TW201309310A - 自血液複合物獲得含生長因子組成物之方法及自該方法所獲得之組成物 - Google Patents
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Abstract
本發明提供一種獲得含生長因子之組成物的方法,其包括對含有釋放的生長因子的富含血小板之血漿或富含血小板之血漿的上清液進行熱處理的步驟以增加其溫度,用以除去補體並且減少其中所出現的免疫球蛋白,以及對血漿或上清液進行冷凍乾燥,以獲得可輕易地被輸送、處理及儲存的最終乾燥組成物,藉此利用血液複合物而促進週期性的或慢性的治療。已顯示當最終乾燥組成物重新懸浮的時候,會再一次獲得維持完整生物特性的潮濕的組成物。
Description
本發明係關於一種方法,係為細胞血液成分(血小板、紅血球及白血球)存在或不存在的情況下,自血液複合物獲得含生長因子組成物之方法。本發明亦關於藉由上述方法所獲得之含生長因子組成物。
含有自病患血液中所取得的含生長因子之血液複合物的製備方法已經在所屬技術領域中廣為人知。尤其是在當其引發或刺激肌肉再生、減少特定疾病或缺陷的疼痛時,以及其他許多用途中,前述含生長因子之血液複合物已顯示出擁有許多重要的生物特性。
舉例而言,由本案相同發明人所申請的WO0044314A1號專利申請案,係關於從自體生成之血漿製備膠體的方法,此膠體係富含生長因子且自病患自身的血液中取得;所述過程在由本案相同發明人所申請的更最近的WO2010130851A2號專利申請案有更新的描述。兩種方法具有共同的步驟,諸如病患血液的離心、富含血小板之血漿的分離以及為了活化血漿(亦即,為了使血小板中的生長因子釋放)而於富含血小板之血漿中添加氯化鈣,以及凝結血漿,直到其獲得如膠狀般的稠度。
另一已知的例子係揭露於ES2221770B2號專利案。此專利係關於血液複合物的製備過程,該血液複合物係富含生長因子且具有良好的生物特性。其中,該血液複
合物為液體狀。特別的是,該複合物為富含生長因子之血漿的上清液,其在誘導所述富含生長因子之血漿的凝結與後續的收縮後產生的澄清液態物質中取得。此專利亦描述該上清液的各種用途,其中最重要的用途(因為其之液體稠度)係用來作為眼睛疾病或缺陷的治療中所使用的滴眼劑。
根據先前技術中已知的方法所製備的含有生長因子的血漿膠狀物、上清液或大體上任何自體生成的血液複合物,無論其在上述申請案中欲使用的用途為何,均呈現出在失去生物特性之前必須立即使用的缺點。當血液複合物含有釋放的生長因子時,此必要性更是尤其關鍵。因此,血液複合物無法製備成能夠長時間置於室溫環境中,且相當建議立即使用(以上清液而言,製備後需在八小時內使用),以避免蛋白質及生長因子的降解和變性、或者產品可能受到的細菌汙染。
目前在上述專利申請案中的使用方式及用途(組織再生、細胞培養,短期的使用或甚至每週或每半個月的使用等等)由於能夠配合所述需立即使用的特點,因此自體生成之血液複合物的使用並未受到限制。然而,帶有生長因子之自體生成血漿的潛在應用現今已逐漸浮上檯面,其須持續的浸潤或塗佈該複合物,於各劑量之間的時間間隔變得較短。自體生成之血液複合物(膠狀物、上清液等)的使用如目前已知,在這些新申請案的技術中會需要對病患體進行持續的血液萃取。很明顯地,這些情形對病患的生活品質及慢性或退化性疾病的長期治療的
可行性有相當負面的影響。
有許多可能能夠利用含有生長因子之血液複合物針對慢性或退化性疾病進行治療的例子:眼部、中央神經系統及慢性關節疾病,以及需要慢性或重複的服用此含有生長因子的血液複合物的大多數疾病或缺陷,但就目前而言仍並未真正實現此技術,因為血液複合物必須立即使用且無法儲存。
上述疾病包括,但不限於下列疾病:系統性紅斑狼瘡、影響締結組織的慢性自體免疫疾病,其中免疫系統產生發炎及組織損壞,具體而言係為抗體結合至器官細胞以及抗原-抗體複合物的形成;斯耶格倫綜合症(Sjögren's syndrome),一種系統性自體免疫疾病,其主要影響外分泌腺產生乾燥現象;皮肌炎(dermatomyositis),一種締結組織的疾病,會導致肌肉及皮膚的發炎;類風濕關節炎(rheumatoid arthritis),一種系統性自體免疫疾病,其驅使慢性發炎的產生,主要位於關節,且逐漸導致各種不同程度的變形破壞及功能退化。目前許多研究顯示,若含有生長因子之自體生成的血液組成物能夠規律地讓病患使用,可最有效率地緩和這些疾病。
本發明的一目的係為提供一種自富含血小板之血漿或富含血小板之血漿的上清液中獲得含有生長因子之組成物之方法,其中此方法可用來取得能長時間儲存且易於輸送的組成物,使得此組成物適合在任何給定的時間點或認為需要的時候使用,而非必定要立即使用。因此,
根據本發明之方法,應能取得一種組成物,其在沒有持續性地自病患體萃取血液的情況下,可用來規律使用於慢性疾病的治療手段,藉此改善病患的生活品質。
本發明的另一目的係為根據本發明之方法所獲得的組成物可維持其完整的生物特性。
本發明的另一目的係為根據本發明之方法所獲得的組成物可維持良好的生物特性,尤其在作為自體免疫疾病中的必要治療。
本發明之標的係為一種獲得含生長因子組成物之方法,其包括數個步驟。
首先,該方法包括下述步驟:備有富含血小板之血漿或富含血小板之血漿的上清液,其含有釋放的生長因子。該富含血小板之血漿或富含血小板之血漿的上清液可為下述各種類型:富含生長因子的血漿膠體以及根據WO0044314A1、WO2010130851A2號專利案所揭露的技術或任何其他可利用之技術;富含血小板之血漿在誘導凝結及後續的收縮之後以液態成分形式取得的上清液,其中所述上清液,舉例而言,可經由如ES2221770B2號專利案所述的技術所取得;或者一般任何富含血小板之血漿。
接著,本發明之方法包括下述對該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液進行熱處理,且此時血液複合物的溫度上升。該熱處理可導致補體的消除且減少在血漿或上清液中最常存在的免疫球蛋白,其就免
疫學的角度而言,在交叉反應中扮演關鍵角色。所述補體的消除或相當程度的減少存在於血漿或上清液中,顯著改善了產品對於免疫系統疾病的應用性。
此外,本發明之方法包括一步驟,其中血液複合物係經冷凍乾燥,以獲得實際上無濕度的最終組成物。
依據本發明,對血漿或上清液進行熱處理以及冷凍乾燥的步驟依何種順序進行均無差別,亦即該等步驟可依任何順序實施。
此外,本發明之方法可包括富含血小板之血漿或富含血小板之血漿的上清液進行過濾之步驟。所述步驟係於冷凍乾燥之前進行,但並非必須在緊接著冷凍乾燥之前進行;例如,若熱處理於冷凍乾燥之前進行,則過濾步驟將在熱處理前進行。
此種從自體生成之富含血小板之血漿或自體生成之富含血小板之血漿的上清液可使最終乾燥組成物表現出較傳統的潮濕血漿(humid plasma)或上清液更多優點。其中一個顯著的優點是,該乾燥組成物相較於潮濕複合物(液體、具些許黏性的膠體或任何其他濃度的物質)特別地易於處理以及輸送。進一步而言,由於其不含水,乾燥組成物可在室溫下保存,並且因為產品具有長期穩定性而甚至可無限期的儲存(且並非一定要在製備後立即使用,因此其可延遲使用)。此外,其缺乏水分的特性能排除被汙染的風險。乾燥組成物的另一優點為其可以快速回復至原始狀態;此方法藉由在例行使用的任何等張溶液(例如:水)中簡單地重新懸浮此乾燥組成物而就地
實施。
已顯示的是,本發明之乾燥組成物的又一好處則是當乾燥組成物重新懸浮以便為了能夠服用而恢復濕潤狀態,所述重新懸浮的組成物保留了潮濕血漿或上清液在經歷本發明之方法之前的生物特性。也就是說,該重新懸浮的組成物維持了與帶有生物活性之生長因子相類似的濃度;此外,經重新懸浮之組成物在細胞增生、細胞遷移及化學向性(chemotaxis)、以及生長因子的自分泌及旁分泌合成現象,均與潮溼血漿或上清液相同。其中,生物特性的保存尤其在本發明的方法進行期間對產品施以適當的溫度而達成。換句話說,在本發明之各種步驟所使用的低溫能確保過程中血漿或上清液內任何揮發性成分的流失可維持在最小。低溫亦確保細菌汙染的風險降低,以及製備過程不會因為任何與酵素有關的變化而受到損害(對於如本發明之血漿或上清液的製備有酵素存在的情形,在低溫環境下處理以避免遭受破壞,是相當有益的)。
本發明另一個極為有益的功效在於,該乾燥組成物以及從而產生的最終經重新懸浮之組成物中補體不存在或其含量減少,藉此使該經重新懸浮之最終組成物特別適於治療多種自體免疫疾病。
上述特點可使該乾燥組成物用於非立即性治療,例如:規律性地治療慢性疾病,以及尤其是慢性自體免疫疾病。如此一來,若將依據本發明獲得的乾燥組成物儲存起來,例如:依劑量儲存,接著利用所述組成物的慢
性治療轉化成簡單的過程:該慢性病患無懼無慮地能夠攜帶其所需劑量(例如,在一容器中)到任何地方;就服用此劑量而言,病患只需簡單地潤濕或重新懸浮此藥物,並且一旦回復至原始的潮濕稠度(humid consistency)(液狀或其他狀態)則可接著使用此組成物。
關於藉由本發明之方法所獲得之組成物的這些特點及好處可歸納成以下幾點:最適化的穩定性;對於多種自體免疫疾病有特殊適應症;簡單、快速且完整的可溶性;無限期的儲存;適當的保護抵抗外在的破壞因子,以及要使用時可迅速取得的特性。
本發明之另一標的係為藉由本發明之方法所獲得的含有生長因子之組成物。所述組成物顯示出如上所述的所有優點。
本發明的細節係描述於所附圖式中,所附圖式係用於闡述本而非限定本發明。
本發明之目的係提供一種在血液細胞成分(血小板、紅血球及白血球)存在或不存在的情形下獲得含生長因子組成物之方法,其包括下列步驟:
a)備有富含血小板之血漿或富含血小板之血漿的上清液,其係含有釋放的生長因子,該血漿或上清液係根據任何適用的製備方法所製得。帶有釋放的生長因子的血漿或上清液,藉由適合的試劑(氯化鈣、凝血酶、鈣鹽、其他含二價離子之試劑及其組合物,或任何其他可活化凝血的系統),其含在血小板中之生長因子係已被釋放且
凝血連鎖反應被活化,藉以獲得一產物,其富含蛋白質以及細胞質與血小板衍生生長因子。該血漿或上清液可為各種類型:根據WO0044314A1號專利案、WO2010130851A2號專利案中所揭露的技術或其他適合的技術所獲得的富含生長因子之血漿膠體;在誘導凝血作用以及後續的血漿收縮之後,以液態成分形式所獲得的上清液,其中所述上清液可根據例如ES2221770B2號專利案中所描述之技術而獲得;或者,一般而言,藉由任何給定的方法所獲得的血漿或上清液。
b)對該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液進行熱處理,以消除補體以及減少某些血漿或上清液中最常見之免疫球蛋白的生成,其就免疫學觀點而言,在交叉反應中扮演關鍵角色。所述之存在於血漿或上清液中之補體的消除或一定程度的減少能夠顯著地有利於血液複合物對於免疫系統疾病的適用性。已知的是,在血液複合物中補體系統的存在由於涉及免疫系統的過度刺激以及在許多情況下血液複合物欲治療的疾病其症狀學本身,而可能引發有害的影響。血漿補體係關於許多變化,諸如自體免疫疾病中經由補體(典型補體反應途徑)所傳遞而可能產生的負面反應(紅斑性狼瘡、關節炎等)或者來自慢性誘導細胞過敏疾病且亦經由補體傳遞而產生的負面反應。此外,部分補體因子增加過敏反應以及巨噬反應,並且誘導細胞與微器官的分解。依次地,在血液複合物中最常見的免疫球蛋白(immunoglobulins,Ig)係為IgG免疫球蛋白,其中部分的
主要功能在於修復補體、Fc受體在巨噬細胞中的結合(當巨噬作用期間經調理作用粒子(opsonising particles)時)以及在抗體媒介的細胞毒性期間受體在NK細胞中的結合。這就是為何存在於血漿或上清液之補體的消除或一定程度之減少對於後者在免疫系統疾病上的應用是很重要的優勢。熱處理使得獲得適用於帶有免疫系統缺陷之病患需求的最終組成物是可能的。至於免疫球蛋白,其全部或部分減少對於帶有自體免疫疾病之病患是重要的,如各種IgG參與了某些劇烈的排斥反應過程以及因此在配方中減少其存在,幫助治療各種類型的疾病,且免除了排斥反應或激烈的免疫反應的風險。
c)將血漿或上清液冷凍乾燥,以消除幾乎全部其含有的水分,且允許血漿或上清液自潮濕狀態通過至非潮濕狀態,可使其長時間儲存。
血漿或上清液事實上一開始就被活化,意即在熱處理之前包含釋放的生長因子提供了驚人的效果。一方面,活化之後所獲得的血漿或上清液以及進一步的熱處理對於團聚及形成纖維蛋白凝塊(fibrin clot)實際上具有完整的能力。其實際上具有完整對於自粒狀容器釋放因子的能力。事實上,血漿或上清液的這些能力能保持不被影響,可自圖14、15及16所示的數據所了解。圖14為人類結膜纖維母細胞(HConF)的初代細胞培養表現在以下三種不同的細胞培養基:未經熱處理的經活化之富含血小板之血漿(標記為”PRGF”)、本發明的經熱處理但在熱處理前未活化之富含血小板之血漿(標記
為”PostAct”)、以及本發明的經活化後再經熱處理之富含血小板之血漿(標記為”PriorAct”)中濃度的示意圖。如圖所示,若使用本發明的組合物(樣本PriorAct),以及若使用經活化及未經熱處理之血漿(樣本PRGF),細胞增生情形實際上是相同的。相反地,若使用先經熱處理再經活化(樣本PostAct)之富含血小板之血漿作為細胞培養基,細胞增生情形實際上為零。圖15所示為相似的示意圖,但使用的是成長的人類角膜細胞(HCK)。而圖16所示為利用ELISA方法測量存在於不同組成物中不同生長因子的濃度。如圖所示,生長因子的濃度在根據本發明經活化且再經熱處理的富含血小板之血漿中(標記為PriorAct)以及在經活化且未經熱處理的血漿中(標記為PRGF)實際上是相同的。相反地,先經熱處理再經活化的富含血小板之血漿(樣本PostAct)顯示出相當差的生長因子濃度。
冷凍乾燥較佳地係在添加佐劑(醣類例如海藻糖、化學成分等)不存在時進行。對於許多物質的冷凍乾燥過程,佐劑是必須的,但已知的是,血漿或上清液可在無佐劑輔助的情況下進行冷凍乾燥,且沒有任何佐劑添加而進行冷凍乾燥可產生最終乾燥組成物(以及因而產生用於病患身上的重新懸浮之組成物),其具有較高的生物相容性。舉例而言,在一些研究中已經證明某些佐劑如海藻糖,對細胞增生具有負面影響。
此外,原則上此方法的特徵在於,對血漿或上清液進行熱處理及冷凍乾燥的步驟並無特定順序。然而,較
佳地,熱處理步驟係在對血漿或上清液進行冷凍乾燥的步驟之前進行,由於在冷凍乾燥之前,先經熱處理的產物能包含所有對本發明的目標(補體及IgG蛋白的減少)有益的特性及潛力。考量冷凍乾燥是為了改善複合物保存及儲存的能力,以及因此較佳地構成最終而非起始狀態是很重要的。因此,總而言之,首要目標便是最佳化此產物,而次要目標便是改善其保存及儲存的能力。
熱處理係可為任何可適當增加血漿或上清液之溫度的處理方法,較佳地溫度可增加至37℃並維持1分鐘以上。例如,血漿或上清液可置入所述溫度的水浴中並維持所述時間。若37℃是本體的溫度且此溫度是補體及免疫球蛋白具有最大生物活性狀態,根據本發明較佳的是,血漿或上清液加熱至37℃以上,以達到某些前述成分的消除作用。
特別優異的是,將血漿或上清液置於溫度在50至60℃之間(較佳地為56℃)的環境下,係由於在此溫度下,補體成分會理想地降解,且包含在產物中蛋白質及生長因子的保護會最大化。因此,已顯示的是,溫度低於這個範圍時,無法確保在培養期間補體在血漿或上清液中被消除。換句話說,在溫度高於60至65℃的環境下進行培養能引起包含在血漿或上清液中的生長因子及蛋白質的變性。除此之外,較佳的是,將血漿或上清液置於所述溫度中維持20至70分鐘(較佳地為介於30至60分鐘),係由於在這段時間中補體成分亦能理想地降解,且包含在產物中地蛋白質及生長因子的保護也最大
化。冷凍乾燥的步驟較佳地包括下列子步驟:- 將血漿或上清液於溫度低於0℃的環境下冷凍;- 對血漿或上清液於溫度為低於或等於0℃且高度真空的環境下進行第一次乾燥,乾燥時間為1分鐘或以上,且依此在血漿或上清液中大部分的自由水分則蒸發;- 選擇性地,對血漿或上清液於溫度0℃以上且高度真空、低度真空或無真空的環境下進行第二次乾燥,乾燥時間為1分鐘以上,依此可藉由將包含在血漿或上清液中未凍結的水分蒸散,甚至最後一些水蒸氣都可消除,直到取得低於1%的最終濕度;- 對血漿或上清液於溫度高於或等於0℃且高度真空、低度真空或無真空的環境下進行第三次乾燥,乾燥時間為1分鐘或以上,且依此在產物中任何殘留的溼氣都會透過蒸散作用而消除,且其含水量減少,藉以改善最終產物的穩定性。
特別優異的是,將血漿或上清液係於溫度介於-60至-40℃之間(較佳地為-50℃)的環境下冷凍,冷凍時間大於1小時(較佳地為大於2小時),係由於溫度若不在於此範圍,尤其是較低的冷凍溫度,會增加血漿或上清液因為冷凍的緣故而失去其自身生物特性的風險。除此之外,較佳的是血液複合物被冷凍至少1小時以確保其均勻冷凍(此均勻性能保證冷凍乾燥的穩定度以及產品的生物特性不易起變化)。
關於第一次乾燥過程,其在介於-60至-40℃之間以及介於0.05至0.15毫巴之間(較佳地為-50℃以及0.1毫巴)的環境下進行時效果特別優異。低溫範圍在此係用來能夠確保產物在昇華的過程中能完全凍結,且能保存起始產物的物理、化學及生物特性,藉以避免經冷凍乾燥之產物的蛋白質可能的變性。過程持續的實際時間係依據欲冷凍乾燥以及已建立以確保冰塊完全昇華(對於適當的乾燥過程相當必要)的產品份量。
關於第二次乾燥,其在介於+15至+25℃之間以及介於0.05至0.15毫巴之間(較佳地為+20℃以及0.1毫巴)的環境下進行時效果特別優異。係由於此環境條件可使產物中任何殘留的溼氣在蒸散過程中消除,且將濕度降低至1%以下,以便增進最終產物的穩定性。
最後,第三次乾燥在介於+15至+25℃之間以及高度真空(較佳地為+20℃以及高度真空)的環境下進行時效果特別優異,藉以消除任何殘餘的溼氣,並提供最終產物在均勻度及穩定度方面的最佳特性。
本發明之方法亦可包括一額外的步驟:將血漿或上清液過濾,以消除或避免高分子量成分、血小板團聚物或纖維片段的存在,其可能影響冷凍過程中的產品均勻度及冷凍乾燥過程中的產品穩定度,對乾燥組成物的重新懸浮有負面影響(應該要考量的是,經冷凍乾燥之產物的溶解速率與其包含的粒子尺寸成反比,且包含在乾燥組成物中的大型粒子會降低溶解度或者甚至不能溶解)。若欲進行此額外的步驟,則血漿或上清液的過濾步
驟在冷凍乾燥之前進行,不過並非必須要在緊接著冷凍乾燥之前進行。另外,舉例而言,若在進行本發法的一開始,血漿或上清液已經過濾過,則過濾血漿或上清液之步驟並非必需。
此處將闡述本發明之方法的範例,顯示自富含生長因子之上清液獲取的乾燥組成物中取得之最終重新懸浮組成物的製備過程,並且進行本發明之方法的步驟過程。
首先,富含生長因子的血漿係自病患體內萃取的血液中製備。為此,血液先經過離心,以將其分離成各種部分,如已知的先前技術。接著,血漿部分係利用血漿萃取機器(PTD)的輔助而萃取至9毫升的分餾管。而後此血漿部分受到活化;活化係藉由消除分餾管中的血漿體積而完成,以及接著每毫升(μl)血漿添加50微升(μl)的PRGF®活化劑(一種以氯化鈣為基底的活化劑)。血漿活化過程可以說是生長因子自血液中的血小板釋放的過程。
再來,上清液係由富含生長因子之血漿獲得。為此,已經活化的富含生長因子之血漿係培養於加熱組(heating block)中,溫度為37℃,加熱時間為1小時至1小時半,直到纖維凝塊完全收縮。而後,分餾管在1000g的轉速下離心10分鐘,以達到以下兩個目的:將已形成的纖維凝塊沉澱,以及從凝塊中盡可能萃取出最大體積的上清液。之後,經離心的管子置於層流櫃(laminar flow cabinet)中,管子呈開啟狀以確保樣品完全無菌。所取出
的上清液係收集於10毫升針筒中,針筒連接有一個鈍的肌肉注射針頭。而後針頭自針筒移除,連接一個孔徑為0.22微米(μm)的PVDF過濾膜,並且將上清液過濾。在過濾的過程中,帶有過濾膜的針筒係連接至多次劑量的分配器,每個裝置施放1毫升的經過濾之上清液。最後,將容器無菌密封。
接著,進行本發明之方法以便自經過濾之液態上清液獲得乾燥組成物。帶有經過濾之上清液的多劑量容器係藉由置於已加熱至56℃水浴中30至60分鐘進行熱處理。在熱處理之後,容器立即置於冷凍乾燥機中,其內部溫度已冷卻至-50℃,以便將樣品冷凍,依據上清液的體積,冷凍時間介於2小時至8小時之間,且直到樣品已均勻冷凍。隨後,第一次冷凍乾燥在溫度為-50℃及壓力為0.1毫巴的環境下進行,可達最久時間為24小時。接著,第二次乾燥在溫度為+20℃及壓力為0.1毫巴的環境下進行,可達最久時間為6小時,緊接久時間為12小時。所得的產品為一致的均質粉末,其顯現些微的緊密性,且當其接觸到水溶液中時,可輕易迅速的重新懸浮(亦即溶解並再次回到其上清液狀態的原始稠度)。
最終乾燥組成物需要重新懸浮以便能夠使用。因此,醫師或病患必須浸沒一特定劑量的乾燥組成物至容器內預定體積的無菌水中,並搖晃容器,直到乾燥組成物完全溶解,以再次獲得濕潤或液狀的最終組成物。該最終組成物維持初始的濕潤上清液在經熱處理及冷凍乾燥前的所有生物特性。所述最終組成物可直接使用於病
患身上,例如用作為眼部滴劑。
以下闡述本發明之方法實施於富含生長因子之血漿的上清液,進行三次實驗研究的結果,以及依本發明之方法所獲得的組成物。所述實驗結果的結論均詳細描述如下。
如前所述,本發明所進行的適當溫度之熱處理,可保存上清液的生物特性。換句話說,最終乾燥組成物實質上表現出與起始液態上清液有相同的特性。
係關於此,在眼球表面之細胞培養的實驗顯示出熱處理過程(56℃水浴加熱30分鐘)不影響上清液對角膜基質細胞(HCK)、結膜成纖維細胞(HConF)與結膜上皮細胞的生物影響。所述細胞在試管培養的增生係與未經熱處理之上清液的細胞培養情形相似。在圖1可觀察到在三種角膜中每平方公分角膜細胞的數量,每個樣品受到傳統的未經熱處理之澄清血漿液體處理過,以及受到本發明經熱處理之上清液處理過。角膜基質細胞反應在未經熱處理之傳統澄清血漿液體中以及反應在本發明經熱處理之上清液中的細胞增生實際上是相同的。同樣的情形在結膜纖維母細胞及角膜上皮細胞的研究中也有發生。
亦對傳統的上清液液體中以及本發明經熱處理之上清液中出現的生長因子之濃度進行分析,已顯示的是,關於血小板因子PDGF-AB及TGF-β1,熱處理並未影響
它們在最終上清液的含量。進一步顯示的是,所分析的血漿生長因子如IGF-I的濃度,並未受到所施加的溫度而有改變,而其他試劑如免疫球蛋白G與免疫球蛋白M(IgG及IgM)的數值分別降至9%及13%。亦顯示的是,當上清液受到熱處理時,補體因子D完全消失。這些結果的例子可由所附的圖式中觀察到。舉例而言,圖2所示的為三個施體(donor)之上清液經本發明的熱處理之前及之後的PDGF-AB之份量。由圖中可見,所述分量實際上維持恆定(在第一上清液樣品中有些微降低,在第二上清液樣品中則維持恆定,而在第三上清液樣品中則有些微增加)。另一方面,圖3所示為三個施體(donor)之上清液經本發明的熱處理之前及之後的補體因子D之份量。如同所見,補體因子D係存在於起始上清液液體中,而在經熱處理的上清液中則完全消失。
如前面描述已提到的,本發明所進行的冷凍乾燥步驟,可保存上清液的生物特性。換句話說,最終乾燥組成物實質上表現出與起始液態上清液有相同的特性。
對血漿上清液進行冷凍乾燥對於結膜成纖維細胞以及角膜細胞之細胞增生的影響在實驗過程中進行分析。實驗結果顯示冷凍乾燥並未影響在研究中三種(相對應施體的)上清液中都未存在的所述細胞種類之生長。舉例而言,可由圖4得知,其所示為受到傳統的血漿上清液(未經熱處理)以及本發明的經熱處理之上清液的治療後,三
個角膜中的成纖維細胞(HConF)在每平方公分面積的數目。存在其中的成纖維細胞維持相對恆定(在第一上清液樣品中有些微下降,在第二上清液樣品中有些微上升,而在第三上清液樣品中有些微下降)。
亦對傳統的上清液液體中以及本發明經熱處理之上清液中出現的生長因子之濃度進行分析,已顯示的是,生長因子的濃度在經過冷凍乾燥之後並未有改變。此結果對於生長因子如轉化生長因子-β1(TGF-β1)、血小板衍生生長因子-AB(PDGF-AB)、血管內皮生長因子(VEGF)及表皮生長因子(EGF)、以及血漿因子如類胰島素生長因子-I(IGF-I)或補體因子D均適用。經由所舉的例子,圖5所示為由三個施體(donor)所提供之本發明的上清液未冷凍乾燥及經冷凍乾燥時,其生長因子PDGF-AB及TGF-β1之平均濃度;可觀察到前者的濃度有些微降低,而後者的濃度雖些微降低但仍然維持顯著的高濃度。同樣地,圖6所示為由三個施體(donor)所提供之本發明的上清液未冷凍乾燥與熱處理以及經冷凍乾燥與熱處理時,其生長因子VEGF及EGF之平均濃度;可觀察到兩個生長因子的濃度均些微下降,但仍維持高數值。
對上清液進行過濾是否會對上清液有任何不需要的生物影響,或者恰恰相反,其生物特性仍可維持不變,對此亦有進行研究。
活體外研究顯示過濾上清液的步驟對於結膜成纖維細胞、角膜細胞及角膜上皮細胞增生現象的生物影響並
未改變。
舉例而言,圖7所示為三個上清液在過濾前及過濾後,其每平方公分所含的結膜纖維母細胞(HConF)之份量。可由圖中觀察到,結膜成纖維細胞的增生結果在經過濾的上清液與未經過濾的上清液中是相似的。
關於在已過濾及未過濾之上清液所測量之生長因子的量,已顯示的是,在所分析的三個上清液樣品中(均源自三個不同的施體)。圖8所示為經過濾及未經過濾之上清液中,生長因子TGF-β1之平均濃度,證明過濾上清液的步驟未能使濃度有顯著不同。此結果不只適用於在血小板顆粒(platelet alpha-granule)(例如:TGF-β1、PDGF-AB、VEGF、EGF或TSP-1),亦適用於存在於血漿中的生長因子如IGF-I(第1型類胰島素生長因子)或內皮抑素(endostatin)。關於這點,圖9所示為三種施體中之上清液進行過濾前及進行過濾後,其生長因子IGF-I之平均濃度。尤途中可觀察到,在三個樣品中,IGF-I的量實際上維持恆定。
圖10所示為源自人類角膜基質細胞(HCK)之初代細胞分別經現有的富含生長因子之血漿的上清液(PRGF supernatant)處理72小時後,以及經本發明之經過濾、熱處理及冷凍乾燥後的富含生長因子之血漿的上清液處理72小時後的細胞增生程度。由圖中可觀察到,初代細胞的數目在由本發明之方法所獲得的上清液中有些微地
上升。
圖11所示為源自人類結膜纖維母細胞(HConF)之初代細胞分別經現有的PRGF上清液處理72小時後,以及經本發明之經過濾、熱處理、冷凍乾燥且後續經重新懸浮的PRGF上清液處理72小時後的細胞增生程度。正如前一張圖所示,藉由本發明之方法所獲得之上清液中,初代細胞的數量有些微上升。
圖12所示為人類角膜細胞(HCK)培養之移動細胞分別經現有的PRGF上清液處理後,以及經本發明之經過濾、熱處理、冷凍乾燥且後續經重新懸浮的PRGF上清液處理後的影響程度,對於來自人類角膜基質細胞(HCK)的初代細胞培養之移轉的影響。由圖中可觀察到,若傳統的上清液用作為生長培養基,則初代細胞的數目係些微上升。
圖13所示為人類結膜纖維母細胞(HConF)培養細胞進行24小時的培養後,分別經現有的PRGF上清液處理後,以及經本發明之經過濾、熱處理及冷凍乾燥且後續經重新懸浮的富含生長因子之血漿的上清液處理後,對於其初代細胞培養之移轉的影響。由圖中可觀察到,雖然根據本發明所獲得之上清液中所得的結果較好,但在兩種情況下的結果其實相當類似。
簡而言之,在分析所有實驗結果的圖表後,可以總結的是,最終重新懸浮之組成物的行為及特性均與現有需要立即使用之上清液的行為和特性相當類似(帶有些微不合理的相異之處)。因此,可以總結的是,在一方面,
為了獲得乾燥且可重新懸浮的產物,而對濕潤上清液進行過濾、熱處理以及冷凍乾燥,並不影響產物的特性,且另一方面,其提供了本文所列的許多優點。
圖1所示為以現有技術之血漿上清液(未經熱處理)以及本發明的經熱處理之上清液的治療後,三個角膜中的角膜細胞HCK)在每平方公分面積的數目示意圖。
圖2所示為三個施體(donor)之上清液經本發明的熱處理之前及之後的PDGF-AB之份量的示意圖。
圖3所示為三個施體(donor)之上清液經本發明的熱處理之前及之後的補體因子D之份量的示意圖。
圖4所示為受到現有技術之血漿上清液(未經熱處理)以及本發明的經熱處理之上清液的治療後,三個角膜中的成纖維細胞(HConF)在每平方公分面積的數目示意圖。
圖5所示為由三個施體(donor)所提供之本發明的上清液未冷凍乾燥及經冷凍乾燥時,其生長因子PDGF-AB及TGF-β1之平均濃度的示意圖。
圖6所示為由三個施體(donor)所提供之本發明的上清液未冷凍乾燥及經冷凍乾燥時,其生長因子VEGF及EGF之平均濃度的示意圖。
圖7所示為三個上清液在過濾前及過濾後,其每平方公分所含的結膜纖維母細胞(HConF)之份量的示意圖。
圖8所示為經過濾及未經過濾之上清液中,生長因子TGF-β1之平均濃度的示意圖。
圖9所示為經過濾及未經過濾之上清液中,生長因
子IGF-I之平均濃度的示意圖。
圖10所示為源自人類角膜細胞(HCK)之初代細胞分別經現有的富含生長因子之血漿(PRGF)的上清液以及本發明之經過濾、熱處理及冷凍乾燥後的富含生長因子之血漿的上清液處理72小時後的數量示意圖。
圖11所示為源自人類結膜纖維母細胞(HConF)之初代細胞分別經現有的富含生長因子之血漿(PRGF)的上清液以及本發明之經過濾、熱處理及冷凍乾燥後(其後續經重新懸浮)的富含生長因子之血漿(PRGF)的上清液處理72小時後的數量示意圖。
圖12所示為人類角膜細胞(HCK)培養之移動細胞分別經現有的富含生長因子之血漿(PRGF)的上清液以及本發明之經過濾、熱處理及冷凍乾燥後(其後續經重新懸浮)的富含生長因子之血漿(PRGF)的上清液處理後的數量示意圖。
圖13所示為人類結膜纖維母細胞(HConF)培養之移動細胞分別經現有的富含生長因子之血漿(PRGF)的上清液以及本發明之經過濾、熱處理及冷凍乾燥後(其後續經重新懸浮)的富含生長因子之血漿(PRGF)的上清液處理後的數量示意圖。
圖14所示為人類結膜纖維母細胞(HConF)的初代細胞培養表現在以下三種培養基:未經熱處理的經活化之富含血小板之血漿、本發明的經熱處理之富含血小板之血漿(但在熱處理前未活化)、以及本發明的經活化後再經熱處理之富含血小板之血漿中,其濃度的示意圖。
PRGF 富含生長因子之血漿
PostAct 本發明經熱處理但在熱處理前未活化之富含生長因子之血漿
PrzorAct 本發明經活化後再熱處理之富含生長因子之血漿。
圖15所示為人類角膜細胞(HCK)的初代細胞培養(使用與前一圖示中相同的培養基)之濃度的示意圖。
PRGF 富含生長因子之血漿
PostAct 本發明經熱處理但在熱處理前未活化之富含生長因子之血漿
PrzorAct 本發明經活化後再熱處理之富含生長因子之血漿。
圖16所示為在三個在前二個圖示中用來作為細胞培養基的組成物中不同生長因子之濃度的示意圖。
PRGF 富含生長因子之血漿
PostAct 本發明經熱處理但在熱處理前未活化之富含生長因子之血漿
PrzorAct 本發明經活化後再熱處理之富含生長因子之血漿。
Claims (19)
- 一種獲得含生長因子組成物之方法,包括下列步驟:a)備有富含血小板之血漿或富含血小板之血漿的上清液,其含有釋放的生長因子;b)對該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液進行熱處理,此時血液複合物的溫度上升;c)將該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液冷凍乾燥;其中該熱處理以及冷凍乾燥的步驟係依任何順序進行。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中冷凍乾燥過程進行時不需添加佐劑。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該熱處理於冷凍乾燥之前進行。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該熱處理包括下列步驟:- 將該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液置於溫度高於37℃的環境下,為期為1分鐘以上。
- 如申請專利範圍第4項之方法,其中:- 該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液係置於溫度介於50至60℃之間的環境下20分鐘至70分鐘。
- 如申請專利範圍第5項之方法,其中:- 該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上 清液係置於溫度為56℃的環境下30分鐘至60分鐘。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其中該冷凍乾燥的步驟包括下列步驟:- 將該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液於溫度低於0℃的環境下冷凍;- 對該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液於溫度為低於或等於0℃且高度真空的環境下進行第一次乾燥,乾燥時間為1分鐘以上。
- 如申請專利範圍第7項之方法,其中:- 該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液係於溫度介於-60至-40℃之間的環境下冷凍,冷凍時間大於1小時,- 該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液的第一次乾燥係於溫度介於-60至-40℃之間且壓力介於0.05至0.15毫巴(mBar)之間的環境下進行。
- 如申請專利範圍第8項之方法,其中:- 該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液的冷凍過程係於溫度為-50℃的環境下進行,冷凍時間大於2小時。- 該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液的第一次乾燥係於溫度為-50℃且壓力為0.1毫巴的環境下進行。
- 如申請專利範圍第7項之方法,其中該冷凍乾燥的步 驟包括下列額外步驟:- 對該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液於溫度高於或等於0℃且高度真空的環境下進行第二次乾燥,乾燥時間為1分鐘以上。
- 如申請專利範圍第10項之方法,其中:- 該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液的第二次乾燥係於溫度介於+15至+25℃之間且壓力介於0.05至0.15毫巴之間的環境下進行。
- 如申請專利範圍第11項之方法,其中:- 該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液的第二次乾燥係於溫度為+20℃且壓力為0.1毫巴的環境下進行。
- 如申請專利範圍第7項之方法,其中:- 對該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液於溫度高於或等於0℃且低度真空或非真空的環境下進行第二次乾燥,乾燥時間為1分鐘以上。
- 如申請專利範圍第10項之方法,其中其包括下列額外步驟:- 對該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液於溫度高於或等於0℃且高度真空的環境下進行第三次乾燥,乾燥時間為1分鐘以上。
- 如申請專利範圍第14項之方法,其中:- 該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液的第三次乾燥係於溫度介於+15至+25℃之間 且高度真空的環境下進行。
- 如申請專利範圍第15項之方法,其中:- 該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液的第三次乾燥係於溫度為+20℃且高度真空的環境下進行。
- 如申請專利範圍第10項之方法,其包括下列額外步驟:- 對該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液於溫度高於或等於0℃且低度真空或非真空的環境下進行第三次乾燥,乾燥時間為1分鐘以上。
- 如申請專利範圍第1項之方法,其包括下列額外步驟:在進行冷凍乾燥之前,過濾該富含血小板之血漿或該富含血小板之血漿的上清液。
- 一種含生長因子之組成物,其係由如申請專利範圍第1至18項中任一項之方法所獲得。
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