KR20140054026A - 단백질을 안정화시키는 제제 - Google Patents

Abstract

일 측면에서, 본 발명은 단백질을 안정화시키는 제제를 제공하며, 제제는 완충제를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 완충제는 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함하거나, 또는 완충제는 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 단백질은 치료 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 치료 단백질은 항트롬빈이다.

Description

단백질을 안정화시키는 제제{FORMULATIONS THAT STABILIZE PROTEINS}

본 발명의 개시는 항트롬빈과 같은 치료 단백질을 포함한 단백질을 안정화시키는 제제를 제공한다.

치료 단백질의 제한된 안정성은 약학 산업에서 투여될 최종 치료 단백질 제제의 제조 단계 동안 그리고 이의 저장(보관) 동안 둘 모두의 경우에 일반적으로 문제가 된다. 예를 들어, 치료 단백질의 제조 동안 (예를 들어, 합성적으로, 재조합적으로 또는 유전자 이식으로(transgenically)), 단백질은 종종 다양한 정제 단계와 가공(처리) 단계 사이의 긴 시간 동안 저장되며, 제제 성분들은 치료 단백질의 안정성에 영향을 미칠 수 있다.

발명의 요약

일 측면에서, 본 발명의 개시는 치료 단백질과 같은 단백질을 안정화시키는 제제를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제(buffer)를 포함하고, 완충제는 인산일수소(mono-hydrogen-phosphate)와 인산이수소(di-hydrogen-phosphate)를 포함하고, 인산일수소 및 인산이수소는 동일한 카운터 이온을 가진다. 몇몇 실시양태에서, 카운터 이온은 나트륨 또는 칼륨이다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제를 포함하고, 완충제는 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제를 포함하고, 완충제는 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제를 포함하고, 완충제는 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨으로 실질적으로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제를 포함하고, 완충제는 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨으로 실질적으로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 인산일수소나트륨 및 인산이수소칼륨을 둘다 포함하는 것은 아니다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 인산일수소칼륨 및 인산이수소나트륨을 둘다 포함하는 것은 아니다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 치료 단백질을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 치료 단백질은 항트롬빈(antithrombin)이다.

일 측면에서 본 발명의 개시는 치료 단백질 및 완충제를 포함하는 제제를 제공하고, 완충제는 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함하거나, 또는 완충제는 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함한다. 본원에 개시된 제제들 중 임의의 제제의 몇몇 실시양태에서, 완충제는 10 mM 내지 100 mM의 농도를 가진다. 본원에 개시된 제제들 중 임의의 제제의 몇몇 실시양태에서, 완충제는 50 mM의 농도를 가진다. 본원에 개시된 제제들 중 임의의 제제의 몇몇 실시양태에서, 제제는 염화칼륨을 추가로 포함한다. 본원에 개시된 제제들 중 임의의 제제의 몇몇 실시양태에서, 염화칼륨은 100 내지 150 mM의 농도를 가진다. 본원에 개시된 제제들 중 임의의 제제의 몇몇 실시양태에서, 염화칼륨은 120 mM의 농도를 가진다. 본원에 개시된 제제들 중 임의의 제제의 몇몇 실시양태에서, 제제의 pH는 7.5 내지 8.5이다. 본원에 개시된 제제들 중 임의의 제제의 몇몇 실시양태에서, 제제의 pH는 8이다. 본원에 개시된 제제들 중 임의의 제제의 몇몇 실시양태에서, 치료 단백질은 항트롬빈이다. 본원에 개시된 제제들 중 임의의 제제의 몇몇 실시양태에서, 제제는 정화된 유제품(clarified milk product)을 포함한다. 본원에 개시된 제제들 중 임의의 제제의 몇몇 실시양태에서, 제제는 추가 단백질을 포함한다.

일 측면에서 본 발명의 개시는 항트롬빈을 포함하는 제제를 제공한다. 본원에 개시된 항트롬빈을 포함한 제제들 중 임의의 제제의 몇몇 실시양태에서, 항트롬빈은 저장 이전의 헤파린 결합 기능성(heparin binding functionality)와 비교해서 2-8℃에서 3개월간 저장 후 90% 이상의 헤파린 결합 기능성을 유지한다. 본원에 개시된 항트롬빈을 포함한 제제들 중 임의의 제제의 몇몇 실시양태에서, 2-8℃에서 3개월간 저장 후 응집된 형태인 항트롬빈의 양(중량)에 있어 증가는 저장 이전의 응집된 형태인 항트롬빈의 양(중량)과 비교해서 3배 미만이다. 본원에 개시된 항트롬빈을 포함한 제제들 중 임의의 제제의 몇몇 실시양태에서, 2-8℃에서 3개월간 저장 후 항트롬빈의 산화량에 있어 증가는 저장 이전의 항트롬빈의 산화량과 비교해서 2배 미만이다.

일 측면에서 본 발명의 개시는 치료 단백질을 안정화시키는 제제를 제조하는 방법을 제공하며, 본 방법은 완충제를 포함하는 용액을 제공하는 단계로서, 완충제가 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함하거나, 또는 완충제가 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함하는 것인 단계, 및 치료 단백질을 상기 용액에 첨가하여 치료 단백질을 안정화시키는 제제를 생성하는 단계를 포함한다.

일 측면에서 본 발명의 개시는 치료 단백질을 안정화시키는 제제를 제조하는 방법을 제공하며, 본 방법은 치료 단백질을 포함하는 용액을 제공하는 단계, 및 완충제를 상기 용액에 첨가하여 치료 단백질을 안정화시키는 제제를 생성하는 단계로서, 완충제가 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함하거나, 또는 완충제가 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함하는 것인 단계를 포함한다.

본원에 개시된 방법들 중 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 완충제의 최종 농도(resulting concentration)는 50 mM이다. 본원에 개시된 방법들 중 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 제제는 염화칼륨을 추가로 포함한다. 본원에 개시된 방법들 중 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 용액의 최종 pH는 pH 8이다. 본원에 개시된 방법들 중 임의의 방법의 몇몇 실시양태에서, 치료 단백질은 항트롬빈이다.

일 측면에서 본 발명의 개시는 항트롬빈을 안정화시키는 제제를 제조하는 방법을 제공하며, 본 방법은 항트롬빈을 포함하는 밀크 조성물로부터 항트롬빈을 분리하여 항트롬빈을 포함하는 용액을 생성하는 단계, 항트롬빈을 포함하는 용액을 저온살균(pasteurizing)하는 단계, 항트롬빈을 포함하는 용액을 완충제로 교환하여 항트롬빈을 안정화시키는 제제를 생성하는 단계로서, 완충제가 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함하거나, 또는 완충제가 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함하는 것인 단계를 포함한다.

본 발명의 각 한정사항은 본 발명의 다양한 실시양태를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 일 요소 또는 요소들의 조합을 포함하는 본 발명의 각 한정사항은 본 발명의 각 측면에 포함될 수 있음이 예상된다. 본 발명은 하기 상세한 설명 또는 도면에 나타낸 성분들의 구성 및 배열에 대한 상세 내역에 이의 적용이 제한되는 것이 아니다. 본 발명은 다른 실시양태일 수 있고 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본원에 사용된 표현 및 용어는 설명을 위한 것이고 제한적인 의미로 해석되지 말아야 한다.

도 1은 다양한 완충제에서 동결/해동 후 항트롬빈의 산화 상태를 도시한다.
도 2는 다양한 완충제에서 동결/해동 후 항트롬빈의 헤파린 친화도를 도시한다.
도 3은 다양한 완충제에서 동결/해동 후 항트롬빈의 응집(aggregation)을 도시한다.
도 4는 다양한 완충제에서 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 산화 상태를 도시한다.
도 5는 다양한 완충제에서 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 헤파린 친화도를 도시한다.
도 6은 다양한 완충제에서 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 응집을 도시한다.
도 7은 인산염계에서 동결/해동 후 항트롬빈의 안정성 파라미터에 대한 개요를 제공한다.
도 8은 인산염계에서 1 개월간 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 안정성 파라미터에 대한 개요를 제공한다.
도 9는 인산염계에서 3 개월간 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 안정성 파라미터에 대한 개요를 제공한다.
도 10은 다양한 완충제에서 1 개월간 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 안정성 파라미터에 대한 개요를 제공한다.
도 11은 염화칼륨을 포함한 다양한 완충제에서 동결/해동 후 항트롬빈의 산화 상태를 도시한다.
도 12는 염화칼륨을 포함한 다양한 완충제에서 동결/해동 후 항트롬빈의 헤파린 친화도를 도시한다.
도 13은 염화칼륨을 포함한 다양한 완충제에서 동결/해동 후 항트롬빈의 응집을 도시한다.
도 14는 염화칼륨을 포함한 다양한 완충제에서 동결/해동 후 항트롬빈의 안정성 파라미터에 대한 개요를 제공한다.
도 15는 염화칼륨을 포함한 다양한 완충제에서 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 산화 상태를 도시한다.
도 16은 염화칼륨을 포함한 다양한 완충제에서 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 헤파린 친화도를 도시한다.
도 17은 염화칼륨을 포함한 다양한 완충제에서 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 응집을 도시한다.
도 18은 염화칼륨을 포함한 다양한 완충제에서 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 안정성 파라미터에 대한 개요를 제공한다.
도 19는 24개월의 기간에 걸쳐 항트롬빈의 산화를 도시한다.
도 20은 24개월의 기간에 걸쳐 항트롬빈의 응집을 도시한다.
도 21은 24개월의 기간에 걸쳐 항트롬빈의 헤파린 친화도를 도시한다.
도 22는 통상적인 공정을 이용한 헤파린 용출물(eluate)의 처리량(throughput) 데이터를 도시한다.
도 23은 정화된 밀크를 이용한 헤파린 용출물의 처리량 데이터를 도시한다.
도 24는 헤파린 용출물의 SDS PAGE를 도시한다.
도 25는 항트롬빈 제제 로트(lot) #300-21-DS의 안정성을 도시한다.
도 26은 항트롬빈 제제 로트 #300-22-DS의 안정성을 도시한다.
도 27은 항트롬빈 제제 로트 #300-23-DS의 안정성을 도시한다.
도 28은 항트롬빈 제제의 산화를 도시한다.
도 29는 항트롬빈 제제의 헤파린 친화도를 도시한다.
도 30은 항트롬빈 제제의 응집을 도시한다.
도 31은 항트롬빈 제제의 단백질 농도를 도시한다.
도 32는 항트롬빈 제제의 트롬빈 억제 활성을 도시한다.
도 33은 항트롬빈 제제의 고유 활성(specific activity)을 도시한다.
도면은 단지 설명을 위한 것이고 본 발명의 개시의 구현을 위해 필수적인 것은 아니다.

일 측면에서, 본 발명의 개시는 치료 단백질과 같은 단백질을 안정화시키는 제제를 제공한다.

본원에서 사용된 치료 단백질은 질병 또는 장애를 치료하기 위해 피험체에 투여될 수 있는 단백질이다. 치료 단백질은 살아있는 유기체, 예컨대 박테리아, 식물, 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포주 및 트랜스제닉 포유동물에 의해 생산되는 단백질, 및 합성적으로 생산되는 단백질을 포함한다. 치료 단백질의 예는 항체(예를 들면, 단일클론 항체), 혈액 단백질(예를 들면, 인자 VIII), 효소(예를 들면, 알파 갈락토시다제) 및 인슐린과 같은 호르몬을 포함한다. 본원에서 사용된 단백질 (및 치료 단백질)은 또한 (예를 들면, 글리코실화에 의해, 또는 라벨링에 의해) 변형되어진 단백질 (및 치료 단백질)을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제를 포함하고, 완충제는 인산일수소 및 인산이수소를 포함하며, 인산일수소 및 인산이수소는 동일한 카운터 이온을 가진다. 몇몇 실시양태에서, 카운터 이온은 나트륨 또는 칼륨이다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제를 포함하고, 완충제는 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제를 포함하고, 완충제는 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제를 포함하고, 완충제는 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨으로 실질적으로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제를 포함하고, 완충제는 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨으로 실질적으로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 인산일수소나트륨 및 인산이수소칼륨를 둘다 포함하는 것은 아니다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 인산일수소칼륨 및 인산이수소나트륨을 둘다 포함하는 것은 아니다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 단백질을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 치료 단백질을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 치료 단백질은 항트롬빈이다.

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 개시는 단백질의 안정성을 손상시킴이 없이 단백질의 장기간 저장을 허용하는 제제를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 제제는 제조 및 정제 공정의 상이한 단계에서 단백질(예를 들면, 치료 단백질)의 장기간 저장을 허용한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 제제는 단백질 안정성을 유지하면서 고온에서(즉, -20℃, 4℃, 또는 실온에서) 단백질(예를 들면, 치료 단백질)의 장기간 저장을 허용한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 제제는 단백질 안정성을 유지하면서 보다 저온에서(즉, -40℃ 또는 -60℃에서) 단백질(예를 들면, 치료 단백질)의 장기간 저장을 허용한다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 제제는, 심지어 저장 조건이 이상적이지 않더라도, 예를 들어 단백질(예를 들면, 치료 단백질)을 포함하는 제제가 동결-해동 사이클을 겪더라도 단백질(예를 들면, 치료 단백질)의 안정성을 유지한다.

놀랍게도 본원에서, 완충제를 포함하는 제제로서, 완충제가 인산일수소 및 인산이수소를 포함하고 두 인산염 이온이 동일한 카운터 이온을 갖는 제제가 단백질의 안정성을 유지하는 것을 밝혀내었다. 이에, 일 측면에서 본 발명의 개시는 완충제를 포함하는 제제로서, 완충제가 인산일수소 및 인산이수소를 포함하고, 두 인산염 이온이 동일한 카운터 이온을 갖는 제제를 제공한다. 또한, 본원에서 놀랍게도, 완충제를 포함하는 제제로서, 완충제가 인산일수소 및 인산이수소를 포함하고, 두 인산염 이온이 동일한 카운터-이온을 가지지 않는 제제가 단백질의 안정성을 유지하지 못하는 것을 밝혀내었다.

완충제를 포함하되, 완충제가 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함하는 제제와, 완충제를 포함하되, 완충제가 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함하는 제제는 치료 단백질을 안정화시키는 것으로 밝혀졌다. 이에 반해, 완충제를 포함하되, 완충제가 인산일수소칼륨 및 인산이수소나트륨을 포함하는 제제, 또는 완충제를 포함하되, 완충제가 인산일수소나트륨 및 인산이수소칼륨을 포함하는 제제는 치료 단백질을 안정화시키지 못했다.

몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 제제는 단백질을 안정화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 제제는 치료 단백질을 안정화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 치료 단백질은 항트롬빈이다.

본원에 개시된 제제는 단백질의 제조 방법(예를 들면, 유전자 이식으로, 재조합으로 또는 합성으로)에 상관없이 단백질을 안정화시키는데 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 제제는 밀크-생산된(milk-produced) 단백질을 안정화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 제제는 재조합으로 생성된 단백질을 안정화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 제제는 밀크-생산된 치료 단백질을 안정화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 제제는 재조합으로 생성된 치료 단백질을 안정화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 제제는 밀크-생산된 항트롬빈을 안정화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 개시된 제제는 재조합으로 생산된 항트롬빈을 안정화시킨다.

본원에 개시된 제제는 단백질의 제조 공정의 임의 단계 동안 단백질을 안정화시키는데 사용될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 제제는 채취(harvest) 단계 직후(예를 들면, 트랜스제닉 동물의 젖(밀크)으로부터 단백질을 채취한 직후, 용해된(lysed) 세포로부터 단백질을 채취한 직후, 또는 상기 단백질을 합성한 직후) 단백질을 안정화시키는데 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 밀크를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 용해된 세포로부터의 성분 또는 단백질 합성으로부터의 성분을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 제제는 단지 부분적으로 정제된 단백질을 안정화시키는데 사용된다. 예를 들어, 단백질은 채취되어, 본원에 개시된 임의의 제제를 생성하기 위해 본원에 개시된 임의의 완충제와 배합되기 이전에 1 또는 2 단계 정제 처리될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 정화된 유제품을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 부분적으로 정제된 세포 용해물로부터의 성분 또는 부분적으로 정제된 단백질 합성 반응으로부터의 성분을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 안정화될 단백질(예를 들면, 치료 단백질) 이외에 1종 이상의 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 비(non)-단백질 성분을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 단백질을 포함한 조성물 또는 용액은 본원에 개시된 임의의 제제를 생성하기 위해 본원에 개시된 임의의 완충제와 배합되기 이전에 복수의 정제 단계를 겪을 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 단백질을 포함한 조성물 또는 용액은 본원에 개시된 임의의 완충제(예를 들면, 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨, 또는 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨)와 단백질을 배합하기 이전에 저온살균된다. 단백질은 본원에 개시된 임의의 완충제와 배합되기 이전에 저온살균 및 정제 단계를 함께 겪을 수 있다. 이에, 예를 들어, 단백질(예를 들면, 치료 단백질)은, 단백질이 본원에 개시된 임의의 완충제와 배합되기 이전에, 제1 정제 단계, 저온살균 단계 및 제2 정제 단계를 겪을 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 단백질은 트랜스제닉 동물의 젖에서 생산되고 단백질은 트랜스제닉 동물의 젖으로부터 채취된다. 몇몇 실시양태에서, 밀크 용액은 불용성 성분을 제거하기 위해 정화된다. 몇몇 실시양태에서, 밀크는 여과에 의해 정화된다. 몇몇 실시양태에서, 추가 정제 단계가 수행되지 않고 이러한 부분적인 정제 단계 후에 성분들이 첨가되어 본원에 개시된 치료 단백질을 포함한 제제를 생성한다. 몇몇 실시양태에서, 치료 단백질을 포함한 제제는 투여 이전에 추가로 정제된다. 몇몇 실시양태에서, 치료 단백질을 포함한 제제는 투여를 위해 추가 정제 이전에 선적(shipment)된다. 몇몇 실시양태에서, 치료 단백질을 포함한 제제는 선적 및/또는 투여 이전에, 예를 들어 바이러스 및 바이러스 입자를 제거하기 위해 나노여과된다.

몇몇 실시양태에서, 단백질 제제는 제제의 단백질의 안정성 분석을 위해 정제된다. 몇몇 실시양태에서, 단백질은 항트롬빈이고 제제는 불순물을 제거하기 위해 제제를 헤파린 컬럼과 접촉시킴으로써 정제된다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 제제를 양이온 교환 컬럼과 접촉시킴으로써 정제된다. 몇몇 실시양태에서, 단백질의 안정성은 "안정성 지시자(indicator)", 예를 들면 응집, 제제 정제 후 산화를 측정함으로써 분석된다. 몇몇 실시양태에서, 단백질은 항트롬빈이고 제제는 "안정성 지시자", 예를 들면 응집, 헤파린 컬럼 및 양이온 교환 컬럼 상에서 제제의 정제 후 산화를 측정함으로써 분석된다.

본 발명의 개시는 본원에 개시된 단백질을 포함한 제제를 확립하는 (establishing) 임의의 방법을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 단백질은 (예를 들면, 고형물로서 또는 농축물로서) 본원에 기재된 임의의 완충제에 첨가되어 본 발명의 제제를 생성한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 1종 이상의 완충제 성분(예를 들면, 인산칼륨의 농축물)을 단백질을 포함한 조성물 또는 용액에 첨가함으로써 확립된다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 안정화될 단백질을 포함하는 조성물 또는 용액의 완충제를 본 발명의 완충제(예를 들면, 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨 또는 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨)로 교체함으로써 확립된다. 완충제의 교체는 예를 들면, 안정화될 단백질을 포함한 조성물 또는 용액을 컬럼에 첨가하여 단백질을 고정화시키고 단백질을 본원에 개시된 완충제(예를 들면, 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨, 또는 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨)로 용출함으로써 행해질 수 있다. 본원에 기재된 제제를 확립하기 위해 앞서 기재된 방법들의 조합이 또한 포함된다.

안정성

일 측면에서, 본 발명의 개시는 단백질을 안정화시키는 제제를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 단백질은 치료 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 치료 단백질은 항트롬빈이다.

본원에서 사용된 "단백질을 안정화시키는 제제"는 소정 기간에 걸쳐(예를 들면, 1개월 또는 2개월), 바람직하게는 고온에서(예를 들면, -20℃ 또는 4℃), 또는 1회 이상의 동결/해동 사이클을 겪은 후, 단백질의 안정성을 유지하는 제제이다.

본원에 개시된 제제는 소정 기간에 걸쳐 단백질을 안정화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 1일 초과, 2일 초과, 5일 초과, 1주 초과, 1개월 초과, 2개월 초과, 1년 초과, 최대 10년의 기간에 걸쳐 단백질을 안정화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 1년 초과 동안 단백질을 안정화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 2년간 단백질을 안정화시킨다.

몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 제제는 고온에서 단백질을 안정화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 고온(elevated temperature)은 -60℃ 초과, -50℃ 초과, -40℃ 초과, -30℃ 초과, -20℃ 초과, -10℃ 초과, 0℃ 초과, 또는 20℃ 초과이다. 몇몇 실시양태에서, 고온은 -20℃이다. 다른 실시양태에서, 고온은 0℃ 내지 -60℃, 0℃ 내지 -50℃, 0℃ 내지 -40℃, 0℃ 내지 -30℃, 0℃ 내지 -20℃, 0℃ 내지 20℃, 또는 2℃ 내지 8℃ 범위 내이다. 몇몇 실시양태에서, 고온은 2℃ 내지 8℃ 범위 내이다. 몇몇 실시양태에서, 본원에 개시된 제제는 심지어 제제가 1회 이상의 동결-해동 사이클을 겪더라도 단백질을 안정화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 -20℃에서 2년간 단백질을 안정화시킨다.

본원에서 사용된 "단백질의 안정성"은 소정 기간에 걸쳐 단백질의 구조적 온전성(structural integrity) 및 기능성(functionality)의 지속을 나타낸다. 이에, 단백질이 자신의 구조적 온전성 및 자신의 기능성(예를 들면, 생물학적 기능성)을 정해진 기간에 걸쳐 유지한다면 단백질은 안정하다. 마찬가지로, 앞서 기재한 바와 같이, 단백질을 안정화시키는 제제는 소정 기간에 걸쳐 단백질의 안정성을 유지하는 제제이다.

단백질의 구조적 온전성은 단백질의 폴리펩티드 사슬의 형태(conformation)의 온전성 및 폴리펩티드 사슬에서 아미노산과 아미노산 측쇄의 화학적 성질(chemistry)의 온전성을 의미한다. 구조적 온전성을 유지한 단백질은 폴리펩티드 사슬의 형태와 폴리펩티드 사슬에서 아미노산과 아미노산 측쇄의 화학적 성질을 유지하는 단백질이다. 예를 들어, 단백질은 폴리펩티드가 소정 기간 이전과 비교해서 소정 기간 이후에 동일한 형태를 가진다면 그리고 폴리펩티드 사슬에서 아미노산과 아미노산 측쇄의 화학적 성질이 그러한 소정 기간 동안 변화하지 않는다면 그러한 소정 기간에 걸쳐 구조적 온전성을 유지하고 있다. 동일한 올리고머화 상태를 유지하는 것은 또한 단백질의 구조적 온전성의 척도인 것으로 이해해야 한다. 이에, 단백질이 동일한 올리고머화 상태를 유지한다면(예를 들어, 단량체로 남는다면) 그 단백질은 마찬가지로 구조적 온전성을 유지하는 것이다. 업계의 통상의 기술을 가진 자는 단백질의 구조적 온전성(형태, 아미노산의 화학적 성질 및 올리고머화 상태)을 측정하는 방법을 숙지하고 있을 것이다. 단백질의 형태는 X-선 결정학을 포함한 표준 실험실 기법, 원형 이색성 분광분석 및 형광 분광분석을 포함한 분광분석, 및 핵 자기 공명을 사용하여 측정될 수 있다. 측쇄의 화학적 성질을 포함한 아미노산의 화학적 성질은, 특정 화학 기의 존재에 대한 시험을 위한 화학 반응(예를 들면, 측쇄의 산화 상태 측정)에 의해 또는 단백질의 구조를 결정할 수 있는 상술된 실험실 기법에 의해 측정될 수 있다. 단백질의 올리고머화 상태는 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해 측정될 수 있다.

단백질의 기능성은 단백질이 수행하는 기능(예를 들면, 생물학적 기능)을 지칭한다. 기능성을 유지하는 단백질은 특정 (생물학적) 기능을 수행하는 능력을 유지하는 단백질이다. 예를 들면, 단백질은, 단백질이 소정 기간 이전에 특정 기능을 수행하는 능력과 비교해서 그러한 기간에 걸쳐 동일한 능력을 가진다면 그러한 기간에 걸쳐 기능성을 유지하고 있는 것이다. 기능성의 예는 효소 반응을 실시하거나(예를 들면, 펩티드 결합을 절단하거나), 표적에 결합하거나(예를 들면, 수용체를 차단하거나) 또는 세포 반응을 유도하는(예를 들면, 수용체를 활성화함으로써) 능력을 포함한다. 각 단백질의 기능성을 결정하는 구체적인 방법은 단백질의 성질에 좌우될 것이다. 업계의 통상의 기술을 가진 자는 특정 단백질의 기능적 활성을 측정하기 위해 어떠한 기능적 분석이 필요한지를 확인하기 위해 업계에 공지된 방법들을 사용할 수 있다. 단백질의 기능성들 중 다수는 표적으로의 단백질의 결합을 필요로 한다. 이에, 단백질의 기능성은 종종, 단백질이 특정 표적에 결합할 수 있는지를 조사함으로써 측정될 수 있다. 이러한 결합은 구조적 분석에서 (결합이 존재하는지) 또는 기능적 분석에서 (단백질이 자신의 생물학적 기능을 수행할 수 있는지, 예를 들면, 단백질이 세포 신호전달 캐스케이드를 개시할 수 있는지, 단백질이 효소 기능을 수행할 수 있는지, 단백질이 단백질-단백질 상호작용을 차단할 수 있는지) 측정될 수 있다. 기능적 분석의 예는 결합 분석, 효소 분석 및 세포 분석이다.

몇몇 실시양태에서, 단백질의 안정성은 소정 기간의 시작에서 단백질의 구조적 온전성 및/또는 기능성을 소정 기간의 말미에(예를 들면, 3개월 기간) 단백질의 구조적 온전성 및/또는 기능성과 비교함으로써 측정된다. 예를 들면, 단백질의 응집 백분율(%)을 소정 기간 이전에 측정하고 이를 소정 기간 이후 단백질의 응집률%과 비교한다.

몇몇 실시양태에서, 단백질의 안정성은 상이한 저장 조건에서 단백질의 구조적 온전성 및/또는 기능성을 비교함으로써 측정된다. 예를 들면, 단백질의 응집률%을 정해진 기간에 걸쳐 2-8℃에서 저장된 제1 분취량에서 측정하고 이를 동일한 기간에 걸쳐 -20℃에서 저장된 제2 분취량과 비교한다.

몇몇 실시양태에서, 단백질의 안정성은 상이한 조건, 시점과 비교함이 없이 단백질의 구조적 온전성 및/또는 기능성의 절대값을 측정으로써 결정된다. 예를 들면, 단백질의 응집률%을 정해진 기간 후에 측정하고 이를 소정의 표준과 비교한다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 정해진 샘플 중의 5% 미만의 단백질이 응집한다면 단백질은 안정한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 단백질 제제는 상기 제제 중의 단백질의 응집률%이 상기 제제의 나노여과를 허용할 정도로 충분히 낮다면 안정한 것으로 간주된다. 몇몇 실시양태에서, 나노여과는 단백질 제제가 선적 및/또는 투여를 위해 허용가능한지: 상기 제제가 나노필터를 통과할 수 있는지, 상기 제제가 선적을 위해 허용가능한지를 판단하기 위한 시험으로써 사용된다.

몇몇 실시양태에서, 단백질 안정성은 소정 기간 (예를 들면, 1개월, 2개월, 또는 3개월) 전과 후에 단백질의 구조적 온전성 및/또는 기능성을 비교함으로써 결정된다. 몇몇 실시양태에서, 소정 기간 이전의 구조적 온전성 및/또는 기능성과 비교해서 그러한 소정 기간 후에 구조적 온전성 및/또는 기능성이 50% 초과하여, 60% 초과하여, 70% 초과하여, 80% 초과하여, 90% 초과하여, 91% 초과하여, 등, 최대 99% 초과하여 유지된다면 단백질은 안정화된 것이다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 단백질을 3개월간 저장했을 때 저장 이전의 기능성과 비교해서 단백질의 기능성이 95%를 초과하여 유지된다면 단백질은 안정화된 것이다.

몇몇 실시양태에서, 단백질 안정성은, 단백질을 상이한 온도에서 소정 기간 (예를 들면, 1개월, 2개월, 또는 3개월) 동안 저장했을 때 구조적 온전성 및/또는 기능성을 비교함으로써 결정된다. 몇몇 실시양태에서, 단백질을 고온에서 저장했을 때 보다 저온에서의 저장과 비교해서 구조적 온전성 및/또는 기능성이 50% 초과하여, 60% 초과하여, 70% 초과하여, 80% 초과하여, 90% 초과하여, 91% 초과하여, 등, 최대 99% 초과하여 유지된다면 단백질은 안정화된 것이다. 예를 들면, 몇몇 실시양태에서, 단백질을 고온에서(예를 들면, 2℃-8℃) 저장했을 때 보다 저온에서의(예를 들면, -20℃) 저장과 비교해서 단백질의 기능성이 95% 초과하여 유지된다면 단백질은 안정화된 것이다.

몇몇 실시양태에서, 안정성이 측정될 단백질은 치료 단백질이다. 몇몇 실시양태에서, 치료 단백질은 항트롬빈이다. 몇몇 실시양태에서 항트롬빈의 안정성은 헤파린에 결합할 수 있는 항트롬빈의 백분율 또는 양을 측정함으로써 결정된다. 몇몇 실시양태에서 항트롬빈의 안정성은 응집되는 항트롬빈의 백분율 또는 양(중량)을 측정함으로써 결정된다. 몇몇 실시양태에서 항트롬빈의 안정성은 산화되어진 항트롬빈의 백분율을 측정함으로써 결정된다.

몇몇 실시양태에서, 항트롬빈의 안정성은 저장 이전과 소정 기간 동안 저장 이후 헤파린에 결합하는 능력을 비교함으로써 결정된다. 몇몇 실시양태에서, 항트롬빈의 안정성은 고온에서 저장된 제1 분취량 중의 헤파린에 결합하는 능력을 동일 기간 동안 보다 저온에서 저장된 분취량과 비교함으로써 결정된다. 몇몇 실시양태에서, 저장 전과 비교해서 소정 기간 동안 저장 후 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 91% 초과, 등, 최대 99% 초과의 항트롬빈이 헤파린에 결합할 수 있다면 항트롬빈은 안정화된 것이다. 몇몇 실시양태에서, 동일 기간 동안 보다 저온에서 저장된 분취량과 비교해서 고온에서 저장 후 50% 초과, 60% 초과, 70% 초과, 80% 초과, 90% 초과, 91% 초과, 등, 최대 99% 초과의 항트롬빈이 헤파린과 결합할 수 있다면 항트롬빈은 안정화된 것이다. 몇몇 실시양태에서, 항트롬빈을 소정 기간(예를 들면, 3개월) 동안 고온에서(예를 들면, 2℃ - 8℃) 저장한 경우 보다 저온(예를 들면, -20℃)과 비교해서 95% 초과의 항트롬빈이 헤파린과 결합할 수 있다면 항트롬빈은 안정화된 것이다.

몇몇 실시양태에서, 항트롬빈의 안정성은 저장 이전과 소정 기간 동안 저장 이후에 항트롬빈의 응집(중량으로)을 비교함으로써 결정된다. 몇몇 실시양태에서, 항트롬빈의 안정성은 고온에서 저장된 제1 분취량 중의 항트롬빈의 응집(중량으로)을 동일 기간 동안 보다 저온에서 저장된 분취량과 비교함으로써 결정된다. 몇몇 실시양태에서, 저장 전 응집 양과 비교했을 때 저장 후 10배 미만, 9배 미만, 8배 미만, 7배 미만, 6배 미만, 5배 미만, 4배 미만, 3배 미만, 2배 미만, 1.5배 미만 및 최대 동일량의 항트롬빈이 응집된 형태라면 항트롬빈은 안정화된 것이다. 몇몇 실시양태에서, 항트롬빈을 고온에서 저장했을 때 보다 저온과 비교해서 10배 미만, 9배 미만, 8배 미만, 7배 미만, 6배 미만, 5배 미만, 4배 미만, 3배 미만, 2배 미만, 1.5배 미만 및 최대 동일량의 항트롬빈이 응집된 형태라면 항트롬빈은 안정화된 것이다. 몇몇 실시양태에서, 단백질을 소정 기간(예를 들면, 3개월) 동안 고온에서(예를 들면, 2℃ - 8℃) 저장한 경우 보다 저온(예를 들면, -20℃)과 비교해서 항트롬빈 양(중량으로)의 3배 미만이 응집된 형태라면 항트롬빈은 안정화된 것이다.

몇몇 실시양태에서, 항트롬빈의 안정성은 저장 이전과 소정 기간 동안 저장 이후에 항트롬빈의 산화를 비교함으로써 결정된다. 몇몇 실시양태에서, 항트롬빈의 안정성은 고온에서 저장된 제1 분취량 중의 항트롬빈의 산화를 동일 기간 동안 보다 저온에서 저장된 분취량과 비교함으로써 결정된다. 몇몇 실시양태에서, 저장 전 응집 양과 비교했을 때 저장 이후에 10 배 미만, 9배 미만, 8배 미만, 7배 미만, 6배 미만, 5배 미만, 4배 미만, 3배 미만, 2배 미만, 1.5배 미만 및 최대 동일량의 항트롬빈이 산화된다면 항트롬빈은 안정화된 것이다. 몇몇 실시양태에서, 항트롬빈을 고온에서 저장한 경우 보다 저온에서와 비교했을 때 10배 미만, 9배 미만, 8배 미만, 7배 미만, 6배 미만, 5배 미만, 4배 미만, 3배 미만, 2배 미만, 1.5배 미만 및 최대 동일량의 항트롬빈이 산화된다면 항트롬빈은 안정화된 것이다. 몇몇 실시양태에서, 단백질을 소정 기간(예를 들면, 3개월) 동안 고온에서(예를 들면, 2℃ - 8℃) 저장한 경우 보다 저온(예를 들면, -20℃)과 비교해서 항트롬빈의 양의 2배 미만이 산화된다면 항트롬빈은 안정화된 것이다.

몇몇 실시양태에서, 저장 전과 비교해서 3개월 저장 후 90% 이상의 항트롬빈이 헤파린에 결합하거나, 또는 2% 미만의 항트롬빈이 산화되거나, 또는 5% 미만의 항트롬빈이 응집되거나, 또는 90% 이상의 항트롬빈이 헤파린에 결합한다면 항트롬빈은 안정화된 것이다.

몇몇 실시양태에서, 저장 전과 비교해서 3개월 저장 후 90% 이상의 항트롬빈이 헤파린에 결합하고, 2% 미만의 항트롬빈이 산화되고, 5% 미만의 항트롬빈이 응집되고, 90% 이상의 항트롬빈이 헤파린에 결합한다면 항트롬빈은 안정화된 것이다.

제제

몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제를 포함한다. 본원에서 사용된 완충제는 약산과 이의 컨쥬게이트 염기를 포함하는 조성물이거나 또는 약염기와 이의 컨쥬게이트 산의 조합(물)이다. 완충제를 포함하는 조성물 또는 용액은 일반적으로 완충제가 없는 조성물 또는 용액 보다 더 안정화된 pH를 갖는다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제를 포함하되, 여기서 완충제는 인산일수소 및 인산이수소를 포함하고, 인산일수소 및 인산이수소는 동일한 카운터 이온을 갖는다. 몇몇 실시양태에서, 카운터 이온은 나트륨 또는 칼륨이다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제를 포함하되, 여기서 완충제는 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제를 포함하되, 여기서 완충제는 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제를 포함하되, 여기서 완충제는 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨으로 실질적으로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 완충제를 포함하되, 여기서 완충제는 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨으로 실질적으로 구성된다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 인산일수소나트륨과 인산이수소칼륨을 둘다 포함하는 것은 아니다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 인산일수소칼륨과 인산이수소나트륨을 둘다 포함하는 것은 아니다.

인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨으로 "실질적으로 구성된" 완충제는, 인산일수소칼륨과 인산이수소칼륨 이외에 완충제로서 작용할 수 있는 추가 이온 또는 다른 성분을 유사한 양으로 가지지 않는 완충제이다. 본원에서 사용된 유사한 양은 동일한 양, 0.9배의 양, 0.8배의 양, 0.7배의 양, 0.6배의 양, 0.5배의 양, 0.4배의 양, 0.3배의 양, 최대 0.2배의 양을 지칭한다. 이에, 예를 들면, 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨으로 실질적으로 구성되고 50 mM 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함하는 완충제는 또한 50 mM 인산일수소나트륨 또는 50 mM 인산이수소나트륨을 포함하지 않는다.

마찬가지로, 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨으로 "실질적으로 구성된" 완충제는, 인산일수소나트륨과 인산이수소나트륨 이외에 완충제로서 작용할 수 있는 추가 이온 또는 다른 성분을 유사한 양으로 가지지 않는 완충제이다.

이에, 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨으로 "실질적으로 구성된" 완충제는 또한 비(non)-칼륨 (예를 들면, 나트륨) 인산일수소 및 비-칼륨 (예를 들면, 나트륨) 인산이수소를 유사한 양으로 포함하지 않는다. 마찬가지로, 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨으로 "실질적으로 구성된" 완충제는 또한, 비-나트륨 (예를 들면, 칼륨) 인산일수소 및 비-나트륨 (예를 들면, 칼륨) 인산이수소를 유사한 양으로 포함하지 않는다.

몇몇 실시양태에서, 완충제 농도는 10 mM 내지 250 mM 또는 25 mM 내지 100 mM 이다. 몇몇 실시양태에서, 완충제 농도는 50 mM이다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 1 이상의 염을 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 염은 염화칼륨이다. 몇몇 실시양태에서, 염화칼륨 농도는 1 mM 내지 250 mM, 2 mM 내지 200 mM, 또는 10 내지 150 mM이다. 몇몇 실시양태에서, 염화칼륨 농도는 120 mM이다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 염화칼륨 이외에 1 이상의 염을 포함한다. 제제에 사용될 수 있는 염의 비제한적인 예는 암모늄염 및 칼슘염을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 이러한 1 이상의 추가 염의 농도는 10 mM 내지 250 mM, 25 mM 내지 100 mM이다. 몇몇 실시양태에서, 염 농도는 50 mM이다. 몇몇 실시양태에서, 염 농도는 10 mM 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 염 농도는 250 mM을 초과한다. 몇몇 실시양태에서, 염 농도는 50 mM이다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 치료 단백질을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 치료 단백질은 알부민, 알파-마크로글로불린, 항키모트립신, 항트롬빈, 항트립신, 아포(Apo) A, 아포 B, 아포 C, 아포 D, 아포 E, 아포 F, 아포 G, 베타 XIIa, C1-억제제, C-반응성 단백질, C7 단백질, C1r 단백질, C1s 단백질, C2 단백질, C3 단백질, C4 단백질, C4bP 단백질, C5 단백질, C6 단백질, C1q 단백질, C8 단백질, C9 단백질, 카르복시펩티다제 N, 세룰로플라스민(ceruloplasm), 인자 B, 인자 D, 인자 H, 인자 I, 인자 IX, 인자 V, 인자 VII, 인자 VIIa, 인자 VIII, 인자 X, 인자 XI, 인자 XII, 인자 XIII, 피브리노겐, 피브로넥틴, 합토글로빈, 헤모펙신, 헤파린 보조 인자 II, 히스티딘-풍부(rich) GP, IgA, IgD, IgE, IgG, ITI, IgM, 키니나제 II, 키니노겐, 리소자임, PAI 2, PAI 1, PCI, 플라스민, 플라스민 억제제, 플라스노겐, 프리알부민, 프로칼리크레인, 프로페르딘, 프로테아제 넥신, 단백질 C, 단백질 S, 단백질 Z, 프로트롬빈, TFPI, 티올-프로테인아제, 트롬보모둘린, 조직 인자 (TF), TPA, 트랜스콜라바민(transcolabamin) II, 트랜스코르틴, 트랜스페린, 비트로넥틴, 또는 폰빌레브란드(von Willebrand) 인자이다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 1 내지 50 mg/ml의 치료 단백질, 2 내지 25 mg/ml의 치료 단백질, 3 내지 10 mg/ml의 치료 단백질, 4 내지 8 mg/ml의 치료 단백질 또는 5 내지 6 mg/ml의 치료 단백질을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 1 mg/ml 미만의 치료 단백질을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 50 mg/ml 초과의 치료 단백질을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 치료 단백질은 항트롬빈이다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 1 내지 50 mg/ml의 항트롬빈, 2 내지 25 mg/ml의 항트롬빈, 3 내지 10 mg/ml의 항트롬빈, 4 내지 8 mg/ml의 항트롬빈 또는 5 내지 6 mg/ml의 항트롬빈을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 5 내지 6 mg/ml의 항트롬빈을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 1 mg/ml 미만의 항트롬빈을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 50 mg/ml 초과의 항트롬빈을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 최대 100 mg/ml의 항트롬빈을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 100 mg/ml 초과의 항트롬빈을 포함한다.

제제는 또한 추가 단백질을 포함하여, 추가 성분을 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들면, 치료 단백질의 새로이 채취된 용액(예를 들면, 전혀 정제되지 않거나, 또는 단지 부분적으로 정제됨)은 치료 단백질 이외에 다른 단백질 (예를 들면, 밀크 단백질 또는 세포 용해물에서 발견되는 단백질)을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 다양한 추가의 비-단백질 성분(예를 들면, 밀크 또는 세포 용해물에서 발견되는 비-단백질 성분)을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 제제의 pH는 pH 6 내지 pH 9, 또는 pH 7.5 내지 pH 8.5이다. 몇몇 실시양태에서, 제제의 pH는 pH 8이다. 필요하다면, 산(예컨대 HCl) 또는 염기(예컨대 NaOH)가 제제에 추가되어 원하는 pH를 얻을 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 치료 단백질은 항트롬빈이고, 제제의 pH는 pH 7.5 내지 pH 8.5이다. 몇몇 실시양태에서, 치료 단백질은 항트롬빈이고, 제제의 pH는 pH 8이다. 제제의 pH는 치료 단백질의 성질에 따라 달라질 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 안정화 부형제(stabilizing excipient)를 함유하지 않는다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 안정화 부형제, 예컨대 카르복실산 또는 이의 염을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 카르복실산은 시트르산나트륨이다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 모노카르복실산 및/또는 이의 염을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 글루콘산 및/또는 글루콘산나트륨을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 디카르복실산 및/또는 이의 염을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 시트르산, 숙신산, 말론산, 말산, 타르타르산 및/또는 이의 염을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 트리카르복실산 및/또는 이의 염을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 니트릴로트리아세트산 및/또는 나트륨 니트릴로트리아세트산을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 테트라카르복실산 및/또는 이의 염을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 및/또는 나트륨 EDTA를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 펜타카르복실산 및/또는 이의 염을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA) 및/또는 나트륨 DTPA를 포함한다. 적합한 카르복실산은 시트르산염 화합물, 예컨대 시트르산나트륨; 타르타르산염(tartrate) 화합물, 숙신산염 화합물, 말론산염, 글루콘산염, 1,2,3,4-부탄테트라카르복실산(BTC), EDTA 또는 DTPA 또는 이의 염을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 문헌[참조: Kaushil et al. in Protein Science 1999 8: 222-233] 및 문헌[참조: Busby et al. in the Journal of Biological Chemistry Volume 256, Number 23 pages 12140-1210-12147]은 카르복실산 및 이의 용도를 기재하고 있다. 몇몇 실시양태에서, 안정화 부형제는 완충제로서 작용하지 않는다.

몇몇 실시양태에서, 안정화 부형제는 50 내지 600 mM, 250 내지 500 mM, 또는 250 내지 350 mM의 농도를 가진다. 몇몇 실시양태에서, 안정화 부형제는 농도가 50 내지 100 mM, 50 내지 150 mM, 50 내지 200 mM, 50 내지 250 mM, 50 내지 300 mM, 50 내지 350 mM, 50 내지 400 mM, 50 내지 450 mM, 50 내지 500 mM 또는 50 내지 550 mM이다. 몇몇 실시양태에서, 안정화 부형제는 농도가 550 내지 600 mM, 500 내지 600 mM, 450 내지 600 mM, 400 내지 600 mM, 350 내지 600 mM, 300 내지 600 mM, 250 내지 600 mM, 200 내지 650 mM, 150 내지 600 mM 또는 100 내지 600 mM이다. 몇몇 실시양태에서, 안정화 부형제는 농도가 100 내지 550 mM, 150 내지 500 mM, 200 내지 450 mM, 250 내지 400 mM 또는 300 내지 350 mM이다. 몇몇 실시양태에서, 안정화 부형제는 농도가 100, 150, 250, 500 또는 600 mM이다. 몇몇 실시양태에서, 안정화 부형제의 농도는 100 mM 미만이다. 몇몇 실시양태에서, 안정화 부형제의 농도는 600 mM을 초과한다. 일 실시양태에서, 안정화 부형제는 농도가 300 mM이다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 당(예를 들면, 이당류 당)을 포함한다. 일반적으로, 당은 추가 안정화 효과를 가질 수 있고 단백질의 응집을 최소화할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 당은 이당류 당이다. 제제에 추가될 수 있는 이당류 당은 수크로스, 락툴로스, 락토스, 말토스, 트레할로스 및 셀로바이오스를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 이당류로서 수크로스 또는 트레할로스를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 당은 0.5 내지 5% (w/v(중량/부피))로 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 당은 0.5% 이상, 1% 이상, 1.5% 이상, 2% 이상, 2.5% 이상, 3% 이상, 3.5% 이상, 4% 이상, 4.5% 이상, 또는 최대 5% (중량/부피)이다. 몇몇 실시양태에서, 당은 1 내지 2% (w/v)로 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 당은 1% (w/v)로 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 당은 1 % (w/v) 미만으로 존재한다. 몇몇 실시양태에서, 당은 5% (w/v)를 초과하여 존재한다. 일 실시양태에서, 당은 수크로스 또는 트레할로스이고 1% (w/v)로 존재한다.

몇몇 실시양태에서, 안정한 액체 제제는 계면활성제를 포함하지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 안정한 액체 제제는 1종 이상의 계면활성제를 추가로 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 계면활성제는 폴리소르베이트(Polysorbate) 80, 폴리소르베이트 20, 트윈(Tween) 20 또는 트윈 80이다. 몇몇 실시양태에서, 계면활성제는 0.5 내지 1 v/v%이다. 몇몇 실시양태에서, 계면활성제는 0.5 또는 1 v/v%이다. 몇몇 실시양태에서, 계면활성제는 과산화수소 오염을 거의 가지지 않거나(예를 들면, 5 mM 미만, 4 mM 미만, 3 mM 미만, 2 mM 미만, 또는 1 mM 미만의 과산화수소) 전혀 가지지 않는다.

몇몇 실시양태에서, 치료 단백질의 제제는 주사기, 바이알, 병(bottle), 앰풀 또는 백(bag)에 함유된다. 몇몇 실시양태에서, 백은 EVA 백이다. 또 다른 실시양태에서, 병은 PETG 병이다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 50 mM 인산칼륨, (인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨), 및 120 mM 염화칼륨, 및 pH=8을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 50 mM 인산칼륨, (인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨), 및 120 mM 염화칼륨, 및 pH 8로 실질적으로 구성된다.

항트롬빈

몇몇 실시양태에서, 제제는 치료 단백질을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 치료 단백질은 항트롬빈이다. 항트롬빈은 일반적으로, 트롬빈과 인자 Xa를 억제하는 세린 프로테아제 억제제인 432개 아미노산과 58 kDA의 분자량의 글리코단백질이다. 항트롬빈은 항트롬빈 III의 알파 (또는 알파) 형태일 수 있지만, 본 발명의 개시의 제제는 임의 형태의 항트롬빈을 위해 사용될 수 있다. 항트롬빈은 혈장에 천연적으로 존재하고, 인간 항트롬빈은 인간 혈장으로부터 단리될 수 있다. 인간 항트롬빈은 또한 재조합 방법으로 제조되어 재조합 인간 항트롬빈(rhAT; 달리 언급이 없는 한 본원에서 사용된 용어 "항트롬빈"은 rhAT를 포함함)을 생산할 수 있다.

재조합 항트롬빈 알파는 트랜스제닉 동물에서 생산될 수 있고 항트롬빈 알파가 결여된 피험체를 치료하는데 사용될 수 있다(예를 들면, 미국 특허 제5,843,705호, 미국 특허 제6,441,145호 및 미국 특허 제7,019,193호 참조). 아트린(ATryn)®은 유전성 항트롬빈 결핍 환자에서 수술 전후(peri-operative) 및 분만기 주위(peri-partum) 혈전색전증 현상(thromboembolic event)의 예방을 위해 FDA에 의해 승인된, 재조합으로 생산된 인간 항트롬빈 알파이다. 유럽에서, ATryn®은 임상적으로 위험한 상황에서 심부정맥 색전증과 혈전 색전증의 예방을 위해 선천성 항트롬빈 결핍이 있는 수술 환자에 사용하기 위해 승인되었다. 본원에서 사용된 용어 "항트롬빈"은 ATryn®를 포함한다.

본원에 개시된 항트롬빈 제제는 고온과 같은 저장 조건 하에 안정하다. 본원에 개시된 항트롬빈 제제는 긴 저장 수명을 가지고 이러한 저장 조건 하에 원하는 수준의 활성을 유지하는 것으로 확인되었다.

본원에 개시된 제제는 투여 전에 추가로 가공될 필요가 있는 항트롬빈의 제제와 투여 준비 중인 제제를 안정화시키기 위해 사용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 이에, 몇몇 실시양태에서, 항트롬빈의 제제는 투여 이전에 선적되고/되거나, 추가 가공되고/되거나, 정제되고/되거나, 뱃치로(in batches) 나눠질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 밀크-생산된 항트롬빈을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 제제는 심층 여과에 의해 정제되고/되거나(미국 특허 제7,531,632호) TFF 완충제 교환에 의해 정제된(미국 특허 제6,268,487호) 항트롬빈을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 항트롬빈 제제는 또한 밀크 성분을 함유한다. 몇몇 실시양태에서 항트롬빈 제제는 저온 살균된 것이다.

일 측면에서, 본 발명의 개시는 항트롬빈을 안정화시키는 제제를 제조하는 방법을 제공하며, 본 방법은 항트롬빈을 포함한 밀크 조성물로부터 항트롬빈을 분리하여 항트롬빈을 포함한 용액을 생성하는 단계, 항트롬빈을 포함한 용액을 저온 살균하는 단계, 항트롬빈을 포함한 용액을 완충제로 교환하여 항트롬빈을 안정화시키는 제제를 생성하는 단계를 포함하고, 여기서 완충제는 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함하거나, 또는 완충제는 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함한다.

제제에 대한 첨가제

몇몇 실시양태에서, 제제는 1종 이상의 항산화제를 포함한다. 항산화제는 용액으로부터 자유 라디칼을 제거함으로써 산화를 억제할 수 있는 물질이다. 항산화제는 업계에 통상적인 기술을 가진 자에게 익히 알려져 있으며 아스코르브산, 아스코르브산 유도체(예를 들면, 아스코르빌팔미테이트, 아스코르빌스테아레이트, 아스코르브산나트륨, 아스코르브산칼슘, 등), 부틸화된 히드록시 아니솔, 부틸화된 히드록시 톨루엔, 알킬갈레이트, 나트륨 메타-비설파이트, 나트륨 비설파이트, 나트륨 디티오나이트, 나트륨 티오글리콜산, 나트륨 포름알데히드 설폭실레이트, 토코페롤 및 이의 유도체, (d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤 아세테이트, dl-알파 토코페롤 아세테이트, d-알파 토코페롤 석시네이트, 베타 토코페롤, 델타 토코페롤, 감마 토코페롤, 및 d-알파 토코페롤 폴리옥시에틸렌 글리콜 1000 석시네이트) 모노티오글리세롤 및 나트륨 설파이트와 같은 재료를 포함한다. 이러한 재료는 전형적으로 0.01 내지 2.0% (w/v) 범위로 첨가된다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 1종 이상의 등장화제를 포함한다. 이러한 용어는 업계에서 등삼투압제(iso-osmotic agent)와 상호교환적으로 사용되고, 삼투압을 혈장과 같은 인간 세포외 유체와 등삼투성인 0.9% 염화나트륨 용액의 것으로 증가시키기 위해 약학 조제물에 첨가되는 화합물로서 알려져 있다. 바람직한 등장화제는 염화나트륨, 만니톨, 솔비톨, 락토스, 덱스트로스 및 글리세롤이다.

몇몇 실시양태에서, 제제는 1종 이상의 방부제를 포함한다. 적합한 방부제는 클로로부탄올(0.3 - 0.9% W/V), 파라벤(0.01 - 5.0%), 티메로살(thimerosal)(0.004 - 0.2%), 벤질 알콜(0.5 - 5%), 페놀(0.1 - 1.0%), 등(w/v)을 포함하지만 이에 한정되지 않는다.

방법

일 측면에서 본 발명의 개시는 치료 단백질을 안정화시키는 제제를 제조하는 방법을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 방법은 완충제를 용액에 첨가한 후 단백질을 첨가하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 방법은 단백질을 용액에 첨가한 후 완충제를 첨가하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 방법은 단백질을 포함하는 용액을 제공하는 단계 및 완충제를 상기 용액에 첨가하는 단계를 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 본 방법은 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함한 완충제를 첨가하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 방법은 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함하는 완충제를 첨가하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 방법은 완충제를 포함하는 용액을 제공하는 단계 및 단백질을 용액에 첨가하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 완충제는 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 완충제는 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함한다.

몇몇 실시양태에서, 본 방법은 용액으로부터 완충제를 제거하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 방법은 용액으로부터 완충제를 제거하는 단계 및 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함하는 완충제를 첨가하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 방법은 용액으로부터 완충제를 제거하는 단계 및 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함한 완충제를 첨가하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 용액은 치료 단백질을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 완충제의 첨가 및 완충제의 제거는 동시에 수행된다. 몇몇 실시양태에서, 완충제의 첨가 및 완충제의 제거는 순차적으로 수행된다. 완충제의 첨가 및 제거는 치료 단백질을 포함하는 용액 상에서 수행될 수 있거나, 또는 치료 단백질은 완충제를 교환한 후 첨가될 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 상기 방법 모두에서, 완충제는 앞서 제공된 바와 같은 농도 수준에 이른다(예를 들면, 50 mM). 이들 방법의 몇몇 실시양태에서, 제제는 앞서 제공된 바와 같은 pH이거나 또는 pH에 이른다(예를 들면, pH 8).

염을 제거하고 용액에 염을 첨가하는 방법은 업계에 공지되어 있으며 투석, 완충제 교환, 컬럼 정제, 등을 포함한다.

투여

몇몇 실시양태에서, 본 발명의 개시는 투여 전에 추가 가공(처리)를 요구하는 치료 단백질의 제제를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 개시는 투여를 위해 준비된 치료 단백질의 제제를 제공한다. 투여를 위한 준비는 투여 전에 해동 및/또는 주사기로의 전달과 같은 최소 단계를 요구하는 제제를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 개시의 제제는 정맥내, 동맥내 또는 비경구 투여를 위해 농축된 제형으로서 의도된다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 제제는 또한 주로 주사를 위해 농축된 제형으로서 의도된다.

본원에 기재된 제제는, 단독으로 또는 조합으로 사용시, 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 치료적 유효량은 하기에서 논의된 파라미터에 의해 결정되지만; 어떠한 경우든, 본원에 기재된 병태들 중 하나(예를 들면, 선천성 또는 후천성 항트롬빈 결핍)를 갖는 피험체, 예컨대 인간 피험체를 치료하는데 효과적인 약물(들)의 수준을 설정하는 양이다. 유효량은 치료될 병태(증상)의 개시를 지연시키거나, 병태의 진행을 완전히 억제하거나 감소시키거나, 병태의 개시 또는 진행을 멈추게 하는데 필요한 단독 양 또는 복수 용량의 양을 의미한다. 피험체에 투여되는 경우, 유효량은 치료될 특정 병태; 병태의 중증도; 연령, 물리적 상태, 키 및 체중을 포함한 개개 환자 파라미터; 병행(concurrent) 치료; 치료 빈도; 및 투여 방식에 따라 달라질 것임은 당연하다. 이들 인자는 업계의 통상적인 기술을 가진 자에게 익히 알려져 있고 단지 일상 실험으로 어드레싱될 수 있다. 최대 용량, 즉 의학적 판단력에 따른 최고 수준의 안전한 용량을 사용하는 것이 일반적으로 바람직하다.

본원에 기재된 제제는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하거나 이러한 담체에서 희석될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 인간 또는 다른 포유동물 예컨대 개, 고양이, 말, 소, 양, 또는 염소에로의 투여에 적합한 1종 이상의 상용성 고체, 또는 반고체 또는 액체 충전제, 희석제 또는 포접(encapsulating) 물질을 의미한다. 용어 "담체"는 천연 또는 합성의, 유기 또는 무기 성분을 의미하고, 활성 성분과 배합되어 적용을 촉진한다. 담체는 원하는 약학 효능 또는 안정성에 실질적으로 악영향을 미치는 상호작용이 없는 방식으로 본 발명의 조제물과 혼합되고 서로 간에 혼합될 수 있다. 정맥내, 동맥내 또는 비경구, 등 제제에 적합한 담체는 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pa]에서 확인할 수 있다.

일 실시양태에서, 치료 단백질의 제제는 멸균성(sterile)이다.

또 다른 실시양태에서, 치료 단백질의 제제는 키트에 함유된다. 일 실시양태에서, 키트는 제제를 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 키트는 주사기를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 키트는 제제 투여를 위한 설명서를 추가로 포함한다. 추가 실시양태에서, 키트는 제제의 희석을 위한 용액을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 키트는 제제의 희석을 위한 용액과 제제를 혼합하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 앞서 언급한 키트는 또한 본 발명의 또 다른 측면에서 제공된다.

본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 어떠한 형태로든 추가적인 제한으로 해석되지는 않아야 한다. 본 출원 전반에서 인용된 참고문헌(문헌 참고자료, 발행된 특허, 공개된 특허 출원, 및 동시 계류중인 특허 출원을 포함함) 모두의 전체 내용은 특히 앞서 언급된 교시의 경우에 명시적으로 참고적으로 인용된다. 그러나, 임의의 참고문헌의 인용이 선행문헌(prior art)임을 인정하는 의도는 아니다.

실시예

실시예들에서, "K/Na 인산염"은 인산일수소칼륨 및 인산이수소나트륨을 지칭하고; "Na/K 인산염"은 인산일수소나트륨 및 인산이수소칼륨을 지칭하고; "Na/Na 인산염"은 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 지칭하고; "K/K 인산염"은 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 지칭한다. 이들 4종의 완충제는 본원에서 일괄적으로 "인산염계(phosphate systems)"로 언급되어진다.

실시예 1

항트롬빈과 다양한 인산염 및 시트르산염 완충제를 포함하는 용액(pH 6, pH 7, 또는 pH 8 (인산염 완충제) 또는 pH 6 또는 pH 7 (시트르산염 완충제))에 대해 -20℃ 또는 -40℃로 동결 해동 사이클을 실시하였다. 용액을 동결-해동 사이클 동안 60 ml 백에 보관했다. 사용된 항트롬빈의 농도는 5-10 mg/ml이다. 항트롬빈의 산화 상태, 헤파린 친화도, 및 응집을, 동결-해동 사이클 이전 및 이후에 측정하였다. 항트롬빈의 응집(백분율로 표시됨)을 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 측정하였다. 항트롬빈의 산화는, 항트롬빈을 단리한 다음 펩티드 맵핑을 위해 RP-HPLC를 사용하여 측정하였다. 도 1은 다양한 완충제에서 동결/해동 후 항트롬빈의 산화 상태를 도시한다. 도 2는 다양한 완충제에서 동결/해동 후 항트롬빈의 헤파린 친화도를 도시한다. 도 3은 다양한 완충제에서 동결/해동 후 항트롬빈의 응집을 도시한다. 도 7은 동결/해동 후 인산염계에서 항트롬빈의 안정성 파라미터에 대한 개요를 제공한다.

실시예 2

항트롬빈과 다양한 인산염 및 시트르산염 완충제를 포함하는 용액(pH 6, pH 7, 또는 pH 8 (인산염 완충제) 또는 pH 6 또는 pH 7 (시트르산염 완충제))을 최대 3개월의 기간 동안 2℃ 내지 8℃에서 저장하였다. 용액을 60 ml 백에 저장하였다. 사용된 항트롬빈의 농도는 5-10 mg/ml이다. 항트롬빈의 산화 상태, 헤파린 친화도 및 응집(SEC에 의해)을 저장 이전과 이후에 측정하였다. 항트롬빈의 산화(백분율로 표시)는, 항트롬빈을 단리한 후 펩티드 맵핑을 위해 RP-HPLC를 사용하여 측정하였다. 헤파린 결합은, 제제를 헤파린 결합 컬럼과 접촉시킨 후 HPLC에 의해 측정하였다. 도 4는 다양한 완충제에서 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 산화 상태를 도시한다. 도 5는 다양한 완충제에서 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 헤파린 친화도를 도시한다. 도 6은 다양한 완충제에서 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 응집을 도시한다. 도 8은 인산염계에서 1개월간 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 안정성 파라미터에 대한 개요를 제공한다. 도 9는 인산염계에서 3개월간 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 안정성 파라미터에 대한 개요를 제공한다. 도 10은 다양한 완충제에서 1개월간 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 안정성 파라미터에 대한 개요를 제공한다.

실시예 3

염화칼륨(120 mM, pH 7.5)을, 항트롬빈과 다양한 인산염 및 시트르산염 완충제를 포함하는 용액(pH 6, pH 7, 또는 pH 8 (인산염 완충제) 또는 pH 6 또는 pH 7 (시트르산염 완충제))에 첨가하였다. 이후, 용액에 대해 -20℃ 또는 -40℃로 동결 해동 사이클을 실시하였다. 용액을 동결-해동 사이클 동안 60 ml 백에 보관했다. 사용된 항트롬빈의 농도는 5-10 mg/ml이다. 항트롬빈의 산화 상태, 헤파린 친화도, 및 응집은, 동결-해동 사이클 이전 및 이후에 측정하였다. 항트롬빈의 산화(백분율로 표시됨)는, 항트롬빈을 단리한 후 펩티드 맵핑을 위해 RP-HPLC를 사용하여 측정하였다. 헤파린 결합은 제제를 헤파린 결합 컬럼과 접촉시킨 후 HPLC에 의해 측정하였다. 항트롬빈의 응집(백분율로 표시됨)은 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 측정하였다. 도 11은 다양한 완충제에서 동결/해동 후 항트롬빈의 산화 상태를 도시한다. 도 12는 다양한 완충제에서 동결/해동 후 항트롬빈의 헤파린 친화도를 도시한다. 도 13은 다양한 완충제에서 동결/해동 후 항트롬빈의 응집을 도시한다. 도 14는 동결/해동 후 다양한 완충제에서 항트롬빈의 안정성 파라미터에 대한 개요를 제공한다.

실시예 4

염화칼륨(120 mM, pH 7.5)을 항트롬빈과 다양한 인산염 및 시트르산염 완충제를 포함하는 용액(pH 6, pH 7, 또는 pH 8 (인산염 완충제) 또는 pH 6 또는 pH 7 (시트르산염 완충제))에 첨가하였다. 용액을 최대 3개월의 기간 동안 2℃ 내지 8℃에서 저장하였다. 용액을 60 ml 백에 저장하였다. 항트롬빈의 산화 상태, 헤파린 친화도 및 응집(SEC에 의해)을 저장 이전과 이후에 측정하였다. 항트롬빈의 산화(백분율로 표시)는, 항트롬빈을 단리한 후 펩티드 맵핑을 위해 RP-HPLC를 사용하여 측정하였다. 헤파린 결합은, 제제를 헤파린 결합 컬럼과 접촉시킨 후 HPLC에 의해 측정하였다. 도 15는 다양한 완충제에서 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 산화 상태를 도시한다. 도 16은 다양한 완충제에서 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 헤파린 친화도를 도시한다. 도 17은 다양한 완충제에서 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 응집을 도시한다. 도 18은 다양한 완충제에서 2-8℃에서 저장 후 항트롬빈의 안정성 파라미터에 대한 개요를 제공한다.

실시예 5

정화된 출발 물질(Clarified Starting Material, CSM)의 세 종류 로트(lot)를 파일럿 스케일로 제조하였다. 이들 CSM 각각을 10 L 백에서 -20℃에서 동결시키고 최대 2년간 저장하였다. 다양한 시점에 동결기로부터 백을 꺼내, 해동하고 정제하였다. 항트롬빈 알파 분자의 안정성은, 연구 기간에 걸쳐 산화, 응집 및 헤파린 친화도를 모니터링함으로써 결정하였다. 2년간의 동결 저장에 걸쳐 안정성을 나타내는 파라미터들 중 임의의 파라미터에서도 유의한 변화는 관찰되지 않았다(도 19-21 참조).

트랜스제닉 염소 젖을 정화하고, 저온살균하고 농축한 다음, 정제 캠페인(campaign)에서 필요시까지 저장 설비로 보냈다. 초기에, CSM을 PBS pH7.4 (50 mM 인산나트륨, 150 mM 염화나트륨)에서 제제화하였지만, -20℃에서 동결 시, 용액은 응집되었고 해동시 헤파린 친화도 상실이 일어났다.

pH 7 초과의 칼륨염으로 제조된 PBS 제제는 항트롬빈 알파를 안정화시켰고 -20℃에서 충분히 동결되었다. 새로운 정화된 제제(50 mM 인산칼륨, 120 mM 염화칼륨 pH8.0)를 사용하여 프로세스를 스케일업시켜 벌크 동결이 생성물에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다.

세 종류의 CSM 로트를 심층 여과, 저온살균 및 칼륨 CSM 제제 완충제에서 농축/투석여과에 의해 제조하였다. 동결 이전에, 소규모 정제를 위해 적은 양의 샘플을 제거하여 제로(0) 시점 분석 결과를 측정하였다. 각각의 로트를 2개의 대략 5 L 세그먼트로 분할하고 10 L 백 안으로 여과하였다. 백을 -20℃에서 즉시 동결시키고 적절한 시점에 이를 때까지 저장하였다. 시험 스케줄에 대한 개요를 표 1에 기록하였다.

CSM 동결 안정성 스케줄

시점	CSM 로트
4 개월	033007
7 개월	040507
10 개월	033007
14 개월	040507
18 개월	*041307
24 개월	041307

*로트를 샘플링을 위해 해동하고 7개월 시점에 재동결시켰다

각 시점에 분취량을 수조에서 해동하고 후술하는 바와 같이 정제하였다. CSM을 1.15 L 헤파린 HyperD 상에 로딩하고 로딩/용출 사이클을 2회 실시하였다. 2개의 용출 피크를 모아 풀(pool)을 농축하고 Q 세파로스 로딩 완충제에서 투석여과하였다. 생성물을 490 ml Q 세파로스 컬럼 상에 로딩하고 강화된(increased) 염 완충제로 용출시켰다. Q 용출을 1.76 M 시트르산나트륨 pH7.0과 1:1 혼합하고 450 ml 토소(Tosoh) 페닐 650C 컬럼 상에 직접 로딩하였다. 흐름을 통한 분획(flow through fraction) 중의 생성물을 모아 대략 25 g/l로 농축시키고 약물(Drug Substance, DS) 제제 완충제에서 투석여과하였다. 최종 DS를 분석 시험 이전에 무균 여과하였다.

응집 및 헤파린 친화도 측정을 위해서는 최종 DS가 사용되었지만, 산화는 페닐 컬럼 후 상당히 증가하기 때문에 산화 수준은 헤파린 용출물 상에서 측정하였다. SP 세파로스 프리컬럼(precolumn)의 도입은 임의의 하류 산화를 무시하며 그래서 각 시점에 SP 세파로스 컬럼 없이 대등하게 정제되었다. 모든 분석 결과는 각 CSM 로트에 대해 얻어진 0 시점 결과와 비교하였다.

재료 및 방법

각 정제는 SP 세파로스 프리컬럼을 제외하고는 제2 세대 개발 리포트 1에 기재된 바와 같이 수행하였다.

헤파린 HyperD (Cambrex 2003-2004에 의해 사용됨)

Q 세파로스 FF 로트 303367

토소 페닐 650C 로트 65PHC01B

응집, 헤파린 친화도 및 산화를 PAD에서 실시하였다.

50 mM 인산염 (K/Na) 120 mM KCl pH 7.5

50 mM 인산염 (Na/K) 120 mM KCl pH 7.5

50 mM 인산염 (Na/Na) 120 mM KCl pH 7.5

50 mM 인산염 (K/K) 120 mM KCl pH 7.5

50 mM 시트르산나트륨 120 mM KCl pH 7.5

결과

각 동결 백에 대해, 해동 전 불완전 동결 및/또는 풀링의 징후에 대해 주의깊게 관찰하였다. 어떠한 시점에서도 이상 징후는 관찰되지 않았다. 표 2는 안정성 연구 전반에 걸쳐 분석 결과에 대한 개요를 수록하고 있다.

CSM 동결 안정성 분석 결과

시점	헤파린 용출물의 산화		응집		헤파린 친화도
	t=0	t=X	t=0	t=X	t=0	t=X
4 개월	5.7%	5.9%	<0.1%	<0.1%	97%	99%
7 개월	5.7%	5.6%	<0.1%	<0.1%	97%	98%
10 개월	5.7%	5.6%	<0.1%	<0.1%	97%	97%
14 개월	5.7%	6.0%	<0.1%	<0.1%	97%	100%
18 개월	3.8%	3.9%	<0.1%	<0.1%	96%	97%
24 개월	3.8%	3.6%	<0.1%	<0.1%	96%	98%

각 로트는 다양한 0 시점 결과를 가졌기 때문에, 데이터를 각각의 0 시점 결과에 대한 각 분석 결과에 있어 차이를 디스플레이하도록 표준화하였다. 각각의 안정성-지시 기법에 대한 데이터를 도 19-21에 작도하였다.

산화 결과는 0.3% 증가부터 0.2% 감소에 이르기까지 변동하였다. 이러한 변동에 대한 평균치를 구하였고 순효과(net difference)는 초기 시점에 대해 무시할 정도였다. 헤파린 친화도 결과 각각은 0 시점 결과와 동일하거나 이보다 높았다. 따라서, -20℃에서의 동결 저장은 항트롬빈 알파에 악영향을 미치지 않는다. 응집 결과는 초기의 비동결 샘플뿐만 아니라 각 시점에 대한 분석의 정량 한계치를 결코 초과하지 않았다. -20℃에서의 저장은 항트롬빈 알파의 응집에 영향을 미치지 않았다.

결과

인산칼륨 완충된 염화칼륨 정화된 제제 완충제는 온도가 용액의 최저 공융점 보다 충분히 더 낮기 때문에 -20℃에서 완전히 동결되었다. 이전에 사용된 나트륨계 PBS는 시간에 따른 매우 높은 수준의 응집과 낮은 수준의 헤파린 친화도를 야기하는 염화나트륨으로 인해 부분적으로 액체로 남았다. 나트륨을 칼륨으로 대체하면 이러한 문제는 사라졌다.

-20℃에서 동결 상태의 항트롬빈 알파의 안정성은 모든 칼륨 완충제에서 최대 2년간 입증되었다. 생성물의 품질은, 세 종류의 가장 민감한 안정성-지시 분석에 의해 분석하였다. 각 안정성 시점 조제물은 세 종류의 모든 분석에 의해 새로운 CSM 상에서 실시된 초기 소규모 정제에 필적하였다. 따라서, 정화된 출발 물질은 최대 24개월간 -20℃에서 동결된 50 mM 인산칼륨, 120 mM 염화칼륨 pH8.0에서 안정한 것으로 확인되었다.

실시예 6

항트롬빈 제제로부터 바이러스를 제거하기 위해 나노여과를 실시하였다. 헤파린 컬럼을 사용하여 정화된 밀크 풀(milk pool)을 정제하였다. 헤파린 용출물을 5 ㎠ 20 nM 바이알 필터를 사용하여 여과하였다. SDS PAGE를 사용하여 스트림을 분석하였다. 프리필터들을 시험하여 찌꺼기 종(fouling species)을 제거하였다: 0.1 um PES 프리-필터, 0.2 uM 심층 필터, 300 KD UF, Q-흡수제 및 S-흡수제. 처리량 데이터를 도 22 및 23에 도시하고 있다. SDS PAGE는 도 24에 도시하였다.

균등물

상기의 명세서는 당업자가 본 발명을 실시가능하도록 하기에 충분한 것으로 생각한다. 본 발명은 제공된 실시예의 범위로 한정되지 않는데, 그 이유는 실시예가 본 발명의 특정 측면과 실시양태에 대한 예시로서 의도되기 때문이다. 다른 기능적으로 대등한 실시양태들이 본 발명의 범위 내에 속한다. 본원에 도시되고 기재된 것 이외의 본 발명의 다양한 변형은 상기의 상세한 설명으로부터 당업자에게 자명할 것이고 이 또한 첨부된 청구범위의 범위 내에 속한다. 본 발명의 이점 및 목적은 본 발명의 각 실시양태에 의해 반드시 달성되는 것은 아니다.

Claims (21)

1. 치료 단백질 및 완충제를 포함하는 제제로서,
   완충제가 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함하거나, 또는
   완충제가 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함하는 것인 제제.
2. 제1항에 있어서, 완충제가 10 mM 내지 100 mM의 농도를 갖는 것인 제제.
3. 제2항에 있어서, 완충제가 50 mM의 농도를 갖는 것인 제제.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 염화칼륨을 추가로 포함하는 제제.
5. 제4항에 있어서, 염화칼륨이 100 내지 150 mM의 농도를 갖는 것인 제제.
6. 제4항에 있어서, 염화칼륨이 120 mM의 농도를 갖는 것인 제제.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제제의 pH가 7.5 내지 8.5인 제제.
8. 제7항에 있어서, 제제의 pH가 8인 제제.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 단백질이 항트롬빈인 제제.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 정화된 유제품(clarified milk product)을 포함하는 것인 제제.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 추가 단백질을 포함하는 것인 제제.
12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항트롬빈은 저장 이전의 헤파린 결합 기능성과 비교해서 2-8℃에서 3개월간 저장 후 90% 이상의 헤파린 결합 기능성을 유지하는 것인 제제.
13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 2-8℃에서 3개월간 저장 후 응집된 형태인 항트롬빈의 양(중량)에 있어 증가가 저장 이전의 응집된 형태인 항트롬빈의 양(중량)과 비교해서 3배 미만인 제제.
14. 제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 2-8℃에서 3개월간 저장 후 항트롬빈의 산화량에 있어 증가가 저장 이전의 항트롬빈의 산화량과 비교해서 2배 미만인 제제.
15. 치료 단백질을 안정화시키는 제제를 제조하는 방법으로서,
    완충제를 포함하는 용액을 제공하는 단계로서, 완충제가 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함하거나, 또는 완충제가 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함하는 것인 단계, 및
    치료 단백질을 상기 용액에 첨가하여 치료 단백질을 안정화시키는 제제를 생성하는 단계를 포함하는 방법.
16. 치료 단백질을 안정화시키는 제제를 제조하는 방법으로서,
    치료 단백질을 포함하는 용액을 제공하는 단계, 및
    완충제를 상기 용액에 첨가하여 치료 단백질을 안정화시키는 제제를 생성하는 단계로서, 완충제가 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함하거나, 또는 완충제가 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함하는 것인 단계를 포함하는 방법.
17. 제15항 또는 제16항에 있어서, 완충제의 최종 농도가 50 mM인 방법.
18. 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제제가 염화칼륨을 추가로 포함하는 것인 방법.
19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 용액의 최종 pH가 pH 8인 방법.
20. 제15항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 단백질이 항트롬빈인 방법.
21. 항트롬빈을 안정화시키는 제제를 제조하는 방법으로서,
    항트롬빈을 포함하는 밀크 조성물로부터 항트롬빈을 분리하여 항트롬빈을 포함하는 용액을 생성하는 단계,
    항트롬빈을 포함하는 용액을 저온살균(pasteurizing)하는 단계,
    항트롬빈을 포함하는 용액을 완충제로 교환하여 항트롬빈을 안정화시키는 제제를 생성하는 단계로서, 완충제가 인산일수소칼륨 및 인산이수소칼륨을 포함하거나, 또는 완충제가 인산일수소나트륨 및 인산이수소나트륨을 포함하는 것인 단계를 포함하는 방법.

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