KR20140018905A - 신규 조절제 및 용법 - Google Patents

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KR20140018905A
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오릿 풀드
스캇 제이. 딜라
로버트 에이. 스툴
알렉스 뱅코비치
알렉산드라 레이다 리애나 레이저틱
제프리 번스타인
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스템 센트알엑스 인코포레이티드
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Abstract

항체 및 그의 유도체를 포함하는 신규 조절제, 및 과증식성 장애를 치료하기 위한 상기 조절제를 사용하는 방법을 제공한다.

Description

신규 조절제 및 용법 {NOVEL MODULATORS AND METHODS OF USE}
교차 참조 출원
본 출원은 2011년 2월 18일 제출된 미국 가출원 일련번호 제61/444,614호 및 2011년 9월 2일 제출된 특허 협력 조약 (PCT) 제PCT/US2011/050451호를 우선권 주장하며, 각각은 그의 전체 내용이 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 ASCII 포맷으로 제출되고 본원에 그의 전체 내용이 참고로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2012년 1월 26일에 생성된 상기 ASCII 복사본은 명칭 112304PCT.txt이며 크기 163,049 바이트이다.
발명의 분야
본 출원은 일반적으로 신규 조성물 및 과증식성 장애 및 그의 임의의 확대, 재발, 악화 또는 전이를 예방하거나, 치료하거나, 또는 개선하는 그의 사용 방법에 관한 것이다. 넓은 측면에서, 본 발명은 신생물 장애의 치료, 진단 또는 예방을 위한 항-PTK7 항체 및 융합 구조체(constructs)를 포함하는, 단백질 티로신 키나제(protein tyrosine kinase) 7 (PTK7) 조절제의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 특히 바람직한 실시양태는 종양 개시 세포 빈도의 감소를 포함하는 악성종양(malignancies)의 면역요법 치료를 위한 상기 PTK7 조절제의 사용을 제공한다.
발명의 배경
줄기 및 전구 세포 분화 및 세포 증식은 기관발생 동안의 조직 성장과 모든 생물(living organisms)의 일생 동안의 대부분 조직의 세포 대체 및 수리를 지지하기 위한 통일된 역할을 하는 정상 진행 과정이다. 분화 및 증식 결정은 종종 세포 운명 결정 및 조직 아키텍처(architecture)를 유지하기 위해 균형을 이루는 수많은 요인 및 신호에 의해 제어된다. 정상 조직 아키텍처는 세포 분열 및 조직 성숙을 조절하는 미세환경 신호(cue)에 반응하는 세포에 의해 주로 유지된다. 따라서, 세포 증식 및 분화는 통상적으로 손상되거나 죽어가는 세포의 교체 또는 성장이 필요한 경우에만 일어난다. 불행히도, 세포 증식 및/또는 분화의 파괴(disruption)는 예를 들어, 다양한 신호전달 케미컬의 부족 또는 과잉, 미세환경 변화의 존재, 유전적 돌연변이 또는 그의 일부 조합을 포함하는 무수히 많은 인자로 인해 생길 수 있다. 정상 세포의 증식 및/또는 분화가 방해되거나 또는 어떻게든 방해되는 경우, 암과 같은 과증식성 장애를 포함하는 다양한 질환 또는 장애로 이어질 수 있다.
암의 통상적인 치료는 화학요법, 방사선요법, 수술, 면역요법 (예컨대, 생물학적 반응 개질제, 백신 또는 표적화 치료법) 또는 그의 조합을 포함한다. 불행히도, 지나치게 많은 암들이 환자에 대해 거의 예외 없이 상기 통상적인 치료에 비-반응성이거나 또는 최소로 반응한다. 예를 들어, 일부 환자에서, 특정 암은 선택된 요법의 일반적 유효성에도 불구하고 그것을 비-반응성이 되게 하는 유전자 돌연변이를 보인다. 게다가, 암의 유형에 따라, 일부 이용가능한 치료, 예컨대 수술이 실행 가능한 대안이 아닐 수 있다. 현재 표준 케어 치료법에 내재하는 한계는 이전의 치료를 받은 후 악화된 환자를 위한 케어를 시도하는 경우 특히 자명하다. 그러한 경우, 실패한 치료 섭생(therapeutic regimens) 및 결과적인 환자 악화는 궁극적으로 불치인 것으로 입증되는 비교적 공격적인 질환으로서 흔히 나타나는, 난치성(refractory) 종양에 기여할 수 있다. 비록 수년간 암의 진단 및 치료에서 상당한 발전이 있었음에도 불구하고, 많은 고형 종양에 대한 전반적인 생존율은 악화, 종양 재발 및 전이를 방지하는 현존 요법의 실패로 인해 큰 변화없이 유지되고 있다. 따라서, 더욱 표적화되고 강력한 요법을 개발하는 것이 과제로 남아있다.
하나의 유망한 연구 분야는 많은 암의 기저가 되는 것으로 나타나는 종양형성성 "시드" 세포를 추격하는 표적화 치료법의 사용을 포함한다. 목적을 달성하기 위해, 대부분의 고형 조직은 다수의 그러한 조직을 포함하는 분화 세포 유형을 발생시키는 성체, 조직-거주 줄기 세포 집단을 함유하는 것으로 공지되어 있다. 이러한 조직에서 발생하는 종양은 줄기 세포로부터 또한 발생하지만 그의 전반적인 증식 및 구조(organization)에서 현저하게 다른 이질성 세포 집단으로 유사하게 이루어진다. 다수의 종양 세포가 제한된 증식 능력을 갖는다는 것이 점점 더 인식되고 있지만, 소수의 암 세포 집단 (통상 암 줄기 세포 또는 CSC로 공지됨)은 널리 자가-재생하는(self-renew) 배타적인 능력을 가짐으로써 내재하는 종양을 재개시하는 능력을 가능하게 한다. 더욱 구체적으로, 암 줄기 세포 가설은 무제한 자가-재생이 가능한, 및 종양 전구 세포 및 나중에는 말기 분화 종양 세포로의 분화의 결과로서 그의 복제능력이 점점 제한되는 종양 세포의 발생이 가능한, 각 종양의 내부에 뚜렷한 세포 서브세트 (즉 CSC) (대략 0.1-10%)가 존재함을 제시한다.
최근 몇 년간 상기 CSC (종양 지속 세포(tumor perpetuating cells) 또는 TPC로도 공지됨)는 전통적인 화학요법제 또는 방사선에 더욱 잘 견딜 수 있고, 따라서 표준 케어 임상 요법 후에도 난치성 종양, 2차 종양의 성장을 일으키고 전이를 촉진하기를 지속할 수 있다는 것이 더욱 자명해졌다. 이와 관련하여 암 줄기 세포가 다양한 신생물(neoplasia)의 이동 및 침습 잠재력의 촉진에 연루되고 있다. 게다가, 정상 조직-거주 줄기 세포의 기관발생 및/또는 자가-재생을 조절하는 경로가 CSC에서 탈조절되거나(deregulated) 또는 변경되고, 이것이 계속적인 자가-재생성 암 세포의 확대 및 종양 형성을 초래한다는 것을 제시하는 증거가 분명해지고 있다. 일반적으로 본원에 그의 전체 내용이 참고로 포함되는 문헌[Al-Hajj et al., 2004, PMID: 15378087] 및 문헌 [Dalerba et al., 2007, PMID: 17548814] 각각을 참조한다. 그러므로, 전통적인 것뿐 아니라 더욱 최근의 표적화 치료 방법의 유효성은, 이러한 다양한 치료 방법에도 불구하고 암을 지속시키는 능력이 있는 내성 암 세포의 존재 및/또는 출현에 의해 분명히 제한된다. 문헌 [Huff et al., European Journal of Cancer 42: 1293-1297 (2006)] 및 문헌 [Zhou et al., Nature Reviews Drug Discovery 8: 806-823 (2009)] 각각은 본원에서 그의 전체 내용이 참고로 포함된다. 그러한 관찰은 종양이 어떻게 성장하고, 재발하고, 전이하는지에 대한 이해가 갈수록 수준 높게 발전하는 것에 의해 및 고형 종양을 앓는 경우의 환자 생존을 실질적으로 증가시키기 위한 전통적인 용적 축소제의 일관된 불능에 의해 확인된다. 따라서, 신생물 장애를 치료하기 위한 최근의 전략은 종양 지속 세포의 분화를 제거하거나, 고갈시키거나, 침묵시키거나 또는 촉진함으로써 종양 재발 또는 환자 악화를 초래하는 전이의 가능성을 줄이는 것의 중요성을 인식하였다.
그러한 전략을 발전시키기 위한 노력은 비-전통적인 이종이식(xenograft) (NTX) 모델이 연루되는 최근의 성과를 포함하며, 여기서 초기(primary) 인간 고형 종양 표본은 면역손상 마우스에 배타적으로 이식되고 계대된다. 수많은 암에서 그러한 기술은 이질성 종양을 발생시키고 그것의 성장을 무한하게 하는 특별한 능력을 갖는 세포의 하위집단(subpopulation)의 존재를 확인해준다. 이전에 가설을 세운 바와 같이, NTX 모델에서의 성과는 종양 세포의 식별된 CSC 하위집단이 임상적 반응 속도 및 전반적인 생존 사이의 격차를 가능성 있게 설명하면서 용적축소(debulking regimens) 섭생, 예컨대 화학요법 및 방사선에 더욱 저항력이 있는 것으로 나타나는 것을 확인했다. 추가로, CSC 연구에서 NTX 모델의 사용은 종양 재발 및 전이에서 중요한 영향을 갖고 이로써 환자 생존율을 개선하는, CSC-표적화 치료를 이끌 수 있는 신약 개발 및 신약 후보의 임상전 평가에서의 근본적인 변화를 촉발시켰다. 진전이 있었지만, CSC 동일성(identity) 및 분화 가능성을 특징짓기 위한 실험적 플랫폼(platforms)의 결핍과 더불어, 초기 및/또는 이종이식 종양 조직을 처리하는 것과 관련된 내재하는 기술적 어려움은 주요한 과제를 제기한다. 그와 같이, 암 줄기 세포를 선택적으로 표적화하고 과증식성 장애의 치료, 예방, 및/또는 관리에 사용될 수 있는 진단, 예방, 또는 치료 화합물 또는 방법을 개발할 실질적인 필요가 남는다.
발명의 요약
상기 및 다른 목적은 넓은 의미에서 PTK7 관련 장애 (예컨대, 과증식성 장애 또는 신생물 장애)의 치료에서 사용될 수 있는 방법, 화합물, 조성물 및 제조품에 관한 본 발명에 의해 제공된다. 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 효과적으로 종양 세포 및/또는 암 줄기 세포를 표적화하고, 폭넓은 다양한 악성종양을 겪고 있는 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있는 신규한 단백질 티로신 키나제 7 (또는 PTK7) 조절제를 제공한다. 본원에서 더욱 자세하게 논의되는 바와 같이, 현재 다수의 공지된 PTK7 이소형이 존재하며 개시된 조절제는 바람직하게는 하나 또는 동일한 수를 포함하거나 또는 그와 회합한다. 게다가, 특정 실시양태에서 개시된 PTK7 조절제는 PTK7 폴리펩티드 또는 유전자 (또는 그의 단편)를 인식하거나 그들과 경쟁하거나, 작용하거나, 상쇄하거나, 상호작용하거나, 결합하거나 또는 회합하고, 하나 이상의 생리학적 경로상에서의 PTK7 단백질의 영향을 조절하거나, 조정하거나, 개조하거나, 변경하거나 또는 개질하는 임의의 화합물을 포함할 수 있다. 따라서, 넓은 의미에서 본 발명은 일반적으로 단리된 PTK7 조절제 및 그의 용도에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서 본 발명은 더욱 특히, 항체 (즉, 적어도 하나의 PTK7의 이소형과 면역우선적으로(immunopreferentially) 결합, 반응하거나 또는 그와 회합하는 항체)를 포함하는 단리된 PTK7 조절제에 관한 것이다. 게다가, 하기 광범위하게 논의된 바와 같이, 그러한 조절제는 증식성 장애의 예방, 진단 또는 치료에 유용한 제약 조성물을 제공하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 선택된 실시양태에서, PTK7 조절제는 PTK7 폴리펩티드 또는 그의 단편, 그 둘을 단리된 형태로 또는 다른 모이어티(moieties)와 융합하거나 회합하여 (예컨대, Fc-PTK7, PEG-PTK7 또는 표적화 모이어티와 회합한 PTK7) 포함할 수 있다. 다른 선택된 실시양태에서, PTK7 조절제는 본 출원의 목적상, PTK7을 인식하거나, 그와 경쟁하거나, 상호작용하거나, 결합하거나 또는 회합하고, 종양 개시 세포를 포함하는 신생 세포(neoplastic cells)의 성장을 중화하거나, 제거하거나, 감소시키거나, 감작하거나, 재프로그래밍하거나, 억제하거나 또는 제어하는, 임의의 구조체 또는 화합물을 의미하는 것인, PTK7 길항제를 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 PTK7 조절제는 항-PTK7 항체, 또는 그의 단편 또는 유도체를 포함하는데, 이것이 신생 세포의 생존, 재발, 재생 및/또는 전이를 전파하거나, 유지하거나, 확장하거나, 증식시키거나 또는 다르게는 용이하게하는 종양 개시 세포의 능력을, 침묵시키거나, 중화하거나, 감소시키거나, 축소하거나, 고갈시키거나, 완화하거나, 약화시키거나, 재프로그래밍하거나, 제거하거나, 또는 다르게는 억제하는 것이 예기치않게 발견되었다. 특히 바람직한 실시양태에서, 항체 또는 면역반응성 단편은 하나 이상의 항암제 (예컨대, 세포독성제)와 회합되거나 또는 그에 접합될 수 있다.
선택된 실시양태에서 적합한 PTK7 조절제는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 경쇄 가변 영역이 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38, 서열 40, 서열 42, 서열 44, 서열 46, 서열 48, 서열 50, 서열 52, 서열 54, 서열 56, 서열 58 및 서열 60에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역이 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 35, 서열 37, 서열 39, 서열 41, 서열 43, 서열 45, 서열 47, 서열 49, 서열 51, 서열 53, 서열 55, 서열 57, 서열 59 및 서열 61에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는, 항체를 포함할 수 있다.
물론, 본 개시내용의 관점에서 당업자는 각각의 전술한 중쇄 및 경쇄 가변 영역과 회합된 CDR을 용이하게 식별할 수 있고 그러한 CDR을 사용하여 과도한 실험을 하지 않고 키메라, 인간화 또는 CDR 이식 항체를 조작 또는 제작할 수 있다. 그와 같이, 선택된 실시양태에서 본 발명은 도 6a 또는 도 6b에 도시된 가변 영역 서열로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항-PTK7 항체에 관한 것이다. 바람직한 실시양태에서, 그러한 항체는 단일클론 항체를 포함할 것이고, 더욱 바람직한 실시양태에서는 키메라, CDR 이식 또는 인간화 항체를 포함할 것이다. 하기에 더욱 자세히 논의되는 바와 같이, 또 다른 실시양태는 하나 이상의 세포독성제와 접합 또는 회합된 항체를 포함할 것이다.
따라서, 다른 실시양태에서 본 발명은 hSC6.23, hSC6.24, hSC6.41 및 hSC6.58로 이루어진 군으로부터 선택되는 인간화 PTK7 조절제를 포함할 것이다. 또 다른 실시양태는 인간화 항체를 포함하는 PTK7 조절제에 관한 것이고, 여기서 상기 인간화 항체는 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 상기 경쇄 가변 영역은 서열 62, 서열 64, 서열 66 및 서열 68에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 63, 서열 65, 서열 67 및 서열 69에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
앞서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 한 양태는 PTK7 조절제와 암 줄기 세포의 예기치 못한 회합을 포함한다. 따라서, 특정 다른 실시양태에서 본 발명은 대상체에 투여시 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키는 PTK7 조절제를 포함할 것이다. 빈도의 감소는 바람직하게는 시험관내 또는 생체내 제한 희석법을 사용하여 결정될 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 그러한 분석은 면역손상 마우스내로 살아있는 인간 종양 세포를 이식하는 것을 포함하는 생체내 제한 희석법을 사용하여 수행될 수 있다. 다르게는, 제한 희석법은 살아있는 인간 종양 세포를 시험관내 콜로니 지지 조건(colony supporting conditions)으로 제한 희석 침착시키는 것을 포함하는, 시험관내 제한 희석법을 사용하여 수행될 수 있다. 두 경우에서, 빈도 감소의 분석, 계산 또는 정량화는 바람직하게는 푸아송(Poisson) 분포 통계를 사용하여 정확한 계산을 제공하는 것을 포함할 것이다. 그러한 정량화 방법이 선호되지만, 다른 저(less) 노동 집약 방법론, 예컨대 유동 세포계측법(flow cytometry) 또는 면역조직화학 검사법 또한 요망되는 값을 제공하기 위해 사용될 수 있고, 따라서 본 발명의 범위에 속하는 것으로 명확하게 고려된다는 것이 이해될 것이다. 그러한 경우에, 빈도의 감소는 종양 개시 세포에서 풍부한 것으로 공지된 종양 세포 표면 마커의 유동세포 분석 또는 면역조직화학적 검출을 사용하여 결정될 수 있다.
그와 같이, 본 발명의 다른 바람직한 실시양태에서 치료 유효량의 PTK7 조절제를 필요로 하는 대상체에 투여하여 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키는 것을 포함하는, PTK7 관련 장애를 치료하는 방법을 포함한다. 바람직하게는, PTK7 관련 장애는 신생물 장애를 포함한다. 또, 종양 개시 세포 빈도의 감소는 바람직하게는 시험관내 또는 생체내 제한 희석법을 사용하여 결정될 것이다.
이 점에서 본 발명이 적어도 부분적으로는, PTK7 면역원이 다양한 신생물(neoplasia)의 병인론(etiology)에 연루되는 종양 지속 세포 (즉, 암 줄기 세포)와 관련된다는 발견을 기초로 한다는 것이 이해될 것이다. 더욱 구체적으로, 본 출원은 다양한 예시적인 PTK7 조절제의 투여가 종양 개시 세포에 의한 종양형성성 신호전달을 매개하거나, 감소시키거나, 고갈시키거나, 억제하거나 또는 제거할 수 있음 (즉, 종양 개시 세포의 빈도를 감소시킬 수 있음)을 예기치 않게 입증한다. 종양 개시 세포의 고갈, 중화, 감소, 제거, 재프로그래밍 또는 침묵에 의해서든, 또는 종양 세포 형태의 수정 (예컨대, 유도된 분화, 니치(niche) 파괴)에 의해서든, 이 감소된 신호전달은 종양생성, 종양 유지, 확대 및/또는 전이 및 재발을 억제함으로써 차례로 PTK7 관련 장애의 더욱 효과적인 치료를 가능하게 한다.
전술한 암 줄기 세포와의 연관성과 더불어, PTK7 이소형이 내피 세포의 혈관 형성, 이동 및 종양발생에 관련되고 있는 특정한 발달 신호전달 캐스케이드 (즉, Wnt 신호전달 경로)에 관여할 수도 있다는 증거가 있다. 본원에 기재된 신규한 PTK7 조절제를 사용하는 상기 세포 상호작용의 중재는, 하나 초과의 메카니즘 (즉, 종양 개시 세포 감소 및 종양발생성 경로 신호전달 파괴)이 추가적인 또는 상승적인 효과를 제공함으로써 장애를 개선 또는 치료할 수 있다. 또 다른 바람직한 실시양태는 조절제 매개 항암제를 전달하기 위한 세포 표면 PTK7의 세포 내재화(internalization)를 이용할 수 있다. 이 점에서, 본 발명이 임의의 특정 작용 메카니즘에 의해 제한되지 않고 PTK7 관련 장애 (다양한 신생물을 포함함)를 치료하는 개시된 조절제의 폭넓은 용도를 포함한다는 것이 인식될 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 측면은 종양 생존 경로를 잠재적으로 파괴시키면서 동시에 종양 개시 세포를 침묵시키는 개시된 조절제의 능력을 활용한다. 그러한 다중-활성(multi-active) PTK7 조절제 (예컨대, PTK7 길항제)는 표준 케어 항암제 또는 용적 축소제와 함께 사용되는 경우 특히 효과적인 것으로 입증될 수 있다. 따라서 본 발명의 바람직한 실시양태는 개시된 조절제를 초기 치료에 뒤따르는 유지 요법을 위한 항-전이제로서 사용하는 것을 포함한다. 추가로, 본 발명의 교시에 따라 둘 이상의 PTK7 길항제 (예컨대 PTK7 상의 2개의 별개 에피토프에 특별히 결합하는 항체)가 조합되어 사용될 수 있다. 게다가, 하기에서 일부 상세하게 논의된 바와 같이, 본 발명의 PTK7 조절제는 접합되거나 또는 비접합된 상태로 사용될 수 있고, 임의로 다양한 화학적 또는 생물학적 항암제와 조합하여 감작제로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 바람직한 실시양태는 PTK7 조절제를 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 항암제를 사용하는 치료를 위해, 상기 대상체에서 종양을 감작하는 방법을 포함한다. 다른 실시양태는 PTK7 조절제를 필요로 하는 대상체에 그를 투여하는 것을 포함하는 치료에 뒤따르는 전이의 감소 방법을 포함한다. 본 발명의 특히 바람직한 양태에서, PTK7 조절제는 시험관내 또는 생체내 제한 희석법을 사용하여 결정되는 것인, 종양 개시 세포 빈도를 특히 감소시킬 것이다.
본 발명의 더욱 일반적으로 바람직한 실시양태는 대상체에 PTK7 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, 그를 필요로 하는 대상체에서의 PTK7 관련 장애의 치료 방법을 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서 PTK7 조절제는 항암제와 회합 (예컨대, 접합)될 것이다. 또 다른 실시양태에서 PTK7 조절제는 세포의 표면 상의 또는 근처의 PTK7과의 회합 또는 결합에 뒤따라 내재화될 것이다. 게다가 신호전달 경로의 임의 파괴 및 부수적인 이점을 포함하는 본 발명의 이로운 측면은 대상체 종양 조직이 정상적인 인접 조직에 비해 향상된 수준의 PTK7을 나타내든 또는 감소되거나 하락한 수준의 PTK7을 나타내든 간에 성취될 수 있다.
또 다른 양태에서 본 발명은 치료 유효량의 하나 이상의 내재화 PTK7 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, 신생물 장애를 겪고 있는 대상체의 치료 방법을 포함할 것이다. 바람직한 실시양태는, 다른 선택된 실시양태에서 세포독성제와 접합되거나 또는 회합되는 내재화 항체 조절제의 투여를 포함할 것이다.
다른 실시양태는 치료 유효량의 하나 이상의 고갈성(depleting) PTK7 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, PTK7 관련 장애를 겪고 있는 대상체의 치료 방법에 관한 것이다.
또 다른 실시양태에서 본 발명은 개시된 효과기 또는 조절제가 종양 질량의 적어도 일부분을 제거하기 위해 고안된 초기 절차 (예컨대, 화학요법, 방사선 또는 수술) 이후에 일정 시간에 걸쳐 투여되는 것인 유지 요법의 방법을 제공한다. 그러한 치료 섭생은 PTK7 조절제가 전이 및/또는 종양 재발을 억제하기 위해 예방차원으로 작용할 수 있는, 몇 주의 기간, 몇 개월의 기간 또는 심지어 몇 년의 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 개시된 조절제는 전이, 종양 유지 또는 재발을 방지하거나 지체시키기 위해 공지된 용적축소 섭생과 협력하여 투여될 수 있다.
본 발명의 PTK7 조절제가 PTK7의 단일 이소형 또는 단백질의 선택된 소수 이소형 (즉 스플라이스 변이체에 의해 제공됨)과 반응하도록 제작되고 선택될 수 있거나, 또는 역으로 몇몇 또는 모든 PTK7 이소형 (현재 5개가 확인됨)과 반응하거나 또는 회합하는 pan-PTK7 조절제를 포함할 수 있음이 추가로 인식될 것이다. 더욱 특히, 본원에 개시된 바와 같이 바람직한 조절제, 예컨대 항체는 그가 단일 스플라이스 변이체에 의해 나타나는 도메인과 (예컨대, 특정 엑손 교차점에서) 또는 다수 또는 모든 PTK7 이소형에 걸쳐 보존된 Ig 도메인과 반응하도록 발생되고 선택될 수 있다. 이는 본 발명에 관하여, 특정 이소형이 바람직하게는 TIC 상에 발현될 수 있고 따라서 치료 표적으로서 기여하여 종양형성성 세포 빈도의 선택적인 감소 및/또는 암 줄기 세포 집단의 고갈을 제공할 수 있다는 점에서 유의하다.
따라서, 선택된 실시양태에서 본 발명은 pan-PTK7 조절제를 포함한다. 다른 선택된 실시양태에서 본 발명은 면역특이적으로 하나 이상의 스플라이스 변이체 또는 이소형과 회합하는 PTK7 조절제를 포함한다. 바람직하게는 스플라이스 변이체는 이소형 a, 이소형 b, 이소형 c 및 이소형 d로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 또 다른 실시양태에서 본 발명은 치료 유효량의 pan-PTK7 조절제를 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상체의 치료 방법을 포함한다. 또 다른 실시양태는 하나 이상의 이소형과 면역특이적으로 회합하는 PTK7 조절제를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 그를 필요로 하는 대상체의 치료 방법을 포함한다.
상기 논의된 치료 용도를 넘어서서, 본 발명의 조절제는 PTK7 관련 장애 및 특히 과증식성 장애를 진단하는데 사용될 수 있다는 것이 또한 인식될 것이다. 일부 실시양태에서, 조절제는 대상체에 투여되어 생체내 검출되거나 또는 모니터링될 수 있다. 당업자는 그러한 조절제가 하기 개시된 마커 또는 리포터로 표지되거나 또는 회합될 수 있고, 다수의 표준 기술 (예컨대, MRI, CAT 스캔, PET 스캔 등) 중 임의의 하나를 사용하여 검출될 수 있음을 인식할 것이다.
따라서, 일부 실시양태에서 본 발명은 PTK7 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, 생체내 PTK7 관련 장애의 진단, 검출 또는 모니터링을 필요로 하는 대상체에서 생체내 PTK7 관련 장애를 진단, 검출 또는 모니터링하는 방법을 포함할 것이다.
다른 경우에서, 조절제는 당업계에서 인정된 절차를 사용하는 시험관내 진단 환경(setting)에서 사용될 수 있다. 그와 같이, 바람직한 실시양태는
a. 과증식성 장애의 진단을 필요로 하는 대상체로부터 조직 샘플을 얻는 단계;
b. 조직 샘플을 하나 이상의 PTK7 조절제와 접촉시키는 단계; 및
c. 샘플과 회합된 PTK7 조절제를 검출하거나 또는 정량화하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 과증식성 장애를 진단하는 방법을 포함한다.
상기 방법은 본 출원과 연계하여 용이하게 파악될 수 있고, 통상적으로 이용가능한 상업 기술, 예를 들어 자동 플레이트 판독기, 전용 리포터 시스템 등을 사용하여 손쉽게 수행될 수 있다. 선택된 실시양태에서, PTK7 조절제는 샘플에 존재하는 종양 지속 세포와 회합할 것이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 검출 또는 정량화 단계는 종양 개시 세포 빈도 및 그의 검출의 감소를 포함할 것이다. 게다가, 제한 희석법은 앞서 상기에 시사한 것과 같이 수행될 수 있고, 바람직하게는 빈도 감소에 대한 정확한 계산을 제공하기 위해 푸아송 분포 통계법을 이용할 것이다.
비슷한 맥락에서, 본 발명은 또한 PTK7 관련 장애, 예컨대 암의 진단 또는 모니터링에 유용한 키트를 제공한다. 목적 달성을 위해, 본 발명은 바람직하게는 PTK7 조절제 포함 저장기(receptacle) 및 PTK7 관련 장애를 치료하거나 진단하는 상기 PTK7 조절제를 사용하기 위한 지침서를 포함하는, PTK7 관련 장애를 진단하거나 치료하는데 유용한 제조품을 제공한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시양태는 또한 유동세포 분석, 형광 활성화 세포 분리(fluorescence activated cell sorting) (FACS) 또는 레이저 매개 분획화와 같은 방법을 통해, 종양 개시 세포의 집단 또는 하위집단을 식별하거나, 단리하거나, 분획화하거나 또는 풍부화하는데 유용한 수단으로서의 개시된 조절제의 특성을 활용한다.
그와 같이, 본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 상기 종양 개시 세포를 PTK7 조절제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 종양 개시 세포 집단을 식별하거나, 단리하거나, 분획화하거나 또는 풍부화하는 방법에 관한 것이다.
전술한 것은 개요이고 따라서 필요에 의해 세부사항의 단순화, 일반화 및 생략을 포함하며, 결과적으로, 당업자는 개요는 오직 예시적인 것이고 아무런 제한을 의도하지 않는다는 것을 인식할 것이다. 본원에 기재된 방법, 조성물 및/또는 장치 및/또는 다른 주제 물질의 다른 측면, 특징, 및 이점은 본원에 제시된 교시에서 명백해질 것이다. 상기 개요는 하기 상세한 설명에서 추가로 기재되는 선택 개념을 단순화된 형태로 소개하기 위해 제공된다. 상기 개요는 청구한 주제 물질의 핵심적인 특징 또는 필수적인 특징을 식별하는 것을 의도하지 않으며, 청구한 주제 물질의 범위를 결정하는 목적으로 사용하려는 의도 또한 아니다.
도면의 간단한 설명
도 1a - 1c는 각각 인간 PTK7을 코딩하는 핵산 서열 (서열 1), 예시적인 인간 PTK7 변이체의 아미노산 서열 (서열 2)을 제시하고, 도 1c는 PTK7의 4개의 대표적인 이소형을 나란히 기록한 서열 (서열 3-6)을 제시하고, 여기서 도 1a에서 밑줄친 구획은 PTK7-1 오픈 리딩(open reading) 프레임을 나타내고, 도 1b에서 밑줄친 구획은 본원에 정의된 바와 같은 PTK7의 세포외 도메인을 나타내고, 도 1c은 NCBI의 유전자 데이터베이스(Gene database)에 보고된 바와 같은 인간 PTK7 단백질의 4개의 공지된 예시적인 이소형의 단백질 배열을 나타내고 (단백질 접수번호: 이소형 a = NP_002812, 이소형 b = NP_690619; 이소형 c = NP_690620; 이소형 d = NP_690621), 여기서 도 1c는 모티프 펩티드 "GxGxFGxV", "HRDLxxxN" 및 "SDVWSxG"을 각각 서열 11-13으로서 추가로 개시한다.
도 2는 전체 결장직장 종양 표본의 서브세트로부터 얻어진 고도로 풍부화된 종양 전구 세포 (TProg), 종양 지속 세포 (TPC) 및 비-종양형성성 세포 (NTG) 집단의 전체 전사체 서열분석을 사용하여 측정한, 비처리된 (-) 및 이리노테칸(irinotecan) 처리된 (+) 마우스에서 PTK7의 유전자 발현 수준을 제시하는 도시이다.
도 3은 정량적 RT-PCR을 사용하여 측정되고, 3가지 상이한 비-전통적인 이종이식 (NTX) 결장직장 또는 췌장 종양 세포주 중 하나를 갖는 마우스로부터 얻어지고 비-종양형성성 (NTG) 풍부화된 세포 집단에 대해 정규화된, 고도로 풍부화된 종양 전구 세포 (TProg) 및 종양 지속 세포 (TPC) 집단에서 인간 PTK7의 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 도시이다.
도 4a 및 4b는 RT-PCR을 사용하여 측정되고, 정상 결장 및 직장 조직에서의 평균 발현에 대해 정규화되거나 (도 4a) 또는 정상 인접 조직과 매칭된 (도 4b), 단계 I-IV 질환을 갖는 환자로부터의 전체 결장직장 종양 표본에서 인간 PTK7 상대적인 유전자 발현 수준을 나타내는 도시이다.
도 5a 및 5b는 RT-PCR로 측정된, 전체 종양 표본에서 (회색 점) 또는 18종의 상이한 고형 종양 유형 중 하나를 갖는 환자로부터의 매칭된 NAT (백색 점)에서의 인간 PTK7 유전자의 상대적 또는 절대적 유전자 발현 수준을 각각 나타내는 도시이다.
도 6a 및 6b는 본원에서 실시예에 기재된 바와 같이 단리되고, 클로닝되고 조작된 다수의 예시적인 뮤린 및 인간화 PTK7 조절제의 중쇄 및 경쇄 가변영역의 연속성 아미노산 서열을 표 형태로 제공한다.
도 7a - 7e는 예시적인 PTK7 조절제의 물리화학적 특성을 도시 및 표로 제공하고, 여기서 도 7a는 뮤린 및 인간 PTK7에 대하여 특정 조절제의 결합 특성을 도시하고, 도 7b는 선택된 조절제에 대한 친화도, 비닝(binning) 및 교차-반응성 데이터를 제공하고, 도 7c 및 7d는 선택된 뮤린 조절제 및 그의 인간화 대응물에 대한 상대적인 결합 특성을 나타내고, 도 7e는 인간 PTK7 및 그의 뮤린 오솔로그(ortholog)에 대하여 선택된 조절제의 결합 친화도를 제공한다.
도 8a - 8g는 본 발명에 따른 다양한 PTK7 구조체를 제시하고, 여기서 도 8a - 8f는 Ig-PTK7-ECD 구조체의 형태인 6개의 PTK7 조절제 변이체의 아미노산 서열을 제공하고 (여기서 각 구조체의 세포외 도메인 부분은 다양함), 도 8g는 PTK7의 세포외 부분의 7개의 Ig 도메인을 괄호에 의해 표시된 바와 같은 다수의 PTK7 조절제의 ELISA 유래 결합 영역과 함께 도해로 예시한다.
도 9a - 9e는 상이한 종양 용균물에서 및 NTX 샘플에서의 PTK7 단백질의 발현 수준을 예시하고, 여기서 도 9a - 9d는 정상 인접 조직 대조군과 비교하여 다양한 종양 및 질환 단계에 대한 종양 용균물 수준을 제시하고, 도 9e는 대조군 염색 (회색)을 비-종양형성성 (파선) 및 추정 암 줄기 세포 군집 (실선)에 대한 염색과 비교한, 선택된 조절제를 갖는 인간 비-전통적인 이종이식의 염색을 예시하는 히스토그램을 제공한다.
도 10a - 10e는 본 발명의 선택된 조절제의, 세포 표면에서 PTK7과의 결합시 내재화하는 능력을 도시로 예시하고, 여기서 도 10c은 예시적인 조절제 (즉, 도 10c에서 H10으로 지칭되는 SC6.10.2)와 관련된 형광 이동을 나타내고, 도 10a 및 10b는 대조군을 나타내고, 도 10d는 하이브리도마 상청액으로부터의 예시적인 조절제가 정제된 대조군 (H2.35, H10.2 및 H25.1로 각각 지칭되는 SC6.2.35, SC6.10.2 및 SC6.25.1)과 비교하여 내재화에 대해 스크리닝될 수 있음을 입증하고, 도 10e는 파선이 배경 컷오프(cutoff)를 나타내고 결합 사건에 반응하여 세포에 의해 내재화되는 PTK7 분자의 수가 y축 상에 플로팅(plotted)된, 다양한 조절제 (각 데이터 포인트는 별개의 조절제를 나타냄)의 내재화의 정도를 예시한다.
도 11a - 11d는 개시된 조절제의, 세포독성제의 전달을 면역특이적으로 매개하고 세포 사멸을 증진시키는 능력을 도시로 예시하고, 여기서 도 11a는 PTK7을 발현하는 세포로 세포독성 적재량(payloads)을 지시하는 표적화 모이어티로서 3개의 예시적인 조절제 (H2.35, H10.2 및 H25.3으로 각각 지칭되는 SC6.2.35, SC6.10.2 및 SC6.25.3)의 용도를 제시하고, 도 11b - 11d는 4개의 추가의 예시적인 조절제의 3개의 별개의 세포주를 제거하는 능력을 예시한다 (여기서 각각의 도에서 하향 경사의 곡선은 내재화된 독소를 통한 세포 사멸의 지표임).
도 12는 3개의 예시적인 PTK7 조절제의, 세포독성제의 전달을 면역특이적으로 매개함으로써 다양한 NTX 종양 세포주에서 종양 세포 생존력을 감소시키는 능력을 입증한다.
도 13a - 13c는 개시된 조절제의, 종양 지속 세포의 빈도를 감소시키고 그의 종양형성 잠재력을 억제하는 역량의 지표이고, 여기서 도 13a 및 13b는 세포독성제의 전달을 매개하는 조절제 (즉, SC6.H2 표지된 SC6.2.35)가 2개의 별개의 NTX 유방 종양 세포 군집의 생존력에 영향을 줌을 나타내고, 도 13c는 면역손상된 마우스내로의 이식시 처리된 세포주의 종양형성성이 감소되었음을 제시한다.
도 14는 본 발명의 예시적인 인간화 PTK7 조절제의, 세포독성제의 PTK7 발현 세포로의 면역특이적 전달 및 내재화를 효율적으로 매개하는 능력을 입증한다.
발명의 상세한 설명
I. 도입
본 발명이 다수의 상이한 형태로 구현될 수 있음에도 불구하고, 본원에 개시된 것은 본 발명의 원칙을 예시하는 그의 구체적인 예시적 실시양태이다. 본 발명이 예시된 특정 실시양태에 제한되지 않는다는 것이 강조되어야 한다. 게다가, 본원에 사용된 임의의 구획 제목은 오직 구조적 목적을 위한 것이고 기재된 주제 물질을 제한하는 것으로 해석되지 않는다.
이전에 시사한 바와 같이, 놀랍게도 다양한 이소형을 포함하는 PTK7의 발현이 신생물 성장 및 과증식성 장애와 관련된다는 점 및 그러한 리간드가 관련 질환의 치료에서 활용될 수 있는 유용한 종양 마커를 제공한다는 점이 발견되었다. 더욱 구체적으로는, 본원에 개시된 것과 같은 PTK7 조절제가 필요로 하는 대상체에서의 신생물 장애의 진단, 테라그노시스(theragnosis), 치료 또는 방지에 유리하게 사용될 수 있다는 것이 발견되었다. 따라서, 본 발명의 바람직한 실시양태가 하기에서 광범위하게, 특히 암 줄기 세포 및 개시된 조절제와 그것의 상호작용의 맥락에서 논의될 것이지만, 당업자는 본 발명의 범위가 그러한 예시적인 실시양태에 의해 제한되지 않음을 인식할 것이다. 더 정확히 말하면, 본 발명 및 첨부된 청구항은 폭넓고 명확하게 PTK7 조절제, 및 임의의 특정 작용 메카니즘 또는 특이적으로 표적화된 종양 성분과 상관없이, 신생물 또는 과증식성 장애를 포함하는 다양한 PTK7 관련 또는 매개 장애의 진단, 테라그노시스, 치료 또는 방지에서의 그것의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 다양한 선행기술 개시물과 대조적으로, 일반적인 단백질 티로신 키나제 조절제가 아니라 주로 PTK7의 다양한 이소형의 면역특이적 조절제에 관한 것이라는 점이 추가로 인식될 것이다. 즉, 상기 클래스의 단백질 티로신 키나제 수용체는 몇몇 유형의 장애에서 널리 연루되어 있고 치료 중재를 위해 일반적으로 표적화되어 왔지만, PTK7 특이적 조절제는 종전에는 낮은 주의를 끌었다. 부분적으로 이것은, 키나제 중복이 상기 클래스의 특정 구성원의 임의의 특정 길항작용에 대해 보상할 가능성이 있기 때문에 일반적인 PTK 활성과의 간섭 (특히 보존 키나제 도메인과 상호작용하는 작은 분자와의 간섭)이 치료 관점에서 더욱 효과적이라는 믿음으로부터 비롯될 수 있다. 게다가, PTK7은 전하는 바에 따르면, 치료 표적으로서 그의 활용을 가로막았을 수도 있는 불활성 키나제 도메인 (또는 의사 키나제 (pseudokinase) 도메인)을 포함한다.
역으로, 본 발명은 하나 이상의 PTK7의 이소형과 바람직하게 반응하여 치료 이점을 제공하는 면역특이적 조절제의 사용을 포함한다. 상기에서 간략히 논의된 바와 같이 특정 실시양태에서 본 발명의 조절제는 단일 PTK7 이소형과 회합되도록 발생되고 선택될 수 있는 반면, 다른 실시양태에서 선택된 조절제는 하나 초과의 PTK7 이소형 또는 모든 인정된 이소형과 반응할 수 있다. 이러한 후자의 실시양태에서 본 발명은 하나 초과의 PTK7 이소형과 회합하거나 또는 반응함으로써 하나 초과의 PTK7 매개 경로의 침묵(quiescence)을 허용할 수 있는, 예기치 않은 추가적인 또는 상승적인 효과를 제공하는 조절제를 포함할 수 있다.
더욱 일반적으로, 본 출원에서 입증된 바와 같이, 상기 개시된 면역특이적 PTK7 조절제는 종양형성성 세포를 표적화하고 제거하거나 또는 무력화하고 PTK7 관련 장애 (예컨데, 신생물)를 치료하기 위해 효과적으로 사용될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이 PTK7 관련 장애는, 장애 또는 질환의 추이 또는 병인론 동안의 PTK7 발현의 표현형 수차 (phenotypic aberration)에 의해 표시되고, 진단되거나 또는 식별되는 임의의 장애 또는 질환 (증식성 장애를 포함함)을 의미하여야 할 것이다. 이 점에서 표현형 수차는, 예를 들어, 상승되거나 또는 하락한 수준의 PTK7 발현, 특정 한정 가능한 세포 집단 상의 비정상적 PTK7 발현 또는 세포 수명의 부적절한 시기 또는 단계에서의 비정상적 PTK7 발현을 포함할 수 있다.
바로 위에서 논의된 일반적 관계뿐만 아니라, 본 발명자는 선택된 "종양 개시 세포" (TIC) 및 PTK7 간의 종전에는 공지되지 않은 표현형 관계를 추가로 발견하였다. 이 점에서, 선택된 TIC가 정상 조직 및 비-종양형성성 세포 (NTG)에 비하여 향상된 수준의 PTK7을 발현하는데, 이는 함께 고형 종양의 많은 부분을 포함한다는 점이 발견되었다. 따라서, PTK7 이소형은 종양 관련 마커 (또는 항원 또는 면역원)를 포함하고, 세포 표면 상의 또는 종양 미세환경에서의 변화된 단백질 수준으로 인하여 TIC 및 관련 신생물을 검출 및 억제하는 효과적인 물질을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 더욱 구체적으로는, 단백질과 회합, 결합하거나 반응하는 면역반응성 길항제 및 항체를 포함하는 PTK7 조절제가, 종양 개시 세포의 빈도를 효과적으로 감소시키고, 그 때문에 이러한 종양-개시 세포가 환자에서 종양 성장, 전이 또는 재발이 동면하게 하고/거나 계속 일어나게하는 능력을 제거하거나, 고갈시키거나, 무력화하거나, 감소시키거나, 그의 분화를 촉진하거나, 또는 다르게는 불가능하게 하거나 제한하는데 유용하다는 것이 추가로 발견되었다. 하기에서 더욱 구체적으로 논의되는 바와 같이, TIC 종양 세포 하위집단은 두 종양 지속 세포 (TPC) 및 고도로 증식성인 종양 전구 세포 (TProg) 모두로 구성된다.
상기 발견의 관점에서, 당업자는 본 발명이 PTK7 조절제, 및 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키는 그의 용도를 추가로 제공한다는 것을 인식할 것이다. 하기에서 광범위하게 논의되는 바와 같이, 본 발명의 PTK7 조절제는 PTK7을 인식하거나, 그와 반응하거나, 경쟁하거나, 길항작용하거나, 상호작용하거나, 결합하거나, 순항작용하거나, 또는 회합하는 임의의 화합물 또는 PTK7 또는 그의 유전자를 폭넓게 포함한다. 이러한 상호작용에 의해, PTK7 조절제는 이로써 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키거나 또는 완화한다. 본원에 개시된 예시적인 조절제는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함한다. 특정 바람직한 실시양태에서, 선택된 조절제는 PTK7 또는 그의 면역반응성 단편 또는 유도체에 대한 항체를 포함할 것이다. 상기 항체는 성질이 길항적이거나 순항적일 수 있고, 임의로 세포독성제와 접합되거나 또는 회합될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명 내의 조절제는 PTK7 이소형 또는 그의 반응성 단편을 포함하는 PTK7 구조체를 포함할 것이다. 그러한 구조체가 융합 단백질을 포함할 수 있고 다른 폴리펩티드, 예컨대 면역글로불린으로부터의 반응성 도메인 또는 생물학적 반응 개질제를 포함할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 또 다른 양태에서, PTK7 조절제는 게놈(genomic) 수준에서 요망되는 효과를 발휘하는 핵산 조립을 포함할 것이다. 본 발명의 교시에 적합한 또 다른 조절제는 하기에서 상세하게 논의될 것이다.
궁극적으로 어떤 형태의 조절제가 선택되든, 그것은 바람직하게는 단리되고 정제된 상태로 대상체내에 도입될 것이다. 이 점에서 "단리된 PTK7 조절제"는 넓은 의미에서 및 표준 제약 실무에 따라 원치 않는 오염물질이 (생물학적인 것이든 또는 아닌 것이든) 실질적으로 없는 상태인, 조절제를 포함하는 임의의 제제 또는 조성물을 의미하는 것으로 고려되어야 한다. 조금 더 상세하게 논의되는 바와 같이, 상기 제제는 다양한 당업계에서 인정된 기술을 사용하여 요망되는 만큼 정제되고 제제화 될 수 있다. 물론, 그러한 "단리된" 제제는 완제품의 상업, 제조 또는 치료적 측면을 개선하기 위해 및 제약 조성물을 제공하기 위해 요망되는 만큼, 불활성 또는 활성인 성분과 의도적으로 제제화 또는 조합될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
II. PTK7 생리학
결장 암종 키나제 4 (CCK4)로서 또한 공지된 단백질 티로신 키나제 (PTK7)는 원래 정상 인간 멜라닌세포로부터 클로닝되고 (문헌 [Lee et al., Oncogene 8(12), 1993]) 별도로 결장 암종 조직으로부터 클로닝된 수용체 티로신 키나제이다 (문헌 [Mossie et al., Oncogene 11(10), 1995]). 상기 PTK7 유전자는 6p21.1-p12.2에 위치한다. 인간 PTK7의 5개의 스플라이스 이소형은 고환 cDNA로부터 클로닝되었다 (문헌 [Jung, Ji et al., Biochim Biophys Acta 1579, 2002]). 고환과 간 암종 간 또는 결장 암종주 간에 서로에 대한 이소형의 상대적 함량은 다르지만, 이러한 이소형의 기능적 유의성이 존재하는 경우에도, 공지되어 있지 않다. 생물정보 분석은, 마우스가 대안적으로 스플라이싱된 mRNA로부터 가용성 Ptk7 이소형을 발현할 수 있음을 제시한다 (문헌 [Forrest, Taylor et al., Genome Biol 7, 2006]). 본 출원의 목적상, 문맥상 제약에 의해 달리 지시되지 않는다면 용어 "PTK7" 및 "CCK4"는 상호교환적으로 사용될 수 있고 인간 PTK7의 스플라이스 변이체, 이소형, 종 오솔로그 및 상동체를 포함할 수 있는 것으로 인식될 것이다. 상기 용어는 또한 PTK7 단백질 조절제 (예컨대, 항체 또는 면역반응성 단편)가 특이적으로 결합할 수 있는 에피토프를 함유하는 PTK7의 천연 또는 변이 형태의 임의의 유도체 또는 단편을 나타낼 수 있음이 추가로 인식될 것이다.
전장 PTK7 단백질은 674 아미노산 세포외 도메인 (ECD)과 이어서 짧은 TM 스패닝 부분 (spanning portion) 및 345 아미노산 세포질 도메인을 갖는 I형 막관통 단백질이다. 인간 PTK7의 예시적 이소형 (즉, 전사 변이체 PTK7-1)의 완전한 핵산 서열은 젠뱅크(Genbank) 접수번호 NM_002821을 갖고 도 1a에 제시된다 (서열 1). 유사하게, PTK7-1 단백질의 전장 예시적 아미노산 서열이 도 1b에 도시된다 (서열 2). 도 1b의 위치 93에서 점 돌연변이 (point mutation) (L -> P)가 존재한다는 점에서, 서열 2에서의 PTK7 단백질은 서열 1의 밑줄친 핵산 서열의 번역 생성물 (즉, 서열 3에 제시된 이소형 a)과 상이함을 주목한다. 이소형에 관하여, 젠뱅크에서 보고된 바와 같이 도 1c가 PTK7의 4개의 예시 이소형의 아미노산 서열의 주석화된 배열을 제시한다 (단백질 접수: 이소형 a = NP_002812, 서열 3; 이소형 b = NP_690619, 서열 5; 이소형 c = NP_690620, 서열 6; 이소형 d = NP_690621, 서열 4). 앞서 시사된 바와 같이, 이소형 a에 제시된 서열은 도 1a에 제시된 PTK7 변이체 1로부터의 오픈 리딩 프레임의 번역 생성물에 상응한다. 다른 스플라이스 이소형은, 제시된 바와 같이 이소형 a에 비해 다양한 Igcam이 부족한 세포외 도메인을 코딩한다. 모든 이소형은 동일한 세포내 도메인을 코딩한다. 단백질 세린/티로신 키나제의 촉매반응 도메인에서 보존된 서브모티프는 그의 키나제 도메인을 불활성으로 만드는 것으로 생각되는 PTK7 단백질에서의 변화 (예컨대, 서브도메인 I 및 VII에서의 변화)가 주석화된 바와 같이, PTK7 배열 아래에 도시된다.
임의의 사건에서, 도 1c에 도시된 바와 같이 다양한 스플라이스 변이체가 그의 ECD 구조체와 상이한 PTK7 이소형을 코딩하는 반면, 성숙한 전장 PTK7 ECD는 7개의 면역글로불린-유사 도메인을 포함한다. 모든 이소형은 일반적인 클래스의 티로신 키나제에서 발견한 것과 실질적으로 상동인 세포질 도메인을 함유한다. 그러나, PTK7은 검출가능한 티로신 키나제 활성이 부족하기 때문에, 다양한 보존 키나제 서브도메인에서의 몇몇 아미노산 변화가 ATP의 손상된 결합을 초래하는 의사 키나제의 하위족(subfamily)에 속한다 (문헌 [Kroiher et al. Bioessays 23(1), 2001]). 특히, 서브도메인 I 및 VII에서의 주요 잔기는 ATP의 비-이동성 포스페이트와의 직접적인 상호작용뿐만 아니라 상기 포스페이트를 가교하는 Mg2 + 보조인자의 킬레이트화가 손상되도록 PTK7에서 변화된다 (문헌 [Hanks et al., Methods Enzymol 200, 1991]).
본 발명에 적합한 PTK7 폴리펩티드가 '성숙한' 단백질의 형태일 수 있거나 또는 더 큰 단백질, 예컨대 융합 단백질의 일부일 수 있음이 추가로 인식될 것이다. 분비 또는 선도 서열을 함유하는 추가의 아미노산 서열, 전구-, 프로- 또는 전구프로-단백질 서열, 또는 정제를 보조하는 서열, 예컨대 친화성 태그, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만 다중 히스티딘 잔기, FLAG 태그, HA 태그 또는 myc 태그를 포함하는 것이 종종 유리하다. 재조합형 제조 중 안정성을 제공할 수 있는 추가의 서열이 또한 사용될 수 있다. 그러한 서열은 추가의 서열로서 절단가능 (cleavable) 서열 또는 그의 일부를 도입시키는 것이 요구되는 경우 임의로 제거될 수 있다. 따라서, 본원에 정의된 PTK7 폴리펩티드는 다른 폴리펩티드를 포함하는 부속 (adjunct) 모이어티와 융합된 구조체를 포함할 수 있다. 그러한 추가의 서열 및 친화성 태그는 당업계에 널리 공지되어 있고, 표준 생화학적 기술을 사용하여 발생될 수 있다.
PTK7 기능의 생물학적 중요성은 그의 불활성 키나제 도메인에도 불구하고 히드라부터 초파리에서 닭 및 인간까지의 보존 오솔로그의 존재에서도 암시될 수 있으며, 그 각각은 서열 분석에 의해 키나제 활성이 부족함이 예측된다 (문헌 [Kroiher et al., 2001]). 헬릭스-헬릭스 회합의 성향과 관련된 특정 TM 도메인 모티프의 고도의 보존 및 리간드 부착에 반응하여 RTK가 전형적으로 이량화된다는 사실에 기반하여, TM 도메인이 PTK7 이량화를 매개할 수 있음이 제시되었다 (문헌 [Kroiher et al., 2001]). 후기 연구는 PTK7 TM 도메인이 우선적 자기-회합을 촉진시키지 않음을 제시하였으나 (문헌 [Kobus et al., Biochemistry 44(5), 2005]), 다른 RTK의 TM 도메인 또는 신호전달 복합체의 구성원과의 이가의 상호작용 (heteromeric interactions)을 배제하지 않았다. 따라서, PTK7 의사 키나제 도메인 그 자체는 신호를 직접 전송할 것으로 예상되지 않으나, 신호전달 경로에서 다른 분자에 대한 비계로서 상호작용할 수 있거나 또는 다른 티로신 키나제(들)를 동원할 수 있다 (문헌 [Kroiher et al., 2001]).
인간 PTK7은 태아 결장 및 세포주로부터 유도된 다양한 결장 암종 (문헌 [Mossie et al. supra, 1995])뿐만 아니라 전이성 결장직장 암종 (문헌 [Mossie et al. supra, 1995])에서 발현될 수 있지만 성인 결장에서는 발현되지 않는다. PTK7을 발현하는 것으로 보고되는 다른 정상 조직 및 세포는 폐, 갑상샘 및 난소 (문헌 [Mossie, Jallal et al. 1995]), CD4+ 최근 흉선 이주 T-세포 (문헌 [Haines et al., J Exp Med 206(2) 2009]), 및 정상 골수성 전구세포 및 CD34+CD38- 골수 세포 (문헌 [Prebet et al., Blood 116(13), 2010])를 포함한다. 암 조직에 대하여, PTK7 발현은 또한 결장 암종 세포에서 (문헌 [Mossie et al. 1995]); AML 샘플에서 (문헌 [Muller-Tidow, et al. Clin Cancer Res 10(4), 2004]); CD34-전구-TALL 세포에서 (문헌 [Shangguan et al., J Proteome Res 7(5) 2008]) 및 위 암종에서 (문헌 [Gorringe et al., Genes Chromosomes Cancer 42(3), 2005])에서 발견되고 있다. 흥미롭게도, PTK7은 원래 정상 멜라닌세포로부터 클로닝됨에도 불구하고, 전이성 흑색종에서는 상실되는 것으로 보고되었다 (문헌 [Easty et al., Int J Cancer 71(6), 1997]). 또한 PTK7은 유방암 세포주에서의 발현은 다양하지만 (문헌 [Su et al., J Cancer 1 2010]), 염색체 6p21의 삭제를 함유하는 임의의 유방암에서도 상실될 수 있다 (문헌 [Piao et al., Genes Chromosomes Cancer 30(2), 2001]). PTK7은 또한 폐 선암종에서 발현되고, 이때 더 강한 발현 정도는 이러한 종양에서의 더욱 호의적인 예후와 연관된다 (문헌 [Endoh et al., J Clin Oncol 22(5), 2004]). 골육종에서의 6p12-p21 영역의 증폭의 세밀한 맵핑은 유전자 복사수에서의 증가가 qRT-PCR에 의해 결정되는 바와 같이 반드시 PTK7의 과발현을 초래하지는 않음을 보여준다 (문헌 [Lu et al., Mol Cancer Res 6(6), 2008]).
리간드 또는 PTK7에 대한 리간드는 공지되지 않지만, PTK7은 다양한 생물학적 신호전달 경로 및 발달 과정에 연결되어 있다. 단백질의 면역글로불린-유사 ECD 도메인 구조체는 이것이 세포-세포 접촉 또는 접착에 참여하거나 그것을 감지할 수 있음을 제시한다. PTK7, OTK의 초파리 오솔로그는 축삭돌기 유도 (axon guidance) 중 세마포린 신호전달에 대한 잠재적인 보조-수용체로서 플렉신과 회합된다 (문헌 [Winberg et al., Neuron 32(1), 2001]). 최근 PTK7, KLG의 병아리 오솔로그가 병아리 심장 형태 형성 (cardiac morphogenesis)에 중요한 복합체에서 플렉신A1 및 세마6D와 상호작용함을 보여주는 한편 (문헌 [Toyofuku et al., Genes Dev 18(4), 2004]) 제노푸스(Xenopus)에서의 플렉신A1과 PTK7의 상호작용이 입증되었다 (문헌 [Wagner et al., Biochem Biophys Res Commun 402(2) 2010]). 가용성 PTK7 (sPTK7)을 사용하여 VEGF-유발된 혈관 형성에서뿐만 아니라 시험관내 인간 내피세포의 관 형성, 이동 및 침투에서의 PTK7의 역할을 보여주었다 (문헌 [Shin et al., Biochem Biophys Res Commun 371(4), 2008]). 마우스 PTK7은 또한 표피 상처 치유 과정에 연관되고 있고, 이는 액틴 세포골격 재배치(reorganization) 및 세포 이동을 요구한다 (문헌 [Caddy et al., Dev Cell 19(1), 2010]).
특정 신호전달 캐스케이드에 관하여, PTK7은 발달에 중요한 다양한 Wnt 신호전달 경로의 구성요소로 나타난다 (문헌 [Puppo et al., EMBO Rep 12(1), 2010]). Ptk7에서 널(null) 또는 심한 저차형 돌연변이 (hypomorphic mutation)를 발현하는 마우스는 평면 셀 극성 (PCP) 경로에서의 PTK7의 역할과 일치하는 표현형을 나타내면서 출산전후에 사망한다 (문헌 [Lu et al., Nature 430(6995), 2004]). 유사하게, ECD에서 3개의 아미노산 삽입을 갖는 돌연변이 PTK7 단백질을 함유하는 츄조이 ( chuzhoi ) 마우스는 PCP-결함성 표현형을 나타낸다 (문헌 [Paudyal, Damrau et al. 2010]). 뮤린 PTK7이 다른 PCP 유전자, 예컨대 Vangl2 (문헌 [Lu et al., 2004]), Celsr1 (문헌 [Paudyal, Damrau et al. 2010]), Scrb1 및 Grhl3 (문헌 [Caddy et al., 2010])과 유전적으로 상호작용하는 것으로 나타난다. 멤브레인 1 형 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MT1-MMP)가 가용성 PTK7 (즉, sPTK7)을 방출하기 위해 PTK7을 절단하고, MT1-MMP 활성 균형의 오조절 (disregulation) 및 sPTK7 생산은 제브라피시에서의 수렴 신장 (convergent extension) 결함을 초래하며, 또한 PCP 경로에서의 PTK7의 역할과 일치한다 (문헌 [Golubkov et al., J Biol Chem 285(46), 2010)]. 제노푸스에서, PTK7은 dsh를 갖는 복합체에서 발견되고 Wnt-수용체 fz7이 비-정규 (non-canonical) Wnt 신호전달 경로에서 발견된 반면에 (Shnitsar et al., Development 135(24), 2008), PTK7과 β-카테닌 사이의 상호작용은 마우스 세포에서의 정규 Wnt 신호전달에 의해 동역학상 영향을 받는 것으로 나타날 수 있었다 (문헌 [Puppo et al., 2010). 또한, PTK7 촉진제에서의 보존 TCF/LEF-전사 인자 결합 부위는 이것이 Wnt 응답 유전자이고 특정 결장직장암에서 PTK7 상향 조절을 설명할 수 있음을 제시하는데, 이는 이러한 종양이 Wnt 경로 신호전달에 대해 빈번하게 오조절 되기 때문이다 (Katoh, Int J Mol Med 20(3), 2007).
암 조직 내에서, 상기에 기재된 Wnt 경로를 조절하는 그의 잠재력 외에도, PTK는 PTK7의 RNAi 매개 녹-다운에 의해 역전될 수 있는 HCT116 결장 암종주, 표현형에서의 프로-증식 (pro-proliferation) 및 항-세포자멸 신호를 전달하는 것으로 나타난다 (Meng et al., PLoS One 5(11), 2010). PTK7 항-세포자멸 신호는 AML 아구에서의 안트라시클린-매개 세포 사멸에 대한 저항을 전달하였고, 이는 가용성 PTK7-Fc 단백질을 사용하여 역전될 수 있었다 (Prebet et al., 2010). PTK7을 결합하고 이어서 내재화하는 앱타머를 사용하여 배양 조직 내 T-ALL 세포로의 다우노루비신 전달을 표적화하는 전략에 특정 암 세포에 의한 PTK7의 과발현이 활용되고 있다 (Xiao et al., Chemistry 14(6), 2008).
전술한 특징에 추가로, 본 개시내용은 PTK7의 발현이 다양한 종양 개시 세포 집단에서 상승됨을 입증한다. 벌크(bulk) 종양에서의 일부 이상의 비-종양형성 세포에서 PTK7의 수반되는 상향조절과 함께, 이것은 PTK7 매개 리간드 수용체 상호작용이 종양 증식, 종양혈관형성 및/또는 종양 전이와 연결된 세포 신호전달 캐스케이드를 촉발시킬 수 있는 가능성을 발생시킨다. 임의의 특정 이론에 제한되고자 함은 아니지만, 본 발명의 PTK7 조절제 (특히 길항작용 또는 중화 실시양태)는 적어도 부분적으로는, 종양 개시 세포 빈도를 감소하거나 또는 제거하여 이로써 전통적인 표준 케어 치료 섭생 (예컨대 이리노테칸)과는 상이한 방식으로, 또는 면역요법 신호전달 또는 PTK7 발현 세포를 사멸시킬 수 있는 적재량의 전달을 통해 종양 증식 또는 생존을 간섭함으로써 작용하는 것으로 생각된다. 예를 들어, PTK7을 길항작용함에 의한 암 줄기 세포 활성에서의 감소는 증식성 세포를 제거하거나, 또는 종양 개시 세포의 분화를 유도하여 그것의 자가-재생 (즉 무제한적인 증식 및 다분화능의 유지) 능력을 잃게 하는 화학요법 섭생에도 불구하고 세포 증식을 단순히 촉진하는 것을 포함할 수 있다. 다르게는, 바람직한 실시양태에서, PTK7 발현 세포에 대한 세포독성 T-세포의 동원(recruitment), 또는 내재화할 수 있는 항-PTK7 항체에 접합된 강력한 독소의 전달은 TPC를 선택적으로 사멸시킬 수 있다.
III. 종양 지속 세포
당업계의 교시와는 달리, 본 발명은 종양 개시 세포 및 특히 종양 지속 세포를 표적화하고, 이로써 신생물 장애의 치료, 관리 또는 예방을 가능하게 하는데 특히 유용한 PTK7 조절제를 제공한다. 보다 구체적으로는, 놀랍게도, 상기에 나타낸 바와 같이, 특이적인 종양 세포 하위집단은 PTK7을 발현하며 암 줄기 세포 자가-재생 및 세포 생존에 중요한 모르포겐 신호전달의 국소 코디네이션을 변경시킬 수 있음이 발견되었다. 따라서, 바람직한 실시양태에서 PTK7의 조절제는 본 교시에 따라 종양 개시 세포 빈도를 감소시키고, 이로써 과증식성 질환의 치료 또는 관리를 가능하게 하는데 사용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 종양 개시 세포 (TIC)는 종양 지속 세포 (TPC; 즉, 암 줄기 세포 또는 CSC) 및 고도의 증식성 종양 전구 세포 (TProg라고 칭함) 둘다를 포함하며, 이들은 함께 벌크 종양 또는 덩어리의 독특한 하위집단 (즉 0.1 내지 40％)을 일반적으로 포함한다. 본 개시의 목적을 위해, 용어 종양 지속 세포 및 암 줄기 세포 또는 신생물 줄기 세포는 등가물이며, 본원에서 상호교환하여 사용할 수 있다. 반대로, TPC는, 종양 내에 존재하는 종양 세포의 조성물을 전적으로 개괄할 수 있다는 점, 낮은 수의 단리된 세포의 연속 이식 (마우스를 통한 2회 이상의 계대)에 의해 입증된 바와 같이 무제한의 자가 재생 능력을 가질 수 있다는 점에서, TProg와는 상이하다. 하기에 보다 상세히 논의하는 바와 같이, 적절한 세포 표면 마커를 사용하는 형광-활성화 세포 분리 (FACS)는, 적어도 어느 정도는, 단일 세포 및 세포 응괴 (즉 이중선 등) 사이를 구별하는 능력을 갖기 때문에, 고도로 풍부화된 세포 하위집단을 단리 (예컨대, > 99.5％ 순도)하는데 신뢰할 수 있는 방법이다. 이러한 기술을 이용하여, 고도로 정제된 TProg 세포의 낮은 세포수를 면역손상 마우스로 이식한 경우에, 이들은 1차 이식으로 종양 성장에 에너지를 공급할 수 있는 것으로 나타났다. 그러나, 정제된 TPC 하위집단과는 달리, TProg 발생 종양은 표현형 세포 이종의 모 종양을 전적으로 반영하지 않으며, 차후 이식의 재개시 연속 종양생성에 있어서 명백히 비효율적이다. 반대로, TPC 하위집단은 모 종양의 세포 이종을 전적으로 재구성하며, 연속적으로 단리하여 이식할 때에 종양을 효율적으로 개시할 수 있다. 따라서, 당업자는, TPC 및 TProg의 결정적 차이는, 이 둘이 1차 이식에서 발생되는 종양일 수 있다 하더라도, TPC가 낮은 세포수에서의 연속 이식에 대해 이종 종양 성장에 지속적으로 에너지를 공급할 수 있다는 독특한 능력을 갖고있다는 점이라는 것을 인식할 것이다. TPC를 특징짓는 다른 통상의 접근법은, 배양 조건 및 시험관 내에서의 세포주 계대를 가지고 마커 발현을 변화시킬 수 있긴 하지만, 형태학 및 세포 표면 마커의 조사, 전사 프로파일, 및 약물 반응이 포함된다.
따라서, 본 발명의 목적을 위해, 정상 줄기 세포와 같이, 정상 조직의 세포 체계를 지지하는 종양 지속 세포는, 이것이 다계열 분화에 대한 능력을 유지하면서 무한정으로 자가 재생할 수 있다는 능력으로 바람직하게는 정의될 수 있다. 따라서, 종양 지속 세포는 종양형성성 자손 (즉, 종양 개시 세포: TPC 및 TProg) 및 비-종양형성성 (NTG) 자손 둘다를 발생시킬 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 비-종양형성성 세포 (NTG)는 종양 개시 세포로부터 생성되나, 종양을 포함하는 이종 계열의 종양 세포를 자가 재생 또는 발생시킬 수 있는 능력을 그 자체는 가지지 않은 종양 세포를 의미한다. 실험상, NTG 세포는, 심지어 과다 세포수로 이식되었을 때에도, 마우스에서 종양을 재현가능하게 형성시킬 수 없다.
나타낸 바와 같이, TProg는 또한 마우스에서 종양을 발생시키는 그들의 제한된 능력으로 인하여 종양 개시 세포 (또는 TIC)로 분류된다. TProg는 TPC의 자손이며, 전형적으로 한정된 수의 비-자가-재생 세포 분열을 할 수 있다. 더욱이, TProg 세포는 조기 종양 전구 세포 (ETP) 및 후기 종양 전구 세포 (LTP)로 더 분열될 수 있으며, 이들 각각은 표현형 (예컨대, 세포 표면 마커) 및 종양 세포 아키텍처를 개괄하는 상이한 능력에 의해 구별될 수 있다. 이러한 기술적 차이에도 불구하고, ETP 및 LTP 둘다는 이들이 낮은 세포수로 이식되어서 모 종양의 이종을 전형적으로 반영하지 않을 때에는 일반적으로 종양을 연속적으로 덜 재구성할 수 있다는 점에서 TPC와는 기능적으로 다르다. 상기 차이에도 불구하고, 다양한 TProg 집단은, 드물게 줄기 세포에 통상적으로 기인하는 자가 재생 능력을 얻을 수 있으며, 그 자체로 TPC (또는 CSC)가 된다. 어쨌든, 두 종류의 종양-개시 세포는 한 환자의 전형적인 종양 덩어리로 나타내어 질 수도 있고, 본원에서 개시된 바와 같이, 조절제로 치료를 받게 된다. 즉, 개시된 조성물은, 특정 실시양태 또는 종양에서 나타나는 믹스에 상관없이, 빈도를 줄이거나 이러한 PTK7 양성 종양 개시 세포의 약제감수성을 변경시키는 데에 일반적으로 효과적이다.
본 발명의 맥락에서, TPC는 보다 종양형성성이며, 상대적으로 보다 비활동적이고, 종종, 종양 벌크를 포함하는 TProg (ETP 및 LTP 둘다), NTG 세포 및 종양-침윤성 비-TPC 유도 세포 (예컨대, 섬유모세포/간질, 내피 & 조혈 세포)보다 더 화학 내성적이다. 전통 요법 및 섭생이, 큰 부분에서, 종양을 용적축소시키는 것, 급속히 증식하는 세포를 공격한다는 것 둘 다를 위해 고안되었다는 것을 고려하면, TPC는 더 빠르게 증식하는 TProg 및 다른 벌크 종양 세포 집단보다 전통 요법 및 섭생에 대해 보다 내성이 있을 것 같다. 추가로, TPC는 이를 전통 요법에 비해 상대적으로 화학내성적이게 만드는 다른 특징 (예컨대, 다중 약물 내성 전달체 발현의 증가, DNA 복구 메카니즘 및 항-세포자멸 단백질의 향상)을 종종 발현시킨다. 이러한 특성, 즉 TPC에 의한 약물 내성에 기여하는 개개는, 진행기 신생물(advanced stage neoplasia)을 갖는 대부분의 환자에게 장기 이점을 보장하는 표준 종양학(oncology) 치료 섭생의 실패; 즉, 지속적인 종양 성장 및 재발 (즉 TPC 또는 CSC)에 에너지를 공급하는 그 세포를 적절하게 표적화하고 근절시키는데 실패에 대한 주 이유가 된다.
대부분의 상기한 당업계 치료와는 달리, 본 발명의 신규 조성물은 바람직하게는 선택적 조절제의 형태 또는 특이적인 표적 (예컨대, 유전 물질, PTK7 항체 또는 리간드 융합 구조체)에 상관없이 대상체에게의 투여에 따른 종양 개시 세포의 빈도를 감소시킨다. 상기 주지한 바와 같이, 종양 개시 세포 빈도의 감소는 a) 종양 개시 세포의 제거, 고갈, 민감화, 침묵 또는 억제; b) 종양 개시 세포의 성장, 확장 또는 재발을 조절하는 것; c) 종양 개시 세포의 개시, 번식, 유지 또는 증식을 중단시키는 것; 또는 d) 종양형성성 세포의 생존, 재생 및/또는 전이를 별도로 방해하는 것에 의한 결과로서 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양 개시 세포의 빈도에서의 감소는 하나 이상의 생리적 경로의 변화의 결과로서 일어난다. 경로의 변화는, 종양 개시 세포의 제거의 감소에 의해, 또는 이들의 잠재성 (예컨대, 유도 분화, 니치 파괴)을 변경시킴으로써, 또는 별도로 종양 환경 또는 다른 세포에 영향을 주는 이들의 능력이 간섭받는 것에 의해서이든지 간에, 결국 종양생성, 종양 유지 및/또는 전이 및 재발을 억제함으로써 PTK7 관련 장애가 보다 효과적으로 치료될 수 있게 된다.
이러한 종양 개시 세포의 빈도에서의 감소를 평가하는 데에 사용될 수 있는 방법 중에는 시험관내 또는 생체내 중 하나의 제한 희석법이며, 바람직하게는 후속으로 푸아송 분포 통계를 이용하여 산출하거나 또는 미리 정해진 결정적인 이벤트 (예컨대 생체내이든 아니든 종양을 발생시킬 수 있는 능력)의 빈도를 평가한다. 이러한 제한 희석법이 종양 개시 세포 빈도의 감소를 계산하는 바람직한 방법인 한편, 달리, 요구가 적은 방법도 (비록 약간 덜 정확할지라도) 효과적으로 원하는 값을 측정하는데 사용될 수 있으며, 본원의 교시에 전적으로 양립될 수 있다. 따라서, 당업계의 숙련자에 의해 인식되는 바와 같이, 익히 공지된 유세포분석 수단 또는 면역조직화학적 수단을 통한 빈도값의 감소를 측정하는 것도 가능하다. 상기 언급된 방법 모두에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Dylla et al. 2008, PMCID: PMC2413402 & Hoey et al. 2009, PMID: 19664991]을 참고한다; 이들 각각은 그 전체가 참고문헌으로 본원에 포함된다.
제한 희석법에 대해서는, 시험관내에서의 종양 개시 세포 빈도의 산출은 (예컨대 처리 및 비처리 종양 개개로부터) 분획되거나 또는 비분획된 것 중 하나의 인간 종양 세포를, 콜로니 형성을 육성시키는 시험관내 성장 조건에 둠으로써 달성할 수 있다. 이러한 방식으로, 콜로니 형성 세포를, 콜로니의 단순 계수 및 특징규명에 의해, 또는, 예를 들어 인간 종양 세포를 계열 희석의 플레이트로 침전시켜 각각을 플레이팅 후 최소 10일째에 콜로니 형성에 대해 양성 또는 음성으로 잘 스코어링하는 것으로 이루어지는 분석에 의해 산출할 수 있다. 생체내에서의 제한 희석 실험 또는 분석은, 종양 개시 세포 빈도를 측정하는 그의 능력에 있어서 일반적으로 보다 정확하며, 비처리 대조군 또는 처리 조건 중 하나로부터의 인간 종양 세포의 계열 희석 중 면역손상 마우스로의 이식 및 후속적으로 각 마우스를 이식 후 최소한 60일째에 종양 형성에 대해 양성 또는 음성으로 스코어링하는 것을 포함한다. 시험관내 또는 생체내에서의 제한 희석법에 의한 세포 빈도값의 도출은, 바람직하게는 푸아송 분포 통계를 양성 및 음성 이벤트의 기지의 빈도에 적용하고, 이에 따라 양성 이벤트의 정의 (이 경우, 콜로니 또는 종양 형성, 각각)을 달성한 이벤트에 대한 빈도를 제공함으로써 행해진다.
종양 개시 세포 빈도를 계산하는데 사용될 수 있는 본 발명에 적합한 다른 방법에 대하여, 가장 통상적인 것은 정량화할 수 있는 유동세포분석 기술 및 면역조직화학적 염색 공정를 포함한다. 바로 앞서 기재한 제한 희석법 기술만큼 정확하지는 않지만, 이들 공정는 노동 강도가 훨씬 작고, 상대적으로 단시간 프레임으로 합리적인 값을 제공한다. 따라서, 숙련자는 종양 개시 세포를 풍부하게 하는 것으로 알려진 세포 표면 단백질을 인식하여 결합하는 하나 이상의 항체 또는 시약(예컨대, 하기 실시예 1에 열거하는 잠재적으로 적합한 마커)을 채용하고, 이에 따라 다양한 샘플로부터 TIC 값을 측정하는 유동세포분석 세포 표면 마커 프로파일 측정을 사용할 수 있다. 또 다른 적합한 방법에 있어서, 당업계의 숙련자는 상기 세포를 구획하는 것으로 추정되는 세포 표면 단백질에 결합할 수 있는 하나 이상의 항체 또는 시약을 사용하는 면역조직화학에 의해 제자리(in situ) (예컨대, 조직 절편에서)에서 TIC 빈도를 산출할 수 있다.
상기 언급된 방법 중 어느 하나를 이용하여, 이어서 본원의 교시에 따라 개시된 PTK7 조절제 (세포독성제에 접합된 것을 포함함)에 의해 제공되는 TIC (또는 그의 TPC)의 빈도 감소를 정량할 수 있다. 특정한 경우에, 본 발명의 화합물은 (제거, 유도 분화, 니치 파괴, 침묵 등을 포함하는, 상기 주지된 다양한 메카니즘에 의한) TIC의 빈도를 10％, 15％, 20％, 25％, 30％까지 또는 심지어 35％까지 감소시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, TIC 빈도의 감소는 대략 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 또는 65%일 수 있다. 특정 실시양태에서, 개시 화합물은 TIC 빈도를 70％, 75％, 80％, 85％, 90％까지 또는 심지어 95％까지 감소시킬 수 있다. 물론, TIC의 빈도 중 어떠한 감소도 신생물의 종양형성성, 지속, 재발 및 공격성에서의 상응하는 감소를 초래할 것으로 보인다.
IV. PTK7 조절제
어떠한 경우에든, 본 발명은, 다수의 PTK7 관련 악성종양 중 어느 하나를 포함하는 다양한 장애의 진단, 테라그노시스, 치료 및/또는 예방용의 PTK7 길항제를 포함하는 PTK7 조절제의 용도에 관한 것이다. 개시된 조절제는 단독으로 또는 매우 다양한 항암 화합물, 예컨대 화학요법 또는 면역요법제 (예컨대, 치료용 항체) 또는 생물학적 반응 개질제와 조합하여 사용할 수 있다. 다른 선택적 실시양태에서, 둘 이상의 별개의 PTK7 조절제를, 증강된 항-신생물성 효과를 제공하기 위하여 조합하여 사용할 수 있거나, 다중특이적 구조체를 제작하기 위하여 사용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 PTK7 조절제는 뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 펩티드 또는 폴리펩티드를 포함할 것이다. 보다 훨씬 바람직하게는, 조절제는 가용성 PTK7 (sPTK7), 또는 그의 형태, 변이체, 유도체 또는 단편 [예를 들어, PTK7 융합 구조체 (예컨대, PTK7-Fc, PTK7-표적화 모이어티 등) 또는 PTK7-접합체 (예컨대, PTK7-PEG, PTK7-세포독성제, PTK7-brm 등)를 포함함]을 포함할 것이다. 또한, 다른 실시양태에서, PTK7 조절제는 항체 또는 그의 면역반응성 단편 또는 유도체를 포함할 것으로 인식될 것이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절제는 중화 항체, 또는 그의 유도체 또는 단편을 포함할 것이다. 다른 실시양태에서, PTK7 조절제는 내재화 항체 또는 그의 단편을 포함할 것이다. 또 다른 실시양태에서, PTK7 조절제는 고갈성 항체 또는 그의 단편을 포함할 것이다. 추가로, 상기 언급된 융합 구조체와 같이, 이들 항체 조절제는, 선택적 세포독성제, 중합체, 생물학적 반응 개질제 (BRM), 또는 다양한 (및 임의로 다중) 작용 메카니즘에 직접적인 면역요법을 제공하는 유사물과 접합, 링크 또는 별법으로 회합될 수 있다. 상기에 시사한 바와 같이, 이러한 항체는 pan-PTK7 항체일 수 있으며, 둘 이상의 PTK7 이소형 또는 단일 이소형과 선택적으로 반응하는 면역특이적 항체와 회합할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조절제는 유전자 수준에서 작용할 수 있으며, 안티센스 구조체, siRNA, 마이크로 RNA 등과 같은 화합물을 포함할 수 있다.
추가로, 개시된 PTK7 조절제는, 종양 세포, 특히, TPC, 및/또는 여러 가지 메카니즘 (선택적 경로를 효능화 또는 길항화하는 것, 또는 예를 들어 PTK7 조절제의 형태, 임의의 관련 적재량 또는 투여량 및 전달 방법에 의존하는 특이적 세포를 제거하는 것을 포함함)을 통하는 관련 신생물의 성장, 번식 또는 생존을 고갈, 침묵, 중화, 제거 또는 억제할 수 있는 것으로 인식될 것이다. 따라서, 본원에서 개시되는 바람직한 실시양태는 특이적 종양 세포 하위집단, 예컨대 종양 지속 세포의 고갈, 억제 또는 침묵에 관한 것이지만, 이러한 실시양태는 단지 예시이며, 어떠한 의미로든 제한하려는 것은 아니라는 것을 강조해야 할 것이다. 오히려, 첨부되는 특허청구범위에서 나타내는 바와 같이, 본 발명은 광범위하게 PTK7 조절제, 및 임의의 특정 메카니즘 또는 표적 종양 세포 집단과 상관없이, 다양한 PTK7 관련된 과증식성 장애의 치료, 관리 또는 예방에 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다.
동일한 의미에서, 본 발명의 개시된 실시양태는 PTK7과 회합하는 하나 이상 PTK7 길항제를 포함할 것이다. 그 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 PTK7 길항제는, PTK7 단백질 또는 그의 단편을 인식하거나 이들과 반응하거나 결합하거나 복합하거나 경쟁하거나 회합하거나 또는 별도로 상호작용하고, 또한, 벌크 종양 또는 NTG 세포를 포함하는 종양 개시 세포 또는 다른 신생물성 세포의 성장을 제거시키거나 침묵시키거나 감소시키거나 억제시키거나 방해하거나 저지시키거나 또는 조절하는, 임의의 리간드, 폴리펩티드, 펩티드, 융합 단백질, 항체 또는 그의 면역학적 활성 단편 또는 유도체를 포함할 것이다. 선택적인 실시양태에서, PTK7 조절제는 PTK7 길항제를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 길항제는 특정적 또는 특이적 단백질의 활성 (리간드와 수용체의 결합 또는 기질과 효소의 상호작용을 포함함)을 중화, 블록킹, 억제, 무효화, 감소 또는 간섭할 수 있는 분자를 의미한다. 보다 일반적으로, 본 발명의 길항제는 항체 및 그의 항원-결합 단편 또는 유도체, 단백질, 펩티드, 당단백질, 당펩티드, 당지질, 다당류, 올리고당류, 핵산, 안티센스 구조체, siRNA, miRNA, 생물유기화학적 분자, 펩티드 모방체, 약리적 작용제 및 이들의 대사산물, 전사 및 번역 조절 서열 등을 포함할 것이다. 길항제는 또한, 단백질에 특이적으로 결합함으로써 그의 기질 표적, 상기 단백질의 길항제 변이체, 상기 단백질에 대한 안티센스 분자, RNA 앱타머 및 상기 단백질에 대한 리보자임과의 결합을 격리시키는 소분자 억제제, 융합 단백질, 수용체 분자 및 유도체를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되며 둘 이상의 분자 또는 화합물 또는 화합물에 적용되는 용어 인식하다 또는 회합하다는 한 분자가 다른 분자에 영향을 끼칠 수 있는 분자의 공유결합 또는 비공유결합의 반응, 결합, 특이적 결합, 복합, 상호작용, 연결, 링크, 일체화, 합체, 합병 또는 합류한다는 의미를 가질 것이다.
더욱이, 본원의 실시예에서 입증되는 바와 같이, 인간 PTK7의 특정 조절제는, 특정한 경우에, 인간 이외의 다른 종 (예컨대, 뮤린)으로부터의 PTK7과 교차-반응할 수 있다. 다른 경우에서, 예시적인 조절제는 하나 이상의 이소형의 인간 PTK7에 특이적일 수 있으며, 다른 종으로부터의 PTK7 오솔로그와 교차반응성을 나타내지는 않을 것이다. 물론, 본원에서의 교시와 함께, 단일 종으로부터의 둘 이상의 이소형과 회합하는 pan-PTK7 항체, 또는 단일 이소형과 배타적으로 회합하는 항체를 포함할 수 있다.
어떠한 경우에든, 하기에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 당업자는 개시된 조절제가 접합된 형태 또는 비접합된 형태로 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 즉, 상기 조절제는 제약학적 활성 화합물, 생물학적 반응 개질제, 항암제, 세포독성제 또는 세포정지제, 진단적 모이어티 또는 생체적합성 개질제와 (예컨대 공유결합적으로 또는 비-공유결합적으로) 회합되거나 또는 접합될 수 있다. 이 점에 있어서, 이러한 접합체는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 융합 단백질, 핵산 분자, 소분자, 모방제, 합성 약물, 무기 분자, 유기 분자 및 방사성 동위원소를 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다. 더욱이, 본원에서 나타내는 바와 같이, 선택적인 접합체는, 적어도 부분적으로는 접합에 영향을 미치는데 사용되는 방법에 따라 다양한 몰비로 PTK7 조절제와 공유결합적으로 또는 비-공유결합적으로 링크될 수 있다.
V. 항체
a. 개요
특히 바람직한 실시양태에 대해 이전에 시사한 바와 같이, 본 발명은 PTK7의 하나 이상의 이소형과 우선적으로 회합하는 항체 형태의 PTK7 조절제를 포함한다. 용어 항체는, 가장 넓은 의미로 사용되고, 이들이 원하는 생물학적 활성 (즉, 면역특이적 또는 면역우선적 PTK7 회합 또는 결합)을 나타내는 한, 합성 항체, 단일클론 항체, 올리고클론 또는 폴리클론 항체, 멀티클론 항체, 재조합적으로 제조된 항체, 세포내 항체(intrabody), 다중특이적 항체, 이중특이적 항체, 일가 항체, 다가 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, CDR-이식 항체, 영장류화 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, 단일-쇄 FvFcs (scFvFc), 단일-쇄 Fvs (scFv), 항-개별특이형 (anti-Id) 항체 및 임의의 다른 면역학적 활성 항체 단편을 특이적으로 포함한다. 보다 넓은 의미로는, 본 발명의 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편 (즉, 항원 결합 부위를 함유하는 분자이며, 상기 부위에서 이들 단편은, 이에 제한되지 않는 Fc 영역 또는 그의 단편을 비롯한 또 다른 면역글로불린 도메인과 융합되거나 될 수 없음)을 포함한다. 추가로, 본원에서 보다 상세하게 개요를 서술하는 바와 같이, 용어 항체 및 항체들은, 하기에서 기재하는 바와 같이, 전장 항체 및 Fc 영역을 함유하는 변이체 Fc-융합물, 또는 그의 단편을 포함하고, 임의로 하나 이상의 아미노산 잔기 수식을 포함하며, 면역글로불린의 면역학적 활성 단편과 융합되는 Fc 변이체를 포함한다.
하기에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 유전적 용어 항체 또는 면역글로불린은, 생화학적으로 구별될 수 있는 항체의 5개의 특징적인 클래스를 포함하며, 이들의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 적절한 클래스로 용이하게 배정될 수 있다. 역사적 이유로, 무손상 항체의 주요 클래스는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 일컬어진다. 인간에서, IgG 및 IgA 클래스는, 구조 및 특정한 생화학적 특성에 따라 인지된 서브클래스 (이소타입), 즉, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 나누어 질 수 있다. 인간의 IgG 이소타입은 혈청 중에 가장 풍부한 순으로 명명되었으며, 가장 풍부한 것이 IgG1인 것으로 인식할 것이다.
항체의 5개의 모든 클래스 (즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM) 및 모든 이소타입 (즉, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, and IgA2), 뿐만 아니라 이들의 변이는 본 발명의 범위 내이지만, 면역글로불린의 IgG 클래스를 포함하는 바람직한 실시양태는 본 발명의 목적을 위해 단독으로 좀 더 상세하게 논의될 것이다. 그러나, 이러한 개시는 본 발명을 실시하기 위한 예시적 조성물 및 방법으로 단지 명시하는 것이며, 본 발명 또는 여기에 첨부된 특허청구범위의 범위를 어떠한 방식으로든 제한하려는 것은 아닌 것으로 이해될 것이다.
이 점에 있어서, 인간 IgG 면역글로불린은 분자량이 대략 23,000 달톤인 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드, 및 이소타입에 따라 분자량이 53,000 내지 70,000인 2개의 동일한 중쇄를 포함한다. 상이한 클래스의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 상응하는 소문자의 그리스 문자 α, δ, ε, γ 및 μ 각각에 의해 표시된다. 임의의 척추동물 종으로부터의 항체의 경쇄는, 이들의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여, 2개의 명백하게 뚜렷한 타입 (카파 (κ) 및 람다 (λ)로 칭함) 중 하나로 지정될 수 있다. 당업자는 상이한 클래스의 면역글로불린의 서브유닛 구조 및 3차원 배열이 익히 공지되어 있다는 것을 인식할 것이다.
4개의 사슬이 Y 배열로 이황화 결합에 의해 연결(join)되어 있으며, 여기서 Y의 입 쪽에서 출발하여 가변 영역으로 쭉 이어져 Y의 2개의 말단까지의 중쇄를 경쇄가 블랭킷하고 있다. 각각의 경쇄는 1개의 공유결합적 이황화 결합에 의해 중쇄에 링크되어 있는 반면, 힌지 영역에서는 2개의 이황화 결합에 의해 중쇄에 연결되어 있다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 떨어져 있는 사슬 내 이황화 가교를 가지고 있으며, 이들 수는 IgG의 이소타입에 기초하여 달라질 수 있다.
각각의 중쇄는 한쪽 말단에서 가변 도메인 (VH)에 이어서 다수의 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한쪽 말단에서 가변 도메인 (VL) 및 그의 다른 말단에서 불변 도메인을 가지며; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 첫번째 불변 도메인과 함께 맞춰지고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 함께 맞춰진다. 이와 관련하여, 경쇄 (VL) 및 중쇄 (VH) 부분 둘다의 가변 도메인은 항원 인식 및 특이성을 결정하는 것으로 인식할 것이다. 반대로, 경쇄 (CL) 및 중쇄 (CH1, CH2 또는 CH3)의 불변 도메인은 중요한 생물학적 특성, 예컨대 분비, 경태반 이동성, 순환 반감기, 보체 결합 등을 부여하고 조절한다. 관례상, 불변 영역 도메인의 숫자체계는 이들이 항체의 항체 결합 부위 또는 아미노-말단으로부터 더 먼 쪽이 될수록 커진다. 따라서, 항체의 아미노 또는 N-말단은 가변 영역을 포함하고, 카르복시 또는 C-말단은 불변 영역을 포함한다. 따라서, CH3 및 CL 도메인은 실제로 중쇄 및 경쇄의 카르복시-말단을 각각 포함한다.
용어 가변은, 가변 도메인의 특정 부분이 면역글로불린 중의 서열에 있어서 광범위하게 상이하며, 이들 핫스팟이 특정 항체의 결합 및 특이성 특징을 대체로 정의한다는 점을 의미한다. 이들 초가변 부위는, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘다의 각각에서 상보성 결정 영역 (complementarity determining region, CDR)으로 알려진 3개의 분절에 분명히 나타난다. CDR 옆에 배치된 가변 도메인의 보다 고도의 보존 영역은 프레임워크 영역 (framework region, FR)으로 불린다. 보다 구체적으로, 자연적으로 발생하는 단량체성 IgG 항체의 경우에, 항체의 각 아암(arm)에 존재하는 6개의 CDR은, 항체를 수성 환경에서 그의 3차원 배열을 추정해 볼 때, 특정하게 위치배열되어 항원 결합 부위를 형성하는 아미노산의 짧은 비-연속성 서열이다.
중쇄 및 경쇄 가변 도메인의 잔부를 포함하는 프레임워크 영역은 아미노산 서열에서 분자 간 가변성이 적다는 것을 보여 준다. 오히려, 프레임워크 영역은 대체로 β-시트 입체형태를 취하고, CDR은 β-시트 구조에 연결된 (또한, 특정 경우에 상기 시트 구조의 일부를 형성하는) 루프를 형성한다. 따라서, 이들 프레임워크 영역은, 6개의 CDR이 사슬 간, 비-공유결합적 상호작용에 의해 올바른 배향으로 위치결정되도록 하는 스캐폴드를 형성하기 위해 작용한다. 위치결정된 CDR에 의해 형성된 항원-결합 부위는 면역반응성 항원 상의 에피토프에 상호보완적인 표면을 규정한다. 이러한 상호보완적 표면은 항체가 면역반응성 항원 에피토프에 비-공유결합적으로 결합하는 것을 촉진시킨다. CDR의 위치 및 구성은 당업계의 숙련자에 의해 본원에 제공된 정의를 사용하여 용이하게 확인될 수 있는 것으로 인식될 것이다.
하기에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 전부 또는 일부는 표준 재조합 및 발현 기술을 이용하여 재조합되거나 유전공학처리되어 유효한 항체를 제공할 수 있다. 즉, 일차 항체 (또는 이의 임의의 부분)로부터의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역은 이차 항체로부터의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 임의의 선택적인 부분에 짜 맞추어질 수 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서, 일차 항체의 3개의 경쇄 CDR을 포함하는 전체 경쇄 가변 영역은 이차 항체의 3개의 중쇄 CDR을 포함하는 전체 중쇄 가변 영역과 한쌍이 되어 작동성 항체를 제공할 수 있다. 추가로, 다른 실시양태에서, 다양한 항체로부터 유도된 개개의 중쇄 및 경쇄 CDR이 짜 맞추어져서 최적의 특징을 갖는 원하는 항체를 제공할 수 있다. 따라서, 예시적인 항체는 일차 항체로부터의 3개의 경쇄 CDR, 이차 항체로부터 유도된 2개의 CDR 및 삼차 항체로부터의 3분의 1의 중쇄 CDR을 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 문맥에서, 도 6a 또는 도 6b에 제시된 뮤린 가변 영역 아미노산 서열로부터 유도된, 임의의 개시된 중쇄 및 경쇄 CDR이 이러한 방식으로 재배열되어, 본 교시에 따라 최적화 항-PTK7 (예컨대 항-hPTK7) 항체를 제공할 수 있는 것으로 인식될 것이다. 즉, 도 6a에 제시된 인접 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 (서열 20-60, 짝수) 또는 도 6b에 제시된 인접 중쇄 가변 영역 아미노산 서열 (서열 21-61, 홀수)로부터 유래된 하나 이상의 CDR은 PTK7 조절제로, 특히 바람직한 실시양태에서는 하나 이상의 PTK7 이소형과 면역특이적으로 회합하는 CDR 이식 항체 또는 인간화 항체로 도입될 수 있다. 그러한 인간화 조절제의 경쇄 (서열 62-68, 짝수) 및 중쇄 (서열 63-69, 홀수) 가변 영역 아미노산 서열의 예시가 또한 도 6a 및 도 6b에 제시된다. 이러한 신규 아미노산 서열을 모두 합쳐 본 발명에 따른 21개의 뮤린 및 4개의 인간화 예시적 조절제를 묘사한다. 게다가, 도 6a 및 6b에 제시된 21개의 예시적 뮤린 조절제 및 4개의 인간화 조절제 각각의 상응하는 핵산 서열이 본 출원에 첨부된 서열 목록에 포함된다 (서열 120-169).
어떠한 경우에든, 상보성 결정 영역 잔기 번호는 문헌 [Kabat et al., 1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.]의 것으로 정의될 수 있으며, 구체적으로, 경쇄 가변 도메인의 경우 잔기 24 내지 34 (CDR1), 50 내지 56 (CDR2) 및 89 내지 97 (CDR3), 중쇄 가변 도메인의 경우 31 내지 35 (CDR1), 50 내지 65 (CDR2) 및 95 내지 102 (CDR3)이다. CDR은 항체에서 항체까지 상당히 다르다 (또한, 정의상 카바트 컨센서스 서열(Kabat consensus sequence)과의 상동성을 나타내지 않음)는 것을 주지한다. 프레임워크 잔기가 최대로 정렬되기 위해서는, 넘버링 시스템에서 Fv 영역에 사용되는 스페이서 잔기를 삽입하는 것이 종종 요구된다. 또한, 임의의 주어진 카바트 부위 번호에서 특정한 개개의 잔기의 동종은 종간 또는 대립형질 상이로 인해 항체 사슬에서 항체 사슬까지 달라질 수 있다. 또한, 문헌 [Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342, pp. 877-883 (1989), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996) 및 S. Dubel, ed., Handbook of Therapeutic Antibodies , 3rd ed.,　WILEY-VCH Verlag GmbH and Co. (2007)]을 참고하며, 여기에는 상기 정의가 서로 비교할 때에 아미노산 잔기의 겹쳐짐 또는 서브세트를 포함한다고 되어 있다. 상기 언급된 참고 문헌 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함되며, 상기 언급된 참고 문헌 각각에 의해 정의된 바와 같은 결합 영역 또는 CDR을 포함하는 아미노산 잔기는 비교를 위해 하기에 제시한다.
CDR 정의
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본원에서 논의된 바와 같이, 당업자는 도 6a 및 도 6b에 제시된 각각의 중쇄 및 경쇄 서열에 대한 카바트 등, 코티아 등 또는 맥칼럼 등에 의해 정의된 CDR을 용이하게 정의, 확인, 유도 및/또는 열거할 수 있다. 따라서, 상기 모든 명명법에 의해 정의된 CDR을 포함하는 각각의 대상체 CDR 및 항체는 본 발명의 범위 내에 명백하게 포함된다. 보다 광범위하게, 용어 가변 영역 CDR 아미노산 잔기는 상기 나타낸 임의의 서열 또는 구조 기초 방법을 이용하여 확인된 CDR의 아미노산을 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 가변 영역 프레임워크 (FR) 아미노산 잔기는 Ig 사슬의 프레임워크 영역의 상기 아미노산을 의미한다. 본원에서 사용되는 용어 프레임워크 영역 또는 FR 영역은 가변 영역의 일부이나, CDR (예컨대, 카바트를 이용한 CDR의 정의)의 일부는 아닌 아미노산 잔기를 포함한다. 따라서, 가변 영역 프레임워크는 길이가 약 100 내지 120 아미노산인 비-연속성 서열이나, CDR 바깥쪽의 상기 아미노산만을 포함한다.
중쇄 가변 영역의 구체적인 예 및 카바트 등에 의해 정의된 CDR에 대해, 프레임워크 영역 1은 아미노산 1 내지 30을 포함하는 가변 영역의 도메인에 상응하고; 프레임워크 영역 2는 아미노산 36 내지 49를 포함하는 가변 영역의 도메인에 상응하고; 프레임워크 영역 3은 아미노산 66 내지 94를 포함하는 가변 영역의 도메인에 상응하고, 또한, 프레임워크 영역 4는 아미노산 103에서부터 가변 영역의 말단까지의 가변 영역의 도메인에 상응한다. 경쇄에 대한 프레임워크는 경쇄 가변 영역 CDR 각각에 의해 유사하게 분리되어 있다. 유사하게, 맥컬럼 등 또는 코티아 등 에 의한 CDR의 정의 (예컨대, CDR-L1 23-34, CDR-L2 50-56, CDR-L3 89-97; CDR-H1 26-32, CDR-H2 50-58, CDR-H3 95-102)를 이용하면, 프레임워크 영역 경계는 상기한 바와 같이 각 CDR 말단에 의해 분리되어 있다.
상기 언급된 구조적 고찰을 고려해 보면, 당업자는 본 발명의 항체가 다수의 기능적 실시양태 중 임의의 하나를 포함할 수 있는 것을 인식할 것이다. 이 점에 있어서, 적합한 항체는 대상체에서 원하는 생리적 반응을 제공하는 임의의 면역반응성 항체 (용어는 본원에서 정의된 바와 같음)를 포함할 수 있다. 개시된 항체의 하나는 본 교시와 함께 사용할 수 있지만, 본 발명의 특정한 실시양태는 키메라, 인간화 또는 인간 단일클론 항체 또는 그의 면역반응성 단편을 포함할 것이다. 또 다른 실시양태는, 예를 들어, 동종 또는 이종 다합체성 구조체, Fc 변이체 및 접합된 또는 글리코실화 변형된 항체를 포함한다. 추가로, 이러한 배열은 상호 배타적이지 않다는 점, 적합한 개개의 항체는 본원에 개시된 기능적 측면 중 하나 이상을 포함할 수 있다는 점을 이해할 것이다. 예를 들어, 적합한 항체는 인간화 가변 영역을 갖는 단일 사슬 디아바디, 또는 혈청 반감기를 조정하는 글리코실화 패턴을 변경하는 Fc 수식된 완전 인간 전장 IgG3 항체를 포함할 수 있다. 다른 예시적인 실시양태는 당업자에게 용이하게 명백하며 본 발명의 범위 내에 존재하는 것으로 쉽게 식별될 수 있다.
b. 항체 생성
익히 공지된 바와 같으며, 본원에서 실시예에 나타낸 바와 같이, 토끼, 마우스, 래트 등을 비롯한 다양한 숙주 동물을 접종시켜서 본원에서의 교시에 따른 항체를 제공하는데 사용할 수 있다. 접종되는 종에 따라, 면역학적 반응을 증강시키는데 사용될 수 있는 당업계 공지의 아쥬반트는, 비제한적으로, 프로인트 (완전 및 불완전), 미네랄 젤, 예컨대 수산화알루미늄, 표면 활성 물질, 예컨대 리소레시틴, 플루로닉 폴리올, 다음이온, 펩티드, 오일 에멀젼, 키홀 림펫 헤모시아닌, 디니트로페놀, 및 잠재적으로 유용한 인간 아쥬반트, 예컨대 BCG (바실 칼메테 게랭) 및 코리네박테륨 파르붐을 포함한다. 상기 아쥬반트는 항원을 국소 침착으로 격리시킴으로써 급속한 분산으로부터 항원을 보호할 수 있거나, 또는 이들은 대식세포, 및 면역계의 다른 성분에 대한 화학주성인 인자를 분비하는 숙주를 자극하는 물질을 함유할 수 있다. 바람직하게는, 폴리펩티드를 투여하는 경우에, 면역화 스케줄은 폴리펩티드를 몇 주에 걸쳐서 2회 이상 투여하는 것을 포함할 것이다.
선택적 이소형 및/또는 펩티드를 포함할 수 있는 PTK7 면역원 (예컨대, 가용성 PTK7 또는 sPTK7), 또는 원하는 단백질을 발현하는 생세포 또는 세포 제제로 동물을 면역화한 후에, 항체 및/또는 항체-생산 세포는 당업계에서 인정된 기술을 이용하여 상기 동물로부터 얻을 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리클론 항-PTK7 항체-함유 혈청은 상기 동물로부터 혈액을 뽑거나 동물을 희생시켜서 얻는다. 상기 혈청은 상기 동물로부터 얻은 형태로 연구 목적을 위해 사용할 수 있거나, 별법으로, 항-PTK7 항체는 부분적으로 또는 완전히 정제하여 면역글로불린 분획물 또는 동종 항체 제제를 제공할 수 있다.
c. 단일클론 항체
폴리클론 항체는 본 발명의 특정한 양태와 함께 사용될 수 있지만, 바람직한 실시양태는 PTK7 반응성 단일클론 항체의 사용을 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 단일클론 항체 또는 mAb는 실질적 동종 항체 집단으로부터 얻은 항체를 의미하며, 즉 상기 집단을 구성하는 개개의 항체는 가능한 돌연변이, 예컨대 자연적으로 발생하는 돌연변이 (이들은 소량으로 존재할 수 있음)를 제외하고는, 동일하다. 따라서, 개질제 단일클론은 항체의 형질을 별개의 항체의 혼합물이 아닌 것을 가리키며, 임의 타입의 항체와 함께 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 단일클론 항체는, PTK7과 결합하거나 회합하는 폴리펩티드 서열을 포함하는 항체를 포함하며, 여기서 PTK7-결합 폴리펩티드 서열은 다수의 폴리펩티드 서열로부터 단일 표적 결합 폴리펩티드 서열의 선별을 포함하는 과정에 의해 얻었다.
바람직한 실시양태에서, 항체-생산 세포주는 면역화 동물로부터 단리된 세포로부터 제조된다. 면역화한 후에, 상기 동물을 희생시키고, 림프절 및/또는 비장 B 세포는 첨부 실시예에 나타낸 바와 같은 당업계에 익히 공지된 방법에 의해 무한증식시킨다. 세포의 무한증식 방법은, 비제한적으로, 이들을 종양유전자로 트랜스펙션시키고, 이들을 종양발생성 바이러스로 감염시키고, 무한증식 세포를 선별하는 조건하에서 이들을 배양시키고, 이들을 발암성 또는 돌연변이성 화합물에 적용시키고, 무한증식 세포, 예컨대 골수종 세포와 융합시키고, 종양 억제 유전자를 불활성화시키는 것을 포함한다. 골수종 세포와의 융합을 이용하는 경우에, 상기 골수종 세포는 바람직하게는 면역글로불린 폴리펩티드를 분비하지 않는다 (비-분비 세포주). 하기의 실시예에서 제시된 바와 같이, 무한증식 세포는 PTK7 (선택적 이소형을 포함함) 또는 그의 면역반응성 부분을 이용하여 스크리닝할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 효소-결합 면역측정법 (ELISA) 또는 방사면역측정법을 이용하여 초기 스크리닝을 수행한다.
보다 일반적으로, 본 발명에 부합하는 별개의 단일클론 항체는 하이브리도마, 재조합 기술, 파지 디스플레이 기술, 효모 라이브러리, 트랜스제닉 동물 (예컨대 제노마우스(XenoMouse)® 또는 HuMAb 마우스(HuMAb Mouse)® 또는 그의 특정 조합을 비롯한 당업계 공지된 매우 다양한 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 단일클론 항체는 하이브리도마 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 이 기술은, 예컨대, 상기에 대략적으로 기재되어 있고, 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling, et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)]에 보다 상세히 교시되어 있고, 상기 문헌 각각은 본원에 포함된다. 개시된 프로토콜을 이용하여, 항체는 바람직하게는 관련 항원 및 아쥬반트의 다중 피하 또는 복강내 주사에 의해 포유동물에서 생성시킨다. 이전에 논의한 바와 같이, 이러한 면역화는 일반적으로 활성화된 비장세포 또는 림프구로부터 (면역화 동물이 트랜스제닉인 경우 완전히 인간일 수 있는) 항원-반응성 항체의 생성을 포함하는 면역 반응을 이끌어낸다. 생성된 항체는, 폴리클론 제제를 제공하기 위하여 동물의 혈청으로부터 수확할 수 있지만, 일반적으로 단일클론 항체의 동종 제제를 제공하기 위하여 비장, 림프절 또는 말초혈액으로부터 개개의 림프구를 단리하는 것이 보다 바람직하다. 가장 전형적으로는, 하이브리도마를 제공하기 위하여, 비장으로부터 상기 림프구를 수득하여 무한증식시킨다.
예를 들어, 상기 기재된 바와 같이, 선별 과정은, 다수의 클론, 예컨대 하이브리도마 클론, 파지 클론, 또는 재조합 DNA 클론의 풀(pool)로부터 독특한 클론의 선별일 수 있다. 선택된 PTK7 결합 서열은, 예를 들어 표적에 대한 친화도를 향상시키기 위해, 표적 결합 서열을 인간화시키기 위해, 세포 배양에서의 그의 생성을 향상시키기 위해, 생체내에서 그의 면역원성을 감소시키기 위해, 다중특이적 항체 등을 생성시키기 위해 추가로 변형시킬 수 있다는 것, 상기 변형된 표적 결합 서열을 포함하는 항체도 본 발명의 단일클론 항체라는 것으로 이해되어야 한다. 폴리클론 항체 제제 (이들은 전형적으로 상이한 결정인자 (에피토프)를 겨냥하는 별개의 항체를 포함함)와 대조하여, 단일클론 항체 제제의 각각의 단일클론 항체는 항원에 대한 단일 결정인자를 겨냥한다. 이들의 특이성에 더하여, 단일클론 항체 제제는 교차-반응성일 수 있는 다른 면역글로불린에 의해 전형적으로 오염되지 않는다는 점에서 유리하다.
d. 키메라 항체
다른 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 2종 이상의 상이한 종 또는 항체의 종류로부터의 단백질 절편이 공유결합적으로 결합하여 유래된 키메라 항체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 키메라 항체는, 중쇄 및/또는 경쇄의 부분은 특정한 종에서 유래되거나 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 동종이지만, 사슬(들)의 잔부는 또 다른 종에서 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체, 뿐만 아니라 원하는 생물학적 활성을 나타내기만 하면 상기 항체의 단편에서의 상응하는 서열과 동일하거나 또는 동종인 구조체(U.S. Pat. No. 4,816,567; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))를 의미하는 것으로 인식할 것이다. 일 예시적인 실시양태에서, 본원에서의 교시에 따른 키메라 항체는 뮤린 VH and VL 아미노산 서열 및 인간 근원에서 유래된 불변 영역을 포함할 수 있다. 다른 적합한 실시양태에서, 본 발명의 키메라 항체는, 본원에 기재되는 바와 같이 CDR 이식 또는 인간화 항체를 포함할 수 있다.
일반적으로, 키메라 항체 제조의 목표는 의도하는 대상체 종으로부터 아미노산 수를 최대화하여 키메라를 제작하는 것에 있다. 한 예로서, CDR-이식 항체는, 그 항체가 특정한 종에서 유래하거나 또는 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하지만, 항체 사슬(들)의 잔부는 또 다른 종에서 유래되거나 또는 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체에서의 상응하는 서열과 동일하거나 동종인 것이다. 인간에서의 사용을 위해, 설치류 항체로부터의 가변 영역 또는 선택적 CDR이, 인간 항체의 자연적 발생 가변 영역 또는 CDR을 대체함으로써 인간 항체로 종종 이식된다. 이러한 구조체는, 일반적으로 항체에 대해 원하지 않는 면역 반응을 감소시키면서 전체 강도 조절제 기능 (예컨대, CDC, ADCC 등)을 제공하는 이점을 갖는다.
e. 인간화 항체
인간화 항체는 CDR 이식 항체와 유사하다. 일반적으로, 인간화 항체는, 비-인간 동물에서 초기에 생성된 단일클론 항체로부터 제조된다. 본원에서 사용된 바와 같이 비-인간 (예컨대, 뮤린) 항체의 인간화 형태는, 비-인간 면역글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 한 실시양태에서, 인간화 항체는, 수용자 항체의 CDR로부터의 잔기가 원하는 특이성, 친화성 및/또는 능력을 갖는 비-인간 종 (공여자 항체), 예컨대 마우스, 래트, 토끼 또는 비인간의 영장류의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 면역글로불린 (수용자 또는 수납자 항체)이다.
일반적으로 항체의 인간화는 공여자 및 수용자 항체 둘다의 서열 상동성 및 정본 구조의 분석을 포함한다. 선택적인 실시양태에서, 수용자 항체는 컨센서스 서열을 포함할 수 있다. 컨센서스 인간 프레임워크를 제작하기 위해서, 수개의 인간 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열로부터의 프레임워크를 정렬시켜 컨센서스 아미노산 서열을 확인할 수 있다. 더욱이, 대부분의 경우에, 인간 면역글로불린의 가변 도메인에서의 하나 이상의 프레임워크 잔기는 공여자 항체로부터의 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 이들 프레임워크 치환은 당업계의 익히 공지된 방법에 의해, 예컨대 항원 결합 및 서열 비교에 중요한 프레임워크 잔기를 확인하고 특정한 위치에서 이상 프레임워크 잔기를 확인하는 CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용 모델링에 의해 확인된다. 이러한 치환은 이식된 CDR(들)의 적절한 3차원 배열을 유지시키는 것을 돕고, 프레임워크 치환이 없는 유사한 구조체에 대한 무한성을 종종 향상시킨다. 더욱이, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 익히 공지된 기술을 이용하여 항체 성능을 추가로 개선시키기 위해 행해질 수 있다.
CDR 이식 및 인간화 항체는, 예를 들어 U.S.P.Ns. 6,180,370, 5,693,762, 5,693,761, 5,585,089 및 5,530,101에 기재되어 있다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR은 비-인간 면역글로불린의 그것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 프레임워크 영역은 인간 면역글로불린 서열의 그것에 상응한다. 또한, 인간화 항체는 적어도 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 일부, 전형적으로 인간 면역글로불린의 그것을 임의로 포함할 것이다. 보다 상세한 것은, 예컨대 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참고한다. 또한, 예컨대 문헌[Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)]; 및 U.S.P.Ns. 6,982,321 및 7,087,409를 참고한다. 또한 또 다른 방법은 인간공학(humaneering)을 일컬으며, 예를 들어 U.S. 2005/0008625에 기재되어 있다. 본 출원의 목적을 위해, 용어 인간화 항체는 프레임워크 치환이 없거나 최소인 CDR 이식 항체 (즉 하나 이상 이식된 비-인간 CDR을 포함하는 인간 항체)를 명확히 포함하고 있을 것이다.
추가로, 비-인간 항-PTK7 항체는 WO 98/52976 및 WO 00/34317에 개시된 방법에 의해 인간 T 세포 에피토프의 특이적 결실 또는 탈면역화에 의해 또한 변경시킬 수 있다. 간략하게는, 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 MHC 클래스 II에 결합하는 펩티드에 대해 분석할 수 있으며; 이들 펩티드는 잠재성 T-세포 에피토프 (WO 98/52976 및 WO 00/34317에 정의되어 있음)를 나타낸다. 잠재성 T-세포 에피토프의 검출을 위해, WO 98/52976 및 WO 00/34317에 기재된 바와 같이, 펩티드 스레딩(peptide threading)이라고 불리는 컴퓨터 모델링 접근법을 적용할 수 있고, 또한 VH 및 VL 서열에 존재하는 모티프에 대해 인간 MHC 클래스 II 결합 펩티드의 데이터베이스를 조사할 수 있다. 이들 모티프는 18개의 주요 MHC 클래스 II DR 동종이형의 어느 하나에 결합하고, 이와 같이 잠재성 T 세포 에피토프를 구성한다. 검출된 잠재성 T-세포 에피토프는, 가변 영역의 아미노산 잔기 중 적은 수를 치환함으로써 또는 단일 아미노산 치환에 의해 제거할 수 있다. 가능한 한, 보존적 치환으로 행해진다. 종종, 배타적이지 않게, 인간 생식계통 항체 서열의 위치에 공통적인 아미노산을 사용할 수 있다. 탈면역화 변화를 확인한 후에, VH 및 VL을 코딩하는 핵산은 돌연변이유발법 또는 다른 합성 방법 (예컨대, 데노보 합성법, 카세트 대체법 등)에 의해 제작할 수 있다. 돌연변이된 가변 서열은 임의로 인간 불변 영역에 융합시킬 수 있다.
선택적인 실시양태에서, 인간화 항체 가변 영역 잔기의 적어도 60％, 65％, 70％, 75％ 또는 80％는 모 프레임워크 영역 (FR) 및 CDR 서열의 잔기에 상응할 것이다. 다른 실시양태에서, 인간화 항체 잔기의 적어도 85％ 또는 90％가 모 프레임워크 영역 (FR) 및 CDR 서열의 잔기에 상응할 것이다. 추가로 바람직한 실시양태에서, 인간화 항체 잔기의 95％ 초과가 모 프레임워크 영역 (FR) 및 CDR 서열의 잔기에 상응할 것이다.
인간화 항체는 본원에 기재된 바와 같은 통상적인 분자 생물학 및 생체분자 공학 기술을 이용하여 제작할 수 있다. 이들 방법은, 중쇄 또는 경쇄의 적어도 하나로부터의 면역글로불린 Fv 가변 영역의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산 서열을 단리하는 공정, 조작하는 공정 및 발현시키는 공정을 포함한다. 상기 핵산의 공급원은 당업자에게 익히 공지되어 있으며, 예를 들어 생식계통 면역글로불린 유전자 또는 합성 구조체로부터, 상기에 기재된 바와 같은 미리 결정된 표적에 대한 항체 또는 면역반응성 단편을 생산하는 하이브리도마, 진핵 세포 또는 파지로부터 얻을 수 있다. 이어서, 인간화 항체를 코딩하는 재조합 DNA를 적절한 발현 벡터로 클로닝할 수 있다.
인간 생식계통 서열은, 예를 들어 문헌 [Tomlinson, I. A. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. et al. (1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Bio. 227:799-817]; 및 [Tomlinson et al. (1995) EMBO J 14:4628-4638]에 개시되어 있다. V BASE 디렉토리는 인간 면역글로불린 가변 영역 서열의 포괄적인 디렉토리를 제공한다 (문헌 [Retter et al., (2005) Nuc Acid Res 33: 671-674] 참고). 이들 서열은, 예컨대 프레임워크 영역 및 CDR에 대한 인간 서열의 공급원으로서 사용될 수 있다. 본원에서 나타낸 바와 같이, 또한 컨센서스 인간 프레임워크 영역이 예컨대 U.S.P.N. 6,300,064에 기재된 바와 같이 사용될 수 있다.
f. 인간 항체
상기 언급된 항체에 더하여, 당업자는 본 발명의 항체가 완전 인간 항체를 포함할 수 있는 것으로 인식할 것이다. 본 출원의 목적상 용어 인간 항체는 인간에 의해 생성되는 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체, 및/또는 본원에서 개시된 바와 같은 인간 항체를 제조하기 위한 임의의 기술을 이용하여 제조할 수 있는 항체를 포함한다. 인간 항체의 이러한 정의는, 구체적으로 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 배제한다.
인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기에 시사된 바와 같이, 파지 디스플레이 기술이 본 교시에 따라 면역활성 결합 영역을 제공하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 특정한 실시양태는, 파지 상에 (바람직하게는 인간) 항체의 라이브러리를 합성하는 단계, 선택적 PTK7 또는 그의 항체-결합 부분을 갖는 라이브러리를 스크리닝하는 단계, PTK7에 결합하는 파지를 단리하는 단계, 및 파지로부터 면역반응성 단편을 얻는 단계를 포함하는, 항-PTK7 항체 또는 그의 항원-결합 부분을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 예로서, 파지 디스플레이 기술에 사용하기 위한 항체 라이브러리를 준비하기 위한 한 방법은, 면역 반응을 일으키는 선택적 PTK7 또는 그의 항원성 부분으로 인간 또는 비-인간 면역글로불린 좌위를 포함하는 비-인간 동물을 면역화시키는 단계, 면역화 동물로부터 항체-생산 세포를 추출하는 단계; 추출된 세포로부터 본 발명의 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 RNA를 단리하는 단계, RNA를 역전사하여 cDNA를 제조하는 단계, 프라이머를 이용하여 cDNA를 증폭하는 단계, 및 cDNA를 파지 디스플레이 벡터에 삽입하여 항체가 그 파지 상에 발현되는 단계를 포함한다. 보다 특히, VH 및 VL 도메인을 코딩하는 DNA를 PCR에 의해 scFv 링커(linker)와 함께 재조합하여 파지미드 벡터 (예컨대, pCANTAB 6 또는 pComb 3 HSS)에 클로닝한다. 이어서, 상기 벡터를 이. 콜라이(E. coli)로 전기천공시키고, 이어서 그 이. 콜라이를 헬퍼 파지와 함께 감염시킨다. 이들 방법에서 사용된 파지는 전형적으로 fd 및 M13를 비롯한 필라멘트형 파지이며, VH 및 VL 도메인은 통상적으로 파지 유전자 III 또는 유전자 VIII 중 하나와 재조합적으로 융합시킨다.
본 발명의 재조합 인간 항-PTK7 항체는 상기한 바와 같이 제조된 재조합적 조합 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 단리할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 라이브러리는 B 세포로부터 단리된 mRNA로부터 제조한 인간 VL 및 VH cDNA를 이용하여 생성시킨 scFv 파지 디스플레이 라이브러리이다. 이러한 라이브러리를 제조하여 스크리닝하는 방법은 당업계에 익히 공지되어 있고, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하는 키트는 상업적으로 이용가능하다 (예컨대, Pharmacia Recombinant Antibody System, 카탈로그 번호 27-9400-01; 및 Stratagene SurfZAPTM phage display kit, 카탈로그 번호 240612). 또한, 항체 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 스크리닝하는데 사용할 수 있는 다른 방법 및 시약도 있다 (예컨대, U.S.P.N. 5,223,409; PCT 출원 번호 WO 92/18619, WO 91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; 문헌 [Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991)]; [Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992)]; [Huse et al., Science 246:1275-1281 (1989)]; [McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)]; [Griffiths et al., EMBO J. 12:725-734 (1993)]; [Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]; Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)]; [Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992)]; [Garrad et al., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991)]; [Hoogenboom et al., Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991)]; 및 [Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991)] 참고).
미성숙한 라이브러리 (천연 또는 합성 중 어느 하나)에 의해 제조된 항체는 중등의 친화도 (약 106 내지 107 M-1의 Ka) 일 수 있지만, 친화도 성숙은 또한 당 기술에 기재된 바와 같이 2차 라이브러리로부터 제작하여 재선별함으로써 시험관내에서 모방할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 오류 유발 폴리머라제(문헌 [Leung et al., Technique, 1: 11-15 (1989)]에 보고되어 있음)를 이용하여 문헌 [Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992)]의 방법 또는 문헌 [Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992)]의 방법으로 시험관내에서 랜덤으로 도입시킬 수 있다. 또한, 친화도 성숙은, 예컨대 선택적인 개개의 Fv 클론에서, 관심 CDR을 가로지르는 랜덤 서열을 갖는 프라이머로 PCR을 행하여 하나 이상의 CDR을 랜덤하게 돌연변이시키고, 보다 고도의 친환성 클론에 대해 스크리닝함으로써 수행할 수 있다. WO 9607754에는 면역글로불린 경쇄의 상보성 결정 영역에서 돌연변이유발을 유도하여 경쇄 유전자의 라이브러리를 제작하는 방법이 기재되어 있다. 또 다른 효과적인 접근은 비면역화 공여자로부터 얻어지는 자연 발생 V 도메인 변이체의 레퍼토리를 갖는 파지 디스플레이에 의해 선별되는 VH 또는 VL 도메인을 재조합하고, 수회의 사슬 재셔플링으로 보다 고도의 친화도에 대해 스크리닝하는 것이다 (문헌 [Marks et al., Biotechnol., 10: 779-783 (1992)]에 기재되어 있음). 이러한 기술은 약 10-9 M 이하의 해리 상수 Kd (koff/kon)를 갖는 항체 및 항체 단편을 제조하게 한다.
그의 표면 상에 결합 쌍을 발현하는 진핵 세포 (예컨대, 효모)를 포함하는 라이브러리를 이용하여 유사한 절차를 채용할 수 있는 것으로 추가로 인식할 것이다. 파지 디스플레이 기술에 따라, 진핵 라이브러리를 관심 항원(즉, PTK7)에 대하여 스크리닝하고, 후보-결합쌍을 발현하는 세포를 단리하여 클로닝한다. 라이브러리 내용물을 최적화하고, 반응성 결합쌍의 친화도 성숙에 대한 단계를 취할 수 있다. 예를 들어, U.S.P.N. 7,700,302 및 U.S.S.N. 12/404,059를 참고한다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선별되며, 상기 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다 (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol, 222:581 (1991)). 다른 실시양태에서, 인간 결합쌍은 진핵 세포, 예컨대 효모에서 생성되는 조합 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 예컨대, U.S.P.N. 7,700,302를 참고한다. 이러한 기술은 유리하게 상당수의 후보 조절제를 스크리닝하는 것을 가능케하고, 후보 서열의 비교적 용이한 조작법 (예컨대, 친화도 성숙 또는 재조합 셔플링에 의함)을 제공한다.
인간 항체는, 인간 면역글로불린 좌위를 트랜스제닉 동물, 예컨대 마우스 (이의 내인성 면역글로불린 유전자는 부분적으로 또는 전적으로 불활성화되었음) 로 도입함으로써 제조할 수 있다. 도전하는 경우에, 인간 항체 생산은 유전자 재배열, 조립, 및 항체 레퍼토리를 비롯한 모든 국면에서 인간에서 발견되는 것과 밀접하게 닮은 것으로 관찰된다. 이러한 접근법은, 예를 들어 U.S.P.N 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, 및 다음의 과학 간행물: Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)에 따른 제노마우스® 기술에 관하여 U.S.P.N 6,075,181 및 6,150,584에 기재되어 있다. 다르게는, 인간 항체는 표적 항원에 대한 항체를 생성하는 인간 B-림프구의 불멸화를 통해 제조할 수 있다 (상기 B 림프구는 신생물 장애를 앓고 있는 개체로부터 회수할 수 있거나 시험관내에서 면역화시킬 수 있음). 예컨대, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (l):86-95 (1991); 및 U.S.P.N. 5,750,373]을 참고한다.
VI. 항체 특징
항체 조절제를 어떻게 얻든지 또는 상기 언급된 어떠한 형태를 취하든지 (예컨대, 인간화, 인간 등), 개시된 조절제의 바람직한 실시양태는 다양한 특징을 나타낼 수 있다. 이에 대하여, 항-PTK7 항체-생산 세포 (예컨대, 하이브리도마 또는 효모 콜로니)를 선별하고, 클로닝하고, 추가로 바람직한 특징(예를 들어, 원기왕성한 성장, 고도의 항체 생성, 및 하기에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이 바람직한 항체 특징을 포함함)에 대해 스크리닝할 수 있다. 하이브리도마는 생체내 동생성 동물에서, 면역계가 결핍된 동물, 예컨대 누드 마우스에서, 또는 시험관내 세포 배양에서 확대될 수 있다. 하이브리도마 및/또는 콜로니의 선별, 클로닝 및 확대 방법 (이들 각각은 별개의 항체 종을 생성시킴)은 당업자들에게 익히 공지되어 있다.
a. 중화 항체
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절제는 중화 항체 또는 그의 유도체 또는 단편을 포함할 것이다. 용어 중화 항체 또는 중화 길항제는, PTK7 분자와 결합하거나 이와 상호작용하여 상기 리간드가 임의의 결합 파트너와 결합하거나 회합하는 것을 방해하며, 이로써 달리 상기 분자의 상호작용으로 인해 발생하는 생물학적 반응 (예컨대, 인산화 또는 VEGF-유발된 혈관형성)을 중단시키는 항체 또는 길항제를 의미한다. 항체 또는 그의 면역학상 기능적 단편 또는 유도체의 결합 및 특이성을 평가하는 데 있어서, 예를 들어 인산화 또는 선택된 기질에 의해 (문헌 [Shin et al, Biochem and Biophys Res Com, Vol. 371:4]) 또는 시험관내 경쟁 결합 검정에서 과량의 항체가 표적 분자에 결합하는 결합 파트너의 양을 측정시 적어도 약 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％, 99％ 또는 그 이상까지 감소시키는 경우에, 항체 또는 단편은 리간드가 그의 결합 파트너 또는 기질과 결합하는 것을 실질적으로 억제할 것이다. 예를 들어 PTK7에 대한 항체의 경우에, 중화 항체 또는 길항제는 바람직하게는 특정 기질에 대한 PTK7의 인산화 능력을 적어도 약 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％, 99％ 또는 그 이상까지 줄일 것이다. 이러한 줄어든 활성은 당업계에서 인정된 기술을 이용하여 직접적으로 측정할 수 있거나, 이 감소가 2차 활성, 예컨대 혈관형성에 대해 주는 영향에 의해 측정할 수 있는 것으로 인식될 것이다.
b. 내재화 항체
증거는 PTK7 또는 그의 선택된 이소형이 가용성 형태로 존재할 수 있다는 것을 나타내고 있지만, 적어도 일부 PTK7은 여전히 세포 표면에 회합되어 있으며, 이로써 개시된 조절제의 내재화를 가능하게 한다. 따라서, 본 발명의 항-PTK7 항체는, 적어도 어느 정도는, PTK7을 발현하는 세포에 의해 내재화될 수 있다. 예를 들어, 종양-개시 세포의 표면 상의 PTK7에 결합하는 항-PTK7 항체는 상기 종양-개시 세포에 의해 내재화될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 이러한 항-PTK7 항체는, 내재화 시에 세포를 사멸하는 항암제, 예컨대 세포독성 모이어티와 회합되거나 또는 접합될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 내재화되는 항-PTK7 항체는 포유동물 세포에 관련된 PTK7와 결합할 때에 세포에 의해 받아들여지는 것이다. 내재화 항체는 항체 단편, 인간 또는 인간화 항체 및 항체 접합체를 포함한다. 내재화는 시험관내 또는 생체내에서 일어날 수 있다. 치료법 적용을 위해, 내재화는 생체내에서 일어날 수 있다. 내재화되는 항체 분자의 수는 PTK7-발현 세포, 특히 PTK7-발현 종양 개시 세포를 죽이는데 충분하거나 적당할 수 있다. 항체 또는 항체 접합체의 효능에 따라, 특정한 경우에, 단일 항체 분자의 세포로의 취입은 항체가 결합하는 표적 세포를 사멸하는 데 충분하다. 예를 들어, 항체에 접합되는 독소의 일 분자의 내재화가 종양 세포를 사멸하는 데 충분하다는 점에서, 특정한 독소는 죽이는 데 있어서 고도로 강력하다. 항-PTK7 항체가 포유동물 세포 상의 PTK7에 결합할 때에 내재화되는지의 여부는 하기 실시예 (예컨대, 실시예 12 및 13)에 기재된 것을 포함하는 다양한 검정법에 의해서 결정할 수 있다. 항체가 세포로 내재화되었는지를 검출하는 방법은 또한 U.S.P.N. 7,619,068 (이는 그 전체가 참고로 본원에 포함됨)에 기재되어 있다.
c. 고갈성 항체
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절제는 고갈성 항체 또는 그의 유도체 또는 단편을 포함할 것이다. 용어 고갈성 항체는 세포 표면 상 또는 근처의 PTK7과 결합하거나 회합하여, (예컨대, 보체-의존성 세포독성 또는 항체-의존성 세포의 세포독성에 의해) 세포의 사멸, 무력화 또는 제거를 유도하거나, 촉진시키거나, 야기시키는 항체 또는 단편을 의미한다. 하기에서 보다 완전히 논의되는 일부 실시양태에서, 선택적 고갈성 항체는 세포독성제와 회합되거나 접합될 것이다. 바람직하게는, 고갈성 항체는, 정의된 세포 집단에서의 종양 지속 세포의 적어도 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 85％, 90％, 95％, 97％ 또는 99％를 없애거나, 무력화하거나, 제거하거나 또는 사멸시킬 수 있을 것이다. 일부 실시양태에서, 상기 세포 집단은 풍부화되거나, 절개되거나, 정제되거나 또는 단리된 종양 지속 세포를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 세포 집단은 종양 지속 세포를 포함하는 전체 종양 샘플 또는 이종 종양 추출물을 포함할 것이다. 당업자는 하기 실시예 (예컨대, 실시예 13 및 14)에 기재되는 바와 같은 표준 생화학적 기술이 본원에서의 교시에 따라 종양형성성 세포 또는 종양 지속 세포의 고갈을 모니터링하여 정량화하는데 사용할 수 있는 것으로 인식할 것이다.
d. 에피토프 결합
개시된 항-PTK7 항체는 선택적인 표적(들)에 의해 존재하는 별개의 에피토프 또는 결정인자와 회합하거나 결합할 것으로 추가로 인식할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 에피토프는 특정한 항체에 의해 인식되어 특이적으로 결합될 수 있는 표적 항원의 바로 그 부분을 의미한다. 상기 항원이 폴리펩티드, 예컨대 PTK7인 경우에, 에피토프는 단백질의 3차 폴딩에 의해 나란히 놓인 연속성 아미노산 및 비연속성 아미노산 둘다로부터 형성될 수 있다. 연속성 아미노산으로부터 형성된 에피토프는 단백질 변성 시에 전형적으로 존속되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 단백질 변성 시에 전형적으로 소실된다. 에피토프는 전형적으로 적어도 3개, 보다 통상적으로 적어도 5개 또는 8 내지 10개의 아미노산을 독특한 공간 입체형태로 포함한다. 보다 구체적으로, 당업자는 용어 에피토프가 면역글로불린 또는 T-세포 수용체와 특이적으로 결합하거나 또는 달리 분자와 상호작용할 수 있는 임의의 단백질 결정인자를 포함하는 것으로 인식할 것이다. 에피토프성 결정인자는 일반적으로 분자, 예컨대 아미노산 또는 탄수화물 또는 당 측쇄로 그룹화되는 화학적 활성 표면을 구성하고, 일반적으로 특이적인 3차원 구조적 특징, 뿐만 아니라 특이적인 전하 특징을 갖는다. 게다가 에피토프는 선형적 또는 입체형태적일 수 있다. 선형 에피토프에 있어서, 단백질 및 상호작용하는 분자 (예컨대 항체) 사이의 모든 상호작용 지점은 상기 단백질의 1차 아미노산 서열을 따라 선형적으로 존재한다. 입체형태적 에피토프에 있어서, 상호작용의 지점은 또 다른 단백질로부터 선형적으로 분리된 단백질 상의 아미노산 잔기를 가로질러 존재한다.
항원 상의 원하는 에피토프가 결정되면, 예컨대 본 발명에 기재된 기술을 이용하여 에피토프를 포함하는 펩티드로 면역화함으로써 그 에피토프에 대한 항체가 생성될 수 있다. 별도로, 상기 발견 공정 동안, 항체의 생성 및 특징규명은 바람직한 에피토프에 관한 정보를 밝힐 수 있다. 이 정보로부터, 이어서 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 경쟁적으로 스크리닝할 수 있다. 이를 달성하기 위한 접근은 또 다른 것과 경쟁적으로 결합하는 항체를 발견하기 위한 경쟁 연구를 수행하는 것이며, 즉 상기 항체는 상기 항원과의 결합에 경쟁한다. 이의 교차-경쟁에 기초하여 항체를 비닝(binning)하는 고도의 스루풋 공정은 WO 03/48731에 기재되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 비닝은 이의 항원 결합 특징에 기초하여 항체를 분류하는 방법을 의미한다. 빈(bin)의 배정은, 시험하는 항체의 관찰 결합 패턴이 얼마나 상이한지에 따라 어느 정도 임의적이다. 따라서, 그 기술이 본 발명의 항체를 카테고리화하는데 유용한 툴이지만, 상기 결합이 에피토프와 항상 직접적으로 상관관계가 있는 것이 아니므로, 에피토프 결합의 초기 결정은 본원에 개시된 바와 같이 다른 기술에서 인정하는 방법론에 의해 추가로 확인해야 한다.
이러한 통고에 따라, 당업자는 당업계에 공지되어 있으며 본원의 실시예에 나타내는 방법을 이용함으로써, 선택적인 1차 항체 (또는 그의 단편)이 동일한 에피토프와 결합하는지 또는 2차 항체와의 결합이 교차 경쟁하는지를 결정할 수 있다. 한 실시양태에서, 당업자는 본 발명의 1차 항체가 포화 조건 하에서 PTK7과 결합시키고, 이어서 2차 항체가 PTK7과 결합하는 능력을 측정할 수 있다. 시험 항체가 1차 항-PTK7 항체와 동시에 PTK7에 결합할 수 있다면, 2차 항체는 1차 항체에 비해 상이한 에피토프에 결합한다. 그러나, 2차 항체가 동시에 PTK7에 결합할 수 없다면, 2차 항체는 동일한 에피토프, 중복되는 에피토프, 또는 1차 항체에 결합하는 에피토프와 아주 근접하여 존재하는 에피토프와 결합한다. 당업계에 공지되고 하기 실시예에서 상술하는 바와 같이, 원하는 데이터는 고상 직접 또는 간접 방사면역검정 (RIA), 고상 직접 또는 간접 효소 면역검정 (EIA), 샌드위치 경쟁 검정, 비아코어™ 시스템(Biacore™ system; 즉 표면 플라스몬 공명 - GE 헬스케어(GE Healthcare)), 포르테바이오(ForteBio)® 어낼라이저 (Analyzer) (즉, 바이오-층 간섭법 - 포르테바이오, 인크.(ForteBio, Inc.)) 또는 유동세포 방법론을 이용하여 얻을 수 있다. 용어 표면 플라스몬 공명은, 본원에서 사용된 바와 같이, 바이오센서 매트릭스 내에서의 단백질 농도의 변화의 검출에 의해 실시간 특이적 상호작용을 분석하는 것을 가능케 하는 광학적 현상을 의미한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 분석은 하기 실시예에서 데모되는 바와 같이 비아코어 또는 포르테바이오 기구를 이용하여 수행한다.
항체의 문맥에서 사용되는 경우의 용어 경쟁한다는 시험 조건 하에서 항체 또는 면역학상 기능적 단편이 공통 항원에 대한 표준 항체의 특이적 결합을 방지하거나 또는 억제하는 검정에 의해 측정되는 항체 간의 경쟁을 의미한다. 전형적으로, 이러한 검정은 이들, 즉 비표지된 시험 면역글로불린 및 표지된 표준 면역글로불린 중 어느 하나를 갖는 세포 또는 고체 표면에 결합된 정제 항원을 사용하는 것을 포함한다. 경쟁 억제는 상기 시험 면역글로불린의 존재 하에서 고체 표면 또는 세포에 결합된 표지의 양을 측정함으로써 측정된다. 통상적으로 상기 시험 면역글로불린는 과량으로 존재한다. 경쟁 검정에 의해 확인되는 항체 (경쟁 항체)는 입체 장애를 일으키는 표준 항체에 의해 결합된 에피토프에 충분히 근접한 이웃 에피토프에 결합하는 표준 항체 및 항체로서 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 포함한다. 경쟁 결합을 측정하는 방법에 관한 추가의 상세는 본원의 실시예에서 제공된다. 통상적으로, 경쟁 항체는 과량으로 존재하는 경우에, 공통 항원에 대한 표준 항체의 특이적 결합을 적어도 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％ 또는 75％까지 억제할 것이다. 특정한 경우에, 상기 결합은 적어도 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 97％ 또는 그 이상까지 억제된다.
에피토프 특이성 외에, 개시된 항체는, 예를 들어 결합 친화도, 용융 온도 (Tm) 및 등전점을 비롯한 다수의 상이한 물리적 특징을 이용하여 특징규명할 수 있다.
e. 결합 친화도
이 점에 있어서, 본 발명은 선택된 PTK7에 대한 고도의 결합 친화도를 갖는 항체, 또는 pan-항체의 경우의 항체, 1종 초과의 PTK7의 사용을 추가로 포함한다. 본 발명의 항체는, 해리 상수 Kd (koff/kon)가 ≤ 10-8M인 경우에 그의 표적 항원에 특이적으로 결합하는 것을 말한다. 상기 항체는 Kd가 ≤ 5x10-9M인 고도의 친화도를 가지며, 또한 Kd가 ≤ 5x10-10M인 더욱 고도의 친화도를 갖는 항원과 특이적으로 결합한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 상기 항체는 Kd가 ≤ 10-9M이고, 오프 레이트(off-rate)가 약 1x10-4/초이다. 본 발명의 한 실시양태에서, 오프 레이트는 < 1x10-5/초이다. 발명의 다른 실시양태에서, 상기 항체는 Kd가 약 10-8M 내지 10-10M인 PTK7과 결합할 것이고, 또한 또 다른 실시양태에서 Kd ≤ 2x10-10M인 것과 결합할 것이다. 본 발명의 또한 다른 선택적인 실시양태는 해리 상수 또는 Kd (koff/kon)가 10-2M 미만, 5x10-2M 미만, 10-3M 미만, 5x10-3M 미만, 10-4M 미만, 5x10-4M 미만, 10-5M 미만, 5x10-5M 미만, 10-6M 미만, 5x10-6M 미만, 10-7M 미만, 5x10-7M 미만, 10-8M 미만, 5x10-8M 미만, 10-9M 미만, 5x10-9M 미만, 10-10M 미만, 5x10-10M 미만, 10-11M 미만, 5x10-11M 미만, 10-12M 미만, 5x10-12M 미만, 10-13M 미만, 5x10-13M 미만, 10-14M 미만, 5x10-14M 미만, 10-15M 또는 5x10-15M 미만인 항체를 포함한다.
특이적 실시양태에서, PTK7에 면역특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 105M-1s-1 이상, 2x105M-1s-1 이상, 5x105M-1s-1 이상, 106M-1s-1 이상, 5x106M-1s-1 이상, 107M-1s-1 이상, 5x107M-1s-1 이상, 또는 108M-1s-1 이상인 결합 속도 상수 또는 k on 속도 (PTK7 (Ab) + 항원 (Ag)k on←Ab-Ag)를 갖는다.
다른 실시양태에서, PTK7에 면역특이적으로 결합하는 본 발명의 항체는 10-1s-1 미만, 5x10-1s-1 미만, 10-2s-1 미만, 5x10-2s-1 미만, 10-3s-1 미만, 5x10-3s-1 미만, 10-4s-1 미만, 5x10-4s-1 미만, 10-5s-1 미만, 5x10-5s-1 미만, 10-6s-1 미만, 5x10-6s-1 미만, 10-7s-1 미만, 5x10-7s-1 미만, 10-8s-1 미만, 5x10-8s-1 미만, 10-9s-1 미만, 5x10-9s-1 또는 10-10s-1 미만인 분리 속도 상수 또는 k off 속도 (PTK7 (Ab) + 항원 (Ag)k off←Ab-Ag)를 갖는다.
본 발명의 다른 선택적 실시양태에서, 항-PTK7 항체는 102M-1 이상, 5x102M-1 이상, 103M-1 이상, 5x103M-1 이상, 104M-1 이상, 5x104M-1 이상, 105M-1 이상, 5x105M-1 이상, 106M-1 이상, 5x106M-1 이상, 107M-1 이상, 5x107M-1 이상, 108M-1 이상, 5x108M-1 이상, 109M-1 이상, 5x109M-1 이상, 1010M-1 이상, 5x1010M-1 이상, 1011M-1 이상, 5x1011M-1 이상, 1012M-1 이상, 5x1012M-1 이상, 1013M-1 이상, 5x1013M-1 이상, 1014M-1 이상, 5x1014M-1 이상, 1015M-1 또는 5x1015M-1 이상인 친화도 상수 또는 Ka (kon/koff)를 가질 것이다.
f. 등전점
상기 언급된 결합 특성에 더하여, 모든 폴리펩티드와 같은 항-PTK7 항체 및 그의 단편은, 일반적으로 폴리펩티드의 순전하가 제로인 pH로 정의되는 등전점 (pI)를 갖는다. 단백질 용해도는 전형적으로 용액의 pH가 단백질의 등전점 (pI)과 동일할 때 가장 나은 것으로 당업계에 공지되어 있다. 그러므로, 항체의 이온화 가능 잔기의 수 및 위치를 변경하여 pI를 조정함으로써 용해도를 최적화시킬 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 pI는 적절한 아미노산을 치환함으로써 (예컨대, 하전 아미노산, 예컨대 리신으로 치환함으로써, 비하전 잔기, 예컨대 알라닌으로 치환함으로써) 조작할 수 있다. 임의의 특정한 이론에 결합되는 것을 원치 않으면서, 상기 항체의 pI의 변화를 초래하는 항체의 아미노산 치환은 항체의 용해도 및/또는 안정도를 향상시킬 수 있다. 당업계의 숙련자는 아미노산 치환이 원하는 pI를 달성하기 위해 특정 항체에 대해 가장 적절할 것이라는 것을 이해할 것이다.
단백질의 pI는 비제한적으로 등전 포커싱 및 다양한 컴퓨터 알고리즘 (예를 들어 문헌 [Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis 14:1023] 참고)을 비롯한 여러 가지 방법에 의해 측정할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항-PTK7 항체의 pI는 약 6.5, 약 7.0, 약 7.5, 약 8.0, 약 8.5, 또는 약 9.0 보다 높다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 항-PTK7 항체의 pI는 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 또는 9.0 보다 높다. 또한 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체의 pI에 있어서의 변경을 초래하는 치환은 PTK7에 대한 이의 결합 친화도를 상당히 감소시키지는 않을 것이다. 하기에서 보다 상세하게 논의되는 바와 같이, FcγR에 대한 변형된 결합을 초래하는 Fc 영역의 치환(들)은 또한 pI의 변화를 초래할 수 있는 것으로 구체적으로 고려되고 있다. 바람직한 실시양태에서, Fc 영역의 치환(들)은 FcγR 결합에서의 원하는 변경 및 pI에서의 임의의 원하는 변화 둘 다에 영향을 미치는 것으로 구체적으로 선택된다. 본원에서 사용된 바와 같이, pI 값은 우세한 전하 형태의 pI로 정의된다.
g. 열 안정성
항체의 Fab 도메인의 Tm은 항체의 열 안정성의 좋은 지표일 수 있으며, 보존 기간의 지표를 추가로 제공할 수 있다. Tm은 단순히, 제시된 도메인 또는 서열에 대해 50％ 비폴딩의 온도이다. 더 낮은 Tm은 더 응집되고/덜 안정하다는 것을 나타내는 반면, 더 높은 Tm은 덜 응집되고/더 안정하다는 것을 나타낸다. 따라서, 더 높은 Tm을 갖는 항체 또는 단편 또는 유도체가 바람직하다. 더욱이, 당업계에서 인정된 기술을 이용하여, 항-PTK7 항체 또는 그의 도메인의 조성을 변경하여 분자 안정성을 증가시키거나 최적화시킬 수 있다. 예를 들어, U.S.P.N. 7,960,142를 참고한다. 따라서, 한 실시양태에서, 선택된 항체의 Fab 도메인은 적어도 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃, 80℃, 85℃, 90℃, 95℃, 100℃, 105℃, 110℃, 115℃ 또는 120℃ 보다 높은 Tm 값을 갖는다. 다른 실시양태에서, 항체의 Fab 도메인은 적어도 약 50℃, 약 55℃, 약 60℃, 약 65℃, 약 70℃, 약 75℃, 약 80℃, 약 85℃, 약 90℃, 약 95℃, 약 100℃, 약 105℃, 약 110℃, 약 115℃ 또는 약 120℃보다 높은 Tm 값을 갖는다. 단백질 도메인 (예컨대, Fab 도메인)의 열 용융 온도 (Tm)는 당업계에 공지된 임의의 표준 방법을 이용하여, 예를 들어 시차 주사 열량측정법 (예컨대, 문헌 [Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 78:394-404; Vermeer et al., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154] 참고, 이들 둘다는 참고로 본원에 포함됨)에 의해 측정할 수 있다.
VII. PTK7 조절제 단편 및 유도체
본 발명의 작용제가 무손상 융합 구조체, 항체, 단편 또는 유도체, 선택적 조절제를 포함할지는 PTK7과 반응하거나, 결합하거나, 배합하거나, 복합시키거나, 연결시키거나, 부착시키거나, 연합시키거나 상호작용시키거나 또는 달리 회합시킬 것이며, 이로써 원하는 항-신생물성 효과를 제공할 것이다. 당업계의 숙련자는 항-PTK7 항체를 포함하는 조절제가 항체 상에 발현된 하나 이상의 결합 부위를 통해 PTK7과 상호작용하거나 회합하는 것으로 인식할 것이다. 보다 구체적으로, 본원에서 사용된 바와 같이 용어 결합 부위는 관심 표적 분자 (예컨대, 효소, 항원, 리간드, 수용체, 기질 또는 억제제)에 선택적으로 결합할 수 있는 폴리펩티드 영역을 포함한다. 결합 도메인은 하나 이상의 결합 부위 (예컨대, 무손상 IgG 항체는 2개의 결합 도메인 및 2개의 결합 부위를 가질 것임)를 포함한다. 예시적인 결합 도메인은 항체 가변 도메인, 리간드의 수용체-결합 도메인, 수용체의 리간드-결합 도메인 또는 효소성 도메인을 포함한다. 본 발명의 목적을 위해, PTK7의 전형적인 활성 영역 (예컨대, Fc-PTK7 융합 구조체의 부분으로서)은 기질에 대한 결합 부위를 포함하거나 또는 인산화를 촉진할 수 있다.
a. 단편
본 발명을 실시하기 위해 선택되는 조절제의 형태 (예컨대 키메라, 인간화 등)에 상관없이, 동일한 방식의 면역반응성 단편은 본원에서의 교시에 따라 사용할 수 있는 것으로 인식할 것이다. 가장 넓은 의미에서, 용어 항체 단편은 무손상 항체 (예컨대 자연 발생 면역글로불린)의 적어도 일부를 포함한다. 보다 특히 용어 단편은 무손상 또는 완전 항체 또는 항체 사슬 보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 사슬 (또는 Fc 융합체 경우에 PTK7 분자)의 부분 또는 일부를 의미한다. 용어 항원-결합 단편은 항원 결합 (즉, 특이적 결합)에 대해 항원과 결합하거나 또는 무손상 항체 (즉, 이들이 유도하는 무손상 항체)와 경쟁하는 면역글로불린 또는 항체의 폴리펩티드 단편을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 항체 분자의 단편은 항체의 항원-결합 단편, 예를 들어 항체 경쇄 (VL), 항체 중쇄 (VH), 단일 사슬 항체 (scFv), F(ab')2 단편, Fab 단편, Fd 단편, Fv 단편, 단일 도메인 항체 단편, 디아바디, 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다. 유사하게는, PTK7의 활성 단편은, PTK7 기질 또는 수용체와 상호작용하여 무손상 PTK7과 유사한 방식 (예컨대, 인산화 - 아마도 어느 정도는 덜 효율적일 수 있음)으로 이들을 변경시킬 수 있는 그의 능력을 보유한 PTK7 분자의 일부를 포함한다.
당업자는 단편이 무손상 또는 완전 조절제 (예컨대, 항체 또는 항체 사슬)의 화학적 또는 효소적 처리를 통해 또는 재조합 수단에 의해 얻어질 수 있는 것으로 인식할 것이다. 이와 관련하여, 다양한 항체 단편이 무손상 항체의 소화라는 관점에서 정의하면서, 숙련자는 이러한 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법론을 이용하여 데노보 합성할 수 있는 것으로 인식할 것이다. 따라서, 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 항체는 전체 항체의 수식에 의해 제조되거나 또는 재조합 DNA 방법론을 이용하여 데노보 합성되는 항체 또는 그의 단편 또는 유도체를 명백히 포함한다.
보다 구체적으로, 항체의 파파인 소화는, Fab 단편이라 불리며, 이들 각각은 단일 항원-결합 부위 및 잔부 Fc 단편을 갖는 (이들의 이름은 용이하게 결정화되는 그의 능력을 반영함) 2개의 동일한 항원-결합 단편을 생성시킨다. 펩신 처리는 2개의 항원-결합 부위를 가지며 여전히 항원과 교차-결합할 수 있는 F(ab')2 단편을 생성시킨다. 상기 Fab 단편은 또한 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지 영역으로부터의 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄-사슬 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 더 적은 잔기를 부가함으로써 Fab 단편과는 상이하다. Fab'-SH는 Fab'에 대해 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 하나 이상의 유리 티올기를 갖는 것으로 본원에서 지정한 것이다. F(ab')2 항체 단편은 이들 사이에 힌지 시스테인을 갖는 Fab' 단편의 쌍으로 원래 제조된다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링이 또한 공지되어 있다. 다른 항체 단편의 보다 상세한 기재에 대해서는, 예컨대 문헌 [Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999)]을 참고한다.
Fv 단편은 완전 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편인 것으로 추가로 인식할 것이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 단단히 결합된 이합체로 구성되며, 이는 자연적으로 공유결합될 수 있으며, 예를 들어 scFv이다. 이는, VH-VL 이합체의 표면 상에 항원 결합 부위를 정의하기 위해 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하는 그 배열로 존재한다. 집합적으로 6개의 CDR 또는 그의 서브세트는 항체에 대한 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 대해 특이적인 단 3개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)은, 통상적으로 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도에서라도, 항원을 인식하고 결합할 수 있는 능력을 갖는다.
다른 실시양태에서, 항체 단편은 예를 들어 Fc 영역을 포함하는 것이며, 무손상 항체가 존재할 때에 Fc 영역과 통상적으로 관련되는 하나 이상의 생물학적 기능, 예컨대 FcRn 결합, 항체 반감기 조절, ADCC 기능 및 보체 결합을 보유하는 것이다. 한 실시양태에서, 항체 단편은 무손상 항체와 실질적으로 유사한 생체내 반감기를 갖는 일가 항체이다. 예를 들어, 이러한 항체 단편은 상기 단편에 생체내 안정성을 부여할 수 있는 Fc 서열에 링크되는 항원 결합 아암을 포함할 수 있다.
b. 유도체
다른 실시양태에서, 본 발명의 조절제는 일가 또는 다가 (예컨대, 이가, 삼가 등)일 수 있을 것으로 추가로 인식할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이 용어 결합가는 항체와 회합하는 잠재성 표적 (즉, PTK7) 결합 부위의 갯수를 의미한다. 각각의 표적 결합 부위는 하나의 표적 분자 또는 표적 분자 상의 특정 위치 또는 좌위와 결합한다. 본 발명의 항체가 하나의 표적 결합 부위보다 많이 포함할 때에 (다가), 각각의 표적 결합 부위는 동일하거나 상이한 분자와 특이적으로 결합할 수 있다 (예컨대, 상이한 리간드 또는 상이한 항원, 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프 또는 위치에 결합할 수 있음). 본 발명의 목적을 위해, 대상 항체는 인간 PTK7에 대해 특이적인 하나 이상의 결합 부위를 갖는다. 한 실시양태에서, 본 발명의 항체는, 분자의 각 결합 부위가 단일 PTK7 위치 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 것이라는 점에서 일가일 것이다. 다른 실시양태에서, 항체는 이들이 하나의 결합 부위보다 많이 포함하며 상이한 결합 부위가 단일 위치 또는 에피토프보다 더 많이 특이적으로 회합한다는 점에서 다가일 수 있을 것이다. 이러한 경우에, 제2의 상이한 에피토프가 또 다른 분자 또는 표면 상에 존재하면서, 다중 에피토프는 선택적 PTK7 폴리펩티드 또는 종 변이체 상에 존재할 수 있거나 또는 단일 에피토프가 PTK7 상에 존재할 수 있다. 예를 들어, U.S.P.N. 2009/0130105를 참고한다.
상기에 시사되는 바와 같이, 다가 항체는 원하는 표적 분자의 상이한 에피토프에 면역특이적으로 결합할 수 있거나, 상기 표적 분자 뿐만 아니라 이종 에피토프, 예컨대 이종 폴리펩티드 또는 고체 지지체 물질 둘다에 면역특이적으로 결합할 수 있다. 항-PTK7 항체의 바람직한 실시양태는 2개의 항원 (즉 이중특이적 항체)에 오로지 결합하지만, 추가적 특이성, 예컨대 삼중특이적 항체를 갖는 항체도 또한 본 발명에 포함된다. 이중특이적 항체의 예로는 PTK7에 대한 하나의 아암과 임의의 다른 항원 (예컨대, 조절제 세포 마커)에 대한 다른 아암을 갖는 것을 포함한다. 이중특이적 항체의 제조 방법은 당업계에 공지되어 있다. 전장의 이중특이적 항체의 전통적인 제조는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 동시발현하는 것에 기초하며, 상기 2개의 사슬은 상이한 특이성을 갖는다 (Millstein et al., 1983, Nature, 305:537-539). 그밖의 보다 정교하며 적합한 다중특이적 구조체 및 이의 제작 방법은 U.S.P.N. 2009/0155255에 나타나 있다.
또 다른 실시양태에서, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 융합되어 있다. 상기 융합은 바람직하게는 힌지, CH2, 및/또는 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 도메인을 갖는다. 한 예로서, 경쇄 결합에 필수적인 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)은 적어도 하나의 융합체에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합체, 및 경우에 따라 면역글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA는 별도의 발현 벡터에 삽입하여, 적합한 숙주 유기체에 함께 트랜스펙션시킨다. 이는, 구조체에 사용되는 3개의 폴리펩티드 사슬의 불균등한 비율이 최적의 수율을 제공하는 경우에, 실시양태에서 3개의 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조정하는데 있어서 큰 유연성을 제공할 수 있다. 그러나, 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬의 동등한 비율의 발현이 높은 수율을 초래하는 경우, 또는 상기 비율이 특정 유의성을 나타내지 않는 경우에, 1개의 발현 벡터에 2개 또는 3개의 모든 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열을 삽입할 수 있다.
이러한 접근의 한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암에 일차 결합 특이성을 갖는 하이브리드 면역글로불린 중쇄 (예컨대, PTK7) 및 다른 아암에 하이브리드 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (이차 결합 특이성을 제공함)으로 구성되어 있다. 면역글로불린 경쇄가 단지 이중특이적 분자의 절반으로 존재하여 분리의 용이한 방식을 제공하기 때문에, 이러한 비대칭적 구조는 원하지 않는 면역글로불린 사슬 복합체로부터 원하는 이중특이적 화합물의 분리를 촉진시킨다는 것을 밝혀냈다. 이 접근법은 WO 94/04690에 개시되어 있다. 이중특이적 항체를 생성시키는 추가의 상세를 위해서는, 예를 들어 문헌 [Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121:210]을 참고한다. WO 96/27011에 기재되어 있는 또 다른 접근법에 따르면, 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 헤테로이합체의 백분율을 최대로 하기 위해 한 쌍의 항체 분자를 유전자공학처리할 수 있다. 바람직한 인터페이스는 항체 불변 도메인의 CH3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러한 방법에서, 제1 항체 분자의 인터페이스로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄는 더 큰 측쇄 (예컨대 티로신 또는 트립토판)로 대체된다. 큰 측쇄(들)에 대해 동일하거나 유사한 크기의 보상적 구멍을 제2 항체 분자의 인터페이스 상에 큰 아미노산 측쇄를 더 작은 것 (예컨대 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체시킴으로써 제작한다. 이는 다른 원하지 않는 최종 산물, 예컨대 호모이합체에 대한 헤테로이합체의 수율을 증가시키는 메카니즘을 제공한다.
이중특이적 항체는 또한 교차-결합 또는 헤테로접합 항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로접합의 항체 중 하나를 아비딘에, 다른 하나를 비오틴에 커플링시킬 수 있다. 이러한 항체는 예를 들어 원하지 않는 세포에 대한 표적 면역계 세포에 대해 제안되어 있고 (U.S.P.N. 4,676,980), HIV 감염의 치료를 위해 제안되어 있다 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089). 헤테로접합 항체는 임의의 편리한 교차-결합 방법을 이용하여 제작할 수 있다. 적합한 교차-결합 작용제는 당업계에 익히 공지되어 있으며, 다수의 교차-결합 기술과 함께 U.S.P.N. 4,676,980에 개시되어 있다.
VIII. PTK7 조절제 - 불변 영역 수식
a. Fc 영역 및 Fc 수용체
상기에 나타낸 개시된 조절제의 가변 또는 결합 영역 (예컨대, Fc-PTK7 또는 항-PTK7 항체)에 대한 다양한 수식, 즉 치환, 부가 또는 결실에 더하여, 당업계의 숙련자는 본 발명의 선택적인 실시양태가 불변 영역 (즉 Fc 영역)의 치환 또는 수식을 포함할 것이라는 것을 인식할 것이다. 보다 특히, 본 발명의 PTK7 조절제는 그 중에서도 하나 이상의 추가의 아미노산 잔기 치환, 돌연변이 및/또는 수식을 함유할 수 있으며, 이는 비제한적으로 변형된 약물동태학, 증가된 혈청 반감기, 증가된 결합 친화도, 감소된 면역원성, 증가된 생산, 변형된 Fc 리간드 결합, 증강된 또는 감소된 ADCC 또는 CDC 활성, 변형된 글리코실화 및/또는 이황화 결합 및 변경된 결합 특이성을 비롯한 바람직한 특징을 갖는 화합물을 생성시킨다. 이에 관하여, 이들 Fc 변이체는 개시된 조절제의 효과적인 항-신생물성 특성을 향상시키는데 유리하게 사용될 수 있는 것으로 인식할 것이다.
본원에서의 용어 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 비롯한 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 면역글로불린 중쇄의 Fc 영역의 경계가 다양할 수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 통상적으로 위치 Cys226의 아미노산 잔기 또는 Pro230로부터 그의 카르복실-말단에까지 이어진 것으로 정의된다. Fc 영역의 C-말단 리신 (EU 번호 체계에 따르면 잔기 447)은, 예를 들어 항체의 생산 또는 정제 동안에, 또는 항체의 중쇄를 코딩하는 핵산을 재조합적으로 조작함으로써 제거할 수 있다. 따라서, 무손상 항체의 조성물은 모든 K447 잔기가 제거된 항체 집단, K447 잔기가 전혀 제거되지 않은 항체 집단, 및 K447 잔기를 갖거나 갖지 않는 항체의 혼합물을 갖는 항체 집단을 포함할 수 있다. 기능적 Fc 영역은 천연 서열 Fc 영역의 효과기 기능을 보유한다. 예시적인 효과기 기능은 C1q 결합; CDC; Fc 수용체 결합; ADCC; 포식작용; 세포 표면 수용체 (예컨대 B 세포 수용체; BCR)의 하향 조절 등을 포함한다. 이러한 효과기 기능은 일반적으로 Fc 영역이 결합 도메인 (예컨대, 항체 가변 도메인)과 결합되는 것을 요구하고, 예를 들어 본원에서의 정의에서 개시된 바와 같이 다양한 검정을 이용하여 평가할 수 있다.
Fc 수용체 또는 FcR은 항체의 Fc 영역과 결합하는 수용체를 서술한다. 일부 실시양태에서, FcR은 천연 인간 FcR이다. 일부 실시양태에서, FcR은 IgG 항체와 결합하는 것 (감마 수용체)이며, FcγRI, Fc.RII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체 (대립 변이체 및 별도로 이들 수용체의 스플라이싱 형태 포함)를 포함한다. FcγII 수용체는 FcγRIIA (활성 수용체) 및 FcγRIIB (억제 수용체)를 포함하며, 이는 그의 세포질 도메인에서 주로 상이한 유사한 아미노산 서열을 갖는다. 활성 수용체 Fcγ RIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기초 활성화 모티프 (immunoreceptor tyrosine-based activation motif; ITAM)를 함유한다. 억제 수용체 FγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신-기초 억제 모티프 (ITIM)를 함유한다. (예컨대, 문헌 [Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)] 참고). FcR은, 예를 들어 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); 및 de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)]에 개관되어 있다. 미래에 확인되는 것까지 포함한 다른 FcR은 본원에서의 용어 FcR에 포함된다. 용어 Fc 수용체 또는 FcR은 또한 신생아 수용체인, FcRn을 포함하며, 이는 특정한 경우에 모계 IgG를 태아에게 전달하는 역할 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) 및 면역글로불린의 항상성의 조절을 담당하는 역할을 한다. FcRn에 결합하는 것을 측정하는 방법은 공지되어 있다 (예컨대, 문헌 [Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); WO 2004/92219 (Hinton et al.) 참고].
b. Fc 기능
본원에서 사용된 바와 같이 보체 의존성 세포독성 및 CDC는 보체의 존재 하에서 표적 세포의 용해를 의미한다. 보체 활성화 경로는 보체 시스템 (C1q)의 제1 성분이 분자, 예를 들어 동족 항원과 복합된 항체와 결합하여 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예컨대 문헌 [Gazzano-Santoro et al., 1996, J. Immunol. Methods, 202:163]에 기재된 바와 같이 CDC 검정을 수행할 수 있다.
추가로, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 또는 ADCC는, 특정한 세포독성 세포 (예컨대, 자연 살해(Natural Killer; NK) 세포, 중성구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR) 상에 결합된 분비 Ig가 이들 세포독성 효과기 세포를 항원-함유 표적 세포에 특이적으로 결합시켜서, 후속적으로 세포독소로 표적 세포를 죽이게 하는 세포독성 형태를 의미한다. 표적 아암 세포독성 세포에 대해 특이적인 고-친화도 IgG 항체는 이러한 사멸에 절대적으로 요구된다. 표적 세포의 용해는 세포외이며, 직접적인 세포-대-세포 접촉을 요구하며, 보체와는 연관되지 않는다.
변형된 FcR 결합 친화도 또는 ADCC 활성을 갖는 PTK7 조절제 변이체는, 모 또는 비변형된 항체에 비해, 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 조절제에 비해 증강된 또는 감소된 FcR 결합 활성 및/또는 ADCC 활성을 갖는 것이다. FcR과의 증가된 결합을 보여주는 조절제 변이체는, 모 또는 비변형된 항체보다 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 조절제보다 더 우수한 친화도를 갖는 하나 이상의 FcR과 결합한다. FcR과의 감소된 결합을 보여주는 변이체는, 모 또는 비변형된 항체보다 또는 천연 서열 Fc 영역을 포함하는 조절제보다 더 열악한 친화도를 갖는 하나 이상의 FcR과 결합한다. FcR과의 감소된 결합을 보여주는 이러한 변이체는 FcR과 거의 결합하지 않거나 그 결합이 주목할 만하지 않으며, 예컨대 당업계에 익히 공지된 기술로 측정된 바와 같이, 예컨대 천연 서열 IgG Fc 영역에 비해 FcR과의 0 내지 20％ 결합을 보유할 수 있다.
FcRn과 관련하여, 본 발명의 항체는 또한 포유동물, 바람직하게는 인간에서 5일 초과, 10일 초과, 15일 초과, 바람직하게는 20일 초과, 25일 초과, 30일 초과, 35일 초과, 40일 초과, 45일 초과, 2달 초과, 3달 초과, 4달 초과, 또는 5달 초과의 반감기(예를 들어, 혈청 반감기)를 제공하는 불변 영역에 변형이 있는 Fc 변이체를 포함 또는 포괄한다. 포유동물, 바람직하게는 인간에서 본 발명의 항체 (또는 Fc 함유 분자)의 증가된 반감기는 포유동물에서 상기 항체 또는 항체 단편의 더 높은 혈청 역가로 귀결되고, 따라서 상기 항체 또는 항체 단편의 투여 주기를 감소시키고/거나 투여될 상기 항체 또는 항체 단편의 농도를 감소시킨다. 증가된 생체내 반감기를 갖는 항체는 당업자에게 공지된 기술에 의해 발생될 수 있다. 예를 들어, 증가된 생체내 반감기를 갖는 항체는 Fc 도메인과 FcRn 수용체 사이의 상호작용에 관여하는 것으로 식별된 아미노산 잔기의 변형(예를 들어, 치환, 결실 또는 부가)에 의해 발생될 수 있다(예를 들어, 국제 공개 공보 WO 제97/34631호; WO 제04/029207호; U.S.P.N. 6,737,056 및 U.S.P.N. 2003/0190311 참조). 인간 FcRn에의 생체내 결합 및 인간 FcRn 고 친화도 결합 폴리펩티드의 혈청 반감기를, 예를 들어 트랜스제닉 마우스 또는 인간 FcRn을 발현시키는 형질감염된 인간 세포주, 또는 변이체 Fc 영역이 있는 폴리펩티드가 투여되는 영장류에서 검정할 수 있었다. WO 2000/42072에는 FcRn에 대한 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 항체 변이체가 기술되어 있다. 또한, 예를 들어 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)]을 참조한다.
c. 글리코실화 변형
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 항체의 글리코실화 패턴 또는 조성물이 변형된다. 보다 특히, 본 발명의 바람직한 실시양태는 하나 이상의 유전자 조작된 글리코형, 즉 Fc 영역을 포함하는 분자에 공유 결합으로 부착된 변경된 글리코실화 패턴 또는 변경된 탄수화물 조성물을 포함할 수 있다. 유전자 조작된 글리코형은 효과기 기능의 증진 또는 감소, 표적 항원에 대한 항체의 친화도의 증가 또는 항체 생성의 용이성을 비제한적으로 포함하는, 다양한 목적을 위해서 유용할 수 있다. 감소된 효과기 기능이 요구되는 경우, 분자를 유전자 조작하여 글리코실화되지 않은 형태로 발현시킬 수 있다는 것이 인식될 것이다. 이러한 탄수화물 변형은, 예를 들어 항체 서열 내 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시켜 달성될 수 있다. 즉, 하나 이상의 가변 영역 프레임워크 글리코실화 부위를 제거함으로써 그 부위에서의 글리코실화를 제거하게 되는 하나 이상의 아미노산 치환을 실시할 수 있다(예를 들어, U.S.P.Ns. 5,714,350호 및 6,350,861 참조). 역으로, 하나 이상의 추가 글리코실화 부위에서의 유전자 조작에 의해 증진된 효과기 기능 또는 개선된 결합을 Fc 함유 분자에 부여할 수 있다.
추가로 또는 별법으로, 변경된 글리코실화 조성물을 갖는 Fc 변이체, 예를 들어 감소된 양의 푸코실 잔기를 갖는 하이포푸코실화 항체 또는 증가된 등분GlcNAc 구조를 갖는 항체를 만들 수 있다. 이러한, 그리고 유사한 변경된 글리코실화 패턴이 항체의 ADCC 능력을 증가시키는 것으로 증명되어 왔다. 당업자에게 공지된 임의의 방법, 예를 들어 유전자 조작된 또는 변이체 발현 균주를 사용하거나, 하나 이상의 효소(예를 들어, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 III (GnTI11))와 공동-발현시키거나, 다양한 유기체 또는 다양한 유기체로부터의 세포주에서 Fc 영역을 포함하는 분자를 발현시키거나, 또는 Fc 영역을 포함하는 분자가 발현된 후 탄수화물(들)을 변형시켜 유전자 조작된 글리코형을 발생시킬 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740]; [Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1]뿐만 아니라 유럽 특허 EP 제1,176,195호; PCT 공개 공보 WO 제03/035835호; WO 제99/54342호, 문헌 [Umana et al, 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180]; [Davies et al., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294]; [Shields et al, 2002, J Biol Chem 277:26733-26740]; [Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473], U.S.P.N. 6,602,684; U.S.P.N. 10/277,370; 10/113,929; PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; 포틸리젠드 (Potillegent)TM 기술 (바이오와, 인코퍼레이티드 (Biowa, Inc.)); 글리코맙 (GlycoMAb)TM 글리코실화 유전자 조작 기술 (글리카르트 바이오테크놀로지 아게 (GLYCART biotechnology AG); WO 제00061739호; EA01229125; U.S.P.N. 2003/0115614; 문헌 [Okazaki et al., 2004, JMB, 336: 1239-49]을 참조한다.
IX. 조절제 발현
a. 개요
목적하는 PTK7 조절제를 코딩하는 DNA는 통상의 절차를 사용하여(예를 들어, 항체 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 용이하게 단리되고 배열될 수 있다. 단리되고 서브클로닝된 하이브리도마 세포 (또는 파지 또는 효모 유래 콜로니)는 조절제가 항체인 경우 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 기능할 수 있다. 목적하는 경우, 본원에 기재된 것과 같이 핵산을 추가로 조작하여 융합 단백질, 또는 키메라, 인간화 또는 완전한 인간 항체를 포함하는 작용제를 생성할 수 있다. 보다 특히, U.S.P.N. 7,709,611에 기재된 것과 같이 단리된 DNA(변형될 수 있음)를 사용하여 항체의 제작을 위해서 불변 및 가변 영역 서열을 클로닝할 수 있다.
이러한 예시적 방법은 선택된 세포로부터의 RNA의 추출, cDNA로의 변환, 및 항체 특이적 프라이머를 사용한 PCR에 의한 증폭을 수반한다. 적합한 프라이머는 당업계에 공지되어 있으며, 본원에 예시된 것과 같이 많은 상업적 공급원으로부터 용이하게 이용가능하다. 조합 라이브러리(combinatorial library)의 스크리닝에 의해서 단리된 재조합 인간 또는 비-인간 항체를 발현시키기 위해서, 항체를 코딩하는 DNA를 재조합 발현 벡터로 클로닝하고, 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 박테리아를 포함하는 숙주 세포로 도입한다는 것이 인식될 것이다. 또 다른 실시양태에서, 조절제는 유인원 COS 세포, NS0 세포, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수 세포로 도입되어, 그렇지 않으면 목적하는 구조체를 생산하지 않는 상기 세포에 의해 발현된다. 하기 더욱 자세히 논의되듯이, 목적하는 조절제를 발현하는 형질전환된 세포를 상대적으로 대량으로 성장시켜 융합 구조체 또는 면역글로불린을 임상적 및 상업적으로 공급할 수 있다.
PTK7 조절제의 목적하는 부분을 코딩하는 핵산을 합성하여 또는 상업적 공급원으로부터 파지 디스플레이 기술, 효모 라이브러리, 하이브리도마 기재 기술로부터 수득하든지 또는 유도하든지 간에, 본 발명이 융합 단백질 및 항-PTK7 항체 또는 그의 항원-결합 단편 또는 유도체를 포함하는 PTK7 조절제를 코딩하는 핵산 분자 및 서열을 명확하게 포괄한다는 것이 인식되어야 한다. 본 발명은 추가로 매우 가혹하거나, 또는 별법으로 중간 또는 덜 가혹한 혼성화 조건(예를 들어, 하기 정의된 것과 같음) 하에서 본 발명의 조절제 또는 그의 단편 또는 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산에 상보적인 폴리뉴클레오티드로 혼성화하는 핵산 또는 핵산 분자(예를 들어, 폴리뉴클레오티드)를 포괄한다. 본원에서 사용된 용어 핵산 분자 또는 단리된 핵산 분자는 적어도 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있으나, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. 또한, 본 발명은 벡터, 플라스미드, 숙주 세포, 코스미드 또는 바이러스성 구조체를 제한 없이 포함하는, 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 이러한 조절제를 혼입하는 임의의 비히클 또는 구조체를 포함한다.
용어 단리된 핵산은 핵산이 (i) 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 시험관내 증폭되거나, (ii) 클로닝에 의해 재조합 생성되거나, (iii) 예를 들어, 분열 및 겔-전기 영동 분류에 의해 정제되거나, 또는 (iv) 예를 들어, 화학 합성에 의해 합성되는 것을 의미한다. 단리된 핵산은 재조합 DNA 기술에 의한 조작에 이용가능한 핵산이다.
보다 구체적으로, 본 발명의 항체, 또는 그의 단편, 유도체, 돌연변이 단백질(mutein) 또는 변이체의 쇄 중 하나 또는 둘 다, 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 식별, 분석, 돌연변이 또는 증폭을 위한 혼성화 프로브, PCR 프라이머 또는 시퀀싱 프라이머로서 사용하는데 충분한 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하기 위한 안티센스 핵산을 포함하는 조절제를 코딩하는 핵산, 및 이들의 상보적 서열이 또한 제공된다. 핵산은 임의의 길이일 수 있다. 핵산의 길이는, 예를 들어 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 75개, 100개, 125개, 150개, 175개, 200개, 250개, 300개, 350개, 400개, 450개, 500개, 750개, 1,000개, 1,500개, 3,000개, 5,000개 이상의 뉴클레오티드일 수 있고/거나 하나 이상의 추가 서열, 예를 들어 조절 서열을 포함할 수 있고/거나 더 큰 핵산, 예를 들어 벡터의 일부일 수 있다. 이들 핵산은 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있고, RNA 및/또는 DNA 뉴클레오티드 및 그의 인공 변이체(예를 들어, 펩티드 핵산)를 포함할 수 있다. 항체 또는 그의 면역반응성 단편 또는 유도체를 포함하는 본 발명의 조절제를 코딩하는 핵산은 바람직하게는 상기 기재된 것과 같이 단리된다.
b. 혼성화 및 동일성
명시한 것과 같이, 본 발명은 특정 혼성화 조건 하에서 다른 핵산으로 혼성화하는 핵산을 추가로 제공한다. 핵산의 혼성화 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6]을 참조한다. 본 출원의 목적상, 중간 정도로 가혹한 혼성화 조건은 5x 나트륨 클로라이드/나트륨 시트레이트(SSC)를 함유하는 예비세척 용액, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0), 약 50% 포름아미드의 혼성화 완충제, 6xSSC 및 55℃의 혼성화 온도(또는 기타 유사한 혼성화 용액, 예를 들어 42℃의 혼성화 온도로 약 50% 포름아미드를 함유하는 용액), 및 0.5xSSC, 0.1% SDS에서 60℃의 세척 조건을 사용한다. 가혹한 혼성화 조건은 45℃에서 6xSSC로 혼성화한 후, 0.1xSSC, 0.2% SDS로 68℃에서 1회 이상 세척한다. 또한, 당업자는 혼성화 및/또는 세척 조건을 조작하여 혼성화의 가혹함을 증가 또는 감소시킴으로써 서로 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산이 전형적으로 서로 혼성화된 상태로 유지되도록 할 수 있다. 보다 일반적으로, 본 개시내용의 목적상, 핵산 서열과 관련하여 용어 실질적으로 동일한은 기준 핵산 서열에 약 85% 또는 90% 또는 95% 또는 97% 이상의 서열 동일성을 나타내는 뉴클레오티드의 서열로서 해석될 수 있다.
혼성화 조건의 선택에 영향을 미치는 기본 매개변수 및 적합한 조건 고안을 위한 지침은, 예를 들어 문헌 [Sambrook, Fritsch, and Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., chapters 9 and 11]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., sections 2.10 and 6.3-6.4)]에 설명되어 있고, 예를 들어 핵산의 길이 및/또는 염기 조성에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명에 따라 핵산이 단독으로 존재하거나 또는 동종 또는 이종일 수 있는 기타 핵산과 조합하여 존재할 수 있다는 것이 추가로 인식될 것이다. 바람직한 실시양태에서, 핵산은 상기 핵산에 대해 동종 또는 이종일 수 있는 발현 제어 서열에 기능적으로 연결된다. 이러한 맥락에서, 용어 동종은 핵산이 자연적으로 발현 제어 서열에 기능적으로 연결되어 있다는 것을 의미하며, 용어 이종은 핵산이 자연적으로 발현 제어 서열에 기능적으로 연결되어 있지 않다는 것을 의미한다.
c. 발현
핵산, 예를 들어 RNA 및/또는 단백질 또는 펩티드를 발현하는 핵산, 및 발현 제어 서열은, 이들이 서로 공유결합으로 연결되어 상기 핵산의 발현 또는 전사가 상기 발현 제어 서열의 제어 또는 영향 하인 경우, 서로 기능적으로 연결된다. 핵산이 기능 단백질로 번역되는 경우, 코딩 서열에 기능적으로 연결된 발현 제어 서열과 함께 상기 발현 제어 서열의 유도는 코딩 서열에서 프레임 시프트를 유발하지 않고 상기 핵산의 전사로 귀결되거나 또는 상기 코딩 서열은 목적하는 단백질 또는 펩티드로 번역될 수 없다.
본 발명에 따라, 용어 발현 제어 서열은 프로모터, 리보솜 결합 부위, 증폭자 및 유전자의 전사 또는 mRNA의 번역을 조절하는 기타 조절 요소를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 발현 제어 서열을 조절할 수 있다. 발현 제어 서열의 정확한 구조는 종의 기능 또는 세포 유형에 따라 다양할 수 있으나, 일반적으로 각각 전사 및 번역의 개시에 관여되는 5'-비전사 및 5'- 및 3'-비번역 서열, 예를 들어 TATA 박스, 캐핑 서열, CAAT 서열 등을 포함한다. 보다 구체적으로, 5'-비전사 발현 제어 서열은 기능적으로 연결된 핵산의 전사 제어를 위한 프로모터 서열을 포함하는 프로모터 영역을 포함한다. 또한, 발현 제어 서열은 증폭자 서열 또는 상류 활성제 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라, 용어 프로모터 또는 프로모터 영역은 발현되는 핵산 서열의 상류 (5')에 위치한 핵산 서열에 관한 것이고, RNA-폴리머라제에 대한 인식 및 결합 부위를 제공함으로써 서열의 발현을 제어한다. 프로모터 영역은 유전자의 전사의 조절에 관여되는 추가 인자에 대한 추가 인식 및 결합 부위를 포함할 수 있다. 프로모터는 원핵 또는 진핵 유전자의 전사를 제어할 수 있다. 또한, 프로모터는 유도성일 수 있거나, 유도제에 반응하여 전사를 개시할 수 있거나 또는 전사가 유도제에 의해 제어되지 않는 경우 구성적일 수 있다. 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 유전자는 발현되지 않거나, 또는 유도제가 없는 경우 단지 조금만 발현된다. 유도제의 존재 하에, 유전자는 켜지거나(switched on) 또는 전사 수준이 증가된다. 이것은 일반적으로 특이적 전사 인자의 결합에 의해 매개된다.
본 발명에 따라 바람직한 프로모터는 SP6에 대한 프로모터, T3 및 T7 폴리머라제, 인간 U6 RNA 프로모터, CMV 프로모터, 및 그의 인공 하이브리드 프로모터(예를 들어, CMV)(일부가 기타 세포 단백질 유전자의 프로모터, 예를 들어 인간 GAPDH(글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제)의 일부로 융합됨)를 포함하고, 추가 인트론(들)을 포함하거나 또는 포함하지 않는다.
본 발명에 따라, 용어 발현은 그의 가장 일반적인 의미로 사용되고, RNA, 또는 RNA 및 단백질/펩티드의 생성을 포함한다. 또한, 핵산의 일부 발현을 포함한다. 또한, 발현을 일시적으로 또는 안정적으로 실시할 수 있다.
바람직한 일 실시양태에서, 핵산 분자는 본 발명에 따라 벡터 내에, 적절한 경우 핵산의 발현을 제어하는 프로모터와 존재한다. 용어 벡터는 본원에서 그의 가장 일반적인 의미로 사용되고 상기 핵산이, 예를 들어 원핵 및/또는 진핵 세포로 도입되고, 적절한 경우 게놈으로 통합되도록 할 수 있는 핵산에 대한 임의의 매개 비히클을 포함한다. 이러한 종류의 벡터는 바람직하게는 세포에서 복제되고/거나 발현된다. 벡터는 플라스미드, 파지플라시미드 복합체, 박테리오파아지 또는 바이러스성 게놈을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 용어 플라스미드는 일반적으로 염색체외 유전 물질의 구조체, 보통 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있는 원형 DNA 이중나선에 관한 것이다.
본 발명을 실시하면서, 분자 생물학, 미생물학에서의 많은 통상의 기법, 및 재조합 DNA 기술이 임의로 사용된다는 것이 인식될 것이다. 이러한 통상의 기법은 본원에 정의된 벡터, 숙주 세포 및 재조합 방법에 관한 것이다. 이들 기법은 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.]; [Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3rd Ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000] 및 [Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al., eds., supra]에 설명되어 있다. 예를 들어, 세포 단리 및 배양에 대한 (예를 들어, 추후 핵산 또는 단백질 단리에 대한) 기타 유용한 참고 문헌은 문헌 [Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York] 및 상기 문헌에서 인용된 참고 문헌들을 포함한다; 문헌 [Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y.]; [Gamborg and Phillips (Eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture]; [Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)] 및 [Atlas and Parks (Eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, Fla.]. (예를 들어, 시험관내 증폭, 세포로부터의 정제, 또는 화학적 합성에 의한) 핵산의 제조 방법, 핵산의 조작 및 제조에 유용한, 핵산(예를 들어, 부위-지향성 돌연변이유발, 제한 효소 절단, 라이게이션 등에 의한) 및 다양한 벡터, 세포주 등의 조작 방법은 상기 참고 문헌에 기재되어 있다. 또한, (예를 들어, 표지되거나 또는 바이오티닐화된 폴리뉴클레오티드를 포함하는) 본질적으로 임의의 폴리뉴클레오티드는 임의의 다양한 상업적 공급원으로부터 주문 생산되거나 또는 표준 생산될 수 있다.
따라서, 하나의 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 부분의 재조합 발현을 가능하게 하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 이러한 재조합 숙주 세포에서 발현에 의해 생성되는 항체는 본원에서 재조합 항체로서 지칭된다. 본 발명은 또한 이러한 숙주 세포의 자손 세포, 및 동일 세포에 의해 생성되는 항체를 제공한다.
본원에 사용된 용어 재조합 숙주 세포 (또는 단순하게 숙주 세포)는 재조합 발현 벡터가 그 안으로 도입되는 세포를 의미한다. 재조합 숙주 세포 및 숙주 세포는 특정 대상체 세포뿐만 아니라 이러한 세포의 자손을 의미한다는 것이 이해되어야 한다. 일부 변형은 돌연변이 또는 환경 영향으로 인해 후세대에서 발생할 수 있기 때문에, 이러한 자손은 사실상 부모 세포와 동일하지 않을 수 있으나, 여전히 본원에 사용된 용어 숙주 세포의 범주 내에 포함된다. 이러한 세포는 상기 기재된 것과 같은 본 발명에 따른 벡터를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 것과 같은 항체 또는 그의 부분을 제조하기 위한 방법을 제공한다. 일 실시양태에 따라, 상기 방법은 상기 기재된 것과 같이 벡터로 형질감염되거나 또는 형질전환된 세포를 배양하고, 항체 또는 그의 부분을 회수하는 것을 포함한다.
상기 명시된 것과 같이, 본 발명의 항체 (또는 그의 단편 또는 변이체)의 발현은 바람직하게는 목적하는 항-PTK7 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 발현 벡터(들)을 포함한다. 당업자에게 공지된 방법을 항체 코딩 서열 및 적절한 전사 및 번역 제어 신호를 포함하는 구조체 발현 벡터에 사용할 수 있다. 이들 방법은, 예를 들어 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 유전적 재조합을 포함한다. 따라서, 본 발명의 실시양태는 프로모터에 작동가능하게 연결된 본 발명의 항-PTK7 항체(예를 들어, 전체 항체, 항체의 중쇄 또는 경쇄, 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인, 또는 그의 부분, 또는 중쇄 또는 경쇄 CDR, 단일 쇄 Fv, 또는 그의 단편 또는 변이체)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 복제가능한 벡터를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 벡터는 항체 분자 (또는 그의 단편)의 중쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 항체의 경쇄 (또는 그의 단편)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 또는 중쇄 및 경쇄를 모두 포함할 수 있다.
본원의 교시에 따라 본 발명의 뉴클레오티드가 단리되고 변형되면, 이들은 항-PTK7 항체 또는 그의 단편을 포함하는 선택된 조절제를 생성하는데 사용될 수 있다.
X. 조절제 생성 및 정제
당업계에서 인식된 분자 생물학 기법 및 현재의 단백질 발현 방법론을 사용하여, 상당한 양의 목적하는 조절제를 생성할 수 있다. 보다 구체적으로, 조절제를 코딩하는 핵산 분자, 예를 들어, 항체 상기 기재된 것과 같이 수득되고 유전자 조작된 항체는 다양한 유형의 숙주 세포를 포함하는 공지되고 상업상 이용가능한 단백질 생성 시스템으로 통합되어 임상 전, 임상 또는 상업적 양의 목적하는 제약 생성물을 제공할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 조절제를 코딩하는 핵산 분자는 선택된 숙주 세포로의 효과적인 통합 및 추후 높은 발현 수준의 목적하는 PTK7 조절제를 제공하는 벡터 또는 발현 벡터로 유전자 조작된다는 것이 인식될 것이다.
바람직하게는, 비록 원핵 시스템을 조절제 생성을 위해서 사용할 수 있다는 것이 인식될 것이지만, PTK7 조절제를 코딩하는 핵산 분자 및 이러한 핵산 분자를 포함하는 벡터는 적합한 포유동물, 식물, 박테리아 또는 효모 숙주 세포의 형질감염을 위해서 사용될 수 있다. 형질감염은 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포로 도입하기 위한 임의의 공지된 방법에 의한 것일 수 있다. 이종 폴리뉴클레오티드를 포유동물 세포로 도입하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 덱스트란-매개 형질감염, 칼슘 포스페이트 침전, 폴리브렌-매개 형질감염, 원형질 융합, 전기 천공법, 리포솜 내 폴리뉴클레오티드(들)의 캡슐화, 및 DNA의 핵으로의 직접 미세 주입을 포함한다. 또한, 핵산 분자는 바이러스성 벡터에 의해 포유동물 세포로 도입될 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, U.S.P.Ns. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 및 4,959,455를 참조한다. 또한, 예를 들어 아그로박테리움-매개 형질전환, 유전자총(biolistic) 형질전환, 직접 주입, 전기 천공법 및 바이러스성 형질전환을 비롯한 식물 세포의 형질전환 방법은 당업계에 공지되어 있다. 박테리아 및 효모 세포의 형질전환 방법이 또한 당업계에 공지되어 있다.
또한, 숙주 세포는 본 발명의 2개의 발현 벡터, 예를 들어 중쇄 유도된 폴리펩티드를 코딩하는 제1 벡터 및 경쇄 유도된 폴리펩티드를 코딩하는 제2 벡터로 공동-형질감염될 수 있다. 2개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드의 실질적으로 동등한 발현을 가능하게 하는, 동일한 선택가능한 마커를 함유할 수 있다. 별법으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 모두 코딩하고 발현시킬 수 있는 단일 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 상황에서, 경쇄는 바람직하게는 과량의 독성이 없는 중쇄를 방지하기 위해서 중쇄 앞에 위치한다. 중쇄 및 경쇄에 대한 코딩 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA를 포함할 수 있다.
a. 숙주-발현 시스템
다양한 숙주-발현 벡터 시스템은 상업상 많이 이용가능하며 본원의 교시에 적합하고, 본 발명의 조절제를 발현시키기 위해서 사용될 수 있다. 이러한 숙주-발현 시스템은 이를 통해 관심 코딩 서열이 발현된 후 정제되는 비히클을 나타내며, 또한 적절한 뉴클레오티드 코딩 서열로 형질전환되거나 또는 형질감염되는 경우, 본 발명의 분자를 계내 발현시킬 수 있는 세포를 나타낸다. 이러한 시스템은 조절제 코딩 서열을 함유하는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 미생물, 예를 들어 박테리아(예를 들어, 이. 콜라이, 비. 수브틸리스, 스트렙토마이세스; 조절제 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질감염된 효모 (예를 들어, 사카로마이세스, 피치아(Pichia)); 조절제 코딩 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 바큘로바이러스(baculovirus))로 감염된 곤충 세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 또는 조절제 코딩 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터(예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질감염된 식물 세포 시스템(예를 들어, 니코티아나 (Nicotiana), 아라비돕시스 (Arabidopsis), 좀개구리밥 (duckweed), 옥수수, 밀, 감자 등); 또는 포유동물 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터(예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유도된 프로모터(예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 박시니아 바이러스 7.5K 프로모터)를 함유하는 재조합 발현 구조체를 포함하는 포유동물 세포 시스템(예를 들어, COS, CHO, BHK, 293, 3T3 세포)을 비제한적으로 포함한다.
박테리아 시스템에서, 다수의 발현 벡터는 발현되는 분자의 의도된 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 조절제의 제약 조성물의 발생을 위해서 이러한 단백질이 다량 생성되어야 하는 경우, 용이하게 정제되는 융합 단백질 생성물의 높은 수준의 발현을 지정하는 벡터가 바람직할 수 있다. 이러한 벡터는 이. 콜라이 발현 벡터 pUR278 (문헌 [Ruther et al., EMBO 1. 2:1791 (1983)])을 비제한적으로 포함하고, 여기서 코딩 서열은 lac Z 코딩 영역과의 프레임 내의 벡터로 개별적으로 결찰되어 융합 단백질이 생성될 수 있다; pIN 벡터(문헌 [Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985)]; [Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989))] 등). 또한, pGEX 벡터를 사용하여 외래 폴리펩티드를 글루타티온 5-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 발현시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 용균된(lysed) 세포로부터 매트릭스 글루타티온 아가로스 비드로의 흡착 및 결합에 의해 쉽게 정제된 후, 유리 글루타티온의 존재 하에 용리될 수 있다. pGEX 벡터는 트롬빈 또는 인자 Xa 프로테아제 분열 부위를 포함하여 클로닝된 표적 유전자 생성물이 GST 모이어티로부터 배출될 수 있도록 설계된다.
곤충 시스템에서, 오토그라파 칼리포니카 핵 다면체 바이러스(Autographa californica nuclear polyhedrosis virus: AcNPV)는 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용될 수 있다. 바이러스는 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 코딩 서열은 바이러스의 비-필수 영역(예를 들어, 폴리헤드린 유전자)으로 개별적으로 클로닝되고, AcNPV 프로모터(예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 제어 하에 놓일 수 있다.
포유동물 숙주 세포에서, 다수의 바이러스-기재 발현 시스템을 사용하여 목적하는 뉴클레오티드 서열을 도입할 수 있다. 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 관심 코딩 서열은 아데노바이러스 전사/번역 제어 복합체, 예를 들어 후기 프로모터 및 삼부(tripartite) 리더 서열에 결찰될 수 있다. 이러한 키메라 유전자는 이후 시험관내 또는 생체내 재조합에 의해 아데노바이러스 게놈에 삽입될 수 있다. 바이러스성 게놈의 비-필수 영역(예를 들어, 영역 E1 또는 E3)에서의 삽입은 감염된 숙주에서 생존 가능하고 분자를 발현시킬 수 있는 재조합 바이러스로 귀결될 것이다 (예를 들어, 문헌 [Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1:355-359 (1984)] 참조). 또한, 삽입된 코딩 서열의 효과적인 번역을 위해서 특이적 개시 신호가 요구될 수 있다. 이들 신호는 ATG 개시 코돈 및 인접 서열을 포함한다. 또한, 전체 인서트의 번역을 보장하기 위해서 개시 코돈은 목적하는 코딩 서열의 리딩 프레임과 서로 맞게 작동해야 한다. 이러한 외인성 번역 제어 신호 및 개시 코돈은 다양한 기원일 수 있으며, 천연 및 합성 모두 가능하다. 발현의 효율은 적절한 전사 증폭자 요소, 전사 종결자 등의 포함에 의해 증진될 수 있다(예를 들어, 문헌 [Bittner et al., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)] 참조). 따라서, 발현에 대해 숙주로서 이용가능한 적합한 포유동물 세포주는 당업계에 공지되어 있으며, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection: ATCC)으로부터 이용가능한 많은 불멸성 세포주를 포함한다. 이들은 특히 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, NS0 세포, SP2 세포, HEK-293T 세포, 293 프리스타일(Freestyle) 세포(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)), NIH-3T3 세포, HeLa 세포, 어린 햄스터 신장(BHK) 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(COS), 인간 간세포 암종 세포(예를 들어, Hep G2), A549 세포 및 다수의 기타 세포주를 포함한다.
재조합 단백질의 장기적인 고-수율 생산을 위해서, 안정적인 발현이 바람직하다. 따라서, 선택된 조절제를 안정적으로 발현시키는 세포주는 표준으로 인식된 기법을 사용하여 유전자 조작될 수 있다. 복제의 바이러스성 기원을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 대신, 숙주 세포는 적절한 발현 제어 요소(예를 들어, 프로모터, 증폭자, 서열, 전사 종결자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택가능한 마커로 제어된 DNA로 형질전환될 수 있다. 외래 DNA의 도입 후, 유전자 조작된 세포를 풍부화된 배지에서 1 내지 2일 동안 성장하도록 둔 후, 선택성 배지로 보낼 수 있다. 재조합 플라스미드 중 선택가능한 마커는 선택에 저항력을 부여하고, 세포가 안정적으로 플라스미드를 그의 염색체로 통합하고, 성장하여 차례로 클로닝되어 세포주로 확장될 수 있는 증식소(foci)를 형성하도록 한다. 이러한 방법은 유리하게는 분자를 발현시키는 세포주를 유전자 조작하는데 사용될 수 있다. 이러한 유전자 조작된 세포주는 분자와 직접적으로 또는 간접적으로 상호작용하는 조성물의 스크리닝 및 평가에 특히 유용할 수 있다.
tk- 세포, hgprt- 세포 또는 aprt- 세포에서 각각 적용될 수 있는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제 (문헌 [Wigler et al., Cell 11:223 (1977)]), 하이포크산틴구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제(문헌 [Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)]) 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제(문헌 [Lowy et al., Cell 22:8 17 (1980)]) 유전자를 비제한적으로 포함하는 다수의 선택 시스템이 당업계에 공지되어 있고 사용될 수 있다. 또한, 하기 유전자에 대한 선택의 기초로서 항대사성물질 내성을 사용할 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr(문헌 [Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980)]; [O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)]); 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt(문헌 [Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)]); 아미노글리코시드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo(문헌 [Clinical Pharmacy 12:488-505]; [Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991)]; [Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)]; [Mulligan, Science 260:926-932 (1993)]; 및 [Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993)]; [TIB TECH 11(5):155-2 15 (May, 1993)]); 및 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro(문헌 [Santerre et al., Gene 30:147 (1984)]). 재조합 DNA 기술 분야에 통상적으로 공지된 방법은 목적하는 재조합 클론을 선택하기 위해서 일상적으로 적용될 수 있고, 이러한 방법은, 예를 들어 문헌 [Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]; 및 [Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, in Chapters 12 and 13, John Wiley & Sons, NY (1994)]; [Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981)]에 기재되어 있다. 안정한 고 수율 세포주를 설정하는 특히 바람직한 한 방법이 일정 조건 하에서 발현을 향상시키기 위한 효과적인 접근법을 제공하는 글루타민 합성효소 유전자 발현 시스템(GS 시스템)을 포함한다는 것이 인식될 것이다. GS 시스템은 각각이 본원에 참조로 포함된 EP 특허 제0 216 846호, 제0 256 055호, 제0 323 997호 및 제0 338 841호와 전적으로 또는 부분적으로 관련되어 논의된다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조정하거나, 또는 목적하는 특이적 방식으로 유전자 생성물을 변형 및 처리하는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 단백질 생성물의 이러한 변형(예를 들어, 글리코실화) 및 처리(예를 들어, 분열)는 단백질의 기능 및/또는 정제를 위해서 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 번역 후 처리 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 메카니즘을 갖는다. 당업계에 공지된 것과 같이, 발현된 폴리펩티드의 목적하는 변형 및 처리를 보장하기 위해서 적절한 세포주 또는 숙주 시스템을 선택할 수 있다. 이를 위해서, 유전자 생성물의 1차 전사체의 적절한 처리, 글리코실화 및 인산화를 위한 세포 기구(machinery)를 보유하는 진핵 숙주 세포가 본 발명에서 사용하는데 특히 효과적이다. 따라서, 특히 바람직한 포유동물 숙주 세포는 CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, NS0, MDCK, 293, 3T3, W138뿐만 아니라 유방암 세포주, 예를 들어 BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, 및 정상 유선 세포주, 예를 들어 CRL7O3O 및 HsS78Bst를 비제한적으로 포함한다. 조절제 및 선택된 생산 시스템에 따라, 당업자는 조절제의 효과적인 발현을 위한 적절한 숙주 세포를 쉽게 선택하고 최적화할 수 있다.
b. 화학 합성
상기 언급된 숙주 세포 시스템 외에, 본 발명의 조절제를 당업계에 공지된 기법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다는 것이 인식될 것이다(예를 들어, 문헌 [Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y.] 및 [Hunkapiller, M., et al., 1984, Nature 310:105-111] 참조). 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드 단편에 상응하는 펩티드를 펩티드 합성기를 사용하여 합성할 수 있다. 또한, 목적하는 경우, 비전형 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체를 치환 또는 부가로서 폴리펩티드 서열로 도입할 수 있다. 비전형 아미노산은 보통의 아미노산의 D-이성질체에 2,4-디아미노부티르산, a-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노부티르산, g-Abu, e-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 히드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, b-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너(designer) 아미노산, 예를 들어 b-메틸 아미노산, Ca-메틸 아미노산, Na-메틸 아미노산 및 아미노산 유사체를 일반적으로 비제한적으로 포함한다. 또한, 아미노산은 D(우선성(dextrorotary)) 또는 L(좌선성(levorotary))일 수 있다.
c. 트랜스제닉 시스템
또한, 본 발명의 PTK7 조절제는 관심 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 서열 (또는 그의 단편 또는 유도체 또는 변이체)에 대해 트랜스제닉인 포유동물 또는 식물의 발생 및 회수 가능한 형태의 목적하는 화합물의 생성을 통해 트랜스제닉으로 생성될 수 있다. 포유동물에서의 트랜스제닉 생성과 관련하여, 항-PTK7 항체는, 예를 들어 염소, 젖소 또는 기타 포유동물의 우유로부터 생산될 수 있고 이로부터 회수될 수 있다. 예를 들어, U.S.P.Ns. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 및 5,741,957를 참조한다. 일부 실시양태에서, 인간 면역글로불린 좌위를 포함하는 비-인간 트랜스제닉 동물은 상기 기재된 것과 같이 PTK7 또는 그의 면역원성 부분으로 면역화된다. 식물 내 항체의 제조 방법은, 예를 들어, U.S.P.Ns. 6,046,037 및 5,959,177에 기재되어 있다.
본원의 교시에 따라, 본 발명의 PTK7 조절제를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 표준 트랜스제닉 기법에 의해 동물 또는 식물로 도입함으로써 비-인간 트랜스제닉 동물 또는 식물을 생산할 수 있다. 문헌 [Hogan] 및 U.S. Pat. No. 제6,417,429호를 참조한다. 트랜스제닉 동물을 만들기 위해서 사용되는 트랜스제닉 세포는 배아 줄기 세포 또는 체세포 또는 수정란일 수 있다. 트랜스제닉 비-인간 유기체는 키메라, 비키메라 이형접합자 및 비키메라 동형접합자일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (1999)]; [Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000)]; 및 [Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999)]를 참조한다. 일부 실시양태에서, 트랜스제닉 비-인간 동물은, 예를 들어 관심 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 구조체를 표적화함으로써 표적화된 파괴 및 대체를 갖는다. 한 실시양태에서, 트랜스제닉 동물은 PTK7에 특이적으로 결합하는 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 분자를 포함하고 발현시킨다. 임의의 트랜스제닉 동물에서 항-PTK7 항체를 만들 수 있는 한편, 특히 바람직한 실시양태에서, 비-인간 동물은 마우스, 랫트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말이다. 추가의 실시양태에서, 비-인간 트랜스제닉 동물은 당업계에 인식된 정제 기법을 사용하여 이로부터 용이하게 수득가능한, 혈액, 우유, 소변, 침, 눈물, 점액 및 기타 체액에서 목적하는 제약 생성물을 발현시킨다.
상이한 세포주에 의해 또는 트랜스제닉 동물에서 발현되는 항체를 비롯한 조절제는 서로 상이한 글리코실화 패턴을 가질 것으로 예상된다. 그러나, 본원에 제공된 핵산 분자에 의해 코딩되거나 또는 본원에 제공된 아미노산 서열을 포함하는 모든 조절제는 분자의 글리코실화 상태와 무관하게, 그리고 보다 일반적으로 번역 후 변형(들)의 존재 또는 부재와 무관하게 본 발명의 일부이다. 또한, 본 발명은 번역 중 또는 번역 후, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 가수분해 분열, 항체 분자 또는 기타 세포 리간드에의 연결 등에 의해 상이하게 변형되는 조절제를 포괄한다. 브롬화시안, 트립신, 키모트립신, 파파인, V8 프로테아제, NaBH4에 의한 특이적 화학적 분열, 아세틸화, 포르밀화, 산화, 환원, 튜니카마이신 존재 하의 대사 합성 등을 비제한적으로 포함하는 공지의 기법에 의해 임의의 많은 화학적 변형을 실시할 수 있다. 본 발명은 또한, 예를 들어 N-결합 또는 O-결합 탄수화물 쇄, N-말단 또는 C-말단의 프로세싱, 화학적 모이어티의 아미노산 골격에의 부착, N-결합 또는 O-결합 탄수화물 쇄의 화학적 변형, 및 원핵 숙주 세포 발현으로 인한 N-말단 메티오닌 잔기의 부가 또는 결실을 포함하는 다양한 번역 후 변형을 포함한다. 또한, 하기 본문 및 실시예에 설명된 것과 같이, 폴리펩티드를 또한 검출가능한 표지, 예를 들어 효소, 형광, 방사성 동위원소 또는 친화도 표지로 변형시켜 조절제의 검출 및 단리를 가능하게 할 수 있다.
d. 정제
본 발명의 조절제가 재조합 발현 또는 본원에 개시된 기타 기법들 중 임의의 한 기법에 의해 제조되면, 조절제를 면역글로불린 정제 분야에 공지된 임의의 방법, 또는 보다 일반적으로 단백질 정제를 위한 임의의 기타 표준 기법에 의해 정제할 수 있다. 이 점에 있어서, 조절제를 단리할 수 있다. 본원에 사용된 것과 같은 단리된 PTK7 조절제는 그의 자연 환경의 성분으로부터 식별 및 분리 및/또는 회수되는 조절제이다. 그의 자연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드에 대한 진단학적 또는 치료적 용도에 개입하는 물질이며, 효소, 호르몬, 및 기타 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 폴리펩티드의 자연 환경의 적어도 하나의 성분은 존재하지 않을 것이기 때문에, 단리된 조절제는 재조합 세포 내에 계내 조절제를 포함한다.
재조합 기법을 사용하는 경우, PTK7 조절제(예를 들어, 항-PTK7 항체 또는 그의 유도체 또는 단편)는 원형질막 주위공간에서 세포내 생성되거나 또는 배지로 직접 분비될 수 있다. 목적하는 분자가 세포내 생성되는 경우, 제1 단계로서, 숙주 세포 또는 용균된 단편인 미립자 파괴물을, 예를 들어 원심분리 또는 한외여과에 의해 제거할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Carter, et al., Bio/Technology 10:163 (1992)]에는 이. 콜라이의 원형질막 주위공간으로 분비된 항체의 단리 절차가 기재되어 있다. 요약해서, 약 30분에 걸쳐 나트륨 아세테이트(pH 3.5), EDTA 및 페닐메틸술포닐플루오라이드(PMSF)의 존재 하에 세포 페이스트를 해동시킨다. 원심분리에 의해 세포 파괴물을 제거할 수 있다. 항체가 배지로 분비되는 경우, 일반적으로 상업상 이용가능한 단백질 농도 필터, 예를 들어 아미콘(Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘(Millipore Pellicon) 한외여과 유닛을 사용하여 이러한 발현 시스템으로부터의 상청액을 우선 농축시킨다. 프로테아제 억제제, 예를 들어 PMSF는 상기 단계들 중 임의의 단계에서 포함되어 단백질 가수분해를 억제할 수 있고, 우발적인 오염물의 성장을 예방하기 위해서 항생제가 포함될 수 있다.
세포로부터 제조된 조절제(예를 들어, fc-PTK7 또는 항-PTK7 항체) 조성물을, 예를 들어 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동법, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있고, 친화성 크로마토그래피가 바람직한 정제 기법이다. 친화성 리간드로서 단백질 A의 적합성은 선택된 구조체 내에 존재하는 임의의 면역글로불린 Fc 도메인의 종 및 이소타입에 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 중쇄 기재의 항체를 정제할 수 있다(문헌 [Lindmark, et al., J Immunol Meth 62:1 (1983)]). 단백질 G가 모든 마우스 이소타입 및 인간 IgG3에 대해 추천된다 (문헌 [Guss, et al., EMBO J 5:1567 (1986)]). 친화성 리간드가 부착되는 매트릭스는 매우 종종 아가로스이지만, 기타 매트릭스도 이용가능하다. 기계적으로 안정한 매트릭스, 예를 들어 제어 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠은 아가로스에 의해 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 처리 시간을 가능하게 한다. 항체가 CH3 도메인을 포함하는 경우, 베이커본드(Bakerbond) ABXTM 수지(제이. 티. 베이커사(J. T. Baker); 미국 뉴저지주 필립스버그 소재)가 정제에 유용하다. 단백질 정제를 위한 기타 기법, 예를 들어 이온-교환 컬럼 상에서의 분류, 에탄올 침강, 역상 HPLC, 실리카상 크로마토그래피, 헤파린상 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환 수지상 세파로스 크로마토그래피(예를 들어, 폴리아스파르트산 컬럼), 크로마토포커싱(chromatofocusing), SDS-PAGE 및 암모늄 술페이트 침강이 회수되는 항체에 따라 역시 이용가능하다. 특히 바람직한 실시양태에서, 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피를 사용하여 적어도 부분적으로 본 발명의 조절제를 정제할 것이다.
XI. 접합 PTK7 조절제
본원에 제공된 교시에 따라 본 발명의 조절제를 정제하면, 조절제는 제약 활성 또는 진단 모이어티 또는 생체적합성 변형제로 연결, 융합, 접합되거나 (예를 들어, 공유결합 또는 비-공유결합에 의해) 또는 그렇지 않으면 제약 활성 또는 진단 모이어티 또는 생체적합성 개질제와 회합될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 접합체는 광범위하게 사용되며 회합 방법과 무관하게 개시된 조절제와 회합된 임의의 분자를 의미할 것이다. 이 점에 있어서, 이러한 접합체가 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 중합체, 핵산 분자, 소분자, 모방 작용제(mimetic agent), 합성 약물, 무기 분자, 유기 분자 및 방사성 동위원소를 포함할 수 있다는 것이 인식될 것이다. 또한, 상기 지적한 것과 같이, 선택된 접합체는 조절제와 공유결합 또는 비-공유결합할 수 있고, 접합을 실시하기 위해서 사용되는 방법에 따라 적어도 부분적으로 다양한 몰비를 나타낼 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절제가 선택된 특징을 부여하는 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드(예를 들어, 생물 독소, 바이오마커, 정제 태그 등)와 접합 또는 회합될 수 있다는 것이 명백할 것이다. 보다 일반적으로, 선택된 실시양태에서, 본 발명은 이종 단백질, 또는 10개 이상, 20개 이상, 30개 이상, 40개 이상, 50개 이상, 60개 이상, 70개 이상, 80개 이상, 90개 이상 또는 100개 이상의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드에 재조합 융합되거나 또는 화학적으로 접합된 (공유결합 접합 및 비-공유결합 접합 모두 포함) 조절제 또는 그의 단편의 용도를 포괄한다. 구조체는 반드시 직접적으로 연결될 필요는 없지만, 링커 서열을 통해 발생할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조절제를 특정 세포 표면 수용체에 대해 특이적인 항체에 융합 또는 접합시킴으로써, 항체를 사용하여 이종 폴리펩티드를 PTK7을 시험관내 또는 생체내 발현시키는 특정 세포 유형에 표적화할 수 있다. 또한, 이종 폴리펩티드에 융합 또는 접합된 조절제는 시험관내 면역검정에서 사용될 수도 있고, 당업계에 공지된 정제 방법론에 적합할 수 있다. 예를 들어, 국제 특허 공개 WO 93/21232호; 유럽 특허 EP 제439,095호; 문헌 [Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99]; U.S. Pat. No. 제5,474,981호; 문헌 [Gillies et al., 1992, PNAS 89:1428-1432]; 및 [Fell et al., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452]를 참조한다.
a. 생체적합성 개질제
바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절제는 목적하는 대로 조절제 특성을 조절하거나, 변경하거나, 개선하거나, 또는 조정하기 위해 사용될 수 있는 생체적합성 개질제와 접합되거나 다르게는 회합될 수 있다. 예를 들어, 생체내 반감기가 증가된 항체 또는 융합 구조체는 비교적 고분자량 중합체 분자, 예컨대 상업상 이용가능한 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 또는 유사한 생체적합성 중합체를 부착시켜 생성할 수 있다. 당업자는 PEG가 매우 상이한 분자량 및 분자 배열로 얻어질 수 있으며, 이는 항체에 특이적 특성을 부여하도록 (예컨대 반감기를 조정할 수 있음) 선택될 수 있음을 인지할 것이다. PEG는 PEG의 상기 항체 또는 항체 단편의 N- 또는 C-말단에의 부위-특이적 접합을 통해 또는 리신 잔기 상에 존재하는 입실론-아미노기를 통해 다관능성 링커를 갖거나 갖지 않는 조절제 또는 항체 단편 또는 유도체에 부착시킬 수 있다. 생물학적 활성의 최소 손실을 야기하는 선형 또는 분지형 중합체 유도체화를 사용할 수 있다. 접합 정도는 SDS-PAGE 및 질량 분석법에 의해 면밀하게 모니터링하여 PEG 분자의 항체 분자에의 최적 접합을 보장할 수 있다. 미반응 PEG는 예컨대 크기 배제 또는 이온-교환 크로마토크래피에 의해 항체-PEG 접합체로부터 분리할 수 있다. 유사한 방식으로, 항체 또는 항체 단편을 생체내 보다 안정성이게 하거나 생체내 보다 긴 반감기를 갖게 하기 위해 개시된 조절제를 알부민에 접합시킬 수 있다. 상기 기법은 당업계에 널리 공지되어 있다 (예컨대 국제 공보 제WO 93/15199호, 동 WO 93/15200호, 및 동 WO 01/77137호; 및 유럽 특허 제0 413, 622호 참조). 기타 생체적합성 접합체는 당업자에게 명백하고 본원의 교시에 따라 쉽게 식별할 수 있다.
b. 진단제 또는 검출제
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절제, 또는 이들의 단편 또는 유도체는 생물학적 분자 (예컨대 펩티드 또는 뉴클레오티드), 소분자, 형광단 또는 방사성 동위원소일 수 있는 진단제 또는 검출가능제제, 마커 또는 리포터에 접합된다. 표지된 조절제가 과증식성 장애의 발달 또는 진행의 모니터링을 위해 또는 개시된 조절제를 포함한 특정 요법 (즉, 치료진단(theragnostics))의 효능을 결정하거나 향후 치료과정을 결정하기 위한 임상 시험 절차의 일부로서 유용할 수 있다. 이러한 마커 또는 리포터는 또한 선택된 조절제를 정제하거나, TIC를 분리 또는 단리하는데 유용할 수 있거나 또는 임상 전 절차 또는 독물학 연구에서 유용할 수도 있다.
이러한 진단 및 검출은, 예를 들어 서양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 또는 아세틸콜린에스테라제를 포함하는 다양한 효소; 이로 제한되지는 않지만 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴과 같은 보결분자단; 이로 제한되지는 않지만 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린과 같은 형광 물질; 이로 제한되지는 않지만 루미놀과 같은 발광 물질; 이로 제한되지는 않지만 루시페라제, 루시페린 및 에쿼린과 같은 생체발광 물질; 이로 제한되지는 않지만 아이오딘 (131I, 125I, 123I, 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (115In, 113In, 112In, 111In), 및 테크네튬 (99Tc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브데넘 (99Mo), 제논 (133Xe), 플루오린 (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 및 117주석과 같은 방사성 물질; 다양한 양전자 방출 단층 촬영을 사용하는 양전자 방출 금속, 비방사성 상자성 금속 이온, 및 방사성 표지되거나 특이적 방사성 동위원소에 접합된 분자를 포함하나, 이로 제한되지는 않는 검출가능한 물질에 조절제를 커플링함으로써 달성할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 적절한 검출 방법론은 당업계에 널리 공지되어 있고 수많은 상업상 공급원으로부터 쉽게 이용가능하다.
상기 나타낸 바와 같이, 다른 실시양태에서, 조절제 또는 그의 단편은 마커 서열, 예컨대 펩티드 또는 형광단에 융합시켜 면역조직화학 또는 FAC와 같은 정제 또는 진단 절차를 용이하게 할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 마커 아미노산 서열은 헥사-히스티딘 펩티드 (서열 7), 예컨대 특히 pQE 벡터에 제공되는 태그 (퀴아겐 인크. (Qiagen Inc.))이며, 이들 중 다수는 상업상 이용가능하다. 예를 들어, 문헌 [Gentz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:821-824]에 기재된 바와 같이, 헥사-히스티딘 (서열 166)은 융합 단백질의 편리한 정제를 제공한다. 정제에 유용한 기타 펩티드 태그는 인플루엔자 혈구응집소 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응하는 혈구응집소 "HA" 태그 (문헌 [Wilson et al., 1984, Cell 37:767]) 및 "플래그" 태그 (U.S.P.N. 4,703,004)를 포함하나, 이로 제한되지는 않는다.
c. 치료용 모이어티
상기 시사한 바와 같이, 조절제 또는 그의 단편 또는 유도체는 또한 치료용 모이어티, 예컨대 항암제, 세포독소 또는 세포독성제, 예컨대, 세포증식억제제 또는 세포파괴제, 치료제 또는 방사성 금속 이온, 예컨대 알파 또는 베타-방사체에 접합되거나, 연결되거나, 융합되거나 또는 이와 회합될 수 있다. 본원에 사용되는 세포독소 또는 세포독성제로는 세포에 해롭고 세포 성장 또는 생존을 억제할 수 있는 임의의 제제 또는 치료용 모이어티가 포함된다. 예로는 파클리탁셀, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신, 메이탄시노이드, 예컨대 DM-1 및 DM-4 (이뮤노젠, 아이엔씨.(Immunogen, Inc.)), 디온, 미톡산트론, 미트라마이신, 악티노마이신 D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀올, 푸로마이신, 에피루비신, 및 시클로포스파미드 및 이들의 유사체 또는 상동체가 포함된다. 추가의 세포독소로는 모노메틸 아우리스타틴 E (MMAE) 및 모노메틸 아우리스타틴 F (MMAF) (시애틀 지네틱스, 인크.(Seattle Genetics, Inc.))를 포함한 아우리스타틴, 아마니틴, 예컨대 알파-아마니틴, 베타-아마니틴, 감마-아마니틴 또는 입실론-아마니틴 (하이델베르크 파마 아게(Heidelberg Pharma AG)), DNA 작은홈 결합제, 예컨대 듀오카르마이신 유도체 (신타가 비.브이.(Syntarga, B.V.)) 및 개질된 피롤로벤조디아제핀 이합체 (PBD, 스피로젠 리미티드(Spirogen, Ltd))가 포함된다. 또한, 한 실시양태에서, 본 발명의 PTK7 조절제는 항-CD3 결합 분자와 회합되어 세포독성 T-세포를 선발할 수 있고 이는 종양 개시 세포를 표적으로 한다 (BiTE 기법; 예컨대 본원에 참조로 인용하는 문헌 [Fuhrmann, S. et. al. Annual Meeting of AACR Abstract No. 5625 (2010)] 참조).
추가의 상용성 치료용 모이어티로는 항대사성물질 (예컨대, 메토트렉세이트, 6-메르캅토푸린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예컨대, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BCNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스디클로로디아민 백금 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예컨대, 다우노루비신 (구 다우노마이신) 및 독소루비신), 항생제 (예컨대, 닥티노마이신 (구 악티노마이신), 블레오마이신, 미트라마이신, 및 안트라마이신 (AMC)), 및 유사분열방지제 (예컨대, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)을 포함하나, 이로 제한되지는 않는 세포독성제가 포함된다. 치료용 모이어티의 보다 광범위한 목록은 각각 본원에 참조로 인용하는 PCT 공보 WO 03/075957 및 U.S.P.N. 2009/0155255에서 찾을 수 있다.
선택된 조절제는 또한 라디오메탈 이온의 접합에 유용한 방사성 물질 또는 거대고리 킬레이트화제와 같은 치료용 모이어티에 접합될 수도 있다 (방사성 물질의 예에 관해 상기 참조). 특정 실시양태에서, 거대고리 킬레이트화제는 링커 분자를 통해 항체에 부착될 수 있는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-N,N',N",N"-테트라아세트산 (DOTA)이다. 이러한 링커 분자는 당업계에 통상적으로 공지되어 있고 문헌 [Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res. 4:2483]; [Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553]; 및 [Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26:943]에 기재되어 있다.
본 발명의 상기 양태와 상용성일 수 있는 예시적인 방사성 동위원소로는 아이오딘 (131I, 125I, 123I, 121I), 탄소 (14C), 구리 (62Cu, 64Cu, 67Cu), 황 (35S), 삼중수소 (3H), 인듐 (115In, 113In, 112In, 111In), 비스무스 (212Bi, 213Bi), 테크네튬 (99Tc), 탈륨 (201Ti), 갈륨 (68Ga, 67Ga), 팔라듐 (103Pd), 몰리브데넘 (99Mo), 제논 (133Xe), 플루오린 (18F), 153Sm, 177Lu, 159Gd, 149Pm, 140La, 175Yb, 166Ho, 90Y, 47Sc, 186Re, 188Re, 142Pr, 105Rh, 97Ru, 68Ge, 57Co, 65Zn, 85Sr, 32P, 153Gd, 169Yb, 51Cr, 54Mn, 75Se, 113Sn, 117주석, 225Ac, 76Br, 및 211At가 포함되나, 이로 제한되지는 않는다. 기타 방사성 핵종, 특별히 60 내지 4,000 keV의 에너지 범위 내의 방사성 핵종이 또한 진단제 및 치료제로서 이용가능하다. 치료하고자 하는 상태 및 목적하는 치료 프로파일에 따라, 당업자는 개시된 조절제와 함께 사용하기에 적절한 방사성 동위원소를 쉽게 선택할 수 있다.
본 발명의 PTK7 조절제는 주어진 생물학적 반응을 개질하는 치료용 모이어티 또는 약물 (예컨대, 생물학적 반응 개질제 또는 BRM)에 접합될 수도 있다. 즉, 본 발명과 상용성인 치료제 또는 모이어티는 고전적인 화학 치료제로 제한되는 것으로 해석되어서는 않는다. 예를 들어, 특히 바람직한 실시양태에서, 약물 모이어티는 목적하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드 또는 이들의 단편일 수 있다. 이러한 단백질은, 예를 들어, 독소, 예컨대 아브린, 리신 A, 온코나제 (또는 또 다른 세포독성 RNase), 수도모나스 외독소, 콜레라 독소, 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예컨대 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판유래 성장 인자, 조직 플라스미노겐 활성제, 세포사멸제, 예컨대 TNF-α, TNF-β, AIM I (국제 공보 제WO 97/33899호 참조), AIM II (국제 공보 제WO 97/34911호 참조), Fas 리간드 (문헌 [Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6:1567]), 및 VEGI (국제 공보 제WO 99/23105호), 혈전제 또는 혈관형성방지제, 예컨대, 안지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는 생물학적 반응 개질제 예를 들어, 림포카인 (예컨대, 인터류킨-1 ("IL-1"), 인터류킨-2 ("IL-2"), 인터류킨-6 ("IL-6"), 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 및 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF")), 또는 성장 인자 (예컨대, 성장 호르몬 ("GH"))을 포함할 수 있다. 상기 설명한 바와 같이, 폴리펩티드 모이어티에 조절제를 융합시키거나 접합시키는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 상기 개시된 참고문헌에 더하여, 예컨대, 각각 본원에 참조로 인용하는 U.S.P.N. 5,336,603; 동 5,622,929; 동 5,359,046; 동 5,349,053; 동 5,447,851, 및 동 5,112,946; EP 307,434; EP 367,166; PCT 공보 WO 96/04388 및 동 WO 91/06570; 문헌 [Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88:10535]; [Zheng et al., 1995, J Immunol 154:5590]; 및 [Vil et al., 1992, PNAS USA 89:11337]을 참조하기 바란다. 조절제와 모이어티의 회합은 반드시 직접적일 필요는 없으나, 링커 서열을 통해 발생할 수 있다. 이러한 링커 분자는 통상적으로 당업계에 공지되어 있고 각각 본원에 참조로 인용하는 문헌 [Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res 4:2483]; [Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10:553]; [Zimmerman et al., 1999, Nucl Med Biol 26:943]; [Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171]에 기재되어 있다.
보다 일반적으로, 치료용 모이어티 또는 세포독성제를 조절제에 접합시키는 기법은 널리 공지되어 있다. 모이어티는 알데히드/쉬프(Schiff) 연결, 술피드릴 연결, 산-불안정성 연결, 시스-아코니틸 연결, 히드라존 연결, 효소 분해가능 연결을 포함하나, 이로 제한되지는 않는 임의의 당업계 인지된 방법에 의해 조절제에 접합될 수 있다 (일반적으로 문헌 [Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171] 참조). 또한, 예컨대, 문헌 [Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)]; [Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)]; [Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)]; ["Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)], 및 [Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119]을 참고하기 바란다. 바람직한 실시양태에서, 치료용 모이어티 또는 세포독성제에 접합되는 PTK7 조절제는 세포 표면과 회합된 PTK7 분자에의 결합시 세포에 의해 내재화되어 치료 적재량을 전달할 수 있다.
XII. 진단 및 스크리닝
a. 진단
나타낸 바와 같이, 본 발명은 과증식성 장애를 검출하거나, 진단하거나, 모니터링하는 시험관내 또는 생체내 방법 및 TPC를 포함한 종양형성성 세포를 식별하기 위해 환자로부터 세포를 스크리닝하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 치료를 위해 암을 갖는 개체를 식별하는 것 또는 환자 또는 환자로부터 얻어진 샘플을 본원에 기재된 바와 같이 선택된 PTK7 조절제와 접촉시키고 조절제의 존재 또는 부재, 또는 샘플 내 PTK7을 결합시키거나 유리시키기 위한 조절제의 회합 수준을 검출하는 것을 포함하는 암의 진행을 모니터링하는 것을 포함한다. 조절제가 항체 또는 이들의 면역학적 활성 단편을 포함하는 경우, 샘플 내 특정 PTK7과의 회합은, 아마도 샘플이 종양 지속 세포 (예컨대, 암 줄기 세포)를 함유할 수 있음을 나타내며, 이는 암을 갖는 개체를 본원에 기재된 PTK7 조절제로 효과적으로 치료할 수 있음을 나타낸다. 상기 방법은 결합 수준을 대조군과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 반대로, 선택된 조절제가 Fc-PTK7인 경우, 선택된 PTK7의 결합 특성을 샘플과 (직접적으로 또는 간접적으로, 생체내 또는 시험관내) 접촉시에 활용하고 모니터링하여 목적하는 정보를 제공할 수 있다. 본원의 교시와 상용성인 기타 진단 또는 치료진단 방법은 당업계에 널리 공지되어 있고 전용 기록 시스템과 같은 시판용 물질을 사용하여 실시할 수 있다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절제를 사용하여 환자 샘플 (예컨대, 혈장 또는 혈액) 내의 PTK7 수준을 검출하고 정량화할 수 있으며, 이를 사용하여 과증식성 장애를 비롯한 PTK7 관련 장애를 검출하거나, 진단하거나, 모니터링할 수 있다. 관련 실시양태에서, 본 발명의 조절제는 순환성 (circulating) 종양 세포를 생체 내 또는 시험관내에서 검출, 모니터링하고/거나 정량화하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 WO 2012/0128801 참고). 또 다른 바람직한 실시양태에서, 상기 순환성 종양 세포는 암 줄기 세포를 포함한다.
예시적인 상용성 검정 방법으로는 방사면역검정, 효소면역검정, 경쟁-결합 검정, 형광 면역검정, 면역블롯검정, 웨스턴 블롯 검정, 유동 세포계측 검정, 및 ELISA 검정이 포함된다. 보다 일반적으로, 생물학적 샘플 내 PTK7의 검출 또는 PTK7 효소 활성의 측정 (또는 그의 억제)는 임의의 당업계 공지 검정을 사용하여 달성할 수 있다. 생체내 상용성 치료진단 또는 진단은 당업계에 인지된 영상 또는 모니터링 기법, 예컨대 자기 공명 영상법 (MRI), 컴퓨터화 단층 촬영 (예컨대 CAT 스캔), 양전자 단층 촬영 (예컨대, PET 스캔), 초음파 등을 포함할 수 있다. 당업자는 장애의 병인, 병리학 징후 또는 임상적 진행을 기초로 적절한 검출, 모니터링 또는 영상 기법 (종종 상업상 이용가능한 공급원 포함)을 쉽게 인지하고 실시할 수 있을 것이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 생체내 암 진행 및/또는 발병을 분석하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 생체내 암 진행 및/또는 발병의 분석은 종양 진행 정도를 결정하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 분석은 종양의 식별을 포함한다. 다른 실시양태에서, 종양 진행의 분석은 일차 종양에 대해 수행한다. 다른 실시양태에서, 분석은 당업자에게 공지된 암의 유형에 따라 시간에 걸쳐 수행한다. 다른 실시양태에서, 일차 종양의 전이 세포로부터 유래되는 이차 종양의 추가 분석을 생체내에서 분석한다. 다른 실시양태에서, 이차 종양의 크기 및 모양을 분석한다. 일부 실시양태에서, 추가 생체외 분석을 수행한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 세포 전이를 결정하는 것 또는 순환성 종양 세포의 수준을 검출하고 정량화하는 것을 포함하는 생체내 암 진행 및/또는 발병을 분석하는 방법을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 세포 전이의 분석은 일차 종양으로부터 불연속적인 부위에서 세포의 진행성 성장의 결정을 포함한다. 다른 실시양태에서, 세포 전이 부위 분석은 신생물 확산 경로를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 체강 내의 혈관구조, 림프관, 또는 이들의 조합을 통해 확산될 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포 전이 분석은 세포 이동, 유포, 유출, 증식 또는 이들의 조합의 관점에서 실행한다.
특정 예에서, 대상 또는 대상으로부터의 샘플 내의 종양형성성 세포는 치료 또는 요법 이전에 개시된 조절제를 사용하여 평가하거나 특성화하여 기저선을 확립할 수 있다. 다른 예에서, 샘플은 치료한 대상으로부터 유래된다. 일부 예에서, 샘플은 대상이 치료를 시작하거나 종결한지 적어도 약 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 30, 60, 90일, 6개월, 9개월, 12개월 또는 12개월 초과 이후에 대상으로부터 취한다. 특정 예에서, 종양형성성 세포는 특정 투약 횟수 후에 (예컨대, 2, 5, 10, 20, 30회 또는 그 이상 치료 투약 이후에) 평가하거나 특성화한다. 다른 예에서, 종양형성성 세포는 1회 이상의 치료를 받은 지 1주, 2주, 1개월, 2개월, 1년, 2년, 3년, 4년 이상 이후에 특성화하거나 평가한다.
또 다른 양태에서, 및 하기 보다 상세히 논의한 바와 같이, 본 발명은 과증식성 장애를 검출하거나, 모니터링하거나, 진단하거나, 가능한 치료를 위해 이러한 장애를 갖는 개체를 식별하거나, 환자의 장애의 진행 (또는 퇴행)을 모니터링하기 위한 키트를 제공하며, 키트는 본원에 기재된 조절제, 및 샘플에 대한 조절제의 영향을 검출하기 위한 시약을 포함한다.
b. 스크리닝
PTK7 조절제 및 이들의 자손을 비롯하여 이를 포함하는 세포, 배양물, 집단 및 조성물을 사용하여 또한 PTK7 (예컨대, 이들의 폴리펩티드 또는 유전 성분)와 상호작용하여 종양 개시 세포 또는 이들의 자손의 기능 또는 활성에 영향을 미치는 화합물 또는 제제 (예컨대, 약물)를 스크리닝하거나 식별할 수 있다. 따라서, 본 발명은 PTK7 또는 그의 기질과 회합하여 종양 개시 세포 또는 이들의 자손의 기능 또는 활성에 영향을 미칠 수 있는 화합물 또는 제제의 평가 또는 식별을 위한 시스템 및 방법을 추가로 제공한다. 이러한 화합물 및 제제는 예를 들어 과증식성 장애의 치료를 위해 스크리닝되는 약물 후보물질일 수 있다. 한 실시양태에서, 시스템 또는 방법은 PTK7을 나타내는 종양 개시 세포 및 화합물 또는 제제 (예컨대, 약물)를 포함하며, 세포 및 화합물 또는 제제 (예컨대, 약물)는 서로 접촉하고 있다.
본 발명은 종양 개시 세포 또는 자손 세포의 활성 또는 기능을 변경하기 위한 PTK7 조절제 또는 제제 및 화합물을 스크리닝하고 식별하는 방법을 추가로 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 종양 개시 세포 또는 이들의 자손을 시험 제제 또는 화합물과 접촉시키고, 시험 제제 또는 화합물이 PTK7 회합된 종양 개시 세포의 활성 또는 기능을 조절하는지를 결정하는 것을 포함한다.
집단 내의 이러한 종양 개시 세포 또는 이들의 자손의 PTK7 관련 활성 또는 기능을 조절하는 시험 제제 또는 화합물은 시험 제제 또는 화합물을 활성제로서 식별한다. 조절될 수 있는 예시적인 활성 또는 기능으로는 세포 형태, 마커의 발현, 분화 또는 탈분화, 성숙, 증식, 생식성, 세포자멸 또는 세포사 신경전구세포 또는 이들의 자손의 변화가 포함된다.
세포 또는 세포 배양물 또는 방법 단계 또는 치료와 관련하여 사용하는 경우, 접촉시킨다는 것은 조성물 (예컨대, PTK7 회합 세포 또는 세포 배양물)과 또 다른 언급된 실체와의 직접적이거나 간접적인 상호작용을 의미한다. 직접 상호작용의 특정 예는 물리적 상호작용이다. 간접 상호작용의 특정 예는 조성물이 중간 분자에 작용하며, 이는 다시 언급된 실체 (예컨대, 세포 또는 세포 배양물)에 작용하는 경우이다.
본 발명의 상기 양태에서, 조절한다는 본 발명의 종양 개시 세포 또는 자손 세포의 특정 양태 (예컨대, 전이 또는 증식)에 관련된 것으로 결정되는 세포 활성 또는 기능에 대한 영향을 검출하는 것과 상용성인 방식으로, 종양 개시 세포 또는 자손 세포의 활성 또는 기능에 영향을 미치는 것을 나타낸다. 예시적인 활성 및 기능은 형태, 발달 마커, 분화, 증식, 생존력, 세포 호흡, 미토콘트리아 활성, 막 완전성, 또는 특정 상태와 관련된 마커의 발현을 측정하는 것을 포함하나, 이로 제한되지는 않는다. 따라서, 화합물 또는 제제 (예컨대, 약물 후보물질)는 본원에 개시되어 있거나 당업자에게 공지되어 있는 바와 같이 종양 개시 세포 또는 자손 세포를 화합물 또는 제제와 접촉시키고 종양 개시 세포 또는 자손 세포의 활성 또는 기능의 임의의 조절을 측정함으로써, 종양 개시 세포 또는 자손 세포에 대한 그의 영향을 평가할 수 있다.
제제 및 화합물을 스크리닝하고 식별하는 방법은 고 처리율 스크리닝에 적합한 방법을 포함하며, 이는 임의로는 예정된 위치 또는 주소에 위치하거나 배치된 세포의 어레이 (예컨대, 마이크로어레이)를 포함한다. 기계적인 또는 수동적인 고 처리율 취급 방법은 짧은 기간 내에 많은 유전자의 발현 수준을 측정하고 화학적 상호작용을 조사할 수 있다. 분자 신호 (예컨대, 형광단) 및 매우 빠른 속도로 정보를 가공하는 자동화 분석을 이용하는 기법이 발달하였다 (예컨대, 문헌 [Pinhasov et al., Comb. Chem. High Throughput Screen. 7:133 (2004)] 참조). 예를 들어, 마이크로어레이 기법은 한번에 수천개의 유전자의 상호작용을 조사하면서, 특정 유전자에 대한 정보를 제공하기 위해 광범위하게 이용된다 (예컨대, 문헌 [Mocellin and Rossi, Adv. Exp. Med. Biol. 593:19 (2007)] 참조).
이러한 스크리닝 방법 (예컨대, 고 처리율)은 활성 제제 및 화합물을 신속하고 효율적으로 식별할 수 있다. 예를 들어, 잠재적인 치료 분자의 식별을 위해, 세포를 배양 접시, 튜브, 플라스크, 롤러 병 또는 플레이트 (예컨대, 단일 다중 웰 플레이트 또는 접시, 예컨대 8, 16, 32, 64, 96, 384 및 1536 다중 웰 플레이트 또는 접시) 상에 임의로는 한정된 위치에 위치하거나 배치 (예비 파종)할 수 있다. 스크리닝할 수 있는 라이브러리로는, 예를 들어, 소분자 라이브러리, 파지 디스플레이 라이브러리, 완전 인간 항체 효모 디스플레이 라이브러리 (아디맵, 엘엘씨(Adimab, LLC)), siRNA 라이브러리, 및 아데노바이러스 형질전환 벡터가 포함된다.
XIII. 제약상 제제 및 치료적 용도
a. 투여 제형 및 경로
임의의 임의적인 접합체와 조절제의 형태, 의도된 전달 방식, 치료하거나 모니터링하는 질환, 및 수많은 기타 변수에 따라, 본 발명의 조성물은 당업계에 인지된 기법을 사용하여 목적하는 대로 제형화할 수 있다. 즉, 본 발명의 다양한 실시양태에서, PTK7 조절제를 포함하는 조성물은 매우 다양한 제약상 허용되는 담체로 제형화된다 (예컨대, 문헌 [Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20th ed. (2003)]; [Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th ed., Lippencott Williams and Wilkins (2004)]; [Kibbe et al., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd ed., Pharmaceutical Press (2000)] 참조). 비히클, 보조제 및 희석제를 포함하는 다양한 제약상 허용되는 담체가 수많은 상업상 공급원으로부터 쉽게 이용가능하다. 더구나, 제약상 허용되는 보조 물질, 예컨대 pH 조절제 및 완충제, 긴장성 조절제, 안정화제, 습윤제 등의 조합도 또한 이용가능하다. 특정 비제한적인 예시적 담체로는 염수, 완충 염수, 덱스트로오스, 물, 글리세롤, 에탄올, 및 이들의 조합이 포함된다.
보다 특히, 일부 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 순수하게 또는 최소의 부가 성분과 함께 투여할 수 있음이 인지될 것이다. 역으로, 본 발명의 PTK7 조절제는 임의로는 조절제의 투여를 용이하게 하거나 활성 화합물의 작용 부위에의 전달을 위해 제약상 최적화된 제제로의 가공을 돕는 당업계에 널리 공지되고 비교적 불활성 물질인 부형제 및 보조 물질을 포함하는 적합한 제약상 허용되는 담체를 함유하도록 제형화할 수 있다. 예를 들어, 부형제는 형태 또는 농도를 제공하거나 희석제로서 작용하여 조절제의 약물동태학을 개선할 수 있다. 적합한 부형제로는 안정화제, 습윤제 및 유화제, 오스몰 농도 변경을 위한 염, 캡슐화제, 완충제, 및 피부 침투 향상제가 포함되나, 이로 제한되지는 않는다.
개시된 전신 투여용 조절제는 장관, 비경구 또는 국소 투여를 위해 제형화할 수 있다. 사실상, 모든 3가지 유형의 제형을 동시에 사용하여 활성 성분의 전신 투여를 달성할 수 있다. 경구 및 비경구 약물 전달을 위한 부형제 및 또한 제형은 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]에 설명되어 있다. 비경구 투여에 적합한 제형으로는 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액, 예를 들어, 수용성 염이 포함된다. 또한, 유성 주사 현탁액을 위해 적절한 활성 화합물의 현탁액을 투여할 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클로는 지방 오일, 예를 들어, 참깨유, 또는 합성 지방산 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트 또는 트리글리세리드가 포함된다. 수성 주사 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질을 함유할 수 있고, 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란이 포함된다. 임의로는, 현탁액은 또한 안정화제를 함유할 수도 있다. 리포솜을 사용하여 세포로의 전달을 위한 제제를 캡슐화할 수도 있다.
장관 투여에 적합한 제형으로는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 알약, 코팅된 정제를 비롯한 정제, 엘릭시르제, 현탁액, 시럽 또는 흡입약 및 이들의 제어된 방출 형태가 포함된다.
일반적으로, PTK7 조절제를 포함하는 본 발명의 화합물 및 조성물은 이를 필요로 하는 대상에, 이로 제한되지는 않지만, 경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 비경구, 비강내, 근육내, 심장내, 심실내, 기관내, 구강, 직장, 복강내, 진피내, 국소, 경피, 및 경막내를 비롯한 다양한 경로에 의해, 또는 다르게는 이식 또는 흡입에 의해, 생체내 투여할 수 있다. 대상 조성물은, 이로 제한되지는 않지만, 정제, 캡슐, 분말, 과립, 연고, 용액, 좌약, 관장제, 주사, 흡입약 및 에어로졸을 비롯한 고체, 반고체, 액체 또는 기체 형태의 제제로 제형화할 수 있다. 투여의 적절한 제형 및 경로는 의도된 적용 및 치료 요법에 따라 선택할 수 있다.
b. 투약량
유사하게, 특정 투약 요법, 즉, 투약량, 시기 및 반복은 특정 개체 및 그 개체의 의료 이력에 따라 좌우될 것이다. 경험상 고려사항, 예컨대 약물동태학 (예컨대, 반감기, 클리어런스율, 등)이 투약량의 결정에 기여할 것이다. 투여 빈도는 치료 과정에 걸쳐 결정하고 조정할 수 있고, 종양 개시 세포를 비롯한 과증식성 또는 신생 세포 수의 감소, 이러한 신생 세포 감소의 유지, 신생 세포의 증식 감소, 또는 전이의 발달 지연을 기초로 한다. 별법으로, 대상 치료 조성물의 지속적인 연속 방출 제형이 적절할 수 있다. 상기 시사한 바와 같이, 지속적인 방출을 달성하기 위한 다양한 제형 및 장치는 당업계에 공지되어 있다.
치료적 관점에서, 제약 조성물은 특이적 적응증의 치료 또는 예방을 위한 유효량으로 투여한다. 치료 유효량은 전형적으로 치료 대상의 중량, 그의 신체적 또는 건강 상태, 처리하고자 하는 상태의 광범위함, 또는 치료 대상의 연령에 의존한다. 일반적으로, 본 발명의 PTK7 조절제는 1회 투약당 약 10 μg/kg 체중 내지 약 100 mg/kg 체중 범위의 양으로 투여할 수 있다. 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 PTK7 조절제는 1회 투약당 약 50 μg/kg 체중 내지 약 5 mg/kg 체중 범위의 양으로 투여할 수 있다. 다른 특정 실시양태에서, 본 발명의 PTK7 조절제는 1회 투약당 약 100 μg/kg 체중 내지 약 10 mg/kg 체중 범위의 양으로 투여할 수 있다. 임의로는, 본 발명의 PTK7 조절제는 1회 투약당 약 100 μg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중 범위의 양으로 투여할 수 있다. 또한 임의로는, 본 발명의 PTK7 조절제는 1회 투약당 약 0.5 mg/kg 체중 내지 약 20 mg/kg 체중 범위의 양으로 투여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 약 100 μg/kg 체중 이상, 약 250 μg/kg 체중 이상, 약 750 μg/kg 체중 이상, 약 3 mg/kg 체중 이상, 약 5 mg/kg 체중 이상, 약 10 mg/kg 체중 이상의 투약량으로 투여된다.
기타 투약 요법은 전문을 본원에 참조로 인용하는 U.S.P.N. 7,744,877에 개시된 체표면적 (BSA) 계산에 근거할 수 있다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, BSA는 환자의 신장 및 중량을 사용하여 계산하고 체표면적으로 나타내어지는 대상의 크기 기준을 제공한다. BSA를 사용하는 본 발명의 선택된 실시양태에서, 조절제는 10 mg/m2 내지 800 mg/m2의 투약량으로 투여할 수 있다. 다른 바람직한 실시양태에서, 조절제는 50 mg/m2 내지 500 mg/m2의 투약량으로, 보다 더 바람직하게는 100 mg/m2, 150 mg/m2, 200 mg/m2, 250 mg/m2, 300 mg/m2, 350 mg/m2, 400 mg/m2 또는 450 mg/m2의 투약량으로 투여될 것이다. 물론, 투약량을 어떻게 계산하는지에 관계없이, 다회 투약량을 선택된 시간 주기에 걸쳐 투여하여 개별 투여보다 실질적으로 높은 절대 투약량을 제공할 수 있다.
어떠한 경우에도, PTK7 조절제는 바람직하게는 이를 필요로 하는 대상에 필요에 따라 투여한다. 투여 빈도의 결정은 치료 상태, 치료 대상의 연령, 치료 상태의 심각성, 치료 대상의 일반적인 건강 상태 등의 참작에 기초하여 당업자, 예컨대 주치의에 의해 이루어질 수 있다. 일반적으로, PTK7 조절제의 유효 투약량은 대상에 1회 이상 투여한다. 보다 특히, 조절제의 유효 투약량은 대상에 1개월에 1회, 1개월에 1회 초과, 또는 1개월에 1회 미만 투여한다. 특정 실시양태에서, PTK7 조절제의 유효 투약량은 1개월 이상, 6개월 이상, 또는 1년 이상의 기간 동안을 비롯하여 수회 투여할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 개시된 조절제의 투여 사이에 몇 일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7), 몇 주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8) 또는 몇 달 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8)이 경과할 수 있다.
투약량 및 요법은 또한 1회 이상의 투여를 받은 개체 내의 개시된 치료 조성물에 대해 실증적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 제조된 치료 조성물의 증가하는 투약량을 개체에 제공할 수 있다. 선택된 조성물의 효능을 평가하기 위해, 특이적 질환, 이상 또는 상태의 마커를 상기 기재된 바와 같이 지켜볼 수 있다. 개체가 암을 갖는 실시양태에서, 이는 촉진 또는 시각적 관측을 통한 종양 크기의 직접 측정, x-선 또는 기타 영상 기법에 의한 종양 크기의 간접 측정; 종양 샘플의 직접적인 종양 생검 및 현미경 시험에 의해 평가되는 개선; 간접적인 종양 마커 (예컨대, 전립선암의 경우 PSA) 또는 본원에 기재된 방법에 따라 식별되는 항원, 통증 또는 마비 감소의 측정; 개선된 말하기, 시력, 호흡 또는 종양과 관련된 기타 장애; 증가된 식욕; 허용된 시험 또는 생존 연장에 의해 측정되는 삶의 질의 증가를 포함한다. 투약량이 개체, 신생물 상태의 유형, 신생물 상태의 단계, 신생물 상태가 개체 내의 다른 위치로 전이되기 시작했는지 여부, 및 사용되는 과거 및 동시 치료법에 따라 달라질 것임은 당업자에게 명백할 것이다.
c. 조합 요법
본 발명에 의해 고려되는 조합 요법은 원치 않는 신생물 세포 증식 (예컨대 내피 세포)의 감소 또는 억제, 암 발생 감소, 암 재발 감소 또는 예방, 또는 암의 확산 또는 전이의 감소 또는 예방에 특히 유용할 수 있다. 이러한 경우, 본 발명의 화합물은 종양 질량을 지지하고 영구화하는 TPC (예컨대 NTG 세포)를 제거하여 감작제 또는 화학감작제로서 기능할 수 있고 현 표준 관리 용적축소제 또는 항암제의 보다 효과적인 사용을 가능케 할 수 있다. 즉, PTK7 조절제 및 하나 이상의 항암제를 포함하는 조합 요법을 사용하여 확립된 암을 감소시키고, 예컨대 존재하는 암 세포의 개수를 감소시키고/거나 용적을 축소시키거나, 또는 암의 하나 이상의 징후 또는 부작용을 호전시킬 수 있다. 이와 같이, 조합 요법은 세포독성제, 세포증식억제제, 화학요법제, 표적 항암제, 생물학적 반응 개질제, 면역요법제, 암 백신, 혈관형성방지제, 사이토킨, 호르몬 요법, 방사선 요법 및 항전이제를 포함하나, 이로 제한되지는 않는 하나 이상의 항암제 및 PTK7 조절제의 투여를 나타낸다.
본 발명의 방법에 따르면, 조합 결과가 각 치료 (예컨대, 항-PTK7 항체 및 항암제)를 별도로 수행하는 경우 관측되는 효과의 합계인 것이 요구되지는 않는다. 적어도 추가의 효과가 일반적으로 바람직하지만, 단일 요법 중 하나보다 높은 임의의 증가된 항-종양 효과가 유익하다. 또한, 본 발명은 조합 치료가 상승작용적 효과를 나타내는 것을 요구하지 않는다. 그러나, 당업자는 바람직한 실시양태를 포함하는 특정 선택된 조합으로, 상승작용이 관측될 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명에 따른 조합 요법을 실시하기 위해, 하나 이상의 항암제와 조합된 PTK7 조절제 (예컨대, 항-PTK7 항체)는 이를 필요로 하는 대상에 대상 내의 항암 활성을 야기하기에 효과적인 방식으로 투여할 수 있다. PTK7 조절제 및 항암제는 목적하는 대로 종양 환경 내에 이들의 조합된 존재 및 이들의 조합 작용을 야기하기에 효과적인 기간 동안 효과적인 양으로 제공된다. 상기 목적을 달성하기 위해, PTK7 조절제 및 항암제는 동시에, 단일 조성물로, 또는 동일하거나 상이한 투여 경로를 사용하여 2가지 이상의 별도의 조성물로서 대상에 투여할 수 있다.
다르게는, 조절제는 예컨대 수분 내지 수주에 걸친 간격으로 항암제 치료에 선행하거나 후속할 수 있다. 항암제 및 항체를 대상에 별도로 적용하는 특정 실시양태에서, 각 전달 시기 사이의 기간은 항암제 및 조절제가 종양에 대해 조합 효과를 발휘할 수 있도록 한다. 특정 실시양태에서, 항암제 및 PTK7 조절제 둘 다를 서로 약 5분 내지 약 2주 내에 투여하는 것이 고려된다.
또 다른 실시양태에서, 조절제 및 항암제의 투여 사이에 몇 일 (2, 3, 4, 5, 6 또는 7일), 몇 주 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8주) 또는 몇 개월 (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개월)이 경과할 수 있다. PTK7 조절제 및 하나 이상의 항암제 (조합 요법)는 1회, 2회 또는 적어도 상태가 치료되거나, 일시적으로 완화되거나, 완치될 때까지의 기간에 투여할 수 있다. 바람직하게는, 조합 요법은 수회 투여한다. 조합 요법은 1일 3회 내지 6개월마다 1회 투여할 수 있다. 투여는 1일 3회, 1일 2회, 1일 1회, 2일마다 1회, 3일마다 1회, 1주 1회, 2주마다 1회, 매달 1회, 2개월마다 1회, 3개월마다 1회, 6개월마다 1회와 같이 예정대로 할 수 있거나 연속적으로 소형펌프를 통해 투여할 수 있다. 상기 나타낸 바와 같이, 조합 요법은 경구, 점막, 협측, 비강내, 흡입성, 정맥내, 피하, 근육내, 비경구, 종양내 또는 국소 경로를 통해 투여할 수 있다. 조합 요법은 종양 부위로부터 떨어진 부위에 투여할 수 있다. 조합 요법은 일반적으로 종양이 존재하는 한 투여할 수 있을 것이되, 조합 요법은 종양 또는 암 성장의 중지 또는 중량 또는 부피의 감소를 야기한다.
한 실시양태에서, PTK7 조절제는 짧은 치료 주기 동안 이를 필요로 하는 대상에 하나 이상의 항암제와 조합하여 투여한다. 항체로의 치료 기간은 사용되는 특정 항암제에 따라 달라질 수 있다. 본 발명은 또한 몇 회의 부분 투여로 나뉘어진 일일 투약 또는 불연속 투여를 고려한다. 특정 항암제에 대한 적절한 치료 시기는 당업자에 의해 인지될 것이고, 본 발명은 각 항암제에 대한 최적의 치료 일정의 계속적인 평가를 고려한다.
본 발명은 조합 요법이 투여되는 동안 적어도 1주기, 바람직하게는 1 초과의 주기를 고려한다. 주기의 총 횟수 및 주기 사이의 간격이 그러하듯이, 1주기에 대한 적절한 기간은 당업자에 의해 인지될 것이다. 본 발명은 각 조절제 및 항암제에 대한 최적의 치료 일정의 계속적인 평가를 고려한다. 더구나, 본 발명은 또한 항-PTK7 항체 또는 항암제의 1회 초과의 투여를 제공한다. 조절제 및 항암제는 격일 또는 격주로 상호교환적으로 투여할 수 있거나; 항체 치료의 순서는 항암제 요법의 하나 이상의 치료에 이어 제공될 것이다. 어떠한 경우에도, 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 화학요법제의 적절한 투여량은 일반적으로 화학요법을 단독으로 또는 다른 화학요법과 조합하여 투여하는 임상 요법에 이미 이용된 투여량 부근일 것이다.
다른 바람직한 실시양태에서, 유지 요법에서 본 발명의 PTK7 조절제를 사용하여 질환의 초기 출현에 이후의 종양 재발 기회를 감소시키거나 제거할 수 있다. 바람직하게는, 환자가 증상이 없거나 회복되도록 장애를 치료하여 초기 종양 질량이 제거되거나, 감소되거나, 다르게는 호전될 것이다. 이러한 때에, 표준 진단 절차를 사용한 질환의 징후가 없거나 거의 없더라도 제약상 유효량의 개시된 조절제를 대상에 1회 이상 투여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 효과기는 일정 기간에 걸쳐 규칙적인 일정으로 투여할 수 있다. 예를 들어, PTK7 조절제는 매주, 2주마다, 매달, 6주마다, 2개월마다, 3개월마다, 6개월마다 또는 매년 투여할 수 있다. 본원의 교시를 고려하면, 당업자는 질환 재발의 잠재성을 감소시키기 위한 유리한 투약량 및 투약 요법을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 또한, 이러한 치료는 수주, 수개월, 수년의 기간 동안 또는 환자 반응 및 임상 및 진단 파라미터에 따라 심지어 무한하게 계속될 수 있다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절제를 예방적으로 사용하여 용적축소 절차에 이은 종양 전이의 가능성을 예방하거나 감소시킬 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같이, 용적축소 절차는 광범위하게 정의되고 종양 또는 종양 증식을 제거하거나, 감소시키거나, 치료하거나, 또는 호전시키는 임의의 절차, 기법 또는 방법을 의미할 것이다. 예시적인 용적축소 절차로는 수술, 방사선 치료 (즉, 빔 방사선), 화학요법 또는 절제가 포함되나, 이로 제한되지는 않는다. 당업자에 의해 쉽게 결정되는 적절한 시기에, 본원의 관점에서 임상 및 진단 또는 진단치료 절차에 의해 제안되는 바와 같이 PTK7 조절제를 투여하여 종양 전이를 감소시킬 수 있다. 조절제는 표준 기법을 사용하여 결정되는 제약상 유효 투약량으로 1회 이상 투여할 수 있다. 바람직하게는, 투약 요법은 필요에 따라 개질되는 것을 가능케 하는 적절한 진단 또는 모니터링 기법을 수반할 것이다.
d. 항암제
본원에서 사용되는 용어 항암제는 암과 같은 세포 증식성 장애를 치료하는데 사용될 수 있는, 세포독성제, 세포증식억제제, 항혈관형성제, 용적축소제, 화학요법제, 방사선요법 및 방사선치료제, 표적 항암제, 생물학적 반응 개질제, 항체, 및 면역요법제를 비롯한 임의의 작용제를 의미한다. 상기 논의된 선택된 실시양태에서, 항암제가 접합체를 포함할 수 있고 투여 전에 조절제와 회합될 수 있음을 인지할 것이다.
용어 세포독성제는 세포의 기능을 감소시키거나 억제시키고/거나 세포의 파괴를 유발하는 물질, 세포에 독성인 물질이다. 전형적으로, 물질은 생물로부터 유래되는 천연 발생 분자이다. 세포독성제의 예에는 박테리아의 작은 분자 독소 또는 효소 활성 독소 (예컨대, 디프테리아 (Diptheria) 독소, 슈도모나스 (Pseudomonas) 내독소 및 외독소, 포도상구균 (Staphylococcal) 장독소 A), 진균의 작은 분자 독소 또는 효소 활성 독소 (예컨대, α-사르신, 레스트릭토신), 식물의 작은 분자 독소 또는 효소 활성 독소 (예컨대, 아브린, 리신, 모데신, 비스쿠민, 포크위드 항바이러스 단백질, 사포린, 젤로닌, 모모리딘, 트리코산틴, 보리 독소, 유동나무 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국자리공 (Phytolacca mericana) 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 여주 (Momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 비누풀 (saponaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미테겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 네오마이신, 및 트리코티신), 또는 동물의 작은 분자 독소 또는 효소 활성 독소, 예컨대 세포독성 RNases, 예컨대 세포외 췌장 RNases; DNase I, 및 이들의 단편 및/또는 변이체가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
화학요법제는 암 세포의 성장, 증식, 및/또는 생존을 비특이적으로 감소시키거나 억제시키는 화합물 (예컨대, 세포독성제 또는 세포증식억제제)을 의미한다. 이러한 화학작용제는 종종 세포 성장 또는 분열에 필요한 세포내 과정에 관한 것이고, 이에 따라 일반적으로 급속하게 성장하고 분열하는 암 세포에 특히 효과적이다. 예를 들어, 빈크리스틴은 미세소관을 해중합하고, 이에 따라 세포가 유사분열되는 것을 억제한다. 일반적으로, 화학요법제에는 암 세포 또는 암 세포가 될 가능성이 있는 세포를 억제하거나 이를 억제하도록 고안되거나 종양형성성 자손 (예컨대, TIC)을 생성하는 임의의 화학작용제가 포함될 수 있다. 이러한 작용제는 예를 들어 제형물 CHOP과의 조합으로 종종 투여되고, 이는 종종 가장 효과적이다.
본 발명의 조절제와 조합하여 (또는 이에 접합되어) 사용될 수 있는 항암제의 예에는 알킬화제, 알킬 술포네이트, 아지리딘, 에틸렌이민 및 메틸아멜라민, 아세토제닌, 캄프토테신, 브리오스타틴, 칼리스타틴, CC-1065, 크립토파이신, 돌라스타틴, 두오카르마이신, 엘레우테로빈, 판크라티스타틴, 사르코딕타이인, 스폰지스타틴, 질소 머스타드, 항생제, 엔다이인 항생제, 다이네미신, 비스포스포네이트, 에스페라미신, 색소단백질 엔다이인 항생제 색소단, 아크라시노마이신스, 액티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아자-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신® 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보다이신, 페프로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 퀼라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사산물, 엽산 유사체, 퓨린 유사체, 안드로겐, 항-부신, 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산, 아세글라톤, 알도포스파미드 글리코시드, 아미노레불린산, 에닐우라실, 암사크린, 베스트라부실, 비산트렌, 에다트락세이트, 데포파민, 데메콜신, 디아지퀴온, 엘포르니타인, 엘립티늄 아세테이트, 에포틸론, 에토글루시드, 갈륨 니트레이트, 히드록시우레아, 렌티난, 로니다이나인, 마이탄시노이드, 미토구아존, 미톡산트론, 모피단몰, 니트라에린, 펜토스타틴, 페나메트, 피라루비신, 로속산트론, 포도필리닌산, 2-에틸히드라지드, 프로카르바진, PSK® 폴리사카라이드 착물 (JHS 내츄럴 프로덕츠 (JHS Natural Products), 오레곤주 유진 소재), 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지퀴온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라큐린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가사이토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 클로란부실; 젬자® 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈® 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (캄토사 (Camptosar), CPT-11), 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸로르니틴 (DMFO); 레티노이드; 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린 (LV); 옥살리플라틴; 세포 증식을 감소시키는 PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR 및 VEGF-A의 억제제 및 상기 중 임의의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 이러한 정의에서 종양에 대해 호르몬의 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 및 항-안드로겐뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드; 리보자임, 예컨대 VEGF 발현 억제제 및 HER2 발현 억제제; 백신, 프로류킨® rIL-2; 루르토테칸® 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스® rmRH; 비노렐빈 및 에스페라미신 및 상기 중 임의의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 다른 실시양태는 면역요법제, 예컨대 리툭시맙, 트라스투주맙, 젬투주맙 오조감신, 알레투주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 토시투모맙, 베바시주맙, 세툭시맙, 파티투무맙, 오파투무맙, 이필리무맙 및 브렌툭시맙 베도틴을 포함하나, 이에 제한되지 않는 암 치료에 승인된 항체의 사용을 포함한다. 당업자는 본원의 교시와 호환될 수 있는 추가의 항암제를 용이하게 확인할 수 있을 것이다.
e. 방사선요법
또한, 본 발명은 방사선요법 (즉, 종양 세포 내에서 DNA 손상을 국소적으로 유도하기 위한 임의의 메카니즘, 예컨대 감마-조사, X-레이, UV-조사, 마이크로파, 전자 방출 등)과 PTK7 조절제의 조합을 제공한다. 또한, 종양 세포에 방사선 동위원소의 직접적인 전달을 사용하는 조합 요법이 고려되고, 이는 표적화된 항암제 또는 다른 표적화 수단과 관련하여 사용될 수 있다. 전형적으로, 방사선 요법은 약 1 주 내지 약 2 주의 기간에 걸쳐 규칙적으로 투여된다. 방사선 요법은 두경부암을 갖는 대상체에 약 6 주 내지 7 주 동안 투여될 수 있다. 임의로는, 방사선 요법은 1회 투여 또는 다회, 순차적 투여로서 투여될 수 있다.
f. 신생물 상태
단독으로 투여하든지 항암제 또는 방사선요법과 조합하든지 간에, 본 발명의 PTK7 조절제는 양성 또는 악성종양 (예컨대, 신장, 간, 콩팥, 방광, 유방, 위, 난소, 결장직장, 전립선, 췌장, 폐, 갑상선, 간 암종; 육종; 교아종; 및 다양한 두경부 종양); 백혈병 및 림프 악성종양; 다른 장애, 예컨대 뉴런, 신경교, 성상세포, 시상하부 및 다른 선상, 대식세포, 상피, 기질 및 할강 장애; 및 염증성, 혈관생성성, 면역성 장애 및 병원균에 의해 유발되는 장애를 포함할 수 있는 환자 또는 대상체에서 신생물 상태를 일반적으로 치료하는데 특히 유용하다. 본 발명의 치료 조성물 및 방법으로 치료하기에 특히 바람직한 표적은 고형 종양을 포함하는 신생물 상태이다. 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절제는 혈액 악성종양의 진단, 방지 또는 치료에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 치료되는 대상체 또는 환자는 인간 (본원에서 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 임의의 포유동물 종을 포함하는 것이 명확함)일 것이다.
보다 구체적으로는, 본 발명에 따라 치료되는 대상체의 신생물 상태는 부신 종양, AIDS-관련 암, 폐포성 연부 육종, 성상세포 종양, 방광암 (편평 세포 암종 및 이행 세포 암종), 골암 (법랑질종, 동맥류 골 낭포, 골연골종, 골육종), 뇌 및 척수 암, 전이 뇌 종양, 유방암, 경동맥체 종양, 자궁경부암, 연골육종, 척색종, 난염성 신장 세포 암종, 투명 세포 암종, 결장암, 결장직장암, 피부 양성 섬유 조직구종, 결합조직성 소원형 세포 종양, 뇌질피복세포증, 유잉 (Ewing) 종양, 연부조직 점액 연골육종, 골성 불완전 섬유 생성증, 골의 섬유 이형성증, 쓸개 및 담관 암, 임신성 융모성 질환, 배세포 종양, 두경부암, 도세포 종양, 카포시 육종, 신장암 (신아세포종, 유두상 신장 세포 암종), 백혈병, 지방종/양성 지방종증 종양, 지방육종/악성 지방종증 종양, 간암 (간모세포종, 간세포 암종), 림프종, 폐암 (소세포 암종, 선암종, 편평 세포 암종, 대세포 암종 등), 수모세포종, 흑색종, 뇌수막종, 다발성 내분비 종양증, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군, 신경아세포종, 신경내분비 종양, 난소암, 췌장암, 유두상 갑상선 암종, 부갑상선 종양, 소아암, 말초 신경 악성종양, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 전립선암, 후부 포도막 흑색종, 희귀 혈액 장애, 신장 전이 암, 횡문양 종양, 횡문근육종, 육종, 피부암, 연부-조직 육종, 편평 세포 암, 위암, 활막육종, 고환암, 흉선 암종, 흉선종, 갑상선 전이 암, 및 자궁암 (자궁경부 암종, 자궁내막 암종 및 자궁근종)을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특정 바람직한 실시양태에서, 암세포는 유방암, 대세포 폐암 (NSCLC), 소세포 폐암, 췌장암, 결장암, 전립선암, 육종, 신장 전이 암, 갑상선 전이 암 및 투명 세포 암종을 포함하는 고형 종양의 군으로부터 선택되나, 이에 제한되지 않는다.
혈액 악성종양에 관해서, 본 발명의 화합물 및 방법이 저등급/NHL 여포 세포 림프종 (FCC), 맨틀 세포 림프종 (MCL), 미만성 대세포 림프종 (DLCL), 소 림프구 (SL) NHL, 중간 등급/여포 NHL, 중간 등급 미만성 NHL, 고등급 면역아세포 NHL, 고등급 림프구성 NHL, 고등급 소 비분할 세포 NHL, 벌키한 (bulky) 질환 NHL, 발덴스트롬 (Waldenstrom) 마크로글로불린혈증, 림프형질세포 림프종 (LPL), 맨틀 세포 림프종 (MCL), 여포 림프종 (FL), 미만성 대세포 림프종 (DLCL), 버킷 림프종 (BL), AIDS-관련 림프종, 단구성 B 세포 림프종, 혈관면역아세포성 림프절병증, 소 림프구, 여포, 미만성 대세포, 미만성 소 분할 세포, 대세포 면역아세포 림프아구종, 작고 비분할된 버킷 및 비-버킷, 여포, 주로 대세포; 여포, 주로 소 분할 세포; 및 여포, 혼합된 소 분할 및 대세포 림프종을 비롯한 다양한 B-세포 림프종을 치료하는데 특히 효과적일 수 있음을 또한 인지할 것이다. 문헌 [Gaidono et al., "Lymphomas", IN CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, Vol. 2: 2131-2145 (DeVita et al., eds., 5.sup.th ed. 1997)]을 참조하길 바란다. 이들 림프종이 분류 시스템의 변화 때문에 종종 상이한 명칭을 가질 것이고 상이한 명칭으로 분류된 림프종을 갖는 환자가 또한 본 발명의 조합 치료 방식으로부터 이점을 가질 것임이 당업자들에게 명백할 것이다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, PTK7 조절제는 백혈병, 예컨대 만성 림프구성 백혈병 (CLL 또는 B-CLL) 또는 급성 골수계 백혈병 AML을 포함하는 특정 골수 및 혈액 악성종양을 효과적으로 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 백혈병은 주로 50세 이상에서 발생이 증가하기 시작하여 60대 후반에 정점에 도달하는 노령자의 질환이다. CLL은 일반적으로 신생물 말초 혈액 림프구의 증식을 포함한다. CLL의 임상 연구결과는 림프구증가증, 임파선염, 비종, 빈혈 및 혈소판감소증을 포함한다. AML은 또한 급성 골수성 백혈병, 급성 골수아구성 백혈병, 급성 과립구성 백혈병, 및 급성 비림프구성 백혈병으로 칭한다. AML에서의 근본적인 병리 생리는 발달의 초기 단계에서의 골수 세포 성숙 정지로 이루어진다. 각각의 장애의 경우에 치료 섭생은 당업자에 의해 본 개시내용의 관점에서 임상적으로 수용된 절차를 사용하여 용이하게 유도될 수 있다
또한, 본 발명은 양성 또는 전암 종양이 존재하는 대상체의 방지적 또는 예방적 치료를 제공한다. 임의의 특정 유형의 종양 또는 신생물 장애가 본 발명을 사용하는 치료에 포함되지 않는 것으로 여겨지지 않아야 한다. 그러나, 종양 세포의 유형은 2차 치료제, 특히 화학요법제 및 표적 항암제와 조합된 본 발명의 용도에 해당될 수 있다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태는 고형 종양을 겪는 대상체를 치료하기 위한 PTK7 조절제의 용도를 포함한다. 이러한 대상체에서, 많은 이들 고형 종양은 개시된 효과기를 사용하는 치료에 이들을 특히 민감하게 할 수 있는 다양한 유전적 돌연변이를 나타내는 조직을 포함한다. 예를 들어, KRAS, APC 및 CTNNB1 및 CDH1 돌연변이는 결장직장암을 갖는 환자에서 비교적 일반적이다. 게다가, 이들 돌연변이를 갖는 종양을 갖는 환자, 특히 KRAS 돌연변이를 갖는 환자는 통상적으로 기존 요법에 가장 난치성이다. 전형적으로 단일 아미노산 치환을 초래하는 KRAS 활성화 돌연변이는 폐 선암종, 점액 선종, 및 췌장관 암종을 비롯한 악성종양의 치료를 다른 어려움에 또한 연루시킨다.
현재, 결장직장암 환자가 EGFR-억제 약물에 반응할지 VEGF-억제 약물에 반응할지에 대한 가장 믿을만한 예측은, 예를 들어 특정 KRAS "활성화" 돌연변이에 관한 시험이다. KRAS는 결장직장암의 35-45%에서 돌연변이되고, 변이 KRAS를 발현하는 종양을 갖는 환자는 이들 약물에 잘 반응하지 않는다. 예를 들어, KRAS 돌연변이는 결장직장암에서 파니투무맙 및 세툭시맙 요법에 반응하지 않을 것으로 예측된다 (문헌 [Lievre et al. Cancer Res 66:3992-5; Karapetis et al. NEJM 359:1757-1765]). 결장직장암을 갖는 환자의 대략 85%는 APC 유전자에서 돌연변이를 가졌고 (문헌 [Markowitz & Bertagnolli. NEJM 361:2449-60]), 800개 초과의 APC 돌연변이는 가족성 선종 폴립증 및 결장직장암을 갖는 환자에서 특성화되었다. 이들 돌연변이의 대부분은 베타-카테닌의 파괴를 매개하는 기능성이 감소된 절단된 APC 단백질을 초래한다. 베타-카테닌 유전자, CTNNB1에서 돌연변이는 단백질의 증가된 안정화를 또한 초래하여 핵 이동 및 몇몇 발암성 전사조절 프로그램의 후속 활성화를 초래하는데, 이는 또한 돌연변이된 APC가 베타-카테닌 파괴를 적절히 매개하지 못함으로써 야기되는 발암의 메카니즘이며, 검사에서 정상 세포 증식 및 분화 프로그램을 유지하는 것을 필요로 한다.
CDH1 (E-카드헤린) 발현의 손실은 결장직장암에서의 또 다른 일반적인 발생이며, 이는 종종 질환의 보다 경과된 단계에서 발견된다. E-카드헤린은 상피 층에서 세포를 연결하고 조직하는 헤린 연접의 중앙 구성원이다. 정상 E-카드헤린은 원형질막에서 베타-카테닌 (CTNNB1)을 물리적으로 격리시키며, 결장직장암에서 E-카드헤린 발현의 손실은 베타-카테닌/WNT 경로의 핵 및 전사조절 활성화에 대한 베타-카테닌의 국소화를 초래한다. 이상 베타-카테닌/WNT 신호전달은 암 분화능에 연루된 발암 및 핵 베타-카테닌에 중앙이 된다 (문헌 [Schmalhofer et al., 2009 PMID 19153669]). E-카드헤린은 상피 세포에서 PTK7 리간드에 대한 공지된 결합 파트너 EphA2의 발현 및 기능에 요구된다 (문헌 [Dodge Zantek et al., 1999 PMID 10511313; Orsulic S and Kemler R, 2000 PMID 10769210]). PTK7 리간드에 결합되고 수용체가 결합되게 하거나 결합되지 않게 하는 조절제를 사용하여 프로발암성 과정을 변경하거나 중단하거나 역전시킬 수 있다. 다르게는, PTK7 조절제는 PTK7 조절제의 결합 선호도를 기초로 이상 PTK7 상호작용이 있는 종양 세포에 우선적으로 결합될 수 있다. 이에 따라, 상기 언급된 유전적 형질을 갖는 암을 갖는 환자는 상기 언급된 PTK7 조절제를 사용하는 치료로부터 이점을 가질 수 있다.
XIV. 제조품
하나 이상의 용기, 1회 이상의 투여량의 PTK7 조절제를 포함하는 제약 팩 및 키트가 또한 포함된다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 1종 이상의 추가 작용제와 함께 또는 1종 이상의 추가 작용제 없이 항-PTK7 항체를 포함하는 소정량의 조성물을 함유하는 단위 투여량이 제공된다. 다른 실시양태를 위해, 이러한 단위 투여량은 주입 동안 1회용의 미리충전된 주사기에서 공급된다. 또 다른 실시양태에서, 단위 투여량에 함유되는 조성물은 염수, 수크로스 등; 완충제, 예컨대 포스페이트 등을 포함하고/거나 안정하고 효율적인 pH 범위 내에서 제형화될 수 있다. 별법으로, 특정 실시양태에서, 조성물은 적절한 액체, 예를 들어 멸균수의 첨가시 재구성될 수 있는 동결건조 분말로서 제공될 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 조성물은 수크로스 및 아르기닌을 포함하나 이에 제한되지 않는 단백질 응집을 억제하는 1종 이상의 물질을 포함한다. 용기(들)상의 또는 이들에 회합된 임의의 라벨은 에워싸인 조성물이 선택되는 질환 상태를 진단하거나 치료하는데 사용됨을 나타낸다.
또한, 본 발명은 1회 투여량 또는 다회 투여량 투여 단위의 PTK7 조절제, 및 임의로는 1종 이상의 항암제를 제조하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 용기 및 용기상에 삽입되거나 회합된 라벨 또는 패키지를 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 상태를 치료하기에 효과적이고 멸균 접속 포트를 가질 수 있는 조성물을 보유한다 (예를 들어, 용기는 피하 주입 니들에 의해 관통가능한 마개를 갖는 정맥주사 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 이러한 키트는 일반적으로 적합한 용기 내에 PTK7 조절제의 제약상 허용되는 제형물, 및 임의로는 동일하거나 상이한 용기들에서 1종 이상의 항암제를 함유할 것이다. 키트는 진단 또는 조합 요법을 위해 다른 제약상 허용되는 제형물을 또한 함유할 수 있다. 예를 들어, 이러한 키트는 본 발명의 PTK7 조절제 이외에 항암제, 예컨대 화학요법 또는 방사선요법 약물; 항-혈관형성제; 항전이제; 표적 항암제; 세포독성제; 및/또는 다른 항암제 중 임의의 1종 이상을 함유할 수 있다. 이러한 키트는 항암제 또는 진단제와 함께 PTK7 조절제를 접합하기 위한 적절한 시약을 또한 제공할 수 있다 (예컨대, 전문이 본원에 참조로 인용되는 U.S.P.N. 7,422,739 참조).
보다 구체적으로는, 키트는 추가의 성분과 함께 또는 추가의 성분 없이 PTK7 조절제를 함유하는 단일 용기를 가지거나, 각각의 목적하는 작용제를 위한 별개의 용기를 가질 수 있다. 조합된 치료가 접합을 위해 제공되는 경우, 단일 용액이 몰 당량 조합으로 또는 다른 성분들보다 과량의 한 성분이 함께 예비혼합될 수 있다. 다르게는, 키트의 PTK7 조절제 및 임의의 선택적인 항암제는 환자에게 투여되기 전에 별개의 용기 내에서 분리되어 유지될 수 있다. 또한, 키트는 멸균의 제약상 허용되는 완충제 또는 다른 희석제, 예컨대 주입용 정균수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수 (PBS), 링거액 및 덱스트로스 용액을 함유하기 위한 제2/제3 용기를 포함할 수 있다.
키트의 성분이 1종 이상의 액체 용액에 제공되는 경우, 액체 용액은 바람직하게는 수용액이고, 특히 바람직하게는 멸균 수용액이다. 그러나, 키트의 성분은 건조 분말(들)로서 제공될 수 있다. 시약 또는 성분이 건조 분말로서 제공되는 경우, 분말은 적합한 용매의 첨가에 의해 재구성될 수 있다. 용매가 또 다른 용기에 또한 제공될 수 있음이 예상된다.
상기 간단히 나타낸 바와 같이, 키트는 동물 또는 환자에 항체 및 임의의 선택적인 성분을 투여하기 위한 수단, 예컨대 하나 이상의 니들 또는 주사기, 또는 점안기, 피펫, 또는 이와 같은 다른 장치를 또한 함유할 수 있으며, 이로부터 제형물이 동물로 주입되거나 도입되거나 또는 신체의 병든 영역에 적용될 수 있다. 본 발명의 키트는 전형적으로 바이알 또는 이와 같은 것을 함유하는 수단, 예를 들어 주입 또는 취입 성형 플라스틱 용기와 같은 상업적인 판매를 위한 밀폐물에서의 다른 부품을 또한 포함할 것이고 이들에 목적하는 바이알 및 다른 장치가 위치하고 보유된다. 임의의 라벨 또는 패키지 삽입은 PTK7 조절제 조성물이 암, 예를 들어 결장직장암을 치료하는데 사용됨을 나타낸다.
다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조절제는 증식성 장애의 진단 또는 치료에 유용한 진단 장치 또는 치료 장치와 조합하여 사용되거나 또는 상기 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 한 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 화합물 및 조성물은 증식성 장애의 병인론 또는 징후에 관여하는 세포 또는 마커 화합물을 검출, 모니터링, 정량화 또는 프로파일링 하는데 사용될 수 있는 특정 진단 장치 또는 기구와 조합될 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 상기 장치는 생체내 또는 시험관내 순환성 종양 세포를 검출, 모니터링 및/또는 정량화하는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 본원에 참고로 인용되는 WO 2012/0128801 참조). 또 다른 바람직한 실시양태에서, 및 상기 논의된 바와 같이, 순환성 종양 세포는 암 줄기 세포를 포함한다.
XV. 연구 시약
본 발명의 다른 바람직한 실시양태는 또한 유동 세포계측법, 형광 활성화 세포 분리 (FACS), 자성 활성화 세포 분류 (MACS) 또는 레이저 매개 분획화와 같은 방법을 통해 종양 개시 세포의 집단 또는 하위집단을 식별하거나, 단리하거나, 분획화하거나 또는 풍부화하는데 유용한 기구로서 개시된 조절제의 특성을 이용한다. 당업자는 조절제가 암 줄기 세포를 비롯한 TIC의 특성화 및 조작을 위한 몇몇 호환가능한 기법에서 사용될 수 있음을 인지할 것이다 (예컨대, 각각 전문이 본원에 참조로 인용되는 U.S.S.Ns. 12/686,359, 12/669,136 및 12/757,649 참조).
XVI. 기타
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학적 및 공업적 용어는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가져야 한다. 추가로, 문맥에 의해 달리 요구되지 않는 한, 단수 용어에는 복수형이 포함되고 복수 용어에는 단수형이 포함되어야 한다. 보다 구체적으로는, 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 문맥에서 달리 분명하게 구술하지 않는 한, 단수 형태 "a," "an" 및 "the"에는 복수 지시대상이 포함된다. 따라서, 예를 들어 "단백질"에는 복수의 단백질이 포함되고, "세포"에는 세포들의 혼합물들이 포함됨을 참조하길 바란다. 또한, 명세서 및 첨부된 청구범위에 제공된 범위에는 모든 종점 및 종점 사이의 모든 지점이 포함된다. 따라서, 2.0 내지 3.0의 범위에는 2.0, 3.0, 및 2.0과 3.0 사이의 모든 지점이 포함된다.
일반적으로, 본원에 기재된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전공학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화 및 이들의 기법과 관련하여 사용된 명칭은 널리 공지되어 있고 당업계에서 일반적으로 사용된다. 달리 언급되지 않는 한, 본 발명의 방법 및 기법은 당업계에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라 그리고 본 발명의 명세서에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 일반적으로 수행된다. 예컨대, 문헌 [Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000)], [Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002)], [Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998)], 및 [Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003)]을 참조하길 바란다. 효소 반응 및 정제 기법은 당업계에서 일반적으로 실시되는 바와 같이 또는 본원에 기재된 바와 같이 제조업자의 명시에 따라 수행된다. 본원에 기재된 분석 화학, 합성 유기화학, 및 의학 및 제약 화학과 관련하여 사용된 명명법 및 그의 실험 절차 및 기법은 당업계에 널리 공지되고 흔히 사용되는 것이다.
본 명세서에서 개시되거나 인용된 모든 참고문헌 또는 문헌은 제한 없이 전문이 본원에 참조로 인용된다. 게다가, 본원에서 사용되는 임의의 구획의 제목은 단지 체계성을 위한 것일 뿐 기재된 대상을 한정하고자 함이 아니다.
실시예
이에 따라, 상기 일반적으로 기재된 본 발명은 하기 실시예를 참조하여 보다 용이하게 이해될 것이며, 이는 예시로서 제공된 것일 뿐 본 발명을 제한하고자 의도되지 않는다. 실시예는 하기 실험이 수행된 실험의 전부임을 나타내는 것으로 의도되지 않는다. 달리 언급되지 않는 한, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 섭씨 온도이고, 압력은 대기압 또는 대기압 부근 압력이다.
실시예 1
종양 개시 세포 집단의 풍부화
암 환자에 존재하는 고형 종양의 세포 이종성을 특성화하기 위해, 특정한 표현형 마커를 사용하여 종양 지속 세포 (TPC; 즉, 암 줄기 세포: CSC)의 동일성을 명확히하고 임상적으로 적절한 치료 표적을 확인하였고, 거대한 비-전통적인 이종이식 (NTX) 종양 은행을 개발하고 당업계에 인지된 기법을 사용하여 유지하였다. 다수의 분리성 종양 세포주를 포함하는 NTX 종양 은행을 다양한 고형 종양 악성종양을 겪는 많은 암 환자로부터 최초로 수득한 이종 종양 세포의 다발성 계대를 통해 면역손상 마우스에서 증식시켰다. 잘 확립된 계통을 갖는 다수의 분리성 초기 계대 NTX 종양 세포주의 지속된 이용가능성은 이들이 세포주로부터 정제된 세포의 재생가능하고 반복된 특성화를 가능하게 함에 따라 TPC의 확인 및 단리를 매우 촉진시켰다. 보다 특히, 단리되거나 정제된 TPC는 세포가 유래되는 환자 종양 샘플을 개괄하는 마우스에서 표현형적 및 형태학적 이종 종양을 생성하는 이들의 능력에 따라 상기에 가장 정확히 정의되었다. 따라서, 마우스에서 완전히 이종성인 종양을 생성하는데 작은 집단의 단리된 세포를 사용하는 능력은 단리된 세포가 TPC를 포함한다는 사실을 강하게 나타내었다. 이러한 작업에서 최소한의 계대 NTX 세포주의 사용은 생체내 실험을 매우 간소화하고 용이하게 증명가능한 결과를 제공하였다. 게다가, 초기 계대 NTX 종양은 종양성장, 기존 요법에 대한 내성 및 종양 재발을 유도하는 하부 메카니즘에 임상적으로 적절한 이해를 제공하는 이리노테칸 (즉, 캠토사®)과 같은 치료제에 또한 반응하였다.
NTX 종양 세포주가 확립되었기 때문에, 유동 세포분석법을 사용하여 구성요소인 종양 세포 표현형을 분석하여, 종양 개시 세포 (TIC)를 특징화하거나, 단리하거나, 정제하거나 또는 풍부화하고 이러한 집단 내에서 TPC 및 TProg 세포를 분리하거나 분석하는데 사용될 수 있는 분리성 마커를 확인하였다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 단백질 발현을 기초로 하는 세포의 급속한 특성화 및 잠재적으로 유용한 마커의 부수적인 확인을 위해 제공되는 등록상표 프로테오믹 기초 플랫폼 (즉, 페노프린트(PhenoPrint)™ 어레이)을 사용하였다. 페노프린트 어레이는 수백개의 별개의 결합 분자를 포함하는 등록상표 프로테오믹 플랫폼이고, 이는 상업적인 공급처로부터 많이 공급되고, 각각의 웰이 피코에리트린 형광 채널에서 뚜렷한 항체를 함유하고 및 플레이트를 교차하여 모든 웰에 어레이된 상이한 형광색소에서 다발성 추가 항체를 함유하는 96 웰 플레이트에 어레이되었다. 이는 비-피코에리트린 채널을 통해 적절한 세포의 급속한 포함 또는 부적절한 세포의 제거를 통해 선택된 종양 세포의 하위집단에서 목적 항원의 발현 수준을 결정하게 하였다. 페노프린트 어레이가 당업계에 널리 공지된 조직 분리, 이식 및 줄기 세포 기법과 조합하여 사용되는 경우 (모두 각각 전문이 본원에 참조로서 인용되는 상기 문헌 [Al-Hajj et al., 2004], [Dalerba et al., 2007] 및 [Dylla et al., 2008]), 적절한 마커를 효과적으로 확인하고 후속적으로 단리시키고 높은 효율로 특정한 인간 종양 세포 하위집단을 이식하는 것이 가능하였다.
이에 따라, 중증 면역손상 마우스에서 인간 종양에 대해 일반적으로 수행되는 다양한 NTX 종양 세포주의 확립시, 800 - 2,000 mm3에 도달시 종양을 마우스로부터 절제하였고 당업계에 인지된 효소 소화 기법을 사용하여 세포를 단일 세포 현탁액으로 해리시켰다 (예를 들어, 본원에 포함되는 U.S.P.N. 2007/0292414 참조). 세포 대 세포를 기초로 하는 절대 (세포 당) 및 상대 (집단에서 다른 세포와의 비교) 표면 단백질 발현 모두가 제공된 페노프린트 어레이를 사용하여 이들 현탁액으로부터 수득된 데이터는 세포 집단의 보다 복잡한 특성화 및 층화를 초래하였다. 보다 구체적으로는, 페노프린트 어레이의 사용은 NTG 벌크 종양 세포 및 종양 기질로부터 TIC 또는 TPC를 예기 구별하고, 및 NTX 종양 모델로부터 단리되는 경우, 상이한 수준의 특정한 세포 표면 단백질을 발현하는 종양 세포 하위집단의 비교적 급속한 특성화를 제공하는 단백질 또는 마커의 급속한 확인을 가능하게 하였다. 특히, 종양 세포 집단에 걸쳐 이종성 발현되는 단백질은 높은 수준 및 낮은 수준의 특정한 단백질 또는 마커를 발현하는 뚜렷하고 고도로 정제된 종양 세포 하위집단의 단리 및 면역-손상된 마우스에의 이식을 가능하게 하였고, 이에 따라 TPC가 한 하위집단에 풍부한지 다른 하위집단에 풍부한지의 평가를 촉진하였다.
용어 풍부화는 세포의 단리와 동의어로 사용되고, 이는 출발 또는 초기 세포 집단과 비교해서 한 유형의 세포의 양 (분획물)이 다른 유형의 세포의 분획물보다 증가하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 풍부화는 세포의 출발 집단과 비교해서 세포의 집단에서 한 유형의 세포가 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50% 또는 50% 초과만큼의 백분율로 증가함을 나타낸다.
본원에서 사용되는 마커는, 세포 또는 조직의 문맥에서 질환 또는 장애에 영향을 받는 조직 또는 세포 집단에서 또는 이들상에서 확인되는 것들을 포함하는 특정한 세포, 세포 집단 또는 조직에서 또는 이들상에서 특이적으로 관찰되거나 이들과 확인가능하게 회합되는 화학적 또는 생물학적 독립체의 형태로 임의의 특징을 의미한다. 분명히 나타나는 바와 같이, 마커는 사실상 형태학적, 기능적 또는 생화학적일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 마커는 특정한 세포 유형 (예컨대, TPC)에 의해 또는 특정 조건하의 세포 (예컨대, 세포 수명의 특정한 시점 동안 또는 특정한 니치에서의 세포)에 의해 순차적으로 또는 우선적으로 발현되는 세포 표면 항원이다. 바람직하게는, 이러한 마커는 단백질이고, 보다 바람직하게는 당업계에 공지된 항체, 앱타머 또는 다른 결합 분자를 위한 에피토프를 갖는다. 그러나, 마커는 단백질 (펩티드 및 폴리펩티드), 지질, 폴리사카라이드, 핵산 및 스테로이드를 포함하나 이에 제한되지 않는 세포 내에서 또는 표면상에서 관찰되는 임의의 분자로 이루어질 수 있다. 형태학적 마커의 특징 또는 형질의 예에는 형상, 크기, 및 핵 대 세포질의 비가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 기능적 마커의 특징 또는 형질의 예에는 특정 기질에 접착하는 능력, 특정 염료를 도입하거나 배제시키는 (이에 제한되지 않으나, 예를 들어 친유성 염료를 배제시키는) 능력, 특정한 조건하에 이동하는 능력 및 특정한 계통을 따라 분화하는 능력이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 마커는 리포터 유전자, 예를 들어 리포터 유전자를 코딩하는 핵산 서열을 세포로 도입함으로써 세포에 의해 발현되는 리포터 유전자 및 마커로서 사용될 수 있는 리포터 단백질의 생성을 초래하는 이의 전사로부터 발현되는 단백질일 수 있다. 마커로서 사용될 수 있는 이러한 리포터 유전자에는, 예를 들어 형광 단백질 효소, 염색소립 단백질, 내성 유전자 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
관련된 의미로, 조직, 세포 또는 세포 집단 (예컨대, 안정한 TPC 표현형)의 문맥에서 용어 마커 표현형은 특정한 세포 또는 세포 집단을 (예컨대 FACS에 의해) 특성화하거나, 식별하거나, 분리하거나, 단리하거나 또는 풍부화하는데 사용될 수 있는 임의의 마커 또는 마커의 조합을 의미한다. 특정 실시양태에서, 마커 표현형은 세포 표면 마커의 조합의 발현을 검출하거나 확인함으로써 측정될 수 있는 세포 표면 표현형이다.
당업자는 다수의 마커 (또는 이들의 부재)가 다양한 집단의 암 줄기 세포와 회합되고 종양 세포 하위집단을 단리하거나 특성화하는데 사용되었음을 인지할 것이다. 이와 관련하여, 예시적인 암 줄기 세포 마커는 OCT4, 나노그, STAT3, EPCAM, CD24, CD34, NB84, TrkA, GD2, CD133, CD20, CD56, CD29, B7H3, CD46, 트랜스페린 수용체, JAM3, 카르복시펩티다제 M, ADAM9, 온코스타틴 M, Lgr5, Lgr6, CD324, CD325, 네스틴, Sox1, Bmi-1, eed, easyh1, easyh2, mf2, yy1, smarcA3, smarckA5, smarcD3, smarcE1, mllt3, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, WNT10B, WNT16, AXIN1, BCL9, MYC, (TCF4) SLC7A8, IL1RAP, TEM8, TMPRSS4, MUC16, GPRC5B, SLC6A14, SLC4A11, PPAP2C, CAV1, CAV2, PTPN3, EPHA1, EPHA2, SLC1A1, CX3CL1, ADORA2A, MPZL1, FLJ10052, C4.4A, EDG3, RARRES1, TMEPAI, PTS, CEACAM6, NID2, STEAP, ABCA3, CRIM1, IL1R1, OPN3, DAF, MUC1, MCP, CPD, NMA, ADAM9, GJA1, SLC19A2, ABCA1, PCDH7, ADCY9, SLC39A1, NPC1, ENPP1, N33, GPNMB, LY6E, CELSR1, LRP3, C20orf52, TMEPAI, FLVCR, PCDHA10, GPR54, TGFBR3, SEMA4B, PCDHB2, ABCG2, CD166, AFP, BMP-4, β-카테닌, CD2, CD3, CD9, CD14, CD31, CD38, CD44, CD45, CD74, CD90, CXCR4, 데코린, EGFR, CD105, CD64, CD16, CD16a, CD16b, GLI1, GLI2, CD49b, 및 CD49f를 포함한다. 예를 들어, 각각 본원에 참조로서 포함되는 문헌 [Schulenburg et al., 2010], PMID: 20185329, U.S.P.N. 7,632,678 및 U.S.P.Ns. 2007/0292414, 2008/0175870, 2010/0275280, 2010/0162416 및 2011/0020221을 참조한다. 다수의 이들 마커가 상기 기재된 페노프린트 어레이에 포함되었음을 인지할 것이다.
유사하게, 특정한 종양 유형의 암 줄기 세포와 회합되는 세포 표면 표현형의 비제한적인 예에는 CD44hiCD24low, ALDH+, CD133+, CD123+, CD34+CD38-, CD44+CD24-, CD46hiCD324+CD66c-, CD133+CD34+CD10-CD19-, CD138-CD34-CD19+, CD133+RC2+, CD44+α2β1 hiCD133+, CD44+CD24+ESA+, CD271+, ABCB5+뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 암 줄기 세포 표면 표현형도 포함된다. 예를 들어, 각각 전문이 본원에 참조로서 인용되는 상기 문헌 [Schulenburg et al., 2010], 문헌 [Visvader et al., 2008], PMID: 18784658 및 U.S.P.N. 2008/0138313을 참조하길 바란다. 당업자는 바로 상기에 예시된 것들과 같은 마커 표현형이 표준 유동 세포 분석 및 세포 분류 기법과 조합하여 사용되어 추가의 분석을 위한 TIC 및/또는 TPC 세포 또는 세포 집단을 특성화하거나, 단리하거나, 정제하거나 또는 풍부화할 수 있음을 인지할 것이다. 본 발명과 관련하여, CD46, CD324 및, 임의로는 CD66c가 분석되는 종양 표본이 1차 환자 종양 표본이든지 환자-유래 NTX 종양이든지 관계없이 많은 인간 결장직장 ("CR"), 유방 ("BR"), 대세포 폐 (NSCLC), 소세포 폐 (SCLC), 췌장 ("PA"), 전립선 ("PR"), 신장 ("KDY"), 흑색종 ("Mel"), 난소 ("OV"), 및 두경부암 ("HN") 종양 세포의 표면상에서 고도로 발현되거나 이질성으로 발현된다는 점이 중요하다.
음성 발현 (즉 "-") 세포는 본원에서 형광 방출의 추가적인 채널에서 다른 해당 단백질을 완전한 항체 염색 칵테일 라벨링의 존재하에 형광 채널에서 이소타입 조절 항체와 함께 관찰되는 발현의 95번째 백분위수 미만이거나 이와 동일하게 발현하는 세포로서 정의된다. 당업자는 음성 이벤트를 규정하기 위한 이러한 절차가 "형광 마이너스인 것", 또는 "FMO", 염색으로서 지칭됨을 인지할 것이다. 상기 기재된 FMO 염색 절차를 사용하여 이소타입 대조군 항체와 함께 관찰되는 발현의 95번째 백분위수를 초과하는 발현 세포는 본원에서 "양성" (즉 "+")으로 정의된다. 본원에서 규정된 바와 같이, "양성"으로서 광범위하게 정의되는 다양한 집단의 세포가 존재한다. 우선, 저발현 (즉 "lo")을 갖는 세포는 이소타입 대조군 항체와 함께 FMO 염색을 사용하여 측정된 95번째 백분위수 초과 및 상기 기재된 FMO 염색 절차를 사용하여 이소타입 대조군 항체와 함께 관찰된 발현의 95번째 백분위수의 한 표준 편차 내에서 관찰된 발현 세포로서 일반적으로 정의된다. "고"발현 (즉 "hi") 세포는 이소타입 대조군 항체와 함께 FMO 염색을 사용하여 측정된 95번째 백분위수 초과 및 상기 기재된 FMO 염색 절차를 사용하여 이소타입 대조군 항체와 함께 관찰된 발현의 95번째 백분위수 초과의 한 표준 편차 초과에서 관찰된 발현 세포로서 정의될 수 있다. 다른 실시양태에서, 99번째 백분위수는 바람직하게는 음성과 양성 FMO 염색 사이의 경계선으로서 사용될 수 있고, 특히 바람직한 실시양태에서 백분위수는 99% 초과일 수 있다.
결장직장암 환자로부터 몇몇 NTX 종양을 교차하여 발현 세기 및 이질성을 기초로 결장직장 종양 항원을 신속하게 확인하고 서열을 매기기 위해 상기 기재된 것과 같은 기법을 사용하여, 종양 대 정상 인접 조직의 비교에 의해 후보 TPC 항원을 추가로 평가하고, 이어서 악성 세포에서 적어도 일부 특정한 항원의 상향조절 또는 하향조절을 기초로 선택하였다. 게다가, 마우스로 이질성 종양을 완전히 이식하는 능력 (즉, 종양형성성 능력)을 풍부화하는 능력을 갖는 다양한 세포 표면 마커의 체계적인 분석, 및 이들 마커의 후속 조합은 이식시 모든 종양 생성 능력을 오직 함유하는 뚜렷하게 고도로 풍부화된 종양 세포 하위집단 (즉, 종양 개시 세포)을 확인하고 특성화하는 형광 활성화 세포 분리 (FACS) 기법을 맞추기 위한 능력 및 해결 방법을 실질적으로 개선시킨다.
반복을 위해, 용어 종양 개시 세포 (TIC) 또는 종양형성성 (TG) 세포는 벌크 종양 또는 물질의 독특한 하위집단 (즉, 0.1-25%)을 함께 일반적으로 포함하는 고도의 증식성 종양 전구 세포 (TProg) (이의 특징은 상기 정의되어 있음) 및 종양 지속 세포 (TPC; 즉 암 줄기 세포) 모두를 포함한다. 이러한 방식으로 특성화된 대부분의 종양 세포는 이러한 종양 형성 능력이 전혀 없고, 이에 따라 비-종양형성성 (NTG)으로서 특성화될 수 있다. 놀랍게도, 등록상표 페노프린트 어레이를 사용하여 확인된 가장 뚜렷한 마커는 표준 FACS 프로토콜을 사용하여 결장직장 종양에서 종양 개시 세포 집단을 풍부화하는 능력을 입증하지 않았으나, 뚜렷한 마커 조합을 사용하여 종양 개시 세포의 두 하위집단; TPC 및 TProg를 확인할 수 있음이 입증되었다. 당업자는 TPC 및 TProg 모두가 1차 이식 종양을 개시하나, 이들 사이의 정해진 차이는 적은 세포 수에서 연속 이식시 지속적으로 종양 성장을 촉진하는 TPC의 능력임을 인지할 것이다. 게다가, 다른 것들이 종양형성성 세포를 풍부화하는데 유사하게 사용될 수 있는 소정의 세포 표면 마커 또는 효소 활성을 가질지라도 (상기 문헌 [Dylla et al 2008]) 본 발명자들에 의한 발견 이전에 TPC 및 TProg 모두를 풍부화하는데 조합으로 사용되는 마커/단백질이 임의의 조직 또는 신생물에서 이러한 활성을 함유하는 세포로 회합되는 것이 공지되지 않았다. 하기 기재된 바와 같이, 상기 시사된 세포 표면 마커 조합을 사용하여 단리된 특정한 종양 세포 하위집단을 이어서 온전한 전사체 차세대 염기서열분석을 사용하여 분석하여 순차적으로 발현된 유전자를 확인하고 특성화하였다.
실시예 2
농축된 종양 개시 세포 집단으로부터의 RNA 샘플의 분리 및 분석
수립 결장직장 NTX (종양주 SCRX-CR4)를 실시예 1에 기재된 바와 같이 계대배양하고 면역손상된 마우스에서 종양을 개시하는데 사용하였다. 평균 종양 크기가 약 300 mm3에 이르면 적어도 안락사 20일 이전의 기간 동안 15 mg/kg의 이리노테칸, 25 mg/kg의 겜시타빈, 또는 비히클 대조물 (PBS)로 무작위로 마우스를 주 2회 처리하였다. 종양을 이어서 제거하였고 TPC, TProg 및 NTG 세포 각각을 새로 절제된 결장직장 NTX 종양으로부터 분리하였고, 유사하게, TG 및 NTG 세포를 일반적으로 실시예 1에 기재한 기술을 사용하여 췌장 NTX 종양으로부터 분리하였다. 보다 구체적으로, 세포 집단을 FACS에 의해 분리하고 즉시 펠렛화하고 퀴아겐 알엘티플러스 (Qiagen RLTplus) RNA 용균 완충제 (퀴아겐) 중에서 용균시켰다. 이어, 용균물을 사용될 때까지 -80℃에서 보관하였다. 동결시, 총 RNA를 판매 회사의 지침서에 따라 퀴아겐 알엔이지 (RNeasy) 분리 키트 (퀴아겐 인크.)를 사용하여 추출하였으며 판매 회사의 프로토콜 및 권장된 기기 설정을 사용하여 나노드롭 (Nanodrop) (써모 사이언티픽 (Thermo Scientific)) 및 바이오애널라이저 (Bioanalyzer) 2100 (아길렌트 테크놀로지스 (Agilent Technologies) 상에서 다시 정량화하였다. 생성된 총 RNA 제제는 유전자 서열 분석 및 분석에 적합하였다.
샘플당 5 ng의 총 RNA으로 시작하고 어플라이드 바이오시스템스 솔리드 (Applied Biosystems SOLiD) 3.0 (올리고 라이게이션/검출에 의한 서열 분석) 차세대 서열 분석 플랫폼 (라이프 테크놀로지스 (Life Technologies))을 사용한 전체 전사체 서열 분석을 위해, 비히클 또는 화학요법제 처리된 마우스로부터 상기에 기재된 바와 같이 분리된 각각의 세포 집단으로부터 얻은 총 RNA 샘플을 제조하였다. 솔리드 플랫폼에 의해 발생된 데이터는 인간 게놈으로부터의 34,609개의 유전자까지 맵핑하였고, 몇몇의 샘플에서 PTK7을 검출할 수 있었다.
일반적으로 솔리드3 차세대 서열 분석 플랫폼은 비드에 연결된 클론-증폭 RNA/DNA 단편의 병렬 서열 분석을 가능케 하였다. 이어서, 염료 표지한 올리고뉴클레오티드와의 라이게이션에 의한 서열 분석을 사용하여 샘플에 존재하는 각 단편의 50개의 염기 판독을 생성하였고, 총 5000만개 보다 많은 판독은 게놈에서의 보다 훨씬 정확하게 단백질의 mRNA 전사 수준 발현을 나타내었다. 솔리드3 플랫폼은 단지 판독 범위 (게놈 위치에 고유하게 맵핑된 판독)를 기재로 하여 단지 발현뿐만 아니라 SNP, 공지된 또는 비공지된 대안 스플라이싱 이벤트, 및 잠재적인 신규한 엑손 발견을 수집할 수 있었다. 이에 따라, 상기 차세대 플랫폼의 사용은 발현된 mRNA 전사의 특이적 스플라이싱 변이체에 대한 차이 또는 선호뿐만 아니라 전사 수준 발현에서의 차이를 측정하는 것을 가능케 하였다. 게다가, 어플라이드 바이오시스템스의 수정된 전체 전사체 프로토콜을 사용하는 솔리드3 플랫폼을 이용한 분석은 단지 대략 5 ng의 출발 물질 예비증폭을 요구하였다. 이는, 세포의 TPC 서브세트가 예를 들어 NTG 또는 벌크 종양에 비해 수가 대단히 적고 이에 따라 매우 적은 양의 사용가능한 출발 물질을 초래하는 분급된 세포 집단으로부터의 총 RNA 추출이므로 유의하다.
솔리드3 플랫폼으로부터의 2회 획득된 서열 분석 데이터를 정규화하고 형질전환되고 폴딩된 비율을 표준 산업 관행대로 계산하였다. 도 2에서 보듯이, PTK7 유전자 발현 수준 (엑손까지 맵핑된 백만 당 판독으로서 표현됨; RPM_엑손)을 각각의 SCRx-CR4 종양 세포 하위집단에서 측정하였다. 데이터의 분석은, PTK7은 각각 비히클 또는 이리노테칸으로 처리된 마우스에서 전사 수준이 NTG 집단보다 2-4배 사이, 그리고 TProg 집단보다 50-200%배 상향조절되었음을 나타내었다.
상기 상세한 관측은 PTK7 발현이 일반적으로 TPC 집단에서 높아짐을 나타내었으며, PTK7은 종양 발생 및 종양 유지에 중요한 역할을 할 수 있어 면역 요법을 위한 흥미로운 표적임을 시사하였다.
실시예 3
농축된 종양 개시 세포 집단에서 PTK7의 실시간 PCR 분석
결장직장암 중 TProg 및 NTG 세포에 비한 TPC 집단 및 췌장암 중 NTG 세포에 비한 TG에서의 전체 전사체 서열 분석에 의해 관측된 차등 PTK7 발현을 입증하기 위해, 택맨 (TaqMan)® 정량적 실시간 PCR을 사용하여 상기에 기재된 바와 같이 다양한 NTX 세포주로부터 분리된 각각의 세포 집단에서의 유전자 발현 수준을 측정하였다. 이러한 실시간 PCR 분석은 관심있는 특정 유전자에 특이적인 프라이머 및 프로브 세트를 사용하여 별개의 대상에 대한 보다 직접적이고 신속한 유전자 발현 수준을 측정할 수 있게 하였음을 인식할 것이다. 택맨® 실시간 정량적 PCR을 다수의 환자-유래된 NTX 세포주 세포 집단 및 해당 대조물에서의 PTK7 및 PTK7 유전자 발현을 측정하는데 사용된 어플라이드 바이오시스템스 7900HT 기계 (라이프 테크놀로지스) 상에서 실시하였다. 게다가, 분석은 시판용 PTK7 및 PTK7 프라이머/프로브 세트 (라이프 테크놀로지스)를 사용하며 택맨 시스템과 함께 공급된 지침서에 상술된 바와 같이 수행되었다.
도 3에서 보다시피, 2개의 별개 결장직장 NTX 종양 세포주 (SCRX-CR4 & CR5) 및 췌장 종양주 (SCRX-PA3)로부터 분리된 NTG 및 TPC 집단을 사용하여 유전자 발현의 정량적 실시간 PCR 반응측정을 수행하였다. TProg 세포 집단을 또한 SCRx-CR4에 대해 분리하고 분석하였다. 도3에 제시된 데이터는 PTK7 유전자 발현은 NTG 세포에 비해 동일한 종양으로부터의 결장직장 TPC에서 2배보다 많이 높아졌음을 나타냈다. PTK7은 또한 이리노테칸으로 처리되고 있는 마우스의 TPC, 및 췌장 종양의 TIC 세포 집단 (예컨대 SCRx-PA3)에서 2배보다 많이 높아졌다.
널리 인정된 실시간 정량적 PCR의 방법을 사용하여 관측된, 결장직장 및 췌장 환자 유래된 NTX 종양 둘 다로부터의 NTG 세포 대조물에 비해 NTX TPC 세포 시료에서의 높은 PTK7 발현은 상기 실시예의 보다 민감한 솔리드3 전체 전사체 서열 분석 데이터를 확인시켰다. 이러한 결과는 추가로 PTK7 발현 수준 및 치료에 대해 저항하고 재발하는 세포 기재 종양 발생의 관측된 연계성을 뒷받침하였다.
실시예 4
비분획화 결장직장 종양 표본에서의 PTK7의 발현
PTK7 유전자 발현이 결장직장 종양으로부터의 TProg 및 NTG 세포에 비해 동일한 종양으로부터의 TPC 집단에서 증가된 것이 발견된 점을 고려하여, 정상 인접 조직 (NAT)에 비해 비분획화 결장직장 종양 견본에서 PTK7의 발현이 증가된 것이 또한 검출가능한지 여부를 판단하기 위해 실험을 수행하였다. 또한 정상 조직 표본 (NL)에서의 수준에 비해 종양에서의 PTK7의 발현이 어느 정도인지를 판단하기 위한 측정을 수행하였다.
보다 구체적으로 상이한 단계의 110개의 결장직장 환자 종양 표본, 정상 인접 조직, 및 48개의 정상 조직을 포함하는 맞춤 투머스캔 qPCR (오리진 테크놀로지스 (Origene Technologies)) 384-웰 어레이를 당업계에 공지된 기술을 사용하여 설계하고 제작하였다. 실시예 3에 상술한 절차 및 동일한 PTK7 특이적 프라이머/프로브 세트를 사용하여, 택맨® 실시간 정량적 PCR을 맞춤 플레이트의 웰에서 실시하였다.
도 4a 및 4b는 발현 데이터의 결과를 정상 결장 및 직장 조직에서의 평균 발현에 대하여 정규화시킨 그래프 형태로 나타낸다. 보다 특히, 도 4a는 질환의 다양한 단계 (I-IV)의 110명의 결장직장암 환자로부터 얻은 168개의 조직 표본 (이 중 35개의 조직 표본은 결장직장암 환자로부터의 정상 인접 (NAT) 조직임) 및 다른 위치로부터의 48개의 정상 조직 (NL 조직)을 사용하여 생성한 데이터를 요약한다. 도표에서, 각 조직 표본/환자로부터의 데이터는 점으로 표시하였으며, X축 상에 표시된 선은 각 집단의 기하 평균값을 나타낸다. 유사하게, 도 4b는 다양한 질환 단계 (I-IV)에서 종양 (T) 또는 정상 인접 조직 (N)으로부터 얻은, 24명의 해당 결장직장 환자 표본으로부터의 데이터를 포함한다. 여기서 도표화 데이터는 개개 환자로부터의 각각의 종양 및 정상 인접 조직 사이를 연결하여 샘플 단위로 샘플에 대해 나타내었다. 정상 인접 조직에 비해 다수의 해당 종양에서 PTK7의 발현이 명백히 많이 되었으며, 단계 3 및 4에서의 차등 발현은 통계적 유의도 (n ≥ 4, P ≤ 0.037)에 이르렀다.
도 4a 및 4b는, 제시된 모든 네 단계에서, 정상 인접 조직에 비해 다수의 결장직장 종양 및 해당 종양 표본에서 PTK7 유전자의 발현된 수준이 높아짐을 나타낸다. 게다가, 결장직장암의 임의의 단계에서 평균 PTK7 유전자 발현은 상승된 대부분의 정상 조직에 비해 상승된 것으로 나타난다 (도 4a). 이러한 결과는 PTK7 발현이 결장직장암 내에서 증가함을 입증하며 PTK7 발현이 결장직장 TPC 및 췌장 TIC에서 최대라는 상기 관측과 결부되면, PTK7을 발현하는 암 줄기 세포의 치료 표적화가 암 환자에게 치료 혜택을 제공할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 5
대표적인 종양 샘플에서의 PTK7 리간드의 차등 발현
추가 결장직장암 환자 종양 샘플 및 18종의 충실성 종양 유형 중 1종을 진단받은 환자로부터의 종양 표본에서의 PTK7 유전자 발현을 추가로 평가하기 위해서, 실시예 4에서 기재한 바와 같이 맞춤 제조되었지만, 결장직장 샘플만을 포함하는 것보다, 18개의 상이한 종양 유형으로부터의 고형 종양 샘플을 포함하는 티슈스캔 (TissueScan) qPCR (오리진 테크놀로지스) 384-웰 어레이를 사용하여 택맨® qRT-PCR을 실시하였다. 측정 결과를 도 5a 및 5b에 나타내었으며 측정 결과는 PTK7의 유전자 발현이 다수의 고형 종양 유형에서 상당히 높아졌음을 나타낸다.
이와 관련하여, 도 5a 및 5b는 상이한 18종의 충실성 종양 유형 중 1종을 갖는 환자로부터의 전체 종양 표본 (회색 점) 또는 해당 인접 정상 세포 (NAT; 백색 점)에서 인간 PTK7의 상대적인 및 절대적인 유전자 발현 수준을 각각 나타낸다. 도 5a에서, 분석된 각 종양 유형에 대한 NAT에서의 평균 유전자 발현에 대해 데이터를 정규화하였다. 도 5b에서, 다양한 조직/종양에서의 PTK7의 절대적인 발현을 평가하였으며, 데이터를 정량적 실시간 PCR에 의한 지수 증폭에 이르게 하기 위해 필요한 주기의 수 (Ct)로서 도표화하였다. 증폭되지 않은 표본은 실험 프로토콜에서 증폭의 마지막 주기를 나타내는 45의 Ct 값으로 지정되었다. 각 점은 개개 조직 표본을 나타내며, 평균값은 흑색 선으로 나타내었다.
맞춤 조립된 오리진 티슈스캔 (OriGene TissueScan) 어레이를 사용하여, 결장직장암 진단을 받은 다수의 환자 및 부신, 자궁내막, 식도, 간, 감상샘 및 방광암을 진단받은 대부분의 환자가 NAT에 비해 그들의 종양에서 상당히 보다 많은 PTK7 유전자 발현을 가짐을 관측하였으며, 이는 PTK7이 이러한 종양의 종양 발생 및/또는 종양 진행에서 역할을 할 수 있음을 시사한다. 또한 NAT에 비해 상승된 PTK7 발현을 갖는 폐 및 전립선암 환자의 부분집합이 있었다. 또한 이러한 연구로부터 명백하였던 것은 PTK7 유전자 발현이 대부분의 NAT 샘플에서 일반적으로 보통이며, 유방, 자궁경부, 난소, 췌장, 고환 및 방광에서는 발현이 최대로 관측되었다는 것이었다. 또한, 이러한 데이터는 선택된 과증식 장애를 보이는 환자의 종양 발생 또는 종양 영속화에 관해 상승된 PTK7 발현이 표시적인 역할을 하며, 잠재적으로는 방향을 결정함을 시사한다.
실시예 6
PTK7 면역원의 구축 및 발현
본 발명에 따른 특정 PTK7 조절제를 생성하고, 특징화하기 위해 2개의 형태의 PTK7 면역원을 구축하고, 발현하였다. 초기에 상업적 발현 벡터, pCMV6-XL4-PTK7을 오리진, 인크.(Origene, Inc.)로부터 구매하였다. 전장 ORF의 서열을 확인하고(도 1a의 밑줄친 부분), 이어서 PCR에 의해 pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP 렌티바이러스 벡터 (System Biosciences)의 EcoRI 및 NotI 부위 내에 서브클로닝하였다. 이 렌티바이러스 벡터는 T2A 리보솜 스킵(skip) 펩티드 및 GFP 선택가능한 마커에 융합된 전장 PTK7 단백질을 발현하여, 도입된 세포에서의 다중시스트론성(multicistronic) 발현을 가능하게 한다. 이 렌티바이러스 벡터는 표준 프로토콜에 따라 293T 세포 또는 BALB/c 3T3 세포를 형질도입시키기 위해 사용되었다. 추가로, pCMV6-XL4-PTK7을 PTK7 단백질을 293T 세포의 표면상에 폴리에텐이민을 사용한 세포의 형질감염 48-시간 후 일시적으로 발현하기 위해 사용하였다. 혈장 막 제제를 PTK7 과-발현 세포로부터 차등 원심분리를 사용하여 수득하였다.
다른 예에서, 가용성 PTK7 면역원을 제조하고 pEE12.4 발현 벡터 (Lonza AG)를 사용하여 도 1b의 밑줄친 아미노산에 의해 나타낸 서열에 의해 코딩된 단백질의 세포외 도메인 (ECD)을 코딩하는 PTK7 cDNA의 부분 내에 발현하였다. 제1 예에서, ECD 단편을 IgK 리더 서열의 하류 및 8xHis 에피토프 태그(서열 8)의 상류에 인-프레임(in-frame) 서브클로닝하였다. 가용성 His-태그된 PTK7 ECD 면역원을 CHO-KSV 세포의 일과성 형질감염에 의해 생성하고, Ni-NTA 수지 및 표준 방법 (Qiagen Inc.)을 사용하여 세포 상청액으로부터 분비된 단백질을 정제하였다. 상기한 PTK7-ECD-His 구조체, 상기 기재된 혈장 프렙(prep) 및 형질감염된 세포에 추가로, Fc-PTK7-ECD 구조체를 또한 생성하고 발현하였다. 이 절차를 도 1b에 제시된 ECD 단편의 PCR 증폭에 의해 고 정확도 KOD 핫 스타트(Hot Start) DNA 폴리머라제 (EMD Chemicals)를 사용하여 출발하였다. 이 PCR 반응에서 사용된 전방향 프라이머는 PTK7 서열: GCCATTGTCTTCATCAAGCAGCC (서열 9)를 가졌으며, 또한 배양물 상청액으로의 생성물의 분비를 위한 5' HindIII 제한 부위 및 뮤린 IgG 카파(Kappa) 신호 펩티드 / 리더 서열을 포함하였다. 이들 구조체를 증폭시키기 위해 사용된 역방향 프라이머는 PTK7 서열: CTGGATCATCTTGTAGGGGGGAG (서열 10)을 가졌으며, 합성된 유전자 (DNA 2.0 Inc.)로서 주문된 인간 IgG2 Fc 단백질의 상류를 클로닝할 수 있도록 허락하는 5' DraIII 및 BglII 제한 부위를 포함하였다.
증폭되거나 또는 서브-클로닝된 생성물을 이어서 HindIII 및 EcoRI 제한 부위를 사용하여 최종 발현 벡터 pEE12.4 (Lonza AG) 내에 이동시켰으며, 정확도를 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 플라스미드를 CHO-S 또는 293T 현탁액 세포 중 하나 내에 일시적으로 형질감염시키고, His-태그된 단백질에 대한 니켈 친화성 컬럼 또는 Fc 융합 생성물에 대한 단백질 A 중 하나에 의해 정제하였다. 생성물을 추가로 포스페이트 완충 염수 (PBS), pH 7.2 내의 슈퍼덱스(Superdex)200 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 크기 배재 크로마토그래피에 의해 정제하였으며, 정제된 융합 단백질을 브래드포드(Bradford) 방법 (문헌 [Bradford, 1976: PMID 942051])을 사용하여 정량화하였다.
실시예 7
hPTK7 면역원을 사용한 항-PTK7 항체의 생성
뮤린 항체의 형태의 PTK-7 조절제를 본원의 교시에 따라 각각, 이전의 실시예에 제시된 바와 같이 제작된 전장 hPTK7, hPTK7-His 또는 hPTK7-Fc를 과발현하는 BALB/3T3 또는 HEK 293 세포로의 접종을 통해 생성하였다. 이에 대해 암컷 마우스의 3개의 균주 (3개 각각: Balb/c, CD-1, FVB)를 상기한 PTK7 면역원의 제제로 면역화시켰다. 마우스를 모두 발바닥 경로를 통해 각각 경우에 동일한 부피의 타이터맥스(TiterMax)® 또는 알룸 아쥬반트로 유화된 10 μg의 선택된 PTK7 구조체 또는 1X106개의 세포로 면역화시켰다.
FACS 또는 고체-상 ELISA 검정을 인간 PTK7에 대해 특이적인 마우스 IgG 항체에 대한 마우스 혈청을 스크리닝하기 위해 사용하였다. ELISA를 위해, 플레이트를 PBS 중의 0.01-1 μg/mL 범위의 상이한 농도에서의 PTK7-His로 밤새 코팅하였다. 0.02% (v/v) 트윈(Tween) 20을 함유하는 PBS로 세척한 후, 웰을 PBS 중의 3% (w/v) BSA 또는 PBS 중의 2% FCS, 200 μL/웰로 1시간 동안 실온에서 블록킹하였다. 마우스 혈청 희석물을 50 μL/웰으로 PTK7-His 코팅된 플레이트 상에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 이어서 1시간 동안 실온에서 3% BSA-PBS 또는 PBS 중의 2% FCS 중에 1:10,000으로 희석된 50 μL/웰 HRP-표지된 염소 항-마우스 IgG와 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고 100 μL/웰의 TMB 기질 용액 (Thermo Scientific 34028)을 15분 동안 실온에서 첨가하였다. 최종적으로 동일한 부피의 2M H2SO4를 기질 발달을 중지시키기 위해 첨가하고, OD 450에서 분광광도계에 의해 분석하였다.
나타낸 바와 같이 뮤린 혈청을 또한 항-PTK7 항체에 대해 FACS에 의해 인간 PTK7을 과발현하며 GFP와 동시-형질도입된 세포에 대해 시험하였다. 간단히 웰 당 1x105개 BALB/3T3세포를 인간 PTK7로 도입하고, GFP를 30분 동안 PBS/2%FCS 중에 1:100로 희석된 100ul 마우스 혈청으로 인큐베이션하였다. 세포를 PBS/2%FCS로 세척하고, 이어서 샘플 당 50μL 다이라이트(DyeLight) 649 표지된 염소-항-마우스 IgG, PBS/2%FCS 중에 1:200으로 희석된 Fc 단편 특이적 2차와 함께 인큐베이션하였다. 15분의 인큐베이션 후, 세포를 PBS/2%FCS로 2회 세척하고, DAPI를 갖는 PBS/2%FCS 중에 재-현탁시키고, FACS에 의해 분석하였다.
혈청 양성 면역화된 마우스를 희생시키고, 배수되는 림프절 (확대된 경우 오금 및 샅굴)을 절개하고, 항체 생성 세포에 대한 공급원으로서 사용하였다. B 세포의 단일 세포 현탁액 (375x106개 세포)을 비-분비성 P3x63Ag8.653 골수종 세포 (ATCC #CRL-1580)와 1:1의 비율로 전기융합에 의해 융합시켰다. 세포 전기융합을 BTX 하이브리뮨 시스템(Hybrimmune System) 또는 ECM2001, (둘 다 BTX 하버드 어패러투스(Harvard Apparatus)임)을 사용하여 제조자의 지침서에 따라 수행하였다. 다음 전기융합 세포를 아자세린(Azaserine) (Sigma #A9666) (15% 태아 클론 I 혈청 (Hyclone), 10% BM 콘디메드(Condimed) (Roche Applied Sciences), 1 mM 나트륨 피루베이트, 4 mM L-글루타민, 100 IU 페니실린-스트렙토마이신, 50 μM 2-머캅토에탄올, 및 100 μM 히포크산틴을 함유하는 DMEM (Cellgro cat#15-017-CM) 배지)으로 보충된 하이브리도마 선택 배지 중에 재현탁시켰다. 제1 융합에서 세포를 2X104/웰로 넓적 바닥 미량역가 플레이트에 플레이팅하고, 이어서 선택적 HAT 배지 (Sigma, CRL P-7185) 중에 2주 동안 인큐베이션하였다. 제2 융합에서, 세포를 융합 후 4개의 T225 플라스크에서 플라스크 당 90 ml 선택 배지로 플레이팅하였다. 플라스크를 이어서 5% CO2 및 95% 공기를 함유하는 습화된 37℃ 인큐베이터 중에 6-7일 동안 놓았다.
성장 후 T225에서의 제2 융합으로부터의 세포를 포함하는 라이브러리를 FACSAria I 세포 분류기를 사용하여 분류하고, 웰 당 1개 세포로 팔콘(Falcon) 96 웰 U-바닥 플레이트 (둘 다 비디 바이오사이언시즈(BD Biosciences))에 플레이팅하였다. 임의의 남은 사용되지 않은 하이브리도마 라이브러리 세포를 필요한 경우 이후의 시험을 위해 냉동시켰다. 선택된 하이브리도마를 이어서 15% 태아 클론 I 혈청 (Hyclone), 10% BM-콘디메드 (Roche Applied Sciences), 1 mM 나트륨 피루베이트, 4 mM L-글루타민, 100 IU 페니실린-스트렙타마이신, 50 μM 2-머캅토에탄올, 및 100 μM 히포크산틴을 함유하는 200 μL의 배양물 배지 중에 성장시켰다. 96 웰 플레이트에서의 두 융합 모두에 대한 10-14일의 성장 후 각각 웰로부터의 상청액을 ELISA 또는 FACS 검정을 사용하여 뮤린 PTK7에 대해 반응성인 항체에 대해 검정하였다.
간단히, 96 웰 플레이트 (VWR, 610744)를 1 μg/mL 뮤린 PTK7-His으로 나트륨 카르보네이트 완충제 중에 밤새 4℃에서 코팅하였다. 플레이트를 세척하고 2% FCS-PBS로 1시간 동안 37℃에서 블록킹하고, 바로 사용하거나 또는 4℃에서 보관하였다. 희석되지 않은 하이브리도마 상청액을 플레이트 상에서 1시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 1% BSA-PBS 중에 1:10,000로 희석된 HRP 표지된 염소 항-마우스 IgG로 1시간 동안 실온에서 프로빙하였다. 상기 기재된 기질 용액으로의 인큐베이션 후 플레이트를 OD 450에서 판독하였다.
마우스 면역글로불린을 분비하는 성장 양성 하이브리도마 웰을 또한 상기 기재된 것과 유사한 FACS 검정을 사용하여 인간 PTK7 특이성에 대해 스크리닝하였다. 간단히 웰 당 인간 PTK7 및 GFP로 도입된 1x105개의 BALB/3T3세포를 30분 동안 25-100 μL 하이브리도마 상청액으로 인큐베이션하였다. 세포를 PBS/2%FCS로 2회 세척하고, 이어서 샘플 당 50μL 다이라이트 649 표지된 염소-항-마우스 IgG, PBS/2%FCS 중에 1:200으로 희석된 Fc 단편 특이적 2차와 함께 인큐베이션하였다. 15분 인큐베이션 후 세포를 PBS/2%FCS로 2회 세척하고, DAPI (Life Technologies)를 갖는 PBS/2%FCS 중에 재-현탁시키고, FACS에 의해 분석하였다. 제2 융합을 위해 생성된 PTK7 특이적 클로날 하이브리도마를 확장시키고 CS-10 냉동보존용 배지 (Biolife Solutions) 중에 저온 보존하고, 액체 질소 중에 보관하였다.
제1 융합을 위해, 서브클로닝을 제한된 희석 평판 배양을 사용하는 선택된 항원-양성 웰 상에서 실시하였다. 단일 콜로니 성장 및 단일 콜로니 웰로부터의 상청액의 존재에 대해 플레이트를 시각적으로 조사하였고 추후 항원-특이적 ELISA 및 상기에 기재된 바와 같은 FACS 확인에 의해 스크리닝하였다. 생성되는 클로날 집단을 증식시켰고 냉동보존용 배지 (90% FBS, 10% DMSO)에서 저온 보존하였으며 액체 질소에서 보관하였다.
제1 융합에 대해 양성 웰로부터 PTK7을 분비하는 하이브리도마 (4 히트(hit) OD405@20분 >0.75)를 추가의 특징화를 위해 선택하였다.
48개 플레이트 (4608 웰)에 걸쳐 시딩된 제2 융합은 수백 개의 히트를 갖는 대략 65% 클로닝 효율을 야기하였다. 선택된 클론은 인간 PTK7에 대해 면역특이적인 몇몇 12개의 뮤린 항체를 제공하였으며, 일부는 또한 뮤린 PTK7과 교차-반응하였다.
실시예 8
PTK7 조절제의 서열분석 및 인간화
8(a) 서열분석:
상기를 기반으로, 다수의 예시적 분명한 고정화 인간에 결합하는 모노클로날 항체 및 분명히 높은 친화성을 갖는 마우스 PTK7과 교차-반응하는 항체를 서열분석 및 추가의 분석을 위해 선택하였다. 도 6a 및 6b에 표의 방식으로 나타낸 바와 같이, 실시예 7에서 생성된 선택된 모노클로날 항체로부터의 경쇄 가변 영역 (도 6a) 및 중쇄 가변 영역 (도 6b)의 서열 분석은 많은 영역은 신규한 상보성 결정 영역을 가졌으며, 종종 신규한 VDJ 배열을 나타낸 것을 확인하였다. 도 6a 및 6b에 나타낸 상보성 결정 영역은 상기 문헌 [Chothia et al.]에 따라 정의된다는 것을 주목한다.
더 특이적으로, 도 6a는 항-PTK7 항체로부터의 21개의 신규한 뮤린 경쇄 가변 영역 (서열 20 - 60, 짝수)의 인접 아미노산 서열 및 대표적인 뮤린 경쇄로부터 유도된 4개의 인간화 경쇄 가변 영역 (서열 62 - 68, 짝수)의 인접 아미노산 서열을 나타낸다. 유사하게, 도 6b는 동일한 항-PTK7 항체로부터의 21개의 신규한 뮤린 중쇄 가변 영역 (서열 21 - 61, 홀수)의 인접 아미노산 서열 및 인간화 경쇄를 제공하는 항체와 동일한 뮤린 항체로부터의 4개의 인간화 중쇄 가변 영역 (서열 63 - 69, 홀수)의 인접 아미노산 서열을 나타낸다. 따라서, 종합하여 생각하면 도 6a 및 6b는 21개의 뮤린 항-PTK7 항체 (SC6.2.35, SC6.10.2, SC6.4.1, SC6.50.1, SC6.3, SC6.4, SC6.6, SC6.7, SC6.13, SC6.14, SC6.15, SC6.19, SC6.20, SC6.21, SC6.23, SC6.24, SC6.26, SC6.29, SC6.41, SC6.58 및 SC6.59로 지칭됨) 및 4개의 인간화 항체 (hSC6.23, hSC6.24, hSC6.41 및 hSC6.58로 지칭됨)의 주석이 달린 서열을 제공한다. 지정 SC6.4.1 및 SC6.4는 단지 명명 변칙을 반영하며, 조절제는 실제로 신규한 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 갖는 2개의 별개의 항체를 포함한다는 것을 주목한다.
본 출원의 목적을 위해, 각각 특정 항체의 서열은 순차적이다. 따라서 mAb SC6.2.35는 각각 경쇄 및 중쇄 가변 영역에 대해 서열 20 및 21을 포함한다. 이와 관련하여 SC6.10.2는 서열 22 및 23, SC6.4.1은 서열 24 및 25, 기타 등등을 포함한다. 추가로, 도 6a 및 6b의 항체 아미노산 서열 각각에 대해 상응하는 핵산 서열은 본원에 첨부된 서열 목록으로서 본 출원에 포함된다. 포함된 핵산 서열은 상응하는 아미노산 서열 (중쇄 또는 경쇄)보다 1백 초과인 서열을 포함한다. 따라서, mAb SC6.2.35의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 아미노산 서열 (즉, 서열 20 및 21)을 코딩하는 핵산 서열은 서열 120 및 121을 포함한다. 인간화 구조체를 코딩하는 서열을 포함하는 다른 항체 핵산 서열의 수를 유사하게 매겼다.
예시적인 조절제를 서열분석 하는 제1 단계로서, 선택된 하이브리도마 세포를 RNA를 제조하기 위해 트리졸® 시약 (Life Technologies) 중에서 용균시켰다. 이와 관련하여 104 내지 105개의 세포를 1 ml의 트리졸에 재현탁시키고, 200 μL의 클로로포름을 첨가한 후 강력 교반하였다. 샘플을 이어서 4℃에서 10 분 동안 원심분리하고, 수성상을 새 마이크로원심분리 튜브로 옮겼으며, 여기서 동일한 부피의 이소프로판올을 첨가하였다. 튜브를 다시 강력 교반하였고 실온에서 10 분간 인큐베이션하였고, 이어서 4℃에서 10 분간 원심분리하였다. 생성된 RNA 펠렛을 70%의 에탄올 1 ml로 1회 세척하였고, 이어서 실온에서 간단히 건조시키고, 이어서 40 μL의 DEPC-처리된 물 중에서 재현탁하였다. RNA 제제의 품질은 1% 아가로스 겔 중에서 3 μL를 분별하여 측정하였고, 이어서 사용될 때까지 -80℃에서 저장하였다.
각 하이브리도마의 Ig 중쇄 가변 영역을 완전한 마우스 VH 목록을 표적하도록 설계된 32개의 마우스 특이적 리더 서열 프라이머를 모든 마우스 Ig 이소타입에 대해 특이적인 3' 마우스 Cγ 프라이머와 조합하여 포함하는 5' 프라이머 믹스를 사용하여 증폭시켰다. VH의 400 bp PCR 단편을 두 말단 모두로부터 동일한 PCR 프라이머를 사용하여 서열분석 하였다. 유사하게 각각의 Vk 마우스 족을 증폭시키기 위해 설계된 마우스 카파 불변 영역에 대해 특이적인 단일 역방향 프라이머와 조합된 32개의 5' Vk 리더 서열 프라이머 혼합물을 카파 경쇄를 증폭시키고 서열분석 하기 위해 사용하였다. VH 및 VL 전사체를 역방향 트랜스크립타제 폴리머라제 쇄 반응 (RT-PCR)을 사용하여 100 ng의 총 RNA로부터 증폭시켰다.
V 카파 경쇄에 대해 4개 및 V 감마 중쇄 (γ1)에 대해 4개, 총 8개의 RT-PCR 반응을 각각 하이브리도마에 대해 수행하였다. 퀴아겐 원 스텝(QIAGEN One Step) RT-PCR 키트를 증폭을 위해 사용하였다 (Qiagen, Inc.). 이 키트는 센시스크립트(Sensiscript) 및 옴니스크립트(Omniscript) 역방향 트랜스크립타제, 핫스타태크(HotStarTaq) DNA 폴리머라제, dNTP 혼합물, 완충제 및 "어려운" (예를 들어, GC-풍부) 주형의 효율적인 증폭을 가능하게 하는 신규한 첨가제인 Q-용액의 혼합물을 제공한다. 추출된 PCR 생성물을 특이적 V 영역 프라이머를 사용하여 직접 서열분석 하였다. 뉴클레오티드 서열을 IMGT를 사용하여 가장 높은 서열 상동성을 갖는 배선 V, D 및 J 유전자 구성원을 식별하기 위해 분석하였다. 유도된 서열을 Ig V- 및 J-영역의 공지된 배선 DNA 서열에 V-BASE2 (상기 문헌 [Retter et al])를 사용하여, 그리고 VH 및 VL 유전자의 마우스 배선 데이터베이스에 대한 정렬에 의해 비교하였다.
제조된 반응 혼합물은 RNA 3 μL, 5× RT-PCR 완충제의 100 μM 중쇄 또는 카파 경쇄 프라이머 5 μL의 0.5, dNTP 1 μL, 역방향 트랜스크립타제 및 DNA 폴리머라제를 함유하는 효소 믹스 1 μL, 및 리보뉴클레아제 억제제 RNasin (Promega BioSystems) 0.4 μL를 함유하였다. 반응 혼합물은 역전사 및 PCR에 모두 요구되는 모든 시약을 포함하였다. 열 사이클러 프로그램 (thermal cycler program)은 RT 단계였다 (50℃에서 30 분, 95℃에서 15 분, 이어 30 사이클 (95℃에서 30 초, 48℃에서 30 초, 72℃에서 1.0 분)). 이어서, 72℃에서 10 분간 최종 인큐베이션하였다.
직접적으로 DNA를 서열분석하기 위한 PCR 생성물을 제조하기 위해, 제조업자의 프로토콜에 따라 이들을 퀴아퀵(QIAquick)™ PCR 정제 키트를 사용하여 정제하였다. DNA를 50 μL의 멸균수를 사용하여 스핀 컬럼으로부터 용출하였고 이어 양 가닥으로부터 직접 서열분석하였다. 다시 생성된 DNA 서열을 VBASE2를 사용하여 분석하여 (데이터는 나타내지 않음) 도 6a 및 6b에 제시된 주석화된 서열을 제공하였다. 더 특이적으로, 상기 논의된 바와 같이, 21개의 뮤린 항-PTK7 항체 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 주석화된 아미노산 서열은 도 6a 및 6b에 제시된다.
8(b) 인간화:
실시예 7에서 생성된 뮤린 항체 중 4종을 상보성 결정 영역 (CDR) 그라프팅을 사용하여 인간화하였다. 중쇄 및 경쇄를 위한 인간 프레임워크는 기능성 인간 배선 유전자에 대한 서열 및 구조 유사성을 기준으로 하여 선택하였다. 이와 관련하여, 구조적 유사성은 코티아 등의 상기한 문헌에서 기재된 바와 같이 마우스 정규 CDR 구조를 동일한 정규 구조를 가진 인간 후보자들과 비교하여 평가하였다.
보다 구체적으로, 뮤린 항체 SC6.23, SC6.24, SC6.41 및 SC6.58을 컴퓨터를 이용한 CDR-그라프팅 방법 (어바이시스 (Abysis) 데이터베이스, 유씨엘 비즈니스 (UCL Business Plc.)) 및 표준 분자 공학 기술을 사용하여 인간화시켜 hSC6.23, hSC6.24, hSC6.41 및 hSC6.58 조절제를 제공하였다. 인간 프레임워크 영역의 가변 영역을 마우스 프레임워크 서열 및 그의 정규 구조에 대해 가장 높은 서열 상동성을 기준으로 하여 선택하였다. 분석의 목적을 위해 아미노산의 각 CDR 도메인으로의 지정은 카바트 등의 넘버링에 따랐다. 일반적으로 인간 프레임워크 영역과 관련하여 마우스 하이브리도마로부터의 항원-결합 상보성 결정 영역 (CDR)을 보유하는 인간화 항체를 갖는 최적 인간화 항체를 만들기 위해 몇몇의 인간화 항체 변이체를 제조하였다. 비아코어 시스템을 사용한 측정에 의해 궁극적으로 인간화 SC6.23, SC6.24, SC6.41 및 SC6.58 mAbs는 인간 PTK7 항원에 그의 뮤린 대응물과 유사한 친화성을 갖고 결합하였다는 것이 밝혀졌다.
당업계에 공지된 기술을 사용하여 분자 공학 절차를 수행하였다. 이를 위하여, 총 mRNA를 제조업자의 프로토콜 (트리졸® 플러스 RNA 정제 시스템, 라이프 테크놀로지스)에 따라 하이브리도마로부터 추출하였다. 각각의 하이브리도마를 증폭하도록 설계된 서열 특이적 5' 리더 서열 프라이머를 3' 인간 Cγ1 프라이머와 함께 사용하여 각각의 인간화 항체의 가변 영역을 증폭시키고 클로닝하였다. 유사하게 각각의 Vk 영역을 특이적으로 증폭하도록 설계된 5' Vk 리더 서열을 인간 카파 불변 영역에 특이적인 단일 역방향 프라이머와 조합하여 사용하여 카파 경쇄를 증폭시키고 클로닝하였다. 증폭된 단편을 키메라 인간 감마1/카파 쇄로서 클로닝하고, 이는 각각 인간화 mAb에 대한 벤치 마크로서의 역할을 하였다.
뉴클레오티드 서열 정보로부터, SC6.23, SC6.24, SC6.41 및 SC6.58의 중쇄 및 경쇄의 V, D 및 J 유전자 세그먼트에 관한 데이터를 얻었다. 서열 데이터를 기초하여, 재조합 단일클론 항체의 클로닝을 위해 항체의 Ig VH 및 VK 사슬의 리더 서열에 특이적인 신규한 프라이머 세트를 설계하였다. 이어서 마우스 Ig 배선 서열을 사용하여 V-(D)-J 서열을 정렬하였다. SC6.23의 중쇄 유전자가 VH36096 (V), DSP2.3 (D) 및 JH3로 밝혀졌다. SC6.24의 중쇄 유전자가 VHJ558 (V), DSP2.7 (D) 및 JH4로 밝혀졌다. SC6.41의 중쇄 유전자가 IGHV14-4 (V), DFL16.1 (D) 및 JH2로 밝혀졌다. SC6.58의 중쇄 유전자를 IGHV4-1 (V), DFL16.1 (D) 및 JH4로서 식별하였다. 모든 4개의 경쇄는 K 클래스이었다. 경쇄 유전자를 SC6.24 mAb에 대한 IGKV14-111 및 JK5, SC6.23 mAb에 대한 IGKV3-5 및 JK1, SC6.41 mAb에 대한 IGKV2-137 및 JK4 배선 서열 및 SC6.58 카파 경쇄에 대한 IGKV17-121 및 JK4 배선 서열로서 식별하였다. 이들 결과를 바로 아래의 표 1에 요약하였다.
Figure pct00002
4종의 클론 모두로부터 얻은 중쇄 및 경쇄 서열은 기능성 인간 가변 영역 서열에 정렬되었고 상동성 및 정규 구조에 대해 검토되었다. 중쇄 및 경쇄 분석의 결과는 하기 표 2 및 3 각각에 나타내었다.
Figure pct00003
Figure pct00004
배선 선택 및 CDR 이식 절차는 일반적으로 그들의 결합 특징을 보유한 항체를 제공함에 따라, 대부분의 구조체에서 뮤린 잔기를 삽입할 필요성이 적은 것으로 나타났다.
상기 언급된 바와 같이, 모든 4개의 항체에 대한 인간화 중쇄 가변 영역 쇄 및 인간화 카파 경쇄의 아미노산 서열을 도 6a 및 6b (서열 62 - 69)에 나타내고, 상응하는 핵산 서열 (서열 162 -169)을 첨부된 서열 목록에 제시하였다.
보다 특히 인간화 SC6.23 경쇄 (서열 62 및 162), 및 인간화 중쇄 (서열 63 및 163)의 아미노산 서열 및 상응하는 핵산 서열은 도 6a 및 6b 및 서열 목록에 나타낸다. 유사하게, 인간화 SC6.24 경쇄 (서열 64 및 164), 및 인간화 중쇄 (서열 65 및 165)의 아미노산 서열 및 상응하는 핵산 서열은 동일한 방식으로 나타낸다. 본 발명의 또다른 실시양태는 인간화 SC6.41 경쇄 (서열 66 및 166), 및 인간화 중쇄 (서열 67 및 167)의 아미노산 서열 및 상응하는 핵산 서열에 의해 제시된다. 또다른 실시양태에서, 인간화 SC6.58 경쇄 (서열 68 및 168), 및 인간화 중쇄 (서열 69 및 169)의 아미노산 서열 및 상응하는 핵산 서열이 제시된다. 하기 실시예에 입증된 바와 같이 각각의 상기한 인간화 항체는 본원의 교시에 따라 효과적인 PTK7 조절제로서 기능한다.
임의의 사건에서 개시된 조절제는 발현되었으며, 당업계에서 인정된 기술을 사용하여 단리하였다. 그 목적을 달성하기 위해 두 중쇄 모두의 합성 인간화 가변 DNA 단편 (Integrated DNA Technologies)을 인간 IgG1 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 가변 경쇄 단편을 인간 C-카파 발현 벡터 내에 클로닝하였다. 항체는 CHO 세포 내에 중쇄 및 경쇄의 동시-형질감염에 의해 발현되었다.
더욱 특히, 항체 생성을 위해 인간 면역글로불린 발현 벡터 내로 뮤린 및 인간화 가변 유전자 PCR 생성물의 지향성 클로닝을 수행하였다. Ig 유전자-특이적 PCR에서 사용된 모든 프라이머는 제한 부위 (IgH에 대해 AgeI 및 XhoI, IgK에 대해 XmaI 및 DraIII)를 포함하였으며, 이는 인간 IgG1, 및 IGK 불변 영역을 각각 함유하는 발현 벡터 내로의 직접 클로닝을 허락하였다. 간단히, PCR 생성물을 퀴아퀵 PCR 정제 키트 (Qiagen, Inc.)로 정제하고, 이어서 AgeI 및 XhoI (IgH), XmaI 및 DraIII (IgK) 각각으로 소화하였다. 소화된 PCR 생성물을 발현 벡터 내로의 라이게이션 전에 정제하였다. 라이게이션 반응을 10 μL의 총 부피에서 200U T4-DNA 리가제 (New England Biolabs), 7.5 μL의 소화된 및 정제된 유전자-특이적 PCR 생성물 및 25ng 선형화된 벡터 DNA로 수행하였다. 적격 이. 콜라이 DH10B 박테리아 (Life Technologies)를 열 충격을 통해 42℃에서 3 μL 라이게이션 생성물로 형질전환하고, 암피실린 플레이트 상에 플레이팅하였다 (100 μg/mL). VH 영역의 AgeI-EcoRI 단편을 이어서 pEE6.4HuIgG1(Lonza AG) 발현 벡터의 동일 부위 내에 삽입하였고, 합성 XmaI-DraIII VK 삽입물을 각각 pEE12.4Hu-카파 발현 벡터의 XmaI-DraIII 부위 내에 클로닝하였다.
인간화 항체를 생성하는 세포를 293펙틴(fectin)을 사용한 적절한 플라스미드로의 HEK 293 세포의 형질감염에 의해 생성하였다. 이 점에 있어서 플라스미드 DNA를 QIA프렙 스핀(QIAprep Spin) 컬럼 (Qiagen)으로 정제하였다. 인간 배아 신장 (HEK) 293T (ATCC 번호 CRL-11268) 세포를 150mm 플레이트 (Falcon, Becton Dickinson)에서 표준 조건하에 10% 열 불활성화 FCS, 100 μg/mL 스트렙토마이신, 100 U/mL 페니실린 G (모두 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터의 것임)로 보충된 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (DMEM)에서 배양하였다.
일과성 형질감염을 위해 세포를 80% 전면배양으로 성장시켰다. 동일 양의 IgH 및 상응하는 IgL 쇄 벡터 DNA (12.5 μg의 각각 벡터 DNA)를 1.5 mL 옵티(opti)-MEM 중에 50 μL HEK 293 형질감염 시약과 혼합된 1.5 mL 옵티(Opti)-MEM에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 고르게 배양 플레이트에 분배하였다. 상청액을 형질감염 3일 후 수거하고, 10% FBS로 보충된 20 mL의 신선한 DMEM으로 대체하고, 형질감염 후 6일차에서 다시 수거하였다. 배양 상청액을 800×g에서 10분 동안의 원심분리에 의해 세포 파괴물로부터 제거하고 4℃에서 보관하였다. 재조합 키메라 및 인간화 항체를 단백질 G 비드 (GE Healthcare)로 정제하였다.
실시예 9
PTK7 조절제의 특징화
9(a) 일반적 조절제 특징
다양한 방법을 사용하여 상기 제시된 바와 같이 생성된 선택된 PTK7 조절제 (뮤린 및 인간화 둘 다)의 면역화학적 특징을 분석하였다. 특이적으로, 다수의 이들 항체를 게먹이원숭이 및 뮤린 상동체 (예를 들어, 포르테바이오에 의함)에 대한 친화성, 동역학, 비닝, 및 교차 반응성에 대해 특징화하였다. 조절제의 반응성을 또한 환원된 및 비-환원된 샘플을 사용하여 에피토프가 선형인지 또는 아닌지의 여부에 대한 일부 지표를 제공하기 위해 웨스턴 블롯에 의해 측정하였다. 도 7a에 제시된 뮤린 및 인간 항원 결합 데이터에 추가로, 선택된 뮤린 조절제에 대한 항체 특징화의 결과는 도 7b에 표로 나타낸 형태로 제시된다. 최종적으로, 도 7c - 7e에 나타낸 바와 같이 인간화 조절제를 갖는 선택된 뮤린에 대한 친화성을 표준 항원 농도 시리즈를 갖는 포르테바이오 RED (ForteBio, Inc.) 상의 바이오-층 간섭 분석법을 사용하여 측정하였다. 일반적으로, 선택된 조절제는 나노몰 범위의 상대적으로 높은 친화성을 나타냈다.
본 발명에 따라, 조절제 친화도를 정확도를 보장하기 위해 3가지 방법으로 측정하였다. 첫 번째로, 결합 신호를 상대적 조절제 활성을 결정하기 위해 ELISA에서의 항원의 계열 희석에 대해 프로빙한 고정된 양의 항체에 대해 측정하였다 (데이터는 나타내지 않음). 두 번째로, 선택된 효과기의 친화성 및 동역학 상수 kon 및 koff를 이어서 포르테바이오 레드(ForteBio RED) (ForteBio, Inc.) 상의 바이오-층(bio-layer) 간섭 분석법을 사용하여 표준 항원 농도 시리즈로 측정하였다. 최종적으로, 선택된 조절제의 친화도를 표면 플라스몬 공명 (Biacore System, GE Healthcare)에 의해 측정하였다. 표준 항원 농도 시리즈를 기반으로, 그리고 1:1 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델을 사용하여, 당업계에 흔한 기술을 사용하여 항원에 대한 항체 결합의 Kd 및 동역학 상수 kon 및 koff를 결정하였다 (예를 들어, 도 7c 및 7e를 참조). 일반적으로 뮤린이든 또는 인간화이든, 선택된 효과기는 나노몰 범위 내의 상대적으로 높은 친화성을 나타냈다. 도 7b의 표에서 첨자 B는 비아코어 상에서 수행된 친화도 측정을 지정하는 반면, 첨자 F는 포르테바이오 상에서 수행된 측정을 지정한다.
또한 PTK7 효과기에 의해 인식된 에피토프가 인접 아미노산을 포함하는지 또는 항원의 2차 구조와 병치된 비인접 아미노산에 의해 형성되었는지 여부를 결정하기 위해 예비 처리를 수행하였다. 이에 대해 웨스턴 블롯을 환원 (예를 들어, 0.5M DTT를 사용함)하에, 그리고 비-환원 조건하에 수행하였다. 더 특이적으로, 당업계에 공지된 표준 전기영동 기술을 사용하여, 두 상태 모두에서의 PTK7 항원을 겔 상에서 수행하고, 선택된 조절제에의 노출 전에 블롯팅하였다. 도 7b에 나타낸 바와 같이, 시험된 2개의 PTK7 조절제는 분명히 디술피드 결합이 무손상인 항원과만 반응하였다 (NR). 남아있는 PTK7 조절제는 웨스턴 블롯 활성에 대해 시험하지 않았다.
항체 비닝에 대해, 포르테바이오 옥테트 레드96 애널라이저(Octet Red96 Analyzer) (ForteBio, Inc.)를 제조자의 지침서 및 당업계에서 인정된 샌드위치 방법 [문헌 [Analytical Biochemistry 386:172-180 (2009)]에 따라 사용하여 동일하거나 또는 상이한 빈에 결합된 항체를 식별하였다. 간단히, 항체 (Ab1)를 항-마우스 포획 칩 상에 포획하고, 이어서 15ug/mL (100nM)의 고농도의 비결합 항체를 칩을 차단하고, 기준선을 확립하기 위해 사용하였다. 실시예 6에 제공된 단인자표현, 재조합 hPTK7-His (이소형 a) (500nM)을 이어서 특이적 항체 (Ab1)에 의해 포획하고, 팁을 대조군으로서의 동일한 항체 (Ab1)로 웰 내에 담구거나, 또는 상이한 항체 (Ab2)로 웰 내에 담궜으며, 여기서 두 항체 모두는 4ug/mL (25nM)의 농도를 가졌다. 신규한 항체와의 추가의 결합이 관찰된 경우, 이어서 Ab1 및 Ab2를 상이한 빈 내에 있는 것으로 결정하였다. 추가의 결합이 발생하지 않은 경우, 대조군 Ab1과 유사하게, 이어서 Ab2를 동일한 빈 내에 있는 것으로 결정하였다. 이 절차는 독특한 항체의 큰 라이브러리를 96-웰 플레이트 중의 독특한 빈을 나타내는 항체가 가득한 열을 사용하여 스크리닝하기 위해 확장될 수 있다. 3개의 대표적인 조절제에 대한 예시적 데이터는 인간 및 뮤린 PTK7 항원 둘 다에 대해 도 7a에 나타낸다. 도 7a는 SC6.10.2가 마우스에 절대 결합하지 않은 반면, SC6.2.35는 동일한 친화성을 갖는 마우스 PTK7-His에 결합된 약 10%의 인간 및 SC6.25.1에 결합하였다는 것을 나타낸다 (주목; 항체는 도 7a에 H2.35, H10.2 및 H25.1로 나타낸다). 추가로 각각의 이들 시험된 항체는 상이한 빈 내에 속하였다는 것을 결정하였다. 유사한 방식으로, 비닝 분석을 9개의 추가의 PTK7 조절제에 대해 수행하였으며, 도 7b에 결과를 나타낸다. 이들 데이터는 시험된 조절제에 의해 인식된 7개 이상의 분명한 빈을 식별하였다. 표의 ND는 데이터는 결정되지 않았다는 것을 나타낸다.
최종적으로, 게먹이원숭이 및 뮤린 PTK7 상동체에 대한 교차-반응성을 포르테바이오로 재조합적으로 발현된, 단인자표현 항원을 포함하는 농도 시리즈를 사용하여 평가하였다. 도 7b에 나열된 바와 같이 다수의 예시적 조절제는 마우스 PTK7과 교차-반응성이었으며, 모든 항체는 매우 유사한 게먹이원숭이 PTK7과 교차-반응하였다.
9(b) 인간화 조절제 특징
이 실시예에 상기 제시된 기술을 사용하여 인간화 구조체 hSC6.23, hSC6.24, hSC6.41 및 hSC6.58을 그들의 결합 특징을 결정하기 위해 분석하였다. 추가로, 인간화 항체 결합을 모 뮤린 항체와 인간화 절차에 의해 야기된 속도 상수의 임의의 미묘한 변화를 식별하기 위해 두 항체 모두에 대해 직접 비교하였다.
더 구체적으로, 뮤린 SC6.23의 친화도를 비아코어에 의해 표면 플라스몬 공명 (SPR)을 사용하여 도 7c에 제시된 결과를 제공하기 위해 측정하였다. 25, 12.5, 및 6.25 nM의 농도 시리즈를 기반으로 (도 7c 및 7d에서 맨 위 내지 맨 아래로 곡선이 생성됨) 및 1:1 랭뮤어 결합 모델을 사용하여, 항원에 대한 항체 결합의 Kd를 2.3 nM으로 추정하였다. 이어서 인간화 SC6.23 구조체로 수행된 유사한 실험은 등가의 결과를 나타냈으며 (도 7d), 이는 인간화 절차는 친화도에 불리한 영향을 주지 않았다는 것을 나타냈다. 이와 관련하여 측정은 인간화 구조체는 3.9 nM의 친화성을 가졌다는 것을 나타냈으며, 이는 치료적 항체에 대해 허용되는 한계 내이다. 각각의 인간화 구조체에 대한 실시예 8에 기재된 유사한 측정은 이 실시예에 나타낸 다른 기술과 함께 도 7e에 제시되며, 이는 개시된 인간화 PTK7 조절제는 치료적 항체에 대한 원하는 질을 갖는 것을 나타낸다.
실시예 10
선택된 PTK7 조절제의 에피토프 결정
비닝 데이터를 추가로 개선시키고, 상기 제시된 바와 같은 생성된 선택된 PTK7 조절제에 의해 정의된 에피토프 영역을 결정하기 위해, PTK7 ECD의 몇몇 상이한 변이체를 구축하고 발현시켰다. 더 특이적으로 PTK7 결실 돌연변이체를 다양한 PTK7 Ig 도메인을 증폭한 프라이머를 사용하여 설계하고, 이들을 합성 유전자 (DNA 2.0)로서 주문한 인간 IgG2 Fc 도메인의 상류의 BglII 제한 부위에 융합시켰다. 이들 Fc 융합 단백질을 이어서 HindIII 및 EcoRI 제한 부위를 사용하여 pEE12.4 발현 벡터 (Lonza AG) 내에 클로닝하였다. 단리된 무 내독소 플라스미드 DNA (Qiagen Inc.)를 293펙틴 (Life Technologies)을 사용하여 유착성 293 세포의 형질감염을 위해 사용하였다. 293 형질감염된 세포로부터의 상청액을 형질감염 72시간 후 수거하였다. 구체적으로 Fc 영역에 융합된 다음 결실 구조체를 설계하였다:
Figure pct00005
처음 6개의 이들 구조체에 대한 아미노산 서열이 도 8a-8f에 제시된다 (선택된 PTK7 ECD를 Fc 영역과 함께 포함함). 제7 구조체에 대한 서열은 Fc 도메인에 융합된 도 1c에 제시된 이소형 a (서열 3)의 세포외 도메인을 포함한다.
이들 구조체를 사용하여 몇몇 조절제를 정의된 Ig 도메인의 결실을 갖는 PTK7 단백질을 인식하는 그들의 능력에 대해 시험하였다. 도메인 결실 구조체의 사용을 포함하는 ELISA 검정을 통해, 그리고 표준 조건하에 수행하였다. 이와 관련하여 PTK7 Ig 도메인 Fc 융합을 염소 항-인간 IgG Fc-특이적 (Jackson Immunoresearch) 항체로 코팅된 ELISA 플레이트 상에 포획하였다. 다양한 결실 Fc 융합 단백질에 결합하는 각 뮤린 항-PTK7 항체의 능력을 이어서 HRP-표지된 염소 항-마우스 Fc-특이적 항체로 검출하였다.
이 검정을 사용하여 예시적 조절제를 특정 PTK7 Ig 도메인에 대해 지시된 것으로 식별하였다. ELISA 결과의 예는 각각의 대표적인 검출된 에피토프 또는 결합 패턴을 정의하고, 바로 아래의 표 4에 포함된다.
Figure pct00006
항-PTK7 모노클로날 항체는 몇몇 상이한 에피토프를 ELISA 검정에서의 양성 결합의 상이한 패턴을 기반으로 분명히 인식한다 (표 4 및 도 8g). 도 8g에서 조절제는 SC6보다는 6M으로서 나열되었고, SC6.2.35 및 SC6.10.2는 H2.35 및 H10.2로서 나열되었음을 주목한다. Ig 도메인 6-7 내의 에피토프에만 결합하는 항체는 없지만, 이들 2개의 도메인은 SC6.18 및 SC6.31에 의해 결합된 Ig3-7 Fc 융합 구조체의 2차/3차 구조에 기여할 수 있다 (표에는 없음). 추가로, 3개의 항체 (SC6.2.35, SC6.4.1 및 SC6.10.2)는 처음 4개의 Ig 도메인의 에피토프를 인식하며, Ig 도메인 6-7 내의 에피토프에 결합하는 항체는 없다. 처음 4개의 Ig 도메인에서 SC6.2.35는 도메인 1-2 내의 에피토프에 결합한다. SC6.4.1은 Ig 도메인 2 및 3의 경계 내의 에피토프를 인식한다. 반대로 SC6.10.2는 처음 4개의 Ig 도메인 내의 임의의 결실에 대해 민감성인 것으로 나타나며, 따라서 모든 4개의 Ig 유사 도메인은 에피토프 SC6.10.2를 정의하는데 관여할 가능성이 있다. 유사하게 일부 항체는 전장 구조체, Ig 도메인 1-7에만 결합하였으며, 이는 Ig 결실이 이들 에피토프의 결합 부위 또는 2차 구조의 일부를 방해하였을 수 있다는 것을 나타낸다. 도 8g는 추가의 항체 및 개시된 조절제의 결합 국소화를 나타내는 비교 데이터를 포함하는 이들 결합 패턴의 도식적 표현을 제공하며, 여기서 PTK7 ECD의 7개의 Ig 도메인은 블럭 형태로 제시되며, 괄호는 각각 항-PTK7 항체의 이 ECD 내의 더 자세히 설명된 에피토프 위치를 언급하기 위해 사용되었다.
실시예 11
예시적 종양 샘플에서의 PTK7 단백질 발현
이전의 실시예에서 상승된 유전자 발현 수준을 기록하고, PTK7에 대한 항체를 생성한 후, 선택된 환자 종양 집단에서의 상응하는 PTK7 단백질 발현에 대한 증거를 찾았다. 이 점에 있어서, 11개의 종양 유형으로부터의 432개의 조직 용균물, 또는 그들의 각각의 정상 인접 조직의 4개의 희석을 포함하는 역상 암 단백질 용균물 어레이 (ProteoScanTM Arrays; OriGene Technologies)를 외인성 프로모터에 의한 TP53-과발현이 없거나 또는 있는 HEK 293 세포로 이루어진 대조군과 함께 제공하였다. 이 어레이 상에서의 용균물에서의 PTK7 단백질 발현을 웨스턴 블롯에 의해 실시예 7에 제시된 바와 같이 생성되고 PTK7 단백질을 인식하는 마우스 단일클론 PTK7 항체 (예컨대 클론 SC6.2.35)를 사용하여 검출하였다. 비색적 검출 시약 및 프로토콜을 프로테오스캔 어레이스(ProteoScan Arrays)의 제조자에 의해 제공하였으며, 제작된 어레이 상의 점을 비제트스캔2 자바 소프트웨어(BZScan2 Java Software) (INSERM-TAGC)를 사용한 평판 스캐너를 사용하여 점 강도를 정량화하기 위해 디지털 영상으로 변환하였다.
이러한 검정의 결과는 PTK7 단백질의 발현은 흑색종, 비-소세포 폐 암종 (NSCLC), 소세포 폐 암종 (SCLC), 결장직장암, 췌장암, 유방암 및 난소암 환자-유래 종양 샘플의 부분집합에서 상향조절된다는 것을 나타낸다. 선택된 종양에 대한 이들 검정으로부터의 예시적 데이터는 도 9a-9d에 나타낸다. 더 구체적으로, 도 9a는 PTK7 단백질 발현은 결장직장 종양 표본의 부분집합에서 유의하게 상승된 것으로 나타나는 것을 나타내며; 특히 질환의 더 이른 단계로부터 수득된 표본으로부터의 정상 인접 조직 또는 종양 조직과 비교한 경우 단계 IV 질환을 갖는 환자에서 유의하게 상승된 것을 나타낸다. 도 9b에 나타낸 바와 같이, PTK7 단백질 발현은 또한 대부분의 신경내분비 췌장 종양, 및 각각 유방암 (도 9c) 및 난소암 (도 9d)을 갖는 환자의 부분집합에서 상승되었다. 데이터는 상기 기재된 바와 같이 생성되었으며, 점 당 평균 픽셀 강도 (점 강도)로서 나타낸다. 각각 샘플에서의 수평 흑색 막대는 각각의 범주 내의 표본에 대한 평균을 나타낸다.
이들 데이터는 상기 실시예에서의 PTK7 과발현이 결장직장암에서 TIC 및/또는 TPC와 연관된다는 관찰 및 증식 및/또는 생존과 연관될 수 있다는 것을 지지한다. a) PTK7 유전자 발현은 결장직장암에서의 TPC 세포 하위집단 및 췌장 종양에서의 TG 세포 하위집단과 대개 연관되며; b) PTK7 단백질 발현은 TIC 세포 하위집단 상에서 더 높으며; c) PTK7 단백질 발현은 늦은 단계 결장직장암으로부터의 전 종양 표본에서 상승되며; d) 일반 관찰은 TIC는 늦은 단계 종양에서 더 잦은 것을 나타내는 상기 실시예를 고려하여, PTK7은 종양 성장의 근원이 되는 이들 세포, 요법에 대한 내성 및 종양 재발에 연관된 것으로 나타나며, 이는 따라서 PTK7은 상기한 종양에서 TPC 및/또는 TIC를 지지하는데 필수적인 역할을 할 수 있다는 명제를 강화시킨다.
이들 결과를 고려하여 PTK7의 발현을 유동세포 계측법을 사용한 인간 유방 (BR), 폐 (LU), 난소 (OV), 결장 (CR), 및 신장 (KDY) 종양 이종이식의 비-종양형성성 (NTG) 및 암 줄기 세포 (CSC) 집단 내에서 평가하였다. 실시예 1에 제시된 바와 같이 NTG 및 CSC-풍부 집단이 각각 표현형 마커 CD46-/loCD324- 및 CD46hiCD324+를 사용하여 식별, 모니터링 및 농축될 수 있다. 따라서, 면역손상 마우스로부터의 인간 종양 이종이식을 시판되는 항-CD46, 항-CD324, 및 항-PTK7 (Miltenyi Biotech) 항체로 수거, 분리, 및 동시-염색하고, 이어서 CD46-/loCD324- NTG 집단 및 CD46hiCD324+ CSC 집단에서의 유동세포 계측법을 사용하여 PTK7 발현을 평가하였다. 더 특이적으로, 유동세포 계측 분석법을 BD 팍스칸토(FACSCanto)™ II 유동세포 계측기 (BD Biosciences) 상에서 표준 기술을 사용하여 수행하였으며, 염색 특이성을 확인하기 위해 이소타입을 염색하고, 형광 마이너스 원(minus one) (FMO) 제어를 사용하였다.
예시적 유방, 폐, 난소, 결장직장 및 신장 종양 샘플에 대한 결과는 도 9e에 나타내며, 여기서 이소타입 대조군은 솔리드 회색으로 표시되어 있으며, NTG 세포 집단은 마름모 선에 의해 나타내며, CSC-풍부 집단은 실선에 의해 나타낸다. 표면 PTK7 염색은 각각 이들 종양의 NTG 집단에서 상대적으로 낮은 반면, 표면 PTK7 염색은 CSC-풍부 집단에서 현저하게 상승된 것이 인정될 것이다. 이들 결과를 그 후 다수의 개시된 조절제를 사용하여 확인하고 (데이터는 나타내지 않음), 이는 시험된 25개 초과의 독특한 NTX 선 (다양한 고형 종양을 포함함)에 대해 대표적이다.
PTK7의 TPC의 다른 표면 마커와의 상관성있는 발현 패턴을 NSCLC 및 난소 암의 종양형성성 연구에서 추가로 기능적으로 기술하였다. PTK7- 및 PTK7+ 종양 집단을 상기 기재된 바와 같이 염색된 분리된 인간 종양 이종이식으로부터 형광 활성화 세포 분류 (FACS)에 의해 단리시키고, 등가 수를 마트리겔(Matrigel) (BD Biosciences)로 혼합하고, NOD/SCID 수용자 마우스 내에 피하 이식하였다. PTK7- 세포는 수용자 마우스에서 종양을 생성하는데 실패한반면, PTK7+ 종양 세포는 NSCLC 및 난소 암종 둘 다를 갖는 빠르게 성장하는 종양을 지속적으로 생성하였다. 따라서, 본원의 교시에 따라 PTK7은 TPC를 난소 암 및 NSCLC에서 기능적으로 기술하며, 진단적 및 테라그노스틱 제제로서의 개시된 조절제의 이용성에 대한추가의 증거를 제공한다.
실시예 12
선택된 PTK7 조절제는 K562 및 G401 세포에 의해 내재화된다
상기 기재된 바와 같이 마우스를 면역화시킴으로써 생성된 하이브리도마로부터의 PTK7 조절제를 K562 및 G401 세포에서 내재화하는 그들의 능력을 스크리닝하였다.
이와 관련하여, 106/mL의 출발 농도 (단일 세포 현탁액)에서의 K562 세포를 인간 트루스테인(TruStain) (Biolegend, Inc., 422302)으로 10분 동안 실온에서 블로킹하였다. 세포를 반응 당 50x103개 세포로 희석하였다. 복제 샘플을 50μL의 최종 부피를 위해 얼음 상에서 항체 상청액으로 30분 동안 염색하고, 이어서 세포를 FACS 염색 배지 (FSM; 2% 소 태아 혈청/행크의(Hank's) 완충된 식염 용액/25mM HEPES [pH7.4]; Mediatech, Inc.)로 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 이어서 당나귀 항-마우스 알렉사647(Alexa647) (Life Technologies)로 30분 동안 얼음 상에서 두 번째 염색을 하였다. 세포를 이어서 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 다시 세척하고, 내재화를 허락하기 위해 샘플을 내재화 배지 (2% 소 태아 혈청/ 이소코브의(Iscove's) 변형 둘베코 배지(Modified Dulbecco's Medium)) 중에 재현탁하고, 5% CO2 중에 37℃ (또는 대조군에 대해 4℃)에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 얼음에 전달하고 아주 찬 FSM을 첨가함으로써 반응을 중단시켰다. 내재화되지 않고, 세포 표면 상에 남은 임의의 항체를 제거하기 위해, 샘플을 낮은 pH 포스페이트 완충 식염수 (PBS [pH2.0])로 10분 동안 얼음 상에서 처리하였다. 이 "산-스트립(strip)" 단계 후, 샘플을 FSM로 광범위하게 세척하고, 2ug/ml의 DAPI(Life Technologies)를 함유하는 150μL의 FSM 중에재-현탁하고, BD 팍스 칸토 유동 세포계측기 상에서 분석하였다. 이 실험에서 얼음 상에서 인큐베이션한 세포로부터 검출된 형광의 임의의 신호 증가는 항체 내재화의 능력으로부터 야기되었으며, 이는 형광성 분자를 저 pH 포스페이트 완충제 처리 중 세포 표면으로부터 벗겨지는 것으로부터 보호한다. 모든 인큐베이션을 달리 언급하지 않는 한 FACS 염색 배지에서 수행하였다.
상기 기재된 산 스트립 프로토콜을 사용하여 PTK7 항체-함유 하이브리도마 상청액의 개별 클론을 스크리닝하는 경우, 몇몇 상청액은 형광 대 염색되지 않은 세포 및 IgG 음성 대조군 항체에서 양성 이동을 나타냈다 (도 10a 및 10b). 항체 내재화를 산 스트립핑으로부터의 알렉사647 2차 항체를 보호하는 이들 항체의 능력 및 우측으로의 형광의 이동을 야기함에 의해 입증된 바와 같이 몇몇 항-PTK7 항체로 관찰하였다. 항체 클론 SC6.10.2 (즉, 도 10c의 H10)는 이 활성을 갖는 항-PTK7 항체에 의한 전형적인 내재화 능력의 예이다. IgG 대조군에 비교하여, 대략 15%의 PTK7 항체-함유 상청액 (27 중 4)은 내재화를 유도하였다. K562 세포를 사용하여, 이 데이터는 PTK7 ECD에 결합할 수 있는 항체의 부분집합은 항원을 세포 상에 제시된 바와 같이 끌고, 효율적으로 내재화시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
추가로 증거는 개시된 조절제는 도 10d에 나타낸 바와 같이 다양한 예시적 세포주에서 내재화를 매개할 수 있다는 것을 나타낸다. 더 특이적으로 교모세포종 세포주 (G401 윌름 종양 세포)는 높은 수준의 PTK7을 발현하는 것으로 밝혀졌으며 (데이터는 나타내지 않음), 이는 이 세포주는 선택된 검정 조건하에 더 민감성일 수 있으며, 따라서 내재화를 유도할 수 있는 조절제를 더 효과적으로 식별할 수 있다는 것을 제시한다. 일반적으로 이들 세포를 상기한 산-스트립 절차와 함께 사용하여 실시예 7로부터의 170개의 독특한 하이브리도마 상청액을 이들이 내재화 항체를 함유하는지 결정하기 위해 스크리닝하였다. 상기 언급된 스크리닝에서 식별된 정제된 항체 SC6.2.35, SC6.10.2 및 SC6.25.3 (도 10d에 H2.35, H10.2 및 H25.3으로 나타냄)을 양성 대조군으로서 사용하였다 (도 10d). 6개의 예시적 상청액에 존재하는 조절제(웰 지정에 의해 식별됨)의 내재화 능력을 대조군 바로 아래 나타낸다. 이러한 더 개선된 검정으로 데이터는 상기 논의된 면역화 절차에 의해 제공된 다수의 조절제는 PTK7에 결합할 수 있고, 내재화할 수 있다는 것을 나타내지만 (1A02, 1F02, 2A03 및 2F10에 의해 입증됨), 모든 클론 (2F11 및 2F09)이 이 능력을 가진 것은 아니다.
개시된 조절제의 특성에 대한 추가의 설명에서, G401 세포에 유의한 방식으로 결합된 모든 스크리닝된 항체는 어느 정도 내재화하는 것으로 밝혀졌다 (도 10e). 도 10e의 파선에 의해 제시된 바와 같이 양성 세포 염색은 마우스 이소타입 대조군 항체를 기준으로 4%로 설정되었으며, 이는 0-3%의 세포의 비특이적 염색을 나타냈다. G401 세포 염색의 각각 항체에 대한 평균 형광 강도를 산-스트립 단계 후 (즉, 내재화 후) 37℃ 및 4℃에서 측정하고, 형광 분자의 공지된 수를 함유하는 8-피크 레이보우(Rainbow) 비드 (BD Spherotech #559123)를 사용하여 세포 당 상대적 수용체 수로 보간하였다. 내재화된 수용체의 수를 4℃에서 내재화 단계를 거치는 샘플 (대조군)로부터 수득된 수용체 수를 37℃에서의 수용체 수에서 뺌으로써 계산하였다. PTK7 특이적 항체는 세포 결합의 수준과 독립적으로 내재화된 수용체의 수에 있어서 10-배 차이를 고려하여, 내재화를 유도하는 그들의 능력에 있어서 이질성(heterogeneous)이었다는 것이 언급되었다 (도 10e의 상부 우측 사분면).
실시예 13
PTK7 조절제는 세포독성제의 전달을 촉진시킨다
항체에 안정하게 연결된 세포독성 약물의 표적화는 고형 종양을 가진 환자에 대한 큰 치료적 이득을 가질 수 있는 권한이 부여된 항체 접근법을 나타낸다. 상기 기재된 내재화 PTK7-특이적 항체가 살아있는 세포로의 세포독성제의 전달을 매개할 수 있는지 결정하기 위해, 시험관내 세포 사멸 검정을 수행하였으며, 여기서 리보솜-불활성화 단백질 사포린 (Advanced Targeting Systems)에 접합된 스트렙타비딘이 바이오티닐화된 PTK7 항체에 결합되고, 세포를 내재화시키고, 사멸시키는 이들 사포린 복합체의 능력을 세포 생존력을 측정함으로써 72시간 후 측정하였다.
구체적으로, 웰 당 1x104개의 G401 윌름 종양 세포를 96-웰 플레이트의 웰 내에 플레이팅하였다. 상기 기재된 항-PTK7 항체 형태의 PTK7 조절제를 상청액으로부터 정제하고, 바이오티닐화시키고, 이어서 20 μg/mL로 희석하였다. 항체의 분취액을, 각각, 스트렙타비딘-ZAP (Advanced Targeting Systems)와 1:1로 혼합하였고, 5초 동안 볼텍싱하고, 이어서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 항체-사포린 복합체의 3개의 추가의 계열 10-배 희석을 이어서 수행하였고, 50 μL의 각각 혼합물을, 각각, G401 세포 함유 웰에 첨가하였다. 세포/항체-사포린 혼합물을 이어서 37℃/5%CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 후, 세포를 원형-저면 96-웰 플레이트에서 스핀 다운(spun down)하고, 상청액을 제거하고, 100 μL의 신선한 배양물 배지를 각각 웰에 첨가하였다. 세포를 이어서 추가의 72시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 생존 세포 수를 제조자의 프로토콜에 따라 쎌타이터-글로(CellTiter-Glo) (Promega Inc.)를 사용하여 열거하였다.
상기 기재된 세포 사멸 검정을 사용하여, 클론 SC6.2.35, SC6.10.2 및 SC6.25.3으로부터의 항체를 포함하는 예시적 내재화 PTK7 조절제 (FIG 11a에 H2.35, H10.2 및 H25.3로 나타냄)는 사포린 독소 내재화 및 세포 사멸을 매개하는 것으로 나타났다. 보다 특히 도 11a는 비-특이적 이소타입 대조군 항체 (즉 MOPC)와 대조적으로 PTK7 매개 내재화를 통한 세포 사멸의 효과를 갖는 이들 조절제의 능력을 명백히 나타낸다. 이러한 데이터는 개시된 조절제는 PTK7에 대해 면역특이적이고, 세포독성 적재량의 전달을 효과적으로 매개할 수 있고, 세포 표면 회합을 통해 PTK7 양성 세포를 사멸시킬 수 있다는 것을 나타낸다.
상기한 사멸 검정의 연장에서 PTK7 특이적 항체를 통한 세포독성 적재량의 전달을 4개의 예시적 조절제 (SC6.23, SC6.41, SC6.51 및 SC6.58)를 더 사용하여 나타내며, SC6.10.2는 양성 대조군으로서 사용된다. 이로 인해 다음 세포 유형을 96 웰 조직 배양물 플레이트 내에 그들의 각각 배양물 배지 (웰 당 500개 세포)에 항체 및 독소의 첨가 하루 전에 플레이팅하였다: G401 윌름 종양 세포, 세포 표면 상에 PTK7 분자 (본원에 293.PTK7 세포로 나타냄)를 발현하기 위한 레트로바이러스 형질도입을 사용하여 유전자조작된 HEK293T 및 대조군으로서 기능하는 HEK293T.
이 검정을 위해 다양한 농도의 정제된 PTK7 조절제를 플레이팅된 세포를 함유하는 웰에 첨가하였다. 조절제의 첨가 후 4nM의 농도의 사포린 (Fab-ZAP, Advanced Targeting Systems, #IT-48)에 공유 연결된 고정된 양의 항-마우스 IgG Fab 단편을 웰에 첨가하고, 배양물을 72시간 동안 인큐베이션하였다. 생존 세포 수를 상기 기재된 바와 같이 쎌타이터-글로를 사용하여 결정하였다. 사포린-Fab 단편 (조절제는 갖지 않음)을 갖는 세포를 함유하는 배양물을 사용한 생 발광 계수는 100% 참조 값으로서 설정되었으며, 모든 다른 계수를 이에 따라 계산하였다 ("정규화 RLU"로 지칭됨).
이 검정을 사용하여, 모든 시험된 PTK7 항체 (이소타입 대조군 항체는 아님)는 표적 세포를 사멸시킬 수 있는 것으로 나타나며 (도 11b - 11d), 여기서 도 11b, 11c 및 11d는 G401 세포, 293.PTK7 세포 및 HEK293T 세포 각각에 대한 조절제의 영향을 나타낸다. 조절제 매개 내재화 및 사멸은 세포 유형 (도 11b - G401 세포 및 11d - HEK293T 세포를 비교함), 표적 세포 (도 11c - 293.PTK7 세포 및 11d - HEK293T 세포에 비교함)에 대한 PTK7의 발현 수준 및 다양한 조절제의 내재화하는 본질적인 능력에 의존적이라는 것이 인정될 것이다. 검정은 추가로, 내재화는 주로 추가의 가교의 필요성 없이 세포 표면에의 PTK7- 특이적 항체의 결합 때문에 발생하는 것을 입증한다. 도 11b - 11d의 용량 반응 곡선 (및 추가의 조절제에 대해 유사하게 유도된 값 - 나타내지 않음)을 생성하기 위해 사용된 데이터를 기반으로 반-최대 효과적 농도 ("EC50")를 각각의 시험된 조절제 / 표적 세포 조합에 대해 결정하였다. 더 특이적으로 바로 아래의 표 5는 바로 위에 기재된 검정을 사용하여 각각의 3개의 표적 세포에 대해 결정된 13개의 조절제에 대한 EC50 (pM)을 나열한다. ND는 값이 결정되지 않았음을 나타낸다.
Figure pct00007
사멸에 대한 일부 변형이 개별 조절제 사이에 주목된 반면, 표 5의 데이터로부터 자명한 일부 일반적 추세가 있었다. 이와 관련하여 조절제는 일반적으로 G401 세포 또는 야생형 293 세포 중 하나 보다 293 세포를 과발현하는 유전자조작된 PTK의 세포 사멸을 매개하는데 더 효과적이었다. 흥미있게도, 많은 시험된 조절제는 세포 표면 상에 PTK7을 발현하는 것으로 알려진 비-유전자조작된 G401 종양 세포의 사멸을 매개하는데 상대적으로 효과적이었다. 이러한 재현가능한 결과는 본원에 예시된 바와 같은 넓은 범위의 내재화 PTK7 조절제의 치료적 잠재력을 시사한다.
실시예 14
PTK7 조절제는 종양형성성 세포에 대한 세포독성제의 전달을 촉진시킨다
이전의 실시예의 결과를 확증하고, PTK7 조절제가 1차 인간 종양 세포의 독소 내재화 및 세포 사멸을 매개할 수 있다는 것을 입증하기 위해, 마우스 혈통-고갈된 NTX 세포 (즉 면역손상 마우스에서의 저-계대 이종이식으로서 번식된 인간 종양 세포)를 플레이팅하고 후속적으로 항-PTK7 항체 및 Fab-ZAP에 노출시켰다.
특이적으로, 폐 (LU), 난소 (OV) 암 및 흑색종 (SK) 환자로부터 유래된 NTX 종양을 단일 세포 현탁액으로 분리하고, 피라미리아(Primaria)TM 플레이트 (BD Biosciences) 상에 성장 인자 보충된 무 혈청 배지 중에 암 줄기 세포 증식을 촉진하는 흔한 당업계에서 인정된 기술을 사용하여 플레이팅하였다. 37℃/5%CO2/5%O2에서의 배양 3-5일 후 세포를 일반적으로 이전의 실시예에 제시된 이소타입 대조군 (IgG2a) 항체 또는 3개 중 1개의 뮤린 항-PTK7 항체 (0.1 nM에서의 SC6.2.35, SC6.10.2, 또는 SC6.25.1; - SC6.H2, SC6.H10 및 SC6.H25 표지됨), 및 Fab-ZAP (40nM)와 접촉시켰다. 조절제-매개 사포린 세포독성을 이어서 쎌타이터 글로를 제조자의 지침서에 따라 사용하여 남아있는 세포의 수를 정량화함으로써 5-7일 후 평가하였다. 결과를 처리되지 않은 세포에 대해 정규화하였다.
도 12에 나타낸 바와 같이 각각의 시험된 조절제에의 노출(그러나 이소타입 대조군은 아님)은 모든 종양 유형에 대해 감소된 생존 세포 수를 야기하였다. 이에 대해 세포 사멸의 양은 분명히 특이적 종양 세포주 및 특정 조절제에 대해 의존적이라는 것이 인식될 것이다. 이들 데이터는 본 발명의 조절제는 면역특이적으로 다양한 종양 유형으로부터의 다양한 항원 발현 세포와 회합될 수 있고, 내재화될 수 있고, 따라서 구성요소인 세포의 사멸을 매개할 수 있다는 것을 나타낸다. 추가로, 이전에 기재된 바와 같이 암 줄기 세포 증식을 촉진하는 조건하에 배양된 NTX 종양 세포주에 대한 이를 수행할 수 있는 개시된 조절제의 능력은 선택적으로 암 줄기 세포를 제거하는 그들의 능력을 강하게 시사한다.
실시예 15
PTK7 조절제는 암 줄기 세포 종양형성성을 감소시킨다
암 줄기 세포의 빈도를 감소시키고 그들의 종양형성성 잠재력에 영향을 주는 개시된 조절제의 능력을 추가로 확인하기 위해, NTX 유방 종양 세포를 SC6.2.35로 처리하고, 면역손상 마우스 내에 후속적으로 이식하였다.
이와 관련하여, 2명의 유방 암 환자-유래된 NTX 종양 (BR13 및 BR64)을 분리하고 인간 종양 세포를 종양형성성 세포를 유지하기 위해 당업계에 공지된 조건하에 배양하고, 이전의 실시예에 제시된 바와 같이 PTK7 조절제 (및 이소타입 대조군) 및 Fab-ZAP로 처리하였다. 세포독성을 이어서 제조자의 지침서에 따라 쎌타이터 글로를 사용하여 세포 생존력에 대해 처리 14일 후 측정하였다. 다시 결과를 비처리된 세포에 대해 정규화하였다.
각각 도 13a 및 13b에 나타낸 바와 같이 BR13 (도 13a) 및 BR64 (도 13b)로부터 유래된 유방 종양 세포를 대체로 PTK7 조절제 매개 면역특이적 회합 및 사포린 세포독성제의 내재화를 통해 제거하였다. 더 특이적으로 0.2 nM에서의 PTK7 조절제 SC6.2.35 (SC6.H2)로의 처리는 대략 70-80%의 세포의 제거를 야기한 반면, IgG2a 대조군 처리된 세포는 대체로 영향받지 않았다. 결과는 실시예 13에 제시된 결과와 일관되며, 추가로 본 발명의 다양한 종양으로부터 유래된 종양 지속 세포를 제거하는 개시된 조절제의 능력을 기반으로한 넓은 적용가능성을 입증한다.
개시된 조절제가 종양 개시 세포를 제거한다는 것을 확인하기 위해, 2개의 유방암 세포주로부터의 처리된 제제를 종양 개시 세포가 살아있는지 결정하기 위해 마우스 내에 이식하였다. 더 특이적으로, 3중 웰로부터의 세포를 각각 독립적으로 수거하고, PBS 함유 2% BSA 중에 세척하고, 100ul 중에 재현탁시키고, 이어서 일반적으로 실시예 1에 제시된 절차를 사용하여 개별 면역손상 마우스 내에 이식하였다. 마우스를 매주 종양 성장에 대해 모니터링하고, 발생한 임의의 종양을 그들의 부피를 계산하기 위해 측정하였다. IgG 대조군으로 처리된 NTX BR13 및 BR64 세포로 이식된 마우스만 종양을 발달한 반면, PTK7 조절제와 접촉된 세포 이식된 마우스는 종양을 발달하지 않았다. 이들 결과는 TIC는 독소 전달을 매개할 수 있는 PTK7 조절제에 의해 제거되었다는 것을 입증한다 (도 13c).
데이터의 검토는 유방암 세포주의 PTK7 조절제 및 사포린 중 하나로의 처리 후 남아있는 생존 세포의 이식은 종양의 형성을 야기하지 않는다는 것을 나타낸다. 반대로, 유방 암 세포주 (즉, 이소타입 대조군 항체로 처리된 세포주) 둘 다로부터의 대조군 세포는 이식 후 종양 성장을 재개시할 수 있었다. 특히, 각각 대조군 세포주 (BR22 및 BR64)로 이식된 3마리의 마우스 중 2마리는 측정가능한 종양을 발달하였으며, 이는 이식된 세포가 종양 지속 세포를 포함하였다는 것을 나타낸다. 더 유의하게, 조절제 처리된 세포의 종양을 형성하는 무능력은 이식된 세포는 종양 지속 세포를 포함하지 않았다는 것을 강하게 암시한다. 즉, PTK7 조절제 / 사포린 조합으로의 처리는 본 발명에 따른 종양 지속 세포를 선택적으로 표적하고, 제거하는 가능성이 있다. 임의의 사건에서, 이들 데이터는 개시된 조절제로의 처리가 종양 세포의 종양형성성 잠재력을 감소시키는데 효과적인 것을 입증한다.
실시예 16
인간화 PTK7 조절제는 세포독성제의 전달을 매개한다
본 발명의 바람직한 실시양태는 인간화 PTK7 조절제를 치료적 환경에서 사용할 가능성이 있음에 따라, 업무를 인간화 항-PTK7 항체 (실시예 8에 제시된 바와 같이 제작됨)는 세포독성제의 전달을 통해 세포 사멸의 효과적인 매개자로서 기능한다는 것을 입증하기 위해 수행하였다.
보다 특히, 3개의 예시적 인간화 PTK7 조절제 (hSC6.23, hSC6.58 및 hSC6.24)를 세포독성 적재량의 도입을 매개하고, 종양형성성 세포를 본원의 교시에 따라 제거하기 위해 사용하였다. 일반적으로 상기 실시예 13에 제시된 프로토콜을 사용하여 PTK7 (즉 293.PTK7 세포)을 발현하도록 유전자조작된 HEK293 세포를 선택된 조절제의 상이한 농도 및 항-인간 Fab (Fab-ZAP 인간, Advanced Targeting Systems)에 연결된 사포린에 노출시켰다. 인큐베이션 후 세포를 세척하고 조절제-매개 사포린 세포독성을 이어서 5-7일 후 제조자의 지침서에 따라 쎌타이터 글로를 사용하여 남아있는 세포의 수를 정량화함으로써 평가하였다. 결과를 비처리된 세포에 정규화하였고, 도 14에 그래프로 제시된다.
도 14에 제시한 곡선의 검사는 모든 3개의 시험된 PTK7 조절제가 세포독성 적재량 감소 세포 생존력의 내재화를 유도하는데 매우 효과적이었다는 것을 나타낸다. 이에 대해 각각의 조절제는 1 및 10 pM 사이의 농도에서의 세포 생존력의 50% 감소 및 100 pM의 농도에서의 세포 생존력의 80% 초과의 감소를 제공하였다. 다시, 본 개시에 따라 이들 데이터는 선택된 세포 집단에의 세포독성제의 전달을 면역특이적으로 매개할 수 있는 고도의 효과적인 조절제를 시사한다.
당업계 숙련자는 추가로 본 발명은 그의 목적 또는 중심적인 속성으로부터 벗어나지 않고 다른 특이적 형태에 통합될 수 있다는 것을 인정할 것이다. 이에 대해, 본 발명의 상기 기재는 그의 예시적인 실시양태만을 개시하며, 다른 변형은 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 고려된다는 것을 이해해야한다. 따라서, 본 발명은 본원에 상세히 기재된 특정 실시양태에 제한되지 않는다. 그 보다는, 본 발명의 범주 및 내용을 나타내는 부착된 특허청구범위를 참조해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> STEM CENTRX, INC. <120> NOVEL MODULATORS AND METHODS OF USE <130> 11200.0006-00304 <140> <141> <150> PCT/US2011/050451 <151> 2011-09-02 <150> 61/444,614 <151> 2011-02-18 <160> 169 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4249 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcggcgcgcg gggactcgga ggtactgggc gcgcgcggct ccggctcggg acgcctcggg 60 acgcctcggg gtcgggctcc ggctgcggct gctgctgcgg cgcccgcgct ccggtgcgct 120 ccgcctcctg tgcccgccgc ggagcgcagt ctgcgcgccc gccgtgcgcc ctcagctcct 180 tttcctgagc ccgccgcgat gggagctgcg cggggatccc cggccagacc ccgccggttg 240 cctctgctca gcgtcctgct gctgccgctg ctgggcggta cccagacagc cattgtcttc 300 atcaagcagc cgtcctccca ggatgcactg caggggcgcc gggcgctgct tcgctgtgag 360 gttgaggctc cgggcccggt acatgtgtac tggctgctcg atggggcccc tgtccaggac 420 acggagcggc gtttcgccca gggcagcagc ctgagctttg cagctgtgga ccggctgcag 480 gactctggca ccttccagtg tgtggctcgg gatgatgtca ctggagaaga agcccgcagt 540 gccaacgcct ccttcaacat caaatggatt gaggcaggtc ctgtggtcct gaagcatcca 600 gcctcggaag 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120 ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcagtac gataaactat 180 acgccatctc tgaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtac 240 ctgcaaatga gcaaagtgag atctgaggac acagcccttt attactgtgc aagaccggga 300 tatggtaacc tctttgttta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ctca 354 <210> 142 <211> 341 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 142 gacattgtga tgacacagtc tccatcctcc ctgagtgtgt cagcaggaga gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggaa atccaaagaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agaagccagg gcagcctcct aaactgttga tctacggggc atccactagg 180 ggatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggaccgattt cactcttacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttactact gtcagaatga tcatactttt 300 ccgtacacgt tcggaggggg gaccaagctg gaaataaaac g 341 <210> 143 <211> 348 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 143 gaggtgaagc ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgagactc 60 tcctgtgcag cctcaggatt cgattttagt aaagactgga tgagttgggt ccggcaggct 120 ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag acagtagtac gataaactat 180 gcaccagctc taaaggataa attcatcatc tccagagaga acgccaaaaa tacgctgtac 240 ctgcaaatga acaaagtgag atctgaggac acagcccttt attactgtgc aagatggtca 300 actgggcttg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348 <210> 144 <211> 321 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 144 gatatccaga tgacacagac tccatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcaattgca gggcaagtca gggcctcagc aattatttaa actggtatca gcagaaacca 120 gatggaactg ttaaactcct gatctactac gcatcaatat tacactcagg agtcccatca 180 aggttcactg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcac cctggagcaa 240 gaggatattg gcacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccaaac tggaaatcaa c 321 <210> 145 <211> 348 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 145 caggttcaac tgcagcagtc tggacctgag ctggtgaagc ctggggcctc agtgaagatt 60 tcctgcaagg cttctggcta tccattcagt acctcctgga tgaactgggt gaagcagagg 120 cctggaaagg gtcttgagtg gattggacgg atttatcttg gagatggaga tactaactac 180 aatgggaagt tcacgggcaa ggccacactg actgcagaca aatcctccag cacagtttac 240 atgcaactca gcagcctgac atctgaggac tctgcggtct acttctgtgc aagatggagg 300 ggtgactacg actactgggg ccaaggcacc actctcacag tctcctca 348 <210> 146 <211> 340 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 146 gacattgtga tgtcacagtc tccatcctcc ctagctgtgt cagttggaga gaaggttact 60 ctgagctgca agtccagtca gagcctttta tatagtagca ctcaaaacaa ctacttggcc 120 tggtaccagc agacaccagg gcagtctcct aaactgctga tttactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg ggacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgaaggctga agacctggca gtttattact gtcagcaata ttatagctat 300 ccgtggacgt tcggtggagg caccaagctg gaaatcaaac 340 <210> 147 <211> 354 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 147 tctgatgtgc agcttcagga gtcaggacct ggcctcgtga aaccttctca gactctgtct 60 ctcacctgct ctgtccctga ctactccatc accagtgatt atcactggca ctggatcagg 120 cagtttccag gaaacaaact ggagtggatg ggatacataa gctcaagggg tagtactaac 180 tacaacccat ctctcaaaaa tcgaatctcc atcactcatg acacatctga gaatcagttc 240 ttcctgaaat tgacttctgt gactactgag gactcagcca catattattg tgcaggcttg 300 tcccagttag ctcttgacta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 148 <211> 322 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 148 gacatcaaga tgacccagtc tccatcttcc atgtatgcat ctctaggaga gagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtca ggacatttat ccctatttaa actggttcca acaaaaacca 120 gggaaatctc ctaagaccct gatctatcgt acaaatagat tgctagatgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tggacaagat tattctctca ccatcagcag cctggactat 240 gaagatatgg gaatttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggagctgaa ac 322 <210> 149 <211> 360 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 149 caagttactc taaaagagtc tggccctggg atattgaagc cctcacagac cctcagtctg 60 acttgttctt tctctgggtt ttcactgagc acttctaata tgggtgtagg ctggattcgt 120 cagccttcag ggaagggtct ggagtggctg gcacacattt ggtgggatga tgataagtat 180 tataacccat ccctgaagag ccagctcaca atctccaagg atacctccag aaaccaggtc 240 ttcctcaaga tcaccagtgt ggacactgaa gatactgcca cttactactg tgttcgaagt 300 aactatggtt acgcctggtt tgcttactgg ggccaaggga ctctggtcac tgtctctgca 360 <210> 150 <211> 334 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 150 gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 60 atatcctgca gagccagtga aagtgttgat agctatggca aaagttttat gcactggtac 120 cagcagagac caggacagcc acccaaactc ctcatctatc gtgcatccaa cctagaatct 180 gggatccctg ccaggttcag tggcagtggg tctaggacag acttcaccct caccattaat 240 cctgtggagg ctgatgatgt tgcaacctat tactgtcaac aaagtaatga ggatccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaac 334 <210> 151 <211> 357 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 151 caggtccagt tgcagcagtc tgggcctgag gtggtgaggc ctggggtctc agtgaagatt 60 tcctgcaagg gttccggcta cacattcact gattatgctg tgcactgggt gaagctgagt 120 catgcaaaga gtctggagtg gattggagtt attagtactt acaatgatta tacatacaac 180 aaccaggatt ttaagggcaa ggccacaatg actgtagaca aatcctccag cacagcctat 240 atggaacttg ccagattgac atctgaggat tctgccatct attactgtgc aagaggtaac 300 tcctacttct atgctttgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctca 357 <210> 152 <211> 334 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 152 gacattgcgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctggggca gagggccacc 60 atttcctgca gagccagcga aagtgttgat aattctggca tttgttttgt gaactggttc 120 caacagaaac caggacagcc acccaaactc ctcatctatg ctgcatccaa ccaaggatcc 180 ggggtccctg ccaggtttag tggcagtggg tctgggacag acttcagcct caacatccat 240 cctatggaga aggatgatac tgcaatgtat ttctgtcagc aaagtaagga ggttccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaac 334 <210> 153 <211> 363 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 153 caggttcagc tgcagcagtc tggagctgag ctggcgagcc ctgggacttc agtgaagctg 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcaca ttctatggta taagctgggt gaagcagaaa 120 actggacagg gccttgagtg gattggagag atttatcctg gaagttataa tgcttactac 180 aatgacaagt tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca gatcctccag cacagcctac 240 atgcagctca gcagcctgac atctgaggac tctgccgtct atttctgtgc cagagactat 300 ggtgacccgt attactatgc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 154 <211> 334 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 154 gacattgtgc tgacacagtc tcctgcttcc ttaactgtgt ctctggggca gagggccacc 60 atctcatgca gggccagcca aagtgtcagt acatctacct ttaattatat gaactggtac 120 caacagaaac taggacagcc acccaaactc ctcatcaagt atgcatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggaggatat tgcaacatat tactgtcagc acagttggga gattccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaac 334 <210> 155 <211> 354 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 155 gaggtgaagc ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc ccagaaactc 60 tcctgtgcag cctcaggatt cgatttcagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct 120 ccagggaaag ggctagaatg gattggagaa attaatccag atagcagtac ggtaaactat 180 acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtac 240 ctgcaaatga gtaaagtgag atctgaggac acagcccttt attactgtgc aagaccggga 300 tatggtaacc tctttgttta ctggggccaa gggactctgg tcactgtctc ctca 354 <210> 156 <211> 337 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 156 gatattgtgt tgactcaggc tacaccctct gtacctgtca ctcctggaga gtcagtatcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagtctcctg catactaagg gcgacactta cttgtattgg 120 ttcctgcaga ggccaggcca gtctcctcag ctcctgatat atcggatgtc caaccttgcc 180 tcaggagtcc cagacaggtt cagtggcagt gggtcaggaa ctgttttcac actgagaatc 240 agtagagtgg aggctgagga tgtgggtgtt tattactgta tgcaacatct agaatatcca 300 ttcacgttcg gctcggggac aaagttggaa ataaaac 337 <210> 157 <211> 354 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 157 gaggttcagc tgcagcagtc tggggcagag tctgtgaggt caggggcctc agtcaagttg 60 tcctgcaccg cttctggcct caatattaaa gactactata tgcactgggt gaacctgagg 120 cctgaacagg gcctggagtg gattggatgg attgatcctg agaatggtga tactgaatat 180 gccccggagt tccagggcaa ggccactatg actgcagaca catcttccaa cacagcctac 240 ctgcagctca gcagcctgac atctgaggac actgccgtct attactgtaa tgcttgcaac 300 tacggtagtg cctacggcta ctggggccaa ggcaccactc tcacagtctc ctca 354 <210> 158 <211> 322 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 158 gaaacaactg tgacccagtc tccagcatcc ctgtccatgg ctataggaga aaaagtcacc 60 atcagatgca taaccaacac tgatattgat gatgatatga actggtacca gcagaagcca 120 ggggaacctc ctaagctcct tatttcagaa ggcaatggtc ttcgtcctgg agtcccatcc 180 cgattctcca gcagtggcta tggcacagat tttgttttta caattgaaaa catgctctca 240 gaagatgttg cagattacta ctgtttgcaa agtgataact tgcctctcac gttcggctcg 300 gggacaaagt tggaaataaa ac 322 <210> 159 <211> 360 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 159 gaggtgaagc ttctcgagtc tggaggtggc ctggtgcagc ctggaggatc cctgaaactc 60 tcctgtgcag cctcaggatt cgattttagt agatactgga tgagttgggt ccggcaggct 120 ccagggaaag gactagaatg gattggagat cttaatccag atagcagtgc gataaactat 180 acgccatctc taaaggataa attcatcatc tccagagaca acgccaaaaa tacgctgtac 240 ctgcaaatga gcaaagtgag atctgaggac acagcccttt attactgtac actcattact 300 acgttagtac cctatactat ggacttctgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 160 <211> 340 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 160 gacattgtga tgactcagtc tccatcctcc ctgactgtga cagcaggagt gaaggtcact 60 atgagctgca agtccagtca gagtctgtta aacagtggag atcaaaagaa ctgcttgact 120 tggtaccagc agaaaccagg gcagccacct aaactgttga tctactgggc atccactagg 180 gaatctgggg tccctgatcg cttcacaggc agtggatctg gaacagattt cactctcacc 240 atcagcagtg tgcaggctga agacctggca gtttattact gtcagaatga ttatagttat 300 ccgctcacgt tcggtgctgg gaccaagctg gagctgaaac 340 <210> 161 <211> 360 <212> DNA <213> Mus sp. <400> 161 gaaatacatc tggtggagtc tgggggaggc ttagtgaagc ctggagggtc cctgaaagtc 60 tcctgtgcag cctctggatt cactttcagt aggtatgcca tgtcttgggt tcgccagact 120 ccggagaaga ggctggagtg ggtcgcaacc attagtggtg gtggtcgtta cacctactat 180 ccagaccttg tgaagggtcg attcaccatc tccagagaca ttgccaggac caccctgtac 240 ctgcaaatga gcagtctgag gtctgaggac acggccatgt attactgtgc aagaacagct 300 cgggcttcga attatgctat ggactactgg ggtcaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360 <210> 162 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 162 gacatccaga tgacccagtc tccatcttcc ctgtctgcat ctgtaggaga tagagtcact 60 atcacttgca aggcgagtca ggacatttat ccctatttaa actggttcca acaaaaacca 120 gggaaagctc ctaagaccct gatctatcgt acaaatagat tgctagatgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tggaacagat tttactttca ccatcagcag cctgcaacct 240 gaagatattg caacttatta ttgtctacag tatgatgagt ttccgctcac gttcggtgct 300 gggaccaagc tggaaatcaa ac 322 <210> 163 <211> 361 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240 agcctagagc ctgaagattt tgcagtttat tactgtcagc agagtaatga ggatccgtgg 300 acgttcggtg gaggcaccaa gctggaaatc aaac 334 <210> 165 <211> 358 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 165 caggtccagc ttgtgcagtc tgggcctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcact gactatgctg tgcattgggt gcgccaggcc 120 cccggaaaaa ggcttgagtg gattggagtg atcagcactt acaatgatta cacatacaat 180 aaccaggact tcaagggcag agtcaccatg accagggaca catccgcgag cacagcctac 240 atggagctga gcagactgag atctgaagac acggctgtgt attactgtgc gagaggtaac 300 tcctacttct atgctttgga ctactggggt caaggaacct cagtcaccgt ctcctcag 358 <210> 166 <211> 337 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 166 gatattgtga tgactcagtc tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60 atctcctgca ggtctagtaa gagcctcctg catactaaag gagacaccta tttgtattgg 120 ttcctgcaga agccagggca gtctccacag ctcctgatct atcggatgtc taatcgggcc 180 tccggggtcc ctgacaggtt cagtggcagt ggatcaggca cagattttac actgaaaatc 240 agcagagtgg aggctgagga tgttggggtt tattactgta tgcaacatct agaatatcca 300 ttcacgttcg gccaggggac aaagttggaa atcaaac 337 <210> 167 <211> 355 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 167 caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtt 60 tcctgcaagg catctggata caccttcaaa gactactata tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcgaccctg aaaatggtga cacagaatac 180 gcaccggagt tccagggcag agtcaccatg accagggaca cgtccacgag cacagtctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtaa tgcttgcaac 300 tacggtagtg cctacggcta ctggggccaa ggcaccactc tcaccgtctc ctcag 355 <210> 168 <211> 322 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 168 gaaacgacac 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Claims (100)

  1. 단리된 PTK7 조절제.
  2. 제1항에 있어서, PTK7 조절제가 PTK7 길항제를 포함하는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  3. 제1항에 있어서, PTK7 조절제가 항체 또는 그의 면역반응성 단편을 포함하는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  4. 제3항에 있어서, 항체 또는 그의 면역반응성 단편이 단일클론 항체를 포함하는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  5. 제4항에 있어서, 단일클론 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  6. 제4항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 중화(neutralizing) 항체를 포함하는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  7. 제4항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 내재화(internalizing) 항체를 포함하는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  8. 제4항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 이소형 a, 이소형 b, 이소형 c 및 이소형 d로 이루어진 군으로부터 선택되는 PTK7 이소형과 회합하는 항체를 포함하는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 이소형 a와 회합하는 항체를 포함하는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 경쇄 가변 영역 및 3개의 상보성 결정 영역을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 및 경쇄 상보성 결정 영역이 도 6a 및 도 6b에 제시된 상보성 결정 영역을 포함하는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  11. 제9항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 경쇄 가변 영역이 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38, 서열 40, 서열 42, 서열 44, 서열 46, 서열 48, 서열 50, 서열 52, 서열 54, 서열 56, 서열 58 및 서열 60에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역이 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 35, 서열 37, 서열 39, 서열 41, 서열 43, 서열 45, 서열 47, 서열 49, 서열 51, 서열 53, 서열 55, 서열 57, 서열 59, 및 서열 61에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 세포독성제를 추가로 포함하는 단리된 PTK7 조절제.
  13. 제10항 또는 제11항의 단리된 PTK7 조절제의 PTK7로의 결합을 약 40% 이상 억제하는 경쟁 항체를 포함하는 단리된 PTK7 조절제.
  14. 제11항의 아미노산 중쇄 가변 영역 또는 아미노산 경쇄 가변 영역을 코딩하는 핵산.
  15. 제14항의 핵산을 포함하는 벡터.
  16. 제1항에 있어서, 서열 3에 제시된 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 단리된 PTK7 조절제.
  17. 제16항에 있어서, PTK7 조절제가 면역글로불린 불변 영역의 적어도 일부분을 추가로 포함하는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  18. 제1항에 있어서, 상기 조절제가 그를 필요로 하는 대상체에 투여시 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  19. 제18항에 있어서, 빈도의 감소가 종양 개시 세포에서 풍부한 것으로 공지된 종양 세포 표면 마커의 유동세포 분석을 사용하여 결정되는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  20. 제18항에 있어서, 빈도의 감소가 종양 개시 세포에서 풍부한 것으로 공지된 종양 세포 표면 마커의 면역조직화학적 검출을 사용하여 결정되는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  21. 제18항에 있어서, 상기 종양 개시 세포가 종양 지속 세포(tumor perpetuating cells)를 포함하는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  22. 제1항에 있어서, 세포독성제를 추가로 포함하는 단리된 PTK7 조절제.
  23. 제1항의 단리된 PTK7 조절제를 포함하는 제약 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 상기 단리된 PTK7 조절제가 단일클론 항체를 포함하는 것인 제약 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 인간화 항체를 포함하는 것인 제약 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 인간화 항체가 hSC6.23, hSC6.24, hSC6.41 및 hSC6.58로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체를 포함하는 것인 제약 조성물.
  27. 제1항에 있어서, 상기 PTK7 조절제가 pan-PTK7 조절제를 포함하는 것인 단리된 PTK7 조절제.
  28. PTK7 관련 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 PTK7 조절제를 투여하는 것을 포함하는, PTK7 관련 장애를 치료하는 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 PTK7 조절제가 PTK7 길항제를 포함하는 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 PTK7 조절제가 항체 또는 그의 면역반응성 단편을 포함하는 것인 방법.
  31. 제30항에 있어서, 항체 또는 그의 면역반응성 단편이 단일클론 항체를 포함하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 단일클론 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 경쇄 가변 영역이 서열 20, 서열 22, 서열 24, 서열 26, 서열 28, 서열 30, 서열 32, 서열 34, 서열 36, 서열 38, 서열 40, 서열 42, 서열 44, 서열 46, 서열 48, 서열 50, 서열 52, 서열 54, 서열 56, 서열 58 및 서열 60에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역이 서열 21, 서열 23, 서열 25, 서열 27, 서열 29, 서열 31, 서열 33, 서열 35, 서열 37, 서열 39, 서열 41, 서열 43, 서열 45, 서열 47, 서열 49, 서열 51, 서열 53, 서열 55, 서열 57, 서열 59, 및 서열 61에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 인간화 항체인 방법.
  35. 제31항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 중화 항체를 포함하는 것인 방법.
  36. 제31항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 내재화 항체를 포함하는 것인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 내재화 항체가 세포독성제를 포함하는 것인 방법.
  38. 제28항에 있어서, 상기 PTK7 관련 장애가 증식성 장애를 포함하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 증식성 장애가 신생물 장애를 포함하는 것인 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 신생물 장애가 고형 종양(solid tumor)을 포함하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 신생물 장애가 부신암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 결장직장암, 췌장암, 전립선암 또는 유방암을 포함하는 것인 방법.
  42. 제39항에 있어서, 상기 신생물 장애가 혈액 악성종양을 포함하는 것인 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 혈액 악성종양이 백혈병 또는 림프종을 포함하는 것인 방법.
  44. 제39항에 있어서, 상기 신생물 장애를 겪고 있는 대상체가 종양 개시 세포를 포함하는 종양을 나타내는 것인 방법.
  45. 제44항에 있어서, 상기 대상체에서 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  46. 제45항에 있어서, 빈도의 감소가 종양 개시 세포에서 풍부한 것으로 공지된 종양 세포 표면 마커의 유동세포 분석 또는 종양 개시 세포에서 풍부한 것으로 공지된 종양 세포 표면 마커의 면역조직화학적 검출을 사용하여 결정되는 것인 방법.
  47. 제45항에 있어서, 빈도의 감소가 시험관내 또는 생체내 제한 희석법(limiting dilution analysis)을 사용하여 결정되는 것인 방법.
  48. 제47항에 있어서, 빈도의 감소가 살아있는 인간 종양 세포를 면역손상(immunocompromised) 마우스 내로 이식하는 것을 포함하는 생체내 제한 희석법을 사용하여 결정되는 것인 방법.
  49. 제48항에 있어서, 생체내 제한 희석법을 사용하여 결정되는 빈도의 감소가 푸아송(Poisson) 분포 통계를 사용하여 종양 개시 세포 빈도를 정량화하는 것을 포함하는 것인 방법.
  50. 제47항에 있어서, 빈도의 감소가 살아있는 인간 종양 세포를 시험관내 콜로니 지지 조건(colony supporting conditions)으로 제한 희석 침착시키는 것을 포함하는 시험관내 제한 희석법을 사용하여 결정되는 것인 방법.
  51. 제50항에 있어서, 시험관내 제한 희석법을 사용하여 결정되는 빈도의 감소가 푸아송 분포 통계를 사용하여 종양 개시 세포 빈도를 정량화하는 것을 포함하는 것인 방법.
  52. 제28항에 있어서, 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  53. 제28항에 있어서, 상기 PTK7 조절제가 서열 3에 제시된 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 것인 방법.
  54. 제28항에 있어서, 상기 PTK7 조절제가 pan-PTK7 조절제를 포함하는 것인 방법.
  55. 종양 개시 세포의 빈도 감소를 필요로 하는 대상체에게 PTK7 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 종양 개시 세포의 빈도를 감소시키는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 종양 개시 세포가 종양 지속 세포를 포함하는 것인 방법.
  57. 제56항에 있어서, 상기 종양 지속 세포가 CD44+ 또는 CD133+ 세포인 방법.
  58. 제55항에 있어서, 상기 PTK7 조절제가 항체를 포함하는 것인 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체를 포함하는 것인 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 세포독성제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  61. 제55항에 있어서, 대상체가 부신암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 결장직장암, 췌장암, 전립선암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 신생물 장애를 겪고 있는 것인 방법.
  62. 제55항에 있어서, 종양 개시 세포의 빈도가 10% 이상 감소되는 것인 방법.
  63. 제55항에 있어서, 빈도의 감소가 종양 개시 세포에서 풍부한 것으로 공지된 종양 세포 표면 마커의 유동세포 분석 또는 종양 개시 세포에서 풍부한 것으로 공지된 종양 세포 표면 마커의 면역조직화학적 검출을 사용하여 결정되는 것인 방법.
  64. 혈액 악성종양을 겪고 있는 대상체에게 PTK7 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체를 치료하는 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 PTK7 조절제가 단일클론 항체를 포함하는 것인 방법.
  66. 대상체에게 PTK7 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, 항암제를 사용하는 치료에서 대상체의 종양을 감작시키는(sensitizing) 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 PTK7 조절제가 항체를 포함하는 것인 방법.
  68. 제66항에 있어서, 상기 종양이 고형 종양인 방법.
  69. 제66항에 있어서, 상기 항암제가 화학요법제를 포함하는 것인 방법.
  70. 제66항에 있어서, 상기 항암제가 면역요법제를 포함하는 것인 방법.
  71. a. 과증식성 장애의 진단을 필요로 하는 대상체로부터 조직 샘플을 얻는 단계;
    b. 조직 샘플을 하나 이상의 PTK7 조절제와 접촉시키는 단계; 및
    c. 샘플과 결합된 PTK7 조절제를 검출하거나 또는 정량화하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 과증식성 장애를 진단하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, PTK7 조절제가 단일클론 항체를 포함하는 것인 방법.
  73. 제72항에 있어서, 항체가 리포터와 작동가능하게 결합되는 것인 방법.
  74. PTK7 조절제를 포함하는 저장기(receptacle) 및 상기 PTK7 조절제를 사용하여 PTK7 관련 장애를 치료하거나 또는 진단하기 위한 지침서를 포함하는, PTK7 관련 장애를 진단하거나 또는 치료하는데 유용한 제조품.
  75. 제74항에 있어서, 상기 PTK7 조절제가 단일클론 항체인 제조품.
  76. 제74항에 있어서, 저장기가 판독가능한 플레이트를 포함하는 것인 제조품.
  77. 치료 유효량의 하나 이상의 내재화 PTK7 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, 신생물 장애를 겪고 있는 대상체를 치료하는 방법.
  78. 제77항에 있어서, 상기 PTK7 조절제가 항체를 포함하는 것인 방법.
  79. 제78항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체를 포함하는 것인 방법.
  80. 제79항에 있어서, 단일클론 항체가 세포독성제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  81. 제80항에 있어서, 항암제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  82. 치료 유효량의 1종 이상의 중화 PTK7 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, 신생물 장애를 겪고 있는 대상체를 치료하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 PTK7 조절제가 항체를 포함하는 것인 방법.
  84. 제83항에 있어서, 상기 항체가 단일클론 항체를 포함하는 것인 방법.
  85. 제84항에 있어서, 상기 단일클론 항체가 인간화 항체를 포함하는 것인 방법.
  86. 제85항에 있어서, 상기 인간화 항체가 세포독성제를 추가로 포함하는 것인 방법.
  87. 제82항에 있어서, 신생물 장애가 부신암, 방광암, 자궁경부암, 자궁내막암, 신장암, 간암, 폐암, 난소암, 결장직장암, 췌장암, 전립선암 및 유방암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  88. 종양 개시 세포를 PTK7 조절제와 접촉시키는 단계를 포함하는, 상기 종양 개시 세포의 집단을 식별하거나, 단리하거나, 분획화하거나 또는 풍부화하는 방법.
  89. 제88항에 있어서, 상기 PTK7 조절제가 항체를 포함하는 것인 방법.
  90. 인간화 항체를 포함하는 PTK7 조절제이며, 인간화 항체가 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 포함하고, 여기서 상기 경쇄 가변 영역은 서열 62, 서열 64, 서열 66 및 서열 68에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역은 서열 63, 서열 65, 서열 67 및 서열 69에 제시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 60% 이상 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 것인, PTK7 조절제.
  91. 제약상 유효량의 PTK7 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, 전이의 억제 또는 예방을 필요로 하는 대상체에서 전이를 억제하거나 또는 예방하는 방법.
  92. 제91항에 있어서, 대상체가 PTK7 조절제의 투여 전 또는 후에 용적축소(debulking) 절차를 받는 것인 방법.
  93. 제92항에 있어서, 상기 용적축소 절차가 하나 이상의 항암제를 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
  94. 제약상 유효량의 PTK7 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, 유지 요법의 수행을 필요로 하는 대상체에서 유지 요법을 수행하는 방법.
  95. 제94항에 있어서, 상기 대상체가 신생물 장애에 대해 PTK7 조절제의 투여 전에 치료된 것인 방법.
  96. PTK7 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, 과증식성 장애를 겪고 있는 대상체에서 종양 개시 세포를 고갈시키는 방법.
  97. PTK7 조절제를 투여하는 단계를 포함하는, PTK7 관련 장애의 진단, 검출 또는 모니터링을 필요로 하는 대상체에서 PTK7 관련 장애를 생체내 진단하거나, 검출하거나 또는 모니터링하는 방법.
  98. 순환성 종양 세포를 PTK7 조절제와 접촉시키는 단계를 포함하는, PTK7 관련 장애의 진단, 검출 또는 모니터링을 필요로 하는 대상체에서 PTK7 관련 장애를 생체내 진단하거나, 검출하거나 또는 모니터링하는 방법.
  99. 제98항에 있어서, 상기 접촉 단계가 생체내에서 발생하는 것인 방법.
  100. 제98항에 있어서, 상기 접촉 단계가 시험관내에서 발생하는 것인 방법.
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