KR20140123475A - 항체 제형 및 방법 - Google Patents

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Abstract

AA 아밀로이드증 및 AL 아밀로이드증을 포함하는 아밀로이드증의 예방 또는 치료에 유용한 항체 제형 및 방법.

Description

항체 제형 및 방법{ANTIBODY FORMULATIONS AND METHODS}
관련 출원
2011년 10월 25일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/551,406호에 대한 우선권을 주장하고, 상기 출원은 본원에 전문이 인용에 의해 포함된다.
기술분야
본 발명은 면역학 및 의학의 기술 분야에 관한 것이다.
아밀로이드증은, 국소 부위에 또는 전신적으로 발생할 수 있는, 다수의 "아밀로이드 침착물" 또는 "아밀로이드 플라크"를 형성하는 단백질 피브릴의 세포외 침착을 종종 수반하는 아밀로이드 단백질의 병리학적 형태의 존재를 특징으로 하는 다수의 질환을 기술하는 일반적인 용어이다. 이들 침착물 또는 플라크는, 주로, 각종 조직 부위에서 광범위하게 직경 10 내지 100㎛의 불용성 침착물로 결집된 천연 발생의 가용성 단백질 또는 펩타이드로 이루어진다. 침착물은, 직경이 약 10 내지 15nm인, 일반적으로 피브릴의 횡방향 응집체(lateral aggregate)로 이루어진다. 아밀로이드 피브릴은, 콩고 레드 염료로 염색되었을 때 편광에서 특징적인 연녹황색 복굴절을 생성한다. 일반적으로, 이들 침착물의 피브릴 조성은, 각종 형태의 아밀로이드 질환에 대한 식별 특징이다.
플라크 침착물을 형성하는 펩타이드 또는 단백질은 흔히 보다 큰 전구체(precusor) 단백질로부터 생성된다. 보다 구체적으로는, 피브릴 침착물과 같은 아밀로이드 응집체의 발병은, "비정상" 전구체 단백질이, 역-평행 β 병풍 시트(anti-parallel β pleated sheet)로 응집하는 단편들로 단백질분해성 절단됨을 포함한다.
전신성 아밀로이드증은 진행성 기관 손상을 초래하는 미스폴딩된(misfolded) 단백질의 조직 침착에 의해 야기된 질환의 복합 그룹이다. 가장 일반적인 유형인 AL 아밀로이드증 또는 원발성 아밀로이드증은, 미스폴딩된 면역글로불린 경쇄를 생성하는 클로날 혈장 세포에 의해 야기되는 혈액 장애을 수반한다. 혈장 세포에 의한 미스폴딩된 경쇄의 과다생성은, AL 아밀로이드증을 지닌 개체의 조직 및 기관에서 비정상 AL 단백질(아밀로이드)의 침착물을 초래한다. AL 아밀로이드증의 임상학적 특징은, 심장, 신장 및 간의 기능장애, 위장관 침윤(gastrointestinal involvement), 신경병증 및 대설증을 포함할 수 있는, 증상 및 기관 기능장애의 무리를 포함한다. 아밀로이드원성(amyloidogenic) 면역글로불린 경쇄가 기관 기능장애를 초래하는 메커니즘은, 잘 특징분석되어 있지 않지만, 아밀로이드 침착물 및 원피브릴성 응집체 둘 다가, AL 아밀로이드증을 지닌 환자에서 관찰된 기관에 대한 세포독성 효과에 기여할 수 있음이 가정된다. AL 아밀로이드증은, AL 아밀로이드증이, 다발성 골수종을 지닌 환자들 중 소수의 서브세트(15% 이하)에서 동시에 발생할 수 있지만, 그 자체로 질환 실체이다.
AL 아밀로이드증은, 추정된 발병률이 1,000,000명 중 8명인 희귀 장애이다. 미국에서 매년 불과 1200 내지 3200명의 새로운 케이스의 AL 아밀로이드증이 보고되고 있다. AL 아밀로이드증 환자들 중 3분의 2는 남성이고, 환자들 중 5% 미만이 40세 이하이다. AL 아밀로이드증의 원인과 기원은 둘 다 제대로 이해되지 못하고 있다.
AL 아밀로이드증을 지닌 환자의 현재 치료는, 골수 장애, 즉, 경쇄의 생성에 관여하는 혈장 세포를 감소시키거나 제거함으로써 아밀로이드의 생성을 제한하거나 중단시키는 것을 목표로 한다. 가장 적극적인 치료 옵션(option)은, 환자가 이겨낼 수 있는 환자에 대해 줄기 세포 이식 및 고용량 화학치료요법을 포함한다. 다른 치료 용법으로는, 경쇄 생성을 감소시키기 위한 시도에서 혈액 암종을 치료하는데 흔히 사용되는 약물, 예를 들면, 멜팔란, 프레드니손, 덱사메타손 및 프로테오솜 저해제(예를 들면, 보르테조밉)의 병용이 포함된다. 아밀로이드원성 단백질의 잠재적 독성 형태를 직접적으로 표적화하는 AL 아밀로이드증에 대한 승인된 치료법은 현재 존재하지 않는다.
전신성 아밀로이드증의 다른 유형인 AA 아밀로이드증 또는 2차 아밀로이드증은, 만성 염증 질환(예를 들면, 류마티스성 관절염 및 강직성 척추염) 또는 만성 감염증(예를 들면, 결핵 또는 골수염)과 같은 다른 질병의 결과로서 "이차적으로" 발생한다. 2차 아밀로이드증에서, 침착성 아밀로이드 단백질은, 급성-페이즈(phase) 단백질 혈청 아밀로이드 A로부터 유도된 아밀로이드 A 단백질이다. 2차 아밀로이드증의 치료는, 기저 질병의 치료에 관한 것이다.
따라서, 병리학적 아밀로이드 피브릴을 직접적으로 표적화하는 AA 아밀로이드증 및 AL 아밀로이드증을 치료하기 위한 치료요법에 대한 요구가 존재한다. 본 발명은, AL 및 AA 아밀로이드 단백질의 병리학적 형태의 공통적인 면역원성 에피토프로 인하여 AL 및 AA 아밀로이드 둘 다에 대해 고친화성 결합을 나타내는, 2A4 및 7D8 항체 및 이의 키메라 버젼 및 사람화된 버젼의 약제학적 제형을 제공한다.
본 발명의 요약
본 발명은, 아밀로이드 질환의 예방 및 치료에 유용한 항체 제형을 제공한다. 본 발명의 한 양상에서, 약제학적 제형은, (a) 항원에 결합하기 위해 항체 2A4(ATCC 수탁 번호 PTA-9662) 또는 항체 7D8(ATCC 수탁 번호 PTA-9468)과 특이적으로 경쟁하고/하거나, AEDS(서열번호 18)를 포함하는 에피토프에 대해 지시되고, 여기서, 약 1mg/mL 내지 약 100mg/mL 범위 내의 농도로 존재하는, 항체 2A4 또는 항체 7D8의 키메라 버젼 또는 사람화된 버젼 또는 이들의 단편; (b) 약 20mM 내지 약 30mM 범위 내의 농도로 존재하는 히스티딘 완충제; (c) 약 210mM 내지 약 250mM 범위 내의 농도로 존재하는 트레할로스; 및 (d) 약 0.005중량% 내지 약 0.05중량% 범위 내의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 20을 포함하고, 상기 약제학적 제형은, 약 6 내지 약 7 범위 내의 pH를 특징으로 한다. 예를 들면, 본 발명의 대표적인 제형은, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및/또는 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 보다 구체적으로는, 이와 같은 제형은 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14 내지 서열번호 16 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 갖는 항체, 예를 들면, 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 갖는 항체를 포함할 수 있다.
본 발명의 추가의 대표적인 제형은, (a) 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 제시된 3개 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11에 제시된 3개 상보성 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는, 항체; 및 (b) 서열번호 12, 서열번호 7 및 서열번호 8에 제시된 3개 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11의 3개 상보성 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 갖는, 항체를 포함한다.
본 발명의 대표적인 제형에서, 항체는, 약 5mg/mL 내지 약 15mg/mL 범위 내의 농도(예를 들면, 약 10mg/mL)로 존재하거나 약 25 내지 75mg/mL 범위 내의 농도(예를 들면, 50mg/mL)로 존재한다.
본 발명의 다른 대표적인 제형에서, 히스티틴 완충제는 약 25mM의 농도로 존재한다. 히스티딘 완충제는 L-히스티딘 및 L-히스티딘 HCl 일수화물을 포함할 수 있다. 예를 들면, L-히스타민은 약 16mM 내지 약 22mM 범위 내의 농도로 사용될 수 있고, L-히스티딘 HCl 일수화물은 약 4mM 내지 약 8mM 범위 내의 농도로 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 대표적인 제형에서, 트레할로스는 약 230mM의 농도로 존재한다.
본원에 기술된 바와 같이 제조된 본 발명의 대표적인 제형은, (a) 약 300 mOsm/kg의 삼투질농도를 특징으로 하고/하거나; (b) 제형 중에 응집체로서 존재하는 항체의 약 10% 미만을 포함하고/하거나; (c) 증량제를 추가로 포함하고/하거나; (d) 무균 상태이고/이거나; (e) 동결 및 해동시 안정하다.
본 발명의 한 양상에서, 제형은, (a) 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14 내지 서열번호 16 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고, 약 10mg/mL의 농도로 존재하는, 항체; (b) 약 25mM의 농도로 존재하는 히스티딘 완충제; (c) 약 230mM의 농도로 존재하는 트레할로스; (d) 약 0.2g/L의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 20를 포함하고; (e) 약 6.5의 pH를 포함한다.
본 발명의 다른 양상에서, 약제학적 제형은, (a) 항체 2A4(ATCC 수탁 번호 PTA-9662), 항체 7D8(ATCC 수탁 번호 PTA-9468), 또는 항원에 결합하기 위해 2A4 또는 7D8과 특이적으로 경쟁하는 항체 2A4 또는 항체 7D8의 키메라 버젼 또는 사람화된 버젼, 또는 이들의 단편이고, 약 50mg/mL 내지 약 100mg/mL 범위 내의 농도로 존재하는, 항체; (b) 완충제; (c) 비환원당; 및 (d) 비이온성 계면활성제를 포함한다. 특정 예에서, 개시된 제형의 항체는, 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다.
본 발명의 다른 양상에서, 항체 제형은 동결건조된다. 예를 들면, 대표적인 동결건조 제형은, (a) 항체 2A4(ATCC 수탁번호 PTA-9662) 또는 항체 7D8(ATCC 수탁번호 PTA-9468)의 사람화된 버젼 또는 이의 항원 결합 단편; (b) 히스티딘; (c) 트레할로스; 및 (d) 폴리소르베이트 20을 포함할 수 있다. 동결건조 제형은 재구성될 때에 약 6 내지 약 7의 pH를 가질 수 있고, 예를 들면, 재구성될 때에 pH 6.5일 수 있다. 동결건조 제형은 전형적으로 약 100mg 내지 약 1000mg의 항체를 포함한다. 동결건조 제형은 전형적으로 폴리소르베이트 20을 약 0.005중량% 내지 약 0.05중량% 범위 내의 농도로 포함한다. 재구성 후, 동결건조 제형은 수용액을 수득하고, 예를 들면, (a) 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14 내지 서열번호 16 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고, 약 10mg/mL의 농도로 존재하는, 항체; (b) 약 25mM의 농도로 존재하는 히스티딘 완충제; (c) 약 230mM의 농도로 존재하는 트레할로스; (d) 약 0.2g/L의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 20; 및 (e) 약 6.5의 pH를 포함하는, 수용액을 수득한다. 대표적인 동결건조 제형은 멸균수로 재구성 후 약 100mg의 항체를 포함한다.
또한, 개시된 제형을 제조하는데 사용된 항체를 암호화하는 핵산도 제공된다. 예를 들면, 이러한 핵산은 서열번호 13의 항체 경쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 서열번호 14 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 항체 중쇄를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산을 포함한다. 예를 들면, 서열번호 19 및 서열번호 20(서열번호 19와 동일하고, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다)에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 13의 사람화된 2A4 경쇄를 암호화한다. 다른 예로서, 서열번호 22 및 서열번호 23(서열번호 22와 동일하고, 신호 펩타이드를 암호화하는 서열을 추가로 포함한다)에 제시된 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 15의 사람화된 2A4 중쇄를 암호화한다.
항체의 생산을 위해, 개시된 핵산은 벡터 내에 단독으로 또는 조합(예를 들면, 사람화된 2A4 경쇄를 암호화하는 핵산과 사람화된 2A4 중쇄를 암호화하는 핵산의 조합)으로 포함될 수 있다. 예를 들면, 벡터는 서열번호 13 내지 서열번호 16, 서열번호 21 및 서열번호 24 중 어느 하나를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 22, 및 서열번호 23 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 대표적인 벡터로는, (a) 서열번호 13 또는 서열번호 21의 사람화된 2A4 경쇄 및 서열번호 15 또는 서열번호 24의 사람화된 2A 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터; (b) 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 및 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 벡터; 및 (c) 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 및 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 벡터가 포함된다.
또한, 본원에 개시된 핵산들 중 하나 이상이 숙주 세포의 게놈 내에 안정하게 혼입된 숙주 세포(예를 들면, CHO 세포)도 제공된다. 예를 들면, 숙주 세포는 당해 숙주 세포의 게놈 내에 서열번호 13 내지 서열번호 16, 서열번호 21 및 서열번호 24 중 어느 하나를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 안정하게 통합되거나, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 22, 및 서열번호 23 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 안정하게 통합되거나, 또는 이들의 조합이 안정하게 통합될 수 있다. 본 발명의 대표적인 숙주 세포로는, (a) 서열번호 13 또는 서열번호 21에 제시된 사람화된 2A4 경쇄 및 서열번호 15 또는 서열번호 24의 사람화된 2A 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포; (b) 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 및 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 숙주 세포; 및 (c) 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 및 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 숙주 세포가 포함된다.
또한, 본 발명은 약제학적 제형을 제조하는 방법도 제공한다. 본 발명의 한 양상에서, 이러한 방법은, (a) 뮤린, 키메라 또는 사람화된 2A4 항체의 경쇄 및 중쇄, 또는 뮤린, 키메라 또는 사람화된 7D8 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산이 포유동물 세포의 게놈 내에 안정하게 혼입된 포유동물 세포를 배양하여, 상기 세포가 항체를 세포 배양 배지에 분비하도록 하고, 상기 항체를 상기 세포 배양 배지로부터 정제하는 단계; 및 (b) (i) 항원에 결합하기 위해 항체 2A4(ATCC 수탁 번호 PTA-9662) 또는 항체 7D8(ATCC 수탁 번호 PTA-9468)과 특이적으로 경쟁하고, 약 1mg/mL 내지 약 100mg/mL 범위 내의 농도로 존재하는, 항체 2A4 또는 항체 7D8의 키메라 버젼 또는 사람화된 버젼 또는 이들의 단편; (ii) 약 20mM 내지 약 30mM 범위 내의 농도로 존재하는 히스티딘 완충제; (iii) 약 210mM 내지 약 250mM 범위 내의 농도로 존재하는 트레할로스; 및 (iv) 약 0.005중량% 내지 약 0.05중량% 범위 내의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 20을 포함하고, 약 6 내지 약 7의 pH를 특징으로 하는, 약제학적 제형을 제조하는 단계를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 한 양상에서, 포유동물 세포의 게놈에 사람화된 2A4 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산이 안정하게 혼입된 포유동물 세포가 배양된다. 이러한 목적에 유용한 포유동물 세포로는, (a) 서열번호 13 또는 서열번호 21에 제시된 사람화된 2A4 경쇄 및 서열번호 15 또는 서열번호 24에 제시된 사람화된 2A 중쇄를 암호화하는 핵산 서열이 숙주 세포의 게놈에 안정하게 혼입된 숙주 세포; (b) 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 및 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산이 숙주 세포의 게놈에 안정하게 혼입된 숙주 세포; 및 (c) 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 및 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산이 숙주 세포의 게놈에 안정하게 혼입된 숙주 세포가 포함된다. 본 발명의 일부 양상에서, 개시된 약제학적 제형의 제조 방법은 약제학적 제형 중의 항체의 하나 이상의 특성, 예를 들면, 물리적 안정성, 화학적 안정성, 및/또는 생물학적 활성을 평가하는 추가의 단계를 포함한다.
또한, 추가로, 아밀로이드 단백질 피브릴의 존재를 특징으로 하는 아밀로이드증을 갖거나 가질 위험이 있는 사람 환자에게 본 발명에 약제학적 제형의 유효 용량을 투여하는 단계를 포함하는, 상기 사람 환자의 치료학적 또는 예방학적 치료 방법이 제공된다. 치료될 수 있는 환자는, 아밀로이드 A 단백질 피브릴의 존재를 특징으로 하는 아밀로이드 A 아밀로이드증, 또는 아밀로이드 경쇄형 단백질 피브릴의 존재를 특징으로 하는 AL 아밀로이드증과 같은 아밀로이드 질환을 갖는다. AL 아밀로이드증을 갖는 환자는, 또한, B 림프구 계통과 연관된 이혼화증(dyscrasia), 예를 들면, 다발성 골수종과 같은 악성 종양을 앓고 있을 수 있다.
개시된 치료학적 치료 방법 및 예방학적 치료 방법은 상승 효과를 유발하기 위한 병용 치료요법(즉, 개시된 항체 제형과 하나 이상의 추가의 약물 물질의 투여)을 포함한다. 2종 이상의 약물 물질은 동시에 투여되거나 임의의 순서로 순차적으로 투여되고, 즉, 본 발명의 제형은, 제2 약물 물질이 투여되기 전에, 제2 약물 물질과 동시에, 또는 제2 약물 물질이 투여된 후에 투여된다. 예를 들면, 본 발명의 제형은 메팔란과 동시에 또는 순차적으로 병용 투여될 수 있다. 다른 예로서, 본 발명의 제형은 보르테조밉, 멜팔란, 레날리도마이드 및 카르필조밉 중 하나 이상과 동시에 또는 순차적으로 병용 투여될 수 있다.
개시된 치료학적 치료 방법 및 예방학적 치료 방법에 따르면, 본 발명의 제형은, 예를 들면, 약 1일 내지 약 1년 범위 내의 빈도(예를 들면, 약 2주 내지 약 3개월 범위 내의 빈도 또는 1개월에 1회)로 다중 용량으로 투여될 수 있다. 한 양상에서, 본 발명의 항체 제형은 약물 물질 약 10mg 내지 약 5000mg 범위 내의 용량으로 정맥내 투여된다. 예를 들면, 제형은 약 2주 내지 약 2개월 범위 내의 빈도로 사람화된 2A4 약물 물질 약 30mg 내지 약 2500mg 범위 내의 용량으로 투여될 수 있다. 개시된 방법에 사용되는 대표적인 용량으로는 사람화된 2A4 약물 물질 30mg, 100mg, 300mg, 1000mg, 2000mg 및 2500mg이 포함된다.
본 발명의 한 양상에서, 아밀로이드 피브릴, 침착물 또는 프레피브릴(prefibril) 응집체의 존재를 특징으로 하는 경쇄(AL) 아밀로이드증을 갖거나 가질 위험이 있는 사람 환자를 치료학적으로 또는 예방학적으로 치료하는 방법은, 상기 사람 환자에게, (a) 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14 내지 서열번호 16 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고, 약 10mg/mL의 농도로 존재하는, 항체; (b) 약 25mM의 농도로 존재하는 히스티딘 완충제; (c) 약 230mM의 농도로 존재하는 트레할로스; (d) 약 0.2g/L의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 20; 및 (e) 약 6.5의 pH를 포함하는 약제학적 제형의 유효 용량을 투여함을 포함한다. 이러한 방법에서, 용량은 전형적으로 약 1주 내지 대략 분기마다(quarterly)의 빈도(예를 들면, 28일마다 1회)로 정맥내 또는 피하 투여되는 항체 약 0.5mg/kg 내지 약 30mg/kg(예, 약 0.5mg/kg 내지 약 8mg/kg 또는 약 8mg/kg 내지 약 30mg/kg)이다.
본 발명은, 추가로, (a) 약 100mg 항체를 분말 형태로 포함하는 바이알; (b) 상기 항체의 재구성에 관한 지침서; 및 (c) 주입을 위해 재구성된 상기 항체의 제조에 관한 지침서를 포함하고, (i) 상기 항체는, 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14 내지 서열번호 16 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고; (ii) 상기 재구성 지침서는, 10mL의 실용량(extractable volume)으로의 주입을 위한 물에 의한 재구성을 요구하는, 약제품을 제공한다.
도 1a 및 도 1b는, 각종 사람화된 2A4 항체 경쇄 및 중쇄 서열을 나타낸다. 밑줄 그어진 볼드체는 N-연결된 당화를 위한 컨센서스(consensus) 서열이다.
도 2는, 뮤린 2A4 및 7D8 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH) 서열을 나타낸다. 두 줄 그어진 것은 리더 서열이고; 밑줄 그어진 것은 상보성 결정 영역(CDR) 서열이다.
도 3은, 사람화된 2A4 버젼 3 경쇄 가변 영역(VL) 및 중쇄 가변 영역(VH) 서열을 나타낸다. 소문자는 복귀 돌연변이이다.
도 4a 및 도 4b는, 사람화된 2A4 버젼 3 중쇄(도 4a) 및 경쇄(도 4b) 서열을 암호화하는 핵산 서열을 나타낸다. 한 줄 밑줄은 리더 서열이고, 밑줄이 없는 부분은 가변 영역이며, 두 줄 밑줄은 불변 영역이다.
본 발명은 아밀로이드 질환의 예방 및 치료에 유용한 항체 제형을 제공한다. 본 발명의 한 양상에서, 제형은, (a) 항원에 결합하기 위해 항체 2A4(ATCC 수탁 번호 PTA-9662) 또는 항체 7D8(ATCC 수탁 번호 PTA-9468)과 특이적으로 경쟁하고/하거나, AEDS(서열번호 18)를 포함하는 에피토프에 대해 지시되고, 여기서, 약 1mg/mL 내지 약 100mg/mL 범위 내의 농도로 존재하는, 항체 2A4 또는 항체 7D8의 키메라 버젼 또는 사람화된 버젼 또는 이들의 단편; (b) 약 20mM 내지 약 30mM 범위 내의 농도로 존재하는 히스티딘 완충제; (c) 약 20mM 내지 약 30mM 범위 내의 농도로 존재하는 트레할로스; 및 (d) 약 0.005중량% 내지 약 0.05중량% 범위 내의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 20을 포함하고, 약 6 내지 약 7 범위 내의 pH를 특징으로 한다.
본원에 기술된 본 발명의 한 양상에서, 사람화된 2A4는 뮤린 2A4의 IgG1, 카파 이소형(isotype) 버젼이다. 사람화된 2A4의 특이성을 특성확인하는 과정에서, 항체는 경쇄 아밀로이드 피브릴 내의 경쇄와 고친화성 및 입체구조-의존적 방식으로 반응하지만 순환시 유리(free) 경쇄와는 반응하지 않는 것으로 밝혀졌다.
본 발명은, AA 아밀로이드증 및 AL 아밀로이드증을 지닌 환자의 미스폴딩된 아밀로이드 단백질을 표적으로 하는 사람화된 2A4 및/또는 사람화된 7D8 항체의 정맥내 주입 방법을 제공한다. 일부 사람화된 2A4 항체는 AL 및 SAA의 병리학적 아밀로이드 형태에 특이적으로 결합하지만, 이들 병리학적 형태의 모 분자(SAA, 천연 면역글로불린 경쇄[LC], 온전한 면역글로불린[Ig])와는 결합하지 않는다.
I. 약제학적 제형 및 약제품
I.A. 특징
항원(즉, 사람 AA 또는 AL 단백질)에 결합하기 위해 항체 2A4(ATCC 수탁번호 PTA-9662) 또는 항체 7D8(ATCC 수탁번호 PTA-9468)과 특이적으로 경쟁하고/하거나, AEDS(서열번호 18)를 포함하는 에피토프에 대해 지시되는, 항체 2A4 또는 항체 7D8의 키메라 또는 사람화된 버젼 또는 이들의 단편을 포함하는 약제학적 제형이 본원에서 제공된다. 또한, 뮤린 항체 2A4 또는 뮤린 항체 7D8 또는 이들의 단편을 포함하는 약제학적 제형이 제공된다. 항체는 약 1mg/mL 내지 약 100mg/mL 범위 내의 농도로 존재한다. 약제학적 제형은 약 6 내지 약 7 범위 내의 pH를 특징으로 하고, 히스티딘 완충제를 약 20mM 내지 약 30mM 범위 내의 농도로, 트레할로스를 약 210mM 내지 약 250mM 범위 내의 농도로, 폴리소르베이트 20을 약 0.005 중량% 내지 약 0.05 중량% 범위 내의 농도로 포함한다.
용어 "사람화된 면역글로불린" 또는 "사람화된 항체"는, 하나 이상의 사람화된 면역글로불린 또는 항체 쇄(즉, 하나 이상의 사람화된 경쇄 또는 중쇄)를 포함하는 면역글로불린 또는 항체를 말한다. 용어 "사람화된 면역글로불린 쇄" 또는 "사람화된 항체 쇄"(즉, "사람화된 면역글로불린 경쇄" 또는 "사람화된 면역글로불린 중쇄")는, 실질적인 사람 면역글로불린 또는 항체의 가변 프레임워크 영역 및 실질적인 비사람 면역글로불린 또는 항체의 상보성 결정 영역(CDR)(예, 1개 이상의 CDR, 바람직하게는 2개의 CDR, 더 바람직하게는 3개의 CDR)을 포함하는 가변 영역을 갖고 추가로 불변 영역(예, 경쇄의 경우엔 1개 이상의 불변 영역 또는 이의 일부, 바람직하게는 중쇄의 경우엔 3개의 불변 영역)을 포함하는 면역글로불린 또는 항체 쇄(즉, 각각 경쇄 또는 중쇄)를 가리킨다. 용어 "사람화된 가변 영역"(예, "사람화된 경쇄 가변 영역" 또는 "사람화된 중쇄 가변 영역")은 실질적인 사람 면역글로불린 또는 항체의 가변 프레임워크 영역 및 실질적인 비사람 면역글로불린 또는 항체의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 가변 영역을 말한다.
용어 "실질적인 사람 면역글로불린 또는 항체" 또는 "실질적인 사람"은 비교 목적으로 사람 면역글로불린 또는 항체 아미노산 서열과 배열되었을 때, 이 영역이 사람 프레임워크 또는 불변 영역 서열과 적어도 80 내지 90%, 바람직하게는 90 내지 95%, 더 바람직하게는 95 내지 99%의 동일성(즉, 국부적 서열 동일성)을 공유하여, 예를 들면, 보존 치환, 컨센서스 서열 치환, 배선 치환, 복귀 돌연변이 등이 가능함을 의미한다. 보존 치환, 컨센서스 서열 치환, 배선 치환, 복귀 돌연변이 등의 도입은 흔히 사람화된 항체 또는 쇄의 "최적화"라고도 한다. 용어 "실질적인 비사람 면역글로불린 또는 항체" 또는 "실질적인 비사람"은 비사람 유기체(예, 비사람 포유동물)의 것과 적어도 80 내지 95%, 바람직하게는 90 내지 95%, 더 바람직하게는 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 면역글로불린 또는 항체 서열을 가짐을 의미한다.
따라서, 사람화된 면역글로불린 또는 항체의 모든 영역 또는 잔기, 또는 가능하게는 CDR을 제외한 사람화된 면역글로불린 쇄 또는 항체 쇄의 모든 영역 또는 잔기는 하나 이상의 천연 사람 면역글로불린 서열의 상응하는 영역 또는 잔기와 실질적으로 동일하다. 용어 "상응하는 영역" 또는 "상응하는 잔기"는 제1 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열과 제2 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열을 비교 목적상 최적으로 배열했을 때, 제1 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 상의 영역 또는 잔기와 동일한(즉, 균등한) 위치를 차지하고 있는 제2 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열 상의 영역 또는 잔기를 가리킨다.
일부 제형에서, 항체는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 제형에서, 항체는 서열번호 3 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 제형에서, 항체는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 3 또는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 제형에서, 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 제형에서, 항체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 제형에서, 항체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 제형에서, 항체는 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 3개 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11의 3개 상보성 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다. 다른 제형에서, 항체는 서열번호 12, 서열번호 7 및 서열번호 8의 3개 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11의 3개 상보성 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함한다.
본 발명의 다른 제형에서, 항체는 미국특허 제7,928,203호 및 PCT 국제공개번호 WO 2009/086539에 기술된 뮤린, 키메라 또는 사람화된 2A4 항체 또는 뮤린, 키메라 또는 사람화된 7D8 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 상기 특허 문헌의 전체 내용은 본원에 참고로 삽입되며, 이들 특허 및 공보에 기술된 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열은 본원에 참고로 특별히 삽입된다.
일부 제형에서, 항체는 서열번호 13 또는 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14 내지 서열번호 16 및 서열번호 24 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함한다. 항체는 상기된 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열의 리더 서열을 포함할 수도 있고 포함하지 않을 수도 있다.
다른 제형에서, 항체는 2A4 또는 7D8 항체의 키메라 및 사람화된 버젼를 포함한 2A4 또는 7D8 항체의 단편이며, 이의 예로는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, Fv 단편 또는 ScFv 단편을 들 수 있다.
본 발명의 일부 양상에서, 항체는 아밀로이드 단백질 응집체와 특이적으로 결합하지만 단량체 아밀로이드 단백질과는 특이적으로 결합하지 않는다(예, 아밀로이드 단백질의 단량체 형태에 대한 특이적 결합 친화성이 10배 이상, 보통 100배 이상 더 낮다).
일부 제형에서, 항체는 약 5mg/mL 내지 약 100mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 제형에서, 항체는 약 5mg/mL 내지 약 15mg/mL의 농도로 존재한다. 일부 제형에서, 항체는 약 25mg/mL 내지 약 75mg/mL의 농도로 존재한다. 예를 들면, 항체는 약 10mg/mL의 농도로 존재하거나 약 50mg/mL의 농도로 존재할 수 있다. 항체는 약 50mg/바이알 내지 약 500mg/바이알 또는 그 이상의 무균 액상 용량형에 존재할 수 있다. 예를 들면, 항체는 약 100mg/바이알의 무균 액상 용량형에 존재할 수 있다.
기술된 제형에 사용된 항체는 세포독성제, 방사능치료제, 면역조절제, 이차 항체(예, 이종결합체 항체의 형성) 또는 키메라 또는 사람화된 2A4 또는 키메라 또는 사람화된 7D8 항체의 활성을 촉진 또는 증강시키는 임의의 다른 생물학적 활성물질과 같은 치료 잔기와 결합될 수 있다. 대표적인 치료 잔기는 아밀로이드 질환 또는 아밀로이드 질환 증상의 치료, 관리 또는 완화에 유용한 것으로 알려진 물질을 포함한다.
또한, 기술된 제형에 사용된 항체는 예를 들면 아밀로이드 질환의 진단, 아밀로이드 질환의 진행의 모니터링 및/또는 치료 효능의 평가에 유용한 것과 같은 검출용 표지와 결합될 수 있다. 기술된 바와 같이 제형된 항체는 특히 AA 아밀로이드증 또는 AL 아밀로이드증을 앓고 있거나 앓을 가능성이 있는 대상자 또는 이러한 대상자로부터 채취된 적절한 생물학적 샘플에서 그러한 결정을 수행하는데 특히 유용하다. 사람화된 2A4 항체 또는 사람화된 7D8 항체와 결합 또는 연결될 수 있는 대표적인 검출용 표지는 다양한 효소(예, 서양 고추냉이 퍼옥시다제, 알카리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제); 보결분자단(예, 스트렙타비딘바이오틴 및 아비딘/바이오틴); 형광물질(움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 파이코에리쓰린); 발광물질(예, 루미놀); 바이오발광물질(예, 루시페라제, 루시페린 및 애쿠오린); 방사성물질(예, 요오드(131I, 125I, 123I, 121I), 탄소(14C), 황(5S), 트리튬(3H), 인듐(115In, 113In, 112In, 111In,), 테크네튬(99Tc), 탈륨(201Ti), 갈륨(68Ga, 67Ga), 팔라듐(103Pd), 몰리브데늄(99Mo), 제논(133Xe), 불소(18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn 및 117Tin, 이에 국한되지 않음); 양전자 방출 단층촬영술을 이용하는 양전자 방출 금속, 비방사성 상자성 금속 이온 및 방사성표지되거나 특정 방사성동위원소에 결합된 분자를 포함한다.
치료 잔기 및/또는 검출용 물질은 본 분야에 공지된 기술에 의해 뮤린, 키메라 또는 사람화된 2A4 항체 또는 뮤린, 키메라 또는 사람화된 7D8 항체에 직접 결합 또는 연결되거나 중간체(예, 링커)를 통해 간접적으로 결합 또는 연결될 수 있다(참조예: Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies 84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., Immunol. Rev., 1982, 62:119-58).
기술된 제형에 사용되는 항체는 또한 뮤린, 키메라 또는 사람화된 2A4 항체 또는 뮤린, 키메라 또는 사람화된 7D8 항체의 변형 형태로서 상응하는 비변형 항체에 비하여 생체내 반감기가 증가된 것을 포함한다. 이와 같은 변형 형태는 예를 들면 당화, 아세틸화, 페질화(pegylation), 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질분해 절단, 세포 리간드 또는 다른 단백질과의 결합 등에 의해 제조할 수 있다. 한 가지 예로서, 항체 반감기 연장의 대표적인 방법은 PCT 공개번호 WO 02/060919에 기술되어 있다.
본 발명은 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HPSEC)에 의해 평가된 결과 적어도 약 30일간 38℃ 내지 42℃에서 안정성을 갖는 항체 제형, 적어도 약 1년간 20℃ 내지 24℃에서 안정성을 갖는 항체 제형 및 적어도 약 3년간 2℃ 내지 4℃에서 안정성을 갖는 항체 제형을 포함한다. 보다 자세하게는, 기술된 제형은 검출되지 않거나 낮은 수준의 항체 응집 및/또는 절편화를 나타내거나 최초 수준에 비하여 증가가 검출되지 않거나 낮은 수준인 항체 단편화 및/또는 응집(예, 약 10% 미만의 응집)을 나타낸다. 단편화의 낮은 수준 내지 미검출 수준을 갖는 제형은 예를 들면 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HPSEC)에 의해 결정된 단일 피크에서 또는 환원 모세관 겔 전기영동(rCGE)에 의한 2개 피크(각각 항체 중쇄 또는 항체 경쇄에 상응함)에서 비분해 항체를 총 단백질의 약 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 이상 함유하고, 총 단백질의 5% 이상, 4% 이상, 3% 이상, 2% 이상, 1% 이상 또는 0.5% 이상을 갖는 어떠한 다른 단일 피크도 함유하지 않는다. 낮은 수준 내지 미검출 수준의 응집을 갖는 제형은 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HPSEC)에 의해 측정된 결과로서 단백질 중량 기준 약 15% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하, 약 1% 이하 또는 약 0.5% 이하의 응집을 함유한다. 예를 들면, 일부 제형에서, 항-아밀로이드 항체의 약 10% 이하가 응집체로서 존재한다. 본 발명의 안정한 제형은 키메라 또는 사람화된 2A4 또는 키메라 또는 사람화된 7D8의 생물학적 활성, 예를 들면 ELISA 및/또는 추가의 기능 검정에 의해 측정가능한 결합 친화성의 손실이 전혀 또는 거의 없음을 보여주며, 예를 들면 해당 활성의 최초 측정값의 최소 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99%이다.
히스티딘 완충제는 일부 제형에서 약 25mM의 농도로 존재할 수 있다. 일부 제형에서, 히스티딘 완충제는 L-히스티딘 및 L-히스티딘 HCl 일수화물을 포함한다. 예를 들면, 일부 제형에서, L-히스티딘은 약 16mM 내지 약 22mM의 농도로 존재하고 L-히스티딘 HCl 일수화물은 약 4mM 내지 약 8mM의 농도로 존재한다.
일부 제형에서, 트레할로스는 약 210mM 내지 약 250mM의 농도로 존재하고, 예를 들면 약 230mM이다. 일부 제형에서, 자당, 만니톨 또는 솔비톨과 같은 다른 비환원당이 사용된다.
일부 제형에서, 폴리소르베이트 20은 약 0.005 중량% 내지 약 0.05 중량%의 농도로 존재하며, 예를 들면 0.005 중량%, 0.01 중량%, 0.015 중량%, 0.02 중량%, 0.025 중량%, 0.03 중량%, 0.035 중량%, 0.04 중량%, 0.045 중량% 또는 0.05 중량%이다. 그렇지 않으면, 일부 제형에서는 폴리소르베이트 20이 약 0.05g/L, 0.1g/L, 0.15g/L, 0.2g/L, 0.25g/L, 0.3g/L, 0.35g/L, 0.4g/L, 0.45g/L 또는 0.5g/L의 농도로 존재한다. 일부 제형은 폴리소르베이트 20을 0.2g/L의 농도로 포함한다.
일부 제형은 pH가 약 6 내지 7임을 특징으로 하며, 예를 들면 pH가 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9 또는 7.0이다. 일부 제형은 약 6.5의 pH를 갖는다.
일부 제형은 약 300 mOsm/kg의 삼투질농도를 특징으로 한다.
또한, 증량제가 일부 제형에 포함될 수 있다.
전형적으로, 제형은 무균 상태이고, 이러한 상태는 예를 들면 0.2㎛ 또는 0.22㎛ 필터를 이용한 무균 여과에 의해 달성된다. 본 발명의 제형은 또한 동결 및 해동시 일반적으로 안정하다.
임의로, 본 발명의 제형은 추가의 다른 부형제를 포함할 수 있으며, 이의 예로는 당류, 폴리올 및 아미노산(예, 아르기닌, 라이신 및 메티오닌)을 들 수 있다. 다른 관점에서, 본 발명은 또한 계면활성제, 무기염, 추가의 당 및/또는 다른 부형제가 실질적으로 없는, 즉 약 0.0005% 미만, 0.0003% 미만 또는 0.0001% 미만으로 존재하는 제형을 제공한다.
한 가지 예로서 제형은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14, 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고 약 10mg/mL의 농도로 존재하는 항체, 약 25mM의 농도로 존재하는 히스티딘 완충제, 약 230mM의 농도로 존재하는 트레할로스 및 약 0.2g/L의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 20을 포함하고 약 6.5의 pH를 갖는다.
I.B. 제형의 제조
본 발명은 또한 제형의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 한 양상에서, 이러한 방법은, (a) 뮤린, 키메라 또는 사람화된 2A4 항체의 경쇄 및 중쇄, 또는 뮤린, 키메라 또는 사람화된 7D8 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산이 포유동물 세포의 게놈 내에 안정하게 혼입된 포유동물 세포를 배양하여, 상기 세포가 항체를 세포 배양 배지에 분비하도록 하고, 상기 항체를 상기 세포 배양 배지로부터 정제하는 단계; 및 (b) (i) 약 1mg/mL 내지 약 100mg/mL의 농도로 존재하는 정제된 항체; (ii) 약 20mM 내지 약 30mM의 농도로 존재하는 히스티딘 완충제; (iii) 약 210mM 내지 약 250mM의 농도로 존재하는 트레할로스; 및 (iv) 약 0.005 중량% 내지 약 0.05 중량%의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 20을 포함하고 약 6 내지 약 7의 pH를 특징으로 하는 제형을 제조하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일부 양상에서, 기술된 제형의 제조 방법은, 물리적 안정성, 화학적 안정성 및 생물학적 안정성으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 제형 중의 항체의 하나 이상의 특성을 평가하는 추가의 단계를 포함한다.
예를 들면, 본 발명의 한 양상에서, 사람화된 2A4 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 핵산이 포유동물 세포의 게놈 내에 안정하게 혼입된 포유동물 세포가 항체의 생산을 위해 배양된다. 이 목적에 유용한 포유동물 세포는 (a) 서열번호 13 또는 서열번호 21의 사람화된 2A4 경쇄 및 서열번호 15 또는 서열번호 24의 사람화된 2A 중쇄를 암호화하는 핵산 서열이 자신의 게놈내에 안정하게 혼입된 숙주 세포; (b) 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 및 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산이 자신의 게놈내에 안정하게 혼입된 숙주 세포; 및 (c) 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 및 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산이 자신의 게놈내에 안정하게 혼입된 숙주 세포를 포함한다.
항체의 생성을 위해 기술된 핵산은 벡터 내에 포함된다. 일부 예에서, 벡터는 뮤린 2A4 또는 7D8 항체 또는 이의 키메라 또는 사람화된 버젼을 암호화하는 핵산과 숙주 세포내에서 DNA의 발현을 유도할 수 있는 적합한 조절 서열을 함유하고 상기 핵산은 상기 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 상기 조절 서열은 전사를 유도하는 프로모터(예, 본 분야에 알려져 있는 항시성 프로모터 또는 유도성 프로모터), 전사를 조절하는 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열, 인핸서, 폴리아데닐화 신호 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자(예, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 레트로바이러스, 헤르페스 바이러스, 백시니아 바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스 및 사이토메갈로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터) 또는 단순히 게놈 삽입체일 수 있다. 일단 적합한 숙주 내로 형질전환되면 항체 핵산은 숙주의 게놈 내로 통합할 수 있거나 숙주 게놈과 상관없이 독립적으로 복제하고 기능을 발휘할 수 있다.
기술된 핵산은 단독으로 또는 조합적으로(예, 항체 경쇄를 암호화하는 핵산과 항체 중쇄를 암호화하는 핵산의 조합) 벡터내에 포함된다. 예를 들면, 벡터는 서열번호 13-16, 21 및 24중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 서열번호 19-20 및 22-23중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산; 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 본 발명의 대표적인 벡터는 (a) 서열번호 13의 사람화된 2A4 경쇄 및 서열번호 15의 사람화된 2A 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 벡터; (b) 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 및 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 벡터; 및 (c) 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 및 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 벡터를 포함한다.
본 발명의 항체 제형을 제조하는데 유용한 숙주 세포는 사람 기원의 세포를 포함한 포유동물 세포를 포함하며, 예로는 원숭이 신장 세포, 사람 배아 신장 세포, 베이비 햄스터 신장(BHK) 세포, 챠이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 마우스 세르톨리 세포, 사람 경부암(헬라) 세포, 개 신장 세포, 사람 폐 세포, 사람 간 세포, 마우스 유선암 세포 및 NS0 세포를 들 수 있다. 예를 들면, 숙주 세포는 자신의 게놈내에 서열번호 13 내지 서열번호 16, 서열번호 21 및 서열번호 24 중 어느 하나를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 22, 및 서열번호 23 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 또는 이의 조합이 안정하게 통합되어 있다. 본 발명의 대표적인 숙주 세포는 (a) 서열번호 13 또는 서열번호 21의 사람화된 2A4 경쇄 및 서열번호 15 또는 서열번호 24의 사람화된 2A 중쇄를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 숙주 세포; (b) 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 및 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 숙주 세포; 및 (c) 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산 및 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 포함한다.
본 발명의 다른 관점에서, 키메라 또는 사람화된 2A4 항체 또는 키메라 또는 사람화된 7D8 항체는 화학적 합성에 의해 제조된 다음 기술된 제형에 사용된다.
기술된 제형의 제조에 사용되는 항체는 전형적으로 분리되거나 정제된 것으로서, 다시 말해서 항체를 생성하는 세포로부터 유래된 세포 물질 또는 다른 오염 단백질이 항체로부터 실질적으로 유리되어 있거나, 항체가 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구물질 또는 다른 화학물질이 항체로부터 실질적으로 유리되어 있다. 예를 들면, 세포 물질로부터 실질적으로 유리되어 있는 항체는 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%(건조 중량 기준) 또는 그 이하의 오염 단백질을 갖는 항체 제형을 포함한다. 항체가 재조합적으로 생성된 경우, 항체는 배양 배지로부터 실질적으로 유리되어 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1% 또는 그 이하의 단백질 제제 용량을 갖는다. 항체가 화학적 합성에 의해 생성된 경우, 바람직하게는 항체는 단백질 합성에 관련된 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 실질적으로 유리되거나 분리된다. 따라서, 이러한 항체 제형는 약 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 8%, 5%, 2%, 1%, 0.5%, 0.1%(건조 중량 기준) 또는 그 이하의 화학적 전구체 또는 항체 약물외의 다른 화합물을 갖는다. 재조합적으로 발현된 항체의 정제는 본 분야에 알려진 많은 방법의 임의의 것을 이용할 수 있으며, 예로는 친화성 크로마토그래피, 산 처리, 심층 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 나노여과, 한외여과, 투석 및 정용여과(diafiltration)를 들 수 있다.
정제된 항체 약물은 본원에 기술된 제형중 임의 것을 포함한 용액으로 조정되고, 목적하는 농도로 희석되며, 사용시까지 저장될 수 있다. 임의로, 제형은 사용시까지 농축 형태로 저장될 수 있다. 액상 제형은 이의 안정성 프로필에 따라 동결 형태로 저장하거나, 냉장하에 또는 실온에서 저장할 수 있으며, 이는 경험적으로 결정할 수 있다. 일부 경우에 추가의 여과 단계가 적용된다. 본원에 기술된 제형중 일부는 동결건조되어 분말 형태로 저장될 수 있다. 동결건조제는 이의 안정성 프로필에 따라 동결 형태로 저장하거나 냉장하에 또는 실온에서 저장할 수 있으며, 이는 경험적으로 결정할 수 있다. 예를 들면, 동결건조제는 약 2℃ 내지 8℃의 온도에서 저장될 수 있다. 이러한 경우에, 제형은 환자에 투여하기 전에 재구성되어 본원에 기술된 농도로 존재하는 항체 및 부형제를 함유한 액상 제제를 형성한다. 일부 경우에서, 제형은 무균수에 재구성된다. 일부 경우에, 제형은 재구성하고 환자를 위한 투여용 주입백에 첨가한다. 재구성된 약제는 환자에 투여하기 전에 안정성 프로필에 준하는 시간 동안 냉장하에 또는 실온에서 저장할 수 있다. 동결건조 및 재구성 기술은 본 분야에 알려져 있는 것으로 아래 실시예에서 기술된다.
따라서, 본 발명은 또한 동결건조된 항체 약물 및 재구성 및 용법에 관한 지침서를 포함하는 의약 제품을 포함한다. 예를 들면, 대표적인 의약 제품은 (a) 약 100mg의 항체를 분말 형태로 포함하는 바이알; (b) 항체의 재구성에 관한 지침서; 및 (c) 주입을 위한 재구성된 항체의 제조에 관한 지침서를 포함할 수 있고, (i) 항체는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14 내지 서열번호 16 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고; (ii) 재구성 지침서는, 10 mL의 실용량으로 주입을 위한 물에 의한 재구성을 요구한다.
II. 진단 및 치료 방법
또한, 아밀로이드 단백질 피브릴의 존재에 의해 특징적으로 나타나는 아밀로이드증을 앓고 있거나 앓게될 위험에 있는 사람 환자에게 본원에 기술된 약제중 임의의 것을 유효량 투여하는 단계를 포함하는 상기 사람 환자의 치료 또는 예방 방법이 제공된다.
II.A. 진단 및 치료가 가능할 수 있는 대상자
사람화된 2A4 약물은 아밀로이드 경쇄 AL 또는 아밀로이드 A(AA) 단백질이 연루된 아밀로이드증과 같은 전신성 아밀로이드증의 치료에 사용된다. 전신성 아밀로이드증은 치명적인 기관 손상을 일으키는 미스폴딩 단백질이 조직에 침착되어 발병하는 복합적인 질환군이다. 가장 일반적인 유형인 AL 아밀로이드증 또는 원발성 아밀로이드증은 미스폴딩 면역글로불린 경쇄를 생성하는 클론성 혈장 세포에 의해 발병되는 혈액 질환을 수반한다. 혈장 세포에 의한 미스폴딩 경쇄의 과다생성은 AL 아밀로이드증 환자의 조직 및 기관에 비정상 AL 단백질(아밀로이드)의 침착물을 초래한다. AL 아밀로이드증의 임상적 특징은 심장, 신장 및 간 기능장애, 항물출혈, 신경병증 및 대설증을 포함한 한 무리의 병태 및 기관장애를 포함한다. 전신성 아밀로이드증의 다른 유형인 AA 아밀로이드증 또는 이차 아밀로이드증이 만성 염증 질환(예, 류마티스성 관절염 및 강직성 척추염) 또는 만성 감염증(예, 결핵 또는 골수염)과 같은 다른 질환의 결과로서 "이차적으로" 발생한다. 이차 아밀로이드증에서 침착되는 아밀로이드 단백질은 급성기 단백질 혈청 아밀로이드 A로부터 유도된 아밀로이드 A 단백질이다.
이차적인 아밀로이드증은 AA 아밀로이드뿐만 아니라 AL 아밀로이드에서 동정된 새로운 에피토프의 항체 표적화를 통한 아밀로이드-특이적 면역요법이 가능할 수 있을 예정이다. AA와 AL의 동물 모델 연구에서 항체의 합리적인 용량에서 유의적이고 긍정적인 치료 효과가 가능할 수 있음이 입증된 바 있다.
기술된 항체 제형을 이용하여 치료가 가능할 수 있는 대상자 또는 환자는 아밀로이드 질환의 위험에 있으나 증상이 나타나지 않은 사람뿐만 아니라 아밀로이드 질환의 증세를 현재 보이고 있는 환자를 포함한다. 따라서, 본 발명의 방법은 대상 환자의 위험에 대한 임의의 평가를 실시할 필요없이 일반 집단에 예방차원에서 투여할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법은 확인된 유전적 위험성 자가면역 질환을 보유하고 있는 사람에게 특히 유용하다. 이러한 사람들은 이 질환을 앓아 본 경험이 있는 친척이 있는 자 및 유전자 마커 또는 생화학 마커의 분석에 의해 위험성이 결정된 자를 포함한다. 다른 예로서, AA 아밀로이드증을 보유하고 있는 환자는 상당 기간 증상이 나타나지 않을 수 있음에 따라 아밀로이드 침착물이 광범위하게 퍼져있을 때까지 AA 아밀로이드증의 임상 진단이 흔히 늦춰지거나 놓치게 된다. 증상이 이미 나타난 환자의 경우, 불과 53%만이 진단된 것으로 추산되고 있다(참조예: L.E.K. Consulting, Independent Market Research (2003)). 기술된 항체 제형의 예방적 투여는 AA 아밀로이드증의 발병을 줄일 수 있다.
본 발명의 방법은 AA 아밀로이드증 또는 AL 아밀로이드증의 위험에 있는 것으로 알고 있거나, 그러한 질환을 보유하고 있는 것으로 의심되거나, 그러한 질환으로 확진받은 사람에게 특히 유용하다. 이와 같은 사람들은 이로써 한정되는 것은 아니지만 만성염증질환, 유전성염증질환 및 만성미생물감염증의 보유자를 포함하며, 예를 들면 류마티스성관절염, 소아만성관절염, 강직성척추염, 건선, 건선관절병증, 라이터증후군, 성인형스틸병, 베체트병, 크론병, 가족성지중해열, 나병, 결핵, 기관지확장증, 욕창성궤양, 만성신우신염, 골수염, 휘플씨병, 골수종, 마크로글로불린혈증, 면역세포이상, 단클론성감마병증, 잠재장애의 보유자이다. 만성 염증성 및 감염성 증세는 AA 아밀로이드증의 발병에 전조로 나타나며, 국소적결절성아밀로이드증으로 판정된 AL 아밀로이드증은 만성 염증 질환과 연관이 있을 수 있다. AA 아밀로이드증의 위험에 있는 것으로 알고 있는 사람은 또한 이들로 한정되는 것은 아니지만 호지킨 림프종, 신장암, 위암, 폐암, 비뇨생식로암, 기저세포암 및 모양세포성백혈병과 같은 악성신생물의 보유자를 포함한다. 추가로, AA 아밀로이드증의 위험에 있는 것으로 알고 있는 사람은 또한 이들로 한정되는 것은 아니지만 캐슬만병과 같은 림프증식성질환의 보유자를 포함한다. 이러한 환자중 일부는 아밀로이드 A 피브릴의 존재에 의해 특징적으로 나타나는 AA 아밀로이드증을 보유한다. 일부 환자는 AL 아밀로이드증이 원인인 전신성 기관 장애를 보유하며, 그러한 장애에는 심장, 신장, 간, 말초신경계, 위장계, 자율신경계, 폐 및/또는 연조직 또는 림프계의 장애가 포함된다.
또한 치료가 가능할 수 있는 환자로는 아밀로이드 질환 또는 연관된 증상(예, 염증질환, 만성미생물감염증, 악성신생물, 유전성염증질환 및 림프증식성질환)의 치료를 위해 대체요법을 받은 적이 있거나, 현재 받고 있거나, 장래에 받고자 하는 환자를 포함한다. 예를 들면, 환자는 또한 병용요법과 관련하여 본원에서 동정된 치료제중 하나 이상을 투여받을 수 있거나 투여받은 적이 있을 수 있다. 특정 예로서, AL을 앓고 있는 환자는 또한, 보르테조밉, 멜팔란, 레날리도마이드 및/또는 카르필조밉을 투여받을 수 있거나 투여받은 적이 있을 수 있다. 아밀로이드 질환의 치료를 위해 대체요법을 이전에 받은 적이 있는 환자의 경우, 이와 같은 요법은 관련 임상평가에 의해 성공적이거나 성공적이지 않을 수 있다.
II.B. 치료 요법
본원에 사용된 용어 "치료"는 질환과 연관된 한 가지 이상의 증상 또는 영향의 완화 또는 호전, 질병과 연관된 한 가지 이상의 증상 또는 영향의 개시의 예방, 억제 또는 지연, 질병과 연관된 한 가지 이상의 증상 또는 영향의 중증도 또는 빈도의 감소 및/또는 본원에 기술된 목적하는 결과의 증가 또는 도출을 의미한다.
본원에 기술된 목적하는 치료 결과는 아밀로이드 질병 및 환자 프로필에 따라 다양하며 본 분야의 전문가는 용이하게 결정할 수 있다. 일반적으로, 목적하는 결과는 병원성 아밀로이드 피브릴의 감소 또는 제거, 아밀로이드 응집 및/또는 아밀로이드 침착의 감소 또는 억제 및 병원성 및/또는 응집된 아밀로이드 피브릴에 대한 면역반응의 증가와 같은 측정가능지표를 포함한다. 또한, 목적하는 결과는 아밀로이드 질환-특이 증상의 호전을 포함한다. 예를 들면, AL 아밀로이드증의 치료를 위한 목적하는 결과는 기관 장애, 말초 및 자율 신경병증, 수근관증후군, 대설증, 제한성심근증, 대형 관절의 관절병증, 면역이상, 골수종 및 잠재장애를 포함하여 알려진 증상의 발병 또는 중증도의 감소를 포함한다. 다른 예로서, AA의 치료를 위한 목적한 결과는 연관된 염증, 관절염, 건선, 미생물 감염증, 악성종양 또는 AA 아밀로이드증을 유도한 다른 기존 또는 공존 질환의 증상의 감소를 포함한다.
기술된 요법의 목적하는 결과는 대조 또는 기준 측정값과 비교하여 일반적으로 정량가능한 측정값이다. 본원에 사용된 "향상", "증가" 또는 "감소"와 같은 상대적 용어들은 본원에 기술된 치료의 개시전에 동일한 사람에 대한 측정 또는 대조자 또는 대조군에 대한 측정과 같이 대조군에 대한 상대적인 값을 가리킨다. 대조자는 치료중인 사람과 동일한 아밀로이드 질환을 앓고 있고 나이도 거의 동일하지만(치료중인 사람의 병기와 대조자의 병기가 비슷할 수 있도록 하기 위해) 기술된 항체 제형을 이용한 치료를 받지않고 있는 사람이다. 이 경우에, 기술된 항체 제형의 효능은 미치료 대조군에 대한 측정가능 지표로부터의 벗어나 있는 정도 또느 성향에 의해 평가된다. 다른 방법으로서, 대조자는 치료중인 사람과 나이가 거의 동일한 건강한 사람이다. 이 경우에는 기술된 항체 제형의 효능이 건강한 대조군에 대한 측정가능 지표쪽을 향한 정도 또는 성향에 의해 평가된다. 치료에 대한 반응으로 나타난 변화 또는 진전은 일반적으로 통계상 유의적이며 p-값으로 표시되고, p-값이 0.1 이하, 0.05 미만, 0.01 미만, 0.005 미만 또는 0.001 미만이면 유의적인 것으로 인정될 수 있다.
증상이 없거나 증상이 있는 환자 모두에서, 기술된 방법에 따른 치료는 AA 또는 AL 아밀로이드 기저 질환의 진단 전후로 하여 언제든 개시할 수 있다. 치료는 전형적으로 일정 기간동안에 다회 용량을 수반한다. 치료는 시간이 경과하면서 항체를 검정하거나 방사성표지된 SAP 신티그래피를 사용하여 모니터링할 수 있다. 만일 반응이 떨어진다면 추가용량이 권고될 수 있다. AL 아미로이드증 환자의 치료에 대한 반응은 심장 마커(예, NT-proBNP 및/또는 트로포닌), 혈청 크레아틴 및/또는 알칼리성 포스파타제를 평가하거나, 혈중 유리 경쇄(SFLC) 검정, 정량 면역글로불린 검정, 부검, 혈중 단백질 전기영도(SPEP), 뇨단백질 전기영동(UPEP), 혈청, 뇨면역고정 전기영동(IFE) 및/또는 기관 영상화 기술을 실시하여 모니터링할 수 있다. 예로서 완전관해가 혈청 및 뇨의 음성 IFE, 정상적인 카파/람다 비율 및/또는 골수중의 혈장 세포 5% 미만을 포함한 반응 기준으로부터 결정될 수 있다. 다른 예로 매우 좋은 부분관해(VGPR)가 40mg/L 미만의 dFLC로부터 결정될 수 있다. 또 다른 예로서 부분관해(PR)이 50 % 이상의 dFLC 감소로부터 경정될 수 있다. 신장에서의 치료 반응은 25% 이상의 eGFR 감소 또는 0.5mg/dL 이상의 혈청 크레아틴 증가가 없을 때에 예를 들면 24시간 뇨 단백질 배출에서 50% 이상의 감소(예, >0.5 g/24시간)로부터 결정될 수 있다. 간에서의 치료 반응은 예를 들면 초기 상승된 알카리성 포스파타제의 50% 이상 감소 또는 CT 스캔 또는 MRI에서 간 크기의 2 cm 이상 감소로부터 결정될 수 있다. 심장에서의 치료 반응은 예를 들면 NT-proBNP 650 ng/L 이상의 기저 환자에서 NT-proBNP의 30% 및 300 ng/L 이상의 감소로부터 결정될 수 있다.
항체 제형는 해당 환자에게 약 10mg 내지 약 5000mg의 용량, 예를 들면 약 10mg, 약 30mg, 약 100mg, 약 300mg, 약 1000mg, 약 2000mg 또는 dir 2500mg의 용량으로 정맥내 투여될 수 있다. 또한, 항체 제형는 숙주 체중 kg 당 약 0.1mg 내지 약 50mg 또는 약 0.5mg 내지 약 30mg의 용량으로 정맥내 투여될 수 있다. 예를 들면, 용량은 체중 kg 당 약 0.5mg, 약 1.0mg, 약 1.5mg, 약 2.0mg, 약 4.0mg, 약 5.0mg, 약 8.0mg, 약 10mg, 약 15mg, 약 16mg, 약 20mg, 약 25mg 또는 약 30mg일 수 있다. 임상적으로 어떠한 유의적인 반응이 없을 때에 처방자는 환자에게 과다한 안전성 위험(예, 3등급 이상의 비혈액성 독성, 최대 구토방지제/지사제 치료에 의해 조절되지 않는 제3등급 이상의 구역, 구토 또는 설사, 성장 인자의 보조가 없을 때 7일 이상 지속되는 4등급의 호중구감소증, 38.5℃ 이상의 열 및/또는 전신성 감염증을 동반한 임의의 지속적인 3등급 또는 4등급의 호중구감소증 또는 4등급 이상의 혈액성 독성)을 초래할 수도 있을 것이라는 합리적이고 확실한 판단하에 환자에게 용량을 늘릴 수 있다.
항체는 보통 다양한 경우로 투여된다. 예로서 치료 요법은 2주에 1회, 1개월에 1회 또는 3 내지 6개월에 1회의 투여를 포함한다. 예를 들면, 환자는 항체 제형을 4주(28일)에 1회 투여받을 수 있다. 투약 횟수는 환자에 대한 항체 제형의 약동학 프로필에 따라 조정될 수 있다. 예를 들면, 항체의 반감기는 2주의 투약 기간을 보장할 수 있다. 일부 방법에서, 결합 특이성이 다른 2종 이상의 모노클로날 항체가 동시에 투여되며, 이 경우엔 각 항체의 투여량이 표시 범위이하로 줄어든다. 단독 투여사이의 간격은 1주, 1개월 또는 1년일 수 있다. 또한, 간격은 환자에 있어서 아밀로이드 단백질(예, AA)에 대한 항체의 혈중 농도를 측정한 결과에 따라 변할 수 있다. 일부 방법에서는 혈장중 항체 농도가 약 1 내지 1000㎍/ml 또는 약 25-300㎍/ml이 되도록 용량을 조정한다. 다른 방법으로서, 항체는 지방성 제형으로서 투여될 수 있으며, 이 경우엔 투여 횟수를 줄일 필요가 있다.
용량 및 횟수는 환자 체내에서의 항체의 반감기에 따라 다양할 수 있다. 일반적으로, 사람 항체의 반감기가 가장 길고, 이어서 사람화된 항체, 키메라 항체 및 비사람 항체의 순이다. 투여 용량 및 횟수는 예방인지 치료인지에 따라 다양할 수 있다. 예방인 경우, 비교적 저용량이 장기간에 걸쳐 비교적 긴 간격으로 투여된다. 일부 환자는 여생을 위해 치료를 계속 받는다. 치료인 경우엔 질환의 진행이 감소되거나 멈출 때까지 및/또는 부분 또는 완전 관해에 이를 때까지 및/또는 환자로부터 질환 증상의 완화 또는 호전이 보일 때까지 비교적 고용량이 비교적 단기간 간격으로 투여된다. 이후, 환자는 예방차원에서 투약을 받을 수 있다.
본원에 기술된 약제는 비경구(예, 정맥내, 근육내, 피하) 투여에 적합한 용량형으로 제공될 수 있다. 약제는 특정 용도에 맞게 다른 형태로서 직장, 경피, 비내, 질내, 흡입, 안내 등의 투여에 적합한 용량으로 제공될 수 있다. 약제는 전형적으로 통상적인 제약 실무에 따라 제조한다(참조예: Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (19th ed.) ed. A. R. Gennaro, 1995, Mack Publishing Company, Easton, Pa. and Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, N.Y.).
본 발명의 한 양상에서, 아밀로이드 피브릴, 침착물 또는 원피브릴 응집체의 존재에 의해 특징적으로 나타나는 경쇄(AL) 아밀로이드증을 보유하고 있거나 보유하게 될 위험에 있는 사람 환자를 치료 또는 예방하는 방법은 상기 환자에게 (a) 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14, 15 또는 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고 약 10mg/mL의 농도로 존재하는 항체; (b) 약 25mM의 농도로 존재하는 히스티딘 완충제; (c) 약 230mM의 농도로 존재하는 트레할로스; (d) 약 0.2g/L의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 20을 포함하고 (e) 약 6.5의 pH를 갖는 약제의 유효량를 투여하는 단계를 포함한다. 이와 같은 방법에서, 용량은 전형적으로 약 1주 내지 대략 분기마다의 주기(예, 28일마다 1회)로 정맥내 또는 피하 투여되는 항체 약 0.5mg/kg 내지 약 30mg/kg(예, 약 0.5mg/kg 내지 약 8mg/kg 또는 약 8mg/kg 내지 약 30mg/kg)이다.
II.C. 병용 약물 요법
또한, 본 발명은 아밀로이드 질환, 특히 AA 아밀로이드증 및 AL 아밀로이드증의 치료 또는 예방을 위한 병용 치료요법을 포함한다. 이러한 병용 치료요법은 본 발명의 항체 제형을 한 가지 이상의 제2 치료제를 투여함으로써 수행되며, 예를 들면 경우에 따라 AA 아밀로이드증 또는 AL 아밀로이드증을 치료 또는 예방하기 위한 다른 요법과 병용하는 것이다. 본 발명에 따른 병용 치료요법은 또한 아밀로이드 질환과 연관된 질병 또는 증세, 예를 들면 염증 질환, 만성 미생물 감염증, 신생물(악성 신생물을 포함), 유전성 염증 질환 및/또는 림프증식성 질환의 치료 또는 예방을 위해 사용되는 제2 요법과 함께 수행할 수 있다. 많은 치료법이 상업적 이용, 임상 평가 및 전임상 개발에서 이용되고 있으며, 이들중 어떠한 것도 임의로 선택되어 기술된 항체 제형와 병용하여 이용될 수 있다. 이러한 치료법은 이로써 한정되는 것은 아니지만 다음의 몇 가지 주요 범주중에서 선택된 화합물 또는 치료법중 한 가지 이상일 수 있다: (i) 비스테로이드성 소염 약물(NSAID)(예, 데토프로펜, 디클로페낙, 디플루니살, 에토돌락, 페노프로펜, 플루르비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 메클로페나메이트, 메페남산, 멜록시캄, 나부메온, 나프록센 나트륨, 옥사프로진, 피록시캄, 술린닥, 톨메틴, 셀레콕십, 로페콕십, 아스피린, 콜린 살리실레이트, 살살테 및 나트륨 및 마그네슘 살리실레이트); (ii) 스테로이드(예, 코르티손, 덱사메타손, 하이드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니손, 트리암시놀론); (iii) DMARD, 즉 질환 완화용 항류마티스 약물(예, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 레플루노마이드, 사이클로포스파미드, 하이드록시클로로퀸, 설파살라진, D-페니실라민, 미노사이클린 및 금); (iv) 재조합 단백질(예, ENBREL®(에타네르셉트, 가용성 TNF 수용체) 및 REMICADE®(인플릭시맙, 키메라 모노클로날 항-TNF 항체)); (v) 줄기세포 이식; 및/또는 (vi) 화학요법. AL 아밀로이드증 환자는 또한 혈액 악성종양의 치료에 흔히 사용되는 약물(예, 멜팔란, 프레드니손, 덱사메타손, 레날리도마이드(REVLIMID®) 및 프로테오솜 억제제(예, 보르테조밉(VELCADE®) 및 카르필조밉(KYPROLISTM))) 또는 이들 약물의 조합을 표준 치료 용량으로 포함하는 치료 요법을 받을 수 있다.
병용 치료요법의 기간은 치료중인 아밀로이드 질환의 유형, 아밀로이드 질환과 연관된 기저 질환, 환자의 연령 및 상태, 환자 질환의 병기 및 종류, 치료에 대한 환자 반응 등에 의해 좌우된다. 의사는 치료 효과를 면밀하게 관찰할 수 있고 필요에 따라 임의로 조절한다. 추가로, AA 아밀로이드증이 발전할 위험이 보다 높은 사람(예, 유전적 소인이 있거나 염증 질환 또는 다른 기저 질환을 이전에 앓았던 사람) 또는 AL 아밀로이드증이 발전할 위험이 보다 높은 사람은 피브릴과 같은 AA AL 응집체의 발생을 억제 또는 지연시킬 목적으로 또는 치료 후 유지요법으로서 예방차원의 병용 치료를 받을 수 있다.
병용 치료요법을 수행할 때 2종 이상의 약물은 동시에 투여하거나 임의로 순서로 순차적으로 투여한다. 즉, 본 발명의 약제는 제2 약물 투여 전에 투여되거나, 제2 약물과 동시에 투여되거나, 제2 약물의 투여에 이어서 투여된다. 예를 들면, 병용 치료요법은 제2 약물/요법의 투여전(예, 1분, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주 또는 12주 전), 투여와 동시 또는 투여후(예, 1분, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주 또는 12주 후)에 제1 요법을 투여함으로써 수행할 수 있다.
병용되는 각 약물의 투여 용량, 투여 횟수 및 투여 방식은 독립적으로 조절할 수 있다. 예를 들면, 제1 치료제/치료법은 1일에 3회 경구 투여하고 제2 치료제/치료법은 1일에 1회 근육내 투여할 수 있다. 병용 치료요법은 중간에 휴지기를 두고 교대로 적용할 수 있다. 또한, 두 화합물이 함께 혼합되거나 제형되어 한 번 투여로 두 화합물을 전달할 수 있다. 이 경우에 각각의 치료제는 일반적으로 조성물의 총중량을 기준으로 1 내지 95중량%의 양으로 존재한다. 다른 방안으로서, 본 발명의 항체 제형와 제2 치료제는 독립적으로 별개의 용량으로 제형될 수 있다. 치료를 위한 약물 병용은 의약팩의 요소로서 제공될 수 있다.
바람직하게는, 기술된 병용 치료요법은 상승 치료 효과, 즉 개별적인 효과 또는 치료결과의 합보다 큰 효과를 나타낸다. 측정가능한 치료 결과는 본원에 기술되어 있다. 예를 들면, 상승 치료 효과는 병용되는 각 약물에 의해 유도되는 치료 효과의 합보다 약 2배 이상 또는 약 5배 이상 또는 약 10배 이상 또는 약 20배 이상 또는 약 50배 이상 또는 약 100배 이상 큰 효과일 수 있다. 또한, 상승 치료 효과는 병용되는 각 약물에 의해 유도되는 치료 효과의 합에 비하여 10% 이상 또는 20% 이상 또는 30% 이상 또는 40% 이상 또는 50% 이상 또는 60% 이상 또는 70% 이상 또는 80% 이상 또는 90% 이상 또는 100% 이상 또는 그 이상의 치료 효과 증가로서 관찰될 수 있다. 상승 효과는 또한 치료제가 병용 사용될 때 치료제의 용량을 줄여 주는 효과이다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 방식을 실증하기 위한 목적으로 포함되었다. 하기 실시예의 소정 양상은 본 발명의 공동-발명자가 본 발명을 원활히 실시할 수 있을 것으로 발견하였거나 고려한 기술 및 절차의 관점에서 기술된다. 본 명세서의 공개 내용 및 본 분야의 일반적인 기술 수준에 비추어, 당해 분야 숙련가는 하기 실시예가 단지 예시인 것으로 의도되고, 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 많은 변화, 변형 및 변경이 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
실시예 1. AL 아밀로이드증의 치료를 위한 사람화된 2A4의 선택
뮤린 항체 2A4의 사람화된 버젼인 IgG1, 카파 이소형 항체를 조제하였다. 대표적인 사람화된 2A4 항체의 경쇄 및 중쇄 서열은 도 1a, 도 1b, 및 도3에 제시된다. 도 3에 아미노산 서열을 나타낸, 특정 사람화된 2A4 항체 버젼 3을 암호화하는 핵산 서열은 도 4a 및 도 4b에 도시한다.
모 모노클로날 2A4 항체는, 아미노산 잔기 76에서 천연 사람 혈청 아밀로이드 A(sAA) 분자의 절단으로부터 얻어진 사람 sAA의 새로운-카르복시 말단 에피토프에 대해 지시된다. 뮤린 항체는 IgG 또는 유리된 경쇄(LC)와 교차반응하지 않고, 현재까지 실험된 환자 유도된 AL 아밀로이드 샘플에 대해 넓은 이소형 인식을 나타냈다. 2A4는, 가용성 다합체 및 불용성 침착물을 포함하는 AL 경쇄 아밀로이드의 다중 형태를 인식한다. 또한, 상기 항체는, 마우스 이종이식편 모델에서 아밀로이드종의 퇴행을 촉진시키는 것으로 밝혀졌다. 뮤린 2A4 항체의 경쇄 및 중쇄 서열은 도 2에 제시된다.
실시예 2. 사람화된 2A4 항체의 용량 결정
TRIAD 마우스 모델 및 사이노몰거스 원숭이에서의 비임상 연구는, 마우스에서 4 및 40mg/kg의 용량, 원숭이에서 10, 50 및 100mg/kg의 용량을 사용하였다. mg/kg 단위의 사람 등가 용량(HED)으로의 전환(혈관 공간에 대한 제한으로 인하여 모노클로날 항체에 대해 가장 적절한 전환)은, 마우스의 경우 0.32 및 3.2의 HED를 제공하고, 원숭이의 경우 3.2, 16 및 32의 HED를 제공한다. 현재 입수가능한 데이터에 근거하여, 당해 종 둘 다에서의 NOAEL(무독성량)은, 투여된 최고 용량인 것으로 예상된다. 3.2의 마우스 HED(용량 제한으로 인하여 가장 민감한 종) 및 10배의 안전 계수를 이용하면, 최초 사람 투약을 위한 MRSD는 대략 0.32mg/kg일 수 있다. 동물 연구를 기초로 하여, 사람에 대한 투여는 0.5mg/kg의 용량으로 시작한다.
실시예 3. 발현 벡터의 제조
최종 h2A4 IgG1 HC 벡터의 생성을 위해, 주형으로서 플라스미드 CET1019AS-hygro-h2A4VH3-Sce 4.23.07를 이용한 PCR에 의해 중쇄의 가변 영역을 분리하였다. 증폭을 위해 사용된 프라이머는 서브클로닝을 위해 단편의 5' 말단에 MfeI 제한 부위를, 3' 말단에 BlpI 제한 부위를 도입하였다. 가변 영역은 G1m(3) 동종이형의 사람 IgG1의 게놈 불변 영역을 함유하는 MfeI 및 BamHI 분해된 진핵 발현 벡터 pBI-61 내로 클로닝되었다. 얻어진 재조합 발현 벡터 pBI-61/2A4 IgG1-REM은 크기가 9,015 염기 쌍이고 DHFR 프로모터 및 폴리아데닐화 신호의 제어 하에 햄스터의 선별 마커 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 보유한다. 또한, 이러한 벡터는 이. 콜라이에서의 선별을 위한 베타-락타마제 유전자뿐만 아니라 이. 콜라이 복제 기원(Co1E1 ori), SV40 복제 기원(SV40 ori) 및 사상 파지 f1 복제 기원(f1 ori)을 함유한다. HC의 발현은 햄스터 게놈으로부터 유도된 전사 증가 요소(TE)와 조합된 사람 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터의 즉시 조기 프로모터/인핸서 영역에 의해 구동된다. 전사 종결 및 안정화를 위해, 햄스터 성장 호르몬으로부터의 폴리아데닐화 신호가 사용되고, 전사 증가를 위해 햄스터 게놈(TE)으로부터 유도된 비암호화 서열이 사용된다.
주형으로서 플라스미드 CET1019AS-hu2A4VL3-hck-puro-Sce 4.19.07를 사용하여, h2A4 LC의 가변 영역을 PCR에 의해 분리하였고, 동일한 제한 효소로 분해된 최종 진핵 발현 벡터 pBI-60 내로의 서브클로닝을 위해 단편의 5' 말단에 SgrAI 제한 부위가, 3' 말단에 KpnI 제한 부위가 도입되었다. 이 벡터는 사람 카파 쇄의 게놈 불변 영역을 함유한다. 생성된 재조합 발현 벡터 pBI-60/2A4 LC는 크기가 7,144 염기 쌍이고 SV50 프로모터의 제어 하에 제네티신에 대한 내성을 부여하는 선별마커 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 돌연변이체를 함유한다. 전사 종결을 위해, 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제로부터의 폴리아데닐화 신호가 사용된다. 또한, 이 벡터는 이. 콜라이에서의 선별을 위한 베타-락타마제 유전자뿐만 아니라 이. 콜라이 복제 기원(Co1E1 ori) 및 사상 파지 f1(f1 ori)을 함유한다. LC의 발현은 햄스터 게놈으로부터 유도된 전사 증가 요소(TE)와 조합된 사람 사이토메갈로바이러스(CMV)로부터의 즉시 조기 프로모터/인핸서 영역에 의해 구동된다. 전사 종결 및 안정화를 위해, 햄스터 성장 호르몬으로부터의 폴리아데닐화 신호가 사용되고, 전사 증가를 위해 햄스터 게놈(TE)으로부터 유도된 비암호화 서열이 사용된다.
실시예 4. 사람화된 2A4 항체(수집액-유도된 물질)의 생성
사람화된 2A4는 소-유도된 구성성분이 전혀 함유되지 않은 화학적 규명 배지에서 성장된 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포에서 생산되었다. 항체는 안정한 형질감염 세포로부터 수집(pool)되었고, 이 세포로부터 궁극적으로 생산 세포주가 유도되었다. 수집액-유도된 물질은 단백질 A-친화성 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 이 물질은 시아노몰거스 원숭이에서 사람 조직 교차-반응성 연구 및 단일 용량 약동학(PK) 연구에 사용되었다. 사람화된 2A4 항체의 제형은 10mg/mL 항체, 25mM L-히스티딘/L-히스티딘 HCl 일수화물, 230mM 트레할로스 탈수화물, 0.02%(w/v) 폴리소르베이트(TWEEN®) 20, pH=6.5이다.
실시예 5. 사람화된 2A4 항체(클론-유도된 물질)의 생산
단일 CHO 세포 클론을 실시예 3에 기술된 세포 수집액으로부터 분리하였고, 소 물질이 전혀 없는 마스터 셀 뱅크(MCB)의 구축에 사용하였다. 사람화된 2A4의 GMP 임상 버젼(2,000 L)과 동일한 세포 배양 및 정제 과정(규모 확장 변경 제외)을 사용하여, 비임상 연구용 사람화된 2A4를 80L 규모로 생성하였다. 2,000L 규모에서 생산된 물질도 비임상 연구에서 사용될 수 있다.
실시예 6. 사람화된 2A4 항체의 제조 방법
바이알 해동 및 접종물 확장. MCB로부터의 세포를 해동시키고 적절한 세포 배양 플라스크로 이동시킨다. 세포는 약 37℃에서 배양한다. 해동된 배양물을 1 내지 4일간 증식시킨다(세포 해동 후 1차 계대). 계대 배양을 위해, 성장된 세포 배양물의 분취량(및 예비가온된, 0.22㎛ 이하 여과된 접종 배지의 일정 용량)을 사용하여 약 0.02L 내지 1L 작업 용적의 표준 세포 배양 용기에서 약 0.1 내지 0.5 x 106 세포/mL의 식종 밀도를 조성한다. 예를 들면, 1차 계대는 0.125L 또는 0.25L 또는 0.5L 용기에서 수행하고, 이후 계대는 1L 용기에서 수행할 수 있다. 이 배양 단계에서 보존 배양을 개시할 수 있다. 개별의 생산용 발효조에서 접종 배양물을 제조하기 위해, 보존 배양액의 분취물을 증식시켜 25L 용량까지의 배양물을 생성하였다. 전형적으로, 세포 배양물은 1L 배양물로부터 둘 이상의 1L 또는 2L 배양물로 늘리고, 이어서 둘 이상의 2L 또는 3L 배양물로 확장한 후, 최종적으로 용기당 25L 배양 용적까지의 배양물을 둘 이상 준비한다. 여러 용기로부터 성장된 세포 현탁액을 수집하고 80L 생물반응기에 접종하는데 사용할 수 있다. 진탕 플라스크, T-플라스크, 스피너 플라스크 및 백을 상기 배양 단계를 위한 표준 세포 배양 용기로서 사용할 수 있다.
생물반응기에서의 식종 배양. 세포를 접종하기 전에, 생물반응기에 0.22㎛ 이하 여과된 성장 배지를 첨가한다. 충진된 생물반응기에 내용물은 약 37℃로 가온하고 세포의 항온배양 동안 이 온도를 유지한다. 접종 배양물로부터의 세포를 예비가온 배지로 이동시킨다. 최초 세포 밀도는 0.1 내지 0.5 x 106 세포/ml 범위 내를 목표로 한다. 세포를 80L 생물반응기에서 성장시키고, 후속적으로 400L 생물반응기에서 성장시킨다. 세포를 약 2 내지 4일마다 계대배양한다. 이 단계에서, 세포는 동일하거나 보다 더 큰 용적의 다른 용기로 이동시킬 수 있다. 전형적으로, 세포 배양물은 1 x 80L 생물반응기 배양물에서 1 x 400L 배양물로 확장한다. 생산 단계를 개시하기 위해, 세포를 성장된 400L 세포 현탁액으로부터 약 2,000L 작업 용적의 생산용 생물반응기로 이동시킨다.
2,000L 생물반응기에서의 생산 배양. 세포를 접종하기 전에, 생산용 생물반응기에 0.22㎛ 이하 여과된 생산 배지를 첨가한다. 충진된 생산용 생물반응기의 내용물을 약 37℃로 가온하고 세포의 항온배양 동안 이 온도로 유지한다. 생산 단계의 최초 세포 밀도는 0.1 내지 0.5 x 106 세포/ml 범위 내를 목표로 한다. 생산용 생물반응기를 유가 배양 방식으로 가동한다. 항체 생산을 지지하고 배양 기간을 연장시키기 위해, 생산 단계 동안에 영양 공급 배지를 첨가한다. 공급 개시 시점은 배양 시간에 의해 또는 세포 밀도에 의해 결정된다. 필요한 경우, 생산 단계 동안에 글루코스 용액 및/또는 글루타민 용액을 첨가하여 생산 기간 동안의 이들 물질의 고갈을 방지할 수 있다. 2,000L 생산용 생물반응기의 가동 시간은 전형적으로 8 내지 14일이다. 수확전 샘플를 무균성, 마이코플라스마 및 외래성 바이러스에 대해 시험관내에서 시험한다.
수확 및 정화. 생산 단계에서 8 내지 14일의 배양 후, 새포 배양액을 세포로부터 분리한다. 수확전 샘플링 후 및 수확 전에, 배양액의 pH 및 온도를 조정하여 수확 동안에 세포, 파편 및 입자의 제거를 촉진할 수 있다. 세포를 제거하기 위하여, 배양액을 원심분리+전량 여과 유닛을 통과시킨다. 세포는 원심분리되고/되거나 막에 남게 된다. 수확된 배양액을 기공 크기 0.22㎛ 이하의 필터에 통과시키고 적당한 용기에 수집한다. 인산 완충 염수(PBS)로 수확 시스템을 수세(flushing)하여 잔여 배양액을 제거하고 수확 시스템으로부터 잔여 생성물을 회수할 수 있다. 얻어진 회수된 생성물은 수확된 배양액과 함께 모아 수확 수집액을 형성하고, 수확 수집액은 또한 수확된 무세포 배양액(HCCF)라고도 칭한다. HCCF의 pH 및 온도는 후속 다운스트림 공정 단계를 원활히 하기 위하여 조정할 수 있다.
정제. 친화성 크로마토그래피, 산 처리, 심층 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 나노여과, 및 한외여과/투석여과를 포함한 일련의 단계에 의해 HCCF로부터 항체를 정제할 수 있으며, 상기 정제 공정 중 일부는 수회의 주기로 수행할 수 있다. 오염물을 제거하기 위해, 친화성 크로마토그래피 공정 단계는 항체 생성물과 특이적으로 결합한다. HCCF를 MabSelect 매트릭스가 패킹된 크로마토그래피 컬럼에 적용한다. 매트릭스는 중성 pH에서 항체와 결합하고, 한편, 오염물은 그대로 통과하여 제거된다. 용출 단계에서 컬럼을 pH 3.5의 100mM 아세트산/나트륨 아세테이트 용액으로 용출시킨다. 잠재적인 바이러스 오염물을 불활성화시키기 위하여, 항체 용액을 실온에서 pH 3.5±0.1에서 최소 60분간 항온배양한다. 항온배양 후 산 처리된 수집액을 2M 트로메타몰 용액을 이용하여 pH를 7.2로 조정하고 정화를 위해 심층 여과하였다. 음이온 교환 크로마토그래피를 위해, 심층 여과된 수집액의 전도도를 주사용수(WFI)로 7 mS/cm 이하로 조정한다. 조정된 수집액을 Q 세파로즈 FF 수지가 패킹된 크로마토그래피 컬럼에 적용한다. 항체는, 미결합된 음이온 교환 매트릭스를 통과한다. 유속을 모니터링하고 항체 함유 분획을 흡광도 측정값을 기준으로 수거한다. 양이온 교환 크로마토그래피를 위해, 생성물 수집액에 아세트산을 첨가하여 pH를 5.5±0.1로 조정하고 WFI로 전도도를 7.5 mS/cm 이하로 조정한다. 조정된 생생물 수집액을 SP 세파로즈 FF 양이온 교환 수지가 패킹된 크로마토그래피 컬럼에 적용한다. 이 크로마토그래피 단계는 결합-용출 방식으로 수행한다. 항체는 양이온 교환 매트릭스와 결합한다. 용출 단계에서 100mM 아세트산/나트륨 아세테이트 및 138.5mM 염화나트륨 용액(pH 5.5)으로 컬럼을 용출시킨다. 항체 용액을 0.1㎛ 프리필터를 통과시키고, Planova 20N 나노필터의 1 bar 차압의 최대 압력에서 Planova 20N 나노필터에 통과시켜 잠재적 바이러스 오염물을 제거한다. 한외여과/투석여과(UF/DF) 동안에, 생성물을 목표 농도로 농축시키고 완충액을 제형 완충액으로 교환한다. 농축 및 투석여과는 컷오프값이 약 30kD인 한외여과막을 사용하여 수행한다. 생성물을 30 내지 100mg/mL로 농축시킨다. 이어서, 30kD 수집액을 25mM L-히스티딘 용액(pH 6.5)으로 투석여과하고 약 60 내지 70mg/mL의 농도로 수세한다. 30kD 수집액 중간물은 제형을 수행할 때까지 -40℃에 저장할 수 있다. 제형을 위해, 30kD 생성물 수집액은, 17.5mM L-히스티딘/7.5mM L-히스티딘 하이드로클로라이드, 230mM 트레할로스 및 0.02%(w/v) 폴리소르베이트 20을 함유하는 용액(pH=6.5)으로 조정한다. 마지막으로, 항체를 제형 완충액을 이용하여 10mg/mL의 바람직한 목표 농도로 희석시킨다. 생성된 약물은 0.22㎛ 필터에 통과시켜 모든 잠재적인 외래성 미생물 오염물 및 미세 입자 물질을 제거한다. 약물 물질은 충진시까지 -40℃에서 동결 저장할 수 있다.
실시예 7. 사람화된 2A4 항체를 함유한 약물 물질의 특성확인
제형에 사용된 사람화된 2A4는 2개의 이종이량체로 구성된다. 각각의 이종이량체는 약 50kDa(449개 아미노산)의 중쇄 폴리펩타이드와 약 24kDa(219개 아미노산)의 카파 경쇄 폴리펩타이드로 구성된다. 항체 단백질은 총분자량이 약 147kDa인 사람화된 아미노산 서열을 갖는다. 항체 분자의 4개의 폴리펩타이드 쇄는 디설파이드 결합에 의해 함께 연결되어 있다. 각각의 중쇄 폴리펩타이드는 N-연결된 당화를 위한 1개의 컨센서스 서열(도 1a에서 볼드체와 밑줄로 표시된 위치 299 내지 301)을 함유한다. 혈청 아밀로이드 A 에피토프에 대한 결합 부위는 항체 분자당 2개가 있다.
경쟁 결합 ELISA는 참조 표준물과 비교하여, 사람화된 2A4와 항원(난알부민과 접합된 경우 CGGHEDT(서열번호 17))의 결합을 측정하는 것으로 확립되었다.
실시예 8. 사람화된 2A4 약물 물질 구성성분 및 조성
임상용 사람화된 2A4 약물 물질(100mg/바이알)은 25 mL 바이알(20R) 중의 10 mL 충진액으로 이루어진 무균 액상 용량형이다. 비임상용 사람화된 2A4 약물 물질(200mg/바이알)은 25 mL 바이알(20R) 중의 20 mL 충진액이다. 표 1에는 사람화된 2A4의 비임상용 및 임상용 제형이 제공된다. 사람화된 2A4 약물의 최종 제형은 20℃에서 1.034 g/mL의 밀도 및 6.5의 pH를 갖는다.
비임상용 및 임상용 사람화된 2A4 약물 물질의 조성
구성성분
 기능
 농도
(g/L)		 공칭량(mg/바이알)
비임상용 바이알 크기
= 25 mL(20R)		 임상용 바이알 크기
= 25 mL(20R)
사람화된 2A4 약물 물질 활성 물질 10 200 100
L-히스티딘 완충제 구성성분 2.72 54.4 27.2
L-히스티딘 HCl 일수화물 완충제 구성성분 1.57 31.4 15.7
트레할로스 이수화물 등장화제 87.02 1,740.4 870.2
폴리소르베이트(TWEEN®) 20 계면활성제 0.20 4.0 2.0
주사용수(WFI) 용매 - 총 용적이 20 mL가 되게 WFI를 첨가함 총 용적이 10 mL가 되게 WFI를 첨가함
실시예 9. 약제품(100mg/mL 바이알)의 배치 포뮬러
하기 표 2에 제공된 바와 같이 2,600개의 약제품 바이알에 대한 회분 처방을 설계하였다.
2,600개 바이알의 배치 포뮬러
성분 등급 배치당 양
사람화된 2A4 항체 - 260.0 g
L-히스티딘 USP, Ph. Eur. 70.72 g
L-히스티딘 HCl 일수화물 Ph. Eur. 40.82 g
트레할로스 탈수화물 USP/NF, Ph. Eur. 2,262.52 g
폴리소르베이트 20 USP/NF, Ph. Eur. 5.20 g
실시예 10. 동결건조
아래 표 3에 제시된 프로그램에 따라 N2를 주입하고 MKS 제어 시스템(MKS 장비)로 압력을 조절하면서, Hof Com 26041 동결 건조기를 사용하여, 사람화된 2A4 약물 물질을 약 86시간에 걸쳐 동결건조시켰다. 종점은 피라니 신호로 검출하였다. 건조 모드 동안에 바이알은 동결건조판(lyo plates) 없이 선반에 똑바로 세웠다. 질소 재충진(backfill)은 약품 등급 무균 N2로 약 600 mbar에서 진행한다. 그런 후 바이알을 잠그고 5℃의 동결건조에 저장하였다. 최종 약제품은 차광하여 2 내지 8℃에 저장한다. 이 공정에서 제조된 것은 백색 내지 황색의 동결건조 케이크(lyo cake)이어야 한다.
표 3은 사람화된 2A4 약물 물질의 동결건조를 위한 프로그램을 요약한다.
동결건조 단계
단계 단계 번호 시간
[hh:mm]		 선반 온도(℃) 진공 MKS
(mbar)
로딩 01 00:01 5 정지
동결 02 00:15 5 정지
03 00:05 2 정지
04 02:00 2 정지
05 01:05 -50 정지
06 02:30 -50 정지
일차 건조 07 00:05 -50 0.10
08 00:40 -10 0.10
09 55:00 -10 0.10
이차 건조 10 04:30 30 0.10
11 20:00 30 0.10
총 시간 86:11
실시예 11. 동결건조된 약제품의 재구성
투여 전에 동결건조제는 멸균 주사용수로 재구성되어야 한다. h2A4 바이알의 재구성은 공기층류(laminar air-flow) 하에 다음의 절차에 따라 수행하였다. 각 약품 바이알의 완전 플립-오프-캡을 제거하였다. 고무-스톱퍼도 제거하였다. 필요한 용적의 용매를 피펫팅하여 첨가하였다(피스톤 피펫을 이용하여 2x 5mL). 이 작업을 수행할 때 용매를 동결건조된 약제품에 서서히 첨가하는 것을 확실히 하였다. 동결건조된 약제품이 완전히 용해될 때까지 바이알을 조심스럽게 와동시켰다(진탕은 아님). 바이알을 주의 깊게 왕복 회전시킴으로써 용액을 균질화하였다. 용해물을 표 1에 따라 분취하고 분석할 때까지 -70℃에 저장하였다.
실시예 12. 사람화된 2A4 약물 물질의 임상 평가
AL 아밀로이드증을 지닌 대상자에 대한 사람화된 2A4 약물 물질의 최대 허용 용량(MTD) 및/또는 페이즈 2 권장 용량(P2RD)을 결정하는 임상 시험을 설계한다. 투약은 0.5mg/kg으로 출발해서 최고 30mg/kg 또는 총 2500mg(더 낮은 것으로)까지 올릴 것이다. 처음에, 사람화된 2A4 약물 물질은 기관 기능 또는 허용불가한 치료 관련 독성의 진행 또는 동의 철회시까지 28일마다 단일 제제로서 정맥내 제공될 것이다. 초기 용량으로부터의 사람화된 2A4 약물 물질의 반감기(t1 /2)를 기준으로 다른 투약 스케쥴이 더 적절한 것임을 시사하는 경우(예, 매 2주, 격2주, 매 28일 1회 보다 적은 횟수), 후속 코호트에 대한 투약은 대안의 투약 스케쥴로 변경할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ONCLAVE THERAPEUTICS LIMITED <120> ANTIBODY FORMULATIONS AND METHODS <130> E090 1040.WO <150> US 61/551,406 <151> 2011-10-25 <160> 24 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 131 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(19) <223> LEADER SEQUENCE <220> <221> mat_peptide <222> (20)..(131) <220> <221> MISC_FEATURE <222> (43)..(58) <223> CDR 1 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (74)..(80) <223> CDR 2 <220> <221> MISC_FEATURE <222> (113)..(121) <223> CDR 3 <400> 1 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Met Phe Trp Ile Pro Ala -15 -10 -5 Ser Ser Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val -1 1 5 10 Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu 15 20 25 Val His Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro 30 35 40 45 Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr 65 70 75 Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val 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<220> <223> Humanized antibody sequence containing murine and human residues (Hu2A4 VH3VL3 hcg1,k cDNA sequence - light chain without signal sequence) <400> 19 gacgtggtga tgacccagtc ccctctgtcc ctgcctgtga cccctggcga gcctgcctcc 60 atctcctgcc ggtcctccca gtccctggtg cactccaccg gcaacaccta tctgcactgg 120 tatctgcaga agcctggcca gtctcctcag ctgctgatct acaaggtgtc caaccggttc 180 tccggcgtgc ctgaccggtt ctctggctcc ggctccggca ccgacttcac cctgaagatc 240 tcccgggtgg aggccgagga cgtgggcgtg tactactgct cccagtccac ccacgtgcct 300 ttcaccttcg gcggaggcac caaggtggag atcaagcgaa ctgtggctgc accatctgtc 360 ttcatcttcc cgccatctga tgagcagttg aaatctggaa ctgcctctgt tgtgtgcctg 420 ctgaataact tctatcccag agaggccaaa gtacagtgga aggtggataa cgccctccaa 480 tcgggtaact cccaggagag tgtcacagag caggacagca aggacagcac ctacagcctc 540 agcagcaccc tgacgctgag caaagcagac tacgagaaac acaaagtcta cgcctgcgaa 600 gtcacccatc agggcctgag ctcgcccgtc acaaagagct tcaacagggg agagtgttag 660 <210> 20 <211> 726 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence containing murine and human residues (Hu2A4 VH3VL3 hcg1,k cDNA sequence - light chain) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(66) <220> <221> CDS <222> (1)..(726) <220> <221> V_region <222> (67)..(402) <220> <221> C_region <222> (403)..(726) <400> 20 atg gac atg cgg gtg ccc gca cag ctg ctg ggc ctg ctg atg ctg tgg 48 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Met Leu Trp 1 5 10 15 gtg tcc ggc tcc tcc ggc gac gtg gtg atg acc cag tcc cct ctg tcc 96 Val Ser Gly Ser Ser Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser 20 25 30 ctg cct gtg acc cct ggc gag cct gcc tcc atc tcc tgc cgg tcc tcc 144 Leu Pro Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 35 40 45 cag tcc ctg gtg cac tcc acc ggc aac acc tat ctg cac tgg tat ctg 192 Gln Ser Leu Val His Ser Thr Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu 50 55 60 cag aag cct ggc cag tct cct cag ctg ctg atc tac aag gtg tcc aac 240 Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn 65 70 75 80 cgg ttc tcc ggc 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acctacgcca tgtactggat caggcaggct 120 cctggcaagg gactggagtg ggtggcccgg atcaggtcca agtccaacaa ctacgctatc 180 tactacgccg actccgtgaa ggaccggttc accatctccc gggacgactc caagaactcc 240 ctgtatctgc agatgaactc cctgaaaacc gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgctcgg 300 ccttactccg actccttcgc ctactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gtccagcgcc 360 tccaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480 aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540 ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcttgggcac ccagacctac 600 atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagagagt tgagcccaaa 660 tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720 tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag gacaccctca tgatctcccg gacccctgag 780 gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac 840 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc 900 acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag 960 tacaagtgca aggtctccaa caaagccctc ccagccccca tcgagaaaac catctccaaa 1020 gccaaagggc agccccgaga accacaggtg tacacgctgc ccccatcccg ggaggagatg 1080 accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc 1140 gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 1200 gactccgacg gctccttctt cctctatagc aagctcaccg tggacaagag caggtggcag 1260 caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 1320 aagagcctct ccctgtcccc gggtaaatga 1350 <210> 23 <211> 1407 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody sequence containing murine and human residues (Hu2A4 VH3VL3 hcg1,k cDNA sequence - heavy chain) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <220> <221> CDS <222> (1)..(1407) <220> <221> V_region <222> (58)..(414) <220> <221> C_region <222> (415)..(1407) <400> 23 atg gag ttc ggc ctg tcc tgg ctg ttc ctg gtg gcc atc ctg aag ggc 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 gtg cag tgc gag gtg cag ctg gtc gag tcc ggc gga ggc ctg gtg cag 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 cct ggc ggc tcc ctg aga ctg tcc tgc gcc gcc tcc ggc ttc acc ttc 144 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 aac acc tac gcc atg tac tgg atc agg cag gct cct ggc aag gga ctg 192 Asn Thr Tyr Ala Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg gtg gcc cgg atc agg tcc aag tcc aac aac tac gct atc tac 240 Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Ile Tyr 65 70 75 80 tac gcc gac tcc gtg aag gac cgg ttc acc atc tcc cgg gac gac tcc 288 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 85 90 95 aag aac tcc ctg tat ctg cag atg aac tcc ctg aaa acc gag gac acc 336 Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr 100 105 110 gcc gtg tac tac tgc gct cgg cct tac tcc gac tcc ttc gcc tac tgg 384 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Tyr Ser Asp Ser Phe Ala Tyr Trp 115 120 125 ggc cag ggc acc ctg gtg acc gtg tcc agc gcc tcc acc aag ggc cca 432 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 tcg gtc ttc ccc ctg gca ccc tcc tcc aag agc acc tct ggg ggc aca 480 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 gcg gcc ctg ggc tgc ctg gtc aag gac tac ttc ccc gaa ccg gtg acg 528 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 gtg tcg tgg aac tca ggc gcc ctg acc agc ggc gtg cac acc ttc ccg 576 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 gct gtc cta cag tcc tca gga ctc tac tcc ctc agc agc gtg gtg acc 624 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 gtg ccc tcc agc agc ttg ggc acc cag acc tac atc tgc aac gtg aat 672 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 cac aag ccc agc aac acc aag gtg gac aag aga gtt gag ccc aaa tct 720 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 tgt gac aaa act cac aca tgc cca ccg tgc cca gca cct gaa ctc ctg 768 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 245 250 255 ggg gga ccg tca gtc ttc ctc ttc ccc cca aaa ccc aag gac acc ctc 816 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 atg atc tcc cgg acc cct gag gtc aca tgc gtg gtg gtg gac gtg agc 864 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 cac gaa gac cct gag gtc aag ttc aac tgg tac gtg gac ggc gtg gag 912 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 gtg cat aat gcc aag aca aag ccg cgg gag gag cag tac aac agc acg 960 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320 tac cgt gtg gtc agc gtc ctc acc gtc ctg cac cag gac tgg ctg aat 1008 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 ggc aag gag tac aag tgc aag gtc tcc aac aaa gcc ctc cca gcc ccc 1056 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 340 345 350 atc gag aaa acc atc tcc aaa gcc aaa ggg cag ccc cga gaa cca cag 1104 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 gtg tac acg ctg ccc cca tcc cgg gag gag atg acc aag aac cag gtc 1152 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 agc ctg acc tgc ctg gtc aaa ggc ttc tat ccc agc gac atc gcc gtg 1200 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 gag tgg gag agc aat ggg cag ccg gag aac aac tac aag acc acg cct 1248 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 ccc gtg ctg gac tcc gac ggc tcc ttc ttc ctc tat agc aag ctc acc 1296 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 gtg gac aag agc agg tgg cag cag ggg aac gtc ttc tca tgc tcc gtg 1344 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 atg cat gag gct ctg cac aac cac tac acg cag aag agc ctc tcc ctg 1392 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 tcc ccg ggt aaa tga 1407 Ser Pro Gly Lys 465 <210> 24 <211> 468 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Construct <400> 24 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45 Asn Thr Tyr Ala Met Tyr Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Arg Ile Arg Ser Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Ile Tyr 65 70 75 80 Tyr Ala Asp Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser 85 90 95 Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr 100 105 110 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Pro Tyr Ser Asp Ser Phe Ala Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 130 135 140 Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr 145 150 155 160 Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr 165 170 175 Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro 180 185 190 Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr 195 200 205 Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn 210 215 220 His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser 225 230 235 240 Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu 245 250 255 Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu 260 265 270 Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser 275 280 285 His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 290 295 300 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr 305 310 315 320 Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn 325 330 335 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro 340 345 350 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 355 360 365 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 370 375 380 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 385 390 395 400 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 405 410 415 Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 420 425 430 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 435 440 445 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 450 455 460 Ser Pro Gly Lys 465

Claims (86)

  1. (a) 항원에 결합하기 위해 항체 2A4(ATCC 수탁 번호 PTA-9662) 또는 항체 7D8(ATCC 수탁 번호 PTA-9468)과 특이적으로 경쟁하고, 약 1mg/mL 내지 약 100mg/mL 범위 내의 농도로 존재하는, 항체 2A4 또는 항체 7D8의 키메라 버젼 또는 사람화된 버젼 또는 이들의 단편;
    (b) 약 20mM 내지 약 30mM 범위 내의 농도로 존재하는 히스티딘 완충제;
    (c) 약 210mM 내지 약 250mM 범위 내의 농도로 존재하는 트레할로스; 및
    (d) 약 0.005중량% 내지 약 0.05중량% 범위 내의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 20을 포함하는, 약제학적 제형으로서,
    상기 약제학적 제형은, 약 6 내지 약 7 범위 내의 pH를 특징으로 하는, 약제학적 제형.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체가, 항체 2A4의 사람화된 버젼인, 약제학적 제형.
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 약제학적 제형.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 약제학적 제형.
  5. 제3항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 5에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 약제학적 제형.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 14 내지 서열번호 16 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 약제학적 제형.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 약제학적 제형.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8에 제시된 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11에 제시된 3개의 상보성 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 약제학적 제형.
  9. 제1항에 있어서, 상기 항체가, ATCC 수탁 번호 PTA-9468에 의해 생성된 항체 7D8의 사람화된 버젼 또는 키메라 버젼인, 약제학적 제형.
  10. 제1항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 12, 서열번호 7 및 서열번호 8에 제시된 3개의 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11에 제시된 3개의 상보성 영역을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는, 약제학적 제형.
  11. 제1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 약 5mg/mL 내지 약 15mg/mL 범위 내의 농도로 존재하는, 약제학적 제형.
  12. 제11항에 있어서, 상기 항체가 약 10mg/mL의 농도로 존재하는, 약제학적 제형.
  13. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 약 25mg/mL 내지 약 75mg/mL 범위 내의 농도로 존재하는, 약제학적 제형.
  14. 제13항에 있어서, 상기 항체가 약 50mg/mL의 농도로 존재하는, 약제학적 제형.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히스티딘 완충제가 약 25mM의 농도로 존재하는, 약제학적 제형.
  16. 제15항에 있어서, 상기 히스티딘 완충제가 L-히스티딘 및 L-히스티딘 HCl 일수화물을 포함하는, 약제학적 제형.
  17. 제16항에 있어서, 상기 L-히스티딘이 약 16mM 내지 약 22mM 범위 내의 농도로 존재하고, 상기 L-히스티딘 HCl 일수화물이 약 4mM 내지 약 8mM 범위 내의 농도로 존재하는, 약제학적 제형.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 트레할로스가 약 230mM의 농도로 존재하는, 약제학적 제형.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 약 300mOsm/kg의 삼투질농도(osmolality)를 특징으로 하는, 약제학적 제형.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체의 약 10% 미만이 약제학적 제형 중에서 응집체로서 존재하는, 약제학적 제형.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 증량제를 추가로 포함하는, 약제학적 제형.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 무균인, 약제학적 제형.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 동결 및 해동시에 안정한, 약제학적 제형.
  24. (a) 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 14 내지 서열번호 16 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고, 약 10mg/mL의 농도로 존재하는 항체;
    (b) 약 25mM의 농도로 존재하는 히스티딘 완충제;
    (c) 약 230mM의 농도로 존재하는 트레할로스;
    (d) 약 0.2g/L의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 20; 및
    (e) 약 6.5의 pH
    를 포함하는, 약제학적 제형.
  25. 제24항에 있어서, 상기 항체가, 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 서열번호 15에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하는, 약제학적 제형.
  26. (a) 항체 2A4(ATCC 수탁 번호 PTA-9662), 항체 7D8(ATCC 수탁 번호 PTA-9468), 또는 항원에 결합하기 위해 2A4 또는 7D8과 특이적으로 경쟁하는 항체 2A4 또는 항체 7D8의 키메라 버젼 또는 사람화된 버젼, 또는 이들의 단편이고, 약 50mg/mL 내지 약 100mg/mL 범위 내의 농도로 존재하는, 항체;
    (b) 완충제;
    (c) 비환원당; 및
    (d) 비이온성 계면활성제
    를 포함하는, 약제학적 제형.
  27. (a) 항체 2A4(ATCC 수탁 번호 PTA-9662) 또는 항체 7D8(ATCC 수탁번호 PTA-9468)의 사람화된 버젼 또는 이의 항원 결합 단편;
    (b) 히스티딘;
    (c) 트레할로스; 및
    (d) 폴리소르베이트 20
    을 포함하는, 항체의 동결건조 제형.
  28. 제27항에 있어서, 상기 제형이, 재구성될 때에 약 6 내지 약 7의 pH를 갖는, 동결건조 제형.
  29. 제28항에 있어서, 상기 제형이, 재구성될 때에 약 6.5의 pH를 갖는, 동결건조 제형.
  30. 제27항에 있어서, 약 100mg 내지 약 1000mg의 항체를 포함하는, 동결건조 제형.
  31. 제27항에 있어서, 상기 폴리소르베이트 20이 약 0.005중량% 내지 약 0.05중량% 범위 내의 농도로 존재하는, 동결건조 제형.
  32. 제27항에 있어서,
    (a) 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14 내지 서열번호 16 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고, 약 10mg/mL의 농도로 존재하는, 항체;
    (b) 약 25mM의 농도로 존재하는 히스티딘 완충제;
    (c) 약 230mM의 농도로 존재하는 트레할로스;
    (d) 약 0.2g/L의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 20; 및
    (e) 약 6.5의 pH
    를 포함하는 수용액을 수득하기 위한 재구성을 가능하게 하는, 동결건조 제형.
  33. 제32항에 있어서, 상기 동결건조 제형이 약 100mg의 항체를 포함하고, 무균수로의 재구성을 가능하게 하는, 동결건조 제형.
  34. 서열번호 13을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
  35. 제34항에 있어서, 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
  36. 제35항에 있어서, 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
  37. 서열번호 14 내지 서열번호 16 중 어느 하나를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
  38. 제37항에 있어서, 서열번호 15를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
  39. 제38항에 있어서, 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
  40. 제39항에 있어서, 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 핵산.
  41. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는, 벡터.
  42. 제34항 및 제38항의 핵산을 포함하는, 벡터.
  43. 제35항 및 제39항의 핵산을 포함하는, 벡터.
  44. 제36항 및 제40항의 핵산을 포함하는, 벡터.
  45. 제34항 내지 제40항 중 어느 한 항의 핵산이 숙주 세포의 게놈 내에 안정하게 혼입된, 숙주 세포.
  46. 제45항에 있어서, 상기 숙주 세포가 CHO 세포인, 숙주 세포.
  47. 제45항에 있어서, 서열번호 13을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 서열번호 14 내지 서열번호 16 중 어느 하나를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 숙주 세포의 게놈 내에 안정하게 혼입된, 숙주 세포.
  48. 제38항에 있어서, 서열번호 19를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 서열번호 22를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 숙주 세포의 게놈 내에 안정하게 혼입된, 숙주 세포.
  49. 제38항에 있어서, 서열번호 20을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 및 서열번호 23을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산이 숙주 세포의 게놈 내에 안정하게 혼입된, 숙주 세포.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 숙주 세포가 CHO 세포인, 숙주 세포.
  51. (a) 사람화된 2A4 항체의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 하나 이상의 핵산이 포유동물 세포의 게놈 내로 안정하게 혼입된 포유동물 세포를 배양하여, 상기 세포가 항체를 세포 배양 배지에 분비하도록 하고, 상기 항체를 상기 세포 배양 배지로부터 정제하는 단계; 및
    (b) 제1항의 약제학적 제형을 제조하는 단계
    를 포함하는, 약제학적 제형의 제조 방법.
  52. 제51항에 있어서, 상기 사람화된 2A4 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산이, 서열번호 13을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 사람화된 2A4 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산이, 서열번호 14 내지 서열번호 16 중 어느 하나를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  53. 제52항에 있어서, 상기 사람화된 2A4 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산이, 서열번호 13을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 사람화된 2A4 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산이, 서열번호 15를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  54. 제53항에 있어서, 상기 사람화된 2A4 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 19의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 사람화된 2A4 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 22의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 사람화된 2A4 항체의 경쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 20의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고, 상기 사람화된 2A4 항체의 중쇄를 암호화하는 핵산이 서열번호 23의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 방법.
  56. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 물리적 안정성, 화학적 안정성 및 생물학적 활성으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 제형 중의 항체의 하나 이상의 특성을 평가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  57. 제51항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물이 CHO 세포인, 방법.
  58. 아밀로이드 단백질 피브릴의 존재를 특징으로 하는 아밀로이드증을 갖거나 가질 위험이 있는 사람 환자에게 제1항 내지 33항 중 어느 한 항에 따른 약제학적 제형의 유효 용량을 투여하는 단계를 포함하는, 아밀로이드 단백질 피브릴의 존재를 특징으로 하는 아밀로이드증을 갖거나 가질 위험이 있는 사람 환자의 치료학적 또는 예방학적 치료 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 사람 환자가, 아밀로이드 A 단백질 피브릴의 존재를 특징으로 하는 아밀로이드 A 아밀로이드증을 갖는, 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 제형이 제25항의 제형인, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 사람 환자가, 아밀로이드 경쇄-유형 단백질 피브릴의 존재를 특징으로 하는 AL 아밀로이드증을 갖는, 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 제형이 제25항의 제형인, 방법.
  63. 제61항 또는 제62항에 있어서, 상기 환자가 또한 멜팔란(melphalan), 보르테조밉(bortezomib), 레놀리도마이드(lenolidomide) 또는 카르필조밉(carfilzomib) 중 1종 또는 2종으로 치료되는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, 상기 환자가, 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 제형으로의 치료 전에 멜팔란 및/또는 보르테조밉으로 치료되는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 환자가, 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 제형으로의 치료와 동시에 멜팔란 및/또는 보르테조밉으로 치료되는, 방법.
  66. 제64항에 있어서, 상기 환자가, 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항의 제형으로의 치료 후에 멜팔란 및/또는 보르테조밉으로 치료되는, 방법.
  67. 제58항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, AL 아밀로이드증이 B 림프구 계통의 이혼화증과 연관되어 있는, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 이혼화증이 악성 종양인, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 악성 종양이 다발성 골수종인, 방법.
  70. 제58항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이 다중 용량으로 투여되는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상기 제형이 약 1일 내지 약 1년 범위 내의 빈도로 투여되는, 방법.
  72. 제71항에 있어서, 상기 빈도가 약 2주 내지 약 3개월 범위 내인, 방법.
  73. 제58항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제형이, 사람화된 2A4 약물 물질 약 10mg 내지 약 5000mg 범위 내의 용량으로 정맥내 투여되는, 방법.
  74. 제73항에 있어서, 상기 제형이, 사람화된 2A4 약물 물질 약 30mg 내지 약 2500mg 범위 내의 용량으로 약 2주 내지 약 2개월 범위 내의 빈도로 투여되는, 방법.
  75. 제73항 또는 제74항에 있어서, 상기 제형이 1개월에 1회 투여되는, 방법.
  76. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용량이, 사람화된 2A4 약물 물질 약 30mg인, 방법.
  77. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용량이, 사람화된 2A4 약물 물질 약 100mg인, 방법.
  78. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용량이, 사람화된 2A4 약물 물질 약 300mg인, 방법.
  79. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용량이, 사람화된 2A4 약물 물질 약 1000mg인, 방법.
  80. 제73항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용량이, 사람화된 2A4 약물 물질 약 2500mg인, 방법.
  81. 아밀로이드 피브릴, 침착물 또는 프레피브릴(prefibril) 응집체의 존재를 특징으로 하는 경쇄(AL) 아밀로이드증을 갖거나 가질 위험이 있는 사람 환자를 치료학적으로 또는 예방학적으로 치료하는 방법으로서, 상기 사람 환자에게,
    (a) 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14 내지 서열번호 16 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고, 약 10mg/mL의 농도로 존재하는, 항체;
    (b) 약 25mM의 농도로 존재하는 히스티딘 완충제;
    (c) 약 230mM의 농도로 존재하는 트레할로스;
    (d) 약 0.2g/L의 농도로 존재하는 폴리소르베이트 20; 및
    (e) 약 6.5의 pH
    를 포함하는 약제학적 제형의 유효 용량을 투여함을 포함하는, 아밀로이드 피브릴, 침착물 또는 프레피브릴 응집체의 존재를 특징으로 하는 경쇄(AL) 아밀로이드증을 갖거나 가질 위험이 있는 사람 환자를 치료학적으로 또는 예방학적으로 치료하는 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 용량이, 약 1주마다 내지 대략 분기마다(quarterly)의 빈도로 정맥내 또는 피하 투여되는 항체 약 0.5mg/kg 내지 약 30mg/kg인, 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 투여 빈도가 28일에 1회인, 방법.
  84. 제82항에 있어서, 상기 용량이 약 0.5mg/kg 내지 약 8mg/kg인, 방법.
  85. 제82항에 있어서, 상기 용량이 약 8mg/kg 내지 약 30mg/kg인, 방법.
  86. (a) 약 100mg 항체를 분말 형태로 포함하는 바이알;
    (b) 상기 항체의 재구성에 관한 지침서; 및
    (c) 주입을 위해 재구성된 상기 항체의 제조에 관한 지침서
    를 포함하는, 약제품(pharmaceutical product)으로서,
    (i) 상기 항체는, 서열번호 13에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 및 서열번호 14 내지 서열번호 16 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄를 포함하고;
    (ii) 상기 재구성 지침서는, 10mL의 실용량(extractable volume)으로의 주입을 위한 물에 의한 재구성을 요구하는, 약제품.
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