KR20230131212A

KR20230131212A - 안정화제를 사용하지 않고도 안정한, 탄파너셉트를포함하는 안과용 조성물

Info

Publication number: KR20230131212A
Application number: KR1020237024247A
Authority: KR
Inventors: 박승국; 안혜경; 정미진; 심혜은
Original assignee: 한올바이오파마주식회사
Priority date: 2021-01-14
Filing date: 2022-01-13
Publication date: 2023-09-12
Also published as: US20240059768A1; JP2024503462A; CN116981442A; CA3207852A1; TW202245823A; EP4279066A1; WO2022154529A1

Abstract

본 발명은 안정화제를 사용하지 않고도 안정한, 탄파너셉트를 포함하는 안과용 조성물, 및 상기 조성물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다. 히스티딘, 수크로스와 같은 안정화제의 사용이 탄파너셉트 유래의 산성/염기성 변이체 등의 불순물의 생성을 야기하고, 생물학적 활성에 영향을 주는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 본 발명에 따른 안과용 약학 조성물은 이러한 안정화제의 사용을 배제하는 대신 pH를 조절하여 냉장저장 조건뿐 아니라 가속조건 및 가혹조건에서도 이러한 불순물의 생성을 현저히 감소시켜 안정한 탄파너셉트 안과용 조성물을 제조할 수 있다.

Description

안정화제를 사용하지 않고도 안정한, 탄파너셉트를 포함하는 안과용 조성물

본 발명은 안정화제를 사용하지 않고도 안정한, 탄파너셉트를 포함하는 안과용 조성물, 및 상기 조성물의 제조 및 사용 방법에 관한 것이다.

일반적으로 눈에 국소 투여하기 위한 치료제는 액체 또는 겔 형태 중 하나로 제형화되며, 투여시까지 무균상태로 안정하게 유지되어야 한다. 이러한 안과용 용액은 완충액, 다양한 계면활성제, 안정화제, 등장화제 등을 함유하며 이들은 안과용 조성물이 사용자에게 더욱 편해지도록 보조한다. 안과용 용액의 효능 및 상업화에 특히 중요한 것은 용액의 안정성이다. 용액 안정성은 제제 중에 존재하는 모든 화합물들의 상호작용, 뿐만 아니라 온도 및 pH에 따라 달라질 수 있다.

단백질 함유 약학 조성물은 최적의 조건이 아닌 조건에서 물리화학적으로 변성이 일어난다. 특히, 단백질의 농도, 완충제의 종류, 안정화제의 종류 및 농도, 유기 공용매의 종류 및 농도, 염의 농도, pH, 온도, 공기와의 접촉 등의 요인은 단백질의 산화(oxidation), 탈아미드화(deamidation), 이성질체화(isomerization), 다합체화(polymerization) 등에 상당한 영향을 미친다. 이러한 변성은 단백질의 응집(aggregation), 단편(fragment) 및 이성질체(isomer)를 생성시켜 생리 활성을 감소시킬 수 있다.

한편 종양괴사인자(TNF-α)는 단핵구 및 대식세포를 포함하는 많은 세포 유형에 의해 생산되는 사이토카인이다. TNF-α는 감염증, 자가면역질환, 패혈증, 이식거부 등 다양한 기타 인간 면역질환에 연관되어 있다. TNF-α의 과도한 발현은 인간 질환에서의 부정적인 결과를 초래하기 때문에 치료제로서의 방향은 TNF-α의 활성을 제어거나 상쇄시키는 방향으로 고안되어 왔다. 이에 TNF-α에 결합하여 중화시키는 항체를 개발하여 다양한 단백질 제제로 판매되고 있다. 그러나 이 항 TNF-α 항체 제제는 큰 분자량으로 인해 국소부위에서 유발되는 염증질환에는 제제가 효율적으로 도달하지 못하는 한계가 있다. 이에 본 출원인은 작은 크기의 높은 활성을 가짐으로서 국소 염증질환 치료에 적합한 폴리펩티드 분자를 개발한 바 있다. 본 발명의 TNF-α 저해제인 변형된 인간 종양 괴사 인자 수용체-1 폴리펩티드, 탄파너셉트는 출원인의 특허출원인 대한민국 공개특허공보 제2012-0072323호에 개시되어 있으며 이의 안구건조증에 대한 치료 용도도 대한민국 공개특허공보 제2013-0143484호에 기술되어 있다.

대한민국 공개특허공보 제2012-0072323호 대한민국 공개특허공보 제2013-0143484호

단백질 조성물은 보관수명이 화학합성의약품에 비해 보관기간이 짧을 수 있고, 또한 보관기간 동안 유발되는 전하 변이체나 응집물과 같은 물리화학적 불순물이 유발되어, 생물학적 활성이 저하될 수 있다.

본 발명은 탄파너셉트를 포함하는, 안정화제를 사용하지 않고도 안정한 안과용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명자들은 냉장저장 조건뿐 아니라 가속 및 가혹 조건에서 보관시에도 탄파너셉트 유래 불순물(산성/염기성 변이체)의 생성을 최소화할 수 있는 안과용 조성물을 개발하기 위하여 탄파너셉트의 안정성에 대한 다양한 연구를 수행하였다. 특히, 본 발명자들은 완충제, 등장화제, pH 범위, 기능성 부형제 등을 포함한 다양한 제제화 연구를 수행하였다. 그 결과 본 발명자들은 히스티딘, 수크로스와 같은 안정화제의 사용이 특정 pH에서는 오히려 산성/염기성 변이체를 생성시켜 탄파너셉트의 조성물의 안정성에 영향을 끼치는 것을 발견하였다. 이에 본 발명은 안정화제를 포함하지 않는 pH 5.0 내지 pH 6.5에서 안정한 탄파너셉트 안과용 조성물을 제공하고자 한다.

구체적으로, 본 발명은 탄파너셉트 및 pH 5.0 내지 pH 6.5의 완충 시스템을 포함하고, 안정화제를 실질적으로 포함하지 않는 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물을 제공한다.

탄파너셉트는 대한민국 공개특허공보 제2013-0143484호에서 개시하고 있는 TNFRI 변이체로, 천연형 TNFRI의 아미노산 서열의 41번 내지 211번으로 이루어진 아미노산 서열(TNFRI171)에서 L68V/S92M/H95F/R97P/H98G/K161N의 아미노산 변형을 포함하는 아미노산 서열로 표시된다.

탄파너셉트는 총 171개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드이므로, 일반적인 단백질 함유 약학 조성물이 그러한 것처럼 환자에게 투여하기 전까지 안정성을 확보하여 최선의 약효를 나타내도록 하는 것이 약물 개발에 있어서의 가장 중요한 이슈 중 하나이다.

탄파너셉트의 안정성을 확보할 수 있는 제제의 개발을 위해, 본 발명자들은 우선 탄파너셉트의 보관 안정성을 실험하였고, 그 결과 탄파너셉트가 보관 과정에서 전하 변이체를 형성하는 점이 관찰되었다(실험예 1). 본원에서 사용된 용어 "전하 변이체"는 단백질 또는 폴리펩티드의 천연 상태로부터 변형되어 단백질 또는 폴리펩티드의 전하가 달라진 것을 말한다. 일부 예에서, 전하 변이체는 본래의 단백질 또는 폴리펩티드보다 더 산성; 즉, 본래의 단백질 또는 폴리펩티드보다 낮은 pI값을 갖는다. 다른 예에서, 전하 변이체는 본래의 단백질 또는 폴리펩티드보다 더 염기성; 즉, 본래의 폴리펩티드보다 높은 pI값을 갖는다. 이러한 변형은 조작되거나 자연 과정, 예컨대 산화, 탈아미드화, 리신 잔기의 C-말단 프로세싱, N-말단 피로글루타메이트 형성, 및 비효소적 당화의 결과일 수 있다. 일부 예에서, 단백질 또는 폴리펩티드 전하 변이체는 단백질에 부착된 글리칸이, 예를 들어 시알산 또는 그의 유도체의 첨가에 의해 변형되어 당단백질의 전하가 모 당단백질과 비교하여 달라진 당단백질이다. 본원에서 사용된 "탄파너셉트 전하 변이체"는 탄파너셉트의 천연 상태로부터 변형되어 탄파너셉트의 전하가 달라진 물질이다.

전하 변이체는 일반적으로 약물의 활성 저하를 야기하는 점이 잘 알려져 있으므로 전하 변이체의 생성량을 일정 수준 이하로 관리하는 것이 필요하다. 이에 본 발명자들은 안과용 안정화제로 사용가능한 성분들을 이용하여 전하 변이체와 같은 불순물 발생을 최소화할 수 있는지 확인하였고, 일차적으로 수크로스와 히스티딘을 포함시키는 것이 바람직하다는 점을 확인하였다(실험예 2). 그러나, 탄파너셉트 함유 조성물의 적정 pH를 찾는 추가의 연구과정에서, 특정 pH에서는 이들 안정화제를 사용하더라도 전하 변이체의 생성율이 높고, 도리어 안정화제를 사용하지 않으면서 pH를 pH 5.0 내지 pH 6.5의 수준으로 조절하는 것이 전하 변이체의 생성율을 가장 낮출 수 있는 방법임을 확인하기에 이르렀다(실험예 3).

이에 본 발명은 탄파너셉트 및 pH 5.0 내지 pH 6.5의 완충 시스템을 포함하고, 안정화제를 실질적으로 포함하지 않는 탄파너셉트 함유 안과용 조성물을 제공한다.

탄파너셉트는 적정 함량으로 조성물 중에 포함하는 것이 바람직한데, 함량이 높아질수록 응집물과 같은 불순물의 함량이 증가할 수 있기 때문이다. 본 발명의 탄파너셉트 함유 안과용 조성물에 있어서, 탄파너셉트는 0.01 내지 10%(w/v), 예를 들어, 0.01 내지 8%(w/v), 0.01 내지 6%(w/v), 0.01 내지 4%(w/v), 0.01 내지 2%(w/v), 0.01 내지 1%(w/v), 0.02 내지 1%(w/v), 0.05 내지 0.8%(w/v), 0.1 내지 0.7%(w/v), 0.2 내지 0.6%(w/v) 등의 함량으로 포함될 수 있다. 상업적 목적을 고려하여, 탄파너셉트는 0.25%(w/v), 0.5%(w/v), 1%(w/v), 2%(w/v), 3%(w/v), 4%(w/v), 5%(w/v), 6%(w/v), 7%(w/v), 8%(w/v), 9%(w/v), 10%(w/v) 등의 함량으로 조성물 내에 포함될 수 있다. 상기 탄파너셉트의 함량은 투여 대상 환자의 질환 종류, 중증도 등에 따라 달라질 수 있다.

본 발명에 따른 탄파너셉트 함유 안과용 조성물은 pH 5.0 내지 pH 6.5의 완충 시스템을 포함한다. 상기 완충 시스템은 pH 5.0 내지 pH 6.5의 pH를 가지면 충분하며, 예컨대, pH 5.0 내지 pH 6.0의 완충 시스템, pH 5.5 내지 pH 6.5의 완충 시스템, pH 5.5 내지 pH 6.0의 완충 시스템, pH 5.8 내지 pH 6.3의 완충 시스템 등 pH 5.0 내지 pH 6.5의 범위 내에 속하는 수치 범위는 모두 본 발명의 범주에 포함된다. 본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 탄파너셉트 함유 안과용 조성물은 pH 5.0 내지 pH 6.0의 완충 시스템을 포함한다. 본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 탄파너셉트 함유 안과용 조성물은 pH 5.5 내지 pH 6.0의 완충 시스템을 포함한다.

본 발명에 따른 탄파너셉트 함유 안과용 조성물에서 완충 시스템을 구현하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. pH 5.0 내지 pH 6.5의 완충 시스템은 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제, 아세테이트 완충제, 숙시네이트 완충제, 시트레이트 완충제, 글루타메이트 완충제 및 락테이트 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 어떠한 완충 시스템을 사용하던 pH 5.0 내지 pH 6.5의 조건을 충족하면 탄파너셉트의 안정성 확보가 가능하리라 판단된다. 다만, 특정 완충 시스템의 사용이 상대적으로 바람직할 수는 있다. 하기 실시예를 통해, 아세테이트 완충제에 비해서는 시트레이트 완충제가 상대적으로 응집물이나 전하 변이체 생성 제어 측면에서 유리함이 확인되었다(실험예 4). 따라서, 본 발명의 구체예에서, 상기 완충 시스템은 시트레이트 완충제를 포함하는 완충 시스템, 예를 들어 시트레이트 완충 시스템 또는 시트레이트-포스페이트 완충 시스템일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 완충 시스템에 포함되는 완충제는 완충 효과의 증대를 위해 짝산-짝염기의 조합으로 구성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 완충 시스템은 시트레이트 완충제를 포함하고, 여기에서 시트레이트 완충제로는 트리소듐 시트레이트(짝염기)와 시트르산(짝산)을 포함한다.

본 발명의 완충 시스템은 5mM 내지 50 mM 농도의 완충제, 예를 들어, 10mM 내지 30 mM 농도의 완충제를 포함한다.

본 발명의 안과용 조성물은 안정화제를 실질적으로 포함하지 않는 것을 특징으로 한다. 여기에서 안정화제라 함은 유효성분으로 사용되는 탄파너셉트의 화학적, 물리적 안정성 또는 생물학적 활성의 감소를 막기 위해 제제 내에 포함시키는 추가의 성분을 의미한다. 예를 들어, 안과용 조성물에 있어서 단백질의 응집 저해를 위해 수크로스나 만니톨과 같은 당류를 사용하거나, 프롤린, 아르기닌, 글리신, 라이신 또는 메티오닌 등과 같은 아미노산계 안정화제를 사용하여 단백질의 안정화를 도모할 수 있다는 점이 잘 알려져 있다. 본 발명은 하기 실시예에서 확인한 바와 같이, 통상의 경우와 달리 이러한 안정화제를 포함하는 경우 도리어 탄파너셉트의 안정성에 좋지 않은 영향을 미친다는 점을 발견하여, 안정화제를 실질적으로 포함시키지 않는다. 본 발명에서 설명하는 완충제나 등장화제는 안정화제에 포함되지 않는다.

안정화제를 “실질적으로 포함하지 않는”은 안정화제를 0.1%(w/v) 미만, 0.05%(w/v) 미만, 0.03%(w/v) 미만, 0.02%(w/v) 미만, 0.01%(w/v) 미만, 0.005%(w/v) 미만, 0.001%(w/v) 미만으로 포함하거나, 가장 바람직하게는 전혀 포함하지 않음을 의미한다.

상기 안과용 조성물의 삼투압 농도는 260 mOsm/kg내지 320 mOsm/kg일 수 있다.

본 발명에 따른 안과용 조성물은 유효성분인 탄파너셉트와 완충 시스템 외에 추가로 등장화제를 포함할 수 있다. 등장화제는 본 발명에 따른 안과용 조성물의 삼투압을 조절하기 위해 사용된다. 본 발명에서, 등장화제는 본 발명에 따른 안과용 조성물이 260 mOsm/kg 내지 320 mOsm/kg의 삼투압 농도를 갖도록 포함된다. 삼투압은 물 단위당 용해된 입자의 수를 측정한 것이다. 용액에서, 물의 단위 수 (용매)에 비례하여 용질 입자의 수가 적을수록, 저-삼투압 용액이 덜 농축된다. 반-투과성 막 (용매 분자에만 투과 가능한 막)을 사용하여 다른 용질 농도의 용액을 분리하는 경우, 용매 분자가 막을 가로질러 저농도에서 고농도로 교차하여 농도 평형을 형성하는 삼투 현상이 발생한다. 상기 움직임을 구동하는 압력을 삼투압이라 하며 용액 중의 용질의 "입자"의 수에 의해 지배된다. 동일한 농도의 입자를 함유하여 동일한 삼투압을 가하는 용액을 등-삼투압이라 한다. 만약 저-삼투압 또는 고-삼투압 용액이 눈에 배치되면, 그것은 눈을 손상시킬 수 있고, 따라서 눈에 사용되는 약물을 위한 등-삼투압 용액이 필요하다. 본 발명에서는 등장화제로서 염화나트륨을 사용하였다. 본 발명에 따른 안과용 조성물 내에서 등장화제의 함량은 0.5%(w/v) 내지 1%(w/v)일 수 있다. 본 발명에 따른 안과용 조성물에서 등장화제의 농도는 100mM 내지 150mM일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에서, 본 발명에 따른 안과용 조성물은 탄파너셉트, pH 5.5 내지 pH 6.0의 완충 시스템, 등장화제 및 물로 구성된다. 일 실시예에서, 본 발명에 따른 안과용 조성물은 탄파너셉트, 시트레이트 완충제를 포함하는 pH 5.5 내지 pH 6.0의 완충 시스템, 염화나트륨 및 물로 구성된다.

본 발명에 따른 탄파너셉트 함유 안과용 조성물은 가속 또는 가혹 조건하에서도 매우 안정하다.

본 발명에 따른 탄파너셉트 함유 안과용 조성물은 가속조건 하 6개월 보관 후 전하 변이체의 양이 20% 이하일 수 있다.

본 발명에 따른 탄파너셉트 함유 안과용 조성물은 가속조건 하 6개월 보관 후 염기성 변이체의 양이 10% 이하일 수 있다.

본 발명에 따른 탄파너셉트 함유 안과용 조성물은 가속조건 하 6개월 보관 후 산성 변이체의 양이 10% 이하이다.

본 발명에 따른 탄파너셉트 함유 안과용 조성물은 장기보관조건 하 36개월 보관 후 탄파너셉트의 전하 변이체의 양이 20% 이하이다.

본 발명에 따른 탄파너셉트 함유 안과용 조성물은 장기보관조건 하 36개월 보관 후 탄파너셉트의 염기성 변이체의 양이 10% 이하이다.

본 발명에 따른 탄파너셉트 함유 안과용 조성물은 장기보관조건 하 36개월 보관 후 탄파너셉트의 산성 변이체의 양이 10% 이하이다.

본 발명에 따른 안과용 약학 조성물은 탄파너셉트의 물리화학적 및 생물학적 안정성을 향상시킴으로써, 안구건조증 등의 TNF-매개 안 질환을 앓고 있는 환자에게 점적 투여 등의 통상적인 방법에 의해 투여될 수 있다.

히스티딘, 수크로스와 같은 안정화제의 사용이 탄파너셉트 유래의 산성/염기성 변이체 등의 불순물의 생성을 야기하고, 생물학적 활성에 영향을 주는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 본 발명에 따른 안과용 약학 조성물은 이러한 안정화제의 사용을 배제하는 대신 pH를 조절하여 냉장저장 조건뿐 아니라 가속조건 및 가혹조건에서도 이러한 불순물의 생성을 현저히 감소시켜 안정한 탄파너셉트 안과용 조성물을 제조할 수 있다.

도 1은 37℃에서 0주~4주간 보관 후의 탄파너셉트의등전점 전기영동(IEF) 결과를 보여준다.
도 2는 37℃에서 0주~4주간 보관 후의 탄파너셉트의 IEX-HPLC 분석 결과를 보여준다.
도 3은 전하변이체의 IEF 분석 결과를 보여준다.
도 4는 전하변이체의 IEX-HPLC 분석 결과를 보여준다
도 5는 안정화제를 포함하지 않는 대조군과, 안정화제로서 메티오닌, 글라이신, 히스티딘 염산염, 수크로스를 각각 포함하는 안정화제 스크리닝 용액군의 IEX-HPLC 주피크 변화량을 보여준다.
도 6은 안정화제를 포함하지 않는 대조군과, 안정화제로서 메티오닌, 글라이신, 히스티딘 염산염, 수크로스를 각각 포함하는 안정화제 스크리닝 용액군의 IEX-HPLC 산성 변이체 변화량을 보여준다.
도 7은 안정화제를 포함하지 않는 대조군과, 안정화제로서 메티오닌, 글라이신, 히스티딘 염산염, 수크로스를 각각 포함하는 안정화제 스크리닝 용액군의 IEX-HPLC 염기성 변이체 변화량을 보여준다.
도 8은 다양한 pH 및 안정화제 조건에 따른 탄파너셉트 안과용 조성물의 40℃, 4주 보관 후의 안정성을 RP-HPLC 변이체에 의해 분석한 결과를 보여준다.
도 9는 다양한 pH 및 안정화제 조건에 따른 탄파너셉트 안과용 조성물의 40℃, 4주 보관 후의 안정성을 IEX-HPLC 주피크 변화량에 의해 나타낸 것이다.
도 10은 다양한 pH 및 안정화제 조건에 따른 탄파너셉트 안과용 조성물의 40℃, 4주 보관 후의 안정성을 IEX-HPLC 산성 변이체 변화량에 의해 나타낸 것이다.
도 11은 다양한 pH 및 안정화제 조건에 따른 탄파너셉트 안과용 조성물의 40℃, 4주 보관 후의 안정성을 IEX-HPLC 염기성 변이체 변화량에 의해 나타낸 것이다.
도 12 내지 14는 4종의 탄파너셉트 안과용 조성물을 4℃, 25℃, 40℃의 조건으로 보관하면서 수행한 SEC-HPLC 분석 결과를 보여준다.
도 15 내지 17은 4종의 탄파너셉트 안과용 조성물을 4℃, 25℃, 40℃의 조건으로 보관하면서 수행한 IEX-HPLC를 이용한 산성 변이체 분석 결과를 보여준다.
도 18 내지 20은 4종의 탄파너셉트 안과용 조성물을 4℃, 25℃, 40℃의 조건으로 보관하면서 수행한 IEX-HPLC를 이용한 염기성 전하변이체 분석 결과를 보여준다.
도 21은 탄파너셉트 안과용 조성물의 안정성을 SEC-HPLC를 이용한 응집물 분석 결과를 통해 보여주는 것이다.
도 22 내지 도 23는 탄파너셉트 안과용 조성물의 안정성을 IEX-HPLC를 이용한 전하변이체 분석 결과를 통해 보여주는 것이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 후술하는 제조예, 실시예, 실험예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 이들은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되지 않는다.

실험예 1: 탄파너셉트 전하변이체 분석

전하변이체의 생성은 약물 활성, 안정성, 안전성에 영향을 줄 수 있기 때문에 본 발명자들은 우선 탄파너셉트의 전하변이체에 대해 분석하였다. 탄파너셉트를 37℃에서 4주간 보관한 후,등전점 전기영동(IEF) 및 IEX-HPLC 분석을 수행하였다.

등전점 전기영동 방법

- pH 3.0 내지 pH 7.0 범위의 겔에서 well 당 10 ug을 로딩하였고, 100 V에서 1 시간, 200 V 에서 1 시간, 500 V 에서 30분 동안 전기영동을 수행하였다. 12% trichloroacetic acid로 30분간 고정시킨 후 쿠마시블루로 염색하였다.

IEX-HPLC (이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피)

IEX-HPLC (이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피)는 이온 교환체를 사용하여 단백질의 순전하(net charge)에 따른 컬럼의 고정상과의 친화도에 따라 단백질을 분리한다. 본 시험법은 양이온 교환컬럼과 온도제어부 (25℃ 설정), 자동 샘플 추출기 (4℃ 설정), 280 nm가 구동되는 UV 검출기와 0.7 mL/min의 유속을 유지할 수 있는 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 수행하였다.

전하변이체 분리정제

탄파너셉트 안과용 조성물에 존재하는 전하변이체 특성에 따라 분리하여 분석하고자, SP-HP 컬럼과 단백질 분리용 액체 크로마토그래피 (FPLC)를 이용하여 염농도에 따라 분리 정제를 수행하였다. 전하변이체 특성에 따라 산성변이체 (A), 주피크시료 (B), 염기성변이체 (C)로 시료를 준비하였고, 각각 IEF와 IEX-HPLC 분석 수행하였다.

도 1은 37℃에서 0주~4주간 보관 후의 탄파너셉트의등전점 전기영동(IEF) 결과를 보여준다.

등전점 전기영동의 결과, 도 1A에서 볼 수 있는 바와 같이, 보관 기간이 증가할수록 낮은 pI 값 위치에서 밴드가 진해져서 탄파너셉트의 산성 변이체의 생성이 매우 뚜렷이 확인되었다.

도 2는 37℃에서 0주~4주간 보관 후의 탄파너셉트의 IEX-HPLC 분석 결과를 보여준다.

IEX-HPLC의 결과에서도, 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, 보관 기간이 길어질수록 산성변이체의 양이 증가함을 확인할 수 있었다.

전하변이체의 특성을 살펴보고자 SP-HP 컬럼을 이용하여 전하에 따라 분리하여 얻어진 산성변이체, 주피크시료, 염기성변이체 시료를 IEF와 IEX-HPLC로 분석하였다.

도 3은 전하변이체의 IEF 분석 결과를, 도 4는 전하변이체의 IEX-HPLC 분석 결과를 보여준다. 도 3 및 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 산성 변이체만을 분리한 A 시료는 크로마토그램에서 주피크 시료보다 앞부분에 용출되며, 또한 IEF 결과에서도 주피크 시료보다 낮은 pI를 갖는 것을 알 수 있다. 이와 더불어 염기성 변이체 시료인 B시료는 크로마토그램 결과에서 주피크 시료보다 뒷부분에 용출되며, IEF 결과에서도 주피크 시료를 포함해서 다소 높은 pI값을 나타내는 것을 알 수 있었다.

실험예 2: 안과용 안정화제의 스크리닝

단백질 조성물에 첨가되는 안정화제는 환자에게 투여하기 전까지 제제를 안정하게 보관하기 위해 필요로 한다. 이들을 첨가하여 보관 중 유발될 수 있는 응집물이나 전하변이체와 같은 불순물들을 최소화하여 보관기간 동안 안정한 제제로 유지될 수 있도록 한다. 따라서 단백질 조성물에 있어 주성분을 안정화시키는 적절한 안정화제를 선택하여 안정한 조성물을 제조하는 것은 무엇보다도 중요하다. 본 발명자들은 주성분인 탄파너셉트를 안정화시키는 안정화제 종류 선정을 위한 각 안정화제에서의 가혹시험(40℃, 4주 보관)을 진행하기 위해 우선 하기와 같은 실험을 진행하였다.

1) 탄파너셉트 용액 시료 제조

125mM 염화나트륨을 함유하는 20mM 소듐 시트레이트 완충제에 포함된 10 mg/mL의 탄파너셉트 용액을 제조하였다.

2) 완충제 pH 7.0, 20mM 시트레이트 포스페이트 제조

초순수 900 mL 에 시트르산 무수물 0.37 g, 인산수소이나트륨 2.58 g를 첨가하여 잘 섞어주었다. 37% 염산 또는 40% 소듐 하이드록사이드를 이용하여 pH 7.0에 적정한 뒤 초순수를 첨가하여 최종 1 L로 제조하였다.

3) 안정화제 스크리닝 용액 제조

2)에서 제조한 완충제 100 mL에 안정화제 4종 (메티오닌 0.149 g, 글라이신 0.751 g, 히스티딘 염산염 1.55 g, 수크로스 6.84 g)을 각각 첨가하여 pH 7.0인 4가지의 안정화제 스크리닝용 조성물을 제조하였다.

[표 1]

안과용 안정화제 스크리닝용 용액의 조성

4) 시료 제조 및 평가

3.5 kDa 원심분리 필터에 탄파너셉트와 3)에서 제조한 안과용 안정화제 스크리닝용 용액 10 mL 첨가 후 4℃, 4000 rpm으로 시료를 원심분리하여 상기 1)의 탄파너셉트의 완충제에서 3)의 안정화제 스크리닝용 완충제로 치환시켰다. 위 과정을 반복하여 탄파너셉트 1 mg/mL이 포함된 안정화제 스크리닝용 용액(시료)을 제조하였다. 이를 40℃, 4주 보관하여 0주차, 4주차 시료를 IEX-HPLC 분석하여 각 시료에서 확인되는 물리화학적 불순물을 분석하였다.

[표 2]

표 2 및 도 5 내지 7은 안정화제를 포함하지 않는 대조군과, 안정화제로서 메티오닌, 글라이신, 히스티딘 염산염, 수크로스를 각각 포함하는 안정화제 스크리닝 용액군의 IEX-HPLC 분석 결과를 보여준다.

그 결과, 표 2 및 도 5 내지 7에서 볼 수 있는 바와 같이, 수크로스와 히스티딘 염산염을 포함시키는 경우 염기성 변이체 및 산성 변이체의 생성량이 감소하는 경향이 나타나는 것으로 확인되었다. 특히, 히스티딘 염산염의 경우 대조군이나 다른 안정화제 대비 산성 변이체의 생성량을 크게 감소시키는 것으로 확인되었다.

실험예 3: 다양한 pH를 갖는 안과용 조성물의 제조 및 안정성 평가

눈물의 pH는 pH 7.0 내지 7.5이므로 이와 유사한 pH 조건으로 안과용 조성물을 설정하는 것이 가장 바람직하겠으나, 단백질의 안정성은 pH에 의해서도 크게 영향을 받을 수 있기 때문에 다양한 pH를 갖는 안과용 조성물을 제조하고 그의 안정성을 평가하고자 하였다.

(1) 안과용 조성물의 제조

1) 완충제 pH 5.0 내지 pH 7.0, 20 mM 시트레이트 포스페이트 제조

초순수 400 mL에 시트르산 무수물와 인산수소이나트륨을 각 pH 에 맞게 첨가하여 잘 섞어주었다. (pH 5.0/5.5 완충제 제조의 경우; 시트르산 무수물 0.62 g, 인산수소이나트륨 0.97 g // pH 6.0/6.5완충제 제조의 경우; 시트르산 무수물 0.43 g, 인산수소이나트륨 1.11 g // pH 7.0 완충제 제조의 경우; 시트르산 무수물 0.19g, 인산수소이나트륨 1.29 g) 37% 염산 또는 40% 수산화나트륨을 이용하여 각 조건에 맞는 pH 5.0 내지 pH 7.0 에 적정한 뒤 초순수 첨가하여 최종 500 mL로 제조하였다.

2) 안정화제가 첨가된 안과용 조성물 제조 (pH 5.0 내지 pH 7.0)

1)에서 제조한 pH 5.0 내지 pH 7.0 에 해당되는 완충제 5종 각 100 mL 에 수크로스 6.85 g과 히스티딘 1.55 g을 첨가하여 수크로스 200 mM이 포함된 pH 5.0 내지 pH 7.0 의 20 mM 시트레이트 포스페이트 완충제 5 종과 히스티딘 100 mM이 포함된 pH 5.0 내지 pH 7.0 의 20 mM 시트레이트 포스페이트 완충제 5 종을 제조하였다. 안정화제 미함유 실험군으로는 1)에서 제조한 pH 5.0 내지 pH 7.0의 20 mM 시트레이트 포스페이트 완충제를 그대로 사용하여 안정화제가 미포함/포함된 pH 5.0 내지 pH 7.0 의 완충제 총 15종을 제조하였다.

3) 시료 제조 및 평가

3.5 kDa 원심분리 필터를 이용하여 2)에서 제조한 완충제 4 mL과 탄파너셉트를 첨가 후 4℃, 4000 rpm으로 시료를 원심분리 하여 기존의 탄파너셉트의 완충제에서 안정화제가 포함된 pH 5.0 내지 pH 7.0의 완충제로 치환시켰다. 위 과정을 반복하여 서로 다른 pH와 안정화제를 포함하는 15종의 시료를 제조하였다. 이를 40℃, 4주 보관하여 0주차, 4주차 시료를 분석하여 각 시료에서 확인되는 물리화학적 불순물을 분석하였다.

[표 3]

안정화제가 첨가된 안과용 조성물 제조 (pH 5.0 내지 pH 7.0)

(2) pH 및 안정화제에 따른 탄파너셉트 안정성 평가

1) 역상 크로마토그래피에 의한 분석

RP-HPLC(역상 크로마토그래피)는 단백질의 극성에 따라 순도를 평가하는 방법이다. 본 시험법은 역상크로마토그래피 컬럼과 온도제어부 (60℃ 설정), 자동샘플 추출기 (4℃ 설정), 214 nm 가 구동되는 UV 검출기와 1.0 mL/min의 유속을 유지할 수 있는 고성능 액체크로마토그래피(HPLC)를 사용하여 수행하였다.

상기 제조한 15종의 시료를 가혹조건(40℃ 보관)에서 4주간 보관하여 0주차, 4주차 시료를 분석하여 각 시료에서 확인되는 변이체의 생성 변화량을 비교하였다. 그 결과, 표 4 및 도 8에서 볼 수 있는 바와 같이, pH 7.0에서는 안정화제 미함유 실험군 대비 수크로스 또는 히스티딘을 안정화제로 포함시킨 실험군이 낮은 변이체 생성율을 나타냈다. 그러나, 히스티딘을 안정화제로 포함시킨 실험군의 경우 pH 5.0 내지 pH 6.5에서 모두 대조군보다 높은 변이체 생성율을 나타내었고, 수크로스를 안정화제로 포함시킨 실험군의 경우 pH 5.0 내지 pH 6.0에서 대조군 보다 높은 생성율을 나타내었다.

[표 4]

2) 이온 교환 고성능 액체 크로마토그래피에 의한 분석

앞서 제조한 15종의 시료를 가혹조건 (40℃ 보관)에서 4주간 보관하여 0주차, 4주차 시료를 분석하여 각 시료에서 확인되는 산성/염기성 변이체의 생성 변화량을 비교하였다.

그 결과, 표 5 및 도 9 내지 11에서 볼 수 있는 바와 같이, 산성 변이체의 생성량 측면에서 pH 5.0 내지 pH 6.5에서 안정화제 미함유 군은 수크로스나 히스티딘 함유 실험군보다 좋은 결과를 나타내었다. 특히, pH 5.0 내지 pH 6.0에서 안정화제 미함유 실험군은 10% 미만의 산성 변이체 생성량 변화를 나타내었다. 염기성 변이체의 경우, pH 5.0 내지 pH 6.0에서 안정화제 미함유 군은 수크로스나 히스티딘 함유 실험군 보다 좋은 결과를 나타내었다. pH 6.5 내지 pH 7.0에서는 수크로스 함유 실험군이 가장 낮은 염기성 변이체 생성량 변화를 나타내었고, 히스티딘 함유 실험군의 경우 안정화제 미함유 군과 별다른 차이를 나타내지 않았다.

[표 5]

위 결과를 분석한 결과, pH 7.0에서는 안정화제 미함유 군보다 수크로스나 히스티딘 함유군이 변이체 생성량이 낮은 경향을 보였으나, pH가 pH 5.5 또는 pH 6.0으로 낮아지게 되면 도리어 수크로스나 히스티딘 함유군의 변이체 생성량이 안정화제 미함유군에 비해 상당히 높아지는 경향성을 확인할 수 있었다.

실험 결과들을 종합적으로 분석한 결과, 예상과 달리, 탄파너셉트 안과용 조성물은 pH 5.5 내지 pH 6.0으로 안정화제를 미함유한 군이 가장 낮은 변이체 생성량을 나타내는 것으로 파악되었다.

일반적으로 안과용 조성물은 생체 내 pH 조건과 유사하도록 pH 7.0으로 설정하는 것을 고려하나, 안과용 조성물에서 유효성분의 안정성은 약효 발휘의 중요한 요소이므로, 본 발명에 따른 탄파너셉트 안과용 조성물은 pH 5.5 내지 pH 6.0으로 pH를 설정하고, 수크로스나 히스티딘은 함유시키지 않는 것이 바람직하다는 결론을 얻었다.

실험예 4: 버퍼 시스템에 따른 안정성 평가

탄파너셉트의 농도, pH, 염화나트륨 농도, 삼투압 등은 고정하고, 버퍼 조성 및 기능성 부형제 2종 첨가 유무의 차이를 비교하기 위한 4개 군을 구성하여 4℃, 25℃, 40℃ 조건에서 최종 제제 선정을 위한 스크리닝을 진행하였다. 안과용 조성물의 pH는 앞선 실험결과를 고려하여 pH 5.5로 고정하였고, 이 범위에서 일반적으로 사용이 가능한 기본 버퍼로 소듐 아세테이트(20 mM)와 소듐 시트레이트(20 mM)를 사용하여 버퍼 시스템에 따른 탄파너셉트의 안정성을 평가하고자 하였다.

하기 표 6과 같이, 4개의 탄파너셉트 안과용 조성물을 제조하여 탄파너셉트의 안정성을 시험하였다.

[표 6]

SEC-HPLC를 이용한 응집물 분석과 IEX-HPLC를 이용한 전하 변이체 분석을 통해 탄파너셉트 안과용 조성물의 안정성 시험을 수행하였다. 안정성 시험은 4℃, 25℃, 40℃의 조건에서 총 2달 동안 수행되었고, 0주, 2주, 1개월, 2개월의 시점에서 SEC-HPLC를 이용한 응집물 분석과 IEX-HPLC를 이용한 전하 변이체 분석을 수행하였다.

(1) SEC-HPLC를 이용한 응집물 분석

SEC-HPLC (크기 배제 고성능 액체 크로마토그래피)는 다공성 겔로 채워진 컬럼의 고정상 시료를 주입하여 크기에 따른 차이에 따라 단백질을 분리한다. 본 시험법은 크기배제 컬럼과 온도제어부 (25℃ 설정), 자동 샘플 추출기 (4℃ 설정), 214 nm가 구동되는 UV 검출기와 0.5 mL/min의 유속을 유지할 수 있는 고성능 액체크로마토그래피 (HPLC)를 사용하여 수행하였다.

표 7 내지 9, 및 도 12 내지 14는 상기 4종의 탄파너셉트 안과용 조성물을 4℃, 25℃, 40℃의 조건으로 보관하면서 수행한 SEC-HPLC 분석 결과를 보여준다. SEC-HPLC 분석 결과, 온도가 높을수록 응집물이 증가하는 경향을 나타냈고, 특히 아세테이트 버퍼 사용 제제의 경우에 빠르게 생성되는 것으로 파악되었다. 시트레이트 버퍼를 사용한 3가지 제제는 FFS3이 4℃, 2개월 결과에서 높게 측정되었다. 25℃, 40℃ 2주, 1개월, 2개월 모든 조건에서 FFS2의 부형제를 사용하지 않은 경우 가장 안정한 결과를 나타내었다.

[표 7]

SEC 응집물 분석 [4℃]

[표 8]

SEC 응집물 분석 [25℃]

[표 9]

SEC 응집물 [40℃]

(2) IEX-HPLC를 이용한 산성변이체 분석

표 10 내지 12, 및 도 15 내지 17은 상기 4종의 탄파너셉트 안과용 조성물을 4℃, 25℃, 40℃의 조건으로 보관하면서 수행한 IEX-HPLC를 이용한 산성 변이체 분석 결과를 보여준다.

[표 10]

IEX-산성변이체 [4℃]

[표 11]

IEX-산성변이체 [25℃]

[표 12]

IEX-산성변이체[40℃]

(3) IEX-HPLC를 이용한 염기성변이체 분석

표 13 내지 15, 및 도 18 내지 20은 상기 4종의 탄파너셉트 안과용 조성물을 4℃, 25℃, 40℃의 조건으로 보관하면서 수행한 IEX-HPLC를 이용한 염기성 전하변이체 분석 결과를 보여준다.

[표 13]

IEX-염기성변이체 [4℃]

[표 14]

IEX-염기성변이체 [25℃]

[표 15]

IEX-염기성변이체 [40℃]

IEX-HPLC 분석에서는 모든 제제가 40℃ 고온 보관조건에서 산성 및 염기성 전하변이체가 증가하는 경향을 나타냈고, 아세테이트 버퍼 (FFS1) 제제에서는 염기성 변이체가 모든 온도에서 뚜렷이 증가하는 패턴을 나타냈다.

결론적으로, 응집물 및 염기성 변이체 생성 측면에서 시트레이트 버퍼 (FFS2~4)에 비해 아세테이트 버퍼 (FFS1)의 안정성이 상대적으로 떨어짐을 확인하였다. 또한, 시트레이트 버퍼 조성을 기반으로 하여 기능성 부형제를 첨가한 군들과 기능성 부형제를 첨가하지 않은 군을 비교시 부형제를 사용하지 않은 군이 가장 안정한 것으로 나타나, 제품 제조공정의 단순화, 제조공정 상의 오염 및 균일성 문제 등을 종합적으로 고려하여 시트레이트 버퍼 (FFS2)를 사용하는 제형을 최종 제형으로 선정하였다. 다만, 눈물의 생리학적 pH가 중성임을 감안하여 물질 안정성이 수용 가능한 수준에서 환자 순응도가 좀더 높을 것으로 예상되는 pH 6.0을 최종 제품의 pH로 선택하였다.

제조예 1: 탄파너셉트 안과용 조성물의 제조

초순수 900ml에 트리소듐 시트레이트 이수화물(Tri-sodium citrate dihydrate) 5.35g, 시트르산 무수물(Citric acid, anhydrous) 0.35g, 염화나트륨(sodium chloride) 7.3g을 넣고 완전히 녹여 완충제를 제조하였다. 제조된 완충제의 pH는 pH 6.0 ± 0.1 임을 확인한 뒤, 메스실린더를 이용하여 최종 1L에 맞추고 0.22 μm bottle top filter system으로 여과하였다.

상기 제조된 완충제에 탄파너셉트를 포함시켜 아래와 같은 조성의 탄파너셉트 0.25% 점안제 조성물을 제조하였다.

[표 16]

실험예 5: 탄파너셉트 안과용 조성물의 안정성 평가

제조예 1에 따른 탄파너셉트 안과용 조성물의 안정성을 평가하였다.

장기보관 조건은 5℃(습도 미조절), 가속조건은 25℃/60% RH로 설정하여 제조예 1의 조성물을 보관하였고, 앞서 설명한 SEC-HPLC를 이용한 응집물 분석과 IEX-HPLC를 이용한 전하변이체 분석을 수행하였다.

[표 17]

표 17 및 도 21은 SEC-HPLC를 이용한 응집물 분석 결과를 보여준다. 표 17 및 도 21에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 1의 조성물은 5℃ 장기보관 조건에서 3년간 보관하였을 때, 응집물이 5% 이내로 유발되어 안정한 것으로 확인되었다. 또한, 25℃/60% RH 가속조건에서 6개월 간 보관하였을 때, 5% 이내로 유발된 것을 확인하였다.

[표 18]

표 18 및 도 22 내지 도 23은 IEX-HPLC를 이용한 전하변이체 분석 결과를 보여준다. 표 18 및 도 22 내지 도 23에서 볼 수 있는 바와 같이, 제조예 1의 조성물은 5℃ 장기보관조건에서 3년간 보관하였을 때, 산성 변이체 10% 이내로 유발되어 보관기간 동안 안정한 것으로 확인되었다. 염기성 변이체 또한 10% 이내로 유발되어 보관기간 동안 안정한 것으로 확인되었다.

또한, 25℃/60% RH 가속조건에서 6개월간 보관하였을 때, 산성 변이체 10% 이내로 유발된 것을 확인하였다. 염기성 변이체 또한 10% 이내로 유발되어 보관기간 동안 안정한 것으로 확인되었다.

Claims

탄파너셉트 및 pH 5.0 내지 pH 6.5의 완충 시스템을 포함하고,
안정화제를 실질적으로 포함하지 않는 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안과용 조성물에서 탄파너셉트는 0.01%(w/v) 내지 10%(w/v) 포함되는 것인 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안과용 조성물에서 완충 시스템의 pH는 pH 5.0 내지 pH 6.0인 완충 시스템을 포함하는 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물
제1항에 있어서,
상기 안과용 조성물에서 완충 시스템의 pH는 pH 5.5 내지 pH 6.0인 완충 시스템을 포함하는 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물
제1항에 있어서,
상기 완충 시스템은 포스페이트 완충제, 히스티딘 완충제, 아세테이트 완충제, 숙시네이트 완충제, 시트레이트 완충제, 글루타메이트 완충제 및 락테이트 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상의 완충제를 포함하는 것인 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 완충 시스템은 완충 시스템으로서 시트레이트 완충 시스템, 포스페이트 완충 시스템 또는 시트레이트-포스페이트 완충 시스템을 포함하는 것인 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물.
제6항에 있어서,
상기 시트레이트 완충 시스템은 완충제로서 트리소듐 시트레이트 및 시트르산을 포함하는 것인 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 완충 시스템은 5mM 내지 50mM의 완충제를 포함하는 것인 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안과용 조성물은 등장화제를 추가로 포함하는 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물.
제9항에 있어서,
상기 등장화제는 염화나트륨인 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안과용 조성물은 가속 조건 하 6개월 보관 후 탄파너셉트의 전하 변이체의 양이 20% 이하인 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안과용 조성물은 가속조건 하 6개월 보관 후 탄파너셉트의 염기성 변이체의 양이 10% 이하인 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안과용 조성물은 가속조건 하 6개월 보관 후 탄파너셉트의 산성 변이체의 양이 10% 이하인 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안과용 조성물은 장기보관조건 하 36개월 보관 후 탄파너셉트의 전하 변이체의 양이 20% 이하인 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안과용 조성물은 장기보관조건 하 36개월 보관 후 탄파너셉트의 염기성 변이체의 양이 10% 이하인 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안과용 조성물은 장기보관조건 하 36개월 보관 후 탄파너셉트의 산성 변이체의 양이 10% 이하인 안정한 탄파너셉트 함유 안과용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 안과용 조성물의 삼투압 농도는 260mOsm/kg 내지 320 mOsm/kg 인 탄파너셉트 함유 안과용 조성물.