KR20140057244A - 혈소판으로부터 얻어진 조성물을 포함하는 성장 인자를 위한 프로세스 - Google Patents
혈소판으로부터 얻어진 조성물을 포함하는 성장 인자를 위한 프로세스 Download PDFInfo
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Abstract
보체의 제거 및 면역글로불린의 감소를 위해, 그의 온도를 증가시키기 위한 방출된 성장 인자를 함유하는 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액을 열처리하는 단계, 및 용이하게 수송, 취급 및 저장될 수 있는, 최종 건조 조성물을 수득하기 위하여 혈장 또는 상청액을 동결 건조하는 단계를 포함하므로 서 혈액 화합물을 사용한 주기적 또는 만성적 치료를 용이하게 하는, 성장 인자를 함유하는 조성물을 수득하기 위한 방법. 최종 건조 조성물이 재현탁 될 때, 그의 생물학적 성질이 그대로 유지된 습윤 조성물이 다시 수득 되는 것으로 나타났다.
Description
본 발명은 혈액 화합물로부터, 세포의 혈액 성분 (혈소판(platelets), 적혈구(erythrocytes) 및 백혈구(white blood cells))의 존재 또는 부재하에, 성장 인자를 함유하는 조성물을 수득하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법의 수단에 의해 수득된 성장 인자를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
환자의 혈액으로부터 수득된 성장 인자를 함유하는 혈액 화합물의 제조는 선행 기술에 광범위하게 공지되어 있다. 성장 인자를 함유하는 상기 혈액 화합물은 조직 재생의 유발 및 촉진, 특정 유형의 질환 및 장애에서 통증 감소, 및 기타 다중 용도에 관하여, 매우 중요한 생물학적 성질을 갖는 것으로 나타났다.
예로서, 본 발명의 출원인과 동일한 출원인에 의한 특허 출원 WO0044314A1호는, 자가 혈액 혈장(autologous blood plasma)으로부터의 겔의 제조 방법에 관한 것이며, 그 겔은 성장 인자가 풍부하며 및 환자 자신의 혈액으로부터 수득된다; 상기 제조는 이 역시 본 출원인에 의한 더 최근의 특허 출원 WO2010130851A2호에서 업데이트되었다. 양 방법은 겔상(gel-like) 컨시스턴시(consistency)를 얻을 때까지 혈장을 활성화하고(즉, 방출될 혈장 혈소판에 함유된 성장 인자를 유발) 및 혈장을 응고시키기 위하여 환자 혈액의 원심 분리, 혈소판 풍부 혈장의 분리 및 혈소판 풍부 혈장에 염화 칼슘의 첨가와 같은 일반적인 단계를 공유한다.
또 다른 공지의 예는 특허 ES2221770B2호에 개시된다. 이 특허는 성장 인자가 풍부하며 매우 유익한 생물학적 성질을 갖는 혈액 화합물의 제조 방법에 관한 것이다. 이 경우, 화합물은 액체 형태이다. 특히, 화합물은 응고를 유도하고 및 후속하여 상기 성장 인자 풍부 혈장의 수축 후에 나타나는 상청액의 액체 상으로부터 수득 되는 성장 인자 풍부 혈액 혈장(growth-factor-rich blood plasma)의 상청액 이다. 이 특허는 또한 다양한 용도의 상청액을 기술하며, 그중에서도 (그의 액체 컨시스턴시로 인한) 안과 질환 및 장애의 치료를 위한 점안 액으로서의 그의 용도이다.
선행 기술의 공지 방법에 따라 제조된 성장 인자를 함유하는 혈장 겔, 상청액 또는 일반적으로 임의의 자가(autologous) 혈액 화합물은, 그들이 사용하려고 하는 적용에 상관없이, 그들이 생물학적 성질을 손실하기 전에 즉시 적용된다는 단점이 존재한다. 이러한 필요성은 방출된 성장 인자를 함유하는 혈액화합물 일 때 특히 중요하다. 그러므로, 혈액 화합물은 실온에서 장기간 지속하기 위해 제조된 것은 아니며, 단백질 및 성장 인자의 분해 및 변성 또는 제품의 가능한 세균 오염을 방지하기 위하여, 그의 즉각적인 적용이 (상청액의 경우, 제조 8시간 내에) 추천된다.
자가 혈액 화합물의 즉각적인 사용의 필요성은 그들이 사용되어 온 적용 (조직 재생, 세포 배양, 급성 적용 또는 심지어 매주 또는 반달마다, 등의 적용)이 상기 즉각적인 사용과 양립할 수 있었으므로 지금까지 제한되어 있지 않다. 그러나, 성장 인자가 있는 자가 혈액 화합물의 새로운 잠재적인 적용은 복용 사이의 시간 간격 감소와 함께 화합물의 연속 침윤(continuous infiltraion) 또는 적용을 필요로 하는 것이 오늘날 부상되고 있다. 현재 알려진 바와 같이, 이들 새로운 적용에서, 자가 혈액 화합물(겔, 상청액, 등)의 용도는, 환자로부터 연속 혈액 추출을 필요로 할 것이다. 명백하게, 이러한 상황은 환자의 삶의 질 및 만성 또는 퇴행성 질환의 장기 치료의 가능성에 매우 부정적인 영향을 줄 수 있다.
성장 인자를 함유하는 혈액 화합물로 치료될 수 있는 만성 또는 퇴행성 질환의 많은 예가 있으나, 혈액 화합물이 즉각적으로 사용되어야 하고 저장될 수 없으므로 현재는 없다: 성장 인자를 함유하는 혈액 화합물의 만성적 또는 반복 투여가 필요한 안과, 중추 신경계 및 퇴행성 관절 질환, 및 일반적으로 이들 모든 질환 또는 장애.
상술한 질환은 이것으로 제한되는 것은 아니지만 하기를 포함한다: 전신성 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus), 면역 체계가 특히 세포 기관으로의 항체의 결합 및 항원-항체 복합체의 형성에 기인하는, 염증 및 조직 손상을 생성하는 것을 특징으로 하는, 결합 조직에 영향을 주는 만성 자가면역 질환; 쇼그렌 증후군, 건조함을 초래하는 외분비샘(exocrine glands)에 주로 영향을 주는 전신성 자가면역 질환; 피부근염(dermatomyositis), 근육 및 피부 염증을 초래하는 결합 조직의 질환; 류마티스 관절염, 다양한 정도의 변형(deformity) 및 기능 장애로 파괴를 점직적으로 초래하는, 주로 관절의 만성 염증을 유발하는 전신성 자가면역 질환. 현재 성장 인자를 함유하는 자가 혈액 조성물이 정기적으로 환자에게 적용될 수 있다면 이들 모든 질환을 가장 효율적으로 늦출 수 있다는 것을 보여주는 연구가 있다.
본 발명의 목적은 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액으로부터 성장 인자를 함유하는 조성물을 수득하는 방법을 제공하는 것이며, 여기에서, 이 방법은 장기간 동안 저장될 수 있으며 용이하게 수송될 수 있는 조성물의 조달을 허용하는 것이며, 이에 따라 조성물은 즉각적인 사용에 적당할 뿐만 아니라 소정 시간에 또는 필요하다고 판단될 때 사용하기에 적당하다. 그러므로, 본 발명에 따른 방법은 환자로부터 지속적인 혈액 추출의 필요 없이, 만성 질환의 치료적 접근을 근거로 정기적으로 사용될 수 있는 조성물의 조달을 허용하며, 따라서 환자의 삶의 질을 향상시킬 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 방법으로부터 수득된 조성물이 그의 생물학적 성질 그대로를 유지하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 방법으로부터 수득된 조성물이 자가면역 질환의 치료용으로 특히 나타낸 개선된 생물학적 성질을 유지하는 것이다.
본 발명의 목적은 여러 단계를 포함하는, 성장 인자를 함유하는 조성물의 수득 방법이다.
우선, 본 방법은 방출된 성장 인자를 함유하는 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액을 제공하는 단계를 포함한다. 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액은 다양한 타입일 수 있다: 성장 인자 풍부 혈장 겔 및 WO0044314A1호, WO2010130851A2호 또는 기타 출원 기술에 개시된 기술에 따라 수득됨; 혈소판 풍부 혈액 혈장의 응고 유도 및 후속하여 수축 후 나타나는 액체 성분으로서 수득된 상청액, 여기에서 상기 상청액은 예를 들어 특허 ES2221770B2호에 기재된 기술에 따라 수득 될 수 있거나; 또는 일반적으로 임의의 혈소판 풍부 혈장.
그후, 본 발명에 따른 방법은 혈액 화합물의 온도가 증가하는 동안, 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액의 열처리 단계를 포함한다. 열 처리는 보체의 제거를 허용하며 및 면역학적 관점에서 상호 반응에 중요한 역할을 하는 혈장 또는 상청액에서 가장 빈번하게 발견되는 면역글로불린 일부의 존재를 감소시킨다. 혈장 또는 상청액 내에 존재하는 보체의 상기 제거 또는 상당한 감소는 면역 체계 질환의 치료를 위한 제품의 적용 가능성을 대단히 향상시킨다.
또한, 본 발명에 따른 방법은 습기가 실질적으로 없는 최종 조성물을 수득하기 위하여 혈액 화합물이 동결 건조되는 단계를 포함한다.
본 발명에 따라, 혈장 또는 상청액의 열처리 및 동결 건조가 수행되는 단계의 순서는 차이가 없다, 즉 이들은 임의의 순서로 수행될 수 있다.
게다가, 본 발명에 따른 방법은 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액을 여과하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 단계는 동결 건조 전에 수행될 수 있지만, 동결 건조 전 즉각적으로 수행될 필요는 없다; 예를 들어, 열처리가 동결 건조 전에 수행되는 경우, 여과 단계는 열처리 전에 수행될 것이다.
자가 혈소판 풍부 혈장 또는 자가 혈소판 풍부 혈장의 상청액으로부터 조성물을 수득하기 위한 방법은 기존의 습윤 혈장 또는 상청액 보다 많은 장점을 갖는 최종 건조 조성물을 허용한다. 중요한 장점은 건조 조성물이 취급 및 수송에 있어서 습윤 화합물(액체, 다소 점성 겔 또는 기타 컨시스턴시)보다 현저하게 용이하다는 것이다. 더욱이, 그것은 물을 함유하지 않기 때문에, 건조 조성물은 실온에서 유지될 수 있으며 및 장기간 안정성을 갖는 제품이므로 심지어 무한정의 시간 동안 저장될 수도 있다(및 그 결과 그의 사용은 제조 후 즉각적으로 사용될 필요가 없기 때문에 연기될 수 있다). 또한, 물이 결여되었다는 사실은 오염될 위험을 제거한다. 건조 조성물의 또 다른 장점은 그의 원래의 상태로 신속하게 복원될 수 있다는 것이다; 이 방법은 통상적으로 사용된 등장(isotonic) 용매(예컨대 물) 내에서 건조 조성물을 간단히 재현탁 시킴으로 서 현장에서 용이하게 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 건조 조성물의 추가적인 장점은 건조 조성물이 투여될 목적으로 습윤 상태로 복구하기 위해 재현탁 될 때 상기 재현탁된 조성물은 본 발명에 따른 방법을 수행하기 전에 습윤 혈장 또는 상청액의 생물학적 성질을 보존한다는 것을 나타내었다. 다시 말해서, 재현탁된 조성물은 생물학적 활성을 갖는 성장인자의 유사 농도를 유지하며; 또한, 재현탁 된 조성물에 의해 세포 증식(cell proliferation), 세포 이동(cell migration) 및 주화성(chemotaxis)에 대한 효과가 유도되며 및 성장 인자의 자가분비(autocrine) 및 측분비(paracrine) 합성은 습윤 혈장 또는 상청액의 것과 동일하다. 생물학적 성질의 보존은, 그 중에서도, 본 발명에 따른 방법 동안 제품에 적용된 적절한 온도의 결과이다. 반면, 그 방법의 여러 단계에서 사용된 낮은 온도는, 방법 동안 일어날 수 있는 혈장 또는 상청액 내에 함유된 휘발성 성분의 손실을 최소로 유지한다는 것을 확실하게 한다. 저온은 또한 세균 오염에 대하여 낮은 오염을 보장하며 및 그 제제는 효소에 관하여 임의의 변경을 허용하지 않는다(효소-함유 제제는, 본 발명의 혈장 또는 상청액의 경우에서처럼, 그들이 손상되는 것을 방지하기 위하여 저온에서 취급된다 ).
본 발명의 또 다른 매우 유익한 효과는 건조 조성물이며, 및 그러므로 최종 재현탁된 조성물은 그의 보체가 없거나 또는 감소 된 양을 함유하며, 이에 따라 재현탁된 최종 조성물이 다수의 자가면역 질환의 치료에 특히 최적이 되도록 한다.
전술한 모든 것은 건조 조성물이 비즉각적인 치료(non-immediate tretments), 예컨대 정기적으로 만성적 장애의 치료를 위해, 및 특히, 만성적 자가면역 질환의 치료를 위해 사용될 수 있도록 한다. 이러한 방식으로, 본 발명에 따라 수득된 건조 조성물이, 예를 들어, 복용량으로 저장된다면, 상기 조성물을 사용한 만성적 치료는 매우 간단한 방법으로 전환될 것이며: 만성 환자는 두려움 또는 곤란함이 없이 어느 곳에서나 (예를 들어, 용기 내에) 자신의 복용량을 휴대할 수 있고; 복용량을 투여하기 위하여, 환자는 그것을 단순히 모이스튼(moisten) 또는 재현탁시키고, 일단 원래의 습윤 컨시스턴시(humid consistency)(액체 등)이 복원되면, 조성물을 적용하기 위해 진행된다.
본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 조성물과 연관된 모든 특정 특징 및 장점이 하기와 같이 요약될 수 있다: 최적 안정성; 다수의 자가면역 질환에 대한 특정 지시; 간단, 신속 및 완전한 용해도; 비제한적 저장; 외부 유해 인자에 대한 적절한 보호 및 신속한 용해도.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명의 방법에 따라 수득된 성장 인자를 함유하는 조성물이다. 상기 조성물은 상술한 모든 장점을 나타낸다.
본 발명의 상세한 설명은 예시 및 비 제한적으로 의도된, 첨부한 도면으로 서술된다:
도 1은 열처리가 수행되지 않은 종래의 상청액의 혈장액 및 본 발명에 따라 열처리 된 상청액으로 처리된 세 각막에서 제곱 센티미터 당 각막간질세포(keratocytes)(HCK)의 수의 그래프를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따라 열처리 되기 전 및 후에 세 제공자(donors)의 상청액에서 PDGF-AB 레벨의 그래프를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따라 열 처리 되기 전 및 후에 세 제공자의 상청액에서 보체 인자 D 레벨을 나타낸다.
도 4는 열 처리가 수행되지 않은 종래의 상청액의 혈장액, 및 본 발명에 따라 열처리 된 상청액으로 처리된 세 각막에서 제곱 센티미터당 섬유모세포(fibroblasts)(HConF)의 수의 그래프를 나타낸다.
도 5는 동결건조되지 않은 및 본 발명에 따라 동결 건조된 양자의, 세 제공자로부터의 상청액 중 성장 인자 PDGF-AB 및 TGF-β1의 평균 농도의 그래프를 나타낸다.
도 6은 동결건조되지 않은 및 본 발명에 따라 동결 건조된 양자의, 세 제공자로부터의 상청액 중 성장 인자 VEGF 및 EGF의 평균 농도의 그래프를 나타낸다.
도 7은 상기 상청액을 여과하기 전 및 후에, 세 상청액 액체 중 제곱 센티미터 당 함유된 결막섬유모세포(conjunctival fibroblasts)(HConF)의 양의 그래프를 나타낸다.
도 8은 여과된 및 여과되지 않은 상청액 중 성장 인자 TGF-β1의 평균 농도의 그래프를 나타낸다.
도 9는 여과된 및 여과되지 않은 상청액 중 성장 인자 IGF-I의 평균 농도의 그래프를 나타낸다.
도 10은 종래의 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액 및 본 발명에 따라 여과, 열처리, 및 동결 건조된 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액으로 72시간 처리 후 인간 각막 간질세포(human corneal keratocyte)(HCK)로부터 유도된 일차 세포의 수의 그래프를 나타낸다.
도 11은 종래의 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액 및 본 발명에 따라 여과, 열처리, 및 동결 건조된 후, 후속하여 재현탁 된 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액으로 72시간 처리 후 인간 결막섬유모세포(HConF)로부터 유도된 일차 세포의 수의 그래프를 나타낸다.
도 12는 종래의 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액 및 본 발명에 따라 여과, 열처리, 및 동결 건조된 후, 후속하여 재현탁 된 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액으로 처리 후 인간 각막 간질세포(HCK) 세포 배양액 내의 이동된 세포(migrated cell)의 수의 그래프를 나타낸다.
도 13은 종래의 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액 및 본 발명에 따라 여과, 열처리, 및 동결 건조된 후, 후속하여 재현탁 된 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액으로 처리 후 결막섬유모세포(conjunctival fibroblast)(HCF) 세포 배양액 내의 이동된 세포의 수의 그래프를 나타낸다.
도 14는 세 개의 상이한 배지: 열처리 되지 않은 활성화된 혈소판 풍부 혈장, 본 발명에 따라 열처리 되었지만 열처리 전에 활성화되지 않은 혈소판 풍부 혈장, 및 활성화 및 이어서 본 발명에 따라 열처리 된 혈소판 풍부 혈장에서 수행된 인간 결막 섬유모세포(HConF)의 일차 세포 배양의 농도의 그래프를 나타낸다.
도 15는 이전의 도면에서 나타낸 경우에서와 같이 동일한 배지를 사용하여, 인간 각막 간질세포(HCK)의 일차 세포 배양의 농도의 그래프를 나타낸다.
도 16은 이전의 두 도면에서 나타낸 경우에서의 세포 배양 배지로서 역할을 한 세 조성물 내의 상이한 성장 인자의 농도의 몇몇 그래프를 나타낸다.
도 1은 열처리가 수행되지 않은 종래의 상청액의 혈장액 및 본 발명에 따라 열처리 된 상청액으로 처리된 세 각막에서 제곱 센티미터 당 각막간질세포(keratocytes)(HCK)의 수의 그래프를 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따라 열처리 되기 전 및 후에 세 제공자(donors)의 상청액에서 PDGF-AB 레벨의 그래프를 나타낸다.
도 3은 본 발명에 따라 열 처리 되기 전 및 후에 세 제공자의 상청액에서 보체 인자 D 레벨을 나타낸다.
도 4는 열 처리가 수행되지 않은 종래의 상청액의 혈장액, 및 본 발명에 따라 열처리 된 상청액으로 처리된 세 각막에서 제곱 센티미터당 섬유모세포(fibroblasts)(HConF)의 수의 그래프를 나타낸다.
도 5는 동결건조되지 않은 및 본 발명에 따라 동결 건조된 양자의, 세 제공자로부터의 상청액 중 성장 인자 PDGF-AB 및 TGF-β1의 평균 농도의 그래프를 나타낸다.
도 6은 동결건조되지 않은 및 본 발명에 따라 동결 건조된 양자의, 세 제공자로부터의 상청액 중 성장 인자 VEGF 및 EGF의 평균 농도의 그래프를 나타낸다.
도 7은 상기 상청액을 여과하기 전 및 후에, 세 상청액 액체 중 제곱 센티미터 당 함유된 결막섬유모세포(conjunctival fibroblasts)(HConF)의 양의 그래프를 나타낸다.
도 8은 여과된 및 여과되지 않은 상청액 중 성장 인자 TGF-β1의 평균 농도의 그래프를 나타낸다.
도 9는 여과된 및 여과되지 않은 상청액 중 성장 인자 IGF-I의 평균 농도의 그래프를 나타낸다.
도 10은 종래의 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액 및 본 발명에 따라 여과, 열처리, 및 동결 건조된 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액으로 72시간 처리 후 인간 각막 간질세포(human corneal keratocyte)(HCK)로부터 유도된 일차 세포의 수의 그래프를 나타낸다.
도 11은 종래의 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액 및 본 발명에 따라 여과, 열처리, 및 동결 건조된 후, 후속하여 재현탁 된 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액으로 72시간 처리 후 인간 결막섬유모세포(HConF)로부터 유도된 일차 세포의 수의 그래프를 나타낸다.
도 12는 종래의 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액 및 본 발명에 따라 여과, 열처리, 및 동결 건조된 후, 후속하여 재현탁 된 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액으로 처리 후 인간 각막 간질세포(HCK) 세포 배양액 내의 이동된 세포(migrated cell)의 수의 그래프를 나타낸다.
도 13은 종래의 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액 및 본 발명에 따라 여과, 열처리, 및 동결 건조된 후, 후속하여 재현탁 된 성장 인자(PRGF)가 풍부한 혈장의 상청액으로 처리 후 결막섬유모세포(conjunctival fibroblast)(HCF) 세포 배양액 내의 이동된 세포의 수의 그래프를 나타낸다.
도 14는 세 개의 상이한 배지: 열처리 되지 않은 활성화된 혈소판 풍부 혈장, 본 발명에 따라 열처리 되었지만 열처리 전에 활성화되지 않은 혈소판 풍부 혈장, 및 활성화 및 이어서 본 발명에 따라 열처리 된 혈소판 풍부 혈장에서 수행된 인간 결막 섬유모세포(HConF)의 일차 세포 배양의 농도의 그래프를 나타낸다.
도 15는 이전의 도면에서 나타낸 경우에서와 같이 동일한 배지를 사용하여, 인간 각막 간질세포(HCK)의 일차 세포 배양의 농도의 그래프를 나타낸다.
도 16은 이전의 두 도면에서 나타낸 경우에서의 세포 배양 배지로서 역할을 한 세 조성물 내의 상이한 성장 인자의 농도의 몇몇 그래프를 나타낸다.
본 발명의 목적은 혈액의 세포 성분(혈소판, 적혈구, 및 백혈구)의 존재 또는 부재하에 성장 인자를 함유하는 조성물을 수득하는 방법이며, 이 방법은 하기 단계를 포함한다:
a) 혈장 또는 상청액이 임의의 적용 가능한 제조 방법에 따라 제조될 수 있는, 방출된 성장 인자를 함유하는 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액을 제공하는 단계. 방출된 성장 인자를 갖는 혈장 또는 상청액은 적용 가능한 물질의 모든 수단(염화 칼슘, 트롬빈, 칼슘염, 2가 이온을 함유하는 기타 물질 또는 그의 조합, 또는 응고를 활성화하는 임의의 기타 시스템)에 의해 혈소판 내에 함유된 성장 인자가 방출되고 및 응고 캐스케이드는 활성화된 것이며, 그에 의해 단백질 및 혈장 및 혈소판-관련 성장 인자 양자가 풍부한 제품을 수득한다. 혈장 또는 상청액은 다양한 타입일 수 있다: WO0044314A1호, WO2010130851A2호 또는 기타 적용가능한 기술에 개시된 기술에 따라 수득된 성장 인자 풍부 혈장 겔; 응고 유도 및 후속하여 혈액 혈장의 수축(retraction) 후 나타나는 액체 성분으로서 수득된 상청액, 여기서, 상기 상청액은 특허 ES2221770B2호에 기술된 기술에 따라 수득 될 수 있다; 또는, 일반적으로, 임의의 주어진 방법에 의해 수득된 임의의 혈장 또는 상청액.
b) 면역학적 관점에서 상호 반응(cross reactions)에 중요한 역할을 하는, 혈장 또는 상청액에서 가장 빈번하게 발견되는 면역글로불린의 일부의 존재를 감소시키고 보체를 제거하기 위해 혈장 또는 상청액에 열처리를 가하는 단계. 혈장 또는 상청액에 존재하는 보체의 상기 제거 또는 상당한 감소는 면역 체계 질환에 대한 혈액 화합물의 적용 가능성을 매우 유익하게 한다. 혈액 화합물 내의 보체 시스템의 존재는 면역 체계의 과자극(overstimulation) 및 많은 경우 혈액 화합물이 치료하고자 하는 질환 자체의 종합적 증상에 포함되어 있기 때문에 역효과를 야기할 수 있다는 것은 공지되어 있다. 혈장 보체는 보체(고전적 보체 경로)에 의해 매개된 자가면역 질환(홍반성 낭창(lupus erythematosus), 관절염, 등)에서의 가능한 부작용(adverse reaction) 또는 보체에 의해 또한 매개된 만성 염증성 질환으로부터의 부작용과 같은 다수의 변경에 관련된다. 게다가, 보체 인자의 일부는 염증 및 식균작용(phagocytosis)을 증진시키며 및 세포 및 미생물의 용해를 유도한다. 결과적으로, 면역글로불린(Ig) 중에서 혈액 화합물 내의 가장 빈번히 발견되는 것은 면역글로불린 IgG이며, 그의 주 생물학적 작용중의 일부는 식균작용 동안 입자를 옵소닌화(opsonising) 할 때 식세포(phagocytic cells) 내의 Fc 수용체에 결합 및 항체-매개된 세포독성 동안 NK 세포 내의 수용체에 결합인 보체의 고정이다. 이것이 혈장 또는 상청액 내에 존재하는 보체의 제거 또는 상당한 감소가 면역 체계의 질환에 후자의 적용을 위해 중요한 장점을 갖는 이유이다. 열 처리는 면역 체계 장애가 있는 환자의 요구에 맞춘 최종 조성물의 수득을 가능하게 한다. 면역글로불린에 관하여도, 다양한 IgG는 급성 거부 반응(acute rejection) 공정의 일부에 참여하며 따라서 제형 내의 그들의 존재의 감소는 거부 또는 급성 면역 반응의 위험 없이 다양한 타입의 조직 치료에 도움이 되기 때문에, 그의 전체 또는 일부의 감소는 자가면역 질환을 갖는 환자에게 중요하다.
c) 장기간 저장할 수 있도록 포함하고 있는 거의 모든 물을 제거하고 및 혈장 또는 상청액이 습윤 상태에서 습윤 되지 않은 상태로 통과할 수 있도록 하기 위한 혈장 또는 상청액의 동결 건조 단계.
혈장 또는 상청액이 초기에 활성화된다는 것, 즉 열 처리 전에 방출된 성장 인자를 함유한다는 사실은 놀라운 효과를 제공한다. 한편으로는, 활성화 및 추가의 열처리 후에 수득된 혈장 또는 상청액은 실질적으로 그대로의 섬유소 응괴(fibrin clot)의 응집 및 형성 능을 갖는다. 그것은 또한 그들의 과립 용기로부터 인자를 자유롭게 하는 능력을 그대로 갖는다. 혈장 또는 상청액의 능력이 영향을 받지 않고 남아있다는 사실은 도 14, 15 및 16의 데이터로부터 이해되어 질 수 있다. 도 14는 하기의 세 개의 상이한 세포 배양 배지에서 수행된 인간 결막 섬유모세포(human conjunctival fibroblasts)(HConF)의 일차 세포 배양의 농도 그래프를 나타낸다: 열처리 되지 않은 활성화된 혈소판 풍부 혈장("PRGF"라고 표시함), 본 발명에 따라 열처리 되었지만 열처리 전에 활성화되지 않은 혈소판 풍부 혈장 ("PostAct"로 표시함), 및 활성화되고 그후 본 발명에 따라 열처리 된 혈소판 풍부 혈장("PriorAct"로 표시함). 도시된 바와 같이, 세포 증식은 본 발명의 조성물 ("PriorAct")이 사용된 경우와 활성화되고 열처리 되지 않은 혈장("PRGF")이 사용된 경우 실질적으로 동일하다. 반대로, 세포 증식은 제 1로 열처리 되고 이어서 활성화된 혈소판 풍부 혈장("PostAct")이 세포 배양 배지로 사용된 경우 실질적으로 제로이다. 도 15는 유사한 그래프를 도시하지만, 성장된 인간 각막 간질세포(HCK)를 갖는다. 도 16은, 결과적으로, ELISA에 의해 측정된, 상이한 조성물 내에 존재하는 상이한 성장 인자의 농도를 도시한다. 도시된 바와 같이, 성장 인자 농도는 활성화되고 이어서 본 발명에 따라 열처리 된 혈소판 풍부 혈장("PriorAct"로 표시됨) 및 활성화되고 열처리 되지 않은 혈장 ("PRGF")에서 실질적으로 동일하다. 반대로, 제 1로 열처리 되고 이어서 활성화된 혈소판 풍부 혈장("PostAct")은 전반적으로 매우 악화 된 성장 인자 농도를 나타낸다.
동결 건조는 바람직하게는 애주번트(당류 예컨대 트레할로스, 화학 성분, 등)의 첨가 없이 수행된다. 애주번트는 많은 물질의 동결 건조를 위해 필요하지만, 혈장 또는 상청액은 그들의 도움없이 동결 건조될 수 있으며 및 임의의 애주번트 첨가 없이 동결 건조를 수행하는 것은 높은 생체적합성(biocompatibility)을 갖는 최종 건조 조성물(및 그러므로 환자에게 적용을 위해 재현탁된 조성물) 을 초래하는 것으로 나타났다. 일부 연구는, 예를 들어, 트레할로스 등과 같은 특정 애주번트가 세포 증식에 대하여 부정적인 영향을 갖는다는 것을 입증하였다.
게다가, 그 방법은, 원칙적으로, 혈장 또는 상청액을 열처리 및 동결 건조하는 단계의 수행에 대하여 고정된 순서가 없다는 것을 특징으로 한다. 그럼에도 불구하고, 혈장 또는 상청액을 동결 건조하는 단계 전에 열처리 단계를 수행하는 것이 바람직한데, 그 이유는 먼저(previously) 열 처리된 제품은 그의 유익한 성질 및 잠재력을 모두 함유할 것이므로, 이것은 동결 건조되기 전 이 방법의 목적(보체 및 IgG의 감소)이기 때문이다. 동결 건조가 화합물의 보존 및 저장 능력을 개선하기 위해서 수행되며, 및 따라서 그것이 초기 단계가 아니라 최종을 구성하는 것이 바람직하다는 것을 고려하는 것이 중요하다. 그러므로, 요약하면, 제 1 목적은 제품을 최적화하는 것이고, 제 2 목적은 보존 및 저장에 대한 그의 능력을 개선하는 것이다.
열 처리는 혈장 또는 상청액의 온도를 37℃ 초과로, 바람직하게는 1분 이상의 기간 동안 적절하게 상승시키는 임의의 처리일 수 있다. 예를 들어, 혈장 또는 상청액은 수조(water bath)로 상기 온도에서 및 상기 기간 동안 도입될 수 있다. 37℃가 신체의 온도이며, 뿐만 아니라 보체 및 면역글로불린의 최대 생물학적 활성 단계의 온도라는 사실을 감안할 때, 본 발명에 따라 혈장 또는 상청액이 상술한 성분의 일부를 제거하기 위해 37℃ 초과로 가열되는 것이 바람직하다.
혈장 또는 상청액은 50 내지 60℃(바람직하게는 56℃)의 온도에서 수행하는 것이 특히 바람직한데, 그 이유는 이 온도에서, 보체의 성분은 최적으로 분해되고 및 제품 내에 함유된 단백질 및 성장 인자의 보호는 최대화되기 때문이다. 그러므로, 이 범위 미만의 온도는 배양 중 보체가 혈장 또는 상청액에서 제거되는 것을 보장하지 못하는 것으로 나타났다. 반면, 60-65℃ 초과의 온도에서의 배양은 혈장 또는 상청액 내에 함유된 성장 인자 및 단백질의 변성을 초래할 수 있다. 게다가 혈장 또는 상청액은 20 내지 70 분(바람직하게는 30 내지 60분) 동안 상기 온도에서 수행되는 것이 바람직 한데, 그 이유는 이 기간 동안 보체의 성분도 또한 최적으로 분해되고 및 제품 내에 함유된 단백질 및 성장 인자의 보호도 또한 최대화되기 때문이다.
동결 건조의 단계는 바람직하게는 하기의 하위 단계를 포함한다:
- 혈장 또는 상청액을 0℃ 미만의 온도로 냉동(freezing)하는 단계;
- 0℃ 이하의 온도 및 고 진공에서, 1분 이상 동안 및 혈장 또는 상청액 내에 함유된 대부분의 자유수(free water)를 증발시키는 방식으로 혈장 또는 상청액의 제 1 건조를 수행하는 단계;
- 임의로, 0℃ 이상의 온도 및 고 진공, 저 진공 또는 진공 없이, 1분 이상 동안 및 최종 습기가 1% 미만으로 도달될 때까지 혈장 또는 상청액 내에 함유된 해동된 물을 증발시킴으로 서, 심지어 마지막 극미량의 수증기를 제거시키는 방식으로 혈장 또는 상청액의 제 2 건조를 수행하는 단계;
- 임의로, 0℃ 이상의 온도 및 고 진공, 저 진공 또는 진공 없이, 1분 이상 동안 및 제품에 남아있는 잔류 습기는 증발을 통해 제거하고 그의 습기 함량을 감소시켜 최종 제품의 안정성을 향상시키는 방식으로 혈장 또는 상청액의 제 3 건조를 수행하는 단계.
60 내지 -40℃(바람직하게는 -50℃)의 온도에서 1시간 이상 동안(바람직하게는 2시간 이상 동안) 혈장 또는 상청액을 냉각시키는 것이 특이 유리한데, 그 이유는 이 범위 밖의 온도, 특히 더 낮은 냉동 온도는, 혈장 또는 상청액이 냉동의 결과로서 그의 생물학적 성질을 잃기 때문이다. 그 외에도, 혈액 화합물이 균질 하게 냉각 되도록 하기 위하여 1 시간 이상 동안 혈액 화합물이 냉각되는 것이 바람직하다(이러한 균질성은 동결 건조의 안정성을 보장하고 제품의 생물학적 성질은 변경되지 않는다).
제 1 건조에 관한 것으로서, -60 내지 -40℃의 온도 및 0.05 내지 0.15mBar(바람직하게는 -50℃ 내지 0.1mBar)에서 수행하는 것이 특히 유리하다. 저온 범위는 승화 공정 동안 제품이 완전히 냉동되도록 하기 위해 및 초기 제품의 물리적, 화학적 및 생물학적 성질을 보전하여 동결건조된 제품의 단백질의 잠재적인 변성을 방지하도록 하기 위해 본원에서 사용된다. 공정의 정확한 지속 기간은 동결 건조될 제품의 양에 의존하며 및 충분한 건조를 위해 필요한 얼음의 완전한 승화가 되도록 하기 위하여 확립되었다.
제 2 건조에 관하여, +15 내지 +25℃의 온도 및 0.05 내지 0.15mBar(바람직하게는 +20℃ 및 0.1 mBar)에서 수행하는 것이 특히 유리한데, 그 이유는 이들 조건이 증발을 통해 제품에 남아 있는 임의의 잔류 습기를 제거하고 그의 습기 함량을 1% 미만으로 감소시키게 하여 최종 제품의 안정성을 개선하는 목적을 갖기 때문이다.
최종적으로, +15 내지 +25℃의 온도 및 고 진공(바람직하게는 +20℃ 및 고 진공)에서 제 3 건조를 수행하여, 마지막 극미량의 습기를 제거하고 균일성(uniformity) 및 안정성의 면에서 최적 특징을 갖는 최종 제품을 제공하는 것이 특히 유리하다.
본 발명에 따른 방법은, 결과적으로 건조 조성물의 재현탁에 대하여 부정적인 영향을 줄 수 있는 냉동 공정의 균일성 및 동결 건조 공정의 안정성에 영향을 줄 수 있는 고 분자량 성분, 혈소판 응집체 또는 섬유소의 잔류물의 존재를 제거하거나 또는 방지하기 위하여 혈장 또는 상청액을 여과하는 추가 단계도 또한 포함할 수 있다(동결건조된 제품의 용해 속도는 그것을 구성하는 입자의 크기에 반비례하고, 및 건조 조성물 내에 함유된 큰 입자는 용해를 느리게 하거나 또는 심지어 용해를 불가능하게 한다는 것을 고려되어야 한다). 이러한 추가 공정이 수행될 경우, 혈장 또는 상청액의 여과는 동결 건조 전에 수행되지만, 직전에 할 필요는 없다. 또 다른 주의로서, 혈장 또는 상청액의 여과 단계는, 예를 들어, 방법의 시작에서, 혈장 또는 상청액이 이미 여과되었다면, 필요하지 않다.
방법의
실시예
방법의 실시예는, 결과적으로 성장 인자가 풍부한 상청액으로부터 수득된 건조 조성물로부터 최종 재현탁된 조성물의 제조를 보여주며 본 발명에 따른 방법의 단계를 수행하여, 이후에 설명된다
첫 번째로, 성장 인자 풍부 혈장은 환자로부터 추출된 혈액으로부터 제조된다. 이러한 목적을 위하여, 혈액은 선행 기술에서 공지된 바와 같이 다양한 분획으로 분리하기 위하여 원심분리된다. 후속하여, 혈장 분획은 9ml의 분획관(fractionation tube)에 PTD(혈장 추출 장치, Plasma Extraction Device)의 도움으로 추출된다. 그후 혈장 분획은 활성화되며; 활성화는 분획관 내에 함유된 혈장 부피를 산정하고 후속하여 혈장 밀리리터당 50㎕의 PRGF 활성화제(염화 칼슘 기재 활성화제)를 첨가하여 수행된다. 혈장 활성화는 성장 인자가 혈장 내에 함유된 혈소판으로부터 방출된 것을 말하는 것과 같다.
두 번째로, 상청액은 성장 인자가 풍부한 혈장으로부터 수득된다. 이러한 목적을 위하여, 이미 활성화된 성장 인자 풍부 혈장은 37℃에서 1 시간 내지 1 시간 30분 동안 섬유소 응괴가 완전히 반응될 때까지 히팅 블록(heating block)에서 배양된다. 그후, 분획관은 형성된 섬유소 응괴를 침전시키고 응괴 내에 보유되어 있을 수 있는 가능한 상청액의 최대 용적을 추출하는 두 가지 주요 이유를 위해 10분 동안 1000g에서 원심분리한다. 그 후, 원심 분리 관은 층류 캐비닛(laminar flow cabinet)에 도입하고, 여기에서 샘플의 완전한 멸균이 되도록 개방될 수 있다. 방출된 상청액은 굵은 근육내 바늘(blunt intramuscular needle)이 부착된 10ml 주사기로 수집된다. 그후 바늘은 주사기로부터 제거되며, 0.22㎛ PVDF 여과기가 부착되며 및 상청액은 여과된다. 여과 공정 동안, 여과기가 있는 주사기는 디바이스당 1ml의 여과된 상청액을 투여하는, 다회복용 디스펜서(multidose dispenser)에 연결된다. 최종적으로, 용기는 완전 밀봉(hermetically sealed)된다.
다음, 본 발명에 따른 방법은 여과된 액체 상청액으로부터 최종 건조 조성물을 수득하기 위하여 수행된다. 여과된 상청액이 있는 다회복용 용기는 30 내지 60분 동안 56℃로 먼저 열처리 된 수조(water bath)에 도입함으로 서 열처리 된다. 이 기간 후 용기는 상청액의 부피에 따라 및 샘플이 균질하게(homogeneously) 동결될 때까지 2 내지 8시간의 시간 간격 동안 이들을 동결시키기 위하여 -50℃로 냉각된 동결 건조기로 즉각적으로 도입된다. 이 후, 제 1 건조는 -50℃ 및 0.1mBar에서 최대 24시간 동안 수행된다. 그 후, 제 2 건조는 +20℃ 및 0.1mBar에서 최대 6시간 동안 수행하고, 이어서 +20℃ 및 고 진공에서 최대 12시간 동안 제 3 건조가 수행된다. 수득한 제품은 약간 압축된 것으로 나타나며 및 수용액과 접촉하게 될 때 간단하고 신속하게 재현탁 될 수 있는(즉, 용해되어 상청액 본래의 컨시스턴시로 되돌아 가는) 균일 및 균질한 분말이다.
최종 건조 조성물은 적용되기 위해서 재현탁 될 필요가 있다. 그러므로, 의사 또는 환자는 최종 건조 조성물의 복용량을 용기 안에 있는 소정 부피의 멸균 증류수에 놓고 이어서 습윤 또는 액체 최종 조성물로 다시 수득할 수 있도록 건조 조성물이 완전히 용해될 때까지 용기를 흔들어준다. 이 최종 조성물은 열처리 및 동결 건조 전의 본래의 습윤 상청액의 모든 생물학적 성질을 유지한다. 상기 최종 조성물은 그 후, 예를 들어 점안액으로 서 환자에게 직접 적용될 수 있다.
실험 결과
하기는 성장 인자가 풍부한 혈장의 상청액 상에서 수행된 방법 및 본 발명에 따라 수득된 조성물에 대하여 수행된 세 개의 실험 연구의 결과를 기술한다. 상기 결과에서 도달된 기술적 결론은 또한 하기에 상세히 기술한다.
1. 최종 건조
상청액의
생물학적 효과 및 성장 인자 레벨에 대한 열 처리 온도의 영향
상술한 바와 같이, 적절한 온도에서 본 발명에 따라 수행된 열처리는 상청액의 생물학적 성질을 보존하기 위해 허용한다. 다시 말해, 최종 건조 조성물은 실질적으로 초기 액체 상청액과 동일한 성질을 갖는다.
이와 관련하여, 안구 표면(eye surface) 세포 배양에 대하여 수행된 실험은 열 처리 공정(30분 동안 56℃ 수조)이 각막 간질세포(HCK), 결막 섬유모세포(HConF), 및 각막 상피 세포의 증식에 대한 상청액의 생물학적 효과에 영향을 주지 않았다는 것을 나타낸다. 생체외 배양(in vitro culture)에서 상기 세포의 증가는 열 처리되지 않은 상청액과 유사하였다. 이것은 열 처리를 수행하지 않은 종래의 상청액의 혈장액, 및 본 발명에 따라 열처리된 상청액으로 각기 처리된 세 각막에서 제곱 센티미터당 각막 간질세포(HCK)의 수를 나타내는 도 1에서 관측될 수 있다. 열처리를 수행하지 않은 종래의 상청액의 혈장액에 반응하는 및 본 발명에 따라 열처리 된 상청액에 반응하는 각막 간질세포의 증식은 실질적으로 동일하다. 결막 섬유모세포 및 각막 상피세포에 대한 연구의 경우에도 동일하게 나타났다.
분석은 또한 종래의 상청액 액체 및 본 발명에 따라 열처리 된 상청액에 존재하는 성장-인자 레벨에 대하여 수행되었다. 혈소판 인자 PDGF-AB 및 TGF-β1에 대하여, 열처리는 최종 상청액 내의 그들의 존재에 영향을 주지 않는 것으로 나타났다. IGF-I와 같은 혈장 성장 인자의 분석 농도는 적용된 온도에 의해 변화되지 않으며, 반면 면역글로불린 G 및 M(IgG 및 IgM)과 같은 기타 물질의 값은 각기 9% 및 13%로 감소 되는 것으로 더 나타났다. 상청액이 열 처리되었을 때 보체 인자 D는 완전히 소멸 되는 것으로 또한 나타났다. 이들 결과의 예는 하기의 도면에서 볼 수 있다. 예를 들어, 도 2는 본 발명에 따른 열처리 전 및 후의 세 제공자(donor)의 상청액 내에서의 PDGF-AB 레벨을 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 상기 레벨은 실질적으로 일정하게 남아있는다(제 1 상청액에서 이들은 약간 감소되며, 제 2 상청액에서 이들은 일정하게 남아 있고, 제 3 상청액에서 이들은 약간 증가된다). 반면, 도 3은 본 발명에 따른 열처리 전 및 후의 세 제공자의 상청액 내에서의 보체 인자 D 레벨을 나타낸다. 관측될 수 있는 바와 같이, 인자 D는 초기 상청액 액체 내에 존재하며, 반면 열처리 된 상청액 내에서 완전하게 소멸된다.
2.
상청액의
생물학적 효과 및 성장-인자 레벨에 대한 동결 건조 공정의 영향
본 발명의 설명에서 이미 언급된 바와 같이, 본 발명에 따라 수행된 동결 건조 공정은 상청액의 생물학적 성질의 보존을 허용한다. 다시 말해, 최종 건조 조성물은 실질적으로 초기 액체 상청액과 동일한 성질을 갖는다.
결막 섬유모세포 및 각막간질세포의 증식에 대한 혈장 상청액의 동결 건조 효과는 실험 동안 분석되었다. 그 결과는 동결 건조가 연구되었던 (각각의 세 제공자의) 세 상청액의 어느 것도 상기 세포 타입의 성장에 영향을 주지 않는다는 것을 나타낸다. 이것은, 예를 들어, 도 4에서 열처리가 수행되지 않은 종래의 상청액의 혈장액 및 본 발명에 따라 열 처리된 상청액으로 처리된 세 각막 내의 제곱 센티미터당 섬유모세포(HConF)의 수를 나타낸다는 것을 알 수 있다. 섬유모세포의 존재는 비교적 일정하게 남아 있는다(제 1 상청액에서 이들은 약간 감소되며, 제 2 상청액에서 이들은 약간 증가되고, 제 3 상청액에서 이들은 약간 감소된다).
분석은 또한 종래의 상청액 액체 및 본 발명에 따라 동결 건조된 상청액 내에 존재하는 성장 인자의 레벨에 대하여 수행되었다. 성장-인자 레벨은 동결 건조후 변화되지 않는다는 것을 나타내었다. 이것은 TGF-β1, PDGF-AB, VEGF 및 EGF와 같은 혈소판 인자 및 IGF-I 또는 보체 인자 D와 같은 혈장 인자 양자에 적용된다. 예로서, 도 5는 동결 건조되지 않고 열처리 되지 않은 또는 본 발명에 따라 동결 건조 및 열처리 된 세 제공자의 상청액 내에서 성장 인자 PDGF-AB 및 TGF-β1의 평균 농도를 나타낸다; 전자의 농도는 약간 증가 되었으며, 반면 후자의 농도는 약간 감소되었지만 여전히 유의하게 높은 것으로 관측될 수 있다. 유사하게, 도 6은 동결 건조되지 않고 열처리 되지 않은 또는 본 발명에 따라 동결 건조 및 열처리 된 세 제공자의 상청액 내에서 성장 인자 VEGF 및 EGF의 농도를 나타낸다; 이들 인자의 농도는 약간 감소 되었으나, 그래도 높은 값으로 남아 있는 것으로 관측될 수 있다.
3.
상청액의
생물학적 효과 및 성장-인자 레벨에 대한 여과 공정의 영향
상청액의 여과가 상청액에 대한 바람직하지 않은 생물학적 효과를 가질 수 있을지, 또는 반대로, 그의 생물학적 성질이 변경되지 않고 남아 있는 지의 여부를 또한 연구하였다.
생체외 연구는 상청액의 여과 공정이 결막 섬유모세포, 각막간질세포 및 각막 상피의 증식에 대한 생물학적 효과를 변경하지 않는다는 것을 나타내었다.
도 7은 예를 들어, 상청액의 여과 전 후, 세 상청액 액체 내의 제곱 센티미터당 함유된 결막 섬유모세포(HConF)의 양을 나타낸다. 관측될 수 있는 바와 같이, 여과된 상청액 내의 결막 섬유모세포의 증식은 여과되지 않은 상청액 내의 것과 유사하였다.
여과 및 여과되지 않은 상청액 내에서 측정된 성장 인자의 레벨에 대하여, 분석된 세 상청액(모든 경우, 세 상이한 제공자로부터 유도됨)에서와 유사한 것으로 나타났다. 도 8은 상청액의 여과가 상기 농도를 유의하게 변화시키지 않는다는 증거를 제공하는, 여과 및 여과되지 않은 상청액 내에서 TGF-β1 성장 인자의 평균 농도를 나타낸다. 이 사실은 혈소판 알파 과립(예컨대 TGF-β1, PDGF-AB, VEGF, EGF 또는 TSP-1) 내에 함유된 성장 인자에만 적용되는 것이 아니라 IGF-I (제 1형 인슐린 유사(type 1 insulin-like) 성장 인자) 또는 엔도스타틴과 같은 혈장 내에 존재하는 성장 인자에 대하여도 적용된다. 이와 관련하여, 도 9는 여과를 수행하기 전 후 세 제공자의 상청액 내에서 성장 인자 IGF-I의 평균 농도를 나타낸다. 관측될 수 있는 바와 같이, IGF-I 레벨은 모든 세 경우에 실질적으로 남아 있었다.
4. 다양한
상청액
성질에 대한, 여과, 열처리 및 동결 건조 단계를 포함하는 본 발명에 따른 방법의 영향
도 10은 성장 인자 풍부 혈장(PRGF 상청액)의 종래의 상청액, 및 본 발명에 따른 여과, 열처리, 동결 건조 및 후속하여 재현탁된 PRGF 상청액을 사용하여 72시간의 치료 후 인간 각막 각막간질세포(HCK)로부터 유도된 일차 세포의 증식의 그래프를 나타낸다. 관측될 수 있는 바와 같이, 일차 세포의 수는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 상청액 내에서 약간 높았다.
도 11은 종래의 PRGF 상청액, 및 본 발명에 따라 여과, 열처리, 동결 건조 및 후속하여 재현탁된 PRGF 상청액으로 72시간 처리 후 인간 결막 섬유모세포(HConF)로부터 유도된 일차 세포의 증식의 그래프를 나타낸다. 전술한 그래프에서와 같이, 일차 세포의 수는 본 발명에 따른 방법에 의해 수득된 상청액 내에서 약간 높았다.
도 12는 인간 각막 간질세포(HCK)로 부터 일차 세포 배양의 이동에 대한, 종래의 PRGF 상청액 및 본 발명에 따라 여과, 열처리, 동결 건조 및 후속하여 재현탁된 PRGF 상청액의 적용 효과를 나타낸다. 관측될 수 있는 바와 같이, 일차 세포의 수는 종래의 상청액이 성장 배지로 사용된 경우에 단지 약간 높았다.
도 13은 24시간 세포 배양 후 인간 결막 섬유모세포(HConF)로부터 일차 세포 배양의 이동에 대한, 종래의 PRGF 상청액 및 본 발명에 따라 여과, 열처리, 동결 건조 및 후속하여 재현탁된 PRGF 상청액의 적용 효과를 나타낸다. 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에 따라 수득된 상청액의 결과가 약간 더 우수하였지만 두 경우 행동 방식이 매우 유사하였다.
실험 결과의 그래프를 모두 분석한 후 요약하면, 최종 재현탁된 조성물의 행동 방식 및 성질은 즉각적으로 적용할 필요가 있는 종래의 상청액의 행동 방식 및 성질과 매우 유사하다(약간의 중요하지 않은 변화는 있음)고 결론을 내릴 수 있다. 그러므로, 한편으로는, 건조한 재현탁성 제품을 수득하기 위해 습윤 상청액을 여과, 열처리 및 동결 건조하는 사실은 제품의 성질에 영향을 주지 않으며, 반면, 본 명세서에서 나열된 다수의 이점을 제공하는 것으로 결론을 내릴 수 있다.
Claims (19)
- 하기 단계를 포함하는 성장 인자를 함유하는 조성물의 수득 방법:
a) 방출된 성장 인자를 함유하는 혈소판 풍부 혈장(platelet-rich plasma) 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액(supernatant)을 제공하는 단계,
b) 혈액 화합물의 온도가 증가하는 동안, 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액을 열처리하는 단계,
c) 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액을 동결 건조하는 단계.
- 청구항 1에 있어서,
동결 건조가 애주번트(adjuvants)를 첨가함이 없이 수행되는 것을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법.
- 청구항 1에 있어서,
열 처리가 동결 건조 전에 수행되는 것을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법.
- 청구항 1에 있어서,
하기 단계를 포함하는 열처리 단계인 것을 특징으로 하는 방법:
- 37℃ 초과의 온도로 1 분 이상의 기간 동안 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액을 수행하는 것을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법.
- 청구항 4에 있어서,
- 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액이 50 내지 60℃의 온도로 20 내지 70분 동안 수행됨을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법.
- 청구항 5에 있어서,
- 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액이 56℃의 온도에서 30 내지 60분 동안 수행됨을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법.
- 청구항 1에 있어서,
동결 건조 단계가 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법:
- 0℃ 미만의 온도로 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액을 냉동하는 단계,
- 0℃ 이하의 온도 및 고 진공(high vacuum)에서, 1분 이상 동안 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액의 제 1 건조를 수행하는 단계.
- 청구항 7에 있어서,
- 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액이 -60 내지 -40℃의 온도에서 1시간 초과 동안 냉동되며,
- 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액의 제 1 건조가 -60 내지 -40℃의 온도에서 및 0.05 내지 0.15mBar의 압력에서 수행되는 것을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법.
- 청구항 8에 있어서,
- 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액의 냉동이 -50℃의 온도에서 2시간 초과 동안 수행되며,
- 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액의 제 1 건조가 -50℃의 온도 및 0.1mBar의 압력에서 수행되는 것을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법.
- 청구항 7에 있어서,
동결 건조 단계가 하기의 추가 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법:
- 0℃ 이상의 온도 및 고 진공에서, 1분 이상 동안 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액의 제 2 건조를 수행하는 단계 .
- 청구항 10에 있어서,
- 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액의 제 2 건조가 +15 내지 +25℃의 온도 및 0.05 내지 0.15mBar의 압력에서 수행되는 것을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법.
- 청구항 11에 있어서,
- 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액의 제 2 건조가 +20℃의 온도 및 0.1mBar의 압력에서 수행되는 것을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법.
- 청구항 7에 있어서,
동결 건조의 단계가 하기의 추가 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법:
- 0℃ 이상의 온도 및 저 진공 또는 진공 없이, 1분 이상 동안 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액의 제 2 건조를 수행하는 단계.
- 청구항 10에 있어서,
하기의 추가 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법:
- 0℃ 이상 및 고 진공에서, 1분 이상 동안 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액의 제 3 건조를 수행하는 단계.
- 청구항 14에 있어서,
- 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액의 제 3 건조 단계가 +15 내지 +25℃의 온도 및 고 진공에서 수행되는 것을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법.
- 청구항 15에 있어서,
- 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액의 제 3 건조가 +20℃ 및 고 진공에서 수행됨을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법.
- 청구항 10에 있어서,
하기의 추가 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법:
- 0℃ 이상의 온도 및 저 진공 또는 진공 없이, 1분 이상 동안 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액의 제 3 건조를 수행하는 단계.
- 청구항 1에 있어서,
동결 건조 전에 수행되는, 혈소판 풍부 혈장 또는 혈소판 풍부 혈장의 상청액을 여과하는 추가 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물의 수득 방법.
- 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득된 성장 인자를 함유하는 조성물.
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