CN103702679B - 用于来自血小板的含有生长因子的组合物的方法 - Google Patents

用于来自血小板的含有生长因子的组合物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及获得含有生长因子的组合物的方法，其包括以下阶段：热处理含有释放的生长因子的富含血小板的血浆或富含血小板的血浆的上清液以升高其温度，以便消除补体并且减少其中存在的免疫球蛋白；和冷冻干燥血浆或上清液以获得最终的干燥组合物，其易于运输、处置和贮存，并且其有利于定期或长期用血液复合物治疗。已经证实，一旦重新混悬所述最终的干燥组合物，即获得其中最初的生物学性质被保留的新的湿组合物。

Description

用于来自血小板的含有生长因子的组合物的方法
技术领域
本发明涉及在存在或不存在细胞血液组份(血小板、红细胞和白细胞)的情况下由血液复合物获得含有生长因子的组合物的方法。本发明还涉及通过所述方法获得的含有生长因子的组合物。
现有技术
由患者的血液获得的含有生长因子的血液复合物的制备在现有技术中是广泛已知的。已经证实所述的含有生长因子的血液复合物具有非常重要的生物学性质，尤其是当它触发和刺激组织再生、减轻某些类型的疾病和障碍中的疼痛以及用于其它多种用途时。
作为实例，专利申请WO0044314A1(其申请人与本发明的申请人之一相同)涉及由自体血浆制备凝胶的方法，所述凝胶富含生长因子并且是由患者自身血液获得的；所述方法在更近期的专利申请WO2010130851A2(其也是由本申请的申请人提交的)中被更新。这两种方法具有共同的步骤，例如离心患者的血液、分离富含血小板的血浆和向富含血小板的血浆中加入氯化钙，以便活化血浆(即，导致血浆血小板中含有的生长因子被释放)和凝固血浆，直至它获得凝胶样稠度。
另一个已知的实例在专利ES2221770B2中公开。该专利涉及制备富含生长因子并且具有非常有益的生物学性质的血液复合物的方法。在这种情况中，所述复合物是液体形式。特定地，该复合物是富含生长因子的血浆的上清液，其获自诱导所述富含生长因子的血浆凝固和随后收缩后出现的上清液液相。该专利还描述了所述上清液的多种用途，在其应用中最重要的是其作为用于治疗眼疾病和障碍的滴眼液的用途(这归因于其液体稠度)。
根据现有技术已知的方法制备的含有生长因子的血浆凝胶、上清液或概括而言任意自体血液复合物无论其预期使用的用途如何均呈现出在它们失去其生物学性质之前必须立即应用的缺点。这种必然性在血液复合物含有释放的生长因子时特别关键。因此，无法制备在室温下长期保存的血液复合物，推荐立即应用它们(在上清液的情况下，在其制备的8小时内应用)，以避免蛋白质和生长因子的降解和变性或者可能的产品细菌污染。
迄今为止对自体血液复合物的立即使用的需求不受限制，因为已经使用它们的应用(组织再生、细胞培养、紧急应用或者甚至是每周或每半个月应用等应用)与所述立即使用是相容的。然而，现在具有生长因子的自体血液复合物的新的潜在应用正在出现，其需要所述复合物的连续渗入或应用，其中两次剂量之间的间隔时间减少。如目前其已知的那样，自体血液复合物(凝胶、上清液等)在这些新应用中的使用需要由患者进行连续血液提取。显然，这种情况会对患者的生活质量和长期治疗慢性或变性疾病的可行性产生极为不利的影响。
存在大量能用含有生长因子的血液复合物治疗的慢性或变性疾病的实例，但是由于血液复合物必须立即使用并且不能贮存，所以没有：眼疾病、中枢神经系统疾病和变性关节疾病，以及概括而言所有那些需要长期或重复施用含有生长因子的血液复合物的疾病或障碍。
上面提及的疾病包括但不限于以下疾病：系统性红斑狼疮—一种影响结缔组织的慢性自身免疫性疾病，特征在于免疫系统产生炎症和组织损害，特别是由于抗体与器官细胞结合并形成抗原-抗体络合物导致的；舍格伦综合征—一种主要影响外分泌腺、从而导致干燥的系统性自身免疫性疾病；皮肌炎—一种导致肌肉和皮肤炎症的结缔组织疾病；类风湿性关节炎—一种系统性自身免疫性疾病，其引起慢性炎症、主要是关节的慢性炎症，从而进行性地导致具有不同程度的畸形和功能残疾的破坏。目前有研究表明，如果能被定期施用于患者，含有生长因子的自体血液组合物能最有效地减缓所有这些疾病。
本发明的一个目的是提供由富含血小板的血浆或富含血小板的血浆的上清液获得含有生长因子的组合物的方法，其中该方法使得获得了能长期贮存且能容易地被运输的组合物，以至于该组合物适合不用于立即使用，而是用于在任意给定的时间或者当认为必要时应用。因此，本发明的方法应使得能获得在慢性疾病的治疗方法中可定期使用、无需由患者持续进行血液提取、从而改善患者生活质量的组合物。
本发明的另一个目的是，由本发明的方法获得的组合物维持其生物学性质不受损。
本发明的另一个目的是，由本发明的方法获得的组合物维持改善的生物学性质，其特别适用于治疗自身免疫性疾病。
发明概述
本发明的一个目的是获得含有生长因子的组合物的方法，其包括几个步骤。
首先，该方法包括提供含有释放的生长因子的富含血小板的血浆或富含血小板的血浆的上清液的步骤。富含血小板的血浆或富含血小板的血浆的上清液可以是各种类型：富含生长因子的且根据WO0044314A1、WO2010130851A2中公开的技术或者任意其它适用的技术获得的血浆凝胶；在诱导凝固和随后富含血小板的血浆收缩后出现的作为液体组分获得的上清液，其中所述上清液可以例如根据专利ES2221770B2中所述的技术获得；或概括而言任意富含血小板的血浆。
随后，本发明的方法包括热处理富含血小板的血浆或富含血小板的血浆的上清液的步骤，在此期间血液复合物的温度被升高。热处理使得消除了补体并且减少了一些最常见于血浆或上清液中的、从免疫学观点来看在交叉反应中发挥关键作用的免疫球蛋白的存在。所述的血浆或上清液中存在的补体的消除或明显减少大大增强了产品用于治疗免疫系统疾病的适用性。
另外，本发明的方法包括其中将血液复合物冷冻干燥以获得几乎没有水份的最终组合物的步骤。
根据本发明，以何种顺序进行热处理和冷冻干燥血浆或上清液的步骤不会造成差异，即它们可以以任意顺序进行。
此外，本发明的方法可以包括过滤富含血小板的血浆或富含血小板的血浆的上清液的步骤。所述步骤在冷冻干燥前进行，但是不必须在冷冻干燥前即刻进行；例如，在进行热处理、然后冷冻干燥的情况下，过滤步骤在热处理前进行。
由自体富含血小板的血浆或自体富含血小板的血浆的上清液获得组合物的方法使得能获得最终的干燥组合物，与传统的湿血浆或上清液相比其表现出大量优点。一个显著的优点是，干燥组合物明显比湿复合物(液体，或多或少具有粘性的凝胶或任意其它稠度)更易于处置和运输。此外，由于它不含水，所以干燥组合物可以被保持在室温下并且甚至能贮存不受限制的时间，因为它是具有长期稳定性的产品(并且作为结果其使用可以被推迟，因为它不必须在其制备后立即使用)。另外，它不含水这一事实消除了它被污染的风险。干燥组合物的另一个优点是，它能被快速恢复至其最初状态；该方法能通过简单地将干燥组合物重新混悬在常用的任意等张(isotonic)溶剂(例如水)中而被容易地现场进行。
已经证实，本发明的干燥组合物的另一个优点是，当为了实现施用目的而将干燥组合物重新混悬以恢复湿状态时，所述的重新混悬的组合物保存了进行本发明的方法之前的湿的血浆或上清液的生物学性质。也就是说，重新混悬的组合物保持了具有生物学活性的生长因子的类似浓度；另外，由重新混悬的组合物诱导的对细胞增殖、细胞迁移和趋化作用以及生长因子的自分泌和旁分泌合成的作用与湿的血浆或上清液的作用相同。这种保存生物学性质尤其是在本发明的方法过程中应用于产品的适宜温度的结果。另一方面，在方法的各个步骤中使用的低温度确保了将可能在方法过程中出现的血浆或上清液中含有的挥发性组分的任何损失保持在最低限度。低温度还确保了细菌污染的低风险，并且确保了制备物在酶方面不发生任何改变(有利的是，在低温度下处理含酶的制备物以避免破坏它们，正如在本发明的血浆或上清液的情况中)。
本发明的另一个非常有益的作用是，干燥组合物以及因此重新混悬的组合物不含补体或者含有减少的量的补体，从而使得重新混悬的最终组合物对于治疗大量自身免疫性疾病而言是特别理想的。
所有上述内容使得干燥组合物可用于非即刻治疗，例如用于定期治疗慢性障碍，特别是慢性自身免疫性疾病。如果贮存、例如按剂量贮存根据本发明获得的干燥组合物，则这种方式使得用所述组合物进行长期治疗变成了一种非常简单的过程：慢性病患者能在任何地点没有忧虑或困难地携带它们的剂量(例如在容器中)；为了施用该剂量，患者仅需将其湿润或重新混悬，一旦已经恢复最初的湿稠度(液体等)，则施用该组合物。
可以将与通过本发明的方法获得的组合物相关的所有这些特定的特征和益处总结如下：最佳的稳定性；特定地适用于大量自身免疫性疾病；简单、快速和完全的溶解性；不受限制的贮存；对外部有害因素的足够的防护性和快速的可用性。
本发明的另一个目的是通过本发明的方法获得的含有生长因子的组合物。所述组合物呈现出上文所述的所有优点。
附图简要说明
在所附的图中描绘了本发明的细节，所附的图旨在举例说明而非限制本发明：
-图1显示了用未进行热处理的常规上清液血浆液体以及用根据本发明热处理的上清液处理的三个角膜中每平方厘米中角膜细胞(HCK)的数量的图。
-图2显示了在根据本发明热处理之前和之后三个供体的上清液中PDGF-AB水平的图。
-图3给出了在根据本发明热处理之前和之后三个供体的上清液中的补体因子D水平。
-图4显示了用未进行热处理的常规上清液血浆液体以及用根据本发明热处理的上清液处理的三个角膜中每平方厘米中成纤维细胞(HConF)的数量的图。
-图5显示了来自三个供体的未冷冻干燥的和根据本发明冷冻干燥的上清液中生长因子PDGF-AB和TGF-β1的平均浓度的图。
-图6显示了来自三个供体的未冷冻干燥的和根据本发明冷冻干燥的上清液中生长因子VEGF和EGF的平均浓度的图。
-图7显示了在过滤所述上清液之前和之后三种上清液液体中每平方厘米中含有的结膜成纤维细胞(HConF)的数量的图。
-图8显示了过滤的和未过滤的上清液中生长因子TGF-β1的平均浓度的图。
-图9显示了过滤的和未过滤的上清液中生长因子IGF-I的平均浓度的图。
-图10显示了源自用常规的富含生长因子的血浆(PRGF)的上清液以及用根据本发明过滤的、热处理的且冷冻干燥的富含生长因子的血浆(PRGF)的上清液处理72小时后的人角膜细胞(HCK)的原代细胞的数量的图。
-图11显示了源自用常规的富含生长因子的血浆(PRGF)的上清液以及用根据本发明过滤的、热处理的且冷冻干燥的并且已经随后被重新混悬的富含生长因子的血浆(PRGF)的上清液处理72小时后的人结膜成纤维细胞(HConF)的原代细胞的数量的图。
-图12显示了用常规的富含生长因子的血浆(PRGF)的上清液以及用根据本发明过滤的、热处理的且冷冻干燥的并且已经随后被重新混悬的富含生长因子的血浆(PRGF)的上清液处理后的人角膜细胞(HCK)的细胞培养物中迁移的细胞的数量的图。
-图13显示了用常规的富含生长因子的血浆(PRGF)的上清液以及用根据本发明过滤的、热处理的且冷冻干燥的并且已经随后被重新混悬的富含生长因子的血浆(PRGF)的上清液处理后的结膜成纤维细胞(HCF)的细胞培养物中迁移的细胞的数量的图。
-图14显示了在三种不同培养基中进行的人结膜成纤维细胞(HConF)原代细胞培养物的浓度的图：未根据本发明进行热处理的活化的富含血小板的血浆；已经根据本发明进行了热处理、但是热处理之前未被活化的富含血小板的血浆；和已经被活化、然后根据本发明进行了热处理的富含血小板的血浆。
-图15显示了使用与前一个图中所给出的情况相同的培养基的人角膜细胞(HCK)的原代细胞培养物的浓度的图。
-图16显示了在前面两个图中所示的情况中用作细胞培养基的三种组合物中不同生长因子的浓度的多个图。
发明详述
本发明的一个目的是在存在或不存在血细胞组分(血小板、红细胞和白细胞)的情况下获得含有生长因子的组合物的方法，其包括以下步骤：
a)提供含有释放的生长因子的富含血小板的血浆或富含血小板的血浆的上清液，所述血浆或上清液是根据任意适用的制备方法制备的。具有释放的生长因子的血浆或上清液是其中血小板中含有的生长因子已经被释放并且凝固级联已经被活化的血浆或上清液，所有释放和活化均借助于适用的物质(氯化钙、凝血酶、钙盐、含有二价离子的其它物质或其组合，或任意其它活化凝固的系统)来实现，从而获得富含蛋白质以及血浆和血小板相关生长因子的产品。所述血浆或上清液可以是不同类型：根据WO0044314A1、WO2010130851A2中所公开的技术或其它适用的技术获得的富含生长因子的血浆凝胶；在诱导凝固和随后血浆收缩后出现的作为液体组分获得的上清液，其中所述上清液可以例如根据专利ES2221770B2中所述的技术获得；或概括而言通过任意给定的方法获得的任意血浆或上清液。
b)对血浆或上清液应用热处理，以消除补体并且减少一些最常见于血浆或上清液中的、从免疫学观点来看在交叉反应中发挥关键作用的免疫球蛋白的存在。所述的血浆或上清液中存在的补体的消除或明显减少大大有益于血液复合物用于免疫系统疾病的适用性。已知的是，血液复合物中补体系统的存在可导致有害效应，因为其参与免疫系统的过度刺激以及血液复合物旨在治疗的疾病的症状学本身的许多情况。血浆补体与大量改变例如由补体(经典补体途径)介导的自身免疫性疾病(红斑狼疮、关节炎等)中可能的不良反应或者来自也由补体介导的慢性炎性疾病的不良反应有关。此外，部分补体因子增加炎症和吞噬作用并且诱导细胞和微生物裂解。相应地，在最常见于血液复合物中的免疫球蛋白(Ig)中有免疫球蛋白IgG，其一些主要生物学功能是固定补体、在吞噬作用过程中当调理颗粒时与吞噬细胞中的Fc受体结合以及在抗体介导的细胞毒性过程中与NK细胞中的受体结合。这就是为什么消除或明显减少血浆或上清液中存在的补体对于将血浆或上清液应用于免疫系统疾病而言是如此重要的优点的原因。热处理使得能获得适用于具有免疫系统障碍的患者的需求的最终组合物。就免疫球蛋白而言，它们的的总体或部分减少对具有自身免疫性疾病的患者是重要的，因为多种多样的IgG参与一些急性排斥过程，因此减少它们在配制物中的存在有助于在没有排斥或急性免疫反应的情况下治疗各种类型的组织。
c)将血浆或上清液冷冻干燥以消除其含有的几乎所有水并且使得血浆或上清液从湿状态转化成能使其长期贮存的非湿状态。
在热处理前血浆或上清液最初被活化、即含有释放的生长因子这一事实提供了令人意外的效果。一方面，活化并进一步热处理后获得的血浆或上清液具有几乎完整的聚集和形成纤维蛋白凝块的能力。它还具有完整的从其颗粒状容器中释放因子的能力。血浆或上清液保持不受影响的能力这一事实能从图14、15和16中的数据中得到理解。图14显示了在三种不同的细胞培养基中进行的人结膜成纤维细胞(HConF)的原代细胞培养物的浓度的图：未进行热处理的活化的富含血小板的血浆(标记为“PRGF”)；已经根据本发明进行了热处理、但是热处理之前未被活化的富含血小板的血浆(标记为“PostAct”)；和已经被活化、然后根据本发明进行了热处理的富含血小板的血浆(标记为“PriorAct”)。如所示的那样，在使用本发明的组合物(“PriorAct”)的情况下和在使用活化的且未热处理的血浆(“PRGF”)的情况下，细胞增殖几乎相同。相反地，在使用已经首先进行了热处理、然后活化的富含血小板的血浆(“PostAct”)作为细胞培养基的情况下，细胞增殖几乎为零。图15显示了类似的图，但具有成长的人角膜细胞(HCK)。图16进而显示了借助于ELISA测定的存在于不同组合物中的不同生长因子浓度。如所示的那样，在已经被活化、然后根据本发明热处理的富含血小板的血浆(标记为“PriorAct”)中和在活化的且未热处理的血浆(“PRGF”)中生长因子浓度几乎相同。相反，已经首先被热处理、然后被活化的富含血小板的血浆(“PostAct”)显示出总体差得多的生长因子浓度。
冷冻干燥优选在不添加佐剂(糖例如海藻糖、化学组分等)的情况下进行。佐剂对于许多物质的冷冻干燥而言是必需的，但已经证实血浆或上清液可以在无需它们帮助的情况下被冷冻干燥，并且在不添加任何佐剂的情况下进行冷冻干燥导致了具有更高的生物相容性的最终的干燥组合物(以及因此为了将其应用于患者被重新混悬的组合物)。一些研究例如已经证实某些佐剂如海藻糖对细胞增殖具有不利影响。
此外，所述方法的特征在于，一般而言，进行热处理和冷冻干燥血浆或上清液的步骤没有既定的顺序。但是，优选的是在冷冻干燥血浆或上清液的步骤之前进行热处理步骤，因为在被冷冻干燥之前预先被热处理的产品将含有所有其有益性质和潜能，这是该方法的目标(减少补体和IgG)。重要的是考虑到进行冷冻干燥以改善复合物被保存和贮存的能力，因此优选的是它构成了最后的、而非最初的阶段。因此，总言之，第一目标是优化产品，第二目标是改善其被保存和贮存的能力。
热处理可以是使得适宜地增加血浆或上清液的温度、优选增加至高于37℃的温度达1分钟或更长的一段时间的任何处理。例如，可以将血浆或上清液放入在所述温度下的水浴中并且达所述时间。考虑到37℃是体温以及补体和免疫球蛋白处于其最大生物活性阶段的温度这一事实，本发明优选的是将血浆或上清液高于37℃进行加热，以实现消除一些上面提到的组分。
尤其有利的是使血浆或上清液经受50－60℃的温度(优选56℃)，因为在该温度下补体的组分被最佳地降解且产品中所含有的蛋白质和生长因子的保护被最大化。因此，已经证实低于该范围的温度无法确保在孵育过程中血浆或上清液中的补体被消除。另一方面，使用高于60-65℃的温度进行孵育会导致血浆或上清液中所含有的生长因子和蛋白质变性。除此之外，优选的是，使血浆或上清液在20－70分钟(优选30－60分钟)期间经受所述温度，因为在该段时间中，补体的组分也被最佳地降解并且产品中所含有的蛋白质和生长因子的保护也被最大化。
冷冻干燥步骤优选包括下列子步骤：
-将血浆或上清液冷冻至低于0℃的温度；
-将血浆或上清液在低于或等于0℃的温度下、在高真空的情况下、在1分钟或更长时间期间、以血浆或上清液中所含有的大部分游离水被蒸发掉的方式进行第一次干燥；
-任选地，将血浆或上清液在高于或等于0℃的温度下、在高真空、低真空或无真空的情况下、在1分钟或更长时间期间、以甚至最后痕量的水蒸气被除去的方式进行第二次干燥，所述最后痕量的水蒸气被除去是通过蒸发血浆或上清液中所含有的未冷冻的水直至达到最终水份低于1%来进行的；
-任选地，将血浆或上清液在高于或等于0℃的温度下、在高真空、低真空或无真空的情况下、在1分钟或更长时间期间、以产品中剩余的任何残余水份通过蒸发被消除并且其水份含量被降低的方式进行第三次干燥，从而改善最终产品的稳定性。
尤其有利的是，将血浆或上清液冷冻至-60－-40℃的温度(优选-50℃)达超过1小时(优选超过2小时)，因为该范围之外的温度、尤其是更低的冷冻温度会增加冷冻后血浆或上清液失去其生物学性质的风险。除此之外，优选的是，将血液复合物冷冻至少1小时以确保血液复合物被均匀地冷冻(该均匀性保证了冷冻干燥的稳定性并且保证了产品的生物学性质不被改变)。
就第一次干燥而言，尤其有利的是，在-60－-40℃的温度和0.05－0.15mBar下(优选在-50℃和0.1mBar下)进行第一次干燥。因此使用低温度范围以便确保产品在升华过程期间被完全冷冻，并且以便保存最初产品的物理、化学和生物学性质，从而避免潜在的冷冻干燥产品的蛋白质的变性。该过程的确切持续时间取决于待冷冻干燥的产品的量，并且已经被确立以确保冰的完全升华，其对于充分干燥而言是必须的。
就第二次干燥而言，尤其有利的是，在+15－+25℃的温度和0.05－0.15mBar下(优选在+20℃和0.1mBar下)进行第二次干燥，因为这些条件使得能通过蒸发消除产品中剩余的任何残余水份并且使得能将其水份含量降至低于1%，目的在于改善最终产品的稳定性。
最后，尤其有利的是，在+15－+25℃的温度下、在高真空的情况下(优选在+20℃下、在高真空的情况下)进行第三次干燥，从而消除任何最后的痕量水份并且提供在均匀性和稳定性方面具有最佳特征的最终产品。
本发明的方法还可以包括过滤血浆或上清液的另外的步骤，以消除或避免高分子量组分、血小板聚集物或纤维蛋白残余物的存在，所述高分子量组分、血小板聚集物或纤维蛋白残余物会影响冷冻过程的均匀性和冷冻干燥过程的稳定性，其进而会对干燥组合物的重新混悬具有不利影响(应考虑的是，冷冻干燥产品的溶出速率与组成它的颗粒的大小成反比，并且干燥组合物中所含有的大颗粒会减缓溶出或者甚至使其不可能溶出)。如果进行该另外的过程，那么在冷冻干燥前(但是不必须在冷冻干燥前即刻)进行血浆或上清液的过滤。另一个需要注意的是，过滤血浆或上清液的步骤不是必需的，例如如果在方法开始时血浆或上清液已经被过滤，则该步骤不是必须的。
方法的实例
下文解释了所述方法的实例，其显示了由干燥组合物制备最终的重新混悬的组合物，而所述干燥组合物是由富含生长因子的上清液并且进行本发明的方法的步骤获得的。
首先，由提取自患者的血液制备富含生长因子的血浆。为了实现该目的，如现有技术中已知的那样，将血液离心以分离其各种级分。随后，将血浆级分借助于PTD(血浆提取装置)提取到9ml的分级试管中。然后将血浆级分活化；活化是通过评估分级试管中含有的血浆体积并且随后加入50μlActivator(基于氯化钙的活化剂)/毫升血浆来进行的。血浆活化等同于是将生长因子从血浆中所含有的血小板中释放出来。
第二，由富含生长因子的血浆获得上清液。为了实现该目的，将已经活化的富含生长因子的血浆于37℃在加热部件中孵育1小时至1.5小时，直至纤维蛋白块完全收缩。然后，由于以下两个主要原因将分级试管在10分钟期间以1000g离心：沉淀已经形成的纤维蛋白块，和提取最大体积的可能被保留在纤维蛋白块内的上清液。此后，将离心的试管放在层流箱中，在层流箱中它们可以被打开，以确保样品的完全无菌。将释放的上清液收集在与钝的肌内针头连接的10ml注射器中。然后从注射器上取下针头，连接0.22μmPVDF过滤器并且过滤上清液。在过滤过程期间，使带有过滤器的注射器与多剂量分配器相连，每个装置施用1ml过滤的上清液。最后，将容器气密性地密封。
接下来，实施本发明的方法，以便由过滤的液体上清液获得最终的干燥组合物。通过放入预先已经加热至56℃的水浴中达30－60分钟将具有过滤的上清液的多剂量容器进行热处理。在该段时间后，立即将容器放入已经被冷却至-50℃的冷冻干燥机中，以便视上清液的体积而定将它们冷冻2－8小时的一段时间，直至样品被均匀地冷冻。此后，在-50℃和0.1mBar下进行第一次干燥达最长24小时。然后，在+20℃和0.1mBar下进行第二次干燥达最长6小时，接下来在+20℃下、在高真空的情况下进行第三次干燥达最长12小时。得到的产品是均匀的且均相的粉末，其显示略微紧密并且当接触水性溶液时能简单地、迅速地重新混悬(即，溶解和恢复至其上清液的最初的稠度)。
最终的干燥组合物需要被重新混悬以便应用。因此，医师或患者必须将一剂最终的干燥组合物浸入在容器内的预定体积的无菌蒸馏水中，然后振摇容器，直至干燥组合物完全溶解，以便获得再次湿的或液体的最终组合物。该最终组合物保持了热处理和冷冻干燥之前的最初的湿上清液的所有生物学性质。然后可以将所述最终组合物直接应用于患者，例如作为滴眼液直接应用于患者。
实验结果
下文描述了三个实验研究的结果，所述三个实验研究是使用所述方法、用本发明的富含生长因子的血浆的上清液和其获得的组合物进行的。下文还详细说明了根据所述结果得出的技术结论。
1.热处理温度对最终的干燥上清液的生物学作用和生长因子水平的 影响
如所提到的那样，根据本发明在适宜的温度下进行热处理使得保存了上清液的生物学性质。换言之，最终的干燥组合物基本上呈现出了与最初的液体上清液相同的性质。
与此相关，在眼表面细胞培养物上进行的实验显示热处理过程(水浴,56℃，处理30分钟)不影响上清液对角膜细胞(HCK)、结膜成纤维细胞(HConF)和角膜上皮细胞的增殖的生物学作用。在体外培养物中所述细胞的倍增与未进行热处理的上清液类似。这可以在图1中观察到，图1显示了三种角膜中每平方厘米中角膜细胞(HCK)的数量，所述三种角膜各自用未进行热处理的常规上清液血浆液体和用已经根据本发明进行了热处理的上清液处理。响应于未进行热处理的常规上清液血浆液体以及响应于已经根据本发明进行了热处理的上清液角膜细胞的增殖几乎相等。在所研究的结膜成纤维细胞和角膜上皮细胞的情况中也出现了相同的结果。
还对常规上清液液体和已经根据本发明进行了热处理的上清液中存在的生长因子水平进行了分析。已经证实，在血小板因子PDGF-AB和TGF-β1方面，热处理不影响它们在最终上清液中的存在。已经进一步证实，所分析的血浆生长因子例如IGF-I的浓度未因为所应用的温度而改变，而其它物质如免疫球蛋白G和M(IgG和IgM)的值分别降低了9%和13%。还证实，当上清液经受了热处理时补体因子D完全消失。这些结果的实例可以在后面的图中观察到。例如，图2显示了在根据本发明进行热处理之前和之后三个供体的上清液中的PDGF-AB水平。如可以看到的那样，所述水平几乎保持恒定(在第一种上清液中它们略微下降，在第二种上清液中它们保持恒定，在第三种上清液中它们略微增加)。另一方面，图3显示了在根据本发明进行热处理之前和之后三个供体的上清液中的补体因子D水平。如可以观察到的那样，因子D存在于最初的上清液液体中，而在热处理的上清液中它完全消失了。
2.冷冻干燥过程对上清液的生物学作用和生长因子水平的影响
如本说明书中已经提到的那样，根据本发明进行的冷冻干燥过程使得能保护上清液的生物学性质。换言之，最终的干燥组合物基本上呈现出与最初的液体上清液相同的性质。
在实验过程中分析了冷冻干燥血浆上清液对结膜成纤维细胞和角膜细胞增殖所具有的作用。结果显示，在所研究的三种上清液(三个供体各自的上清液)中没有任何一种上清液中冷冻干燥不影响所述细胞类型的生长。这可以例如在图4中看到，图4显示了用没有进行热处理的常规上清液血浆液体和用已经根据本发明进行了热处理的上清液处理的三种角膜中每平方厘米中成纤维细胞(HConF)的数量。成纤维细胞的存在保持相对恒定(在第一种上清液中它们略微下降，在第二种上清液中它们略微增加，在第三种上清液中它们略微下降)。
还对常规上清液液体和已经根据本发明进行了冷冻干燥的上清液中存在的生长因子水平进行了分析。已经证实，在冷冻干燥后生长因子水平未改变。这适用于血小板因子例如TGF-β1、PDGF-AB、VEGF和EGF以及血浆因子例如IGF-I或补体因子D。例如，图5显示了未冷冻干燥且未热处理的或者已经根据本发明被冷冻干燥且热处理的三个供体的上清液中生长因子PDGF-AB和TGF-β1的平均浓度；可以观察到，前者的浓度略微增加，而后者的浓度略微降低、但仍然保持是显著高的。类似地，图6显示了未冷冻干燥且未热处理的或者已经根据本发明被冷冻干燥且热处理的三个供体上清液中生长因子VEGF和EGF的浓度；可以观察到，两种因子的浓度均略微增加，但是仍然保持在高值。
3.过滤过程对上清液的生物学作用和生长因子水平的影响
还研究了过滤上清液是否可能对上清液具有任何不希望的生物学影响，或者相反是否其生物学性质保持不变。
体外研究证明，过滤上清液的过程不改变对结膜成纤维细胞、角膜细胞和角膜上皮的增殖的生物学作用。
例如，图7显示了在过滤上清液之前和之后三种上清液液体中每平方厘米中所含有的结膜成纤维细胞(HConF)的数量。如可以观察到的那样，过滤的上清液中结膜成纤维细胞的增殖与未过滤的上清液中结膜成纤维细胞的增殖类似。
在过滤的和未过滤的上清液中测量的生长因子水平方面，已经证实，它们在三个分析的上清液(在所有情况中均源自三个不同的供体)中类似。图8显示了过滤的和未过滤的上清液中TGF-β1生长因子的平均浓度，从而提供了过滤上清液不显著改变所述浓度的证据。这一事实不仅仅适用于血小板α-颗粒中所含有的生长因子(例如TGF-β1、PDGF-AB、VEGF、EGF或TSP-1)，而且也适用于血浆中存在的生长因子例如IGF-I(1型胰岛素样生长因子)或内皮抑制素。在该方面，图9显示了在进行过滤之前和之后三个供体的上清液中的生长因子IGF-I的平均浓度。如可以观察到的那样，IGF-I水平在所有三种情况中均保持几乎恒定。
4.包括过滤、热处理和冷冻干燥步骤的本发明的方法对各种上清液性 质的影响
图10显示了源自用常规的富含生长因子的血浆的上清液(PRGF上清液)和用根据本发明过滤、热处理、冷冻干燥的并随后重新混悬的PRGF上清液处理72小时后的人角膜细胞(HCK)的原代细胞的增殖的图。如可以观察到的那样，在通过本发明的方法获得的上清液中原代细胞的数量略微更高。
图11显示了源自用常规的PRGF上清液和用根据本发明过滤、热处理、冷冻干燥的并随后重新混悬的PRGF上清液处理72小时后的人结膜成纤维细胞(HConF)的原代细胞的增殖的图。像前一段落，在通过本发明的方法获得的上清液中原代细胞的数量略微更高。
图12显示了应用常规PRGF上清液和根据本发明过滤、热处理、冷冻干燥的并随后重新混悬的PRGF上清液对来自人角膜细胞(HCK)的原代细胞培养物的迁移的作用。如可以观察到的那样，在使用常规上清液作为生长培养基的情况下原代细胞的数量仅略微更高。
图13显示了应用常规PRGF上清液和根据本发明过滤、热处理、冷冻干燥的并随后重新混悬的PRGF上清液对进行24小时细胞孵育之后的来自人结膜成纤维细胞(HConF)的原代细胞培养物的迁移的作用。如可以观察到的那样，在两种情况中行为十分类似，但是根据本发明获得的上清液的结果稍微更好。
总之，在分析了所有实验结果的图后，可以得出结论：最终的重新混悬的组合物的性质的行为和性质与需要立即应用的常规上清液的行为和性质非常类似(有轻微的无关紧要的变化)。因此，可以得出结论：一方面，过滤、热处理和冷冻干燥湿上清液以获得干燥的可重新混悬的产品这一事实不影响产品性质，另一方面，它提供了本文献中所列举的大量益处。

Claims (18)

1.获得含有生长因子的组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供含有血小板释放的生长因子的富含血小板的血浆或含有血小板释放的生长因子的富含血小板的血浆的上清液，然后进行下列操作之一：
(I)
(b)对含有血小板释放的生长因子的富含血小板的血浆或其上清液进行热处理，其中富含血小板的血浆或其上清液的温度升高，且
(c)冷冻干燥(I)(b)的热处理的含有血小板释放的生长因子的富含血小板的血浆或其上清液，或者
(II)
(b’)冷冻干燥含有血小板释放的生长因子的富含血小板的血浆或其上清液，由此得到冻干物，且
(c’)对(b’)的冻干物进行热处理，由此冻干物的温度升高，
其中所述步骤(a)包括使富含血小板的血浆或其上清液与活化凝固的物质接触以人工诱导生长因子的释放，由此血小板释放生长因子，获得含有释放的生长因子的所述富含血小板的血浆或其上清液，
其中(I)(c)或(II)(b’)的冷冻干燥为所述血浆或其上清液经历的第一次干燥，且
其中在(I)(b)或(II)(c’)的热处理中，(I)的富含血小板的血浆或其上清液或(II)的冻干物在50－60℃的温度处理20－70分钟。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于冷冻干燥在不添加佐剂的情况下进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其中适用(I)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
-所述热处理包括使所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液经受56℃的温度30－60分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于冷冻干燥步骤包括以下步骤：
-将所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液冷冻至低于0℃的温度；和
-在低于或等于0℃的温度下、在高真空中、在1分钟或更长时间期间进行所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液的第一次干燥。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
-将所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液冷冻至-60－-40℃的温度达超过1小时；和
-在-60－-40℃的温度下、在0.05－0.15mBar的压力下进行所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液的第一次干燥。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
-所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液的冷冻在-50℃的温度下进行超过2小时；和
-在-50℃的温度下、在0.1mBar的压力下进行所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液的第一次干燥。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于冷冻干燥步骤包括下面的另外的步骤：
-在高于或等于0℃的温度下、在高真空中、在1分钟或更长时间期间进行所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液的第二次干燥。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：
-在+15－+25℃的温度下、在0.05－0.15mBar的压力下进行所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液的第二次干燥。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：
-在+20℃的温度和0.1mBar的压力下进行所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液的第二次干燥。
11.根据权利要求5所述的方法，其特征在于冷冻干燥步骤包括下面的另外的步骤：
-在高于或等于0℃的温度下、在低真空或无真空的情况下、在1分钟或更长时间期间进行所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液的第二次干燥。
12.根据权利要求8所述的方法，其特征在于其包括下面的另外的步骤：
-在高于或等于0℃的温度下、在高真空的情况下、在1分钟或更长时间期间进行所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液的第三次干燥。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于：
-在+15－+25℃的温度下、在高真空的情况下进行所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液的第三次干燥。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：
-在+20℃下、在高真空的情况下进行所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液的第三次干燥。
15.根据权利要求8所述的方法，其特征在于其包括下面的另外的步骤：
-在高于或等于0℃的温度下、在低真空或无真空的情况下、在1分钟或更长时间期间进行所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液的第三次干燥。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于其包括下面的另外的步骤：过滤所述富含血小板的血浆或所述富含血小板的血浆的上清液，该步骤在冷冻干燥前进行。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于由于热处理，所述血浆或上清液或所述冻干物中的补体和/或免疫球蛋白的含量减少。
18.获得含有生长因子的组合物的方法，其包括以下步骤：
(a)提供含有血小板释放的生长因子的富含血小板的血浆或含有血小板释放的生长因子的富含血小板的血浆的上清液，然后进行下列操作之一：
(I)
(b)对含有血小板释放的生长因子的富含血小板的血浆或其上清液进行热处理，其中富含血小板的血浆或其上清液的温度升高，且
(c)冷冻干燥(I)(b)的热处理的含有血小板释放的生长因子的富含血小板的血浆或其上清液，或者
(II)
(b’)冷冻干燥含有血小板释放的生长因子的富含血小板的血浆或其上清液，由此得到冻干物，且
(c’)对(b’)的冻干物进行热处理，由此冻干物的温度升高，
其中在(I)(b)或(II)(c’)的热处理中，(I)的富含血小板的血浆或其上清液或(II)的冻干物在50－60℃的温度处理20－70分钟。
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