CN116981442A - 无使用稳定剂的含有天凡诺赛普特的稳定眼用组成物 - Google Patents

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Abstract

本发明是关于一种无使用稳定剂的含有天凡诺赛普特(tanfanercept)的稳定眼用组成物，以及制备和使用该组成物的方法。根据本发明，发现稳定剂(诸如组胺酸或蔗糖)的使用导致杂质(诸如天凡诺赛普特衍生的酸性/碱性变体)的产生，并影响生物活性。根据本发明的眼用医药组成物可控制pH而非排除使用此种稳定剂以在冷藏储存条件以及加速条件和应力条件下显著减少杂质的产生，从而制备稳定的天凡诺赛普特眼用组成物。

Description

无使用稳定剂的含有天凡诺赛普特的稳定眼用组成物
技术领域
本发明是关于一种无使用稳定剂的含有天凡诺赛普特(tanfanercept)的稳定眼用组成物，以及制备和使用该组成物的方法。
背景技术
通常，将用于眼部局部给药的治疗剂配制成液体或凝胶形式，并在给药之前稳定地保持在无菌状态。此等眼用溶液包含缓冲液、各种界面活性剂、稳定剂和等渗压试剂，并有助于使眼用组成物对使用者而言更为舒适。溶液的稳定性对该溶液的有效性和商业化而言是特别重要的。溶液稳定性可根据配方中所存在的所有化合物之间的相互作用以及温度和pH值而变化。
含蛋白质的医药组成物在非最佳条件下发生物理化学变性。特别是诸如蛋白质的浓度、缓冲液的类型、稳定剂的类型和浓度、有机共溶剂的类型和浓度、盐的浓度、pH、温度和与空气接触等因素显著影响蛋白质的氧化、去酰胺、异构化和聚合。此种变性可能因产生蛋白质的聚集体、片段和异构物而降低生理活性。
同时，肿瘤坏死因子(TNF-α)是藉由多种细胞类型(包括单核细胞和巨噬细胞)所产生的细胞激素。TNF-α是与多种其他人类免疫疾病有关，包括感染、自体免疫疾病、败血症和移植排斥。由于TNF-α过表现而引起人类疾病的负面结果，已设计治疗剂以控制或弱化TNF-α的活性。因此，已开发出抗体以与TNF-α结合而中和的并以各种蛋白质制剂形式销售的。然而，由于分子量大，此种抗-TNF-α抗体制剂具有该制剂无法有效抵达局部区域所引起的发炎性疾病的限制。因此，本案申请者开发因体积小和活性高而适合用于治疗局部发炎性疾病的多肽分子。本发明的TNF-α抑制剂(其为经修饰的人类TNF受体-1多肽，天凡诺赛普特)是揭露于本案申请者所提交的韩国专利公开公报第2012-0072323号，并且其用于治疗干眼症的用途是揭露于韩国专利公开公报第2013-0143484号中。
相关技术文件
专利文件
韩国专利公开公报第2012-0072323号
韩国专利公开公报第2013-0143484号
发明内容
蛋白质组成物的架储期相较于化学合成药物可能较短，并且在该储存期间可能产生物理化学杂质(诸如电荷变体或聚集体)，从而降低生物活性。
本发明旨在提供稳定眼用组成物，其包含天凡诺赛普特，而无使用稳定剂。
技术解决方法
本案发明者对天凡诺赛普特的稳定性进行各项研究以开发在冷藏储存条件以及在加速和应力条件下储存时，能使天凡诺赛普特衍生的杂质(酸性/碱性变体)的产生减至最低的眼用组成物。具体地，本案发明者进行各种配方研究，包括缓冲液、等渗压试剂、pH范围和功能性赋形剂。结果，本案发明者已发现稳定剂(诸如组胺酸和蔗糖)的使用即使在特定pH下亦允许产生酸性/碱性变体，从而影响该天凡诺赛普特组成物的稳定性。因此，本发明提供pH5.0至pH 6.5的稳定天凡诺赛普特眼用组成物，其实质上不含稳定剂。
具体而言，本发明提供含有天凡诺赛普特的稳定眼用组成物，其包含天凡诺赛普特和pH 5.0至pH 6.5的缓冲系统，并且实质上不含稳定剂。
天凡诺赛普特为韩国公开公报第2013-0143484号中所揭露的TNFRI变体，并且是由野生型TNFRI的胺基酸序列的第41至211号胺基酸所组成的胺基酸序列(TNFRI171)中包含L68V/S92M/H95F/R97P/H98G/K161N的胺基酸修饰的胺基酸序列表示。
由于天凡诺赛普特是由总计171个胺基酸所组成的多肽，如同普通含蛋白质的医药组成物，药物开发中最重要的问题之一是确保该组成物在给予患者之前的稳定性以及显出最佳药效。
为了开发确保天凡诺赛普特的稳定性的配方，本案发明者先测验天凡诺赛普特的储存稳定性，并且结果观察到天凡诺赛普特在储存期间形成电荷变体(实验实施例1)。本文所用的术语“电荷变体”表示蛋白质或多肽的电荷因修饰而从其天然状态发生变化。在一些实施例中，电荷变体比原始蛋白质或多肽的酸性更强，即其pI值比该原始蛋白质或多肽低。在另一个实施例中，电荷变体比该原始蛋白质或多肽的碱性更强，即其pI值比该原始多肽高。该类修饰可为工程或自然程序(例如氧化、去胺化、离胺酸残基的C末端处理、N-末端焦谷胺酸的形成和非酵素糖基化)的结果所致。在一些实施例中，蛋白质或多肽电荷变体为相较于母体糖蛋白具有因添加连接该蛋白质的聚糖而改变电荷的糖蛋白，例如涎酸或其衍生物。本文所用的术语“天凡诺赛普特电荷变体”为天凡诺赛普特的电荷因经修饰而从其天然状态发生改变的材料。
一般而言，由于众所周知电荷变体通常导致药物活性下降，因此必需将电荷变体的产生量控制在特定值或更低。因此，本案发明者确认可使用可用作眼用稳定剂的组分将杂质(诸如电荷变体)的产生减至最低，并且在该组成物中可能主要包含蔗糖和组胺酸(实验实施例2)。然而，在测定含有天凡诺赛普特的组成物的适当pH的另外研究中，证实该电荷变体的生产率即使在特定pH下使用稳定剂时亦是高的，并且将该电荷变体的生产率减至最低值的方法包括提高该电荷变体的生产率，以及调节pH至5.0至6.5而不使用稳定剂(实验实施例3)。
因此，本发明提供含有天凡诺赛普特的眼用组成物，其包含天凡诺赛普特和pH5.0至pH 6.5的缓冲系统，并且实质上不含稳定剂。
天凡诺赛普特较佳是以适当含量包含在组成物中，因为该含量越高，杂质(诸如聚集体)的含量越高。在本发明的含有天凡诺赛普特的眼用组成物中，可包含的天凡诺赛普特含量为0.01至10％(w/v)，例如0.01至8％(w/v)、0.01至6％(w/v)、0.01至4％(w/v)、0.01至2％(w/v)、0.01至1％(w/v)、0.02至1％(w/v)、0.05至0.8％(w/v)、0.1至0.7％(w/v)、或0.2至0.6％(w/v)。鉴于商业目的考虑，该组成物可包含的天凡诺赛普特含量为0.25％(w/v)、0.5％(w/v)、1％(w/v)、2％(w/v)、3％(w/v)、4％(w/v)、5％(w/v)、6％(w/v)、7％(w/v)、8％(w/v)、9％(w/v)，或10％(w/v)。天凡诺赛普特的含量可根据欲给予药物的患者的疾病类型和严重性而变化。
根据本发明的含有天凡诺赛普特的眼用组成物包含pH 5.0至pH 6.5的缓冲系统。该缓冲系统的pH为pH 5.0至pH 6.5即足够，并且在pH 5.0至pH 6.5的范围内所含的所有数值(例如，pH 5.0至pH 6.0的缓冲系统、pH 5.5至pH 6.5的缓冲系统、pH 5.5至pH 6.0的缓冲系统和pH 5.8至pH 6.3的缓冲系统)皆包含在本发明范围内。在一个本发明具体实施方式中，根据本发明的含有天凡诺赛普特的眼用组成物包含pH 5.0至pH 6.0的缓冲系统。在另一个本发明具体实施方式中，根据本发明的含有天凡诺赛普特的眼用组成物包含pH 5.5至pH6.0的缓冲系统。
在根据本发明的含有天凡诺赛普特的眼用组成物中，实施缓冲系统的方法是为彼等在该技术领域中具有通常技艺者所熟知。pH 5.0至pH 6.5的缓冲系统可包含一种或两种或更多种选自由下列各者组成的群组的缓冲液：磷酸盐缓冲液、组胺酸缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、谷胺酸盐缓冲液和乳酸盐缓冲液。无论使用任何缓冲系统，若该缓冲系统符合pH 5.0至pH 6.5的条件，证实可确保天凡诺赛普特的稳定性。然而，使用特定缓冲系统可能相对理想。根据下列实施例，相较于乙酸盐缓冲液，证实柠檬酸盐缓冲液在控制聚集体或电荷变体的产生方面相对有利(实验实施例4)。因此，在一个本发明具体实施方式中，该缓冲系统可为含有柠檬酸盐缓冲液的缓冲系统，例如柠檬酸盐缓冲系统或柠檬酸盐-磷酸盐缓冲系统，但本发明不限于此。该缓冲系统中所包含的缓冲液可由共轭酸-共轭碱的组合组成以提高缓冲效果。例如，在一个本发明具体实施方式中，该缓冲系统包含柠檬酸盐缓冲液，而该柠檬酸盐缓冲液包含柠檬酸三钠(共轭碱)和柠檬酸(共轭酸)。
本发明的缓冲系统包含5mM至50mM缓冲液，例如10mM至30mM缓冲液。
本发明的眼用组成物实质上不包含稳定剂。在此，该稳定剂表示包含在配方中以防止用作活性成分的天凡诺赛普特的化学和物理稳定性或生物活性下降的额外组分。例如，为了抑制该眼用组成物中蛋白质的聚集，众所周知可使用糖类(诸如蔗糖或甘露醇)或胺基酸基稳定剂(诸如脯胺酸、精胺酸、甘胺酸、离胺酸或甲硫胺酸)以确保蛋白质的稳定化。本发明实质上不包含稳定剂，因为从下列具体实施方式中已发现(与通常情况不同)此种稳定剂对天凡诺赛普特的稳定性有不利影响。本发明所描述的缓冲液或等渗压试剂是不包含在该稳定剂内。
“实质上不含”或“实质上无”该稳定剂表示其含量小于0.1％(w/v)、0.05％(w/v)、0.03％(w/v)、0.02％(w/v)、0.01％(w/v)、0.005％(w/v)或0.001％(w/v)，最佳是完全不含的。
眼用组成物的渗透压可为260至320mOsm/kg。
除了作为活性成分的天凡诺赛普特和缓冲系统之外，根据本发明的眼用组成物可进一步包含等渗压试剂。该等渗压试剂是用于调节根据本发明的眼用组成物的渗透压。在本发明中，包含等渗压试剂以使根据本发明的眼用组成物的渗透压为260至320mOsm/kg。该渗透压是藉由测量每单位水中所溶解的颗粒数目所测得。在溶液中，由于溶质颗粒数目是随水(溶剂)的单位数成比例减少，因此低渗透压溶液的浓度较低。当使用半透膜(只有溶剂分子可穿透的膜)分离不同溶质浓度的溶液时，产生溶剂分子从低浓度穿过该膜移至高浓度以形成浓度平衡的渗透作用。驱动此移动的压力是称为渗透压，并且是由溶液中的溶质“颗粒”数目所控制。将含有相同颗粒浓度并施加相同渗透压的溶液称为等渗透压。若将低渗压或高渗压溶液置于眼中，则可能损伤眼睛，因此眼用药物需使用等渗压溶液。本发明是使用氯化钠作为等渗压试剂。在根据本发明的眼用组成物中，等渗压试剂的含量可为0.5至1％(w/v)。在根据本发明的眼用组成物中，等渗压试剂的浓度可为100至150mM。
在一个本发明具体实施方式中，根据本发明的眼用组成物是由天凡诺赛普特、pH5.5至pH 6.0的缓冲系统、等渗压试剂和水组成。在一个具体实施方式中，根据本发明的眼用组成物是由天凡诺赛普特、pH 5.5至pH 6.0并含有柠檬酸盐缓冲液的缓冲系统、氯化钠和水组成。
根据本发明的含有天凡诺赛普特的眼用组成物甚至在加速或应力(stress)条件下亦非常稳定。
根据本发明的含有天凡诺赛普特的眼用组成物在加速条件下储存6个月之后可具有20％或更少量的电荷变体。
根据本发明的含有天凡诺赛普特的眼用组成物在加速条件下储存6个月之后可具有10％或更少量的碱性变体。
根据本发明的含有天凡诺赛普特的眼用组成物在加速条件下储存6个月之后可具有10％或更少量的酸性变体。
根据本发明的含有天凡诺赛普特的眼用组成物在长期储存条件下储存36个月之后可具有20％或更少量的天凡诺赛普特电荷变体。
根据本发明的含有天凡诺赛普特的眼用组成物在长期储存条件下储存36个月之后可具有10％或更少量的天凡诺赛普特碱性变体。
根据本发明的含有天凡诺赛普特的眼用组成物在长期储存条件下储存36个的月后可具有10％或更少量的天凡诺赛普特酸性变体。
因为天凡诺赛普特的理化和生物稳定性获得改善，因此根据本发明的眼用医药组成物可根据惯用方法(诸如滴注法)给予患有TNF介导的眼部疾病(诸如干眼症)的患者。
本发明效果
根据本发明，发现稳定剂(诸如组胺酸或蔗糖)的使用导致杂质(诸如天凡诺赛普特衍生的酸性/碱性变体)的产生，并影响生物活性。根据本发明的眼用医药组成物可控制pH，而非排除使用此种稳定剂以在冷藏储存条件以及加速条件和应力条件下显著减少杂质的产生，从而制备稳定的天凡诺赛普特眼用组成物。
图式简单说明
图1显示天凡诺赛普特在37℃下储存0至4周后的等电聚焦(isoelectricfocusing,IEF)结果；
图2显示天凡诺赛普特在37℃下储存0至4周后的IEX-HPLC分析结果。
图3显示电荷变体的IEF分析结果；
图4显示电荷变体的IEX-HPLC分析结果；
图5显示不含稳定剂的对照组及分别含有甲硫胺酸、甘胺酸、组胺酸盐酸盐和蔗糖作为稳定剂的稳定剂筛选溶液组在IEX-HPLC中主峰的变化；
图6显示不含稳定剂的对照组及分别含有甲硫胺酸、甘胺酸、组胺酸盐酸盐和蔗糖作为稳定剂的稳定剂筛选溶液组在IEX-HPLC中酸性变体的变化；
图7显示不含稳定剂的对照组及分别含有甲硫胺酸、甘胺酸、组胺酸盐酸盐和蔗糖作为稳定剂的稳定剂筛选溶液组在IEX-HPLC中碱性变体的变化；
图8显示在RP-HPLC中藉由变体分析各种pH和稳定剂的条件下所制得的天凡诺赛普特眼用组成物在40℃下储存4周后的稳定性结果；
图9显示在IEX-HPLC中藉由主峰的变化表示在各种pH和稳定剂的条件下所制得的天凡诺赛普特眼用组成物在40℃下储存4周后的稳定性；
图10显示在HEX-HPLC中藉由酸性变体的变化表示在各种pH和稳定剂的条件下所制得的天凡诺赛普特眼用组成物在40℃下储存4周后的稳定性；
图11显示在HEX-HPLC中藉由碱性变体的变化表示在各种pH和稳定剂的条件下所制得的天凡诺赛普特眼用组成物在40℃下储存4周后的稳定性；
图12至14显示当四种类型的天凡诺赛普特眼用组成物分别储存在4℃、25℃和40℃时，进行SEC-HPLC分析的结果；
图15至17显示当四种类型的天凡诺赛普特眼用组成物分别储存在4℃、25℃和40℃时，使用IEX-HPLC分析酸性变体的结果；
图18至20显示当四种类型的天凡诺赛普特眼用组成物分别储存在4℃、25℃和40℃时，使用IEX-HPLC分析碱性变体的结果；
图21藉由使用SEC-HPLC分析聚集体的结果显示天凡诺赛普特眼用组成物的稳定性；
图22至23藉由使用IEX-HPLC分析电荷变体的结果显示天凡诺赛普特眼用组成物的稳定性。
实施方式
本发明较佳体实施方式的详细描述
参照下列制备实施例、说明性实施例和实验实施例，阐明本发明的优点和特征以及实现本发明的方法。然而，提供此等实施例仅为了帮助对本发明的理解，并不欲解释为对本发明的限制。
实验实施例1：天凡诺赛普特电荷变体的测定
电荷变体的产生可能影响药物活性、稳定性和安全性，因此，本案发明者首先分析天凡诺赛普特的电荷变体。更具体地，使天凡诺赛普特在37℃下储存4周之后，实施等电聚焦(IEF)和IEX-HPLC分析。
等电聚焦方法
以每孔10μg装入pH 3.0至pH 7.0的凝胶中，随后在100V下进行电泳1小时，在200V下进行1小时，然后在500V下进行30分钟。以12％三氯乙酸固定该产品达30分钟，然后以考马斯亮蓝(Coomassie blue)染色。
IEX-HPLC(离子交换-高效液相色层分析法)
离子交换-高效液相色层分析法(IEX-HPLC)是使用离子交换剂根据对管柱中的固定相的亲和力而用于分离蛋白质，其是与该蛋白质的净电荷有关。本发明实验方法是使用阳离子交换管柱、温度控制器(设定为25℃)、自动进样器(设定为4℃)、操作在280nm下的UV检测器和可保持0.7mL/min的流速的高效液相色层分析(HPLC)系统进行。
电荷变体的分离和纯化
为了根据含有天凡诺赛普特的眼用组成物中所存在的电荷变体的性质而分离和分析它，使用SP-HP管柱和用于分离蛋白质的液相色层分析法(FPLC)以按盐浓度而分离和纯化蛋白质。根据电荷变体性质，制备酸性变体样品A、主峰样品B和碱性变体样品C，随后分别进行IEF和IEX-HPLC分析。
图1显示天凡诺赛普特在37℃下储存0至4周后的等电聚焦(IEF)的结果。
从IEF的结果(如图1A所示)明显证实随着储存期间的延长，低pI值的带变得更深(或更浓)，指示天凡诺赛普特的酸性变体的产生。
图2说明天凡诺赛普特在37℃下储存0至4周后的IEX-HPLC分析结果。
此外，从IEX-HPLC的结果(如图2所示)亦证实随着储存期间的延长，酸性变体的量增加。
为了研究电荷变体的性质，使藉由使用SP-HP管柱进行含电荷的分离所获得的酸性变体样品、主峰样品和碱性变体样品进行IEF及IEX-HPLC分析。
图3显示电荷变体的IEF分析结果。此外，图4说明电荷变体的IEX-HPLC分析结果。如图3和4所示，层析图结果说明在主峰样品之前仅溶洗出分离的酸性变体的样品A。同样地，从IEF的结果可看出样品A的pI值是低于主峰样品。此外，层析图结果亦说明在主峰样品之后才溶洗出碱性变体样品(即样品B)。此外，从IEF结果可见样品B的pI值略高于主峰样品。
实验实施例2：筛选眼用稳定剂
通常需将稳定剂加入蛋白质组成物中以稳定储存配方直到将该配方给予患者。事实上，使用稳定剂可显著减少储存期间可能产生的杂质(诸如聚集体或电荷变体)，以便在储存期间保持稳定配方。因此，选择可稳定蛋白质组成物的主要组分，从而制备稳定组成物的理想稳定剂是绝对重要的。为了进行稳定剂的应力实验(40℃，储存4周)并选择可稳定作为本发明主要组分的天凡诺赛普特的所需稳定剂类型，本案发明者首先进行下列实验。
1)制备天凡诺赛普特溶液样品
制备于含有125mM氯化钠的20mM柠檬酸钠缓冲液中的10mg/mL天凡诺赛普特溶液。2)制备柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液pH 7.0
将0.37g柠檬酸酐和2.58g磷酸氢二钠加入900mL超纯水中，随后彻底混合该等物。使用37％盐酸或40％氢氧化钠在pH 7.0下进行滴定之后，加入超纯水以制备1L最终产品。
3)制备稳定剂筛选溶液
将四(4)种类型的稳定剂(0.149g甲硫胺酸、0.751g甘胺酸、1.55g组胺酸盐酸盐及6.84g蔗糖)分别加入100mL项目2)中所制得的缓冲液中，从而在pH 7.0下制备四(4)种类型的稳定剂筛选组成物。
[表1]
4)样品的制备和评估
在将项目3)中所制得用于筛选眼用稳定剂的10mL溶液与天凡诺赛普特一起加入3.5kDa离心过滤器之后，使样品在4℃及4000rpm下离心以便以项目3)的稳定剂筛选缓冲液替代项目1)的天凡诺赛普特缓冲液。重复上述步骤以产生含有1mg/mL天凡诺赛普特的稳定剂筛选溶液(样品)。将所得样品在40℃下储存4周，随后分别在0周和4周时经由IEX-HPLC分析样品，以便分析各样品中所鉴别出的理化杂质。
[表2]
表2和图5至7显示无任何稳定剂的控制组及分别包含甲硫胺酸、甘胺酸、组胺酸盐酸盐和蔗糖作为稳定剂的稳定剂筛选组的IEX-HPLC分析结果。
因此，如表2及图5至7所示，证实包含蔗糖和组胺酸盐酸盐者显示减少产生碱性变体和酸性变体的趋势。具体而言，在组胺酸盐酸盐的情况下，可见到酸性变体的产生相较于控制组或其他稳定剂是显著减少的。
实验实施例3：制备不同pH的眼用组成物并评估其稳定性
由于眼泪的pH为7.0至7.5，最佳是将眼用组成物设定为相似pH条件。然而，pH亦可能极大程度地影响蛋白质稳定性。因此，打算制备具有不同pH值的眼用组成物并评估其稳定性。
(1)制备眼用组成物
1)制备pH 5.0至pH 7.0的20mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液
将柠檬酸酐和磷酸氢二钠加入400mL超纯水中以符合所需pH(在pH 5.0/5.5缓冲液的情况下：0.62g柠檬酸酐和0.97g磷酸氢二钠；在pH 6.0/6.5缓冲液的情况下：0.43g柠檬酸酐和1.11g磷酸氢二钠；在pH 7.0缓冲液的情况下：0.19g柠檬酸酐和1.29g磷酸氢二钠)。此外，使用37％盐酸或40％氢氧化钠滴定至pH 5.0至pH 7.0以符合不同条件之后，加入超纯水以制备500mL的最终产品。
2)制备添加稳定剂的眼用组成物(pH 5.0至pH 7.0)
在100mL项目1)中所制得的五种(5)pH 5.0至pH 7.0的缓冲液中的各者中加入6.85g蔗糖及1.55g组胺酸，从而制备五种(5)类型的pH 5.0至pH 7.0的20mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(其各包含200mM蔗糖)以及五种(5)类型的pH 5.0至pH 7.0的20mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(其各包含100mM组胺酸)。作为无稳定剂的实验组，如上述项目1)中所制得的五种(5)pH 5.0至pH 7.0的20mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液是直接用作无稳定剂的实验组。因此，制备总计15种类型具有/无稳定剂的pH 5.0至pH 7.0的缓冲液。
3)样品的制备和评估
在加入4mL项目2)中所制得的各缓冲液以及天凡诺赛普特之后，使用3.5kDa离心过滤器使样品进行离心，随后以含有稳定剂的pH 5.0至pH 7.0的缓冲液取代现存的天凡诺赛普特缓冲液。重复上述步骤以获得15种类型含有不同稳定剂并具有不同pH值的样品。制得样品是在40℃下储存4周，然后在0周及4周时分析的，以便分析各样品中所鉴别出的理化杂质。
[表3]制备添加稳定剂的眼用组成物(pH 5.0至pH 7.0)
无稳定剂 组胺酸 蔗糖
pH 5.0 0mM 100mM 200mM
pH 5.5 0mM 100mM 200mM
pH 6.0 0mM 100mM 200mM
pH 6.5 0mM 100mM 200mM
pH 7.0 0mM 100mM 200mM
(2)评估天凡诺赛普特对pH和稳定剂的稳定性
1)逆相色层分析
RP-HPLC(逆相色层分析法)是按蛋白质的极性评估纯度的方法。本发明实验方法是使用逆相色层分析管柱、温度控制器(设定为60℃)、自动进样器(设定为4℃)、操作在214nm下的UV检测器和可保持1.0mL/min的流速的高效液相色层分析(HPLC)系统进行。
使所制得的15种类型的样品在应力条件下储存(在40℃下储存)4周，然后在0周和4周时分析，以便分析各样品中所鉴别出的产生变体的变化。因此，如表4和图8所示，其是由包含蔗糖或组胺酸作为稳定剂的pH 7.0的实验组显出比无稳定剂的实验组更低的变体产生速率的结果获得证实。然而，在包含组胺酸作为稳定剂的实验组的情况下，说明在pH 5.0至pH 6.5下变体产生的速率是高于控制组。此外，在包含蔗糖作为稳定剂的实验组中，说明在pH 5.0至pH 6.0下变体产生的速率是高于控制组。
[表4]
2)离子交换高效液相色层分析(IEX-HPLC)
由于蛋白质的净电荷，IEX-HPLC是使用离子交换剂根据对管柱的固定相的亲和力而用于分离蛋白质。本发明实验方法是使用阳离子交换管柱、温度控制器(设定为25℃)、自动进样器(设定为4℃)、操作在280nm下的UV检测器和可保持0.7mL/min的流速的高效液相色层分析(HPLC)系统进行。
将所制得的15种类型的样品在应力条件下储存(40℃下储存)4周，然后在0周和4周时分析，随后比较各样品中所鉴别出的产生酸性/碱性变体的变化。
因此，如表5和图9至11所示，可看出就产生酸性变体而言，pH 5.0至pH 6.5的无稳定剂组显出比含有蔗糖或组胺酸的实验组更好的结果。具体而言，pH 5.0至pH 6.0的无稳定剂组在产生酸性变体方面显示变化小于10％。对于碱性变体，pH 5.0至pH 6.0的无稳定剂组显示比含有蔗糖或组胺酸的实验组更好的结果。在pH 6.5至pH 7.0时，含有蔗糖的实验组在产生碱性变体方面显示变化最小，而含有组胺酸的实验组则与无稳定剂组之间无显著差异。
[表5]
分析上述测量值的结果，pH 7.0的含有蔗糖或组胺酸的实验组显示比无稳定剂组产生更少变体的趋势。相反地，当将pH值降低至pH 5.5或pH 6.0时，可看出相较于无稳定剂组，在含有蔗糖或组胺酸的实验组中倾向显著增加变体的产生。
结合实验结果，与预期相反，可确定pH 5.5至pH 6.0且不含任何稳定剂的含有天凡诺赛普特的眼用组成物的实验组(即无稳定剂组)显出最少变体产生。
通常，眼用组成物可设定为pH 7.0，该值是类似体内pH。然而，活性成分在眼用组成物中的稳定性是表现医学疗效的要点，从而得出较佳将本发明的含有天凡诺赛普特的眼用组成物设定为pH 5.5至pH 6.0，同时不含蔗糖或组胺酸的结论。
实验实施例4：评估对缓冲系统的稳定性
为了比较缓冲液的基本组成及添加/未添加两种功能性赋形剂的差异，同时固定天凡诺赛普特的浓度、pH、氯化钠的浓度、渗透压等，制备四种(4)实验组并分别在4℃、25℃和40℃下筛选，以便选择最终配方。考虑上述实验结果，将眼用组成物的pH固定为pH 5.5。此外，相对于缓冲系统，使用乙酸钠(20mM)和柠檬酸钠(20mM)作为通常可用于上述范围的普通缓冲液以评估天凡诺赛普特。
如下表6所示，制备四种(4)类型的含有天凡诺赛普特的眼用组成物并将其用于进行天凡诺赛普特的稳定的性实验。
[表6]
藉由SEC-HPLC分析聚集体并分析电荷变体，使含有天凡诺赛普特的眼用组成物进行稳定性实验。该稳定性实验是在4℃、25℃和40℃下进行共计2个月。在0周、2周、1个月和2个月时，经由SEC-HPLC进行聚集体分析并经由IEX-HPLC进行电荷变体分析。
(1)藉由SEC-HPLC分析聚集体
粒径排阻高效液相色层分析法(SEC-HPLC)通常是藉由将固定相样品导入填有多孔凝胶的管柱中而用于根据尺寸差异分离蛋白质。本发明实验方法是使用粒径排阻管柱、温度控制器(设定为25℃)、自动进样器(设定为4℃)、操作在214nm下的UV检测器和可保持0.5mL/min的流速的高效液相色层分析(HPLC)系统进行。
表7至9及图12至14说明上述四种(4)类型的含有天凡诺赛普特的眼用组成物储存在4℃、25℃和40℃时，进行的SEC-HPLC分析的结果。由SEC-HPLC分析结果可见温度越高，聚集体的浓度越高。具体而言，在包含缓冲液的配方的情况下，聚集体迅速产生。在以柠檬酸盐缓冲液所制得的三种(3)类型的配方中，FFS3在4℃下储存2个月之后量得具有高聚集体含量。此外，不含任何赋形剂的FFS2在包括25℃、40℃、2周、1个月和2个月的所有条件下皆显示最稳定的结果。
[表7]SEC聚集体分析[4℃]
[表8]SEC聚集体分析[25℃]
[表9]SEC聚集体分析[40℃]
(2)藉由IEX-HPLC进行酸性变体分析
表10至12及图15至17说明上述四种(4)类型的含有天凡诺赛普特的眼用组成物储存在4℃、25℃和40℃时，藉由IEX-HPLC进行酸性变体分析的结果。
[表10]IEX-酸性变体[4℃]
[表11]IEX-酸性变体[25℃]
[表12]IEX-酸性变体[40℃]
(3)藉由IEX-HPLC进行碱性变体分析
表13至15及图18至20说明上述四种(4)类型的含有天凡诺赛普特的眼用组成物储存在4℃、25℃和40℃时，藉由IEX-HPLC进行碱性变体分析的结果。
[表13]IEX-碱性变体[4℃]
[表14]IEX-碱性变体[25℃]
[表15]IEX-碱性变体[40℃]
由IEX-HPLC分析可见所有配方在40℃的高温储存条件下皆显示酸性和碱性变体有增加的趋势，具体而言，乙酸盐缓冲液(FFS1)配方显出在所有温度下碱性变体皆显著增加的模式。
因此，在产生聚集体和碱性变体方面，证实乙酸盐缓冲液(FFS1)的稳定性是比柠檬酸盐缓冲液(FFS2至4)更差。此外，根据柠檬酸盐缓冲液的基本组成，当比较添加功能性赋形剂组和无功能性赋形剂组时，证明无功能性赋形剂组是最稳定的。因此，在简化产品制造程序、制造程序中的污染和均匀性的整体考虑下，采用使用柠檬酸盐缓冲液(FFS2)的配方作为最终配方。然而，考虑眼泪的生理pH为中性，除了可接受的稳定性程度之外，选择患者顺应性可能稍高的pH 6.0作为最终产品的pH。
制备实施例1：生产含有天凡诺赛普特的眼用组成物
在900ml超纯水中加入5.35g柠檬酸三钠二水合物、0.35g柠檬酸酐和7.3g氯化钠并使其完全溶解，从而制备缓冲液。在确认缓冲液的pH为pH 6.0±0.1之后，使用量筒将缓冲液的量调整至最终溶液体积为1L，然后经由0.22gm瓶盖过滤器系统过滤。
然后，将天凡诺赛普特加入所制得的缓冲液中以产生含有0.25％天凡诺赛普特的眼药水组成物。
[表16]
组分 含量(mg/m1)
天凡诺赛普特 2.5
柠檬酸三钠，二水合物 5.35
柠檬酸酐 0.35
氯化钠 7.31
氢氧化钠 依需要
盐酸 依需要
超纯水 Q.S.
实验实施例5：评估含有天凡诺赛普特的眼用组成物的稳定性
使根据制备实施例1的含有天凡诺赛普特的眼用组成物进行稳定性评估。
长期储存条件是设定为5℃(未调整湿度)，而加速条件则设定为25℃/60％RH。制备实施例1中的组成物是储存在此等条件下，然后使其经由SEC-HPLC进行聚集体分析并经由IEX-HPLC进行电荷变体分析。
[表17]
表17及图21显示经由SEC-HPLC进行聚集体分析的结果。如表17及图21所示，当组成物在5℃的长期储存的条件下储存3年时，由于聚集体的形成是在5％内，因而确认制备实施例1的组成物是稳定的。此外，当组成物在25℃/60％RH的加速条件下储存6个月时，说明聚集体的产生是在5％内。
[表18]
表18及图22至23显示经由IEX-HPLC进行电荷变体分析的结果。如表18及图22至23所示，当组成物是在5℃的长期储存条件下储存3年时，由于储存期间电荷变体的形成是在5％内，因而确认制备实施例1的组成物是稳定的。此外，碱性变体的形成亦在10％内，从而说明储存期间的稳定性。
此外，当组成物在25℃/60％RH的加速条件下储存6个月时，说明酸性变体的形成是在10％内。此外，碱性变体的形成是在10％内，从而说明储存期间的稳定性。

Claims (17)

1.一种含有天凡诺赛普特(tanfanercept)的稳定眼用组成物，其包含：
天凡诺赛普特和pH 5.0至pH 6.5的缓冲系统，
其实质上不含稳定剂。
2.如权利要求1所述的组成物，其中所述天凡诺赛普特的含量为0.01％(w/v)至10％(w/v)。
3.如权利要求1所述的组成物，其中所述缓冲系统的pH为pH 5.0至pH 6.0。
4.如权利要求1所述的组成物，其中所述缓冲系统的pH为pH 5.5至pH 6.0。
5.如权利要求1所述的组成物，其中所述缓冲系统包含一种或两种或更多种选自由下列各者组成的群组的缓冲液：磷酸盐缓冲液、组胺酸缓冲液、乙酸盐缓冲液、琥珀酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、谷胺酸盐缓冲液和乳酸盐缓冲液。
6.如权利要求1所述的组成物，其中所述缓冲系统为柠檬酸盐缓冲系统、磷酸盐缓冲系统或柠檬酸盐-磷酸盐缓冲系统。
7.如权利要求6所述的组成物，其中所述柠檬酸盐缓冲系统包含柠檬酸三钠和柠檬酸作为缓冲液。
8.如权利要求1所述的组成物，其中所述缓冲系统包含5至50mM缓冲液。
9.如权利要求1所述的组成物，其进一步包含等渗压试剂。
10.如权利要求9所述的组成物，其中所述等渗压试剂为氯化钠。
11.如权利要求1所述的组成物，其中所述眼用组成物在加速条件下储存6个月之后具有20％或更少量的天凡诺赛普特电荷变体。
12.如权利要求1所述的组成物，其中所述眼用组成物在加速条件下储存6个月之后具有10％或更少量的天凡诺赛普特碱性变体。
13.如权利要求1所述的组成物，其中所述眼用组成物在加速条件下储存6个月之后具有10％或更少量的天凡诺赛普特酸性变体。
14.如权利要求1所述的组成物，其中所述眼用组成物在长期储存条件下储存36个月之后具有20％或更少量的天凡诺赛普特电荷变体。
15.如权利要求1所述的组成物，其中所述眼用组成物在长期储存条件下储存36个月之后具有10％或更少量的天凡诺赛普特碱性变体。
16.如权利要求1所述的组成物，其中所述眼用组成物在长期储存条件下储存36个月之后具有10％或更少量的天凡诺赛普特酸性变体。
17.如权利要求1所述的组成物，其中所述眼用组成物的渗透压(osmolality)为260至320mOsm/kg。
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