KR20140146017A - 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출물 및 차전자 추출물로부터 선택된 1종 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물, 그리고 남성 성기능 개선 및 불임 예방용 식품 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 HUVEC에서 NO 농도, ACE (Angiotensin converting enzyme) 저해 효과, PDE (Phosphodiesterase)-5 저해 효과, CREM 발현 등과 정자 수, 정자의 활동성의 증강, 테스토스테론 함량 증가 등을 통해 남성 성기능 개선 또는 불임에 효과가 있다.

Description

남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물{A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR IMPROVING GENERATIVE OF MALE AND TREATING INFERTILITY}

본 발명은 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출물 및 차전자 추출물로부터 선택된 1종 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물, 그리고 남성 성기능 개선 및 불임 예방용 식품 조성물에 관한 것이다. 상기 조성물은 HUVEC에서 NO 농도, ACE (Angiotensin converting enzyme) 저해 효과, PDE (Phosphodiesterase)-5 저해 효과, CREM 발현 등과 정자 수, 정자의 활동성의 증강, 테스토스테론 함량 증가 등을 통해 남성 성기능 개선은 물론 특히 불임에 효과가 있다.

현대적인 생활환경은 과로, 음주, 스트레스, 환경오염 등으로 생체리듬에 혼란을 주어 고혈압, 당뇨, 비만 등의 생활 습관병에 노출되는 빈도가 증가함에 따라 한창 왕성해야 할 20~30대 부터 기력의 저하, 노화 및 성 기능 부진 등의 현상이 나타나는 경우가 허다하며, 40세 이상에서는 보다 심각한 수준으로 나타나고 있다. 성 기능 부진 중에는 특히 불임이 사회적으로 큰 문제가 되고 있다. 혈류개선을 통한 발기부전의 문제를 해결하는 것도 중요하지만 보다 근원적으로 성호르몬의 개선, 정자의 개수 및 활동성의 개선을 통해 불임을 해소하는 것이 더욱 중요하다.

불임이란 피임을 하지 않고 1년 이상 정상적인 부부생활을 하면서 임신하지 못하는 것으로, 불임부부는 전체 부부의 10~20%를 차지하고 있다. 불임의 발생빈도는 미국의 경우 정상부부의 약 15%가 불임증이며, 우리나라는 산부인과 외래 환자의 8%가 불임증이다. 불임의 원인은 여성에게만 있는 경우가 약 40%, 남성에게만 있는 경우가 약 40%, 남성과 여성 양쪽 모두에게 있는 경우가 약 10%, 원인불명인 경우가 약 10%로 나타내며, 결과적으로 그 원인의 절반은 남성요인이라 할 수 있다(Korean society for Sexual Medicine and Andrology. Namseonggwahak. Seoul, Gunjachulpansa. 5-54, 161-163. (2003) ; The Korean Urological Association. Textbook of Urology. 3rd. SeoulGoryeouihak. 507-22. (2001)).

남성 불임이란 정자가 생성되고 수송되어 사정에 의하여 배출된 후 난자와 결합하는 과정에서 어느 한 부분이라도 문제가 있을 경우 불임으로 이어지고, 현대 남성에게 있어 정자의 생성 및 상태, 정자형성 장애 그리고 정자의 운동성에 관한 부분이 가장 문제가 되고 있다(Jouannet P, et. al., APMIS . 109 (3), 333-44. (2001)). 정자형성 과정의 장애는 남성 불임 중 가장 많은 비중을 차지하고 있는데, 이는 주로 시상하부, 뇌하수체, 고환으로 이어지는 호르몬 분비의 이상, 유전적 인자, 고환의 발육부전, 잠복고환, 정맥류, 고온에 노출된 경우 등의 원인으로 정자의 형성이 정상적으로 이루어지지 않거나 기형적 정자의 생성 비율이 높은 경우를 말한다(The Korean Urological Association. Textbook of Urology. 3rd. SeoulGoryeouihak. 507-22. (2001)). 정자의 운동성은 난자와 결합하여 수정이 이루어지는 과정에서 필수적인 요소이다(Tienthai P. Anim Reprod Sci . 80, 131-46. (2004)). 정자의 운동성은 여성의 자궁을 거치면서 수정능획득을 시작하게 되고, hyperactivation 운동성과 첨체반응을 유도하게 된다(Guzick DS et. al., N Engl J Med. 345, 1388-93. (2001).

최근 남성불임은 잦은 음주, 흡연, 환경오염, 영양섭취, 과다한 약물복용, 환경독소에서의 노출, 지나 친 성교, 피로, 스트레스 등으로 증가하는 추세이며, 이로 인해 정상적인 남성에 있어서도 정자의 운동성, 정자 수 감소 등이 나타나고 있다(Saleh RA and Agarwal A. J Androl . 23, 737-52. (2002)).

남성불임의 원인으로 무정자증, 정자질의 장애, 정자형성장애, 정자의 운동성 감소 등이 주요한 원인으로 파악된다(The Korean Urological Association. Textbook of Urology. 3rd. SeoulGoryeouihak. 507-22. (2001)). 정자형성장애에는 고환에서의 생성된 후 정자수가 적게 만들어 지는 감정자증(oligozoospermia), 정자의 활동성이 약한 약정자증 (asthenozoospermia)이 있다(Saleh RA and Agarwal A. J Androl . 23, 737-52. (2002)).

임신 가능한 정액의 조건으로는 정액 1 ㎖ 중에 6000만 ~ 1억의 정자가 들어 있고, 그 중 이상(異常) 정자수가 20~30% 이하여야 하며, 사정 후 4~8시간 동안 50% 이상이 활동하고 정액양이 2~5 ㎖이 되어야 하지만, 정자 부족증은 정액 1 ㎖ 중의 정자수가 3000만 이하에 불과해 불임의 원인이 되는 증상이다.

남성 생식기능 저하의 예방 또는 치료용 조성물에 대한 다양한 연구들이 특허출원되어 있거나 등록되어 있다. 종래 기술에서는 남성 생식기능 저하를 유도하기 위해 인위적으로 정자 손상이 유발되도록 염화카드뮴을 실험동물에 경구 투여하거나(공개특허공보 특2002-0085401), 테트라클로로디벤조-피-다이옥신을 실험동물에 처리하는 (대한민국 특허 10-0508539) 등의 방법이 이용되었다. 하지만, 모든 남성 생식기능 저하의 예방 또는 치료를 위한 효능 검색 연구가 정자의 실제 생성 기간을 고려하지 않는 등 합리적이지 못하였다. 이러한 예로, 남성의 생식기능을 향상시키는 삼백초 발효 원액 (대한민국 특허 10-0508539)에서는 실험동물을 이용한 효능 검색 방법에서 세부적인 실험 방법에 대하여는 기술되지 않았으며, 남성 생식기능 저하의 예방 또는 치료 또는 조혈 촉진용 조성물 및 그의 제조방법 (공개특허공보 특2002-0085401)에서는 실험동물에 액제를 경구투여한 후 1주 또는 2주 후에 정소를 적출하여 정자수 및 정자활동성 등을 관찰하였다. 또한, 남성 생식기능 저하의 예방 및 치료용 조성물 (공개특허공보 10-2005-0028475)에서는 실험동물에 조성물을 1일 2회 l8일간 복강내 투여한 후 투여 종료 1일 후 부검하여 정자수, 정자 활동성 및 정자 활동 지속력 등을 측정하였다.

남성불임에 관련된 연구들은 대체로 서양의학적인 시술에만 의존하여 한약재를 이용한 생약재의 연구는 뒷전으로 물러나 있다. 그럼에도 불구하고 남성 성기능 개선치료에 있어서 우리나라의 경우 사회 관습적, 윤리적 이유 등으로 한의학에 의존하여 치료하는 경우가 많고 또한 상당수의 성공 사례들이 있으나 현재까지 사용해온 성기능 개선 치료관련 생약제들은 오랜 경험과 과거 문헌에 의한 것으로 정확한 작용기전 및 각각의 처방에 대한 기본적이고 체계적인 연구가 없는 경우가 대부분이다. 현재 판매되고 있는 건강식품의 대부분은 성기능 개선에 좋다고 알려진 성분을 대략 혼합하여 유효성분의 적정량, 시너지 효과, 복용기간 등의 과학적 연구를 무시하고 제조 판매하기 때문에 대개 체험적 효과가 미미하다.

이에, 본 발명자들은 남성 불임 치료제를 개발하고자 노력하던 중, 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출물 및 차전자 추출물 중에서 선택된 1종 이상의 추출물이 TM3 세포에서의 세포 독성, HUVEC에서 NO 농도, ACE (Angiotensin converting enzyme) 저해 효과, PDE (Phosphodiesterase)-5 저해 효과, CREM 발현 등의 in vitro 테스트와 혈청 내 cGMP의 변화, 혈청 내 Testosterone의 변화, 장기 무게 (정소, 부정소, 정낭) 측정, 정자수, 정자 운동성의 in vivo 테스트를 통해 남성 성기능 개선 및 불임 치료에 효과가 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출물 및 차전자 추출물을 이용한 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출물 및 차전자 추출물을 이용한 남성 성기능 개선 및 불임 예방용 식품 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출물 및 차전자 추출물로부터 선택된 1종 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출물 및 차전자 추출물로부터 선택된 1종 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 성기능 개선 및 불임 예방용 식품 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출물 및 차전자 추출물로부터 선택된 1종 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 추출물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것이 바람직하며, 이때 상기 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물 및 오미자 추출물로 이루어진 추출물(본 발명에서 상기 5가지 추출물들을 KH-204라 간략히 명명함)이 바람직하고, 산수유 추출물 100 중량부를 기준으로 구기자 50~150 중량부, 복분자 20~100 중량부, 토사자 20~100 중량부 및 오미자 10~50 중량부인 것이 보다 바람직하다. 또는 상기 조성물은 차전자 추출물을 유효성분으로 포함하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명의 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 추출물은 ⅰ) 상기 약재에 물 또는 에탄올을 가하고 80 내지 150℃에서 1 내지 4시간 동안 추출하는 단계; ⅱ) 상기 추출 용액을 1000~5000 rpm의 원심분리로 침전된 불순물을 제거하고 0.3~0.6 ㎛ 필터로 여과하는 단계; 및 ⅲ) 상기 여과액을 회전진공농축기로 농축하는 단계;를 포함하는 것이 바람직하다.

구체적으로, 본 발명의 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물에 있어서, 상기 산수유, 구기자, 복분자, 토사자, 오미자 및 차전자에 1 내지 20 배의 물을 가하고 80 내지 150℃에서 1 내지 24시간 동안 추출한 후 여과하여 얻어지거나, 1 내지 20배의 10~50% 에탄올을 가하고 40 내지 100℃에서 1 내지 24 시간 동안 추출한 후 여과하여 얻어지는 것이 바람직하다.

이중에서 산수유, 구기자, 복분자, 토사자 및 오미자 추출물로 구성된 것을 KH-204로 명명하고, 이들의 에탄올 추출 및 열수 추출물을 측정하였다.

구체적으로, 상기 추출물은 각 약재를 물 또는 유기용매로 추출하여 얻을 수 있는데, 유기용매로는 저급알콜, 아세톤, 클로로포름, 메틸렌클로라이드, 에테르, 에틸아세테이트, 헥산 등을 예시할 수 있다. 저급알콜로는 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올을 예시할 수 있으며, 에탄올이 가장 바람직하다.

또는 산수유, 구기자, 복분자, 토사자, 오미자 및 차전자 건조물 또는 분말에 1 내지 20배, 바람직하게는 2 내지 15배, 더욱 바람직하게는 10배의 물을 첨가하고 80 내지 150℃, 바람직하게는 100 내지 120℃의 온도에서 1 내지 24시간, 바람직하게는 3 내지 5시간, 더욱 바람직하게는 4시간 동안 추출한 후 여과하여 각 약재의 열수 추출물을 제조할 수 있으며, 이를 여과하여 얻어진 여액을 감압농축하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법들에서 추출공정은 필요에 따라 2회 이상 반복하여 실시할 수 있으며, 여과 후 얻어진 추출물을 동결 건조 또는 감압건조시켜 분말 형태로 만들 수도 있다.

구체적으로, 산수유, 구기자, 복분자, 토사자, 오미자 및 차전자 건조물 또는 분말에 1 내지 20 배, 바람직하게는 2 내지 15 배, 더욱 바람직하게는 10배의 10~50% 에탄올 수용액을 첨가하고 40 내지 100, 바람직하게는 50 내지 60의 온도에서 1 내지 24시간, 바람직하게는 3 내지 5시간, 더욱 바람직하게는 4시간 동안 추출한 후 여과하여 각 약재의 에탄올 추출물을 제조할 수 있으며, 이를 여과하여 얻어진 여액을 감압농축하여 제조할 수 있다. 상기 추출방법들에서 추출공정은 필요에 따라 2회 이상 반복하여 실시할 수 있으며, 여과 후 얻어진 추출물을 동결 건조 또는 감압건조시켜 분말 형태로 만들 수도 있다.

또한, 본 발명의 약학 조성물은 약리효과를 증진시키기 위해 약학적으로 허용가능한 다른 생약재 또는 그의 추출물을 추가로 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 추출방법에 따라 생약재의 추출물을 제조한 후 약학 조성물에 가하거나 상기 산수유, 구기자, 복분자, 토사자, 오미자 및 차전자 중 선택된 1종 이상의 약재와 생약재를 혼합한 후 상기 방법으로 추출하여 얻어진 추출물을 조성물에 포함시킬 수도 있다. 상기에서 약학적으로 허용가능한'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 알레르기반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 말한다.

또한, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다.

경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다.

또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 약학적 조성물은 경피 투여될 수 있다. 상기에서 경피 투여'란 본 발명의 약학적 조성물을 세포 또는 피부에 투여하여 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물에 함유된 활성성분이 피부 내로 전달되도록 하는 것을 말한다. 예컨대, 본 발명의 약학적 조성물을 주사형 제형으로 제조하여 이를 30 게이지의 가는 주사 바늘로 피부를 가볍게 단자 (prick)하는 방법, 또는 피부에 직접적으로 도포하는 방법으로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 크림제, 로션제, 외용연고제, 오일제, 보습제, 겔제, 에어로졸 및 비강흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

본 발명의 조성물의 유효 성분인 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출물 및 차전자 추출물로부터 선택된 1종 이상의 추출물의 총 유효량은 단일 투여량 (single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량 (multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 바람직하게 본 발명의 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출물 및 차전자 추출물로부터 선택된 1종 이상의 추출물의 바람직한 전체 용량은 1일당 환자 체중 1 ㎏ 당 약 100 ㎍ 내지 5 ㎎, 가장 바람직하게는 500 ㎍ 내지 1 ㎎일 수 있다. 그러나, 상기 추출물의 용량은 약학적 조성물의 투여경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 추출물을 남성 성기능 개선 및 불임 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명에 있어서, '남성 성기능 개선 및 불임 치료'란 통상적으로 불임을 유발할 수 있는 정자 수, 정자 활동성, 테스토스테론 호르몬, 성행동 및 성기능 등의 정상화 또는 이들의 증진을 의미한다.

*또한, 본 발명은 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출물 및 차전자 추출물로부터 선택된 1종 이상의 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 성기능 개선 및 불임 예방용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품 (functional food), 영양 보조제 (nutritional supplement), 건강식품 (health food) 및 식품 첨가제 (food additives) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출물 및 차전자 추출물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출물 및 차전자 추출물과 남성 성기능 개선 및 불임 예방 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료 (알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품 (예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품 (예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류 (예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품 (예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료 (예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출물 및 차전자 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출물 및 차전자 추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

산수유는 층층나무과에 속한 낙엽소교목인 산수유 열매의 육질을 건조한 것으로 맛이 시고, 따뜻한 성질을 가지고 있다. "동의보감"과 "향약집성방" 등에 따르면 강음(强陰), 신정(腎精)과 신기(腎氣) 보강, 수렴 등의 효능이 있고 두통, 이명(耳鳴), 해수병, 해열, 월경 과다 등의 지한(止汗) 등에도 효과를 볼 수 있다고 전하고 있다. 자양강장 등으로 일반인들에게 가장 널리 알려진 한약으로 십전대보탕(十全大補湯), 육미지황탕(六味地黃湯)이 있는데, 이 처방에서 산수유는 가장 중요한 약재로 사용된다.

구기자는 낙엽관목으로 높이는 2.5 m에 달하고, 가지 끝은 아래로 늘어지며, 짧은 가지는 가시모양이며, 잎은 긴 가지 밑 부분에서 2 내지 3 편식 족생하는 형태이다. 예로부터 동의보감에는 "성한(性寒), 미고(味苦), 무독(無毒)하며, 내상(內傷)의 대노(大勞)와 허흡(噓吸)을 다스리고, 근골(筋骨)을 굳세게 하며, 음 (陰)을 강하게 하고 오노(五勞)와 칠상(七傷)을 다스리며 정기를 보하고 안색을 바꿔서 희게 하고 명목(明目), 안신(安神)하고 장수한다"고 전한다. 또한 본초 강목에서는 독성이 없고, 열을 식히고, 체내에 쌓인 사기, 흉부의 염증 소갈, 당뇨병, 관절, 류마티스, 신경통 등에 좋으며 오래 복용하면 근육을 건전하게 하고 전신이 상쾌하고 더위와 추위를 모르는 젊음을 찾는다고 하였고 차, 술 등 다양한 방법으로 오랫동안 이용되었다.

복분자는 장미과에 속한 낙엽관목인 익지 않은 복분자 딸기의 열매를 건조한 것으로 맛이 시고 따뜻한 성질을 가지고 있는 것으로, 간장과 신장을 보호하는데 그 효능이 있다. 동의보감에 의하면 복분자는 성질은 평하고 맛은 달고 시며 독이 없고 "남자의 신정(腎精)의 허갈(虛喝)과 여자의 무자(無子)를 주치하고 남자의 음기를 굳세고 길게 하며 간을 도우며, 눈을 맑게 하며, 신장의 기운을 가득하게 하여 몸을 가볍게 하고, 머리털이 희어지지 않게 한다"라 기록되어 있다. 또한, 최근 연구에서 신장기능, 불임증, 음위증, 유정몽설, 강장제, 혈액 등을 맑게 해주며 간을 보하고 눈을 맑게 하는 효능이 증명되었으며 복분자 딸기의 덜 익은 열매의 가수분해성 탄닌으로서 1종의 갈로탄닌(gallotannin)과 3종의 엘라기탄닌(ellagitannin)을 분리하였으며, 이화학적 성상과 스펙트럼 데이터를 토대로 갈릭산, 2,3-(S)-HHDP-D-글루코피라노즈, 산귄(sanguiin) H-4 및 산귄 H-6를 보고하였다. 복분자의 경우 효소적 지질과 산화에 대해서도 강한 억제 활성을 나타내며 그 성분으로는 갈릭산 등의 페놀 화합물이 확인되었다. 페놀성 화합물은 식품계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양한 구조와 분자량을 가지며, 이들은 페놀성 히드록실기를 가지고 있기 때문에 단백질 등의 거대분자들과 결합하는 성질을 가지며, 항산화 효과, 항균성, 아질산염 소거능 등의 생리활성 기능도 가진다.

토사자는 메꽃과에 속한 1년생 기생초본인 심새삼 및 등속식물의 씨를 건조한 것이다. 토사자는 맛이 맵고 달며 평이한 성질을 지니고 있는 것으로 항암, 강심, 혈압강하작용 및 혈당강하, 신장과 비장을 보호하는데 그 효능이 있다. 동의보감에서는 "정력을 증강시키고 기운을 북돋우며, 요통과 무릎이 시린 증상에 효과가 좋고 달여서 수시로 마시면, 당뇨병에 효과가 있다"라고 전하고 신농본초경에 "여러 가지 부족증을 보충해주며 기력을 더해주고 건실하게 한다. 오래 복용하면 눈이 밝아지고 장수할 수 있다"라고 전해진다.

오미자는 목련과에 속하는 오미자의 성숙한 열매를 건조시킨 것으로 5가지 맛을 가지고 있어 간 기능 보호 작용과 항노화 작용, 항균 작용, 대사와 면역 기능에 대한 작용을 하는데 그 효능이 있다. 동의보감에서는 폐와 신장을 보호하고 허로(虛勞), 구갈, 번열, 해소를 고친다고 전한다. 이러한 오미자는 차, 술, 화채 등으로 다양하게 이용되어지고 있다.

차전자는 질경이과(Plantaginaceae)에 속하는 식물인 질경이(Plantago asiatica L.)의 종자를 일컫는 것으로, 한의학적으로 이수(利水), 청열(淸熱), 명목(明目), 거담(祛痰)의 효능이 있고, 소변불통, 대하, 혈뇨, 해수, 목적(目赤)을 치료하는데 주로 쓰인다. <동의보감>에 따르면 차전자는 기운이 허약하여 소변이 잘나오지 않는 것을 주로 치료하고, 다섯가지 종류의 임질을 다스리며, 소변의 막히고 체함을 통하게 하고, 수분이 잘 배설되게 하며, 눈을 밝게 하고 충혈을 없애주며, 간장의 열독을 다스린다고 한다. 따라서 차전자는 수독형의 부종으로 인해 붓는 증상을 개선해 준다.

본 발명자들은 산수유, 구기자, 복분자, 토사자, 오미자 및 차전자의 각각의 열수 및 30% 에탄올 추출물과 이들을 혼합한 추출물을 이용하여 MTT assay를 통하여 웅성마우스의 정소세포인 TM3 세포에서의 세포 독성을 측정하였다(표 1 및 도 1 내지 도 8 참조). 그 결과, KH-204 에탄올, KH-204 열수, 산수유, 오미자, 구기자에서는 독성이 없음을 확인하였고, 토사자, 차전자, 복분자 시료들은 약간의 독성이 있음이 확인되었다.

또한, HUVEC 세포를 사용하여 eNOS에 관여하여 발기에 밀접히 관여하는 NO 생성 효능을 측정하였다(표 3 및 도 9, 도 10 참조). 그 결과, KH-204 30% 에탄올 추출물 및 열수 추출물 그룹이 질산염의 농도를 증가시킴을 확인하였다. 즉, 상기 시료들은 혈관확장인자인 NO 생성을 증가시킴으로 음경 발기능을 개선시킨다.

또한, 본 발명의 각 추출물의 ACE (Angiotensin converting enzyme) 저해 효과를 측정하였다(표 5 및 도 11 참조). 그 결과, 구기자(49.1%), KH-204 열수 추출 (47.0%), 오미자(45.9%), 차전자(36.3%), KH-204 30% 에탄올 추출(34.2%), 복분자(29.9%) 순으로 저해율이 높았다. 따라서 이들 시료는 혈관의 이완을 통하여 간접적으로 음경의 혈류량을 증가시켜 발기를 유지하는데 도움이 된다.

또한, PDE (Phosphodiesterase)-5 저해율을 측정하였다(표 8 및 도 14 참조). PDE-5 저해효과는 복분자 (34.5%), 오미자 (35.6%), 구기자 (32.8%), KH-204 (30% 에탄 올추출, 25.6%) 순으로 좋았다.

또한, 동물 실험을 통한 장기 무게 측정과 정자 기능을 측정하였다. KH-204 에탄올 추출물과 양성 대조군인 홍삼에서 측정한 결과, 먼저 마우스 무게(표 10 및 도 15 참조)는 홍삼 보다 무게 감소를 보였다. 그러나, 정남 무게는 KH-204 (에탄올 추출) 농도를 높게 투여한 그룹 일수록 증가하는 경향을 보였다(표 11 및 도 16 참조). 정소 무게는 KH-204 (에탄올 추출)를 투여한 그룹과 홍삼을 투여한 그룹이 유사하였다(표 12 및 도 17 참조). 부정소의 무게도 대체로 KH-204 (에탄올 추출)를 투여한 그룹과 홍삼을 투여한 그룹이 유사하였다(표 13 및 도 18 참조). 정자수는 KH-204 (에탄올 추출)의 농도가 증가할수록 증가하는 경향을 보였고, 양성 대조군으로 사용한 홍삼 400 그룹 보다 KH-204 (에탄올 추출)를 투여한 모든 그룹에서 많은 정자수가 확인되었다(표 14 및 도 19 참조). 마우스의 정자운동성도 KH-204 (에탄올 추출)의 농도가 증가할수록 증가하는 경향을 보였고, 양성 대조군으로 사용한 홍삼 400 그룹 보다 KH-204 (에탄올 추출)를 투여한 모든 그룹에서 높은 정자 운동성이 확인되었다(표 15 및 도 20 내지 도 26 참조).

상기와 같이 구성되는 본 발명은 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물로서, 정자 수, 정자의 운동성, 테스토스테론 호르몬의 함량, 성 행동, 성 기능 등을 증가시키는 효과가 있어 화학적 합성제품의 투여로 인해 발생되는 부작용과 윤리적, 사회적인 문제없이 성기능 장애 및 남성불임증으로 고통받는 환자뿐만 아니라 일반인에게 남성 생식기능 및 성기능 개선에 도움을 줄 수 있다.

도 1은 KH-204 에탄올 추출물의 세포독성 확인 실험을 나타낸 그래프이다.
도 2은 KH-204 열수 추출물의 세포독성 확인 실험을 나타낸 그래프이다.
도 3은 산수유 추출물의 세포독성 확인 실험을 나타낸 그래프이다.
도 4는 오미자 추출물의 세포독성 확인 실험을 나타낸 그래프이다.
도 5은 복분자 추출물의 세포독성 확인 실험을 나타낸 그래프이다.
도 6은 토사자 추출물의 세포독성 확인 실험을 나타낸 그래프이다.
도 7는 차전자 추출물의 세포독성 확인 실험을 나타낸 그래프이다.
도 8은 구기자 추출물의 세포독성 확인 실험을 나타낸 그래프이다.
도 9는 KH-204 에탄올 추출물의 HUVEC에서의 nitrate의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10는 KH-204 열 수 추출물의 HUVEC에서의 nitrate의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 11은 각 시료의 ACE 저해율을 측정한 결과(%)를 나타낸 그래프로, 각 시료별 (농도 : 500 ppm)로 angiotensin-converting enzyme 저해율을 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에서 사용된 PDE (Phosphodiesterase)-5 저해 효과 측정 원리를 설명한 그림이다.
도 13 및 도 14은 각각 PDE-5 억제율 (%)을 얻기 위한 표준 곡선(도 13) 및 각 시료별 (500 ppm) Phosphodiesterase-5 저해율의 측정 결과(도 14)을 나타낸 그래프이다.
도 15는 KH-204 30% 에탄올 추출물 시료를 농도별로 8일간 경구투여한 후의 마우스의 최종 무게를 나타낸 그래프이다.
도 16은 KH-204 30% 에탄올 추출물 시료를 농도별로 8일간 경구투여한 후의 마우스 왼쪽 정낭 무게를 나타낸 그래프이다.
도 17는 KH-204 30% 에탄올 추출물 시료를 농도별로 8일간 경구투여한 후의 마우스 왼쪽 정소 무게를 나타낸 그래프이다.
도 18는 KH-204 30% 에탄올 추출물 시료를 농도별로 8일간 경구투여한 후의 마우스 왼쪽 부정소 무게를 나타낸 그래프이다.
도 19은 KH-204 30% 에탄올 추출물 시료를 농도별로 8일간 경구투여한 후의 마우스 정자수를 나타낸 그래프이다.
도 20은 KH-204 30% 에탄올 추출물 시료를 농도별로 8일간 경구투여한 후의 마우스 정자 운동성(%)을 나타낸 그래프이다.
도 21 내지 도 26은 정자의 운동성을 나타낸 현미경 사진으로, 대조군 그룹의 정자 사진 (광학현미경 200배율)(도 21), KH-204 30% 에탄올 추출물 50 ㎎/㎏을 투여한 그룹의 정자 사진 (광학현미경 200배율)(도 22), KH-204 30% 에탄올 추출물 100 ㎎/㎏을 투여한 그룹의 정자 사진 (광학현미경 200배율)(도 23), KH-204 30% 에탄올 추출물 200 ㎎/㎏을 투여한 그룹의 정자 사진 (광학현미경 200배율)(도 24), KH-204 30% 에탄올 추출물 400 ㎎/㎏을 투여한 그룹의 정자 사진 (광학현미경 200배율)(도 25), 및 양성 대조군으로 홍삼 400 ㎎/㎏을 투여한 그룹의 정자 사진 (광학현미경 200배율)이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 제조예 > 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 조성물의 제조

< 제조예 1> 30% 에탄올 추출물의 제조

<1-1> 산수유 30% 에탄올 추출물의 제조

먼저 불순물을 제거하고 잘 건조시킨 산수유 22 g을 준비하여 4 내지 8 배의 30% 에탄올 수용액을 넣고 60 내지 70에서 3 내지 5시간 동안 환류 추출하였다. 추출물은 여과한 후 여액을 50 내지 60 이하에서 감압 농축하였다.

<1-2> 구기자 30% 에탄올 추출물의 제조

불순물을 제거하고 잘 건조시킨 구기자 42 g을 준비하여 4 내지 8 배의 30% 에탄올 수용액을 넣고 60 내지 70℃에서 3 내지 5시간 동안 환류 추출하였다. 추출물은 여과한 후 여액을 50 내지 60℃ 이하에서 감압 농축하였다.

<1-3> 복분자 30% 에탄올 추출물의 제조

불순물을 제거하고 잘 건조시킨 복분자 26 g을 준비하여 4 내지 8 배의 30% 에탄올 수용액을 넣고 60 내지 70℃에서 3 내지 5시간 동안 환류 추출하였다. 추출물은 여과한 후 여액을 50 내지 60℃ 이하에서 감압 농축하였다.

<1-4> 토사자 30% 에탄올 추출물의 제조

불순물을 제거하고 잘 건조시킨 토사자 26 g을 준비하여 4 내지 8 배의 30% 에탄올 수용액을 넣고 60 내지 70℃에서 3 내지 5시간 동안 환류 추출하였다. 추출물은 여과한 후 여액을 50 내지 60℃ 이하에서 감압 농축하였다.

<1-5> 오미자 30% 에탄올 추출물의 제조

불순물을 제거하고 잘 건조시킨 오미자 6 g을 준비하여 4 내지 8 배의 30% 에탄올 수용액을 넣고 60 내지 70℃에서 3 내지 5시간 동안 환류 추출하였다. 추출물은 여과한 후 여액을 50 내지 60℃ 이하에서 감압 농축하였다.

<1-6> KH -204 30% 에탄올 추출물의 제조

상기 농축된 산수유, 구기자, 복분자, 토사자, 오미자 농축액을 분말로 제조하고, 여기에 10배 분량의 정제수를 가하여 약탕기(대웅, Korea)에 2시간 동안 끓여 용액을 취하여 3,000 rpm으로 원심침전시키고 상층액만 취하여 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 여과한 다음 회전진공농축기(Eyela A-1000S, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축하여 시료를 회수한 후 동결건조(ILSHIN, Korea)하여 23.5 g을 회수하여 -20℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.

<1-7> 차전자 30% 에탄올 추출물의 제조

불순물을 제거하고 잘 건조시킨 차전자 32 g을 준비하여 4 내지 8 배의 30% 에탄올 수용액을 넣고 60 내지 70℃에서 3 내지 5시간 동안 환류 추출하였다. 추출물은 여과한 후 여액을 50 내지 60℃ 이하에서 감압 농축하였다. 최종적으로 30 ㎖의 증류수를 가하여 현탁시킨 후 동결 건조하여 최종 갈색 분말을 얻었다.

< 제조예 2> KH -204 열수 추출물의 제조

불순물을 제거하고 잘 건조시킨 산수유 32 g, 구기자 32 g, 복분자 16 g, 토사자 16 g, 오미자 4 g을 준비하여 4 내지 8 배의 물을 넣고 100 내지 120℃에서 3 내지 5시간 동안 환류 추출하였다. 추출물은 여과한 후 여액을 50 내지 60℃ 이하에서 감압 농축하였다. 여기에 10배 분량의 정제수를 가하여 약탕기(대웅, Korea)에 2시간 동안 끓여 용액을 취하여 3,000 rpm으로 원심침전시키고 상층액만 취하여 0.45 ㎛ 필터를 사용하여 여과한 다음 회전진공농축기(Eyela A-1000S, Tokyo Rikakikai Co., Tokyo, Japan)로 농축하여 시료를 회수한 후 동결건조(ILSHIN, Korea)하여 23.5 g을 회수하여 -20℃에서 보관하면서 실험에 사용하였다.

< 실시예 1> TM3 세포에서의 세포 독성 측정

마우스 정소세포 TM3에 대하여 MTT 분석을 통하여 시료의 세포독성 유무를 확인하였다. TM3 세포(KCLB21714)는 한국 세포주은행에서 분양받았다. FBS(Fetal bovine serum), DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium), MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide), Sigma사(Sigma Chem. Co., USA)로부터 구입하였다. ELISA microplate reader기는 VersaMax (Molecular Device, USA)를 사용하였다.

구체적으로, 시료에 대한 세포 독성을 알아보기 위해 웅성마우스의 정소세포인 TM3 세포를 사용하여 Sladowski 등(Sladowski D, et. al. J Immunol Methods 157, 203-207. (1993))의 방법으로 MTT 분석을 실시하였다. 96 웰 플레이트에 TM3 세포 180 ㎕(2 X 10⁵ cells)에 시료들 농도별로 20 씩 처리해 각각 62.5 ppm, 125 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, 2000 ppm, 4000 ppm 농도가 되도록 처리한 후 37에서 24시간 동안 배양한 다음 MTT 용액(5 ㎎/㎖) 20 ㎕를 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 그 후 상층액을 제거한 뒤 DMSO를 웰당 200 ㎕씩 넣고 20분간 반응시킨 다음 ELISA reader 570 ㎚에서 흡광도를 측정하여 생존율을 계산하였다. 정상군(시료 처리 대신에 PBS를 처리한 그룹)의 값을 대조군으로 하고 이때의 O.D.(Optical density) 값을 세포의 생존도가 100% 라고 정의하고, 나머지 군의 측정한 O.D. 값을 상대치로 환산을 하면 다음과 같다.

세포 생존율 (%) = (실험치/대조군) X 100

각 시료의 세포독성 결과를 하기 표 1, 도 6 내지 도 13에 기재하였다.

	대조군	62.5	125	250	500	1000	2000	4000	(ppm)
KH-204 에탄올 추출	100.00 ± 0.09	89.40 ± 0.016	89.86 ± 0.036	90.02 ± 0.020	85.41 ± 0.041	86.26 ± 0.014	86.22 ± 0.061	73.58 ± 0.025	(%)
KH-204 열수 추출	100.00 ± 0.09	86.36 ± 0.009	87.07 ± 0.041	86.74 ± 0.039	87.79 ± 0.031	88.60 ± 0.011	87.55 ± 0.008	78.25 ± 0.060	(%)
산수유	100.00 ± 0.09	86.64 ± 0.051	85.75 ± 0.007	85.12 ± 0.003	85.20 ± 0.014	84.16 ± 0.025	68.62 ± 0.019	61.71 ± 0.057	(%)
오미자	100.00 ± 0.09	96.47 ± 0.075	92.01 ± 0.144	88.49 ± 0.095	83.94 ± 0.080	82.39 ± 0.195	79.49 ± 0.019	78.70 ± 0.003	(%)
복분자	100.00 ± 0.09	92.23 ± 0.033	69.98 ± 0.034	61.88 ± 0.035	62.07 ± 0.013	52.20 ± 0.081	47.98 ± 0.105	35.32 ± 0.113	(%)
토사자	100.00 ± 0.09	102.44 ± 0.006	99.13 ± 0.059	80.00 ± 0.001	65.58 ± 0.077	59.96 ± 0.110	57.48 ± 0.004	52.83 ± 0.058	(%)
차전자	100.00 ± 0.09	99.29 ± 0.073	90.84 ± 0.010	81.16 ± 0.087	75.35 ± 0.048	71.32 ± 0.018	69.10 ± 0.065	67.87 ± 0.056	(%)
구기자	100.00 ± 0.09	94.41 ± 0.982	85.20 ± 0.874	85.16 ± 0.892	82.03 ± 0.840	80.21 ± 0.822	79.22 ± 0.812	77.30 ± 0.793	(%)

TM3 세포에 시료들을 농도별로 처리하여 세포 생존율 측정한 결과를 시료를 처리하지 않은 대조군의 세포 생존율을 100%로 하여 비교하였고, 20% 이상의 세포 수가 감소하였을 때, 세포독성으로 판단하였다.

그 결과, 상기 표 1에 기재한 바와 같이, KH-204 에탄올 추출물 시료는 4000 ppm 농도에서 생존률 73.58% 이었고, KH-204 열수 추출물 시료는 4000 ppm 농도에서 생존률 78.25%으로 4000 ppm 부터 약간의 독성이 관찰되었다. 산수유, 오미자, 구기자는 2000 ppm 농도에서 생존률이 각각 68.2%, 79.49%, 79.22%로 2000 ppm부터 독성이 확인되었다. 토사자와 차전자는 500 ppm에서 생존률이 각각 65.58%와 75.35%로 확인되었으며, 복분자는 125 ppm 농도에서 생존률이 69.98%로 세포독성을 확인하였다.

보통 1000 ppm 농도에서 세포 생존률이 80% 이하일 때 독성이 있다고 판단을 하는데, KH-204 에탄올, KH-204 열수, 산수유, 오미자, 구기자에서는 독성이 없음을 확인하였고, 토사자, 차전자, 복분자 시료들은 독성이 있음이 확인되었다. 하지만 이들의 혼합물인 KH-204에서 독성이 확인되지 않아 다음 in virto 실험과 in vivo 실험을 수행하였다.

< 실시예 2> HUVEC 에서 NO 농도 측정

음경이 발기하기 위해서는 먼저 음경해면체 동맥과 음경 평활근의 완전한 이완과 음경 해면체내 혈관강(sinusoidal vascular space)에 혈액이 축적되어야 하고, 음경 평활근의 이완은 신경전달물질과 비신경전달물질에 의해 이루어진다. 최근 비신경전달물질인 프로스타그라딘(prostaglandin)과 EDRF(endothelium derived relaxing factor)에 의한 음경해면체내 평활근의 조절이 발기에 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. Palmer 등에 의해 NO(nitric oxide)가 강력한 EDRF의 하나로 밝혀짐에 따라 음경해면체 평활근 이완에 대한 NO의 역할에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다. NO는 체내에서 NOS(nitric oxide synthase)의 생화학적 작용에 의해서 생합성되어 진다. 그리고 면역조직 화학법에 의해 NOS 함유 신경과 그들이 존재하는 장기들이 밝혀지고 있으며, 이들의 분포는 흰쥐와 인체에서 신경 해부학적으로 유사함이 밝혀졌다. 음경 해면체 조직 중의 혈관 평활근 이완을 촉진시켜 발기 능을 개선시키는 인자인 NO는 불완전하고 안정성이 없는 물질로서 반감기가 매우 짧기 때문에 직접적으로 정량 할 수 없으므로, 체내 산화대사 물질인 아질산염(nitrite)의 함량을 측정함으로써 NO의 함량을 예상할 수 있다. HUVEC 세포를 사용하여 eNOS에 관여하여 발기에 밀접히 관여하는 NO 생성 효능을 측정하였다.

HUVEC에서 NO 농도를 측정하기 위하여 total nitric oxide assay kit를 사용하였다. 12 웰 플레이트에 한 웰 당 HUVEC 900 (110⁴cell) 씩 넣고 24시간 동안 37, 5% CO₂ 배양기에서 배양한 다음 배지를 버리고 배양 세포 표면을 1X PBS로 세척하였다. 1X PBS에 녹인 시료들을 최종 농도가 0, 50, 100, 200, 400 ppm이 되도록 EGM-2에 혼합하여 37, 5% CO₂ 배양기에서 48시간 배양 하였다. 배양이 끝난 배지 50 에 NADH 25 , 질산염 환원제(nitrate reductase) 25 을 혼합한 후 37에서 30분 간 반응한 뒤, Griess reagent 50 , Griess reagent 50 을 넣고 잘 섞어 상온에서 10 분간 정치하였다. 반응이 끝난 후 550 에서 흡광도를 측정하여 질산염(nitrate)의 농도를 계산하며, 질산염을 NO 생성의 지표로 하여 측정하였다.

사용된 KH-204 에탄올 및 열수 추출물의 농도와 대조군 홍삼의 농도는 하기 표 2와 같다.

그룹	실험 농도
KH -204 30% 에탄올 추출	0, 50, 100, 200, 400 ppm
KH -204 열수 추출	0, 50, 100, 200, 400 ppm
홍삼 (양성 대조군)	400 ppm

그 결과, 각 KH-204 에탄올 및 열수 추출물의 각 농도별, 대조군 홍삼에서의 NO 생성 결과를 하기 표 3, 도 9 및 도 10에 기재하였다.

	0 (음성대조군)	50	100	200	400	홍삼 400 (양성대조군)	(ppm)
KH-204 에탄올 추출물	0.002 ± 0.092	3.877 ± 0.783	6.038 ± 0.468	7.508 ± 0.065	16.369 ± 0.609	8.362 ± 0.020	(%)
KH-204 열수 추출물	0.002 ± 0.092	0.031 ± 0.109	0.454 ± 0.403	2.438 ± 0.555	7.438 ± 0.533	8.362 ± 0.020	(%)

그 결과, KH-204 30% 에탄올 추출물 시료를 50, 100, 200, 400 ppm 처리함에 따라 질산염의 농도가 약 3.877, 6.038, 7.508, 16.369 μ㏖/㎖로 나타났으며, 시료 대신 배지를 처리한 음성 대조군은 0.002 μ㏖/㎖의 결과를 얻었고, 이와 비교했을 때 KH-204 30% 에탄올 추출물그룹이 질산염의 농도가 증가됨을 확인하였다(도 9).

KH-204 열수 추출물 시료를 50, 100, 200, 400 ppm 처리함에 따라 질산염의 농도가 약 0.031, 0.454, 2.438, 7.438 μ㏖/㎖로 나타났으며, 시료 대신 배지를 처리한 음성 대조군과 비교했을 때 KH-204 30% 에탄올 추출물과 마찬가지로 증가함을 보였다(도 10).

특히, KH-204 30% 에탄올 추출물 400 ppm 에서의 농도는 16.369 μ㏖/㎖으로 양성 대조군으로 사용된 홍삼 400 ppm의 값 8.362 μ㏖/㎖ 보다 더 많이 질산염의 농도가 증가됨을 확인하였다.

KH-204 열수 추출물 시료들은 음성 대조군 보다는 질산염의 농도가 증가되었지만, 양성 대조군인 홍삼 400 ppm 그룹의 질산염의 농도보다 낮음을 확인해, KH-204 열수 추출물 보다는 KH-204 30% 에탄올 추출물이 각각 농도를 비교하였을 때 더 효과적으로 질산염을 생성함을 알 수 있었다. 테스트 결과들로 시료들은 혈관확장인자인 NO 생성을 증가시킴으로 음경 발기능을 개선시키는 것으로 판단된다.

< 실시예 3> ACE ( Angiotensin converting enzyme ) 저해 효과 측정

남성 성기능 개선 및 강화에 깊은 관련이 있는 발기유지의 핵심인 혈관근육의 이완상태를 유지하기 위해 강력한 혈관 수축제인 안지오텐신(angiotensin) 의 합성에 관여하는 ACE의 작용을 저해하는 것이 효과적이라고 사료되며, 실제 지금까지 일부 ACE 저해제가 성기능 개선 및 강화를 위한 후보 물질로서 제안되어 왔다. Angiotensin-converting enzyme (ACE; peptodyldipeptide hydrolase EC 3.4.15.1)은 혈압을 조절하는 아주 중요한 역할을 하고 있는 효소이다. 이 효소는 10개의 아미노산으로 구성된 angiotensin 을 angiotensin 로 가수분해함으로써 혈압을 증가시킨다. 강력한 혈관 수축제인 angiotensin 는 알도스테론의 분비를 촉진시킨다. 그 결과 알도스테론은 신장내 Na⁺과 물의 보유를 증가시켜주며 동맥혈압의 증가를 가져온다. ACE를 저해하여 angiotensin 의 생성을 억제한다면 혈압 낮출 수 있다. 또한 혈관을 이완시키면 음경 내 혈류량이 증가하게 되어 음경 발기가 유도된다는 점에서 의의가 있다. 본 테스트에서는 ACE의 기질인 Angiotensin 을 대신하여 N-Hippuryl-His-Leu을 사용하였고 ACE는 토끼의 폐조직 분말로부터 추출하여 효소액으로 사용했다. 효소반응을 통해 생성된 히푸릭산(hippuric acid)을 228 nm에서 측정하여 저해율을 확인했다(I., M., Y., Shon and S., H., Na., J Korean Soc Food Sci Nutr . 36, 1511-1516. (2007) ; E., K., Cho et. al, J. Life Sci . 21, 811-818. (2011) ; C. Liang et. al., Natural product sciences , 17 (4), 363-366. (2011).

그 원리를 요약하면 하기와 같다.

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu (Angiotensin) + ACE ( Enzyme ) : 반응물

↓

Asp-Arg- Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe (Angiotensin ) + His-Leu : 생성물

*Hippuric acid-His-Leu (N-Hippuryl-His-Leu) + ACE ( Enzyme ) : 반응물

↓

Hippuric acid + His-Leu : 생성물

본 테스트에 사용된 Boric acid, rabbit lung acetone powder Sigma, HHL(hippuryl-histidyl-leucine)은 시그마-알드리치에서 구입하여 사용하였고 PURELAB Plus에서 생산된 초순수를 사용하였다. 그 외 사용된 시약은 Extra pure 등급의 시약을 사용하였다. UV-VIS 흡광계는 Spectronic Genesys 5(Milton Roy Co., Ivyland, USA)을 사용하였다.

본 테스트에 사용된 시료, 추출조건 및 농도를 요약하면 하기 표 4와 같다.

시료	추출조건	제조농도 ppm	최종농도 ppm
KH-204	30% 에탄올	2500	500
KH-204	열수	2500	500
오미자	30% 에탄올	2500	500
구기자	30% 에탄올	2500	500
차전자	30% 에탄올	2500	500
복분자	30% 에탄올	2500	500
토사자	30% 에탄올	2500	500
산수유	30% 에탄올	2500	500
Enalapril maleate salt (양성 대조군)		2500	25

시료들을 2500 ppm이 되게 증류수에 녹여 사용 전까지 4℃에 보관했다. 본 실험은 Cho 등(E., K., Cho et. al., J. Life Sci . 21, 811-818. (2011))의 방법을 수정하여 수행하였다. Rabbit lung acetone powder (Sigma社)을 0.3 M NaCl 이 함유된 0.1 M Sodium borate buffer(pH 8.3) 0.1 g/㎖(w/v)의 농도로 한 후, 4℃에서 2시간 추출하였다. 이후 4℃, 4000 rpm에서 40분 동안 원심분리 하였으며, 상등액을 ACE 조효소액으로 사용하였다. 기질은 0.3 M NaCl이 함유된 0.1 M Sodium borate buffer(pH 8.3)에 HHL(hippuryl-histidyl-leucine)을 5 ㎎/㎖(w/v)의 농도로 녹인 후 사용하였다. ACE 저해활성은 시료에 ACE 조효소액 50 ㎕을 가한 다음 37℃에서 5분간 예비반응을 시킨 뒤 기질 용액을 가한 후 다시 37℃에서 30 분간 반응시켰다. 0.1 M HCl 150 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시키고 750 ㎕의 ethyl acetate를 가한 후 15초간 교반하고 4, 3000 rpm에서 5분간 원심분리 시켰다. 상등액을 완전히 건조시키고 증류수 3 ㎖에 녹여 228 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 음성 대조군으로는 조효소액 대신 증류수를 사용하였으며 양성 대조군은 Enalapril maleate salt를 사용하였다. ACE 저해율은 다음 계산식을 이용하여 계산하였다.

ACE 억제율 (%) =[1-(ACE test/ACE control)] X 100

그 결과, 각 시료의 ACE 저해율을 하기 5, 도 11에 기재하였다.

시료 명	추출 조건	농도	ACE 저해율 (%)
KH-204	열수	500 ppm	47.0 ± 8.2
KH-204	30% 에탄올		34.2 ± 2.7
오미자	30% 에탄올		45.9 ± 6.8
구기자	30% 에탄올		49.1 ± 8.2
차전자	30% 에탄올		36.3 ± 8.2
복분자	30% 에탄올		29.9 ± 2.7
토사자	30% 에탄올		12.8 ± 0.0
산수유	30% 에탄올		16.0 ± 1.4
Enalapril maleate salt (양성 대조군)		25 ppm	98.3 ± 5.4

상기 억제율은 5 ㎎/㎖ HHL(hippuryl-histidyl-leucine)을 기질로 사용하였고 0.1 g/㎖ ACE 조효소액을 37℃에서 30분 동안 반응시켜 228 nm에서 흡광도 측정을 하였다. 시료별 저해율을 비교하였을 때 구기자(49.1%), KH-204 열수 추출 (47.0%), 오미자(45.9%), 차전자(36.3%), KH-204 30% 에탄올 추출(34.2%), 복분자(29.9%) 순으로 저해율이 높았다. 따라서 6가지 시료는 혈관의 이완을 통하여 간접적으로 음경의 혈류량을 증가시켜 발기를 유지하는데 도움이 된다고 생각되어진다.

< 실시예 4> PDE ( Phosphodiesterase )-5 저해율 측정

음경의 발기는 중추신경계, 말초신경계 및 평활근을 포함하는 생리학적 과정의 복잡한 상호작용으로 인해 발생한다. 특히, 비아드레날린성, 비콜린성 신경 및 내피로부터의 일산화질소(nitric oxide, NO) 방출은 음경해면체 내의 구아닐사이클라제(guanylate cyclase)를 활성화시키고 세포내 cGMP(cyclic GMP) 수준을 증가시킨다. 세포내 cGMP의 증가는 세포내 칼슘 수준을 감소시키고, 이는 주상 평활근 이완을 유발하여 다시 해면체 부피 확장을 통해 음경 발기를 유도한다. cGMP는 PDE(phosphodiesterase)-5에 의해 분해되므로 그 활성이 억제되어야 cGMP의 농도가 증가되어 발기 기능이 향상된다. 본 테스트에서는 3,5-cGMP를 기질로 하여 PDE-5에 의해 5-GMP가 생성되고 이것은 5-Nucleotidase에 의해 인산이 생성된다. 생성된 인산 양을 측정하여 PDE-5 활성을 얼마나 억제했는지를 알아보고 이를 바탕으로 남성불임개선에 자료로 사용하고자 하였다(도 12).

Cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit(BML-AK800, Enzo life science)를 구입하여 사용하였고 흡광도 측정에 사용된 UV-VIS 흡광계는 Spectronic Genesys 5(Milton Roy Co., Ivyland, USA) 모델이며, ELISA microplate reader기는 VersaMax(Molecular Device, Sunnyvale, USA)를 사용하였다.

본 테스트에 사용된 KH-204 에탄올 및 열수 추출물을 포함한 약재 시료, 추출조건 및 농도를 요약하면 하기 표 6과 같다.

시료	추출 조건	농도 (ppm)	최종농도 (ppm)
KH-204	30% 에탄올	2500	500
KH-204	열수	2500	500
구기자	30% 에탄올	2500	500
복분자	30% 에탄올	2500	500
산수유	30% 에탄올	2500	500
오미자	30% 에탄올	2500	500
토사자	30% 에탄올	2500	500
차전자	30% 에탄올	2500	500
IBMX (양성대조군)			9

시료들은 2500 ppm이 되게 증류수에 녹여 사용 전까지 4℃에 보관하였고, PDE 저해효과는 Jang 등의 방법에 따라(J. D. Corbin and S. H. Francis. J. Andrology. 24, S38-S41. (2003)) cyclic nucleotide phosphodiesterase assay kit를 이용하여 측정하였다. 5-GMP를 5-nucleotidase로 처리한 다음 BIOMOL GREEN reagent를 처리하여 620 nm에서 흡광도를 측정하여 표준곡선을 얻고, 3,5-cGMP를 기질로 하여 PDE와 각각의 시료를 첨가하여 반응시킨 다음 5-nucleotidase로 처리하고 BIOMOL GREEN reagent를 처리하여 620 nm에서 흡광도를 측정, 생성된 5-GMP의 양을 대조군과 비교하여 PDE 저해율을 계산하였다. 음성대조군은 기질만을 제외하였고 양성대조군은 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX)을 양성 대조군으로 사용하였다. IBMX의 IC₅₀ 값은 5.5 ppm이었다.

PDE-5 억제율(%) = [1-(PDE test - sample blank/ control - control blank)] X 100

그 결과, 얻어진 표준 곡선의 하기 표 7 및 도 13과 같다.

5-GMP (n)	O.D. 620
3.00	0.6640
2.00	0.5045
1.50	0.3844
1.00	0.2647
0.75	0.2427
0.50	0.1583
0.25	0.1121
0	0.0708

그 결과, 얻어진 PDE 저해율 측정 결과는 하기 표 8 및 도 14와 같다.

시료 명	추출 조건	농도	저해율 (%)
KH-204	열수	500 ppm	-3.0 ± 1.2
KH-204	30% 에탄올		25.6 ± 1.4
토사자	30% 에탄올		13.5 ± 1.6
구기자	30% 에탄올		32.8 ± 0.5
차전자	30% 에탄올		-3.40 ± 1.3
복분자	30% 에탄올		34.5 ± 2.92
오미자	30% 에탄올		35.6 ± 1.6
산수유	30% 에탄올		-15.3 ± 1.8
IBMX (양성 대조군)		9 ppm	94.7 ± 3.6

그 결과, 현재 발기부전 치료물질로 알려진 Sildenafil의 IC₅₀ 값은 3.5 nM이고 Vardenafil의 IC₅₀ 값은 6.6 nM이며 Tadalafil의 IC₅₀ 값은 0.2 nM으로 보고되었다. PDE-5 저해효과는 복분자 (34.5%), 오미자 (35.6%), 구기자 (32.8%), KH-204 (30% 에탄올추출, 25.6%) 순으로 좋았다.

이상으로 in vitro 테스트를 완료하고, 이하에서는 동물실험을 통한 in vivo 테스트를 수행하였다.

< 실시예 5> 동물 실험(장기 무게 측정 및 정자 기능 측정)

KH-204에 대하여 일반 동물 모델을 통한 효과를 검증 하였다. 사용된 KH-204 에탄올 추출물의 농도와 대조군 홍삼의 농도는 하기 표 9와 같다.

그룹	음성대조군	시료 처리군				양성 대조군
농도	0 (/)	50 (/)	100 (/)	200 (/)	400 (/)	홍삼 400 (/)

ICR계 마우스 (웅성, 8주령)는 (주) 오리엔트바이오 (경기도가평)에서 구입하여 1 주간 적응시킨 뒤 실험에 사용하였다. 실험 기간 중에 물과 사료는 자유로이 섭취시켰으며, 사육실 온도는 22 ± 2℃, 습도는 55 ± 5% 및 명암은 12 시간 주기로 자동 조절하였다.

구체적으로, 멸균수를 투여한 음성대조군 그룹, KH-204 (30% ethanol 추출)를 투여한 시료처리 그룹, 양성 대조군으로 홍삼을 투여한 그룹에 각각 1일 1회 8일간 샘플을 경구 투여하였다. 적응기간이 끝난 웅성마우스를 대조군과 시료 투여군으로 나누었으며, 시료 투여군은 50, 100, 200, 400 ㎎/㎏ 농도 그룹으로 나누었고, 각 군당 6 마리씩 사용하였다. 1일 1회 8일간 경구투여 하였다. 마지막 경구투여 24시간 후 마우스의 무게를 측정한 다음, 희생시켜 왼쪽 정소, 왼쪽 부정소, 왼쪽 정낭을 분리하여 각각의 무게를 측정하고, 분리한 부정소는 10 ㎖ DMEM 배지에서 homogenization 한 다음, 1 ㎖을 24 웰에 분주하고 10분 뒤에 200 배율의 현미경 상에서 정자 수를 측정하였다.

<5-1> 마우스 무게

그 결과, 마우스의 최종 무게는 하기 표 10 및 도 15와 같다.

	대조군	50 (㎎/㎏)	100 (㎎/㎏)	200 (㎎/㎏)	400 (㎎/㎏)	홍삼 400 (㎎/㎏)
체중(g)	37.01 ± 1.63	36.53 ± 1.09	36.73 ± 1.13	34.61 ± 1.85	29.29 ± 1.58	36.09 ± 1.08

그 결과, 마지막 날 마우스의 무게를 측정한 경우에 KH-204 (에탄올 추출)을 200 (㎎/㎏), 400 (㎎/㎏)을 투여 하였을 때 각각 34.61 g, 29.29 g으로 대조군에 비해 감소하였고, 특히 400 (㎎/㎏) 용량을 투여한 그룹에서는 약 7 g 정도 줄어들 20% 정도의 무게 감소를 보였다.

<5-2> 장기(정낭) 무게

그 결과, 마우스의 정낭 무게는 하기 표 11 및 도 16과 같다.

	대조군	50 (㎎/㎏)	100 (㎎/㎏)	200 (㎎/㎏)	400 (㎎/㎏)	홍삼 400 (㎎/㎏)
정낭 (g)	0.075 ± 0.02	0.078 ± 0.01	0.084 ± 0.02	0.089 ± 0.02	0.091 ± 0.01	0.094 ± 0.01

그 결과, 마우스의 정낭 무게는 KH-204 (에탄올 추출) 농도를 높게 투여한 그룹 일수록 증가하는 경향을 보였다.

<5-3> 장기(정소) 무게

그 결과, 마우스의 정소 무게는 하기 표 12 및 도 17과 같다.

	대조군	50 (㎎/㎏)	100 (㎎/㎏)	200 (㎎/㎏)	400 (㎎/㎏)	홍삼 400 (㎎/㎏)
정소 (g)	0.11 ± 0.01	0.11 ± 0.02	0.11 ± 0.01	0.13 ± 0.01	0.12 ± 0.01	0.13 ± 0.00

그 결과, 마우스의 정소는 KH-204 (에탄올 추출) 200 (㎎/㎏)를 투여한 그룹에서 무게가 가장 높았고, 홍삼 400 (㎎/㎏)를 투여한 그룹과 같은 결과가 나왔다.

<5-4> 장기(부정소) 무게

그 결과, 마우스의 부정소 무게는 하기 표 13 및 도 18과 같다.

	대조군	(㎎/㎏)	0 (㎎/㎏)	0 (㎎/㎏)	0 (㎎/㎏)	삼 400 (㎎/㎏)
부정소 (g)	0.040 ± 0.000	0.041 ± 0.002	0.042 ± 0.004	0.041 ± 0.002	0.037 ± 0.002	0.042 ± 0.004

그 결과, 마우스의 부정소는 그룹간의 차이가 거의 없었지만, KH-204 (에탄올 추출) 400 (㎎/㎏)를 투여한 그룹에서는 부정소의 무게가 감소한 결과를 얻었다.

<5-5> 정자수

그 결과, 마우스의 정자수는 하기 표 14 및 도 19와 같다.

	대조군	(㎎/㎏)	0 (㎎/㎏)	0 (㎎/㎏)	0 (㎎/㎏)	삼 400 (㎎/㎏)
정자수 (마리)	94.80 ± 7.19	106.33 ± 8.59	118.60 ± 18.66	123.00 ± 14.52	127.00 ± 16.31	103.80 ± 10.43

그 결과, 마우스의 정자수는 KH-204 (에탄올 추출)의 농도가 증가할수록 증가하는 경향을 보였고, 양성 대조군으로 사용한 홍삼 400 (㎎/㎏) 그룹 보다 KH-204 (에탄올 추출)를 투여한 모든 그룹에서 많은 정자수가 확인되었다.

<5-6> 정자 운동

그 결과, 마우스의 정자 운동은 하기 표 15 및 도 20 내지 도 26과 같다.

	대조군	(㎎/㎏)	0 (㎎/㎏)	0 (㎎/㎏)	0 (㎎/㎏)	삼 400 (㎎/㎏)
정자 운동성 (%)	53.73 ± 16.69	68.46 ± 3.52	70.88 ± 6.12	74.09 ± 8.20	91.12 ± 2.56	66.50 ± 8.56

그 결과, 마우스의 정자운동성은 KH-204 (에탄올 추출)의 농도가 증가할수록 증가하는 경향을 보였고, 양성 대조군으로 사용한 홍삼 400 (㎎/㎏) 그룹 보다 KH-204 (에탄올 추출)를 투여한 모든 그룹에서 높은 정자 운동성이 확인되었다.

<기타 제조예 1> KH -204 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 남성 불임 치료제의 제조

본 발명자들은 상기 실시예를 통해 KH-204 에탄올 추출물의 남성 불임 치료 효능이 뛰어남을 확인하여 KH-204 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 남성 불임 치료제를 하기와 같이 제조하였다. 또한, 하기 치료제의 제조예는 치료제 뿐만 아니라 건강식품의 제조에도 응용하여 사용될 수 있다.

<1-1> KH -204 에탄올 추출물을 함유하는 연질캅셀( soft gelatin capsules )

KH-204 에탄올 추출물 20%, 비타민 C 4.5%, 비타민 D₃ 0.001%, 황산망간 0.1%, 밀납 15%, 팜유 30%, 홍화씨유 30.399%

<1-2> KH -204 에탄올 추출물을 함유하는 정맥주사용 제제의 제조

KH-204 에탄올 추출물 2%, 만니톨 3%, 생리식염수 95%

<1-3> KH -204 에탄올 추출물을 함유하는 정제( tablet )

KH-204 에탄올 추출물35%, 비타민 C 15%, 비타민 D₃ 0.001%, 황산망간0.1%, 결정셀룰로오즈25.0%, 유당21.999%, 스테아린산마그네슘 2.9%

<기타 제조예 2> KH -204 에탄올 추출물을 유효성분으로 함유하는 기능성 식품의 제조

본 발명자들은 상기 실시예를 통해 KH-204 에탄올 추출물이 남성 불임 치료 활성이 뛰어남을 확인하여 이를 유효성분으로 함유하는 기능성 식품을 하기와 같이 제조하였다.

<2-1> 음료의 제조

꿀 522 ㎎, 치옥토산아미드5 ㎎, 니코틴산아미드10 ㎎, 염산리보플라빈나트륨3 ㎎, 염산피리독신2 ㎎, 이노시톨30 ㎎, 오르트산50 ㎎, KH-204 에탄올 추출물1.2 ㎎, 물200 ㎖, 상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

<2-2> 츄잉껌의 제조

껌베이스40 %, 설탕 56.36 %, KH-204 에탄올 추출물 0.64 %, 후르츠향1 %, 물2 %, 상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.

<2-3> 캔디의 제조

설탕 60 %, 물엿 39.26%, KH-204 에탄올 추출물 0.64 %, 오렌지향 0.1 % 상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캔디를 제조하였다.

<2-4> 비스켓의 제조

박력1급 88 ㎏, 중력1급 76.4 ㎏, 정백당 16.5 ㎏, 식염 2.5 ㎏, 포도당 2.7 ㎏, 팜쇼트닝 40.5 ㎏, 암모 5.3 ㎏, 중조 0.6 ㎏, 중아황산나트륨 0.55 ㎏, 쌀가루 5.0 ㎏, 비타민 B1 0.003 ㎏, 비타민 B2 0.003 ㎏, 밀크향 0.16 ㎏, 물 71.1 ㎏, 전지분유 4 ㎏, 대용분유 1 ㎏, 제일인산칼슘0.1 ㎏, 살포염1 ㎏, 분무유25 ㎏, KH-204 에탄올 추출물 0.5 ㎏, 상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 비스켓을 제조하였다.

<2-5> 아이스크림의 제조

유지방 10.0 %, 무지유고형분 10.4 %, 설탕 12.0 %, 물엿 3.0 %, 유화안정제(스팬, span) 0.5 %, 향료(스트로베리) 0.15 %, 물 63.31 %, KH-204 에탄올 추출물 0.64 %, 상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 아이스크림을 제조하였다.

<2-6> 쵸코렛의 제조

설탕 34.36 %, 코코아 버터 34 %, 코코아 매스 15 %, 코코아 파우다 15 %, 레시틴 0.5 %, 바닐라향 0.5 %, KH-204 에탄올추출물 0.64 %, 상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 초코렛을 제조하였다.

이상, 본 발명의 바람직한 실시예를 들어 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상의 범위내에서 당 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의하여 여러 가지 변형이 가능하다.

Claims (5)

1. 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물, 오미자 추출
   물 및 차전자 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 선택되는 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 성기능 개선 및 불임 치료용 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물 또는 유기용매 추출물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 추출물은 각각, 산수유, 구기자, 복분자, 토사자, 오미자 및 차전자에 대하여 상기 물질 중량대비 4 내지 8 배의 30% 에탄올에 넣고 60 내지 70℃에서 3 내지 5시간 동안 환류 추출한 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
5. 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하되, 물 또는 에탄올로 추출한, 산수유 추출물, 구기자 추출물, 복분자 추출물, 토사자 추출물 및 오미자 추출물로 이루어진 군으로부터 하나 선택되는 추출물을 유효성분으로 포함하는 남성 성기능 개선 및 불임 예방용 식품 조성물.

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