文定義的某些式(I)化合物可展現互變異構現象。應瞭解，本發明在其定義中包括任何此互變異構形式或其混合物，其具有SERD活性且不僅僅限於式圖內所利用或實例中所提及之任一種互 變異構形式。一般而言，任何此等互變異構形式中僅一種提及於下文實例中或呈現於下文任何有關式圖中。
本發明意欲包括存在於本發明化合物中之原子的所有同位素。 應瞭解同位素包括具有相同原子序數、但不同質量數的彼等原子。舉例而言，氫同位素包括氚及氘。碳同位素包括13C及14C。實例1之氘化型式描述於實例10中。
式(I)化合物之適合醫藥學上可接受之鹽為例如鹼金屬或鹼土金屬鹽，諸如鈉、鈣或鎂鹽，或銨鹽，或與有機鹼(諸如甲胺、二甲胺、三甲胺、哌啶、嗎啉或三(2-羥基乙基)胺)所形成之鹽。
式(I)化合物之其他適合醫藥學上可接受之鹽可為其他金屬鹽，諸如鉀、鋅或此項技術中已知的其他此等金屬陽離子。式(I)化合物之另一適合醫藥學上可接受之鹽為例如在式(I)化合物投與之後在人體或動物體內形成的鹽。
式(I)化合物之適合醫藥學上可接受之鹽亦可為例如式(I)化合物之酸加成鹽，例如與強無機或有機酸(諸如鹽酸、氫溴酸、硫酸或三氟乙酸)形成的酸加成鹽。式(I)化合物之其他潛在的適合醫藥學上可接受之鹽亦可如下文實例1所述。
考察形成式(I)化合物之鹽的實驗檢查實例1((E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸)形成晶體鹽的潛力。試驗以下酸及鹼：
乙酸、己二酸、苯磺酸、苯甲酸、肉桂酸、檸檬酸、D,L-乳酸、乙烷二磺酸、乙烷磺酸、反丁烯二酸、鹽酸、L-酒石酸、順丁烯二酸、蘋果酸、丙二酸、甲烷磺酸、萘二磺酸、磷酸、糖精、丁二酸、硫酸、甲苯磺酸、乙酸鈣、二乙胺、乙醇胺、乙二胺、羥乙基吡咯啶、乙酸鎂、葡甲胺、哌嗪、氫氧化鉀、氫氧化鈉、第三丁基胺、三乙醇胺、參(羥甲基)胺基甲烷(Tris)及N,N-二乙基乙醇胺。
在上述酸及鹼中，在所用實驗條件下，可分離的固體鹽並非總是可以或不可以晶形獲得。實例1之較佳鹽包括可以晶形分離的彼等物，例如苯磺酸鹽(benzene sulfonic acid salt/besylate salt)、丁二酸鹽(succinic acid salt/succinate salt)及順丁烯二酸鹽(maleic acid salt/maleate salt)。
在一個態樣中，實例1之適合鹽可包括苯磺酸鹽、丁二酸鹽及順丁烯二酸鹽。在另一個態樣中，實例1之適合鹽可為順丁烯二酸鹽，其描述於實例11中。
更應瞭解，式(I)化合物之適合醫藥學上可接受之共晶體亦形成本發明之一態樣。為避免疑問，術語共晶體(co-crystal/cocrystal)係指多組分系統，其中存在一或多種主體API(活性醫藥成分)分子及一或多種客體(或共形成劑)分子。在共晶體中，API分子與客體(或共形成者)分子以其純形式(為了區分共晶體與溶劑合物或水合物)單獨存在時，在室溫下呈固體狀。此特定定義不包括其中API分子與客體分子之間存在明顯或完全質子交換的鹽。在共晶體中，API與共形成劑分子藉由氫鍵鍵結及可能的其他非共價相互作用來發生相互作用。醫藥學上可接受之共形成劑包括中性分子，諸如菸醯胺、間苯二酚及二甲酚；以及可離子化分子，諸如草酸、3,5-二羥基苯甲酸及異喹啉(質子交換程度決定是否形成鹽或共晶體)。可注意到共晶體自身可形成溶劑合物，包括水合物。
更應瞭解，式(I)化合物之適合醫藥學上可接受之溶劑合物亦形成本發明之一態樣。適合醫藥學上可接受之溶劑合物為例如水合物，諸如半水合物、單水合物、二水合物或三水合物或其替代量。
更應瞭解，式(I)化合物之適合醫藥學上可接受之前藥亦形成本發明之一態樣。因此，本發明化合物可以前藥形式投與，前藥為在人體或動物體內分解而釋放本發明化合物的化合物。前藥可用於改變本 發明化合物之物理特性及/或藥物動力學特性。當本發明化合物含有可與特性修改基團連接的適合基團或取代基時，可形成前藥。前藥實例包括活體內可分裂酯衍生物，其可在式(I)化合物之羧基處形成。
因此，本發明包括如上文中定義的式(I)之彼等化合物，其可藉由有機合成獲得且可在人體或動物體內經由其前藥分裂而獲得。因此，本發明包括藉由有機合成方式產生的式(I)之彼等化合物；以及在人體或動物體內經由前驅化合物代謝而產生的此等化合物，亦即式(I)化合物可為以合成方式產生的化合物或以代謝方式產生的化合物。
式(I)化合物之適合醫藥學上可接受之前藥為根據合理醫學判斷而適於投與人體或動物體而無不良藥理學活性且無不當毒性的化合物。
前藥之各種形式已描述於例如以下文件中：a)Methods in Enzymology，第42卷，第309-396頁，K.Widder，等人編(Academic Press,1985)；b)Design of Pro-drugs,H.Bundgaard編(Elsevier,1985)；c)A Textbook of Drug Design and Development,Krogsgaard-Larsen及H.Bundgaard編，第5章"Design and Application of Pro-drugs",H.Bundgaard第113-191頁(1991)；d)H.Bundgaard,Advanced Drug Delivery Reviews,8,1-38(1992)；e)H.Bundgaard，等人，Journal of Pharmaceutical Sciences,77,285(1988)；f)N.Kakeya，等人，Chem.Pharm.Bull.,32,692(1984)；g)T.Higuchi及V.Stella,"Pro-Drugs as Novel Delivery Systems",A.C.S.Symposium Series，第14頁；及h)E.Roche(編者),"Bioreversible Carriers in Drug Design", Pergamon Press,1987.
具有羧基之式I化合物的適合醫藥學上可接受之前藥為例如其活體內可分裂酯。含有羧基之式I化合物之活體內可分裂酯為例如醫藥學上可接受之酯，其在人體或動物體中分裂而產生親本酸。對於羧基之適合醫藥學上可接受之酯包括(1-6C)烷基酯，諸如甲基、乙基及第三丁基酯；(1-6C)烷氧基甲基酯，諸如甲氧基甲基酯；(1-6C)烷醯氧基甲基酯，諸如特戊醯氧甲基；3-酞基酯；(3-8C)環烷基羰基氧基-(1-6C)烷基酯，諸如環戊基羰基氧基甲基及1-環己基羰基氧基乙基酯、2-側氧基-1,3-二氧雜環戊烯基甲基酯(諸如5-甲基-2-側氧基-1,3-二氧雜環戊烯基-4-基甲基酯)；及(1-6C)烷氧基羰基氧基-(1-6C)烷基酯，諸如甲氧基羰基氧基甲基及1-甲氧基羰基氧基乙基酯。
具有羧基之式I化合物之適合醫藥學上可接受之前藥為例如活體內可分裂醯胺，諸如N-C1-6烷基及N,N-二-(C1-6烷基)醯胺，諸如N-甲基、N-乙基、N-丙基、N,N-二甲基、N-乙基-N-甲基或N,N-二乙基醯胺。
式(I)化合物之活體內作用可部分地藉由一或多種代謝物發揮，此等代謝物係在式(I)化合物投與之後在人體或動物體內形成。如上文中所述，式(I)化合物之活體內作用亦可經由前驅化合物(前藥)之代謝發揮。
如下文所示，已利用活體外人類系統鑑別出實例1之兩種異構體代謝物(其中由於標有*之碳存在兩種組態，因此異構體為非對映異構體)，且兩種異構體之合成陳述於本文實例14A及14B中。
另外，咸信以下化合物在一些物種中(諸如在小鼠中)為活性代謝物：
此等活性代謝物形成本發明之其他獨立態樣。
為避免疑問，應瞭解在本說明書中，在基團由「上文中定義」或「定義於上文中」限定之情況下，該基團包涵最先出現之最寬廣定義，以及針對該基團之各個及所有特定定義。
本發明之特定新穎化合物包括例如式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其中除非另有說明，否則R1及R2各具有上文中或以下陳述中所定義之任何含義：在一個態樣中，R1為氫。在另一個態樣中，R1為氟。
在一個態樣中，R2為氫。在另一個態樣中，R2為氟。
在一個態樣中，R1與R2為氫。在另一個態樣中，R1與R2為氟。在另一個態樣中，R1為氫且R2為氟。
在一個態樣中，R3為氫。在另一個態樣中，R3為甲基。
在一個態樣中，R4為氫且R5為氟。在另一個態樣中，R5為氫且R4為氟。
本發明之特定化合物為例如下文所述之實例中所揭示的式(I)化合物。
舉例而言，本發明之特定化合物為選自以下任一者的式(I)化合物：(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸；(E)-3-(4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸；(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸；(E)-3-(4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸；(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)；(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)；(E)-3-(4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)；(E)-3-(4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)；(E)-3-(3-氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)；或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明之另一種特定化合物為選自以下任一者的式(I)化合物：(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸； (E)-3-(4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸；(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸；(E)-3-(4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸；(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)；(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)；(E)-3-(4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)；(E)-3-(4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)；(E)-3-(3-氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)；及(E)-3-[4-[(1R,3R)-1-氘代-2-(2-氟-2-甲基-丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基]-3,5-二氟-苯基]丙-2-烯酸；或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明之特定醫藥學上可接受之鹽為順丁烯二酸(1R,3R)-1-{4-[(E)-2-羧基乙烯基]-2,6-二氟苯基}-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-β-咔啉-2-鎓鹽。
本發明之另一態樣提供一種製備式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的方法。適合方法以以下代表性方法變化形式說明之，除非另有說明，否則其中R1至R5具有上文中定義的任何含義。必需的起始物質可藉由標準有機化學程序獲得。此等起始物質之製備結合以下代表 性方法變化形式及隨附實例加以描述。或者，必需的起始物質可藉由與所說明類似的程序獲得，此在有機化學工作者之普通技能範圍內。
式(I)化合物宜由式(II)之酯衍生物水解而製得，其中R6為(1-6C)烷基，諸如甲基。水解宜在適合溶劑(諸如THF及MeOH水溶液)中，在適合溫度(宜為室溫)下，在鹼(諸如使用氫氧化鈉)存在下進行。
式(II)化合物可例如如下製備：a)使式(III)化合物與(IV)化合物在此項技術中已知適於皮克-斯彭勒反應(Pictet-Spengler reaction)的條件下(諸如在酸(諸如乙酸)存在下及在適合溶劑(例如甲苯)中及在適合溫度(諸如80℃)下)反應；或
b)使式(V)化合物與式(VI)化合物(其中LG為此項技術中已知的離去基團，諸如鹵化物或三氟甲烷磺酸酯(三氟甲磺酸酯)，宜為三氟甲磺酸酯)在鹼(例如胺鹼，諸如N-乙基-N-異丙基丙-2-胺)及適合極性溶劑(諸如二噁烷)存在下、在適合溫度(諸如室溫至90℃)下反應。
式(III)化合物可由式(VII)化合物與式(VI)化合物在上文針對式(V)與(VI)之化合物反應所述的條件下反應而製備。
式(IV)化合物可由式(VIII)化合物與丙烯酸烷酯(諸如丙烯酸甲酯，此時R6為甲基在此項技術中已知用於黑克反應(Heck reaction)的條件下反應而製備；亦即在芳基膦(例如三-鄰甲苯基膦)、鈀催化劑(諸如乙酸鈀(II)及鹼(諸如三乙胺)存在下、在適合溶劑(諸如DMA)中、在適合溫度(環境地質學80℃)下反應而製備。
式(V)化合物可由式(VII)化合物與式(IV)化合物在與上文針對式(III)與(IV)之化合物反應所述類似的條件下反應而製備。
其中LG為三氟甲磺酸酯的式(VI)化合物可如下文流程1及2所示製備。其中LG不為三氟甲磺酸酯的其他式(VI)化合物可藉由此項技術中已知的類似方法製備。
流程1
步驟1：氟化劑，例如N,N-二乙基-1,1,2,3,3,3-六氟丙-1-胺/DCM/RT，接著還原劑，例如氫化鋁鋰/THF/RT
步驟2：三氟甲烷磺酸酐/鹼，例如2,6-二甲基吡啶/DCM/0℃。
流程2
步驟1：還原劑，例如氫化鋁鋰/乙醚/0℃
步驟2：三氟甲烷磺酸酐/鹼，例如2,6-二甲基吡啶/DCM/-10℃。
式(I)化合物具對掌性。熟習此項技術者將瞭解，可利用立體選擇性反應獲得所要異構體。或者，立體化學可藉由適合方式調整，諸如經由使具有經保護之胺基的中間物酸化而使順式異構體差向異構化變成反式異構體，如本文實例4中所說明(及例如J.Org.Chem.2009,74,2771-2779中所述)。
在本發明之另一態樣中，提供一種製備式(I)化合物的方法，包含使式(II)化合物水解，宜在鹼存在下水解。
應瞭解，上述方法變化形式中之製程步驟亦可存在其他排列。
應瞭解，必要時，藉由上文中所述任何方法獲得的任何式(I)化合物可轉化為另一種式(I)化合物。
需要式(I)化合物之醫藥學上可接受之鹽時，其可由例如該化合物與適合鹼之反應獲得。
需要式(I)化合物之醫藥學上可接受之前藥時，其可使用習知程序獲得。舉例而言，式(I)化合物之活體內可分裂酯可例如如下獲得： 使含有羧基的式(I)化合物與醫藥學上可接受之醇反應。關於前藥之其他資訊已提供於上文中。
亦應瞭解，在上文中提及的一些反應中，保護化合物中之任何敏感基團可為必需的或合乎需要的。保護必需或合乎需要的情況及適用於保護的方法已為熟習此項技術者所知。習知保護基可根據標準實務使用(欲知說明，參見T.W.Green,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley and Sons,1991)。因此，若反應物包括諸如胺基、羧基或羥基之基團，則保護本文提及之一些反應中的基團可為合乎需要的。
適用於胺基或烷基胺基的保護基為例如醯基，例如烷醯基，諸如乙醯基、烷氧羰基(例如甲氧羰基)、乙氧羰基或第三丁氧羰基、芳基甲氧羰基(例如苯甲氧羰基)或芳醯基，例如苯甲醯基。脫除上述保護基的條件必需根據保護基之選擇而變。因此，例如，醯基(諸如烷醯基或烷氧羰基或芳醯基)可例如藉由適合鹼(諸如鹼金屬氫氧化物，例如氫氧化鋰或氫氧化鈉)水解來移除。或者，諸如第三丁氧羰基之醯基可例如藉由適合酸(如鹽酸、硫酸或磷酸或三氟乙酸)處理來移除，且芳基甲氧羰基(諸如苯甲氧羰基)可例如藉由催化劑(碳載鈀)氫化或藉由路易斯酸(Lewis acid)(例如參(三氟乙酸硼))處理來移除。適用於一級胺基的替代保護基為例如鄰苯二甲醯基，其可藉由烷基胺(例如二甲基胺基丙基胺)或肼處理來移除。
適用於羥基的保護基為例如醯基，例如烷醯基(諸如乙醯基)、芳醯基(例如苯甲醯基)，或芳基甲基，例如苯甲基。脫除上述保護基的條件必需根據保護基之選擇而變。因此，例如，醯基(諸如烷醯基或芳醯基)可例如藉由適合鹼(諸如鹼金屬氫氧化物，例如氫氧化鋰或氫氧化鈉)水解來移除。或者，諸如苯甲基之芳基甲基可例如藉由催化劑(諸如碳載鈀)氫化來移除。
適用於羧基的保護基為例如酯化基團，例如甲基或乙基，其可例如藉由鹼(諸如氫氧化鈉)水解來移除；或例如第三丁基，其可例如藉由酸(例如有機酸，諸如三氟乙酸)處理來移除；或例如苯甲基，其可例如藉由催化劑(諸如碳載鈀)氫化來移除。
保護基可使用化學技術中熟知的習知技術、在合成中的任何適宜階段移除。
本文定義之某些中間物(例如式II、III、IV、V、VI、VII及VIII之化合物，特別是式II、III及/或V之化合物)為新穎的且此等中間物作為本發明之另一特徵而提供。
生物學分析
以下分析用於量測本發明化合物之作用。
ERα結合分析
在競爭分析中使用LanthaScreenTM時差式螢光共振能量轉移(TR-FRET)偵測終點評估化合物結合至經分離之雌激素受體α配位體結合域(ERα-LBD(GST))的能力。對於LanthaScreen TR-FRET終點而言，適合螢光團(Fluormone ES2，產品碼P2645)及重組人類雌激素受體α配位體結合域(產品碼PV4543)購自Invitrogen且用於量測化合物結合。 分析原理為，向螢光配位體中添加ER α-LBD(GST)以形成受體/螢光團複合物。經鋱標記之抗GST抗體(產品碼PV3551)藉由結合至其GST標記而用於間接地標記受體，且根據測試化合物置換螢光配位體、導致Tb-抗GST抗體與追蹤劑之間之TR-FRET信號損失的能力來偵測競爭性結合。如下進行分析，其中所有試劑添加均使用Beckman Coulter BioRAPTR FRD微流體工作站進行：
1.利用聲學技術將120nl測試化合物分配至低容量384孔黑色分析盤中。
2.在ES2篩選緩衝液中製備1×ER α-LBD/Tb-抗GST Ab且培育20 分鐘。
3.使用之前，向ER α-LBD/Tb-抗GST Ab溶液中添加1×螢光團。
4.將12μl之1×AR-LBD/Tb-抗GST Ab/螢光團試劑分配至分析盤之各孔中。
5.遮蓋分析盤以防止試劑見光及蒸發，且在室溫下培育1小時。
6.在337nm激發且使用BMG PheraSTAR量測各孔在490nm及520nm之螢光發射信號。
使用Labcyte Echo 550將化合物自含有連續稀釋之化合物的化合物源微盤(4個孔分別含有10mM、0.1mM、1μM及10nM最終化合物)直接配給至分析微盤中。Echo 550為利用聲學技術執行DMSO化合物溶液之微盤至微盤直接轉移的液體處理機，且該系統可經程式化以自不同源盤孔轉移多次較小nL體積的化合物，從而在分析中得到化合物之所要連續稀釋液，接著回填以在整個稀釋度範圍內校正DMSO濃度。向各孔中添加總計120nL化合物加DMSO且以12點濃度反應格式，分別在100、29.17、10.42、2.083、1、0.292、0.104、0.02083、0.01、0.002917、0.001042、0.0001μM之最終化合物濃度範圍內測試化合物。將各化合物所得的TR-FRET劑量反應資料輸入適合套裝軟體(諸如Origin或Genedata)以執行曲線擬合分析。競爭性ER α結合係以IC50值表示。此值係藉由計算為使追蹤化合物與ER α-LBD之結合減少50%所需的化合物濃度來確定。
MCF-7 ER下調分析
在基於細胞之免疫螢光分析中，使用MCF-7人類乳腺管癌乳房細胞株評估化合物下調雌激素受體(ER)數目的能力。MCF-7細胞自冷凍小瓶(約5×106個細胞)取出直接於含有2mM L-麩胺醯胺的分析培養基(不含苯酚紅的杜貝科氏改良伊格爾氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's medium，DMEM)(Sigma D5921)中復蘇，且使用18G×1.5吋 (1.2×40mm)無菌寬距針一次性注射5%(v/v)經炭/葡聚糖處理之胎牛血清細胞，且使用庫爾特計數器(Coulter Counter)(Beckman)量測細胞密度。細胞於分析培養基中進一步稀釋至每毫升3.75×104個細胞之密度且使用Thermo Scientific Matrix WellMate或Thermo Multidrop向經組織培養液處理之384孔黑色透明底盤(Costar，第3712號)中每孔添加40μl。細胞接種之後，盤在37℃、5% CO2培育隔夜(Liconic旋轉料架式恆溫箱)。使用LabCyte Echo® 555型化合物格式轉換器(其為自動化工作單元(整合式Echo 2工作單元)之一部分)產生測試資料。使用測試化合物之10mM化合物儲備溶液產生384孔化合物填加盤(Labcyte P-05525-CV1)。將40μl各種10mM化合物儲備溶液分配至第一象限孔中且接著使用Hydra II(MATRIX UK)液體處理單元執行1：100於DMSO中之逐步連續稀釋，分別在第2象限孔(0.1mM)、第3象限孔(1μM)及第4象限孔(0.01μM)中得到40μl經稀釋化合物。向源盤之第P列之各孔中添加40μl DMSO，以便在整個劑量範圍內校正DMSO。為了填加對照孔，向化合物源盤之O1列中添加40μl DMSO且向化合物源盤之O3列中添加40μl含有100μM Faslodex®之DMSO。Echo係利用聲學技術執行DMSO化合物溶液向分析盤中之微盤至微盤直接轉移。系統可經程式化以在微盤之間轉移低至2.5nL之數倍增量之體積且如此在分析盤中產生化合物之連續稀釋液，接著回填，以在整個稀釋度範圍內校正DMSO濃度。使用整合式Echo 2工作單元，經由如上製備之化合物源盤將化合物分配至細胞盤上，產生3μM至3pM劑量範圍之12pt複製品(3倍稀釋及一個最終10倍稀釋)。向最大信號對照孔中填加DMSO，得到0.3%之最終濃度，且向最小信號對照孔中填加Faslodex®，相應地得到100nM之最終濃度。細胞盤在37℃、5% CO2進一步培育18-22個小時且接著藉由添加20μl之11.1%(v/v)甲醛溶液(於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS))中加以固著，得到3.7%(v/v)之最終甲醛濃 度。細胞在室溫下固著20分鐘，隨後使用BioTek洗盤機、用250μl PBS/Proclin(PBS+殺生物性防腐劑)洗滌兩次，接著向所有孔中添加40μl PBS/Proclin且在4℃儲存盤。上述固著方法係在整合式Echo 2工作單元上進行。使用自動化AutoElisa工作單元執行免疫染色。自所有孔中吸出PBS/Proclin且細胞在室溫下用40μl含有0.5% TweenTM 20(v/v)的PBS滲透1小時。盤用含有250μl之PBS/0.05%(v/v)Tween 20+Proclin(PBST+殺生物性防腐劑)洗滌三次且接著添加20μl含有ERα(SP1)兔單株抗體(Thermofisher)(1：1000)之PBS/TweenTM/3%(w/v)牛血清白蛋白。盤在4℃(Liconic旋轉料架式恆溫箱)培育隔夜且接著用250μl之PBS/0.05%(v/v)TweenTM 20+Proclin(PBST)洗滌三次。接著在室溫下培育每孔20μl含有山羊抗兔IgG AlexaFluor 594或山羊抗兔AlexaFluor 488抗體(Molecular Probes)與Hoechst之PBS/TweenTM/3%(w/v)牛血清白蛋白(1：5000)1小時。盤接著用250μl之PBS/0.05%(v/v)TweenTM 20+Proclin(PBST+殺生物性防腐劑)洗滌三次。向各孔中添加20μl PBS且盤用黑色盤封條覆蓋且在讀盤之前在4℃儲存。使用讀取594nm(24小時時間點)或488nm(5小時時間點)螢光的Cellomics Arrayscan讀盤，以量測各孔中之ERα受體含量。根據細胞數目校正平均總強度，得到每個細胞的總強度。將資料輸入適合套裝軟體(諸如Origin)以執行曲線擬合分析。ERα受體之下調係以IC50值表示且藉由計算為使得平均最大總強度信號降低50%所必需的化合物濃度來測定。
雖然式(I)化合物之藥理學特性如所預期隨著結構改變而變化，但一般而言，式(I)化合物所具有之活性在一或多項上述測試中可在以下濃度或劑量下顯示。
實例產生以下資料(下述資料可為單一實驗的結果或多次重複實驗之平均值)：
MCF-7活體內異種移植研究，其中實例1作為單一藥劑及與mTOR抑制劑組合
將MCF7細胞(5×106個細胞懸浮於100μl RPMI細胞培養基中)皮下植入免疫受損(SCID)小鼠之後肋中，次日，各小鼠手術植入0.5mg/21日雌激素丸粒(Innovative Research,USA)。每週量測腫瘤兩次且藉由雙側游標卡尺量測(長度×寬度)來測定生長抑制，其中長度為橫越腫瘤之最長直徑且寬度為相應垂向之最長直徑。腫瘤體積係使用式(長度×寬度)×(長度×寬度)×π/6)計算。
細胞植入後13天量測腫瘤，從而將小鼠隨機分配至測試組。次日(亦即細胞植入後第14天)開始用化合物處理。
mTOR抑制劑AZD2014以15mg/kg、以每10g為0.1ml之體積每天經口(p.o.)給與不同組小鼠，每日一次。實例1以5mg/kg、以0.1ml/10g每日經口給與一次。一組動物經口給與媒劑以充當對照組。相對於對照組，每組九隻小鼠使用活性劑。
此研究所得資料顯示於圖10中。
式(I)化合物與PI3Kα/δ抑制劑組合之作用可以類似於與上述mTOR抑制劑組合的方式研究。
HCC1428長期雌激素匱乏性(HCC1428 LTED)異種移植物功效研究
適合細胞培養期之後，將HCC1428 LTED細胞(1×106個)皮下植 入已經歷卵巢切除術之雌性免疫受損NSG小鼠(Jackson Labs,USA)之後肋中。每週量測腫瘤兩次且藉由雙側游標卡尺量測(長度×寬度)來測定生長抑制，其中長度為橫越腫瘤之最長直徑且寬度為相應垂向之最長直徑。腫瘤體積係使用式(長度×寬度)×(長度×寬度)×π/6)計算。細胞植入後，每週量測腫瘤一次，直至平均尺寸達到150mm3，此時將小鼠置放於隨機所分之測試組中，各組含有10個小鼠。 次日(此研究中之第62日)開始用化合物處理且繼續每週量測腫瘤一次。實例1以0.1ml/10g之體積、以25mg/kg每天經口(p.o.)給與，每日一次。另一組動物經口給與媒劑以充當對照組。
給藥28天後，經對照物處理之腫瘤平均生長220mm3(使用幾何平均值)，而經實例1處理之小鼠的腫瘤尺寸減小46mm3，表示腫瘤生長被抑制121%(P<0.001，依據不成對t檢驗)。
為量測異種移植腫瘤中之雌激素受體蛋白含量，最後給與媒劑或實例1處理後24小時，收穫腫瘤樣品且在液氮中急凍。進行蛋白質萃取時，將腫瘤片段添加至濕冰上之2ml取樣管中之700μl Invitrogen細胞萃取緩衝液(FNN0011)中，該細胞萃取緩衝液添加有Sigma磷酸酶抑制劑(第2(P5726)及3(P0044)1號，100倍稀釋)及Roche完全(11836145001)蛋白酶抑制劑(每50ml為1個錠劑)、1mM二硫蘇糖醇(DTT)。使用Mixermill(27級/秒)及2分鐘3輪均質化來將樣品均質化。 將樣品短時間離心以確定腫瘤完全均質化。用超音波處理勻漿10秒且接著以最高速度(13000rpm)離心旋轉15分鐘。量測上清液中之蛋白質含量且使用標準方法使約45μg蛋白質在15孔Bis-Tris凝膠(4-12%凝膠)上跑電泳。蛋白質分離且轉移至硝化纖維素濾膜上之後，添加雌激素受體68kDa：ThermoFisher SP1 #9101S抗體，於牛乳/PBS/T中1：400稀釋且在4℃培育隔夜。濾膜在約20ml之TBS/T 0.05%中洗滌(3×5mins)且抗兔偵測性二次抗體於含有5% marvel之TBS/T中1：2000稀釋 且在室溫下培育1小時。使用化學發光SuperSignal West Dura長使用期受質偵測信號且使用Syngene軟體定量。使用1：10,000於marvel中稀釋之V931 Sigma及抗小鼠偵測抗體作為內參考物來量測黏著斑蛋白含量。圖11及圖12中之結果顯示，實例1處理時，ER含量相對於媒劑對照物而言降低60%。
根據本發明之另一態樣，提供醫藥組合物，其包含如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，以及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。
適用於錠劑調配物之醫藥學上可接受之賦形劑包括例如惰性稀釋劑、造粒及崩解劑、黏合劑、潤滑劑、防腐劑及抗氧化劑。錠劑調配物可未包覆包衣或經包覆包衣以修改其崩解及隨後活性成分在胃腸道內之吸收，或改良其穩定性及/或外觀，在任一情況下，均使用此項技術中熟知之習知包衣劑及程序。
或者，口服使用的組合物可呈硬明膠膠囊形式，其中活性成分與惰性固體稀釋劑混合，或呈軟明膠膠囊形式，其中活性成分與水或油混合。
水性懸浮液通常含有呈細粉狀形式的活性成分，以及一或多種懸浮劑、分散或濕潤劑。水性懸浮液亦可含有一或多種防腐劑、抗氧化劑、著色劑、芳香劑及/或甜味劑。
油性懸浮液可藉由將活性成分懸浮於植物油中或礦物油中調配而成。油性懸浮液亦可含有增稠劑。可添加甜味劑(諸如上文所列之甜味劑)及芳香劑以提供適口之口服製劑。此等組合物可藉由添加抗氧化劑來防腐。
適於藉由添加水來製備水性懸浮液之分散性散劑及顆粒劑一般含有活性成分以及分散劑或濕潤劑、懸浮劑及一或多種防腐劑。亦可存在其他賦形劑，諸如甜味劑、調味劑及著色劑。
本發明醫藥組合物亦可呈水包油乳液形式。油相可為植物油或礦物油或其任何混合物。乳液亦可含有甜味劑、調味劑及防腐劑。
糖漿及酏劑可用甜味劑調配，且亦可含有緩和劑、防腐劑、調味劑及/或著色劑。
醫藥組合物亦可呈無菌可注射水性或油性懸浮液之形式，其可根據已知程序使用上述適當分散劑或濕潤劑及懸浮劑中之一或多者來調配，。無菌可注射製劑亦可為非經腸可接受之無毒稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液。
供吸入投與之組合物可呈習知壓縮氣溶膠形式，其經配置可使活性成分以含有細粉狀固體或液滴之氣溶膠形式分配。可使用習知氣溶膠推進劑，諸如揮發性氟化烴或烴，且氣溶膠裝置經適當配置可分配定量之活性成分。
關於調配物之其他資訊，讀者可參考Comprehensive Medicinal Chemistry(Corwin Hansch；Chairman of Editorial Board),Pergamon Press 1990之第5卷第25.2章。
在本發明之一個態樣中，上述醫藥組合物包含實例1之化合物[(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸]，或其醫藥學上可接受之鹽。實例1化合物宜以本文所述之其多晶形物存在，如晶形B。
合成如實例1中所述之(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸的方法提出，該方法係在氮氣氛圍下避光進行以免形成降解產物。
稱為(R,E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-鎓-1-基)苯基)丙烯酸酯的降解產物具有以下結構：
且據信可由實例1[(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸]藉由在空氣中自動氧化、經由自由基鏈機制形成。
此化合物亦可稱為(E)-3-[3,5-二氟-4-[(3R)-2-(2-氟-2-甲基-丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-鎓-1-基]苯基]丙-2-烯酸酯且製備其的合成方法明示於實例13中。
熟習此項技術者將瞭解，控制降解產物形成對於醫藥之安全生產及儲存為必需的。又，熟習此項技術者將瞭解，某些化合物在儲存時，甚至在調配成醫藥組合物之後可能會降解，且此降解有時候可藉由在醫藥組合物中使用適當賦形劑及/或藉由適當包裝最終產物加以控制。熟習此項技術者將進一步瞭解，根據商業用途開發的最終調配物需要針對多種特徵進行最佳化，此等特徵不僅包括化學穩定性，而且包括例如物理穩定性及溶解特徵。因此，此等調配物係為了平衡許多不同因素而開發。
(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸或其醫藥學上可接受之鹽之組合物宜包括充當抗氧化劑的化合物。
適用於醫藥組合物中之抗氧化劑化合物在此項技術中已知且包括例如丙酮合亞硫酸氫鈉；α硫辛酸；α生育酚；抗壞血酸；抗壞血酸棕櫚酸酯；丁基化羥基甲氧苯；丁基化羥基甲苯；胡蘿蔔素；單水合 檸檬酸；沒食子酸十二酯；異抗壞血酸；反丁烯二酸；麩胱甘肽；組胺酸；次磷酸；乳糖酸；硫辛酸；蘋果酸；抑黑素；甲硫胺酸；d-甘露糖；單硫代甘油；沒食子酸辛酯；焦亞硫酸鉀；丙酸；沒食子酸丙酯；抗壞血酸鈉；亞硫酸氫鈉；甲醛合次硫酸氫鈉；偏亞硫酸氫鈉；亞硫酸鈉；硫代硫酸鈉；氯化亞錫；二氧化硫；百里酚(thymol)；生育酚；生育三烯酚；泛醌醇；尿酸；維生素E；及維生素E聚丁二酸乙二醇酯。此等化合物可藉由多種機制發揮其抗氧化劑作用，且此等機制中之一或多者可比任何特定化合物之其他機制更有效。一些抗氧化劑化合物，諸如BHA，充當自由基淨化劑。其他抗氧化劑，諸如偏亞硫酸氫鈉及抗壞血酸，容易氧化且因此可先於活性成分而被氧化。
舉例而言，在金屬誘導之過氧化物形成涉及氧化機制的情況下，使用螯合劑(例如EDTA(乙二胺四乙酸))可適用於移除任何金屬污染物且從而間接地達成穩定作用。其他金屬螯合劑在此項技術中已知且包括例如磺丁基β環糊精鈉；乙酸鈣；單水合檸檬酸；環糊精；依地酸二鈉(disodium edetate)；依地酸；反丁烯二酸；半乳糖；麩胺酸；組胺酸；羥丙基纖維素β環糊精；蘋果酸；噴替酸(pentetic acid)；植物螯合肽(phytochelatin)；聚(甲基乙烯基醚/順丁烯二酸酐)；檸檬酸鉀；二水合檸檬酸三鈉；磷酸氫二鈉；磷酸二氫鈉；酒石酸；及海藻糖。
舉例而言，實例1之例示性調配物中包括沒食子酸丙酯、偏亞硫酸氫鈉、抗壞血酸及丁基化羥基甲氧苯。亦包括EDTA。此調配物之實例係以實例12提供。其中，含有偏亞硫酸氫鈉之組合物在多種不同熱及濕度條件下儲存四週之後的穩定性似乎小於不含有抗氧化劑的彼等物。含有抗壞血酸之組合物在多種不同熱及濕度條件下儲存4週之後似乎最穩定(如依據HPLC分析所確定)。
適用於包含實例1化合物之調配物中的其他添加劑包括使用金屬 含量較低的賦形劑、過氧化物含量較低的賦形劑、作為自由基淨化劑的賦形劑(諸如甘露醇)以及填充劑。此調配物之生產方法亦可影響穩定性。舉例而言，確保活性成分與誘導穩定性之賦形劑緊密混合對於確保最大穩定性可具重要作用。緊密混合可受例如混合速度、粒徑及濕式或乾式混合/造粒過程的影響。
在本發明之一個態樣中，提供醫藥組合物，其包含(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸或其醫藥學上可接受之鹽，以及至少一種醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。
在本發明之一個態樣中，提供醫藥組合物，其包含(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸或其醫藥學上可接受之鹽，且亦包含抗氧化劑。抗壞血酸可適用作抗氧化劑。
在本發明之一個態樣中，提供醫藥組合物，其包含(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸或其醫藥學上可接受之鹽，且亦包含金屬螯合劑。EDTA可適用作金屬螯合劑。
在本發明之另一個態樣中，提供醫藥組合物，其包含(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸或其醫藥學上可接受之鹽、抗氧化劑且視情況進一步包含金屬螯合劑。
在本發明之另一個態樣中，提供醫藥組合物，其包含(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸或其醫藥學上可接受之鹽，以及至少一種醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑，其中該組合物含有小於5% w/w之(R,E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶 并[3,4-b]吲哚-2-鎓-1-基)苯基)丙烯酸酯。
在本發明之另一個態樣中，提供醫藥組合物，其包含(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸或其醫藥學上可接受之鹽，以及至少一種醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑，其中該組合物含有小於2% w/w之(R,E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-鎓-1-基)苯基)丙烯酸酯。
在本發明之另一個態樣中，提供醫藥組合物，其包含(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸或其醫藥學上可接受之鹽，以及至少一種醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑，其中該組合物含有小於1% w/w之(R,E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-鎓-1-基)苯基)丙烯酸酯。
在本發明之另一個態樣中，提供醫藥組合物，其包含(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸或其醫藥學上可接受之鹽，以及至少一種醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑，其中該組合物含有小於0.5% w/w之(R,E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-鎓-1-基)苯基)丙烯酸酯。
在本發明之另一個態樣中，提供醫藥組合物，其包含(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸或其醫藥學上可接受之鹽，以及至少一種醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑，其中該組合物含有小於0.1% w/w之(R,E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-鎓-1-基)苯基)丙烯酸酯。
在本發明之另一個態樣中，提供醫藥組合物，其包含(E)-3-(3,5- 二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸或其醫藥學上可接受之鹽，以及至少一種醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑，其中該組合物含有小於0.05% w/w之(R,E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-鎓-1-基)苯基)丙烯酸酯。
在上述態樣中，若組合物描述成含有小於2% w/w、1% w/w、0.5% w/w、0.1% w/w或0.05% w/w之(R,E)-3-(3,5-二氟-4-(2-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-4,9-四氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-鎓-1-基)苯基)丙烯酸酯，則熟習此項技術者將瞭解此意指與存在於組合物中之(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸相比之平均重量百分比。
降解產物(R,E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-鎓-1-基)苯基)丙烯酸酯因此可在分析技術(諸如HPLC)中用作參考標記或參考標準物，以監測實例1化合物或含有其之醫藥組合物的穩定性。
與一或多種賦形劑組合而產生單一劑型之活性成分的量必需根據所治療主體及特定投藥途徑而變化。舉例而言，經口投與人類通常需要例如將待投與之1mg至2g活性劑(更適合為100mg至2g，例如250mg至1.8g，諸如500mg至1.8g，尤其500mg至1.5g，宜為500mg至1g)與適當且適宜量之賦形劑混配，此量可為總組合物之約3wt%至約98wt%不等。將瞭解，若需要較大劑量，則可能需要多個劑型，例如兩個或兩個以上錠劑或膠囊，其中活性成分之劑量宜在其間分配。單一固體劑型宜含有1mg與300mg之間的活性成分。
本發明化合物用於治療或預防目的之劑量規模當然根據疾病病況之性質及嚴重程度、動物或患者之年齡及性別以及投藥途徑、根據熟知醫學原理而變化。
在本發明化合物用於治療或預防目的時，其通常經投與以便接受例如每公斤體重1mg至100mg範圍內之每日劑量，需要時可分次給藥。一般而言，使用非經腸途徑時，投與較低劑量。因此，例如，靜脈內投藥時，通常使用例如每公斤體重1mg至25mg範圍內之劑量。 類似地，藉由吸入投藥時，將使用例如每公斤體重1mg至25mg範圍內之劑量。然而經口投與較佳，尤其以錠劑形式經口投與。通常，單位劑型將含有約10mg至0.5g本發明化合物。
如上所述，已知經由ERα傳導信號因介導癌症及其他細胞增殖、介導血管生成事件及介導癌細胞之活動性、遷移及侵入性而引起致腫瘤性。已發現本發明化合物具有強抗腫瘤活性，咸信此強抗腫瘤活性係經由涉及信號轉導步驟之ERα之拮抗及下調而獲得，此等信號轉導步驟引起腫瘤細胞之增殖及存活及轉移性腫瘤細胞之侵入及遷移能力。
因此，本發明化合物可具有用作抗腫瘤藥劑的價值，特定而言，用作哺乳動物癌細胞之增殖、存活、活動性、擴散及侵入的選擇性抑制劑，從而抑制腫瘤生長及存活以及抑制轉移性腫瘤生長。特定而言，本發明化合物可具有作為抗增殖劑及抗侵入劑用於抑制及/或治療實體腫瘤疾病的價值。特定而言，本發明化合物可適用於預防或治療對抑制ERα敏感且涉及信號轉導步驟的彼等腫瘤，此等信號轉導步驟引起腫瘤細胞之增殖及存活及轉移性腫瘤細胞之遷移能力及侵入性。此外，本發明化合物可適用於預防或治療由ERα之拮抗及下調單獨或部分介導的彼等腫瘤，亦即可用於在需要此治療之熱血動物中產生ERα抑制作用的化合物。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其作為藥劑用於溫血動物，諸如人。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義的式(I)化合物或其 醫藥學上可接受之鹽，其用於在諸如人之溫血動物中產生抗增殖作用。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其作為抗侵入劑用於抑制及/或治療溫血動物(諸如人)之實體腫瘤疾病。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，係用於在諸如人之溫血動物中產生抗增殖作用。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，係用於製造供在諸如人之溫血動物中產生抗增殖作用的藥劑。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，係用於製造供抑制及/或治療溫血動物(諸如人)之實體腫瘤疾病的藥劑，諸如抗侵入劑。
根據本發明之另一態樣，提供一種在需要此治療之溫血動物(諸如人)中產生抗增殖作用的方法，包含向該動物投與有效量之如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
根據本發明之另一態樣，提供一種藉由抑制及/或治療需要此治療之溫血動物(諸如人)之實體腫瘤疾病來產生抗侵入作用的方法，包含向該動物投與有效量之如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療溫血動物(諸如人)之癌症。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，係用於製造供預防或治療溫血動物(諸如人)之癌症的藥劑。
根據本發明之另一態樣，提供一種預防或治療需要此治療之溫血動物(諸如人)之癌症的方法，包含向該動物投與有效量之如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療溫血動物(諸如人)之實體腫瘤疾病。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，係用於製造供預防或治療溫血動物(諸如人)之實體腫瘤疾病用的藥劑。
根據本發明之另一態樣，提供一種預防或治療需要此治療之溫血動物(諸如人)之實體腫瘤疾病的方法，包含向該動物投與有效量之如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於預防或治療對抑制涉及信號轉導步驟之ERα敏感的彼等腫瘤，此等信號轉導步驟引起腫瘤細胞之增殖、存活、侵入及遷移能力。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，係用於製造供預防或治療對抑制涉及信號轉導步驟之ERα敏感之彼等腫瘤的藥劑，此等信號轉導步驟引起腫瘤細胞之增殖、存活、侵入及遷移能力。
根據本發明之另一態樣，提供一種預防或治療對抑制涉及信號轉導步驟之ERα敏感之彼等腫瘤的方法，該等信號轉導步驟引起腫瘤細胞之增殖、存活、侵入及遷移能力，該方法包含向該動物投與如上文中定義之有效量的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於提供針對ERα的抑制作用。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，係用於製造供提供針對ERα之抑制作用的藥劑。
根據本發明之另一態樣，亦提供一種提供針對ERα之抑制作用的方法，該方法包含投與有效量之如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於提供針對ERα的選擇性抑制作用。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，係用於製造供提供針對ERα之選擇性抑制作用的藥劑。
根據本發明之另一態樣，亦提供一種提供針對ERα之抑制作用的方法，該方法包含投與有效量之如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
本文中描述可結合至ERα配位體結合域且為選擇性雌激素受體降解劑的化合物。在生物化學及基於細胞的分析中，本發明化合物顯示為強雌激素受體結合劑且降低細胞中之ERα含量且因此可適用於治療雌激素敏感性疾病或病狀(包括對內分泌療法已呈現抗性的疾病)，亦即用於治療乳癌及婦科癌症(包括子宮內膜癌、卵巢癌及子宮頸癌)及表現ERα突變蛋白的癌症，該等ERα突變蛋白可為新生突變或歸因於先前內分泌療法(諸如芳香酶抑制劑)之治療結果。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療乳癌或婦科癌症。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療乳癌，子宮內膜癌，卵巢癌或子宮頸癌。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療乳癌。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽，其用於治療乳癌，其中該癌症已對一或多種其他內分泌療法呈現抗性。
根據本發明之另一態樣，提供一種治療乳癌或婦科癌症的方法，包含投與有效量之如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
根據本發明之另一態樣，提供一種治療乳癌、子宮內膜癌、卵巢癌或子宮頸癌的方法，包含投與有效量之如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
根據本發明之另一態樣，提供一種治療乳癌的方法，包含投與有效量之如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
根據本發明之另一態樣，提供一種治療乳癌的方法，其中該癌症對一或多種其他內分泌療法已呈現抗性，該方法包含投與有效量之如上文中定義的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，係用於製造供治療乳癌或婦科癌症用的藥劑。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，係用於製造供治療乳癌、子宮內膜癌、卵巢癌或子宮頸癌用的藥劑。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，係用於製造供治療乳癌用的藥劑。
根據本發明之另一態樣，提供如上文中定義之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，係用於製造供治療乳癌用的藥劑，其中 該癌症對一或多種其他內分泌療法已呈現抗性。
在所有上述用途及方法中，適合的式(I)化合物為實例1，或其醫藥學上可接受之鹽。在一個態樣中，實例1呈如本文所述的晶形B。
在本發明之一個特徵中，所治療之癌症為乳癌。在此特徵之另一個態樣中，乳癌為雌激素受體+ve(ER+ve)。在此態樣之在一個實施例中，式(I)化合物係與如本文定義的另一種抗癌劑(諸如抗激素劑)組合給與。
如上文中所述，式(I)化合物之活體內作用可部分地藉由一或多種代謝物發揮，此等代謝物係在式(I)化合物投與之後在人體或動物體內形成。
本發明因此亦涵蓋一種抑制患者中之ER-α的方法，包含向患者投與有效抑制該患者中之ER-α之量的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
本發明因此亦涵蓋一種抑制患者中之ER-α的方法，包含向患者投與有效抑制該患者中之ER-α之量的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。
本文定義的抗癌療法可用作單獨療法或除本發明化合物之外，亦可包括習知手術或放射療法或化學療法。此化學療法可包括以下一或多類抗腫瘤劑： (i)如醫學腫瘤學中所用之其他抗增殖/抗贅生藥物及其組合，諸如烷化劑(例如順鉑(cis-platin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)、卡鉑(carboplatin)、環磷醯胺、氮芥(nitrogen mustard)、美法侖(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、白消安(busulphan)、替莫唑胺(temozolamide)及亞硝基脲)；抗代謝物(例如吉西他濱(gemcitabine)及抗葉酸物，諸如氟嘧啶(如5-氟尿嘧啶及替加氟(tegafur))、雷替曲塞(raltitrexed)、甲胺喋呤(methotrexate)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)及羥基脲)；抗腫瘤抗生素(例如蒽環黴素(anthracycline)，如阿黴素(adriamycin)、博萊黴素(bleomycin)、小紅莓(doxorubicin)、道諾黴素(daunomycin)、表柔比星(epirubicin)、伊達比星(idarubicin)、絲裂黴素-C(mitomycin-C)、放線菌素D(dactinomycin)及光神黴素(mithramycin))；抗有絲分裂劑(例如長春花生物鹼(vinca alkaloid)，如長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、長春地辛(vindesine)及長春瑞賓(vinorelbine)；及紫杉類藥物(taxoids)，如紫杉醇(taxol)及克癌易(taxotere)；及polo激酶(polokinase)抑制劑)；及拓撲異構酶抑制劑(例如表鬼臼毒素(epipodophyllotoxin)(如依託泊苷(etoposide)及替尼泊苷(teniposide))、安吖啶(amsacrine)、拓朴替康(topotecan)及喜樹鹼(camptothecin))； (ii)抗激素劑，諸如抗雌激素藥劑(例如他莫昔芬、氟維司群、托瑞米芬(toremifene)、拉洛昔芬(raloxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)及依多昔芬(iodoxyfene))、孕激素(例如甲地孕酮乙酸酯(megestrol acetate))、芳香酶抑制劑(例如阿那曲唑(anastrozole)、雷曲唑(letrozole)、沃拉唑(vorazole)及依西美坦(exemestane))； (iii)生長因子功能及其下游信號傳導路徑之抑制劑：包括任何生長因子或生長因子受體目標之Ab調節劑，評述於Stern等人Critical Reviews in Oncology/Haematology,2005,54，第11-29頁)；亦包括此等目標之小分子抑制劑，例如激酶抑制劑，實例包括抗erbB2抗體曲妥珠單抗(trastuzumab)[HerceptinTM]、抗EGFR抗體盤尼圖單抗(panitumumab)、抗EGFR抗體西妥昔單抗(cetuximab)[Erbitux,C225]及酪胺酸激酶抑制劑，包括erbB受體家族之抑制劑，諸如表皮生長因子家族受體(EGFR/erbB1)酪胺酸激酶抑制劑，諸如吉非替尼(gefitinib)或埃羅替尼(erlotinib)；erbB2酪胺酸激酶抑制劑，諸如拉帕替尼(lapatinib)，及混合erb1/2抑制劑，諸如阿法替尼；類似策略可利 用於其他類別的生長因子及其受體，例如肝細胞生長因子家族或其受體(包括c-met及ron)之抑制劑，胰島素及胰島素生長因子家族或其受體(IGFR,IR)之抑制劑；血小板源生長因子家族或其受體(PDGFR)之抑制劑；及由其他受體酪胺酸激酶(諸如c-kit、AnLK及CSF-1R)介導之信號傳導的抑制劑； 亦包括靶向PI3激酶信號傳導路徑中之信號傳導蛋白的調節劑，例如PI3激酶同功異型物之抑制劑，諸如PI3K-α/β/γ及ser/thr激酶，諸如AKT、mTOR(諸如AZD2014)、PDK、SGK、PI4K或PIP5K；亦包括上文未列舉之絲胺酸/蘇胺酸激酶之抑制劑，例如raf抑制劑，諸如威羅菲尼(vemurafenib)；MEK抑制劑，諸如司美替尼(selumetinib)(AZD6244)；Abl抑制劑，諸如伊馬替尼(imatinib)或尼羅替尼(nilotinib)；Btk抑制劑，諸如依魯替尼；Syk抑制劑，諸如福斯替尼(fostamatinib)；極光激酶抑制劑(例如AZD1152)；其他ser/thr激酶(諸如JAK、STAT及IRAK4)之抑制劑；及週期素依賴性激酶抑制劑，諸如帕伯希布(palbociclib)； (iv)DNA損傷信號傳導路徑調節劑，例如PARP抑制劑(例如奧拉帕尼(Olaparib))、ATR抑制劑或ATM抑制劑； (v)細胞凋亡及細胞死亡路徑之調節劑，諸如Bcl家族調節劑(例如ABT-263/那托克斯(Navitoclax)、ABT-199)； (vi)抗血管生成劑，諸如抑制血管內皮生長因子作用的彼等物[例如抗血管內皮細胞生長因子抗體貝伐株單抗(bevacizumab)(AvastinTM)及例如VEGF受體酪胺酸激酶抑制劑，諸如索拉非尼(sorafenib)、阿西替尼(axitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)及範得它尼(vandetanib)(及依據其他機制起作用的化合物(例如三羧胺基喹啉(linomide)、整合素αvβ3功能抑制劑及血管抑制素)]； (vii)血管損傷劑，諸如康柏斯達汀A4(Combretastatin A4)； (viii)抗侵入劑，例如c-Src激酶家族抑制劑類似物(dasatinib,J.Med.Chem.,2004,47,6658-6661)及伯舒替尼(bosutinib)(SKI-606)，及金屬蛋白酶抑制劑，如馬立馬斯他(marimastat)；尿激酶血漿素原活化劑受體功能抑制劑或肝素酶抗體]； (ix)免疫治療方法，包括例如增強患者腫瘤細胞之免疫原性的離體及活體內方法，諸如用介白素2、介白素4或粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子之細胞激素轉染；降低T細胞無因變性之方法；使用經轉染之免疫細胞(諸如經細胞激素轉染之樹突狀細胞)的方法；使用經細胞激素轉染之腫瘤細胞株的方法及使用抗個體基因型抗體的方法。特定實例包括靶向PD-1的單株抗體(例如BMS-936558)或靶向CTLA4的單株抗體(例如艾匹木單抗(ipilimumab)及曲美木單抗(tremelimumab))； (x)反義或基於RNAi的療法，例如針對所列舉之目標的彼等療法。
(xi)基因治療方法，包括例如置換異常基因(諸如異常p53或異常BRCA1或BRCA2)的方法；GDEPT(基因導引之酶前藥療法)，諸如使用胞嘧啶脫胺酶、胸苷激酶或細菌性硝基還原酶的方法及使患者對化學療法或放射療法之耐受性增強的方法，諸如多藥抗性基因療法。
根據本發明之此態樣，提供適用於癌症療法中之組合，該組合包含如本文定義的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽與另一種抗腫瘤劑，特定而言上述(i)至(xi)中所列之任一種抗腫瘤劑。特定而言，上文(i)至(xi)中所列之抗腫瘤劑為所治療之特定癌症的標準照護療法；熟習此項技術者瞭解「標準照護療法」之含義。在一個態樣中，本發明化合物為實例1，或其醫藥學上可接受之鹽。
因此在本發明之另一態樣中，提供本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽與另一種抗腫瘤劑(特定而言，選自上文(i)至(xi)中所列項的抗腫瘤劑)的組合。
在本發明之另一態樣中，提供實例1[(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸]或其醫藥學上可接受之鹽與另一種抗腫瘤劑(特定而言，選自上文(i)至(xi)中所列項的抗腫瘤劑)之組合。
因此在本發明之另一態樣中，提供本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽與另一種抗腫瘤劑(特定而言，選自上文(i)中所列項的抗腫瘤劑)的組合。
在本發明之另一態樣中，提供如上文中所定義的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽及上文(i)中所列之任一種抗腫瘤劑。
在本發明之另一態樣中，提供實例1或其醫藥學上可接受之鹽與上文(i)中所列之任一種抗腫瘤劑的組合。
在本發明之另一態樣中，提供適用於癌症療法中的組合，該組合包含如上文中定義的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽及類紫杉醇，諸如紫杉醇或克癌易，克癌易適宜。舉例而言，與類紫杉醇(諸如紫杉醇或克癌易，克癌易適宜)組合之本發明適合化合物為實例1或其醫藥學上可接受之鹽。
在本發明之另一態樣中，提供本發明之化合物或其醫藥學上可接受之鹽與另一種抗腫瘤劑(特定而言，選自上文(ii)中所列項的抗腫瘤劑)的組合。
在本發明之另一態樣中，提供適用於癌症療法中的組合，該組合包含如上文中所定義的本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽及上文(ii)中所列之任一種抗激素劑，例如上文(ii)中所列之任一種抗雌激素劑，或例如上文(ii)中所列之芳香酶抑制劑。
在本發明之另一態樣中，提供適用於癌症療法中的組合，該組合包含實例1或其醫藥學上可接受之鹽及上文(ii)中所列之任一種抗激素劑，例如上文(ii)中所列之任一種抗雌激素劑，或例如上文(ii)中所 列之芳香酶抑制劑。
在本發明之另一態樣中，提供適用於癌症療法中的組合，該組合包含實例1或其醫藥學上可接受之鹽及mTOR抑制劑，諸如AZD2014(參見例如WO2008/023161)。
在本發明之另一態樣中，提供適用於癌症療法中的組合，該組合包含實例1或其醫藥學上可接受之鹽及PI3Kα抑制劑，諸如本發明人共同申請中之PCT申請案PCT/GB2014/050163中的彼等PI3Kα/δ抑制劑。適合PI3Kα/δ抑制劑之一個實例為PCT/GB2014/050163中之實例3，其為化合物1-(4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基)-3-羥基丙-1-酮，或其醫藥學上可接受之鹽。製備PCT/GB2014/050163之實例3的方法陳述於本文參考實例1中。
在本發明之另一態樣中，提供適用於癌症療法中的組合，該組合包含實例1或其醫藥學上可接受之鹽及帕伯希布。
在一個態樣中，式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽(尤其實例1或其醫藥學上可接受之鹽)與上文(ii)中所列之抗腫瘤劑或mTOR抑制劑(諸如AZD2014)或PI3K-α抑制劑(諸如本發明人之共同申請中之PCT申請案PCT/GB2014/050163中之彼等PI3Kα/δ抑制劑，尤其其中的實例3)或帕伯希布的組合適用於治療乳癌或婦科癌症，諸如乳癌、子宮內膜癌、卵巢癌或子宮頸癌，尤其乳癌，諸如ER+ve乳癌。
本文中，在使用術語「組合」的情況下，應瞭解此係指同時、分開或依序投藥。在本發明之一個態樣中，「組合」係指同時投藥。 在本發明之另一個態樣中，「組合」係指分開投藥。在本發明之另一態樣中，「組合」係指依序投藥。在依序或分開投藥的情況下，延遲投與第二組分不應使得組合之有益作用喪失。在兩種或兩種以上組分之組合係分別或依序投與的情況下，應瞭解各種組分之劑量方案可不同於且不依賴於其他組分。本發明化合物宜每日給與一次。
根據本發明之另一態樣，提供醫藥組合物，其包含式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽與選自上文中在(i)至(xi)中所列項之抗腫瘤劑之組合，以及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。
根據本發明之另一態樣，提供醫藥組合物，其包含實例1[(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸]或其醫藥學上可接受之鹽與選自上文中在(i)至(xi)中所列項之抗腫瘤劑組合，以及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。
根據本發明之另一態樣，提供醫藥組合物，其包含式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽與在上文(ii)中所列之任一種抗激素劑(例如上文(ii)中所列之任一種抗雌激素劑，或例如上文(ii)中所列之芳香酶抑制劑)組合，以及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。
在本發明之另一態樣中，提供醫藥組合物，其包含實例1或其醫藥學上可接受之鹽及上文(ii)中所列之任一種抗激素劑，例如上文(ii)中所列之任一種抗雌激素劑，或例如上文(ii)中所列之芳香酶抑制劑；以及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。
在本發明之另一態樣中，提供醫藥組合物，包含實例1或其醫藥學上可接受之鹽及mTOR抑制劑，諸如AZD2014(參見例如WO2008/023161)；以及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。
在本發明之另一態樣中，提供醫藥組合物，其包含實例1或其醫藥學上可接受之鹽及PI3Kα抑制劑，諸如本發明人之共同申請中之PCT申請案PCT/GB2014/050163中的彼等PI3Kα/δ抑制劑；以及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。適合PI3Kα/δ抑制劑之一個實例為PCT/GB2014/050163之實例3，如上文中所述。
在本發明之另一態樣中，提供醫藥組合物，其包含實例1或其醫藥學上可接受之鹽及帕伯希布與醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。
在一個態樣中，式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽(尤其實例1或其醫藥學上可接受之鹽)與上文(ii)中所列之抗腫瘤劑或mTOR抑制劑(諸如AZD2014)或PI3K-α抑制劑(諸如本發明人之共同申請中之PCT申請案PCT/GB2014/050163中之彼等PI3Kα/δ抑制劑，尤其其中的實例3)或帕伯希布的上述醫藥組合物適用於治療乳癌或婦科癌症，諸如乳癌、子宮內膜癌、卵巢癌或子宮頸癌，尤其乳癌，諸如ER+ve乳癌。
根據本發明之另一態樣，提供醫藥組合物，其包含式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽與選自上文在(i)至(xi)中所列項之抗腫瘤劑的組合，以及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑，用於治療癌症。
根據本發明之另一態樣，提供醫藥組合物，其包含式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽與在上文(ii)中所列之任一種抗激素劑(例如上文(ii)中所列之任一種抗雌激素劑，或例如上文(ii)中所列之芳香酶抑制劑)組合，以及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑，用於治療癌症。
根據本發明之另一態樣，提供醫藥組合物，其包含實例1或其醫藥學上可接受之鹽與選自上文(i)至(xi)中所列項之抗腫瘤劑的組合，以及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑，用於治療癌症。
在本發明之另一態樣中，提供醫藥組合物，其包含實例1或其醫 藥學上可接受之鹽及上文(ii)中所列之任一種抗激素劑，例如上文(ii)中所列之任一種抗雌激素劑，或例如上文(ii)中所列之芳香酶抑制劑；以及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑，用於治療癌症。
在本發明之另一態樣中，提供醫藥組合物，包含實例1或其醫藥學上可接受之鹽及mTOR抑制劑，諸如AZD2014(參見例如WO2008/023161)；以及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑，用於治療癌症。
在本發明之另一態樣中，提供醫藥組合物，其包含實例1或其醫藥學上可接受之鹽及PI3Kα抑制劑，諸如本發明人之共同申請中之PCT申請案PCT/GB2014/050163中的彼等PI3Kα/δ抑制劑；以及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑，用於治療癌症。適合PI3Kα/δ抑制劑之一個實例為PCT/GB2014/050163之實例3，如上文中所述。
在本發明之另一態樣中，提供醫藥組合物，其包含實例1或其醫藥學上可接受之鹽及帕伯希布與醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑，用於治療癌症。
在一個態樣中，式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽(尤其實例1或其醫藥學上可接受之鹽)與上文(ii)中所列之抗腫瘤劑或mTOR抑制劑(諸如AZD2014)或PI3K-α抑制劑(諸如本發明人之共同申請中之PCT申請案PCT/GB2014/050163中之彼等PI3Kα/δ抑制劑，尤其其中的實例3)或帕伯希布的上述醫藥組合物適用於治療乳癌或婦科癌症，諸如乳癌、子宮內膜癌、卵巢癌或子宮頸癌，尤其乳癌，諸如ER+ve乳癌。
根據本發明之另一特徵，提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽與選自上文(i)至(xi)中所列項之抗腫瘤劑組合的用途，係用於製造供治療溫血動物(諸如人)之癌症的藥劑。
根據本發明之另一特徵，提供實例1或其醫藥學上可接受之鹽與 選自上文(i)至(xi)中所列項之抗腫瘤劑組合的用途，係用於製造用於溫血動物(諸如人)之癌症的藥劑。
根據本發明之另一態樣，提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽與上文(ii)中所列之任一種抗激素劑(例如上文(ii)中所列之任一種抗雌激素劑，或例如上文(ii)中所列之芳香酶抑制劑)組合的用途，用於製造供治療溫血動物(諸如人)之癌症的藥劑。
在本發明之另一態樣中，提供實例1或其醫藥學上可接受之鹽與上文(ii)中所列之任一種抗激素劑(例如上文(ii)中所列之任一種抗雌激素劑，或例如上文(ii)中所列之芳香酶抑制劑)組合的用途；用於製造供治療溫血動物(諸如人)之癌症的藥劑。
在本發明之另一態樣中，提供實例1或其醫藥學上可接受之鹽與mTOR抑制劑(諸如AZD2014(參見實例WO2008/023161))組合的用途；用於製造供治療溫血動物(諸如人)之癌症的藥劑。
在本發明之另一態樣中，提供實例1或其醫藥學上可接受之鹽與PI3Kα抑制劑(諸如本發明人之共同申請中之PCT申請案PCT/GB2014/050163中的彼等PI3Kα/δ抑制劑)組合的用途，係用於製造供治療溫血動物(諸如人)之癌症的藥劑。適合PI3Kα/δ抑制劑之一個實例為PCT/GB2014/050163中之實例3，如上文中所述。
在本發明之另一態樣中，提供實例1或其醫藥學上可接受之鹽與帕伯希布組合的用途，係用於製造供治療溫血動物(諸如人)之癌症的藥劑。
在一個態樣中，式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽(尤其實例1或其醫藥學上可接受之鹽)與上文(ii)中所列之抗腫瘤劑或mTOR抑制劑(諸如AZD2014)或PI3K-α抑制劑(諸如本發明人之共同申請中之PCT申請案PCT/GB2014/050163中之彼等PI3Kα/δ抑制劑，尤其其中的實例3)或帕伯希布組合的上述用途適用於製造供治療乳癌或婦科癌症 (諸如乳癌、子宮內膜癌、卵巢癌或子宮頸癌，尤其乳癌，諸如ER+ve乳癌)的藥劑。
因此，在本發明之另一特徵中，提供一種治療需要此治療之溫血動物(諸如人)之癌症的方法，包含向該動物投與有效量之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽與選自上文(i)至(xi)中所列項之抗腫瘤劑的組合。
根據本發明之另一態樣，提供一種治療需要此治療之溫血動物(諸如人)之癌症的方法，包含向該動物投與有效量之實例1或其醫藥學上可接受之鹽與選自上文(i)至(xi)中所列項之抗腫瘤劑的組合。
根據本發明之另一態樣，提供一種治療需要此治療之溫血動物(諸如人)之癌症的方法，包含向該動物投與有效量之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽與上文(ii)中所列之任一種抗激素劑(例如上文(ii)中所列之任一種抗雌激素劑，或例如上文(ii)中所列之芳香酶抑制劑)的組合。
在本發明之另一態樣中，提供一種治療需要此治療之溫血動物(諸如人)之癌症的方法，包含向該動物投與有效量之實例1或其醫藥學上可接受之鹽與上文(ii)中所列之任一種抗激素劑(例如上文(ii)中所列之任一種抗雌激素劑，或例如上文(ii)中所列之芳香酶抑制劑)的組合。
在本發明之另一態樣中，提供一種治療需要此治療之溫血動物(諸如人)之癌症的方法，包含向該動物投與有效量之實例1或其醫藥學上可接受之鹽與mTOR抑制劑(諸如AZD2014)(參見例如WO2008/023161)的組合。
在本發明之另一態樣中，提供一種治療需要此治療之溫血動物(諸如人)之癌症的方法，包含向該動物投與有效量之實例1或其醫藥學上可接受之鹽與PI3Kα抑制劑(諸如本發明人之共同申請中之PCT申 請案PCT/GB2014/050163中的彼等PI3Kα/δ抑制劑)的組合。適合PI3Kα/δ抑制劑之一個實例為PCT/GB2014/050163中之實例3，如上文中所述。
在本發明之另一態樣中，提供一種治療需要此治療之溫血動物(諸如人)之癌症的方法，包含向該動物投與有效量之實例1或其醫藥學上可接受之鹽與帕伯希布的組合。
在一個態樣中，上述治療癌症之方法為治療乳癌或婦科癌症(諸如乳癌、子宮內膜癌、卵巢癌或子宮頸癌，尤其乳癌，諸如ER+ve乳癌)的方法。
根據本發明之另一態樣，提供一種套組，其包含式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽與選自上文(i)至(xi)中所列項之抗腫瘤劑的組合。
根據本發明之另一態樣，提供一種套組，其包含式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽與選自上文(i)或(ii)中所列項之抗腫瘤劑的組合。
根據本發明之另一態樣，提供一種包含以下之套組：a)呈第一單位劑型的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽；b)選自上文(i)至(xi)中所列項之呈第二單位劑型的抗腫瘤劑；及c)含有該第一及第二劑型的容器構件。
根據本發明之另一態樣，提供一種包含以下之套組：a)呈第一單位劑型的式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽；b)選自上文(i)至(ii)中所列項之呈第二單位劑型的抗腫瘤劑；及c)含有該第一及第二劑型的容器構件。
根據本發明之另一態樣，提供一種套組，其包含實例1或其醫藥學上可接受之鹽與選自上文(i)至(xi)中所列項之抗腫瘤劑的組合。
根據本發明之另一態樣，提供一種套組，其包含實例1或其醫藥 學上可接受之鹽與選自上文(i)或(ii)中所列項之抗腫瘤劑的組合。
根據本發明之另一態樣，提供一種包含以下之套組：a)呈第一單位劑型的實例1或其醫藥學上可接受之鹽；b)選自上文(i)至(xi)中所列項之呈第二單位劑型的抗腫瘤劑；及c)含有該第一及第二劑型的容器構件。
根據本發明之另一態樣，提供一種包含以下之套組：a)呈第一單位劑型的實例1或其醫藥學上可接受之鹽；b)選自上文(i)至(ii)中所列項之呈第二單位劑型的抗腫瘤劑；及c)含有該第一及第二劑型的容器構件。
根據本發明之另一態樣，提供一種包含以下之套組：a)呈第一單位劑型的實例1或其醫藥學上可接受之鹽；b)呈第二單位劑型的抗腫瘤劑，其選自AZD2014、PI3Kα抑制劑(諸如本發明人之共同申請中之PCT申請案PCT/GB2014/050163中的彼等PI3Kα/δ抑制劑)及帕伯希布；及c)含有該第一及第二劑型的容器構件。
在所有上述方法、用途及其他態樣中，在使用實例1之化合物的情況下，其適用作晶形B。
除典型地根據常見醫囑時程進行的標準照護療法之外，可添加如上文所述的組合療法。
雖然式(I)化合物之主要價值係作為治療劑用於溫血動物(包括人)，但其亦適用於抑制ER-α，只要有此需要。因此，其適合作為藥理學標準物用於開發新生物測試及搜尋新藥劑。
根據本發明之另一態樣，提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，係用於治療腫瘤細胞已鑑別出具有突變型ERα基因的癌症患者。在一個實施例中，式(I)化合物為實例1。
根據本發明之另一態樣，提供式(I)化合物或其醫藥學上可接受 之鹽，用於治療其中腫瘤細胞已鑑別出具有突變型ERα基因的癌症。在一個實施例中，式(I)化合物為實例1。
根據本發明之另一態樣，提供一種治療其中腫瘤細胞已鑑別出具有突變型ERα基因之癌症的方法，包含投與有效量之式(I)化合物或其醫藥學上可接受之鹽。在一個實施例中，式(I)化合物為實例1。
在其他實施例中，本發明係關於包含式(I)化合物的醫藥組合物，用於預防及治療其中腫瘤細胞已鑑別出具有突變型ERα基因的癌症。在一個實施例中，式(I)化合物為實例1。
在上述所有態樣中，所測定/鑑別之ERα突變形式位於整個基因之所有位置上。
在使用腫瘤(諸如乳癌)作為實例的上述所有態樣中，所測定/鑑別之ERα特定突變形式為位於位置Ser463Pro、Val543Glu、Leu536Arg、Tyr537Ser、Tyr537Asn及Asp538Gly的彼等突變形式。
圖1顯示實例7形式A之X射線粉末繞射圖案。
圖2顯示實例1形式B之X射線粉末繞射圖案。
圖3顯示實例1形式B之DSC熱分析圖。
圖4顯示實例1形式A之X射線粉末繞射圖案。
圖5顯示實例1形式A之TGA熱分析圖。
圖6顯示實例1形式C之X射線粉末繞射圖案。
圖7顯示實例1形式C之TGA熱分析圖。
圖8顯示實例11之X射線粉末繞射圖案。
圖9顯示實例11之DSC跡線。
圖10顯示使用實例1及mTOR抑制劑(AZD2014)進行之MCF-7異種移植物研究的結果。
圖11顯示使用實例1進行之HCC1428長期雌激素匱乏性(LTED)異種移植物功效的結果。
圖12顯示實例1之最後劑量之後24小時時，HCC1428 LTED活體內異種移植物樣品中的ER蛋白含量。
實例
本發明現利用以下實例加以說明，其中一般而言：
(i)操作係在周圍溫度(亦即在17至25℃範圍內)下及在惰性氣體(諸如氮氣)氛圍下進行；
(ii)蒸發係藉由旋轉蒸發或使用Genevac設備或Biotage v10蒸發器真空進行且在過濾移除殘餘固體之後進行處理程序；
(iii)在自動化Teledyne Isco CombiFlash® Rf或Teledyne Isco CombiFlash® Companion®上進行急驟層析純化，其使用預裝填之RediSep Rf GoldTM Silica管柱(20-40μm，球狀顆粒)、GraceResolvTM濾芯(Davisil®二氧化矽)或Silicycle濾芯(40-63μm)。
(iv)製備性層析係在配有UV收集的Gilson製備性HPLC儀器上進行。
(v)對掌性製備性層析係在配有UV收集器的Gilson儀器(233注射器/溶離份收集器，333 & 334泵，155UV偵測器)或Varian Prep Star儀器(2×SD1泵、325UV偵測器、701溶離份收集器、配合Gilson 305注射運作之泵)上進行。
(vi)產量存在時，不一定為可達到的最大值；
(vii)一般而言，式I之最終產物之結構係依據核磁共振(NMR)譜確認；NMR化學位移值係以δ標度量測[質子核磁共振譜係使用Bruker Avance 500(500MHz)或Bruker Avance 400(400MHz)儀器測定]；除非另外說明，否則量測係在周圍溫度下進行；使用以下縮寫：s：單峰；d：二重峰；t：三重峰；q：四重峰；m：多重峰；dd：雙二重峰；ddd：雙組雙二重峰；dt：雙三重峰；bs：寬信號。
(viii)一般而言，式I之最終產物亦藉由液相層析後之質譜法 (LCMS或UPLC)表徵；UPLC係使用配備有Waters SQ質譜儀的Waters UPLC(管柱溫度40，UV=220-300nm，質量說明=具有正/負轉換的ESI)、使用97% A+3% B至3% A至97% B之溶劑系統、在1ml/min流量下進行1.50分鐘(總運作時間，平衡恢復為起始條件等為1.70min)，其中A=0.1%甲酸/水(酸運作)或0.1%氨/水(鹼運作)，B=乙腈。對於酸分析而言，所用管柱為Waters Acquity HSS T3 1.8μm 2.1×50mm；對於鹼分析而言，所用管柱為Waters Acquity BEH 1.7μm 2.1×50mm；LCMS係使用Waters Alliance HT(2795)、在1.1ml/min流量下進行(95% A至95% B歷時4分鐘，保持0.5分鐘)，Waters Alliance HT配備有Waters ZQ ESCi質譜儀及Phenomenex Gemini-NX(50×2.1mm 5μm)管柱。調節劑保持為恆定5% C(50：50乙腈：水+0.1%甲酸)或D(50：50乙腈：水+0.1%氫氧化銨(0.88SG))，此視其是否為酸性或鹼性方法而定。
(ix)離子交換純化通常係使用SCX-2(Biotage，丙基磺酸官能化二氧化矽，使用三官能矽烷製成，未封端)濾芯進行。
(x)中間物純度係藉由薄層層析、質譜、HPLC(高效液相層析)及/或NMR分析加以評估；
(xi)對實例7進行XRPD分析時，將樣品安置於零背景矽晶圓上且使用PANalytical CubiX Pro繞射儀(1=1.5418Å)分析。對樣品進行離心以改良計數統計。在2°至40° 2θ掃描範圍內、根據θ-2θ組態的反射幾何學收集資料，其中每0.025067°增量曝光25秒。藉由在45kV及40mA下操作的長細聚焦銅管產生X射線。熟習X射線粉末繞射技術者亦認識到，相對峰強度可受例如尺寸超過30微米且具有非單一縱橫比的晶粒影響，此可能影響樣品之分析。熟習此項技術者亦認識到，反射位置可受樣品置放於繞射儀中之準確高度及繞射儀之零點校準的影響。樣品之表面平坦度亦可具有較小的影響。因此，所呈現之繞射圖 案資料不視為絕對值；
(xii)對實例1進行XRPD分析時，藉由將結晶物質之樣品安置於Panalytical單一矽晶體(SSC)晶圓座架上且藉助於顯微鏡載片將樣品攤成薄層來測定X射線粉末繞射圖。樣品以每分鐘30轉進行離心(以改良計數統計)且使用藉由在45kV及40mA下操作之長細聚焦銅管所產生的X射線(波長為1.5418埃)照射。使X射線束通過0.04rad梭拉狹縫(soller slit)，接著將自動的可變發散狹縫設定為20mm且最後遮蔽20mm射線束。返折輻射經導引而通過20mm反散射狹縫及0.04rad梭拉狹縫。在θ-θ模式中，在2度至40度2θ範圍內，樣品每0.0025067° 2θ增量(連續掃描模式)暴露1.905秒。運作時間為3分鐘36秒。儀器裝備有X-Celerator偵測器。控制及資料獲取係藉助於用X'Pert工業軟體操作操作的Dell Pentium 4HT工作站。
(xiii)差示掃描量熱法：分析儀器：TA TA Instruments Q1000 DSC。典型地，配備有蓋之標準鋁鍋中所包含之小於5mg物質以每分鐘10℃之恆定加熱速率在25℃至300℃溫度範圍內加熱。使用氮氣的淨化氣體係以每分鐘50ml流量使用。
(xiv)熱解重量分析分析儀器：TA Instruments Q5000 TGA。典型地，將小於10mg的物質置放於100μl鉑鍋中且以每分鐘10℃之恆定加熱速率在30℃至150℃溫度範圍內加熱。
(xv)使用以下縮寫：
實例1：(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸
由於可能形成光降解產物，因此以下方法應在氮氣氛圍下避光進行。
將(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(350g，766.69mmol)裝入5L固定容器中。向容器中添加異丙醇(2.80L)。一次性添加氫氧化鈉(5M，460ml，2.30mol)且混合物在21℃攪拌16小時。黑色溶液經由過濾器過濾以移除微粒。濾液返回至反應容器中。 過濾器及濾液收集容器用異丙醇(700ml)洗滌且將洗滌液添加至反應容器中。攪拌反應混合物且添加水(1.75L)。將濃鹽酸(37% w/w，165ml，1.92mol)裝入容器中。向容器中再添加鹽酸(21.5ml)以將pH值調節為4.0與4.5之間。溶液加熱至50℃。歷經1小時將水(1.92L)添加至容器中，使內部溫度維持於50至53℃之間。在添加期間，將夾套溫度提高至70℃以使反應器溫度維持於此範圍內。在水添加完成之10分鐘內，混合物自接晶種且開始結晶。混合物在50至52℃保持1.5小時(夾套設定溫度為58℃)。所得黃色懸浮液歷經6小時冷卻至5℃(夾套溫度)。漿液在5℃(夾套溫度)保持11個小時。所得黃色固體藉由過濾分離。濾餅用刮勺刮成糊狀以防止濾餅破裂。容器用水(1.05L)洗滌。 使用洗滌液洗滌濾餅。濾餅在空氣中汲乾，接著歷經4天真空乾燥至恆重(烘箱溫度=30℃)。從而分離出呈黃色結晶固體狀之(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸「形式B」(319.45g，94%)。1H NMR(500MHz,DMSO,27℃)1.05(3H,d),1.08-1.28(6H,m),2.35(1H,dd),2.58(1H,dd),2.8-2.97(2H,m),3.47-3.57(1H,m),5.22(1H,s),6.67(1H,d),6.91-7.06(2H,m),7.19(1H,d),7.41(1H,d),7.46(2H,d),7.54(1H,d),10.58(1H,s),12.62(1H,s)。
可形成形式B結晶物質之用於合成實例1的替代方法如下： 由於可形成光降解產物，因此以下方法應在氮氣氛圍下避光進行。
將(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(50.0g，109.53mmol)於異丙醇(450ml)中攪拌。一次性添加氫氧化鈉(68.34g，65.72ml，328.58mmol)且混合物在20℃攪拌16小時。反應混合物用水(250ml)稀釋，用濃鹽酸(27.28ml，317.63mmol)將pH值調節至 pH4且混合物加熱至50℃。歷經30分鐘再添加水(225ml)，維持溫度高於45℃。在添加期間，物質開始結晶。混合物歷經5小時自50℃冷卻至5℃，接著使懸浮液在0℃再保持11個小時。藉由過濾分離出黃色固體。濾餅用水(100ml)洗滌，在過濾器上再乾燥20分鐘，接著在真空烘箱中乾燥16個小時至恆重(30℃，引出空氣)，得到呈結晶固體狀之標題化合物(46.52g)(形式B)。
1H NMR(500MHz,DMSO,27℃)1.02-1.09(3H,m),1.17(6H,dd),2.37(1H,dd),2.59(1H,dd),2.8-2.98(2H,m),3.47-3.58(1H,m),5.24(1H,s),6.68(1H,d),6.9-7.06(2H,m),7.20(1H,d),7.38-7.51(3H,m),7.55(1H,d),10.59(1H,s),12.60(1H,br)。
晶形B亦可自乙醇/水混合物及乙醇/MTBE混合物中分離。
在本發明之另一態樣中，提供自異丙醇/水混合物中分離之實例1之晶形B。
在本發明之另一態樣中，提供一種分離實例1之晶形B的方法，該方法包含使(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯在異丙醇及鹼中水解，隨後酸化及自異丙醇水溶液中分離出結晶產物。
實例1形式B之特徵為提供以下2θ值中之至少一者(使用CuKα輻射所量測)：8.4及10.9。實例1形式B之特徵為提供實質上如圖2中所示的X射線粉末繞射圖案。十個X射線粉末繞射峰顯示於表A中：
表A 實例1形式B之十個X射線粉末繞射峰
DSC分析實例1形式B顯示其為高熔點固體，其吸熱線顯示在188.6℃開始熔融(圖3)。實例1顯示經由熔融降解可引起熔融起點發生變化，因此188.6℃值不應視為絕對的。
亦已觀測到實例1之兩種溶劑化形式。
形式A為甲基第三丁基醚單溶劑合物。X射線粉末繞射圖案顯示於圖4中。TGA顯示55至150℃之間的相關重量損失為14.7%(圖5)。單甲基第三丁基醚溶劑合物之理論損失經計算為16.6%。
形式C為丙酮單溶劑合物，X射線粉末繞射圖案顯示於圖6中。 TGA顯示50-150℃相關重量損失為10.0% w/w(圖7)。單丙酮溶劑合物之理論損失經計算為11.0%。
如下製備用作起始物質的(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯：
製備三氟甲烷磺酸2-氟-2-甲基丙基酯
在氮氣氛圍下，將2-氟-2-甲基-丙-1-醇(1000g，10.86莫耳)裝入20L容器中。向容器中添加DCM(8.5L)。攪拌混合物且冷卻至1℃。 向混合物中添加2,6-二甲基吡啶(1395g，13.02莫耳)。歷經1小時添加三氟甲烷磺酸酐(3220g；11.41莫耳)於DCM(1L)中之溶液，維持反應混合物溫度低於5℃(在添加期間，夾套設定溫度降低至-20℃)。添加容器及管線用DCM(0.5L)洗滌且洗滌液一次性添加至容器中。混合物在0℃攪拌1小時，得到紅色溶液。
向水(7L)中添加濃鹽酸溶液(1.23L，37% w/w，16.3莫耳)。向紅色溶液中添加稀鹽酸溶液且經攪拌之混合物溫熱至25℃。分離各層且丟棄含水上層。有機層用水(2×5L)洗滌。有機溶液在減壓下濃縮，得到紅色油狀物。使用攪拌膜蒸發器(4.5毫巴，夾套溫度50℃，冷凝器溫度4℃)、藉由蒸餾純化紅色油狀物，得到呈淺紅色油狀之三氟甲烷磺酸2-氟-2-甲基丙基酯(1.69Kg，69%)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6,27℃)δ 1.40(6H,d),4.79(2H,d)。
製備(R)-N-(1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)-2-氟-2-甲基丙-1-胺
在氮氣氛圍下，向100L玻璃內襯夾套式容器中添加(2R)-1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-胺(3.81kg，21.21莫耳)。添加1,4-二噁烷(23L)，且啟動攪拌器。向經攪拌之懸浮液中添加二異丙基乙胺(5.55L；31.82莫耳)，隨後添加三氟甲烷磺酸(2-氟-2-甲基-丙基)酯(5.55kg，23.77莫耳)。向容器中添加1,4-二噁烷(4L)，且混合物加熱至75℃。繼續加熱24小時，隨後將混合物冷卻至25℃。向容器中添加水(30.5L)，隨後添加甲苯(30.5L)。40分鐘之後，關停攪拌器且讓各層分離。移除水層且向有機溶液中添加水(30.5L)。攪拌混合物15分鐘，隨後讓各層分離。自容器中移除水層。有機溶液藉由真空蒸餾(夾套溫度65℃，110毫巴壓力)濃縮，直至約27L鎦出液已移除。將容器中之剩餘溶液冷卻，得到(R)-N-(1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)-2-氟-2-甲基丙-1-胺(15.4Kg，97%)於甲苯中之溶液(33% w/w)。1H NMR(500MHz,DMSO,27℃)0.98(3H,d),1.26(3H,d),1.30(3H,d),2.57-2.75(3H,m),2.81(1H,dd),2.84-2.92(1H,m),6.97(1H,t),7.06(1H,t),7.11-7.22(1H, 多重峰被甲苯信號遮蔽),7.34(1H,d),7.52(1H,d),10.80(1H,s)。
製備{2,6-二氟-4-[(1E)-3-甲氧基-3-側氧基丙-1-烯-1-基]苯基}(羥基)甲烷磺酸鈉
將2,6-二氟-4-溴苯甲醛(1000g，4.39mol)及二氯化1,1-雙(二-第三丁基膦基)二茂鐵鈀(57.2g；87.76mmol)裝入20L容器中。添加氯化四-N-丁基銨(122g，438.97mmol)，隨後添加二甲基乙醯胺(5L)。 容器用氮氣流淨化。向容器中添加二異丙基乙胺(1.5L，8.78mol)，隨後添加丙烯酸甲酯(0.435L，4.82mol)。攪拌混合物且加熱至60℃。混合物在此溫度下保持20小時。向混合物中添加乙酸乙酯(10L)且停止加熱。向容器中添加水(5L)。經攪拌之混合物冷卻至25℃且繼續攪拌10分鐘。停止攪拌且讓各層分離。移除水層且丟棄。有機層依序用鹽酸(2.2M，6L)及水(5L)洗滌。向容器中添加Phosphonics SPM32清除劑(1050g，1050mol)且混合物在25℃攪拌3天。藉由過濾移除固體材料。濾餅用乙醇(5L)洗滌且合併之濾液在減壓下濃縮，得到固體。將固體溶於乙醇(9L)中且溶液在20L容器中攪拌。溶液加熱至50℃。歷經30分鐘添加亞硫酸氫鈉(460g，4.42mol)於水(2.5L)中之溶液。所得稠漿在50℃攪拌4小時。漿液歷經2小時冷卻至20℃。藉由過濾分離固體且容器及濾餅用MTBE(2×3L)洗滌。所得固體真空乾燥，得到呈淺褐色固體狀之{2,6-二氟-4-[(1E)-3-甲氧基-3-側氧基丙-1-烯-1-基]苯基}(羥基)甲烷磺酸鈉(1035g，71%)。1H NMR(500MHz,DMSO,27℃)δ 3.73(3H,s),5.32(1H,d),5.94(1H,d),6.76(1H,d),7.40(2H,d),7.60(1H,d)。
製備(E)-3-(3,5-二氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯
在氮氣氛圍下，向100L容器中添加{2,6-二氟-4-[(1E)-3-甲氧基-3-側氧基丙-1-烯-1-基]苯基}(羥基)甲烷磺酸鈉(1.211kg，3.52mol)，隨後添加碳酸鉀(0.974kg，7.05mol)。添加水(9.1L)且開啟攪拌器。添加乙酸乙酯(9.1L)。混合物在25℃攪拌5小時。關停攪拌器且讓混合物在25℃靜置14小時。移除下層水相且丟棄。在減壓下濃縮上層有機相，得到淺褐色固體。真空乾燥固體，得到呈褐色固體狀之(E)-3-(3,5-二氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯(608g，76%)。1H NMR(500MHz,DMSO,27℃)δ 3.77(3H,s),6.94(1H,d),7.66(1H,d),7.71(2H,d),10.20(1H,s)。
製備(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯
在氮氣氛圍下，向20L容器中裝入(E)-3-(3,5-二氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯(0.606kg，2.65mol)及(R)-N-(1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)-2-氟-2-甲基丙-1-胺(33% w/w於甲苯中之溶液，2.0kg，2.65mol)，隨後裝填甲苯(4.22L)。向容器中添加乙酸(304ml，5.31mol)。攪拌混合物且加熱至80℃。混合物在80℃攪拌隔夜，隨後冷卻至20℃。向混合物中添加碳酸鉀(0.916kg，6.63mol)於水(3.3L)中之溶液。攪拌混合 物10分鐘，隨後關停攪拌器且讓各層分離。移除水層且丟棄。將水(3.3L)裝入反應器中。攪拌混合物10分鐘，接著讓其靜置10分鐘。移除下層水相且讓有機層在室溫下靜置隔夜。將此批料加熱至80℃。歷經35分鐘向熱溶液中添加庚烷(4.61L)。經攪拌之混合物在約80℃保持1小時。歷經2個小時將混合物冷卻至30℃，在此期間，產物結晶。 漿液在30℃攪拌2.5小時。藉由過濾分離出固體。反應容器壁用庚烷洗滌且洗滌液用於洗滌濾餅。真空乾燥固體，得到呈粉紅色固體狀之(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(0.763kg，61%)。1H NMR(400MHz,DMSO,27℃)δ 1.06(3H,d),1.13(3H,d),1.21(3H,d),2.35(1H,dd),2.58(1H,dd),2.8-2.98(2H,m),3.44-3.61(1H,m),3.74(3H,s),5.24(1H,s),6.80(1H,d),6.9-7.05(2H,m),7.19(1H,d),7.41(1H,d),7.50(2H,d),7.63(1H,d),10.58(1H,s)。m/z：ES+[M+H]+457。
實例1之替代製法：(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸
向(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(11.28g，24.71mmol)於THF(143ml)及甲醇(71.4ml)中之溶液中添加7.5M氫氧化鈉(32.9ml，247.10mmol)。反應物在室溫下攪拌4小時。藉由添加2N HCl溶液將水溶液之pH值調節至約6.5，接著用乙醚(3×150ml)萃 取該溶液。合併之有機物經Na2SO4乾燥且濃縮。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至20%甲醇/DCM)純化，得到黃色固體。由於溶解度高於預期溶解度，因此嘗試用丙酮/庚烷濕磨失敗。移除溶劑，得到黃色固體，於添加有幾滴乙醚的異己烷(50ml)中濕磨，過濾出所得固體且乾燥，得到呈黃色粉末狀之粗產物(11.14g)。在氮氣下且在黑暗中將固體溶於乙醇(100ml)中。接著在黑暗中，在62℃，使用真空泵蒸發溶液直至5mBar。此程序重複兩次且所得黃色玻璃狀物用刮勺刮成細粉末且在62℃使用真空泵抽至5mBar歷時60分鐘，得到黃色粉末。粉末接著在真空烘箱中、在62℃及300mBar下、在P2O5上擱置隔夜，得到呈淺黃色固體狀之標題產物(9.77g，89%)。1H NMR(400MHz,DMSO,27℃)δ 1.07-1.16(3H,m),1.18-1.29(6H,m),2.39(1H,dd),2.62(1H,dd),2.92(2H,dd),3.56(1H,d),5.26(1H,s),6.70(1H,d),7.02(2H,dd),7.22(1H,d),7.47(3H,dd),7.58(1H,d),10.60(1H,s),12.60(1H,s)。m/z：ES+(電噴霧+)[M+H]+443。
如下製備用作起始物質的(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯：
製備2-氟-2-甲基丙-1-醇
在0℃，歷經15分鐘將氫化鋁鋰(3.37g，88.56mmol)逐份添加至2-氟-2-甲基丙酸乙酯(9.9g，73.80mmol)於乙醚(184ml)中之冷卻溶液中。反應物攪拌1小時，接著添加水(3.3ml)，隨後依序添加15% NaOH溶液(3.3ml)及水(6.7ml)。懸浮液攪拌15分鐘，接著過濾且固體用乙醚洗滌。蒸發濾液，得到呈無色油狀之2-氟-2-甲基丙-1-醇(5.90g，87%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3,27℃)δ 1.37(6H,d),3.56(2H,d),OH未觀測到。
三氟甲烷磺酸2-氟-2-甲基丙基酯之替代製法
在-10℃，向2-氟-2-甲基丙-1-醇(6.25g，67.85mmol)於DCM(146ml)中之溶液中添加三氟甲烷磺酸酐(12.06ml，71.24mmol)，隨後添加2,6-二甲基吡啶(11.42ml，81.42mmol)。反應物攪拌1小時，接著用2N HCl(2×100ml)及飽和NaHCO3溶液(2×100ml)洗滌。有機相接著經Na2SO4乾燥且濃縮，得到呈紅色油狀之三氟甲烷磺酸2-氟-2-甲基丙基酯(12.89g，85%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3,27℃)δ 1.46(6H,d),4.41(2H,d)。
此中間物可藉由真空蒸餾純化。DSC分析顯示，該物質具有自加熱的潛力。處於製程安全之故，攪拌膜蒸發器或類似製程可優於分批蒸餾。
(R)-N-(1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)-2-氟-2-甲基丙-1-胺之替代製法
向(R)-1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-胺(5.00g，28.70mmol)及N-乙基-N-異丙基丙-2-胺(7.44ml，43.04mmol)於二噁烷(50ml)中之溶液中添加三氟甲烷磺酸2-氟-2-甲基丙基酯(8.04g，35.87mmol)。反應物加熱至90℃維持3小時。冷卻至室溫後，反應物用EtOAc(200ml)稀釋且用飽和NaHCO3溶液(2×100ml)洗滌。水相用EtOAc(150ml)萃取，合併之有機物接著經MgSO4乾燥且濃縮。粗產物藉由急驟二氧化矽層析 法(溶離梯度100% EtOAc)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈褐色油狀之(R)-N-(1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)-2-氟-2-甲基丙-1-胺(6.49g，91%)。 1H NMR(400MHz,CDCl3,27℃)δ 1.14(3H,d),1.31(3H,d),1.37(3H,d),1.94(1H,s),2.63-2.87(3H,m),2.92(1H,dd),3.07(1H,h),7.07(1H,d),7.08-7.15(1H,m),7.16-7.24(1H,m),7.37(1H,d),7.62(1H,d),8.04(1H,s)。m/z：ES+[M+H]+249。
(E)-3-(3,5-二氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯之替代製法
將4-溴-2,6-二氟苯甲醛(9.99g，45.20mmol)及丙烯酸甲酯(6.14ml，67.81mmol)溶解於經澈底除氣之DMA(100ml)中且添加三-鄰甲苯基膦(1.376g，4.52mmol)、乙酸鈀(II)(0.507g，2.26mmol)及三乙胺(12.60ml，90.41mmol)。攪拌反應物且加熱至80℃維持6小時。冷卻反應混合物且經由矽藻土層過濾，且用甲醇(50ml)洗滌。粗產物預先吸收至二氧化矽上且藉由抽吸式層析法(用0-10%乙醚/二氯甲烷溶離)純化。蒸發含有所要產物的溶離份且用乙醚(50ml)濕磨，得到黃色固體，用水(50ml)濕磨且在高真空下、在50℃乾燥，得到呈黃色固體狀之(E)-3-(3,5-二氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯(8.85g，87%)。1H NMR(400MHz,DMSO,27℃)δ 3.75(3H,s),6.93(1H,d),7.52-7.81(3H,m),10.18(1H,s)。LCMS中未觀測離子質量。
(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯之替代製法
將(E)-3-(3,5-二氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯(6.58g，29.09mmol)添加至(R)-N-(1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)-2-氟-2-甲基丙-1-胺(6.02g，24.24mmol)於甲苯(51.1ml)及乙酸(2.78ml，48.48mmol)中之懸浮液中。反應物加熱至80℃維持5小時。反應混合物藉由使用SCX-2管柱的離子交換層析法純化。所要產物自使用7M NH3/甲醇的管柱溶離且將純溶離份蒸乾，得到褐色固體。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至30% EtOAc/庚烷)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈黃色固體狀之標題產物(7.52g，68.0%)。1H NMR(400MHz,DMSO,100℃)δ 1.10(3H,d),1.12-1.31(6H,m),2.28-2.72(2H,m),2.84-3.09(2H,m),3.52-3.69(1H,m),3.76(3H,s),5.30(1H,s),6.64(1H,d),6.9-7.11(2H,m),7.21(1H,d),7.32(2H,d),7.42(1H,d),7.58(1H,d),10.14(1H,s)。m/z：ES+[M+H]+457。
實例2：(E)-3-(4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸
將7.5M氫氧化鈉溶液(0.983ml，7.37mmol)添加至(E)-3-(4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲 哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(310mg，0.74mmol)於甲醇(5ml)中之溶液中。混合物在20℃攪拌2小時。反應混合物藉由使用SCX-2管柱的離子交換層析法純化。含有所要產物的溶離份自使用7M NH3/甲醇的管柱溶離且將純溶離份蒸乾，得到黃色固體。粗產物藉由使用水(含有0.1%甲酸)與MeCN之極性遞減混合物作為溶離劑的製備型HPLC(Waters SunFire管柱，5μ二氧化矽，50mm直徑，100mm長度)純化。 將含有所要化合物的溶離份蒸乾且接著裝載至SCX-2管柱上且用7N氨/甲醇溶離，得到呈黃色固體狀之標題產物(63.0mg，21.02%)。1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ 1.06(3H,d),1.30(3H,d),1.47(3H,d),2.53-2.64(2H,m),2.79(2H,s),3.10(1H,d),5.08(1H,s),6.47(1H,d),6.98(1H,t),7.06(1H,t),7.19-7.37(3H,m),7.44(1H,d),7.56(1H,d),7.63(2H,d),10.81(1H,s),12.30(1H,s)。m/z：ES+[M+H]+407。
如下製備用作起始物質的(E)-3-(4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯：
製備(E)-3-(4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯
將4-溴苯甲醛(30g，162.15mmol)及丙烯酸甲酯(20.94g，243.22mmol)溶解於經澈底除氣的DMA(300ml)中且用三-鄰甲苯基膦(4.94g，16.21mmol)、乙酸鈀(II)(1.820g，8.11mmol)及三乙胺(45.2ml，324.29mmol)處理且加熱至110℃維持16個小時。反應隨後呈現完全。將反應混合物傾注入傾注入水(4L)中且將所得沈澱物過濾且乾燥。固體用100%庚烷至30% EtOAc/庚烷溶離、在二氧化矽上層析。 合併有關溶離份且蒸乾，得到黃色固體產物，用庚烷濕磨，過濾且用冷庚烷洗滌。將固體乾燥，得到黃色結晶產物(E)-3-(4-甲醯基苯基)丙 烯酸甲酯(25.6g，83%)。1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ 3.75(3H,s),6.79(1H,d),7.72(1H,d),7.93(4H,s),10.03(1H,s)。LCMS中未觀測到離子質量。
製備(E)-3-(4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯
將(R)-N-(1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)-2-氟-2-甲基丙-1-胺(如實例1(製備起始物質)中所述獲得)(450mg，1.81mmol)及(E)-3-(4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯(345mg，1.81mmol)溶於甲苯(15ml)中，添加乙酸(5ml)及分子篩。反應物在110℃、在氮氣下攪拌16個小時，接著冷卻至室溫。粗產物藉由使用SCX-2管柱的離子交換層析法純化。所要產物自使用7M NH3/甲醇的管柱溶離且將純溶離份蒸乾，得到粗產物。 粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至30% EtOAc/庚烷)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈黃色固體狀之(E)-3-(4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(317mg，41.6%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)δ 1.09(3H,d),1.30(3H,d),1.47(3H,d),2.48-2.78(4H,m),3.30(1H,m),3.79(3H,s),5.09(1H,s),6.40(1H,d),7.12(1H,td),7.17(1H,td),7.29(1H,d),7.34(2H,d),7.43(2H,d),7.54(1H,d),7.66(2H,m)。 m/z：ES+[M+H]+421。
實例3：(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸
向(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(275mg，0.60mmol)於THF(1.5ml)及甲醇(1.5ml)中之溶液中添加2M氫氧化鈉(3.0ml，6.00mmol)。反應物在室溫下攪拌3個小時。添加EtOAc(15ml)及水(15ml)，接著藉由添加2N HCl將水溶液之pH值調節至約7。 分離各層且水相用EtOAc(15mL)萃取。合併之有機物經Na2SO4乾燥且濃縮。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至10%甲醇/DCM)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈淺黃色固體狀之標題產物(250mg，94%)。1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ 0.77(3H,d),1.06(3H,d),1.93(1H,m),2.18(1H,dd),2.58(1H,dd),2.65(1H,dd),2.84(1H,dd),3.35(1H,dd),4.32(1H,d),4.44(1H,d),5.16(1H,s),6.67(1H,d),6.93-7.04(2H,m),7.21(1H,d),7.42(1H,d),7.46(2H,m),7.54(1H,d),10.57(1H,s),12.51(1H,s)。m/z：ES+[M+H]+443。
如下製備用作起始物質的(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯：
製備(S)-3-氟-2-甲基丙-1-醇
向(R)-3-羥基-2-甲基丙酸甲酯(9.25ml，83.81mmol)於DCM(77ml)中之溶液中逐滴添加N,N-二乙基-1,1,2,3,3,3-六氟丙-1-胺(18.25 ml，100.57mmol)(反應物溫熱至約40℃)。反應物在周圍溫度下攪拌1小時，接著溫熱至回流維持4小時，隨後冷卻至室溫隔夜。將反應混合物傾倒至冰上，且分離各層。水相用DCM(2×150ml)萃取，合併之有機物接著經乾燥且小心地濃縮。將殘餘物溶於THF(200ml)中且在冰浴中冷卻。氫化鋁鋰(6.45g，167.61mmol)歷經15分鐘分多份添加。反應物在0℃攪拌1小時且溫熱至室溫再維持1小時。在冰浴中冷卻後，藉由添加水(7ml)、隨後添加15% NaOH(7ml)且最後添加水(21ml)來淬滅反應。添加MgSO4直至形成粒狀固體。經由矽藻土過濾固體且固體用乙醚(50ml)洗滌。濾液用2N HCl(2×100ml)洗滌，接著有機相經Na2SO4乾燥且濃縮。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至10% EtOAc/DCM)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈淡黃色油狀之(S)-3-氟-2-甲基丙-1-醇(6.42g，83%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)δ 0.97(3H,dd),1.96-2.14(1H,m),3.64(2H,d),4.3-4.42(1H,m),4.42-4.54(1H,m),OH未觀測到。
製備三氟甲烷磺酸(S)-3-氟-2-甲基丙基酯
在0℃，向(S)-3-氟-2-甲基丙-1-醇(7.9g，85.77mmol)於DCM(140ml)中之經攪拌溶液中添加三氟甲烷磺酸酐(17.31ml，102.92mmol)，隨後逐滴添加2,6-二甲基吡啶(11.95ml，102.92mmol)。反應混合物在0℃攪拌45分鐘且在室溫攪拌30分鐘。反應混合物用DCM(60ml)稀釋，且依序用1M HCl(3×100ml)、飽和碳酸氫鈉溶液(100ml)及飽和鹽水(50ml)洗滌。有機層經Na2SO4乾燥，過濾且蒸發至接近乾燥。溶液經由二氧化矽柱塞過濾且用DCM(50ml)充分洗滌且蒸發，得到呈狀之三氟甲烷磺酸(S)-3-氟-2-甲基丙基酯(14.38g， 74.8%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,27℃)δ 1.09(3H,dd),2.24-2.44(1H,m),4.30(0.5H,dd),4.37-4.46(1H,m),4.52(2.5H,tt)。
製備(S)-N-((R)-1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)-3-氟-2-甲基丙-1-胺
將三氟甲烷磺酸(S)-3-氟-2-甲基丙基酯(666mg，2.97mmol)添加至(R)-1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-胺(470mg，2.7mmol)及N-乙基-N-異丙基丙-2-胺(0.700ml，4.05mmol)於1,4-二噁烷(6.05ml)中之溶液中。 反應物在室溫下攪拌1個小時。反應混合物用EtOAc(20ml)稀釋且用水(20ml)洗滌。水相用EtOAc(2×20ml)萃取，合併之有機相接著經乾燥(MgSO4)且濃縮。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至10%甲醇/DCM)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈褐色油狀之(S)-N-((R)-1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)-3-氟-2-甲基丙-1-胺(590mg，88%)。 1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)δ 0.86(3H,dd),1.20(3H,d),1.94-2.11(1H,m),2.64-2.74(2H,m),2.85-2.98(2H,m),3.05-3.15(1H,m),4.13-4.39(2H,m),7.09(1H,d),7.12(2H,ddd),7.20(1H,ddd),7.33-7.41(1H,m),7.56-7.65(1H,m),8.10(1H,s)。m/z：ES+[M+H]+249。
製備(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯
將乙酸(2.0ml)添加至(S)-N-((R)-1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)-3-氟-2-甲基丙-1-胺(273mg，1.10mmol)及(E)-3-(3,5-二氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯(如實例1(製備起始物質)中所述獲得)(226mg，1mmol)於甲苯(8.0ml)中之溶液中。反應物溫熱至95℃維持2.5小時。在真空下移除揮發物，接著使殘餘物通過SCX-2管柱。管柱接著用7M NH3/甲醇溶離以釋放產物。濃縮濾液且粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至10%甲醇/DCM)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈淺黃色固體狀之(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(282mg，61.8%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)δ 0.82(3H,d),1.12(3H,d),1.81-1.99(1H,m),2.24(1H,ddd),2.64(1H,ddd),2.71(1H,dd),2.93-3.01(1H,ddd),3.42(1H,dq),3.81(3H,s),4.25-4.39(1H,m),4.38-4.53(1H,m),5.20(1H,s),6.39(1H,d),6.99(2H,m),7.06-7.16(2H,m),7.21-7.25(1H,m),7.52(3H,m)。m/z：ES+[M+H]+457。
實例4：(E)-3-(4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸
向(E)-3-(4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(285mg，0.68mmol)於甲醇(3ml)中之溶液中添加7.5M氫氧化鈉溶液(0.904ml，6.78mmol)。混合物在20℃攪拌2小時。反應混合物藉由使用SCX-2管柱的離子交換層析法純化。含有所要產物的溶離份自使用7M NH3/甲醇的 管柱溶離且將純溶離份蒸乾，得到黃色固體。粗產物藉由使用水(含有1% NH3)與MeCN之極性遞減混合物作為溶離劑的製備型LCMS(Phenomenex Gemini-NX axia Prep C18 OBD管柱，5μ二氧化矽，50mm直徑，100mm長度)純化。將含有所要化合物的溶離份蒸乾，得到呈黃色固體狀之標題產物(80mg，29.0%)。1H NMR(500MHz,DMSO,33℃)δ 0.87(3H,d),1.04(3H,d),1.91-2.27(2H,m),2.50(1H,p),2.57-2.75(2H,m),3.13(1H,s),4.51(2H,dd),4.86(1H,s),6.47(1H,d),6.92-6.99(1H,m),7-7.09(1H,m),7.15-7.35(3H,m),7.35-7.5(2H,m),7.57(2H,d),10.64(1H,d),CO2H未觀測到。m/z：ES+[M+H]+407。
如下製備用作起始物質的(E)-3-(4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯：
製備(E)-3-(4-((1S,3R)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯
在氮氣下，在23℃，向(R)-1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-胺(17g，97.57mmol)於乙酸(250ml)中之經攪拌溶液中添加(E)-3-(4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯(如實例2(製備起始物質)中所述獲得)(18.56g，97.57mmol)。所得溶液在80℃攪拌2小時。將反應混合物蒸乾且再溶解於DCM(500ml)中，且依序用飽和NaHCO3(300ml×2)、2M NaOH(aq)(300ml)、水(300ml)及飽和鹽水(300ml)洗滌。有機層經MgSO4乾燥，過濾且蒸發，得到粗產物。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶 離梯度1至7%甲醇/DCM)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈米色泡沫狀之(E)-3-(4-((1S,3R)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(25.1g，74.3%)。產物大部分為順式異構體，其含有不可分離的約12%反式異構體。1HNMR(400MHz,DMSO,30℃)δ 1.25(3H,d),2.37-2.48(1H,m),2.74(1H,d),3.12(1H,s),3.73(3H,s),5.18(1H,s),6.64(1H,d),6.97(2H,dd),7.19(1H,d),7.36-7.46(3H,m),7.64-7.75(3H,m),10.19(1H,s),NH未觀測到。m/z：ES+[M+H]+347。
製備(E)-3-(4-((1S,3R)-2-烯丙基-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯
將(E)-3-(4-((1S,3R)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(35g，101.03mmol)、3-溴丙-1-烯(9.62ml，111.14mmol)及N-乙基-N-異丙基丙-2-胺(19.36ml，111.14mmol)懸浮於乙腈(160ml)中，使氮氣鼓泡通過5分鐘且接著將混合物密封於微波管中。反應物於微波反應器中加熱至140℃維持3.5小時且冷卻至室溫。
將反應混合物蒸乾且再溶解於DCM(100ml)中，且依序用1M檸檬酸(100ml)、水(100ml)及飽和鹽水(100ml)洗滌。有機層經MgSO4乾燥，過濾且蒸發，得到粗產物。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至20% EtOAc/庚烷)純化。將純溶離份蒸乾，得到(E)-3-(4-((1R,3R)-2-烯丙基-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯 基)丙烯酸甲酯：(E)-3-(4-((1S,3R)-2-烯丙基-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(10.00g，25.6%)之50：50混合物，其呈淺黃色固體狀。m/z：ES+[M+H]+387。
製備(E)-3-(4-((1R,3R)-2-烯丙基-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯
在氮氣下，在20℃，向含有(E)-3-(4-((1S,3R)-2-烯丙基-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(9.7g，25.10mmol)之DCM(100ml)中添加三氟乙酸(5.59ml，75.29mmol)。 所得溶液在20℃攪拌3天。反應混合物小心地用飽和NaHCO3溶液(250ml)稀釋，且DCM層依序用水(250ml)及飽和鹽水(250ml)洗滌。有機層經MgSO4乾燥，過濾且蒸發，得到粗產物。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度10至20% EtOAc/庚烷)純化。將溶離份蒸乾，得到(E)-3-(4-((1R,3R)-2-烯丙基-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯：(E)-3-(4-((1S,3R)-2-烯丙基-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(7.99g，82%)之65：35混合物，其呈淺黃色固體狀。m/z：ES+[M+H]+387。
製備(E)-3-(4-((1R,3R)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯
使7批單獨65：35(E)-3-(4-((1R,3R)-2-烯丙基-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯：(E)-3-(4-((1S,3R)-2-烯丙基-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(2.00g，5.17mmol)如下反應。
將(E)-3-(4-((1R,3R)-2-烯丙基-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(2.00g，5.17mmol)及氯參(三苯膦)銠(I)(威爾金森催化劑(Wilkinson's catalyst))(2.346g，2.54mmol)懸浮於乙腈(12ml)及水(2.4ml)中，且使氮氣鼓泡通過5分鐘，隨後密封於微波管中。反應物於微波反應器中加熱至100℃維持60分鐘且冷卻至室溫。合併反應混合物且蒸乾且再溶解於DCM(200ml)中且添加飽和NaHCO3溶液(200ml)。有機層依序用水(200ml)及飽和鹽水(200ml)洗滌，隨後經MgSO4乾燥，過濾且蒸發，得到粗產物。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至5%甲醇/DCM)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈淺黃色固體狀之(E)-3-(4-((1R,3R)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(7.02g，55.9%)。1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ 1.14(3H,d),2.27-2.4(1H,m),2.81(1H,dd),2.94-3.05(1H,m),3.72(3H,s),5.19(1H,s),6.60(1H,d),6.94-7(1H,m),7.01-7.09(1H,m),7.26(3H,d),7.43(1H,d),7.59-7.68(3H,m),10.70(1H,s),NH未觀測到。m/z：ES+[M+H]+347。
製備(E)-3-(4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯
向(E)-3-(4-((1R,3R)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(300mg，0.87mmol)及N,N-二異丙基乙胺(0.226ml，1.30mmol)於1,4-二噁烷(5ml)中之溶液中添加三氟甲烷磺酸(S)-3-氟-2-甲基丙基酯(如實例3(製備起始物質)中所述獲得)(291mg，1.30mmol)。混合物在90℃攪拌1小時，接著將混合物蒸乾且將殘餘物分配於DCM(30ml)與水(30ml)之間。水層用DCM(30ml)萃取且將萃取物與有機層合併。所合併之萃取物經由相分離紙過濾且蒸發。殘餘物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離溶劑：15% EtOAc/庚烷)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈灰白色固體狀之(E)-3-(4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(314mg，86%)。1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ 0.87(3H,d),1.06(3H,d),1.9-2.28(2H,m),2.55-2.8(3H,m),2.97-3.21(1H,m),3.72(3H,s),4.31-4.69(2H,m),4.88(1H,s),6.60(1H,dd),6.98(1H,t),7.04(1H,t),7.17-7.35(3H,m),7.44(1H,d),7.55-7.76(3H,m),10.65(1H,s)。m/z：ES+[M+H]+421。
實例5：(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)
向含有(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1)(217mg，0.46mmol)之THF(1ml)/甲醇(1ml)中添加氫氧化鈉(184mg，4.61mmol)。所得溶液在20℃攪拌16小時。反應物用水(10ml)稀釋且藉由添加2N HCl將pH值調節至7。溶液用EtOAc(2×20ml)萃取。合併之有機物經Na2SO4乾燥且濃縮。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至50% EtOAc/庚烷)純化。將純溶離份蒸發，得到粗物質。使用乙醚/異己烷混合物濕磨粗產物，得到呈黃色固體狀之標題產物(53.0mg，25.2%)。1H NMR(400MHz,DMSO,27℃)δ 0.54(3H,d),1.06(3H,s),1.34(3H,s),2.14(1H,dd),2.66(1H,d),2.83(1H,d),3.03(1H,dd),4.21(1H,t),4.33(1H,t),5.12(1H,s),6.73(1H,d),7.01(2H,dtd),7.14-7.28(1H,m),7.43(1H,d),7.54(2H,s),7.59(1H,d),10.50(1H,s),12.61(1H,s),CO2H未觀測到。m/z：ES+[M+H]+457。
用作起始物質的3-(3,5-二氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸酯(異構體1)如下製備：
製備(E)-3-(4-(3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)-3,5-二氟苯基)丙烯酸甲酯
將1-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基丙-2-胺(807mg，4.29mmol)與(E)-3-(3,5-二氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯(如實例1(製備起始物質)中所述獲得)(970mg，4.29mmol)合併於乙酸(15ml)中且混合物加熱至80℃維持2小時。反應混合物藉由使用SCX-2管柱的離子交換層析法純化。所要產物自使用2M NH3/甲醇的管柱溶離且將含有產物的溶離份蒸乾，得到呈黃色泡沫狀之(E)-3-(4-(3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)-3,5-二氟苯基)丙烯酸甲酯(1610mg，95%)。1H NMR(500MHz,DMSO,20℃)δ 1.15(3H,s),1.27(3H,s),2.23(1H,s),2.61(2H,s),3.75(3H,s),5.46(1H,s),6.84(1H,d),6.97(2H,dtd),7.18(1H,d),7.39(1H,d),7.58(2H,s),7.67(1H,d),10.60(1H,s)。
m/z：ES-[M-H]-395。
製備3-(3,5-二氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸酯(異構體1)
向(E)-3-(4-(3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)-3,5-二氟苯基)丙烯酸甲酯(0.3g，0.76mmol)與N-乙基-N-異丙基丙-2-胺(0.458ml，2.65mmol)於1,4-二噁烷(2ml)中之溶液中添加三氟甲烷 磺酸(S)-3-氟-2-甲基丙基酯(如實例3(製備起始物質)中所述獲得)(0.339g，1.51mmol)。繼續攪拌24小時，接著在真空下移除揮發物且藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至25% EtOAc/庚烷)純化粗產物。將純溶離份蒸乾，得到呈白色固體狀之(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(0.202g，36%)。將該物質與另一分批(0.36g)合併且藉由製備型HPLC(Chiralpak IA管柱，20μm二氧化矽，20mm直徑，250mm長度)純化(庚烷：IPA 70：30，80mL/min(4次注射))。將含有所要化合物的溶離份蒸發，產生3-(3,5-二氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸酯(異構體1，第一溶離，217mg)及3-(3,5-二氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸酯(異構體2，第二溶離，165mg)。在Chiralpak IA管柱(5μm二氧化矽，4.6mm直徑，50mm長度，庚烷：IPA 70：30,2ml/min)上進行分析。
1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ 0.50(3H,d),1.02(3H,s),1.30(3H,s),2.11(1H,dd),2.62(2H,d),2.80(1H,d),2.99(1H,dd),3.74(3H,s),4.09-4.23(1H,m),4.29(1H,d),5.09(1H,s),6.81(1H,d),6.97(2H,dt),7.16(1H,d),7.39(1H,d),7.53(2H,d),7.64(1H,d),10.44(1H,s)。m/z：ES+[M+H]+471。
實例6：(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)
向(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1)(148mg，0.31mmol)於THF(0.8ml)/甲醇(0.8ml)中之溶液中添加2M氫氧化鈉(1.6ml，3.20mmol)。反應物在室溫下攪拌3個小時。添加EtOAc(15ml)及水(15ml)，且藉由添加2N HCl將水溶液之pH值調節至約7。分離各層且水相用EtOAc(15mL)萃取。合併之有機物經Na2SO4乾燥且濃縮。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度25至100% EtOAc/庚烷)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈淺黃色固體狀之標題產物(異構體1)(124mg，86%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)δ 1.03(3H,d),1.08(3H,s),1.16(3H,d),1.35(3H,s),2.56(1H,dd),2.66(1H,d),3.02(1H,d),3.17(1H,dd),5.24(1H,s),6.39(1H,d),7.00(2H,d),7.05-7.16(2H,m),7.20(1H,dd),7.28(1H,s),7.49(1H,dd),7.61(1H,d),CO2H未觀測到。m/z：ES+[M+H]+457。
如下製備用作起始物質的(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1)：
製備(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1)
向(E)-3-(4-(3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)-3,5-二氟苯基)丙烯酸甲酯(如實例5(製備起始物質)中所述獲得)(600mg，1.51mmol)與N-乙基-N-異丙基丙-2-胺(0.915ml，5.30mmol)於1,4-二噁烷(2.5ml)中之溶液中添加三氟甲烷磺酸2-氟-2-甲基丙基酯(如實例1(製備起始物質)中所述獲得)(679mg，3.03mmol)。反應物在室溫下攪拌1個小時。反應物接著加熱至105℃維持88小時。在真空下移除揮發物且藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至50% EtOAc/庚烷)純化粗產物。將純溶離份蒸乾，得到呈白色固體狀之(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(430mg，60.4%)。外消旋產物藉由製備型HPLC(Chiralpak AD管柱，20μm二氧化矽，50mm直徑，250mm長度)(庚烷：乙醇90：10，90mL/min)純化。將含有所要化合物的溶離份蒸乾，得到(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1，第一溶離，149mg，34.6%)及(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體2，第二溶離，143mg，33.3%)，其呈米色固體狀。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)δ 1.01(3H,d),1.08(3H,s),1.15(3H,d),1.34(3H,s),2.55(1H,dd),2.66(1H,d),2.98-3.06(1H,m),3.17(1H,dd),3.80(3H,s),5.23(1H,s),6.38(1H,d),6.97(2H,d),7.07-7.12(2H,m),7.17-7.22(1H,m),7.32(1H,s),7.46-7.5(1H,m),7.52(1H,d)。m/z ES-[M-H]-469。
實例7：(E)-3-(4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)
向(E)-3-(4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1)(3.55g，8.17mmol)於甲醇(100ml)、THF(100ml)及水(75ml)中之溶液中添加2M氫氧化鈉溶液(20.42ml，40.85mmol)。混合物在40℃加熱16小時。 混合物用水(100ml)稀釋且濃縮至使得有機溶劑已移除的體積。所得水溶液用2M HCl酸化至pH 6。所得水性懸浮液用DCM(500ml)(添加鹽水以有助於分離其形成的乳液)萃取，經由相分離紙過濾，經MgSO4乾燥，接著經由矽藻土過濾且蒸發，得到約3.5g淺黃色固體。 粗產物用乙醚/DCM(1：1，150ml)處理且用超音波處理。所形成的精細懸浮液通過二氧化矽墊(約100g)且二氧化矽用乙醚(2L)溶離。將含有產物的溶離份合併，蒸發且在真空下、在50℃乾燥，得到呈米色固體狀之標題產物(2.305g，64.5%)。1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ 0.52(3H,d),1.03(3H,s),1.05-1.16(1H,m),1.23(3H,s),2.21(1H,dd),2.65(1H,d),2.84(1H,d),2.89(1H,dd),4.19(1H,ddd),4.31(1H,ddd),4.66(1H,s),6.50(1H,d),6.93(1H,ddd),6.98(1H,ddd),7.18(1H,d),7.38(2H,d),7.40(1H,d),7.58(1H,d),7.63(2H,d),10.18(1H,s),12.30(1H,s)。m/z：ES+[M+H]+421。
在塞緊的250ml圓底燒瓶中，產物(9.0g，21.40mmol)在氮氣下、在黑暗中、在乙腈(150ml)中製漿1小時。混合物在室溫下攪拌一個週末，接著過濾且用冷乙腈(60ml)洗滌，得到白色固體，在40℃、在高真空下乾燥5小時，產生標題產物之晶形A(7.81g，87%)。
晶形A之XRPD跡線包括以下峰且顯示於圖1中。
如下製備用作起始物質的(E)-3-(4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1)：
製備(E)-3-(4-(3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(外消旋物)
在氮氣下，向含有1-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基丙-2-胺(43.8g，219.62mmol)之乙酸(314ml)中一次性添加(E)-3-(4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯(41.8g，219.62mmol)(如實例2(製備起始物質)中所述獲得)。 所得溶液在80℃攪拌5小時。真空濃縮反應混合物。添加甲苯(200ml)且將殘餘物蒸乾。
共沸物處理重複兩次或兩次以上，得到褐色固體。此固體於1：1 EtOAc/庚烷(500ml)中攪拌30分鐘，隨後過濾且用1：1 EtOAc/庚烷洗滌。將化合物風乾，得到白色固體。將粗物質懸浮於2-甲基四氫呋喃(750ml)中，且歷經10分鐘向經攪拌之混合物中添加飽和碳酸氫鈉溶液(起泡)，攪拌混合物直至物質溶解且水相保持鹼性。分離各相且有機相用鹽水洗滌，經MgSO4乾燥，過濾且真空濃縮，得到淺黃色泡沫(約78g)。將該物質溶於乙醚(200ml)中且濃縮至乾燥(重複兩次)。第二次添加時，獲得正確固體。此固體於乙醚中攪拌且蒸乾，得到(E)-3-(4-(3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(外消旋物)(73.6g，89%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)δ 1.26(3H,s),1.35(3H,s),1.42(1H,br s),2.69-2.82(2H,m),3.80(3H,s),5.12(1H,s),6.41(1H,d),7.06-7.16(2H,m),7.21(1H,dd),7.37(2H,d),7.46-7.54(4H,m),7.67(1H,d)。m/z：ES+[M+H]+361。
製備(E)-3-(4-(3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1)
(E)-3-(4-(3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(外消旋物)(65g)如下以七次注射加以純化。
外消旋物質藉由製備型HPLC(Chiralpak OD管柱，20μm二氧化矽，100mm直徑，250mm長度)(庚烷：IPA 50：50)純化。將含有所要化合物的溶離份蒸乾，得到(E)-3-(4-(3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1，第一溶離，30.3 g，93%)及(E)-3-(4-(3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體2，第二溶離，28.2g，86%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)δ 1.27(3H,s),1.36(3H,s),2.69-2.82(2H,m),3.80(3H,s),5.14(1H,s),6.43(1H,d),7.12(2H,pd),7.2-7.24(1H,m),7.39(3H,d),7.51(3H,d),7.68(1H,d),NH未觀測到。m/z：ES+[M+H]+361。
製備(E)-3-(4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1)
向(E)-3-(4-(3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1)(3.5g，9.71mmol)與N-乙基-N-異丙基丙-2-胺(6.34ml，36.41mmol)於1,4-二噁烷(17.5ml)中之溶液中添加三氟甲烷磺酸(S)-3-氟-2-甲基丙基酯(如實例3(製備起始物質)中所述獲得)(5.32g，21.36mmol)。混合物在22℃攪拌3天。將混合物蒸發且殘餘物分配於DCM(150mL)與水(150mL)之間。水層用DCM(50ml)萃取且將萃取物與有機層合併。所合併之萃取物經由相分離紙過濾且蒸發。殘餘物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離溶劑：15% EtOAc/庚烷)純化。含有大量產物的溶離份開始形成晶體；將管攪拌以促進進一步結晶。藉由過濾收集晶體且用少量的15% EtOAc/庚烷洗滌，得到呈白色結晶固體狀之(E)-3-(4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1)(2.91g，69.0%)。將得自結晶的液體與其他含有產物的溶離份合併且蒸發。殘 餘物自EtOAc/庚烷中再結晶，再得到呈白色結晶固體狀之3-(4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸酯(異構體1)(635mg，15.1%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)δ 0.53(3H,d),0.95-1.07(1H,m),1.09(3H,s),1.32(3H,s),2.16(1H,dd),2.66(1H,d),2.94(1H,d),2.97(1H,d),3.80(3H,s),4.14(1H,ddd),4.31(1H,ddd),4.59(1H,s),6.42(1H,d),7.05-7.11(2H,m),7.13(1H,s),7.17(1H,dd),7.35(2H,d),7.45(2H,d),7.50(1H,dd),7.67(1H,d)。m/z：ES+[M+H]+435。
實例8：(E)-3-(4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)
向(E)-3-(4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1)(68mg，0.16mmol)於甲醇(5ml)、THF(5.00ml)及水(5.00ml)中之溶液中添加2M氫氧化鈉溶液(0.782ml，1.56mmol)且混合物在22℃攪拌40小時。將混合物濃縮至全部有機溶劑已移除的體積且用2M HCl酸化至pH 6。添加濃氨水(2滴)，隨後添加甲醇(約2ml)，得到淺黃色溶液。粗產物藉由使用水(含有1% NH3)與MeCN之極性遞減混合物作為溶離劑的製備型HPLC(Waters XBridge Prep C18 OBD管柱，5μ二氧化矽，50mm直徑，100mm長度)純化。將含有所要化合物的溶離份蒸乾，得到呈黃色固體狀之標題產物(異構體1)(50.0mg，76%)。1H NMR(500MHz,DMSO,30℃)δ 0.93(3H,s),1.19(3H,d),1.23(3H,s),1.51(3H,d), 2.56-2.64(2H,m),2.75(1H,d),3.04(1H,dd),5.06(1H,s),6.40(1H,d),7.03(1H,ddd),7.09-7.15(2H,m),7.35(1H,dd),7.44-7.51(5H,m),10.87(1H,s),CO2H未觀測到。m/z：ES+[M+H]+421。
如下製備用作起始物質的(E)-3-(4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1)：
製備(E)-3-(4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1)
向(E)-3-(4-(3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(外消旋物)(如實例7(製備起始物質)中所述獲得)(250mg，0.69mmol)與N,N-二異丙基乙胺(0.453ml，2.60mmol)於1,4-二噁烷(1.25ml)中之溶液中添加三氟甲烷磺酸2-氟-2-甲基丙基酯(如實例1(製備起始物質)中所述獲得)(389mg，1.73mmol)。混合物在95℃攪拌64小時且接著分配於DCM(30ml)與水(30ml)之間。水層用DCM(20ml)萃取且將萃取物與有機層合併。所合併之萃取物經由相分離紙過濾且蒸發。殘餘物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離溶劑：15% EtOAc/庚烷)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈米色固體狀之(E)-3-(4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(外消旋物)(178mg，59.1%)。外消旋產物藉由製備型HPLC(Chiralpak AD管柱，20μm二氧化矽，50mm直徑，250mm長度)(庚烷：乙醇：80：20)純化。將含有所要化合物的溶離份 蒸乾，得到(E)-3-(4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1，第一溶離，70mg)及(E)-3-(4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體2，第二溶離，66mg)。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)δ 1.00(3H,s),1.13(3H,d),1.20(3H,s),1.44(3H,d),2.57-2.78(3H,m),2.93(1H,dd),3.80(3H,s),5.05(1H,s),6.41(1H,d),7.13(1H,ddd),7.18(1H,ddd),7.32(1H,d),7.43(2H,d),7.51(2H,d),7.54(1H,d),7.64(1H,s),7.67(1H,d).m/z：ES+[M+H]+435。
實例9：(E)-3-(3-氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)
向(E)-3-(3-氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(600mg，1.33mmol)(非對映異構體混合物)於甲醇(5ml)及THF(20ml)中之溶液中添加2M氫氧化鈉(3.31ml，6.63mmol)，且混合物在周圍溫度下攪拌4小時。 混合物濃縮至使得全部有機溶劑已移除的體積，用水(50ml)稀釋，用稀HCl酸化至pH 6且用乙酸乙酯(2×50ml)萃取。將萃取物合併且在減壓下蒸發。殘餘物藉由製備型HPLC(Chiralpak IA管柱，20μm二氧化矽，20mm直徑，250mm長度)(庚烷：IPA 90：10，0.2%乙酸，80mL/min)純化。將含有所要化合物的溶離份合併且加以分析，產生(E)-3-(3-氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡 啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1，第一溶離，130mg，22.36%)及(E)-3-(3-氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體2，第二溶離，30.0mg，5.16%)。1H NMR(500MHz,DMSO,30℃)δ 0.49(3H,d),1.03(3H,s),1.14-1.21(1H,m),1.28(3H,s),2.17(1H,dd),2.59-2.71(1H,m),2.8-2.99(2H,m),4.09-4.34(2H,m),4.99(1H,s),6.59(1H,d),6.86-7.07(2H,m),7.1-7.19(1H,m),7.18-7.29(1H,m),7.36-7.49(2H,m),7.49-7.66(2H,m),10.31(1H,s),CO2H未觀測到。m/z：ES+[M+H]+439。
如下製備用作起始物質的(E)-3-(3-氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(非對映異構體混合物)：
製備(E)-3-(3-氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯
將4-溴-2-氟苯甲醛(20.88g，102.87mmol)及丙烯酸甲酯(13.98ml，154.30mmol)溶解於經澈底除氣的DMA(150ml)中且添加三-鄰甲苯基膦(3.13g，10.29mmol)、乙酸鈀(II)(1.155g，5.14mmol)及三乙胺(28.7ml，205.74mmol)。攪拌反應物且加熱至100℃維持16小時。再添加三-鄰甲苯基膦(3.13g，10.29mmol)及乙酸鈀(II)(1.155g，5.14mmol)且反應混合物加熱至110℃再維持2小時。添加水(1L)且反應混合物用DCM(2×500ml)萃取。將合併之有機物乾燥(MgSO4)，過濾且蒸發，得到褐色固體。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至25% EtOAc/庚烷)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈黃色固體狀 之(E)-3-(3-氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯(15.20g，71.0%)。
1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)δ 3.83(3H,s),6.53(1H,d),7.31(1H,dd),7.41(1H,d),7.65(1H,d),7.79-8(1H,m),10.25-10.41(1H,m)。LCMS中未觀測到離子質量。
製備(E)-3-(4-(3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)-3-氟苯基)丙烯酸甲酯(外消旋物)
1-(1H-吲哚-3-基)-2-甲基丙-2-胺(1g，5.31mmol)及(E)-3-(3-氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯(1.106g，5.31mmol)於乙酸(15ml)中在80℃、在氮氣下攪拌2小時。粗產物藉由使用SCX-2管柱的離子交換層析法純化。所要產物自使用7M NH3/甲醇的管柱溶離且將純溶離份蒸乾，得到(E)-3-(4-(3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)-3-氟苯基)丙烯酸甲酯(外消旋物)(2.000g，99%)。1H NMR(400MHz,DMSO,30℃)δ 1.14(3H,s),1.27(3H,s),2.52-2.74(2H,m),3.74(3H,s),5.12(1H,s),6.69(1H,d),6.86-7.05(2H,m),7.20(1H,d),7.25-7.33(2H,m),7.39(1H,d),7.73(1H,d),7.85(1H,t),10.29(1H,s),NH未觀測到。m/z：ES+[M+H]+379。
製備(E)-3-(3-氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(非對映異構體混合物)
向(E)-3-(4-(3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)-3-氟苯基)丙烯酸甲酯(外消旋物)(850mg，2.25mmol)與N-乙基-N-異丙基丙-2-胺(1.467ml，8.42mmol)於1,4-二噁烷(5ml)中之溶液中添加三氟甲烷磺酸(S)-3-氟-2-甲基丙基酯(如實例3(製備起始物質)中所述獲得)(1.259g，5.62mmol)。混合物在60℃加熱4小時，接著在周圍溫度下攪拌12小時。混合物分配於乙酸乙酯(25mL)與水(25mL)之間。水層用乙酸乙酯(2×25ml)萃取且將萃取物與有機層合併。合併之萃取物在真空下蒸發。殘餘物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離溶劑：10% EtOAc/庚烷)純化。將純溶離份蒸乾，得到(E)-3-(3-氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(非對映異構體混合物)(600mg，59.0%)。m/z：ES+[M+H]+453.
實例10：(E)-3-[4-[(1R,3R)-1-氘代-2-(2-氟-2-甲基-丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基]-3,5-二氟-苯基]丙-2-烯酸
(E)-3-[4-[(1R,3R)-1-氘代-2-(2-氟-2-甲基-丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基]-3,5-二氟-苯基]丙-2-烯酸甲酯(4.70g， 10.27mmol)溶於iPrOH(42.8ml)中且一次性添加5M氫氧化鈉溶液(6.16ml，30.82mmol)，反應物接著在室溫下攪拌4小時。添加水(100ml)且藉由添加2N HCl而使pH值達成約5。溶液用EtOAc(×2)萃取且合併之有機物經乾燥(MgSO4)且真空濃縮。使殘餘物通過二氧化矽柱塞(首先用DCM溶離，接著用含有至多5% MeOH之DCM溶離)。將含有產物的溶離份蒸發，得到黃色固體(約4.2g)。將殘餘物(4.2g)溶於EtOH(20ml)中且溫熱至35℃。歷經約40分鐘緩慢添加水(30ml)。混合物接著再攪拌30分鐘，接著緩慢冷卻至室溫。再添加水(30ml)，且反應物接著冷卻至0℃。過濾混合物且固體用水洗滌，隨後在真空下、在35℃乾燥隔夜，得到呈淺黃色固體狀之(E)-3-[4-[(1R,3R)-1-氘代-2-(2-氟-2-甲基-丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基]-3,5-二氟-苯基]丙-2-烯酸(3.34g，73.3%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)1.12(3H,d),1.19(3H,d),1.26(3H,d),2.43(1H,dd),2.63(1H,dd),2.87(1H,dd),3.07(1H,dd),3.65(1H,q),6.41(1H,d),7.02(2H,d),7.06-7.16(2H,m),7.19-7.25(1H,m),7.41(1H,s),7.48-7.57(1H,m),7.63(1H,d),CO2H未觀測到。m/z：ES+[M+H]+444。
製備(4-溴-2,6-二氟-苯基)-二氘代-甲醇
向4-溴-2,6-二氟苯甲酸甲酯(2.89g，11.5mmol)於THF(46.0ml)中之溶液中逐份添加硼氘化鋰(0.497g，17.25mmol)。反應物加熱至50℃維持2小時。冷卻後，小心地添加(30ml)2N HCl。分離各層，且水相用EtOAc(2×50ml)萃取。合併之有機相用鹽水洗滌，乾燥(MgSO4)且濃縮，得到呈白色固體狀之(4-溴-2,6-二氟-苯基)-二氘代- 甲醇(2.250g，87%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)1.96(1H,s),7.07-7.13(2H,m)。
製備4-溴-2,6-二氟-1-氘代苯甲醛
在室溫下，向含有(4-溴-2,6-二氟-苯基)-二氘代-甲醇(2.20g，9.78mmol)之DCM(39.1ml)中添加戴斯-馬丁試劑(Dess-Martin reagent)(4.98g，11.73mmol)。反應物攪拌1小時，接著藉由添加(50ml)含有10%硫代硫酸鈉的飽和NaHCO3淬滅。分離各層且水相用DCM(2×50ml)萃取。將有機相乾燥(MgSO4)且濃縮，接著粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至25% EtOAc/庚烷)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈白色固體狀之4-溴-2,6-二氟-1-氘代苯甲醛(2.040g，94%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)7.18-7.25(2H,m)。未觀測到離子質量。
製備(E)-3-(4-氘代羰基-3,5-二氟-苯基)丙-2-烯酸甲酯
將4-溴-2,6-二氟-1-氘代苯甲醛(3.33g，15.0mmol)、三乙胺(4.18ml，30.00mmol)、乙酸鈀(II)(0.168g，0.75mmol)及三甲苯膦(0.457g，1.50mmol)溶於DMF(36.6ml)中，除氣。接著添加丙烯酸甲酯(2.026ml，22.50mmol)且反應物加熱至80℃維持4小時。冷卻後，將混合物添加至水(150ml)中且用EtOAc(2×150ml)萃取。合併之有機 相用2N HCl(100ml)洗滌，接著用鹽水(100ml)洗滌，接著乾燥(MgSO4)且濃縮。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至40% EtOAc/庚烷)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈狀之(E)-3-(4-氘代羰基-3,5-二氟-苯基)丙-2-烯酸甲酯(2.93g，86%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)3.83(3H,d),6.51(1H,d),7.12(2H,m),7.57(1H,d)。 m/z(ES+),[M+H]+=228。
(R)-N-(1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)-2-氟-2-甲基丙-1-胺
在氮氣氛圍下，向100L玻璃內襯夾套式容器中添加(2R)-1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-胺(3.81kg，21.21莫耳)。添加1,4-二噁烷(23L)，且啟動攪拌器。向經攪拌之懸浮液中添加二異丙基乙胺(5.55L；31.82莫耳)，隨後添加三氟甲烷磺酸(2-氟-2-甲基-丙基)酯(5.55kg，23.77莫耳)。向容器中添加1,4-二噁烷(4L)，且混合物加熱至75℃。繼續加熱24小時，隨後將混合物冷卻至25℃。向容器中添加水(30.5L)，隨後添加甲苯(30.5L)。40分鐘之後，關停攪拌器且讓各層分離。移除水層且向有機溶液中添加水(30.5L)。攪拌混合物15分鐘，隨後讓各層分離。自容器中移除水層。有機溶液藉由真空蒸餾(夾套溫度65℃，110毫巴壓力)濃縮，直至約27L鎦出液已移除。將容器中之剩餘溶液冷卻，得到(R)-N-(1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)-2-氟-2-甲基丙-1-胺(15.4Kg，97%)於甲苯中之溶液(33% w/w)。1H NMR(500MHz,DMSO,27℃)0.98(3H,d),1.26(3H,d),1.30(3H,d),2.57-2.75(3H,m),2.81(1H,dd),2.84-2.92(1H,m),6.97(1H,t),7.06(1H,t),7.11-7.22(1H,多重峰被甲苯信號遮蔽),7.34(1H,d),7.52(1H,d),10.80(1H,s)。
製備(E)-3-[4-[(1R,3R)-1-氘代-2-(2-氟-2-甲基-丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基]-3,5-二氟-苯基]丙-2-烯酸甲酯
(R)-N-(1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)-2-氟-2-甲基丙-1-胺[33% w/w於甲苯中](11.26g，14.97mmol)及(E)-3-(4-氘代羰基-3,5-二氟-苯基)丙-2-烯酸酯(3.40g，14.97mmol)於甲苯(55.6ml)/乙酸(4.28ml，74.83mmol)中、在80℃加熱5小時。冷卻後，在真空下移除揮發物。將殘餘物溶解於DCM(200ml)且用飽和NaHCO3溶液(200ml)洗滌。水相用DCM(100ml)萃取，接著用鹽水洗滌合併之有機相，乾燥且真空濃縮。將粗物質裝載至SCX-2管柱上(用甲醇溶離以移除未反應的醛)。 管柱接著用7M NH3-MeOH溶離以釋放產物。蒸發鹼性濾液且藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至40% EtOAc/庚烷)純化粗產物。將純溶離份蒸乾，得到呈淺黃色固體狀之(E)-3-[4-[(1R,3R)-1-氘代-2-(2-氟-2-甲基-丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基]-3,5-二氟-苯基]丙-2-烯酸甲酯(4.70g，68.6%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,30℃)1.11(3H,d),1.19(3H,d),1.25(3H,d),2.42(1H,dd),2.62(1H,dd),2.87(1H,dd),3.07(1H,dd),3.65(1H,q),3.81(3H,s),6.39(1H,d),6.99(2H,d),7.06-7.17(2H,m),7.23(1H,dd),7.45(1H,s),7.49-7.6(2H,m)。m/z：ES+[M+H]+458。
實例11：製備順丁烯二酸(1R,3R)-1-{4-[(E)-2-羧基乙烯基]-2,6-二氟苯基}-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-β-咔啉-2-鎓鹽
順丁烯二酸(1.31g，11.29mmol)於丙酮(15ml)中之溶液在氮氣下攪拌。向順丁烯二酸溶液中添加(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(實例1)(5.00g，11.3mmol)於丙酮(25ml)中之溶液，得到黃色溶液。反應容器用箔覆蓋以避光且用氮氣流淨化隔夜直至溶劑蒸發。 獲得固體，真空乾燥2小時，得到呈乳膏固體狀之標題化合物(6.23g，98%)。1H NMR(500MHz,DMSO,27℃)0.95-1.34(9H,m),2.24-2.45(1H,m),2.54-2.66(1H,m),2.8-2.99(2H,m),3.52(1H,s),5.22(1H,s),6.26(2H,s),6.67(1H,d),6.89-7.07(2H,m),7.19(1H,d),7.39-7.51(3H,m),7.55(1H,d),10.59(1H,s)。
此順丁烯二酸鹽之XRPD跡線顯示於圖8中且DSC跡線顯示於圖9中。
實例12
實例1之例示性組合物係使用濕式造粒法以75g規模製造。依下表中所列之量稱取活性成分、甘露醇、微晶纖維素及乙醇酸澱粉鈉且轉移至Diosna P1-6混合造粒機中且以600rpm混合(伴隨切斬)6分鐘。 對於組合物A而言，連續混合，同時分兩份等分試樣、以每秒約1mL速率添加30mL水，等分試樣之間暫停混合；而對於組合物B，使用類似方法添加藉由將所需量之EDTA及抗壞血酸與20mL水在50℃攪拌20分鐘(避光)所製備的溶液，在此情況下第二份等分試樣包含約10mL洗液。濕式混合連續進行總共1.5分鐘。使濕顆粒通過1.5mm篩， 接著在真空下、在50-60℃乾燥至水分含量為<2% w/w。所得顆粒使用1mm篩研磨，接著使用Turbula摻合機、以32rpm與滑潤劑混合5分鐘。藉由使用配備有6mm常規凹形工具的Riva小型壓機將顆粒壓縮成標稱100mg壓縮重量來形成含有10mg活性成分的錠劑。
評估組合物A及B之錠劑在降解物形成方面的穩定性，此等錠劑裝填於經感應密封的75cc HDPE瓶中或於皮式培養皿中暴露於大氣，在黑暗中、在下表所列之控制溫度及濕度下儲存。顯然，含有螯合劑與抗氧化劑的組合物B對於化學降解比作為標準錠劑調配物的組合物A更穩定。
例示性組合物在降解物形成(%)方面的穩定性
ND：未偵測到(<0.02% w/w)
實例13：(E)-3-[3,5-二氟-4-[(3R)-2-(2-氟-2-甲基-丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-鎓鹽-1-基]苯基]丙-2-烯酸酯
在室溫下，向硝酸鈰銨(248mg，0.45mmol)於乙腈(6ml)/水(1.500ml)中之溶液中添加(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(200mg，0.45mmol)。反應物攪拌2小時且再添加硝酸鈰銨(248mg，0.45mmol)。溶液在25℃再攪拌15分鐘。反應混合物用2M HCl(3ml)酸化且用DCM(2×10ml)萃取。接著真空濃縮有機相且使用水(含有0.1%甲酸)與MeCN之極性遞減混合物作為溶離劑、藉由製備型HPLC(Waters SunFire管柱，5μ二氧化矽，50mm直徑，100mm長度)純化粗產物。將含有所要化合物的溶離份蒸乾，得到呈橙色玻璃狀之標題化合物(亦稱為(R,E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-2-鎓-1-基)苯基)丙烯酸酯)(35.0mg，17.58%)。1H NMR(500MHz,DMSO,30℃)1.27(3H,d),1.43-1.55(6H,m),3.51(1H,d),3.72(1H,dd),3.96(1H,dd),4.18-4.32(1H,m),4.67(1H,s),6.59(1H,s),7.09-7.3(2H,m),7.42(1H,t),7.52-7.73(3H,m),7.78(1H,d),NH未觀測到。HRMS(ESI)：[M+H]+，實驗值441.17831,C23H24F2N2O2需要441.17844。
實例14A：製備(E)-3-[3,5-二氟-4-[(1R,3R)-2-(2-氟-3-羥基-2-甲基-丙基)-3-甲基-1,3,4,9-四氫吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基]苯基]丙-2-烯酸(異構體1)
a=未知絕對構型
異構體1
向(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-3-羥基-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯-異構體1(120mg，0.25mmol)於THF(0.635ml)/甲醇(0.635ml)中之溶液中添加2M氫氧化鈉(1.27ml，2.54mmol)。反應物在室溫下攪拌1小時，接著用EtOAc及水稀釋。藉由添加2M HCl將水相調節至pH 6，且分離各層。水層用EtOAc萃取，接著將合併之有機相乾燥(MgSO4)且真空濃縮。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至10% MeOH/DCM)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈米色固體狀之(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-3-羥基-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸-異構體1(85mg，72.9%)。1H NMR(400MHz,DMSO,27℃)0.97(3H,d),1.05(3H,d),2.32-2.4(1H,m),2.44-2.54(1H,m),2.73-2.93(3H,m),3-3.14(2H,m),3.32-3.49(2H,m),4.73(1H,s),5.14(1H,s),6.58(1H,d),6.82-6.96(2H,m),7.10(1H,d),7.33(1H,d),7.36(1H,d),7.45(1H,d),10.49(1H,s)。m/z(ES+),[M+H]+=459。
實例14B：製備(E)-3-[3,5-二氟-4-[(1R,3R)-2-(2-氟-3-羥基-2-甲基-丙基)-3-甲基-1,3,4,9-四氫吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基]苯基]丙-2-烯酸(異構體2)
a=未知絕對構型
異構體2
向(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-3-羥基-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯-異構體2(110mg，0.23mmol)於THF(0.529ml)/甲醇(0.529ml)中之溶液中添加2M氫氧化鈉(1.27ml，2.54mmol)。反應物在室溫下攪拌1小時，接著用EtOAc及水稀釋。藉由添加2M HCl將水相調節至pH 6，且分離各層。水層用EtOAc萃取，接著將合併之有機相乾燥(MgSO4)且真空濃縮。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至10% MeOH/DCM)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈米色固體狀之(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-3-羥基-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸-異構體2(81mg，76%)。1H NMR(400MHz,DMSO,27℃)1.02(2H,s),1.05(3H,d),1.23(1H,s),1.90(3H,s),2.28-2.46(1H,m),2.53-2.7(1H,m),2.86-3.03(2H,m),3.56(1H,d),4.83(1H,s),5.17(1H,s),6.66(1H,d),6.86-7.08(2H,m),7.17(1H,d),7.40(1H,d),7.44(2H,d),7.53(1H,d),10.54(1H,s)。m/z(ES+),[M+H]+=459。
如下製備用作起始物質的(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-3-羥基-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1及2)：
2-氟-2-甲基丙烷-1,3-二醇
向2-氟-2-甲基丙二酸酯(1.345g，7.00mmol)於THF(35.0ml)中之冷卻溶液中逐份添加LiAlH4(0.741g，19.25mmol)。反應物歷經1小時溫熱至室溫。冷卻至0℃後，藉由添加水(0.75mL)、15% NaOH(0.75mL)、接著添加水(1.5mL)來淬滅反應。懸浮液攪拌30分鐘，接著過濾且固體用THF洗滌。將濾液蒸發，得到呈無色油狀之2-氟-2-甲基丙烷-1,3-二醇(0.745g，98%)。1H NMR(400MHz,CDCl3,27℃)1.34(3H,d),2.12-2.27(2H,m),3.75(4H,d)。
3-(((R)-1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)胺基)-2-氟-2-甲基丙-1-醇
在0℃，向2-氟-2-甲基丙烷-1,3-二醇(0.70g，6.47mmol)於DCM(17.85ml)中之溶液中添加三氟甲烷磺酸酐(1.151ml，6.80mmol)，隨後添加2,6-二甲基吡啶(0.908ml，7.77mmol)。讓反應物歷經30分鐘溫熱至室溫，接著用2M HCl洗滌。使有機相通過相分離器濾芯且真空濃縮。將殘餘物溶於二噁烷(12mL)中，接著添加(R)-1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-胺(1.128g，6.47mmol)及DIPEA(1.678ml，9.71mmol)且反應物加熱至90℃維持2小時。冷卻後，反應物用DCM稀釋且用水洗滌。水相用DCM萃取，接著真空濃縮有機相。粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至10% MeOH/DCM)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈褐色膠狀之3-(((R)-1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)胺基)-2-氟-2-甲基丙-1-醇(0.815g，47.6%)。m/z(ES+),[M+H]+=265。
(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-3-羥基-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1及2) 及對映異構體
a=未知絕對構型
異構體1及2
將(E)-3-(3,5-二氟-4-甲醯基苯基)丙烯酸甲酯(565mg，2.50mmol)添加至3-(((R)-1-(1H-吲哚-3-基)丙-2-基)胺基)-2-氟-2-甲基丙-1-醇(661mg，2.50mmol)於甲苯(11.3ml)/乙酸(1.25ml)中之懸浮液中。 反應物加熱至90℃維持5小時。冷卻後，在真空下移除揮發物，接著使殘餘物通過SCX-2管柱(用甲醇溶離以移除未反應的醛)。管柱接著用NH3/MeOH溶離以釋放產物。蒸發鹼性濾液，接著藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度0至50% EtOAc/庚烷)純化粗產物。將純溶離份蒸乾，得到呈黃色固體狀之(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-3-羥基-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體1-122mg，10.3%)及呈黃色/橙色固體狀之(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-3-羥基-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸甲酯(異構體2-129mg，11%)。異構體1-1H NMR(400MHz,CDCl3,27℃)1.10(3H,d),1.14(3H,d), 2.54(1H,dd),2.62-2.73(1H,m),3.06-3.3(2H,m),3.40(1H,dd),3.56(1H,t),3.80(3H,s),3.87-4.08(1H,m),4.27(1H,s),5.16(1H,s),6.37(1H,d),7.01(2H,d),7.07-7.15(2H,m),7.14-7.24(1H,m),7.42-7.56(2H,m),7.71(1H,s)。m/z(ES+),[M+H]+=473。異構體2-1H NMR(400MHz,CDCl3,27℃)1.15(3H,d),1.20(3H,d),2.65(1H,dd),2.79(1H,t),2.93-3.09(2H,m),3.57(1H,dt),3.70(1H,dd),3.78(3H,s),4.2-4.67(1H,m),5.42(1H,s),6.32(1H,d),6.94(2H,d),7.06-7.15(2H,m),7.19-7.27(2H,m),7.42(1H,s),7.51(1H,dd),8.02(1H,s)。 m/z(ES+),[M+H]+=473。
參考實例1：1-(4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基)-3-羥基丙-1-酮
在氮氣下，將吡啶4-甲基苯磺酸酯(11.62g，46.24mmol)添加至1-(4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基)-3-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)丙-1-酮(128g，231.19mmol)於甲醇(1L)中之懸浮液中。混合物在60℃攪拌1.5小時。5分鐘之後，混合物溶解。混合物在50℃保持隔夜，在此期間，沈澱物形成。藉由過濾分離出固體物質且用水及乙腈洗滌。此物質仍含有來自前一階段的少量雜質且需要進一步純化。將該物質溶於二氯甲烷中且藉由矽膠急驟層析法(0%甲醇/DCM至10%甲醇/DCM)純化。從而分離出呈乳膏固體(形式A)狀之所要產物1-(4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基)-3-羥基丙-1-酮(參考實例1)(92g，85%)： 1 H NMR譜： (DMSO-d6)1.4-1.51(12H,m),1.51-1.78(2H,m),1.89-2.05(2H,m),2.72-2.86(1H,m),2.91-3.05(1H,m),3.12-3.24(1H,m),3.64(2H,q),3.83-4.01(1H,m),4.29-4.41(1H,m),4.47(1H,t),4.58(2H,q),8.26(2H,s),8.85(1H,s)；質譜[M+H]+=470。
如下製備1-(4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基)-3-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)丙-1-酮： 將1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(76ml，511.14mmol)添加至4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-甲酸第三丁酯(150g，319.46mmol)於2-甲基THF(1.2L)中之懸浮液中。添加碘乙烷(46mL，575.03mmol)且混合物在35℃攪拌16小時。再添加碘乙烷(46mL，575.03mmol)及1,8-二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(76mL，511.14mmol)且在35℃連續攪拌24小時。將混合物傾注入水中且藉由過濾分離出不溶性物質，用水及MTBE洗滌且真空乾燥，得到呈狀之4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-甲酸第三丁酯(116g，73.0%)。濾液用DCM萃取且有機溶液用硫酸鎂乾燥，過濾且在減壓下濃縮。殘餘物藉由使用梯度溶離(30% MTBE/庚烷至100% MTBE)的二氧化矽急驟管柱層析法純化。從而分離出呈黃色固體狀之第二批所要產物(12g，24.12mmo1,7.55%)，隨後與第一批產物合併： 1 H NMR譜：(DMSO-d6)1.41(9H,s),1.44(9H,s),1.48(3H,t),1.52-1.69(2H,m),1.87-2.04(2H,m),2.79-3.03(3H,m),3.86-4.03(2H,m),4.59(2H,q),7.89(2H,s),8.85(1H,s)；質譜[M+H]+=498。
4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-甲酸第三丁酯(3009.5g，6.05mol)於DCM(9L)中之懸浮液在N2下冷卻至5-10℃。向懸浮液中逐份添加 TFA(9L)，同時維持溫度<30℃。反應混合物在室溫下攪拌1小時。 濃縮混合物，所得殘餘物溶於水(30L)中且在0-5℃緩慢添加至35%氨水溶液(12L)中。懸浮液攪拌30分鐘，接著濾出產物且用水(2×6L)洗滌。產物在50℃真空乾燥2天，得到3-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)-5-(1-乙基-3-(哌啶-4-基)-1H-1,2,4-三唑-5-基)吡嗪-2-胺(2496g)： 1 H NMR譜：(DMSO-d6)1.4-1.52(12H,m),1.57-1.73(2H,m),1.83-1.93(2H,m),2.57-2.7(2H,m),2.71-2.84(1H,m),2.96-3.09(2H,m),4.58(2H,q),8.06(2H,s),8.84(1H,s)；質譜[M+H]+=398。
在室溫下，在氮氣下，向3-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)丙酸(HATU，48.80g，0.2774mol)及N-乙基-N-異丙基丙-2-胺(86.96mL，0.4993mol)於THF(552mL)中之溶液中逐份添加六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基(115.73g，0.3051mol)。所得混合物攪拌20分鐘，接著歷經1小時逐份添加3-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)-5-(1-乙基-3-(哌啶-4-基)-1H-1,2,4-三唑-5-基)吡嗪-2-胺(122.5g(110.25g活性),0.2774mol)。3.5小時之後，濃縮混合物且殘餘物在室溫下、於MeCN(275mL)中製成漿液15分鐘。濾出產物，用MeCN(3×110mL)洗滌且在50℃真空乾燥隔夜。由此得到1-(4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基)-3-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)丙-1-酮(131.9g，96%)。 1 H NMR譜：(DMSO-d6)1.29-1.48(16H,m),1.48-1.75(4H,m),1.83-1.99(2H,m),2.48-2.68(2H,m),2.68-2.79(1H,m),2.87-2.99(1H,m),3.07-3.19(1H,m),3.32-3.42(1H,m),3.47-3.6(1H,m),3.64-3.75(1H,m),3.75-3.84(1H,m),3.84-3.95(1H,m),4.24-4.39(1H,m),4.47-4.6(3H,m),7.84(2H,s),8.79(1H,s)：質譜[M+Na]+=577。
實例3之替代製法
在N2下，將吡錠對甲苯磺酸鹽(11.97g，47.7mmol)添加至1-(4- (5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基)-3-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)丙-1-酮(131.9g，0.2382mmol)於甲醇(1045mL)中之懸浮液中。反應混合物在60℃攪拌5.5小時，接著在50℃攪拌隔夜。反應混合物冷卻至0℃且濾出固體。產物在室溫下於水(250mL)中製成漿液20分鐘，濾出，用水(3×40mL)洗滌且在50℃真空乾燥。由此得到呈形式A之1-(4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基)-3-羥基丙-1-酮(21.4g)(參見下文)。
濃縮甲醇液體且所得固體在室溫下於水(0.6L)中製成漿液20分鐘。藉由過濾分離出固體且用水(3×100mL)洗滌。濾餅再次於水(0.5L)中製成漿液再維持20分鐘。藉由過濾分離出產物，用水(100mL)洗滌且在50℃真空乾燥。由此得到81.9g呈形式A之1-(4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基)-3-羥基丙-1-酮(81.9g)。
合併兩批料(103.3g)，用形式B(16.68g)接種且在室溫下於MeCN(826mL)中製成漿液隔夜。由此得到117.4g呈形式B之淺黃色固體狀1-(4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基)-3-羥基丙-1-酮(117.4g)(參見下文)。此物質藉由在庚烷(7.5rel vols)中製漿1小時而進一步純化。過濾混合物，在過濾器上汲乾，且在真空烘箱中在50℃乾燥隔夜，得到呈形式B之1-(4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基)-3-羥基丙-1-酮(102.5g)。
形式B亦可藉由將形式A在MeCN中製漿而無需接種來製備。
形式A或B亦可如下轉化為形式C： 1-(4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基)-3-羥基丙-1-酮(例如藉由上述方 法製備之形式B)於IPA(12vol)中之懸浮液在回流下加熱直至固體溶解。熱過濾溶液，接著冷卻至室溫。由此得到呈形式C之淺黃色固體狀1-(4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1-乙基-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-基)-3-羥基丙-1-酮(99.3g，97%)。
形式C亦可如下轉化為形式B： 在10L凸緣燒瓶中，含有形式C(377.8g，1份)之MIBK(7900mL)加熱至110-115℃，得到溶液。將溶液冷卻至97-103℃且立即研磨過濾至50L容器中，該容器含有在-15℃攪拌之乙腈(8220mL)中之形式B之晶種(0.8g)。在添加期間，50L容器中之溫度藉助於夾套冷卻而維持在-15℃與25℃之間。藉由類似方法添加另外三份溶於MIBK中的化合物。向所得漿液中添加形式B之晶種(0.8g)且混合物接著在10-20℃攪拌隔夜。製程中分析確認所要形式(形式B)，未見到形式C或非晶形。過濾混合物且用乙腈(3340mL)洗滌。固體烘乾2天(固體在乾燥期間碎裂為粉末及約1mm至3-4mm尺寸之小結塊之混合物)直至獲得恆重。產量=1532.8g(93.5%)。
如下製備3-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)丙酸： 在氮氣下，在0℃向甲醇(2.4L)與濃硫酸(44.4mL，832.61mmol)之經攪拌溶液中逐滴添加β-丙內酯(175mL，2.78mol)。將此溶液在室溫下攪拌2天。將反應混合物冷卻至10℃，隨後逐份添加碳酸氫鈉(145g，1.72mol)，所得懸浮液在室溫下攪拌75分鐘。過濾此溶液，濾餅用甲醇(800mL)洗滌。蒸發濾液，得到油狀物，再溶解於二氯甲烷(1.2L)中且攪拌60分鐘後再過濾。過濾此溶液，隨後蒸發，得到呈油狀之3-羥基丙酸甲酯(219g，76%)。 1 H NMR譜：(CDCl3)2.50(2H,t),3.63(3H,s),3.78(2H,t)。
在室溫下，在氮氣下，將吡錠對甲苯磺酸鹽(7.65g，30.45mmol)添加至3-羥基丙酸甲酯(63.4g，609.00mmol)與3,4-二氫-2H-哌 喃(78mL，852.60mmol)於二氯甲烷(650mL)中之透明溶液中，得到混濁溶液。將此溶液在室溫下攪拌隔夜。反應混合物用水(250mL)及鹽水(250mL)洗滌，隨後乾燥(MgSO4)且蒸發，得到油狀物。此粗產物藉由急驟二氧化矽層析法(溶離梯度15至30% EtOAc/庚烷)純化。將純溶離份蒸乾，得到呈無色油狀之3-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)丙酸甲酯(67.7g，59.0%)： 1 H NMR譜：(CDCl3)1.47(4H,dddd),1.55-1.84(2H,m),2.55(2H,t),3.33-3.53(1H,m),3.53-3.7(4H,m),3.78(1H,ddd),3.93(1H,dt),4.42-4.72(1H,m)；質譜[MH]+=189。
在室溫下，將氫氧化鈉(2M，349mL，697.58mmol)添加至3-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)丙酸甲酯(67.68g，359.58mmol)於THF(680mL)中之溶液中。反應混合物在室溫下攪拌3小時。真空移除THF，水層接著用乙酸乙酯(260mL)洗滌，隨後冷卻至0℃且藉由添加鹽酸(2M)小心酸化至pH 5。產物用乙酸乙酯(3×250mL)萃取，隨後乾燥(MgSO4)且蒸發，得到呈透明油狀之3-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)丙酸(57.0g，91%)。將此物質溶於乙酸乙酯(750mL)中，接著用水(3×250mL)及鹽水(250mL)洗滌以移除剩餘乙酸。將有機溶液乾燥(MgSO4)且蒸發，得到呈無色油狀之3-(四氫-2H-哌喃-2-基氧基)丙酸(45.67g，72.9%)： 1 H NMR譜： 1H NMR(CDCl3)1.43-1.67(4H,m),1.65-1.95(2H,m),2.68(2H,t),3.48-3.58(1H,m),3.73(1H,dt),3.88(1H,ddd),4.02(1H,dt),4.59-4.7(1H,m)；質譜[M-H]-=173。
如下製備4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-甲酸第三丁酯： 將水合肼(23.59mL，480.75mmol)逐滴添加至3-胺基-6-溴吡嗪-2-甲酸甲酯(100g，418.04mmol)於EtOH(2L)中之經攪拌混合物中。 混合物在氮氣下在50℃加熱。所得稠懸浮液在50℃攪拌16小時。一次性添加額外肼(2.5mL)且懸浮液在50℃再攪拌24小時。將乙醇(500 mL)裝入稠反應混合物中且混合物冷卻至室溫。過濾所得懸浮液且固體用乙醇(1L)洗滌且真空乾燥，得到呈乳膏固體狀之3-胺基-6-溴吡嗪-2-甲醯肼(98g，定量)： 1 H NMR譜：(DMSO-d6)4.52(2H,s),7.59(2H,s),8.30(1H,s),9.74(1H,s)；質譜[M+H]+=232。
將特戊酸酐(165mL，815.38mmol)添加至3-胺基-6-溴吡嗪-2-甲醯肼(172g，741.26mmol)於乙腈(1.8L)中之經攪拌混合物中且混合物在80℃加熱1小時。將反應物攪拌16小時。藉由過濾分離出所要黃色固體物質。將濾液分配於EtOAc(2L)與碳酸氫鈉水溶液(2L)之間。有機層用飽和鹽水洗滌且經MgSO4乾燥。過濾溶液且濃縮，得到橙色黏性固體，用MTBE(250mL)濕磨。藉由過濾分離出不溶性黃色固體且此物質顯示與第一固體相同。合併之固體在真空烘箱中在50℃乾燥3天，得到呈黃色固體狀之3-胺基-6-溴-N'-特戊醯基吡嗪-2-甲醯肼(224g，96%)： 1 H NMR譜：(DMSO-d6)1.17(9H,s),7.62(2H,s),8.37(1H,s),9.42-9.56(1H,m),10.09-10.23(1H,m)；質譜[M+H]+=318。
在50℃，在30分鐘期間內，向含有3-胺基-6-溴-N'-特戊醯基吡嗪-2-甲醯肼(2301g，7.28mol)之MeCN(10.8L)中逐份(約280g×6)添加DIPEA(3.044L，17.48mol)及對甲苯磺醯氯(1665g，8.73mol)。 藉由控制添加速率而維持反應溫度在65至70℃之間。添加完成之後，反應混合物在70℃攪拌1小時。混合物冷卻至室溫且用5% NaHCO3(水溶液，24.2L)淬滅。所得懸浮液攪拌30分鐘，接著過濾。產物用水(14.8L)洗滌，汲乾且在50℃乾燥16小時。將產物溶於DCM(12L)且分離各相。將有機相裝載至二氧化矽墊(6kg)上且產物用20% EtOAc/DCM(8×10L)溶離。將含有產物的溶離份濃縮，得到純度為99.8%(依據HPLC)的1987g(92%產率)5-溴-3-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-胺(36g，17%)： 1 H NMR譜：(DMSO-d6)1.43(9H, s),7.70(2H,s),8.39(1H,s)；質譜[M+H]+=298。
使氮氣流通過5-溴-3-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-胺(89.35g，239.75mmol)於DMA(1.2L)中之溶液20分鐘。向經攪拌之混合物中依序添加二環己基(2',4',6'-三異丙基聯苯-2-基)膦(11.43g，23.98mmol)、參(二苯亞甲基丙酮)二鈀(0)(5.49g，5.99mmol)、鋅(1.568g，23.98mmol)及二氰基鋅(16.89g，143.85mmol)。混合物加熱至100℃且攪拌1小時。冷卻混合物且分配於DCM(3L)與水(1L)之間。黑色混合物經由矽藻土過濾且分離有機層。溶液用水洗滌、接著用鹽水洗滌。溶液用硫酸鎂乾燥且在減壓下濃縮。殘餘物用MTBE濕磨且藉由過濾分離，用MTBE洗滌。真空乾燥濾餅，得到呈淺橙色固體狀之5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-甲腈(55.7g，95%)： 1 H NMR譜：(DMSO-d6)1.46(9H,s),6.02(1H,s),8.38(2H,s)；質譜[M-H]-=242。
將水合肼(82mL，1.69mol)添加至含有5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-甲腈(55g，225.18mmol)之IPA(200mL)中且混合物在氮氣下、在50℃加熱16小時。混合物在冰浴中冷卻。所得沈澱物藉由過濾收集，用IPA及乙醚洗滌且乾燥至恆重，得到呈黃色固體狀之(Z)-5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-甲腙醯胺(49.2g，79%)： 1 H NMR譜：(DMSO-d6)1.45(9H,s),5.26(2H,s),5.58(2H,s),7.56(2H,s),8.75(1H,s)；質譜[M+H]+=277。
將六氟磷酸O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N,N,N',N'-四甲基(74.3g，195.44mmol)添加至N-Boc-異哌啶酸(41.1g，179.15mmol)及4-甲基嗎啉(35.9mL，325.74mmol)於DMA(800mL)中之溶液中。混合物攪拌10分鐘，接著向溶液中一次性添加(Z)-5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-甲腙醯胺(45g，162.87mmol)(觀測到放熱，22℃至27℃)。幾分鐘之後。產物自反應混合物中結晶。自容器 中移除反應混合物且經由溶渣過濾。自容器(150mL)側面再添加DMA至洗滌產物中且將此物傾倒至濾餅中。向容器中添加異丙醇(600mL)且使用劇烈攪拌將容器中之剩餘產物懸浮於此溶劑中。DMA一經抽吸移除，則使用異丙醇懸浮液洗滌濾餅。將濾餅吸乾，接著用MTBE洗滌且再次吸乾。真空乾燥濾餅，得到呈黃色固體狀之(Z)-4-(2-(胺基(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)亞甲基)肼羰基)哌啶-1-甲酸第三丁酯(76g，95%)： 1 H NMR譜：(DMSO-d6)1.40(9H,s),1.46(9H,s),1.63-1.9(2H,m),2.33-2.6(2H,m，被DMSO信號遮蔽),2.63-3.03(2H,m),3.18-3.48(4H,m，被水信號遮蔽),3.88-4.11(2H,m),6.43(2H,s),7.76(2H,br),8.84(0.5H,s),8.87(0.5H,s),9.85(1H,s)；質譜[M+H]+=488。
在一替代製法中，可如下當場製備N-Boc-異哌啶酸： 將異哌啶酸(858g，3.74mol)溶於DMA(25.3L)中且添加4-甲基嗎啉(393mL，3.74mol)。攪拌5分鐘且添加氯甲酸異丁酯(489mL，3.74mol)。在25℃攪拌反應混合物2小時且冷卻至15℃，隨後歷經10分鐘逐份添加(Z)-5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-甲腙醯胺(940g，3.4mol)。反應混合物在15℃攪拌1至2小時。歷經1小時逐份添加水(20.5L)且再攪拌1小時，隨後過濾。濾餅接著用水(4×4L)洗滌且在過濾器上汲乾，隨後在真空烘箱中在50℃乾燥，直至乾燥而得到所要產物。
在3L固定式雙重夾套容器中，向二噁烷(500mL)中添加乙酸(200mL)且溶液在氮氣下加熱至70℃。向溫熱混合物中逐份添加(Z)-4-(2-(胺基(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)亞甲基)肼羰基)-哌啶-1-甲酸第三丁酯(74.5g，152.80mmol)。10分鐘之後，溫度升高至100℃(輕微回流)。反應混合物在100℃攪拌1.5小時(懸浮液)，接著在80℃保持隔夜(保持隔夜之後形成溶液)。所得溶液 在減壓下濃縮，接著用甲苯稀釋，蒸乾，用甲苯溶解且再次濃縮。將殘餘油狀物與一些乙酸乙酯混合且濃縮至乾燥。固體自溶液中結晶，用MTBE(200mL)濕磨且藉由過濾分離。濾餅用水及MTBE洗滌，得到呈灰色固體狀之4-(5-(5-胺基-6-(5-第三丁基-1,3,4-噁二唑-2-基)吡嗪-2-基)-1H-1,2,4-三唑-3-基)哌啶-1-甲酸第三丁酯(50g，70%)。
濾液在減壓下濃縮，得到黃色固體。此物質用MTBE濕磨且過濾。濾餅用乙酸乙酯洗滌且接著用MTBE洗滌，得到呈淺黃色固體狀之第二批料(4.93g，7%)。此物質與第一批料相同： 1 H NMR譜：(DMSO-d6)1.17(9H,s),1.22(9H,s),1.29-1.47(2H,m),1.67-1.78(2H,m),2.57-2.87(3H,m),3.57-3.92(2H,m),7.56(2H,br),8.56(1H,s),13.47(2H,br s)；質譜[M+H]+=470。

Claims (15)

  1. 一種式(I)化合物，
    Figure TWI653235B_C0001
    或其立體異構體或醫藥學上可接受之鹽，其中：R1及R2各獨立地為H或F；R3為氫或甲基；且R4及R5係選自下列之任一者：a)R4為H且R5為氟；及b)R4為氟且R5為H。
  2. 如請求項1之化合物，或其立體異構體或醫藥學上可接受之鹽，其中該化合物為式(IA)化合物
    Figure TWI653235B_C0002
  3. 如請求項1或請求項2之化合物，或其立體異構體或醫藥學上可接受之鹽，其中R3為氫。
  4. 如請求項1或請求項2之化合物，或其立體異構體或醫藥學上可接受之鹽，其中R3為甲基。
  5. 如請求項1或請求項2之化合物，或其立體異構體或醫藥學上可接受之鹽，其中R4為氫且R5為氟。
  6. 如請求項1或請求項2之化合物，或其立體異構體或醫藥學上可接受之鹽，其中R5為氫且R4為氟。
  7. 如請求項1之化合物，或其立體異構體或醫藥學上可接受之鹽，該化合物係選自：(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸；(E)-3-(4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸；(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸；(E)-3-(4-((1R,3R)-2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸；(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)；(E)-3-(3,5-二氟-4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)；(E)-3-(4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)；(E)-3-(4-(2-(2-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)；(E)-3-(3-氟-4-(2-((S)-3-氟-2-甲基丙基)-3,3-二甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸(異構體1)；及(E)-3-[4-[(1R,3R)-1-氘代-2-(2-氟-2-甲基-丙基)-3-甲基-4,9-二氫-3H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基]-3,5-二氟-苯基]丙-2-烯酸。
  8. 如請求項7之化合物，其為(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸，或其立體異構體或醫藥學上可接受之鹽。
  9. 一種化合物(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氫-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸，其呈XRPD實質上如圖2中所示的晶形。
  10. 一種如請求項1至9中任一項之化合物或其立體異構體或醫藥學上可接受之鹽之用途，其係於製備預防或治療細胞增殖性病症之藥劑。
  11. 一種如請求項1至9中任一項之化合物或其立體異構體或醫藥學上可接受之鹽之用途，其係用於製備預防或治療癌症之藥劑。
  12. 如請求項11之用途，其中該病症為乳癌或婦科癌症。
  13. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至9中任一項之化合物或其立體異構體或醫藥學上可接受之鹽，及醫藥學上可接受之稀釋劑或載劑。
  14. 如請求項13之醫藥組合物，其中該組合物進一步包含抗氧化劑且視情況進一步包含金屬螯合劑。
  15. 一種適用於治療癌症的組合，該組合包含如請求項1至9中任一項之化合物或其立體異構體或醫藥學上可接受之鹽及另一抗腫瘤劑。
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