TW202227121A - 以含有天凡諾賽普特（ｔａｎｆａｎｅｒｃｅｐｔ）之眼用組成物治療乾眼症 - Google Patents

Abstract

本發明係關於使用含有天凡諾賽普特之眼用組成物治療乾眼症。根據本發明，作為針對乾眼症之臨床試驗的結果，含有天凡諾賽普特之眼用組成物在中央角膜染色評分(CCSS)和總體角膜染色評分(TCSS)之改善方面顯示優異的效果，這在臨床上很重要。此外，在有中度至重度嚴重性乾眼之患者中更顯著地顯示出如此之中央角膜染色評分(CCSS)和總體角膜染色評分(TCSS)的改善。另外，具有較高眼部不適評分或較高眼睛乾燥度評分(其係主觀症狀)之患者亦顯示更大的改善。即使使用相同劑量之天凡諾賽普特，該含有天凡諾賽普特之眼用組成物在具有更嚴重或嚴峻之基線徵象或症狀評分的患者中顯示更優越的功效。此結果為出乎意料且在對中度或重度乾眼症無療法的現有條件下是有意義的，因為可提供新穎及替代療法方案。

Description

以含有天凡諾賽普特（ｔａｎｆａｎｅｒｃｅｐｔ）之眼用組成物治療乾眼症

本發明係關於使用包含有天凡諾賽普特之眼用組成物的乾眼症治療方法。

乾眼症是每年侵襲數百萬人之常見的眼部疾病。特別地，已知停經後女性經常患有乾眼症，原因在於生育期結束引起之荷爾蒙變化。乾眼呈現程度隨人而異。輕度症狀之情況下，患者可能感覺不適、乾燥和不便。重度之情況下，視力可能嚴重受損。其他疾病諸如休格倫氏(Sjogren’s)症候群和疤痕性類天疱瘡可能顯現乾眼之綜合症狀。

基於現今之研究結果，乾眼症係理解為由於各種壓力(stress)所引起之涉及眼部表面上細胞因子和抗原呈現細胞的自體免疫反應的發生而引起之疾病，其使免疫細胞集中到角膜組織中，從而損害組織。

乾眼症之典型治療方法可能包括使用人工淚液，從而補充眼球的淚膜，減少眼淚的蒸發並使之穩定。此外，亦可使用刺激內部眼淚產生之眼植入物。人工淚液的主要成分可包括纖維素醚、卡波姆(carbomer)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、透明質酸鈉等，其係含於緩衝液或等滲鹽溶液中以製備人工淚液。這些成分可使溶液黏稠以防止溶液易於從眼中流出，除此外，在用作潤滑劑的同時可防止眼淚蒸發。然而，包括此類成分的治療劑不是用於治療的基本解決方案而是限於用作對症治療。

另一方面，隨著引起乾眼之原因與眼部表面上的發炎反應有關之揭示，正進行將各種類型的抗炎物質應用於治療之研究且已證實其效果。

具體而言，據報導，患有乾眼症之患者的眼部組織(諸如淚腺和瞼腺)表現失衡和過多的發炎介質。此外，已知多種化合物諸如類固醇、細胞因子抑制劑、環孢菌素A、15-HETE等有效治療乾眼症。

腫瘤壞死因子α(TNFα)係參與發炎反應之主要因子並與細胞表面的人類腫瘤壞死因子受體(TNFR)I或II結合以產生各種細胞反應，包括凋亡和發炎反應。由於已證明可透過抑制TNFα和腫瘤壞死因子受體(TNFR)之結合來治療各種自體免疫相關的發炎反應，已開發出多種TNFα抑制劑而代表性TNFα抑制劑包括例如由Fc與可溶性TNFR II結合產生的依那西普(etanercept)(產品名稱：Enbrel)、作為針對TNFα之抗體的英夫單抗(infliximab)(產品名稱：Remicade)和阿達木單抗(adalimumab)(產品名稱：Humira)等等。這些主要係用於治療類風濕關節炎、牛皮癬和克隆氏症。

然而，抗TNFα抗體藥物具有局限性，因其無法有效地達到由於高分子量而在局部部位發生的發炎性疾病。因此，本案申請人開發了具有小尺寸但高活性的多肽分子，其適合於治療局部發炎性疾病。本發明之TNFα抑制劑，即修飾的人類腫瘤壞死受體-1多肽(天凡諾賽普特)在本案申請人提交的韓國專利公開公報第2012-0072323號中揭露。此外，在韓國專利公開公報第203-0143484號中亦已描述天凡諾賽普特在治療乾眼症中的用途。

[先前技術文獻] [專利文件] 韓國專利公開公報 第2012-0072323號 韓國專利公開公報 第2013-0143484號

[要解決的技術問題]

本發明之一目標為提出適用於使用含有天凡諾賽普特之眼用組成物治療乾眼症的患者群體。

本發明之另一目標為提供一種具有適當組成之用於治療乾眼症的眼用組成物(其使用天凡諾賽普特)，以及一種使用此眼用組成物治療乾眼症之方法。 [技術解決方案]

天凡諾賽普特是由共171個胺基酸所組成之多肽。因此，類似於一般含蛋白質的藥物組成物，藥物開發中最重要的問題之一是在對患者給藥之前確保穩定性以達成該組成物之最大功效。藥物開發中的另一個重要問題是，除了確保藥物穩定性之外，還要找到對藥物最佳反應之特定患者群體，從而提高藥物之效用。即使已確認該藥物有效，療效可能並不適用於所有患者。因此，為了提供關於可選擇最適合用於治療患者疾病的藥物之資訊，較佳為指定可用相應藥物治療之適當患者群體。

由於已發現天凡諾賽普特於治療乾眼症之用途，本案發明人不斷研究使用上述藥物製造用於治療乾眼症之眼用組成物。考慮到天凡諾賽普特作為蛋白質藥物之藥用特性，正在研究改善藥物穩定性之眼用組成物的組成，且透過臨床試驗確定了在使用天凡諾賽普特治療時表現出最高治療效率之患者群體。

結果，本發明提供包含天凡諾賽普特作為活性成分之眼用組成物，其用於治療有中度至重度乾眼之患者的乾眼症。

根據天凡諾賽普特之臨床試驗結果，證實了包含有天凡諾賽普特之眼用組成物在有中度至重度乾眼之患者而非有輕度乾眼之患者中對乾眼症的治療展現優異之效果。此結果係與先前技術相反，先前技術中大多數用於治療乾眼症之眼用組成物已被評估為適於治療輕度乾眼而非中度至重度乾眼。在具有中度至重度乾眼的患者而非具有輕度乾眼的患者中，包含有天凡諾賽普特之眼用組成物對乾眼症的治療顯示出更優異的效果，這將在眼用組成物治療乾眼症的領域中提供一種新穎的治療手段。

有中度至重度乾眼之患者可包括在下角膜、中央角膜和上角膜之至少一個區域的角膜染色評分為2或更高且席爾默氏(Schirmer’s)淚液試驗評分為不小於1且不大於7之患者。

根據本發明，作為乾眼患者之乾眼程度的評估方法，可使用作為乾眼症之客觀評價指標的徵象和作為其主觀評價指標的症狀以及藥物對乾眼的改善程度。

可藉由評估角膜染色評分(corneal staining score,「CSS」)來評估客觀評估指標，即徵象。CSS評估是一種將染色劑滴入眼睛，接著觀察對角膜的損傷程度，然後對觀察到的損傷程度進行評分之方法。CSS所表示得分範圍是0到4。染色程度與損壞程度成正比。即，較高的CSS表示對角膜的損傷更嚴重。CSS為2表示CSS評估標準較弱。同理，CSS為3表示中等而CSS為4表示嚴重。然而，即使任何一個區域的CSS為2，就其他客觀徵象或主觀評估指標症狀而言，乾眼症也可能處於中等程度或更高程度。因此，除了CSS之外，還應結合其他評估指標來確定乾眼症之狀態。

與CSS一同確定之另一客觀評估指標可為席爾默氏淚液試驗評分。席爾默氏淚液試驗(Schirmer’s tear test,「STT」)是一種方法，其中將STT試紙條置於患者每隻眼睛的下眼瞼緣上，然後閉上眼睛5分鐘，接著將STT試紙條移除，並測量及記錄濕部之長度(mm)。在本發明中，具中度至重度乾眼之患者可包括在下角膜、中央角膜和上角膜之至少一個區域的CSS為2或更高且STT評分為1至7範圍之患者。在此，其意味著STT評分越低，乾眼症之嚴重性就越嚴重。

當以本發明之眼用組成物投予具乾眼症之患者，在投予該眼用組成物後8週內開始出現該中度至重度乾眼之徵象的改善。

投予後8週的期間僅為說明性的，徵象的改善(「徵象改善」)可例如在較短的期間內表現，諸如投予後7週、6週、5週、4週、3週、2週或1週。這意味著徵象改善取決於受試者，即患者，且可根據不同因素而變化，諸如嚴重性、藥物劑量等等，條件為徵象改善至少在投予後8週內出現。

具體而言，徵象改善可由總體角膜染色評分(total corneal staining score, TCSS)和中央角膜染色評分(central corneal staining score, CCSS)之降低來確定。具有高CSS之角膜區域可根據患者或乾眼症之嚴重性而有所不同。然而，總體角膜染色評分(TCSS)包括角膜每個區域(包括下部、中央部和上部區域)之CSS的總和，因此就徵象改善而言，減少TCSS具有重大意義。通常，當以眼藥水形式投予眼用組成物時，眼藥水可能沉降到下角膜部分，因此增加了改善下角膜染色評分(inferior corneal staining score, ICSS)的可能性。然而，本發明將採用中央角膜染色評分(CCSS)(與視覺直接相關的臨床相關區域)之降低作為徵象改善的指標。

同時，亦可透過症狀之改善作為主觀評估指標來評估中度至重度乾眼是否得到改善。

當以本發明之眼用組成物投予具乾眼症之患者，在投予該眼用組成物後8週內開始出現該中度至重度乾眼之症狀的改善。

投予後8週的期間僅為說明性的，症狀的改善(「症狀改善」)可例如在較短的期間內表現，諸如投予後7週、6週、5週、4週、3週、2週或1週。這意味著症狀改善取決於受試者，即患者，且可根據不同因素而變化，諸如嚴重性、藥物劑量等等，條件為症狀改善至少在投予後8週內出現。

症狀改善可透過減少眼睛乾燥度評分(eye dryness score, EDS)來確定。本發明中使用的EDS透過受試者在視覺模擬量表(visual analog scales, VAS)上對眼睛乾燥度評分的評估來定義。可以0至100範圍內之連續標度評估待測受試者的EDS，其中0指的是「無乾燥」而100表示「最大乾燥」。

根據本發明之實施例，患者之CCSS可為2或更高(CCSS≥2)。CCSS≥2表示中央角膜區域的CSS處於中等程度或更高。此外，患者之TCSS可為5或更高(TCSS≥5)。TCSS≥5表示下、中央和上角膜區域的CSS總數為中等程度或更高。

此外，根據本發明之實施例，在投予該眼用組成物前，患者的席爾默氏淚液試驗評分(Schirmer’s tear test score, 「STTS」)可為1至7之範圍。根據本發明之另一實施例，在投予該眼用組成物前，患者的STTS可為1至3之範圍。如上所述，STTS與乾眼症的嚴重性成反比。在患者的STTS為1至3之範圍的情況下，本發明之眼用組成物亦展現優異之乾眼治療效果。

根據另一實施例，在投予該眼用組成物前，患者的眼部不適評分(ocular discomfort score,「ODS」)可為3或更高。透過在0至4分之範圍內對患者主觀感覺到的眼部不適程度進行評分來確定ODS。因此，較高的分數意味著眼部不適增加。ODS為3或更高表示該患者至少患有中度乾眼症，因此感到間歇性甚至持續不適。

根據適於投予本發明之眼用組成物的患者群體的另一實施例，在投予該眼用組成物前，患者的TCSS可為5或更高且ODS可為3或更高。

可替代地，適於投予本發明之眼用組成物的患者可包括在投予該眼用組成物前，TCSS為4或更高且EDS為40或更高的患者(例如，TCSS為5或更高且EDS為60或更高)。

此外，適於投予本發明之眼用組成物的患者可包括在投予該眼用組成物前，在1個月內有使用人工淚液之經歷的患者。

本發明之眼用組成物可以眼藥水之形式配製。

具體而言，本發明之眼用組成物可以眼藥水之形式一天一或多次投予。例如，該眼用組成物可以眼藥水之形式一天兩次投予。

同時，為了開發即使組成物在冷藏條件下及/或在加速和壓力(stress)條件下保存，也能使天凡諾賽普特衍生之雜質(酸性/鹼性變體)的產生減至最少之眼用組成物，本案發明人已進行了許多關於天凡諾賽普特穩定性之研究。特別地，本案發明人研究了包括緩衝液、等滲劑、pH範圍、功能性賦形劑等多種配方。結果，發現使用穩定劑諸如組胺酸或蔗糖會誘導在特定pH下產生酸性/鹼性變體，從而對天凡諾賽普特組成物之穩定性產生影響。因此，本發明旨在提供在不包括穩定劑的情況下在pH 5.0至pH 6.5下穩定之含有天凡諾賽普特之眼用組成物。

具體而言，本發明提供一種含有天凡諾賽普特之穩定的眼用組成物，其包含天凡諾賽普特及pH 5.0至pH 6.5的緩衝系統且實質上不含任何穩定劑。

天凡諾賽普特係韓國專利公開公報第2013-0143484號中所揭示之TNFRI變體，且係以包括由天然TNFRI的第41至211號胺基酸殘基所組成之胺基酸序列TNFRI171的修飾的胺基酸L68V/S92M/H95F/R97P/H98G/ K161N的胺基酸序列所表示。

天凡諾賽普特是一種由總共171個胺基酸所組成之多肽。因此，類似於普通之含蛋白質的藥物組成物，藥物開發中最重要的問題之一是在投予患者前確保其穩定性以表現出藥物組成物之最佳功效。

為了開發確保天凡諾賽普特之穩定性的配方，首先，本案發明人進行了天凡諾賽普特之儲存穩定性的實驗。實驗的結果，觀察到天凡諾賽普特在儲存期間形成電荷變體(實驗實例1)。本文所提及之術語「電荷變體」是指由於蛋白質或多肽從其天然狀態之修飾引起的蛋白質或多肽的電荷變化。在一些實例中，電荷變體可具有比原始蛋白質或多肽更高的酸度，即更低的pI值。在其他實例中，電荷變體可具有比原始蛋白質或多肽更高的鹼性，即更高的pI值。上述修飾可為操縱或自然過程(例如氧化、脫醯胺基化、離胺酸殘基中C末端之加工，N末端焦麩胺酸之形成和非酶糖化作用)的結果。在一些實例中，蛋白質或多肽的電荷變體可為醣蛋白，其中與母體醣蛋白相比，黏附至蛋白質的聚醣通過添加涎酸或其衍生物來修飾以改變該醣蛋白的電荷。在此提及之術語「天凡諾賽普特電荷變體」是指由於天凡諾賽普特從其天然狀態的修飾而改變天凡諾賽普特之電荷的物質。

眾所周知，電荷變體通常造成藥物活性的下降。因此，有必要將電荷變體的產生量最小化至預定程度或更少。因此，本案發明人研究了使用可用作眼部穩定劑之組分是否能使雜質諸如電荷變體的產生最小化，而結果證實了較佳為先包括蔗糖和組胺酸(實驗實例2)。然而，在為探索含有天凡諾賽普特之組成物的合適pH的進一步研究中，發現即使在使用這些穩定劑的情況下，電荷變體的生成率在特定pH下也高。相反地，已證明在不使用任何穩定劑的情況下將pH調節在pH 5.0至pH 6.5之範圍內是所欲解決方案，以盡可能地降低電荷變體的生成率(實驗實例3)。

因此，本發明可提供含有天凡諾賽普特之眼用組成物，其包含天凡諾賽普特和pH 5.0至pH 6.5的緩衝系統且實質上不包括穩定劑。

天凡諾賽普特係較佳以適當的含量包括於組成物中。隨著含量的增加，諸如聚集體之雜質的含量可能增加。關於含有天凡諾賽普特之眼用組成物，天凡諾賽普特可以0.01%(體積重量，w/v)至1%(w/v)之量被包括，例如，0.02%(w/v)至1%(w/v)、0.05%(w/v)至0.8%(w/v)、0.1%(w/v)至0.7%(w/v)、0.2%(w/v)至0.6%(w/v)等。考慮到商業目的，天凡諾賽普特可以0.25%(w/v)、0.5%(w/v)、1%(w/v)等之量包括在組成物中。天凡諾賽普特之含量可能取決於作為藥物投予受試者之患者的疾病類型、疾病的嚴重性等。

根據本發明之含有天凡諾賽普特之眼用組成物可包含pH 5.0至pH 6.5之緩衝系統。緩衝系統之pH在pH 5.0至pH 6.5的範圍內即為足夠。在pH 5.0至pH 6.5範圍內的數值，例如，緩衝系統在pH 5.0至pH 6.0、緩衝系統在pH 5.5至pH 6.5、緩衝系統在pH 5.5至pH 6.0、緩衝系統在pH 5.8至pH 6.3等，可包括於本發明之範圍內。根據本發明之一實施例，本發明之含有天凡諾賽普特之眼用組成物可包括pH 5.0至pH 6.0的緩衝系統。根據本發明之另一實施例，本發明之含有天凡諾賽普特之眼用組成物可包括pH 5.5至pH 6.0的緩衝系統。

在本發明之含有天凡諾賽普特之眼用組成物中實施緩衝系統的方法是本領域技術人員眾所周知的。pH 5.0至pH 6.5的緩衝系統可包括，例如，一或多種選自由磷酸鹽緩衝液、組胺酸緩衝液、醋酸鹽緩衝液、琥珀酸鹽緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液、麩胺酸鹽緩衝液和乳酸鹽緩衝液所組成之群組的緩衝液。係認為若滿足pH 5.0至pH 6.5之條件則可使用任何緩衝系統來確保天凡諾賽普特之穩定性。事實上，與其他緩衝系統相比，較佳使用特定的緩衝系統。從以下實施例中，可證實，與醋酸鹽緩衝液相比，檸檬酸鹽緩衝液在控制聚集體或電荷變體之產生方面是相對有優勢的(實驗實例4)。因此，根據本發明之實施例，緩衝系統可為包括檸檬酸鹽緩衝液的緩衝系統，例如，檸檬酸鹽緩衝液系統或檸檬酸鹽-磷酸鹽緩衝液系統，但不限於此。為了增加緩衝效果，緩衝系統中包括的緩衝液可以由共軛酸-共軛鹼之組合構成。例如，根據本發明之實施例，緩衝系統可包括檸檬酸鹽緩衝液，其中檸檬酸鹽緩衝液包括檸檬酸三鈉(共軛鹼)和檸檬酸(共軛酸)。

本發明之緩衝系統可包括濃度為5 mM至50 mM的緩衝液，例如，濃度為10 mM至30 mM的緩衝液。

本發明之眼用組成物的特徵在於實質上不包括穩定劑。在此，穩定劑是指為了防止用作活性成分之天凡諾賽普特的化學或物理穩定性或生物活性降低而包括於配方中之另外組分。例如，就眼用組成物而言，眾所周知的是諸如蔗糖或甘露醇之醣類可用於抑制蛋白質的凝結，或者諸如脯胺酸、精胺酸、甘胺酸、離胺酸或甲硫胺酸之含胺基酸的穩定劑可用於獲得蛋白質的穩定化作用。如以下實施例所示，本發明與典型情況不同，且發現當包括如上所述之穩定劑時，其對天凡諾賽普特之穩定性有不利影響。因此，本發明之眼用組成物實質上不含穩定劑。本發明中所提及的緩衝劑或等滲劑不符合作為穩定劑的資格。

「實質上不含」穩定劑是指穩定劑的含量少於0.1%(w/v)、少於0.05%(w/v)、少於0.03%(w/v)、少於0.02%(w/v)、少於0.01%(w/v)、少於0.005%(w/v)、或少於0.001%(w/v)。最佳地，這意味著其不含任何穩定劑。

眼用組成物之滲透濃度可在260 mOsm/kg至320 mOsm/kg的範圍內。

本發明之眼用組成物除天凡諾賽普特以外還可包含等滲劑作為活性成分和緩衝系統。等滲劑可用於調節根據本發明之眼用組成物的滲透壓。根據本發明，可包括等滲劑以使本發明之眼用組成物的滲透濃度為260 mOsm/kg至320 mOsm/kg。滲透壓是藉由測量每單位水中溶解的顆粒數來確定的。在溶液中，由於溶質顆粒的數量與水(溶劑)的單位數量成比例地減少，低滲透壓溶液的濃度較低。當使用半透膜(只有溶劑分子可通過之膜)分離具有不同溶質濃度的溶液時，可能發生滲透，從而使溶劑分子通過該膜並在低濃度和高濃度之間相交，因此導致濃度平衡。驅動上述移動之壓力(pressure)稱為滲透壓，其係由溶質的「顆粒」數量所控制。此外，確定含有相同濃度的顆粒並施加相同滲透壓的溶液具有等滲透壓。若低滲透或高滲透壓溶液進入眼睛，眼睛可能會受到傷害。因此，需要用於眼用藥物的等滲壓力溶液。在本發明中，氯化鈉係用作等滲劑。關於本發明之眼用組成物，等滲劑的含量可在0.5%(w/v)至1%(w/v)之範圍內。此外，用於本發明之眼用組成物的等滲劑之濃度可在100 mM至150 mM之範圍內。

根據本發明之一實施例，本發明之眼用組成物可包括天凡諾賽普特、pH 5.5至pH 6.0緩衝系統、等滲劑和水。在一實例中，本發明之眼用組成物可包括天凡諾賽普特、pH 5.5至pH 6.0的含有檸檬酸鹽緩衝液之緩衝系統、氯化鈉和水。

根據本發明之含有天凡諾賽普特之眼用組成物在加速或壓力(stress)條件下可為非常穩定。

根據本發明之含有天凡諾賽普特之眼用組成物在加速條件下儲存6個月後可含20%或更少量的電荷變體。

根據本發明之含有天凡諾賽普特之眼用組成物在加速條件下儲存6個月後可含10%或更少量的鹼性變體。

根據本發明之含有天凡諾賽普特之眼用組成物在加速條件下儲存6個月後可含10%或更少量的酸性變體。

根據本發明之含有天凡諾賽普特之眼用組成物在長期儲存條件下儲存36個月後可含20%或更少量的電荷變體。

根據本發明之含有天凡諾賽普特之眼用組成物在長期儲存條件下儲存36個月後可含10%或更少量的鹼性變體。

根據本發明之含有天凡諾賽普特之眼用組成物在長期儲存條件下儲存36個月後可含10%或更少量的酸性變體。

此外，本發明可提供一種用於治療乾眼症之方法，其包括對患有中度至重度乾眼的患者投予包含天凡諾賽普特作為活性成分之眼用組成物。

以天凡諾賽普特作為活性成分之眼用組成物係實質上與上述實施例相同，適於眼用組成物投予的患者亦與上述相同。

根據本發明之眼用藥物組成物可改善天凡諾賽普特的理化穩定性和生物穩定性，且可透過任何典型之投予方法諸如眼用滴注投予患有TNF介導的眼部疾病諸如乾眼症之患者。 [發明效果]

根據本發明，作為針對乾眼症之臨床試驗的結果，含有天凡諾賽普特之眼用組成物在中央角膜染色評分(CCSS)和總體角膜染色評分(TCSS)之改善方面顯示優異的效果，這在臨床上很重要。此外，在患有中度至重度乾眼的患者中，中央角膜染色評分(CCSS)和總體角膜染色評分(TCSS)之這種改善更為顯著。另外，具有較高眼部不適評分或較高眼睛乾燥度評分(其係主觀症狀)之患者亦顯示更大的改善。即使使用相同劑量之天凡諾賽普特，該含有天凡諾賽普特之眼用組成物在具有更嚴重或嚴峻之徵象或症狀的患者中顯示更優越的功效。此結果為出乎意料且在對中度或重度乾眼症無療法的現有條件下是有意義的，因為可提供新穎及替代療法方案。

[發明之較佳實施例詳細說明]

參照以下製備實例、說明性實例和實驗實例，將闡明本發明之優點和特徵以及實現本發明之方法。然而，提供這些實例僅是為了促進對本發明之理解而不能解釋為對本發明之限制。

[A 部分 ] 含有天凡諾賽普特之眼用組成物

實驗實例 1 ：天凡諾賽普特電荷變體之測定

電荷變體之產生可能影響藥物活性、穩定性和安全性，因此，本案發明人首先分析了天凡諾賽普特之電荷變體。更具體地，將天凡諾賽普特在37℃下儲存4週後，實施等電聚焦(IEF)和IEX-HPLC分析。

等電聚焦方法

以每孔10 μg填入pH 3.0至pH 7.0的凝膠中，然後在100V下進行電泳1小時，在200V下1小時，接著在500V下30分鐘。將產物用12%三氯乙酸固定30分鐘，接著用考馬斯亮藍(Coomassie blue)染色。

IEX-HPLC(離子交換-高效液相色層分析)

離子交換-高效液相色層分析(IEX-HPLC)係用於基於對柱中固定相的親和力而使用離子交換劑分離蛋白質，其係與蛋白質之淨電荷有關。使用陽離子交換柱、溫度控制器(設置為25℃)、自動進樣器(設置為4℃)、在280 nm下驅動的UV檢測器和高效液相色層分析(HPLC)系統進行本發明實驗方法可維持0.7 mL/min之流速。

電荷變體之分離和純化

為了基於其性質分離和分析含有天凡諾賽普特之眼用組成物中存在的電荷變體，使用SP-HP柱和用於蛋白質分離的液相色層分析(FPLC)來根據鹽濃度分離和純化蛋白質。基於電荷變體性質，製備酸性變體樣品A、主峰樣品B和鹼性變體樣品C，然後分別進行IEF和IEX-HPLC分析。

圖1顯示天凡諾賽普特在37℃下儲存0至4週後之等電聚焦(IEF)結果。

從IEF的結果來看，如圖1A所示，顯然證實了隨著儲存時間的延長，低pI值的條帶變得更黑(或更厚)，顯示天凡諾賽普特的酸性變體之產生。

圖2顯示天凡諾賽普特在37℃下儲存0至4週後之IEX-HPLC分析結果。

此外，根據IEX-HPLC的結果，如圖2所示，亦證實，隨著儲存時間延長，酸性變體的量增加。

為了研究電荷變體的性質，對酸性變體樣品、主峰樣品和鹼性變體樣品透過使用SP-HP柱進行含電荷分離獲得IEF及IEX-HPLC分析。

圖3顯示電荷變體之IEF分析結果。此外，圖4顯示電荷變體之IEX-HPLC分析的結果。如圖3和4所示，層析圖結果表明僅分離出之酸性變體的樣品A在主峰樣品之前被洗滌。並且，從IEF結果可看出，樣品A的pI值低於主峰樣品。另外，層析圖結果亦表明鹼性變體樣品(即樣品B)係在主峰樣品之後被洗滌。此外，從IEF結果可看出，樣品B的pI值略高於主峰樣品。

實驗實例 2 ：眼用穩定劑之篩選

通常需要添加到蛋白質組成物中的穩定劑來穩定地儲存配方直到將該配方投予患者。事實上，使用穩定劑可顯著減少在儲存過程中可能產生的雜質諸如聚集體或電荷變體，從而在儲存過程中保持穩定配方。因此，選擇能夠穩定蛋白質組成物的主要成分從而製備穩定組成物之理想穩定劑是絕對重要的。為了進行穩定劑的壓力(stress)實驗(40℃，儲存4週)並選擇能夠穩定天凡諾賽普特作為本發明主要成分之穩定劑的期望類型，本案發明人首先進行了以下實驗。

1)天凡諾賽普特溶液樣品之製備

製備10 mg/mL天凡諾賽普特溶液於含有125 mM氯化鈉的20 mM檸檬酸鈉緩衝液。

2)檸檬酸磷酸鹽緩衝液pH 7.0之製備

將0.37 g的檸檬酸酐和2.58 g的磷酸氫二鈉添加到900 mL的超純水中，然後將其充分混合。使用37%鹽酸或40%氫氧化鈉在pH 7.0滴定後，添加超純水以製備1 L最終產品。

3)穩定劑篩選溶液之製備

將四(4)種類型的穩定劑(0.149 g甲硫胺酸、0.751 g甘胺酸、1.55 g組胺酸鹽酸鹽及6.84 g蔗糖)分別添加到100 mL在項目2)中所製備之緩衝液中，從而製備pH 7.0之四(4)種類型的穩定劑篩選組成物。

4)樣品的製備和評估

向3.5 kDa離心過濾器中加入10 mL在項目3)中所製備之用於篩選眼用穩定劑的溶液以及天凡諾賽普特後，將樣品在4℃及4000 rpm下離心，以項目3)中穩定劑篩選緩衝液代替項目1)中天凡諾賽普特緩衝液。重複上述步驟以產生含有1 mg/mL天凡諾賽普特的穩定劑篩選溶液(樣品)。將得到的樣品在40℃下儲存4週，然後透過IEX-HPLC分別在0週和4週進行分析，以分析在每個樣品中鑑定出的理化雜質。

表2和圖5至7顯示沒有任何穩定劑之控制組及分別包括甲硫胺酸、甘胺酸、組胺酸鹽酸鹽和蔗糖作為穩定劑的穩定劑篩選組之IEX-HPLC分析結果。

因此，如表2及圖5至7所示，證實了包含蔗糖和組胺酸鹽酸鹽顯示出鹼性變體和酸性變體產生減少的趨勢。具體地，在組胺酸鹽酸鹽的情況下，可以看出與控制組或其他穩定劑相比，酸性變體的產生顯著減少。

實驗實例 3 ：不同 pH 之眼用組成物之製備及其穩定性評估

由於眼淚的pH為7.0至7.5，最佳為將眼用組成物設定相似的pH條件。然而，pH亦可能極大地影響蛋白質穩定性。因此，旨在製備具有不同pH值之眼用組成物並評估其穩定性。

(1)眼用組成物之製備

1)製備pH 5.0至pH 7.0之20 mM檸檬酸磷酸鹽緩衝液

將檸檬酸酐和磷酸氫二鈉添加到400 mL超純水中以達到所欲pH(在pH 5.0/5.5緩衝液的情況下：0.62 g檸檬酸酐和0.97 g磷酸氫二鈉；在pH 6.0/6.5緩衝液的情況下：0.43 g檸檬酸酐和1.11g磷酸氫二鈉；在pH 7.0緩衝液的情況下：0.19克檸檬酸酐和1.29克磷酸氫二鈉)。此外，為了達到不同條件，使用37%鹽酸或40%氫氧化鈉滴定至pH 5.0至pH 7.0後，添加超純水以製備500 mL的最終產物。

2)添加穩定劑之眼用組成物之製備(pH 5.0至pH 7.0)

對100 mL項目1)中所製備的pH 5.0至pH 7.0之五種(5)緩衝液中各添加6.85 g蔗糖及1.55 g組胺酸，從而製備五種(5)類型之pH 5.0至pH 7.0之20 mM檸檬酸磷酸鹽緩衝液，其各含200 mM蔗糖，以及五種(5)類型之pH 5.0至pH 7.0之20 mM檸檬酸磷酸鹽緩衝液，其各含100 mM組胺酸。作為無穩定劑的實驗組，將如上所述項目1)中所製備的pH 5.0至pH 7.0之五種(5)20 mM檸檬酸磷酸鹽緩衝液直接用作無穩定劑的實驗組。因此，製備了總共15種類型之具有/不具穩定劑之pH 5.0至pH 7.0的緩衝液。

3)樣品的製備和評估

在添加4 mL項目2)中所製備的各緩衝液以及天凡諾賽普特後，使用3.5 kDa離心過濾器對樣品進行離心，然後以含有穩定劑之pH 5.0至pH 7.0的緩衝液替換現有的天凡諾賽普特緩衝液。重複上述步驟以得到15種類型之含有不同穩定劑及具有不同pH值的樣品。所製備之樣品在40℃下儲存4週，接著在0週及4週分析，以分析各樣品中鑑定出的理化雜質。

(2)天凡諾賽普特對pH和穩定劑之穩定性評估

1)反相色層分析

RP-HPLC(反相色層分析)是一種基於蛋白質極性評估純度的方法。本實驗方法係使用反相色層分析柱、溫度控制器(設置為60℃)、自動進樣器(設置為4℃)、在214 nm下驅動的UV檢測器和高效液相色層分析(HPLC)系統所進行，其可維持1.0 mL/min的流速。

將所製備的15種類型之樣品在壓力(stress)條件(40℃下儲存)儲存4週，接著在0週和4週分析，以分析在各樣品中鑑定出的變體之生成變化。因此，如表4和圖8所示，從結果證實與無穩定劑的實驗組相比，在pH 7.0下包括蔗糖或組胺酸作為穩定劑的實驗組展現較低的變體生成率。然而，在包括組胺酸作為穩定劑的實驗組的情況下，證實了在pH 5.0至pH 6.5之變體的生成率高於控制組。此外，在包括蔗糖作為穩定劑的實驗組中，證實了在pH 5.0至pH 6.0之變體的生成率高於控制組。

2)離子交換高效液相色層分析(IEX-HPLC)分析

由於蛋白質的淨電荷，基於與柱之固定相的親和力，IEX-HPLC係用於透過離子交換劑分離蛋白質。使用陽離子交換柱、溫度控制器(設置為25℃)、自動進樣器(設置為4℃)、在280 nm下驅動的UV檢測器和高效液相色層分析(HPLC)系統進行本發明實驗方法可維持0.7 mL/min之流速。

將所製備的15種類型之樣品在壓力(stress)條件(40℃下儲存)儲存4週，接著在0週和4週分析，然後比較各樣品中鑑定出的酸性/鹼性變體之生成變化。

因此，如表5和圖9至11所示，就酸性變體的生成而言，pH 5.0至pH 6.5的無穩定劑組比含蔗糖或組胺酸之實驗組展現更好的結果。具體而言，在pH 5.0至pH 6.0之無穩定劑組顯示酸性變體之生成變化少於10%。對於鹼性變體，在pH 5.0至pH 6.0之無穩定劑組顯示比含蔗糖或組胺酸之實驗組更好的結果。在pH 6.5至pH 7.0時，含蔗糖之實驗組顯示鹼性變體的生成變化最小，而含組胺酸之實驗組與無穩定劑組之間無顯著差異。

分析上述測量值的結果，相較無穩定劑組，在pH 7.0含蔗糖或組胺酸之實驗組顯示較少的變體生成趨勢。相反地，當將pH值降低至pH 5.5或pH 6.0時，可看出與無穩定劑組相比，含蔗糖或組胺酸之實驗組中變體的生成趨於顯著增加。

結合實驗結果，可確定的是，與預期相反，在pH 5.5至pH 6.0下不含任何穩定劑之含有天凡諾賽普特之眼用組成物的實驗組，即，無穩定劑組展現最少的變體生成。

通常，眼用組成物可設定為pH 7.0，其與體內pH相似。然而，活性成分在眼用組成物中之穩定性是表達醫學功效的要點，因此得出的結論是，較佳為將本發明之含有天凡諾賽普特之眼用組成物設定為pH 5.5至pH 6.0而不含蔗糖或組胺酸。

實驗實例 4 ：評估緩衝系統之穩定性

為了比較緩衝液之構成組成及兩種功能性賦形劑添加/未添加的差異，同時固定了天凡諾賽普特之濃度、pH、氯化鈉之濃度、滲透壓等，製備了四種(4)實驗組並分別在4℃、25℃和40℃下篩選，以選擇最終配方。考慮到上述實驗結果，眼用組成物之pH被固定為pH 5.5。此外，作為通常可在上述範圍內使用之普通緩衝液，使用醋酸鈉(20 mM)和檸檬酸鈉(20 mM)相對於緩衝系統來評估天凡諾賽普特。

如下表6所示，製備了四種(4)類型含有天凡諾賽普特之眼用組成物並用於進行天凡諾賽普特之穩定性實驗。

經由SEC-HPLC分析聚集體並分析電荷變體，對含有天凡諾賽普特之眼用組成物進行穩定性實驗。穩定性實驗在4℃、25℃和40℃下進行了共2個月。在0週、2週、1個月和2個月時，進行透過SEC-HPLC的聚集體分析及透過IEX-HPLC的電荷變體分析。

(1)透過SEC-HPLC之聚集體分析

粒徑篩析高效液相色層分析(SEC-HPLC)通常用於藉由將固定相樣品引入填充有多孔凝膠的柱中，根據尺寸差異分離蛋白質。使用粒徑篩析柱、溫度控制器(設置為25℃)、自動進樣器(設置為4℃)、在214 nm下驅動的UV檢測器和高效液相色層分析(HPLC)系統進行本發明實驗方法可維持0.5 mL/min之流速。

表7至9、以及圖12至14顯示在將上述四種(4)類型含有天凡諾賽普特之眼用組成物儲存在4℃、25℃和40℃時進行SEC-HPLC分析的結果。從SEC-HPLC分析結果可看出溫度越高，聚集體的濃度越高。具體而言，在包括緩衝液之配方的情況下，聚集體迅速產生。在以檸檬酸鹽緩衝液製備的三種(3)類型配方中，FFS3在4℃下儲存2個月後測得具有高含量之聚集體。此外，不含任何賦形劑之FFS2在包括25℃、40℃、2週、1個月和2個月之所有條件下均顯示最穩定的結果。

(2)透過IEX-HPLC分析酸性變體

表10至12、以及圖15至17顯示在將上述四種(4)類型含有天凡諾賽普特之眼用組成物儲存在4℃、25℃和40℃時進行IEX-HPLC分析酸性變體的結果。

(3)透過IEX-HPLC分析鹼性變體

表13至15、以及圖18至20顯示在將上述四種(4)類型含有天凡諾賽普特之眼用組成物儲存在4℃、25℃和40℃時進行IEX-HPLC分析鹼性變體的結果。

從IEX-HPLC分析可看出所有配方在40℃的高溫儲存條件下顯示酸性和鹼性變體增加的趨勢，特別是，醋酸鹽緩衝液(FFS1)配方展現在所有溫度下鹼性變體顯著增加之模式。

因此，在產生聚集體和鹼性變體之方面，證實了醋酸鹽緩衝液(FFS1)之穩定性比檸檬酸鹽緩衝液(FFS2至4)更差。此外，基於檸檬酸鹽緩衝液之構成組成，在將添加功能性賦形劑組與沒有功能性賦形劑組進行比較時，證明沒有功能性賦形劑組是最穩定的。因此，整體上考慮簡化產品製造過程、製造過程中的污染和均勻性的情況下，採用檸檬酸鹽緩衝液(FFS2)的配方作為最終配方。然而，考慮到眼淚之生理pH為中性，選擇患者順應性可能會稍微更高的pH 6.0及可接受的穩定性程度作為最終產品之pH。

製備實例 1 ：含有天凡諾賽普特之眼用組成物之生產

對900 ml超純水中加入5.35 g檸檬酸三鈉二水合物、0.35 g檸檬酸酐和7.3 g氯化鈉並使其完全溶解，從而製備緩衝液。在確認緩衝液之pH為pH 6.0±0.1之後，使用量筒將緩衝液之量調整至最終溶液體積為1 L，接著透過0.22 μm瓶頂過濾器系統過濾。

然後，將天凡諾賽普特添加到所製備之緩衝液中以產生含0.25%天凡諾賽普特之眼藥水組成物。

實驗實例 5 ：含有天凡諾賽普特之眼用組成物之穩定性評估

對根據製備實例1的含有天凡諾賽普特之眼用組成物進行穩定性評估。

長期存儲條件設置為5℃(濕度未調整)，而加速條件設置為25℃/60%RH。在這些條件下儲存製備實例1中之組成物，接著透過SEC-HPLC進行聚集體分析並透過IEX-HPLC進行電荷變體分析。

表17及圖21顯示透過SEC-HPLC之聚集體分析的結果。如表17及圖21所示，當組成物在5℃長期儲存條件下儲存3年，由於5%以內形成聚集體因而確認了製備實例1之組成物是穩定的。此外，將組成物於加速條件下在25℃/60%RH儲存6個月時，顯示5%以內產生聚集體。

表18及圖22至23顯示透過IEX-HPLC之電荷變體分析的結果。如表18及圖22至23所示，當組成物在5℃長期儲存條件下儲存3年，由於5%以內形成電荷變體因而確認了製備實例1之組成物是穩定的。此外，鹼性變體亦為10%以內形成，從而證明儲存期間之穩定性。

另外，將組成物於加速條件下在25℃/60%RH儲存6個月時，顯示10%以內形成酸性變體。此外，10%以內形成鹼性變體，從而證明儲存期間之穩定性。

[B 部分 ] 含有天凡諾賽普特之眼用組成物之臨床試驗

為了評估相對於安慰劑的含有天凡諾賽普特之眼用組成物之安全性和有效性，進行了以下臨床試驗。

臨床試驗程序

對於受試者，即患有乾眼症之患者，進行了第3期、多中心、隨機、雙盲及安慰劑對照的臨床試驗。每天兩次對637名患者投予眼藥水8週後，評估下角膜染色評分(以下簡稱為「ICSS」)及眼部不適評分(以下簡稱為「ODS」)作為主要療效指標(endpoint)，以及中央角膜染色評分(以下簡稱為「CCSS」)、總體角膜染色評分(以下簡稱為「TCSS」)及眼睛乾燥度評分(以下簡稱為「EDS」)作為次要療效指標。

1. 臨床試驗時間表

臨床試驗按圖24所示之順序進行。在10週的臨床試驗期間(包括2週篩選過程，然後是8週給藥期間)，受試者共去了6個臨床試驗站點。第一次篩選是在第一次就診(visit)時進行的，第二次篩選是在第二次就診時進行的。通過兩個篩選過程之受試者係透過以下給藥方法進行給藥。

2. 篩選方法

總共12個臨床試驗站點中，對總共1109名受試者進行篩選。其中，在篩選期間排除了472名受試者，而剩下637名受試者接受了給藥。在篩選期間，將受試者兩次暴露於受控不利環境(CAE®)室中90分鐘(就診1，就診2)。受試者的選擇標準如下。

就診1的篩選標準：

1)有至少6個月的乾眼病史，

2)在6個月內有使用或希望使用眼藥水治療乾眼症的病史，

3)最佳矯正視力為0.7 logMAR或更高。

就診1和就診2的篩選標準：

1)根據Ora Calibra®眼部不適和4症狀問卷調查，得分為2分或更高，

2)席爾默氏試驗評分為1 mm至10 mm，

3)至少一個區域的角膜染色評分(CSS)為2或更高，

4)結膜發紅評分為1或更高，

5)CAE暴露後ICSS(下角膜染色評分)至少增加1分或更多。此外，在90分鐘的CAE暴露期間每隔5分鐘測量一次ODS，但3分或更高在CAE暴露的兩個或多個連續時間點必須報告。

同一眼睛滿足2)至5)的所有條件。

在就診2時，將最終合格受試者盲法隨機分為試驗藥物(天凡諾賽普特)或安慰劑組。

3. 患者組別

通過篩選過程的637名受試者參加了臨床試驗。他們被隨機分配到雙盲中接受臨床研究治療。318名受試者被投予含有天凡諾賽普特之眼用液劑(0.25%)，而319名受試者接受了安慰劑眼用液劑。下表19中顯示臨床試驗受試者之人口統計資訊。

4. 試驗藥物和安慰劑

作為試驗藥物，使用在製備實例1中所製備的含有天凡諾賽普特之眼用組成物(0.25%)。本文使用的安慰劑係以與試驗藥物相同組成所製備，除了其不包括天凡諾賽普特。

5. 投予及評估

[表20]

組別	研究產品	天凡諾賽普特 之濃度	給藥
試驗藥物	含有天凡諾賽普特之 眼用組成物	0.25%	雙眼滴眼藥水，每天兩次，8週(57 ± 3 天)
安慰劑	安慰劑眼用組成物	0%

如表20所示，每位受試者自行施用試驗藥物或安慰劑，從第二就診日起算為第一天投予，在8週內每天兩次(BID)，並完成每日症狀評估。受試者在開始投予後的第1天(就診2)、第8天(就診3)、第15天(就診4)、第29天(就診5)和第57天(就診6)去了臨床試驗站點。對這些受試者之徵象和症狀進行評估。在開始投予後第15天(就診4)、第29天(就診5)和第57天(就診6)，將受試者暴露於CAE®室中，且分別在暴露之前、期間和之後進行乾眼徵象和症狀之評估。就這點而言，僅在開始投予後第8天(就診3)在沒有暴露於CAE®室的情況下評估徵象和症狀。

6. 客觀徵象評估指標

作為乾眼症之客觀徵象評估指標，係使用角膜染色評分(CSS)評估。CSS評估是一種將染劑滴入眼睛後接著對損傷程度評分的方法，用於觀察角膜損傷。

在本臨床試驗中，使用Ora Calibra ^®角膜染色評分量表。圖25示意性示出用於評估角膜染色評分之方法。如圖25所示，將角膜分為中央區域(黑色)、上部區域(或上區域；亮灰色)和下部區域(下區域：深灰色)並將這些部分的染色程度評估為0至4分的範圍內，相對於表21中顯示的標準，以0.5分為增量(分數越高，角膜損傷越嚴重)。評估結果分為中央部分的CCSS、上部分的SCSS和下部分的ICSS，並將這些值相加並表示為TCSS。

[表21]Ora Calibra ^®角膜染色評分量表

0	無	無染色
1	微量	偶見
2	輕度	可數
3	中度	不可數，但不融合
4	嚴重	融合

7. 主觀症狀評估指標

乾眼症之症狀評估指標是受試者透過質詢主觀感覺到的疾病症狀之改善，且可透過ODS、EDS、和其他類型的調查表來評估。

7-1. 眼部不適評分 (ODS)

在本臨床試驗中，ODS是透過Ora Calibra ^®ODS來評估的。

相對於下表22中所示的標準，受試者分別主觀感覺到之眼部不適程度在0至4分的範圍內評分(分數越高，眼部不適越多)。

[表22]Ora Calibra® 眼部不適評分量表

0	無不適
1	間歇性覺察
2	持續覺察
3	間歇性不適
4	持續不適

7-2. 眼睛乾燥度評分 (EDS)

EDS是受試者在視覺模擬量表(VAS)上對眼睛乾燥度評分之評估。受試者對EDS評分的範圍為0到100之數。0表示「沒有乾燥感」而100表示「最大乾燥感」。

8. 席爾默氏淚液試驗

本文所用之另一種用於乾眼症之評估方法為席爾默氏淚液試驗。席爾默氏淚液試驗(STT)是一種方法，其中將STT試紙條放在患者每隻眼睛的下眼瞼邊緣，然後閉上眼睛5分鐘，接著將STT試紙條移除，並測量及記錄濕部之長度(mm)。

臨床試驗結果

1. 基線評估

如上述臨床試驗程序中所述，在開始受試者的臨床試驗後第1天，將暴露於CAE®室前評估的客觀徵象(諸如CSS)和主觀症狀(諸如EDS和ODS)用作基線。對於318名接受試驗藥物的受試者和319名接受安慰劑的患者，以下表23列出四種(4)類型之CSS(ICSS、CCSS、SCSS、TCSS)以及EDS和ODS的基線評分。

2. CSS 評估結果

在完成臨床藥物給藥8週後，對於隨機分配之受試者(治療意向(ITT)群體)，研究了CSS自基線的平均變化作為客觀徵象。圖26示出在投予結束時(8週)下、上及中央角膜區域的角膜染色評分(CSS)的變化，以及上述CSS值的總和，即相對於治療意向群體(ITT群體，僅觀察到的數據)之基線的總CSS。

如圖26所示，就中央區域(CCSS，p=0.024)及總角膜(TCSS，p=0.045)而言，相對於安慰劑，有試驗藥物給藥的受試者在8週時展現明顯改善之角膜損傷結果。

表24及圖27至28展示8週內CCSS和TCSS之變化以及所有受試者之統計分析結果。

3. ODS 和 EDS 評估結果

在完成8週的研究產品投予後，研究ODS和EDS自基線的平均變化(作為主觀症狀)。

表25顯示從就診1起1個月內有/無使用人工淚液經歷之受試者以及所有受試者自基線到第8週EDS的平均變化。此外，圖29示出在上述受試者中，從第8週的就診1起1個月內有使用人工淚液經歷之受試者自EDS的基線的平均變化。

如表25和圖29所示，對於隨機分配的受試者(ITT群體，僅觀察到的數據)，相對於安慰劑，試驗藥物對EDS(乾眼症之主觀指標)沒有展現明顯之改善。然而，可以確定的是對症狀相對敏感的患者組，自就診1(-14天)起30天內須使用人工淚液者，展現顯著效果(p=0.0334)。

在第2週和第4週，所有受試者的ODS展現改善。

在患者主觀症狀的調查表中，ITT群體中未確認ODS的顯著差異(其為主要療效指標)。然而，對自就診1起1個月內有過使用人工淚液經歷的症狀相對敏感之患者進行亞組分析，則可以確認EDS的顯著差異。

4. 亞組患者組之臨床試驗結果

參加臨床試驗之患者根據基線嚴重性(即臨床試驗開始時的疾病嚴重性)分為亞組，然後分析徵象和症狀相關指標。

表26和圖30總結了在第8週相對於疾病嚴重性，CCSS自基線的平均變化。

如表26和圖30所示，證實了在基線疾病嚴重性較高的患者組中，與安慰劑相比，試驗藥物的功效有更清楚的證明。

參加臨床試驗之所有受試者的分析結果表明從給藥後1週開始，試驗藥物和安慰劑之間開始出現CCSS之差異，且持續到8週(p=0.0239，雙樣本t-檢定)。

在所有患者中，僅對基線TCSS為5或更高的嚴重角膜損傷患者進行分析。從分析結果來看，相對於安慰劑而言，確認其CCSS改善有顯著性(p=0.0031)。

此外，僅分析在給藥開始時中央角膜部分有損傷之患者，即基線CCSS為2分或更高者。從分析結果確認有顯著性(p=0.0001)。

此外，僅分析基線席爾默氏淚液試驗評分在1至7(即，淚液分泌相對較少)範圍內之患者。從分析結果中亦確認有顯著性(p=0.0008)。

因此，關於徵象，可理解的是在基線嚴重性高的患者組中，與安慰劑相比，試驗藥物的療效更明顯。同樣地，在症狀基線嚴重性較高的患者組或徵象及症狀基線評分組合較高嚴重性的患者組中亦觀察到類似結果。

此外，作為對全部患者的分析結果，試驗藥物在總體角膜染色評分(TCSS)、三個角膜區域CCSS、ICSS和SCSS之總和(p=0.0452，ANCOVA)方面相對於安慰劑顯示明顯的改善。可看出在總患者中有較高基線疾病嚴重性之患者組的分析中，更清楚證明試驗藥物在TCSS方面的治療效果。

下表27和圖31顯示自基線到第8週按基線疾病嚴重性分層的TCSS平均變化。

在全部受試者中，僅分析基線TCSS為5或更高(即嚴重角膜損傷)的患者。從分析結果來看，相對於安慰劑，在給藥8週後TCSS改善方面有顯著性(p=0.0109)。

此外，僅分析在給藥開始時中央角膜區域有損傷的患者，即基線CCSS為2或更高者。從分析結果確認有顯著性(p=0.0019)。

此外，僅分析基線STT在1至7範圍內，即，淚液分泌相對較少的患者。從分析結果亦確認有顯著性(p=0.0025)。

此外，同樣地，在症狀基線嚴重性較高的患者組或徵象及症狀基線組合嚴重性較高的患者組中亦觀察到類似結果。在雙樣本t-檢定統計分析結果中亦證實這些結果係基本上相同。

[圖1]顯示天凡諾賽普特在37℃下儲存0至4週後之等電聚焦(isoelectric focusing, IEF)結果。

[圖2]顯示天凡諾賽普特在37℃下儲存0至4週後之IEX-HPLC分析結果。

[圖3]顯示電荷變體之IEF分析結果。

[圖4]顯示電荷變體之IEX-HPLC分析結果。

[圖5]顯示沒有任何穩定劑的對照組及分別含有甲硫胺酸、甘胺酸、組胺酸鹽酸鹽和蔗糖作為穩定劑之穩定劑篩選溶液組的IEX-HPLC主峰之變化。

[圖6]顯示沒有任何穩定劑的對照組及分別含有甲硫胺酸、甘胺酸、組胺酸鹽酸鹽和蔗糖作為穩定劑之穩定劑篩選溶液組的IEX-HPLC酸性變體之變化。

[圖7]顯示沒有任何穩定劑的對照組及分別含有甲硫胺酸、甘胺酸、組胺酸鹽酸鹽和蔗糖作為穩定劑之穩定劑篩選溶液組的IEX-HPLC鹼性變體之變化。

[圖8]顯示在40℃下儲存4週後，根據RP-HPLC變體之變化，針對不同pH和不同穩定劑，分析含有天凡諾賽普特之眼用組成物之穩定性的結果。

[圖9]顯示在40℃下儲存4週後，根據IEX-HPLC主峰之變化，針對不同pH和不同穩定劑，含有天凡諾賽普特之眼用組成物之穩定性。

[圖10]顯示在40℃下儲存4週後，根據IEX-HPLC酸性變體之變化，針對不同pH和不同穩定劑，含有天凡諾賽普特之眼用組成物之穩定性。

[圖11]顯示在40℃下儲存4週後，根據IEX-HPLC鹼性變體之變化，針對不同pH和不同穩定劑，含有天凡諾賽普特之眼用組成物之穩定性。

[圖12至14]顯示分別在4℃、25℃和40℃下儲存期間對四(4)種類型的含有天凡諾賽普特之眼用組成物之SEC-HPLC分析結果。

[圖15至17]顯示分別在4℃、25℃和40℃下儲存期間透過IEX-HPLC對4種類型的含有天凡諾賽普特之眼用組成物之酸性變體測定結果。

[圖18至20]顯示分別在4℃、25℃和40℃下儲存期間透過IEX-HPLC對4種類型的含有天凡諾賽普特之眼用組成物之鹼性電荷變體測定結果。

[圖21]顯示基於透過SEC-HPLC之聚集測定的含有天凡諾賽普特之眼用組成物之穩定性。

[圖22至23]顯示基於透過IEX-HPLC之電荷變體測定的含有天凡諾賽普特之眼用組成物之穩定性。

[圖24]示意性顯示關於用於患有乾眼症之患者作為待測受試者的本發明之含有天凡諾賽普特之眼用組成物的臨床試驗時間表。

[圖25]示意性顯示用於評估角膜染色評分之方法。

[圖26]顯示投予結束時(8週)下、上及中央角膜區域之角膜染色評分(CSS)的變化，以及上述CSS值的總和，即總體CSS，其係相對於治療意向群體(ITT群體)之基線。

[圖27]顯示8週總受試者之CCSS的平均變化。

[圖28]顯示8週總受試者之TCSS的平均變化。

[圖29]顯示從8週第一次就診起1個月內有使用人工淚液經歷之受試者的EDS自基線的平均變化。

[圖30]顯示在8週時相對於疾病嚴重性自CCSS的基線之平均變化。

[圖31]顯示在8週時相對於疾病嚴重性自TCSS的基線之平均變化。

Claims (34)

1. 一種眼用組成物，其包含天凡諾賽普特(tanfanercept)作為活性成分，用於治療有中度至重度乾眼之患者的乾眼症。
2. 如請求項1之組成物，其中該患者在下角膜、中央角膜和上角膜之至少一個區域的角膜染色評分為2或更高且席爾默氏(Schirmer’s)淚液試驗評分為1至7。
3. 如請求項1之組成物，其中在投予該眼用組成物後8週內開始出現該中度至重度乾眼之徵象(sign)的改善。
4. 如請求項3之組成物，其中該徵象的改善係基於總體角膜染色評分(TCSS)和中央角膜染色評分(CCSS)之降低來確定。
5. 如請求項1之組成物，其中在投予該眼用組成物後8週內開始出現該中度至重度乾眼之症狀(symptom)的改善。
6. 如請求項5之組成物，其中該症狀的改善係基於眼睛乾燥度評分(EDS)之降低來確定。
7. 如請求項1之組成物，其中在投予該眼用組成物前，該患者的CCSS為2或更高。
8. 如請求項1之組成物，其中在投予該眼用組成物前，該患者的TCSS為5或更高。
9. 如請求項1之組成物，其中在投予該眼用組成物前，該患者的席爾默氏淚液試驗(STT)評分為1至7。
10. 如請求項1之組成物，其中在投予該眼用組成物前，該患者的STT評分為1至3。
11. 如請求項1之組成物，其中在投予該眼用組成物前，該患者的眼部不適評分(ODS)為3或更高。
12. 如請求項1之組成物，其中在投予該眼用組成物前，該患者的TCSS為5或更高且ODS為3或更高。
13. 如請求項1之組成物，其中在投予該眼用組成物前，該患者的TCSS為4或更高且EDS為40或更高。
14. 如請求項1之組成物，其中該眼用組成物係以眼藥水之形式一天一或多次投予。
15. 如請求項1之組成物，其中該眼用組成物係以眼藥水之形式一天兩次投予。
16. 如請求項1之組成物，其中該眼用組成物包含天凡諾賽普特及pH 5.0至pH 6.5之緩衝系統，且該眼用組成物係實質上不含穩定劑。
17. 如請求項1之組成物，其中該眼用組成物包含0.01至1%(w/v)之天凡諾賽普特。
18. 一種治療乾眼症之方法，包含對有中度至重度乾眼之患者投予眼用組成物，該組成物包含天凡諾賽普特作為活性成分。
19. 如請求項18之方法，其中該患者在下角膜、中央角膜和上角膜之至少一個區域的角膜染色評分為2或更高且席爾默氏淚液試驗評分為1至7。
20. 如請求項18之方法，其中在投予該眼用組成物後8週內開始出現該中度至重度乾眼之徵象的改善。
21. 如請求項20之方法，其中該徵象的改善係基於總體角膜染色評分(TCSS)和中央角膜染色評分(CCSS)之降低來確定。
22. 如請求項18之方法，其中在投予該眼用組成物後8週內開始出現該中度至重度乾眼之症狀的改善。
23. 如請求項22之方法，其中該症狀的改善係基於眼睛乾燥度評分(EDS)之降低來確定。
24. 如請求項18之方法，其中在投予該眼用組成物前，該患者的CCSS為2或更高。
25. 如請求項18之方法，其中在投予該眼用組成物前，該患者的TCSS為5或更高。
26. 如請求項18之方法，其中在投予該眼用組成物前，該患者的席爾默氏淚液試驗(STT)評分為1至7。
27. 如請求項18之方法，其中在投予該眼用組成物前，該患者的STT評分為1至7。
28. 如請求項18之方法，其中在投予該眼用組成物前，該患者的眼部不適評分(ODS)為3或更高。
29. 如請求項18之方法，其中在投予該眼用組成物前，該患者的TCSS為5或更高且ODS為3或更高。
30. 如請求項18之方法，其中在投予該眼用組成物前，該患者的TCSS為4或更高且EDS為40或更高。
31. 如請求項18之方法，其中該眼用組成物係以眼藥水之形式一天一或多次投予。
32. 如請求項18之方法，其中該眼用組成物係以眼藥水之形式一天兩次投予。
33. 如請求項18之方法，其中該眼用組成物包含天凡諾賽普特及pH 5.0至pH 6.5之緩衝系統，且該眼用組成物係實質上不含穩定劑。
34. 如請求項18之方法，其中該眼用組成物包含0.01至1%(w/v)之天凡諾賽普特。

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