ES2829206T3 - Moduladores novedosos y procedimientos de uso - Google Patents

Abstract

Anticuerpo humano humanizado o recombinante, injertado con CDR, quimérico, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a la PTK7 humana y que comprende regiones variables de las cadena ligeras y pesadas, en el que: (a) la región variable de cadena ligera comprende tres CDR expuestas como residuos 24-34 de la SEQ ID NO: 62 para la CDR1 de VL, residuos 50-56 de la SEQ ID NO: 62 para la CDR2 de VL y residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 62 para la CDR3 de VL, y la región variable de cadenas pesada comprende tres CDR expuestas como residuos 31-35 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR1 de VH, residuos 50-65 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR2 de VH y residuos 95-102 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR3 de VH, en el que la numeración de las CDR es según Kabat; (b) la región variable de cadena ligera comprende tres CDR expuestas como residuos 23-34 de la SEQ ID NO: 62 para la CDR1 de VL, residuos 50-56 de la SEQ ID NO: 62 para la CDR2 de VL y residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 62 para la CDR3 de VL, y la región variable de cadena pesada comprende tres CDR expuestas como residuos 26- 32 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR1 de VH, residuos 50-58 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR2 de VH y residuos 95-102 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR3 de VH, en el que la numeración de las CDR es según Chothia; o (c) la región variable de cadena ligera comprende tres CDR expuestas como residuos 30-36 de la SEQ ID NO: 62 para la CDR1 de VL, residuos 46-55 de la SEQ ID NO: 62 para la CDR2 de VL y residuos 89-96 de la SEQ ID NO: 62 para la CDR3 de VL, y la región variable de cadena pesada comprende tres CDR expuestas como residuos 30- 35 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR1 de VH, residuos 47-58 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR2 de VH y residuos 93-101 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR3 de VH, en el que la numeración de las CDR es según MacCallum.

Description

DESCRIPCIÓN

Moduladores novedosos y procedimientos de uso

CAMPO DE LA INVENCIÓN

[0001] Esta solicitud se refiere en general a composiciones novedosas y procedimientos de uso de las mismas para prevenir, tratar o mejorar trastornos hiperproliferativos y cualquier expansión, recidiva, recaída o metástasis de los mismos. En términos generales, la presente descripción se refiere al uso de moduladores de la proteína tirosina cinasa 7 (PTK7), lo que incluye anticuerpos anti-PTK7 y construcciones de fusión, para el tratamiento, el diagnóstico o la profilaxis de trastornos neoplásicos. Los casos particularmente preferidos de la presente descripción contemplan el uso de tales moduladores de la PTK7 para el tratamiento inmunoterápico de neoplasias malignas que comprende una reducción en la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

[0002] La diferenciación celular y proliferación celular de citoblastos y células progenitoras son procesos en curso normales que actúan de manera conjunta para mantener el crecimiento tisular durante la organogénesis y el reemplazo y la reparación celular de la mayoría de los tejidos durante la vida de todos los organismos vivos. Las decisiones de diferenciación y proliferación a menudo están controladas por numerosos factores y señales que están equilibrados para mantener las decisiones del destino celular y la arquitectura tisular. La arquitectura tisular normal es mantenida en gran medida por células que responden a señales microambientales que regulan la división celular y la maduración tisular. Por consiguiente, la proliferación y diferenciación celular normalmente se producen solo según sea necesario para el reemplazo de células dañadas o moribundas o para el crecimiento. Desafortunadamente, la alteración de la proliferación y/o diferenciación celular puede ser consecuencia de multitud de factores que incluyen, por ejemplo, la falta o exceso de abundancia de diversos compuestos químicos de transducción de señales, la presencia de microentornos alterados, las mutaciones genéticas o alguna combinación de los mismos. Cuando se interrumpe o altera de algún modo la proliferación y/o diferenciación celular normal, esto puede conducir a diversas enfermedades o trastornos que incluyen trastornos hiperproliferativos tales como el cáncer.

[0003] Los tratamientos convencionales para el cáncer incluyen quimioterapia, radioterapia, cirugía, inmunoterapia (p. ej., modificadores de la respuesta biológica, vacunas o agentes terapéuticos dirigidos) o combinaciones de los mismos. Lamentablemente, demasiados cánceres no son sensibles o son mínimamente sensibles a tales tratamientos convencionales, lo que deja pocas opciones a los pacientes. Por ejemplo, en algunos pacientes, ciertas neoplasias malignas presentan mutaciones genéticas que las hacen insensibles al tratamiento a pesar de la eficacia general de las terapias seleccionadas. Asimismo, en función del tipo de cáncer, algunos tratamientos disponibles, tal como la cirugía, pueden ser alternativas no viables. Las limitaciones inherentes de los agentes terapéuticos de referencia actuales son particularmente evidentes cuando se intenta tratar a pacientes que se han sometido a tratamientos anteriores y posteriormente han sufrido una recaída. En tales casos, las pautas terapéuticas fallidas y el deterioro de los pacientes resultante pueden contribuir a la aparición de tumores resistentes al tratamiento que se presentan a menudo como una enfermedad relativamente agresiva que, en última instancia, resulta ser incurable. Aunque se han producido grandes mejoras en el diagnóstico y tratamiento del cáncer a lo largo de los años, las tasas de supervivencia totales para muchos tumores sólidos han permanecido en gran medida invariables debido al fracaso de las terapias existentes para impedir la recaída, recidiva tumoral y metástasis. Por tanto, el desarrollo de terapias más dirigidas y potentes sigue siendo un reto.

[0004] Un área de investigación prometedora implica el uso de agentes terapéuticos dirigidos para perseguir las células “simiente” tumorigénicas que parecen subyacer a muchas neoplasias malignas. Para ello, actualmente se sabe que la mayoría de los tejidos sólidos contienen poblaciones de citoblastos histoespecíficos adultos que generan los tipos de células diferenciadas que comprenden la mayoría de ese tejido. Los tumores que aparecen en estos tejidos consisten igualmente en poblaciones heterogéneas de células que también provienen de los citoblastos, pero que difieren notablemente en su proliferación y organización general. Aunque se reconoce cada vez más que la mayoría de las células tumorales tienen una capacidad limitada para proliferar, una población minoritaria de células cancerosas (habitualmente conocidas como citoblastos cancerosos o CSC) tiene la capacidad exclusiva de autorrenovarse ampliamente, permitiendo de ese modo una capacidad de reiniciación tumoral inherente. Más específicamente, la hipótesis de los citoblastos cancerosos propone que hay un subconjunto inconfundible de células (es decir, CSC) dentro de cada tumor (aproximadamente 0,1-10 %) que es capaz de autorrenovación indefinida y de generar células tumorales progresivamente limitadas en su capacidad de replicación como resultado de la diferenciación a células progenitoras tumorales y, posteriormente, a células tumorales terminalmente diferenciadas.

[0005] En los últimos años, se ha hecho más evidente que estos CSC (también conocidos como células perpetuadoras de tumores o TPC) podrían ser más resistentes a los agentes quimioterápicos tradicionales o la radiación y, por tanto, persistir después de las terapias de referencia convencionales para estimular posteriormente el crecimiento de tumores resistentes al tratamiento, tumores secundarios y favorecer la metástasis. A este respecto, los citoblastos cancerosos se han visto implicados en el fomento del potencial migratorio e invasivo de diversas neoplasias. Asimismo, los indicios crecientes sugieren que las vías que regulan la organogénesis y/o la autorrenovación de los citoblastos histoespecíficos normales se desregulan o alteran en los CSC, lo que da como resultado la expansión continua de células cancerosas autorrenovables y la formación de tumores. Véase, en general, Al-Hajj y col., 2004, PMID: 15378087; y Dalerba y col., 2007, PMID: 17548814.

[0006] Por tanto, la eficacia de los procedimientos de tratamiento tradicionales, así como de los dirigidos más recientes, se ha visto aparentemente limitada por la existencia y/o aparición de células cancerosas resistentes que son capaces de perpetuar el cáncer incluso ante estos procedimientos de tratamiento distintos. Huff y col., European Journal of Cancer 42: 1293-1297 (2006) y Zhou y col. Nature Reviews Drug Discovery 8: 806-823 (2009).

[0007] Tales observaciones son confirmadas por la incapacidad constante de los agentes reductores del tamaño tumoral tradicionales para aumentar sustancialmente la supervivencia de los pacientes cuando padecen tumores sólidos, y por el desarrollo de una comprensión cada vez más sofisticada de cómo crecen, recidivan y metastatizan los tumores. Por consiguiente, las estrategias recientes para tratar trastornos neoplásicos han reconocido la importancia de eliminar, agotar, silenciar o favorecer la diferenciación de las células perpetuadoras de tumores para reducir la posibilidad de recidiva tumoral o metástasis que conduce a la recaída de los pacientes.

[0008] Los esfuerzos para desarrollar tales estrategias han incorporado trabajos recientes que implican modelos de xenoinjertos no tradicionales (NTX), donde las muestras de tumores sólidos primarios humanos se implantan y someten a pases exclusivamente en ratones inmunodeprimidos. En numerosas neoplasias malignas, tales técnicas confirman la existencia de una subpoblación de células con la singular capacidad de generar tumores heterogéneos y estimular su crecimiento indefinidamente. Como se hipotetizó anteriormente, el trabajo en modelos de NTX ha confirmado que las subpoblaciones identificadas de CSC de las células tumorales parecen más resistentes a tratamientos de reducción del tamaño tumoral tales como la quimioterapia y la radiación, lo que explica posiblemente la disparidad entre las tasas de respuesta clínica y la supervivencia general. Además, el empleo de modelos de NTX en la investigación de los CSC ha provocado un cambio fundamental en el descubrimiento de fármacos y la evaluación preclínica de fármacos potenciales que puede conducir a terapias dirigidas a los CSC que tengan un impacto importante sobre la recidiva y metástasis tumoral, mejorando de ese modo las tasas de supervivencia de los pacientes. Aunque se han hecho progresos, las dificultades técnicas inherentes asociadas a la manipulación de tejido tumoral primario y/o de xenoinjertos, junto con la falta de plataformas experimentales para caracterizar la identidad y el potencial de diferenciación de los CSC, plantean retos importantes. Como tal, sigue existiendo una necesidad importante de dirigirse selectivamente a los citoblastos cancerosos y de desarrollar compuestos o procedimientos de diagnóstico, profilácticos o terapéuticos que se puedan usar en el tratamiento, la prevención y/o el tratamiento de trastornos hiperproliferativos.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0009] La invención es como se define en las reivindicaciones.

[0010] Estos y otros objetivos son contemplados por la presente descripción que, en términos generales, se refiere a procedimientos, compuestos, composiciones y artículos de fabricación que se pueden usar en el tratamiento de trastornos asociados a la PTK7 (p. ej., trastornos hiperproliferativos o trastornos neoplásicos). Para ello, la presente descripción proporciona moduladores de la proteína tirosina cinasa 7 (o PTK7) novedosos que se dirigen eficazmente a las células tumorales y/o los citoblastos cancerosos y se pueden usar para tratar a pacientes que padecen un amplio abanico de neoplasias malignas. Como se comentará más pormenorizadamente en esta memoria, actualmente hay varias isoformas de la PTK7 conocidas y los moduladores descritos comprenden preferentemente, o se asocian con, una o más de las mismas. Asimismo, en ciertos casos, los moduladores de la PTK7 descritos pueden comprender cualquier compuesto que reconoce, compite, agoniza, antagoniza, interactúa, se une o se asocia con un polipéptido o gen de PTK7 (o fragmento de los mismos) y modula, ajusta, altera, cambia o modifica el impacto de la proteína PTK7 sobre una o más vías fisiológicas. Por tanto, en términos generales, la presente descripción se refiere en general a moduladores de la PTK7 aislados y al uso de los mismos. En casos preferidos, la descripción se refiere más particularmente a moduladores de la PTK7 aislados que comprenden anticuerpos (es decir, anticuerpos que se unen, reaccionan o se asocian inmunopreferentemente con al menos una isoforma de la PTK7). Asimismo, como se comenta ampliamente más adelante, tales moduladores se pueden usar para proporcionar composiciones farmacéuticas útiles para la profilaxis, el diagnóstico o el tratamiento de trastornos proliferativos.

[0011] En casos seleccionados de la descripción, los moduladores de la PTK7 pueden comprender un polipéptido de PTK7 o fragmentos del mismo, indistintamente en forma aislada o fusionados o asociados con otros restos (p. ej., Fc-PTK7, PEG-PTK7 o PTK7 asociada con un resto de guiado). En otros casos seleccionados, los moduladores de la PTK7 pueden comprender antagonistas de la PTK7 que, a los efectos de la presente solicitud, se debe entender que significan cualquier construcción o compuesto que reconoce, compite, interacciona, se une o se asocia con la PTK7 y neutraliza, elimina, reduce, sensibiliza, reprograma, inhibe o controla el crecimiento de células neoplásicas, lo que incluye células iniciadoras de tumores. En casos preferidos, los moduladores de la PTK7 de la presente descripción comprenden anticuerpos anti-PTK7, o fragmentos o derivados de los mismos, que se ha descubierto inesperadamente que silencian, neutralizan, reducen, disminuyen, agotan, moderan, merman, reprograman, eliminan o inhiben de otro modo la capacidad de las células iniciadoras de tumores para propagar, mantener, expandir, proliferar o facilitar de otro modo la supervivencia, recidiva, regeneración y/o metástasis de células neoplásicas. En realizaciones particularmente preferidas, los anticuerpos o fragmentos inmunorreactivos se pueden asociar a, o conjugar con, uno o más agentes anticancerígenos (p. ej., un agente citotóxico).

[0012] En casos seleccionados, los moduladores de la PTK7 pueden comprender un anticuerpo que tiene una región variable de las cadenas ligeras y una región variable de las cadenas pesadas donde dicha región variable de las cadenas ligeras comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos como se exponen en la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 58 y SEQ ID NO: 60 y donde dicha región variable de las cadenas pesadas comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos como se exponen en la SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 59 y SEQ ID NO: 61.

[0013] Evidentemente, a la vista de la presente descripción, los expertos en la materia podrían identificar fácilmente las CDR asociadas a cada una de las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras antes mencionadas y usar esas CDR para genomanipular o fabricar anticuerpos quiméricos, humanizados o injertados con CDR sin necesidad de experimentación excesiva. Como tal, en casos seleccionados, la presente descripción se refiere a anticuerpos anti-PTK7 que comprenden una o más CDR de una secuencia de la región variable expuesta en la FIG.

6A o FIG. 6B. En casos preferidos, tales anticuerpos comprenderán anticuerpos monoclonales y, en casos aún más preferidos, comprenderán anticuerpos quiméricos, injertados con CDR o humanizados. Como se comenta más pormenorizadamente más adelante, otros casos más comprenderán tales anticuerpos conjugados o asociados con uno o más agentes citotóxicos.

[0014] Por consiguiente, en otros casos, la presente descripción comprenderá un modulador de la PTK7 humanizado seleccionado del grupo que consiste en hSC6.23, hSC6.24, hSC6.41 y hSC6.58. Otros casos más se refieren a un modulador de la PTK7 que comprende un anticuerpo humanizado donde dicho anticuerpo humanizado comprende una región variable de las cadenas ligeras y una región variable de las cadenas pesadas donde dicha región variable de las cadenas ligeras comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos como se exponen en la SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66 y SEQ ID NO: 68 y donde dicha región variable de las cadenas pesadas comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 60 % de identidad con una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las secuencias de aminoácidos como se exponen en la SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67 y SEQ ID NO: 69.

[0015] Como se ha indicado anteriormente, un aspecto de la invención comprende la asociación inesperada de polipéptidos de PTK7 a citoblastos cancerosos. Por tanto, en ciertas otras realizaciones, la descripción comprenderá un modulador de la PTK7 que reduce la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores tras la administración a un sujeto. Preferentemente, la reducción de la frecuencia se determinará usando análisis de dilución limitante in vitro o in vivo. En casos particularmente preferidos, tales análisis se pueden realizar usando análisis de dilución limitante in vivo que comprenden el trasplante de células tumorales humanas vivas a ratones inmunodeprimidos. Alternativamente, los análisis de dilución limitante se pueden realizar usando análisis de dilución limitante in vitro que comprenden la deposición de diluciones limitantes de células tumorales humanas vivas en condiciones compatibles con las colonias in vitro. En cualquier caso, el análisis, cálculo o cuantificación de la reducción de la frecuencia comprenderá preferentemente el uso de modelos estadísticos de distribución de Poisson para proporcionar un recuento exacto. Se apreciará que, aunque se prefieren tales procedimientos de cuantificación, también se puede usar otra metodología menos laboriosa, tal como citometría de flujo o la inmunohistoquímica, para proporcionar los valores deseados y, por consiguiente, se contempla expresamente como dentro del alcance de la presente descripción. En tales casos, la reducción de la frecuencia se puede determinar usando análisis citométrico de flujo o detección inmunohistoquímica de marcadores superficiales de las células tumorales que se sabe que se enriquecen en las células iniciadoras de tumores.

[0016] Como tal, otro caso preferido de la presente descripción comprende un procedimiento para tratar un trastorno asociado a la PTK7 que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de la PTK7 a un sujeto con necesidad del mismo de manera que la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores se reduce. Preferentemente, el trastorno asociado a la PTK7 comprende un trastorno neoplásico. De nuevo, la reducción en la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores se determinará preferentemente usando análisis de dilución limitante in vitro o in vivo.

[0017] A este respecto, se apreciará que la presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que los inmunógenos de PTK7 se asocian con las células perpetuadoras de tumores (es decir, citoblastos cancerosos) implicadas en la etiología de diversas neoplasias. Más específicamente, la presente solicitud demuestra inesperadamente que la administración de diversos moduladores de las PTK7 ejemplares puede mediar, reducir, agotar, inhibir o eliminar la transducción de señales tumorigénicas por las células iniciadoras de tumores (es decir, reducir la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores). Esta transducción de señales reducida, ya sea por agotamiento, neutralización, reducción, eliminación, reprogramación o silenciamiento de las células iniciadoras de tumores o modificando la morfología de las células tumorales (p. ej., diferenciación inducida, alteración del nicho), permite a su vez el tratamiento más eficaz de trastornos asociados a la PTK7 inhibiendo la tumorigénesis, el mantenimiento, la expansión y/o la metástasis y recidiva tumoral.

[0018] Además de la asociación antes mencionada con los citoblastos cancerosos, hay indicios de que las isoformas de la PTK7 pueden estar implicadas en la angiogénesis, la migración de células endoteliales y las cascadas de transducción de señales de desarrollo específicas que se han vinculado a la oncogénesis (es decir, vías de transducción de señales Wnt). La intervención en tales interacciones celulares, usando los moduladores de la PTK7 novedosos descritos en esta memoria, puede mejorar o tratar de ese modo un trastorno mediante más de un mecanismo (es decir, reducción de las células iniciadoras de tumores y alteración de la transducción de señales de la vía oncogénica) para proporcionar efectos aditivos o sinérgicos. Otros casos preferidos más pueden se beneficiar de la internalización celular de la PTK7 de la superficie celular para administrar un agente anticancerígeno mediada por moduladores. A este respecto, se apreciará que la presente descripción no está limitada por ningún mecanismo de acción particular, sino que abarca el uso en términos generales de los moduladores descritos para tratar trastornos asociados a la PTK7 (que incluyen diversas neoplasias).

[0019] Por tanto, otras facetas de la presente descripción aprovechan la capacidad de los moduladores descritos para alterar potencialmente las vías de supervivencia oncogénica a la vez que silencian las células iniciadoras de tumores. Tales moduladores de la PTK7 multiactivos (p. ej., antagonistas de la PTK7) pueden resultar particularmente eficaces cuando se usan en combinación con agentes anticancerígenos o agentes reductores del tamaño de los tumores de referencia. Por consiguiente, los casos preferidos de la presente descripción comprenden el uso de los moduladores descritos como agentes antimetastásicos para la terapia de mantenimiento posterior a los tratamientos iniciales. Además, se pueden usar en combinación con dos o más antagonistas de la PTK7 (p. ej., anticuerpos que se unen específicamente a dos epítopos distintos sobre la PTK7) según las presentes enseñanzas. Asimismo, como se comenta pormenorizadamente más adelante, los moduladores de la PTK7 de la presente descripción se pueden usar en estado conjugado o no conjugado y, opcionalmente, como un agente sensibilizante en combinación con un abanico de agentes anticancerígenos químicos o biológicos.

[0020] Por consiguiente, otro caso preferido de la presente descripción comprende un procedimiento para sensibilizar un tumor en un sujeto para el tratamiento con un agente anticancerígeno que comprende la etapa de administrar un modulador de la ^pTK7 a dicho sujeto. Otros casos comprenden un procedimiento para reducir la metástasis después del tratamiento que comprende administrar un modulador de la PTK7 a un sujeto con necesidad del mismo. En un aspecto particularmente preferido de la descripción, el modulador de la PTK7 dará como resultado específicamente una reducción de la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores como se determina usando análisis de dilución limitante in vitro o in vivo.

[0021] Los casos preferidos más generalmente de la descripción comprenden un procedimiento para tratar un trastorno asociado a la PTK7 en un sujeto con necesidad del mismo que comprende la etapa de administrar un modulador de la PTK7 al sujeto. En casos particularmente preferidos, el modulador de la PTK7 se asociará (p. ej., conjugará) con un agente anticancerígeno. En otros casos más, el modulador de la PTK7 se internalizará después de la asociación o unión con la PTK7 sobre, o cerca de, la superficie de la célula. Asimismo, los aspectos beneficiosos de la presente invención, que incluyen cualquier alteración de las vías de transducción de señales y beneficios colaterales, se pueden conseguir si el tejido tumoral del sujeto presenta niveles elevados de PTK7 o niveles reducidos o bajos de PTK7 en comparación con el tejido adyacente normal.

[0022] En otro aspecto más, la presente descripción comprenderá un procedimiento para tratar a un sujeto que padece un trastorno neoplásico que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador de la PTK7 internalizante. Los casos preferidos comprenderán la administración de moduladores de anticuerpos internalizantes donde, en otros casos seleccionados, los moduladores de anticuerpos internalizantes están conjugados o asociados con un agente citotóxico.

[0023] Otros casos se refieren a un procedimiento para tratar a un sujeto que padece un trastorno asociado a la PTK7 que comprende la etapa de administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de al menos un modulador de la PTK7 reductor.

[0024] En otro caso más, la presente descripción proporciona procedimientos de terapia de mantenimiento donde los efectores o moduladores descritos se administran a lo largo de un periodo de tiempo después de un procedimiento inicial (p. ej., quimioterápico, radiación o cirugía) diseñado para retirar al menos una porción de la masa tumoral. Tales pautas terapéuticas se pueden administrar a lo largo de un periodo de semanas, un periodo de meses o incluso un periodo de años, donde los moduladores de la PTK7 pueden actuar profilácticamente para inhibir la metástasis y/o recidiva tumoral. En otros casos más, los moduladores descritos se pueden administrar junto con tratamientos de reducción del tamaño tumoral conocidos para impedir o retardar la metástasis, el mantenimiento o la recidiva tumoral.

[0025] Se apreciará además que los moduladores de la PTK7 de la presente descripción se pueden fabricar y seleccionar para que reaccionen con una única isoforma de la PTK7 o unas cuantas isoformas seleccionadas (es decir, proporcionadas por variantes de corte y empalme) de la proteína o, por el contrario, pueden comprender un panmodulador de la ^pTK7 que reacciona o se asocia con algunas o todas las isoformas de la PTK7 (actualmente se han identificado cinco). Más específicamente, como se describe en esta memoria, se pueden generar y seleccionar moduladores preferidos, tales como anticuerpos, para que reaccionen con dominios presentados por variantes de corte y empalme únicas (p. ej., en uniones de exones específicas) o con dominios de Ig que se conservan en múltiples, o en todas las, isoformas de la PTK7. Esto es significativo en lo que respecta a la presente invención porque ciertas isoformas se pueden expresar preferentemente sobre las TIC y, por lo tanto, pueden actuar como dianas terapéuticas para permitir la reducción selectiva de la frecuencia de aparición de células tumorigénicas y/o el agotamiento de las poblaciones de citoblastos cancerosos.

[0026] Por consiguiente, en un caso seleccionado, la descripción comprende un panmodulador de la PTK7. En otros casos seleccionados, la descripción comprende un modulador de la PTK7 que se asocia inmunoespecíficamente con una o más variantes de corte y empalme o isoformas. Preferentemente, las variantes de corte y empalme se pueden seleccionar del grupo que consiste en isoforma a, isoforma b, isoforma c e isoforma d. En otros casos más, la presente descripción comprende un procedimiento para tratar a un sujeto con necesidad del mismo que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un panmodulador de la PTK7. Otros casos más comprenden un procedimiento para tratar a un sujeto con necesidad del mismo que comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un modulador de la PTK7 que se asocia inmunoespecíficamente con una o más isoformas.

[0027] Además de los usos terapéuticos comentados anteriormente, también se apreciará que los moduladores de la presente descripción se pueden usar para diagnosticar trastornos relacionados con la PTK7 y, en particular, trastornos hiperproliferativos. En algunos casos, el modulador se puede administrar al sujeto y detectar o realizar el seguimiento in vivo. Los expertos en la materia apreciarán que tales moduladores se pueden marcar o asociar con marcadores o indicadores, como se describe más adelante, y detectar usando cualquiera de varias técnicas convencionales (p. ej., RMN, TAC, TEP, etc.).

[0028] Por tanto, en algunos casos, la descripción comprenderá un procedimiento para diagnosticar, detectar o realizar el seguimiento de un trastorno asociado a la PTK7 in vivo en un sujeto con necesidad del mismo que comprende la etapa de administrar un modulador de la PTK7.

[0029] En otros casos, los moduladores se pueden usar en un ámbito de diagnóstico in vitro usando procedimientos reconocidos en la técnica. Como tal, un caso preferido comprende un procedimiento para diagnosticar un trastorno hiperproliferativo en un sujeto con necesidad del mismo que comprende las etapas de:

a. obtener una muestra de tejido de dicho sujeto;

b. poner en contacto la muestra de tejido con al menos un modulador de la PTK7 y

c. detectar o cuantificar el modulador de la PTK7 asociado con la muestra.

[0030] Tales procedimientos se pueden distinguir fácilmente en combinación con la presente solicitud y se pueden realizar fácilmente usando tecnología comercial generalmente disponible tal como lectores de placas automáticos, sistemas indicadores exclusivos, etc. En casos seleccionados, el modulador de la PTK7 se asociará con las células perpetuadoras de tumores presentes en la muestra. En otros casos preferidos, la etapa de detección o cuantificación comprenderá una reducción de la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores y la detección de las mismas. Asimismo, se pueden realizar análisis de dilución limitante como se mencionó anteriormente y emplearán preferentemente el uso de modelos estadísticos de distribución de Poisson para proporcionar un recuento exacto de la reducción de la frecuencia.

[0031] De manera similar, la presente descripción también proporciona kits que son útiles en el diagnóstico y seguimiento de trastornos asociados a la PTK7 tales como el cáncer. Para ello, la presente descripción proporciona preferentemente un artículo de fabricación útil para diagnosticar o tratar trastornos asociados a la ^pTK7 que comprende un recipiente que comprende un modulador de la PTK7 y material didáctico para usar dicho modulador de la PTK7 para tratar o diagnosticar el trastorno asociado a la PTK7.

[0032] Otros casos preferidos de la descripción también aprovechan las propiedades de los moduladores descritos como un instrumento útil para identificar, aislar, seccionar o enriquecer poblaciones o subpoblaciones de células iniciadoras de tumores mediante procedimientos tales como análisis citométrico de flujo, clasificación de células activadas por fluorescencia (CCAF) o seccionamiento mediado por láser.

[0033] Como tal, otro caso preferido de la presente descripción se refiere a un procedimiento para identificar, aislar, seccionar o enriquecer una población de células iniciadoras de tumores que comprende la etapa de poner en contacto dichas células iniciadoras de tumores con un modulador de la PTK7.

[0034] Lo anterior es un resumen y, por tanto, contiene, por necesidad, simplificaciones, generalizaciones y omisiones de detalles; por consiguiente, los expertos en la materia apreciarán que el resumen es únicamente ilustrativo y no está destinado a ser limitante de ninguna manera. Otros aspectos, características y ventajas de los procedimientos, las composiciones y/o los dispositivos y/u otra materia descritos en esta memoria resultarán evidentes en las enseñanzas expuestas en esta memoria. El resumen se proporciona para introducir una selección de conceptos de una forma simplificada que se describen adicionalmente más adelante en la Descripción detallada. Este resumen no está destinado a identificar características clave ni características esenciales de la materia reivindicada, ni tampoco está destinado a ser usado como un recurso para determinar el alcance de la materia reivindicada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0035]

Las FIG. 1A-1C representan, respectivamente, la secuencia del ácido nucleico que codifica la PTK7 humana (SEQ ID NO: 1), la secuencia de aminoácidos de una variante de la PTK7 humana ejemplar (SEQ ID NO: 2) y la FIG.

1C representa las secuencias alineadas y comentadas de cuatro isoformas representativas de la PTK7 (SEQ ID NO: 3-6), donde la sección subrayada de la FIG. 1A representa el marco abierto de lectura de la PTK7-1, la sección subrayada de la FIG. 1B simboliza un dominio extracelular de la PTK7 como se define en esta memoria y la FIG. 1C muestra una alineación proteica de cuatro isoformas ejemplares conocidas de la proteína PTK7 humana como se describe en la base de datos de genes del NCBI (números de entrada de las proteínas: isoforma a = NP_002812, isoforma b = NP_690619; isoforma c = NP_690620; isoforma d = NP_690621), donde la FIG. 1C describe además los motivos peptídicos “GxGxFGxV”, “RDLxxxN” y “SDVWSxG” como las SEQ ID NO: 11-13, respectivamente.

La FIG. 2 es una representación gráfica que representa los niveles de expresión genética de PTK7 en ratones no tratados (-) y tratados (+) con irinotecán como se mide usando secuenciación del transcriptoma completo de poblaciones de células progenitoras tumorales altamente enriquecidas (TProg), células perpetuadoras de tumores (TPC) y células no tumorigénicas (NTG) obtenidas de un subconjunto de muestras de un tumor colorrectal completo.

La FIG. 3 es una representación gráfica que muestra los niveles de expresión genética relativos de PTK7 humana en poblaciones de células progenitoras tumorales altamente enriquecidas (TProg) y células perpetuadoras de tumores (TPC) obtenidas de ratones que llevaban una de tres estirpes celulares de tumores colorrectales o pancreáticos de xenoinjerto no tradicional (NTX) diferentes y normalizadas contra poblaciones de células enriquecidas no tumorigénicas (NTG) como se mide usando RT-PCR cuantitativa.

Las FIG. 4A y 4B son representaciones gráficas que muestran los niveles de expresión genética relativos de PTK7 humana como se miden usando RT-PCR en muestras de tumores colorrectales completos de pacientes con enfermedad en estadio I-IV, como se normalizan contra la media de la expresión en tejido normal de colon y recto (FIG. 4A) o comparados con tejido adyacente normal (FIG. 4B).

Las FIG. 5A y 5b son representaciones gráficas que muestran los niveles de expresión genética relativos o absolutos, respectivamente, de genes de PTK7 humana como se miden mediante RT-PCR en muestras de tumores completos (punto gris) o comparados con NAT (puntos blancos) de pacientes con uno de dieciocho tipos de tumores sólidos diferentes.

Las FIG. 6A y 6B proporcionan, en forma tabular, las secuencias de aminoácidos contiguas de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de varios moduladores de la PTK7 ejemplares murinos y humanizados aislados, clonados y genomanipulados como se describe en los Ejemplos de esta memoria.

Las FIG. 7A-7E proporcionan, en representaciones gráficas y tabulares, características fisicoquímicas de moduladores de la PTK7 ejemplares, donde la FIG. 7A representa características de unión de ciertos moduladores con respecto a la PTK7 murina y humana, la FIG. 7B proporciona datos de afinidad, unión y reactividad cruzada para moduladores seleccionados, las FIG. 7C y 7D muestran características de unión comparativas de un modulador murino seleccionado y su equivalente humanizado y la FIG. 7E proporciona afinidades de unión para moduladores seleccionados con respecto a la PTK7 humana y su ortólogo murino.

Las FIG. 8A-8G representan diversas construcciones de PTK7 según la presente descripción, donde las FIG. 8A-8F proporcionan las secuencias de aminoácidos de seis variantes de moduladores de la PTK7 en forma de construcciones de Ig-PTK7-ECD donde la porción de dominio extracelular de cada construcción es variable y la FIG. 8G ilustra esquemáticamente los siete dominios de Ig de la porción extracelular de la PTK7 junto con las regiones de unión obtenidas mediante ELISA de varios moduladores de la PTK7 como se indican entre corchetes. Las FIG. 9A-9E ilustran los niveles de expresión de la proteína PTK7 en diferentes lisados tumorales y en muestras de NTX, donde las FIG. 9A-9D representan los niveles de lisado tumoral para diversos tumores y estadios de enfermedad en comparación con controles de tejido adyacente normal y la FIG. 9E proporciona histogramas que ilustran la tinción de xenoinjertos no tradicionales humanos con moduladores seleccionados donde la tinción de control (gris) se comparó con la tinción en poblaciones no tumorigénicas (línea discontinua) y poblaciones putativas de citoblastos cancerosos (línea continua).

Las FIG. 10A-10E ilustran gráficamente la capacidad de un modulador seleccionado de la presente descripción para internalizarse tras la unión con PTK7 sobre una superficie celular, donde la FIG. 10C muestra el desplazamiento fluorescente asociado a un modulador ejemplar (es decir, SC6.10.2, denominado H10 en la FIG.

10C) y las FIG. 10A y 10B representan controles, la FIG. 10D demuestra que los moduladores ejemplares de sobrenadantes de hibridoma se pueden cribar para determinar la internalización en comparación con controles purificados (SC6.2.35, SC6.10.2 y SC6.25.1, denominados H2.35, H10.2 y H25.1, respectivamente) y la FIG. 10E ilustra el grado de internalización de diversos moduladores (cada punto de datos representa un modulador distinto), donde la línea discontinua simboliza el corte de referencia y el número de moléculas de PTK7 que son internalizadas por la célula en respuesta al acontecimiento de unión se representa gráficamente en el eje y. Las FIG. 11A-11D ilustran gráficamente la capacidad de los moduladores descritos para mediar inmunoespecíficamente la administración de agentes citotóxicos y favorecer la destrucción celular, donde la FIG.

11A representa el uso de tres moduladores ejemplares (SC6.2.35, SC6.10.2 y SC6.25.3, denominados H2.35, H10.2 y H25.3, respectivamente) como restos de guiado para dirigir cargas útiles citotóxicas a células que expresan PTK7 y donde las FIG. 11B-11D ilustran la capacidad de cuatro moduladores ejemplares adicionales para eliminar tres estirpes celulares distintas donde, en cada FIG., la curva de pendiente descendente es indicativa de destrucción celular por toxina internalizada.

La FIG. 12 pone de manifiesto la capacidad de tres moduladores de la PTK7 ejemplares para mediar inmunoespecíficamente la administración de agentes citotóxicos y reducir de ese modo la viabilidad de las células tumorales en un abanico de estirpes celulares de tumores de NTX.

Las FIG. 13A-13C son indicativas de la capacidad de los moduladores descritos para reducir la frecuencia de aparición de células perpetradores de tumores e inhibir su potencial tumorigénico, donde las FIG. 13A y 13B muestran que la administración de agentes citotóxicos mediada por moduladores (es decir, SC6.H2 marcado con SC6.2.35) afecta la viabilidad de dos poblaciones celulares distintas de tumores de mama de NTX y la FIG. 13C representa la tumorigenicidad reducida de las estirpes celulares tratadas tras implantación en ratones inmunodeprimidos.

La FIG. 14 demuestra la capacidad de moduladores de la PTK7 humanizados ejemplares de la presente descripción para mediar eficazmente la administración e internalización inmunoespecíficas de agentes citotóxicos a células que expresan PTK7.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

I. Introducción

[0036] Aunque la presente invención se puede realizar de muchas formas diferentes, en esta memoria se describen realizaciones ilustrativas específicas de la misma que ejemplifican los principios de la invención. Cabe destacar que la presente invención no se limita a las realizaciones específicas ilustradas. Asimismo, todos los títulos de las secciones usados en esta memoria se dan con fines organizativos y no se deben interpretar como limitantes de la materia descrita.

[0037] Como se mencionó anteriormente, sorprendentemente, se ha encontrado que la expresión de PTK7, que incluye diversas isoformas, está asociada al crecimiento neoplásico y trastornos hiperproliferativos y que tales ligandos proporcionan marcadores tumorales útiles que se pueden aprovechar en el tratamiento de enfermedades relacionadas. Más específicamente, se ha descubierto que los moduladores de la PTK7, tales como los descritos en esta memoria, se pueden usar ventajosamente en el diagnóstico, la teragnosis, el tratamiento o la prevención de trastornos neoplásicos en sujetos con necesidad de los mismos. Por consiguiente, aunque los casos preferidos de la descripción se comentarán ampliamente más adelante, particularmente en el contexto de los citoblastos cancerosos y sus interacciones con los moduladores descritos, los expertos en la materia apreciarán que la presente descripción no se limita a tales casos ejemplares. En su lugar, la presente descripción se refiere en términos generales y expresamente a moduladores de la PTK7 y su uso en el diagnóstico, la teragnosis, el tratamiento o la prevención de un abanico de trastornos asociados a, o mediados por, la PTK7, que incluyen trastornos neoplásicos o hiperproliferativos, independientemente de cualquier mecanismo de acción particular o componente tumoral al que se dirigen específicamente.

[0038] Se apreciará además que, al contrario que diversas descripciones de la técnica anterior, la presente descripción se dirige en gran medida a moduladores inmunoespecíficos de las diversas isoformas de la PTK7 en lugar de a moduladores generales de la proteína tirosina cinasa. Es decir, aunque la clase de receptores de la proteína tirosina cinasa se ha visto ampliamente implicada en varios tipos de trastornos y en general ha sido objetivo de intervención terapéutica, hasta ahora, los moduladores específicos de la PTK7 han atraído menos atención. En parte, esto puede deberse a la creencia de que la interferencia con la actividad general de PTK (particularmente con moléculas pequeñas que interactúan con dominios de cinasa conservados) es más eficaz desde un punto de vista terapéutico, ya que la redundancia de las cinasas probablemente compensaría cualquier antagonismo específico de miembros particulares de la clase. Asimismo, la PTK7 comprende supuestamente un dominio de cinasa inactivo (o dominio de pseudocinasa) que puede haber disuadido de su utilización como diana terapéutica.

[0039] Por el contrario, la presente descripción comprende el uso de moduladores inmunoespecíficos que reaccionan preferentemente con una o más isoformas de la PTK7 para proporcionar beneficios terapéuticos. Como se comentó brevemente antes, en ciertos casos, los moduladores de la presente descripción se pueden generar y seleccionar para que se asocien con una única isoforma de la PTK7, mientras que, en otros casos, los moduladores seleccionados pueden reaccionar con más de una isoforma o con todas las isotermas reconocidas de la PTK7. En estos últimos casos, la presente descripción puede comprender moduladores que se asocian o reaccionan con más de una isoforma de la ^pTK7, proporcionando de ese modo un efecto aditivo o sinérgico inesperado que puede permitir la inactividad de más de una vía mediada por la PTK7.

[0040] Más generalmente, como se demuestra en la presente solicitud, los moduladores de la PTK7 inmunoespecíficos descritos se pueden usar eficazmente para dirigirse a, y eliminar o incapacitar de otro modo, las células tumorigénicas y tratar trastornos asociados a la PTK7 (p. ej., neoplasias). Como se emplea en esta memoria, un trastorno asociado a la PTK7 se debe entender que significa cualquier trastorno o enfermedad (lo que incluye trastornos proliferativos) que es caracterizado, diagnosticado o identificado por una anomalía fenotípica de la expresión de la PTK7 durante el curso o la etiología de la enfermedad o trastorno. A este respecto, la anomalía fenotípica puede comprender, por ejemplo, niveles elevados o reducidos de expresión de PTK7, expresión anómala de PTK7 en ciertas poblaciones celulares definibles o expresión anómala de PTK7 en una fase o etapa inapropiada de un ciclo vital celular.

[0041] Además de la asociación general comentada antes, los inventores han descubierto además una asociación fenotípica hasta ahora desconocida entre las células iniciadoras de tumores (TIC) y la PTK7. A este respecto, se ha encontrado que las TIC seleccionadas expresan niveles elevados de PTK7 en comparación con las células de tejido normal y no tumorigénicas (NTG), que juntas constituyen normalmente gran parte de un tumor sólido. Por tanto, las isoformas de la PTK7 comprenden marcadores (o antígenos o inmunógenos) asociados a los tumores y se ha encontrado que proporcionan agentes eficaces para la detección e inhibición de las TIC y las neoplasias asociadas debido a los niveles alterados de las proteínas sobre las superficies celulares o en el microentorno tumoral. Más específicamente, se ha descubierto además que los moduladores de la PTK7, que incluyen antagonistas y anticuerpos inmunorreactivos que se asocian, unen o reaccionan con las proteínas, reducen eficazmente la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores y, por lo tanto, son útiles para eliminar, agotar, incapacitar, reducir, favorecer la diferenciación, o impedir o limitar de otro modo la capacidad, de estas células iniciadoras de tumores para permanecer en estado latente y/o continuar estimulando el crecimiento, la metástasis o la recidiva tumoral en un paciente. Como se comenta más pormenorizadamente más adelante, la subpoblación de células tumorales TIC está compuesta tanto por células perpetuadoras de tumores (TPC) como por células progenitoras tumorales altamente proliferativas (TProg).

[0042] En vista de estos descubrimientos, los expertos en la materia apreciarán que la presente descripción proporciona además moduladores de la PTK7 y su uso para reducir la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores. Como se comentará ampliamente más adelante, los moduladores de la PTK7 de la descripción comprenden en términos generales cualquier compuesto que reconoce, reacciona, compite, antagoniza, interactúa, se une, agoniza o se asocia con la PTK7 o PTK7 o sus genes. Mediante estas interacciones, los moduladores de la PTK7 reducen o moderan de ese modo la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores. Los moduladores ejemplares descritos en esta memoria comprenden nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, péptidos o polipéptidos. En ciertos casos preferidos, los moduladores seleccionados comprenderán anticuerpos contra la PTK7 o fragmentos inmunorreactivos o derivados de los mismos. Tales anticuerpos pueden ser de naturaleza antagonista o agonista y pueden estar opcionalmente conjugados o asociados con un agente citotóxico. En otros casos, los moduladores de la presente descripción comprenderán una construcción de PTK7 que comprende una isoforma de la PTK7 o un fragmento reactivo de la misma. Se apreciará que tales construcciones pueden comprender proteínas de fusión y pueden incluir dominios reactivos de otros polipéptidos tales como inmunoglobulinas o modificadores de la respuesta biológica. En otros aspectos más, el modulador de la PTK7 comprenderá una estructura de ácido nucleico que ejerce los efectos deseados a nivel genómico. Más adelante se comentarán pormenorizadamente otros moduladores más compatibles con las presentes enseñanzas.

[0043] Independientemente de la forma en que se selecciona el modulador en última instancia, este estará preferentemente en estado aislado y purificado antes de la introducción en un sujeto. A este respecto, un modulador de la PTK7 aislado se debe interpretar que significa, en términos generales y según la práctica farmacéutica convencional, cualquier preparado o composición que comprende el modulador en un estado sustancialmente exento de contaminantes (biológicos o de otro tipo) no deseados. Como se comentará pormenorizadamente más adelante, estos preparados se pueden purificar y formular según se desee usando diversas técnicas reconocidas en la técnica. Evidentemente, se apreciará que tales preparados aislados se pueden formular o combinar intencionadamente con principios activos o inertes según se desee para mejorar los aspectos comerciales, de fabricación o terapéuticos del producto acabado y proporcionar composiciones farmacéuticas.

II. Fisiología de la PTK7

[0044] La proteína tirosina cinasa (PTK7), también conocida como cinasa 4 del carcinoma de colon (CCK4), es un receptor tirosina cinasa originalmente clonado a partir de melanocitos humanos normales (Lee y col., Oncogene 8(12), 1993) e independientemente a partir de tejido de carcinoma de colon (Mossie y col., Oncogene 11(10), 1995). El gen PTK7 está ubicado en 6p21.1-p 12.2. Se han clonado cinco isoformas de corte y empalme de la PTK7 humana a partir de ADNc testicular (Jung, Ji y col., Biochim Biophys Acta 1579, 2002). La abundancia relativa de las isotermas entre sí difiere entre las estirpes de carcinoma testicular y hepatoma o de colon, pero la importancia funcional de estas isotermas, si la hay, es desconocida. Los análisis bioinformáticos han sugerido que el ratón puede expresar una isoterma de la PTK7 soluble a partir de ARNm sometido a corte y empalme alternativo (Forrest, Taylor y col., Genome Biol 7, 2006). A los efectos de la presente solicitud, se apreciará que los términos “PTK7” y “CCK4” se pueden usar indistintamente e incluyen variantes de corte y empalme, isoformas, ortólogos y homólogos de la PTK7 humana, a menos que las limitaciones contextuales lo impongan de otro modo. Se apreciará además que los términos también se pueden referir a cualquier derivado o fragmento de una forma natural o variante de la PTK7 que contiene un epítopo al que se puede unir específicamente un modulador de la proteína PTK7 (p. ej., un anticuerpo o fragmento inmunorreactivo).

[0045] La proteína PTK7 de longitud completa es una proteína transmembrana de tipo I, con un dominio extracelular (ECD) de 674 aminoácidos, seguido de una porción de dominio TM corta y un dominio citoplasmático de 345 aminoácidos. Una secuencia de ácido nucleico completa de una isoforma ejemplar de la PTK7 humana (es decir, la variante de transcripción PTK7-1) tiene el número de entrada de Genbank NM_002821 y se representa en la FIG.

1A (SEQ ID NO: 1). Similarmente, se muestra una secuencia de aminoácidos ejemplar de longitud completa de la proteína PTK7-1 se presenta en la FIG. 1B (SEQ ID NO: 2). Cabe señalar que la proteína PTK7 de la S^e Q ID NO: 2 difiere del producto de traducción de la secuencia de ácido nucleico subrayada de la SEQ ID NO: 1 (es decir, la isoforma a como se presenta en la SEQ ID NO: 3) en que hay una mutación puntual (L -> P) en la posición 93 de la FIG. 1B. Con respecto a las isoformas, la FIG. 1C muestra la alineación comentada de secuencias de aminoácidos de cuatro isoformas ejemplares de la PTK7 como se describe en Genbank (números de entrada de las proteínas: isoforma a = NP_002812, SEQ ID NO: 3; isoforma b = NP_690619, SEQ ID NO: 5; isoforma c = NP_690620, SEQ ID NO: 6; isoforma d = NP_690621, SEQ ID NO: 4). Como se mencionó anteriormente, la secuencia expuesta en la isoforma a corresponde al producto de traducción del marco abierto de lectura de la variante 1 de la PTK7 expuesta en la FIG.

1A y es la más larga de las isoformas. Las otras isoformas de corte y empalme codifican dominios extracelulares que carecen de diversos dominios IgCAM en comparación con la isoforma a, como se muestra. Todas las isoformas codifican el mismo dominio intracelular. Los submotivos conservados en el dominio catalítico de las proteínas serina/tirosina cinasas se muestran debajo de las alineaciones de la PTK7, al igual que los comentarios de los cambios en la proteína PTK7 que se cree que inactivan su dominio de cinasa (p. ej., cambios en los subdominios I y VII).

[0046] En cualquier caso, el ECD de la PTK7 de longitud completa madura comprende siete dominios de tipo inmunoglobulina, mientras que, como se muestra en la FIG. 1C, las diversas variantes de corte y empalme codifican isoformas de la PTK7 que difieren en su estructura de ECD. Todas las isoformas contienen un dominio citoplasmático con homología sustancial al encontrado en la clase general de las tirosina cinasas. Sin embargo, la PTK7 carece de actividad de tirosina cinasa detectable y, como tal, pertenece a una subfamilia de pseudocinasas en la que varios cambios de aminoácidos en diversos subdominios de cinasa conservados conducen a una unión deficiente del ATP (Kroiher y col. Bioessays 23(1), 2001). Específicamente, los residuos clave en los subdominios I y VII están alterados en la PTK7, de tal manera que las interacciones directas con los fosfatos no transferibles del ATP, así como la quelación del cofactor Mg2+ que forma puentes con estos fosfatos, se verían deterioradas (Hanks y col., Methods Enzymol 200, 1991).

[0047] Se apreciará además que los polipéptidos de PTK7 compatibles con la presente descripción pueden estar en forma de una proteína “madura” o pueden formar parte de una proteína más grande, tal como una proteína de fusión. A menudo es ventajoso incluir una secuencia de aminoácidos adicional que contiene secuencias secretoras o líder, una secuencia de pre-, pro- o preproproteína, o una secuencia que ayuda en la purificación, tal como una cola de afinidad, por ejemplo, pero sin limitación, múltiples residuos de histidina, una cola FLAG, cola HA o cola myc. También se pueden usar secuencias adicionales que pueden proporcionar estabilidad durante la producción recombinante. Tales secuencias se pueden retirar opcionalmente según sea necesario incorporando una secuencia escindible como una secuencia adicional o parte de la misma. Por tanto, un polipéptido de PTK7, como se define en esta memoria, puede comprender construcciones fusionadas a restos adjuntos que incluyen otros polipéptidos. Tales secuencias adicionales y colas de afinidad se conocen bien en la técnica y se pueden generar usando técnicas bioquímicas convencionales.

[0048] La importancia biológica de la función de la PTK7, a pesar de su dominio de cinasa inactivo, se puede deducir de la presencia de ortólogos conservados de Hydra a Drosophila a gallinas y seres humanos, cada uno de los cuales se predice, mediante análisis de las secuencias, que carece de actividad de cinasa (Kroiher y col., 2001). En base a la alta conservación de un motivo del dominio TM específico asociado a una propensión a la asociación hélicehélice y al hecho de que el RTK habitualmente dimeriza en respuesta al acoplamiento de ligandos, se sugirió que el dominio TM puede mediar la dimerización de la PTK7 (Kroiher y col., 2001). Un estudio posterior sugirió que el dominio TM de la PTK7 no favorece la autoasociación preferente (Kobus y col., Biochemistry 44(5), 2005), pero no descartó interacciones heteroméricas con los dominios TM de otros RTK o miembros de un complejo de transducción de señales. Por lo tanto, no cabe esperar que el dominio de pseudocinasa de la PTK7 transmita directamente la señal, sino que puede interactuar como un armazón para otras moléculas en la vía de transducción de señales o puede reclutar otra u otras tirosina cinasas (Kroiher y col., 2001).

[0049] La PTK7 humana no se expresa en el colon de los adultos, aunque sí se expresa en el colon de los fetos y en un abanico de estirpes celulares procedentes del carcinoma de colon (Mossie y col., arriba, 1995), así como en el cáncer colorrectal metastásico (Saha y col., Science 294(5545) 2001). Otros tejidos y células normales que se ha descrito que expresan PTK7 incluyen el pulmón, la tiroides y el ovario (Mossie, Jallal y col. 1995), los linfocitos T emigrantes tímicos recientes CD4+ (Haines y col., J Exp Med 206(2) 2009) y las células progenitoras mieloides normales y células de la médula ósea CD34+CD38-(Prebet y col., Blood 116(13), 2010). Con respecto a los tejidos cancerosos, la expresión de PTK7 también se ha encontrado en células del carcinoma de colon (Mossie y col. 1995); en muestras de LMA (Muller-Tidow y col. Clin Cancer Res 10(4), 2004); en células de LLA pre-T CD34-(Shangguan y col., J Proteome Res 7(5) 2008) y en el carcinoma gástrico (Gorringe y col., Genes Chromosomes Cancer 42(3), 2005). Interesantemente, a pesar de ser clonada originalmente a partir de melanocitos normales, se ha descrito que la PTK7 se pierde en el melanoma metastásico (Easty y col., Int J Cancer 71(6), 1997). La PTK7 también se puede perder en ciertas neoplasias malignas de mama que contienen eliminaciones del cromosoma 6p21 (Piao y col., Genes Chromosomes Cancer 30(2), 2001), aunque la expresión es variable en las estirpes celulares del cáncer de mama (Su y col., J Cancer 12010). La PTK7 también se expresa en el adenocarcinoma de pulmón, donde los niveles de expresión más fuertes se han interrelacionado con un pronóstico más favorable en estos tumores (Endoh y col., J Clin Oncol 22(5), 2004). La cartografía fina de las amplificaciones de la región 6p12-p21 en osteosarcomas ha demostrado que los aumentos en el número de copias de los genes no dan como resultado necesariamente la sobreexpresión de Pt K7, como se determina mediante qRT-PCR (Lu y col., Mol Cancer Res 6(6), 2008).

[0050] El ligando o ligandos para la PTK7 no se conocen, aunque la PTK7 se ha vinculado a un abanico de vías de transducción de señales biológicas y procesos de desarrollo. La estructura de dominio ECD de tipo inmunoglobulina de la proteína sugiere que puede ser un participante en, o un sensor de, el contacto y la adhesión intercelular. El ortólogo de Drosophila de la PTK7, OTK, se ha asociado con la plexina como un potencial correceptor para la transducción de señales de las semaforinas durante la guía axonal (Winberg y col., Neuron 32(1), 2001). Recientemente se ha demostrado una interacción entre la plexina-A1 y la PTK7 en Xenopus (Wagner y col., Biochem Biophys Res Commun 402(2) 2010), mientras que se ha demostrado que el ortólogo de gallina de la PTK7, KLG, interactúa con la plexina-A1 y la Sema6D en un complejo importante para la morfogénesis cardíaca de las gallinas ((Toyofuku y col., Genes Dev 18(4), 2004). Se usó PTK7 soluble (sPTK7) para demostrar un papel de la PTK7 en la angiogénesis inducida por el VEGF, así como en la formación del tubo, migración e invasión in vitro de células endoteliales humanas (Shin y col., Biochem Biophys Res Commun 371(4), 2008). La PTK7 de ratón también se ha vinculado a procesos de cicatrización de lesiones epidérmicas, que requieren reorganización citoesquelética de la actina y migración celular (Caddy y col., Dev Cell 19(1), 2010).

[0051] Con respecto a las cascadas de transducción de señales específicas, la PTK7 parece ser un componente de diversas vías de transducción de señales Wnt importantes para el desarrollo (Puppo y col., EMBO Rep 12(1), 2010). Los ratones que expresan una mutación nula o gravemente hipomórfica en Ptk7 mueren perinatalmente, presentando fenotipos coherentes con un papel de la PTK7 en una vía de polaridad celular plana (PCP) (Lu y col., Nature 430(6995), 2004). Similarmente, los ratones chuzhoi que contienen proteínas de PTK7 mutantes con una inserción de tres aminoácidos en el ECD presentan fenotipos anómalos de PCP (Paudyal, Damrau y col. 2010). Se ha demostrado que la PTK7 murina interactúa genéticamente con otros genes de PCP, que incluyen Vangl2 (Lu y col., 2004), Celsrl (Paudyal, Damrau y col. 2010), Scrbl y Grhl3 (Caddy y col., 2010). La metaloproteinasa de la matriz de tipo 1 de la membrana (MT1-MMP) escinde la PTK7 para liberar PTK7 soluble (es decir, sPTK7), y la regulación deficiente del equilibrio entre la actividad de la MT1-MMP y la producción de sPTK7 conduce a defectos de extensión convergente en el pez cebra, también coherentes con un papel de la PTK7 en una vía de PCP (Golubkov y col., J Biol Chem 285(46), 2010). En Xenopus, la PTK7 se encontró en complejos con dsh y el receptor de Wnt fz7 en las vías de transducción de señales Wnt no canónicas (Shnitsar y col., Development 135(24), 2008), mientras que las interacciones entre la PTK7 y la p-catenina podrían demostrar verse afectadas dinámicamente por la transducción de señales Wnt canónicas en células de ratón (Puppo y col., 2010). Adicionalmente, un punto de unión al factor de transcripción TCF/LEF conservado en el promotor de PTK7 sugiere que es un gen de respuesta Wnt y puede explicar la mejora de la regulación de la PTK7 en ciertas neoplasias malignas colorrectales, ya que estos tumores están a menudo regulados de manera deficiente para la transducción de señales de la vía Wnt (Katoh, Int J Mol Med 20(3), 2007).

[0052] En los tejidos cancerosos, además de su potencial para modular las vías Wnt descritas anteriormente, la PTK parece transmitir señales proproliferación y antiapoptóticas en la estirpe del carcinoma de colon HCT116, fenotipos que se podrían invertir mediante la inactivación mediada por ARNi de la PTK7 (Meng y col., PLoS One 5(11), 2010). Las señales antiapoptóticas de la PTK7 transmiten resistencia a la destrucción celular mediada por antraciclina en los blastos de LMA, que se podría invertir usando una proteína PTK7-Fc soluble (Prebet y col., 2010). La sobreexpresión de PTK7 por células cancerosas específicas se ha aprovechado en una estrategia para dirigir la administración de daunorrubicina a células de LLA de linfocitos T en cultivo usando aptámeros que unen la PTK7 y posteriormente son internalizados (Xiao y col., Chemistry 14(6), 2008).

[0053] Además de las características antes mencionadas, la presente descripción demuestra que la expresión de PTK7 es elevada en diversas poblaciones de células iniciadoras de tumores. Junto con la mejora simultánea de la regulación de la PTK7 en al menos algunas de las células no tumorigénicas de la masa tumoral, esto plantea la posibilidad de que las interacciones entre ligando y receptor mediadas por la PTK7 pueden desencadenar cascadas de transducción de señales celulares vinculadas a la proliferación tumoral, neoangiogénesis y/o metástasis tumoral. Sin desear ceñirnos a ninguna teoría particular, se cree que los moduladores de la PTK7 de la presente descripción (particularmente los casos antagonistas o neutralizantes) actúan, al menos en parte, indistintamente reduciendo o eliminando la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores, interfiriendo de ese modo con la propagación o supervivencia tumoral de manera diferente a las pautas terapéuticas de referencia tradicionales (p. ej., irinotecán), o mediante la transducción de señales o administración inmunoterápica de una carga útil capaz de destruir las células que expresan PTK7. Por ejemplo, una reducción en la actividad de los citoblastos cancerosos antagonizando la PTK7 puede incluir simplemente favorecer la proliferación celular de cara a tratamientos quimioterápicos que eliminan las células proliferantes o inducir la diferenciación de la célula iniciadora del tumor de tal manera que se pierda su capacidad de autorrenovación (es decir, proliferación ilimitada y mantenimiento de la histoespecificidad). Alternativamente, en casos preferidos, la incorporación de linfocitos T citotóxicos a las células que expresan PTK7, o la administración de una toxina potente conjugada a un anticuerpo anti-PTK7 que es capaz de internalizarse, puede destruir selectivamente las TPC.

III. Células perpetuadoras de tumores

[0054] Al contrario que las enseñanzas de la técnica anterior, la presente descripción proporciona moduladores de la PTK7 que son particularmente útiles para dirigirse a las células iniciadoras de tumores, y especialmente a las células perpetuadoras de tumores, facilitando de ese modo el tratamiento, la conducta diagnóstico-terapéutica o la prevención de trastornos neoplásicos. Más específicamente, como se indicó anteriormente, sorprendentemente, se ha encontrado que subpoblaciones específicas de células tumorales expresan PTK7 y pueden modificar la coordinación localizada de la transducción de señales de los morfógenos importante para la autorrenovación y la supervivencia celular de los citoblastos cancerosos. Por tanto, en casos preferidos, los moduladores de la PTK7 se pueden usar para reducir la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores según las presentes enseñanzas y facilitar de ese modo el tratamiento o la conducta diagnóstico-terapéutica de trastornos hiperproliferativos.

[0055] Como se emplea en esta memoria, el término célula iniciadora de tumores (TIC) abarca tanto células perpetuadoras de tumores (TPC; es decir, citoblastos cancerosos o CSC) como células progenitoras tumorales altamente proliferativas (denominadas TProg), que juntas constituyen en general una subpoblación singular (es decir, 0,1-40 %) de un volumen o masa tumoral. A los efectos de la presente descripción, los términos células perpetuadoras de tumores y citoblastos cancerosos o citoblastos neoplásicos son equivalentes y se pueden usar indistintamente en esta memoria. Por el contrario, las TPC se diferencian de las TProg en que estas pueden recordar por completo la composición de las células tumorales que existen en un tumor y tienen capacidad de autorrenovación ilimitada, como se demuestra mediante trasplante en serie (dos o más pases a través de ratones) de números bajos de células aisladas. Como se comentará más pormenorizadamente más adelante, la clasificación de células activadas por fluorescencia (CCAF) usando marcadores de la superficie celular apropiados es un procedimiento fiable para aislar subpoblaciones celulares muy enriquecidas (p. ej., >99,5 % de pureza) debido, al menos en parte, a su capacidad para distinguir entre células individuales y grupos de células (es decir, dobletes, etc.). Usando tales técnicas se ha demostrado que, cuando se trasplantan números bajos de células TProg altamente purificadas a ratones inmunodeprimidos, estas pueden estimular el crecimiento tumoral en un trasplante primario. Sin embargo, a diferencia de las subpoblaciones de TPC purificadas, los tumores generados por TProg no reflejan por completo la heterogeneidad celular fenotípica del tumor precursor y son manifiestamente ineficaces para reiniciar la tumorigénesis en serie en trasplantes posteriores. Por el contrario, las subpoblaciones de TPC reconstituyen por completo la heterogeneidad celular de los tumores precursores y pueden iniciar eficazmente tumores cuando se aíslan y trasplantan en serie. Por tanto, los expertos en la materia reconocerán que una diferencia concluyente entre las TPC y TProg, aunque ambas pueden ser generadoras de tumores en trasplantes primarios, es la capacidad singular de las TPC para estimular perpetuamente el crecimiento tumoral heterogéneo tras el trasplante en serie con números de células bajos. Otras estrategias habituales para caracterizar las TPC implican la morfología y el análisis de marcadores de la superficie celular, el perfil transcripcional y la respuesta a los fármacos, aunque la expresión de los marcadores puede cambiar con las condiciones de cultivo y con el pase de la estirpe celular in vitro.

[0056] Por consiguiente, a los efectos de la presente invención, las células perpetuadoras de tumores, al igual que los mastocitos normales compatibles con las jerarquías celulares de los tejidos normales, están definidas preferentemente por su capacidad para autorrenovarse indefinidamente a la vez que mantienen la capacidad de diferenciación multilinaje. Por tanto, las células perpetuadoras de tumores son capaces de generar tanto descendencia tumorigénica (es decir, células iniciadoras de tumores: TPC y TProg) y como descendencia no tumorigénica (NTG). Como se emplea en esta memoria, una célula no tumorigénica (NTG) se refiere a una célula tumoral que proviene de células iniciadoras de tumores, pero ella misma no tiene la capacidad para autorrenovarse o generar los linajes heterogéneos de células tumorales que constituyen un tumor. Experimentalmente, las células NTG son incapaces de formar tumores en ratones de forma reproducible, incluso cuando se trasplantan números de células en exceso.

[0057] Como se indicó, las TProg también se clasifican como células iniciadoras de tumores (o TIC) debido a su capacidad limitada para generar tumores en ratones. Las TProg son descendientes de las TPC y habitualmente son capaces de realizar un número finito de divisiones celulares no autorrenovadoras. Asimismo, las células TProg se pueden dividir además en células progenitoras tumorales incipientes (ETP) y células progenitoras tumorales tardías (LTP), cada una de las cuales se puede distinguir por el fenotipo (p. ej., marcadores de la superficie celular) y las diferentes capacidades para recordar la arquitectura de las células tumorales. A pesar de que tales diferencias técnicas, tanto las ETP como las LTP difieren funcionalmente de las TPC en que generalmente son menos capaces de reconstituir en serie tumores cuando se trasplantan números de células bajos y habitualmente no reflejan la heterogeneidad del tumor precursor. A pesar de las diferencias anteriores, también se ha observado que diversas poblaciones de TProg pueden, en raras ocasiones, adquirir la capacidad de autorrenovación atribuida normalmente a los citoblastos y convertirse ellas mismas en TPC (o CSC). En cualquier caso, es probable que ambos tipos de células iniciadoras de tumores estén representados en la masa tumoral típica de un único paciente y se sometan al tratamiento con los moduladores como se describe en esta memoria. Es decir, las composiciones descritas generalmente son eficaces para reducir la frecuencia de aparición o alterar la quimiosensibilidad de tales células iniciadoras de tumores PTK7 positivas independientemente de la realización o mezcla particular representada en un tumor.

[0058] En el contexto de la presente invención, las TPC son más tumorigénicas, relativamente más inactivas y a menudo más quimiorresistentes que las TProg (tanto ETP como LPT), NTG y las células no procedentes de TPC infiltrantes de tumores (p. ej., fibroblastos/estroma, células endoteliales y hematopoyéticas) que constituyen la masa de un tumor. Puesto que las terapias y los tratamientos convencionales se han diseñado, en gran parte, tanto para reducir el tamaño de los tumores como para atacar rápidamente a las células proliferantes, es probable que las TPC sean más resistentes a las terapias y los tratamientos convencionales que las TProg que proliferan más rápido y otras poblaciones celulares de las masas tumorales. Además, las TPC a menudo expresan otras características que las hacen relativamente quimiorresistentes a las terapias convencionales, tales como expresión aumentada de transportadores de resistencia a múltiples fármacos, mecanismos de reparación de ADN mejorados y proteínas antiapoptóticas. Estas propiedades, cada una de las cuales contribuye a la tolerancia a los fármacos de las TPC, constituyen una razón clave de la incapacidad de los tratamientos oncológicos convencionales para garantizar un beneficio a largo plazo para la mayoría de los pacientes con neoplasia en estadio avanzado; es decir, la incapacidad de dirigirse y erradicar adecuadamente las células que estimulan el crecimiento tumoral continuo y la recidiva (es decir, TPC o CSC).

[0059] A diferencia de muchos de los tratamientos de la técnica anterior antes mencionados, las composiciones novedosas de la presente descripción reducen preferentemente la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores tras la administración a un sujeto independientemente de la forma o diana específica (p. ej., material genético, anticuerpo contra PTK7 o construcción de fusión de ligandos) del modulador seleccionado. Como se señaló anteriormente, la reducción de la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores se puede producir como resultado de a) eliminación, agotamiento, sensibilización, silenciamiento o inhibición de las células iniciadoras de tumores; b) control del crecimiento, expansión o recidiva de las células iniciadoras de tumores; c) interrupción de la aparición, propagación, mantenimiento o proliferación de células iniciadoras de tumores; o d) obstaculizando de otro modo la supervivencia, regeneración y/o metástasis de las células tumorigénicas. En algunas realizaciones, la reducción en la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores se produce como resultado de un cambio en una o más vías fisiológicas. El cambio en la vía, ya sea por reducción o eliminación de las células iniciadoras de tumores o modificando su potencial (p. ej., diferenciación inducida, alteración del nicho) o interfiriendo de otro modo en su capacidad para afectar al entorno tumoral o a otras células, permite a su vez el tratamiento más eficaz de trastornos asociados a la PTK7 inhibiendo la tumorigénesis, el mantenimiento y/o la metástasis y recidiva tumoral.

[0060] Entre los procedimientos que se pueden usar para evaluar tal reducción en la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores están los análisis de dilución limitante, indistintamente in vitro o in vivo, preferentemente seguidos de recuento usando modelos estadísticos de distribución de Poisson o evaluando la frecuencia de acontecimientos concluyentes predefinidos tales como la capacidad para generar tumores in vivo o no. Aunque tales análisis de dilución limitante son los procedimientos preferidos para calcular la reducción de la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores, también se pueden usar otros procedimientos, menos exigentes, para determinar eficazmente los valores deseados, aunque con una exactitud ligeramente inferior, y son totalmente compatibles con las enseñanzas de esta memoria. Por tanto, como apreciarán los expertos en la materia, también es posible determinar la reducción de los valores de frecuencia por medios citométricos de flujo o inmunohistoquímicos bien conocidos. En lo que respecta a todos los procedimientos antes mencionados, véase, por ejemplo, Dylla y col.

2008, PMCID: PMC2413402 y Hoey y col. 2009, PMID: 19664991.

[0061] En lo que respecta a los análisis de dilución limitante, el recuento in vitro de la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores se puede lograr depositando células tumorales humanas indistintamente fraccionadas o no fraccionadas (p. ej., de tumores tratados y no tratados, respectivamente) en condiciones de crecimiento in vitro que fomentan la formación de colonias. De esta manera, las células formadoras de colonias se pueden contar mediante un simple recuento y caracterización de las colonias, o mediante análisis que consisten en, por ejemplo, la deposición de células tumorales humanas en placas en diluciones en serie y la puntuación de cada pocillo como positivo o negativo para la formación de colonias al menos 10 días después del sembrado en placas. Los experimentos o análisis de dilución limitante in vivo, que en general son más exactos en lo que respecta a su capacidad para determinar la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores, abarcan el trasplante de células tumorales humanas, a partir de indistintamente condiciones de control no tratadas o tratadas, por ejemplo, a ratones inmunodeprimidos en diluciones en serie y la puntuación posterior de cada ratón como positivo o negativo para la formación de tumores al menos 60 días después del trasplante. La obtención de valores de frecuencia de aparición de células mediante análisis de dilución limitante in vitro o in vivo se realiza preferentemente aplicando modelos estadísticos de distribución de Poisson a la frecuencia conocida de acontecimientos positivos y negativos, proporcionando de ese modo una frecuencia para los acontecimientos que satisfacen la definición de un acontecimiento positivo; en este caso, la formación de colonias o tumores, respectivamente.

[0062] En lo que respecta a otros procedimientos compatibles con la presente invención que se pueden usar para calcular la frecuencia de aparición de células iniciadoras de tumores, los más habituales comprenden técnicas citométricas de flujo y procedimientos de tinción inmunohistoquímica cuantificables. Aunque no son tan precisos como las técnicas de análisis de dilución limitante descritas antes, estos procedimientos son mucho menos laboriosos y proporcionan valores razonables en un plazo de tiempo relativamente corto. Por tanto, se apreciará que un experto en la materia podrá usar la determinación de perfiles de marcadores de la superficie celular mediante citometría de flujo empleando uno o más anticuerpos o reactivos que unen proteínas de la superficie celular reconocidas en la técnica que se sabe que se enriquecen en las células iniciadoras de tumores (p. ej., marcadores potencialmente compatibles como se exponen en el Ejemplo 1 más adelante) y midiendo de ese modo los niveles de TIC de diversas muestras. En otro procedimiento compatible más, un experto en la materia podría contar la frecuencia de aparición de TIC in situ (p. ej., en una sección tisular) mediante inmunohistoquímica usando uno o más anticuerpos o reactivos que son capaces de unir proteínas de la superficie celular que se piensa que definen estas células.

[0063] Usando cualquiera de los procedimientos antes mencionados es posible cuantificar a continuación la reducción de la frecuencia de aparición de TIC (o TPC en las mismas) proporcionada por los moduladores de la PTK7 descritos (que incluyen los conjugados a agentes citotóxicos) según las enseñanzas de esta memoria. En algunos casos, los compuestos de la presente descripción pueden reducir la frecuencia de aparición de TIC (mediante un abanico de mecanismos indicados anteriormente, que incluyen eliminación, diferenciación inducida, alteración del nicho, silenciamiento, etc.) en 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 % o incluso en 35 %. En otros casos, la reducción en la frecuencia de aparición de TIC puede ser del orden de 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % o 65 %. En ciertos casos, los compuestos descritos pueden reducir la frecuencia de aparición de TIC en 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 % o incluso 95 %. Evidentemente, se apreciará que cualquier reducción de la frecuencia de aparición de TIC probablemente da como resultado una reducción correspondiente en la tumorigenicidad, persistencia, recidiva y agresividad de la neoplasia.

IV. Moduladores de la PTK7

[0064] En cualquier caso, la presente descripción se refiere al uso de moduladores de la PTK7, lo que incluye antagonistas de la PTK7, para diagnóstico, teragnosis, tratamiento y/o profilaxis de diversos trastornos que incluyen cualquiera de varias neoplasias malignas asociadas a la PTK7. Los moduladores descritos se pueden usar solos o en combinación con una amplia diversidad de compuestos anticancerígenos tales como agentes quimioterápicos o inmunoterápicos (p. ej., anticuerpos terapéuticos) o modificadores de la respuesta biológica. En otros casos seleccionados, se pueden usar dos o más moduladores de la PTK7 distintos en combinación para proporcionar efectos antineoplásicos mejorados o se pueden usar para fabricar construcciones multiespecíficas.

[0065] En ciertos casos, los moduladores de la PTK7 de la presente descripción comprenderán nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos, péptidos o polipéptidos. Aún más preferentemente, los moduladores comprenderán PTK7 soluble (sPTK7) o una forma, variante, derivado o fragmento de la misma, lo que incluye, por ejemplo, construcciones de fusión de PTK7 (p. ej., PTK7-Fc, PTK7-resto de guiado, etc.) o conjugados de PTK7 (p. ej., PTK7-PEG, PTK7-agente citotóxico, PTK7-brm, etc.). También se apreciará que, en otros casos, los moduladores de la PTK7 comprenden anticuerpos o fragmentos o derivados inmunorreactivos de los mismos. En casos particularmente preferidos, los moduladores de la presente descripción comprenderán anticuerpos neutralizantes, o derivados o fragmentos de los mismos. En otros casos, los moduladores de la PTK7 pueden comprender anticuerpos internalizantes o fragmentos de los mismos. En otros casos más, los moduladores de la PTK7 pueden comprender anticuerpos reductores o fragmentos de los mismos. Asimismo, al igual que con las construcciones de fusión antes mencionadas, estos moduladores de anticuerpos se pueden conjugar, enlazar o asociar de otro modo con agentes citotóxicos, polímeros o modificadores de la respuesta biológica (BRM) o similares seleccionados para proporcionar inmunoterapias dirigidas con diversos (y opcionalmente múltiples) mecanismos de acción. Como se mencionó anteriormente, tales anticuerpos pueden ser pananticuerpos contra la PTK7 y asociarse con dos o más isoformas de la PTK7 o anticuerpos inmunoespecíficos que reaccionan selectivamente con una única isoforma. En otros casos más, los moduladores pueden actuar a nivel genético y pueden comprender compuestos como construcciones no codificantes, ARNip, microARN y similares.

[0066] Se apreciará además que los moduladores de la PTK7 descritos pueden agotar, silenciar, neutralizar, eliminar o inhibir el crecimiento, la propagación o la supervivencia de las células tumorales, particularmente las TPC, y/o las neoplasias asociadas a través de un abanico de mecanismos, que incluyen la agonización o antagonización de vías seleccionadas o la eliminación de células específicas en función de, por ejemplo, la forma del modulador de la PTK7, cualquier carga útil o dosis asociada y el procedimiento de administración. Por consiguiente, aunque los casos preferidos descritos en esta memoria se refieren al agotamiento, la inhibición o el silenciamiento de subpoblaciones de células tumorales específicas, tales como células perpetuadoras de tumores, se debe hacer hincapié en que tales casos son meramente ilustrativos y no limitantes en ningún sentido. En su lugar, como se expone en las reivindicaciones adjuntas, la presente descripción se refiere en términos generales a moduladores de la PTK7 y su uso en el tratamiento, la conducta diagnóstico-terapéutica o la profilaxis de diversos trastornos hiperproliferativos asociados a la PTK7, independientemente de cualquier mecanismo o población de células tumorales diana particulares.

[0067] En el mismo sentido, los casos descritos de la presente descripción pueden comprender uno o más antagonistas de las PTK7 que se asocian con la PTK7. Para ello, se apreciará que los antagonistas de la PTK7 de la presente descripción pueden comprender cualquier ligando, polipéptido, péptido, proteína de fusión, anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo o derivado del mismo que reconoce, reacciona, se une, se combina, compite, se asocia o interactúa de otro modo con la proteína PTK7 o un fragmento de la misma y elimina, silencia, reduce, inhibe, impide, limita o controla el crecimiento de las células iniciadoras de tumores u otras células neoplásicas, lo que incluye células de la masa tumoral o NTG. En casos seleccionados, los moduladores de la PTK7 comprenden antagonistas de la PTK7.

[0068] Como se emplea en esta memoria, un antagonista se refiere a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir con las actividades de una proteína particular o especificada, lo que incluye la unión de los receptores a los ligandos o las interacciones de las enzimas con los sustratos. Más generalmente, los antagonistas de la descripción pueden comprender anticuerpos y fragmentos de unión al antígeno o derivados de los mismos, proteínas, péptidos, glucoproteínas, glucopéptidos, glucolípidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, construcciones no codificantes, ARNip, miARN, moléculas bioorgánicas, peptidomiméticos, agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control transcripcional y la traduccional, y similares. Los antagonistas también pueden incluir inhibidores de molécula pequeña, proteínas de fusión, moléculas de receptor y derivados que se unen específicamente a la proteína impidiendo de ese modo su unión a su sustrato diana, variantes de antagonistas de la proteína, moléculas no codificantes dirigidas a la proteína, aptámeros de ARN y ribozimas contra la proteína.

[0069] Como se emplea en esta memoria y se aplica a dos o más moléculas o compuestos, los términos reconoce o se asocia se debe entender que significan la reacción, unión, unión específica, combinación, interacción, conexión, enlace, vinculación, coalescencia, fusión o adhesión, covalente o no covalentemente, de las moléculas de manera que una molécula ejerce un efecto sobre la otra molécula.

[0070] Asimismo, como se demuestra en los ejemplos de esta memoria, algunos moduladores de la PTK7 humana pueden, en ciertos casos, presentar reactividad cruzada con la PTK7 de una especie distinta de la humana (p. ej., murina). En otros casos, los moduladores ejemplares pueden ser específicos para una o más isoformas de la PTK7 humana y no presentarán reactividad cruzada con ortólogos de la PTK7 de otras especies. Evidentemente, junto con las enseñanzas de esta memoria, tales realizaciones pueden comprender pananticuerpos contra la PTK7 que se asocian con dos o más isoformas de una única especie o anticuerpos que se asocian exclusivamente con una única isoforma.

[0071] En cualquier caso, y como se comentará más pormenorizadamente más adelante, los expertos en la materia apreciarán que los moduladores descritos se pueden usar en forma conjugada o no conjugada. Es decir, el modulador se puede asociar con, o conjugar a (p. ej., covalente o no covalentemente), compuestos farmacéuticamente activos, modificadores de la respuesta biológica, agentes anticancerígenos, agentes citotóxicos o citostáticos, restos de diagnóstico o modificadores biocompatibles. A este respecto, se entenderá que tales conjugados pueden comprender péptidos, polipéptidos, proteínas, proteínas de fusión, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequeñas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas y radioisótopos. Asimismo, como se indica en esta memoria, el conjugado seleccionado puede estar enlazado covalente o no covalentemente al modulador de la PTK7 en diversas relaciones molares en función de, al menos en parte, el procedimiento usado para lograr la conjugación.

V. Anticuerpos

a. Compendio

[0072] Como se ha mencionado anteriormente, los casos particularmente preferidos de la presente descripción comprenden moduladores de la PTK7 en forma de anticuerpos que se asocian preferentemente con una o más isoformas de la PTK7. El término anticuerpo se usa en el sentido más general y cubre específicamente anticuerpos sintéticos, anticuerpos monoclonales, anticuerpos oligoclonales o policlonales, anticuerpos multiclonales, anticuerpos producidos recombinantemente, intracuerpos, anticuerpos multiespecíficos, anticuerpos biespecíficos, anticuerpos monovalentes, anticuerpos multivalentes, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos injertados con CDR, anticuerpos primatizados, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), FvFc monocatenarios (scFvFc), Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) y cualesquiera otros fragmentos de anticuerpo inmunológicamente activos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (es decir, asociación o unión a la PTK7 inmunoespecífica o inmunopreferente). En términos más generales, los anticuerpos de la presente invención incluyen moléculas de inmunoglobulina y fragmentos inmunológicamente activos de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un punto de unión al antígeno, donde estos fragmentos pueden o no estar fusionados a otro dominio de inmunoglobulina que incluye, pero no se limita a, una región Fc o un fragmento de la misma. Además, como se describe más pormenorizadamente en esta memoria, los términos anticuerpo y anticuerpos incluyen específicamente variantes de la Fc como se describen más adelante, lo que incluyen anticuerpos de longitud completa y fusiones a variantes de Fc que comprenden regiones Fc, o fragmentos de las mismas, que comprenden opcionalmente al menos la modificación de un residuo de aminoácido y están fusionadas a un fragmento inmunológicamente activo de una inmunoglobulina.

[0073] Como se comenta más pormenorizadamente más adelante, los términos genéricos anticuerpo o inmunoglobulina comprenden cinco clases inconfundibles de anticuerpos que se pueden distinguir bioquímicamente y, en función de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, se pueden asignar fácilmente a la clase apropiada. Por razones históricas, las principales clases de anticuerpos intactos se denominan IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. En los seres humanos, las clases IgG e IgA se pueden dividir además en subclases reconocidas (isotipos), es decir, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2, en función de la estructura y ciertas propiedades bioquímicas. Se apreciará que los isotipos de IgG en los seres humanos se nombran en orden de su abundancia en el suero, siendo la IgG1 la más abundante.

[0074] Aunque las cinco clases de anticuerpos (es decir, IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) y todos los isotipos (es decir, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2), así como las variaciones de los mismos, se encuentran dentro del alcance de la presente invención, las realizaciones preferidas que comprenden la clase IgG de inmunoglobulinas se comentarán pormenorizadamente únicamente con fines ilustrativos.

[0075] A este respecto, las inmunoglobulinas IgG humanas comprenden dos cadenas polipeptídicas ligeras idénticas de peso molecular aproximadamente 23000 Daltons y dos cadenas pesadas idénticas de peso molecular de 53000-70000 en función del isotipo. Los dominios constantes de las cadenas pesadas que corresponden a las diferentes clases de anticuerpos se simbolizan mediante la letra griega minúscula a, 6, £, y, y H correspondiente, respectivamente. Las cadenas ligeras de los anticuerpos de cualquier especie de vertebrados se pueden asignar a uno de dos tipos claramente inconfundibles, denominados kappa (k) y lambda (A), en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Los expertos en la materia apreciarán que las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las diferentes clases de inmunoglobulinas se conocen bien.

[0076] Las cuatro cadenas están unidas por enlaces disulfuro en una configuración en Y donde las cadenas ligeras abarcan las cadenas pesadas que comienzan en la boca de la Y continúan a través de la región variable hasta los dos extremos de la Y. Cada cadena ligera está enlazada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que dos enlaces disulfuro en la región bisagra unen las cadenas pesadas. Las cadenas pesadas y ligeras correspondientes también tienen puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente, cuyo número puede variar en función del isotipo de la IgG.

[0077] Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (V^h), seguido de varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (V^l) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. A este respecto, se apreciará que los dominios variables de las porciones de las cadenas ligeras (V^l) y pesadas (V^h) determinan el reconocimiento del antígeno y la especificidad. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (C^l) y la cadena pesada (C^h1, C^h2 o C^h3) confieren y regulan propiedades biológicas importantes tales como la secreción, movilidad transplacentaria, semivida en circulación, unión del complemento y similares. Por convenio, la numeración de los dominios de la región constante aumenta a medida que se vuelven más distales del punto de unión al antígeno o extremo amino del anticuerpo. Por tanto, el extremo amino o N del anticuerpo comprende la región variable y el extremo carboxílico o C comprende la región constante. Por tanto, los dominios C^h3 y C^l comprenden realmente el extremo carboxilo de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

[0078] El término variable se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en la secuencia entre inmunoglobulinas y estos puntos calientes definen en gran medida las características de unión y especificidad de un anticuerpo particular. Estos puntos hipervariables se encuentran en tres segmentos, conocidos como regiones determinantes de la complementariedad (CDR), en los dominios variables tanto de las cadenas ligeras como de las cadenas pesadas, respectivamente. Las porciones más altamente conservadas de los dominios variables que flanquean las CDR se denominan regiones marco (FR). Más específicamente, en los anticuerpos de IgG monoméricos de origen natural, las seis CDR presentes en cada brazo del anticuerpo son secuencias de aminoácidos cortas y no contiguas que están ubicadas específicamente para formar el punto de unión al antígeno cuando el anticuerpo adopta su configuración tridimensional en un entorno acuoso.

[0079] Las regiones marco que comprenden el resto de los dominios variables pesado y ligero presentan menos variabilidad intermolecular en la secuencia de aminoácidos. En su lugar, las regiones marco adoptan en gran medida una conformación de lámina p y las CDR forman bucles que conectan, y en algunos casos forman parte de, la estructura de lámina p. Por tanto, estas regiones marco actúan para formar un armazón que permite el posicionamiento de las seis CDR en la orientación correcta mediante interacciones intercadena no covalentes. El punto de unión al antígeno formado por las CDR posicionadas define una superficie complementaria al epítopo sobre el antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria favorece la unión no covalente del anticuerpo al epítopo del antígeno inmunorreactivo. Se apreciará que la posición y composición de las CDR pueden ser identificadas fácilmente por un experto en la materia usando las definiciones proporcionadas en esta memoria.

[0080] Como se comenta más pormenorizadamente más adelante, todas o parte de las regiones variables de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras se pueden recombinar o genomanipular usando técnicas recombinantes y de expresión convencionales para proporcionar anticuerpos eficaces. Es decir, la región variable de las cadenas pesadas o ligeras de un primer anticuerpo (o cualquier porción de la misma) se puede mezclar y emparejar con cualquier porción seleccionada de la región variable de las cadenas pesadas o ligeras de un segundo anticuerpo. Por ejemplo, en un caso, toda la región variable de las cadenas ligeras que comprende las tres CDR de las cadenas ligeras de un primer anticuerpo se puede emparejar con toda la región variable de las cadenas pesadas que comprende las tres CDR de las cadenas pesadas de un segundo anticuerpo para proporcionar un anticuerpo operativo. Asimismo, en otros casos, se pueden mezclar y emparejar CDR de las cadenas pesadas y ligeras individuales procedentes de diversos anticuerpos para proporcionar el anticuerpo deseado que tiene características optimizadas. Por tanto, un anticuerpo ejemplar puede comprender tres CDR de las cadenas ligeras de un primer anticuerpo, dos CDR de las cadenas pesadas procedentes de un segundo anticuerpo y una tercera CDR de las cadenas pesadas de un tercer anticuerpo.

[0081] Más específicamente, en el contexto de la presente descripción, se apreciará que cualquiera de las CDR de las cadenas pesadas y ligeras descritas procedentes de las secuencias de aminoácidos de la región variable murina expuestas en la FIG. 6A o FIG. 6B se pueden reorganizar de esta manera para proporcionar anticuerpos anti-PTK7 (p. ej., anti-hPTK7) optimizados según las presentes enseñanzas. Es decir, una o más de las CDR procedentes de las secuencias de aminoácidos de la región variable de las cadenas ligeras contiguas expuestas en la FIG. 6A (SEQ ID NO: 20-60, números pares) o de las secuencias de aminoácidos de la región variable de las cadenas pesadas contiguas expuestas en la FIG. 6B (SEQ ID NO: 21-61, números impares) se pueden incorporar en un modulador de la PTK7 y, en casos particularmente preferidos, en un anticuerpo injertado con CDR o humanizado que se asocia inmunoespecíficamente con una o más isoformas de la PTK7. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos de la región variable de las cadenas ligeras (SEQ ID NO: 62-68, números pares) y pesadas (SEQ ID NO: 63-69, números impares) de tales moduladores humanizados también se exponen en las FIGS. 6A y 6B. Estas secuencias de aminoácidos novedosas tomadas conjuntamente representan veintiún moduladores ejemplares murinos y cuatro humanizados según la presente descripción. Asimismo, las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes de cada uno de los veintiún moduladores ejemplares murinos y los cuatro moduladores humanizados expuestos en las FIGS.

6A y 6B están incluidas en el listado de secuencias adjunto a la presente solicitud (SEQ ID NO: 120-169).

[0082] En cualquier caso, los números de los residuos de las regiones determinantes de la complementariedad se pueden definir como los de Kabat y col. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield, Va.), específicamente, los residuos 24-34 (CDR1), 50-56 (CDR2) y 89-97 (CDR3) del dominio variable de las cadenas ligeras y 31-35 (CDR1), 50-65 (CDR2) y 95-102 (CDR3) del dominio variable de las cadenas pesadas. Cabe destacar que las CDR varían considerablemente de un anticuerpo a otro (y por definición no presentarán homología con las secuencias consenso de Kabat). La alineación máxima de los residuos del marco requiere frecuentemente la inserción de residuos espaciadores en el sistema de numeración, que se van a usar para la región Fv. Además, la identidad de ciertos residuos individuales en cualquier número de posición de Kabat puede variar de una cadena de anticuerpo a otra debido a la divergencia alélica o entre especies. Véase también Chothia y col., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Chothia y col., Nature 342, páginas 877-883 (1989), MacCallum y col., J. Mol. Biol.

262:732-745 (1996) y S. Dubel, ed., Handbook of Therapeutic Antibodies, 3a ed., WILEY-VCH Verlag GmbH and Co. (2007), donde las definiciones incluyen el solapamiento o subconjuntos de residuos de aminoácidos cuando se comparan entre sí.

Los residuos de aminoácidos que comprenden las regiones de unión o CDR como se definen en cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen para su comparación a continuación.

Definiciones de las CDR

Definiciones de las CDR

[0083] Como se comenta en esta memoria, un experto en la materia podría definir, identificar, obtener y/o enumerar fácilmente las CDR como definen Kabat y col., Chothia y col. o MacCallum y col. para cada secuencia de las cadenas ligeras y pesadas correspondiente expuesta en la FIG. 6A o FIG. 6B. Por consiguiente, cada una de las CDR objetivo y los anticuerpos que comprenden las CDR definidas mediante todas estas nomenclaturas están incluidas expresamente dentro del alcance de la presente descripción. En términos más generales, el término residuo de aminoácido de la CDR de la región variable incluye los aminoácidos de una CDR como se identifican usando cualquier procedimiento basado en la secuencia o estructura como se expuso anteriormente.

[0084] Como se emplea en esta memoria, el término residuos de aminoácidos del marco (FR) de la región variable se refiere a los aminoácidos de la región marco de una cadena de Ig. El término región marco o región FR, como se emplea en esta memoria, incluye los residuos de aminoácidos que forman parte de la región variable, pero no forman parte de las CDR (p. ej., usando la definición de Kabat de las CDR). Por lo tanto, un marco de la región variable es una secuencia no contigua de aproximadamente 100-120 aminoácidos de longitud, pero incluye solo los aminoácidos situados fuera de las CDR.

[0085] Para el ejemplo específico de una región variable de las cadenas pesadas y para las CDR como definen Kabat y col., la región marco 1 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 1-30; la región marco 2 corresponde al dominio de la región variable que comprende los aminoácidos 36-49; la región marco 3 corresponde al dominio de la región variable que abarca los aminoácidos 66-94 y la región marco 4 corresponde al dominio de la región variable del aminoácido 103 al final de la región variable. Las regiones marco para la cadena ligera están separadas similarmente por cada una de las CDR de la región variable de las cadenas ligeras. Similarmente, usando la definición de las CDR de Chothia y col. (p. ej., CDR-L1 23-34, CDR-L250-56, CDR-L389-97; CDR-H1 26-32, CDR-H250-58, CDR-H395-102) o McCallum y col., los límites de la región marco están separados por los extremos de las CDR correspondientes como se describió anteriormente.

[0086] Teniendo en mente las consideraciones estructurales antes mencionadas, los expertos en la materia apreciarán que los anticuerpos de la presente invención pueden comprender cualquiera de varias realizaciones funcionales. A este respecto, los anticuerpos compatibles pueden comprender cualquier anticuerpo inmunorreactivo (como se define el término en esta memoria) que proporciona la respuesta fisiológica deseada en un sujeto. Aunque se puede usar cualquiera de los anticuerpos descritos junto con las presentes enseñanzas, ciertas realizaciones de la invención comprenderán anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o humanos o fragmentos inmunorreactivos de los mismos. Otras realizaciones más pueden comprender, por ejemplo, construcciones multiméricas homogéneas o heterogéneas, variantes de Fc y anticuerpos conjugados o sometidos a glucosilación. Asimismo, se entenderá que tales configuraciones no son mutuamente excluyentes y que los anticuerpos individuales compatibles pueden comprender uno o más de los aspectos funcionales descritos en esta memoria. Por ejemplo, un anticuerpo compatible puede comprender un diacuerpo monocatenario con regiones variables humanizadas o un anticuerpo de IgG3 de longitud completa totalmente humano con modificaciones de Fc que alteran el patrón de glucosilación para modular la semivida en el suero. Otras realizaciones ejemplares resultan fácilmente evidentes para los expertos en la materia y se puede percibir fácilmente que están dentro del alcance de la invención.

b. Generación de anticuerpos

[0087] Como se sabe, y se muestra en los Ejemplos de esta memoria, se pueden inocular diversos animales hospedadores, que incluyen conejos, ratones, ratas, etc., y usar para proporcionar anticuerpos según las enseñanzas de esta memoria. Los aditivos conocidos en la técnica que se pueden usar para aumentar la respuesta inmunitaria, en función de la especie inoculada, incluyen, pero no se limitan a, medio de Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones oleosas, hemocianinas de lapa californiana, dinitrofenol y aditivos humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) y Corynebacterium parvum. Tales aditivos pueden proteger al antígeno de la dispersión rápida manteniéndolo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulan al hospedador a secretar factores que son quimiotácticos para los macrófagos y otros componentes del sistema inmunitario. Preferentemente, si se administra un polipéptido, el esquema de inmunización implicará dos o más administraciones del polipéptido, distribuidas a lo largo de varias semanas.

[0088] Después de la inmunización de un animal con un inmunógeno de PTK7 (p. ej., PTK7 soluble o sPTK7) que puede comprender isotermas y/o péptidos seleccionados, o con células vivas o preparados celulares que expresan la proteína deseada, se pueden obtener anticuerpos y/o células productoras de anticuerpos del animal usando técnicas reconocidas en la técnica. En algunos casos, se obtiene suero que contiene anticuerpo anti-PTK7 policlonal desangrando o sacrificando al animal. El suero se puede usar con fines de investigación en la forma obtenida del animal o, como alternativa, los anticuerpos anti-PTK7 se pueden purificar parcial o totalmente para proporcionar fracciones de inmunoglobulina o preparados de anticuerpos homogéneos.

c. Anticuerpos monoclonales

[0089] Aunque los anticuerpos policlonales se pueden usar en combinación con ciertos aspectos de la presente descripción, los casos preferidos comprenden el uso de anticuerpos monoclonales reactivos contra la PTK7. Como se emplea en esta memoria, el término anticuerpo monoclonal o mAb se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, con la excepción de posibles mutaciones (p. ej., mutaciones presentes en la naturaleza) que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. Por tanto, el modificador monoclonal indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos distintos y se puede usar en combinación con cualquier tipo de anticuerpo. En ciertas realizaciones, tal anticuerpo monoclonal incluye un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une o asocia con la PTK7, donde la secuencia polipeptídica de unión a la PTK7 se obtuvo mediante un procedimiento que incluye la selección de una única secuencia polipeptídica de unión a la diana de entre una pluralidad de secuencias polipeptídicas.

[0090] En casos preferidos, las estirpes celulares productoras de anticuerpos se preparan a partir de células aisladas del animal inmunizado. Después de la inmunización, el animal se sacrifica y los ganglios linfáticos y/o los linfocitos B esplénicos se inmortalizan por medios bien conocidos en la técnica, como se muestra en los Ejemplos adjuntos. Los procedimientos para inmortalizar células incluyen, pero no se limitan a, transfectarlas con oncogenes, infectarlas con un virus oncogénico y cultivarlas en condiciones que permiten sobrevivir a las células inmortalizadas, someterlas a compuestos carcinogénicos o mutantes, fusionarlas con una célula inmortalizada, p. ej., una célula de mieloma, e inactivar un gen inhibidor de tumores. Si se usa la fusión con células de mieloma, las células de mieloma preferentemente no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una estirpe celular no secretora). Como se expone en los Ejemplos más adelante, las células inmortalizadas se pueden cribar usando una PTK7 (lo que incluye isoformas seleccionadas), o una porción inmunorreactiva de la misma. En un caso preferido, el cribado inicial se realiza usando un enzimoinmunoanálisis de adsorción (ELISA) o un radioinmunoanálisis.

[0091] Más generalmente, se pueden preparar anticuerpos monoclonales distintos coherentes con la presente invención usando un amplio abanico de técnicas conocidas en la técnica, que incluyen la técnica del hibridoma, técnicas recombinantes, tecnologías de presentación en fagos, animales transgénicos (p. ej., un XenoMouse® o HuMAb Mouse®) o alguna combinación de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales se pueden producir usando técnicas del hibridoma tales como las descritas en términos generales anteriormente y enseñadas más pormenorizadamente en Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed.

1988); Hammerling, y col., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). Usando los protocolos descritos, los anticuerpos se producen preferentemente en mamíferos mediante múltiples inyecciones subcutáneas o intraperitoneales del antígeno relevante y un aditivo. Como se comentó anteriormente, esta inmunización provoca generalmente una respuesta inmunitaria que comprende la producción de anticuerpos reactivos contra el antígeno (que pueden ser totalmente humanos si el animal inmunizado es transgénico) a partir de los esplenocitos o linfocitos activados. Aunque los anticuerpos resultantes se pueden recolectar del suero del animal para proporcionar preparados policlonales, generalmente es más deseable aislar linfocitos individuales del bazo, los ganglios linfáticos o la sangre periférica para proporcionar preparados homogéneos de anticuerpos monoclonales. Más habitualmente, los linfocitos se obtienen del bazo y se inmortalizan para proporcionar hibridomas.

[0092] Por ejemplo, como se describió anteriormente, el procedimiento de selección puede ser la selección de un clon singular de entre una pluralidad de clones, tal como un grupo de clones del hibridoma, clones de fagos o clones de ADN recombinante. Se debe entender que una secuencia de unión a la PTK7 seleccionada se puede alterar adicionalmente, por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a la diana, para mejorar su producción en cultivos celulares, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia de unión a la diana alterada también es un anticuerpo monoclonal de esta invención. Al contrario que los preparados de anticuerpos policlonales, que habitualmente incluyen anticuerpos distintos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal de un preparado de anticuerpos monoclonales se dirige contra un único determinante sobre un antígeno. Además de su especificidad, los preparados de anticuerpos monoclonales son ventajosos porque habitualmente no están contaminados por otras inmunoglobulinas que pueden presentar reactividad cruzada.

d. Anticuerpos quiméricos

[0093] En otra realización, el anticuerpo de la invención puede comprender anticuerpos quiméricos procedentes de segmentos proteicos unidos covalentemente de al menos dos especies o tipos de anticuerpos diferentes. Se apreciará que, como se emplea en esta memoria, el término anticuerpos quiméricos se refiere a construcciones en las que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes de anticuerpos procedentes de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la una o más cadenas son idénticas u homologas a las secuencias correspondientes de anticuerpos procedentes de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de tales anticuerpos, siempre que presenten la actividad biológica deseada (patente de EE. UU. n.° 4816567; Morrison y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). En una realización ejemplar, un anticuerpo quimérico según las enseñanzas de esta memoria puede comprender secuencias de aminoácidos de V^h y V^l murinas y regiones constantes procedentes de fuentes humanas. En otras realizaciones compatibles, un anticuerpo quimérico de la presente invención puede comprender un anticuerpo injertado con CDR o humanizado como se describe en esta memoria.

[0094] Generalmente, un objetivo de fabricar un anticuerpo quimérico es crear una quimera en la que la cantidad de aminoácidos de la especie objetivo prevista está maximizada. Un ejemplo es el anticuerpo injertado con CDR, en el que el anticuerpo comprende una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpos particular, mientras que el resto de la una o más cadenas de anticuerpo son idénticas u homólogas a una secuencia correspondiente de anticuerpos procedentes de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos. Para uso en seres humanos, la región variable o las CDR seleccionadas de un anticuerpo de roedor a menudo se injertan en un anticuerpo humano, sustituyendo a las regiones variables o CDR de origen natural del anticuerpo humano. Estas construcciones generalmente tienen la ventaja de proporcionar funciones moduladoras de plena capacidad (p. ej., CDC, ADCC, etc.) a la vez que reducen respuestas inmunitarias no deseadas al anticuerpo por parte del sujeto.

e. Anticuerpos humanizados

[0095] Un anticuerpo humanizado es similar al anticuerpo injertado con CDR. Generalmente, un anticuerpo humanizado se produce a partir de un anticuerpo monoclonal producido inicialmente en un animal no humano. Como se emplea en esta memoria, las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (p. ej., murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima procedente de una inmunoglobulina no humana. En una realización, un anticuerpo humanizado es una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor o aceptor) en la que se reemplazan residuos de una CDR del anticuerpo receptor por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante), tal como ratón, rata, conejo o primate no humano, que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas.

[0096] Generalmente, la humanización de un anticuerpo comprende un análisis de la homología de secuencia y las estructuras canónicas tanto del anticuerpo donante como del receptor. En realizaciones seleccionadas, el anticuerpo receptor puede comprender secuencias consenso. Para crear marcos consenso humanos, se pueden alinear marcos de varias secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas o las cadenas ligeras humanas para identificar una secuencia de aminoácidos consenso. Asimismo, en muchos casos, uno o más residuos del marco del dominio variable de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes del anticuerpo donante. Estas sustituciones del marco se identifican mediante procedimientos bien conocidos en la técnica, p. ej., mediante modelado de las interacciones de los residuos de la CDR y el marco para identificar residuos del marco importantes para la unión al antígeno y comparación de las secuencias para identificar residuos del marco peculiares en posiciones particulares. Tales sustituciones ayudan a mantener la configuración tridimensional apropiada de la una o más CDR injertadas y a menudo mejoran una infinidad en comparación con construcciones similares sin sustituciones del marco. Asimismo, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor ni en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se pueden hacer para depurar adicionalmente el rendimiento del anticuerpo usando técnicas bien conocidas.

[0097] El injerto de CDR y los anticuerpos humanizados se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 6180370, 5693762, 5693761, 5585089 y 5530101. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos de al menos uno, y habitualmente dos, dominios variables, en los que todas o sustancialmente todas las CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones marco son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también comprenderá opcionalmente al menos una porción de una región constante (Fc) de inmunoglobulina, habitualmente la de una inmunoglobulina humana. Para conocer más detalles, véase, p. ej., Jones y col., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992). Véase también, p. ej., Vaswani y Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1: 105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y las patentes de EE. UU. n.° 6982321 y 7 087409. Otro procedimiento más se denomina humanización por genomanipulación y se describe, por ejemplo, en el documento US 2005/0008625. A los efectos de la presente solicitud, el término anticuerpos humanizados se entenderá que incluye expresamente anticuerpos injertados con CDR (es decir, anticuerpos humanos que comprenden una o más CDR no humanas injertadas) sin sustituciones o con sustituciones mínimas del marco.

[0098] Adicionalmente, un anticuerpo anti-PTK7 no humano también se puede modificar mediante eliminación específica de epítopos de linfocitos T humanos o desinmunización mediante los procedimientos descritos en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Brevemente, las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo se pueden analizar para determinar los péptidos que se unen al MHC de clase II; estos péptidos representan epítopos potenciales de linfocitos T (como se define en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317). Para la detección de epítopos potenciales de linfocitos T, se puede aplicar una estrategia de modelado informático denominada enhebrado peptídico y, además, se pueden buscar en una base de datos de péptidos de unión al MHC de clase II humano motivos presentes en las secuencias de V^h y V^l, como se describe en los documentos WO 98/52976 y WO 00/34317. Estos motivos se unen a cualquiera de los 18 alotipos principales del MHC de clase II DR y, por tanto, constituyen epítopos potenciales de linfocitos T. Los epítopos potenciales de linfocitos T detectados se pueden eliminar sustituyendo números pequeños de residuos de aminoácidos en las regiones variables o mediante sustituciones de aminoácidos únicos. En la medida de lo posible, se hacen sustituciones conservadoras. A menudo, pero no exclusivamente, se puede usar un aminoácido habitual para una posición en las secuencias de anticuerpos de la estirpe germinal humana. Después de identificar los cambios de la desinmunización, los ácidos nucleicos que codifican Vh y Vl se pueden construir mediante mutagénesis u otros procedimientos de síntesis (p. ej., síntesis de novo, reemplazo del casete, etc.). Una secuencia variable mutagenizada se puede, opcionalmente, fusionar a una región constante humana.

[0099] En realizaciones seleccionadas, al menos 60 %, 65 %, 70 %, 75% u 80 % de los residuos de la región variable de los anticuerpos humanizados corresponderán a los de las secuencias de la región marco (FR) y la CDR precursoras. En otras realizaciones, al menos 85 % o 90 % de los residuos de los anticuerpos humanizados corresponderán a los de las secuencias de la región marco (FR) y la CDR precursoras. En una realización más preferida, más de 95 % de los residuos de los anticuerpos humanizados corresponderán a los de las secuencias de la región marco (FR) y la CDR precursoras.

[0100] Los anticuerpos humanizados se pueden fabricar usando técnicas de biología molecular e ingeniería biomolecular habituales como se describe en esta memoria. Estos procedimientos incluyen aislar, manipular y expresar secuencias de ácidos nucleicos que codifican todas o parte de las regiones variables Fv de inmunoglobulina de al menos una de una cadena pesada o ligera. Las fuentes de tales ácidos nucleicos son bien conocidas por los expertos en la materia y, por ejemplo, se pueden obtener de un hibridoma, una célula eucariota o un fago que produce un anticuerpo o un fragmento inmunorreactivo contra una diana predeterminada, como se describió anteriormente, de genes de inmunoglobulina de la estirpe germinal, o de construcciones sintéticas. El ADN recombinante que codifica el anticuerpo humanizado se puede clonar a continuación en un vector de expresión apropiado.

[0101] Las secuencias de la estirpe germinal humana, por ejemplo, se describen en Tomlinson, I. A. y col. (1992) J. Mol. Biol. 227:776-798; Cook, G. P. y col. (1995) Immunol. Today 16: 237-242; Chothia, D. y col. (1992) J. Mol. Bio.227:799-817; y Tomlinson y col. (1995) EMBO J 14:4628-4638. El directorio V BASE proporciona un directorio integral de secuencias de la región variable de las inmunoglobulinas humanas (Véase Retter y col., (2005) Nuc Acid Res 33: 671-674). Estas secuencias se pueden usar como fuente de secuencias humanas, p. ej. para las regiones marco y las CDR. Como se expone en esta memoria, también se pueden usar regiones marco humanas consenso, p. ej., como se describe en la patente de EE. UU. n.° 6300064.

f. Anticuerpos humanos

[0102] Además de los anticuerpos antes mencionados, los expertos en la materia apreciarán que los anticuerpos de la presente invención pueden comprender anticuerpos totalmente humanos. A los efectos de la presente solicitud, el término anticuerpo humano comprende un anticuerpo que posee una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un ser humano y/o se ha fabricado usando cualquiera de las técnicas para fabricar anticuerpos humanos como se describen en esta solicitud. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de unión al antígeno no humanos.

[0103] Los anticuerpos humanos se pueden producir usando diversas técnicas conocidas en la técnica. Como se mencionó anteriormente, se pueden usar técnicas de presentación de fagos para proporcionar regiones de unión inmunoactivas según las presentes enseñanzas. Por tanto, ciertos casos de la descripción proporcionan procedimientos para producir anticuerpos anti-PTK7 o porciones de unión al antígeno de los mismos que comprenden las etapas de sintetizar una biblioteca de anticuerpos (preferentemente humanos) en fagos, cribar la biblioteca con una PTK7 seleccionada o una porción de unión al anticuerpo de la misma, aislar el fago que une la PTK7 y obtener los fragmentos inmunorreactivos del fago. A modo de ejemplo, un procedimiento para preparar la biblioteca de anticuerpos para uso en técnicas de presentación de fagos comprende las etapas de inmunizar un animal no humano que comprende loci de inmunoglobulina humana o no humana con la PTK7 seleccionada o una porción antigénica de la misma para crear una respuesta inmunitaria, extraer las células productoras de anticuerpos del animal inmunizado; aislar el ARN que codifica cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos de la invención de las células extraídas, someter a transcripción inversa el ARN para producir ADNc, amplificar el ADNc usando cebadores e insertar el ADNc en un vector de presentación en fago, de tal manera que los anticuerpos se expresan en el fago. Más particularmente, el ADN que codifica los dominios V^h y V^l se recombina junto con un enlazador de scFv mediante PCR y se clonan en un vector fagémido (p. ej., p CANTAB 6 o pComb 3 HSS). El vector se puede electroporar a continuación en E. coli y a continuación la E. coli se infecta con el fago auxiliar. Los fagos usados en estos procedimientos son habitualmente fagos filamentosos que incluyen fd y M13 y los dominios V^h y V^l normalmente se fusionan recombinantemente a indistintamente el gen II o gen II del fago.

[0104] Los anticuerpos anti-PTK7 humanos recombinantes de la presente invención se pueden aislar cribando una biblioteca de anticuerpos combinatoria recombinante preparada como se indicó anteriormente. En una realización preferida, la biblioteca es una biblioteca de presentación en fagos de scFv, generada usando los ADNc de Vl y Vh humanos preparados a partir de ARNm aislado de linfocitos B. Los procedimientos para preparar y cribar tales bibliotecas se conocen bien en la técnica y se comercializan kits para generar bibliotecas de presentación en fagos (p. ej., el sistema Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, n.° de catálogo 27-9400-01; y el kit de presentación de fagos SurfZAP™ de Stratagene, n.° de catálogo 240612). También hay otros procedimientos y reactivos que se pueden usar para generar y cribar bibliotecas de presentación de anticuerpos (véase, p. ej., la patente de EE. UU. n.° 5223409; los números de publicación PCT WO 92/18619, WO91/17271, WO 92/20791, WO 92/15679, WO 93/01288, WO 92/01047, WO 92/09690; Fuchs y col., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay y col., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse y col., Science 246:1275-1281 (1989); McCafferty y col., Nature 348:552-554 (1990); Griffiths y col., EMBO J. 12:725-734 (1993); Hawkins y col., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992); Clackson y col., Nature 352:624-628 (1991); Gram y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3576-3580 (1992); Garrad y col., Bio/Technology 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom y col., Nuc. Acid Res. 19:4133-4137 (1991); y Barbas y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978-7982 (1991).

[0105] Los anticuerpos producidos mediante bibliotecas de animales no inmunizados (ya sean naturales o sintéticas) pueden ser de afinidad moderada (Ka de aproximadamente 106 a 107 M'1), pero la maduración de la afinidad también se puede imitar in vitro por construyendo y reseleccionando a partir de bibliotecas secundarias como se describe en la técnica. Por ejemplo, se puede introducir una mutación aleatoria in vitro usando polimerasa propensa a errores (descrita en Leung y col., Technique, 1: 11-15 (1989)) en el procedimiento de Hawkins y col., J. Mol. Biol., 226: 889-896 (1992) o en el procedimiento de Gram y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3576-3580 (1992). Adicionalmente, la maduración de la afinidad se puede realizar mutando aleatoriamente una o más CDR, p. ej., usando PCR con cebadores que llevan una secuencia aleatoria que abarca la CDR de interés, en clones de Fv individuales seleccionados y cribando para seleccionar los clones de afinidad superior. El documento WO 9607754 describía un procedimiento para inducir la mutagénesis en una región determinante de la complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulina para crear una biblioteca de genes de las cadenas ligeras. Otra estrategia eficaz es recombinar los dominios V^h o V^l seleccionados mediante presentación en fagos con repertorios de variantes de los dominios V de origen natural obtenidos de donantes no inmunizados y cribar para seleccionar los de afinidad superior en varias rondas de retransposición de cadenas como se describe en Marks y col., Biotechnol., 10: 779-783 (1992). Esta técnica permite la producción de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo con una constante de disociación Kd (kdisociación/kasociación) de aproximadamente 10‘9 M o inferior.

[0106] Se apreciará además que se pueden emplear procedimientos similares usando bibliotecas que comprenden células eucariotas (p. ej., levaduras) que expresan pares de unión sobre su superficie. Al igual que con la tecnología de presentación en fagos, las bibliotecas eucariotas se criban contra al antígeno de interés (es decir, PTK7) y las células que expresan pares de unión potenciales se aíslan y clonan. Se pueden realizar etapas para optimizar el contenido de las bibliotecas y para la maduración de la afinidad de los pares de unión reactivos. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7700302 y la patente de EE. UU. n.° 12/404059. En una realización, el anticuerpo humano se selecciona a partir de una biblioteca de fagos, donde la biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan y col. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996): Sheets y col. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol, 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol, 222:581 (1991)). En otras realizaciones, se pueden aislar pares de unión humanos a partir de bibliotecas de anticuerpos combinatorias generadas en células eucariotas tales como levaduras. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7700302. Tales técnicas permiten ventajosamente el cribado de números grandes de moduladores potenciales y permiten la manipulación relativamente sencilla de las posibles secuencias (p. ej., mediante maduración de la afinidad o transposición recombinante).

[0107] Los anticuerpos humanos también se pueden producir introduciendo loci de inmunoglobulinas humanas en animales transgénicos, p. ej., ratones en los que se han inactivado parcial o completamente los genes de inmunoglobulina endógenos. Tras ello, se observa la producción de anticuerpos humanos, que se asemeja estrechamente a la observada en los seres humanos en todos los aspectos, lo que incluye la reordenación genética, el ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Esta estrategia se describe, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° 5 545807; 5545 806; 5569825; 5625126; 5633425; 5661 016 y las patentes de EE. UU. n.° 6075181 y 6150584 relativas a la tecnología XenoMouse®, junto con las publicaciones científicas siguientes: Marks y col., Bio/Technology 10: 779-783 (1992); Lonberg y col., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368:812-13 (1994); Fishwild y col., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Alternativamente, el anticuerpo humano se puede preparar mediante inmortalización de linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (tales linfocitos B se pueden recuperar de un individuo que padece un trastorno neoplásico o que puede haber sido inmunizado in vitro). Véase, por ejemplo, Cole y col., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1985); Boerner y col., J. Immunol, 147 (1):86-95 (1991); y la patente de EE. UU. n.° 5750373.

VI. Características de los anticuerpos

[0108] Independientemente de cómo se obtuviera o de cuales de las formas antes mencionadas tome el modulador (p. ej., humanizado, humano, etc.), los casos preferidos de los moduladores descritos pueden presentar diversas características. A este respecto, se pueden seleccionar, clonar y cribar adicionalmente células productoras de anticuerpos anti-PTK7 (p. ej., hibridomas o colonias de levaduras) para seleccionar características deseables que incluyen, por ejemplo, crecimiento robusto, producción de anticuerpos alta y, como se comenta más pormenorizadamente más adelante, características deseables de los anticuerpos. Los hibridomas se pueden expandir in vivo en animales singénicos, en animales que carecen de sistema inmunitario, p. ej., ratones atímicos, o en cultivos celulares in vitro. Los procedimientos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas y/o colonias, cada uno de los cuales produce una especie de anticuerpo distinta, son bien conocidos por los expertos en la materia.

a. Anticuerpos neutralizantes

[0109] En casos particularmente preferidos, los moduladores de la presente descripción comprenderán anticuerpos neutralizantes o derivados o fragmentos de los mismos. El término anticuerpo neutralizante o antagonista neutralizante se refiere a un anticuerpo o antagonista que se une a, o interactúa con, una molécula de PTK7 e impide la unión o asociación del ligando a cualquier par de unión, interrumpiendo de ese modo la respuesta biológica (p. ej., fosforilación o angiogénesis inducida por el VEGF) que de otro modo daría como resultado la interacción de las moléculas. Al evaluar la unión y especificidad de un anticuerpo o fragmento o derivado inmunológicamente funcional del mismo, un anticuerpo o fragmento inhibirá sustancialmente la unión del ligando a su par o sustrato de unión cuando un exceso de anticuerpo reduce la cantidad de par de unión unido a la molécula diana en al menos aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o más según se mide, por ejemplo, mediante fosforilación o sustratos seleccionados (Shin y col, Biochem and Biophys Res Com, Vol. 371:4) o en un ensayos de unión competitiva in vitro. En el caso de los anticuerpos contra la PTK7, por ejemplo, un anticuerpo o antagonista neutralizante preferentemente reducirá la capacidad de fosforilación de la PTK7 en comparación con un sustrato específico en al menos aproximadamente 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o más. Se apreciará que esta actividad disminuida se puede medir directamente usando técnicas reconocidas en la técnica o se puede medir mediante el impacto que tendrá tal reducción sobre actividades secundarias tales como la angiogénesis.

b. Anticuerpos internalizantes

[0110] Aunque las pruebas indican que la PTK7 o las isoformas seleccionadas de la misma pueden estar presentes en forma soluble, al menos algo de PTK7 permanece probablemente asociada a la superficie celular, permitiendo de ese modo la internalización de los moduladores descritos. Por consiguiente, los anticuerpos anti-PTK7 de la presente invención pueden ser internalizados, al menos en cierta medida, por células que expresan PTK7. Por ejemplo, un anticuerpo anti-PTK7 que se une a la PTK7 sobre la superficie de una célula iniciadora de tumores puede ser internalizado por la célula iniciadora de tumores. En realizaciones particularmente preferidas, tales anticuerpos anti-PTK7 se pueden asociar o conjugar a agentes anticancerígenos tales como restos citotóxicos que destruyen la célula tras la internalización

[0111] Como se emplea en esta memoria, un anticuerpo anti-PTK7 que se internaliza es uno que es absorbido por la célula tras la unión a la PTK7 asociada a una célula de mamífero. El anticuerpo internalizante incluye fragmentos de anticuerpo, anticuerpos humanos o humanizados y conjugados de anticuerpos. La internalización se puede producir in vitro o in vivo. Para aplicaciones terapéuticas, la internalización se puede producir in vivo. El número de moléculas de anticuerpo internalizadas puede ser suficiente o adecuado para destruir una célula que expresa PTK7, especialmente una célula iniciadora de tumores que expresa PTK7. En función de la potencia del anticuerpo o el conjugado de anticuerpo, en algunos casos, la absorción de una única molécula de anticuerpo en la célula es suficiente para destruir la célula diana a la que se une el anticuerpo. Por ejemplo, ciertas toxinas tienen una potencia de destrucción alta de tal manera que la internalización de una molécula de la toxina conjugada al anticuerpo es suficiente para destruir la célula tumoral. Si un anticuerpo anti-PTK7 se internaliza tras la unión a la PTK7 sobre una célula de mamífero se puede determinar mediante diversos ensayos que incluyen los descritos más adelante en los Ejemplos (p. ej., Ejemplos 12 y 13). Los procedimientos para detectar si un anticuerpo se internaliza en una célula también se describen en la patente de EE. UU. n.° 7619068.

c. Anticuerpos reductores

[0112] En otros casos preferidos, los moduladores de la presente descripción comprenderán anticuerpos reductores o derivados o fragmentos de los mismos. El término anticuerpo reductor se refiere a un anticuerpo que se une o asocia a una PTK7 sobre o cerca de la superficie celular e induce, favorece o causa la muerte, incapacitación o eliminación de la célula (p. ej., mediante citotoxicidad dependiente del complemento o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos). En algunas realizaciones comentadas más pormenorizadamente más adelante, los anticuerpos reductores seleccionados estarán asociados o conjugados a un agente citotóxico. Preferentemente, un anticuerpo reductor será capaz de retirar, incapacitar, eliminar o destruir al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 97 % o 99 % de las células perpetuadoras de tumores en una población de células definida. En algunas realizaciones, la población de células puede comprender células perpetuadoras de tumores enriquecidas, seccionadas, purificadas o aisladas. En otras realizaciones, la población de células puede comprender muestras de tumores completos o extractos de tumores heterogéneos que comprenden células perpetuadoras de tumores. Los expertos en la materia apreciarán que se pueden usar técnicas bioquímicas convencionales como se describe más adelante en los Ejemplos (p. ej., Ejemplos 13 y 14) para realizar el seguimiento y cuantificar la eliminación de las células tumorigénicas o células perpetuadoras de tumores según las enseñanzas de la presente memoria.

d. Unión a epítopos

[0113] Se apreciará además que los anticuerpos anti-PTK7 descritos se asociarán o unirán a epítopos o determinantes distintos presentados por la una o más dianas seccionadas. Como se emplea en esta memoria, el término epítopo se refiere a esa porción del antígeno diana capaz de ser reconocida y unida específicamente por un anticuerpo particular. Cuando el antígeno es un polipéptido tal como la PTK7, se pueden formar epítopos tanto a partir de aminoácidos contiguos como de aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por el plegamiento terciario de una proteína. Los epítopos formados a partir de aminoácidos contiguos habitualmente se conservan tras la desnaturalización de la proteína, mientras que los epítopos formados por el plegamiento terciario habitualmente se pierden tras la desnaturalización de la proteína. Un epítopo habitualmente incluye al menos 3 y, más frecuentemente, al menos 5 u 8-10 aminoácidos en una conformación espacial singular. Más específicamente, el experto en la materia apreciará que el término epítopo incluye cualquier determinante proteico capaz de unirse específicamente a un receptor de inmunoglobulinas o linfocitos T o de interaccionar de otro modo con una molécula. Los determinantes epitópicos consisten generalmente en agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como cadenas laterales de aminoácidos, carbohidratos o azúcares y generalmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Adicionalmente, un epítopo puede ser lineal o conformacional. En un epítopo lineal, todos los puntos de interacción entre la proteína y la molécula interactuante (tal como un anticuerpo) se presentan linealmente a lo largo de la secuencia primaria de aminoácidos de la proteína. En un epítopo conformacional, los puntos de interacción se presentan transversalmente a los residuos de aminoácidos de la proteína que están separados linealmente entre sí.

[0114] Una vez que se determina un epítopo deseado sobre un antígeno, es posible generar anticuerpos para ese epítopo, p. ej., inmunizando con un péptido que comprende el epítopo usando técnicas descritas en la presente descripción. Alternativamente, durante el procedimiento de descubrimiento, la generación y caracterización de anticuerpos puede arrojar información sobre epítopos deseables. A partir de esta información, es posible cribar competitivamente a continuación para seleccionar los anticuerpos que se unen al mismo epítopo. Una estrategia para conseguir esto es realizar estudios de competición para encontrar anticuerpos que se unen competitivamente entre sí, es decir, los anticuerpos compiten por la unión al antígeno. Un procedimiento de alto rendimiento para el agrupamiento de datos de anticuerpos en base a su competitividad cruzada se describe en el documento WO 03/48731.

[0115] Como se emplea en esta memoria, el término agrupamiento de datos se refiere a un procedimiento para agrupar anticuerpos en base a sus características de unión al antígeno. La asignación de los grupos de datos es algo arbitraria, en función de cómo de diferentes son los patrones de unión observados de los anticuerpos ensayados. Por tanto, aunque la técnica es una herramienta útil para clasificar anticuerpos de la presente invención, los grupos de datos no siempre se interrelacionan directamente con los epítopos y tales determinaciones iniciales de la unión a epítopos se deben confirmar adicionalmente mediante otra metodología reconocida en la técnica como se describe en esta memoria.

[0116] Con esta advertencia, se puede determinar si un anticuerpo primario seleccionado (o fragmento del mismo) se une al mismo epítopo o presenta competitividad cruzada por la unión con un segundo anticuerpo usando procedimientos conocidos en la técnica y expuestos en los Ejemplos de la presente memoria. En una realización, se permite que el anticuerpo primario de la invención se una a la PTK7 en condiciones de saturación y a continuación se mide la capacidad del anticuerpo secundario para unirse a la PTK7. Si el anticuerpo de ensayo es capaz de unirse a la PTK7 al mismo tiempo que el anticuerpo anti-PTK7 primario, entonces el anticuerpo secundario se une a un epítopo diferente que el anticuerpo primario. Sin embargo, si el anticuerpo secundario no es capaz de unirse a la pTK7 al mismo tiempo, entonces el anticuerpo secundario se une al mismo epítopo, un epítopo superpuesto o un epítopo que se encuentra muy próximo al epítopo unido por el anticuerpo primario. Como se sabe en la técnica y se comenta pormenorizadamente más adelante en los Ejemplos, los datos se pueden obtener usando radioinmunoanálisis (RIA) directo o indirecto en fase sólida, enzimoinmunoanálisis (EIA o ELISA) directo o indirecto en fase sólida, análisis competitivo de tipo sándwich, un sistema Biacore™ (es decir, resonancia de plasmones superficiales, GE Healthcare), un analizador ForteBio® (es decir, interferometría de biocapa, ForteBio, Inc.) o citometría de flujo. El término resonancia de plasmones superficiales, como se emplea en esta memoria, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones específicas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones proteicas dentro de una matriz de biosensor. En un caso particularmente preferido, el análisis se realiza usando un instrumento Biacore o ForteBio como se demuestra en los Ejemplos más adelante.

[0117] El término competir, cuando se usa en el contexto de los anticuerpos, significa competición entre anticuerpos según se determina mediante un ensayo en el que el anticuerpo o fragmento inmunológicamente funcional objeto del ensayo impide o inhibe la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común.

Habitualmente, tal ensayo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o a células que llevan cualquiera de estos, una inmunoglobulina de ensayo no marcada y una inmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide determinando la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o las células en presencia de la inmunoglobulina de ensayo. Normalmente, la inmunoglobulina de ensayo está presente en exceso.

Los anticuerpos identificados mediante un ensayo de competición (anticuerpos competidores) incluyen anticuerpos que se unen al mismo epítopo que el anticuerpo de referencia y anticuerpos que se unen a un epítopo adyacente lo suficientemente próximo al epítopo unido por el anticuerpo de referencia para que haya impedimentos estéricos. Los detalles adicionales relativos a procedimientos para determinar la unión competitiva se proporcionan en los Ejemplos más adelante. Normalmente, cuando un anticuerpo competidor está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común en al menos 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 % o 75 %.

En algunos casos, la unión se inhibe en al menos 80 %, 85 %, 90 %, 95 % o 97 % o más.

[0118] Además de la especificidad por el epítopo, los anticuerpos descritos se pueden caracterizar usando varias características físicas diferentes que incluyen, por ejemplo, las afinidades de unión, la temperatura de fusión

(Tf) y los puntos isoeléctricos.

e. Afinidad de unión

[0119] A este respecto, la presente descripción abarca además el uso de anticuerpos que tienen una afinidad de unión alta por una ^pTK7 seleccionada o, en el caso de los pananticuerpos, por más de un tipo de PTK7. Se dice que un anticuerpo de la invención une específicamente su antígeno diana cuando la constante de disociación Kd (kdisociación/kasociación) es <10-8 M. El anticuerpo une específicamente el antígeno con afinidad alta cuando la Kd es <5 x

10-9 M y con afinidad muy alta cuando la Kd es <5 x 10-10M. En una realización de la invención, el anticuerpo tiene una

Kd de <10-9M y una velocidad de disociación de aproximadamente 1 x 10-4/s. En una realización de la invención, la velocidad de disociación es <1 x 10-5/s. En otras realizaciones de la invención, los anticuerpos se unirán a la PTK7 con una Kd de entre aproximadamente 10-8 M y 10-10M, y en otra realización más se unirán una Kd <2 x realizaciones seleccionadas más de la presente invención comprenden anticuerpos que tienen una constante de disociación o Kd (koff/kon) inferior a 10-2 M, inferior a 5 x 10-2 M, inferior a 10-3 M, inferior a 5 x 10-3 M, inferior a 10-4 M, inferior a 5 x 10-4 M, inferior a 10-5 M, inferior a 5 x 10-5 M, inferior a 10-6 M, inferior a 5 x 10-6 M, inferior a 10-7 M, inferior a 5 x 10-7 M, inferior a 10-8 M, inferior a 5 x 10-8 M, inferior a 10-9 M, inferior a 5 x 10-9 M, inferior a 10-10 M, inferior a 5 x

10-10 M, inferior a 10-11 M, inferior a 5 x 10-11 M, inferior a 10-12 M, inferior a 5 x 10-12 M, inferior a 10-13 M, inferior a 5 x

10-13M, inferior a 10-14 M, inferior a 5 x 10-14M, inferior a 10-15M o inferior a 5 x 10-15M.

[0120] En realizaciones específicas, un anticuerpo de la invención que se une inmunoespecíficamente a la

PTK7 tiene una constante de velocidad de asociación o kon (PTK7 (Ab) antígeno (Ag)kon-^Ab-Ag) de al menos 105 M-1s-1, al menos 2 x 105 M-1s-1, al menos 5 x 105 M-1s-1, al menos 106 M-1s-1, al menos 5 x 106 al menos 5 x 107 M-1s-1 o al menos 108 M-1s-1.

[0121] En otra realización, un anticuerpo de la invención que se une inmunoespecíficamente a la PTK7 tiene una constante de velocidad de disociación o koff (PTK7 (Ab) antígeno (Ag)koff^Ab-Ag) inferior a 10-1 s-1, inferior a 5 x 10-1 s-1, inferior a 10-2s-1, inferior a 5 x 10-2s-1, inferior a 10-3s-1, inferior a 5 x 10-3s-1, inferior a 10-4s-1, inferior a 5 x

10-4s-1, inferior a 10-5s-1, inferior a 5 x 10-5s-1, inferior a 10-6s-1, inferior a 5 x 10-6s-1 inferior a 10-7s-1, inferior a 5 x 10-7s-1, inferior a 10-8s-1, inferior a 5 x 10-8s-1, inferior a 10-9s-1, inferior a 5 x 10-9s-1 o inferior a 10'1°s '1.

[0122] En otras realizaciones seleccionadas de la presente invención, los anticuerpos anti-PTK7 tendrán una constante de afinidad o Ka (kon/kf de al menos 102 M-1, al menos 5 x 102 M-1, al menos 103 M-1, al menos 5 x 103 M-1, al menos 104 M-1, al menos 5 x 104 M-1, al menos 105 M-1, al menos 5 x 105 M-1, al menos 106 M-1, al menos 5 x 106 M-1, al menos 107 M-1, al menos 5 x 107 M-1, al menos 108 M-1, al menos 5 x 108 M-1, al menos 109 M-1, al menos 5 x 109 M-1, al menos 1010 M-1, al menos 5 x 1010 M-1, al menos 1011 M-1, al menos 5 x 1011 M-1, al menos 1012 M-1, al menos 5 x

1012 M-1, al menos 1013M-1, al menos 5 x 1013M-1, al menos 1014M-1, al menos 5 x 1014M-1, al menos 1015M-1 o al menos 5 x 1015 M-1.

f. Puntos isoeléctricos

[0123] Además de las propiedades de unión antes mencionadas, los anticuerpos anti-PTK7 y fragmentos de los mismos, al igual que todos los polipéptidos, tienen un punto isoeléctrico (pl), que generalmente se define como el pH al que un polipéptido no lleva carga neta. Se sabe en la técnica que la solubilidad de las proteínas es habitualmente la mínima cuando el pH de la solución es igual al punto isoeléctrico (pl) de la proteína. Por lo tanto, es posible optimizar

la solubilidad alterando el número y la ubicación de residuos ionizables en el anticuerpo para ajustar el pI. Por ejemplo, el pI de un polipéptido se puede manipular haciendo las sustituciones de aminoácidos apropiadas (p. ej., sustituyendo un aminoácido cargado, tal como una lisina, por un residuo no cargado tal como alanina). Sin pretender ceñirnos a ninguna teoría particular, las sustituciones de aminoácidos de un anticuerpo que dan como resultado cambios en el pI de dicho anticuerpo pueden mejorar la solubilidad y/o estabilidad del anticuerpo. Un experto en la materia entenderá qué sustituciones de aminoácidos serían las más apropiadas para que un anticuerpo particular consiga un pI deseado.

[0124] El pI de una proteína se puede determinar mediante un abanico de procedimientos que incluyen, pero no se limitan a, isoelectroenfoque y diversos algoritmos computacionales (véase, por ejemplo, Bjellqvist y col., 1993, Electrophoresis 14:1023). En una realización, el pI de los anticuerpos anti-PTK7 de la invención es superior a aproximadamente 6,5, aproximadamente 7,0, aproximadamente 7,5, aproximadamente 8,0, aproximadamente 8,5 o aproximadamente 9,0. En otra realización, el pI de los anticuerpos anti-PTK7 de la invención es superior a 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5 o 9,0. En otra realización más, las sustituciones que dan como resultado alteraciones en el pI de los anticuerpos de la invención no reducirán significativamente su afinidad de unión por la PTK7. Como se comenta más pormenorizadamente más adelante, se contempla específicamente que la una o más sustituciones de la región Fc que dan como resultado una unión alterada al FcyR también pueden dar como resultado un cambio en el pI. En una realización preferida, la una o más sustituciones de la región Fc se eligen específicamente para lograr tanto la alteración deseada en la unión al FcyR como cualquier cambio deseado en el pI. Como se emplea en esta memoria, el valor del pI se define como el pI de la forma de carga predominante.

g. Estabilidad térmica

[0125] Se apreciará además que la Tf del dominio Fab de un anticuerpo puede ser un buen indicador de la estabilidad térmica de un anticuerpo y puede proporcionar además un indicio de la vida útil. La Tf es simplemente la temperatura de desplegamiento de 50 % para un dominio o una secuencia determinados. Una Tf inferior indica más agregación/menos estabilidad, mientras que una Tf superior indica menos agregación/más estabilidad. Por tanto, los anticuerpos, fragmentos o derivados que tienen una Tf superior son preferibles. Asimismo, usando técnicas reconocidas en la técnica es posible alterar la composición de los anticuerpos anti-PTK7 o dominios de los mismos para aumentar u optimizar la estabilidad molecular. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 7960142. Por tanto, en una realización, el dominio Fab de un anticuerpo seleccionado tiene un valor de Tf superior a al menos 50 °C, 55 °C, 60 °C, 65 °C, 70 °C, 75 °C, 80 °C, 85 °C, 90 °C, 95 °C, 100 °C, 105 °C, 110 °C, 115 °C o 120 °C. En otra realización, el dominio Fab de un anticuerpo tiene un valor de Tf superior a al menos aproximadamente 50 °C, aproximadamente 55 °C, aproximadamente 60 °C, aproximadamente 65 °C, aproximadamente 70 °C, aproximadamente 75 °C, aproximadamente 80 °C, aproximadamente 85 °C, aproximadamente 90 °C, aproximadamente 95 °C, aproximadamente 100 °C, aproximadamente 105 °C, aproximadamente 110 °C, aproximadamente 115 °C o aproximadamente 120 °C. Las temperaturas de fusión térmica (Tf) de un dominio proteico (p. ej., un dominio Fab) se pueden medir usando cualquier procedimiento convencional conocido en la técnica, por ejemplo, mediante calorimetría diferencial de barrido (véase, p. ej., Vermeer y col., 2000, Biophys. J. 78:394-404; Vermeer y col., 2000, Biophys. J. 79: 2150-2154).

VII. Fragmentos y derivados de moduladores de la PTK7

[0126] Si los agentes de la presente descripción comprenden construcciones de fusión intactas, anticuerpos, fragmentos o derivados, los moduladores seleccionados reaccionarán, se unirán, se combinarán, formarán complejos, se conectarán, se fijarán, se unirán, interactuarán o se asociarán de otro modo con la PTK7 y proporcionarán de ese modo los efectos antineoplásicos deseados. Los expertos en la materia apreciarán que los moduladores que comprenden anticuerpos anti-PTK7 interactúan o se asocian con la PTK7 a través de uno o más puntos de unión expresados sobre el anticuerpo. Más específicamente, como se emplea en esta memoria, el término punto de unión comprende una región de un polipéptido que es responsable de unirse selectivamente a una molécula diana de interés (p. ej., enzima, antígeno, ligando, receptor, sustrato o inhibidor). Los dominios de unión comprenden al menos un punto de unión (p. ej., un anticuerpo de IgG intacto tendrá dos dominios de unión y dos puntos de unión). Los dominios de unión ejemplares incluyen un dominio variable de anticuerpo, un dominio de unión al receptor de un ligando, un dominio de unión al ligando de un receptor o un dominio enzimático. A los efectos de la presente invención, la región activa habitual de la PTK7 (p. ej., como parte de una construcción de fusión Fc-PTK7) puede comprender un punto de unión para un sustrato o favorecer la fosforilación.

a. Fragmentos

[0127] Independientemente de qué forma de modulador (p. ej., quimérico, humanizado, etc.) se selecciona para poner en práctica la invención, se apreciará que los fragmentos inmunorreactivos del mismo se pueden usar según las enseñanzas de esta memoria. En términos más generales, el término fragmento de anticuerpo comprende al menos una porción de un anticuerpo intacto (p. ej., una inmunoglobulina de origen natural). Más particularmente, el término fragmento se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o una cadena de anticuerpo (o molécula de PTK7 en el caso de las fusiones de Fc) que comprende menos residuos de aminoácidos que un anticuerpo o una cadena de anticuerpo intactos o completos. El término fragmento de unión al antígeno se refiere a un fragmento polipeptídico de una inmunoglobulina o un anticuerpo que se une al antígeno o compite con el anticuerpo intacto (es decir, con el anticuerpo intacto del que procede) por la unión al antígeno (es decir, unión específica). Como se emplea en esta memoria, el término fragmento de una molécula de anticuerpo incluye fragmentos de unión al antígeno de anticuerpos, por ejemplo, una cadena ligera de anticuerpo (V^l), una cadena pesada de anticuerpo (V^h), un anticuerpo monocatenario (scFv), un fragmento F(ab') 2, un fragmento Fab, un fragmento Fd, un fragmento Fv, fragmentos de anticuerpo de dominio único, diacuerpos, anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpo monocatenario y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. Similarmente, un fragmento activo de PTK7 comprende una porción de la molécula de PTK7 que conserva su capacidad para interactuar con sustratos o receptores de la PTK7 y modificarlos de una manera similar a la de una PTK7 intacta (p. ej., fosforilación, aunque quizás con algo menos de eficacia).

[0128] Los expertos en la materia apreciarán que los fragmentos se pueden obtener mediante tratamiento químico o enzimático de un modulador intacto o completo (p. ej., anticuerpo o cadena de anticuerpo) o por medios recombinantes. A este respecto, aunque se definen diversos fragmentos de anticuerpo en términos de la digestión de un anticuerpo intacto, un experto en la materia apreciará que tales fragmentos se pueden sintetizar de novo indistintamente químicamente o usando metodología de ADN recombinante. Por tanto, el término anticuerpo, como se emplea en esta memoria, incluye explícitamente anticuerpos o fragmentos o derivados de los mismos producidos indistintamente mediante la modificación de anticuerpos completos o sintetizados de novo usando metodologías de ADN recombinante.

[0129] Más específicamente, la digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos Fab, cada uno con un único punto de unión al antígeno, y un fragmento Fc residual, cuyo nombre refleja su capacidad de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab') ² que tiene dos puntos de unión al antígeno y sigue siendo capaz de reticular antígeno. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (C^h1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab en la adición de unos cuantos residuos en el extremo carboxilo del dominio C^h1 de la cadena pesada que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la denominación en esta memoria para Fab' en los que el uno o más residuos de cisteína de los dominios constantes llevan al menos un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab^{' ) 2} se produjeron originalmente como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo. Véase, p. ej., Fundamental Immunology, W. E. Paul, ed., Raven Press, N.Y. (1999), para consultar una descripción más pormenorizada de otros fragmentos de anticuerpo.

[0130] Se apreciará además que un fragmento Fv es un fragmento de anticuerpo que contiene un punto de reconocimiento y unión al antígeno completo. Esta región se compone de un dímero del dominio variable de una cadena pesada y una ligera en estrecha asociación, que puede ser de naturaleza covalente, por ejemplo, en scFv. En esta configuración, las tres CDR de cada dominio variable interactúan para definir un punto de unión al antígeno sobre la superficie del dímero V^h-V^l. Conjuntamente, las seis CDR o un subconjunto de las mismas confieren especificidad de unión al antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de reconocer y unir el antígeno, aunque normalmente con una afinidad inferior que el punto de unión completo.

[0131] En otras realizaciones, un fragmento de anticuerpo es, por ejemplo, uno que comprende la región Fc, conserva al menos una de las funciones biológicas asociadas normalmente a la región Fc cuando está presente en un anticuerpo intacto, tal como la unión al FcRn, modulación de la semivida del anticuerpo, función de ADCC y unión al complemento. En una realización, un fragmento de anticuerpo es un anticuerpo monovalente que tiene una semivida in vivo sustancialmente similar a un anticuerpo intacto. Por ejemplo, tal fragmento de anticuerpo puede comprender un brazo de unión al antígeno enlazado a una secuencia de Fc capaz de conferir estabilidad in vivo al fragmento.

b. Derivados

[0132] En otro aspecto, se apreciará además que los moduladores de la descripción pueden ser monovalentes o multivalentes (p. ej., bivalentes, trivalentes, etc.). Como se emplea en esta memoria, el término valencia se refiere al número de puntos de unión a la diana (es decir, PTK7) potenciales asociados a un anticuerpo. Cada punto de unión a la diana une específicamente una molécula diana o una posición o un locus específicos sobre una molécula diana. Cuando un anticuerpo de la presente invención comprende más de un punto de unión a la diana (multivalente), cada punto de unión a la diana puede unir específicamente la misma o diferentes moléculas (p. ej., se puede unir a ligandos diferentes o antígenos diferentes, o a epítopos o posiciones diferentes sobre el mismo antígeno). A los efectos de la presente invención, los anticuerpos objetivo tendrán preferentemente al menos un punto de unión específico para la PTK7 humana. En una realización, los anticuerpos de la presente invención serán monovalentes, de manera que cada punto de unión de la molécula se unirá específicamente a una única posición o epítopo de la PTK7. En otras realizaciones, los anticuerpos serán multivalentes, de manera que comprenden más de un punto de unión y los diferentes puntos de unión se asocian específicamente a más de una única posición o epítopo. En tales casos, los múltiples epítopos pueden estar presentes sobre el polipéptido de PTK7 o la variante de corte y empalme seleccionados o un único epítopo puede estar presente sobre la PTK7, mientras que un segundo epítopo diferente puede estar presente sobre otra molécula o superficie. Véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 2009/0130105.

[0133] Como se ha mencionado anteriormente, los anticuerpos multivalentes se pueden unir inmunoespecíficamente a diferentes epítopos de la molécula diana deseada o se pueden unir inmunoespecíficamente tanto a la molécula diana como a un epítopo heterólogo, tal como un polipéptido o material de soporte sólido heterólogo. Aunque las realizaciones preferidas de los anticuerpos anti-PTK7 unen solo dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecíficos), la presente invención también abarca anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecíficos. Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos incluyen, sin limitación, aquellos con un brazo dirigido contra la PTK7 y el otro brazo dirigido contra cualquier otro antígeno (p. ej., un marcador celular del modulador). Los procedimientos para fabricar anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa está basada en la coexpresión de dos pares de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein y col., 1983, Nature, 305:537-539). Otras construcciones multiespecíficas compatibles más sofisticadas y procedimientos para su fabricación se exponen en la patente de EE. UU. n.° 2009/0155255.

[0134] En otras realizaciones más, los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (puntos de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias del dominio constante de inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de las cadenas pesadas de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra Ch2 y/o Ch3. En un ejemplo, la primera región constante de las cadenas pesadas (C^h1) que contiene el punto necesario para la unión a las cadenas ligeras está presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de las cadenas pesadas de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión independientes y se cotransfectan a un organismo hospedador adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipeptídicos en las realizaciones cuando las relaciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o las tres cadenas polipeptídicas en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en relaciones iguales da como resultado rendimientos altos o cuando las relaciones no son de importancia particular.

[0135] En una realización de esta estrategia, los anticuerpos biespecíficos están compuestos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo (p. ej., PTK7) y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrido (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica permite una forma sencilla de separación. Esta estrategia se describe en el documento WO 94/04690. Para conocer más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos, véase, por ejemplo, Suresh y col., 1986, Methods in Enzymology, 121:210. Según otra estrategia descrita en el documento WO 96/27011, se puede genomanipular un par de moléculas de anticuerpo para maximizar el porcentaje de heterodímeros que se recuperan del cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende al menos una parte del dominio C^h3 de un dominio constante de anticuerpo. En este procedimiento, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se sustituyen por cadenas laterales más grandes (p. ej., tirosina o triptófano). Se crean cavidades compensadoras de tamaño idéntico o similar a la una o más cadenas laterales grandes sobre la interfase de la segunda molécula de anticuerpo sustituyendo cadenas laterales de aminoácidos grandes por cadenas laterales más pequeñas (p. ej., alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros.

[0136] Los anticuerpos biespecíficos también incluyen anticuerpos reticulados o heteroconjugados. Por ejemplo, uno de los anticuerpos del heteroconjugado puede estar acoplado a avidina y el otro a biotina. Tales anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmunitario a células no deseadas (patente de EE. Uu . n.° 4676980) y para el tratamiento de la infección por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se pueden fabricar usando cualquier procedimiento de reticulación conveniente. Los agentes reticulantes adecuados se conocen bien en la técnica y se describen en la patente de EE. UU. n.° 4676980, junto con varias técnicas de reticulación.

VIII. Moduladores de la PTK7 - Modificaciones de la región constante

a. Región Fc y receptores de la Fc

[0137] Además de las diversas modificaciones, sustituciones, adiciones o eliminaciones a la región variable o de unión de los moduladores descritos (p. ej., Fc-PTK7 o anticuerpos anti-PTK7) expuestas anteriormente, los expertos en la materia apreciarán que casos seccionados de la presente descripción también pueden comprender sustituciones o modificaciones de la región constante (es decir, la región Fc). Más particularmente, se contempla que los moduladores de la PTK7 de la descripción pueden contener, entre otras, una o más sustituciones, mutaciones y/o modificaciones de residuos de aminoácidos adicionales que dan como resultado un compuesto con características preferidas que incluyen, pero no se limitan a: farmacocinética alterada, semivida en suero aumentada, afinidad de unión aumentada, inmunogenicidad reducida, producción aumentada, unión alterada al ligando de Fc, actividad ADCC o CDC mejorada o reducida, glucosilación alterada y/o enlaces disulfuro y una especificidad de unión modificada. A este respecto, se apreciará que estas variantes de Fc se pueden usar ventajosamente para mejorar las propiedades antineoplásicas efectivas de los moduladores descritos.

[0138] El término región Fc, en esta memoria, se usa para definir una región carboxiterminal de una cadena pesada de inmunoglobulina, que incluye regiones Fc de la secuencia natural y regiones Fc de la variante. Aunque los límites de la región Fc de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fc de la cadena pesada de IgG humana normalmente se define para que se prolongue desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo carboxilo de la misma. La lisina carboxiterminal (residuo 447 según el sistema de numeración de la UE) de la región Fc se puede retirar, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o genomanipulando recombinantemente el ácido nucleico que codifica una cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 retirados, poblaciones de anticuerpos sin ningún residuo K447 retirado y poblaciones de anticuerpos que tienen una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447. Una región Fc funcional posee una función efectora de una región Fc de la secuencia natural. Las funciones efectoras ejemplares incluyen unión al Clq; CDC; unión al receptor de Fc; ADCC; fagocitosis; reducción de la regulación de los receptores de la superficie celular (p. ej., receptor de linfocitos B; BCR), etc. Tales funciones efectoras generalmente requieren que la región Fc se combine con un dominio de unión (p. ej., un dominio variable de anticuerpo) y se pueden evaluar usando diversos ensayos como se describen, por ejemplo, en las definiciones de la presente memoria.

[0139] El receptor de Fc o FcR describe un receptor que se une a la región Fc de un anticuerpo. En algunas realizaciones, un FcR es un FcR humano natural. En algunas realizaciones, un FcR es uno que une un anticuerpo de IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases F^cyRI, Fc.RII y F^cyRIII, lo que incluye variantes alélicas y formas sometidas a corte y empalme alternativo de esos receptores. Los receptores de F^cyII incluyen F^cyRIIA (un receptor activador) y FcyRIIB (un receptor inhibidor), que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en los dominios citoplasmáticos de los mismos. El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación a base de tirosina inmunorreceptor (ITAM) en su dominio citoplasmático. El receptor inhibidor F^yRIIB contiene un motivo de inhibición a base de tirosina inmunorreceptor (ITIM) en su dominio citoplasmático (véase, p. ej., Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). Los FcR se analizan, por ejemplo, en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel y col., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas y col., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, lo que incluye los que se identificarán en el futuro, están abarcados por el término FcR en esta memoria. El término receptor de Fc o FcR también incluye el receptor neonatal, FcRn, que, en ciertos casos, es responsable de la transferencia de IgG maternas al feto (Guyer y col., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kim y col., J. Immunol. 24:249 (1994)) y la regulación de la homeostasis de las inmunoglobulinas. Se conocen procedimientos para medir la unión al FcRn (véase, p. ej., Ghetie y Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997); Ghetie y col., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997); Hinton y col., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004); el documento WO 2004/92219 (Hinton y col.).

b. Funciones de la región Fc

[0140] Como se emplea en esta memoria, citotoxicidad dependiente del complemento y CDC se refieren a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La vía de activación del complemento es iniciada por la unión del primer componente del sistema del complemento (C1q) a una molécula, por ejemplo, un anticuerpo, complejada con un antígeno análogo. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de la CDC, p. ej., como se describe en Gazzano-Santoro y col., 1996, J. Immunol. Methods, 202:163.

[0141] Además, citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos o ADCC se refiere a una forma de citotoxicidad en la que la Ig secretada unida sobre los receptores de Fc (FcR) presentes en ciertas células citotóxicas (p. ej., linfocitos citolíticos naturales (NK), neutrófilos y macrófagos) permite a estas células efectoras citotóxicas unirse específicamente a una célula diana portadora de antígeno y posteriormente destruir la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos de IgG de alta afinidad específicos dirigidos a las células citotóxicas del brazo diana son absolutamente necesarios para tal destrucción. La lisis de la célula diana es extracelular, requiere contacto intercelular directo y no implica al complemento.

[0142] Una variante de modulador de la PTK7 con afinidad de unión al FcR o actividad ADCC alterada es una que tiene actividad de unión al FcR y/o actividad ADCC mejoradas o reducidas en comparación con un anticuerpo precursor o no modificado o con un modulador que comprende una región Fc de la secuencia natural. La variante de modulador que presenta unión aumentada a un FcR une al menos un FcR con afinidad superior al anticuerpo precursor o no modificado o a un modulador que comprende una región Fc de la secuencia natural. Una variante que presenta unión reducida a un FcR, une al menos un FcR con afinidad inferior al anticuerpo precursor o no modificado o a un modulador que comprende una región Fc de la secuencia natural. Tales variantes que presentan unión reducida a un FcR pueden poseer poca unión o unión inapreciable a un FcR, p. ej., 0-20 % de unión al FcR en comparación con una región Fc de IgG de la secuencia natural, p. ej., como se determina mediante técnicas bien conocidas en la técnica.

[0143] En lo que respecta al FcRn, los anticuerpos de la presente invención también comprenden o abarcan variantes de Fc con modificaciones a la región constante que proporcionan semividas (p. ej., semividas en suero) en un mamífero, preferentemente un ser humano, superiores a 5 días, superiores a 10 días, superiores a 15 días, preferentemente superiores a 20 días, superiores a 25 días, superiores a 30 días, superiores a 35 días, superiores a 40 días, superiores a 45 días, superiores a 2 meses, superiores a 3 meses, superiores a 4 meses o superiores a 5 meses. Las semividas aumentadas de los anticuerpos (o moléculas que contienen la Fc) de la presente invención en un mamífero, preferentemente un ser humano, dan como resultado un título sérico superior de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo en el mamífero y, por tanto, reducen la frecuencia de la administración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo y/o reducen la concentración de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se debe administrar. Los anticuerpos que tienen semividas in vivo aumentadas se pueden generar mediante técnicas conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos con semividas in vivo aumentadas modificando (p. ej., sustituyendo, eliminando o añadiendo) residuos de aminoácidos identificados como implicados en la interacción entre el dominio Fc y el receptor FcRn (véanse, p. ej., las publicaciones internacionales n.° WO 97/34631; WO 04/029207; la patente de EE. UU. n.° 6737056 y la patente de EE. UU. n.° 2003/0190311. La unión al FcRn humano in vivo y la semivida en suero de los polipéptidos de unión de alta afinidad al FcRn humano se pueden ensayar, p. ej., en ratones transgénicos o estirpes celulares humanas transfectadas que expresan el FcRn humano, o en primates a los que se administran los polipéptidos con una región Fc de la variante. El documento WO 2000/42072 describe variantes de anticuerpo con unión a FcRn mejorada o reducida. Véase también, p. ej., Shields y col. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001).

c. Modificaciones de la glucosilación

[0144] En otras realizaciones más, se modifican los patrones de glucosilación o las composiciones de los anticuerpos de la invención. Más particularmente, las realizaciones preferidas de la presente invención pueden comprender una o más glucoformas genomanipuladas, es decir, un patrón de glucosilación alterado o una composición de carbohidratos alterada que está fijada covalentemente a una molécula que comprende una región Fc. Las glucoformas genomanipuladas pueden ser útiles para un abanico de fines, que incluyen, pero no se limitan a, mejorar o reducir la función efectora, aumentar la afinidad del anticuerpo por un antígeno diana o facilitar la producción del anticuerpo. En ciertas realizaciones en las que se desea una función efectora reducida, se apreciará que la molécula se puede genomanipular para que se exprese una forma no glucosilada. Tales modificaciones de carbohidratos se pueden lograr, por ejemplo, alterando uno o más puntos de glucosilación en la secuencia de los anticuerpos. Es decir, se pueden hacer una o más sustituciones de aminoácidos que dan como resultado la eliminación de uno o más puntos de glucosilación del marco de la región variable para eliminar de ese modo la glucosilación en ese punto (véanse, p. ej., las patentes de EE. UU. n.° 5714350 y 6350861. Por el contrario, se pueden otorgar funciones efectoras mejoradas o una unión mejorada a la molécula que contiene la Fc genomanipulando uno o más sitios de glucosilación adicionales.

[0145] Adicional o alternativamente, se puede fabricar una variante de Fc que tiene una composición de glucosilación alterada, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene unas estructuras de GlcNAc bisectrices aumentadas. Se ha demostrado que estos y otros patrones de glucosilación alterados similares aumentan la capacidad de ADCC de los anticuerpos. Se pueden generar glucoformas genomanipuladas mediante cualquier procedimiento conocido por un experto en la materia, por ejemplo, usando cepas genomanipuladas o de variantes de expresión (por ejemplo, N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTI11)), expresando una molécula que comprende una región Fc en diversos organismos o en estirpes celulares de diversos organismos, o modificando uno o más carbohidratos después de que se haya expresado la molécula que comprende la región Fc. Véase, por ejemplo, Shields, R. L. y col. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana y col. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, así como la patente europea n.°: EP 1176195; y las publicaciones PCT WO 03/035835. WO 99/54342, Umana y col., 1999, Nat. Biotechnol 17:176-180; Davies y col., 20017 Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields y col., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa y col., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473; la patente de EE. u U. n.° 6602684; las solicitudes de patente de EE. UU. con n.° de serie 10/277370; 10113929; las publicaciones PCT WO 00/61739A1; PCT WO 01/292246A1; PCT WO 02/311140A1; PCT WO 02/30954A1; la tecnología Potillegent™ (Biowa, Inc.); la tecnología de ingeniería de glucosilación GlycoMAb™ (GLYCART biotechnology AG); el documento WO 00061739 el documento EA01229125; la patente de EE. UU. n.° 2003/0115614; Okazaki y col., 2004, JMB, 336: 1239-49.

IX. Expresión de los moduladores

a. Compendio

[0146] El ADN que codifica los moduladores de la PTK7 deseados se puede aislar y secuenciar fácilmente usando procedimientos convencionales (p. ej., usando sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos). Las células de hibridoma aisladas y subclonadas (o colonias procedentes de fagos o levaduras) pueden servir como una fuente preferida de tal ADN si el modulador es un anticuerpo. Si se desea, el ácido nucleico se puede manipular adicionalmente como se describe en esta memoria para crear agentes que incluyen proteínas de fusión, o anticuerpos quiméricos, humanizados o totalmente humanos. Más particularmente, el ADN aislado (que puede estar modificado) se puede usar para clonar secuencias de la región constante y variable para la fabricación de anticuerpos como se describe en la patente de EE. UU. n.° 7709611.

[0147] Este procedimiento ejemplar implica la extracción de ARN de las células seleccionadas, conversión a ADNc y amplificación por PCR usando cebadores específicos de los anticuerpos. Los cebadores adecuados se conocen bien en la técnica y, como se ejemplifica en esta memoria, están fácilmente disponibles a partir de numerosas fuentes comerciales. Se apreciará que, para expresar un anticuerpo humano o no humano recombinante aislado mediante cribado de una biblioteca combinatoria, el ADN que codifica el anticuerpo se clona en un vector de expresión recombinante y se introduce en células hospedadoras que incluyen células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias. En otros casos más, los moduladores se introducen y expresan en células COS de simio, células NS0, células de ovario de hámster chino (CHO) o células de mieloma que de otro modo no producen la construcción deseada. Como se comentará más pormenorizadamente más adelante, las células transformadas que expresan el modulador deseado se pueden hacer crecer en cantidades relativamente grandes para proporcionar suministros clínicos y comerciales de la construcción de fusión o inmunoglobulina.

[0148] Si el ácido nucleico que codifica la porción deseada del modulador de la PTK7 se obtiene o procede de tecnología de presentación en fagos, bibliotecas de levaduras, tecnología basada en hibridomas, sintéticamente o de fuentes comerciales, se debe entender que la presente descripción abarca explícitamente moléculas y secuencias de ácidos nucleicos que codifican moduladores de la PTK7, lo que incluyen proteínas de fusión y anticuerpos anti-PTK7 o fragmentos de unión al antígeno o derivados de los mismos. La invención abarca además ácidos nucleicos o moléculas de ácidos nucleicos (p. ej., polinucleótidos) que se hibridan en condiciones de hibridación de rigurosidad alta, o alternativamente, en condiciones de hibridación de rigurosidad intermedia o inferior (p. ej., como se definen más adelante), a polinucleótidos complementarios a ácidos nucleicos que tienen una secuencia de polinucleótidos que codifica un modulador de la descripción o un fragmento o variante del mismo. El término molécula de ácido nucleico o molécula de ácido nucleico aislado, como se emplea en esta memoria, está destinado a incluir al menos moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácido nucleico puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es ADN bicatenario. Asimismo, la presente descripción comprende cualquier vehículo o construcción que incorpora tales polinucleótidos que codifican moduladores, lo que incluye, sin limitación, vectores, plásmidos, células hospedadoras, cósmidos o construcciones virales.

[0149] El término ácido nucleico aislado significa que el ácido nucleico (i) se amplificó in vitro, por ejemplo, mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), (ii) se produjo recombinantemente mediante clonación, (iii) se purificó, por ejemplo, mediante escisión y fraccionamiento electroforético en gel o (iv) se sintetizó, por ejemplo, mediante síntesis química. Un ácido nucleico aislado es un ácido nucleico que está disponible para genomanipulación mediante técnicas de ADN recombinante.

[0150] Más específicamente, también se proporcionan ácidos nucleicos que codifican un modulador, lo que incluye una o ambas cadenas de un anticuerpo de la invención, o un fragmento, derivado, muteína o variante del mismo, polinucleótidos suficientes para uso como sondas de hibridación, cebadores de PCR o cebadores de secuenciación para identificar, analizar, mutar o amplificar un polinucleótido que codifica un polipéptido, ácidos nucleicos no codificantes para inhibir la expresión de un polinucleótido y secuencias complementarias de los anteriores. Los ácidos nucleicos pueden ser de cualquier longitud. Pueden ser, por ejemplo, de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1.000, 1.500, 3.000, 5.000 o más nucleótidos de longitud y/o pueden comprender una o más secuencias adicionales, por ejemplo, secuencias reguladoras, y/o formar parte de un ácido nucleico más grande, por ejemplo, un vector. Estos ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios y pueden comprender nucleótidos de ARN y/o ADN y variantes artificiales de los mismos (p. ej., ácidos nucleicos peptídicos). Los ácidos nucleicos que codifican moduladores de la descripción, lo que incluye anticuerpos o fragmentos o derivados inmunorreactivos de los mismos, se han aislado preferentemente como se describió anteriormente.

b. Hibridación e identidad

[0151] Como se ha indicado, la invención proporciona además ácidos nucleicos que se hibridan a otros ácidos nucleicos en condiciones de hibridación particulares. Los procedimientos para hibridar ácidos nucleicos se conocen bien en la técnica. Véase, p. ej., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. A los efectos de la presente solicitud, una condición de hibridación moderadamente rigurosa usa una solución de prelavado que contiene 5 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC), 0,5 % de SDS, EDTA 1,0 mM (pH 8,0), tampón de hibridación de aproximadamente 50 % de formamida, 6 x SSC y una temperatura de hibridación de 55 °C (u otras soluciones de hibridación similares, tales como una que contiene aproximadamente 50 % de formamida, con una temperatura de hibridación de 42 °C) y condiciones de lavado de 60 °C, en 0,5 x SSC, 0,1 % de SDS. Una condición de hibridación rigurosa hibrida en 6 x SSC a 45 °C, seguido de uno o más lavados en 0,1 x SSC, 0,2 % de SDS a 68 °C. Asimismo, un experto en la materia puede manipular las condiciones de hibridación y/o lavado para aumentar o reducir la rigurosidad de hibridación de tal manera que los ácidos nucleicos que comprenden secuencias de nucleótidos que son al menos 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % o 99 % idénticas entre sí habitualmente se siguen hibridando entre sí. Más generalmente, a los efectos de la presente descripción, el término sustancialmente idéntica en lo que respecta a una secuencia de ácido nucleico se puede interpretar como una secuencia de nucleótidos que presenta al menos aproximadamente 85%, o 90%, o 95%, o 97% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de referencia.

[0152] Los parámetros básicos que afectan a la elección de las condiciones de hibridación y a las directrices para diseñar condiciones adecuadas se exponen, por ejemplo, en Sambrook, Fritsch y Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., capítulos 9 y 11; y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel y col., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4), y pueden ser fácilmente determinadas por los expertos en la materia en base a, por ejemplo, la longitud y/o composición de bases del ácido nucleico.

[0153] Se apreciará además que los ácidos nucleicos pueden, según la invención, estar presentes solos o en combinación con otros ácidos nucleicos, que pueden ser homólogos o heterólogos. En realizaciones preferidas, un ácido nucleico está enlazado funcionalmente a secuencias de control de la expresión que pueden ser homólogas o heterólogas con respecto a dicho ácido nucleico. En este contexto, el término homólogo significa que un ácido nucleico también está enlazado funcionalmente a la secuencia de control de la expresión de forma natural y el término heterólogo significa que un ácido nucleico no está enlazado funcionalmente a la secuencia de control de la expresión de forma natural.

c. Expresión

[0154] Un ácido nucleico, tal como un ácido nucleico que expresa ARN y/o proteína o péptido, y una secuencia de control de la expresión están enlazados funcionalmente entre sí si están enlazados covalentemente entre sí de tal manera que la expresión o transcripción de dicho ácido nucleico está bajo el control o bajo la influencia de dicha secuencia de control de la expresión. Si el ácido nucleico se va a traducir en una proteína funcional, entonces, con una secuencia de control de la expresión enlazada funcionalmente a una secuencia codificante, la inducción de dicha secuencia de control de la expresión da como resultado la transcripción de dicho ácido nucleico, sin causar un desplazamiento del marco de lectura en la secuencia codificante o sin ser capaz dicha secuencia codificante de traducirse en la proteína o el péptido deseados.

[0155] El término secuencia de control de la expresión comprende, según la invención, promotores, puntos de unión al ribosoma, potenciadores y otros elementos de control que regulan la transcripción de un gen o la traducción de ARNm. En realizaciones particulares de la invención, las secuencias de control de la expresión se pueden regular. La estructura exacta de las secuencias de control de la expresión puede variar en función de la especie o el tipo de célula, pero generalmente comprende secuencias no transcritas 5' y no traducidas 5' y 3' que están implicadas en el inicio de la transcripción y traducción, respectivamente, tales como caja TATA, secuencia de protección de extremos, secuencia CAAT y similares. Más específicamente, las secuencias de control de la expresión no transcritas 5' comprenden una región promotora que incluye una secuencia de promotor para el control transcripcional del ácido nucleico enlazado funcionalmente. Las secuencias de control de la expresión también pueden comprender secuencias potenciadoras o secuencias activadoras aguas arriba.

[0156] Según la invención, el término promotor o región promotora se refiere a una secuencia de ácido nucleico que está ubicada aguas arriba (dirección 5') de la secuencia de ácido nucleico que se está expresando y controla la expresión de la secuencia proporcionando un punto de reconocimiento y unión para la ARN-polimerasa. La región promotora puede incluir además puntos de reconocimiento y unión adicionales para factores adicionales que están implicados en la regulación de la transcripción de un gen. Un promotor puede controlar la transcripción de un gen procariota o eucariota. Asimismo, un promotor puede ser inducible y puede iniciar la transcripción en respuesta a un agente inductor o puede ser constitutivo si la transcripción no está controlada por un agente inductor. Un gen que está bajo el control de un promotor inducible no se expresa o solo se expresa en poca medida si no está presente un agente inductor. En presencia del agente inductor, el gen se activa o el nivel de transcripción aumenta. Esto está mediado, en general, por la unión de un factor de transcripción específico.

[0157] Los promotores que son preferidos según la invención incluyen promotores para la polimerasa SP6, T3 y T7, promotor de ARN U6 humano, promotor de CMV y promotores híbridos artificiales de los mismos (p. ej., CMV) en los que una o más partes están fusionadas a una o más partes de promotores de genes de otras proteínas celulares tales como, p. ej., GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa) humana, y que incluyen o no uno o más intrones adicionales.

[0158] Según la invención, el término expresión se usa en su significado más general y comprende la producción de ARN o de ARN y proteína/péptido. También comprende la expresión parcial de ácidos nucleicos. Asimismo, la expresión se puede llevar a cabo de forma transitoria o estable.

[0159] En una realización preferida, una molécula de ácido nucleico según la invención está presente en un vector, cuando procede con un promotor, que controla la expresión del ácido nucleico. El término vector se usa aquí con su significado más general y comprende cualquier vehículo intermedio para un ácido nucleico que permite, por ejemplo, que dicho ácido nucleico se introduzca en células procariotas y/o eucariotas y, cuando procede, se integre en un genoma. Los vectores de esta clase se replican y/o expresan preferentemente en las células. Los vectores pueden comprender plásmidos, fagémidos, bacteriófagos o genomas virales. El término plásmido, como se emplea en esta memoria, generalmente se refiere a una construcción de material genético extracromosómico, normalmente un ADN bicatenario circular, que se puede replicar independientemente del ADN cromosómico.

[0160] En la puesta en práctica de la presente invención se apreciará que se usan opcionalmente muchas técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y tecnología de ADN recombinante. Tales técnicas convencionales se refieren a vectores, células hospedadoras y procedimientos recombinantes como se definen en esta memoria. Estas técnicas se conocen bien y se explican en, por ejemplo, Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volumen 152 Academic Press, Inc., San Diego, Calif.; Sambrook y col., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3rd ed.), Vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 2000 y Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel y col., eds., arriba. Otras referencias útiles, p. ej., para el aislamiento y cultivo celular (p. ej., para el aislamiento posterior de ácidos nucleicos o proteínas) incluyen Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, Nueva York y las referencias citadas en el mismo; Payne y col. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, N.Y.; Gamborg y Phillips (Eds.) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York) y Atlas y Parks (Eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, Fla. Los procedimientos para fabricar ácidos nucleicos (p. ej., amplificación in vitro, purificación a partir de células o síntesis química), procedimientos para manipular ácidos nucleicos (p. ej., mutagénesis dirigida, mediante digestión con enzimas de restricción, ligadura, etc.) y diversos vectores, estirpes celulares y similares útiles para manipular y fabricar nucleicos se describen en las referencias anteriores. Además, se puede personalizar o solicitar convencionalmente cualquiera de un abanico de proveedores comerciales esencialmente cualquier polinucleótido (lo que incluye, p. ej., polinucleótidos marcados o biotinilados).

[0161] Por tanto, en un aspecto, la presente invención proporciona células hospedadoras recombinantes que permiten la expresión recombinante de anticuerpos de la invención o porciones de los mismos. Los anticuerpos producidos mediante expresión en tales células hospedadoras recombinantes se denominan en esta memoria anticuerpos recombinantes. La presente invención también proporciona células descendientes de tales células hospedadoras y anticuerpos producidos por las mismas.

[0162] El término célula hospedadora recombinante (o simplemente célula hospedadora), como se emplea en esta memoria, significa una célula en la que se ha introducido un vector de expresión recombinante. Se debe entender que célula hospedadora recombinante y célula hospedadora significan no solo la célula del objetivo particular, sino también la descendencia de tal célula. Puesto que se pueden producir ciertas modificaciones en las generaciones subsiguientes debido a indistintamente mutaciones o influencias medioambientales, tal descendencia no puede, de hecho, no ser idéntica a la célula precursora, pero sigue estando incluida dentro del alcance del término célula hospedadora como se emplea en esta memoria. Tales células pueden comprender un vector según la invención como se describió anteriormente.

[0163] En otro aspecto, la presente descripción proporciona un procedimiento para fabricar un anticuerpo o una porción del mismo como se describe en esta memoria. Según una realización, dicho procedimiento comprende cultivar una célula transfectada o transformada con un vector como se describió anteriormente y recuperar el anticuerpo o la porción del mismo.

[0164] Como se indicó anteriormente, la expresión de un anticuerpo de la invención (o un fragmento o variantes del mismo) comprende preferentemente uno o más vectores de expresión que contienen un polinucleótido que codifica el anticuerpo anti-PTK7 deseado. Se pueden usar procedimientos que son bien conocidos por los expertos en la materia para construir vectores de expresión que comprenden secuencias codificantes de anticuerpos y señales de control de transcripcional y traduccional apropiadas. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Las realizaciones de la invención, por tanto, proporcionan vectores replicables que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un anticuerpo anti-PTK7 de la invención (p. ej., un anticuerpo completo, una cadena pesada o ligera de un anticuerpo, un dominio variable de las cadenas pesadas o ligeras de un anticuerpo, o una porción del mismo, o una CDR de las cadenas pesadas o ligeras, un Fv monocatenario, o fragmentos o variantes de los mismos), enlazados funcionalmente a un promotor. En realizaciones preferidas, tales vectores pueden incluir una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena pesada de una molécula de anticuerpo (o un fragmento de la misma), una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena ligera de un anticuerpo (o un fragmento de la misma) o tanto la cadena pesada como la ligera.

[0165] Una vez que los nucleótidos de la presente descripción se han aislado y modificado según las enseñanzas de esta memoria, se pueden usar para producir moduladores seleccionados, lo que incluye anticuerpos anti-PTK7 o fragmentos de los mismos.

X. Producción y purificación de los moduladores

[0166] Usando técnicas de biología molecular reconocidas en la técnica y metodología de expresión proteica actual, se pueden producir cantidades sustanciales de los moduladores deseados. Más específicamente, se pueden integrar moléculas de ácido nucleico que codifican moduladores, tales como anticuerpos obtenidos y genomanipulados como se describió anteriormente, en sistemas de producción de proteínas bien conocidos y comercializados que comprenden diversos tipos de células hospedadoras para proporcionar cantidades preclínicas, clínicas o comerciales del producto farmacéutico deseado. Se apreciará que, en casos preferidos, las moléculas de ácido nucleico que codifican los moduladores se genomanipulan en vectores o vectores de expresión que permiten la integración eficaz en la célula hospedadora seleccionada y niveles de expresión posterior altos del modulador de la PTK7 deseado.

[0167] Preferentemente, las moléculas de ácido nucleico que codifican moduladores y vectores de la PTK7 que comprenden estas moléculas de ácido nucleico se pueden usar para la transfección de una célula hospedadora de mamífero, vegetal, bacteriana o de levadura adecuada, aunque se apreciará que se pueden usar sistemas procariotas para la producción de moduladores. La transfección puede ser mediante cualquier procedimiento conocido para introducir polinucleótidos en una célula hospedadora. Los procedimientos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero se conocen bien en la técnica e incluyen transfección mediada por dextrano, precipitación con fosfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplastos, electroporación, encapsulación del uno o más polinucleótidos en liposomas y microinyección directa del ADN en núcleos. Además, las moléculas de ácido nucleico se pueden introducir en células de mamífero mediante vectores virales. Los procedimientos para transformar células de mamífero se conocen bien en la técnica. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 4399216, 4912040, 4740461 y 4959455. Además, los procedimientos para transformar células vegetales se conocen bien en la técnica, que incluyen, p. ej., transformación mediada por agrobacterias, transformación biolística, inyección directa, electroporación y transformación viral. Los procedimientos para transformar células bacterianas y de levadura también se conocen bien en la técnica.

[0168] Asimismo, la célula hospedadora se puede cotransfectar con dos vectores de expresión de la descripción, por ejemplo, codificando el primer vector un polipéptido procedente de las cadenas pesadas y el codificando el segundo vector un polipéptido precedente de las cadenas ligeras. Los dos vectores pueden contener marcadores seleccionables idénticos que permiten la expresión sustancialmente igual de polipéptidos de las cadenas pesadas y ligeras. Alternativamente, se puede usar un único vector que codifica, y es capaz de expresar, polipéptidos tanto de las cadenas pesadas como de las ligeras. En tales situaciones, la cadena ligera se coloca preferentemente antes que la cadena pesada para evitar un exceso de cadena pesada exenta de tóxicos. Las secuencias codificantes para las cadenas pesadas y ligeras pueden comprender ADNc o ADN genómico.

a. Sistemas de expresión en hospedadores

[0169] Un abanico sistemas de vectores de expresión en hospedadores, muchos comercializados, son compatibles con las enseñanzas de esta memoria y se pueden usar para expresar los moduladores de la descripción. Tales sistemas de expresión en hospedadores representan vehículos mediante los cuales se pueden expresar y posteriormente purificar las secuencias codificantes de interés, pero también representan células que, cuando se transforman o transfectan con las secuencias codificantes de nucleótidos apropiadas, pueden expresar una molécula de la descripción in situ. Tales sistemas incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias (p. ej., E. coli, B. subtilis, streptomyces) transformados con vectores de expresión de ADN de bacteriófago, ADN de plásmido o ADN de cósmido recombinantes que contienen secuencias codificantes de los moduladores; levaduras (p. ej., Saccharomyces, Pichia) transfectadas con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de los moduladores; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., baculovirus) que contienen secuencias codificantes de los moduladores; sistemas de células vegetales (p. ej., Nicotiana, Arabidopsis, espirodela, maíz, trigo, patata, etc.) infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (p. ej., virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico de tabaco, TMV) o transfectadas con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (p. ej., plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de los moduladores; o sistemas de células de mamífero (p. ej., células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que albergan construcciones de expresión recombinantes que contienen promotores procedentes del genoma de células de mamíferos (p. ej., promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (p. ej., el promotor tardío de adenovirus; el promotor 7.5K del virus de la vacuna de la viruela).

[0170] En los sistemas bacterianos, se pueden seleccionar ventajosamente varios vectores de expresión en función del uso previsto para la molécula que se está expresando. Por ejemplo, cuando se va a producir una cantidad grande de tal proteína, para la generación de composiciones farmacéuticas de un modulador, pueden ser deseables vectores que dirigen la expresión de niveles altos de productos de proteínas de fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, pero no se limitan a, el vector de expresión pUR278 de E. coli(Ruther y col., EMBO 1.2:1791 (1983)), en el que la secuencia codificante se puede ligar individualmente en el marco de lectura del vector con la región codificante lac Z de manera que se produce una proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)) y similares. Los vectores pGEX también se pueden usar para expresar polipéptidos externos como proteínas de fusión con glutatión 5 transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar fácilmente a partir de células lisadas mediante adsorción y unión a perlas de glutatión-agarosa de la matriz, seguida de elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir puntos de escisión de proteasa de factor Xa o trombina de manera que el producto genético diana clonado se puede liberar del resto de GST.

[0171] En un sistema de insecto, el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) se puede usar como vector para expresar genes externos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. Las secuencias codificantes se pueden clonar individualmente en regiones no esenciales (por ejemplo, el gen de poliedrina) del virus y colocar bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de poliedrina).

[0172] En células hospedadoras de mamífero, se pueden usar varios sistemas de expresión virales para introducir la secuencia de nucleótidos deseada. En los casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, la secuencia codificante de interés se puede ligar a un complejo de control de la transcripción/traducción de adenovirus, p. ej., el promotor tardío y la secuencia líder tripartita. Este gen quimérico se puede insertar a continuación en el genoma del adenovirus mediante recombinación in vitro o in vivo. La inserción en una región no esencial del genoma viral (p. ej., región El o E3) dará como resultado un virus recombinante que es viable y capaz de expresar la molécula en hospedadores infectados (p. ej., véase Logan & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ⁸ 1:355-359 (1984)). También se pueden requerir señales de inicio específicas para la traducción eficaz de secuencias codificantes insertadas. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. Asimismo, el codón de iniciación debe estar en fase con el marco de lectura de la secuencia codificante deseada para garantizar la traducción de toda la inserción. Estas señales de control traduccional y codones de iniciación exógenos pueden ser de un abanico de orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficacia de expresión se puede mejorar mediante la inclusión de elementos potenciadores de la transcripción, terminadores de la transcripción, etc. apropiados (véase, p. ej., Bittner y col., Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)). Por tanto, las estirpes celulares de mamífero compatibles disponibles como hospedadores para la expresión se conocen bien en la técnica e incluyen muchas estirpes celulares inmortalizadas disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC). Estas incluyen, entre otras, células de ovario de hámster chino (CHO), células NS0, células SP2, células HEK-293T, células 293 FreeStyle (Life Technologies), células NIH-3T3, células HeLa, células renales de hámster recién nacido (BHK), células renales de mono verde africano (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (p. ej., Hep G2), células A549 y varias otras estirpes celulares.

[0173] Para la producción a largo plazo y de alto rendimiento de proteínas recombinantes se prefiere la expresión estable. Por consiguiente, se pueden genomanipular estirpes celulares que expresan de forma estable el modulador seleccionado usando técnicas convencionales reconocidas en la técnica. En lugar de usar vectores de expresión que contienen orígenes de replicación virales, las células hospedadoras se pueden transformar con ADN controlado por elementos para el control de la expresión apropiados (p. ej., promotor, potenciador, secuencias, terminadores de la transcripción, puntos de poliadenilación, etc.) y un marcador seleccionable. Después de la introducción del ADN externo, se puede permitir que las células genomanipuladas crezcan durante 1-2 días en un medio enriquecido y a continuación se cambian a un medio selectivo. El marcador seleccionable del plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite que las células integren de forma estable el plásmido en sus cromosomas y crezcan para formar focos que a su vez se pueden clonar y expandir en estirpes celulares. Este procedimiento se puede usar ventajosamente para genomanipular estirpes celulares que expresan la molécula. Tales estirpes celulares genomanipuladas pueden ser particularmente útiles en el cribado y la evaluación de composiciones que interactúan directa o indirectamente con la molécula.

[0174] Varios sistemas de selección se conocen bien en la técnica y se pueden usar, que incluyen, pero no se limitan a, los genes de timidina quinasa del virus del herpes simple (Wigler y col., Cell 11:223 (1977)), hipoxantinaguanina fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202 (1992)) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy y col., Cell 22:8 17 (1980)) y se pueden emplear en células tk-, hgprt- o aprt-, respectivamente. Además, la resistencia a los antimetabolitos se puede usar como base para la selección de los genes siguientes: dhfr, que confiere resistencia al metotrexato (Wigler y col. Natl. Acad. Sci. USA 77:357 (1980); O'Hare y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527 (1981)); gpt, que confiere resistencia al ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072 (1981)); neo, que confiere resistencia al aminoglucósido G-418 (Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62: 191-217 (1993); TIB TECH 11(5):155-215 (mayo, 1993)); e hygro, que confiere resistencia a la higromicina (Santerre y col., Gene 30:147 (1984)). Los procedimientos habitualmente conocidos en la técnica de la tecnología de ADN recombinante se pueden aplicar sistemáticamente para seleccionar el clon recombinante deseado, y tales procedimientos se describen, por ejemplo, en Ausubel y col. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); y en los Capítulos 12 y 13, Dracopoli y col. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin y col., J. Mol. Biol. 150:1 (1981). Se apreciará que un procedimiento particularmente preferido para crear una estirpe celular estable y de alto rendimiento comprende el sistema de expresión genética de glutamina sintetasa (el sistema GS) que proporciona una estrategia eficaz para mejorar la expresión en ciertas condiciones. El sistema GS se comenta en su totalidad o en parte en relación con las patentes EP 0216846, 0256055, 0323997 y 0338841.

[0175] Además, se puede elegir una cepa de células hospedadoras que modula la expresión de las secuencias insertadas, o modifica y procesa el producto genético de la manera específica deseada. Tales modificaciones (p. ej., glucosilación) y procesamiento (p. ej., escisión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función y/o purificación de la proteína. Diferentes células hospedadoras tienen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento postraduccional y la modificación de proteínas y productos genéticos. Como se sabe en la técnica, se pueden elegir estirpes celulares o sistemas de hospedador apropiados para garantizar la modificación y el procesamiento deseados del polipéptido expresado. Con este fin, las células hospedadoras eucariotas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento correcto de la transcripción primaria, glucosilación y fosforilación del producto genético son particularmente eficaces para su uso en la presente descripción. Por consiguiente, las células hospedadoras de mamífero particularmente preferidas incluyen, pero no se limitan a, CHO, VERY, BHK, HeLa, COS, NS0, MDCK, 293, 3T3, W138, así como estirpes celulares de cáncer de mama tales como, por ejemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O y T47D, y estirpes celulares de la glándula mamaria normal tales como, por ejemplo, CRL7O3O y HsS78Bst. En función del modulador y el sistema de producción seleccionado, los expertos en la materia pueden seleccionar y optimizar fácilmente células hospedadoras apropiadas para la expresión eficaz del modulador.

b. Síntesis química

[0176] Además de los sistemas de células hospedadoras antes mencionados se apreciará que los moduladores de la descripción se pueden sintetizar químicamente usando técnicas conocidas en la técnica (p. ej., véase Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.Y., y Hunkapiller, M., y col., 1984, Nature 310:105-111). Por ejemplo, un péptido correspondiente a un fragmento polipeptídico de la descripción se puede sintetizar mediante el uso de un sintetizador peptídico. Asimismo, si se desea, se pueden introducir aminoácidos no clásicos o análogos de aminoácidos químicos como una sustitución o adición en una secuencia polipeptídica. Los aminoácidos no clásicos incluyen, pero no se limitan a, a los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido a-aminoisobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, g-Abu, e-Ahx, ácido ⁶ -aminohexanoico, Aib, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminopropiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, b-alanina, fluoroaminoácidos, aminoácidos de diseño tales como aminoácidos de b-metilo, aminoácidos de Ca-metilo, aminoácidos de Ca-metilo, aminoácidos de Na-metilo y análogos de aminoácidos en general. Asimismo, el aminoácido puede ser D (dextrógiro) o L (levógiro).

c. Sistemas transgénicos

[0177] Los moduladores de la PTK7 de la descripción también se pueden producir transgénicamente mediante la generación de un mamífero o una planta que son transgénicos para las secuencias de las cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina (o fragmentos, derivados o variantes de las mismas) de interés y producción de los compuestos deseados en una forma recuperable. En relación con la producción transgénica en mamíferos, los anticuerpos anti-PTK7, por ejemplo, se pueden producir en, y recuperar de, la leche de cabras, vacas u otros mamíferos. Véanse, por ejemplo, las patentes de EE. UU. n.° 5827690, 5756687, 5750 172 y 5741 957. En algunas realizaciones, los animales transgénicos no humanos que comprenden loci de inmunoglobulina humana se inmunizan con PTK7 o una porción inmunogénica de la misma, como se describió anteriormente. Los procedimientos para fabricar anticuerpos en plantas se describen, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.° ⁶ 046037 y 5959177.

[0178] Según las enseñanzas de esta memoria, los animales o plantas transgénicos no humanos se pueden producir introduciendo una o más moléculas de ácido nucleico que codifican un modulador de la PTK7 de la descripción en el animal o la planta mediante técnicas transgénicas convencionales. Véase Hogan y la patente de EE. u U. n.° ⁶ 417429. Las células transgénicas usadas para fabricar el animal transgénico pueden ser embriocitoblastos, células somáticas o un óvulo fertilizado. Los organismos no humanos transgénicos pueden ser heterocigotos quiméricos y no quiméricos y homocigotos no quiméricos. Véase, p. ej., Hogan y col. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2a ed. Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson y col., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); y Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999). En algunas realizaciones, los animales no humanos transgénicos tienen una eliminación y sustitución dirigidas por una construcción de guiado que codifica, por ejemplo, una cadena pesada y/o una cadena ligera de interés. En una realización, los animales transgénicos comprenden y expresan moléculas de ácido nucleico que codifican las cadenas pesadas y ligeras que se unen específicamente a la PTK7. Aunque los anticuerpos anti-PTK7 se pueden fabricar en cualquier animal transgénico, en realizaciones particularmente preferidas los animales no humanos son ratones, ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado vacuno o caballos. En realizaciones adicionales, el animal transgénico no humano expresa el producto farmacéutico deseado en sangre, leche, orina, saliva, lágrimas, moco y otros fluidos corporales a partir de los cuales es fácilmente obtenible usando técnicas de purificación reconocidas en la técnica.

[0179] Es probable que los moduladores, lo que incluye anticuerpos, expresados por diferentes estirpes celulares o en animales transgénicos tengan patrones de glucosilación diferentes entre sí. Sin embargo, todos los moduladores codificados por las moléculas de ácido nucleico proporcionadas en esta memoria, o que comprenden las secuencias de aminoácidos proporcionadas en esta memoria, forman parte de la presente descripción, independientemente del estado de glucosilación de la molécula y, más generalmente, independientemente de la presencia o ausencia de una o más modificaciones postraduccionales. Además, la descripción abarca moduladores que se modifican diferencialmente durante o después de la traducción, p. ej., mediante glucosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueadores conocidos, escisión proteolítica, enlace a una molécula de anticuerpo u otro ligando celular, etc. Se puede llevar a cabo cualquiera de numerosas modificaciones químicas mediante técnicas conocidas, que incluyen, pero no se limitan a, escisión química específica mediante bromuro de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, proteasa V⁸ , NaBH⁴ , acetilación, formilación, oxidación, reducción, síntesis metabólica en presencia de tunicamicina, etc. La invención también abarca diversas modificaciones postraduccionales, que incluyen, por ejemplo, cadenas de carbohidratos enlazadas a N u O, procesamiento de los extremos amino o carboxílico), fijación de restos químicos a la cadena principal de aminoácidos, modificaciones químicas de cadenas de carbohidratos enlazadas a N u O y adición o eliminación de un residuo de metionina aminoterminal como resultado de la expresión en células hospedadoras procariotas. Asimismo, como se expone en el texto y los Ejemplos que se presentan más adelante, los polipéptidos también se pueden modificar con un marcador detectable, tal como un marcador enzimático, fluorescente, radioisotópico o de afinidad para la detección y el aislamiento del modulador.

d. Purificación

[0180] Una vez se ha producido un modulador de la descripción mediante expresión recombinante o cualquiera del resto de técnicas descritas en esta memoria, se puede purificar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica para la purificación de inmunoglobulinas, o más generalmente mediante cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. A este respecto, el modulador se puede aislar. Como se emplea en esta memoria, un modulador de la PTK7 aislado es uno que ha sido identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos terapéuticos o de diagnóstico del polipéptido y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteínicos o no proteínicos. Los moduladores aislados incluyen un modulador in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente.

[0181] Cuando se usan técnicas recombinantes, el modulador de la PTK7 (p. ej., un anticuerpo anti-PTK7 o derivado o fragmento del mismo) se puede producir intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretar directamente en el medio. Si la molécula deseada se produce intracelularmente, como primera etapa, los residuos de partículas, indistintamente de células hospedadoras o fragmentos lisados, se pueden retirar, por ejemplo, mediante centrifugación o ultrafiltración. Por ejemplo, Carter y col., Bio/Technology 10:163 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Brevemente, la pasta celular se descongela en presencia de acetato de sodio (pH 3,5), EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) a lo largo de aproximadamente 30 minutos. Los residuos de células se pueden retirar mediante centrifugación. Cuando el anticuerpo se secreta al medio, los sobrenadantes de tales sistemas de expresión generalmente se concentran primero usando un filtro de concentración de proteínas comercializado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Pellicon de Millipore. Un inhibidor de proteasas tal como PMSF se puede incluir en cualquiera de las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se pueden incluir antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes accidentales.

[0182] La composición de modulador (p. ej., fc-PTK7 o anticuerpo anti-PTK7) preparada a partir de las células se puede purificar usando, por ejemplo, cromatografía en hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad, siendo la cromatografía de afinidad la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de la especie y el isotipo de cualquier dominio Fc de inmunoglobulina que esté presente en la construcción seleccionada. La proteína A se puede usar para purificar anticuerpos que están basados en cadenas pesadas de IgG1, IgG2 o IgG4 humana (Lindmark y col., J Immunol Meth 62:1 (1983)). La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la IgG3 humana (Guss y col., EMBO J 5:1567 (1986)). La matriz a la que se fija el ligando de afinidad la mayoría de las veces es agarosa, pero se dispone de otras matrices. Las matrices mecánicamente estables tales como vidrio de poro controlado o poli(estirenodivinil)benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden conseguir con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio C^h3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker; Phillipsburg, N.J.) es útil para la purificación. También se dispone de otras técnicas para la purificación de proteínas, tales como fraccionamiento en una columna de intercambio iónico, precipitación con etanol, CLAR de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina, cromatografía de sefarosa en una resina de intercambio aniónico o catiónico (tal como una columna de ácido poliaspártico), cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación con sulfato de amonio, en función del anticuerpo que se va a recuperar. En casos particularmente preferidos, los moduladores de la presente descripción se purificarán, al menos en parte, usando cromatografía de afinidad con proteína A o proteína G.

XI. Moduladores de la PTK7 conjugados

[0183] Una vez que los moduladores de la invención se han purificado según las enseñanzas de esta memoria, se pueden enlazar con, fusionar a, conjugar a (p. ej., covalente o no covalentemente) o asociar de otro modo con restos farmacéuticamente activos o de diagnóstico o con modificadores biocompatibles. Como se emplea en esta memoria, el término conjugado se usará en términos generales y se debe entender que significa cualquier molécula asociada con los moduladores descritos independientemente del procedimiento de asociación. A este respecto, se entenderá que tales conjugados pueden comprender péptidos, polipéptidos, proteínas, polímeros, moléculas de ácido nucleico, moléculas pequeñas, agentes miméticos, fármacos sintéticos, moléculas inorgánicas, moléculas orgánicas y radioisótopos. Asimismo, como se indicó anteriormente, el conjugado seleccionado puede estar enlazado covalente o no covalentemente al modulador y presentar diversas relaciones molares en función de, al menos en parte, el procedimiento usado para lograr la conjugación.

[0184] En casos preferidos, resultará evidente que los moduladores de la descripción se pueden conjugar o asociar con proteínas, polipéptidos o péptidos que confieren características seleccionadas (p. ej., biotoxinas, biomarcadores, colas de purificación, etc.). Más generalmente, en casos seleccionados, la presente descripción abarca el uso de moduladores o fragmentos de los mismos fusionados recombinantemente o conjugados químicamente (lo que incluye conjugaciones tanto covalentes como no covalentes) a una proteína o un péptido heterólogos, donde la proteína o el péptido comprenden al menos 10, al menos 20, al menos 30, al menos 40, al menos 50, al menos 60, al menos 70, al menos 80, al menos 90 o al menos 100 aminoácidos. La construcción no requiere necesariamente ser enlazada directamente, sino que esto se puede producir a través de secuencias de enlazador. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos para dirigir polipéptidos heterólogos a tipos de células particulares que expresen PTK7, indistintamente in vitro o in vivo, fusionando o conjugando los moduladores de la presente descripción a anticuerpos específicos para receptores particulares de la superficie celular. Asimismo, también se pueden usar moduladores fusionados o conjugados a polipéptidos heterólogos en inmunoanálisis in vitro y pueden ser compatibles con la metodología de purificación conocida en la técnica. Véase, por ejemplo, la publicación internacional n.° WO 93/21232; la patente europea n.° EP 439095; Naramura y col., 1994, Immunol. Lett. 39:91-99; la patente de EE. UU. n.° 5474981; Gillies y col., 1992, PNAS 89:1428-1432; y Fell y col., 1991, J. Immunol. 146:2446-2452.

a. Modificadores biocompatibles

[0185] En un caso preferido, los moduladores de la descripción se pueden conjugar o asociar de otro modo con modificadores biocompatibles que se pueden usar para ajustar, alterar, mejorar o moderar las características de los moduladores según se desee. Por ejemplo, se pueden generar anticuerpos o construcciones de fusión con semividas in vivo aumentadas fijando moléculas de polímeros de peso molecular relativamente alto tales como polietilenglicol (PEG) o polímeros biocompatibles similares comercializados. Los expertos en la materia apreciarán que se puede obtener PEG de muchos pesos moleculares y configuraciones moleculares diferentes, que se pueden seleccionar para conferir propiedades específicas al anticuerpo (p. ej., la semivida se puede personalizar). El PEG se puede fijar a moduladores, o fragmentos o derivados de anticuerpo con o sin un enlazador multifuncional, indistintamente mediante conjugación específica del PEG al extremo amino o carboxílico de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, o a través de grupos amino épsilon presentes sobre residuos de lisina. Se puede usar derivatización de polímeros lineales o ramificados que da como resultado una pérdida mínima de la actividad biológica. El grado de conjugación se puede controlar estrechamente mediante SDS-PAGE y espectrometría de masas para garantizar la conjugación óptima de las moléculas de PEG a las moléculas de anticuerpo. El PEG sin reaccionar se puede separar de los conjugados de anticuerpo-PEG mediante, p. ej., cromatografía de exclusión molecular o intercambio iónico. De manera similar, los moduladores descritos se pueden conjugar a albúmina con el fin de hacer el anticuerpo o fragmento de anticuerpo más estable in vivo o para que tenga una semivida más larga in vivo. Las técnicas se conocen bien en la técnica, véanse, p. ej., las publicaciones internacionales WO 93/15199, WO 93/15200 y WO 01/77137; y la patente europea n.° 0413622. Otros conjugados biocompatibles resultarán evidentes para los expertos en la materia y se podrán identificar fácilmente según las enseñanzas de esta memoria.

b. Agentes de diagnóstico o detección

[0186] En otros casos preferidos, los moduladores de la presente descripción, o fragmentos o derivados de los mismos, están conjugados a un agente de diagnóstico o detectable, marcador o indicador que puede ser una molécula biológica (p. ej., un péptido o nucleótido), una molécula pequeña, un fluoróforo o un radioisótopo. Los moduladores marcados pueden ser útiles para controlar el desarrollo o la progresión de un trastorno hiperproliferativo o como parte de un procedimiento de ensayos clínicos para determinar la eficacia de una terapia particular que incluye los moduladores descritos (es decir, teragnosis) o para determinar un ciclo de tratamiento futuro. Tales marcadores o indicadores también pueden ser útiles para purificar el modulador seleccionado, separar o aislar TIC, o en procedimientos preclínicos o estudios toxicológicos.

[0187] Tal diagnóstico y detección se pueden lograr acoplando el modulador a sustancias detectables que incluyen, pero no se limitan a, diversas enzimas que comprenden, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; grupos prostéticos, tales como, pero no limitados a, estreptavidina/biotina y avidina/biotina; materiales fluorescentes, tales como, pero no limitados a, umbeliferona, fluoresceína, isotiocinato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; materiales luminiscentes, tales como, pero no limitados a, luminol; materiales bioluminiscentes, tales como, pero no limitados a, luciferasa, luciferina y aecuorina; materiales radiactivos, tales como, pero no limitados a, yodo (^{1 3 1} I, ^{1 2 5} I, ^{1 2 3} I, ^{1 2 1} I,), carbono (^{1 4} C), azufre (^{3 5} S), tritio (³ H), indio (^{1 1 5} In, ^{1 1 3} In, ^{1 1 2} In, ^{1 1 1} In,) y tecnecio (^{9 9} Tc), talio (^{2 0 1} Ti), galio (^{6 8} Ga, ^{6 7} Ga), paladio (^{1 0 3} Pd), molibdeno (^{9 9} Mo), xenón (^{1 3 3} Xe), flúor (^{1 8} F), ^{1 5 3} Sm, ^{1 7 7} Lu, ^{1 5 9} Gd, ^{1 4 9} Pm, ^{1 4 0} La, ^{1 7 5} Yb, ^{1 6 6} Ho, ^{9 0} Y,

^{4 7} Sc, ^{1 8 6} Re, ^{1 8 8} Re, ^{1 4 2} Pr, ^{1 0 5} Rh, ^{9 7} Ru, ^{6 8} Ge, ^{5 7} C, ^{6 5} Zn, ^{8 5} Sr, ^{3 2} P, ^{1 5 3} Gd, ^{1 6 9} Yb, ^{5 1} Cr, ^{5 4} Mn, ^{7 5} Se, emisores de positrones usando diversas tomografías de emisión de positrones, iones metálicos paramagnéticos no radioactivos y moléculas están radiomarcadas o conjugadas a radioisótopos específicos. En tales casos, la metodología de detección apropiada se conoce bien en la técnica y está fácilmente disponible a partir de numerosos proveedores comerciales.

[0188] Como se indicó anteriormente, en otros casos, los moduladores o fragmentos de los mismos se pueden fusionar a secuencias de marcador, tales como un péptido o fluoróforo, para facilitar procedimientos de purificación o diagnóstico tales como inmunohistoquímica o FACS. En casos preferidos, la secuencia de aminoácidos del marcador es un péptido de hexahistidina (SEQ ID NO: 7), tal como la cola proporcionada en un vector pQE (Qiagen Inc.), entre

otros, muchos de los cuales están comercializados. Como se describe en Gentz y col., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 86:821-824, por ejemplo, la hexahistidina permite purificación conveniente de la proteína de fusión. Otras colas peptídicas útiles para la purificación incluyen, pero no se limitan a, la cola de hemaglutinina “HA”, que corresponde a

un epítopo procedente de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson y col., 1984, Cell 37:767) y la cola “flag” (patente

de EE. UU. n.° 4703004).

c. Restos terapéuticos

[0189] Como se mencionó anteriormente, los moduladores o fragmentos o derivados de los mismos también

se pueden conjugar, enlazar o fusionar o asociar de otro modo con un resto terapéutico tal como agentes anticancerígenos, una citotoxina o agente citotóxico, p. ej., un agente citostático o citocida, un agente terapéutico o un

ion metálico radiactivo, p. ej., emisores alfa o beta. Como se emplea en esta memoria, una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente o resto terapéutico que es perjudicial para las células y puede inhibir el crecimiento

o la supervivencia celular. Los ejemplos incluyen paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracina, maitansinoides tales como DM-1 y DM-4 (Immunogen, Inc.), diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, puromicina, epirrubicina y ciclofosfamida, y análogos u homólogos de los mismos. Las citotoxinas compatibles adicionales comprenden auristatinas, que incluyen monometilauristatina E (MMAE) y monometilauristatina F (MMAF) (Seattle Genetics, Inc.), amanitinas tales como alfa-amanitina, beta-amanitina, gamma-amanitina o épsilon-amanitina (Heidelberg Pharma AG), agentes de unión al surco menor del ADN tales como derivados de duocarmicina (Syntarga,

B.V.) y dímeros de pirrolobenzodiacepina modificados (Spirogen, Ltd.). Asimismo, en un caso, los moduladores de la

PTK7 de la presente descripción se pueden asociar con moléculas de unión de anti-CD3 para incorporar linfocitos T citotóxicos y hacer que se dirijan a las células iniciadoras de tumores (tecnología BiTE; véase, p. ej., Fuhrmann, S. y

col. Annual Meeting of AACR Abstract n.° 5625 (2010)).

[0190] Los restos terapéuticos compatibles adicionales comprenden agentes citotóxicos que incluyen, pero no

se limitan a, antimetabolitos (p. ej., metotrexato, ⁶ -mercaptopurina, ⁶ -tioguanina, citarabina, 5­ fluorouracildecarbacina), agentes alquilantes (p. ej., mecloretamina, tioepa clorambucilo, melfalán, carmustina (BCNU) y lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cisdiclorodiaminoplatino (II) (DDP, cisplatino), antraciclinas (p. ej., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (p. ej., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina mitramicina y antramicina

(AMC)) y agentes antimitóticos (p. ej., vincristina y vinblastina). Se puede encontrar una lista más exhaustiva de restos terapéuticos en la publicación PCT WO 03/075957 y la patente de EE. UU. n.° 2009/0155255.

[0191] Los moduladores seleccionados también se pueden conjugar a restos terapéuticos tales como materiales radioactivos o quelantes macrocíclicos útiles para conjugar iones radiometálicos (véase arriba para conocer ejemplos de materiales radioactivos). En ciertos casos, el quelante macrocíclico es ácido 1,4,7,10­ tetraazaciclododecano-N,N',N",N"-tetraacético (DOTA) que se puede fijar al anticuerpo a través de una molécula de enlazador. Tales moléculas de enlazador se conocen habitualmente en la técnica y se describen en Denardo y col.,

1998, Clin Cancer Res. 4:2483; Peterson y col., 1999, Bioconjug. Chem. 10:553; y Zimmerman y col., 1999, Nucl. Med.

Biol. 26:943.

[0192] Los radioisótopos ejemplares que pueden ser compatibles con este aspecto de la descripción incluyen, pero no se limitan a, yodo (^{1 3 1} I, ^{1 2 5} I, ^{1 2 3} I, ^{1 2 1} I,), carbono (^{1 4} C), cobre (^{6 2} Cu, ^{6 4} Cu, ^{6 7} Cu), azufre (^{3 5} S), tritio (³ H), indio

(^{1 1 5} In, ^{1 1 3} In, ^{1 1 2} In, ^{1 1 1} In,), bismuto (^{2 1 2} Bi, ^{2 1 3} Bi), tecnecio (^{9 9} Tc), talio (^{2 0 1} Ti), galio (^{6 8} Ga, ^{6 7} Ga), paladio (^{1 0 3} Pd), molibdeno

(^{9 9} Mo), xenón (^{1 3 3} Xe), flúor (^{1 8} F), ^{1 5 3} Sm, ^{1 7 7} Lu, ^{1 5 9} Gd, 149Pm ^{1 4} La, ^{1 7 5} Yb, ^{1 6 6} Ho, ^{9 0} Y, ^{4 7} Sc, ^{1 8 6} R ^{9 7} Ru, ^{6 8} Ge, ^{5 7} Co, ^{6 5} Zn, ^{8 5} Sr, ^{3 2} P, ^{1 5 3} Gd, ^{1 6 9} Yb, ^{5 1} Cr, ^{5 4} Mn, ^{7 5} Se, ^{1 1 3} Sn, ^{1 1 7} Sn, ^{2 2 5} Ac, ^{7 6} Br, y ^{2 1 1} At. También se dispone

de otros radionúclidos como agentes terapéuticos y de diagnóstico, especialmente aquellos en el intervalo de energía

de 60 a 4000 keV. En función de la afección que se va a tratar y el perfil terapéutico deseado, los expertos en la materia podrán seleccionar fácilmente el radioisótopo apropiado para su uso con los moduladores descritos.

[0193] Los moduladores de la PTK7 de la presente descripción también se pueden conjugar a un resto o fármaco terapéutico que modifica una respuesta biológica determinada (p. ej., modificadores de la respuesta biológica

o BRM). Es decir, no se debe interpretar que los agentes o restos terapéuticos compatibles con la presente invención se limitan a los agentes terapéuticos químicos clásicos. Por ejemplo, en realizaciones particularmente preferidas, el resto de fármaco puede ser una proteína o un polipéptido o un fragmento de los mismos que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina tal como abrina, ricina A, onconasa (u otra ribonucleasa citotóxica), exotoxina de pseudomonas, toxina de cólera o toxina de difteria; una proteína tal como factor de necrosis tumoral, interferón a, interferón p, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del plasminógeno tisular, un agente apoptótico, p. ej., TNF-a, TNF-p, AIM I (véase, la publicación internacional n.° WO 97/33899), AIM II (véase la publicación internacional n.° WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi y col., 1994, J. Immunol., 6:1567) y VEGI (véase, la publicación internacional n.° WO 99/23105), un agente trombótico o un agente antiangiogénico, p. ej., angiostatina o endostatina; o un modificador de la respuesta biológica tal como, por ejemplo, una linfocina (p. ej., interleucina-1 (“ IL-1”), interleucina-2 (“ IL-2”), interleucina^{- 6} (“IL-⁶ ”), factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos (“GM-CSF”) y factor estimulante de colonias de granulocitos (“G-CSF”)), o un factor de crecimiento (p. ej., hormona de crecimiento (“GH”)). Como se expuso anteriormente, los procedimientos para fusionar o conjugar moduladores a restos polipeptídicos se conocen en la técnica. Además de las referencias del tema descritas anteriormente, véanse, p. ej., las patentes de EE. UU. n.° 5336603; 5622929; 5359046; 5349053; 5 447851 y 5112946; la patente europea EP 307434; la patente europea EP 367166; las publicaciones PCT WO 96/04388 y WO 91/06570; Ashkenazi y col., 1991, PNAS USA 88:10535; Zheng y col., 1995, J Immunol 154:5590; y Vil y col., 1992, PNAS USA 89:11337. La asociación de un modulador con un resto no tiene que ser necesariamente directa, sino que se puede producir a través de secuencias de enlazador. Tales moléculas de enlazador se conocen habitualmente en la técnica y se describen en Denardo y col., 1998, Clin Cancer Res 4:2483; Peterson y col., 1999, Bioconjug Chem 10:553; Zimmerman y col., 1999, Nucl Med Biol 26:943; Garnett, ^{2 0 0 2} , Adv Drug Deliv Rev 53:171.

[0194] Más generalmente, las técnicas para conjugar restos terapéuticos o agentes citotóxicos a moduladores se conocen bien. Los restos se pueden conjugar a moduladores mediante cualquier procedimiento reconocido en la técnica, lo que incluye, pero no se limita a, el enlace de aldehído/Schiff, enlace de sulfhidrilo, enlace lábil de ácido, enlace de cis-aconitilo, enlace de hidrazona, enlace degradable enzimáticamente (véase, en general, Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev 53:171). Véase además, por ejemplo, Amon y col., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld y col. (eds.), páginas 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom y col., “Antibodies For Drug Delivery”, en Controlled Drug Delivery (2a ed.), Robinson y col. (eds.), páginas 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera y col. (eds.), páginas 475-506 (1985); “Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, en Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin y col. (eds.), páginas 303­ 16 (Academic Press 1985), y Thorpe y col., 1982, Immunol. Rev. 62:119. En casos preferidos, un modulador de la PTK7 que está conjugado a un resto terapéutico o un agente citotóxico puede ser internalizado por una célula tras unirse a una molécula de PTK7 asociada con la superficie celular, administrando de ese modo la carga útil terapéutica.

XII. Diagnóstico y cribado

a. Diagnóstico

[0195] Como se indicó, la presente descripción proporciona procedimientos in vitro o in vivo para detectar, diagnosticar o controlar trastornos hiperproliferativos y procedimientos para cribar células de un paciente para identificar células tumorigénicas, lo que incluye TPC. Tales procedimientos incluyen identificar un individuo que padece cáncer para el tratamiento o el control de la progresión de un cáncer que comprende poner en contacto el paciente o una muestra obtenida a partir de un paciente con un modulador de la PTK7 seleccionado como se describe en esta memoria y detectar la presencia o ausencia, o el grado de asociación del modulador a moléculas de PTK7 unidas o libres en la muestra. Cuando el modulador comprende un anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo, la asociación con una PTK7 particular en la muestra probablemente denota que la muestra puede contener células que perpetuadoras de tumores (p. ej., citoblastos cancerosos), lo que indica que el individuo que tiene cáncer se puede tratar eficazmente con un modulador de la PTK7 como se describe en esta memoria. Los procedimientos pueden comprender además una etapa de comparar el nivel de unión con un control. Por el contrario, cuando el modulador seleccionado es Fc-PTK7, las propiedades de unión de la PTK7 seleccionada se pueden aprovechar y controlar (directa o indirectamente, in vivo o in vitro) cuando está en contacto con la muestra para proporcionar la información deseada. Otros procedimientos de diagnóstico o teragnosis compatibles con las enseñanzas de esta memoria se conocen bien en la técnica y se pueden poner en práctica usando materiales comerciales tales como sistemas indicadores exclusivos

[0196] En un caso particularmente preferido, los moduladores de la presente descripción se pueden usar para detectar y cuantificar los niveles de PTK7 en una muestra del paciente (p. ej., plasma o sangre), que, a su vez, se puede usar para detectar, diagnosticar o controlar trastornos asociados a la PTK7, lo que incluye trastornos hiperproliferativos. En casos relacionados, los moduladores de la presente descripción se pueden usar para detectar, controlar y/o cuantificar las células tumorales circulantes in vivo o in vitro (véase, por ejemplo, el documento WO 2012/0128801). En otros casos preferidos más, las células tumorales circulantes pueden comprender citoblastos cancerosos.

[0197] Los procedimientos de análisis compatibles ejemplares incluyen radioinmunoanálisis, enzimoinmunoanálisis, análisis de unión competitiva, fluoroinmunoanálisis, inmunotransferencia, inmunoelectrotransferencia, citometría de flujo y ELISA. Más generalmente, la detección de PTK7 en una muestra biológica o la medición de la actividad enzimática de la PTK7 (o inhibición de la misma) se puede lograr usando cualquier ensayo conocido en la técnica. La teragnosis o el diagnóstico in vivo compatibles pueden comprender técnicas de diagnóstico por imágenes o supervisión reconocidas en la técnica, tales como resonancia magnética nuclear (RMN), tomografía computarizada (p. ej., TAC), tomografía de positrones (p. ej., TEP), radiografía, ecografía, etc. Los expertos en la materia podrán reconocer y realizar fácilmente técnicas de detección, supervisión o diagnóstico por imágenes apropiadas (que a menudo comprenden fuentes comercializadas) en base a la etiología, manifestación patológica o progresión clínica del trastorno.

[0198] En otro caso, la descripción proporciona un procedimiento para analizar la progresión y/o patogénesis del cáncer in vivo. En otro caso, el análisis de la progresión y/o patogénesis del cáncer in vivo comprende determinar el grado de progresión tumoral. En otro caso, el análisis comprende la identificación del tumor. En otro caso, el análisis de la progresión tumoral se realiza en el tumor primario. En otro caso, el análisis se realiza a lo largo del tiempo en función del tipo de cáncer, como sabrá un experto en la materia. En otro caso, el análisis adicional de tumores secundarios procedentes de células metastásicas del tumor primario se realiza in vivo. En otro caso, se analiza el tamaño y la forma de tumores secundarios. En algunos casos, se realizan análisis ex vivo adicionales.

[0199] En otro caso, la descripción proporciona un procedimiento para analizar la progresión y/o patogénesis del cáncer in vivo que incluye determinar la metástasis celular o detectar y cuantificar el nivel de células tumorales circulantes. En otro caso más, el análisis de la metástasis celular comprende la determinación del crecimiento progresivo de células en un punto que es discontinuo con respecto al tumor primario. En otro caso, el punto de análisis de la metástasis celular comprende la vía de diseminación neoplásica. En algunos casos, las células se pueden dispersar a través de la vasculatura sanguínea, los ganglios linfáticos, dentro de las cavidades corporales o combinaciones de los mismos. En otro caso, el análisis de la metástasis celular se realiza en vista de la migración, diseminación, extravasación, proliferación celular o combinaciones de las mismas.

[0200] En ciertos ejemplos, las células tumorigénicas de un sujeto o una muestra de un sujeto se pueden evaluar o caracterizar utilizando los moduladores descritos antes de la terapia o el tratamiento para establecer un punto de referencia. En otros ejemplos, la muestra procede de un sujeto que fue tratado. En algunos ejemplos, la muestra se toma del sujeto al menos aproximadamente 1,2, 4, ⁶ , 7, ⁸ , 10, 12, 14, 15, 16, 18, 20, 30, 60, 90 días, ⁶ meses, 9 meses, 12 meses o >12 meses después de que el sujeto comienza o termina el tratamiento. En ciertos ejemplos, las células tumorigénicas se evalúan o caracterizan después de un cierto número de dosis (p. ej., después de 2, 5, 10, 20, 30 o más dosis de una terapia). En otros ejemplos, las células tumorigénicas se caracterizan o evalúan 1 semana, 2 semanas, 1 mes, 2 meses, 1 año, 2 años, 3 años, 4 años o más después de recibir una o más terapias.

[0201] En otro aspecto, y como se comenta más pormenorizadamente más adelante, la presente descripción proporciona kits para detectar, controlar o diagnosticar un trastorno hiperproliferativo, identificar un individuo que padece tal trastorno para determinar el posible tratamiento o controlar la progresión (o regresión) del trastorno en un paciente, donde el kit comprende un modulador como se describe en esta memoria y reactivos para detectar el impacto del modulador sobre una muestra.

b. Cribado

[0202] Los moduladores de la PTK7 y células, cultivos, poblaciones y composiciones que comprenden los mismos, lo que incluye la descendencia de los mismos, también se pueden usar para cribar o identificar compuestos o agentes (p. ej., fármacos) que afectan una función o actividad de las células iniciadoras de tumores o los descendientes de las mismas interactuando con la PTK7 (p. ej., el polipéptido o componentes genéticos del mismo). Por lo tanto, la descripción proporciona además sistemas y procedimientos para la evaluación o identificación de un compuesto o agente que puede afectar a una función o actividad de las células iniciadoras de tumores o los descendientes de las mismas asociándose a la PTK7 o sus sustratos. Tales compuestos y agentes pueden ser fármacos potenciales que se criban para el tratamiento de un trastorno hiperproliferativo, por ejemplo. En un caso, un sistema o procedimiento comprende células iniciadoras de tumores que presentan PTK7 y un compuesto o agente (p. ej., fármaco), donde las células y el compuesto o agente (p. ej., fármaco) están en contacto entre sí.

[0203] La descripción proporciona además procedimientos para cribar e identificar moduladores o agentes y compuestos de PTK7 para alterar una actividad o función de las células iniciadoras de tumores o células descendientes de las mismas. En un caso, un procedimiento incluye poner en contacto las células iniciadoras de tumor o descendientes de las mismas con un agente o compuesto de ensayo; y determinar si el agente o compuesto de ensayo modula una actividad o función de las células iniciadoras de tumores asociadas a la PTK7.

[0204] Un agente o compuesto de ensayo que modula una actividad o función relacionada con la PTK7 de tales células iniciadoras de tumores o descendientes de las mismas en la población identifica el agente o compuesto de ensayo como un agente activo. La actividad o función ejemplar que se puede modular incluye cambios en la morfología celular, expresión de un marcador, diferenciación o desdiferenciación, maduración, proliferación, viabilidad, apoptosis o muerte celular de células progenitoras neuronales o descendientes de las mismas.

[0205] Poner en contacto, cuando se usa en referencia a células o un cultivo celular, una etapa del procedimiento o un tratamiento, significa una interacción directa o indirecta entre la composición (p. ej., una célula o un cultivo celular asociado a la PTK7) y otra entidad mencionada. Un ejemplo particular de una interacción directa es la interacción física. Un ejemplo particular de una interacción indirecta se da cuando una composición actúa sobre una molécula intermedia que, a su vez, actúa sobre la entidad mencionada (p. ej., la célula o el cultivo celular).

[0206] En este aspecto de la descripción, modular indica influir en una actividad o función de las células iniciadoras de tumores o células descendientes de las mismas de una manera compatible con la detección de los efectos sobre la actividad o función celular que se ha determinado que es relevante para un aspecto particular (p. ej., metástasis o proliferación) de las células iniciadoras de tumores o células descendientes de las mismas de la descripción. Las actividades y funciones ejemplares incluyen, pero no se limitan a, medir la morfología, marcadores de desarrollo, diferenciación, proliferación, viabilidad, respiración celular, actividad mitocondrial, integridad de la membrana o expresión de marcadores asociados con ciertas afecciones. Por consiguiente, un compuesto o agente (p. ej., un fármaco potencial) se puede evaluar para determinar su efecto sobre las células iniciadoras de tumores o células descendientes de las mismas, poniendo en contacto tales células o células de descendientes de las mismas con el compuesto o agente y midiendo cualquier modulación de una actividad o función de las células iniciadoras de tumores o células descendientes de las mismas como se describe en esta memoria o sabría el experto en la materia.

[0207] Los procedimientos para cribar e identificar agentes y compuestos incluyen aquellos adecuados para cribado de alto rendimiento, que incluyen matrices de células (p. ej., micromatrices) ubicadas o colocadas opcionalmente en ubicaciones o posiciones predeterminadas. Los procedimientos de manipulación robótica o manual de alto rendimiento pueden examinar las interacciones químicas y determinar los niveles de expresión de muchos genes en un periodo de tiempo corto. Se han desarrollado técnicas que utilizan señales moleculares (p. ej., fluoróforos) y análisis automatizados que procesan la información a una velocidad muy elevada (véase, p. ej., a Pinhasov y col., Comb. Chem. High Throughput Screen. 7:133 (2004)). Por ejemplo, la tecnología de micromatrices se ha utilizado ampliamente para examinar las interacciones de miles de genes a la vez y proporcionar al mismo tiempo información sobre genes específicos (véase, p. ej., Mocellin y Rossi, Adv. Exp. Med. Biol. 593:19 (2007)).

[0208] Tales procedimientos de cribado (p. ej., de alto rendimiento) pueden identificar agentes y compuestos activos rápida y eficazmente. Por ejemplo, las células se pueden ubicar o colocar (presembrar) en una placa, tubo, matraz, botella rotatoria o placa de cultivo (p. ej., una única placa de múltiples pocillos tal como una placa de ⁸ , 16, 32, 64, 96, 384 y 1536 pocillos), opcionalmente en ubicaciones definidas, para la identificación de moléculas potencialmente terapéuticas. Las bibliotecas que se pueden cribar incluyen, por ejemplo, bibliotecas de moléculas pequeñas, bibliotecas de presentación en fagos, bibliotecas de presentación en levaduras de anticuerpos totalmente humanos (Adimab, LLC), bibliotecas de ARNip y vectores de transfección adenovirales.

XIII. Preparados farmacéuticos y usos terapéuticos

a. Formulaciones y vías de administración

[0209] En función de la forma del modulador, junto con cualquier conjugado opcional, el modo de administración previsto, la enfermedad que se va a tratar o controlar y varias otras variables, las composiciones de la presente invención se pueden formular según se desee usando técnicas reconocidas en la técnica. Es decir, en diversos casos de la presente descripción, las composiciones que comprenden moduladores de la PTK7 se formulan con una amplia variedad de vehículos farmacéuticamente aceptables (véase, p. ej., Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, 20a ed. (2003); Ansel y col., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7a ed., Lippincott Williamsy Wilkins (2004); Kibbe y col., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a ed., Pharmaceutical Press (2000). Diversos vehículos farmacéuticamente aceptables, que incluyen vehículos, aditivos y diluyentes, están fácilmente disponibles en numerosos proveedores comerciales. Asimismo, también se dispone de una gama de sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, tales como agentes ajustadores del pH y agentes tamponadores, agentes ajustadores de la tonicidad, estabilizantes, agentes humectantes y similares. Ciertos vehículos ejemplares no limitantes incluyen solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos.

[0210] Más particularmente, se apreciará que, en algunas realizaciones, las composiciones terapéuticas de la invención se pueden administrar puras o con un mínimo de componentes adicionales. Por el contrario, los moduladores de la PTK7 de la presente descripción se pueden formular opcionalmente para que contengan vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados que comprenden excipientes y agentes auxiliares que se conocen bien en la técnica y son sustancias relativamente inertes que facilitan la administración del modulador o que ayudan al procesamiento de los compuestos activos en preparados que están farmacéuticamente optimizados para la administración al punto de acción. Por ejemplo, un excipiente puede dar forma o consistencia, o actuar como diluyente para mejorar la farmacocinética del modulador. Los excipientes adecuados incluyen, pero no se limitan a, agentes estabilizantes, agentes humectantes y emulsionantes, sales para modificar la osmolaridad, agentes encapsulantes, tampones y mejoradores de la penetración cutánea.

[0211] Los moduladores descritos para administración sistémica se pueden formular para administración entérica, parenteral o tópica. De hecho, estos tres tipos de formulaciones se pueden usar simultáneamente para conseguir la administración sistémica del principio activo. Los excipientes, así como las formulaciones para administración parenteral y no parenteral de fármacos se exponen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20a ed. Mack Publishing (2000). Las formulaciones adecuadas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble, por ejemplo, sales hidrosolubles. Además, se pueden administrar suspensiones de los compuestos activos, según proceda, para suspensiones de inyección oleosas. Los disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos, por ejemplo, aceite de sésamo, o esteres de ácidos grasos sintéticos, por ejemplo, oleato de etilo o triglicéridos. Las suspensiones de inyección acuosas pueden contener sustancias que aumenten la viscosidad de la suspensión e incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspensión también puede contener estabilizantes. También se pueden usar liposomas para encapsular el agente para su administración a la célula.

[0212] Las formulaciones adecuadas para administración entérica incluyen cápsulas de gelatina dura o blanda, píldoras, comprimidos, lo que incluye comprimidos recubiertos, elixires, suspensiones, jarabes o inhalaciones y formas de liberación controlada de los mismos.

[0213] En general, los compuestos y las composiciones de la descripción, que comprenden moduladores de la PTK7 se pueden administrar in vivo a un sujeto con necesidad de los mismos, por diversas vías, que incluyen, pero no se limitan a, vía oral, intravenosa, intraarterial, subcutánea, parenteral, intranasal, intramuscular, intracraneal, intracardíaca, intraventricular, endotraqueal, bucal, rectal, intraperitoneal, intradérmica, tópica, transdérmica e intratecal, o por implantación o inhalación de otro modo. Las composiciones objetivo se pueden formular en preparados en formas sólidas, semisólidas, líquidas o gaseosas; lo que incluye, pero no se limita a, comprimidos, cápsulas, polvos, gránulos, pomadas, soluciones, supositorios, enemas, inyecciones, inhaladores y aerosoles. La formulación y vía de administración apropiadas se pueden seleccionar según la aplicación y pauta terapéutica previstas.

b. Posología

[0214] Similarmente, la posología particular, es decir, dosis, cronología y repetición, dependerá del individuo particular y de la anamnesis de ese individuo. Consideraciones empíricas tales como la farmacocinética (p. ej., semivida, tasa de depuración, etc.) contribuirán a la determinación de la posología. La frecuencia de administración se puede determinar y ajustar a lo largo del ciclo de terapia, y se basa en reducir el número de células hiperproliferativas o neoplásicas, lo que incluye células iniciadoras de tumores, mantener la reducción de tales células neoplásicas, reducir la proliferación de células neoplásicas o retardar el desarrollo de metástasis. Alternativamente, pueden ser apropiadas formulaciones de liberación continua prolongada de una composición terapéutica objetivo. Como se mencionó anteriormente, diversas formulaciones y dispositivos para conseguir la liberación prolongada se conocen en la técnica.

[0215] Desde un punto de vista terapéutico, las composiciones farmacéuticas se administran en una cantidad eficaz para el tratamiento o la profilaxis de la indicación específica. La cantidad terapéuticamente eficaz es habitualmente dependiente del peso del sujeto que se está tratando, su estado físico o de salud, la magnitud de la afección que se va a tratar o la edad del sujeto que se está tratando. En general, los moduladores de la PTK7 de la descripción se pueden administrar en una cantidad en el intervalo de aproximadamente ^{1 0} pg/kg de peso corporal a aproximadamente 100mg/kg de peso corporal por dosis. En ciertos casos, los moduladores de la PTK7 de la descripción se pueden administrar en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 50 pg/kg de peso corporal a aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal por dosis. En ciertos otros casos, los moduladores de la PTK7 de la descripción se pueden administrar en una cantidad en el intervalo de aproximadamente ^{1 0 0} pg/kg de peso corporal a aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal por dosis. Opcionalmente, los moduladores de la PTK7 de la descripción se pueden administrar en una cantidad en el intervalo de aproximadamente ^{1 0 0} pg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dosis. Opcionalmente, además, los moduladores de la PTK7 de la descripción se pueden administrar en una cantidad en el intervalo de aproximadamente 0,5 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal por dosis. En ciertos casos, los compuestos de la presente descripción se proporcionan en una dosis de al menos aproximadamente ^{1 0 0} pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 250 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 750 pg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 3 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal, al menos aproximadamente ^{1 0} mg/kg de peso corporal.

[0216] Se pueden proponer otras pautas posológicas en base a cálculos de la superficie corporal (SC) como se describe en la patente de E^e . UU. n.° 7744877. Como se sabe bien en la técnica, la SC se calcula usando la altura y el peso del paciente y proporciona una medida del tamaño de un sujeto representada por la superficie de su cuerpo. En casos seleccionados de la descripción que usan la SC, los moduladores se pueden administrar en dosis de 10mg/m² a 800 mg/m2. En otros casos preferidos, los moduladores se administrarán en dosis de 50 mg/m² a 500 mg/m2, y aún más preferentemente en dosis de 100 mg/m2, 150 mg/m2, 200 mg/m2, 250 mg/m2, 300 mg/m2, 350 mg/m2, 400 mg/m² o 450 mg/m2. Evidentemente, se apreciará que, independientemente de cómo se calculen las dosis, se pueden administrar múltiples dosis a lo largo de un período de tiempo seleccionado para proporcionar una dosis absoluta que es sustancialmente superior las administraciones individuales.

[0217] En cualquier caso, los moduladores de la PTK7 se administran preferentemente según sea necesario a sujetos con necesidad de los mismos. La determinación de la frecuencia de administración puede ser determinada por expertos en la materia, tales como un médico responsable del tratamiento, en base a consideraciones de la afección que se está tratando, la edad del sujeto que se está tratando, la gravedad de la afección que se está tratando, el estado de salud general del sujeto que se está tratando y similares. Generalmente, se administra una dosis eficaz del modulador de la PTK7 a un sujeto una o más veces. Más particularmente, se administra una dosis eficaz del modulador al sujeto una vez al mes, más de una vez al mes o menos de una vez al mes. En ciertos casos, la dosis eficaz del modulador de la PTK7 se puede administrar múltiples veces, lo que incluye durante periodos de al menos un mes, al menos seis meses o al menos un año. En otros casos más, pueden transcurrir varios días (2, 3, 4, 5, ⁶ o 7), varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, ⁶ , 7 u ⁸ ) o varios meses (1, 2, 3, 4, 5, ⁶ , 7 u ⁸ ) entre la administración de los moduladores descritos.

[0218] Las posologías y pautas posológicas también se pueden determinar empíricamente para las composiciones terapéuticas descritas en individuos que han recibido una o más administraciones. Por ejemplo, se pueden administrar a los individuos dosis crecientes de una composición terapéutica producida como se describe en esta memoria. Para evaluar la eficacia de la composición seleccionada, se puede realizar un seguimiento de un marcador de la enfermedad, trastorno o afección específico como se describió anteriormente. En los casos en que el individuo tiene cáncer, estos incluyen mediciones directas del tamaño del tumor mediante palpación u observación visual, medición indirecta del tamaño del tumor mediante rayos X u otras técnicas de diagnóstico por imágenes; una mejora como se evalúa mediante biopsia directa del tumor y análisis microscópico de la muestra del tumor; la medición de un marcador tumoral indirecto (p. ej., PSA para el cáncer de próstata) o un antígeno identificado según los procedimientos descritos en esta memoria, una reducción del dolor o parálisis; mejora del habla, la visión, la respiración u otra discapacidad asociada al tumor; aumento del apetito; o un aumento en la calidad de vida como se mide mediante ensayos aceptados o por la prolongación de la supervivencia. Resultará evidente para un experto en la materia que la posología variará en función del individuo, el tipo de afección neoplásica, el estadio de la afección neoplásica, de si la afección neoplásica ha comenzado a metastatizar a otra ubicación en el individuo, y de los tratamientos previos y simultáneos que se están usando.

c. Politerapias

[0219] Las politerapias contempladas por la invención pueden ser particularmente útiles para reducir o inhibir la proliferación no deseada de células neoplásicas (p. ej., células endoteliales), reducir la aparición de cáncer, reducir o impedir la recidiva del cáncer, o reducir o impedir la diseminación o metástasis del cáncer. En tales casos, los compuestos de la presente invención pueden actuar como agentes sensibilizantes o quimiosensibilizantes retirando las TPC que mantienen y perpetúan la masa tumoral (p. ej., células NTG) y permitir el uso más eficaz de los agentes anticancerígenos o reductores del tamaño tumoral de referencia actuales. Es decir, se puede usar una politerapia que comprende un modulador de la PTK7 y uno o más agentes anticancerígenos para reducir el cáncer consolidado, p. ej., reducir el número de células cancerosas presentes y/o reducir la carga tumoral, o mejorar al menos una manifestación o efecto secundario del cáncer. Como tal, politerapia se refiere a la administración de un modulador de la PTK7 y uno o más agentes anticancerígenos que incluyen, pero no se limitan a, agentes citotóxicos, agentes citostáticos, agentes quimioterápicos, agentes anticancerígenos dirigidos, modificadores de respuesta biológica, agentes inmunoterápicos, vacunas contra el cáncer, agentes antiangiogénicos, citocinas, hormonoterapias, radioterapia y agentes antimetastásicos.

[0220] Según los procedimientos de la presente descripción, no es necesario que los resultados combinados sean aditivos de los efectos observados cuando se realiza cada tratamiento (p. ej., anticuerpo anti-PTK7 y agente anticancerígeno) individualmente. Aunque generalmente son deseables al menos efectos aditivos, cualquier efecto antitumoral aumentado superior a una de las terapias individuales es beneficioso. Asimismo, la descripción no requiere que el tratamiento combinado presente efectos sinérgicos. Sin embargo, los expertos en la materia apreciarán que, con ciertas combinaciones seleccionadas que comprenden realizaciones preferidas, se puede observar sinergia.

[0221] Para poner en práctica la politerapia según la descripción, se puede administrar un modulador de la PTK7 (p. ej., anticuerpo anti-PTK7) en combinación con uno o más agentes anticancerígenos a un sujeto con necesidad de los mismos de una manera eficaz para dar como resultado una actividad anticancerígena en el sujeto. El modulador de la PTK7 y el agente anticancerígeno se proporcionan en cantidades eficaces y durante períodos de tiempo eficaces para dar como resultado su presencia combinada y sus acciones combinadas en el entorno tumoral según se desee. Para conseguir este objetivo, el modulador de la PTK7 y el agente anticancerígeno se pueden administrar al sujeto simultáneamente, indistintamente en una única composición o como dos o más composiciones distintas, usando las mismas o diferentes vías de administración.

[0222] Alternativamente, el modulador puede preceder, o seguir, al tratamiento con un agente anticancerígeno, p. ej., en intervalos que varían de minutos a semanas. En ciertos casos donde el agente anticancerígeno y el anticuerpo se administran independientemente al sujeto, el período de tiempo entre el momento de cada administración es tal que el agente anticancerígeno y el modulador son capaces de ejercer un efecto combinado sobre el tumor. En un caso particular, se contempla que tanto el agente anticancerígeno como el modulador de la PTK7 se administran en un plazo de aproximadamente 5 minutos a aproximadamente dos semanas entre sí.

[0223] En otros casos más, pueden transcurrir varios días (2, 3, 4, 5, ⁶ o 7), varias semanas (1, 2, 3, 4, 5, ⁶ , 7 u ⁸ ) o varios meses (1, 2, 3, 4, 5, ⁶ , 7 u ⁸ ) entre la administración del modulador y el agente anticancerígeno. El modulador de la PTK7 y uno o más agentes anticancerígenos (politerapia) se pueden administrar una vez, dos veces o al menos el período de tiempo necesario hasta que la afección se trata, palia o cura. Preferentemente, la politerapia se administra múltiples veces. La politerapia se puede administrar de tres veces al día a una vez cada seis meses. La administración puede ser con una pauta tal como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, una vez cada seis meses o se puede administrar continuamente a través de una minibomba. Como se indicó anteriormente, la politerapia se puede administrar por vía oral, mucosa, bucal, intranasal, inhalatoria, intravenosa, subcutánea, intramuscular, parenteral, intratumoral o tópica. La politerapia se puede administrar en un punto distante del punto del tumor. La politerapia se administrará generalmente durante el tiempo que el tumor está presente, siempre que la politerapia haga que el tumor o cáncer deje de crecer o reduzca su peso o volumen.

[0224] En un caso, se administra un modulador de la PTK7 en combinación con uno o más agentes anticancerígenos durante un ciclo de tratamiento corto a un sujeto con necesidad de los mismos. La duración del tratamiento con el anticuerpo puede variar según el agente anticancerígeno particular usado. La descripción también contempla la administración discontinua o dosis diarias divididas en varias administraciones parciales. El experto en la materia apreciará un tiempo de tratamiento apropiado para un agente anticancerígeno particular, y la descripción contempla la evaluación continua de las pautas de tratamiento óptimas para cada agente anticancerígeno.

[0225] La presente descripción contempla al menos un ciclo, preferentemente más de un ciclo durante el cual se administra la politerapia. El experto en la materia apreciará un período de tiempo apropiado para un ciclo, así como el número total de ciclos y el intervalo entre ciclos. La descripción contempla la evaluación continua de las pautas de tratamiento óptimas para cada modulador y agente anticancerígeno. Asimismo, la descripción también contempla más de una administración de indistintamente el anticuerpo anti-PTK7 o el agente anticancerígeno. El modulador y el agente anticancerígeno se pueden administrar indistintamente, en días o semanas alternos; o se puede administrar una secuencia de tratamiento con anticuerpo, seguida de uno o más tratamientos con agente anticancerígeno. En cualquier caso, como entenderán los expertos en la materia, las dosis apropiadas de los agentes quimioterápicos generalmente serán aproximadamente las ya empleadas en terapias clínicas donde se administran los agentes quimioterápicos solos o en combinación con otros agentes quimioterápicos.

[0226] En otro caso preferido, los moduladores de la PTK7 de la presente descripción se pueden usar en terapia de mantenimiento para reducir o eliminar la posibilidad de recidiva tumoral después de la presentación inicial de la enfermedad. Preferentemente, el trastorno habrá sido tratado y la masa tumoral inicial eliminada, reducida o mejorada de otro modo, por lo que el paciente es asintomático o está en remisión. En tal momento, se pueden administrar al sujeto cantidades farmacéuticamente eficaces de los moduladores descritos una o más veces, incluso aunque no haya, o prácticamente no haya, indicios de enfermedad usando procedimientos de diagnóstico convencionales. En algunos casos, los efectores se administrarán en una pauta regular a lo largo de un período de tiempo. Por ejemplo, los moduladores de la PTK7 se podrían administrar semanalmente, cada dos semanas, mensualmente, cada seis semanas, cada dos meses, cada tres meses, cada seis meses o anualmente. Dadas las enseñanzas de esta memoria, un experto en la materia podría determinar fácilmente las dosis y pautas posológicas favorables para reducir el potencial de recidiva de la enfermedad. Asimismo, tales tratamientos se podrían prolongar durante un periodo de semanas, meses, años o incluso indefinidamente en función de la respuesta del paciente y los parámetros clínicos y de diagnóstico.

[0227] En otro caso preferido más, los moduladores de la presente descripción se pueden usar profilácticamente para prevenir o reducir la posibilidad de metástasis tumoral después de un procedimiento de reducción del tamaño tumoral. Como se emplea en la presente descripción, un procedimiento de reducción del tamaño tumoral se define en términos generales y debe significar cualquier procedimiento, técnica o método que elimina, reduce, trata o mejora un tumor o una proliferación tumoral. Los procedimientos de reducción del tamaño tumoral ejemplares incluyen, pero no se limitan a, cirugía, tratamientos de radiación (es decir, radiación de haces), quimioterapia o ablación. En momentos apropiados determinados fácilmente por un experto en la materia a la vista de la presente descripción, los moduladores de la PTK7 se pueden administrar según sugieran los procedimientos clínicos, de diagnóstico o teragnosis para reducir la metástasis tumoral. Los moduladores se pueden administrar una o más veces en dosis farmacéuticamente eficaces como se determinan usando técnicas convencionales. Preferentemente, la pauta posológica irá acompañada de técnicas de diagnóstico y supervisión apropiadas que permitan modificarla según sea necesario.

d. Agentes anticancerígenos

[0228] Como se emplea en esta memoria, el término agente anticancerígeno significa cualquier agente que se puede usar para tratar un trastorno celular proliferativo tal como cáncer, lo que incluye agentes citotóxicos, agentes citostáticos, agentes antiangiogénicos, agentes reductores del tamaño tumoral, agentes quimioterápicos, radioterapia y agentes radioterápicos, agentes anticancerígenos dirigidos, modificadores de respuesta biológica, anticuerpos y agentes inmunoterápicos. Se apreciará que, en casos seleccionados, como se comentó anteriormente, tales agentes anticancerígenos pueden comprender conjugados y pueden estar asociados con moduladores antes de la administración.

[0229] El término agente citotóxico significa una sustancia que reduce o inhibe la función de las células y/o causa la destrucción de las células, es decir, la sustancia es tóxica para las células. Habitualmente, la sustancia es una molécula de origen natural procedente de un organismo vivo. Los ejemplos de agentes citotóxicos incluyen, pero no se limitan a, toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de bacterias (p. ej., toxina diftérica, endotoxina y exotoxina de pseudomonas, y enterotoxina A de estafilococos), hongos (p. ej., a-sarcina, restrictocina), plantas (p. ej., abrina, ricina, modecina, viscumina, proteína antiviral de fitolaca, saporina, gelonina, momoridina, tricosantina, toxina de la cebada, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitegelina, restrictocina, fenomicina, neomicina y los tricotecenos) o animales, (p. ej., ribonucleasas citotóxicas tales como ribonucleasas pancreáticas extracelulares; desoxirribonucleasa I, los que incluye fragmentos y/o variantes de los mismos.

[0230] Un agente quimioterápico significa un compuesto químico que reduce o inhibe inespecíficamente el crecimiento, la proliferación y/o la supervivencia de células cancerosas (p. ej., agentes citotóxicos o citostáticos). Tales agentes químicos a menudo se dirigen a procesos intracelulares necesarios para el crecimiento o la división celular y, por tanto, son particularmente eficaces contra las células cancerosas, que generalmente crecen y se dividen rápidamente. Por ejemplo, la vincristina despolimeriza los microtúbulos y, por tanto, inhibe que las células entren en mitosis. En general, los agentes quimioterápicos pueden incluir cualquier agente químico que inhibe, o está diseñado para inhibir, una célula cancerosa o una célula que es probable que se vuelva cancerosa o genere una descendencia tumorigénica (p. ej., TIC). Tales agentes se administran a menudo, y la mayoría de las veces son más eficaces, en combinación, p. ej., en la formulación CHOP.

[0231] Los ejemplos de agentes anticancerígenos que se pueden usar en combinación con (o conjugados a) los moduladores de la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, agentes alquilantes, sulfonatos de alquilo, aziridinas, etileniminas y metilamelaminas, acetogeninas, una camptotecina, briostatina, calistatina, CC-1065, criptoficinas, dolastatina, duocarmicina, eleuterobina, pancratistatina, una sarcodicticina, espongistatina, mostazas nitrogenadas, antibióticos, antibióticos enediínicos, dinamicina, bisfosfonatos, una esperamicina, cromoproteína antibióticos enediínicos cromóforos antiobióticos, aclacinomisinas, actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carcinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daundaurorrubicina, detorrubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, Adriamicina®, doxorrubicina, epirubicina, esorrubicina, idarrubicina, marcelomicina, mitomicinas, ácido micofenólico, nogalamicina, olivomicinas, peplomicina, porfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorrubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, cinostatina, zorrubicina; antimetabolitos, análogos del ácido fólico, análogos de purina, andrógenos, antiadrenales, reabastecedores de ácido fólico tales como ácido frolínico, aceglatona, glucósido de aldofosfamida, ácido aminolevulínico, eniluracilo, amsacrina, bestrabucilo, bisantreno, edatraxato, defofamina, demecolcina, diaziquona, elfornitina, acetato de eliptinio, una epotilona, etoglúcido, nitrato de galio, hidroxiurea, lentinano, lonidainina, maitansinoides, mitoguazona, mitoxantrona, mopidanmol, nitraerina, pentostatina, fenamet, pirarrubicina, losoxantrona, ácido podofílico, ² -etilhidrazida, procarbazina, complejo de polisacáridos PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR), razoxano; rizoxina; sizofirán; espirogermanio; ácido tenuazónico; triazicuona; 2,2',2"-triclorotrietilamina; tricotecenos (especialmente toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina); uretano; vindesina; dacarbazina; manomustina; mitobronitol; mitolactol; pipobromano; gacitosina; arabinósido (“Ara-C”); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, cloranbucilo; gemcitabina Gemzar®; ⁶ -tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; tenipósido; edatrexato; daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; irinotecán (Camptosar, CPT-11), inhibidor de la topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO); retinoides; capecitabina; combretastatina; leucovorina (LV); oxaliplatino; inhibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR y VEGF-A que reducen la proliferación celular y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. También se incluyen en esta definición agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal sobre tumores tales como antiestrógenos y moduladores selectivos de los receptores de estrógenos (SERM), inhibidores de la aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógenos en las glándulas suprarrenales, y antiandrógenos; así como troxacitabina (un análogo de citosina de nucleósido de 1,3-dioxolano); oligonucleótidos no codificantes; ribozimas tales como un inhibidor de la expresión de VEGF y un inhibidor de la expresión de HER2; vacunas, rIL-2 PROLEUKIN®; inhibidor de la topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; rmRH ABARELIX®; vinorelbina y esperamicinas y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. Otros casos comprenden el uso de agentes inmunoterápicos, tales como anticuerpos, homologados para terapia contra el cáncer que incluyen, pero no se limitan a, rituximab, trastuzumab, gemtuzumab ozogamicina, alemtuzumab, ibritumomab, tiuxetán, tositumomab, bevacizumab, cetuximab, panitumumab, ofatumumab, ipilimumab y brentuximab vedotina. Los expertos en la materia podrán identificar fácilmente agentes anticancerígenos adicionales que son compatibles con las enseñanzas de esta memoria.

e. Radioterapia

[0232] La presente descripción también contempla la combinación de moduladores de la PTK7 con radioterapia (es decir, cualquier mecanismo para inducir daño al a Dn localmente en las células tumorales tal como irradiación de rayos gamma, rayos X, irradiación UV, microondas, emisiones electrónicas y similares). También se contempla la politerapia que usa la administración dirigida de radioisótopos a células tumorales, y se puede usar junto con un agente anticancerígeno dirigido u otro medio de guiado. Habitualmente, la radioterapia se administra en pulsos a lo largo de un periodo de tiempo de aproximadamente 1 a aproximadamente 2 semanas. La radioterapia se puede administrar a sujetos que padecen cáncer de cabeza y cuello durante aproximadamente ⁶ a 7 semanas. Opcionalmente, la radioterapia se puede administrar como una dosis única o como múltiples dosis secuenciales.

f. Afecciones neoplásicas

[0233] Ya sea administrados solos o en combinación con un agente anticancerígeno o radioterapia, los moduladores de la PTK7 de la presente descripción son particularmente útiles para tratar en general afecciones neoplásicas en pacientes o sujetos que pueden incluir tumores benignos o malignos (p. ej., carcinomas renales, de hígado, riñón, vejiga, mama, gástricos, ováricos, colorrectales, de próstata, pancreáticos, de pulmón, tiroides, hepáticos; sarcomas; glioblastomas; y diversos tumores de cabeza y cuello); leucemias y neoplasias malignas linfoides; otros trastornos tales como trastornos neuronales, gliales, astrocíticos, hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrofágicos, epiteliales, estromales y blastocólicos; y trastornos inflamatorios, angiogénicos, inmunológicos y trastornos causados por patógenos. Las dianas particularmente preferidas para el tratamiento con composiciones terapéuticas y procedimientos de la presente descripción son afecciones neoplásicas que comprenden tumores sólidos. En otros casos preferidos, los moduladores de la presente descripción se pueden usar para el diagnóstico, la prevención o el tratamiento de neoplasias malignas hematológicas. Preferentemente, el sujeto o paciente que se va a tratar será un ser humano, aunque, como se emplea en esta memoria, los términos están expresamente destinados a comprender cualquier especie de mamífero.

[0234] Más específicamente, las afecciones neoplásicas sometidas a tratamiento según la presente invención se pueden seleccionar del grupo que incluye, pero no se limita a, tumores de las glándulas suprarrenales, cánceres asociados a SIDA, sarcoma alveolar de partes blandas, tumores astrocíticos, cáncer de vejiga (carcinoma epidermoide y carcinoma de células de transición), cáncer de huesos (adamantinoma, quistes óseos aneurismáticos, osteocondroma, osteosarcoma), cánceres cerebrales y de la médula espinal, tumores cerebrales metastásicos, cáncer de mama, tumores del cuerpo carotídeo, cáncer de cuello uterino, condrosarcoma, cordoma, carcinoma de células renales cromófobas, carcinoma de células claras, cáncer de colon, cáncer colorrectal, histiocitomas fibrosos cutáneos benignos, tumores desmoplásicos de células pequeñas y redondas, ependimomas, tumores de Ewing, condrosarcoma mixoide extraesquelético, fibrogénesis imperfecta ósea, displasia fibrosa ósea, cánceres de las vías biliares y la vesícula biliar, enfermedad trofoblástica gestacional, tumores de células germinativas, cánceres de cabeza y cuello, insulinomas, sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (nefroblastoma, carcinoma papilar de células renales), leucemias, lipoma/tumores lipomatosos benignos, liposarcoma/tumores lipomatosos malignos, cáncer de hígado (hepatoblastoma, carcinoma hepatocelular), linfomas, cánceres de pulmón (carcinoma microcítico, adenocarcinoma, carcinoma epidermoide, carcinoma de células grandes, etc.), meduloblastoma, melanoma, meningiomas, neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple, síndrome mielodisplásico, neuroblastoma, tumores neuroendocrinos, cáncer ovárico, cánceres pancreáticos, carcinoma papilar de tiroides, tumores paratiroideos, cánceres pediátricos, tumores de la vaina de los nervios periféricos, feocromocitoma, tumores pituitarios, cáncer de próstata, melanoma uveal posterior, trastornos hematológicos poco frecuentes, cáncer renal metastásico, tumor rabdoide, rabdomisarcoma, sarcomas, cáncer de piel, sarcomas de los tejidos blandos, cáncer espinocelular, cáncer de estómago, sarcoma sinovial, cáncer testicular, carcinoma tímico, timoma, cáncer de tiroides metastásico y cánceres uterinos (carcinoma del cuello del útero, carcinoma de endometrio y leiomioma). En ciertas realizaciones preferidas, las células cancerosas se seleccionan del grupo de tumores sólidos que incluye, pero no se limita a, cáncer de mama, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), cáncer de pulmón microcítico, cáncer pancreático, cáncer de colon, cáncer de próstata, sarcomas, cáncer renal metastásico, cáncer de tiroides metastásico y carcinoma de células claras.

[0235] Con respecto a las neoplasias hematológicas malignas, se apreciará además que los compuestos y procedimientos de la presente descripción pueden ser particularmente eficaces para tratar un abanico de linfomas de linfocitos B, que incluyen el linfoma folicular de bajo grado/NHL (FCC), linfoma de células del manto (MCL), linfoma difuso de células grandes (DLCL), NHL linfocítico pequeño (SL), NHL de grado intermedio/folicular, NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de células pequeñas no escindidas de alto grado, NHL con gran masa tumoral, macroglobulinemia de Waldenstrom, linfoma linfoplasmacitoide (LPL), linfoma de células del manto (MCL), linfoma folicular (FL), linfoma difuso de células grandes (DLCL), linfoma de Burkitt (BL), linfomas relacionados con el SIDA, linfoma monocítico de linfocitos B, linfoadenopatía angioinmunoblástica, linfoma linfocitíco pequeño, folicular, difuso de células grandes, difuso de células pequeñas escindidas, linfoblastoma inmunoblástico de células grandes, pequeñas, no escindidas, de Burkitt y no Burkitt, folicular, de células predominantemente grandes; linfomas de células foliculares, predominantemente pequeñas, escindidas; y linfomas foliculares, mixtos de células pequeñas escindidas y grandes. Véase Gaidono y col., “Lymphomas” en CANCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, Vol. 2: 2131-2145 (DeVita y col., eds., 5a ed. 1997). Debería ser evidente para los expertos en la materia que estos linfomas a menudo tendrán nombres diferentes debido a los variables sistemas de clasificación, y que los pacientes que tienen linfomas clasificados con nombres diferentes también se pueden beneficiar de las pautas de politerapia de la presente invención.

[0236] En otros casos preferidos más, los moduladores de la PTK7 se pueden usar para tratar eficazmente ciertas neoplasias malignas mieloides y hematológicas que incluyen leucemias tales como leucemia linfocítica crónica (LLC o LLC-B) o leucemia mieloide aguda LMA. Tales leucemias son predominantemente una enfermedad de los ancianos que comienza a aumentar en incidencia después de los cincuenta años de edad y alcanza un pico a finales de los sesenta. La LLC implica generalmente la proliferación de linfocitos de la sangre periférica neoplásicos. El hallazgo clínico de LLC implica linfocitosis, linfadenopatía, esplenomegalia, anemia y trombocitopenia. La LMA también se denomina leucemia mielógena aguda, leucemia mieloblástica aguda, leucemia granulocítica aguda y leucemia no linfocítica aguda. La fisiopatología subyacente en la LMA consiste en una interrupción de la maduración de las células de la médula ósea en las etapas iniciales de desarrollo. En el caso de ambos trastornos, los expertos en la materia pueden obtener fácilmente las pautas posológicas en vista de la presente descripción usando procedimientos clínicamente aceptados.

[0237] La presente descripción también contempla un tratamiento preventivo o profiláctico de sujetos que presentan tumores benignos o precancerosos. No se cree que se deba excluir ningún tipo particular de tumor o trastorno neoplásico del tratamiento usando la presente descripción. Sin embargo, el tipo de células tumorales puede ser relevante para el uso de la descripción en combinación con agentes terapéuticos secundarios, particularmente agentes quimioterápicos y agentes anticancerígenos dirigidos.

[0238] Otros casos preferidos de la presente descripción comprenden el uso de moduladores de la PTK7 para tratar sujetos que padecen tumores sólidos. En tales sujetos, muchos de estos tumores sólidos comprenden tejido que presenta diversas mutaciones genéticas que pueden hacerlos particularmente susceptibles al tratamiento con los efectores descritos. Por ejemplo, las mutaciones de KRAS, APC y CTNNB1 y CDH1 son relativamente habituales en pacientes con cáncer colorrectal. Asimismo, los pacientes que padecen tumores con estas mutaciones normalmente son los más resistentes a las terapias actuales; especialmente los pacientes con mutaciones de KRAS. Las mutaciones activadoras de KRAS, que habitualmente dan como resultado sustituciones de aminoácidos únicos, también están implicadas en otras neoplasias malignas difíciles de tratar, que incluyen adenocarcinoma de pulmón, adenoma mucinoso y carcinoma ductal del páncreas.

[0239] Actualmente, la previsión más fiable de si los pacientes con cáncer colorrectal responderán a fármacos inhibidores del EGFR o VEGF, por ejemplo, es detectar la presencia de ciertas mutaciones “activadoras” KRAS. KRAS está mutado en 35-45 % de los cánceres colorrectales y los pacientes cuyos tumores expresan KRAS mutado no responden bien a estos fármacos. Por ejemplo, las mutaciones de KRAS son pronóstico de una falta de respuesta a la terapia con panitumumab y cetuximab en el cáncer colorrectal (Lievre y col. Cancer Res 66:3992-5; Karapetis y col. NEJM 359:1757-1765). Aproximadamente 85 % de los pacientes con cáncer colorrectal tienen mutaciones en el gen APC (Markowitz y Bertagnolli, NEJM 361:2449-60), y se han caracterizado más de 800 mutaciones de APC en pacientes con poliposis adenomatosa familiar y cáncer colorrectal. Una mayoría de estas mutaciones dan como resultado una proteína de APC truncada, con capacidad funcional reducida para mediar la destrucción de betacatenina. Las mutaciones en el gen de la beta-catenina, CTNNB1, también pueden dar como resultado una estabilización aumentada de la proteína, que da como resultado la importación nuclear y posterior activación de varios programas transcripcionales oncogénicos, este también es el mecanismo de oncogénesis como consecuencia de la ineficacia del APC mutado para mediar apropiadamente la destrucción de beta-catenina, que es necesaria para mantener los programas de proliferación y diferenciación celular normal bajo control.

[0240] La pérdida de expresión de CDH1 (E-cadherina) es otra manifestación habitual en el cáncer colorrectal, a menudo observada en estadios más avanzados de la enfermedad. E-cadherina es el miembro central de las uniones de adherina que conectan y organizan las células en las capas epiteliales. Normalmente, la E-cadherina secuestra físicamente a la beta-catenina (CTNNB1) en la membrana plasmática; la pérdida de expresión de E-cadherina en el cáncer colorrectal da como resultado la localización de la beta-catenina en el núcleo y la activación transcripcional de la vía beta-catenina/WNT. La transducción de señales de beta-catenina/WNT anómala es fundamental para la oncogénesis y la beta-catenina nuclear se ha visto implicada en la gravedad del cáncer (Schmalhofer y col., 2009 PMID 19153669). La E-cadherina es necesaria para la expresión y función de EphA2, un receptor conocido para los ligandos de la ^pT^k7 en las células epiteliales (Dodge Zantek y col., 1999 PMID 10511313; Orsulic S y Kemler R, 2000 PMID 10769210). El uso de moduladores que se unen a los ligandos de la PTK7 y agonizan o antagonizan la unión al receptor puede modificar, interrumpir o invertir los procesos prooncogénicos. Alternativamente, los moduladores de la PTK7 se pueden unir preferentemente a células tumorales con interacciones de la PTK7 anómalas basadas en las preferencias de unión de los moduladores de la PTK7. Por tanto, los pacientes con neoplasias malignas que llevan los rasgos genéticos mencionados anteriormente se pueden beneficiar del tratamiento con los moduladores de la PTK7 mencionados anteriormente.

XIV. Artículos de fabricación

[0241] También se proporcionan envases y kits farmacéuticos que comprenden uno o más recipientes, que comprenden una o más dosis de un modulador de la PTK7. En ciertas realizaciones, se proporciona una dosis unitaria, donde la dosis unitaria contiene una cantidad predeterminada de una composición que comprende, por ejemplo, un anticuerpo anti-PTK7, con o sin uno o más agentes adicionales. Para otras realizaciones, la dosis unitaria se suministra en una jeringa desechable precargada para inyección. En otras realizaciones más, la composición contenida en la dosis unitaria puede comprender solución salina, sacarosa o similares; un tampón, tal como fosfato, o similares; y/o estar formulada en un intervalo de pH estable y eficaz. Alternativamente, en ciertas realizaciones, la composición se puede proporcionar como un polvo liofilizado que se puede reconstituir tras la adición de un líquido apropiado, por ejemplo, agua estéril. En ciertas realizaciones preferidas, la composición comprende una o más sustancias que inhiben la agregación proteica, que incluyen, pero no se limitan a, sucrosa y arginina. Cualquier etiqueta en, o asociada con, el uno o más recipientes indica que la composición contenida se usa para el diagnóstico o tratamiento del proceso patológico de elección.

[0242] La presente descripción también proporciona kits para producir unidades de administración mono- o multidosis de un modulador de la PTK7 y, opcionalmente, uno o más agentes anticancerígenos. El kit comprende un recipiente y una etiqueta o un prospecto en, o asociado con, el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, jeringas, etc. Los recipientes pueden estar construidos de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente contiene una composición que es eficaz para tratar la afección y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa o un vial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). Tales kits contendrán generalmente en un recipiente adecuado una formulación farmacéuticamente aceptable del modulador de la PTK7 y, opcionalmente, uno o más agentes anticancerígenos en el mismo recipiente o diferentes recipientes. Los kits también pueden contener otras formulaciones farmacéuticamente aceptables, indistintamente para diagnóstico o politerapia. Por ejemplo, además del modulador de la PTK7 de la descripción, tales kits pueden contener uno cualquiera o más de un abanico de agentes anticancerígenos tales como fármacos quimioterápicos o radioterápicos; agentes antiangiogénicos; agentes antimetastásicos; agentes anticancerígenos dirigidos; agentes citotóxicos; y/u otros agentes anticancerígenos. Tales kits también pueden proporcionar reactivos apropiados para conjugar el modulador de la PTK7 con un agente anticancerígeno o un agente de diagnóstico (p. ej., véase la patente de EE. UU. n.° 7422739).

[0243] Más específicamente, los kits pueden tener un único recipiente que contiene el modulador de la PTK7, con o sin componentes adicionales, o pueden tener recipientes distintos para cada agente deseado. Cuando se proporcionan agentes terapéuticos combinados para su conjugación, se puede premezclar una única solución, indistintamente en una combinación molar equivalente o con un componente en exceso con respecto al otro. Alternativamente, el modulador de la PTK7 y cualquier agente anticancerígeno opcional del kit se pueden mantener independientemente en recipientes distintos antes de la administración a un paciente. Los kits también pueden comprender un segundo/tercer medio de contención para contener un tampón estéril y farmacéuticamente aceptable u otro diluyente tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina tamponada con fosfato (PBS), solución de Ringer y solución de dextrosa.

[0244] Cuando los componentes del kit se proporcionan en una o más soluciones líquidas, la solución líquida es preferentemente una solución acuosa, siendo una solución acuosa estéril particularmente preferida. Sin embargo, los componentes del kit se pueden proporcionar como uno o más polvos secos. Cuando se proporcionan reactivos o componentes como un polvo seco, el polvo se puede reconstituir mediante la adición de un disolvente adecuado. Se prevé que el disolvente también se puede proporcionar en otro recipiente.

[0245] Como se indicó brevemente anteriormente, los kits también pueden contener un medio mediante el cual administrar el anticuerpo y cualesquiera componentes opcionales a un animal o un paciente, p. ej., una o más agujas o jeringas, o incluso un cuentagotas, una pipeta u otro aparato similar, mediante el cual se puede inyectar o introducir la formulación en el animal o aplicarla a un área del cuerpo enferma. Los kits de la presente descripción también incluirán habitualmente un medio para contener los viales, o similares, y otro componente aislados para su comercialización, tal como, p. ej., recipientes de plástico moldeados por inyección o soplado en los que se colocan y conservan los viales deseados y otros aparatos. Cualquier etiqueta o prospecto indica que la composición de modulador de la PTK7 se usa para tratar el cáncer, por ejemplo, cáncer colorrectal.

[0246] En otros casos preferidos, los moduladores de la presente descripción pueden usarse junto con, o comprender, dispositivos de diagnóstico o terapéuticos útiles en el diagnóstico o tratamiento de trastornos proliferativos. Por ejemplo, en un caso preferido, los compuestos y las composiciones de la presente descripción se pueden combinar con ciertos dispositivos o instrumentos de diagnóstico que se pueden usar para detectar, controlar, cuantificar o trazar el perfil de células o compuestos marcadores implicados en la etiología o manifestación de trastornos proliferativos. En casos particularmente preferidos, los dispositivos se pueden usar para detectar, controlar y/o cuantificar células tumorales circulantes indistintamente in vivo o in vitro (véase, por ejemplo, el documento WO 2012/0128801).

[0247] En otros casos preferidos más, y como se comentó anteriormente, las células tumorales circulantes pueden comprender citoblastos cancerosos.

XV. Reactivos de investigación

[0248] Otros casos preferidos de la descripción también aprovechan las propiedades de los moduladores descritos como un instrumento útil para identificar, aislar, seccionar o enriquecer poblaciones o subpoblaciones de células iniciadoras de tumores mediante procedimientos tales como citometría de flujo, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), clasificación de células activadas magnéticamente (MACS) o seccionamiento mediado por láser. Los expertos en la materia apreciarán que los moduladores se pueden usar en varias técnicas compatibles para la caracterización y manipulación de TIC, lo que incluye citoblastos cancerosos (véanse, p. ej., las patentes de EE. UU. n.° 12/686359, 12/669136 y 12/757649).

XVI. Varios

[0249] A menos que se definan de otro modo en esta memoria, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados entendidos habitualmente por los expertos en la materia. Además, a menos que el contexto lo requiera de otro modo, los términos en singular deben incluir pluralidades y los términos en plural deben incluir el singular. Más específicamente, como se emplean en esta memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “uno/a” y “el/la” incluyen las referencias en plural a menos que el contexto lo dicte claramente de otro modo. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una proteína” incluye una pluralidad de proteínas; la referencia a “una célula” incluye mezclas de células, y similares. Además, los intervalos proporcionados en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas incluyen ambos límites de los intervalos y todos los puntos entre los límites. Por lo tanto, un intervalo de 2,0 a 3,0 incluye 2,0, 3,0, y todos los puntos entre 2,0 y 3,0.

[0250] Generalmente, la nomenclatura usada en relación con, y las técnicas de, cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y ácidos nucleicos descritas en esta memoria se conocen bien y se usan habitualmente en la técnica. Los procedimientos y las técnicas de la presente descripción se realizan generalmente según procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y comentan a lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que se indique de otro modo. Véase, p. ej., Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); y Coligan y col., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan según las especificaciones del fabricante, como se llevan a cabo habitualmente en la técnica o como se describe en esta memoria. La nomenclatura usada en relación con, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química orgánica sintética, y química medicinal y farmacéutica descritas en esta memoria se conocen bien y se usan habitualmente en la técnica.

[0251] Asimismo, todos los títulos de las secciones usados en esta memoria se dan con fines organizativos y no se deben interpretar como limitantes de la materia descrita.

EJEMPLOS

[0252] La presente invención, como se describió en general anteriormente, se comprenderá más fácilmente por referencia a los ejemplos siguientes, que se proporcionan a modo ilustrativo y no están destinados a ser limitantes de la presente invención. Los ejemplos no están destinados a representar que los experimentos siguientes son todos o los únicos experimentos realizados. A menos que se indique de otro modo, las partes son partes en peso, el peso molecular es el peso molecular medio ponderado, la temperatura está en grados centígrados y la presión es, o se aproxima a, la presión atmosférica.

Ejemplo 1

Enriquecimiento de poblaciones de células iniciadoras de tumores

[0253] Para caracterizar la heterogeneidad celular de los tumores sólidos como existen en los pacientes con cáncer, dilucidar la identidad de las células perpetuadoras de tumores (TPC; es decir, citoblastos cancerosos: CSC) usando marcadores fenotípicos particulares e identificar dianas terapéuticas clínicamente relevantes, se desarrolló y mantuvo un gran banco de tumores de xenoinjerto no tradicional (NTX) usando técnicas reconocidas en la técnica. El banco de tumores de NTX, que comprende un gran número de estirpes celulares tumorales diferentes, se propagó en ratones inmunodeprimidos mediante múltiples pases de células tumorales heterogéneas obtenidas originalmente a partir de numerosos pacientes con cáncer que padecían un abanico de tumores sólidos malignos. La disponibilidad continua de un gran número de estirpes celulares de tumores de NTX de los primeros pases diferentes con linajes bien definidos facilita enormemente la identificación y el aislamiento de TPC, ya que estas permiten la caracterización reproducible y repetitiva de células purificadas a partir de las estirpes celulares. Más particularmente, las TPC aisladas o purificadas se definen con la máxima exactitud retrospectivamente según su capacidad para generar tumores fenotípica y morfológicamente heterogéneos en ratones que recuerdan la muestra tumoral del paciente a partir de la que se originaron las células. Por tanto, la capacidad para usar poblaciones pequeñas de células aisladas para generar tumores totalmente heterogéneos en ratones es fuertemente indicativa del hecho de que las células aisladas comprenden TPC. En tal trabajo, el uso de estirpes celulares de NTX sometidas a un número mínimos de pases simplifica enormemente la experimentación in vivo y proporciona resultados fácilmente verificables. Asimismo, los tumores NTX de los primeros pases responden a agentes terapéuticos tales como irinotecán (es decir, Camptosar®), lo que proporciona conocimientos clínicamente relevantes de los mecanismos subyacentes que impulsan el crecimiento tumoral, la resistencia a las terapias actuales y la recidiva tumoral.

[0254] A medida que se crearon las estirpes celulares de tumores de NTX, se analizaron los fenotipos celulares tumorales constituyentes usando citometría de flujo para identificar diferentes marcadores que se podrían usar para caracterizar, aislar, purificar o enriquecer las células iniciadoras de tumores (TIC) y separar o analizar las células TPC y TProg de tales poblaciones. A este respecto, los inventores emplearon una plataforma proteómica patentada (es decir, la matriz PhenoPrint™) que permitía la caracterización rápida de las células en base a la expresión proteica y la identificación simultánea de marcadores potencialmente útiles. La matriz PhenoPrint es una plataforma proteómica patentada que comprende cientos de moléculas de unión diferentes, muchas obtenidas de proveedores comerciales, dispuestas en placas de 96 pocillos donde cada pocillo contiene un anticuerpo distinto en el canal fluorescente de la ficoeritrina y múltiples anticuerpos adicionales en diferentes fluorocromos dispuestos en cada pocillo a lo largo de la placa. Esto permite la determinación de los niveles de expresión del antígeno de interés en una subpoblación de células tumorales seleccionadas mediante la inclusión rápida de células relevantes o la eliminación de células no relevantes a través de los canales que no son de ficoeritrina. Cuando se usó la matriz PhenoPrint en combinación con técnicas de disociación tisular, trasplante y citoblastos bien conocidas en la técnica (Al-Hajj y col., 2004, Dalerba y col., 2007 y Dylla y col., 2008, todos arriba), fue posible identificar eficazmente marcadores relevantes y posteriormente aislar y trasplantar subpoblaciones de células tumorales humanas específicas con gran eficacia.

[0255] Por consiguiente, tras crear diversas estirpes celulares de tumores de NTX como se hace habitualmente para los tumores humanos en ratones gravemente inmunodeprimidos, se extirparon los tumores de los ratones cuando alcanzaron 800-2000 mm³ y las células se disociaron y dispersaron en suspensiones monocelulares usando técnicas de digestión enzimática reconocidas en la técnica (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. n.° 2007/0292414).

[0256] Los datos obtenidos a partir de estas suspensiones usando la matriz PhenoPrint proporcionaron la expresión de proteínas superficiales tanto absoluta (por célula) como relativa (en comparación con otras células de la población) célula por célula, lo que condujo a la caracterización y estratificación más complejas de las poblaciones celulares. Más específicamente, el uso de la matriz PhenoPrint permitió la identificación rápida de proteínas o marcadores que diferenciaron prospectivamente las TIC o TPC de las células de masas tumorales NTG y estroma tumoral y, cuando se aislaron de los modelos tumorales NTX, permitieron la caracterización relativamente rápida de subpoblaciones de células tumorales que expresaban diferentes niveles de proteínas de la superficie celular específicas. En particular, las proteínas con expresión heterogénea en toda la población de células tumorales permiten el aislamiento y trasplante de subpoblaciones de células tumorales distintas y altamente purificadas que expresan indistintamente niveles altos y bajos de una proteína o marcador particular en ratones inmunodeprimidos, facilitando de ese modo la evaluación de si las TPC estaban enriquecidas en una subpoblación u otra.

[0257] El término enriquecer se usa como sinónimo de aislar células y significa que el rendimiento (fracción) de células de un tipo aumenta sobre la fracción de otros tipos de células en comparación con la población celular de partida o inicial. Preferentemente, enriquecer se refiere a aumentar el porcentaje en aproximadamente 10%, en aproximadamente 20 %, en aproximadamente 30 %, en aproximadamente 40 %, en aproximadamente 50 % o en más de 50 % de un tipo de célula en una población de células en comparación con la población de células de partida.

[0258] Como se emplea en esta memoria, un marcador, en el contexto de una célula o un tejido, significa cualquier característica en forma de una entidad química o biológica que está asociada de forma identificable con, o se encuentra específicamente en, o sobre, una célula, una población celular o un tejido particulares que incluyen los identificados en, o sobre, un tejido o una población celular afectados por una enfermedad o trastorno. Como se manifestó, los marcadores pueden ser de naturaleza morfológica, funcional o bioquímica. En realizaciones preferidas, el marcador es un antígeno de la superficie celular que es expresado diferencial o preferentemente por tipos de células específicos (p. ej., TPC) o por células en ciertas condiciones (p. ej., durante puntos específicos del ciclo de vida celular o por células en un nicho particular). Preferentemente, tales marcadores son proteínas y, más preferentemente, poseen un epítopo para anticuerpos, aptámeros u otras moléculas de unión como se sabe en la técnica. Sin embargo, un marcador puede consistir en cualquier molécula encontrada sobre la superficie o dentro de una célula, lo que incluye, pero no se limita a, proteínas (péptidos y polipéptidos), lípidos, polisacáridos, ácidos nucleicos y esteroides. Los ejemplos de características o rasgos de los marcadores morfológicos incluyen, pero no se limitan a, forma, tamaño y relación de núcleo a citoplasma. Los ejemplos de características o rasgos de los marcadores funcionales incluyen, pero no se limitan a, la capacidad para adherirse a sustratos particulares, capacidad para incorporar o excluir colorantes particulares, por ejemplo, pero no limitada a, exclusiones de tintes lipófilos, capacidad para migrar en condiciones particulares y la capacidad para diferenciarse a lo largo de linajes particulares. Los marcadores también pueden ser una proteína expresada a partir de un gen indicador, por ejemplo, un gen indicador expresado por la célula como resultado de la introducción de la secuencia de ácido nucleico que codifica el gen indicador en la célula y su transcripción, que da como resultado la producción de la proteína indicadora que se puede usar como un marcador. Tales genes indicadores que se pueden usar como marcadores son, por ejemplo, pero no se limitan a, enzimas de proteínas fluorescentes, proteínas cromoméricas, genes de resistencia y similares.

[0259] En un sentido relacionado, el término fenotipo del marcador, en el contexto de un tejido, una célula o una población celular (p. ej., un fenotipo de TPC estable) significa cualquier marcador o combinación de marcadores que se puede usar para caracterizar, identificar, separar, aislar o enriquecer una célula o población celular particular (p. ej., mediante FACS). En realizaciones específicas, el fenotipo del marcador es un fenotipo de la superficie celular que se puede determinar detectando o identificando la expresión de una combinación de marcadores de la superficie celular.

[0260] Los expertos en la materia reconocerán que numerosos marcadores (o su ausencia) se han asociado a diversas poblaciones de citoblastos cancerosos y usado para aislar o caracterizar subpoblaciones de células tumorales. A este respecto, los marcadores de citoblastos cancerosos ejemplares comprenden OCT4, Nanog, STAT3, EPCAM, CD24, CD34, NB84, TrkA, GD2, CD133, CD20, CD56, CD29, B7H3, CD46, receptor de transferrina receptor, JAM3, carboxipeptidasa M, ADAM9, oncostatina M, Lgr5, Lgr⁶ , CD324, CD325, nestina, Sox1, Bmi-1, eed, easyh1, easyh2, mf2, yy1, smarcA3, smarckA5, smarcD3, smarcEl, mllt3, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD⁶ , FZD7, fZd ⁸ , FZD9, FZD10, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, WNT10B, WNT16, AXIN1, BCL9, MYC, (TCF4) SLC7A8, IL1RAP, TEM⁸ , TMPRSS4, MUC16, GPRC5B, SLC6A14, SLC4A11, PPAP2C, CAV1, CAV2, PTPN3, EPHA1, EPHA2, SLC1A1, CX3CL1, ADORA2A, MPZL1, FLJ10052, C4.4A, EDG3, RARRES1, TMEPAI, PTS, CEACAM⁶ , NID2, STEAP, ABCA3, CRIM1, IL1R1, OPN3, DAF, MUC1, MCP, CPD, NMA, ADAM9, GJA1, SLC19A2, ABCA1, PCDH7, ADCY9, SLC39A1, NPC1, ENPP1, N33, GPNMB, LY⁶ E, CELSR1, LRP3, C20orf52, TMEPAI, FLVCR, PCDHA10, GPR54, TGFBR3, SEMA4B, PCDHB2, ABCG2, CD166, AFP, BMP-4, p-catenina, CD2, CD3, CD9, CD14, CD31, CD38, CD44, CD45, CD74, CD90, CXCR4, decorina, EGFR, CD105, CD64, CD16, CD16a, CD16b, GLI1, GLI2, CD49b y CD49f. Véase, por ejemplo, Schulenburg y col., 2010, PMID: 20185329, la patente de EE. UU. n.° 7632678 y las patentes de EE. UU. n.° 2007/0292414, 2008/0175870, 2010/0275280, 2010/0162416 y 2011/0020221.

[0261] Se apreciará que varios de estos marcadores se incluyeron en la matriz PhenoPrint descrita anteriormente.

[0262] Similarmente, los ejemplos no limitantes de fenotipos de la superficie celular asociados a citoblastos cancerosos de ciertos tipos de tumores incluyen CD44hiCD24low, AlDH+, CD133+, CD123+, CD34+CD38-, CD44+CD24-, CD46hiCD324+CD66c-, CD133+CD34+CD10'CD19", CD138'CD34'CD19+, CD133+RC2+, CD^{4 4} +a² P-ihiCD133+, CD44+CD24+ESA+, CD271+, ABCB5+, así como otros fenotipos de la superficie de los citoblastos cancerosos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Schulenburg y col., 2010, arriba, Visvader y col., 2008, PMID: 18784658 y la patente de EE. UU. n.° 2008/0138313.

[0263] Los expertos en la materia apreciarán que se pueden usar fenotipos de marcador tales como los ejemplificados antes junto con análisis citométrico de flujo y técnicas de clasificación celular convencionales para caracterizar, aislar, purificar o enriquecer células o poblaciones celulares de TIC y/o TPC para su análisis posterior. Resulta interesante, en lo que respecta a la presente invención, que la CD46, CD324 y, opcionalmente, CD^{6 6} c están alta o heterogéneamente expresadas sobre la superficie de muchas células tumorales de cáncer colorrectal (“CR”), de mama (“BR”), de pulmón no microcítico (NSCLC), de pulmón microcítico (SCLC), pancreático (“PA”), de próstata (“PR”), de riñón (“KDY”), melanoma (“Mel”), ovárico (“OV”) y de cabeza y cuello (“HN”), independientemente de si las muestras tumorales que se están analizando eran muestras de tumores primarios del paciente o de tumores NTX obtenidas del paciente.

[0264] Las células con expresión negativa (es decir, “-”) se definen en esta memoria como aquellas células que expresan menos o igual que el centil 95 de la expresión observada con un anticuerpo de control de isotipo en el canal de fluorescencia en presencia del marcado con el cóctel de tinción del anticuerpo completo para otras proteínas de interés en canales adicionales de emisión de fluorescencia. Los expertos en la materia apreciarán que este procedimiento para definir acontecimientos negativos se denomina tinción con control de “fluorescencia menos uno”, o “FMO”. Las células con expresión superior al centil 95 de la expresión observada con un anticuerpo de control de isotipo usando el procedimiento de tinción FMO descrito anteriormente se definen en esta memoria como “positivas” (es decir, “+”). Como se define en esta memoria, hay diversas poblaciones de células definidas en términos generales como “positivas”. En primer lugar, las células con expresión baja (es decir, “lo”) se definen en general como aquellas células con expresión observada superior al centil 95 determinado usando tinción FMO con un anticuerpo de control de isotipo y dentro de una desviación estándar del centil 95 de la expresión observada con un anticuerpo de control de isotipo usando el procedimiento de tinción FMO descrito anteriormente. Las células con expresión “alta” (es decir, “hi”) se pueden definir como aquellas células con expresión observada superior al centil 95 determinado usando tinción FMO con un anticuerpo de control de isotipo y superior a una desviación estándar por encima del centil 95 de la expresión observada con un anticuerpo de control de isotipo usando el procedimiento de tinción FMO descrito anteriormente. En otras realizaciones, el centil 99 se puede usar preferentemente como punto de delimitación entre tinción FMO negativa y positiva y, en realizaciones particularmente preferidas, el centil puede ser superior a 99 %.

[0265] Usando técnicas tales como las descritas anteriormente para identificar y clasificar rápidamente los antígenos de tumores colorrectales en base a la intensidad y heterogeneidad de expresión en varios tumores NTX de pacientes con cáncer colorrectal, los antígenos de TPC potenciales se evaluaron adicionalmente mediante comparación de tejido tumoral y tejido adyacente normal y a continuación se seleccionaron en base a, al menos en parte, el aumento o reducción de la regulación del antígeno particular en las células malignas. Asimismo, el análisis sistemático de un abanico de marcadores de la superficie celular para determinar su capacidad de enriquecimiento para determinar la capacidad para trasplantar tumores totalmente heterogéneos a ratones (es decir, la capacidad tumorigénica), y la combinación posterior de estos marcadores mejoraron sustancialmente la resolución del procedimiento y mejoraron la capacidad para personalizar las técnicas de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para identificar y caracterizar subpoblaciones de células tumorales distintas y altamente enriquecidas que contenían exclusivamente toda la capacidad de generación de tumores tras el trasplante (es decir, células iniciadoras de tumores).

[0266] Cabe recordar que el término célula iniciadora de tumores (TIC) o célula tumorigénica (TG) abarca tanto las células perpetuadoras de tumores (TPC; es decir, citoblastos cancerosos) como las células progenitoras tumorales altamente proliferativas (TProg), que juntas comprenden en general una subpoblación singular (es decir, 0,1-25 %) de un volumen o masa tumoral; cuyas características se definieron anteriormente. La mayoría de las células tumorales caracterizadas de esta manera carecen de esta capacidad para formar tumores y, por tanto, se pueden caracterizar como no tumorigénicas (NTG). Sorprendentemente, se observó que la mayoría de los diferentes marcadores identificados usando la matriz PhenoPrint patentada no presentaron capacidad para enriquecer las poblaciones de células iniciadoras de tumores en los tumores colorrectales usando protocolos FACS convencionales, pero que se podrían usar combinaciones de marcadores distintas para identificar las dos subpoblaciones de células iniciadoras de tumores: TPC y TProg. Los expertos en la materia reconocerán que la diferencia determinante entre TPC y TProg, aunque ambas son iniciadoras de tumores en trasplantes primarios, es la capacidad de las TPC para estimular perpetuamente el crecimiento tumoral tras el trasplante en serie con números de células bajos. Asimismo, se desconocía que el marcador/las proteínas usados en combinación para enriquecer tanto las TPC como las TProg estuvieran asociados con células que contenían tal actividad en cualquier tejido o neoplasia antes del descubrimiento por parte de los inventores actuales, aunque otros han definido marcadores de la superficie celular o actividad enzimática que se pueden usar similarmente para enriquecer células tumorigénicas (Dylla y col. 2008, arriba). Como se expone más adelante, las subpoblaciones de células tumorales específicas aisladas usando combinaciones de marcadores de la superficie celular mencionadas anteriormente se analizaron a continuación usando secuenciación de nueva generación del transcriptoma completo para identificar y caracterizar genes expresados diferencialmente.

Ejemplo 2

Aislamiento y análisis de muestras de ARN de poblaciones de células iniciadoras de tumores enriquecidas

[0267] La estirpe tumoral de NTX colorrectal creada SCRX-CR4 se sometió a pases como se describe en el Ejemplo 1 y se usó para iniciar tumores en ratones inmunodeprimidos. Una vez que la carga tumoral media alcanzó ~300 mm3, los ratones se aleatorizaron y trataron con 15 mg/kg de irinotecán, 25 mg/kg de gemcitabina o control de vehículo (PBS) dos veces a la semana durante un período de al menos veinte días antes de la eutanasia. A continuación, se extirparon los tumores y las células TPC, TProg y NTG, respectivamente, se aislaron de tumores NTX colorrectales recién extirpados y, similarmente, se aislaron las células TG y NTG de tumores NTX pancreáticos, generalmente usando la técnica presentada en el Ejemplo 1. Más particularmente, las poblaciones celulares se aislaron mediante FACS y se sedimentaron y lisaron inmediatamente en tampón de lisis de ARN RLTplus de Qiagen (Qiagen, Inc.). Los lisados se almacenaron a continuación a -80 °C hasta su uso. Tras descongelarlos, se extrajo el ARN total utilizando un kit de aislamiento RNeasy (Qiagen) siguiendo las instrucciones del proveedor y se cuantificó en el espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Scientific) y un Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies), de nuevo usando los protocolos y la configuración del instrumento recomendados por el proveedor. El preparado de ARN total resultante fue adecuado para la secuenciación y el análisis genéticos.

[0268] Las muestras de ARN total obtenidas de las poblaciones celulares correspondientes aisladas como se describió anteriormente de ratones tratados con vehículo o agente quimioterápico se prepararon para la secuenciación del transcriptoma completo usando una plataforma de secuenciación de nueva generación SOLiD 3.0 (secuenciación mediante ligadura/detección de oligonucleótidos) de Applied Biosystems (Life Technologies), comenzando con 5 ng de ARN total por muestra. Los datos generados por la plataforma SOLiD se cartografiaron a 34609 genes del genoma humano y se pudo detectar PTK7 en varias muestras.

[0269] Generalmente, la plataforma de secuenciación de nueva generación SOLÍD3 permite la secuenciación paralela de fragmentos de ARN/ADN amplificados clonalmente enlazados a perlas. La secuenciación mediante ligadura con oligonucleótidos marcados con colorante se usa a continuación para generar 50 lecturas de bases de cada fragmento que existe en la muestra con un total de más de 50 millones de lecturas que generan una representación mucho más exacta del nivel de expresión de transcripción de ARNm de las proteínas en el genoma. La plataforma SOLiD3 no solo es capaz de capturar la expresión, sino también los SNP, acontecimientos de corte y empalme alternativo conocidos y desconocidos y descubrimientos de exones potencialmente nuevos en base únicamente a la cobertura de lectura (lecturas cartografiadas exclusivamente a ubicaciones genómicas). Por tanto, el uso de esta plataforma de nueva generación permitió la determinación de diferencias en el nivel de expresión de la transcripción, así como diferencias o preferencias por variantes de corte y empalme específicas de las transcripciones de ARNm expresadas. Asimismo, el análisis con la plataforma SOLiD3 usando un protocolo del transcriptoma completo modificado de Applied Biosystems solo requirió aproximadamente 5 ng de material de partida antes de la amplificación. Esto es significativo, ya que la extracción de ARN total de poblaciones celulares clasificadas en las que el subconjunto de células TPC es, por ejemplo, considerablemente inferior en número que el de NTG o masas tumorales y, por tanto, da como resultado cantidades muy pequeñas de material de partida utilizable.

[0270] Los ciclos de datos de secuenciación duplicados de la plataforma SOLiD3 se normalizaron y transformaron, y se calcularon los factores de aumento o reducción según la práctica industrial convencional. Como se observa en la FIG. 2, se midieron los niveles de expresión genética de PTK7 (expresados como lecturas por millón cartografiadas a exones; RPM_exon) en las subpoblaciones de células tumorales SCRx-CR4 correspondientes. Un análisis de los datos demostró que aumentó la regulación de PTK7 a nivel de transcripción entre 2-4 veces sobre la población de NTG, y 50-200 % sobre la población de TProg, en ratones tratados con vehículo o irinotecán, respectivamente.

[0271] Las observaciones descritas anteriormente demuestran que la expresión de PTK7 es generalmente elevada en las poblaciones de TPC y sugiere que la PTK7 puede desempeñar un papel importante en la tumorigénesis y el mantenimiento de los tumores, constituyendo así una diana interesante para las estrategias inmunoterápicas. Ejemplo 3

Análisis por PCR en tiempo real de PTK7 en poblaciones de células iniciadoras de tumores enriquecidas [0272] Para validar la expresión diferencial de PTK7 observada mediante secuenciación del transcriptoma completo en poblaciones de TPC en comparación con células TProg y NTG en el cáncer colorrectal, y en células TG en comparación con NTG en el cáncer pancreático, se usó PCR cuantitativa en tiempo real TaqMan® para medir los niveles de expresión genética en las poblaciones celulares correspondientes aisladas a partir de varias estirpes de NTX como se expuso anteriormente. Se apreciará que tal análisis por PCR en tiempo real permite una medición más directa y rápida de los niveles de expresión genética para dianas distintas usando cebadores y conjuntos de sondas específicos para un gen particular de interés. La PCR cuantitativa en tiempo real TaqMan® se realizó en una máquina Applied Biosystems 7900HT (Life Technologies), que se usó para medir la expresión de PTK7 y del gen de PTK7 en múltiples poblaciones de la estirpe celular NTX procedentes del paciente y los controles correspondientes. Asimismo, el análisis se realizó como se especifica en las instrucciones suministradas con el Sistema TaqMan y usando PTK7 y conjuntos de cebadores/sondas de PTK7 comercializados (Life Technologies).

[0273] Como se observa en la FIG. 3, se realizó el análisis por PCR cuantitativa en tiempo real de la expresión genética usando poblaciones de NTG y TPC aisladas de 2 estirpes de tumores NTX colorrectales distintas (SCRX-CR4 y CR5) y una estirpe tumoral pancreática (SCRX-PA3). Las poblaciones de células TProg también se separaron y analizaron para detectar SCRx-CR4. Los datos expuestos en la FIG. 3 demuestran que la expresión genética de PTK7 está elevada más de 2 veces en las TPC colorrectales, en comparación con las células NTG de los mismos tumores. La PTK7 también estaba elevada más de 2 veces en las TPC de ratones sometidos a tratamiento con irinotecán y en la población de células TIC de tumores pancreáticos (p. ej., SCRx-PA3). La observación de la expresión de PTK7 elevada en preparados de TPC de NTX en comparación con los controles de células NTG de tumores NTX tanto colorrectales como pancreáticos de pacientes usando la metodología ampliamente aceptada de PCR cuantitativa en tiempo real confirma los datos de secuenciación del transcriptoma completo de SOLiD3 más sensibles del Ejemplo anterior. Tales hallazgos respaldan además la asociación observada entre los niveles de expresión de PTK7 y la tumorigénesis celular subyacente, resistencia a la terapia y recidiva.

Ejemplo 4

Expresión de PTK7 en muestras de tumores colorrectales no fraccionadas

[0274] A la vista del hecho de que se encontró que la expresión genética de PTK7 era elevada en las poblaciones de TPC de tumores colorrectales en comparación con las células TProg y NTG de los mismos tumores, se realizaron experimentos para determinar si la expresión de PTK7 elevada también era detectable en muestras de tumores colorrectales no fraccionadas en comparación con el tejido adyacente normal (NAT). También se hicieron mediciones para determinar cómo se compara la expresión de PTK7 en los tumores con los niveles en muestras de tejido normal (NL).

[0275] Más específicamente, se diseñaron y fabricaron matrices personalizadas de 384 pocillos para qPCR TumorScan (Origene Technologies) que contenían ^{1 1 0} muestras de tumores colorrectales de pacientes en diferentes estadios, tejido adyacente normal y 48 tejidos normales usando técnicas conocidas en la técnica. Usando los procedimientos descritos en el Ejemplo 3 y los mismos conjuntos de cebadores/sondas de PTK7 específicos, se realizó la PCR cuantitativa en tiempo real TaqMan® en los pocillos de las placas personalizadas.

[0276] Las FIG. 4A y 4B muestran los resultados de los datos de expresión en un formato gráfico normalizado contra la expresión media en tejido normal del colon y recto. Más particularmente, la FIG. 4A resume los datos generados usando 168 muestras de tejido, obtenidas de ^{1 1 0} pacientes con cáncer colorrectal en diversos estadios de la enfermedad (I-IV), (de las cuales, 35 muestras de tejido son tejido adyacente normal (NAT) de pacientes con cáncer colorrectal) y 48 de tejidos normales de otras ubicaciones (tejido NL). En la gráfica, los datos de cada muestra de tejido/paciente se representan mediante un punto, con el valor de la media geométrica de cada población marcado sobre el eje X representado como una línea. Similarmente, la FIG. 4B contiene datos de 24 muestras de pacientes colorrectales emparejadas obtenidas de tejido tumoral (T) o tejido adyacente normal (N) en diversos estadios de la enfermedad (I-IV). Aquí, los datos representados gráficamente se presentan muestra por muestra con el enlace entre el tumor correspondiente y el tejido adyacente normal de pacientes individuales. La expresión de PTK7 es claramente superior en la mayoría de los tejidos tumorales emparejados en comparación con el tejido adyacente normal, alcanzando la expresión diferencial en los estadios 3 y 4 significación estadística (n > 4, p < 0,037).

[0277] Ambas FIG. 4A y 4B indican que, en los cuatro estadios presentados, el nivel expresado del gen de PTK7 es elevado en la mayoría de los tumores colorrectales y en muestras de tumores emparejadas en comparación con el tejido adyacente normal. Asimismo, la expresión genética de PTK7 media en cualquier estadio del cáncer colorrectal parece elevada en comparación con la mayoría de los tejidos normales que se evaluaron (FIG. 4A). Estos resultados demuestran que la expresión de PTK7 está aumentada en el cáncer colorrectal y, cuando se combina con las observaciones anteriores de que la expresión de PTK7 es la máxima en las TPC colorrectales y TIC pancreáticas, sugiere que el guiado terapéutico a los citoblastos cancerosos que expresan PTK7 puede proporcionar un beneficio terapéutico a los pacientes con cáncer.

Ejemplo 5

Expresión diferencial de PTK7 en muestras de tumores ejemplares

[0278] Para evaluar adicionalmente la expresión genética de PTK7 en muestras de tumores de pacientes con cáncer colorrectal adicionales y muestras de tumores de pacientes diagnosticados con ¹ de 18 tipos de tumores sólidos diferentes, se realizó la qRT-PCR Taqman® usando matrices de 384 pocillos para qPCR TissueScan (Origene Technologies), que se fabricaron por encargo como se describe en el Ejemplo 4, pero que incluían muestras de tumores sólidos de dieciocho tipos de tumores diferentes en lugar de solo muestras colorrectales. Los resultados de las mediciones se presentan en las FIG. 5A y 5B y demuestran que la expresión génica de PTK7 es significativamente elevada en varios tipos de tumores sólidos.

[0279] A este respecto, las FIG. 5A y 5B muestran los niveles de expresión genética relativos y absolutos, respectivamente, de PTK7 humana en muestras de tumores completos (puntos grises) o tejido adyacente normal emparejado (NAT; puntos blancos) de pacientes con uno de dieciocho tipos de tumores sólidos diferentes. En la FIG.

5A, los datos se normalizan contra la expresión genética media en NAT para cada tipo de tumor analizado. En la FIG.

5B, se evaluó la expresión absoluta de PTK7 en diversos tejidos/tumores, representando gráficamente los datos como el número de ciclos (Ct) necesarios para alcanzar amplificación exponencial mediante PCR cuantitativa en tiempo real. A las muestras no amplificadas se les asignó un valor de Ct de 45, que representa el último ciclo de amplificación en el protocolo experimental. Cada punto representa una muestra de tejido individual, con el valor medio representado como una línea negra.

[0280] Usando la matriz TissueScan de OriGene personalizada, se observó que la mayoría de los pacientes diagnosticados con cáncer colorrectal y la mayoría de los pacientes diagnosticados con cáncer suprarrenal, endometrial, esofágico, hepático, tiroideo y de vejiga presentaban significativamente más expresión genética de PTK7 en sus tumores en comparación con el NAT, lo que sugiere que la PTK7 podría desempeñar un papel en la tumorigénesis y/o progresión tumoral en estos tumores. También hubo subconjuntos de pacientes con cáncer de pulmón y próstata con expresión de PTK7 elevada en comparación con el NAT. Lo que también quedó claro a partir de estos estudios es que la expresión genética de PTK7 fue generalmente moderada en la mayoría de las muestras de NAT; observando la expresión máxima en la mama, el cuello uterino, el ovario, el páncreas, los testículos y la vejiga. Nuevamente, estos datos sugieren que la expresión de PTK7 elevada es indicativa, y potencialmente determinante, de la tumorigénesis o perpetuación de tumores en pacientes que presentan los trastornos hiperproliferativos seleccionados.

Ejemplo ⁶

Construcción y expresión de inmunógenos de PTK7

[0281] Con el fin de generar y caracterizar ciertos moduladores de la PTK7 según la presente descripción, se construyeron y expresaron dos formas de inmunógeno de PTK7. Inicialmente, se adquirió un vector de expresión comercial, pCMV6-XL4-PTK7, de Origene, Inc. Se confirmó la secuencia del ORF de longitud completa (porción subrayada de la FIG. 1A), a continuación, se subclonó mediante PCR en los puntos EcoRI y NotI del vector lentiviral pCDH-EF1-MCS-T2A-GFP (System Biosciences). Este vector lentiviral expresa la proteína PTK7 de longitud completa fusionada a un péptido de salto ribosomal T2A y un marcador seleccionable de GFP, lo que permite la expresión multicistrónica en células transducidas. Este vector lentiviral se usó para transducir células 293T o células BALB/c 3T3 según protocolos convencionales. Además, se usó pCMV6-XL4-PTK7 para expresar transitoriamente la proteína PTK7 sobre la superficie de células 293T 48 horas después de la transfección de las células usando polietenimina. Los preparados de membrana plasmática se obtuvieron de células que sobreexpresaban PTK7 usando centrifugación diferencial.

[0282] En otros casos, se prepararon y expresaron inmunógenos de PTK7 soluble usando el vector de expresión pEE12.4 (Lonza AG), en el que la porción del ADNc de PTK7 que codifica el dominio extracelular (ECD) de la proteína, está codificada por la secuencia simbolizada por los aminoácidos subrayados en la FIG. 1B). En un primer caso, el fragmento de ECD se subclonó dentro del marco de lectura aguas abajo de una secuencia líder de IgK y aguas arriba de una cola de epítopo ⁸ xHis (SEQ ID NO: ⁸ ). El inmunógeno de ECD de PTK7 marcado con His se produjo mediante transfección transitoria de células CHO-KSV y la proteína secretada se purificó del sobrenadante celular usando resinas Ni-NTA y procedimientos convencionales (Qiagen Inc.). Además de la construcción de PTK7-ECD-His mencionada anteriormente, los preparados de plasma y las células transfectadas descritas anteriormente, también se generó y expresó una construcción de Fc-PTK7-ECD. Este procedimiento se inició mediante amplificación por PCR del fragmento de ECD expuesto en la FIG. 1B usando la ADN polimerasa de inicio en caliente KOD de alta fidelidad (EMD Chemicals). El cebador directo usado en esta PCR tenía la secuencia de PTK7: GCCATTGTCTTCATCAAGCAGCC (SEQ ID NO: 9) y también incluía un punto de restricción HindIII 5' y un péptido señal/una secuencia líder de IgG kappa murina para la secreción del producto en el sobrenadante de cultivo. El cebador inverso usado para amplificar estas construcciones tenía la secuencia de PTK7: CTGGATCATCTTGTAGGGGGGAG (S^eQ ID NO: 10) e incluía un punto de restricción DraIII y BgIII 5' que permitía la clonación aguas arriba de la proteína IgG2-Fc humana que se solicitó como un gen sintetizado (DNA 2.0 Inc.).

[0283] Los productos amplificados o subclonados se movieron a continuación al vector de expresión final pEE12.4 (Lonza AG) usando puntos de restricción HindIII y EcoRI, y la fidelidad se confirmó mediante secuenciación de ADN. Los plásmidos se transfectaron transitoriamente en suspensión de células indistintamente CHO-S o 293T y se purificaron indistintamente mediante columna de afinidad de níquel para la proteína marcada con His o de proteína A para el producto de fusión a Fc. Los productos se purificaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión molecular usando una columna Superdex200 (GE Healthcare) en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2, cuantificando la proteína de fusión purificada usando el procedimiento de Bradford (Bradford, 1976: PMID 942051). Ejemplo 7

Generación de anticuerpos anti-PTK7 usando inmunógenos de hPTK7

[0284] Los moduladores de la PTK-7 en forma de anticuerpos murinos se produjeron según las enseñanzas de esta memoria mediante inoculación con células BALB/3T3 o HEK 293, respectivamente, sobreexpresando hPTK7 de longitud completa, hPTK7-His o hPTK7-Fc fabricadas como se expone en el Ejemplo anterior. A este respecto, se inmunizaron tres cepas de ratones hembra (3 de cada una: Balb/c, CD-1, FVB) con preparados de los inmunógenos de PTK7 antes mencionados. Todos los ratones se inmunizaron a través de las almohadillas plantares con 10 pg de la construcción de PTK7 seleccionada o 1 x 10⁶ células en cada caso emulsionadas con un volumen igual de TiterMax® o aditivo de alúmina.

[0285] Se usó indistintamente FACS o ELISA en fase sólida para cribar los sueros de ratón para detectar anticuerpos de IgG de ratón específicos para la PTK7 humana. Para los ELISA, las placas se recubrieron con PTK7-His en diferentes concentraciones que oscilaban de 0,01-1 pg/mL en PBS durante la noche. Después de lavar con PBS que contenía 0,02 % (v/v) de Tween 20, los pocillos se bloquearon con 3 % (p/v) de BSA en PBS o 2 % de FCS en PBS, 200 pL/pocillo, durante 1 hora a TA. Las diluciones de suero de ratón se incubaron en las placas recubiertas con PTK7-His a 50 pL/pocillo a TA durante 1 hora. Las placas se lavaron y a continuación se incubaron con 50 pL/pocillo de IgG de cabra antirratón marcada con HRP diluida 1:10000 en 3 % de BSA-PBS o 2 % de FCS en PBS durante 1 hora a TA. Las placas se lavaron y se añadieron 100 pL/pocillo de la solución de sustrato TMB (Thermo Scientific 34028) durante 15 minutos a TA. Por último, se añadió un volumen igual de H² SO⁴ 2 M para detener el desarrollo del sustrato y se analizaron mediante espectrofotómetro a DO 450.

[0286] Como se indicó, los sueros murinos también se ensayaron para detectar anticuerpos anti-PTK7 mediante FACS contra células que sobreexpresaban PTK7 humana cotransducida con GFP. Brevemente, 1 x 10⁵ células BALB/3T3 por pocillo fueron transducidas con PTK7 humana y GFP y se incubaron durante 30 minutos con 100 uL de suero de ratón diluido 1:100 en PBS/2 % de FCS. Las células se lavaron en PBS/2 % de FCS y a continuación se incubaron con 50 uL por muestra de IgG de cabra antirratón marcada con DyeLight 649, anticuerpo secundario específico del fragmento Fc diluido 1:200 en PBS/2 % de FCS. Después de una incubación de 15 minutos, las células se lavaron 2 veces con PBS/2 % de FCS y se resuspendieron en PBS/2 % de FCS con DAPI y se analizaron mediante FACS.

[0287] Los ratones inmunizados seropositivos se sacrificaron y los ganglios linfáticos drenantes (poplíteos e inguinales, si había adenopatías) se extirparon y usaron como fuente de células productoras de anticuerpos. Una suspensión monocelular de linfocitos B (375 x 10⁶ células) se fusionó con células de mieloma P3x63Ag8.653 no secretoras (n.° ATCC CRL-1580) en una relación de 1:1 mediante electrofusión. La electrofusión celular se realizó usando el sistema Hybrimmune de BTX o un ECM2001 (ambos BTX Harvard Apparatus) según las instrucciones del fabricante. Después de la electrofusión, las células se resuspendieron en medio de selección de hibridomas enriquecido con Azaserine (Sigma n.° A9666) (medio DMEM (Cellgro n.° de cat. 15-017-CM) que contiene 15 % de suero FetalClone I (Hyclone), 10 % de BM Condimed (Roche Applied Sciences), piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 4 mM, 100 UI de penicilina-estreptomicina, 2-mercaptoetanol 50 j M e hipoxantina 100 j M). En una primera fusión, las células se sembraron en placas a ² x ^{1 0}4/pocillo en placas de microtitulación de fondo plano, seguido de dos semanas de incubación en medio HAT selectivo (Sigma, CRL P-7185). En una segunda fusión, las células se sembraron en placas después de la fusión en cuatro matraces T225 a 90 ml de medio de selección por matraz. Los matraces se colocaron a continuación en una incubadora a 37 °C humidificada que contenía 5 % de CO² y 95 % de aire durante ⁶ ­ 7 días.

[0288] Después del crecimiento, la biblioteca que comprende las células de la segunda fusión en los T225 se clasifica usando un clasificador de células FACSAria I y se siembran en placas a una célula por pocillo en placas de fondo en U de 96 pocillos Falcon (ambos BD Biosciences). Todas las células de la biblioteca de hibridomas no utilizadas restantes se congelaron para ensayos futuros, si fueran necesarios. Los hibridomas seleccionados se hicieron crecer a continuación en 200 uL de medio de cultivo que contenía 15 % de suero FetalClone I (Hyclone), 10 % de BM-Condimed (Roche Applied Sciences), piruvato de sodio 1 mM, L-glutamina 4 mM, 100 UI de penicilinaestreptomicina, 2-mercaptoetanol 50 j M e hipoxantina 100 j M. Después de 10-14 días de crecimiento para ambas fusiones en placas de 96 pocillos, los sobrenadantes de cada pocillo se analizaron para detectar anticuerpos reactivos para la PTK7 murina usando un ELISA o FACS.

[0289] Brevemente, las placas de 96 pocillos (VWR, 610744) se recubrieron con 1 jg/mL de PTK7 murina-His en tampón de carbonato de sodio durante la noche a 4 °C. Las placas se lavaron y bloquearon con 2 % de FCS-PBS durante una hora a 37 °C y se usaron inmediatamente o se mantuvieron a 4 °C. Los sobrenadantes de hibridoma sin diluir se incubaron en las placas durante una hora a TA. Las placas se lavaron y sondaron con IgG de cabra antirratón marcada con HRP, diluida 1:10000 en 1 % de BSA-PBS durante una hora a TA. Después de la incubación con solución de sustrato como se describió anteriormente, las placas se leyeron a DO 450.

[0290] Los pocillos de hibridoma positivos para el crecimiento que secretaban inmunoglobulinas de ratón también se cribaron para determinar la especificidad de la PTK7 humana usando un ensayo FACS similar al descrito anteriormente. Brevemente, 1 x 10⁵ células BALB/3T3 por pocillo transducidas con PTK7 humana y GFP se incubaron durante 30 minutos con 25-100 uL de sobrenadante de hibridoma. Las células se lavaron en PBS/2 % de FCS dos veces y a continuación se incubaron con 50 uL por muestra de IgG de cabra antirratón marcada con DyeLight 649, anticuerpo secundario específico del fragmento Fc diluido 1:200 en PBS/2 % de FCS. Después de una incubación de 15 minutos, las células se lavaron 2 veces con PBS/2 % de FCS y se resuspendieron en PBS/2 % de FCS con DAPI (Life Technologies) y se analizaron mediante FACS. Para la segunda fusión, los hibridomas clonales específicos de la PTK7 resultantes se expandieron y crioconservaron en medio de congelación CS-10 (Biolife Solutions) y se almacenaron en nitrógeno líquido.

[0291] Para la primera fusión, la subclonación se realizó en pocillos positivos para el antígeno seleccionados usando siembra en placas con dilución limitada. Las placas se inspeccionaron visualmente para detectar la presencia de crecimiento de monocolonias y los sobrenadantes de los pocillos de monocolonias se cribaron a continuación mediante ELISA específicos del antígeno y confirmación por FACS como se describió anteriormente. Las poblaciones clonales resultantes se expandieron y crioconservaron en medio de congelación (90 % de FBS, 10 % de D^m SO) y se almacenaron en nitrógeno líquido.

[0292] Para la primera fusión, se seleccionaron hibridomas secretores de PTK7 de los pocillos positivos (4 resultados de DO405 a 20 min >0,75) para su caracterización adicional.

[0293] Una segunda fusión sembrada sobre 48 placas (4608 pocillos) dio como resultado aproximadamente una eficacia de clonación de 65 % con cientos de resultados. Los clones seleccionados proporcionaron varias docenas de anticuerpos murinos que eran inmunoespecíficos para la PTK7 humana, algunos de los cuales también presentaban reacción cruzada con la PTK7 murina.

Ejemplo ⁸

Secuenciación y humanización de moduladores de la PTK7

⁸ (a) Secuenciación:

[0294] En base a lo anterior, se seleccionaron varios anticuerpos monoclonales ejemplares distintos que unían PTK7 humana inmovilizada y anticuerpos que presentaban reacción cruzada con la PTK7 de ratón con afinidad aparentemente alta para su secuenciación y análisis posterior. Como se muestra en forma tabular en las FIGS. ⁶ A y ⁶ B, el análisis de las secuencias de las regiones variables de las cadenas ligeras (FIG. ⁶ A) y las regiones variables de las cadenas pesadas (FIG. ⁶ B) de los anticuerpos monoclonales seleccionados generados en el Ejemplo 7 confirmó que muchos tenían regiones determinantes de la complementariedad novedosas y habitualmente presentaban disposiciones VDJ novedosas. Cabe señalar que las regiones determinantes de la complementariedad expuestas en las FIG. ⁶ A y ⁶ B se obtuvieron del análisis de VBASE2.

[0295] Más específicamente, la FIG. ⁶ A representa las secuencias de aminoácidos contiguas de veintiuna regiones variables de las cadenas ligeras murinas novedosas de anticuerpos anti-PTK7 (SEQ ID NO: 20-60, números pares) y cuatro regiones variables de las cadenas ligeras humanizadas (SEQ ID NO: 62-68, números pares) procedentes de cadenas ligeras murinas representativas. Similarmente, la FIG. ⁶ B representa las secuencias de aminoácidos contiguas de veintiuna regiones variables de las cadenas pesadas murinas novedosas (SEQ ID NO: 21­ 61, números impares) de los mismos anticuerpos anti-PTK7 y cuatro regiones variables de las cadenas pesadas humanizadas (SEQ ID NO: 63-69, número impares) de los mismos anticuerpos murinos que los que proporcionaban las cadenas ligeras humanizadas. Por tanto, tomadas en conjunto, las Figuras ⁶ A y ⁶ B proporcionan las secuencias anotadas de veintiún anticuerpos anti-PTK7 murinos (denominados SC6.2.35, SC6.10.2, SC6.4.1, SC6.50.1, SC6.3, SC6.4, SC⁶ .⁶ , SC6.7, SC6.13, SC6.14, SC6.15, SC6.19, SC6.20, SC6.21, SC6.23, SC6.24, SC6.26, SC6.29, SC6.41, SC6.58 y SC6.59) y cuatro anticuerpos humanizados (denominados hSC6.23, hSC6.24, hSC6.41 y hSC6.58). Cabe señalar que las denominaciones SC6.4.1 y SC6.4 simplemente reflejan una anomalía de denominación y que los moduladores realmente comprenden dos anticuerpos distintos con secuencias de la región variable de las cadenas pesadas y ligeras novedosas.

[0296] A los efectos de la presente solicitud, los números de identificación de secuencia de cada anticuerpo particular son secuenciales. Por tanto, el mAb SC6.2.35 comprende las SEQ ID NO: 20 y 21 para las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas, respectivamente. A este respecto, SC6.10.2 comprende las SEQ ID NO: 22 y 23, SC6.4.1 comprende las SEQ ID NO: 24 y 25 y así sucesivamente. Asimismo, las secuencias de ácido nucleico correspondientes para cada secuencia de aminoácidos de los anticuerpos de las FIGS. ⁶ A y ⁶ B se incluyen a la presente solicitud como un listado de secuencias adjunto a esta memoria. Las secuencias de ácido nucleico incluidas comprenden números de identificación de secuencia que son cien veces superiores a la secuencia de aminoácidos correspondiente (cadena ligera o pesada). Por tanto, las secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de la región variable de las cadenas ligera y pesadas del mAb SC6.2.35 (es decir, las SEQ ID NO: 20 y 21) comprenden las SEQ ID NO: 120 y 121. Las otras secuencias de ácido nucleico de los anticuerpos, que incluyen las que codifican construcciones humanizadas, se numeran de manera similar.

[0297] Como primera etapa para secuenciar moduladores ejemplares, las células de hibridoma seleccionadas se lisaron en reactivo Trizol® (Life Technologies) para preparar el ARN. A este respecto, se resuspendieron entre 10⁴ y 10⁵ células en 1 ml de Trizol, y se agitaron enérgicamente después de la adición de 200 pL de cloroformo. A continuación, las muestras se centrifugaron a 4 °C durante 10 minutos y la fase acuosa se transfirió a un tubo de microcentrifugadora fresco al que se añadió un volumen igual de isopropanol. Los tubos se volvieron a agitar enérgicamente y se dejaron incubar a TA durante 10 minutos antes de centrifugarlos a 4 °C durante 10 minutos. Los sedimentos de ARN resultantes se lavaron una vez con 1 ml de etanol a 70 % y se secaron brevemente a temperatura ambiente antes de resuspenderlos en 40 pL de agua tratada con DEPC. La calidad de los preparados de ARN se determinó fraccionando 3 pL en un gel de 1 % de agarosa antes de almacenarlos a -80 °C hasta su uso.

[0298] La región variable de las cadenas pesadas de Ig de cada hibridoma se amplificó usando una mezcla de cebadores 5' que comprendía treinta y dos cebadores de la secuencia líder específicos de ratón, diseñados para dirigirse al repertorio de VH de ratón completo, en combinación con cebador de C^y de ratón 3' específico para todos los isotipos de Ig de ratón. Se secuenció un fragmento de PCR de 400 pb de VH a partir de ambos extremos usando los mismos cebadores de PCR. Similarmente, se usó una mezcla de treinta y dos cebadores de la secuencia líder de Vk 5' diseñada para amplificar cada una de las familias de ratón de Vk combinada con un único cebador inverso específico para la región constante kappa de ratón para amplificar y secuenciar la cadena ligera kappa. Las transcripciones de V^h y V^l se amplificaron a partir de 100 ng de ARN total usando la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR).

[0299] Se realizaron un total de ocho RT-PCR para cada hibridoma: cuatro para la cadena ligera kappa V y cuatro para la cadena pesada gamma V (y1). Se usó el kit de RT-PCR One Step de QIAGEN para la amplificación (Qiagen). Este kit proporciona una combinación de transcriptasas inversas Sensiscript y Omniscript, ADN polimerasa HotStarTaq, mezcla dNTP, tampón y Q-Solution, un aditivo novedoso que permite la amplificación eficaz de moldes “difíciles” (p. ej., ricos en GC). Los productos de la PCR extraídos se secuenciaron directamente utilizando cebadores de la región V específicos. Las secuencias de nucleótidos se analizaron usando IMGT para identificar los genes V, D y J de la estirpe germinal con la homología de secuencia máxima. Las secuencias obtenidas se compararon con secuencias de ADN de la estirpe germinal conocidas de las regiones V y J de Ig usando V-BASE2 (Retter y col., arriba) y mediante alineación de los genes de Vh y Vl con la base de datos de la estirpe germinal de ratón.

[0300] Se prepararon mezclas de reacción que incluían 3 pL de ARN, 0,5 de 100 pM de indistintamente cebadores de la cadena pesada o ligera kappa, 5 pL de 5 x tampón de RT-PCR, 1 pL de dNTP, 1 pL de mezcla de enzimas que contenía transcriptasa inversa y a Dn polimerasa, y 0,4 pL del inhibidor de ribonucleasas RNasin (Promega BioSystems). La mezcla de reacción contiene todos los reactivos requeridos tanto para la transcripción inversa como para la PCR. El programa del ciclador térmico fue etapa a TA, 50 °C durante 30 minutos, 95 °C durante 15 minutos, seguido de 30 ciclos de (95 °C durante 30 segundos, 48 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 1,0 minutos). A continuación, hubo una incubación final a 72 °C durante 10 minutos.

[0301] Para preparar los productos de la PCR para la secuenciación directa de ADN, se purificaron usando el kit de purificación PCR QIAquick™ según el protocolo del fabricante. El ADN se eluyó de la columna de centrifugación usando 50 pL de agua estéril y a continuación se secuenció directamente a partir de ambas hebras. Nuevamente, las secuencias de ADN resultantes se analizaron usando VBASE2 (datos no mostrados) para proporcionar las secuencias anotadas expuestas en las FIG. ⁶ A y ⁶ B. Más específicamente, como se comentó anteriormente, las secuencias de aminoácidos anotadas de veintiún regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpo anti-PTK7 murino se exponen en las FIG. ⁶ A y ⁶ B.

⁸ (b) Humanización:

[0302] Cuatro de los anticuerpos murinos generados en el Ejemplo 7 se humanizaron usando injertos de regiones determinantes de la complementariedad (CDR). Se seleccionaron marcos humanos para las cadenas pesadas y ligeras en base a la similitud de secuencia y estructura con respecto a los genes de la estirpe germinal humana funcionales. A este respecto, la similitud estructural se evaluó comparando la estructura canónica de las CDR de ratón con candidatos humanos con las mismas estructuras canónicas como se describe en Chothia y col. (arriba).

[0303] Más particularmente, los anticuerpos murinos SC6.23, SC6.24, SC6.41 y SC6.58 se humanizaron usando un procedimiento de injerto de CDR asistido por ordenador (Abysis Database, UCL Business Ple.) y técnicas de ingeniería molecular convencionales para proporcionar los moduladores hSC6.23, hSC6.24, hSC6.41 y hSC6.58 Las regiones marco humanas de las regiones variables se seleccionaron en base su homología de secuencia máxima a la secuencia marco de ratón y su estructura canónica. A los efectos del análisis, la asignación de aminoácidos a cada uno de los dominios CDR se hace según la numeración de Kabat y col. Se fabricaron varias variantes de anticuerpo humanizado con el fin de generar el anticuerpo humanizado óptimo con los anticuerpos humanizados que generalmente conservan las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de unión al antígeno del hibridoma de ratón en asociación con regiones marco humanas. En última instancia, se encontró que los mAb SC6.23, SC6.24, SC6.41 y SC6.58 humanizados se unen al antígeno de PTK7 humana con afinidad similar a sus equivalentes murinos, como se mide usando el sistema Biacore.

[0304] Los procedimientos de ingeniería molecular se realizaron usando técnicas reconocidas en la técnica. Para ello, se extrajo ARNm total de los hibridomas según el protocolo del fabricante (sistema de purificación de ARN TRIzol® Plus, Life Technologies). Se usó un cebador de la secuencia líder 5' específico de secuencia, diseñado para amplificar cada hibridoma, en combinación con cebador de C^y1 humano 3' para amplificar y clonar las regiones variables de cada anticuerpo humanizado. Similarmente, se usó una secuencia líder de Vk 5' diseñada específicamente para amplificar cada una de las regiones Vk combinada con un único cebador inverso específico para la región constante kappa humana para amplificar y clonar la cadena ligera kappa. Los fragmentos amplificados se clonaron como cadenas gamma1/kappa humanas quiméricas y sirvieron como referencia para cada mAb humanizado.

[0305] A partir de la información de las secuencias de nucleótidos, se obtuvieron datos relativos a los segmentos de los genes V, D y J de las cadenas pesadas y ligeras de SC6.23, SC6.24, SC6.41 y SC6.58 En base a los datos de las secuencias, se designaron conjuntos de cebadores nuevos específicos para la secuencia líder de la cadena Vh y Vk de Ig de los anticuerpos para la clonación del anticuerpo monoclonal recombinante. Posteriormente, las secuencias V-(D)-J se alinearon con secuencias de la estirpe germinal de Ig de ratón. Los genes de las cadenas pesadas de SC6.23 se identificaron como VH36096 (V), DSP2.3 (D) y JH3. Los genes de las cadenas pesadas de SC6.24 se identificaron como VHJ558 (V), DSP2.7 (D) y JH4. Los genes de las cadenas pesadas de SC6.41 se identificaron como IGHV14-4 (V), DFL16.1 (D) y JH2. Los genes de las cadenas pesadas de SC6.58 se identificaron como IGHV4-1 (V), DFL16.1 (D) y JH4. Las cuatro cadenas ligeras eran clase K. Los genes de las cadenas ligeras se identificaron como IGKV14-11 y JK5 para el mAb SC6.23, IGKV3-5 y JK1 para el mAb SC6.24, secuencia de la estirpe germinal IGKV2-137y JK4 para el mAb SC6.41 y secuencias de la estirpe germinal IGKV17-121 y JK4 para la cadena ligera kappa de SC6.58. Estos resultados se resumen en la TABLA 1 que se presenta a continuación.

TABLA 1

[0306] Las secuencias de las cadenas pesadas y ligeras obtenidas de los cuatro clones se alinearon con las secuencias de la región variable humana funcional y se analizaron para determinar la homología y estructura canónica. Los resultados de los análisis de las cadenas pesadas y ligeras se muestran a continuación en las TABLAS 2 y 3, respectivamente.

TABLA 2

TABLA 3

[0307] Como los procedimientos de selección de la estirpe germinal e injerto de CDR proporcionaron anticuerpos que generalmente conservaban sus características de unión, aparentemente había poca necesidad de insertar residuos murinos en la mayoría de las construcciones.

[0308] Como se mencionó anteriormente, las secuencias de aminoácidos de las cadenas de las regiones variables pesadas humanizadas y las cadenas ligeras kappa humanizadas para los cuatro anticuerpos se presentan en las FiG. ⁶ A y ⁶ B (SEQ ID NO: 62-69) y las secuencias de ácido nucleico correspondientes (SEQ ID NO: 162-169) se exponen en el listado de secuencias adjunto.

[0309] Más particularmente, las secuencias de aminoácidos y las secuencias de ácido nucleico correspondientes de la cadena ligera de SC6.23 humanizada (SEQ ID NO: 62 y 162) y la cadena pesada humanizada (SEQ ID NO: 63 y 163) se presentan en las FIG. ⁶ A y ⁶ B y en el listado de secuencias. Similarmente, las secuencias de aminoácidos y las secuencias de ácido nucleico correspondientes de la cadena ligera de SC6.24 humanizada (SEQ ID NO: 64 y 164) y la cadena pesada humanizada (SEQ ID NO: 65 y 165) se presentan de la misma manera. Otro ejemplo de la descripción se ilustra mediante las secuencias de aminoácidos y las secuencias de ácido nucleico correspondientes de la cadena ligera de SC6.41 humanizada (SEQ ID NO: ^{6 6} y 166) y la cadena pesada humanizada (SEQ ID NO: 67 y 167). En otro aspecto más, se representan las secuencias de aminoácidos y las secuencias de ácido nucleico correspondientes de la cadena ligera de SC6.58 humanizada (SEQ ID NO: ^{6 8} y 168) y la cadena pesada humanizada (SEQ ID NO: 69 y 169). Como se demuestra en los Ejemplos más adelante, cada uno de los anticuerpos humanizados antes mencionados actúa como un modulador de la PTK7 eficaz según las enseñanzas de esta memoria.

[0310] En cualquier caso, los moduladores descritos se expresaron y aislaron usando técnicas reconocidas en la técnica. Para ello, se clonaron fragmentos de ADN variables humanizados sintéticos (Integrated DNA Technologies) de ambas cadenas pesadas en vector de expresión de IgGl humana. Los fragmentos de cadena ligera variable se clonaron en vector de expresión de C-kappa humano. Los anticuerpos se expresaron mediante cotransfección de la cadena pesada y ligera en células CHO.

[0311] Más particularmente, para la producción de anticuerpos se llevó a cabo la clonación direccional de los productos de la pCr de genes variables murinos y humanizados en vectores de expresión de inmunoglobulina humana. Todos los cebadores usados en las PCR específicas del gen de Ig incluyeron puntos de restricción (AgeI y XhoI para IgH, XmaI y DraIII para IgK, que permitieron la clonación directa en vectores de expresión que contenían las regiones constantes de IgG1 e IGK humana, respectivamente. En resumen, los productos de la PCR se purificaron con el kit de purificación de PCR Qiaquick (Qiagen, Inc.), seguido de digestión con Agel y XhoI (IgH), XmaI y DraIII (IgK), respectivamente. Los productos de la PCR digeridos se purificaron antes de la ligadura en vectores de expresión. Las reacciones de ligadura se realizaron en un volumen total de 10 pL con 200 U de T4-DNA Ligase (New England Biolabs), 7,5 pL de producto de la PCR específico del gen purificado y digerido, y 25 ng de ADN de vector linealizado. Se transformaron bacterias DH10B de E. coli competentes (Life Technologies) mediante choque térmico a 42 °C con 3 pL de producto de ligadura y se sembraron en placas de ampicilina (100 pg/mL). El fragmento Agel-EcoRI de la región Vh se insertó a continuación en los mismos puntos del vector de expresión pEE6.4HuIgG1 (Lonza AG), mientras que la inserción de Vk de Xmal-DralII sintética se clonó en los puntos Xmal-DralII del vector de expresión pEE12.4Hu-Kappa correspondiente.

[0312] Las células que producían anticuerpos humanizados se generaron mediante transfección de células HEK 293 con los plásmidos apropiados usando 293fectin. A este respecto, el ADN de plásmido se purificó con columnas de centrifugación QIAprep (Qiagen). Se cultivaron células renales embrionarias humanas (HEK) 293T (n.° de ATCC CRL-11268) en placas de 150 mm (Falcon, Becton Dickinson) en condiciones convencionales en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) enriquecido con 10% de FCS inactivado térmicamente, 100 pg/mL de estreptomicina, 100 U/mL de penicilina G (todos de Life Technologies).

[0313] Para las transfecciones transitorias, las células se hicieron crecer hasta 80 % de confluencia. Se añadieron cantidades iguales de ADN vectorial de la cadena de IgL e IgL correspondiente (12,5 pg de cada ADN vectorial) a 1,5 mL de Opti-MEM mezclado con 50 pL de reactivo de transfección de HEK 293 en 1,5 mL de opti-MEM. La mezcla se incubó durante 30 min a temperatura ambiente y se distribuyó uniformemente en la placa de cultivo. Los sobrenadantes se recolectaron tres días después de la transfección, se sustituyeron por 20 mL de DMEM recién preparado enriquecido con 10 % de FBS y se volvieron a recolectar en el día ⁶ después de la transfección. Los residuos celulares de los sobrenadantes de cultivo se eliminaron mediante centrifugación a 800 x g durante ^{1 0} min y se almacenaron a 4 °C. Los anticuerpos quiméricos y humanizados recombinantes se purificaron con perlas de proteína G (GE Healthcare).

Ejemplo 9

Características de los moduladores de la PTK7

9(a) Características generales de los moduladores

[0314] Se usaron varios procedimientos para analizar las características inmunoquímicas de los moduladores de la PTK7 seleccionados (tanto murinos como humanizados) generados como se expuso anteriormente. Específicamente, varios de estos anticuerpos se caracterizaron para determinar la afinidad, cinética, unión y reactividad cruzada con respecto a los homólogos de cynomolgus y murinos (p. ej., mediante ForteBio). La reactividad de los moduladores también se midió mediante inmunoelectrotransferencia usando muestras reducidas y no reducidas para proporcionar algún indicio de si los epítopos eran lineales o no. Además de los datos de unión a antígenos murinos y humanos expuestos en la FIG. 7A, los resultados de la caracterización de los anticuerpos para los moduladores murinos seleccionados se exponen en forma tabular en la FIG. 7B. Por último, como se muestra en las FIG. 7C-7E, las afinidades por los moduladores murinos y humanizados seleccionados se midieron usando análisis de interferometría de biocapa en un ForteBio RED (ForteBio, Inc.) con una serie de concentraciones de antígeno convencional. En general, los moduladores seleccionados presentaron afinidades relativamente altas en el intervalo nanomolar.

[0315] Según la presente descripción, la afinidad del modulador se midió de tres maneras para garantizar la exactitud. En primer lugar, se midió la señal de unión para una cantidad fija de anticuerpo analizada contra diluciones en serie de antígeno en un ELISA para determinar la actividad relativa del modulador (datos no mostrados). En segundo lugar, se midieron a continuación las afinidades y constantes cinéticas kon y koff de los efectores seleccionados usando análisis de interferometría de biocapa en un ForteBio RED (ForteBio, Inc.) con una serie de concentraciones de antígeno convencional. Por último, se midió la afinidad de los moduladores seleccionados mediante resonancia de plasmones superficiales (Biacore System, GE Healthcare). En base a una serie de concentraciones de antígeno convencional y usando un modelo de unión de Langmuir 1:1, se determinaron la Kd de la unión del anticuerpo al antígeno y las constantes cinéticas kon y koff (p. ej., véanse las FIG. 7C y 7E) usando técnicas habituales en la técnica. Generalmente, los efectores seleccionados, ya sean murinos o humanizados, presentaron afinidades relativamente altas en el intervalo nanomolar. En la tabla de la FIG. 7B, un superíndice B designa mediciones de afinidad hechas en Biacore, mientras que el superíndice F designa mediciones realizadas en ForteBio.

[0316] También se realizó un trabajo preliminar para determinar si el epítopo reconocido por el efector de PTK7 comprende aminoácidos contiguos o está formado por aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por la estructura secundaria del antígeno. A este respecto, se realizaron inmunoelectrotransferencias en condiciones reductoras (p. ej., usando DTT 0,5 M) y no reductoras. Más específicamente, usando técnicas de electroforesis convencionales bien conocidas en la materia, el antígeno de PTK7 en ambos estados se sometió a electroforesis en geles y se transfirió antes de la exposición a los moduladores seleccionados. Como se expone en la FIG. 7B, se ensayaron dos moduladores de la PTK7 que aparentemente solo reaccionaban con el antígeno cuando los enlaces disulfuro estaban intactos (NR). Los moduladores de la PTK7 restantes no se ensayaron para determinar la actividad de electroinmunotransferencia.

[0317] Con respecto al agrupamiento de datos de anticuerpos, se usó un analizador ForteBio Octet Red96 (ForteBio, Inc.) según las instrucciones del fabricante y un procedimiento de tipo sándwich reconocido en la técnica [Analytical Biochemistry 386:172-180 (2009)] para identificar los anticuerpos que se unían a los mismos o diferentes grupos. Brevemente, se capturó un anticuerpo (Ab1) sobre un chip de captura antirratón antes de que usar una concentración alta de anticuerpo que no era de unión de 15 ug/mL (100 nM) para bloquear el chip y establecer un punto de referencia. La hPTK7-His recombinante monomérica (isoforma a) como se contempla en el Ejemplo ⁶ (a 500 nM) fue capturada a continuación por el anticuerpo específico (Ab1) y la punta se sumergió indistintamente en un pocillo con el mismo anticuerpo (Ab1) como control o en un pocillo con un anticuerpo diferente (Ab2), donde había 4 ug/mL de ambos anticuerpos (25nM). Cuando se observó unión adicional con un nuevo anticuerpo, entonces se determinó que Ab1 y Ab2 pertenecían a grupos de datos diferentes. Si no se produjo ninguna unión adicional, similar al Ab1 de control, entonces se determinó que Ab2 pertenecía al mismo grupo de datos. Este procedimiento se puede ampliar para cribar bibliotecas grandes de anticuerpos singulares usando una fila entera de anticuerpos que representan grupos de datos singulares en una placa de 96 pocillos. Los datos ejemplares para tres moduladores representativos se presentan en la FIG. 7A para antígeno de pTK7 tanto humano como murino. La FIG. 7A ilustra que, mientras que SC6.10.2 no se unía en absoluto antígeno de ratón, SC6.2.35 se unía a aproximadamente 10% de antígeno humano y SC6.25.1 se unía a PTK7-His de ratón con idéntica afinidad (nota; los anticuerpos se simbolizan H2.35, H10.2 y H25.1 en la FIG. 7A). Se determinó además que cada uno de estos anticuerpos ensayados se encontraba en un grupo de datos diferente. De manera similar, se llevó a cabo el agrupamiento de datos para nueve moduladores de la PTK7 adicionales, con los resultados mostrados en la FIG. 7B. Estos datos identificaron al menos siete grupos de datos distintos reconocidos por los moduladores ensayados. ND en las tablas indica que los datos no se determinaron.

[0318] Por último, se evaluó la reactividad cruzada con respecto a homólogos de PTK7 de cynomolgus y murinos con un ForteBio usando una serie de concentraciones que comprendía antígeno monomérico expresado recombinantemente. Como se recoge en la FIG. 7B, varios de los moduladores ejemplares fueron reactivos con la PTK7 de ratón, mientras que todos los anticuerpos presentaron reactividad cruzada con la PTK7 de cynomolgus altamente similar.

9(b) Características de los moduladores humanizados

[0319] Usando las técnicas expuestas anteriormente en este Ejemplo, se analizaron las construcciones humanizadas hSC6.23, hSC6.24, hSC6.41 y hSC6.58 para determinar sus características de unión. Adicionalmente, la unión de anticuerpos humanizados se comparó directamente con el anticuerpo murino precursor para ambos anticuerpos para identificar cualquier cambio sutil en las constantes de velocidad provocado por el procedimiento de humanización.

[0320] Más específicamente, la afinidad del SC6.23 murino se midió mediante un Biacore usando resonancia de plasmones superficiales (SPR) para proporcionar los resultados expuestos en la FIG. 7C. En base a una serie de concentraciones de 25, 12,5 y 6,25 nM (que generan las curvas de arriba a abajo en las FIG. 7C y 7D) y usando un modelo de unión de Langmuir 1:1, se estimó que la K d de la unión del anticuerpo al antígeno era 2,3 nM. Los experimentos similares realizados a continuación con la construcción SC6.23 humanizada presentaron resultados equivalentes (FIG. 7D), lo que indica que el procedimiento de humanización no había afectado negativamente a la afinidad. A este respecto, las mediciones indicaron que la construcción humanizada tenía una afinidad de 3,9 nM, que se encuentra perfectamente dentro de los límites aceptables para los anticuerpos terapéuticos. Las mediciones similares para cada una de las construcciones humanizadas descritas en el Ejemplo ⁸ se exponen en la FIG. 7E y, junto con las otras técnicas expuestas en este Ejemplo, demuestran que los moduladores de la PTK7 humanizados descritos poseen cualidades deseables para los anticuerpos terapéuticos.

Ejemplo 10

Determinación de epítopos de moduladores de la PTK7 seleccionados

[0321] Con el fin de depurar adicionalmente los datos del agolpamiento de datos y determinar las regiones epitópicas definidas por los moduladores de la PTK7 seleccionados generados como se expuso anteriormente, se construyeron y expresaron varias variantes diferentes de ECD de PTK7. Más específicamente, los mutantes de eliminación de PTK7 se diseñaron usando cebadores que amplificaron diversos dominios de Ig de PTK7 y estos se fusionaron al punto de restricción BglII aguas arriba del dominio Fc de IgG2 humana, solicitado como un gen sintético (DNA 2.0). Estas proteínas de fusión a Fc se clonaron a continuación en el vector de expresión pEE12.4 (Lonza AG) usando los puntos de restricción HindIII y EcoRI. Se usó ADN de plásmidos exento de endotoxina aislado (Qiagen Inc.) para la transfección de células 293 adherentes usando 293Fectin (Life Technologies). Los sobrenadantes de las células 293 transfectadas se recolectaron 72 horas después de la transfección. Específicamente, se diseñaron las siguientes construcciones de eliminación fusionadas a la región Fc:

[0322] Las secuencias de aminoácidos para las seis primeras de estas construcciones se exponen en las FIG.

⁸ A-⁸ F (que comprenden el ECD de PTK7 seleccionado junto con la región Fc). La secuencia para la séptima construcción comprende el dominio extracelular de la isoforma a (SEQ ID NO: 3) como se expone en la FIG. 1C fusionado al dominio Fc.

[0323] Usando estas construcciones, se ensayaron varios moduladores para determinar su capacidad de reconocer proteínas PTK7 con eliminaciones de dominios de Ig definidos. Mediante un ensayo ELISA que comprende el uso de construcciones con eliminaciones de dominios y realizado en condiciones convencionales. A este respecto, las fusiones a Fc de dominio Ig de PTK7 se capturaron en una placa de ELISA recubierta con anticuerpo de IgG de cabra antihumano específico de Fc (Jackson Immunoresearch). La capacidad de cada anticuerpo anti-PTK7 murino para unir las diversas proteínas de fusión a Fc de eliminación se detectó a continuación con anticuerpo de cabra antirratón marcado con HRP específico de Fc.

[0324] Usando este ensayo, se identificaron moduladores ejemplares dirigidos contra los dominios de Ig de PTK7 particulares. Un ejemplo de los resultados de ELISA define cada epítopo o patrón de unión detectado representativo y se incluye en la TABLA 4 a continuación.

[0325] Los anticuerpos monoclonales anti-PTK7 aparentemente reconocen varios epítopos diferentes en base a los diferentes patrones de unión positiva en el ensayo ELISA (Tabla 4 y FIG. ⁸ G). Cabe señalar que, en la FIG. ⁸ G, los moduladores se recogen como ⁶ M en lugar de SC⁶ y SC6.2.35 y SC6.10.2 se recogen como H2.35 y H10.2. Ninguno de los anticuerpos se une solo a un epítopo en los dominios de Ig 6-7, pero estos dos dominios pueden contribuir a la estructura secundaria/terciaria de la construcción de fusión a Fc Ig3-7 que fue unida por SC6.18 y SC6.31 (NO PRESENTADA EN LA TABLA). Asimismo, tres anticuerpos (SC6.2.35, SC6.4.1 y SC6.10.2) reconocen un epítopo en los cuatro primeros dominios de Ig y ninguno de los anticuerpos se une a un epítopo en los dominios de Ig 6-7. En los cuatro primeros dominios de Ig, SC6.2.35 se une a un epítopo en los dominios 1-2. SC6.4.1 reconoce un epítopo dentro de los límites de los dominios de Ig 2 y 3. Por el contrario, SC6.10.2 parece sensible a cualquier eliminación en los cuatro primeros dominios de Ig y, por lo tanto, los cuatro dominios de tipo Ig probablemente están implicados en la definición del epítopo de SC6.10.2. Similarmente, algunos anticuerpos solo se unen a la construcción de longitud completa, dominios de Ig 1-7, lo que indica que las eliminaciones de Ig pueden haber alterado algunos de los puntos de unión o la estructura secundaria de estos epítopos. La FIG. ⁸ G proporciona una representación esquemática de estos patrones de unión que incluye anticuerpos adicionales y datos comparables que muestran la ubicación de unión de los moduladores descritos, donde los 7 dominios de Ig del ECD de PTK7 están representados en forma de bloque y se usan corchetes para señalar la posición de los epítopos dilucidada dentro de este ECD de los anticuerpos anti-PTK7 correspondientes.

Ejemplo 11

Expresión de proteína PTK7 en muestras de tumores ejemplares

[0326] Después de confirmar niveles de expresión genética elevados y generar anticuerpos contra la PTK7 en los Ejemplos anteriores, se buscaron pruebas de expresión de la proteína PTK7 correspondiente en poblaciones de tumores de pacientes seleccionadas. A este respecto, se proporcionaron matrices de lisado de proteínas del cáncer de fase inversa (matrices ProteoScan™; OriGene Technologies) que comprendían 4 diluciones de 432 lisados tisulares de ^{1 1} tipos de tumores, o sus tejidos adyacentes normales correspondientes, junto con controles que consistían en células HEK 293 con o sin sobreexpresión de TP53 impulsada por un promotor exógeno. La expresión de proteína PTK7 en los lisados de esta matriz se detectó usando un anticuerpo contra la PTK7 monoclonal de ratón generado como se expone en el Ejemplo 7 y que reconoce la proteína PTK7 mediante inmunoelectrotransferencia (p. ej., clon SC6.2.35). Los reactivos y protocolos de detección colorimétrica fueron proporcionados por el fabricante de las matrices ProteoScan, los puntos sobre la matriz fabricada se convirtieron en una imagen digital usando un escáner de base plana con el software de Java BZScan2 (INSERM-TAGC) para cuantificar la intensidad de los puntos.

[0327] Los resultados de tales ensayos indican que la expresión de la proteína PTK7 está aumentada en un subconjunto de muestras de tumores obtenidas de pacientes con melanoma, carcinoma de pulmón no microcítico (NSCLC), carcinoma de pulmón microcítico (SCLC), cáncer colorrectal, pancreático, de mama y de ovario. Los datos ejemplares de estos ensayos para los tumores seleccionados se presentan en las FIG. 9A-9D. Más específicamente, la FIG. 9A muestra que la expresión de proteína PTK7 parece significativamente elevada en un subconjunto de muestras de tumores colorrectales; especialmente en pacientes con enfermedad en estadio IV, en comparación con el tejido adyacente normal o el tejido tumoral de muestras obtenidas de estadios más incipientes de la enfermedad. Como se muestra en la FIG. 9B, la expresión de proteína PTK7 también era elevada en la mayoría de los tumores pancreáticos neuroendocrinos, así como en subconjuntos de pacientes con cáncer de mama (FIG. 9C) y ovario (FIG.

9D), respectivamente. Los datos se generaron como se describió anteriormente y se representaron como intensidad de píxeles promedio por punto (intensidad de los puntos). La barra negra horizontal en cada muestra representa la media de las muestras en cada categoría correspondiente.

[0328] Estos datos respaldan las observaciones de los Ejemplos anteriores de que la sobreexpresión de PTK7 está asociada a TIC y/o TPC en el cáncer colorrectal y puede estar implicada en la proliferación y/o supervivencia. En vista de los Ejemplos anteriores que muestran que: a) la expresión genética de PTK7 está principalmente asociada a la subpoblación de células TPC en el cáncer colorrectal y la subpoblación de células TG en los tumores pancreáticos; b) la expresión de proteína PTK7 es superior en la subpoblación de células TIC; c) la expresión de proteína PTK7 es elevada en muestras de tumores completos de cáncer colorrectal terminal y d) la observación general es que las TIC son más frecuentes en tumores terminales, parece que la PTK7 está asociada a las células subyacentes al crecimiento tumoral, resistencia a la terapia y recidiva tumoral, reforzando así la propuesta de que la PTK7 puede desempeñar un papel integral en el soporte de las TPC y/o TIC en los tumores antes mencionados.

[0329] En vista de estos resultados, se evaluó la expresión de PTK7 en las poblaciones no tumorigénicas (NTG) y de citoblastos cancerosos (CSC) de xenoinjertos de tumores de mama (BR), pulmón (LU), ovario (OV), colon (CR) y riñón (KDY) humanos usando citometría de flujo. Como se expone en el Ejemplo 1, las poblaciones enriquecidas con NTG y CSC se pueden identificar, controlar y enriquecer usando los marcadores fenotípicos CD46'/loCD324‘ y CD46hiCD324+, respectivamente. Por consiguiente, los xenoinjertos de tumores humanos de ratones inmunodeprimidos se recolectaron, disociaron y cotiñeron con anticuerpos anti-CD46, anti-CD324 y anti-PTK7 (Miltenyi Biotech) comercializados antes de evaluar la expresión de PTK7 usando citometría de flujo en la población de NTG CD46 '/loCD324' y la población de CSC CD46hiCD324+. Más específicamente, el análisis de citometría de flujo se realizó utilizando técnicas convencionales en un citómetro de flujo BD FACSCanto™ II (BD Biosciences) con controles de isotipo teñidos y fluorescencia menos uno (FMO) empleados para confirmar la especificidad de la tinción.

[0330] Los resultados para las muestras de tumores de mama, pulmón, ovario, colorrectales y de riñón ejemplares se presentan en la FIG. 9E, donde el control de isotipo está marcado en gris sólido, la población de células NTG está representada por la línea sombreada y la población enriquecida con CSC se muestra mediante la línea sólida. Se apreciará que, mientras que la tinción de PTK7 superficial fue relativamente baja en las poblaciones de NTG de cada uno de estos tumores, la tinción de PTK7 superficial fue notablemente elevada en las poblaciones enriquecidas con CSC. Estos resultados se confirmaron posteriormente (datos no mostrados) usando varios de los moduladores descritos y son representativos de más de veinticinco estirpes de NTX singulares ensayadas (que comprenden diversos tumores sólidos).

[0331] El patrón de expresión de PTK7 interrelacionado con otros marcadores superficiales de TPC se definió además funcionalmente en estudios de tumorigenicidad en NSCLC y cáncer de ovario. Las poblaciones de tumores PTK7- y PTK7+ se aislaron a partir de xenoinjertos de tumores humanos disociados teñidos como se describió anteriormente mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS), y se mezclaron números equivalentes con Matrigel (BD Biosciences) y se trasplantaron por vía subcutánea a ratones receptores NOD/SCID. Mientras que las células PTK7- no produjeron tumores en los ratones receptores, las células de tumores PTK7+ produjeron sistemáticamente tumores de crecimiento rápido tanto en el NSCLC como en los carcinomas ováricos. Por tanto, según las enseñanzas de esta memoria, la PTK7 delimita funcionalmente las TPC en el cáncer de ovario y NSCLC y proporciona pruebas adicionales de la utilidad de los moduladores descritos como agentes de diagnóstico y teragnosis.

Ejemplo 12

Los moduladores de la PTK7 seleccionados son internalizados por las células K562 y G401

[0332] Los moduladores de la PTK7 de hibridomas que se generaron inmunizando ratones como se describió anteriormente se cribaron para determinar su capacidad de internalizarse en células K562 y G401.

[0333] A este respecto, las células K562 en una concentración de partida de 106/mL (suspensión monocelular) se bloquearon con Human TruStain (Biolegend, Inc., 422302) durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células se diluyeron a 50 x 103 células por reacción. Las muestras duplicadas se tiñeron durante 30 minutos en hielo con sobrenadante de anticuerpo para un conseguir volumen final de 50 uL, a continuación, se lavaron con medio de tinción FACS (FSM; 2 % de suero fetal bovino/solución salina tamponada de Hank/HEPES 25 mM [pH 7,4]; Mediatech, Inc.) para retirar el anticuerpo no unido. Esto fue seguido de una segunda tinción con Alexa647 de burro antirratón (Life Technologies) durante 30 minutos en hielo. Las células volvieron a lavar a continuación para retirar el anticuerpo no unido y las muestras se resuspendieron en medio de internalización (2 % de suero fetal bovino/medio de Dulbecco modificado por Iscove) y se incubaron en 5 % de CO2 a 37 °C (o 4 °C para el control) durante 1 hora para permitir la internalización. La reacción se detuvo transfiriendo las muestras a hielo y añadiendo FSM helado. Para retirar cualquier anticuerpo que no se internalizó y permaneció sobre la superficie celular, las muestras se trataron con solución salina tamponada con fosfato a pH bajo (PBS [pH 2,0]) durante 10 minutos en hielo. Después de esta etapa de “eliminación ácida”, las muestras se lavaron exhaustivamente con FSM, se resuspendieron en 150 uL de FSM que contenía 2 ug/mL de DAPI (Life Technologies) y se analizaron en un citómetro de flujo BD FACS Canto. Cualquier aumento en la fluorescencia sobre el detectado a partir de células incubadas en hielo en este experimento dio como resultado la capacidad de internalización de los anticuerpos, lo que protege la molécula fluorescente de ser eliminada de la superficie celular durante el tratamiento con tampón fosfato a pH bajo. Todas las incubaciones se realizaron en medio de tinción FACS, a menos que se indique de otro modo.

[0334] Cuando se cribaron clones individuales de sobrenadantes de hibridoma que contenían anticuerpos contra la PTK7 usando el protocolo de eliminación ácida descrito anteriormente, varios sobrenadantes presentaron un desplazamiento positivo de la fluorescencia en comparación con la células no teñidas y anticuerpos de control negativo de IgG (FIG. 10A y 10B). Se observó internalización de los anticuerpos con varios anticuerpos anti-PTK7, como demuestra la capacidad de estos anticuerpos para proteger el anticuerpo secundario Alexa647 de la eliminación ácida y que da como resultado un desplazamiento de la fluorescencia a la derecha. El clon de anticuerpo SC6.10.2 (es decir, H10 en la FIG. 10C) es un ejemplo de la capacidad de internalización típica por anticuerpos anti-PTK7 con esta actividad. En comparación con los controles de IgG, aproximadamente 15% de los sobrenadantes que contienen anticuerpos contra la PTK7 (4 de 27) indujeron internalización. Usando las células K562, este dato demuestra que un subconjunto de anticuerpos capaces de unir el ECD de PTK7 se acoplan al antígeno como se presenta sobre las células y son capaces de internalizarse eficazmente.

[0335] Las pruebas adicionales que indican que los moduladores descritos pueden mediar la internalización en diversas estirpes celulares ejemplares se presentan en la FIG. 10. Más específicamente, se encontró que una estirpe celular de glioblastoma (células de tumor de Wilms G401) expresa niveles altos de PTK7 (datos no mostrados), lo que sugiere que esta estirpe celular puede ser más sensible en condiciones de ensayo seleccionadas y, por lo tanto, capaz identificar más eficazmente moduladores capaces de inducir internalización. Generalmente, usando estas células con el procedimiento de eliminación ácida antes mencionado, se cribaron 170 sobrenadantes de hibridoma singulares del Ejemplo 7 se analizaron para determinar si contenían anticuerpos internalizantes. Los anticuerpos SC6.2.35, SC6.10.2 y SC6.25.3 purificados (simbolizados H2.35, H10.2 y H25.3 en la FIG. 10D) que se identificaron en el cribado mencionado anteriormente se usaron como controles positivos (FIG. 10D). La capacidad de internalización de los moduladores presentes en seis sobrenadantes ejemplares (identificados mediante la designación de los pocilios) se muestra inmediatamente debajo de los controles. Con este ensayo más depurado, los datos demuestran que numerosos moduladores proporcionados mediante el procedimiento de inmunización comentado anteriormente eran capaces de unir la PTK7 e internalizarse (como demuestran 1A02, 1F02, 2A03 y 2F10), aunque no todos los clones (2F11 y 2F09) poseían esta capacidad.

[0336] En una demostración adicional más de las propiedades de los moduladores descritos, se encontró que todos los anticuerpos cribados que se unían a las células G401 de forma significativa se internalizaban en cierta medida (FIG. 10E). Como se representa mediante la línea discontinua en la FIG. 10E, la tinción celular positiva se estableció en 4 % en base a anticuerpos de control de isotipo de ratón que presentaban tinción inespecífica de 0-3 % de las células. Las intensidades fluorescentes medias de células G401 teñidas con cada anticuerpo se midieron después de la etapa de eliminación ácida (es decir, después de la internalización) a 37 °C y 4 °C y se interpolaron a los números de receptores relativos por célula usando perlas Rainbow de 8 picos (BD Spherotech n.° 559123) que contenían números conocidos de moléculas fluorescentes. Los números de receptores internalizados se calcularon restando los números de receptores obtenidos de muestras sometidas a la etapa de internalización a 4 °C (control) de la de 37 °C. Se observó que los anticuerpos específicos contra la PTK7 son heterogéneos en cuanto a su capacidad para inducir internalización, dada una diferencia de diez veces en los números de receptores internalizados independientes del nivel de unión celular (cuadrante superior derecho de la FIG. 10E).

Ejemplo 13

Los moduladores de la PTK7 facilitan la administración de agentes citotóxicos

[0337] El guiado de un fármaco citotóxico enlazado de forma estable a un anticuerpo representa una estrategia de anticuerpos potenciada que podría tener gran beneficio terapéutico para pacientes con tumores sólidos. Para determinar si los anticuerpos internalizantes específicos contra la PTK7 descritos anteriormente eran capaces de mediar la administración de un agente citotóxico a células vivas, se realizó un ensayo de destrucción celular in vitro donde se unió estreptavidina conjugada a la proteína inactivadora de ribosomas saporina (Advanced Targeting Systems) a anticuerpos contra PTK7 biotinilados y se midió la capacidad de estos complejos de saporina para internalizar y destruir células 72 horas más tarde mediante midiendo la viabilidad celular.

[0338] Específicamente, se sembraron 1 x 104 células de tumor de Wilms G401 por pocillo en placas de 96 pocillos. Los moduladores de la PTK7 en forma de anticuerpos anti-PTK7, como se describieron anteriormente, se purificaron a partir de los sobrenadantes, se biotinilaron y a continuación se diluyeron a 20 pg/mL. Se mezcló una alícuota de cada anticuerpo 1:1 con Streptavidin-ZAP (Advanced Targeting Systems), se agitó con formación de vórtice durante 5 segundos y a continuación se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. A continuación, se hicieron tres diluciones en serie adicionales de 10 veces de los complejos de anticuerpo-saporina y se añadieron 50 uL de cada mezcla, respectivamente, a pocillos que contenían células G401. La mezcla de célula/anticuerpo-saporina se incubó a continuación a 37 °C/5 % de CO² durante 24 horas. Después de esta incubación, las células se centrifugaron en placas de 96 pocillos de fondo redondo, se retiró el sobrenadante y se añadieron 100 uL de medio de cultivo recién preparado a cada pocillo. Las células se incubaron a continuación durante 72 horas adicionales antes de contar los números de células viables usando CellTiter-Glo (Promega Inc.) según el protocolo del fabricante.

[0339] Usando el ensayo de destrucción celular descrito anteriormente, se demostró que los moduladores de la PTK7 internalizantes ejemplares que comprendían anticuerpos de los clones SC6.2.35, SC6.10.2 y SC6.25.3 (simbolizados H2.35, H10.2 y - H25.3 en la Figura 11A) mediaban la internalización de toxina de saporina y la destrucción celular. Más particularmente, la FIG. 11A demuestra claramente la capacidad de estos moduladores para lograr la destrucción celular mediante internalización mediada por la PTK7, al contrario que un anticuerpo de control de isotipo inespecífico (es decir, MOPC). Tales datos demuestran que los moduladores descritos son inmunoespecíficos para la PTK7 y son capaces de mediar eficazmente la administración de una carga útil citotóxica y destruir células PTK7 positivas mediante asociación a la superficie celular.

[0340] En una extensión del ensayo de destrucción antes mencionado, se demostró la administración de una carga útil citotóxica mediante anticuerpos específicos contra la PTK7 usando cuatro moduladores ejemplares más (SC6.23, SC6.41, SC6.51 y SC6.58), con SC6.10.2 usado como control positivo. Para ello, se sembraron los tipos celulares siguientes en placas de cultivo tisular de 96 pocillos en sus medios de cultivo correspondientes (500 células por pocillo) un día antes de la adición de anticuerpos y toxina: células de tumor de Wilms G401, HEK293T genomanipuladas usando transducción retroviral para expresar moléculas de PTK7 sobre su superficie celular (simbolizadas en esta memoria células 293.PTK7) y HEK293T que actúan como control.

[0341] Para este ensayo, se añadieron moduladores de la PTK7 purificados en diversas concentraciones a los pocillos que contenían las células sembradas en placas. Después de la adición de los moduladores, se añadió una cantidad fija de fragmento Fab de IgG antirratón enlazado covalentemente a saporina (Fab-ZAP, Advanced Targeting Systems, n.° IT-48) en una concentración de 4 nM a los pocillos y los cultivos se incubaron durante 72 horas. Los números de células viables se determinaron como se describió anteriormente usando CellTiter-Glo. Las unidades de luminiscencia sin procesar usando cultivos que contenían células con saporina-fragmento Fab se establecieron como valores de referencia de 100% y todas las demás unidades se calcularon en consecuencia (denominadas “RLU normalizadas”).

[0342] Usando este ensayo, se demostró que todos los anticuerpos contra la PTK7 ensayados (pero no los anticuerpos de control de isotipo) fueron capaces de destruir las células diana (FIG. 11B-11D), donde las FIG. 11B, 11C y 11D ilustran el impacto de los moduladores sobre células G401, células 293.PTK7 y células HEK293T, respectivamente. Se apreciará que la internalización y destrucción mediada por los moduladores es dependiente del tipo de célula (comparar las FIG. 11B - células G401 y 11D - células HEK293T), del nivel de expresión de PTK7 en las células diana (comparar las FIG. 11C - células 293.PTK7 y 11D - células HEK293T) y de la capacidad intrínseca de los diversos moduladores para internalizarse. Este ensayo demuestra además que la internalización se produce principalmente debido a la unión del anticuerpo específico contra la PTK7 a la superficie celular sin necesidad de reticulación adicional. En base a los datos usados para generar las curvas de dosis-respuesta de las FIG 11B-11D (y los valores obtenidos de manera similar para moduladores adicionales, no mostrados), se determinó la concentración efectiva media (“CE50”) para cada una de las combinaciones de moduladores/células diana ensayadas. Más específicamente, la TABLA 5 que se presenta a continuación recoge la CE50 (en pM) para trece moduladores como se determinó para cada una de las tres células diana usando el ensayo descrito antes. ND indica que el valor no se determinó.

TABLA 5 Administración de un a ente citotóxico mediada or moduladores de la PTK7

[0343] Aunque se observó alguna variación en cuanto a la destrucción entre los moduladores individuales, hubo algunas tendencias generales que resultan evidentes a partir de los datos de la TABLA 5. A este respecto, los moduladores fueron generalmente más eficaces en la mediación la destrucción celular de las células 293 que sobreexpresaban PTK genomanipuladas que de indistintamente las células G401 o las células 293 de tipo natural. Interesantemente, muchos de los moduladores ensayados fueron relativamente eficaces en la mediación de la destrucción de células tumorales G401 no genomanipuladas que se sabe que expresan PTK7 sobre la superficie celular. Tales resultados reproducibles son indicativos del potencial terapéutico de una amplia gama de moduladores de la PTK7 internalizantes como se ejemplifica en esta memoria.

Ejemplo 14

Los moduladores de la PTK7 facilitan la administración de agentes citotóxicos a células tumorigénicas

[0344] Para corroborar los resultados del Ejemplo anterior y demostrar que los moduladores de la PTK7 pueden mediar la internalización y destrucción celular mediada por toxinas de células tumorales humanas primarias, se sembraron en placas células de NTX de ratón sometidas a selección negativa de linaje (es decir, células tumorales humanas propagadas como xenoinjertos de pase bajo en ratones inmunodeprimidos) y posteriormente se expusieron a anticuerpos anti-PTK7 y Fab-ZAP.

[0345] Específicamente, los tumores NTX procedentes de pacientes con cáncer de pulmón (LU), ovario (OV) y melanoma (SK) se disociaron en una suspensión monocelular y se sembraron en placas Primaria™ (BD Biosciences) en medio exento se suero enriquecido con factor de crecimiento usando técnicas reconocidas en la técnica habitual que favorecen la proliferación de citoblastos cancerosos. Después de 3-5 días de cultivo a 37 °C/5 % de CO^{2 / 5} % de O² , las células se pusieron en contacto con un anticuerpo de control de isotipo (IgG2a) o uno de tres anticuerpos anti-PTK7 murinos (SC6.2.35, SC6.10.2 o SC6.25.1 a 0,1 nM; - SC6.H2, SC6.H10 y SC6.H25 marcados), y Fab-ZAP (a 40 nM) como se expone en general en el Ejemplo anterior. La citotoxicidad de la saporina mediada por los moduladores se evaluó a continuación cuantificando el número de células restantes usando CellTiter Glo según las instrucciones del fabricante 5-7 días después. Los resultados se normalizaron contra células no tratadas.

[0346] Como se observa en la FIG. 12, la exposición a cada uno de los moduladores ensayados (aunque no al control de isotipo) dio como resultado números de células viables reducidos para todos los tipos de tumores. A este respecto, se apreciará que la cantidad de destrucción celular es aparentemente dependiente de la estirpe celular tumoral específica, así como del modulador particular. Estos datos indican que los moduladores de la presente descripción se pueden asociar inmunoespecíficamente con diversas células que expresan antígenos de diversos tipos de tumores, internalizar y mediar de ese modo la destrucción de las células constituyentes. Asimismo, la capacidad de los moduladores descritos para hacer esto con respecto a las estirpes celulares de tumores NTX cultivadas en condiciones que favorecen la proliferación de citoblastos cancerosos como se describió anteriormente es fuertemente indicativa de su capacidad para eliminar selectivamente los citoblastos cancerosos.

Ejemplo 15

Los moduladores de la PTK7 reducen la tumorigenicidad de los citoblastos cancerosos

[0347] Para confirmar adicionalmente la capacidad de los moduladores descritos para reducir la frecuencia de aparición de citoblastos cancerosos y afectar a su potencial tumorigénico, se trataron células de tumores de mama NTX con SC6.2.35 y posteriormente se implantaron en ratones inmunodeprimidos.

[0348] A este respecto, se disociaron dos tumores NTX procedentes de pacientes con cáncer de mama (BR13 y BR64) y las células tumorales humanas se cultivaron en condiciones conocidas en la técnica para mantener las células tumorigénicas y se trataron con un modulador de la PTK7 (y control de isotipo) y Fab-ZAP como se expuso en el Ejemplo anterior. A continuación, se midió la citotoxicidad en términos de viabilidad celular usando Cell Titer Glo según las instrucciones del fabricante catorce días después del tratamiento. Nuevamente, los resultados se normalizaron contra células no tratadas.

[0349] Como se observa en las FIG. 13A y 13B, respectivamente, las células de tumores de mama procedentes de BR13 (FIG. 13A) y de BR64 (FIG. 13B) se eliminaron en gran medida mediante la asociación inmunoespecífica e internalización mediada por los moduladores de la PTK7 del agente citotóxico de saporina. Más específicamente, el tratamiento con el modulador de la PTK7 SC6.2.35 (SC6.H2) a 0,2 nM dio como resultado la eliminación de aproximadamente 70-80 % de las células, mientras que las células tratadas con control de IgG2a no se vieron afectadas en gran medida. Los hallazgos son coherentes con los resultados observados en el Ejemplo 13 y demuestran además la aplicabilidad general de la presente descripción en base a la capacidad de los moduladores descritos para eliminar células perpetuadoras de tumores procedentes de un abanico de tumores.

[0350] Con el fin de confirmar que los moduladores descritos eliminan las células iniciadoras de tumores, los preparados tratados de las dos estirpes celulares de cáncer de mama se trasplantaron a ratones para determinar si las células iniciadoras de tumores seguían vivas. Más específicamente, se recolectaron independientemente células de pocillos por triplicado, se lavaron en PBS que contenía 2 % de BSA, se resuspendieron en 100 ul y a continuación se trasplantaron a ratones inmunodeprimidos individuales usando en general los procedimientos expuestos en el Ejemplo 1. Los ratones se controlaron semanalmente para determinar el crecimiento tumoral y se midieron todos los tumores que aparecían para calcular su volumen. Solo los ratones trasplantados con células BR13 y BR64 NTX tratadas con el control de IgG desarrollaron tumores, mientras que los trasplantados con células puestas en contacto con moduladores de la PTK7 no lo hicieron. Estos resultados demuestran que las TIC son eliminadas por los moduladores de la PTK7 capaces de mediar la administración de toxinas (FIG. 13C).

[0351] Un análisis de los datos demuestra que la implantación de las células vivas restantes después del tratamiento de cualquiera de las estirpes celulares de cáncer de mama con modulador de la PTK7 y saporina no da como resultado la formación de tumores. Por el contrario, las células de control de ambas estirpes celulares de cáncer de mama (es decir, aquellas que se trataron con el anticuerpo de control de isotipo) fueron capaces de reiniciar el crecimiento tumoral tras la implantación. En particular, dos de los tres ratones implantados con cada estirpe celular de control (BR22 y BR64) desarrollaron tumores mensurables, lo que indica que las células implantadas incluían células perpetuadoras de tumores. Más significativamente, la incapacidad de las células tratadas con moduladores para formar tumores implica fuertemente que las células que se implantaron no incluían células perpetuadoras de tumores.

Es decir, es probable que el tratamiento con la combinación de modulador de la PTK7/saporina se dirija y elimine selectivamente las células perpetuadoras de tumores según la presente descripción. En cualquier caso, estos datos demuestran que el tratamiento con los moduladores descritos es eficaz para reducir el potencial tumorigénico de las células tumorales.

Ejemplo 16

Los moduladores de la PTK7 humanizados median la administración de agentes citotóxicos

[0352] Como los casos preferidos de la presente descripción probablemente emplearán moduladores de la PTK7 humanizados en un ámbito terapéutico, se realizó un trabajo para demostrar que los anticuerpos anti-PTK7 humanizados (fabricados como se expuso en el Ejemplo 8) actúan como mediadores eficaces de la destrucción celular mediante administración de agentes citotóxicos.

[0353] Más particularmente, se emplearon tres moduladores de la PTK7 humanizados ejemplares (hSC6.23, ÜSC6.58 y hSC6.24) para mediar la introducción de una carga útil citotóxica y eliminar las células tumorigénicas según las enseñanzas de esta memoria. En general, usando el protocolo expuesto en el Ejemplo 13 anterior, las células HEK293 genomanipuladas para expresar PTK7 (es decir, células 293.PTK7) se expusieron a diferentes concentraciones de los moduladores seleccionados y saporina enlazada a un Fab antihumano (Fab-ZAP humano, Advanced Targeting Systems). Después de la incubación, las células se lavaron y a continuación se evaluó la citotoxicidad de la saporina mediada por los moduladores cuantificando el número restante de células usando CellTiter Glo según las instrucciones del fabricante 5-7 días después. Los resultados se normalizaron contra células no tratadas y se presentan gráficamente en la FIG. 14.

[0354] El análisis de las curvas expuestas en la FIG. 14 demuestra que los tres moduladores de la PTK7 ensayados fueron muy eficaces en la inducción de la internalización de la carga útil citotóxica que reduce la viabilidad celular. A este respecto, cada uno de los moduladores proporcionó una reducción de 50 % de la viabilidad celular a una concentración entre 1 y 10 pM y una reducción superior a 80 % de la viabilidad celular a una concentración de 100 pM. Nuevamente, según la presente descripción, estos datos son indicativos de moduladores altamente eficaces que pueden mediar inmunoespecíficamente la administración de agentes citotóxicos a poblaciones celulares seleccionadas.

[0355] Por consiguiente, la presente invención no se limita a las realizaciones particulares que se han descrito pormenorizadamente en esta memoria. En su lugar, se debe hacer referencia a las reivindicaciones adjuntas como indicativas del alcance y contenido de la invención.

Claims (19)

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo humano humanizado o recombinante, injertado con CDR, quimérico, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a la PTK7 humana y que comprende regiones variables de las cadena ligeras y pesadas, en el que:

(a) la región variable de cadena ligera comprende tres CDR expuestas como residuos 24-34 de la SEQ ID NO: 62 para la CDR1 de Vl, residuos 50-56 de la SeQ ID NO: 62 para la CDR2 de Vl y residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 62 para la CDR3 de V^l, y la región variable de cadenas pesada comprende tres CDR expuestas como residuos 31-35 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR1 de Vh, residuos 50-65 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR2 de Vh y residuos 95-102 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR3 de Vh, en el que la numeración de las CDR es según Kabat; (b) la región variable de cadena ligera comprende tres CDR expuestas como residuos 23-34 de la SEQ ID NO: 62 para la CDR1 de V^l, residuos 50-56 de la S^eQ ID NO: 62 para la CDR2 de V^l y residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 62 para la CDR3 de Vl, y la región variable de cadena pesada comprende tres CDR expuestas como residuos 26­ 32 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR1 de Vh, residuos 50-58 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR2 de Vh y residuos 95-102 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR3 de V^h, en el que la numeración de las CDR es según Chothia; o

(c) la región variable de cadena ligera comprende tres c Dr expuestas como residuos 30-36 de la SEQ ID NO: 62 para la CDR1 de V^l, residuos 46-55 de la S^eQ ID NO: 62 para la CDR2 de V^l y residuos 89-96 de la SEQ ID NO: 62 para la CDR3 de V^l, y la región variable de cadena pesada comprende tres CDR expuestas como residuos 30­ 35 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR1 de VH, residuos 47-58 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR2 de VH y residuos 93-101 de la SEQ ID NO: 63 para la CDR3 de Vh, en el que la numeración de las CDR es según MacCallum.

2. Anticuerpo humano humanizado o recombinante, injertado con CDR, quimérico, o fragmento de unión al antígeno del mismo, que se une específicamente a la PTK7 humana y que comprende regiones variables de las cadena ligeras y pesadas, en el que:

(a) la región variable de cadena ligera comprende tres CDR expuestas como residuos 24-34 de la SEQ ID NO: 64 para la CDR1 de Vl, residuos 50-56 de la SeQ ID NO: 64 para la CDR2 de Vl y residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 64 para la CDR3 de V^l, y la región variable de cadena pesada comprende tres CDR expuestas como residuos 31­ 35 de la SEQ ID NO: 65 para la CDR1 de VH, residuos 50-65 de la SEQ ID NO: 65 para la CDR2 de VH y residuos 95-102 de la SEQ ID NO: 65 para la CDR3 de Vh, en el que la numeración de las CDR es según Kabat;

(b) la región variable de cadena ligera comprende tres ^c D^r expuestas como residuos 23-34 de la SEQ ID NO: 64 para la CDR1 de V^l, residuos 50-56 de la S^eQ ID NO: 64 para la CDR2 de V^l y residuos 89-97 de la SEQ ID NO: 64 para la CDR3 de V^l, y la región variable de cadena pesada comprende tres CDR expuestas como residuos 26­ 32 de la SEQ ID NO: 65 para la CDR1 de VH, residuos 50-58 de la SEQ ID NO: 65 para la CDR2 de VH y residuos 95-102 de la SEQ ID NO: 65 para la CDR3 de V^h; en el que la numeración de las CDR es según Chothia; o

(c) la región variable de cadena ligera comprende tres c Dr expuestas como residuos 30-36 de la SEQ ID NO: 64 para la CDR1 de V^l, residuos 46-55 de la S^eQ ID NO: 64 para la CDR2 de V^l y residuos 89-96 de la SEQ ID NO: 64 para la CDR3 de V^l; y la región variable de cadena pesada comprende tres CDR expuestas como residuos 30­ 35 de la SEQ ID NO: 65 para la CDR1 de VH, residuos 47-58 de la SEQ ID NO: 65 para la CDR2 de VH y residuos 93-101 de la SEQ ID NO: 65 para la CDR3 de Vh; en el que la numeración de las CDR es según MacCallum.

3. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1 o 2, que comprende:

(a) una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la SEQ ID NO: 62 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la SEQ ID NO: 63; o

(b) una región variable de cadena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la SEQ ID NO: 64 y una región variable de cadena pesada que tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 60 % idéntica a la SEQ ID NO: 65.

4. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 1, que comprende una región variable de cadena ligera expuesta como SEQ ID NO: 62 y una región variable de cadena pesada expuesta como SEQ ID NO: 63.

5. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de la reivindicación 2, que comprende una región variable de cadena ligera expuesta como SEQ ID NO: 64 y una región variable de cadena pesada expuesta como SEQ ID NO: 65.

6. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que es un anticuerpo neutralizante, reductor y/o internalizante.

7. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que se une específicamente a una isoforma de la PTK7 seleccionada del grupo que consiste en isoforma a, isoforma b, isoforma c e isoforma d.

8. Conjugado de anticuerpo que comprende el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, cuyo anticuerpo está conjugado, enlazado o asociado de otro modo con un agente citotóxico.

9. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el conjugado de anticuerpo de la reivindicación 8.

10. Ácido nucleico que codifica la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera del anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

11. Vector o una célula hospedadora que comprende dicho ácido nucleico de la reivindicación 10.

12. Célula que comprende un anticuerpo que se une específicamente a la PTK7 humana, en la que la célula comprende uno o más ácidos nucleicos que codifican:

(a) una región variable de cadena ligera expuesta como SEQ ID NO: 62 y una región variable de cadena pesada expuesta como SEQ ID NO: 63; o

(b) una región variable de cadena ligera expuesta como SEQ ID NO: 64 y una región variable de cadena pesada expuesta como SEQ ID NO: 65.

13. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el conjugado de anticuerpo de la reivindicación 8 para uso como un producto farmacéutico.

14. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para uso en la detección, el diagnóstico o el control de un trastorno asociado a la ^pTK7 en un sujeto, en el que el trastorno asociado a la PTK7 es un trastorno proliferativo, que es opcionalmente un trastorno neoplásico que comprende un tumor sólido, tal como cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de pulmón o cáncer de piel.

15. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el conjugado de anticuerpo de la reivindicación 8 para uso en el tratamiento de un trastorno asociado a la PTK7, en el que el trastorno asociado a la PTK7 es un trastorno proliferativo, que es opcionalmente un trastorno neoplásico que comprende un tumor sólido, tal como cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de pulmón o cáncer de piel.

16. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o el conjugado de anticuerpo de la reivindicación 8 para uso en la reducción de la frecuencia de células iniciadoras de tumores en un sujeto.

17. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para uso en un procedimiento in vivo para detectar, diagnosticar o controlar un trastorno asociado a la PTK7 en un sujeto, en el que el trastorno asociado a la PTK7 es un trastorno proliferativo, que es opcionalmente un trastorno neoplásico que comprende un tumor sólido, tal como cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de pulmón o cáncer de piel.

18. Procedimiento in vitro para detectar, diagnosticar o controlar un trastorno asociado a la PTK7 usando el anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el trastorno asociado a la PTK7 es un trastorno proliferativo, que es opcionalmente un trastorno neoplásico que comprende un tumor sólido, tal como cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de pulmón o cáncer de piel.

19. Anticuerpo o fragmento de unión al antígeno del mismo para uso según cualquiera de las reivindicaciones 14-15 o 17 o el conjugado de anticuerpo para uso según la reivindicación 15 o el procedimiento de la reivindicación 18, en el que el trastorno asociado a la PTK7 es cáncer.