CN116867506A - 包括弗里德赖希共济失调蛋白融合蛋白的药物组合物及其使用方法 - Google Patents
包括弗里德赖希共济失调蛋白融合蛋白的药物组合物及其使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
公开了包括TAT‑FXN融合多肽的药物组合物，以及使用该药物组合物治疗被诊断为弗里德赖希共济失调和/或肥厚性心肌病的受试者的方法。
Description
相关申请
本申请要求2020年12月12日提交的美国临时申请第63/124,801号的优先权，该申请的全部内容特此通过引用并入本文。
序列表
本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且特此通过引用整体并入本文。在2021年12月10日创建的所述ASCII副本被命名为130197-01220_SL.txt，并且大小为8,312个字节。
背景技术
弗里德赖希共济失调(FRDA)是由编码弗里德赖希共济失调蛋白(FXN)的基因中的突变引起的罕见的遗传性进行性神经退行性病症。FXN是在全身细胞中发现的必需的和系统发生保守的蛋白，在心脏、脊髓、肝脏、胰腺和骨骼肌中的水平最高。FXN在细胞核中编码，在细胞质中表达并导入线粒体，在线粒体中被加工成成熟形式。在人类中，210个氨基酸的全长hFXN(hFXN1-210，23.1kDa)在氨基末端含有典型的线粒体靶向序列(MTS)，该序列在被导入线粒体基质时被线粒体基质加工肽酶(MPP)在2步裂解中进行加工。所得蛋白是130个氨基酸、14.2kDa的成熟hFXN蛋白(hFXN81-210)。
目前正在开发一种FXN融合蛋白作为FXN替代疗法，以恢复FXN在FRDA患者线粒体中的功能水平。该FXN融合蛋白具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列，并且包含与全长hFXN蛋白的N末端连接的HIV-TAT肽。FXN融合蛋白的作用机制依赖于HIV-TAT肽的细胞穿透能力以将FXN融合蛋白递送入细胞，并且随后在易位入线粒体后被加工成成熟hFXN。FXN融合蛋白在美国专利申请第16/942,276号中进行描述，该申请各自的全部内容特此通过引用并入本文。为了促进用于治疗用途的SEQ ID NO:1的FXN融合蛋白的开发，需要包含FXN融合蛋白的药物组合物。
发明内容
因此，在一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括融合多肽、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的载体，其中所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且所述融合多肽以大于约10mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
在一个实施例中，药物组合物稳定至少1个月。
在一个实施例中，药物组合物在选自由以下组成的群组的温度下稳定至少1个月：约-60℃或更低；约-25℃至约-15℃、约2℃至约8℃；和约20℃至约30℃。
在一个实施例中，所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，所述融合多肽包括SEQID NO:1的氨基酸序列。在一个实施例中，所述融合多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。
在一个实施例中，所述融合多肽以约15mg/mL至约50mg/mL、约20mg/mL至约75mg/mL或约25mg/mL至约100mg/mL的浓度存在于所述组合物中。在一个实施例中，所述融合多肽以大于约15mg/mL、大于约20mg/mL、大于约25mg/mL、大于约30mg/mL、大于约35mg/mL、大于约40mg/mL、大于约45mg/mL、大于约50mg/mL、大于约55mg/mL、大于约60mg/mL、大于约65mg/mL、大于约70mg/mL、大于约75mg/mL、大于约80mg/mL、大于约85mg/mL、大于约90mg/mL、大于约95mg/mL或大于约100mg/mL的浓度存在于所述药物组合物中。在一个实施例中，所述融合多肽以约15mg/mL或更大、约20mg/mL或更大、约25mg/mL或更大、约30mg/mL或更大、约35mg/mL或更大、约40mg/mL或更大、约45mg/mL或更大、约50mg/mL或更大、约55mg/mL或更大、约60mg/mL或更大、约65mg/mL或更大、约70mg/mL或更大、约75mg/mL或更大、约80mg/mL或更大、约85mg/mL或更大、约90mg/mL或更大、约95mg/mL或更大或约100mg/mL或更大的浓度存在于所述药物组合物中。
在一个实施例中，所述融合多肽以约25mg/mL至约150mg/mL的浓度存在于所述药物组合物中。在一个实施例中，所述融合多肽以约50mg/mL的浓度存在于所述药物组合物中。在一个实施例中，所述融合多肽以约100mg/mL的浓度存在于所述药物组合物中。
在一个实施例中，药学上可接受的赋形剂选自由盐、糖、氨基酸或其组合组成的群组。
在一个实施例中，药学上可接受的赋形剂是盐。在一个实施例中，盐选自由氯化钠(NaCl)和氯化钙(CaCl2)组成的群组。
在一个实施例中，药学上可接受的赋形剂是氨基酸。在一个实施例中，氨基酸选自由精氨酸和脯氨酸组成的群组。
在一个实施例中，药学上可接受的赋形剂是糖。在一个实施例中，糖选自由蔗糖和甘露糖醇组成的群组。在一个实施例中，糖是蔗糖。在一个实施例中，糖是甘露糖醇。在一个实施例中，糖以约1mM至约500mM的浓度存在于所述药物组合物中。在一个实施例中，糖以约1mM至约50mM、约25mM至约150mM、约100mM至约300mM、约200mM至约450mM或约250mM至约500mM的浓度存在于所述药物组合物中。在一个实施例中，糖以约250mM的浓度存在于所述药物组合物中。
在一个实施例中，药物组合物进一步包括缓冲液。在一个实施例中，所述缓冲液选自由乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、磷酸盐和Tris组成的群组。在一个实施例中，所述缓冲液选自由乙酸盐、组氨酸和Tris组成的群组。在一个实施例中，所述缓冲液是组氨酸。
在一个实施例中，所述缓冲液以约5mM至约500mM的浓度存在于所述药物组合物中。在一个实施例中，所述缓冲液以约5mM至约50mM、约25mM至约150mM、约50mM至约250mM或约100mM至约500mM的浓度存在于所述药物组合物中。在一个实施例中，所述缓冲液以约20mM的浓度存在于所述药物组合物中。在一个实施例中，药物组合物的pH为约4.0至约8.5。在一个实施例中，药物组合物的pH为约5.0至约7.0。在一个实施例中，药物组合物的pH为约5.8。
在一个实施例中，药物组合物进一步包括表面活性剂。在一个实施例中，所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。在一个实施例中，所述表面活性剂选自由聚氧乙烯二醇辛基酚醚(Triton-X 100)、聚氧乙烯二醇烷基酚醚(Nonoxynol-9)、聚氧乙烯二醇脱水山梨糖醇烷基酯(Polysorbate)、脱水山梨糖醇烷基酯(Span)和聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物(Poloxamer)组成的群组。在一个实施例中，所述表面活性剂是聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)。在一个实施例中，所述表面活性剂以约0.0001％w/v至约1％w/v的浓度存在于所述药物组合物中。在一个实施例中，所述表面活性剂以约0.0001％w/v至约0.1％w/v、约0.01％w/v至约0.5％w/v、约0.05％w/v至约1％w/v、约0.01％w/v至约0.1％w/v、约0.005％w/v至约0.5％w/v或约0.001％w/v至约1.0％w/v的浓度存在于所述药物组合物中。在一个实施例中，所述表面活性剂以约0.05％w/v的浓度存在于所述药物组合物中。
在一个实施例中，所述药学上可接受的载体是水。
在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括融合多肽、药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的载体、缓冲液和表面活性剂，其中所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且所述融合多肽以大于约10mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
在一个实施例中，所述药学上可接受的赋形剂是蔗糖。在一个实施例中，所述缓冲液是组氨酸。在一个实施例中，所述表面活性剂是聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)。在一个实施例中，所述药学上可接受的载体是水。
在又一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括融合多肽、蔗糖、组氨酸、聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中所述融合多肽包括与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且所述融合多肽以大于约10mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
在再一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括融合多肽、250mM蔗糖、20mM组氨酸、0.05％w/v聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且所述融合多肽以大于约10mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
在又一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括融合多肽、甘露糖醇、组氨酸、聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且所述融合多肽以大于约10mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括融合多肽、250mM甘露糖醇、20mM组氨酸、0.05％w/v聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且所述融合多肽以大于约10mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括融合多肽、250mM蔗糖、20mM组氨酸、0.05％w/v聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中所述融合多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；并且所述融合多肽以约50mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
在另一个方面，本公开提供了一种药物组合物，其包括融合多肽、250mM甘露糖醇、20mM组氨酸、0.05％w/v聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中所述融合多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；并且所述融合多肽以约50mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
在一个实施例中，所述药物组合物表现出稳定性。在一个实施例中，所述药物组合物呈冻干形式。在一个实施例中，所述药物组合物适用于注射。
在一些实施例中，药物组合物呈液体形式，并且在约-60℃或更低的温度下储存时稳定至少约1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约13个月、至少约14个月、至少约15个月、至少约16个月、至少约17个月、至少约18个月、至少约19个月、至少约20个月、至少约21个月、至少约22个月、至少约23个月或至少约24个月。
在一些实施例中，药物组合物呈液体形式，并且在约-25℃至约-15℃的温度下储存时稳定至少约1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约13个月、至少约14个月、至少约15个月、至少约16个月、至少约17个月、至少约18个月、至少约19个月、至少约20个月、至少约21个月、至少约22个月、至少约23个月或至少约24个月。
在一些实施例中，药物组合物呈冻干形式，并且在约2℃至约8℃的温度下储存时稳定至少约1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约13个月、至少约14个月、至少约15个月、至少约16个月、至少约17个月、至少约18个月、至少约19个月、至少约20个月、至少约21个月、至少约22个月、至少约23个月或至少约24个月。
在一些实施例中，药物组合物呈冻干形式，并且在约20℃至约30℃的温度下储存时稳定至少约1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约13个月、至少约14个月、至少约15个月、至少约16个月、至少约17个月或至少约18个月。
在一个实施例中，所述药物组合物适用于皮下注射。
在另一个方面，本发明提供了一种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用本公开的药物组合物，使得所述受试者的所述疾病得到治疗或预防。在一个实施例中，所述疾病是弗里德赖希共济失调(FRDA)。在一个实施例中，所述疾病是FRDA相关的疾病。
附图说明
图1是显示在266nm处Tagg制剂评级结果的柱状图。
图2是显示较大的聚集体SLS评级结果的柱状图。
本公开的序列
SEQ ID NO:1，TAT-FXN融合多肽的氨基酸序列(224AA)：MYGRKKRRQR RRGGMWTLGRRAVAGLLASP SPAQAQTLTR VPRPAELAPLCGRRGLRTDIDATCTPRRAS SNQRGLNQIW NVKKQSVYLMNLRKSGTLGHPGSLDETTYE RLAEETLDSL AEFFEDLADK PYTFEDYDVS FGSGVLTVKLGGDLGTYVINKQTPNKQIWL SSPSSGPKRY DWTGKNWVYS HDGVSLHELLAAELTKALKT KLDLSSLAYS GKDA。
SEQ ID NO:2，HIV-1转录细胞穿透肽反式激活因子(TAT-cpp)的完整氨基酸序列，在氨基末端添加有甲硫氨酸用于启动(12AA)：MYGRKKRRQRRR
SEQ ID NO:3，人弗里德赖希共济失调蛋白的线粒体靶向序列(hFXN-mts)的氨基酸序列(80AA)：MWTLGR RAVAGLLASP SPAQAQTLTR VPRPAELAPL CGRRGLRTDIDATCTPRRASSNQRGLNQIW NVKKQSVYLM NLRK
SEQ ID NO:4，完整人弗里德赖希共济失调蛋白(hFXN)的氨基酸序列(210AA)：MWTLGR RAVAGLLASP SPAQAQTLTR VPRPAELAPL CGRRGLRTDIDATCTPRRAS SNQRGLNQIWNVKKQSVYLM NLRKSGTLGH PGSLDETTYERLAEETLDSL AEFFEDLADK PYTFEDYDVS FGSGVLTVKLGGDLGTYVINKQTPNKQIWL SSPSSGPKRY DWTGKNWVYS HDGVSLHELL AAELTKALKTKLDLSSLAYSGKDA
SEQ ID NO:5，成熟人弗里德赖希共济失调蛋白的氨基酸序列(130AA)：SGTLGHPGSLDETTYE RLAEETLDSL AEFFEDLADK PYTFEDYDVS FGSGVLTVKLGGDLGTYVIN KQTPNKQIWLSSPSSGPKRY DWTGKNWVYS HDGVSLHELLAAELTKALKT KLDLSSLAYS GKDA
SEQ ID NO:6，编码SEQ ID NO:1的TAT-FXN融合多肽的核酸序列(cDNA)；针对在大肠杆菌(E.coli)中表达进行优化(684个碱基)：
CATATGTATGGTAGAAAGAAACGTCGTCAACGTCGTCGTGGTGGTATGTGGACCTTGGGCCGTCGCGCGGTTGCGGGCCTGCTGGCGAGCCCAAGCCCGGCACAGGCGCAGACCCTGACGCGCGTTCCGCGTCCGGCGGAATTGGCCCCGTTGTGCGGTCGCCGTGGTCTGCGCACGGATATCGACGCTACCTGTACGCCGCGTCGCGCGAGCAGCAATCAGCGTGGCCTGAATCAAATTTGGAACGTCAAGAAACAATCTGTTTACCTGATGAATCTGCGCAAGAGCGGTACGTTGGGTCACCCGGGCAGCCTGGACGAGACTACCTATGAGCGCCTGGCTGAGGAAACGCTGGACAGCCTGGCCGAATTTTTCGAAGATCTCGCAGATAAGCCGTACACGTTTGAGGATTATGACGTGAGCTTCGGCAGCGGCGTCTTAACCGTGAAACTGGGTGGTGACCTGGGCACCTACGTGATCAATAAGCAAACCCCGAACAAACAGATTTGGCTGAGCTCGCCGAGCTCTGGCCCTAAGCGTTACGATTGGACCGGTAAGAACTGGGTGTATTCCCACGACGGTGTCAGCCTGCATGAACTGCTGGCGGCAGAGCTGACCAAAGCGCTGAAAACTAAACTGGATCTGAGCTCCCTGGCCTACAGCGGTAAAGACGCATAACTCGAG
SEQ ID NO:7：HIV-1转录细胞穿透肽反式激活因子(TAT-cpp)的完整氨基酸序列(11AA)：YGRKKRRQRRR。
具体实施方式
为了促进对新技术原理的理解，现在将参考优选的组合物、其制备方法和使用方法，并使用特定的措辞来描述这些内容。然而，应当理解，本并不意在限制新技术的范围，新技术涉及领域的技术人员通常会想到对新技术原理进行改变、修改和进一步应用，此类改变、修改和进一步应用在本公开和权利要求书的范围内。
定义
除非在使用术语的上下文中另外指明，否则术语将具有如本文所用的以下含义。
术语“约”是指加或减10％的值的范围，例如，约1.0涵盖0.9至1.1的值。
“药学上可接受的”是指由政府监管机构如美国食品和药物管理局(U.S.FDA)或欧洲EMA批准或可批准的，或列入美国药典或其他公认的药典以用于哺乳动物和/或动物并且更特别是人。
如本文所用，“受试者”是指哺乳动物，例如猴、大鼠、小鼠或人。在一个特定实施例中，受试者是人。
任何疾病的“治疗(treat、treating或treatment)”是指逆转、减轻、阻止或改良疾病或疾病的至少一种临床症状或抑制疾病或疾病的至少一种临床症状的进展，在这种情况下是弗里德赖希共济失调(FRDA)。“治疗(treat、treating或treatment)”还指在身体上(例如，稳定可识别症状)、生理上(例如，稳定物理参数)或两者上抑制疾病，并且抑制对受试者可识别或不可识别的至少一个物理参数。
“治疗有效量”是指当向受试者施用以治疗疾病或疾病的至少一种临床症状时，活性药物成分的量足以产生疾病或其症状的此类治疗。“治疗有效量”可以根据例如活性药物成分、疾病和/或疾病的症状、疾病的严重程度和/或疾病或病症的症状、年龄、体重和/或待治疗受试者的健康状况，以及处方医师的判断而变化。
例如，所公开的TAT-FXN融合多肽的“治疗有效量”是治疗FRDA所必需或足够的量，FRDA包含例如FRDA相关的疾病、病症或病况。例如，所公开的TAT-FXN融合多肽的“治疗有效量”是改良、改善与FRDA相关的至少一种症状或指标或实现与FRDA相关的至少一种症状或指标的严重程度降低或延迟FRDA的进展所必需或足够的量，FRDA包含例如FRDA相关的疾病、病症或病况。在一些实施例中，所公开的TAT-FXN融合多肽的术语“治疗有效量”还可以是在被施用TAT-FXN融合多肽的受试者的至少一种组织中引起hFXN量增加必需或足够的量。
“治疗有效剂量”是指对受试者的疾病或病症提供有效治疗的剂量。治疗有效剂量可因活性药物成分和受试者而异，并且可取决于如受试者的状况、受试者的遗传特征和递送途径的因素。
弗里德赖希共济失调和FXN
尽管罕见，但是弗里德赖希共济失调(FRDA)是人最常见的遗传性共济失调，在美国估计有4,000-5,000例。FRDA被认为是由于线粒体蛋白弗里德赖希共济失调蛋白(FXN)并且具体是人弗里德赖希共济失调蛋白(hFXN)缺乏所致。FXN蛋白是在全身细胞中发现的必需且系统发生保守的蛋白。最高水平的FXN发现于心脏、脊髓、肝、胰腺和骨骼肌中。FXN在细胞核中编码，在细胞质中表达并导入线粒体，在线粒体中被加工成它的成熟形式。在人类中，210个氨基酸的全长hFXN(23.1kDa)在氨基末端含有典型的线粒体靶向序列(MTS)，该序列在被导入线粒体基质时被线粒体基质加工肽酶(MPP)在2步裂解中进行加工。所得蛋白是130个氨基酸、14.2kDa的成熟hFXN蛋白。尚未鉴定其他线粒体内翻译后修饰。
尚未定义FXN的确切功能。发表的文献和研究表明FXN可以在线粒体铁稳态，特别是在铁-硫(Fe-S)簇蛋白的从头生物合成(通过将铁呈递给Fe-S簇组装酶支架蛋白)，以及血红素合成中发挥几种作用。在没有FXN的情况下，游离铁可以在线粒体中积累，其中含有Fe-S簇的蛋白失去活性。重要且关键的Fe-S簇依赖性酶系统包括电子传递链的复合物I、II和III，以及Krebs循环的顺乌头酸酶。
FRDA通常表现为进行性多系统疾病，通常始于儿童中期。患者患有多种症状，其包括进行性神经和心脏功能障碍。其中的关键是背根神经节和小脑齿状核的原发性神经变性，其导致进行性肢体共济失调和构音困难的标志性临床发现。肥厚性心肌病也很常见，并且与FRDA受试者30至50岁时的早期死亡有关。其他临床发现可以包括脊柱侧弯、疲劳、糖尿病、视力损伤和听力损失。
与FRDA相关的遗传是常染色体隐性遗传，并且主要由hFXN基因的两个等位基因的第一个内含子中遗传的GAA三联体扩增引起。这种三联体扩增导致FRDA基因的转录抑制，导致患者仅产生少量的hFXN。杂合子(携带者)通常具有的hFXN水平为正常值的约50％，但表型正常。
目前，没有FDA批准的直接解决或改良与FRDA一起发生的FXN缺乏的治疗。因此，本公开提供了一种药物组合物，其包括对治疗FRDA有用的TAT-FXN融合蛋白。
TAT-FXN融合多肽
在一些实施例中，本公开提供了一种药物组合物，其包括本文公开的TAT-FXN融合多肽。例如，TAT-FXN融合多肽可以是多肽，其包括与人弗里德赖希共济失调蛋白(FXN，SEQID NO:4；或成熟FXN，SEQ ID NO:5)具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列，该氨基酸序列融合至与本文公开的TAT-CPP(细胞穿透肽，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7)具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
弗里德赖希共济失调蛋白(例如，完整的人弗里德赖希共济失调蛋白，SEQ ID NO:4)是在大多数真核生物中表达并靶向线粒体基质的必需且高度保守的蛋白。它似乎在线粒体铁稳态，特别是在铁硫(Fe-S)簇蛋白的从头生物合成(通过将铁呈递给IscU支架蛋白)，以及血红素中起作用。铁-硫簇是线粒体中多种蛋白复合物(包括电子传递链的复合物I、II和III)不可缺少的和必需的组分，及Krebs循环的顺乌头酸酶和琥珀酸脱氢酶。铁-硫簇也广泛用于细胞的整个细胞溶质和细胞核中。在它不存在的情况下，游离铁在线粒体中积累，其中含有Fe-S的蛋白失去活性，并且由于电子传递链损害和广泛的线粒体蛋白乙酰化而失去能量产生。
在一些实施例中，本公开药物组合物中包括的TAT-FXN融合多肽可包括与完整的人弗里德赖希共济失调蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)具有至少约90％序列同一性，例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文公开的TAT-FXN融合多肽可包括与成熟人弗里德赖希共济失调蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)具有至少约90％序列同一性，例如约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或约100％序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，本公开药物组合物中包括的TAT-FXN融合多肽可包括在完整的人弗里德赖希共济失调蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)中或在成熟人弗里德赖希共济失调蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)中的至少一个(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)点突变。可包括在弗里德赖希共济失调蛋白中的点突变的实例描述于例如美国专利第9,217,019号中，该专利的全部内容特此通过引用并入本文。在一个特定实施例中，TAT-FXN融合多肽可包括在SEQ ID NO:4的氨基酸位置147或SEQ ID NO:5的位置67处的突变。例如，在SEQ ID NO:4的氨基酸位置147或SEQ ID NO:5的氨基酸位置67处的赖氨酸(K)残基可被不同的氨基酸残基取代，如组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、天冬氨酸或谷氨酸残基。在一个实施例中，在SEQ ID NO:4的氨基酸位置147或SEQ ID NO:5的氨基酸位置67处的赖氨酸(K)残基可以被精氨酸(R)残基取代。
TAT-CPP(细胞穿透肽，例如，SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7)是短的阳离子肽，其来源于具有细胞穿透特性的HIV的较大TAT蛋白。TAT已被用于将多种货物(如蛋白)转导到动物的细胞和组织中。细胞穿透肽可以将多种分子(如蛋白、肽或寡核苷酸)转运到细胞中，否则这些细胞无法吸收大分子量的化合物。细胞穿透肽对多种细胞器(如线粒体、溶酶体和细胞核)的货物递送已经完成，且它们能够将货物穿过胎盘递送。TAT已被用于替代疾病动物模型(如嘌呤核苷磷酸化酶)和人线粒体疾病的动物模型(如硫辛酰胺脱氢酶缺乏症和弗里德赖希共济失调)中缺失的细胞溶质酶。
不希望受任何理论束缚，目前认为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的TAT-CPP肽用于将TAT-FXN融合多肽跨细胞膜递送到线粒体中。然后线粒体可以经由蛋白水解加工适当地加工TAT-FXN融合多肽，以去除转运肽序列TAT-CPP(SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7)和MTS(SEQ ID NO:3)，从而将成熟FXN(hFXN蛋白的C末端130个氨基酸；SEQ ID NO:5)和其他可能的活性降解物释放到线粒体中。
在一些实施例中，本公开药物组合物中包括的TAT-FXN融合多肽可包括以下肽或由以下肽组成：具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的肽。因此，TAT-FXN融合多肽可以是224个氨基酸的重组融合多肽，其包括短的阳离子细胞穿透肽TAT-CPP(SEQ ID NO:2)，该细胞穿透肽通过二肽(Gly-Gly)接头融合至完整的人弗里德赖希共济失调蛋白(hFXN)(SEQ IDNO:4)的氨基末端，该完整的人弗里德赖希共济失调蛋白包括hFXN的天然线粒体靶向序列(MTS)(SEQ ID NO:3)。换言之，所公开的TAT-FXN融合多肽可以是224个氨基酸的重组融合多肽，其包括短的阳离子细胞穿透肽TAT-CPP(SEQ ID NO:2)，该细胞穿透肽通过二肽(Gly-Gly)接头融合至hFXN的天然线粒体靶向序列(MTS)(SEQ ID NO:3)的氨基末端，该天然线粒体靶向序列融合至成熟人弗里德赖希共济失调蛋白(hFXN)(SEQ ID NO:5)的氨基末端。
在一些实施例中，本公开药物组合物中包括的TAT-FXN融合多肽(例如包括SEQ IDNO:1或由其组成的融合多肽)的分子量为约24.92kDa。
在实施例中，本公开药物组合物中包括的TAT-FXN融合多肽没有不必要的序列。例如，SEQ ID NO:1的TAT-FXN融合多肽比Vyas等人，《人类分子遗传学(Hum Mol Genet.)》2012,21(6):1320-1247公开的TAT-FXN融合多肽短大约40aa。TAT-FXN融合多肽的长度较短，部分原因是TAT-FXN融合多肽中存在短的2-氨基酸Gly-Gly接头。与Vyas等人的多肽长度相比，TAT-FXN融合多肽的更短的长度显著降低了TAT-FXN融合多肽的抗原潜力，以帮助确保受试者在重复注射时不会对TAT-FXN融合多肽产生体液免疫应答。体液免疫应答的产生会降低TAT-FXN融合多肽的治疗功效。Vyas等人公开的多肽由于其较大的尺寸而与产生此类免疫应答的风险增加有关；Vyas等人的作者自己承认这一事实(见Vyas等人，同上，第1242页)。抗原性风险的增加至少部分是由于Vyas等人的接头的长度。
相反，本公开药物组合物中包括的TAT-FXN融合多肽在一些实施例中仅含有1、2或3个氨基酸的接头，例如2-氨基酸Gly-Gly接头。该接头具体选择为最小化(如果不是消除)TAT-FXN融合多肽在长时间引入受试者后触发体液免疫应答的风险。
尽管选择的Gly-Gly接头预期将抗原性最小化(即，降低体液免疫应答的风险)，但应认识到，在一些实施例中，可以使用其他短的、非抗原性接头代替Gly-Gly来连接TAT和FXN肽。此类替代接头在本领域中是已知的并且通常富含小氨基酸或极性氨基酸，如甘氨酸和丝氨酸，以提供良好的柔韧性和溶解度。尽管其他也是已知的(例如，Gly-Ser-Ala-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly-Ser-Gly-Glu-Phe(SEQ ID NO:10))，但是替代接头的实例包括甘氨酸重复接头((Gly)n；例如，(Gly)8(SEQ ID NO:8))和主要由甘氨酸和丝氨酸的段构成的“GS”接头(例如，(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)n(SEQ ID NO:9))。Gly-Gly的替代接头应保持短的(例如，20个或更少的氨基酸，如1、2或3个氨基酸)。本公开还考虑了使抗原性最小化、导致良好的融合多肽溶解度并且可从期望表达系统表达的替代接头。
在一些实施例中，本公开药物组合物中包括的TAT-FXN融合多肽还可以省略接头。例如，TAT-FXN融合多肽可以由以下组成：具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少约90％序列同一性，例如至少约95％或约100％序列同一性的氨基酸序列的第一肽和具有与SEQ ID NO:4具有至少约90％序列同一性，例如至少约95％或约100％序列同一性的氨基酸序列的第二肽。在另一个实施例中，TAT-FXN融合多肽可以由以下组成：具有与SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7具有至少约90％序列同一性，例如至少约95％或约100％序列同一性的氨基酸序列的第一肽；具有与SEQ ID NO:3具有至少约90％的序列同一性，例如至少约95％或约100％的序列同一性的氨基酸序列的第二肽；和具有与SEQ ID NO:5具有至少约90％的序列同一性，例如至少约95％或约100％的序列同一性的氨基酸序列的第三肽。
在一些实施例中，本公开药物组合物中包括的TAT-FXN融合多肽(例如SEQ ID NO:1的TAT-FXN融合多肽)包括与人FXN蛋白具有100％序列同一性的FXN多肽。具有与人弗里德赖希共济失调蛋白的氨基酸序列100％相同的氨基酸序列的本公开的TAT-FXN融合多肽预期与线粒体加工肽酶的最优序列识别和加工相关，并且与降低的TAT-FXN融合多肽的抗原性相关。
在本公开的一些实施例中，TAT-FXN融合多肽具有期望的溶解度。例如，TAT-FXN融合多肽(例如，具有SEQ ID NO.1的氨基酸序列)可具有下表A提供的物理参数。
表A.TAT-FXN融合多肽的物理参数
| 参数 | TAT-FXN |
| 氨基酸数量 | 224 |
| 分子量 | 24,922.26 |
| 理论pI | 9.72 |
| (-)带电aa总数 | 23 |
| (+)带电aa总数 | 34 |
| 估计半衰期 | 30小时 |
| 不稳定性指数 | 53.51 |
| 脂肪族指数 | 76.25 |
| 亲水性(GRAVY指数) | -0.610 |
肽的GRAVY(亲水性的总平均值)值计算为所有氨基酸的亲水性值的总和除以序列中的残基数量。数量越大，肽越疏水。
脂肪族指数是脂肪族侧链(丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸)占据的相对体积。它可以被认为是增加球状蛋白热稳定性的积极因素。
本公开药物组合物中包括的TAT-FXN融合多肽的溶解度由TAT-FXN融合多肽的脂肪族指数和亲水性指数证明。可以理解，改善和维持的溶解度允许更精确的给药，并且可显著减少实现期望效果所需的治疗剂量的体积。
在一些实施例中，本公开药物组合物中包括的TAT-FXN融合多肽可溶于在生理pH下的pH缓冲液中，使其与人皮下注射相容。
在一些实施例中，本公开药物组合物中包括的TAT-FXN融合多肽是描述于美国临时申请第62/880,073号、美国临时申请第62/891,029号、美国专利申请第16/942,276号和国际专利申请第PCT/US2020/044069号中的TAT-FXN融合多肽，这些申请各自的全部内容特此通过引用并入本文。
药物组合物
本公开提供了药物组合物，其包括本文所述的TAT-FXN融合多肽，例如，与SEQ IDNO:1的氨基酸序列具有至少约90％、至少约95％、至少约99％或100％序列同一性的融合多肽。
在一些实施例中，融合多肽以大于约10mg/mL，例如约15mg/mL至约50mg/mL、约20mg/mL至约75mg/mL或约25mg/mL至约100mg/mL的浓度存在于所述药物组合物中。在一些实施例中，融合多肽以大于约15mg/mL、大于约20mg/mL、大于约25mg/mL、大于约30mg/mL、大于约35mg/mL、大于约40mg/mL、大于约45mg/mL、大于约50mg/mL、大于约55mg/mL、大于约60mg/mL、大于约65mg/mL、大于约70mg/mL、大于约75mg/mL、大于约80mg/mL、大于约85mg/mL、大于约90mg/mL、大于约95mg/mL或大于约100mg/mL的浓度存在于药物组合物中。在一些实施例中，融合多肽以约15mg/mL或更大、约20mg/mL或更大、约25mg/mL或更大、约30mg/mL或更大、约35mg/mL或更大、约40mg/mL或更大、约45mg/mL或更大、约50mg/mL或更大、约55mg/mL或更大、约60mg/mL或更大、约65mg/mL或更大、约70mg/mL或更大、约75mg/mL或更大、约80mg/mL或更大、约85mg/mL或更大、约90mg/mL或更大、约95mg/mL或更大或约100mg/mL或更大的浓度存在于药物组合物中。
例如，融合多肽可以约25mg/mL至约150mg/mL的浓度存在于药物组合物中。在实施例中，融合多肽以约10mg/mL、15mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL、35mg/mL、40mg/mL、45mg/mL、50mg/mL、55mg/mL、60mg/mL、65mg/mL、70mg/mL、75mg/mL、80mg/mL、85mg/mL、90mg/mL、95mg/mL或100mg/mL的浓度存在于所述药物组合物中。在一个实施例中，融合多肽以约50mg/mL的浓度存在于所述药物组合物中。在另一个实施例中，融合多肽以约100mg/mL的浓度存在于所述药物组合物中。
在一些实例中，存在于本公开的药物组合物中的TAT-FXN融合多肽保持了其热和构象稳定性。在一些实例中，存在于本公开的药物组合物中的TAT-FXN融合多肽不形成不溶性聚集体。用于测量蛋白的热和构象稳定性以及蛋白的聚集的方法在本领域是已知的，并且包含例如差示扫描荧光法(DSF)、动态光散射(DLS)和静态光散射(SLS)。
在一些实施例中，本公开的药物组合物在约-60℃或更低的温度下储存时稳定至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约13个月、至少约14个月、至少约15个月、至少约16个月、至少约17个月、至少约18个月、至少约19个月、至少约20个月、至少约21个月、至少约22个月、至少约23个月或至少约24个月。在一些实施例中，药物组合物呈液体形式。在一些实施例中，药物组合物包括浓度为约50mg/mL的TAT-FXN融合多肽(包括SEQ ID NO:1或由其组成)、约20mM组氨酸、约250mM蔗糖、约0.05％polysorbate20(PS20)，pH为约5.8。
在一些实施例中，本公开的药物组合物在约-25℃至约-15℃(例如，约-20℃或-25℃)的温度下储存时稳定至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约13个月、至少约14个月、至少约15个月、至少约16个月、至少约17个月、至少约18个月、至少约19个月、至少约20个月、至少约21个月、至少约22个月、至少约23个月或至少约24个月。在一些实施例中，药物组合物呈液体形式。在一些实施例中，药物组合物包括浓度为约50mg/mL的TAT-FXN融合多肽(包括SEQ ID NO:1或由其组成)、约20mM组氨酸、约250mM蔗糖、约0.05％polysorbate 20(PS20)，pH为约5.8。
在一些实施例中，本公开的药物组合物在约2℃至约8℃(例如，约4℃)的温度下储存时稳定至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约13个月、至少约14个月、至少约15个月、至少约16个月、至少约17个月、至少约18个月、至少约19个月、至少约20个月、至少约21个月、至少约22个月、至少约23个月或至少约24个月。在一些实施例中，药物组合物呈冻干形式。在一些实施例中，药物组合物包括浓度为约50mg/mL的TAT-FXN融合多肽(包括SEQ ID NO:1或由其组成)、约20mM组氨酸、约250mM蔗糖、约0.05％polysorbate 20(PS20)，pH为约5.8。
在一些实施例中，本公开的药物组合物在约20℃至约30℃(例如，约25℃)的温度下储存时稳定至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约13个月、至少约14个月、至少约15个月、至少约16个月、至少约17个月或至少约18个月。在一些实施例中，药物组合物呈冻干形式。在一些实施例中，药物组合物包括浓度为约50mg/mL的TAT-FXN融合多肽(包括SEQ ID NO:1或由其组成)、约20mM组氨酸、约250mM蔗糖、约0.05％polysorbate 20(PS20)，pH为约5.8。
包括TAT-FXN融合多肽的本公开药物组合物随时间推移的稳定性可例如使用本领域已知的方法评估。例如，本公开药物组合物的随时间推移的稳定性可以根据以下标准中的一个或多个(任何组合)来评估：
a)药物组合物的外观，例如，组合物是否有机会存在颜色或不透明，或是否有可见的颗粒存在；
b)药物组合物的pH；
c)通过A280测量的随时间推移的药物组合物中的蛋白浓度；
d)通过反相色谱法(RP-HPLC)和毛细管电泳(CE)测量的蛋白纯度；
e)通过尺寸排除色谱法(SE-UPLC)测量的主峰纯度和更高阶聚集体的存在；
f)例如使用例如美国公开第2021/0156874A1号中描述的方法测量的蛋白的比活性，该公开的全部内容特此通过引用并入本文；
g)药物组合物中的内毒素量；
h)药物组合物的无菌性；以及
i)药品组合物中存在的微粒物质；以及
j)储存在封闭小瓶中的药物组合物的容器封闭完整性。
存在于本公开的药物组合物中的药学上可接受的赋形剂可选自由盐、糖、氨基酸或其任何组合组成的群组。
例如，药学上可接受的赋形剂可以是盐，其例如选自由氯化钠(NaCl)和氯化钙(CaCl2)组成的群组。
在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂是氨基酸，例如，精氨酸或脯氨酸。
在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂是糖，例如，蔗糖或甘露糖醇。在一个实施例中，糖是蔗糖。在另一个实施例中，糖是甘露糖醇。糖可以约1mM至约500mM的浓度存在于所述药物组合物中。在一个实施例中，糖以约1mM至约50mM、约25mM至约150mM、约100mM至约300mM、约200mM至约450mM或约250mM至约500mM的浓度存在于所述药物组合物中。例如，糖可以约250mM的浓度存在于所述药物组合物中。
在一些实施例中，药物组合物进一步包括缓冲液，例如乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、磷酸盐或Tris缓冲液。在一个实施例中，缓冲液可选自由乙酸盐、组氨酸和Tris组成的群组。在一个实施例中，缓冲液是组氨酸。
缓冲液可以约5mM至约500mM的浓度存在于所述药物组合物中。例如，缓冲液可以约5mM至约50mM、约25mM至约150mM、约50mM至约250mM或约100mM至约500mM的浓度存在于药物组合物中。在一个实施例中，缓冲液(例如组氨酸缓冲液)可以约20mM的浓度存在于所述药物组合物中。
本发明的药物组合物的pH可为约4.0至约8.5。例如，药物组合物的pH可为约5.0至约7.0。在一些实施例中，药物组合物的pH可为约5.0至约6.0、约5.5至约6.5、约6.0至约7.0或约5.5至约6.0。在一些实施例中，药物组合物的pH为约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9、约6.0、约6.1、约6.2、约6.3、约6.4或约6.5。在一些实施例中，药物组合物的pH为约5.8。在一些实施例中，药物组合物的pH为约6.0。
本公开的药物组合物可进一步包括表面活性剂，例如，非离子型表面活性剂。在一些实例中，表面活性剂可选自由聚氧乙烯二醇辛基酚醚(Triton-X 100)、聚氧乙烯二醇烷基酚醚(Nonoxynol-9)、聚氧乙烯二醇脱水山梨糖醇烷基酯(Polysorbate)、脱水山梨糖醇烷基酯(Span)和聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物(Poloxamer)组成的群组。在一个实例中，表面活性剂可以是聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)。
表面活性剂可以约0.0001％w/v至约1％w/v的浓度存在于本公开的药物组合物中。例如，表面活性剂(例如Polysorbate 20)可以约0.0001％w/v至约0.1％w/v、约0.01％w/v至约0.5％w/v、约0.01％至约0.05％、约0.01％至约0.1％、约0.05％至约0.1％、0.01％至约0.1％、约0.05％w/v至约1％w/v、约0.01％w/v至约0.1％w/v、约0.005％w/v至约0.5％w/v或约0.001％w/v至约1.0％w/v的浓度存在于药物组合物中。在一些实施例中，表面活性剂(例如Polysorbate 20)可以约0.01％w/v、约0.02％w/v、0.03％w/v、0.04％w/v、0.05％w/v、0.06％w/v、0.07％w/v、0.08％w/v、0.09％w/v或0.10％w/v的浓度存在于所述药物组合物中。在一些实施例中，表面活性剂(例如Polysorbate20)可以约0.05％w/v的浓度存在于所述药物组合物中。
在一些实例中，本公开的药物组合物可包括药学上可接受的载体，该载体是水。
在一些实例中，本公开的药物组合物可包括以下物质或由以下物质组成：融合多肽、药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的载体、缓冲液和表面活性剂，其中所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且所述融合多肽以大于约10mg/mL(例如，约50ug/mL)的浓度存在于所述组合物中。
在一些实例中，本公开的药物组合物可包括以下物质或由以下物质组成：融合多肽、蔗糖、组氨酸、聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且所述融合多肽以大于约10mg/mL(例如，约50ug/mL)的浓度存在于所述组合物中。
在一些实例中，本公开的药物组合物可包括以下物质或由以下物质组成：融合多肽、250mM蔗糖、20mM组氨酸、0.05％w/v聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate20)和水，其中所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且所述融合多肽以大于约10mg/mL(例如，约50ug/mL)的浓度存在于所述组合物中。
在一些实例中，本公开的药物组合物可包括以下物质或由以下物质组成：融合多肽、甘露糖醇、组氨酸、聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且所述融合多肽以大于约10mg/mL(例如，约50ug/mL)的浓度存在于所述组合物中。
在一些实例中，本公开的药物组合物可包括以下物质或由以下物质组成：融合多肽、250mM甘露糖醇、20mM组氨酸、0.05％w/v聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且所述融合多肽以大于约10mg/mL(例如，约50ug/mL)的浓度存在于所述组合物中。
在一些实例中，本公开的药物组合物可包括以下物质或由以下物质组成：融合多肽、250mM蔗糖、20mM组氨酸、0.05％w/v聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate20)和水，其中所述融合多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；并且其中所述融合多肽以大于约10mg/mL(例如，约50mg/mL)的浓度存在于所述组合物中。
在一些实例中，本公开的药物组合物可包括以下物质或由以下物质组成：融合多肽、250mM甘露糖醇、20mM组氨酸、0.05％w/v聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中所述融合多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；并且其中所述融合多肽以大于约10mg/mL(例如，约50mg/mL)的浓度存在于所述组合物中。
在一些实例中，本公开的药物组合物适用于注射，例如，皮下注射。
治疗用途
本公开的药物组合物(即，包括TAT-FXN融合多肽)可以施用于受试者以治疗与FXN缺乏相关的任何病况。TAT-FXN融合多肽是嵌合蛋白，其包括与HIV-1TAT-CPP(细胞穿透肽)连接的FXN蛋白的功能形式。不希望受任何理论束缚，TAT-FXN融合多肽的一种可能的作用机制是将成熟FXN和其他可能的活性降解物递送至受试者的线粒体。向线粒体的递送可经由TAT肽发生。一旦在线粒体中，融合多肽的蛋白水解加工就将导致成熟FXN的释放。在FXN缺乏的受试者中，直接向线粒体提供成熟FXN可以补充(如果不能完全替代)FXN缺乏。
弗里德赖希共济失调
施用本公开提供的至少一个治疗有效剂量的包括TAT-FXN融合多肽的药物组合物可以在临床上有效治疗弗里德赖希共济失调(FRDA)。
目前预计，用TAT-FXN融合多肽进行蛋白替代疗法将纠正FRDA的代谢缺陷，并恢复患者的充分细胞功能。还预计使用TAT-FXN融合多肽的治疗将使FRDA从进行性和致命的疾病转变为通过频繁注射融合多肽来管理的慢性病况，就像胰岛素已将糖尿病转变为具有正常生活活动的慢性病一样。在已确诊疾病的老年FRDA患者中，施用TAT-FXN融合多肽预计将阻止疾病进展。在出现FRDA症状之前被诊断出的儿童中，施用TAT-FXN融合多肽预计将导致组织功能和健康几乎完全的保护。
FRDA的基因缺陷于1996年被鉴定，并且该领域的共识是线粒体中缺乏FXN蛋白是生化缺陷。多名研究人员已经表明，在缺乏患者成纤维细胞中，并且甚至在具有FXN丧失的酵母中替代FXN将挽救表型。因此，该领域的共识是，FRDA的疗法必须包含增加受影响组织线粒体中FXN蛋白的水平。虽然FXN的精确功能还有待定义，但显然FXN参与了铁-硫簇的组装。在它不存在的情况下，含有铁-硫簇(电子传递链的复合物I、II和III，以及Krebs循环的顺乌头酸酶)的线粒体蛋白的活性严重缺陷。结果，那些高度依赖线粒体产生能量的组织(如心脏和脑)受到严重影响，且超过约60％的患者死于心力衰竭。与其他线粒体疾病一样，多个器官系统也会受到影响，如眼睛、听力和胰腺。因此，临床相关的目标组织包含心脏和脑，并且接着可以对其进行常见的临床测试如超声心动图和神经学测定如弗里德赖希共济失调评定量表(FARS)。
因此，包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物的施用可作为蛋白替代疗法在被诊断患有FRDA(包含例如FRDA相关疾病、病症或病况)的FXN缺乏受试者中有效治疗FRDA(包含例如FRDA相关疾病、病症或病况)。
如本文所用，术语“FRDA”涵盖与弗里德赖希共济失调蛋白缺乏相关的任何疾病、病症或病况。如本文所用，术语“FRDA相关疾病、病症或病况”涵盖继发于FRDA和/或由FRDA引起的疾病、病症或病况，即，当存在于受试者中时，它伴随FRDA并且不存在于无FRDA的受试者中。FRDA相关疾病、病症或病况的非限制性实例包含FRDA相关肺炎、FRDA相关肥厚性心肌病和FRDA相关糖尿病。FRDA相关疾病、病症或病况的其他非限制性实例包含但不限于以以下表征的FRDA相关疾病、病症或病况：
(1)神经系统缺陷，包含但不限于以下一项或多项：本体感觉丧失、反射丧失、行走能力丧失、用眼睛保持凝视的能力丧失；
(2)吞咽受损和/或吞咽能力的进行性丧失；进行性听力丧失；
(3)由因缺乏FXN的视网膜变性导致的进行性视力丧失；
(4)进行性言语丧失；
(5)代谢综合征，其包含但不限于甘油三酯高、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇低和低密度脂蛋白(LDL)胆固醇高；
(6)需要手术矫正的脊柱侧弯；和/或其组合。
在一些实施例中，向受试者施用包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可以治疗FRDA(包含例如FRDA相关的疾病、病症或病况)。如本文所用，“治疗FRDA”涵盖改良、改善FRDA或实现FRDA严重程度的降低，FRDA包含例如FRDA相关的疾病、病症或病况。例如，“治疗FRDA”涵盖改良、改善至少一种与FRDA相关的症状或指标或实现至少一种与FRDA相关的症状或指标的减少。如本文所用，“治疗FRDA”还涵盖延迟受试者FRDA(包含例如FRDA相关的疾病、病症或病况)的进展，例如延迟至少一种与FRDA相关的症状或指标的出现或防止至少一种与FRDA相关的症状或指标严重程度的增加。
在一些实施例中，术语“治疗FRDA”还涵盖实现患有FRDA(包含例如FRDA相关疾病、病症或病况)的受试者(例如人)的存活(例如存活时间)增加。例如，FRDA的治疗可导致患有FRDA(包含例如FRDA相关疾病、病症或病况)的受试者(例如人)的预期寿命增加。在一些实施例中，在本公开的上下文中，治疗FRDA可导致受试者的预期寿命与一个或多个患有类似疾病且未经治疗的对照个体的平均预期寿命相比增加大于约10％、大于约20％、大于约30％、大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％、大于约100％、大于约110％、大于约120％、大于约130％、大于约140％、大于约150％、大于约160％、大于约170％、大于约180％、大于约190％或大于约200％或更多。
在一些实施例中，在本公开的上下文中，FRDA(包含例如FRDA相关疾病、病症或病况)的治疗可导致受试者的预期寿命与一个或多个患有类似疾病且未经治疗的对照个体的平均预期寿命相比增加大于约6个月、大于约8个月、大于约10个月、大于约12个月、大于约2年、大于约4年、大于约6年、大于约8年或大于约10年或更多。在一些实施例中，在本公开的上下文中，FRDA(包含例如FRDA相关疾病、病症或病况)的治疗可导致患有FRDA(包含例如FRDA相关疾病、病症或病况)的受试者(例如人)的长期存活。如本文所用，术语“长期存活”是指存活时间或预期寿命长于约40年、45年、50年、55年、60年或更长。
本领域普通技术人员已知的临床评估可用于评估FRDA(包含例如FRDA相关的疾病、病症或病况)以确定FRDA的严重程度和/或确定向受试者施用所公开的TAT-FXN融合多肽和/或包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物的效果。FRDA的临床评估(包含FRDA严重程度的评估)的方法的实例在例如Paap等人，“临床研究中对遗传性共济失调患者的标准化评估(Standardized Assessment of Hereditary Ataxia Patients in ClinicalStudies)”，《运动障碍临床实践(Mov Disord Clin Pract.)》2016,3(3):230-240和Patel等人，“弗里德赖希共济失调的进展：5年内的定量表征(Progression of Friedreichataxia:quantitative characterization over 5years)”，《临床和转化神经学年鉴(AnnClin Transl Neurol)》2016,3(9):684-694中描述，每篇文献的全部内容特此通过引用并入本文。
定时25英尺步行(T25-FW)是定量移动性和腿部功能性能测试，其测量完成25英尺步行所需的时间。在一些实施例中，向受试者施用所公开的TAT-FXN融合多肽和/或包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可导致FRDA的严重程度降低，如例如通过完成25英尺的步行所需时间所测量的。例如，向受试者施用所公开的TAT-FXN融合多肽和/或包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可导致与在施用所公开的TAT-FXN融合多肽和/或包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物之前受试者完成25英尺步行所需的时间相比或与基线值相比完成25英尺步行所需的时间减少，例如，完成25英尺步行所需的时间减少至少约5％、至少约10％、至少约25％或至少约50％。基线值可以是在施用本公开的所公开的TAT-FXN融合多肽之前测量的完成25英尺步行所需的时间。
在其他实施例中，向受试者施用所公开的TAT-FXN融合多肽和/或包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可以延迟受试者中FRDA的进展，如例如通过完成25英尺步行所需的时间所测量的。例如，向受试者施用所公开的TAT-FXN融合多肽和/或包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可导致与基线值(即在施用所公开的TAT-FXN融合多肽和/或包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物之前在受试者中测量的完成25英尺步行所需的时间)相比完成25英尺步行所需的时间基本相似或完成25英尺步行所需的时间缺乏大幅增加(例如，完成25英尺步行所需的时间增加少于20％、少于10％或少于5％)。
修饰的弗里德赖希共济失调评定量表(mFARS)是用于评估FRDA的严重程度的基于检查的评定量表，如例如Burk等人，“使用临床量表监测弗里德赖希共济失调(FRDA)的进展(Monitoring progression in Friedreich ataxia(FRDA):the use of clinicalscales)”，《神经化学杂志(J of Neurochemistry)》2013,126(增刊1)：118-124和Rummey等人，“弗里德赖希共济失调评定量表的心理测量特性(Psychometric properties of theFriedreich's Ataxia Rating Scale)”，《神经遗传学(Neurol Genet)》2019,5:e371中所描述的，每篇文献的全部内容特此通过引用并入本文。
在一些实施例中，mFARS评分可以包括以下子评分中的至少一个：a)基于功能失能评定量表(FARS-FDS；0-6级；通常由神经科医生进行的评估的评分；b)基于日常生活活动量表(FARS-ADL，0-36级；由患者或护理人员进行的评估)的评分；以及c)基于神经评分量表(FARS-neuro)0-125级；由神经科医生进行的评估)的评分。在一些实例中，FARS_ADL评分是评估受试者完成ADL(例如，言语、切食物、穿衣和个人卫生)的能力的FARS评定量表，评分范围从0到36分。被访者可以是受试者；受试者和家庭的组合；或无法完成测试的那些受试者的家庭成员、配偶或护理人员。
在一些实施例中，基于神经评定量表的评分可以包含神经评定量表的修改评分，其涉及直接的受试者参与和靶向受FRDA影响的特定区域，如延髓、上肢、下肢和直立稳定性(mFARS-neuro，0-99级)。mFARS-neuro从FARS问卷的神经评定量表中排除了子量表D(外周神经系统)和子量表A(延髓)的前2个问题。
在一些实施例中，mFARS评分可以基于从完整的FARS问卷衍生的两个子评分：如上所述的mFARS-neuro和如上所述的FARS_ADL。
在一些实施例中，向受试者施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可导致FRDA的严重程度降低，如例如通过如本文所述的mFARS评分或至少一个mFARS子评分所测量的。例如，向受试者施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可导致与基线值(即在施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物之前在受试者中测量的mFARS评分或至少一个mFARS子评分)相比mFARS评分或至少一个mFARS子评分降低。
在其他实施例中，向受试者施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可以延迟受试者中FRDA的进展，如例如通过如本文所公开的mFARS评分或至少一个mFARS子评分所测量的。例如，向受试者施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可导致与基线值(即在施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物之前在受试者中测量的mFARS评分或至少一个mFARS子评分)相比或与基线值相比mFARS评分或至少一个mFARS子评分基本相似或mFARS评分或至少一个mFARS子评分基本缺乏增加。
九孔钉测试(9HPT)可用于测量患有FRDA受试者的手指灵活性。在这个测试中，受试者被要求从容器中一一取出钉子，并尽快将它们放入板上的九个孔中。然后受试者必须从孔中一一取出钉子，并将它们放回容器中。评分基于完成测试活动所用的时间，以秒为单位记录。
在一些实施例中，向受试者施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可导致FRDA的严重程度降低，如例如通过9HPT评分测量的。例如，向受试者施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可导致与基线值(即在施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物之前在受试者中测量的9HPT评分)相比如完成测试活性的时间所表示的9HPT评分降低(例如如完成测试活性的时间所表示的9HPT评分降低至少约5％、10％、25％或50％)。
在其他实施例中，向受试者施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可以延迟受试者中FRDA的进展，如例如通过9HPT评分所测量的。例如，向受试者施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可导致与基线值(即在施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物之前在受试者中测量的9HPT评分)相比9HPT评分基本相似或如完成测试活性的时间所表示的9HPT评分缺乏大幅增加。
在一些实施例中，向受试者施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物导致与基线水平(即在施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物之前受试者的至少一种组织或生物流体中的hFXN水平)相比受试者的至少一种组织或生物流体中的hFXN水平增加。在一些实施例中，由向受试者施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物引起的受试者的至少一种组织或生物流体中的hFXN水平的增加足以具有治疗效果，即足以治疗受试者的FRDA。
在一些实施例中，向患有FRDA的受试者施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可导致受试者的至少一种组织或生物流体中的hFXN水平低于未患FRDA的受试者(例如，正常、健康受试者)的至少一种组织或生物流体中的hFXN水平，但仍然足以具有治疗效果，即足以治疗受试者的FRDA。例如，在将所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物施用于患有FRDA的受试者后，受试者的至少一种组织或生物流体中的hFXN水平可以是未患FRDA的受试者(例如，正常、健康受试者)的至少一种组织或生物流体中的hFXN水平的约10％至约50％、约20％至约60％或约30％至约80％，但该hFXN的水平仍然足以具有治疗效果，即足以治疗受试者的FRDA。
在一些实施例中，向患有FRDA的受试者施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可导致与施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物之前受试者的至少一种组织或生物流体中的hFXN水平相比或与基线水平相比受试者的至少一种组织或生物流体中的hFXN水平增加至少约5％、约10％、约25％、约50％、约100％、约150％、约200％、约300％、约400％、约500％或约600％。
在一些实施例中，向患有FRDA的受试者施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可导致与施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物之前受试者的至少一种组织或生物流体中的hFXN水平相比或与基线水平相比受试者的至少一种组织或生物流体中的hFXN水平增加约5％至约30％、约10％至约50％、约25％至约100％、约50％至约150％、约100％至约300％、约50％至约250％、约150％至约500％或约200％至约700％。在一些实施例中，向受试者施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可导致与施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物之前受试者的至少一种组织或生物流体中的hFXN水平相比或与基线水平相比受试者的至少一种组织或生物流体中的hFXN水平增加至少约2倍、约3倍、约4倍、约5倍。在一些实施例中，向受试者施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物可导致与施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物之前受试者的至少一种组织或生物流体中的hFXN水平相比或与基线水平相比受试者的至少一种组织或生物流体中的hFXN水平增加约2倍至约5倍或约2倍至约10倍。
在一些实施例中，hFXN水平可以得到测量和/或增加的受试者的组织可以是能够进行活检的任何组织。在一些实施例中，该组织可以包括支气管肺泡组织(其可以通过例如支气管肺泡刷来取样)、粘膜(例如鼻粘膜，其可以通过例如鼻刷来取样)、毛发毛囊、皮肤组织或颊组织。在一些实施例中，该组织包括皮肤组织或颊组织。
在一些实施例中，hFXN水平可以得到测量和/或增加的受试者的生物流体可以是血液或其组分(例如血清、血浆、血小板或任何其他血液组分)、尿液或唾液。
FRDA相关肺炎
被诊断患有FRDA的受试者会患有背根神经节的神经变性，从而导致进行性共济失调。这通常会导致行走、自主进食、讲话、吞咽的能力和肺吸入的进行性丧失。肺吸入事件可导致肺炎、频繁住院，并最终自诊断之日起10至15年时段内死亡。
由于上述许多原因，施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物在被诊断患有FRDA的FXN缺乏受试者中可有效地作为蛋白替代疗法以防止肺吸入，从而预防肺呼吸后的肺炎。因此，本公开提供了治疗受试者的FRDA相关肺炎的方法，其包括向有此需要的受试者施用本公开的包括TAT-FXN融合多肽的药物组合物，从而治疗受试者的FRDA相关肺炎。
FRDA相关肥厚性心肌病
肥厚性心肌病是心脏肌肉变厚，使心脏难以通过循环系统泵血的病况。它可能是由心脏细胞线粒体中的FXN缺乏引起的。在被诊断患有FRDA的受试者中，进行性肥厚性心肌病在约50％的时间会进展为心力衰竭和死亡。使用所公开的TAT-FXN融合多肽的蛋白替代疗法可以替代造成肥厚性心肌病的FXN缺乏。
因此，施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物在被诊断患有FRDA和肥厚性心肌病二者的FXN缺乏受试者中可有效地作为蛋白替代疗法。因此，本公开提供了治疗受试者的FRDA相关的肥厚性心肌病的方法，其包括向有此需要的受试者施用本公开的包括TAT-FXN融合多肽的药物组合物，从而治疗受试者的FRDA相关肥厚性心肌病。
糖尿病
糖尿病的标志是无法适当调节葡萄糖的血液水平，从而导致血糖水平高。在被诊断患有FRDA的受试者中，糖尿病通常是由于胰腺中FXN缺乏的线粒体而出现的。使用所公开的TAT-FXN融合多肽的蛋白替代疗法可以替代造成糖尿病的FXN缺乏。
因此，施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物在被诊断患有糖尿病的FXN缺乏受试者中可以有效地作为蛋白替代疗法。因此，本公开提供了治疗受试者的FRDA相关糖尿病的方法，其包括向有此需要的受试者施用本公开的包括TAT-FXN融合多肽的药物组合物，从而治疗受试者的FRDA相关糖尿病。
其他FRDA相关疾病/病症
被诊断患有FRDA的受试者经常经历与FXN缺乏相关的其他病症。此类FRDA相关病症可包含但不限于：神经性病症，其包含但不限于：本体感觉丧失、反射丧失、行走能力丧失、用眼睛保持凝视的能力丧失；吞咽受损和/或吞咽能力的进行性丧失；进行性听力丧失；由因缺乏FXN的视网膜变性导致的进行性视力丧失；进行性言语丧失；代谢综合征，其包含但不限于甘油三酯高、高密度脂蛋白(HDL)胆固醇低和低密度脂蛋白(LDL)胆固醇高；需要手术矫正的脊柱侧弯；和/或其组合。使用所公开的TAT-FXN融合多肽的蛋白替代疗法可以替代造成这些疾病/病症的FXN缺乏。
因此，施用所公开的包括所公开的TAT-FXN融合多肽的\药物组合物在被诊断患有FRDA并经历神经性病症的FXN缺乏受试者中可以有效地作为蛋白替代疗法，这些神经性病症包含但不限于本体感觉丧失、反射丧失、行走能力丧失、用眼睛保持凝视的能力丧失；吞咽受损和/或吞咽能力的进行性丧失；进行性听力丧失；由因缺乏FXN的视网膜变性导致的进行性视力丧失；进行性言语丧失；代谢综合征，其包含但不限于甘油三酯高、HDL胆固醇低和LDL胆固醇高；需要手术矫正的脊柱侧弯；和/或其组合。
因此，本公开提供了治疗FRDA相关疾病、病症或病况的方法，其包括向有此需要的受试者施用本公开的包括TAT-FXN融合多肽的药物组合物，其中FRDA相关疾病、病症或病况选自：神经性病症，其包含但不限于：本体感觉丧失、反射丧失、行走能力丧失、用眼睛保持凝视的能力丧失；吞咽受损和/或吞咽能力的进行性丧失；进行性听力丧失；由因缺乏FXN的视网膜变性导致的进行性视力丧失；进行性言语丧失；代谢综合征，其包含但不限于甘油三酯高、HDL胆固醇低和LDL胆固醇高；以及需要手术矫正的脊柱侧弯。
在一些实施例中，本公开还提供了治疗FRDA(包含例如FRDA相关的疾病、病症或病况)的方法，其包括向有此需要的受试者施用药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的媒介物、载体和/或赋形剂以及浓度大于或等于10mg/mL的所公开的TAT-FXN融合多肽，例如包括SEQ ID NO:1或由其组成的TAT-FXN融合多肽。例如，该方法可以包括向有此需要的受试者施用如本文所述的药物组合物，其中所公开的TAT-FXN融合多肽以大于约10mg/mL或大于或等于：约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约35mg/mL、约35mg/mL、约40mg/mL、约45mg/mL、约50mg/mL、约55mg/mL、约60mg/mL、约65mg/mL、约70mg/mL、约75mg/mL、约80mg/mL、约85mg/mL、约90mg/mL、约95mg/mL或约100mg/mL的浓度存在于药物组合物中。在一些实施例中，所公开的TAT-FXN融合多肽可以约5mg/mL至约25mg/mL、约15mg/mL至约30mg/mL、约20mg/mL至约50mg/mL、约25mg/mL至约60mg/mL、约35mg/mL至约75mg/mL、约50mg/mL至约80mg/mL或约90mg/mL至约100mg/mL的浓度存在于药物组合物中。在一些实施例中，所公开的TAT-FXN融合多肽可以约40mg/mL至约60mg/mL、约40mg/mL至约55mg/mL、约45mg/mL至约60mg/mL、约45mg/mL至约55mg/mL、约46mg/mL至约54mg/mL、约47mg/mL至约53mg/mL、约48mg/mL至约52mg/mL或约49mg/mL至约51mg/mL的浓度存在于药物组合物中。替代地，所公开的TAT-FXN融合多肽可以约5mg/mL至约50mg/mL、约20mg/mL至约75mg/mL或约25mg/mL至约100mg/mL的浓度存在于药物组合物中。在一些实施例中，方法包括施用如本文所述的药物组合物，其中药物组合物是可注射的药物组合物，例如适用于皮下施用。
施用和给药
本文公开的包括TAT-FXN融合多肽的药物组合物可以通过注射施用于受试者。注射可以是静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内或皮内的。可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液可以根据已知技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为在1,3-丁二醇中的溶液。可以采用的可接受的媒介物和溶剂当中有水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、不挥发性油按常规用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的不挥发性油，包含合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸可用于制备注射剂。可以使用二甲基乙酰胺、包含离子和非离子洗涤剂的表面活性剂和聚乙二醇。也可以使用如上面讨论的那些的溶剂和润湿剂的混合物。
在各个方面，所公开的包括TAT-FXN融合多肽的药物组合物通过皮下注射施用。皮下注射通常以推注形式施用到真皮正下方的皮肤层中。由于在该位置几乎没有血管，因此施用至该位置的药物成分通常会随时间的推移缓慢释放，以提供所公开的TAT-FXN融合多肽吸收到受试者中的持续速率。
静脉内给予的注射体积通常范围为5-20mL。相比之下，皮下给予的注射体积通常仅为0.05mL至1mL，通常最大体积为约1.5mL，因此此类注射中药物成分的浓度必须足够高才能实现期望的治疗效果。在这方面，由本文所公开的TAT-FXN融合多肽展示的改善的溶解度是有利的，因为它在溶液中时将允许更大的浓度，从而适应经由皮下注射的施用。此外，本文提供的药物组合物所实现的高浓度(例如，至少10mg/mL，如约50mg/mL的TAT-FXN融合多肽)是有利的，因为它们可以适应经由皮下注射来施用期望的即治疗量的TAT-FXN融合多肽。
通过注射的施用通常需要以药学上可接受的方式配制肽以注射到受试者中，在一些实施例中受试者是人。在一些实施例中，所公开的TAT-FXN融合多肽通过溶解在药学上可接受的媒介物中被配制用于皮下注射。在各个方面，药学上可接受的媒介物还可以包含一种或多种赋形剂。
存在许多可用于所公开的TAT-FXN融合多肽的药物制剂中的合适的药学上可接受的媒介物。合适的媒介物包含例如水、盐水溶液、乙酸钠、乙酸-乙酸钠缓冲液、磷酸盐缓冲盐水、油乳液等。乳液包含以油为分散相的水包油乳液和以油为连续相的油包水乳液。油可以是植物来源的或合成产生的。合适地，乳液的植物油是大豆油或红花油或其任何组合。在一些实施例中，媒介物是乙酸钠。
存在许多可用于所公开的TAT-FXN融合多肽的药物制剂中的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，药学上可接受的赋形剂是丙二醇。
因此，在一个方面，本公开提供了用于经由皮下注射施用于受试者的药物组合物，其包括：(a)治疗有效量的所公开的TAT-FXN融合多肽；(b)一种或多种药学上可接受的媒介物；和(c)药学上可接受的赋形剂。
药物组合物的pH可以变化。在各个方面，期望将药物组合物的pH维持在生理水平，例如pH在约5-7、约5-6、约5.5-6.5或约6-7。在一个实施例中，药物组合物的pH为约5、约5.5、约6、约6.5或约7。在一个实施例中，药物组合物的pH为约5。在一个实施例中，药物组合物的pH为约5-6。在一个实施例中，药物组合物的pH为约5.5-6.5。在一个实施例中，药物组合物的pH为约5.6-6。在一个实施例中，药物组合物的pH为约5.7-5.9。在一个实施例中，药物组合物的pH为约5.8。在一个实施例中，药物组合物的pH为约6.0。
另一种药物组合物可包括浓度大于或等于2mg/mL的所公开的TAT-FXN融合多肽和药学上可接受的媒介物、载体和/或赋形剂。例如，所公开的TAT-FXN融合多肽可以大于或等于：约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约35mg/mL、约35mg/mL、约40mg/mL、约45mg/mL、约50mg/mL、约55mg/mL、约60mg/mL、约65mg/mL、约70mg/mL、约75mg/mL、约80mg/mL、约85mg/mL、约90mg/mL、约95mg/mL或约100mg/mL的浓度存在于药物组合物中。在一些实施例中，所公开的TAT-FXN融合多肽可以约5mg/mL至约25mg/mL、约15mg/mL至约30mg/mL、约20mg/mL至约50mg/mL、约25mg/mL至约60mg/mL、约35mg/mL至约75mg/mL、约50mg/mL至约80mg/mL或约90mg/mL至约100mg/mL的浓度存在于药物组合物中。替代地，所公开的TAT-FXN融合多肽可以约5mg/mL至约50mg/mL、约20mg/mL至约75mg/mL或约25mg/mL至约100mg/mL的浓度存在于药物组合物中。药物组合物可以是可注射的药物组合物，在进一步的实施例中其适用于皮下施用。
药学上可接受的媒介物可以是水性媒介物，如例如水、盐水溶液或水性缓冲液，如乙酸盐缓冲液或磷酸盐缓冲液。在一个优选的实施例中，缓冲液是组氨酸缓冲液。存在于药物组合物中的所公开的TAT-FXN融合多肽完全溶解在药学上可接受的媒介物中。如本文所用，术语“完全溶解在药物组合物中”是指包括所公开的TAT-FXN融合多肽并且是澄清溶液和/或不包括可见沉淀的药物组合物。
包括所公开的TAT-FXN融合多肽的药物组合物(包括大于10mg/mL(例如50mg/mlL)的浓度)的制备基于以下惊人的发现：能够通过使用如本文所公开的缓冲液、表面活性剂、药学上可接受的赋形剂并在最优pH下制备包括浓度等于或大于约50mg/mL的所公开的TAT-FXN融合多肽的组合物(例如，水性组合物)。本文提供的药物组合物包括浓度大于约10mg/mL(例如约50mg/mL)的所公开的TAT-FXN融合多肽，允许以大于或等于10mg/注射的量通过皮下注射向受试者施用所公开的TAT-FXN融合多肽。例如，所公开的TAT-FXN融合多肽可以大于或等于以下的量通过皮下注射施用于受试者：10mg/注射、15mg/注射、20mg/注射、25mg/注射、30mg/注射、35mg/注射、40mg/注射、45mg/注射、50mg/注射、55mg/注射、60mg/注射、65mg/注射、70mg/注射、75mg/注射、80mg/注射、85mg/注射、90mg/注射、95mg/注射或100mg/注射。例如，所公开的TAT-FXN融合多肽可以大于或等于以下的量通过皮下注射施用于受试者：50mg/注射。例如，所公开的TAT-FXN融合多肽可以以下量通过皮下注射施用于受试者：约2mg/注射至约150mg/注射、约2mg/注射至约100mg/注射、约10mg/注射至约150mg/注射、约20mg/注射至约150mg/注射、约5mg/注射至约25mg/注射、约15mg/注射至约30mg/注射、约20mg/注射至约50mg/注射、约25mg/注射至约60mg/注射、约35mg/注射至约75mg/注射、约50mg/注射至约80mg/注射、约90mg/注射至约120mg/注射和/或约100mg/注射至约150mg/注射。所公开的TAT-FXN融合多肽可以约5mg/注射至约50mg/注射、约20mg/注射至约75mg/注射、约25mg/注射至约100mg/注射或约50mg/注射至约150mg/注射的浓度存在于药物组合物中。
根据个体受试者对所公开的TAT-FXN融合多肽的敏感性、对随时间推移给药的量的耐受性等，所公开的TAT-FXN融合多肽的剂量可能因受试者而异。一般来说，根据每千克受试者体重给予的制剂中活性组合物的毫克数，向受试者施用的所公开的TAT-FXN融合多肽的量的范围可以为每天约5mg kg-1至约60mg kg-1。根据需要，总剂量可以一次施用，作为单剂量施用，或者可以分成每天多次施用的两个或更多个剂量，以产生期望的治疗效果。在一些情况下，在任何一个24小时时段内，可向给定患者施用三个或更多个剂量的所公开的TAT-FXN融合多肽；对于对治疗应答良好的患者，可施用较少的剂量。
一般来说，将向受试者施用被医疗保健提供者认为是安全的起始剂量，然后根据个体受试者的耐受性和FXN的组织水平，上调或下调剂量，以实现期望的治疗效果。例如，受试者的推荐起始剂量可以是30mg kg-1，每天3次皮下施用。医疗保健提供者将施用这一剂量，然后通过提取皮肤活检并测量其中存在的所公开的TAT-FXN融合多肽的量来监测所公开的TAT-FXN融合多肽的水平。存在的量将与已知的基线进行比较，例如在健康受试者中看到的基线，并且所公开的TAT-FXN融合多肽的剂量将根据需要递增或递减调整，以使皮肤水平保持在目标量和/或实现期望的治疗益处，直至每天60mg kg-1的最高剂量。剂量可按1天、1周或更长的时间间隔进行调整。
在一些实施例中，本公开的TAT-FXN融合多肽可以约10-mg至约150mg的剂量向受试者施用，例如，约10mg至约30mg、约20mg至约75mg、约50mg至约100mg或约100mg至约150mg。例如，TAT-FXN融合多肽可以约25mg、约50mg、约75mg、约100mg或约150mg的剂量向受试者施用。在一些实施例中，该剂量可以每天一次施用。在一些实施例中，本公开的TAT-FXN融合多肽可以每天约5mg kg-1至约60mg kg-1的剂量向受试者施用，例如每天约10mg kg-1至50mg kg-1、每天约20mg kg-1至40mg kg-1、每天约30mg kg-1至40mg kg-1、每天约40mg kg-1至50mg kg-1、每天约50mg kg-1至60mg kg-1、每天约5mg kg-1至10mg kg-1、每天约10mg kg-1至15mg kg-1、每天约15mg kg-1至20mg kg-1、每天约20mg kg-1至25mg kg-1、每天约25mg kg-1至30mg kg-1、每天约30mg kg-1至35mg kg-1、每天约35mg kg-1至40mg kg-1、每天约40mg kg-1至45mg kg-1、每天约45mg kg-1至50mg kg-1、每天约50mg kg-1至55mg kg-1和每天约55mg kg-1至60mg kg-1。在一些实施例中，本公开的TAT-FXN融合多肽可以每天约0.05mg kg-1至约20mg kg-1的剂量向受试者施用，例如约0.05mg kg-1至0.5mg kg-1、每天约0.1mg kg-1至1mgkg-1、每天约0.5mg kg-1至5mg kg-1、每天约1mg kg-1至10mg kg-1、每天约2mg kg-1至15mgkg-1、每天约5mg kg-1至15mg kg-1或每天约10mg kg-1至约10mg kg-1。
除了上面提到的皮肤活检，确定给定受试者的有效剂量的标准还包含监测治疗期间受试者显示和/或报告的症状。在开始用所公开的TAT-FXN融合多肽治疗之前，受试者将经历或将已经经历广泛的医学评估。对被诊断患有弗里德赖希共济失调的受试者进行的典型医学评估可包含测量以下一项或多项：神经功能、心脏功能、粗大和精细运动技能、听力、言语、视力、糖尿病的血液检查和吞咽。
在治疗之前进行的评估的结果可以充当评估该施用的治疗的有效性的基线。这种‘基线’评估可以是为任何给定受试者设计和调整适当给药方案的过程的一部分。可以根据需要增加或减少施用剂量以在受试者中产生期望的治疗效果。给药评估的要素可以包含来自受试者的关于活动性、平衡、感觉、情绪、疲劳、耐力、力量和与弗里德赖希共济失调诊断相关的任何其他生理或心理特征的变化的反馈。
本公开提供的药物组合物可考虑以下任何一项或多项进行配制：易于储存、运输、稳定性和患者便利性。制剂可包含预装注射器、小瓶、瓶子等。在一些实施例中，可以将所公开的TAT-FXN融合多肽冻干并放入无菌小瓶中用于储存和/或运输。为了产生药物组合物，可以将冻干肽与无菌媒介物和/或无菌赋形剂混合以产生适用于皮下施用的药物组合物。
本文公开的TAT-FXN融合多肽或药物组合物可用于制造(即制备)用于施用于受试者的药物。该药物是包含TAT-FXN融合多肽的治疗组合物或本文提供的药物组合物。药物组合物可以与药物相同。
实例
实例1.开发包括TAT-FXN融合多肽的药物组合物
概述
对SEQ ID NO:1的TAT-FXN融合多肽进行配制前开发研究，以评估有利于TAT-FXN融合多肽的构象、物理、化学和热稳定性的合适的配制条件。一个关键目标是开发药物组合物，其中SEQ ID NO:1的TAT-FXN融合多肽可以约50mg/mL或更高，例如约50mg/mL至约100mg/mL或更高的高浓度存在。
TAT-FXN融合多肽的构象和热稳定性最初是使用pH范围为4.5至8.0的候选缓冲液组进行评估的，该候选缓冲液组包含乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、磷酸盐和Tris。根据其性能，选择了包括pH范围为5.0至7.5的乙酸盐、组氨酸和tris的测试制剂子集。
评估这些缓冲液以及赋形剂组(包含蔗糖、甘露糖醇、氯化钠(NaCl)、精氨酸和脯氨酸)提高TAT-FXN融合多肽稳定性的能力。从赋形剂筛选中选择了两种缓冲液类型(组氨酸和Tris)和五种赋形剂组合((1)蔗糖、(2)甘露糖醇、(3)甘露糖醇和氯化钙、(4)氯化钙和(5)脯氨酸)进行进一步评估。在随后的溶解度研究中，上述缓冲液和赋形剂组合都达到了≥130mg/mL的TAT-FXN融合多肽浓度，SLS和SEC结果基本相当。值得注意的是，这些高浓度的样品都显示出棕色的颜色。鉴于100mg/mL浓度水平的可操作性和开发高浓度液体制剂的目标，随后的研究是在100mg/mL的TAT-FXN融合多肽下进行。从溶解度筛选中选择了两种缓冲液类型(组氨酸和Tris)和三种赋形剂组合(蔗糖、甘露糖醇以及甘露糖醇与氯化钙)进行进一步评估。表面活性剂筛选显示，0.05％的polysorbate 20(PS20)总体上是有益的，没有明确的迹象表明对TAT-FXN融合多肽有负面影响，并且因此被纳入最终的制剂评估中。最后，进行了最终实验设计(DOE)研究，以区分和选择最佳的缓冲液类型、赋形剂类别/类型和pH。在对所得数据进行统计分析后，鉴定了如下两种最好的候选制剂：(1)20mM组氨酸，250mM蔗糖，0.05％PS20，pH 5.8；和(2)20mM组氨酸，250mM甘露糖醇，0.05％PS20，pH 5.8。
方法
外观
在实验室的漫射照明下，针对干净的白色和黑色背景评估液体样品外观。测试每个样品的颜色和透明度(乳白光)。
蛋白含量
使用紫外可见光谱法测量蛋白含量。在280nm波长下使用1.742mL mg-1cm-1的消光系数测量样品的浓度。
浊度
使用紫外可见光谱法测量浊度。在340nm处分析未经稀释的样品。还使用Uncle仪器在266nm和473nm处使用等温光散射分析样品。
pH测量
使用带有自动温度补偿电极的校准的SevenMulti计(Mettler Toledo)进行所有样品溶液的pH测量。
差示扫描荧光法和静态光散射
通过差示扫描荧光法(DSF)监测TAT-FXN融合多肽制剂的热稳定性。使用Unchained Laboratories UNit仪器收集熔化温度(Tm)数据。蛋白样品以约2mg/mL(必要时在适当的缓冲液交换液中稀释)进行分析，并添加到UNi迷你石英比色皿中。使样品在20℃下平衡30秒，并监测250-500nm(266nm激发波长)的固有荧光光谱的重心平均值(BCM)，同时温度以1℃/分钟的速度从20℃升至95℃。在展开事件期间，BCM与温度曲线的拐点(由导数迹线的最大值或最小值鉴定)被鉴定为该转变的Tm。在266nm和473nm处的静态光散射(SLS)强度也与DSF测量平行测量，以分别观察小聚集体和大聚集体形成的起始温度(Tagg)。Tagg值由分析软件确定，即SLS迹线上升到图中最陡峭点处的散射信号的大约10％时的温度。
动态光散射
动态光散射(DLS)测量样品中颗粒的散射光强度的时间依赖性波动，其中StokesEinstein方程被用来计算溶液中颗粒的流体力学半径。TAT-FXN融合多肽制剂样品的DLS实验使用DynaPro Plate Reader II仪器(Wyatt)，使用40μL的纯样品(如果浓度为2mg/mL)或在不含表面活性剂的制剂缓冲液中稀释到2mg/mL的样品进行。使用括号内的BSA制剂(2mg/mL)来确认系统的适用性。每个样品在未离心和以约16000rcf离心5分钟后两种情况下进行分析。在25℃下总共进行10次单独扫描，每个样品的采集时间为5秒。报告了无标记的采集百分比(或通过累积分析能够适当拟合的扫描次数)。无标记的采集百分比低表明存在大颗粒物质，这使相关曲线的拟合变得复杂。粘度被设定为磷酸盐缓冲盐水的粘度，即1.019cP。比较所得的强度分布图以评估各种制剂组分对按强度的平均粒度(总体直径)、总体尺寸分布宽度参数(总体多分散性百分比，或％Pd)、TAT-FXN融合多肽单体的平均峰直径(峰2直径)以及该峰的宽度参数(峰2的％Pd)的影响。多分散性百分比(总体或峰2)是反映在强度分布图中检测到的异质性的宽度参数，其中％Pd<20％表明近单分散的溶液和/或物种构象。
粘度
使用Brookfield DV-III Ultra可编程流变仪进行基于流变仪的粘度测量。简而言之，用Brookfield粘度标准液#10校准DV-III Ultra可编程流变仪，并在不同的主轴速度(剪切速率)下测量0.5mL的每个样品。对于所有剪切速率均展示出粘度(cP)读数<10％RSD的样品被认为是在该范围符合牛顿学说的，而具有剪切速率依赖性粘度值的样品被认为是非符合牛顿学说的。
渗透压
使用multi-osmette 2430自动渗压计进行渗透压测量，该自动渗压计通过测量凝固点下降来测量液体溶液的渗透压。使用Precision systems multi-osmette渗压计(2430型)进行分析。
其他分析
尺寸排除色谱法(SEC)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、阳离子交换色谱法(CEX)、非还原和还原毛细管凝胶电泳(CGE)根据先前开发的用于分析SEQ ID NO:1的TAT-FXN融合多肽的程序进行。
结果和讨论
基线缓冲液评估
在下表1所列的候选缓冲液的存在下，在4.0至8.0的pH范围内评估SEQ ID NO:1的TAT-FXN融合多肽的热和构象稳定性。
表1.候选缓冲液和制剂
该研究使用以8.5mg/mL在50mM乙酸盐和1％聚丙二醇(pH 5.0)中配制的TAT-FXN融合多肽批次进行。蛋白样品使用Amicon Ultra离心过滤器(10kDa NMWL Ultracel再生纤维素膜，Millipore C/N UFC901096)进行缓冲液交换。在每个预冲洗的浓缩器中，将221μL的TAT-FXN融合多肽与约15mL的适当缓冲液组合。以4000x g离心样品直到达到约500μL的体积。然后向每个离心过滤器中添加5mL体积的适当缓冲液。再次以4000x g离心样品，直到达到约500μL的体积以用于进行>800倍的交换。研究中总共消耗了26mg的材料。
通过Solo-VPE使用1.742ml/mg*cm的消光系数测量样品中的蛋白浓度。由于样品体积的限制，将样品在0.9％的NaCl中稀释10倍。结果显示在下表2中。
表2.基线缓冲液筛选：缓冲液交换后的蛋白浓度
*观察到的沉淀(缓冲液交换后样品浑浊)
表2中呈现的结果表明，所有包括柠檬酸盐和磷酸盐的制剂都表现出≤30％的低回收率，相比之下，其他制剂表现出的回收率≥50％。此外，将原始来源的材料在不含PPG的50mM乙酸盐pH 5.0缓冲液中稀释4.25倍，以生成该研究中指定为样品“O”的样品。尽管预计样品O会表现出与样品E类似的特性，但前者没有受到缓冲液交换的潜在压力并且仍然含有痕量的PPG。
在分析之前，通过用适当的缓冲液稀释，将样品标准化至2mg/mL。低浓度的样品没有被进一步处理。使用差示扫描荧光法(DSF)、动态光散射(DLS)和静态光散射(SLS)确定2mg/mL的蛋白在各种缓冲液中的热和构象稳定性。使用DSF通过测量固有氨基酸荧光的变化来评估TAT-FXN融合多肽的热稳定性。通过测量在90°角的散射强度来收集SLS，并且强度随着聚集而增加。相反，强度的明显和急剧下降表明不溶性聚集体的形成。DLS分析产生了关于每个制剂中颗粒的分布和尺寸的信息。选择针对热和构象稳定性表现出最佳组合属性的制剂进行进一步评估。
差示扫描荧光法和静态光散射
差示扫描荧光法(DSF)用于确定观察到展开事件时的温度(Tm)。此外，评估每个制剂中的TAT-FXN融合多肽的通过SLS在266nm(较小的聚集体)和473nm(较大的聚集体)下确定的聚集(Tagg)模式。下表3中呈现了TAT-FXN融合多肽样品制剂的Tm结果(三次重复的平均值)。
表3.基线缓冲液筛选：DSF结果
*缓冲液交换后的回收率≤50％
表3中呈现的结果表明，观察到pH 6.0和7.0的组氨酸缓冲液；pH 7.5和8.5的Tris缓冲液；以及pH 6.0的乙酸盐缓冲液的熔化温度为60℃或更高。在4至6的pH范围内观察到Tm随pH增加而增加的一般趋势，但与pH 6相比，7或8并没有赋予任何改善的热稳定性。值得注意的是，已知表现出随着温度的升高pH明显下降的Tris缓冲液是在室温下制备的，并且因此pH比在那些熔化温度下报告的pH更低。
下表4中呈现了266nm的Tagg结果(三次重复的平均值)。
表4.基线缓冲液筛选：Tagg 266nm结果
*缓冲液交换后的回收率≤50％
表4中呈现的结果表明，制剂C和K(以及在较小的程度上的F和L)显示出表明聚集的早期散射显著增加，随后在进一步加热(超过55℃)期间强度下降。这是由于非常大的蛋白聚集体会沉淀并从溶液中掉出来。SLS只对溶液中的物种敏感，因此在沉淀后，测量的强度就会下降。
对SLS计数与温度图的较仔细评估显示，尽管报告的Tagg高，但制剂N(Tris pH8.5)的天然光散射水平高(20℃下>110,000个计数)。相比之下，制剂I(组氨酸pH 6.0)在95℃下的光散射仍低于20,000个计数。需要对数据进行不同的解释，以根据导致光散射增加显著高的真实聚集事件对制剂进行评级(图1)。根据重新评估的评级，乙酸盐、组氨酸和琥珀酸盐制剂显然是最好的候选者，其表现优于原始样品。类似地，Tagg 473nm结果也显示出与观察到的计数相似的趋势。图2中呈现了基于Tagg 473数据的制剂评级。分析结果表明，琥珀酸盐pH 4.0、乙酸盐pH 4.0和5.0以及组氨酸pH 6.0制剂表现最好。
柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液的结果是粗浅的，因为它们的浓度显著较低，并且在分析前通过离心去除沉淀，因此没有包含在数据分析中。总之，不仅pH较高，而且具体来说，乙酸盐和组氨酸制剂赋予了TAT-FXN融合多肽更大的热稳定性。尽管Tris缓冲液pH 8.5表现较差，但与乙酸盐和组氨酸制剂相比，在约50℃下在Tris pH 7.5中观察到的聚集是显著到足以指出的。总之，表现最好的制剂是：乙酸盐pH 5.0、组氨酸pH 6.0和Tris pH 7.5。表现最差的制剂是：Tris pH 8.5和琥珀酸盐。
动态光散射
以三次重复收集基线缓冲液筛选样品的光散射数据。评估样品制剂的尺寸和颗粒分布(总体直径、峰2直径和多分散性)。在表5中给出了制成表的结果。
下表5中呈现了473nm的Tagg结果(三次重复的平均值)。
表5.基线缓冲液筛选：Tagg 473nm结果
*缓冲液交换后的回收率≤50％
考虑到制剂C、F、G、H、K和L的蛋白回收率≤50％，那些样品的数据不包含在数据驱动结论中。单体峰直径结果的权重更高，因为总体直径值因较大颗粒的散射而出现偏差，并且因此并不总是准确地反映粒度分布。
柠檬酸盐和磷酸盐的结果是粗浅的，因为它们的浓度显著较低，并且在分析前通过离心去除沉淀，因此没有包含在数据分析中。此外，尽管琥珀酸盐pH 6.0显示出比其他制剂相对较低的多分散性结果(包括总体和单体)，但缓冲液交换的50％蛋白回收率结果表明TAT-FXN融合蛋白的次优条件。与原始样品相比，乙酸盐制剂表现出较小的总体直径。然而，除了Tris pH 7.5之外，大多数评估的制剂在粒度上比原始样品更不均匀。单体直径结果令人鼓舞，其中乙酸盐pH 5.0、组氨酸pH 6.0和7.0以及Tris pH 7.5都与原始制剂相当或更有利。此外，尽管所有的乙酸盐、组氨酸和Tris pH 7.5单体直径多分散性值都比原始制剂大，但结果表明是单分散性物种。
除了单体峰之外，还在源材料和大多数感兴趣的样品中都检测到约30nm的聚集体峰(在琥珀酸盐pH 5和Tris pH 8.5中没有检测到)，从而证实了总体可比性。最后，在琥珀酸盐pH 4.0、乙酸盐pH 5.0、组氨酸pH 6.0和Tris pH 7.5中甚至没有检测到更大直径的颗粒。因此，表现最好的制剂是：乙酸盐pH 5.0、组氨酸pH 7.0以及Tris pH 7.5；而表现最差的制剂是Tris pH 8.5。
讨论
来自柠檬酸盐和磷酸盐制剂的缓冲液交换的蛋白回收率差表明它们与TAT-FXN融合多肽的相容性低。磷酸盐制剂的静态光散射数据证实了这一点。熔化温度似乎在一定程度上依赖于pH，与pH 6相比，在pH 7或8时没有赋予分子额外的稳定性。然而，光散射数据鉴定出在Tris pH 8.5中的高水平的天然光散射(小颗粒和较大的聚集体二者)。Tris pH 7.5在约50℃下显示出明显的聚集事件，但表现优于原始制剂。琥珀酸盐UNit结果表现出随着pH的增加，热稳定性以及聚集的倾向明显增加。琥珀酸盐pH 4.0的动态光散射表现良好。DLS数据支持乙酸盐pH 5.0、组氨酸pH 6.0和组氨酸pH 7.0作为有利的缓冲液，并且表明Tris pH 7.5作为在多分散性和单体直径方面相当的候选者。总之，20mM乙酸盐pH 5.0和组氨酸(pH 6.0和7.0二者)的表现优于原始制剂(50mM乙酸盐pH 5.0，含有痕量PPG)，并被选择用于在后续赋形剂研究中进行进一步评估。还可以结合赋形剂进一步评估Tris pH 7.5。
赋形剂筛选
在各种赋形剂(包含氯化钠、蔗糖、甘露糖醇、精氨酸和脯氨酸)的存在下，使用作为基线缓冲液筛选结果的缓冲制剂(20mM乙酸盐pH 5.0、20mM组氨酸pH 6.0、20mM Tris pH7.5)评估TAT-FXN融合多肽的稳定性。下表6中呈现了用于赋形剂评估的制剂。
表6.赋形剂筛选：制剂
此外，原始样品还在50mM乙酸盐pH 5.0，1％PPG中进行了缓冲液交换。研究的目标蛋白浓度为2mg/mL。蛋白样品使用Amicon Ultra离心过滤器(10kDa NMWL Ultracel再生纤维素膜，Millipore C/N UFC901096)进行缓冲液交换。在每个预冲洗浓缩器中，将294μL的8.5mg/mL TAT-FXN融合多肽与14.5mL的适当缓冲液组合。以4000x g离心样品直到达到约700μL的体积。然后向每个离心过滤器中添加12mL体积的适当缓冲液。再次以4000x g离心样品，直到达到约700μL的体积以用于进行>800倍的交换。通过solo-VPE使用1.742ml/mg*cm的消光系数一式两份测量样品中的TAT-FXN融合多肽的浓度，然后使用适当缓冲液标准化至2mg/mL。回收率结果显示在下表7中。
表7.赋形剂筛选：缓冲液交换后的蛋白浓度
*观察到的沉淀(缓冲液交换后样品浑浊)
值得注意的是，所有的NaCl和精氨酸制剂都显示出<50％的回收率，并且由于样品浓度低，没有进一步调整到2mg/mL。氯化钠和精氨酸制剂在所有的缓冲液组合物中都导致蛋白回收率<50％。此外，在那些样品中观察到了沉淀。
差示扫描荧光法和静态光散射
利用20-95℃的线性热斜坡(0.5℃min-1)分析一式三份的样品，每隔1℃一式三份记录蛋白固有荧光和静态光散射信号，且在每个温度下保持30秒，以允许样品在测量开始前平衡。使用1000ms的暴露时间，并且将系统中的两个激光器衰减到其最大值。使用UNit分析软件进行数据分析，其中将光散射信号和荧光比(重心平均值-350:330)与温度作图，以自动生成Tm和Tagg值。表8中显示了制成表的结果(三次重复的平均值)。
表8.赋形剂筛选：DSF结果
*来自缓冲液交换的回收率<50％
熔化温度的结果是热稳定性的量度，与来自缓冲液交换的蛋白回收率一致，氯化钠和精氨酸是最差的赋形剂。蔗糖、甘露糖醇和脯氨酸显然比氯化钠和精氨酸更有利。组氨酸仅略微超过乙酸盐和Tris缓冲液制剂。此外，有利的赋形剂似乎表现出与其不含赋形剂的等效物相似的热稳定性，其中乙酸盐pH 5.0、组氨酸pH 6.0和Tris pH 7.5的熔化温度分别为63.4℃、66.2℃和63.0℃。
将Tagg 266nm结果收集，并且表明制剂A、D、F、I、K和N显示出表明聚集的散射显著增加，随后在进一步加热期间强度下降。这是由于非常大的蛋白聚集体会沉淀并从溶液中掉出来。SLS只对溶液中的物种敏感，因此在沉淀后，测量的强度就会下降。对SLS计数与温度图的较仔细评估显示，制剂G、H和J的光散射在评估的温度范围内保持低于12,000个计数(H和J在该温度范围内低于10,000个计数)。相比之下，在之前的研究中，等效的无赋形剂缓冲液(组氨酸6.0)在高于30℃的温度下表现出10,000个计数的散射，不过在最高温度下持续到<20,000个计数(图16)。因此，需要对数据进行另一种解释，以根据导致光散射显著增加的真实聚集事件对制剂进行评级(图17至18)。总之，评级显示，制剂H和J(在温度范围内<10,000个计数)是最好的，其次是制剂O和P，其计数在高达55℃下持续SLS<10,000个计数，然后是相当的制剂B和G。还值得注意的是，与其不含赋形剂的缓冲液等效物相比，添加蔗糖、甘露糖醇和脯氨酸降低了散射计数。例如，添加甘露糖醇使最大散射计数从组氨酸pH6.0的约16,000降低到约5,000。
还收集了Tagg 473nm数据。就观察到的计数而言，与Tagg 266nm的数据相比，在473nm SLS数据中观察到类似的问题。因此，对制剂进行评级，并且观察结果的汇总为：
·A、D、F、I、K和N从溶液中“逃出”，导致不溶性颗粒
·C、E、L和M在高于25℃下表现出相当的散射，即约1,000-1,500
·B、G和J在95℃下的计数相当(约1,000)
·以及P在95℃下的散射与C、E、L、M相当，但后期变差
然而，值得注意的是，就473nm处的SLS而言，添加赋形剂似乎导致了更多的散射。总之，蔗糖、甘露糖醇和脯氨酸是更期望的赋形剂，并且组氨酸pH 6是更有利的缓冲液。最不期望的赋形剂是氯化钠和精氨酸。
动态光散射
DLS实验是在离心(10,000x g，10分钟)以去除任何大颗粒后进行的，并使用DynaProTM Plate Reader II仪器对纯样品进行一式三份分析。使用括号内的BSA制剂(2mg/mL)来确认系统的适用性。在25℃下总共进行10次单独扫描，每个样品的采集时间为5秒。由软件的自相关功能产生的数据被手动策划为低累积拟合误差，因此那些单独的扫描被标记并从分析中去除。由于启用了自动衰减功能以确保最优的强度计数率，仪器实时自动确定每次测量的激光功率百分比。对于高计数率的测量，衰减被设置为100％，以保护检测器并最小化导致不可靠的低计数结果的激光功率。因此，排除了以标准化强度(每秒计数)为零和激光功率≤20％获取的数据。比较所得强度分布图以评估各种制剂组分对按强度的平均粒度(总体直径)、总体尺寸分布宽度参数(总体多分散性百分比，或％Pd)、CTI-1601单体的平均峰直径(峰1直径)以及该峰的宽度参数(峰1的％Pd)的影响。然而，重要的是注意到较大的颗粒比较小的颗粒散射更多，所以强度分布图并不代表溶液中的粒度分布(即直径约30nm的颗粒不一定比直径约5nm的颗粒更多)，而是代表确定的粒度直径群体的图形表示。此外，分析通常不区分单体和二聚体物种，因为仪器只能区分半径大3-5倍的颗粒。多分散性百分比(总体或峰1)是反映在强度分布图中检测到的异质性的宽度参数，其中％Pd<20％表明近单分散的溶液和/或物种构象，并且如果由于高度的异质性而不能准确地确定数值，则生成“多模式”结果。
考虑到制剂A、D、F、I、K和N的蛋白回收率≤50％，那些样品的数据不包含在数据驱动结论中。单体峰直径结果的权重更高，因为总体直径值因较大颗粒的散射而出现偏差，并且因此并不总是准确地反映粒度分布。差的累积拟合(相关函数中的基线高)通常是数量波动的结果-在DLS测量过程中散射体积内颗粒数量的变化。这些可能是由大颗粒/聚集体的存在造成的。
总的来说，根据目前的DLS数据，更期望的制剂似乎是组氨酸pH 6.0，甘露糖醇制剂中的单体峰略小。然而，甘露糖醇的结果与不含赋形剂的制剂相当，并且单体的多分散性数据似乎有利于脯氨酸。
讨论
来自氯化钠和精氨酸制剂的缓冲液交换的蛋白回收率差，无论缓冲液类型如何，都表明与TAT-FXN融合蛋白的相容性。静态光散射数据和熔化温度证实了这一点。由于数据集有限，DLS数据难以解释。除了与蔗糖赋形剂存在有关的数据之外，组氨酸pH6.0的数据更完整。总之，组氨酸pH 6.0表现得更好，并且建议在随后的溶解度研究中进一步评估。不建议对精氨酸和氯化钠作进一步评估。
溶解度筛选
根据从基线缓冲液和赋形剂筛选研究中收集的数据，对pH范围为6.0至7.5的九种制剂和三种赋形剂类型进行了溶解度评估。此外，还评估了含有和不含甘露糖醇/氯化钙的组氨酸pH 7.0制剂。
所有测试的样品制剂都能达到130mg/mL或更高的浓度，回收率为大约50％或更高。值得注意的是，这些高浓度的样品都显示出棕色的颜色。DLS结果显示所有的制剂都表现出高水平的散射，从而取消了分析。SEC结果显示基本相当的主要％。基于强度的SLS评级结果(作为浊度的代表)显示组氨酸pH 6.0是优选的。根据申办方的建议，氯化钙在制剂中具有重要意义，表面活性剂筛选被设计为允许评估蔗糖、甘露糖醇以及甘露糖醇与5mM氯化钙。在含有三种表面活性剂类型(PS80、PS20和P188)和无表面活性剂对照的组氨酸pH 6.0缓冲液中分析这些赋形剂。研究设计还允许纳入含三种表面活性剂类型(PS80、PS20和PF-68)和无表面活性剂对照的pH 7.5的Tris/甘露糖醇。
表面活性剂筛选
评估表面活性剂Polysorbate 80(Fischer Sci.C/N PI28329)、Polysorbate 20(Fischer Sci.C/N PI28320)和Pluronic F-68(Fischer Sci.C/N 24-040-032)与四种缓冲液和赋形剂制剂的组合以评估TAT-FXN融合多肽在冻融和搅拌应力期间的稳定性/聚集。研究的目标蛋白浓度为100mg/mL。使用Amicon Ultra离心过滤器(10kDa NMWL Ultracel再生纤维素膜，Millipore C/N UFC901096)对蛋白样品进行缓冲液交换并浓缩成不含表面活性剂的缓冲液-赋形剂组合。在每个预冲洗的浓缩器中，455mg的TAT-FXN融合多肽最初被缓冲液交换到适当的缓冲液中，进行多个离心和稀释循环，以实现>500倍的交换。在最后的缓冲液交换之后，将样品浓缩到2.5mL的体积，并将等效的缓冲液/赋形剂制剂汇集为总共4种不同的制剂。通过紫外可见光谱法(ε＝1.647ml/mg*cm)测量汇集的样品中的蛋白浓度。使用适当的缓冲液将汇集的缓冲液/赋形剂制剂标准化至100mg/mL，并分成四个等分试样(约2.5mL/等分试样)。将表面活性剂以规定的浓度掺入到适当的样品中(在不含表面活性剂的制剂中掺入等效体积的缓冲液-赋形剂)，并通过紫外可见光谱法确认样品中的蛋白浓度。含量结果显示在表20中；所有含量值在93mg/mL至109mg/mL范围内。
将每种样品分成三个等分试样(每个等分试样500-1000μL)，并在研究期间避光。使每种配制样品的一个等分试样经受经由冻融循环(低温瓶)的应力，使一个等分试样经受搅拌(玻璃瓶)，并且一个等分试样在整个研究中储存在室温下用作对照(玻璃瓶)。对于冻融循环，将样品在-80℃下冷冻至少2小时，然后拉出并使其融化至室温。如此重复，总共5个循环。将样品储存在2-8℃直到分析。对于搅拌应力，在室温下以600RPM搅拌样品3天。将最终样品储存在2-8℃直到分析。基于预期的45％的蛋白损失，本研究总共消耗了约7.3g的材料。作为对溶解度的初步评估，通过在500nm处测量纯样品吸光度来评估浊度，并评估视觉外观。通过天然静态光散射(SLS)、动态光散射(DLS)和尺寸排阻色谱法(SEC)评估蛋白在各种缓冲液中的物理稳定性。
视觉外观
评估配制用于表面活性剂筛选的样品的外观。经确定，冻/融和搅拌对视觉外观没有明显影响。所有样品看起来都是透明的，颜色略黄，没有可见颗粒。
浊度和静态光散射
将经受搅拌和冻融应力条件的样品评估为纯的以使用A500确定浊度。评估结果表明，没有观察到明确和一致的趋势，并且表面活性剂对A500的总体影响似乎是中性的。SLS结果表明，虽然稀释的样品集没有显示出与表面活性剂相关的明显趋势，但未稀释的样品显示出含有表面活性剂的样品的散射略高的趋势。然而，鉴于散射计数差的幅度小，动态范围不被认为高于测定变异性水平。
尺寸排阻色谱法
使用SEC评估所有用和不用表面活性剂配制并经受搅拌应力和冻/融应力的样品以及无应力的对照样品(储存在2-8℃)的纯度。对无应力、搅拌应力和冻/融应力样品的评估结果表明，所有的样品都显示出明显的HMW和主峰，没有检测到LMW。值得注意的是，数据显示，与不含表面活性剂或含PS20的样品相比，PS80和P F-68始终表现出更大的％HMW。此外，在无表面活性剂对照与含有PS20的制剂之间的比较中，在无应力、搅拌和冻/融条件下，纳入PS20似乎略有益处。
动态光散射
收集离心的表面活性剂研究样品的光散射数据。将经受搅拌和冻/融应力条件的样品在适当的制剂缓冲液(不含表面活性剂)中稀释到目标2mg/mL，并在三次重复中分析其尺寸和多分散性。结果表明，根据总体直径，与无表面活性剂和含有P F-68的样品相比，Polysorbate表面活性剂似乎带来了更大的胶体稳定性。然而，单个峰结果并没有显示出明显的趋势，从而进一步重新确认在总体直径数据中看到的趋势。
讨论
虽然视觉外观、A500、SLS和DLS的结果显示出表面活性剂通常具有中性影响，但SEC的结果表明与纳入PS20有关的积极影响。SEC数据显示，在所有应力条件下，与其他制剂相比，含有PS20的样品显示出一致的、尽管很小的(约1％至2％)的％HMW降低。由于PS20的影响相对小并且限于SEC，因此将进一步评估PS20的纳入。
实验设计(DOE)
为了确定SEQ ID NO:1的TAT-FXN融合多肽的表现最佳制剂，准备了DOE研究来评估在短期加速稳定性下pH、赋形剂类型和PS20对TAT-FXN融合多肽的影响。用于研究的制剂显示在下表9中。
表9.用于DOE研究的制剂
*含有50mg/mL的TAT-FXN融合多肽
**含有100mg/mL的TAT-FXN融合多肽
DOE研究涉及评估100mg/mL的含和不含氯化钙的含pH 5.5至6.5的组氨酸以及两种赋形剂(蔗糖和甘露糖醇)的制剂。此外，PS20的纳入被作为分类因素而包括。最后，分析四(4)种偏离DOE制剂，从而1)帮助与目前含有50mM乙酸盐pH 5.0，1％PPG的制剂进行桥接，以及2)评估50mg/mL和100mg/mL的制剂效果。
样品制备
根据60％的蛋白回收率史，本研究中总共使用了11.6g的TAT-FXN融合多肽以适应750μL的小瓶灌装。将三个独立批次的材料汇集、混合并过滤以用作起始材料。将蛋白样品缓冲液交换到缓冲液/赋形剂组合中。对样品进行缓冲液交换并使用10kDa MWCO Amicon-15浓缩器(Millipore P/N UFC901096)浓缩。通过向过滤器中添加15mL的溶液，用适当的缓冲液交换溶液预冲洗浓缩器，然后以约3500x g离心8分钟。
对于每个目标100mg/mL制剂A-FF和JJ，使用四(4)个Amicon-15浓缩器单元(每个浓缩器81.25mg)对总共325mg的TAT-FXN融合多肽进行缓冲液交换。以3500x g离心样品直到达到约5mL的体积。对于单一DOE中心点制剂B、F、J、N、R、V、Z和DD以及偏离DOE制剂JJ，在每个浓缩器单元中额外添加8.125mg材料以占据粘度测试所需的样品体积。以添加10mL缓冲液然后通过离心将体积减少到约5mL的循环继续缓冲液交换过程，总共进行了六(6)次缓冲液交换并且总稀释度为约700倍。在最后的缓冲液交换循环后，将单一中心点制剂保留物浓缩到每个浓缩器约0.55mL，而将其他保留物浓缩到每个浓缩器0.5mL，然后从浓缩器单元中回收。
对于每个目标50mg/mL偏离DOE制剂GG、HH和II，使用三(3)个Amicon-15浓缩器单元(每个浓缩器59.58mg)对178.75mg材料进行缓冲液交换。以3500x g离心样品直到达到约3.5mL的体积。以添加11.5mL缓冲液然后通过离心将体积减少到约3.5mL的循环继续缓冲液交换过程，总共进行了四(4)次缓冲液交换。在另一个最后的缓冲液交换循环中，将4mL缓冲液添加到保留物中，然后离心，最终总稀释度为约700倍。在最后的缓冲液交换循环后，将保留物浓缩到约0.7mL，然后从浓缩器单元中回收。将等效保留物样品汇集，总共15个样品，然后通过紫外可见光谱法(ε＝1.647ml/mg*cm)确定蛋白浓度。再次测量蛋白含量，然后使用适当的缓冲液标准化至目标浓度。记录样品的回收体积以评估蛋白回收率。随后将保留物池1-13分成2个等分试样。在标准化步骤期间，在其中一个等分试样中将Surfact-Amps 20溶液添加至0.05％(根据CofA的准确Surfact-Amps 20浓度计算)。在标准化之后，将汇集的制剂拆分，最终共有36个制备的制剂。使用Ultrafree-CL GV 0.22μM无菌浓缩器将制剂无菌过滤。为了无菌过滤，将全部体积的各制剂转移到单独的无菌过滤器，只打开过滤器的顶部部分。Ultrafree-CL单元以约3200x g旋转5分钟，直到整个溶液通过0.22μM的膜。离心后，在装瓶时在生物安全柜(BSC)内重新打开过滤单元。在使用之前，将BSC打开至少15分钟，然后用70％的IPA喷射。所有进入的物品在进入前都用70％的IPA进行喷洒。每个制剂共填充2个小瓶(0.75mL的填充体积)，剩余物残留在无菌过滤器中用于供测试的T0样品，除了外观以外，使用装入小瓶的材料进行测试，然后分期。使用各制剂的小瓶中的一个进行T＝0外观，然后分期。将各制剂的一个小瓶放在5℃，并且另一个小瓶放在40℃/75％RH，孵育3周。
外观
外观结果表明，对于T0和3W 5℃的样品，所有制剂看起来都是透明的，颜色略黄，并且没有可见颗粒。3W 40℃的样品也是看起来透明的，颜色略黄，并且没有可见颗粒。然而，应力样品似乎是高度粘稠的，制剂Q、U和I似乎已经固化。
蛋白含量
蛋白含量的结果表明，虽然可观察到储存和热应力的影响，但一般来说，数据的可见趋势不明显。
浊度
经由A550评估所有样品的浊度，并且结果表明，从结果中没有观察到可见趋势。
pH
测量样品pH并且结果表明，除制剂H和JJ之外，制剂展示出的pH值都在目标pH的0.2个pH单位内。制剂H(100mg/mL/组氨酸/蔗糖/pH 6.5)表现出的pH为6.9，并且制剂JJ(100mg/mL/乙酸盐/蔗糖/pH 5.5)表现出的pH值为6.0。由于这种pH漂移是这些样品所特有的，并且似乎不是整体问题，所以统计数据分析将考虑表观pH。
渗透压和粘度
测量了所有中心点制剂的渗透压，并且结果表明制剂渗透压似乎比预期渗透压高，数值范围为351mOsm至425mOsm。高渗透压结果可能是由制剂缓冲液造成的，因为这些缓冲剂也表现出相当范围内的渗透压(292mOsm至367mOsm)。
粘度测量以3个不同的锥状芯轴转速(扭矩％范围为10-100)进行。如果表观粘度不随剪切速率的变化而变化，则样品的行为方式符合牛顿学说。如果表观粘度随剪切速率的变化而变化，则样品的行为方式不符合牛顿学说。假塑性流体展示出随剪切速率增加而降低的粘度。膨胀剂展示出随剪切速率增加而增加的粘度。结果表明，所有样品都显示出符合牛顿学说的行为。50mg/mL样品显示出的平均粘度结果范围为1.8cP至2.9cP。对于100mg/mL样品，含有PS20的样品始终显示出比不含PS20的样品更低的cP值，并且这些值的范围为14.7cP至28.5cP。应该注意的是，含有氯化钙的制剂比不含氯化钙的制剂表现出更高的cp值。
动态光散射
DLS结果表明，40℃的热应力导致存在聚集体。值得注意的是，3W/40℃的样品显示出总体直径大小的增加，以及测试制剂的多个不同物种。虽然可以注意到应答差异，但基于视觉评估的一般趋势并不明显。因此，应充分利用该数据集的统计分析，以确定显著趋势。
尺寸排阻色谱法
SEC结果表明，5C和40C条件下的％HMW结果都证实了pH依赖性，最优pH水平为5.5和6.5。此外，不含氯化钙的制剂似乎是优选的。最后，PS20的存在对主要％的影响一般是中性的。以50mg/mL配制的偏离DOE的样品显示存在浓度依赖性影响，并且50mg/mL显示较低的％HMW。
非还原CGE
非还原(NR)CGE结果表明，由于这些制剂表现出更高的％HMW，因此不优选纳入氯化钙。此外，纳入PS20似乎是略微优选的。这些观察结果与SEC结果一致，但是不能清楚地看出依赖于pH的趋势
还原CGE
还原(R)CGE数据与NR CGE结果直接相关，并且也与SEC数据一致。5℃的％HMW结果显示出pH依赖性，其中pH 5.5制剂显示出较低的％HMW。在这些数据中，PS20的作用并不明确并且可以被认为是中性因素。同样，氯化钙也没有被注意到为制剂提供明显益处。
反相HPLC
RP HPLC结果表明，pH和赋形剂之间的视觉趋势并不明显，并且制剂是基本相当的。值得注意的是，主要％峰数据(特别是5℃条件下)显示出进一步支持不需要氯化钙，并且在液体制剂中可能没有益处。
CEX
CEX结果表明，制剂之间的差异不是特别明显。尽管制剂之间在酸性％、主要％和碱性％方面存在差异，但没有发现明显的视觉趋势。
实验设计：优化分析
使用Design-Expert 9软件进行DOE数据的分析。各制剂的缓冲液和赋形剂类型被输入为分类变量，而目标pH被输入为数字变量。单独测试分析结果的统计学显著性，其中收集的5℃和3W 40℃的数据被视为单独的应答。只有被认为显著的数据集(拟合模型的p值<0.05)才被用于优化分析的模型。在多个数据集或属性对同一项表现出显著性的情况下，包含具有最高R2的数据集。
总之，模型采用了来自以下的数据：5℃NR-CGE％HMW，40℃NR-CGE％HMW，5℃RCGE主要％，40℃R-CGE主要％，5℃SEC主要％，40℃SEC主要％，5℃RP主要，40℃RP主要和5℃SLS 473nm。数值优化分析的最终输出是缓冲液/pH/赋形剂的组合及其相关的合意性因素。合意性是目标函数，范围从0(无合意性)到1(最优目标)。在这里使用的过程中，每个应答都被赋予了单独的目标，其中数值优化找到了使用单一合意性函数使所有目标最大化的点。对于单独的应答，根据DOE样品获得的动态值范围，将目标设定为在定义的上限和下限范围内最大化或最小化数值。在DOE分析中，可以通过改变权重(0.1-10.0)和相对重要性(+至+++)来调整给定应答的优化目标。在本研究中，所有的应答权重都保持在1.0，导致在指定的极限范围内出现线性合意性。应答重要性在三个曲线内变化，以测试优化过程的稳健性，即评估不同重要性曲线对最终优化制剂的影响。
总之，分析结果表明纳入氯化钙是不利的，并且PS20对蔗糖和甘露糖醇制剂都是有益的。蔗糖和甘露糖醇之间的差异是细微的，并且根据分析数据，两者似乎高度相当。然而，与甘露糖醇相比，蔗糖是优选的，因为它能够直接作为冻干制剂应用，而甘露糖醇则需要在冻干制剂中与其他赋形剂结合。pH为5.5至6.2的制剂似乎是最优的。这些趋势也可以从经由表格和图解释数据中得到证实。根据配制前研究的数据和DOE的统计分析，鉴定了以下两种候选制剂：
1.20mM组氨酸，250mM蔗糖，0.05％PS20，pH 5.8
2.20mM组氨酸，250mM甘露糖醇，0.05％PS20，pH 5.8
结论
本报告中呈现的配制前开发研究的主要目的是鉴定使液体制剂中的SEQ ID NO:1的TAT-FXN融合多肽在应力和非应力条件下产生最优物理、热、化学和结构稳定性的制剂组分。为此，在基线缓冲液评估、赋形剂、溶解度和表面活性剂筛选研究以及最后的实验设计研究过程中，对几种缓冲液类型、pH条件、赋形剂和表面活性剂进行反复评估。基于这些研究，用于初步临床评估的最终制剂被确定为在20mM组氨酸，250mM蔗糖，0.05％polysorbate20，pH 5.8中的50mg/mL CTI-1601。替代制剂被确定为在20mM组氨酸，250mM甘露糖醇，0.05％polysorbate 20，pH 5.8中的50mg/mL CTI-1601。
实例2.鉴定TAT-FXN融合多肽的冻干制剂
考虑到SEQ ID NO:1的TAT-FXN融合多肽一般具有热不稳定性，该研究的目的是对该分子进行冻干研究。冻干配制前开发研究的主要目的是鉴定使冻干的TAT-FXN融合多肽在应力和非应力条件下产生最优化学、物理和结构稳定性的制剂。
冻干的SEQ ID NO:1的TAT-FXN融合多肽的稳定性使用组氨酸pH 5.8作为碱缓冲液，蔗糖作为主要赋形剂和一组次要赋形剂(包含冻干治疗制剂中常用的甘露糖醇)以及更多非常规的还原剂(如抗坏血酸、谷胱甘肽和半胱氨酸)进行评估。根据以前的配制前研究选择制剂组。测试制剂显示在下表10中。
表10.TAT-FXN融合多肽冻干开发制剂
在开始任何冻干活动之前，通过缓冲液交换过程制备在表10所示的十二(12)种制剂中的每一种中配制的约1.0mL的TAT-FXN融合多肽。在透析过程后，测量的蛋白浓度略低于目标50mg/mL，因此样品被标准化至40mg/mL。为了弥补浓度差异造成的任何潜在影响，在标准化之前，取出每个配制样品的一(1)毫升等分试样。将该样品装入小瓶并冻干作为较高浓度的代表，称为标准化前的冻干，并在T0进行测试。在最终标准化至40mg/mL期间，使用10％(w/v)的储备溶液将表面活性剂(PS20)添加到所有制剂中至0.050％。在缓冲液交换和标准化之后，使用0.2μm的无菌过滤瓶对制剂进行无菌过滤。
玻璃化转变温度(Tg')确定
使用差示扫描量热法确定冷冻浓缩溶液的玻璃化转变温度(Tg')。Tg'以及赋形剂的结晶行为是重要的物理化学特性，其指导冷冻干燥的循环开发，具体是确定主要的干燥温度，一般设定至Tg'范围或低于Tg'的范围。转变温度范围为-36.9℃至-27.2℃，这对于含有蔗糖和甘露糖醇的制剂来说是在预期之内的。在十二种Tg'评估制剂中，选择前6种(表10中所示的制剂A-F)用于冻干开发研究。
冻干和短期稳定性
冻干循环由最初的退火步骤组成，其中温度从-50℃循环到-20℃，持续几个小时，以使含有甘露糖醇的制剂完全结晶。在退火步骤之后，通过将压力设置在100mTorr并将搁板温度升至-25℃来启动初级干燥，在初级干燥下保持循环3184min(约53h)。一旦初级干燥完成后，就通过升温到30℃并保持600min(10h)，进行二级干燥以去除任何剩余的水分。总冻干循环持续时间为4989min(约3.5天)。在循环结束时，用分压为约570Torr的氮气回填小瓶，盖上瓶塞并适当密封。
外观
所有冻干的饼状物在整个短期稳定性中都显示出完整的白色结构，制剂D除外，观察到其颜色是红褐色的。这种红褐色的颜色很可能是由作为还原剂添加到制剂中的抗坏血酸造成的。在重构和冷冻对照后，观察到所有样品类型、时间点和条件的液体外观都是透明的，并且没有可见的颗粒。然而，颜色略有变化，所有制剂D样品颜色都略红除外，观察到其余的T0样品均是无色的，而观察到2周和4周的时间点条件是略带黄色的。总之，没有观察到对样品外观的重大影响。
残留水分
总的来说，残留水分含量的结果在0.3％-1.6％范围内，与储存在40℃的4周时间点样品有关的水分值较高。制剂D表现出最高的总体水分含量，而制剂A和C总体上表现出较低水分的饼状物。
重构时间
每个小瓶中的材料在68秒时段内完全溶解，没有留下可见的残留物或未溶解的物质。
pH
所有样品的pH确定为5.7±0.1。
A280含量
在所有时间点和条件下，测量的A280含量值范围为36.5mg/mL至49.9mg/mL。
浊度
在所有时间点和条件下测量的所有样品在320nm处的浊度表明，制剂F的T0和-75℃的样品的浊度略微升高。制剂A和B在2周和4周的时间点表现出最低的浊度值，与条件无关。
渗透压
测量所有样品的渗透压，并且在所有时间点和条件下结果范围为278-366mOsm/kg。
Ellman(游离硫醇)
使用Ellman试剂对TAT-FXN融合多肽内的还原巯基进行量化。制剂A和B在所有时间点和条件下都表现出游离硫醇与TAT-FXN融合多肽的摩尔比为约1。T0液体对照、4周冷冻对照和T0重构的制剂C表现出游离硫醇与TAT-FXN融合多肽的摩尔比为<0.5，表明在该制剂中并且在这些条件下，TAT-FXN融合多肽可能被轻微氧化。在所有时间点和条件下，制剂D都显示出游离硫醇与TAT-FXN融合多肽的比率低，表明抗坏血酸的存在似乎没有提供整体的还原环境，并且大部分蛋白处于其氧化状态。
由于含有硫醇化合物、半胱氨酸和谷胱甘肽的存在，没有评估制剂E和F的游离硫醇。游离硫醇的结果与IEC所得的结果一致。
微流成像(MFI)
通过MFI评估粒度分布和形态。所有制剂的总颗粒计数一般都在可接受的限度内。形态学过滤器表明存在硅酮液滴和气泡/砂眼，这使得在≥2和≥5尺寸范围的计数稍高。然而，应用于选择蛋白颗粒的形态学过滤器显示，冻干样品的计数低于液体和冷冻对照样品，表明缺乏较大尺寸的颗粒。
尺寸排阻色谱法(SE-UPLC)
通过SEC评估TAT-FXN融合多肽的主峰纯度和更高阶的聚集体。在制剂A、B、C、E和F中的冻干TAT-FXN融合多肽和对照在所有时间点和条件下都表现出相对主峰纯度>97％。另一方面，在所有时间点和条件下，制剂D均表现出较高分子量物种的相对面积>14％。针对SEC观察到的结果与RP-HPLC结果相关。
离子交换色谱法(IE-HPLC)
通过阳离子交换色谱法评估电荷异质性和化学修饰如氧化。在六种制剂中，制剂A、B和C表现出的总相对主峰面积最高，而制剂D表现出的总相对主峰面积最低。在所有制剂和条件中，制剂A表现出的主峰减少百分比最高。
反相色谱法(RP-HPLC)
通过反相色谱法评估TAT-FXN融合多肽的纯度。在所有制剂和条件中，制剂A和B显示出的主峰纯度最高。
结论
考虑到SEQ ID NO:1的TAT-FXN融合多肽一般具有热不稳定性，该研究的目的是对该分子进行冻干研究。冻干配制前开发研究的主要目的是鉴定使冻干的TAT-FXN融合多肽在应力和非应力条件下产生最优化学、物理和结构稳定性的制剂。该研究采用了液体制剂筛选期间鉴定的适合冻干的缓冲液/赋形剂组合(含蔗糖和/或甘露糖醇的组氨酸缓冲液)，并且存在可以促进蛋白整体还原环境的添加剂，如抗坏血酸、半胱氨酸和谷胱甘肽。对于冻干循环的开发，对配制入六(6)种不同缓冲液的TAT-FXN融合多肽进行共同的保守冻干循环。所有冻干制剂的目标蛋白浓度为40.0mg/mL。根据冻干配制前研究的结果，选择20mM组氨酸，250mM蔗糖，0.05％PS20，pH 5.8作为TAT-FXN融合多肽的最合适的制剂。与所有评估的冻干药物制剂相比，该制剂为目标浓度为40mg/mL的TAT-FXN融合多肽赋予最大的化学、物理和构象稳定性，并且该制剂也是目前的液体制剂。
实例3.TAT-FXN融合蛋白的液体药物组合物的稳定性数据
本研究的目的是确定本公开的药物组合物的稳定性。该药物组合物含有在20mM组氨酸，250mM蔗糖，0.05％polysorbate 20，pH 5.8中的浓度为50mg/mL的SEQ ID NO:1的TAT-FXN融合多肽。将该药物组合物以液体形式在2mL的玻璃瓶中(填充1.2mL)在≤-60℃的温度下储存长达24个月，并在不同的时间点评估该制剂的稳定性。下表11中呈现了稳定性评估的结果。
表11.在≤-60℃下的稳定性研究结果
*NT＝未测试。
*TBD＝待确定。
稳定性研究的结果表明测试的组合物在≤-60℃的温度下稳定至少24个月。
进行类似研究以确定含有在20mM组氨酸，250mM蔗糖，0.05％polysorbate 20，pH5.8中的浓度为50mg/mL的SEQ ID NO:1的TAT-FXN融合多肽的药物组合物在-20℃±5℃下的稳定性。下表12中呈现了该研究针对24个月的时间点的结果。
表12.在-20℃±5℃下的稳定性研究结果
稳定性研究的结果表明测试的组合物在-20℃±5℃的温度下稳定至少24个月。
Claims (65)
1.一种药物组合物，其包括融合多肽、药学上可接受的赋形剂和药学上可接受的载体，其中
所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；
所述融合多肽以大于约10mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述药物组合物稳定至少1个月。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述药物组合物在选自由以下组成的群组的温度下稳定至少1个月：约-60℃或更低；约-25℃至约-15℃、约2℃至约8℃；和约20℃至约30℃。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约99％序列同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述融合多肽包括SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述融合多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述融合多肽以约15mg/mL至约50mg/mL、约20mg/mL至约75mg/mL或约25mg/mL至约100mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述融合多肽以大于约15mg/mL、大于约20mg/mL、大于约25mg/mL、大于约30mg/mL、大于约35mg/mL、大于约40mg/mL、大于约45mg/mL、大于约50mg/mL、大于约55mg/mL、大于约60mg/mL、大于约65mg/mL、大于约70mg/mL、大于约75mg/mL、大于约80mg/mL、大于约85mg/mL、大于约90mg/mL、大于约95mg/mL或大于约100mg/mL的浓度存在于所述药物组合物中。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的药物组合物，其中所述融合多肽以约15mg/mL或更大、约20mg/mL或更大、约25mg/mL或更大、约30mg/mL或更大、约35mg/mL或更大、约40mg/mL或更大、约45mg/mL或更大、约50mg/mL或更大、约55mg/mL或更大、约60mg/mL或更大、约65mg/mL或更大、约70mg/mL或更大、约75mg/mL或更大、约80mg/mL或更大、约85mg/mL或更大、约90mg/mL或更大、约95mg/mL或更大或约100mg/mL或更大的浓度存在于所述药物组合物中。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，其中所述融合多肽以约25mg/mL至约150mg/mL的浓度存在于所述药物组合物中。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其中所述融合多肽以约50mg/mL的浓度存在于所述药物组合物中。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的药物组合物，其中所述融合多肽以约100mg/mL的浓度存在于所述药物组合物中。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂选自由盐、糖、氨基酸或其组合组成的群组。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂是盐。
16.根据权利要求15所述的药物组合物，其中所述盐选自由氯化钠(NaCl)和氯化钙(CaCl2)组成的群组。
17.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂是氨基酸。
18.根据权利要求17所述的药物组合物，其中所述氨基酸选自由精氨酸和脯氨酸组成的群组。
19.根据权利要求14所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂是糖。
20.根据权利要求19所述的药物组合物，其中所述糖选自由蔗糖和甘露糖醇组成的群组。
21.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述糖是蔗糖。
22.根据权利要求20所述的药物组合物，其中所述糖是甘露糖醇。
23.根据权利要求19至22中任一项所述的药物组合物，其中所述糖以约1mM至约500mM的浓度存在于所述药物组合物中。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其中所述糖以约100mM至约300mM、约200mM至约450mM或约250mM至约500mM的浓度存在于所述药物组合物中。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述糖以约250mM的浓度存在于所述药物组合物中。
26.根据权利要求1至25中任一项所述的药物组合物，其进一步包括缓冲液。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述缓冲液选自由乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、磷酸盐和Tris组成的群组。
28.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述缓冲液选自由乙酸盐、组氨酸和Tris组成的群组。
29.根据权利要求26所述的药物组合物，其中所述缓冲液是组氨酸。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲液以约5mM至约500mM的浓度存在于所述药物组合物中。
31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述缓冲液以约5mM至约50mM、约25mM至约150mM、约50mM至约250mM或约100mM至约500mM的浓度存在于所述药物组合物中。
32.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述缓冲液以约20mM的浓度存在于所述药物组合物中。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为约4.0至约8.5。
34.根据权利要求33所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为约5.0至约7.0。
35.根据权利要求34所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为约5.8。
36.根据权利要求1至35中任一项所述的药物组合物，其进一步包括表面活性剂。
37.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述表面活性剂是非离子型表面活性剂。
38.根据权利要求36或37所述的药物组合物，其中所述表面活性剂选自由聚氧乙烯二醇辛基酚醚(Triton-X 100)、聚氧乙烯二醇烷基酚醚(Nonoxynol-9)、聚氧乙烯二醇脱水山梨糖醇烷基酯(Polysorbate)、脱水山梨糖醇烷基酯(Span)和聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物(Poloxamer)组成的群组。
39.根据权利要求38所述的药物组合物，其中所述表面活性剂是聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)。
40.根据权利要求36至39中任一项所述的药物组合物，其中所述表面活性剂以约0.0001％w/v至约1％w/v的浓度存在于所述药物组合物中。
41.根据权利要求36所述的药物组合物，其中所述表面活性剂以约0.0001％w/v至约0.1％w/v、约0.01％w/v至约0.5％w/v、约0.05％w/v至约1％w/v、约0.01％w/v至约0.1％w/v、约0.005％w/v至约0.5％w/v或约0.001％w/v至约1.0％w/v的浓度存在于所述药物组合物中。
42.根据权利要求41所述的药物组合物，其中所述表面活性剂以约0.05％w/v的浓度存在于所述药物组合物中。
43.根据权利要求1至42中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体是水。
44.一种药物组合物，其包括融合多肽、药学上可接受的赋形剂、药学上可接受的载体、缓冲液和表面活性剂，其中
所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且
所述融合多肽以大于约10mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
45.根据权利要求44所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的赋形剂是蔗糖。
46.根据权利要求44或45所述的药物组合物，其中所述缓冲液是组氨酸。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的药物组合物，其中所述表面活性剂是聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)。
48.根据权利要求1至47中任一项所述的药物组合物，其中所述药学上可接受的载体是水。
49.一种药物组合物，其包括融合多肽、蔗糖、组氨酸、聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中
所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且
其中所述融合多肽以大于约10mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
50.一种药物组合物，其包括融合多肽、250mM蔗糖、20mM组氨酸、0.05％w/v聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中
所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且
其中所述融合多肽以大于约10mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
51.一种药物组合物，其包括融合多肽、甘露糖醇、组氨酸、聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中
所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且
其中所述融合多肽以大于约10mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
52.一种药物组合物，其包括融合多肽、250mM甘露糖醇、20mM组氨酸、0.05％w/v聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中
所述融合多肽包括与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列；并且
其中所述融合多肽以大于约10mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
53.一种药物组合物，其包括融合多肽、250mM蔗糖、20mM组氨酸、0.05％w/v聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中
所述融合多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；并且
其中所述融合多肽以约50mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
54.一种药物组合物，其包括融合多肽、250mM甘露糖醇、20mM组氨酸、0.05％w/v聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(Polysorbate 20)和水，其中
所述融合多肽由SEQ ID NO:1的氨基酸序列组成；并且
其中所述融合多肽以约50mg/mL的浓度存在于所述组合物中。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物表现出稳定性。
56.根据权利要求1至54中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物呈冻干形式。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物适用于注射。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物适用于皮下注射。
59.根据权利要求55所述的药物组合物，其中所述药物组合物呈液体形式，并且在约-60℃或更低的温度下储存时稳定至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约13个月、至少约14个月、至少约15个月、至少约16个月、至少约17个月、至少约18个月、至少约19个月、至少约20个月、至少约21个月、至少约22个月、至少约23个月或至少约24个月。
60.根据权利要求55所述的药物组合物，其中所述药物组合物呈液体形式，并且在约-25℃至约-15℃的温度下储存时稳定至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约13个月、至少约14个月、至少约15个月、至少约16个月、至少约17个月、至少约18个月、至少约19个月、至少约20个月、至少约21个月、至少约22个月、至少约23个月或至少约24个月。
61.根据权利要求56所述的药物组合物，其中所述药物组合物在约2℃至约8℃的温度下储存时稳定至少约1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约13个月、至少约14个月、至少约15个月、至少约16个月、至少约17个月、至少约18个月、至少约19个月、至少约20个月、至少约21个月、至少约22个月、至少约23个月或至少约24个月。
62.根据权利要求56所述的药物组合物，其中所述药物组合物在约20℃至约30℃的温度下储存时稳定至少约1个月、至少约2个月、至少约3个月、至少约4个月、至少约5个月、至少约6个月、至少约7个月、至少约8个月、至少约9个月、至少约10个月、至少约11个月、至少约12个月、至少约13个月、至少约14个月、至少约15个月、至少约16个月、至少约17个月或至少约18个月。
63.一种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用根据权利要求1至62中任一项所述的药物组合物，使得所述受试者的所述疾病得到治疗或预防。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述疾病是弗里德赖希共济失调(FRDA)。
65.根据权利要求63所述的方法，其中所述疾病是FRDA相关的疾病。
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