KR20140009238A - 안정성이 증가되고 보유 촉매 활성이 증가된 변종 재조합 베타-글루코세레브로시다제 단백질 - Google Patents

Abstract

재조합 야생형 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 본원에 기술된다. 또한 재조합 야생형 β-글루코세레브로시다제에 비해 더 큰 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 본원에 제공된다. 추가로 하기 위치들: 316, 317, 321 및 145 중 하나 이상에 아미노산 변이를 가질 수 있는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 본원에 기술된다. 리소좀성 축적 질환을 가지는 환자의 치료 방법은 물론, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질의 제조 방법 역시 기술된다.

Description

안정성이 증가되고 보유 촉매 활성이 증가된 변종 재조합 베타-글루코세레브로시다제 단백질{VARIANT, RECOMBINANT BETA-GLUCOCEREBROSIDASE PROTEINS WITH INCREASED STABILITY AND INCREASED RETAINED CATALYTIC ACTIVITY}

관련 출원의 상호-참조

2010년 11월 8일자 미국 가출원 일련번호 61/411,331 및 2010년 11월 10일자 미국 가출원 일련번호 61/412,180에 대하여 35 U.S.C. §119(e)에 따른 우선권을 주장하는 바, 이들 모두는 그 전체가 본원에 참조로써 개재된다.

기술 분야

본 발명의 분야에는 다양한 리소좀성 축적 질환(lysosomal storage disease)을 위한 효소 대체 요법(enzyme replacement therapy)에 유용한 단백질이 포함된다. 이러한 리소좀성 축적 질환에는 고셔병(Gaucher disease)이 포함된다.

β-글루코세레브로시다제는 사포닌 C 및 음이온성 인지질과의 상호작용을 통하여 구경 막(luminal membrane) 표면에서 기능함으로써 당지질인 글루코실세라미드를 가수분해하는 가용성의 리소좀 효소이다. β-글루코세레브로시다제는 포식된 손상 세포 및 병원체로부터 막을 분해하여 재순환시키는 조직 대식세포에서 특히 중요하다. 글루코실세라미드는 수많은 중요한 세포 경로 및 신호전달 연속단계에 연관되어 있는 300 종이 넘는 당지질 및 강글리오시드들의 주요 전구체 분자이기 때문에, 이러한 다양한 지질 분자들의 복잡한 균형을 유지하는 데에 필수적이다.

고셔병은 글루코실세라미드의 축적을 초래하는 β-글루코세레브로시다제의 결핍에 의해 야기된다. 고셔병은 빈혈, 혈소판감소증, 간비장비대 및 골격 이상을 포함한 다양한 임상적 증상들을 통하여 나타난다. 고셔병은 신경학적 관계를 기준으로 하기 3종의 범주로 분류된다: 유형 1 (비-뉴런병증성); 유형 2 (급성 뉴런병증성); 및 유형 3 (만성 뉴런병증성). 고셔병에 대한 알려져 있는 치유법은 존재하지 않지만, 부족한 β-글루코세레브로시다제를 보충해주는 효소 대체 요법 (ERT), 및 글루코실세라미드의 합성을 억제하는 기질 감소 요법(substrate reduction therapy)이 이 질환에 대하여 승인되어 있는 치료법이다. 소형 분자 약학적 샤페론 및 단백질 접힘 조절제와 같은 다른 치료적 접근법들 역시 이 질환의 잠재적인 치료법으로 평가받고 있다. 이러한 치료 접근법들 중, ERT가 고셔병의 내장 증상에 대한 가장 잘 알려져 있으며 효과적인 임상적 치료법이다. 고셔병 치료용으로 1994년에 이미글루세라제(Imiglucerase) (재조합 β-글루코세레브로시다제; 세레자임(Cerezyme)™, 겐자임 코프.(Genzyme Corp.)™)가 개발되어 FDA에 의해 승인된 바 있어서, 현재 해당 질환 치유법의 표준이 되고 있다.

세레자임™ ERT가 가장 효과적인 치료제인 것으로 널리 알려져 있기는 하지만, 이 리소좀 효소는 중성 pH 및 37℃에서 안정하지 않다. 사실, 그의 대부분의 약물은 정맥내 주입 직후 혈액 중에서 비가역적으로 불활성화된다. 촉매 활성을 유지하면서 표적 대식세포로 내재화되는 아주 소량만이 완전한 치료 효과를 제공한다. 따라서, 단백질 제조 단계로부터 그를 필요로 하는 인간 대상체에의 도입시 직면하게 되는 생리학적 조건까지도 효소 불활성화에 대하여 그렇게 민감하지 않은 더욱 안정한 β-글루코세레브로시다제 효소를 개발한다면 유리할 것이다.

개요

야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 본원에 제공된다. 또한 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 더 큰 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 본원에 제공된다. 추가로 하기 위치들: 316, 317, 321 및 145 중 하나 이상에 아미노산 변이를 가질 수 있는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 본원에 기술된다.

야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 더 큰 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질의 제조 방법이 본원에 기술된다. 추가로 상기 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물이 본원에 기술된다. 또한 상기 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 및 제약상 허용되는 완충제를 포함하는 조성물이 본원에 제공된다.

단백질의 루프 1 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지며, 상기 하나 이상의 치환 아미노산은 단백질 활성 부위 부근의 질서(order)를 증가시키는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 하는, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 본원에 기술된다. 추가로 단백질 활성 부위 부근의 α-나선 (α6)에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지며, 하나 이상의 치환 아미노산 측쇄가 해당 나선을 안정화하고 촉매 부위로부터 인접하는 루프 1을 떼어내며 개방적인 활성 입체형태를 가지는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 하는, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 본원에 기술된다. 또한 베타-시트 (β2)와 α-나선 (α2) 사이의 랜덤 코일 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지며, 하나 이상의 치환 아미노산 측쇄는 향상된 안정성을 위해 상이한 잔기와 2차 구조들 사이의 더 우수한 상호작용을 촉진하는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 하는, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 본원에 제공된다.

야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것에 의한, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법이 본원에 제공된다. 또한 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것에 의한, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법이 본원에 제공된다. 또한 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 특이적 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것에 의한, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법이 본원에 제공된다. 또한 하기 위치들: 316, 317, 321 및 145 중 하나 이상에 아미노산 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것에 의한, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법이 본원에 제공된다. 또한 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 고셔병의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것에 의한, 고셔병의 치료 방법이 본원에 제공된다.

또한 하기 아미노산 서열들: 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 또는 서열 16 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 포함하는 화합물이 본원에 제공된다.

또한 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 발현이 가능함을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 본원에 제공된다.

또한 하기 아미노산 서열들: 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 또는 서열 16 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 포함하는 화합물의 제조 방법이 본원에 제공된다. 또한 하기 아미노산 서열들: 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 또는 서열 16 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 코딩하는 핵산의 제조 방법이 본원에 제공된다.

본 발명의 전기 및 기타 측면들은 첨부 도면과 연계하여 하기하는 본 발명의 상세한 설명을 고려할 때 분명해진다. 본 발명을 예시할 목적으로 현재 바람직한 실시양태들을 도면상에 나타내지만, 본 발명이 개시되어 있는 구체적인 수단들로 제한되지는 않는 것으로 양해된다. 도면들이 반드시 일정 비율로 도시된 것은 아니다. 도면 중:
도 1(A)는 통상적인 일시적 형질감염 실험에서 48시간 후에 세포 배양 배지에 분비된 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질들의 상대적 발현을 야생형 효소와 비교한 효소 활성 측정치를 나타내며; (B)는 일시적 형질감염 후 세포 배양 배지에 분비된 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질들 및 야생형 GlcCerase 단백질의 상대적인 양을 비교한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 2는 pH 7.5 및 37℃에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질과 비교한 H145L 변형, H145F 변형, F316A/L317F 변형, K321N 변형, K321A 변형, F316A/L317F/K321N 변형, 및 H145L/K321N 변형을 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질들의 안정성을 나타내며;
도 3은 pH 8 및 37℃에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질과 비교한 F316A/L317F 변형을 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질의 안정성을 나타낸다.

본 개시의 일부를 이루는 첨부 도면 및 실시예와 연계되어 고려되는 하기의 상세한 설명을 참조함으로써, 본 발명의 주제가 더욱 용이하게 이해될 수 있을 것이다. 본 발명이 본원에서 기술되거나 및/또는 나타내는 구체적인 장치, 방법, 적용분야, 조건 또는 파라미터로 제한되는 것은 아니라는 것, 그리고 본원에서 사용되는 용어가 단지 예로써 구체적인 실시양태를 기술할 목적의 것이며 청구 발명을 제한하고자 하는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다.

또한, 첨부된 청구범위를 포함한 본 명세서에서 사용될 때의 단수 형태 "a", "an" 및 "the"에는 복수가 포함되며, 문맥상 분명하게 다르게 기술되지 않는 한, 구체적인 숫자 값에 대한 언급에는 적어도 그 특정 값이 포함된다. 본원에서 사용될 때의 "다수"라는 용어는 하나를 초과하는 것을 의미한다. 값의 범위가 표현되는 경우, 또 다른 실시양태에는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지가 포함된다. 마찬가지로, 선행하는 "약"을 사용하여 근사치로써 값이 표현되는 경우, 그것은 특정 값이 또 다른 실시양태를 형성한다는 것으로 양해된다. 모든 범위는 포괄적이며 조합가능하다.

실시예는 본 발명의 추가적인 이해를 돕기 위하여 제공된다. 사용되는 구체적인 물질, 프로토콜 및 조건은 본 발명을 추가로 예시하고자 하는 것으로써, 그의 합리적인 영역을 제한하는 것으로 간주되어서는 아니 된다.

다르게 주지되지 않는 한, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질의 특성은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질의 특성 (서열 1)에 대비하여 언급된다. 본원에서 "GlcCerase"는 β-글루코세레브로시다제에 대하여 사용되는 약어이다. 모든 아미노산 번호는 서열 1에 대비한 것이다. 따라서, 위치 145는 서열 1에서 출현하는 145번째 아미노산일 것이다. 또한, 본원에서 개시될 때의 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에는 그의 기능성인 단편 또는 유도체도 포함된다.

본원에서 "대략 중성인 pH"는 보통 생리학적 pH (즉 37℃에서 약 7.5의 pH)로 간주되는 pH를 포함하여 의미한다.

적합한 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 세포 배양 및 단백질 제조 동안 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 유사하거나 증가된 단백질 발현 및 세포 배양 배지로의 분비를 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 적합한 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 단백질은 생리학적 조건에서 증가된 안정성을 가지며, 해당 생리학적 조건은 생체내의 것일 수 있다. 또한, 이러한 단백질은 대략 중성인 pH 및 약 37℃의 조건에서 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 할 수도 있다. 이와 같이 증가된 안정성은 대략 중성인 pH 및 약 37℃의 조건에서 약 3시간의 기간에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 증가된 안정성은 세포 배양 배지에서 유지되며, 세포 내부에서 유지될 수 있다. 이러한 단백질은 또한 리소좀 내부에서 증가된 안정성을 가질 수 있는데, 리소좀 내부에서, 조건은 약 pH 5 및 약 37℃일 수 있다. 이러한 단백질은 감소된 단백질 분해(proteolytic degradation)를 특징으로 하는 증가된 안정성을 가질 수도 있는데, 상기 감소된 단백질 분해는 세포 내에서 이루어질 수 있다. 또한, 감소된 단백질 분해는 세포의 리소좀 내의 것일 수 있다. 이러한 단백질은 또한 단백질 정제 동안의 완충 용액 내와 같은 비-생리학적 조건에서 증가된 안정성을 가질 수 있다. 단백질 정제 동안, 이러한 완충 용액은 약 7을 초과하는 pH 또는 약 3 미만인 pH를 가질 수 있다. 이러한 완충 용액은 유기 용매 또는 카오트로픽 염(chaotropic salt)을 함유할 수도 있다. 이러한 단백질은 또한 약 2℃ 내지 약 37℃ 범위인 온도의 완충 용액 중에서 증가된 안정성을 가질 수 있다. 또한, 이러한 단백질은 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위인 온도의 완충 용액 중에서 증가된 안정성을 가질 수도 있다. 또한, 이러한 단백질은 약 20℃ 온도의 완충 용액 중에서 증가된 안정성을 가질 수 있다. 이러한 단백질은 또한 냉동-해동 주기 또는 동결건조 후 재구성 후에도 증가된 안정성을 가질 수 있다. 이러한 단백질은 염수와 같은 약물-제제화 완충제 중에서도 증가된 안정성을 가질 수 있다.

적합한 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 더 큰 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 단백질은 생리학적 조건에서 더 큰 촉매 활성을 보유하고 있으며, 보유하고 있는 더 큰 촉매 활성은 생체내의 것일 수 있다. 또한, 이러한 단백질은 대략 중성인 pH 및 약 37℃의 조건에서 더 큰 촉매 활성을 보유하고 있는 것을 특징으로 할 수도 있다. 이와 같이 더 큰 보유 촉매 활성은 대략 중성인 pH 및 약 37℃의 조건에서 약 2시간의 기간에 걸쳐 모니터링될 수 있다. 이러한 단백질은 세포 배양 배지에서 더 큰 촉매 활성을 보유하고 있으며, 더 큰 상기 보유 촉매 활성은 세포 내부의 것일 수 있다. 또한, 이러한 단백질은 리소좀 내부에서 더 큰 촉매 활성을 보유할 수 있는데, 리소좀 내부에서, 조건은 약 pH 5 및 약 37℃일 수 있다. 이러한 단백질은 감소된 단백질 분해를 특징으로 하는 더 큰 촉매 활성을 보유할 수도 있는데, 상기 감소된 단백질 분해는 세포 내에서 이루어질 수 있다. 또한, 감소된 단백질 분해는 세포의 리소좀 내의 것일 수 있다. 이러한 단백질은 또한 단백질 정제 동안의 완충 용액 내와 같은 비-생리학적 조건에서 더 큰 촉매 활성을 보유할 수 있다. 단백질 정제 동안, 이러한 완충 용액은 약 7을 초과하는 pH 또는 약 3 미만인 pH를 가질 수 있다. 이러한 완충 용액은 유기 용매 또는 카오트로픽 염을 함유할 수도 있다. 이러한 단백질은 또한 약 2℃ 내지 약 37℃ 범위인 온도에서 더 큰 촉매 활성을 보유할 수 있다. 또한, 이러한 단백질은 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위인 온도에서 더 큰 촉매 활성을 보유할 수도 있다. 또한, 이러한 단백질은 약 20℃ 온도에서 더 큰 촉매 활성을 보유할 수 있다. 이러한 단백질은 또한 냉동-해동 주기 또는 동결건조 후 재구성 후에도 더 큰 촉매 활성을 보유할 수 있다. 이러한 단백질은 염수와 같은 약물-제제화 완충제 중에서도 더 큰 촉매 활성을 보유할 수 있다.

변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 또한 하기 위치들: 316, 317, 321 및 145 중 하나 이상에 아미노산 변이를 가질 수 있다. 이러한 단백질은 하기의 아미노산 변이 또는 변이들을 가질 수 있다: (1) F316A 및 L317F; 또는 (2) K321N; 또는 (3) H145L; 또는 (4) H145F; 또는 (5) F316A, L317F, 및 K321N; 또는 (6) K321A; 또는 (7) K321V; (8) F316A, L317F, 및 K321A; 또는 (9) F316A, L317F, 및 K321V; 또는 (10) H145L, F316A, 및 L317F; 또는 (11) H145L 및 K321N; 또는 (12) H145L 및 K321A; 또는 (13) H145L 및 K321V. 이러한 단백질들 중 일부는 세포 배양 및 단백질 제조 동안 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 유사하거나 증가된 단백질 발현 및 세포 배양 배지로의 분비를 가지는 것을 특징으로 할 수도 있다. 이러한 단백질은 또한 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다. 이러한 단백질은 또한 생리학적 조건에서 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 할 수 있는데, 상기 조건은 대략 중성인 pH 및 약 37℃이다. 이러한 단백질은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 더 큰 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 할 수도 있다. 상기 촉매 활성은 약 2시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃의 조건에서 인큐베이션 후 측정될 수 있다. 이러한 단백질은 또한 생리학적 조건에서 더 큰 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 할 수 있다. 아미노산 변이 F316A 및 L317F를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 2배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가진다. 아미노산 변이 K321N을 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 3배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가진다. 아미노산 변이 K321A를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 3배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가진다. 아미노산 변이 K321V를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 1.4배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가진다. 아미노산 변이 H145L을 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 3배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가진다. 아미노산 변이 H145F를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 2배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가진다. 아미노산 변이 F316A, L317F 및 K321N을 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 3배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가진다. 아미노산 변이 H145L, F316A 및 L317F를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 2배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가진다. 아미노산 변이 H145L 및 K321N을 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 3배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가진다. 이와 같은 연장된 겉보기 반감기는 약 2시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃의 조건에서 인큐베이션 후 측정될 수 있다.

실시예 1

시약

4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코시드 (4MUG) 형광성 기질은 리서치 프라덕츠 인터내셔날(Research Products International) (일리노이 마운틴 프라스펙트 소재)로부터 구매하였다. DNA 겔 추출 및 미니프레프(Gel Extraction and Miniprep) DNA® 키트는 키아젠(QIAGEN)® (캘리포니아 발렌시아 소재)의 것이다. 퓨어일드 맥시프레프(PureYield Maxiprep) DNA 키트™은 프로메가(Promega)™ (위스콘신 매디슨 소재)의 것이다. 다르게 언급되지 않는 한, 화학물질들은 시그마(Sigma)™ (미주리 세인트루이스 소재)의 것이다. 퓨젠(Fugene)-HD™ 형질감염 시약은 로슈(Roche)™ (인디애나 주 인디애나폴리스 소재)의 것이다. pEF6/V5-HisA™ 포유동물 발현 벡터, 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM), 소 태아 혈청 (FBS) 및 기타 조직 배양 시약들은 인비트로겐(Invitrogen)™ (캘리포니아 칼스배드 소재)의 것이다. 야생형인 인간 야생형 β-글루코세레브로시다제 cDNA (NM_000157.3)은 오리젠(Origene)™ (매릴랜드 로크빌 소재)로부터 구매하였다. 제한 엔도뉴클레아제, 퓨젼-HF™ DNA 폴리머라제, T4 DNA 리가제, 남극 포스파타제(Antarctic phosphatase), 화학적-적격(chemically-competent) 이. 콜라이(E. coli) (DH5α 세포), 및 엔도글리코시다제 PNGaseF 및 EndoH는 모두 뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs)™ (매사추세츠 입스위치 소재)로부터 구매하였다. 인간 배아 신장 세포 (T-항원을 사용하여 형질전환됨; HEK293T)는 ATCC™의 것이다.

검정

단백질 발현을 평가하기 위하여, 인간 세포주 (HEK293T)에서의 일시적 발현(transient expression)에 의해, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 및 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 모두를 시험하였다. 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 또는 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질의 촉매 활성을 시험하기 위한 리포터 시스템은 약 pH 5.2 및 약 37℃에서 4-MU-β-글루코스 형광성 기질을 가수분해하는 능력이었다. 해당 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 및 정제된 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질의 안정성은 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃에서 인큐베이션 후 각 단백질의 촉매 활성 보유력을 모니터링하는 것에 의해 시험하였다. 이들 실험에서의 조건은 환자에의 β-글루코세레브로시다제 단백질 효소 대체 요법의 정맥내 주입 동안 존재하게 되는 환경을 모방하여 설계되었다.

어떠한 방식으로도 제한하는 것으로 간주되어서는 아니 되지만, 더 구체적으로 말하자면, 10% FBS가 보충된 1 ml의 DMEM 배지가 포함된 12-웰 조직 배양 플레이트에 HEK293T 세포를 도말하고, 5% CO₂ 분위기로 37℃에서 인큐베이팅하였다. HEK293T 세포가 80-90%의 융합도(confluency)에 도달하였을 때, 사용 배지를 새로운 DMEM/10% FBS 배지 1 ml로 교체하고, 각 웰에 1 ㎍의 개별 β-글루코세레브로시다제 단백질의 플라스미드 DNA 또는 PBS (모의-형질감염 음성 대조용)와 3 μl의 퓨젠-HD 형질감염 시약을 제조자의 프로토콜에 따라 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 24-72시간 동안 인큐베이팅하면서, 효소 활성 검정을 통해 매일 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 (배지로 분비된 것)의 발현에 대하여 점검하였다.

β-글루코세레브로시다제 단백질 발현 (및 세포 배양 배지로의 분비)은 24, 48 또는 72-시간 후의 일시적 형질감염 실험으로부터의 컨디셔닝된 배지 및 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코시드 (4MUG) 형광성 기질을 사용한 효소 활성 검정에 의해 평가하였다. 간단하게 말하자면, 지정된 시점에 각 샘플로부터의 컨디셔닝된 배지 20 μl를 수확하여, 0.5 ml 미세원심분리 튜브에서 80 μl의 맥킬베인(McIlvane) 완충제 (MI 완충제: 50 mM 나트륨 시트레이트/나트륨 포스페이트 (pH 5.2)/0.25% (v/v) 트리톤 X-100/0.25% (w/v) 나트륨 타우로콜레이트)로 희석하였다. 각 희석 샘플 25 μl를 96-웰 블랙 투명저 플레이트의 개별 웰에 분취하고 (3반복으로 수행), 다-채널 피페터를 통하여 각 웰에 50 μl의 6 mM 4-MUG 기질 (MI 완충제 중에서 제조)을 첨가하였다. 다음에, 커버 테이프를 사용하여 플레이트를 밀봉하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이팅하였다. 125 μl의 0.1 M NaOH를 첨가함으로써 효소 반응을 중지시키고, 형광 플레이트 해독기에서 각각 355 nm 여기 및 460 nm 방출 파장을 사용하여 방출된 4-MU 형광을 해독하였다. 모의-형질감염 샘플로부터의 4-MU 형광을 "바탕" 대조로 사용하여, 모든 β-글루코세레브로시다제 단백질 샘플로부터 차감하였다.

세포 배양 배지에 존재하는 야생형 및 변종 산 β-글루코세레브로시다제 단백질의 양을 평가하기 위하여, 일시적 형질감염 실험으로부터의 컨디셔닝된 세포 배양 배지를 나트륨 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE)에 적용한 후, 표준 기술을 사용하여 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 다음에, 블로킹( Blocking ) 완충제 (50 mM 트리스-완충된 염수 (pH 7.5)/0.1% (v/v) 트윈-20 (TBST) 중 4% (w/v) 무-지방 우유)를 사용하여 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 막을 인큐베이팅하였다. 이후, 블로킹 완충제 중에 1:2500 희석된 토끼 항-인간 β-글루코세레브로시다제 폴리클로날 1차 항체 (인간 산 β-글루코세레브로시다제의 C-말단에 해당하는 19 아미노산 펩티드에 대하여 유도; 시그마 G-4171)를 사용하여 진탕하면서 실온에서 1시간 동안, 또는 4℃에서 밤새 막을 인큐베이팅하였다. 다음에, 진탕하면서 실온에서 TBST로 블롯을 세척하고, 1시간에 걸쳐 3회 이상 완충제를 교체하였다. 다음에, 블로킹 완충제 중에 1:10,000 희석된 효소-결합 이차 항체 (예컨대 양고추냉이 퍼옥사다제-접합 염소 항-토끼 항체)를 사용하여 진탕하면서 실온에서 1시간 동안 블롯을 인큐베이팅하였다. 진탕하면서 실온에서 TBST로 블롯을 세척하고, 1시간에 걸쳐 3회 이상 완충제를 교체하였다. 다음에, 화학발광 기질 (예컨대 피어스 수퍼시그날 웨스트-듀라(Pierce's Supersignal West-Dura) 연장 기간 기질™)을 사용하여 실온에서 5분 동안 블롯을 인큐베이팅한 후, 화상화 시스템 또는 필름에 의해 가시화함으로써, 야생형 및 변종 산 β-글루코세레브로시다제 효소의 단백질 발현 수준을 평가하였다.

β-글루코세레브로시다제 단백질의 안정성을 평가하기 위하여, 일시적으로 발현된 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 및 정제된 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 (즉 세레자임™)을 중성 pH 완충제 중에서 37℃로 인큐베이팅한 후, 약 3시간의 기간에 걸쳐 촉매 활성의 상실 정도를 측정하기 위하여 효소 활성에 대하여 검정하였다. 간단하게 말하자면, 형질감염-24 또는 48시간 후에 60 μl의 컨디셔닝된 배지 (개별 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 함유)를 수확하고, 0.5 ml 미세원심분리 튜브 중 420 μl의 0.1 M 칼륨 포스페이트 (pH 7.5)/0.2% (v/v) 트리톤 X-100/0.2% (w/v) BSA에 첨가하였다. 유사하게, 정제된 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 DMEM 배지/10% FBS 중에 1:12,500까지 연속 희석하고, 이와 같이 희석된 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 샘플 60 μl를 420 μl의 0.1 M 칼륨 포스페이트 (pH 7.5)/0.2% (v/v) 트리톤 X-100/0.2% (w/v) BSA에 첨가하여 1:100,000의 최종 희석물을 수득하였다 (야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질의 이와 같은 양이 일시적으로 발현된 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질과 유사한 양의 효소 활성을 함유하는 것으로 경험적으로 측정되었음). 모든 샘플을 37℃의 수조에서 인큐베이팅한 후, 특정 시점 (0, 30, 60, 90, 120 또는 180분)에 각 샘플 70 μl를 분리하여, 20 μl의 0.5 M NaOAc (pH 5.2)를 함유하는 새로운 0.5 ml 미세원심분리 튜브에 첨가하였다. 샘플을 철저히 혼합한 후, 25 μl의 각 희석 샘플을 사용하여 상기한 바와 같이 잔류 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 효소 활성을 측정하였다 (3반복). 최초 효소 활성 (t=0분에서의 것)을 각 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질의 100%로 설정하는 동시에, 모든 이후 시점의 효소 활성들을 최초 활성에 대하여 표준화함으로써, 전체 시간 과정에 걸쳐 잔류 효소 활성을 측정하였다. 다수 실험 (2회 이상의 별도 실험)으로부터의 데이터를 사용하여 개별 시점에서의 잔류 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 활성의 평균 값을 수득하고, 나타낸 바와 같이 인큐베이션 시간에 대비하여 그래프화하였다.

실시예 2

상기한 일시적 형질감염 실험을 사용하여, 특정 아미노산 치환을 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질의 발현을 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("야생형 GlcCerase")과 비교하였다 (도 1). 도 1A에서 볼 수 있는 바와 같이, F316A 및 L317F 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("GlcCerase-F316A/L317F"), K321N 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("GlcCerase-K321N"), H145L 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("GlcCerase-H145L"), F316A, L317F 및 K321N 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("GlcCerase-F316A/L317F/K321N"), H145L 및 K321N 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("GlcCerase-H145L/K321N")을 HEK293T 세포 중에서 야생형 GlcCerase와 함께 일시적으로 발현시켰다. 형질감염 48시간 후 컨디셔닝된 세포 배양 배지를 수확하고, 4-메틸움벨리페릴-β-D-글루코시드 (4MUG) 형광성 기질을 사용하여 β-글루코세레브로시다제 효소 활성에 대하여 검정함으로써, 야생형 GlcCerase와 비교하여 해당 변종 GlcCerase 효소들의 상대적인 발현 수준을 평가하였다. 해당 결과는, 더 높게 측정된 세포 배양 배지 중 효소 활성에 의해 입증되는 바와 같이, 여러 변종 GlcCerase 효소들이 야생형 GlcCerase 만큼, 또는 그보다 더 우수하게 발현되었음을 보여준다. GlcCerase-H145F, GlcCerase-H145L/F316A/L317F/K321N을 포함한 다른 변종 GlcCerase 효소들 역시 야생형 GlcCerase보다 더 우수하게 발현되었다 (데이터 미도시). GlcCerase-K321A 및 GlcCerase-H145F/F316A/L317F/K321N은 야생형 GlcCerase와 대략 동일한 수준으로 발현된 반면, GlcCerase-K321V는 야생형 GlcCerase보다 덜 효율적으로 발현되었다 (데이터 미도시).

상기한 바와 같은 웨스턴 블롯팅을 사용하여, 컨디셔닝된 세포 배양 배지 중에 존재하는 변종 GlcCerase 단백질 및 야생형 GlcCerase 단백질의 양을 평가하였다. 도 1B에서 볼 수 있는 바와 같이, 야생형의 GlcCerase에 비해 더 많은 양의 GlcCerase-F316A/L317F 및 GlcCerase-K321N 단백질이 컨디셔닝된 세포 배양 배지 중에 존재하였다. 이러한 웨스턴 블롯팅 데이터는 GlcCerase 효소 활성 결과와 일치함으로써, 야생형의 GlcCerase보다 소정의 변종 GlcCerase 효소가 더 우수하게 발현 및 분비된다는 것을 확인해준다. 다른 변종 GlcCerase 단백질들에 대해서도 유사한 결과가 관찰되었다 (데이터 미도시).

실시예 3

상기한 시험관내 안정성 검정을 사용하여, F316A 및 L317F 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("GlcCerase-F316A/L317F")을 정제된 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("야생형 GlcCerase")과 비교하였다. 변종 및 야생형 단백질에 대하여 사용된 조건은 동일하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, GlcCerase-F316A/L317F는 2 또는 3시간의 시간 과정 동안 대략 중성인 pH 및 약 37℃에서 야생형 GlcCerase에 비해 상당히 더 안정하다. GlcCerase-F316A/L317F는 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 85%를 보유하였다. GlcCerase-F316A/L317F는 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 73%를 보유하였다. GlcCerase-F316A/L317F는 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 50%를 보유하였다. GlcCerase-F316A/L317F는 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 34%를 보유하였다. 비교하면, 동일 실험 조건하에서 처리된 야생형 GlcCerase는 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 68%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 46%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 20%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 8%를 보유하였다.

GlcCerase-F316A/L317F의 추정 반감기 (편의상, 본 연구에서는 최초 효소 활성의 50% 상실을 초래하는 약 pH 7.5 및 약 37℃에서의 인큐베이션 시간으로 정의됨)는 대략 120분인 반면, 야생형 GlcCerase의 추정 반감기는 해당 실험 조건하에서 대략 50분이다. 약 pH 8 및 약 37℃에서도 GlcCerase-F316A/L317F를 시험하였는데, 유사한 경향을 나타내었다 (도 3). GlcCerase-F316A/L317F 및 야생형 GlcCerase 모두가 약 pH 8 및 약 37℃에서는 덜 안정하였으나, 이러한 결과는 GlcCerase-F316A/L317F가 더 높은 pH에서 야생형 GlcCerase에 비해 더 안정하다는 것을 확인해 준다.

실시예 4

상기한 검정을 사용하여, K321N 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("GlcCerase-K321N")을 정제된 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("야생형 GlcCerase")과 비교하였다. 변종 및 야생형 단백질에 대하여 사용된 조건은 동일하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, GlcCerase-K321N은 3시간의 시간 과정 동안 대략 중성인 pH 및 약 37℃에서 야생형 GlcCerase에 비해 상당히 더 안정하다. GlcCerase-K321N은 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 104%를 보유하였다. GlcCerase-K321N은 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 91%를 보유하였다. GlcCerase-K321N은 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 76%를 보유하였다. GlcCerase-K321N은 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 54%를 보유하였다. 비교하면, 동일 실험 조건하에서 처리된 야생형 GlcCerase는 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 68%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 46%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 20%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 8%를 보유하였다.

GlcCerase-K321N의 추정 반감기 (편의상, 본 연구에서는 최초 효소 활성의 50% 상실을 초래하는 약 pH 7.5 및 약 37℃에서의 인큐베이션 시간으로 정의됨)는 대략 180분인 반면, 야생형 GlcCerase의 추정 반감기는 해당 실험 조건하에서 대략 50분이다.

실시예 5

상기한 검정을 사용하여, H145L 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("GlcCerase-H145L")을 정제된 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("야생형 GlcCerase")과 비교하였다. 변종 및 야생형 단백질에 대하여 사용된 조건은 동일하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, GlcCerase-H145L은 3시간의 시간 과정 동안 대략 중성인 pH 및 약 37℃에서 야생형 GlcCerase에 비해 상당히 더 안정하다. GlcCerase-H145L은 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 92%를 보유하였다. GlcCerase-H145L은 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 87%를 보유하였다. GlcCerase-H145L은 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 62%를 보유하였다. GlcCerase-H145L은 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 42%를 보유하였다. 비교하면, 동일 실험 조건하에서 처리된 야생형 GlcCerase는 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 68%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 46%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 20%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 8%를 보유하였다.

GlcCerase-H145L의 추정 반감기 (편의상, 본 연구에서는 최초 효소 활성의 50% 상실을 초래하는 약 pH 7.5 및 약 37℃에서의 인큐베이션 시간으로 정의됨)는 대략 160분인 반면, 야생형 GlcCerase의 추정 반감기는 해당 실험 조건하에서 대략 50분이다.

실시예 6

상기한 검정을 사용하여, H145F 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("GlcCerase-H145F")을 정제된 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("야생형 GlcCerase")과 비교하였다. 변종 및 야생형 단백질에 대하여 사용된 조건은 동일하였다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, GlcCerase-H145F는 3시간의 시간 과정 동안 대략 중성인 pH 및 약 37℃에서 야생형 GlcCerase에 비해 상당히 더 안정하다. GlcCerase-H145F는 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 94%를 보유하였다. GlcCerase-H145F는 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 80%를 보유하였다. GlcCerase-H145F는 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 37%를 보유하였다. GlcCerase-H145F는 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 17%를 보유하였다. 비교하면, 동일 실험 조건하에서 처리된 야생형 GlcCerase는 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 68%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 46%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 20%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 8%를 보유하였다.

GlcCerase-H145F의 추정 반감기 (편의상, 본 연구에서는 최초 효소 활성의 50% 상실을 초래하는 약 pH 7.5 및 약 37℃에서의 인큐베이션 시간으로 정의됨)는 대략 100분인 반면, 야생형 GlcCerase의 추정 반감기는 해당 실험 조건하에서 대략 50분이다.

실시예 7

상기한 검정을 사용하여, F316A, L317F 및 K321N 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("GlcCerase-F316A/L317F/K321N")을 정제된 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("야생형 GlcCerase")과 비교하였다. 변종 및 야생형 단백질에 대하여 사용된 조건은 동일하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, GlcCerase-F316A/L317F/K321N은 3시간의 시간 과정 동안 대략 중성인 pH 및 약 37℃에서 야생형 GlcCerase에 비해 상당히 더 안정하다. GlcCerase-F316A/L317F/K321N은 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 101%를 보유하였다. GlcCerase-F316A/L317F/K321N은 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 91%를 보유하였다. GlcCerase-F316A/L317F/K321N은 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 75%를 보유하였다. GlcCerase-F316A/L317F/K321N은 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 52%를 보유하였다. 비교하면, 동일 실험 조건하에서 처리된 야생형 GlcCerase는 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 68%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 46%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 20%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 8%를 보유하였다.

GlcCerase-F316A/L317F/K321N의 추정 반감기 (편의상, 본 연구에서는 최초 효소 활성의 50% 상실을 초래하는 약 pH 7.5 및 약 37℃에서의 인큐베이션 시간으로 정의됨)는 대략 180분인 반면, 야생형 GlcCerase의 추정 반감기는 해당 실험 조건하에서 대략 50분이다.

실시예 8

상기한 검정을 사용하여, H145L, F316A 및 L317F 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("GlcCerase-H145L/F316A/L317F")을 정제된 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("야생형 GlcCerase")과 비교하였다. 변종 및 야생형 단백질에 대하여 사용된 조건은 동일하였다. GlcCerase-H145L/F316A/L317F는 3시간의 시간 과정 동안 대략 중성인 pH 및 약 37℃에서 야생형 GlcCerase에 비해 상당히 더 안정하다. GlcCerase-H145L/F316A/L317F는 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 대략 77%를 보유하였다. GlcCerase-H145L/F316A/L317FN은 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 80%를 보유하였다. GlcCerase-H145L/F316A/L317F는 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 56%를 보유하였다. GlcCerase-H145L/F316A/L317F는 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 39%를 보유하였다. 비교하면, 동일 실험 조건하에서 처리된 야생형 GlcCerase는 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 68%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 46%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 20%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 8%를 보유하였다.

GlcCerase-H145L/F316A/L317F의 추정 반감기 (편의상, 본 연구에서는 최초 효소 활성의 50% 상실을 초래하는 약 pH 7.5 및 약 37℃에서의 인큐베이션 시간으로 정의됨)는 대략 135분인 반면, 야생형 GlcCerase의 추정 반감기는 해당 실험 조건하에서 대략 50분이다.

실시예 9

상기한 검정을 사용하여, H145L 및 K321N 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("GlcCerase-H145L/K321N")을 정제된 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("야생형 GlcCerase")과 비교하였다. 변종 및 야생형 단백질에 대하여 사용된 조건은 동일하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, GlcCerase-H145L/K321N은 3시간의 시간 과정 동안 대략 중성인 pH 및 약 37℃에서 야생형 GlcCerase에 비해 상당히 더 안정하다. GlcCerase-H145L/K321N은 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 89%를 보유하였다. GlcCerase-H145L/K321N은 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 86%를 보유하였다. GlcCerase-H145L/K321N은 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 76%를 보유하였다. GlcCerase-H145L/K321N은 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 62%를 보유하였다. 비교하면, 동일 실험 조건하에서 처리된 야생형 GlcCerase는 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 68%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 46%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 20%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 8%를 보유하였다.

GlcCerase-H145L/K321N의 추정 반감기 (편의상, 본 연구에서는 최초 효소 활성의 50% 상실을 초래하는 약 pH 7.5 및 약 37℃에서의 인큐베이션 시간으로 정의됨)는 대략 180분인 반면, 야생형 GlcCerase의 추정 반감기는 해당 실험 조건하에서 대략 50분이다.

실시예 10

상기한 검정을 사용하여, K321A 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("GlcCerase-K321A")을 정제된 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("야생형 GlcCerase")과 비교하였다. 변종 및 야생형 단백질에 대하여 사용된 조건은 동일하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, GlcCerase-K321A는 3시간의 시간 과정 동안 대략 중성인 pH 및 약 37℃에서 야생형 GlcCerase에 비해 상당히 더 안정하다. GlcCerase-K321A는 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 90%를 보유하였다. GlcCerase-K321A는 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 89%를 보유하였다. GlcCerase-K321A는 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 68%를 보유하였다. GlcCerase-K321A는 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 49%를 보유하였다. 비교하면, 동일 실험 조건하에서 처리된 야생형 GlcCerase는 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 68%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 46%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 20%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 8%를 보유하였다.

GlcCerase-K321A의 추정 반감기 (편의상, 본 연구에서는 최초 효소 활성의 50% 상실을 초래하는 약 pH 7.5 및 약 37℃에서의 인큐베이션 시간으로 정의됨)는 대략 170분인 반면, 야생형 GlcCerase의 추정 반감기는 해당 실험 조건하에서 대략 50분이다.

실시예 11

상기한 검정을 사용하여, K321A 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("GlcCerase-K321V")을 정제된 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 ("야생형 GlcCerase")과 비교하였다. 변종 및 야생형 단백질에 대하여 사용된 조건은 동일하였다. GlcCerase-K321V는 3시간의 시간 과정 동안 대략 중성인 pH 및 약 37℃에서 야생형 GlcCerase에 비해 상당히 더 안정하다. GlcCerase-K321V는 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 74%를 보유하였다. GlcCerase-K321V는 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 55%를 보유하였다. GlcCerase-K321V는 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 29%를 보유하였다. GlcCerase-K321V는 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 15%를 보유하였다. 비교하면, 동일 실험 조건하에서 처리된 야생형 GlcCerase는 30분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 68%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 60분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 46%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 120분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 20%를 보유하였다. 야생형 GlcCerase는 180분의 인큐베이션 후 그의 최초 활성의 8%를 보유하였다.

GlcCerase-K321V의 추정 반감기 (편의상, 본 연구에서는 최초 효소 활성의 50% 상실을 초래하는 약 pH 7.5 및 약 37℃에서의 인큐베이션 시간으로 정의됨)는 대략 70분인 반면, 야생형 GlcCerase의 추정 반감기는 해당 실험 조건하에서 대략 50분이다.

상기 결과들을 하기 표 1에 요약하였다.

안전성 검정에서, 잔류 활성은 3시간 인큐베이션 후 남아 있는 효소 활성의 양으로써, 각 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 대하여 최초 효소 활성 (t=0분에서의 것)의%로 표현된다. 1회만 시험한 GlcCerase-K321V 및 GlcCerase-H145L/F316A/L317F 이외에는, 각 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 2회 이상의 별도 실험 (표 1에서는 n으로 표시)으로 시험하여, 3시간 시간 과정 동안의 평균 잔류 활성을 측정하였다. 배수-향상은 정제된 야생형 재조합 GlcCerase 단백질에 대비한 변종 재조합 GlcCerase 단백질의 겉보기 반감기 증가를 지칭한다.

야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 더 큰 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 할 수 있는, 위치 145, 316, 317 또는 321에 아미노산 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질, 또는 GlcCerase-F316A/L317F, GlcCerase-K321N, GlcCerase-K321A, GlcCerase-K321V, GlcCerase-H145L, GlcCerase-H145F, 또는 GlcCerase-F316A/L317F/K321N 또는 GlcCerase-F316A/L317F/K321A 또는 GlcCerase-F316A/L317F/K321V 또는 GlcCerase-H145L/F316A/L317F 또는 GlcCerase-H145L/K321N은 업계 숙련자에게 알려져 있는 분자 생물학 및 단백질 정제 기술을 사용하여 효모 세포, 식물 세포, 포유동물 세포 또는 트랜스제닉(transgenic) 동물에서 제조될 수 있다.

위치 145, 316, 317 또는 321에 아미노산 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질, 또는 GlcCerase-F316A/L317F, GlcCerase-K321N, GlcCerase-K321A, GlcCerase-K321V, GlcCerase-H145L, GlcCerase-H145F, 또는 GlcCerase-F316A/L317F/K321N 또는 GlcCerase-F316A/L317F/K321A 또는 GlcCerase-F316A/L317F/K321V 또는 GlcCerase-H145L/F316A/L317F 또는 GlcCerase-H145L/K321N과 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물은 업계 숙련자에게 알려져 있는 제약상 허용되는 담체를 사용하여 제조될 수 있다.

위치 145, 316, 317 또는 321에 아미노산 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질, 또는 GlcCerase-F316A/L317F, GlcCerase-K321N, GlcCerase-K321A, GlcCerase-K321V, GlcCerase-H145L, GlcCerase-H145F, 또는 GlcCerase-F316A/L317F/K321N 또는 GlcCerase-F316A/L317F/K321A 또는 GlcCerase-F316A/L317F/K321V 또는 GlcCerase-H145L/F316A/L317F 또는 GlcCerase-H145L/K321N과 제약상 허용되는 완충제를 포함하는 조성물은 업계 숙련자에게 알려져 있는 제약상 허용되는 완충제를 사용하여 제조될 수 있다.

실시예 12

리소좀 내에서는 GlcCerase 단백질이 산성 pH에서 안정하며 축적된 글루코실세라미드 기질을 청소함에 있어서 매우 효율적이기 때문에, 향상된 효능을 위해서는, 불리한 (중성 pH) 환경을 더 잘 견디어 그의 촉매 활성을 유지함으로써 더 많은 양의 활성 약물이 리소좀으로 전달되도록 할 수 있다면, 더 안정한 GlcCerase ERT가 개발될 수 있다. 활성 부위 효소 억제제인 이소파고민 (IFG)이 결합 (및 억제)할 경우, GlcCerase 효소는 대략 중성인 pH에서 안정화될 수 있다. 열 용융 온도 (Tm)의 15℃까지의 증가로 입증되는 바와 같이, 대략 중성인 pH에서의 재조합 GlcCerase의 단백질 안정성은 IFG에 의해 상당히 향상된다. IFG-유도 GlcCerase 안정화의 작용 기작은 활성 부위 및 주변 영역의 접힘해제(unfolding)를 제한하여 더 안정한 GlcCerase 입체형태를 유지하도록 해주는 IFG와 6개 GlcCerase 활성 부위 잔기들 사이의 광범위한 수소 결합 네트워크에 기인하는 것으로 여겨진다. 활성 부위 및 주변 영역에서 적정한 GlcCerase 구조를 유지하는 것은 촉매 활성 및 전체적인 GlcCerase 안정성에 도움이 된다. GlcCerase에 대한 수많은 상이한 변형들이 대략 중성인 pH에서 촉매 활성을 보유하고 더 안정한 단백질 구조를 유지하는 데에 도움이 될 수 있다. 본원에서는, 대략 중성인 pH에서 덜 쉽게 감김해제(unwinding)되는 경향이 있는 더 질서있는 활성 부위 부근 영역을 형성하는 데에 도움이 되는, 활성 부위 부근 루프 구조 내 전략적 위치에 특정 아미노산 치환을 가지는 일련의 상이한 GlcCerase 효소 구축물들을 제공한다. 또한 본원에서는, 해당 나선 및 인접 루프를 촉매 부위로부터 떼어냄으로써 개방된 활성의 입체형태를 유지하는 데에 도움이 될 수 있는, 활성 부위 부근 α-나선의 변형을 제공한다.

야생형 GlcCerase에 비해 뛰어난 단백질 안정성을 가질 것으로 예상되는 일련의 변형 GlcCerase 효소들을 생성시키는 접근법이 이용되었다. 주로, 하기 두 가지의 상이하지만 보완적인 전략이 사용되었다: (1) 사실상 효소를 억제하지 않고 바람직한 활성의 GlcCerase 입체형태를 모방하는, 촉매 부위 부근 소정 루프 및 나선의 변형; 및 (2) 향상된 단백질 안정성을 위한 상이한 잔기와 2차 구조들 사이의 상호작용을 향상시킬 수 있는, 랜덤 코일 영역의 변형.

일 예에서는, 대략 중성인 pH에서 쉽게 감김해제되려는 경향이 덜한 더 질서있는 영역을 활성 부위 부근에 형성하는 데에 도움이 되도록, 루프 1 영역 (위치 311-319) 내에서 몇 개의 잔기가 변형되었다. 루프 1 내에 변형을 가지는 이와 같은 변종 (GlcCerase-F316A/L317F)은 약 pH 7.5 및 37℃에서 GlcCerase에 비해 상당히 더 안정한 것으로 나타났다.

두 번째 예에서는, 활성 부위 부근의 α-나선 (α6)이 변형되었는데, 해당 나선을 안정화하고, 인접 루프 (루프 1)을 촉매 부위로부터 떼어냄으로써 개방된 활성의 입체형태를 유지하도록 의도되었다. 예컨대, 인접한 α-나선 및 β-구조와의 더 큰 소수성 상호작용을 촉진함으로써 단백질을 안정화하기 위하여, 나선 α6 내에서 하전된 리신 잔기를 비하전 잔기로 치환하는 아미노산 치환을 위치 321에 포함하는 변형 GlcCerase 효소가 생성되었다. 여러 종에 대하여 GlcCerase 효소의 단백질 정렬을 분석한 바 (표 II), B. 타우루스(B. taurus)의 GlcCerase 동종체 (소 GlcCerase; 접근 코드 DAA31806.1)가 위치 321에 아스파라긴 (³²¹Asn)을 포함하고 있다는 것에 주목하였다. 이는 위치 321의 리신 (³²¹Lys)이 잠재적으로 GlcCerase 촉매 활성의 훼손 없이 상이한 아미노산 잔기에 의해 치환될 수 있다는 것을 암시한다. GlcCerase-K321N은 약 pH 7.5 및 37℃에서 2 및 3시간 후에 각각 그의 원래 촉매 활성의 대략 75% 및 54%를 보유하였다. 반면, 야생형 GlcCerase는 동일 조건하에서 그의 최초 활성의 21% 및 8% 만을 보유하였다. GlcCerase-K321N의 추정 반감기는 야생형 GlcCerase보다 대략 3.5배 더 길었다. 유사하게, GlcCerase-K321A는 약 pH 7 및 37℃에서 2 및 3시간 후에 각각 그의 원래 촉매 활성의 대략 68% 및 49%를 보유하였다. GlcCerase-K321A의 추정 반감기는 야생형 GlcCerase보다 대략 3배 더 길었다. GlcCerase-K321V는 약 pH 7 및 37℃에서 2 및 3시간 후에 각각 그의 원래 촉매 활성의 대략 29% 및 15%를 보유하였다. GlcCerase-K321V의 추정 반감기는 야생형 GlcCerase보다 대략 1.4배 더 길었다. 이러한 데이터는 나선 α6 내의 양으로 하전된 리신 잔기를 제거하는 것이 이 영역을 더 질서있게 하여 해당 영역의 감김해제를 제한함으로써 더 큰 GlcCerase 단백질 안정성을 제공한다는 것을 보여준다.

세 번째 예에서는, 베타-시트 (β2)와 α-나선 (α2) 사이에서 랜덤 코일 영역이 변형되었는데, 이는 향상된 안정성을 위해 상이한 잔기와 2차 구조들 사이의 더 우수한 상호작용을 촉진할 수 있다. 다양한 종으로부터의 GlcCerase 효소들의 단백질 정렬 분석 (표 2)에 의해, 이와 같은 랜덤 코일 내의 위치 145가 상이한 종들 사이에서 서로 다른 것으로 드러났다. B. 타우루스 동종체 및 S. 스크로파(S. scrofa ) (돼지) 양자는 이 위치에 류신을 포함하는 반면, 뮤린의 GlcCerase는 세린을 포함한다. 이에 따라, 위치 145의 히스티딘 (¹⁴⁵His)을 Leu (H145L) 또는 Phe (H145F) 중 어느 하나로 치환함으로써, 이러한 변형이 GlcCerase의 안정성을 향상시키게 되는지를 확인하였다. GlcCerase-H145L GlcCerase는 야생형 GlcCerase에 비해 더 안정하며 2시간 후 그의 최초 활성의 62%, 3시간 후에는 42%를 보유하고, 야생형 GlcCerase에 비해 대략 3배 더 긴 반감기 (160분 대 50분)의 추정 반감기를 가지는 것으로 나타났다. 유사하게, GlcCerase H145F는 2시간 후 그의 최초 활성의 대략 37%, 3시간 후 17%를 보유하였으며, 야생형 GlcCerase에 비해 대략 2배 더 긴 반감기를 가졌다. 이러한 변형들이 어떻게 GlcCerase 구조에 영향을 주는지는 현재 알려져 있지 않지만, 부분적으로 하전된 잔기 (¹⁴⁵His)를 류신 또는 페닐알라닌 중 어느 하나의 소수성 잔기로 치환하는 것이 해당 영역을 더 질서있게 함으로써 해당 영역의 감김해제를 제한하는 것일 가능성이 있다. 다르게는, 이러한 변형들이 회전을 야기하여 2차 구조들 (예컨대 베타-시트 β2 및 나선 α2) 사이의 상호작용을 향상시킬 수도 있다.

단백질 정렬 데이터를 하기 표 2에 요약하였다.

적합한 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 단백질의 루프 1 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지고, 상기 하나 이상의 치환 아미노산은 단백질 활성 부위 부근의 질서를 증가시키는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 할 수도 있다. 이러한 단백질은 또한 단백질의 루프 1 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지고, 단백질 활성 부위 부근의 질서를 증가시키는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 하는 상기 하나 이상의 치환 아미노산은 약 pH3 내지 약 pH8 범위에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 더 안정한 것을 특징으로 할 수도 있다. 이러한 단백질은 또한 단백질의 루프 1 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지고, 단백질 활성 부위 부근의 질서를 증가시키는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 하는 상기 하나 이상의 치환 아미노산은 대략 중성인 pH에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 더 안정한 것을 특징으로 할 수도 있다. 이러한 단백질은 또한 단백질의 루프 1 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지고, 상기 하나 이상의 치환 아미노산은 약 pH3 내지 약 pH8 범위에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 쉽게 감김해제되는 경향이 덜한 것을 특징으로 할 수도 있다. 이러한 단백질은 또한 단백질의 루프 1 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지고, 상기 하나 이상의 치환 아미노산은 대략 중성인 pH에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 쉽게 감김해제되는 경향이 덜한 것을 특징으로 할 수도 있다.

적합한 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 단백질의 활성 부위 부근 α-나선 (α6)에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지고, 상기 하나 이상의 치환 아미노산 측은 해당 나선을 안정화하며, 인접 루프 1을 촉매 부위로부터 떼어내고, 개방된 활성의 입체형태를 가지는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 할 수도 있다. 이러한 단백질은 또한 단백질의 활성 부위 부근 α-나선 (α6)에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지고, 해당 나선을 안정화하며 인접 루프 1을 촉매 부위로부터 떼어내고 개방된 활성의 입체형태를 가지는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 하는 상기 하나 이상의 치환 아미노산 측은 약 pH3 내지 약 pH8 범위에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 더 안정한 것을 특징으로 할 수도 있다. 이러한 단백질은 또한 대략 중성인 pH에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 더 개방된 입체형태를 가지는 것을 특징으로 할 수도 있다. 이러한 단백질은 또한 단백질의 루프 1 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지고, 상기 하나 이상의 치환 아미노산은 약 pH3 내지 약 pH8 범위에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 더 개방된 입체형태를 가지는 것을 특징으로 할 수도 있다. 이러한 단백질은 또한 단백질의 루프 1 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지고, 상기 하나 이상의 치환 아미노산은 대략 중성인 pH에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 더 개방된 입체형태를 가지는 것을 특징으로 할 수도 있다.

적합한 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 베타-시트 (β2)와 α-나선 (α2) 사이 랜덤 코일 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지고, 상기 하나 이상의 치환 아미노산의 측쇄가 향상된 안정성을 위해 상이한 잔기와 2차 구조들 사이의 더 우수한 상호작용을 촉진하는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 할 수도 있다. 이러한 단백질은 또한 베타-시트 (β2)와 α-나선 (α2) 사이 랜덤 코일 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지고, 향상된 안정성을 위해 상이한 잔기와 2차 구조들 사이의 더 우수한 상호작용을 촉진하는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 하는 상기 하나 이상의 치환 아미노산의 측쇄가 약 pH3 내지 약 pH8 범위에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 더 안정한 것을 특징으로 할 수도 있다. 이러한 단백질은 또한 베타-시트 (β2)와 α-나선 (α2) 사이 랜덤 코일 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지고, 상기 하나 이상의 치환 아미노산의 측쇄가 대략 중성인 pH에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 향상된 안정성을 위해 상이한 잔기와 2차 구조들 사이의 더 우수한 상호작용을 촉진하는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 할 수도 있다. 이러한 단백질은 또한 베타-시트 (β2)와 α-나선 (α2) 사이 랜덤 코일 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지고, 상기 하나 이상의 치환 아미노산의 측쇄가 약 pH3 내지 약 pH8 범위에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 향상된 안정성을 위해 상이한 잔기와 2차 구조들 사이의 더 우수한 상호작용을 촉진하는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 할 수도 있다. 이러한 단백질은 또한 베타-시트 (β2)와 α-나선 (α2) 사이 랜덤 코일 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 가지고, 상기 하나 이상의 치환 아미노산의 측쇄가 대략 중성인 pH에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 향상된 안정성을 위해 상이한 잔기와 2차 구조들 사이의 더 우수한 상호작용을 촉진하는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 할 수도 있다.

리소좀성 축적 질환의 적합한 치료 방법은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 특이적 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다.

리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 하기 위치들: 316, 317, 321 및 145 중 하나 이상에 아미노산 변이를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 아미노산 변이 316A 및 L317F를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 아미노산 변이 K321N을 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 아미노산 변이 K321A를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 아미노산 변이 K321V를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 아미노산 변이 H145L을 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 아미노산 변이 H145F를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 아미노산 변이 F316A, L317F 및 K321N을 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 아미노산 변이 F316A, L317F 및 K321A를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 아미노산 변이 F316A, L317F 및 K321V를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 아미노산 변이 H145L, F316A 및 L317F를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 아미노산 변이 H145L 및 K321N을 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 아미노산 변이 H145L 및 K321A를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 또한 아미노산 변이 H145L 및 K321V를 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함할 수도 있다. 리소좀성 축적 질환의 치료 방법은 고셔병의 치료 방법을 포함할 수도 있다. 치료 방법은 정맥내 주입에 의한 것, 근육내 주사에 의한 것, 또는 업계 숙련자에게 알려져 있는 기타 투여 경로에 의한 것일 수 있다.

적합한 화합물은 하기 아미노산 서열들: 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 또는 서열 16 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 포함할 수 있다. 적합한 화합물은 하기 아미노산 서열들: 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 또는 서열 16 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 포함할 수 있다.

적합한 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 발현을 할 수 있는 것을 특징으로 할 수도 있다. 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 발현은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 10% 이상 증가될 수도 있다. 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 발현은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 25% 이상 증가될 수도 있다. 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 발현은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 50% 이상 증가될 수도 있다. 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 발현은 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 80% 이상 증가될 수도 있다. 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 포유동물 세포, 트랜스제닉 동물 또는 효모 세포에서 발현될 수도 있다. 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 인간에서 발현될 수도 있다. 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질은 삽입된 유전자로부터 발현될 수도 있다.

실시예 13

야생형 GlcCerase에 비교한 해당 변종 GlcCerase 효소의 상대적인 발현을 평가하기 위하여, 이전에 언급된 방법에 따라 세포 배양물에서 변종 재조합 GlcCerase 단백질 및 야생형 GlcCerase를 발현시켰다. 일시적 형질감염 실험에서 형질감염 약 48시간 후 컨디셔닝된 배지로부터의 효소 활성으로 측정하였을 때, 수많은 상이한 변종 GlcCerase 효소들이 야생형 GlcCerase에 비해 더 우수하게 발현되었다 (도 1). GlcCerase-F316A/L317A는 야생형 GlcCerase에 비해 더 우수하게 발현되었으며 (약 282%), GlcCerase-K321N은 야생형 GlcCerase에 비해 더 우수하게 발현되었고 (약 272%), GlcCerase-H145L은 야생형 GlcCerase에 비해 더 우수하게 발현되었고 (약 157%), GlcCerase-F316A/L317A/K321N은 야생형 GlcCerase에 비해 더 우수하게 발현되었고 (약 272%), GlcCerase-H145L/K321N은 야생형 GlcCerase에 비해 더 우수하게 발현되었다 (약 317%). GlcCerase-K321A는 야생형 GlcCerase와 동등하게 발현된 반면, GlcCerase-K321V는 야생형에 비해 더 낮은 수준으로 발현되었다 (약 61%) (데이터 미도시).

또한 하기 아미노산 서열들: 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 또는 서열 16 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 포함하는 화합물의 제조 방법이 본원에 제공된다. 또한 하기 아미노산 서열들: 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 또는 서열 16 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 코딩하는 핵산의 제조 방법이 본원에 제공된다.

실시예 14

야생형 및 변형 GlcCerase 효소를 위한 플라스미드 구축

올리고뉴클레오티드 프라이머 (표 3에 목록화), 또는 특정 아미노산 치환을 가지는 GlcCerase의 단편을 코딩하는 합성 DNA 미니유전자(minigene) (>400 bp)를 사용하여, 야생형 및 변형 GlcCerase 효소의 발현을 위한 DNA 플라스미드를 생성시켰다. 모든 프라이머 및 합성 DNA 미니유전자들은 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스(Integrated DNA Technologies)™ (아이오와 코랄빌 소재)로부터 구매하였다. PCR 및 포유동물 발현 벡터로의 결찰에 의해 GlcCerase cDNA를 생성시킴으로써, 야생형 인간 GlcCerase (pHD101로 지칭)를 구축하였다. 간단하게 말하자면, 퓨젼(Phusion)-HF 고성능 DNA 폴리머라제™ (NEB™) 및 200 μM dNTP를 통해, 2개의 동일한 50 μl 반응액 중 프라이머 A & B 및 인간 GlcCerase cDNA 클론 (오리젠™) 주형 DNA를 사용하여, 해당 자연 코자크(Kozak) 서열 및 중지 코돈과 함께 전체 야생형 인간 GlcCerase cDNA를 증폭하였다. 프라이머 A는 코자크 서열 직전에 선행하는 5' BglII 및 내부 EcoRI 제한 부위를 포함하도록 구축된 반면, 프라이머 B는 중지 코돈에 후속하는 3' NheI 및 NotI 제한 부위를 포함함으로써, 발현 벡터로의 PCR 생성물의 클로닝을 가능케 하도록 하였다. PCR 반응액을 혼합하고, 생성되는 ~1.6 킬로베이스 (kb) PCR 생성물을 1% (w/v) 아가로스 정제용 겔로부터 분리 및 절제한 후, 키아젠™ 겔 추출 키트를 사용하여 단리하였다. 이후, 제한 엔도뉴클레아제 BglII 및 NotI을 사용하여 37℃에서 밤새 PCR 생성물을 소화시킨 후, 키아젠™ PCR 클린업(cleanup) 키트를 사용하여 제조자의 지침에 따라 재-정제하였다. 포유동물 발현 벡터인 pEF6/V5-HisA™를 BamHI 및 NotI으로 소화한 후, 남극 포스파타제™를 사용하여 탈인산화하고, 키아젠™ PCR 클린업 키트를 사용하여 단리하였다. T4 DNA 리가제 (NEB™)를 사용하여 제조자의 지침에 따라 BglII-NotI 소화 PCR 생성물 (2 μl)를 BamHI-NotI pEF6/V5-HisA™ 벡터 (1 μl)에 결찰시켰다. 1 μl의 결찰 반응액을 사용하여 화학적-적격 이. 콜라이 세포를 형질전환시키고, 100 ㎍/ml의 암피실린을 함유하는 루리아-베르타니(Luria-Bertani) (LB) 아가 플레이트에 도말한 후, 37℃에서 밤새 인큐베이팅함으로써, 암피실린 저항성을 부여하는 β-락타마제 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA로 형질전환된 뚜렷한 세균 콜로니를 형성시켰다. 개별 암피실린-저항성 세균 콜로니들을 채취하여 4 ml LB 브로스 (100 ㎍/ml의 암피실린 함유) 중에서 37℃로 밤새 확장시키고, 다음날 미니프레프™ (키아젠™)에 의해 제조자의 지침에 따라 플라스미드 DNA를 단리하였다. 각각 EcoRI & NheI 및 BamHI을 사용한 2종의 상이한 제한 소화 반응에 의해, 단리된 플라스미드 DNA를 확인하였다. 클론 4로부터의 적정 플라스미드 DNA (pHD101.4로 지칭)를 선택하여, 플라스미드 DNA의 고-수준 복제를 위해 상기한 바와 같이 적격 이. 콜라이 세포를 형질전환하는 데에 사용하였다. 다음에, LB 아가-암피실린 플레이트로부터의 콜로니를 채취하여, 200 ml의 LB 브로스에서 37℃로 밤새 성장시킨 후, 막시프레프(Maxiprep)™ (프로메가™)에 의해 플라스미드 pHD101.4를 단리하였다. DNA 서열분석에 의해 플라스미드 pHD101.4 (야생형 인간 GlcCerase cDNA 코딩)를 확인한 후, 다른 GlcCerase 효소의 구축 및 일시적 형질감염 실험에 사용하였다.

pEF6/V5-HisA™ 벡터의 부합하는 BamHI 부위로의 BglII-소화 GlcCerase PCR 생성물의 결찰이 멀티플 클로닝 부위 내의 BamHI 제한 부위를 제거하도록, BglII 제한 부위를 프라이머 1에 도입하였는데, 이와 같은 변형 발현 벡터는 이하 pEF6'로 지칭될 것이다. pEF6/V5-HisA™ 내에서의 이와 같은 BamHI 부위의 제거는 변형된 GlcCerase 효소를 생성시키기 위하여 특정 뉴클레오티드 치환을 가지는 DNA 단편을 삽입하는 데에 GlcCerase cDNA 내 고유 BamHI 부위가 이용될 수 있도록 하는 데에 필요하다.

GlcCerase-F316A/L317F (pHD105로 지칭)를 생성시키기 위하여, 자연 측접(flanking) 5' BsrGI 및 3' BamHI 제한 부위 사이에서의 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스™에 의해 해당 아미노산 치환을 포함하는 GlcCerase 미니유전자를 합성하였다. BsrGI 및 BamHI 제한 소화에 의해 pIDTSMART™ 플라스미드로부터 합성 변형 GlcCerase DNA 단편 (~0.5 kb)을 방출시키고, 이후 정제용 1% 아가로스 겔에 의해 단리한 후, 미리 BsrGI 및 BamHI으로 소화시켜 탈인산화한 pHD101.4에 인-프레임(in-frame) 결찰시켰다. 이 결찰 반응액 1 마이크로리터를 사용하여 적격 이. 콜라이 세포를 형질전환시킨 후, pHD101에 대하여 상기한 바와 같이 샘플을 처리하였다. 개별 클론으로부터 미니프레프 DNA를 단리하여, EcoRI 및 XbaI을 사용한 제한 소화에 의해 시험하였다. 클론 5 (pHD105.5로 지칭)를 선택하여, DNA 서열분석에 의해 확인한 후, 추가 특성화에 사용하였다.

GlcCerase-K321N (pHD109로 지칭)을 생성시키기 위하여, 중첩(overlap) PCR에 의해 아미노산 치환을 도입하였다. 간단하게 말하자면, PCR 반응 1에서 프라이머 A & D 및 주형 DNA로서의 pHD101.4를 사용하여 N-말단 단편 (~1.1 kb)을 생성시키는 동시에, PCR 반응 2에서 프라이머 B & C 및 pHD101.4 주형을 사용하여 C-말단 단편 (~0.5 kb)을 생성시켰다. 다음에, PCR 반응 A & B로부터의 1 μl 및 프라이머 1 & 2를 첨가하는 것에 의해, PCR 반응 3에서 전체 K321N GlcCerase cDNA를 합성하였다. 전기와 같이 정제용 1% 아가로스 겔로부터 생성되는 PCR 생성물 3 (~1.6 kb)을 단리한 후, EcoRI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켰다. PCR 생성물 3을 재-정제한 후, EcoRI/NotI-소화 및 탈인산화된 pEF6' 벡터에 결찰시키고, 상기한 바와 같이 처리하였다. 개별 클론으로부터 미니프레프 DNA를 단리하여, EcoRI 및 XbaI을 사용한 제한 소화에 의해 시험하였다. 클론 3 (pHD109.3으로 지칭)을 선택하여, DNA 서열분석에 의해 확인한 후, 추가 특성화에 사용하였다.

GlcCerase-H145L (pHD110으로 지칭)을 생성시키기 위하여, 중첩 PCR에 의해 아미노산 치환을 도입하였다. PCR 반응 4에서 프라이머 A & F 및 pHD101.4 주형 DNA를 사용하여 N-말단 단편 (~0.55 kb)을 생성시키는 동시에, PCR 반응 5에서 프라이머 B & E 및 pHD101.4 주형을 사용하여 C-말단 단편 (~1 kb)을 생성시켰다. PCR 반응 4 & 5로부터의 1 μl 및 프라이머 A & B를 첨가하는 것에 의해, PCR 반응 6에서 전체 H145L GlcCerase cDNA를 생성시켰다. 전기와 같이 정제용 1% 아가로스 겔로부터 생성되는 PCR 생성물 6 (~1.6 kb)을 단리한 후, EcoRI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켰다. PCR 생성물 6을 재-정제한 후, EcoRI/NotI-소화 및 탈인산화된 pEF6' 벡터에 결찰시키고, 전기한 바와 같이 처리하였다. 개별 클론으로부터 미니프레프 DNA를 단리하여, EcoRI 및 XbaI을 사용한 제한 소화에 의해 시험하였다. 클론 2 (pHD110.2로 지칭)를 선택하여, DNA 서열분석에 의해 확인한 후, 추가 특성화에 사용하였다.

GlcCerase-H145F (pHD111로 지칭)를 생성시키기 위하여, 중첩 PCR에 의해 아미노산 치환을 도입하였다. PCR 반응 7에서 프라이머 A & H 및 pHD101.4 주형 DNA를 사용하여 N-말단 단편 (~0.55 kb)을 생성시키는 동시에, PCR 반응 8에서 프라이머 B & G 및 pHD101.4 주형을 사용하여 C-말단 단편 (~1 kb)을 생성시켰다. PCR 반응 7 & 8로부터의 1 μl 및 프라이머 A & B를 첨가하는 것에 의해, PCR 반응 9에서 전체 H145L GlcCerase cDNA를 생성시켰다. 전기와 같이 정제용 1% 아가로스 겔로부터 생성되는 PCR 생성물 9 (~1.6 kb)를 단리한 후, EcoRI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켰다. PCR 생성물 9를 재-정제한 후, EcoRI/NotI-소화 및 탈인산화된 pEF6' 벡터에 결찰시키고, 전기한 바와 같이 처리하였다. 개별 클론으로부터 미니프레프 DNA를 단리하여, EcoRI 및 XbaI을 사용한 제한 소화에 의해 시험하였다. 클론 1 (pHD111.1로 지칭)을 선택하여, DNA 서열분석에 의해 확인한 후, 추가 특성화에 사용하였다.

GlcCerase-F316A/L317F/K321N (pHD112로 지칭)를 생성시키기 위하여, 중첩 PCR에 의해 pHD105.5에 아미노산 치환을 도입하였다. PCR 반응 10에서 프라이머 A & D 및 pHD105.5 주형 DNA를 사용하여 N-말단 단편 (~1.1 kb)을 생성시키는 동시에, PCR 반응 11에서 프라이머 B & C 및 pHD105.5 주형을 사용하여 C-말단 단편 (~0.5 kb)을 생성시켰다. PCR 반응 10 & 11로부터의 1 μl 및 프라이머 A & B를 첨가하는 것에 의해, PCR 반응 12에서 전체 F316A/L317F/K321N GlcCerase cDNA를 생성시켰다. 전기와 같이 정제용 1% 아가로스 겔로부터 생성되는 PCR 생성물 12 (~1.6 kb)를 단리한 후, EcoRI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켰다. PCR 생성물 12를 재-정제한 후, 상기한 바와 같이 EcoRI/NotI-소화 및 탈인산화된 pEF6' 벡터에 결찰시켰다. 개별 클론으로부터 미니프레프 DNA를 단리하여, EcoRI 및 XbaI을 사용한 제한 소화에 의해 시험하였다. 클론 7 (pHD112.7로 지칭)을 선택하여, DNA 서열분석에 의해 확인한 후, 추가 특성화에 사용하였다.

GlcCerase-H145L/F316A/L317F (pHD113으로 지칭)를 생성시키기 위하여, 중첩 PCR에 의해 pHD105.5에 아미노산 치환을 도입하였다. PCR 반응 13에서 프라이머 A & F 및 pHD105.5 주형 DNA를 사용하여 N-말단 단편 (~0.55 kb)을 생성시키는 동시에, PCR 반응 14에서 프라이머 B & E 및 pHD105.5 주형을 사용하여 C-말단 단편 (~1 kb)을 생성시켰다. PCR 반응 13 & 14로부터의 1 μl 및 프라이머 A & B를 첨가하는 것에 의해, PCR 반응 15에서 전체 H145L/F316A/L317F GlcCerase cDNA를 생성시켰다. 전기와 같이 정제용 1% 아가로스 겔로부터 생성되는 PCR 생성물 15 (~1.6 kb)를 단리한 후, EcoRI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켰다. PCR 생성물 15를 재-정제한 후, 전기한 바와 같이 EcoRI/NotI-소화 및 탈인산화된 pEF6' 벡터에 결찰시켰다.

GlcCerase-H145F/F316A/L317F (pHD114로 지칭)를 생성시키기 위하여, 중첩 PCR에 의해 pHD105.5에 아미노산 치환을 도입하였다. PCR 반응 16에서 프라이머 A & H 및 pHD105.5 주형 DNA를 사용하여 N-말단 단편 (~0.55 kb)을 생성시키는 동시에, PCR 반응 17에서 프라이머 B & G 및 pHD105.5 주형을 사용하여 C-말단 단편 (~1 kb)을 생성시켰다. PCR 반응 16 & 17로부터의 1 μl 및 프라이머 A & B를 첨가하는 것에 의해, PCR 반응 18에서 전체 H145F/F316A/L317F GlcCerase cDNA를 생성시켰다. 전기와 같이 정제용 1% 아가로스 겔로부터 생성되는 PCR 생성물 18 (~1.6 kb)을 단리한 후, EcoRI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켰다. PCR 생성물 18을 재-정제한 후, 전기한 바와 같이 EcoRI/NotI-소화 및 탈인산화된 pEF6' 벡터에 결찰시켰다.

GlcCerase-H145L/K321N (pHD115로 지칭)를 생성시키기 위하여, BsrGI 및 BamHI 제한 효소를 사용하여 pHD109.3 및 pHD110.2 양자를 소화시킨 후, pHD109.3으로부터의 ~0.5 kb 단편 및 pHD110.2로부터의 ~6.9 kb 단편을 (남극 포스파타제로 처리한 후) 정제용 1% 아가로스 겔에 의해 단리하였다. 다음에, pHD109.3으로부터의 ~0.5 kb 단편 (K321N 아미노산 치환 포함)을 플라스미드 pHD110.2 (H145L 변형 포함)에 인-프레임 결찰시킨 후, 전기한 바와 같이 처리하였다. 개별 클론으로부터 미니프레프 DNA를 단리하여, EcoRI 및 XbaI을 사용한 제한 소화에 의해 시험하였다. 클론 5를 선택하여, DNA 서열분석에 의해 확인한 후, 추가 특성화에 사용하였다.

GlcCerase-H145L/F316A/L317F/K321N (pHD116으로 지칭)을 생성시키기 위해서는, BsrGI 및 BamHI 제한 효소를 사용하여 pHD112.7 및 pHD110.2 양자를 소화시킨 후, pHD112.7로부터의 ~0.5 kb 단편 및 pHD110.2로부터의 ~6.9 kb 단편을 (남극 포스파타제™로 처리한 후) 정제용 1% 아가로스 겔에 의해 단리하게 된다. pHD112.7으로부터의 ~0.5 kb 단편 (F316A/L317F/K321N 아미노산 치환 포함)을 플라스미드 pHD110.2 (H145L 변형 포함)에 인-프레임 결찰시킨 후, 전기한 바와 같이 처리하게 된다. 개별 클론으로부터 미니프레프 DNA를 단리하여, EcoRI 및 XbaI을 사용한 제한 소화에 의해 시험함으로써, 적정한 GlcCerase-H145L/F316A/L317F/K321A cDNA를 가지는 형질전환 세균 균주를 식별하게 된다. 선택된 DNA 구축물을 DNA 서열분석에 의해 확인한 후, 추가 특성화에 사용하게 된다.

GlcCerase-K321A (pHD117로 지칭)를 생성시키기 위하여, 중첩 PCR에 의해 아미노산 치환을 도입하였다. 간단하게 말하자면, PCR 반응 19에서 프라이머 A & J 및 주형 DNA로서의 pHD101.4를 사용하여 N-말단 단편 (~1.1 kb)을 생성시키는 동시에, PCR 반응 20에서 프라이머 B & I 및 pHD101.4 주형을 사용하여 C-말단 단편 (~0.5 kb)을 생성시켰다. 정제용 1% 아가로스 겔에 의해 PCR 생성물 19 및 20을 단리한 후, PCR 반응 21에서 프라이머 A & B를 사용하여 전체 K321A GlcCerase cDNA 단편을 합성하는 데에 주형 DNA로서 사용하였다. 전기와 같이 정제용 1% 아가로스 겔로부터 생성되는 PCR 생성물 21 (~1.6 kb)을 단리한 후, EcoRI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켰다. PCR 생성물 21을 재-정제한 후, EcoRI/NotI-소화 및 탈인산화된 pEF6' 벡터에 결찰시키고, 상기한 바와 같이 처리하였다. 개별 클론으로부터 미니프레프 DNA를 단리하여, EcoRI 및 XbaI을 사용한 제한 소화에 의해 시험하였다. 클론 1 (pHD117.1로 지칭)을 선택하여, 추가 특성화에 사용하였다.

GlcCerase-K321V (pHD118로 지칭)를 생성시키기 위하여, 중첩 PCR에 의해 아미노산 치환을 도입하였다. 간단하게 말하자면, PCR 반응 22에서 프라이머 A & L 및 주형 DNA로서의 pHD101.4를 사용하여 N-말단 단편 (~1.1 kb)을 생성시키는 동시에, PCR 반응 23에서 프라이머 B & K 및 pHD101.4 주형을 사용하여 C-말단 단편 (~0.5 kb)을 생성시켰다. 정제용 1% 아가로스 겔에 의해 PCR 생성물 22 및 23을 단리한 후, PCR 반응 24에서 프라이머 A & B를 사용하여 전체 K321A GlcCerase cDNA 단편을 합성하는 데에 주형 DNA로서 사용하였다. 전기와 같이 정제용 1% 아가로스 겔로부터 생성되는 PCR 생성물 24 (~1.6 kb)를 단리한 후, EcoRI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시켰다. PCR 생성물 24를 재-정제한 후, EcoRI/NotI-소화 및 탈인산화된 pEF6' 벡터에 결찰시키고, 상기한 바와 같이 처리하였다. 개별 클론으로부터 미니프레프 DNA를 단리하여, EcoRI 및 XbaI을 사용한 제한 소화에 의해 시험하였다. 클론 7 (pHD118.7로 지칭)을 선택하여, 추가 특성화에 사용하였다.

GlcCerase-F316A/L317F/K321A (pHD119로 지칭)를 생성시키기 위해서는, 중첩 PCR에 의해 pHD105.5에 아미노산 치환을 도입하게 된다. PCR 반응 25에서 프라이머 A & J 및 pHD105.5 주형 DNA를 사용하여 N-말단 단편 (~1.1 kb)을 생성시키는 동시에, PCR 반응 26에서 프라이머 B & I 및 pHD105.5 주형을 사용하여 C-말단 단편 (~0.5 kb)을 생성시키게 된다. 정제용 1% 아가로스 겔에 의해 PCR 생성물 25 및 26을 단리한 후, PCR 반응 27에서 프라이머 A & B를 사용하여 전체 F316A/L317F/K321A/K321A GlcCerase cDNA 단편을 합성하는 데에 주형 DNA로서 사용하게 된다. 전기와 같이 정제용 1% 아가로스 겔로부터 생성되는 PCR 생성물 27 (~1.6 kb)을 단리한 후, EcoRI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키게 된다. PCR 생성물 27을 재-정제한 후, 상기한 바와 같이 EcoRI/NotI-소화 및 탈인산화된 pEF6' 벡터에 결찰시키게 된다. 개별 클론으로부터 미니프레프 DNA를 단리하여, EcoRI 및 XbaI을 사용한 제한 소화에 의해 시험함으로써, 적정한 GlcCerase-F316A/L317F/K321A cDNA를 가지는 형질전환 세균 균주를 식별하게 된다. 선택된 DNA 구축물을 DNA 서열분석에 의해 확인한 후, 추가 특성화에 사용하게 된다.

GlcCerase-F316A/L317F/K321V (pHD120으로 지칭)를 생성시키기 위해서는, 중첩 PCR에 의해 pHD105.5에 아미노산 치환을 도입하게 된다. PCR 반응 28에서 프라이머 A & L 및 pHD105.5 주형 DNA를 사용하여 N-말단 단편 (~1.1 kb)을 생성시키는 동시에, PCR 반응 29에서 프라이머 B & K 및 pHD105.5 주형을 사용하여 C-말단 단편 (~0.5 kb)을 생성시키게 된다. 정제용 1% 아가로스 겔에 의해 PCR 생성물 28 및 29를 단리한 후, PCR 반응 30에서 프라이머 A & B를 사용하여 전체 F316A/L317F/K321A/K321V GlcCerase cDNA 단편을 합성하는 데에 주형 DNA로서 사용하게 된다. 전기와 같이 정제용 1% 아가로스 겔로부터 생성되는 PCR 생성물 30 (~1.6 kb)을 단리한 후, EcoRI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제로 소화시키게 된다. PCR 생성물 30을 재-정제한 후, 상기한 바와 같이 EcoRI/NotI-소화 및 탈인산화된 pEF6' 벡터에 결찰시키게 된다. 개별 클론으로부터 미니프레프 DNA를 단리하여, EcoRI 및 XbaI을 사용한 제한 소화에 의해 시험함으로써, 적정한 GlcCerase-F316A/L317F/K321V cDNA를 가지는 형질전환 세균 균주를 식별하게 된다. 선택된 DNA 구축물을 DNA 서열분석에 의해 확인한 후, 추가 특성화에 사용하게 된다.

GlcCerase-H145L/K321A (pHD121로 지칭)를 생성시키기 위해서는, BsrGI 및 BamHI 제한 효소를 사용하여 pHD117.1 및 pHD110.2 양자를 소화시킨 후, pHD117.1로부터의 ~0.5 kb 단편 및 pHD110.2로부터의 ~6.9 kb 단편을 (남극 포스파타제™로 처리한 후) 정제용 1% 아가로스 겔에 의해 단리하게 된다. pHD117.1로부터의 ~0.5 kb 단편 (K321A 아미노산 치환 포함)을 플라스미드 pHD110.2 (H145L 변형 포함)에 인-프레임 결찰시킨 후, 전기한 바와 같이 처리하게 된다. 개별 클론으로부터 미니프레프 DNA를 단리하여, EcoRI 및 XbaI을 사용한 제한 소화에 의해 시험함으로써, 적정한 GlcCerase-H145L/K321A cDNA를 가지는 형질전환 세균 균주를 식별하게 된다. 선택된 DNA 구축물을 DNA 서열분석에 의해 확인한 후, 추가 특성화에 사용하게 된다.

GlcCerase-H145L/K321V (pHD122로 지칭)를 생성시키기 위해서는, BsrGI 및 BamHI 제한 효소를 사용하여 pHD118.7 및 pHD110.2 양자를 소화시킨 후, pHD118.7로부터의 ~0.5 kb 단편 및 pHD110.2로부터의 ~6.9 kb 단편을 (남극 포스파타제로 처리한 후) 정제용 1% 아가로스 겔에 의해 단리하게 된다. pHD118.7로부터의 ~0.5 kb 단편 (K321V 아미노산 치환 포함)을 플라스미드 pHD110.2 (H145L 변형 포함)에 인-프레임 결찰시킨 후, 전기한 바와 같이 처리하게 된다. 개별 클론으로부터 미니프레프 DNA를 단리하여, EcoRI 및 XbaI을 사용한 제한 소화에 의해 시험함으로써, 적정한 GlcCerase-H145L/K321V cDNA를 가지는 형질전환 세균 균주를 식별하게 된다. 선택된 DNA 구축물을 DNA 서열분석에 의해 확인한 후, 추가 특성화에 사용하게 된다.

하기 표 3에 변형 GlcCerase 효소 구축용으로 상기 언급된 프라이머 서열들을 요약하였다.

본 발명이 그의 구체적인 실시양태와 연계되어 기술되기는 하였지만, 업계 숙련자라면, 많은 다른 변종 및 변형들, 그리고 다른 용도들이 눈에 보일 것이다. 따라서, 바람직하게는, 본 발명은 본원의 구체적인 개시내용에 의한 것이 아니라, 첨부된 청구범위에 의해서만 기술되어야 한다.

서열

서열 1

서열 2

서열 3

서열 4

서열 5

서열 6

서열 7

서열 8

서열 9

서열 10

서열 11

서열 12

서열 13

서열 14

서열 15

서열 16

SEQUENCE LISTING <110> DO, Hung <120> VARIANT, RECOMBINANT BETA-GLUCOCEREBROSIDASE PROTEINS WITH INCREASED STABILITY AND INCREASED RETAINED CATALYTIC ACTIVITY <130> CALL-0013 <150> US 61/411,331 <151> 2010-11-08 <160> 36 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 497 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human source organism, but with engineered mutation <400> 1 Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys 1 5 10 15 Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro 20 25 30 Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg 35 40 45 Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly 50 55 60 Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu 85 90 95 Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu 100 105 110 Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe 115 120 125 Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu 130 135 140 His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu 145 150 155 160 Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala 165 170 175 Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn 180 185 190 Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr 195 200 205 Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys 210 215 220 Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235 240 Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln 245 250 255 Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr 260 265 270 His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu 275 280 285 Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr 290 295 300 Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala 305 310 315 320 Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu 325 330 335 Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val 340 345 350 Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile 355 360 365 Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala 370 375 380 Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser 385 390 395 400 Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met 405 410 415 Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln 420 425 430 Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala 435 440 445 Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser 450 455 460 Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu 465 470 475 480 Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg 485 490 495 Gln <210> 2 <211> 497 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human source organism, but with engineered mutation <400> 2 Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys 1 5 10 15 Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro 20 25 30 Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg 35 40 45 Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly 50 55 60 Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu 85 90 95 Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu 100 105 110 Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe 115 120 125 Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu 130 135 140 His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu 145 150 155 160 Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala 165 170 175 Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn 180 185 190 Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr 195 200 205 Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys 210 215 220 Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235 240 Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln 245 250 255 Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr 260 265 270 His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu 275 280 285 Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr 290 295 300 Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Ala Phe Ala Pro Ala 305 310 315 320 Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu 325 330 335 Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val 340 345 350 Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile 355 360 365 Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala 370 375 380 Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser 385 390 395 400 Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met 405 410 415 Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln 420 425 430 Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala 435 440 445 Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser 450 455 460 Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu 465 470 475 480 Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg 485 490 495 Gln <210> 3 <211> 497 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human source organism, but with engineered mutation <400> 3 Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys 1 5 10 15 Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro 20 25 30 Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg 35 40 45 Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly 50 55 60 Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu 85 90 95 Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu 100 105 110 Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe 115 120 125 Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu 130 135 140 His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu 145 150 155 160 Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala 165 170 175 Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn 180 185 190 Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr 195 200 205 Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys 210 215 220 Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235 240 Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln 245 250 255 Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr 260 265 270 His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu 275 280 285 Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr 290 295 300 Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala 305 310 315 320 Asn Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu 325 330 335 Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val 340 345 350 Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile 355 360 365 Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala 370 375 380 Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser 385 390 395 400 Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met 405 410 415 Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln 420 425 430 Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala 435 440 445 Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser 450 455 460 Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu 465 470 475 480 Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg 485 490 495 Gln <210> 4 <211> 497 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human source organism, but with engineered mutation <400> 4 Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys 1 5 10 15 Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro 20 25 30 Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg 35 40 45 Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly 50 55 60 Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu 85 90 95 Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu 100 105 110 Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe 115 120 125 Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu 130 135 140 Leu Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu 145 150 155 160 Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala 165 170 175 Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn 180 185 190 Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr 195 200 205 Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys 210 215 220 Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235 240 Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln 245 250 255 Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr 260 265 270 His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu 275 280 285 Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr 290 295 300 Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala 305 310 315 320 Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu 325 330 335 Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val 340 345 350 Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile 355 360 365 Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala 370 375 380 Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser 385 390 395 400 Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met 405 410 415 Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln 420 425 430 Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala 435 440 445 Leu Met His Pro Asp 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Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu 145 150 155 160 Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala 165 170 175 Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn 180 185 190 Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr 195 200 205 Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys 210 215 220 Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235 240 Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln 245 250 255 Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr 260 265 270 His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu 275 280 285 Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr 290 295 300 Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Ala Phe Ala Pro Ala 305 310 315 320 Ala Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu 325 330 335 Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val 340 345 350 Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile 355 360 365 Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala 370 375 380 Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser 385 390 395 400 Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met 405 410 415 Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln 420 425 430 Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala 435 440 445 Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser 450 455 460 Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu 465 470 475 480 Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg 485 490 495 Gln <210> 14 <211> 497 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human source organism, but with engineered mutation <400> 14 Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys 1 5 10 15 Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro 20 25 30 Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg 35 40 45 Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly 50 55 60 Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu 85 90 95 Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu 100 105 110 Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe 115 120 125 Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu 130 135 140 His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu 145 150 155 160 Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala 165 170 175 Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn 180 185 190 Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr 195 200 205 Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys 210 215 220 Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235 240 Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln 245 250 255 Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr 260 265 270 His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu 275 280 285 Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr 290 295 300 Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Ala Phe Ala Pro Ala 305 310 315 320 Val Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu 325 330 335 Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val 340 345 350 Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile 355 360 365 Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala 370 375 380 Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser 385 390 395 400 Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met 405 410 415 Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln 420 425 430 Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala 435 440 445 Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser 450 455 460 Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu 465 470 475 480 Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg 485 490 495 Gln <210> 15 <211> 497 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human source organism, but with engineered mutation <400> 15 Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys 1 5 10 15 Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro 20 25 30 Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg 35 40 45 Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly 50 55 60 Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu 85 90 95 Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu 100 105 110 Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe 115 120 125 Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu 130 135 140 Leu Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu 145 150 155 160 Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala 165 170 175 Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn 180 185 190 Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr 195 200 205 Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys 210 215 220 Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235 240 Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln 245 250 255 Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr 260 265 270 His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu 275 280 285 Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr 290 295 300 Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala 305 310 315 320 Ala Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu 325 330 335 Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val 340 345 350 Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile 355 360 365 Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala 370 375 380 Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser 385 390 395 400 Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met 405 410 415 Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln 420 425 430 Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala 435 440 445 Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser 450 455 460 Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu 465 470 475 480 Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg 485 490 495 Gln <210> 16 <211> 497 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human source organism, but with engineered mutation <400> 16 Ala Arg Pro Cys Ile Pro Lys Ser Phe Gly Tyr Ser Ser Val Val Cys 1 5 10 15 Val Cys Asn Ala Thr Tyr Cys Asp Ser Phe Asp Pro Pro Thr Phe Pro 20 25 30 Ala Leu Gly Thr Phe Ser Arg Tyr Glu Ser Thr Arg Ser Gly Arg Arg 35 40 45 Met Glu Leu Ser Met Gly Pro Ile Gln Ala Asn His Thr Gly Thr Gly 50 55 60 Leu Leu Leu Thr Leu Gln Pro Glu Gln Lys Phe Gln Lys Val Lys Gly 65 70 75 80 Phe Gly Gly Ala Met Thr Asp Ala Ala Ala Leu Asn Ile Leu Ala Leu 85 90 95 Ser Pro Pro Ala Gln Asn Leu Leu Leu Lys Ser Tyr Phe Ser Glu Glu 100 105 110 Gly Ile Gly Tyr Asn Ile Ile Arg Val Pro Met Ala Ser Cys Asp Phe 115 120 125 Ser Ile Arg Thr Tyr Thr Tyr Ala Asp Thr Pro Asp Asp Phe Gln Leu 130 135 140 Leu Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr Lys Leu Lys Ile Pro Leu 145 150 155 160 Ile His Arg Ala Leu Gln Leu Ala Gln Arg Pro Val Ser Leu Leu Ala 165 170 175 Ser Pro Trp Thr Ser Pro Thr Trp Leu Lys Thr Asn Gly Ala Val Asn 180 185 190 Gly Lys Gly Ser Leu Lys Gly Gln Pro Gly Asp Ile Tyr His Gln Thr 195 200 205 Trp Ala Arg Tyr Phe Val Lys Phe Leu Asp Ala Tyr Ala Glu His Lys 210 215 220 Leu Gln Phe Trp Ala Val Thr Ala Glu Asn Glu Pro Ser Ala Gly Leu 225 230 235 240 Leu Ser Gly Tyr Pro Phe Gln Cys Leu Gly Phe Thr Pro Glu His Gln 245 250 255 Arg Asp Phe Ile Ala Arg Asp Leu Gly Pro Thr Leu Ala Asn Ser Thr 260 265 270 His His Asn Val Arg Leu Leu Met Leu Asp Asp Gln Arg Leu Leu Leu 275 280 285 Pro His Trp Ala Lys Val Val Leu Thr Asp Pro Glu Ala Ala Lys Tyr 290 295 300 Val His Gly Ile Ala Val His Trp Tyr Leu Asp Phe Leu Ala Pro Ala 305 310 315 320 Val Ala Thr Leu Gly Glu Thr His Arg Leu Phe Pro Asn Thr Met Leu 325 330 335 Phe Ala Ser Glu Ala Cys Val Gly Ser Lys Phe Trp Glu Gln Ser Val 340 345 350 Arg Leu Gly Ser Trp Asp Arg Gly Met Gln Tyr Ser His Ser Ile Ile 355 360 365 Thr Asn Leu Leu Tyr His Val Val Gly Trp Thr Asp Trp Asn Leu Ala 370 375 380 Leu Asn Pro Glu Gly Gly Pro Asn Trp Val Arg Asn Phe Val Asp Ser 385 390 395 400 Pro Ile Ile Val Asp Ile Thr Lys Asp Thr Phe Tyr Lys Gln Pro Met 405 410 415 Phe Tyr His Leu Gly His Phe Ser Lys Phe Ile Pro Glu Gly Ser Gln 420 425 430 Arg Val Gly Leu Val Ala Ser Gln Lys Asn Asp Leu Asp Ala Val Ala 435 440 445 Leu Met His Pro Asp Gly Ser Ala Val Val Val Val Leu Asn Arg Ser 450 455 460 Ser Lys Asp Val Pro Leu Thr Ile Lys Asp Pro Ala Val Gly Phe Leu 465 470 475 480 Glu Thr Ile Ser Pro Gly Tyr Ser Ile His Thr Tyr Leu Trp Arg Arg 485 490 495 Gln <210> 17 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Asp Asp Phe Gln Leu His Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr 1 5 10 15 <210> 18 <211> 15 <212> PRT <213> S. scorfa <400> 18 Asp Asp Phe Gln Leu Leu Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Val 1 5 10 15 <210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> B. taurus <400> 19 Asp Asp Phe Gln Leu Leu Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Val 1 5 10 15 <210> 20 <211> 15 <212> PRT <213> Murine sp. <400> 20 Asn Asp Phe Gln Leu Ser Asn Phe Ser Leu Pro Glu Glu Asp Thr 1 5 10 15 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> S. scorfa <400> 22 Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> B. taurus <400> 23 Asp Phe Leu Ala Pro Ala Asn Ala Thr Leu Gly Glu Thr 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Murine sp. <400> 24 Asp Phe Leu Ala Pro Ala Lys Ala Thr Leu Gly Glu Thr 1 5 10 <210> 25 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 25 ggcaagatct gaattcggga tggagttttc aagtccttcc agag 44 <210> 26 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 26 tcgagcggcc gcaagctagc ttatcactgg cgacgccaca ggtag 45 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 27 tccagccaac gccaccctag 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 28 ctagggtggc gttggctgga 20 <210> 29 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 29 tgatttccag ttgttgaact tcagcctc 28 <210> 30 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 30 gaggctgaag ttcaacaact ggaaatca 28 <210> 31 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 31 tgatttccag ttgttcaact tcagcctc 28 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 32 gaggctgaag ttgaacaact ggaaatca 28 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 33 tccagccgca gccaccctag 20 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 34 ctagggtggt gcggctgga 19 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 35 tccagccgta gccaccctag g 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 36 cctagggtgg ctacggctgg a 21

Claims (213)

1. 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
2. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 생리학적 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
3. 제2항에 있어서, 생리학적 조건이 생체내에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
4. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
5. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃의 조건에서 약 3시간의 기간에 걸쳐 모니터링되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
6. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 세포 배양 배지에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
7. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 세포 내부에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
8. 제7항에 있어서, 세포 내부가 리소좀 내부인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
9. 제8항에 있어서, 리소좀 내부가 약 pH 5 및 약 37℃의 조건인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
10. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 감소된 단백질 분해를 특징으로 하는 것인 종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
11. 제10항에 있어서, 감소된 단백질 분해가 세포 내에서 이루어지는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
12. 제11항에 있어서, 세포 내가 리소좀 내인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
13. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 비-생리학적 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
14. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 단백질 정제 동안의 완충 용액 내에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
15. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 단백질 정제 동안의 약 7 초과인 pH를 가지는 완충 용액 내에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
16. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 단백질 정제 동안의 약 3 미만인 pH를 가지는 완충 용액 내에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
17. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 유기 용매를 포함하는 완충 용액 내에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
18. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 카오트로픽 염(chaotropic salt)을 포함하는 완충 용액 내에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
19. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 약 2℃ 내지 약 37℃ 범위 온도의 완충 용액 내에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
20. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위 온도의 완충 용액 내에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
21. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 약 20℃ 온도의 완충 용액 내에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
22. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 냉동-해동 주기 후의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
23. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 동결건조 후 재구성 시의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
24. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 약물-제제화 완충제 내에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
25. 제1항에 있어서, 증가된 안정성이 염수 내에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
26. 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 더 큰 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
27. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 생리학적 조건에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
28. 제27항에 있어서, 생리학적 조건이 생체내에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
29. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃의 조건에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
30. 제26항에 있어서, 보유 촉매 활성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃의 조건에서 2 또는 3시간의 시간 과정에 걸쳐 모니터링되는 것인, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
31. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 세포 배양 배지에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
32. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 세포 내부에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
33. 제32항에 있어서, 세포 내부가 리소좀 내부인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
34. 제33항에 있어서, 리소좀 내부가 약 pH 5 및 약 37℃의 조건인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
35. 제26항에 있어서, 보유 촉매 활성이 감소된 단백질 분해를 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
36. 제26항에 있어서, 감소된 단백질 분해가 세포 내에서 이루어지는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
37. 제36항에 있어서, 세포 내가 리소좀 내인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
38. 제26항에 있어서, 보유 촉매 활성이 비-생리학적 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
39. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 단백질 정제 동안 완충 용액 내에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
40. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 단백질 정제 동안 약 7 이상의 pH를 가지는 완충 용액 내에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
41. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 단백질 정제 동안 약 3 이하의 pH를 가지는 완충 용액 내에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
42. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 유기 용매를 포함하는 완충 용액 내에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
43. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 카오트로픽 염을 포함하는 완충 용액 내에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
44. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 약 2℃ 내지 약 37℃ 범위 온도의 완충 용액 내에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
45. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 약 2℃ 내지 약 8℃ 범위 온도의 완충 용액 내에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
46. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 약 20℃ 온도의 완충 용액 내에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
47. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 냉동-해동 주기 후에 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
48. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 동결건조 후 재구성 후에 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
49. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 약물-제제화 완충제 내에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
50. 제26항에 있어서, 더 큰 촉매 활성이 염수 내에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
51. 하기 위치들: 316, 317, 321 및 145 중 하나 이상에 아미노산 변이를 포함하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
52. 제51항에 있어서, 아미노산 변이 F316A 및 L317F를 추가로 포함하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
53. 제52항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
54. 제53항에 있어서, 증가된 안정성이 생리학적 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
55. 제53항에 있어서, 증가된 안정성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
56. 제52항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 2배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
57. 제56항에 있어서, 연장된 겉보기 반감기가 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
58. 제52항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
59. 제58항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
60. 제58항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 생리학적 조건에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
61. 제51항에 있어서, 아미노산 변이 K321N을 추가로 포함하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
62. 제61항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
63. 제62항에 있어서, 증가된 안정성이 생리학적 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
64. 제62항에 있어서, 증가된 안정성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
65. 제61항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 3배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
66. 제65항에 있어서, 연장된 겉보기 반감기가 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
67. 제61항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
68. 제67항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
69. 제67항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 생리학적 조건에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
70. 제51항에 있어서, 아미노산 변이 K321A를 추가로 포함하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
71. 제70항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
72. 제71항에 있어서, 증가된 안정성이 생리학적 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
73. 제71항에 있어서, 증가된 안정성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
74. 제70항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 2배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
75. 제74항에 있어서, 연장된 겉보기 반감기가 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
76. 제70항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
77. 제76항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
78. 제77항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 생리학적 조건에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
79. 제51항에 있어서, 아미노산 변이 K321V를 추가로 포함하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
80. 제79항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
81. 제80항에 있어서, 증가된 안정성이 생리학적 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
82. 제80항에 있어서, 증가된 안정성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
83. 제79항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 1.4배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
84. 제83항에 있어서, 연장된 겉보기 반감기가 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
85. 제79항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
86. 제85항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
87. 제85항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 생리학적 조건에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
88. 제51항에 있어서, 아미노산 변이 H145L을 추가로 포함하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
89. 제88항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
90. 제89항에 있어서, 증가된 안정성이 생리학적 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
91. 제89항에 있어서, 증가된 안정성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
92. 제88항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 2배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
93. 제92항에 있어서, 연장된 겉보기 반감기가 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
94. 제88항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
95. 제94항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
96. 제94항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 생리학적 조건에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
97. 제51항에 있어서, 아미노산 변이 F316A, L317F 및 K321N을 추가로 포함하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
98. 제97항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
99. 제98항에 있어서, 증가된 안정성이 생리학적 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
100. 제98항에 있어서, 증가된 안정성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
101. 제97항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 3배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
102. 제101항에 있어서, 연장된 겉보기 반감기가 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
103. 제97항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
104. 제103항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
105. 제103항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 생리학적 조건에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
106. 제51항에 있어서, 아미노산 변이 F316A, L317F 및 K321A를 추가로 포함하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
107. 제106항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
108. 제107항에 있어서, 증가된 안정성이 생리학적 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
109. 제107항에 있어서, 증가된 안정성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
110. 제106항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 2배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
111. 제110항에 있어서, 연장된 겉보기 반감기가 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
112. 제106항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
113. 제112항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
114. 제112항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 생리학적 조건에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
115. 제51항에 있어서, 아미노산 변이 F316A, L317F 및 K321V를 추가로 포함하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
116. 제115항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
117. 제116항에 있어서, 증가된 안정성이 생리학적 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
118. 제116항에 있어서, 증가된 안정성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
119. 제115항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 1.4배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
120. 제119항에 있어서, 연장된 겉보기 반감기가 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
121. 제115항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
122. 제121항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
123. 제121항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 생리학적 조건에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
124. 제51항에 있어서, 아미노산 변이 H145L 및 K321N을 추가로 포함하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
125. 제124항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
126. 제125항에 있어서, 증가된 안정성이 생리학적 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
127. 제125항에 있어서, 증가된 안정성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
128. 제124항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 3배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
129. 제128항에 있어서, 연장된 겉보기 반감기가 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
130. 제124항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
131. 제130항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
132. 제130항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 생리학적 조건에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
133. 제51항에 있어서, 아미노산 변이 H145L 및 K321A를 추가로 포함하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
134. 제133항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
135. 제134항에 있어서, 증가된 안정성이 생리학적 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
136. 제134항에 있어서, 증가된 안정성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
137. 제133항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 2배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
138. 제137항에 있어서, 연장된 겉보기 반감기가 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
139. 제133항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
140. 제139항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
141. 제139항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 생리학적 조건에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
142. 제51항에 있어서, 아미노산 변이 H145L 및 K321V를 추가로 포함하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
143. 제142항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
144. 제143항에 있어서, 증가된 안정성이 생리학적 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
145. 제143항에 있어서, 증가된 안정성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
146. 제142항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 1.4배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
147. 제146항에 있어서, 연장된 겉보기 반감기가 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
148. 제142항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
149. 제148항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
150. 제148항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 생리학적 조건에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
151. 제51항에 있어서, 아미노산 변이 H145L, F316A 및 L317F를 추가로 포함하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
152. 제151항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
153. 제152항에 있어서, 증가된 안정성이 생리학적 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
154. 제152항에 있어서, 증가된 안정성이 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
155. 제151항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 2배 이상 더 긴 연장된 겉보기 반감기를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
156. 제155항에 있어서, 연장된 겉보기 반감기가 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
157. 제151항에 있어서, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
158. 제157항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 약 3시간의 기간에 걸쳐 대략 중성인 pH 및 약 37℃ 조건에서의 인큐베이션 후 측정되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
159. 제157항에 있어서, 증가된 촉매 활성이 생리학적 조건에서 보유되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
160. (a) 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 발현시키는 것; 및
     (b) 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 정제하는 것
     을 포함하는, 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 촉매 활성을 가지는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질의 제조 방법.
161. 제51항, 제52항, 제61항, 제70항, 제79항, 제88항, 제97항, 제106항, 제115항, 제124항, 제133항, 제142항 및 제151항 중 어느 한 항에 따른 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물.
162. 제51항, 제52항, 제61항, 제70항, 제79항, 제88항, 제97항, 제106항, 제115항, 제124항, 제133항, 제142항 및 제151항 중 어느 한 항에 따른 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질 및 제약상 허용되는 완충제를 포함하는 조성물.
163. 단백질의 루프 1 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 포함하며, 상기 하나 이상의 치환 아미노산은 단백질 활성 부위 부근의 질서를 증가시키는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 하는, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
164. 제163항에 있어서, 약 pH3 내지 약 pH8 범위에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 더 안정한 것을 특징으로 하는 단백질.
165. 제164항에 있어서, 대략 중성인 pH에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 더 안정한 것을 특징으로 하는 단백질.
166. 제163항에 있어서, 약 pH3 내지 약 pH8 범위에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 쉽게 감김해제되는 경향이 덜한 것을 특징으로 하는 단백질.
167. 제166항에 있어서, 대략 중성인 pH에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 쉽게 감김해제되는 경향이 덜한 것을 특징으로 하는 단백질.
168. 단백질 활성 부위 부근의 α-나선 (α6)에 하나 이상의 치환 아미노산을 포함하며, 상기 하나 이상의 치환 아미노산 측은 상기 나선을 안정화하고 촉매 부위로부터 인접하는 루프 1을 떼어내며 개방적인 활성 입체형태를 가지는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 하는, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
169. 제168항에 있어서, 약 pH3 내지 약 pH8 범위에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 더 개방적인 입체형태를 가지는 것을 특징으로 하는 단백질.
170. 제169항에 있어서, 대략 중성인 pH에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 더 개방적인 입체형태를 가지는 것을 특징으로 하는 단백질.
171. 제168항에 있어서, 약 pH3 내지 약 pH8 범위에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 더 활성인 입체형태를 가지는 것을 특징으로 하는 단백질.
172. 제171항에 있어서, 대략 중성인 pH에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 더 활성인 입체형태를 가지는 것을 특징으로 하는 단백질.
173. 베타-시트 (β2)와 α-나선 (α2) 사이의 랜덤 코일 영역에 하나 이상의 치환 아미노산을 포함하며, 하나 이상의 치환 아미노산 측쇄는 향상된 안정성을 위해 상이한 잔기와 2차 구조들 사이의 더 우수한 상호작용을 촉진하는 측쇄 입체형태를 가지는 것을 특징으로 하는, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
174. 제173항에 있어서, 약 pH3 내지 약 pH8 범위에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 더 안정한 것을 특징으로 하는 단백질.
175. 제174항에 있어서, 대략 중성인 pH에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 더 안정한 것을 특징으로 하는 단백질.
176. 제173항에 있어서, 약 pH3 내지 약 pH8 범위에서 야생형 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 상이한 잔기와 2차 구조들 사이의 더 우수한 상호작용을 가지는 것을 특징으로 하는 단백질.
177. 제176항에 있어서, 대략 중성인 pH에서 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질에 비해 상이한 잔기와 2차 구조들 사이의 더 우수한 상호작용을 가지는 것을 특징으로 하는 단백질.
178. 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
179. 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 더 큰 촉매 활성을 보유하는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
180. 야생형 재조합 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 특이적 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
181. 하기 위치들: 316, 317, 321 및 145 중 하나 이상에 아미노산 변이를 포함하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 리소좀성 축적 질환를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
182. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 F316A 및 L317F를 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
183. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 K321N을 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
184. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 K321A를 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
185. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 K321V를 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
186. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 H145L을 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
187. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 H145F를 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
188. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 F316A, L317F 및 K321N을 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
189. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 F316A, L317F 및 K321A를 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
190. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 F316A, L317F 및 K321V를 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
191. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 H145L, F316A 및 L317F를 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
192. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 H145L 및 K321N을 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
193. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 H145L 및 K321A를 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
194. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 H145L 및 K321V를 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
195. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 H145L, F316A, L317F 및 K321N을 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
196. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 H145L, F316A, L317F 및 K321A를 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
197. 제181항에 있어서, 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질이 아미노산 변이 H145L, F316A, L317F 및 K321V를 추가로 포함하는 것인, 리소좀성 축적 질환의 치료 방법.
198. 제178항 내지 제197항 중 어느 한 항에 있어서, 리소좀성 축적 질환이 고셔병인 방법.
199. 제198항에 있어서, 투여가 정맥내 주입인 방법.
200. 제198항에 있어서, 투여가 복강내 주사인 방법.
201. 하기 아미노산 서열들: 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 서열 16 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 포함하는 화합물.
202. 하기 아미노산 서열들: 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 또는 서열 16 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 포함하는 조성물.
203. 야생형 β-글루코세레브로시다제에 비해 증가된 발현이 가능함을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
204. 제203항에 있어서, 발현이 야생형 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 10% 이상 증가되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
205. 제203항에 있어서, 발현이 야생형 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 25% 이상 증가되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
206. 제203항에 있어서, 발현이 야생형 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 50% 이상 증가되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
207. 제203항에 있어서, 발현이 야생형 β-글루코세레브로시다제에 비해 약 80% 이상 증가되는 것인 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
208. 제203항에 있어서, 포유동물 세포에서 발현될 수 있는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
209. 제203항에 있어서, 효모 세포에서 발현될 수 있는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
210. 제203항에 있어서, 트랜스제닉 동물에서 발현될 수 있는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
211. 제203항에 있어서, 삽입된 유전자로부터 발현될 수 있는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질.
212. 하기 아미노산 서열들: 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 또는 서열 16 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 포함하는 화합물의 제조 방법.
213. 하기 아미노산 서열들: 서열 2, 서열 3, 서열 4, 서열 5, 서열 6, 서열 7, 서열 8, 서열 9, 서열 10, 또는 서열 11, 서열 12, 서열 13, 서열 14, 서열 15, 또는 서열 16 중 어느 하나를 가지는 것을 특징으로 하는 변종 재조합 β-글루코세레브로시다제 단백질을 코딩하는 핵산의 제조 방법.

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