CN103314105B - 具有增强的稳定性和增强的保留催化活性的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白 - Google Patents
具有增强的稳定性和增强的保留催化活性的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白 Download PDFInfo
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Abstract
本发明描述了一种变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，所述蛋白特征为与重组野生型β-葡萄糖脑苷脂酶相比具有增强的稳定性。本发明还提供了一种变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其特征为与重组野生型β-葡萄糖脑苷脂酶相比保留了更高的催化活性。本发明进一步描述了一种变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其可以在下述位置中的一个或多个具有氨基酸变异：316、317、321和145。本发明还描述了一种制备变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的方法以及治疗溶酶体贮积症患者的方法。
Description
交叉引用美国相关专利申请
本发明依据35U.S.C.§119(e)要求2010年11月8日提交的序列号为61/411，331的美国临时申请和2010年11月10日提交的序列号61/412，180的美国临时申请的优先权，其全部内容通过引用并入本发明。
技术领域
本发明的领域包括用于治疗多种溶酶体贮积症的酶替代疗法的蛋白。这些溶酶体贮积症包括戈谢病。
背景技术
β-葡萄糖脑苷脂酶是一种可溶性的溶酶体酶，其功能为在管腔膜表面通过与鞘脂酶激活蛋白C和阴离子磷脂的相互作用来水解糖脂葡糖神经酰胺。β-葡萄糖脑苷脂酶在组织巨噬细胞从被吞噬的受损细胞和病原体中分解和回收膜的过程中特别重要。由于葡糖神经酰胺是超过300种参与多种重要的细胞途径和信号级联的糖脂和神经节苷脂的主要前体分子，因而其是维持这些多种脂质分子复杂的平衡所必需的。
戈谢病由β-葡萄糖脑苷脂酶的缺乏引起，该缺乏造成葡糖神经酰胺的蓄积。戈谢病通过多种临床症状体现，包括贫血、血小板减少、肝脾肿大和骨骼畸形。基于神经受累情况将戈谢病分为三种类型:1型(非神经型);2型(急性神经型);和3型(慢性神经型)。目前尚无已知的治疗戈谢病的方法，但是已批准使用补充缺乏的β-葡萄糖脑苷脂酶的酶替代疗法(ERT)和抑制葡糖神经酰胺的合成底物减少疗法来治疗该病。还将其他治疗方法如小分子药理伴侣和蛋白折叠调节剂作为这种疾病的潜在疗法进行评估。在这些治疗方法中，ERT是针对戈谢病的内脏症状最成熟和有效的临床疗法。伊米苷酶(重组β-葡萄糖脑苷脂酶;CerezymeTM，GenzymeCorp.TM)开发出来并被FDA于1994年批准用于治疗戈谢病，而且是目前治疗这种疾病的标准治疗方法。
尽管普遍认为CerezymeTMERT是最有效的治疗方法，但是这种溶酶体酶在中性pH和37°C下不稳定。事实上，药物的绝大部分在静脉输注至血液后不久就被不可逆性的灭活。仅有少部分保持催化活性并进入靶巨噬细胞，其赋予了全部的治疗效果。因此，开发一种更为稳定的β-葡萄糖脑苷脂酶是有益的，该酶在从蛋白生产步骤到在进入所需的人类对象后所遇到的生理条件下均不易于被酶灭活。
发明概述
本发明提供了变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶相比，具有增强的稳定性。本发明还提供了变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶相比，保留了更高的催化活性。本发明进一步描述了变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其在一个或多个下述位置可以具有氨基酸变异:316、317、321和145。
本发明描述了一种变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的制备方法，其特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶相比，保留了更高的催化活性。本发明进一步描述了一种组合物，所述组合物包括变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白和药学上可接受的载体。本发明还提供了一种组合物，所述组合物包括变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白和药学上可接受的缓冲剂。
本发明描述了变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，所述蛋白在所述蛋白的环1区域具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸的特征在于具有侧链构象，所述侧链构象增加所述蛋白活性位点附近的有序性。本发明进一步描述了一种变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，所述蛋白在所述蛋白的活性位点(α6)附近的α-螺旋中具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸侧链的特征在于具有侧链构象，所述侧链构象稳定所述螺旋并牵拉邻近的环1使其远离催化位点且具有开放和活化的构象。本发明还提供了一种变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，所述蛋白在β-折叠(β2)和α-螺旋(α2)之间的无规则卷曲区域具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸的特征在于具有侧链构象，所述侧链构象有利于不同残基和二级结构之间更好的相互作用以改善稳定性。
本发明提供了一种通过向所需对象给予变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白来治疗溶酶体贮积症的方法，所述蛋白的特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶相比具有增强的稳定性。本发明还提供了一种通过向所需对象给予变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白来治疗溶酶体贮积症的方法，所述蛋白的特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶相比保留了更高的催化活性。本发明还提供了一种通过向所需对象给予变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白来治疗溶酶体贮积症的方法，所述蛋白的特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶相比具有增强的特异性活性。本发明还提供了一种通过向所需对象给予变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白来治疗溶酶体贮积症的方法，所述蛋白的特征在于在下述一个或多个位置具有氨基酸变异:316、317、321和145。本发明还提供了一种通过向所需对象给予变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白来治疗戈谢病的方法。
本发明还提供了一种化合物，所述化合物包括变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，所述蛋白的特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一个:SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、或SEQIDNO:16。
本发明还提供了一种变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶相比能够增加表达。
本发明还提供了一种制备包含变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的化合物的方法，所述蛋白的特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一个:SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、或SEQIDNO:16。本发明还提供了一种制备编码变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的核酸的方法，所述蛋白的特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一个:SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDN0:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、或SEQIDNO:16。
附图概述
根据对本发明的下述详细描述并结合附图考虑时，本发明的前述和其他方面是清楚的。出于解释本发明的目的，在附图中所示的均为优选的实施方式，但是将理解的是本发明不限于所公开的特定方式。附图并不一定是按照比例尺绘制的。在附图中:
图1(A)显示了酶活性的测量值，用于比较变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白和野生型酶在典型瞬时转染实验48小时后分泌至细胞培养基中的相对表达情况;(B)显示了western印迹分析，用于比较在瞬时转染后变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白和野生型G1cCerase蛋白的相对分泌量。
图2显示了在pH7.5和37°C下Hl45L修饰、H145F修饰、F316A/L317F修饰、K321N修饰、K321A修饰、F316A/L317F/K321N修饰、和H145L/K321N修饰的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比的稳定性;和
图3显示了在pH8和37°C下具有F316A/L317F修饰的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比的稳定性。
发明详述
通过参考下述的详细描述结合作为本公开一部分的附图和实施例可能更容易理解本主题。应理解的是本发明不限于本发明所描述和/或所示的特定设备、方法、应用、条件或参数，并且本发明所使用的术语仅用于通过示例性的方式描述特定实施方式的目的而非旨在限制所要求保护的发明。
此外，除非上下文中另有明示，否则在说明书中包括所附权利要求书中使用的单数形式的“一”和“一”以及“所述”包括复数，提到一个特定数值至少包括该特定值。本发明所使用的术语“多个”指一个以上。当表示数值范围时，另一个实施方式包括从一个特定值和/或至其它特定值。类似地，当通过在其前面使用“约”表示近似值时，应理解为特定值形成另一个实施方式。所有范围均是开放式和可组合的。
提供实施例以帮助进一步理解本发明。所使用的特定材料、方案和条件旨在进一步解释本发明，不应将其解释为限制其合理的范围。
除非另有说明，否则对变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白性质的说明是相对于野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的性质(SEQIDNO:1)而言的。在本发明中，“G1cCerase”是β-葡萄糖脑苷脂酶的缩写。所有的氨基酸编号均是相对于SEQ.ID.NO.1而言的。因此，位置145将是SEQ.ID.NO.1中的第145个的氨基酸。而且，本发明所公开的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白还包括其功能性片段或衍生物。
在本发明中，“约中性pH”指包括通常被认为是生理pH的pH(即，在37°C下pH约7.5)
适宜的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的特征可以在于，与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比，在细胞培养和蛋白生产期间，具有相似或增加的蛋白表达和向细胞培养基中的分泌。适宜的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的特征可以在于，与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比具有增强的稳定性。这些蛋白在生理条件下具有增强的稳定性并且那些生理条件可以是体内的。此外，这些蛋白的特征还可以在于在约中性pH和约37°C的条件下具有增强的稳定性。该增强的稳定性可以在约中性pH和约37°C的条件下监测约3小时的一段时间。所述增强的稳定性在细胞培养基内保持，并且可以在细胞内保持。这些蛋白还可以在溶酶体内具有增强的稳定性，并且在溶酶体内的条件可以是约pH5和约37°C。这些蛋白还可以具有增强的稳定性，其特征在于蛋白水解降解作用减少，减少的蛋白水解降解作用可以发生在细胞内。此外，减少的蛋白水解降解作用可以在细胞的溶酶体内。这些蛋白还可以在非生理条件下具有增强的稳定性，如在蛋白纯化过程中的缓冲溶液中。在蛋白纯化过程中这些缓冲溶液可以具有高于约7的pH或低于约3的pH。这些缓冲溶液还可以含有有机溶剂或离液盐。这些蛋白还可以在温度范围为约2°C至约37°C的缓冲溶液中具有增强的稳定性。此外，这些蛋白还可以在温度范围为约2°C至约8°C的缓冲溶液中具有增强的稳定性。而且，这些蛋白可以在温度约20°C的缓冲溶液中具有增强的稳定性。这些蛋白还可以在冻融循环后或冻干后复溶时具有增强的稳定性。这些蛋白还可以在药物制剂缓冲液如盐水中具有增强的稳定性。
适宜的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白可以是其特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比保留了更高的催化活性。这些蛋白在生理条件下保留了更高的催化活性，并且更高的保留的催化活性可以是在体内。此外，这些蛋白还可以是其特征在于在约中性pH和约37°C的条件下保留了更高的催化活性。该更高的保留的催化活性可以在约中性pH和约37°C的条件下监测约2小时的一段时间。这些蛋白在细胞培养基中保留了更高的催化活性并且更高的保留的催化活性可以是在细胞内。此外，这些蛋白可以在溶酶体内保留了更高的催化活性并且在溶酶体内的条件可以是约pH5和约37°C。这些蛋白还可以保留了更高的催化活性，其特征在于蛋白水解降解作用减少，该减少的蛋白水解降解作用可以发生在细胞内。此外，该减少的蛋白降解可以在细胞的溶酶体内。这些蛋白还可以在非生理条件下保留更高的催化活性，如在蛋白纯化过程中的缓冲溶液中。在蛋白纯化过程中这些缓冲溶液可以具有高于约7的pH或低于约3的pH。这些缓冲溶液还可以含有有机溶剂或离液盐。这些蛋白还可以在约2°C至约37°C的温度范围内保留更高的催化活性。此外，这些蛋白还可以在约2°C至约8°C的温度范围内保留更高的催化活性。而且，这些蛋白还可以在约20°C的温度保留更高的催化活性。这些蛋白还可以在冻融循环后或冻干后复溶时保留更高的催化活性。这些蛋白还可以在药物制剂缓冲液如盐水中保留更高的催化活性。
变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白还可以在一个或多个下述位置具有氨基酸变异:316、317、321和145。这些蛋白还可以具有氨基酸变异或多个氨基酸变异:(1)F316A和L317F；或(2)K321N;或(3)H145L;或(4)H145F；(5)F316A、L317F、和K321N;或(6)K321A;或(7)K321V;(8)F316A、L317F、和K321A;或(９)F316A、L317F、和K321V;或(10)H145L、F316A、和L317Ｆ；或(11)H145L和K321N;或(12)H145L和K321A;或(13)H145L和K321V。这些蛋白中的某些还可以是其特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比，在细胞培养和蛋白生产期间具有相似或增加的蛋白表达和向细胞培养基中的分泌。这些蛋白的特征还可以在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比具有增强的稳定性。这些蛋白的特征还可以在于在生理条件下具有增强的稳定性并且这些条件可以是约中性pH和约37°C。这些蛋白的特征还可以在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比保留了更高的催化活性。该催化活性可以在约中性pH和约37°C条件下孵育约2小时的一段时间后测定。这些蛋白的特征还可以在于在生理条件下保持更高的催化活性。具有氨基酸变异F316A和L317F的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白具有延长的表观半衰期，所述表观半衰期至少比野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶的长约2倍。具有氨基酸变异K321N的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白具有延长的表观半衰期，所述表观半衰期至少比野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶的长约3倍。具有氨基酸变异K321A的变体、重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白具有延长的表观半衰期，所述表观半衰期至少比野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶的长约3倍。具有氨基酸变异K321V的变体、重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白具有延长的表观半衰期，所述表观半衰期至少比野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶的长约1.4倍。具有氨基酸变异H145L的变体、重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白具有延长的表观半衰期，所述表观半衰期至少比野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶的长约3倍。具有氨基酸变异H145F的变体、重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白具有延长的表观半衰期，所述表观半衰期至少比野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶的长约2倍。具有氨基酸变异F316A、L317F、和K321N的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白具有延长的表观半衰期，所述表观半衰期至少比野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶的长约3倍。具有氨基酸变异H145L、F316A、和L317F的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白具有延长的表观半衰期，所述表观半衰期至少比野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶的长约2倍。具有氨基酸变异H145L和K321N的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白具有延长的表观半衰期，所述表观半衰期至少比野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶的高约3倍。在约中性pH和约37°C的条件下孵育约2小时的一段时间后可以测定该延长的表观半衰期。
实施例1
试剂
4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷(4MUG)荧光底物购自ResearchProductsInternationa1(Mt.Prospect，IL)。DNA凝胶提取和微量制备试剂盒来自(Va1encia，CA)。PureYie1dMaXiprepDNATM试剂盒来自PromegaTM(Madison，WI)。除非另有说明，否则化学试剂来自SigmaTM(St.Louis，MO)。Fugene-HDTM转染试剂来自RocheTM(Indianapo1is，ＩＮ)。pEF6/V5-HisATM哺乳动物表达载体、Du1becco改良的Eag1e培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)和其他组织培养试剂来自ＩnvitrogenTM(Car1sbad，CA)。野生型人野生型β-葡萄糖脑苷酮酶cDNA(NM-000157.3)购自OrigeneTM(Rockvi11e，MD)。限制性核酸内切酶、Phusion-HFTMDNA聚合酶、T4DNA连接酶、Antarctic磷酸酶、化学感受态大肠杆菌(DH5α细胞)以及内糖苷酶PNGaseF和EndoH均购自NewEng1andBiolabsTM(Ipswich，MA)。人胚胎肾细胞(经T-抗原转化;HEK293T)来自ATCCTM。
检测
在人细胞系(KEK293T)中通过瞬时表达，对所有变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白和野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白进行检测，以评估蛋白表达。用于检测变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白或野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白催化活性的报告系统能够在约pH5.2和约37°C水解4-MU-β-葡萄糖荧光底物。通过监测在约中性pH和约37°C孵育约3小时的一段时间后各蛋白保留的催化活性，对这些变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白和经纯化的野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的稳定性进行检测。设计这些实验的条件以模拟在β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白酶替代疗法静脉输注至患者体内时存在的环境。
更具体地，但是并非被解释为限制，使用1m1添加了10%FBS的DMEM培养基将HEK293T细胞接种于12-孔组织培养板，并在37°C和5%CO2气体环境中孵育。当HEK293T细胞达到80-90%融合时，将已消耗的培养基更换为１m１新鲜的DMEM/10%FBS培养基并使用1μg用于各β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白或PBS(作为假-转染阴性对照)的质粒DNA和3μ1Fugene-HD转染试剂按照生产厂商提供的方案对各孔进行转染。将转染细胞孵育24-72小时，每日通过酶活性检测对β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(分泌至培养基)的表达进行检测。
使用来自瞬时转染实验24、48或72小时后的条件培养基和4-甲基伞形酮-β-D-吡喃葡萄糖苷(4-MUG)荧光底物，通过酶活性检测评估β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的表达(和分泌至细胞培养基中的分泌物)。简言之，在所示的时间点从各样品中收集20μ１条件培养基，在0.5m1微量离心管中使用80μ1McI1vane缓冲液(MI缓冲液:50mM柠檬酸钠/磷酸钠(pH5.2)/0.25%(v/v)TritonX-100/0.25%(w/v)牛黄胆酸钠)对其进行稀释。将25μ1各稀释样品等分加入96孔黑色透明底板的各孔中(三复管)并使用多通道移液器每孔加入50μ16mM的4-MUG底物(在MI缓冲液中制备)。然后使用封带将板密封并在37°C孵育1小时。通过加入125μ10.1M的NaOH终止酶反应，在荧光板酶标仪上分别使用355nm激发和460nm发射波长读取释放的4-MU荧光。将假-转染样品的4-MU荧光作为“背景”对照并从所有β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白样品中扣除。
为评估细胞培养基中存在的野生型和变体酸性β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的量，使用标淮技术对来自瞬时转染实验的条件培养基进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酚胺凝胶电泳(SDS-PAGE)并转移至硝酸纤维素膜。然后使用封闭缓冲液孵育膜:室温下在含4%(w/v)脱脂奶粉的50mMTＲＩS-缓冲盐(pH7.5)/0.1%(v/v)吐温-20(TBST)中振荡1小时。然后使用经封闭缓冲液按照1:2500稀释的兔抗-人β-葡萄糖脑苷脂酶多克隆一抗(特别针对与人酸性β-葡萄糖脑苷脂酶C-末端对应的19个氨基酸肽;SigmaG-4171)孵育膜，在室温下振荡1小时或4°C下振荡过夜。然后在室温下使用TBST振荡洗涤印迹1小时，期间至少更换三次缓冲液。然后使用经封闭缓冲液按照1:10，000稀释的酶联二抗(例如，辣根过氧化物酶偶联的山羊抗-兔抗体)在室温下振荡孵育印迹1小时。然后在室温下使用TBST振荡洗涤印迹1小时，期间至少更换三次缓冲液。然后使用化学发光底物(例如，Pierce'sSupersigna1West-DuraEXtendedDurationSubstrateTM)在室温下孵育印迹5分钟，并通过成像系统或通过胶卷显示印记以评估野生型和变体酸性β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的表达水平。
为评估β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的稳定性，在中性pH缓冲液和37°C下孵育瞬时表达的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白和经纯化的野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(即，CerezymeTM)并测定酶活性以确定在约三小时的一段时间内酶活性的损失程度。简言之，在转染后24或48小时收集60μ1条件培养基(含有各变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白)并将其加入到在0.5m1微量离心管中的420μ10.1M的磷酸钾(pH7.5)/0.2%(v/v)TritonX-100/0.2%(w/v)BSA。类似地，在DMEM培养基/10%FBS中将经纯化的野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白按照1:12，500的比例连续稀释，并将60μ1该经稀释的野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白样品加入到420μ10.1M的磷酸钾(pH7.5)/0.2%(v/v)TritonX-100/0.2%(w/v)BSA中使得最终的稀释度为1:100，000。(该野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的量根据经验确定，为了使其含有酶活性的量与瞬时表达的重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白类似)。将所有样品在37°C水浴中孵育，在特定时间点(0、30、60、90、120或180分钟)取出70μ1各样品并加入含20μ10.5MNaOAc(pH5.2)的新的0.5m1微量离心管中。将样品充分混合，使用25μ1各经稀释的样品按照上文所述来测定剩余的重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的酶活性(三复管)。将各重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的初始酶活性(在t=0分钟)设定为100%，将随后所有时间点的酶活性标淮化至初始活性以确定在整个时段内的剩余酶活性。使用多次实验(至少两次独立的实验)的数据获得各时间点剩余重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白活性的平均值，并如图所示以其相对于孵育时间作图。
实施例2
使用上文所述的瞬时转染实验对具有特定氨基酸替换的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白和野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“野生型G1cCerase”)的表达进行比较(图1)。如图1A所示，将具有F316A和L317F变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“G1cCerase-F316A/L317F”)，具有K321N变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“G1cCerase-K321N”)，具有H145L变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“G1cCerase-H145L”)，具有F316A、L317F和K321N变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“GlcCerase-F316A/L317F/K321N”)，具有H145L和K321N变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“G1cCerase-H145L/K321N”)，以及野生型G1cCerase在HEK293T细胞中瞬时表达。在转染后48小时收集条件细胞培养基，并使用4-甲基伞形酮-β-D-葡糖苷(4-MUG)荧光底物测定β-葡萄糖脑苷脂酶活性，以评估与野生型G1cCerase相比这些变体G1cCerase酶的相对表达水平。这些结果表明不同变体G1cCerase酶的表达与野生型G1cCerase相当或更好，如在细胞培养基中检测到更高的酶活性所证明的。其他变体G1cCerase酶包括G1cCerase-H145F、G1cCerase-H145L/F316A/L317F/K321N的表达亦优于野生型GlcCerase(数据未列出)。G1cCerase-K321A和G1cCerase-H145F/F316A/L317F/K321N的表达水平大致与野生型G1cCerase相当，而G1cCerase-K321V的表达效率不及野生型G1cCerase(数据未列出)。
如上文所述使用Westem印迹对条件细胞培养基中存在的变体G1cCerase蛋白和野生型G1cCerase蛋白的量进行评估。如图1B所示，在条件培养基中存在的G1cCerase-F316A/L317F和G1cCerase-K321N蛋白的量高于野生型G1cCerase。这些Western印迹的数据与G1cCerase酶活性的结果一致，其确证了表达和分泌某些变体G1cCerase酶优于野生型G1cCerase。在其他变体G1cCerase中也观察到了类似的结果(数据未列出)。
实施例3
使用上文所述的体外稳定性检测对具有F316A和L317F变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“G1cCerase-F316A/L317F”)和经纯化的野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“野生型G1cCerase”)进行比较。变体和野生型蛋白采用的条件相同。如图2所示，在约中性pH和约37°C下在两或三小时时间段内，G1cCefase-F316A/L317F与野生型G1cCerase相比明显更加稳定。在孵育30分钟后，G1cCerase-F316A/L317F保持了其初始活性的85%。在孵育60分钟后，G1cCerase-F316A/L317F保持了其初始活性的73%。在孵育120分钟后，G1cCerase-F316A/L317F保持了其初始活性的50%。在孵育180分钟后，G1cCerase-F316A/L317F保持了其初始活性的34%。相比之下，在孵育30分钟后，在相同实验条件下处理的野生型G1cCerase保持了其初始活性的68%。在孵育60分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的46%。在孵育120分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的20%。在孵育180分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的8%。
G1cCerase-F316A/L317F的预计半衰期(在本研究中操作型定义为在约pH7.5和约37°C下使初始酶活性损失50%的孵育时间)约为120分钟，而在这些实验条件下野生型G1cCerase的预计半衰期约为50分钟。还在约pH8和约37°C时对G1cCerase-F316A/L317F进行了测试，其显示出了类似的趋势(图3)。在约pH8和约37°C下G1cCefase-F316A/L317F和野生型G1cCerase均更不稳定，但是这些结果证实了在更高的pH下G1cCerase-F316A/L317F比野生型GlcCerase更稳定。
实施例4
使用上文所述的检测对具有K321N变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“G1cCerase-K321N”)和经纯化的野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“野生型G1cCerase”)进行比较。变体和野生型蛋白采用的条件相同。如图2所示，在约中性pH和约37°C下在三小时时间段内G1cCerase-K321N与野生型G1cCerase相比明显更加稳定。在孵育30分钟后，G1cCerase-K321N保持了其初始活性的104%。在孵育60分钟后，G1cCerase-K321N保持了其初始活性的91%。在孵育120分钟后，G1cCerase-K321N保持了其初始活性的76%。在孵育180分钟后，G1cCerase-K321N保持了其初始活性的54%。相比之下，在孵育30分钟后，在相同实验条件下处理的野生型G1cCerase保持了其初始活性的68%。在孵育60分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的46%。在孵育120分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的20%。在孵育180分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的8%。
G1cCerase-K321N的预计半衰期(在本研究中操作型定义为在约pH7.5和约37°C下使初始酶活性损失50%的孵育时间)约为180分钟，而在这些实验条件下野生型G１cCerase的预计半衰期约为50分钟。
实施例5
使用上文所述的检测对具有H145L变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白（“G１cCerase-H145L”)和经纯化的野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“野生型G１cCerase”)进行比较。变体和野生型蛋白采用的条件相同。如图2所示，在约中性pH和约37°C下在三小时时间段内G１cCerase-H145L与野生型G１cCerase相比明显更加稳定。在孵育30分钟后，G１cCerase-H145L保持了其初始活性的92%。在孵育60分钟后，G１cCerase-H145L保持了其初始活性的87%。在孵育120分钟后，GlcCerase-H145L保持了其初始活性的62%。在孵育180分钟后，G１cCerase-H145L保持了其初始活性的42%。相比之下，在孵育30分钟后，在相同实验条件下处理的野生型G１cCerase保持了其初始活性的68%。在孵育60分钟后，野生型G１cCerase保持了其初始活性的46%。在孵育120分钟后，野生型G１cCerase保持了其初始活性的20%。在孵育180分钟后，野生型G１cCerase保持了其初始活性的8%。
G１cCerase-H145L的预计半衰期(在本研究中操作型定义为在约pH7.5和约37°C下使初始酶活性损失50%的孵育时间)约为160分钟，而在这些实验条件下野生型G１cCerase的预计半衰期约为50分钟。
实施例6
使用上文所述的检测对具有H145F变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白（“G１cCerase-H145Ｆ”)和经纯化的野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“野生型G１cCerase”)进行比较。变体和野生型蛋白采用的条件相同。如图1所示，在约中性pH和约37°C下在三小时时间段内，G１cCerase-H145F与野生型G１cCerase相比明显更加稳定。在孵育30分钟后，G１cCerase-H145F保持了其初始活性的94%。在孵育60分钟后，G１cCerase-H145F保持了其初始活性的80%。在孵育120分钟后，G１cCerase-H145F保持了其初始活性的37%。在孵育180分钟后，G１cCerase-H145F保持了其初始活性的17%。相比之下，在孵育30分钟后，在相同实验条件下处理的野生型G１cCerase保持了其初始活性的68%。在孵育60分钟后，野生型G１cCerase保持了其初始活性的46%。在孵育120分钟后，野生型G１cCerase保持了其初始活性的20%。在孵育180分钟后，野生型G１cCerase保持了其初始活性的8%。
G１cCerase-H145F的预计半衰期(在本研究中操作型定义为在约pH7.5和约37°C下使初始酶活性损失50%的孵育时间)约为100分钟，而在这些实验条件下野生型G１cCerase的预计半衰期约为50分钟。
实施例7
使用上文所述的检测对具有F316A、L317F、和K321N变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“G1cCerase-F316A/L317F/K321N”)和经纯化的野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“野生型G1cCerase”)进行比较。变体和野生型蛋白采用的条件相同。如图2所示，在约中性pH和约37°C下在三小时时间段内G1cCerase-F316A/L317F/K321N与野生型G1cCerase相比明显更加稳定。在孵育30分钟后，G1cCerase-F316A/L317F/K321N保持了其初始活性的101%。在孵育60分钟后，G1cCerase-F316A/L317F/K321N保持了其初始活性的91%。在孵育120分钟后，G1cCerase-F316A-L317F/K321N保持了其初始活性的75%。在孵育180分钟后，G1cCerase-F316A/L317F/K321N保持了其初始活性的52%。相比之下，在孵育30分钟后，在相同实验条件下处理的野生型G1cCerase保持了其初始活性的68%。在孵育60分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的46%。在孵育120分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的20%。在孵育180分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的8%。
G1cCerase-F316A/L317F/K321N的预计半衰期(在本研究中操作型定义为在约pH7.5和约37°C下使初始酶活性损失50%的孵育时间)约为180分钟，而在这些实验条件下野生型G1cCerase的预计半衰期约为50分钟。
实施例8
使用上文所述的检测对具有H145L、F316A和L317F变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“G1cCerase-H145L/F316A/L317F”)和经纯化的野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“野生型G1cCerase”)进行比较。变体和野生型蛋白采用的条件相同。在约中性pH和约37°C下在三小时时间段内G1cCerase-H145L/F316A/L317F与野生型G1cCeraSe相比明显更加稳定。在孵育30分钟后，G1cCerase-H145L/F316A/L317F保持了其初始活性的77%。在孵育60分钟后，G1cCerase-H145L/F316A/L317F保持了其初始活性的80%。在孵育120分钟后，G1cCerase-H145L/F316A/L317F保持了其初始活性的56%。在孵育180分钟后，G1cCerase-H145L/F316A/L317F保持了其初始活性的39%。相比之下，在孵育30分钟后，在相同实验条件下处理的野生型G1cCerase保持了其初始活性的68%。在孵育60分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的46%。在孵育120分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的20%。在孵育180分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的8%。
G1cCerase-H145L/F316A/L317F的预计半衰期(在本研究中操作型定义为在约pH7.5和约37°C下使初始酶活性损失50%的孵育时间)约为135分钟，而在这些实验条件下野生型G1cCerase的预计半衰期约为50分钟。
实施例9
使用上文所述的检测对具有H145L和K321N变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“G1cCerase-H145L/K321N”)和经纯化的野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“野生型G1cCerase”)进行比较。变体和野生型蛋白采用的条件相同。如图2所示，在约中性pH和约37°C下在三小时时间段内G1cCerase-H145L/K321N与野生型G1cCerase相比明显更加稳定。在孵育30分钟后，G1cCeraSe-H145L/K321N保持了其初始活性的89%。在孵育60分钟后，G1cCerase-H145L/K321N保持了其初始活性的86%。在孵育120分钟后，G1cCerase-H145L/K321N保持了其初始活性的76%。在孵育180分钟后，G1cCerase-H145L/K31N保持了其初始活性的62%。相比之下，在孵育30分钟后，在相同实验条件下处理的野生型G1cCerase保持了其初始活性的68%。在孵育60分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的46%。在孵育120分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的20%。在孵育180分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的8%。
G1cCerase-H145L/K321N的预计半衰期(在本研究中可操作地定义为在约pH7.5和约37°C下结果使初始酶活性损失50%的孵育时间)约为180分钟，而在这些实验条件下野生型G1cCerase的预计半衰期约为50分钟。
实施例10
使用上文所述的检测对具有K321A变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“G1cCerase-K321A”)和经纯化的野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“野生型G1cCerase”)进行比较。变体和野生型蛋白采用的条件相同。如图2所示，在中性pH和约37°C下在三小时时间段内G1cCerase-K321A与野生型G1cCerase相比明显更加稳定。在孵育30分钟后，G1cCeraSe-K321A保持了其初始活性的90%。在孵育60分钟后，G1cCerase-K321A保持了其初始活性的89%。在孵育120分钟后，G1cCerase-K321A保持了其初始活性的68%。在孵育180分钟后，G1cCerase-K321A保持了其初始活性的49%。相比之下，在孵育30分钟后，在相同实验条件下处理的野生型G1cCerase保持了其初始活性的68%。在孵育60分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的46%。在孵育120分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的20%。在孵育180分钟后，野生型G1cCerase保持了其初始活性的8%。
G1cCerase-K321A的预计半衰期(在本研究中操作型定义为在约pH7.5和约37°C下使初始酶活性损失50%的孵育时间)约为170分钟，而在这些实验条件下野生型G１cCerase的预计半衰期约为50分钟。
实施例１１
使用上文所述的检测对具有K321A变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白（“G１cCerase-K321V”)和经纯化的野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白(“野生型G１cCerase”)进行比较。变体和野生型蛋白采用的条件相同。在约中性pH和约37°C下在三小时时间段内G１cCerase-K321V与野生型G１cCerase相比明显更加稳定。在孵育30分钟后，G１cCerase-K321V保持了其初始活性的74%。在孵育60分钟后，G１cCerase-K321V保持了其初始活性的55%。在孵育120分钟后，G１cCerase-K321V保持了其初始活性的29%。在孵育180分钟后，G１cCerase-K321V保持了其初始活性的15%。相比之下，在孵育30分钟后，在相同实验条件下处理的野生型G１cCerase保持了其初始活性的68%。在孵育60分钟后，野生型G１cCerase保持了其初始活性的46%。在孵育120分钟后，野生型G１cCerase保持了其初始活性的20%。在孵育180分钟后，野生型G１cCerase保持了其初始活性的8%。
G１cCerase-K321V的预计半衰期(在本研宽中操作型定义为在约pH7.5和约37°C下使初始酶活性损失50%的孵育时间)约为70分钟，而在这些实验条件下野生型G1cCerase的预计半衰期约为50分钟。
上述结果汇总于表1
在稳定性检测中各变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的剩余活性为在孵育3小时后保留的酶活性的量，其以初始酶活性(在t=0分钟时)的百分率表示。在至少两次独立实验中(以表1中的n表示)对各重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白进行检测以确定在3小时时间段内的平均剩余活性，但G1cCerase-K321V和G1cCerase-H145L/F316A/L317F除外，其仅进行了一次检测。增加的倍数指与经纯化的野生型重组G1cCerase蛋白相比，变体重组G1cCerase蛋白表观半衰期增加的倍数。
可以使用本领域技术人员公知的分子生物学和蛋白纯化技术在酵母细胞、植物细胞、哺乳动物细胞或转基因动物中制备在位置145、316、317、或321具有氨基酸变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，或者G1cCerase-F316A/L317F、G1cCerase-K321N、G1cCerase-K321A、G1cCerase-K321V、G1cCerase-H145L、G1cCerase-H145F、或G1cCerase-F316A/L317F/K321N或G1cCerase-F316A/L317F/K321A或G1cCerase-F316A/L317F/K321V或G1cCerase-H145L/F316A/L317F或G1cCerase-H145L/K321N，其特征可以在于具有与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比保持了更高的催化活性。
可以使用本领域技术人员公知的药学上可接受的载体制备包括在位置145、316、317、或321具有氨基酸变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，或者G1cCefase-F316A/L317F、G1cCerase-K321N、G1cCerase-K321A、G1cCerase-K321V、G1cCerase-H145L、G1cCerase-H145F、或G1cCerase-F316A/L317F/K321N或G1cCerase-F316A/L317F/K321A或G1cCerase-F316A/L317F/K321V或G1cCerase-H145L/F316A/L317F或G1cCerase-H145L/K321N和约学上可接受载体的组合物。
可以使用本领域技术人员公知的药学上可接受的缓冲剂制备包括在位置145、316、317、或321具有氨基酸变异的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，或者G1cCerase-F316A/L317F、G1cCerase-K321N、G1cCerase-K321A、G1cCerase-K321V、G1cCerase-H145L、G1cCerase-H145F、或G1cCerase-F316A-L317F/K321N或G1cCerase-F316A/L317F/K321A或G1cCerase-F316A/L317F/K321V或G1cCerase-H145L/F316A/L317F或G1cCerase-H145L/K321N和约学上可接受缓冲剂的组合物。
实施例12
由于G1cCerase蛋白在酸性pH下稳定且非常有效地清除溶酶体内蓄积的葡糖神经酰胺底物，因而可以开发一种更为稳定的G１cCeraseERT，其能够更好的耐受不利(中性pH)环境以保持其催化活性，进而使更大量的活性药物递送至溶酶体以改善其效果。当被活性位点酶抑制剂异法戈明(isofagomine)(IFG)结合(和抑制)时，G１cCerase酶在约中性pH下能够稳定。IFG在约中性pH下显著改善重组G１cCerase的蛋白稳定性，其热熔融温度(Ｔm)增加达15°C也证明了这一点。据信，IFG诱导G１cCerase稳定化的作用机制是因为在IFG和六个G１cCerase活性位点残基之间存在的大量氢键网络，限制了活性位点及其周围区域的去折叠，从而维持更为稳定的G１cCerase构象。在活性位点及其周围区域维持适宜的G１cCerase结构有助于催化活性和总体G１cCerase稳定性。对G１cCerase进行一些不同的修饰有助于在约中性pH下保持其催化活性和维持更为稳定的蛋白结构。本发明提供了在接近活性位点的环结构内的重要位置具有特定氨基酸替换的一系列不同的G１cCerase酶的构建，有助于在活性位点附近形成更为有序的区域，其在约中性pH下不易发生解旋。此外，本发明提供了在活性位点附近的α-螺旋的修饰，其可能有助于使该螺旋和附近的环远离催化位点以维持开放、活化的构象。
一种用于产生一系列经修饰的G1cCerase酶的方法，预计该酶具有优于野生型G1cCerase的蛋白稳定性。首先，使用两种不同但均较好的策略:(1)修饰催化位点附近的某些环和螺旋以模拟优选的、活化G1cCerase构象，但不实际地抑制该酶;和(2)修饰无规则卷曲区域，从而可以增强不同残基与二级结构之间的相互作用以增强蛋白稳定性。
在一个实施例中，对环1区域(位置311-319)中的若干残基进行修饰以帮助在活性位点附近形成更加有序的区域，其在约中性pH下不易发生解旋。在环1内具有修饰的该变体(G１cCerase-F316A/Ｌ317F)在约pH7.5和37°C下与G1cCerase相比显示出显著增强的稳定性。
在第二个实施例中，对活性位点附近的α-螺旋(α6)进行修饰，其旨在稳定该螺旋并帮助牵拉邻近的环(环1)远离催化位点，以维持开放、活化的构象。这样，产生了在位置321含有氨基酸替换的经修饰的G1cCerase酶，其在螺旋α6内使用不带电的残基替换了带电的赖氨酸残基，以促进邻近的α-螺旋和β-结构之间产生更强的疏水性相互作用以稳定蛋白。对不同种属G1cCerase酶的蛋白比对进行分析(表II)，注意到B.taurus的(牛G1cCerase;登录代码DAA31806.1)G1cCerase同源物在位置321含有天冬酰胺(３２１Asn)。其提示位置321的赖氨酸(３２１Lys)可能可以被不同氨基酸残基替换而不破坏G１cCeraae的催化活性。在约pH7.5和37°C下2和3小时后，G1cCerase-K321N分别保留了其原始催化活性的约75%和54%。而相反的是，在相同条件下野生型G1cCerase仅保留了其初始活性的21%和8%。G1cCerase-K321N的预计半衰期比野生型G1cCerase约长3.5倍。类似地，在约pH7.5和37°C下2和3小时后，G1cCerase-K321A分别保留了其原始催化活性的约68%和49%。G1cCerase-K321A的预计半衰期比野生型G1cCerase约长3倍。在约pH7和37°C下2和3小时后，G1cCerase-K321V分别保留了其原始催化活性的约29%和15%。G1cCerase-K321V的预计半衰期比野生型G1cCerase约长1.4倍。这些数据显示除去螺旋α6内带正电荷的赖氨酸残基使得该区域更为有序，这限制了该区域的解旋，从而赋予了更好的G1cCerase蛋白稳定性。
在第三个实施例中，对β-折叠(β2)和α-螺旋(α2)之间的无规则卷曲区域进行了修饰，其可能有利于不同残基与二级结构之间更好地相互作用以提高蛋白稳定性。对不同种属的G1cCerase酶的蛋白比对进行分析(表2)揭示了该无规则卷曲的位置145在不同种属之间是不同的。AB.taurus同源物和S.scrofa(猪)在该位置均含有亮氨酸，而鼠G1cCerase含有丝氨酸。因此，我们使用Leu(H145L)或Phe(H145F)替换了位置145的组氨酸(145His)，以确定是否这些修饰将改善G1cCerase的稳定性。与野生型G1cCerase相比G1cCerase-H145LG1cCerase显示出更高的稳定性，在2小时和3小时后其分别保持了初始活性的62%和42%，其预计半衰期比野生型G1cCerase约长3倍(160min对比50min)。类似地，G1cCeraseH145F在2小时和3小时后分别保持了初始活性的约37%和17%，其预计半衰期比野生型G1cCerase约长2倍。目前尚不知晓这些修饰是如何影响G1cCerase的结构的，但是其可能是使用亮氨酸或苯丙氨酸疏水性残基替换部分带电的残基(145His)使得该区域更为有序以限制该区域的解旋。或者，这些修饰可能形成了一个回转并且增强了二级结构(例如，β-折叠β2和螺旋α2)之间的相互作用。
蛋白比对数据汇总于表2。
表2
适宜的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白还可以在所述蛋白的环1区域具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸的特征在于具有侧链构象，其增强所述蛋白活性位点附近的有序性。这些蛋白在所述蛋白的环1区域还可以具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸的特征在于具有侧链构象，其增加所述蛋白活性位点附近的序态，所述蛋白的特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比在约pH3至约pH8范围内具有更高的稳定性。这些蛋白在所述蛋白的环1区域还可以具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸的特征在于具有侧链构象，其增加所述蛋白活性位点附近的有序性，所述蛋白的特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比在约中性pH下具有更高的稳定性。这些蛋白在所述蛋白的环1区域还可以具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸的特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比在约pH3至约pH8范围内更不易于解旋。这些蛋白在所述蛋白的环1区域还可以具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸的特征为与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比在约中性pH下更不易于解旋。
适宜的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白还可以在所述蛋白活性位点附近的α-螺旋(α6)具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸的特征在于具有侧链构象，其稳定该螺旋并牵拉邻近的环1使其远离催化位点并具有开放和活化的构象。这些蛋白还可以在所述蛋白活性位点附近的α-螺旋(α6)具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸的特征在于具有侧链构象，其稳定该螺旋并牵拉邻近的环1使其远离催化位点并具有开放和活化的构象，所述蛋白的特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比在约pH3至约pH8范围内具有更高的稳定性。这些蛋白还可以是其特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比在约中性pH下具有更加开放的构象。这些蛋白还可以在所述蛋白的环1区域具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸的特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比在约pH3至约pH8的范围内具有更开放的构象。这些蛋白还可以在所述蛋白的环1区域具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸的特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比在约中性pH下具有更开放的构象。
适宜的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白还可以在β-折叠(β2)和α-螺旋(α2)之间的无规则卷曲区域具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸侧链的特征在于具有侧链构象，其促进增强不同残基与二级结构之间的相互作用以增强蛋白稳定性。这些蛋白还可以在β-折叠(β2)和α-螺旋(α2)之间的无规则卷曲区域具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸侧链的特征在于具有侧链构象，其有利于不同残基与二级结构之间更好的相互作用以提高蛋白稳定性，所述蛋白的特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比在约pH3至约pH8范围内具有更高的稳定性。这些蛋白还可以在β-折叠(β2)和α-螺旋(α2)之间的无规则卷曲区域具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸侧链的特征在于具有侧链构象，其有利于不同残基与二级结构之间更好的相互作用以提高蛋白稳定性，所述蛋白的特征为与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比在约中性pH下具有更高的稳定性。这些蛋白还可以在β-折叠(β-)和α-螺旋(α2)之间的无规则卷曲区域具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸侧链的特征为具有侧链构象，其有利于不同残基与二级结构之间更好的相互作用以提高蛋白稳定性，所述蛋白的特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比在约pH3至约pH8范围内具有更高的稳定性。这些蛋白还可以在β-折叠(β2)和α-螺旋(α2)之间的无规则卷曲区域具有一个或多个替换氨基酸，所述一个或多个替换氨基酸侧链的特征在于具有侧链构象，其有利于不同残基与二级结构之间更好的相互作用以提高蛋白稳定性，所述蛋白的特征在于，与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比，在约中性pH下具有更高的稳定性。
用于治疗溶酶体贮积症的适宜的方法，其还可以包括向所需对象给予变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，该蛋白的特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比具有增强的稳定性。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，该蛋白的特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比保留了更高的催化活性。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，该蛋白的特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比具有增强的特异性活性。
用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，该蛋白在一个或多个下述位置具有氨基酸变异:316、317、321和145。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予具有氨基酸变异316A和L317F的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予具有氨基酸变异K321N的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予具有氨基酸变异K321A的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予具有氨基酸变异K321V的变体、重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予具有氨基酸变异H145L的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予具有氨基酸变异H145F的变体、重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予具有氨基酸变异F316A、L317F、和K321N的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予具有氨基酸变异F316A、L317F、和K321A的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予具有氨基酸变异F316A、L317F、和K321V的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予具有氨基酸变异H145L、F316A、和L317F的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予具有氨基酸变异H145L和K321N的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予具有氨基酸变异H145L和K321A的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括向所需对象给予具有氨基酸变异H145L和K321V的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白。用于治疗溶酶体贮积症的方法还可以包括治疗戈谢病的方法。治疗方法可以通过静脉输注、肌肉注射或通过本领域技术人员公知的其它给药途径施用。
适宜的化合物可以具有变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一个:SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、或SEQIDNO:16。适宜的化合物可以具有变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一个:SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、或SEQIDNO:16。
适宜的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白还可以是其特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比能够增加表达。与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比，变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的表达还可以增加至少约10%。与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比，变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的表达还可以增加至少约25%。与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比，变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的表达还可以增加至少约50%。与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白相比，变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的表达还可以增加至少约80%。变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白还能够在哺乳动物细胞、转基因动物或在酵母细胞中表达。变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白还能够在人中表达。变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白还能够由插入基因表达。
实施例13
恨据此前所述的方法在细胞培养基中表达变体重组G1cCerase蛋白和野生型G1cCerase，以评估这些变体G1cCerase酶与野生型G1cCerase相比的相对表达。对转染后约48小时的条件培养基中的酶活性进行检测的结果显示(图1)，在瞬时转染实验中多种不同的变体G1cCerase酶的表达优于野生型G1cCerase。G1cCerase-F316A/L317A的表达优于野生型G1cCerase(约282%)、G1cCerase-K321N的表达优于野生型G1cCerase(约272%)、G1cCerase-H145L的表达优于野生型G1cCerase(约157%)、G1cCerase-F316A/L317A/K321N的表达优于野生型G1cCefase(约272%)、G1cCerase-H145L/K321N的表达优于野生型G1cCerase(约317%)。G1cCerase-K321A的表达与野生型G1cCerase相当，而G1cCerase-K321V的表达水平低于野生型(约61%)(数据未列出)。
本发明还提供了包括变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的化合物的制备方法，该蛋白的特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一个:SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDN0:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、或SEQIDNO:16。本发明还提供了编码变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的核酸的制备方法，该蛋白的特征在于具有下述氨基酸序列中的任意一个:SEQIDNO:2、SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO:11、SEQIDNO:12、SEQIDNO:13、SEQIDNO:14、SEQIDNO:15、或SEQIDNO:16。
实施例14
野生型和经修饰的G1cCerase酶的质粒构建
使用编码具有特定氨基酸替换的G1cCerase片段的寡核苷酸引物(列于表3)或合成DNA微基因(＞400bp)产生表达野生型和经修饰的G1cCerase酶的DNA质粒。所有引物和合成DNA微基因均购自IntegratedDNATechnologiesTM(Cora1ville，IA)。利用PCR产生G1cCerasecDNA，然后连接至哺乳动物表达载体来构建野生型人G1cCerase(称为pHD101)。简言之，在两个相同的50μ1反应中通过Phusion-HF高保真DNA聚合酶TM(NEBTM)和200μMdNTP，使用引物A&B和人G1cCerasecDNA克隆(OrigeneTM)模板DNA扩增具有其天然Kozak序列和终止密码子的完整的野生型人G1cCerasecDNA。构建的引物A含有5'BglI1和内在的EcoRI限制性位点，其在后紧邻Kozak序列，而引物B含有3'NheI和NotI限制性位点其在终止密码子之后，以使得能够将PCR产物克隆进表达载体。PCR反应物是混合的，将合成的～1.6千碱基(kb)的PCR产物从1%(w/v)的琼脂糖制备凝胶中分离、切除，并使用QIAGEN’sTM凝胶提取试剂盒对其进行分离。随后使用限制性核酸内切酶Bg1II和NotI在37°C下将PCR产物消化过夜并使用QIAGENTMpCR纯化试剂盒根据生产厂商的说明对其进行再次纯化。使用BamHI和NotI对哺乳动物表达载体pEF6/V5-HisATM进行消化，使用Antarctic磷酸酶TM去磷酸化并使用QIAGENTMpCR纯化试剂盒进行分离。使用T4DNA连接酶(NEBTM)根据生产厂商的说明将Bg1II-NotI消化PCR产物(2μ1)连接至BamHI-NotIpEF6/V5-HisATM载体(1μ1)。使用lμ1连接反应物转化化学-感受态大肠杆菌细胞并将其接种至含100μg/m1氨苄西林的Luria-Benani(LB)琼脂平板上，在37°C下孵育过夜，以形成分离的细菌菌落，该菌落经含有β-内酰胺酶基因的质粒DNA转化，被赋予了氨苄西林抗性。挑取单独的氨苄西林抗性细菌菌落，在4m1LB肉汤培养基中(含100μg/m1氨苄西林)在37°C下扩大培养过夜，次日使用MiniprepTM(QIAGENTM)根据生产厂商的说明分离质粒DNA。通过分别使用EcoRI&NheI和BamHI的两种不同的限制性消化反应检查分离的质粒DNA。选出来自克隆4的正确质粒DNA(称为pHD101.4)，并将其用于按照上文所述的方法再次转化感受态大肠杆菌细胞以达到质粒DNA的高水平复制。然后挑取来自LB琼脂-氨苄西林平板的集落，使其在37°C下在200m1LB肉汤中生长过夜，并使用MaXiprepTM(PromegaTM)分离质粒pHD101.4。通过DNA测序确证质粒pHD101.4(编码野生型人G1cCerasecDNA)，将其用于构建其他G1cCerase酶和用于瞬时转染实验。
在引物1中加入Bg1II限制性酶切位点，以使得Bg1I1-消化G1cCerasePCR产物与pEF6/V5-HisATM载体的兼容BamHI位点的连接消除在多重克隆位点内的BamHI限制性位点，在后文中将这个经过修饰的表达载体称为pEF6’。除去pEF6/V5-HisATM内的该BamHI位点是必要的，这样可以使用G1cCerasecDNA内唯一的BamHI位点插入具有特定核苷酸替换的DNA片段以产生经修饰的G1cCerase酶。
为产生G1cCerase-F316A/L317F(称为pHDlO5)，在5'BsrGI天然翼侧和3'BamHI限制性位点之间通过整合DNA的技术TM合成含有这些氨基酸替换的G1cCerase微基因。通过BsrGI和BamHI限制性消化从pIDTSMARTTM质粒中释放该合成的经修饰的G1cCeraseDNA片段(～0.5kb)，随后使用1%琼脂糖制备凝胶对其进行分离并在框架内将其连接至pHD101.4，pHD101.4事先已使用BsrGI和BamHI消化和去磷酸化。使用1微升该连接反应物转化感受态大肠杆菌细胞，依照上文中针对pHD101的描述处理所述样品。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和XbaI的限制性消化对其进行检测。选择克隆5(称为pHD105.5)，通过DNA测序对其进行确证，并将其用于进一步的表征。
为产生G1cCerase-K321N(称为pHD109)，通过重叠PCR引入氨基酸替换。简言之，通过使用引物A&D和pHD101.4作为模板DNA在PCR反应1中产生N-末端片段(～1.1kb)，而使用引物B&C和pHD101.4模板在PCR反应2中产生C-末端片段(～0.5kb)。然后在PCR反应3中通过加入1μ1PCR反应物A&B和引物1&2合成完整的K321NG1cCerasecDNA。如前所述从1%的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物3(～1.6kb)并使用EcoRI和NotI限制性核酸内切酶消化。将PCR产物3再次纯化并连接至EcoRI/NotI-消化和去磷酸化的pEF6'载体，其过程如上文所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和XbaI的限制性消化对其进行检测。选择克隆3(称为pHD109.3)，通过DNA测序对其进行确证，并将其用于进一步的表征。
为产生G1cCerase-H145L(称为pHD110)，通过重叠PCR引入氨基酸替换。通过使用引物A&F和pHD101.4作为模板DNA在PCR反应4中产生N-末端片段(～0.55kb)，而使用引物B&E和pHD101.4模板在PCR反应5中产生C-末端片段(～1kb)。在PCR反应6中通过加入1μ1PCR反应物4&5和引物A&B产生完整的H145LG1cCerasecDNA。如前所述从1%的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物6(～1.6kb)并使用EcoRI和NotI限制性核酸内切酶消化。将PCR产物6再次纯化并连接至EcoRI/NotI-消化和去磷酸化的pEF6'载体，其过程如上文所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和XbaI的限制性消化对其进行检测。选择克隆2(称为pHD110.2)，通过DNA测序对其进行确证，并将其用于进一步的表征。
为产生G1cCerase-H145F(称为pHD111)，通过重叠PCR引入氨基酸替换。通过使用引物A&H和pHD101.4作为模板DNA在PCR反应7中产生N-末端片段(～0.55kb)，而使用引物B&G和pHD101.4模板在PCR反应8中产生C-末端片段(～1kb)。在PCR反应9中通过加入1μ1PCR反应物7&8和引物A&B产生完整的H145LG1cCerasecDNA。如前所述从1%的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物9(～1.6kb)并使用EcoRI和NotI限制性核酸内切酶消化。将PCR产物9再次纯化并连接至EcoRI/NotI-消化和去磷酸化的pEF6'载体，其过程如上文所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和XbaI的限制性消化对其进行检测。选择克隆1(称为pHD111.1)，通过DNA测序对其进行确证，并将其用于进一步的表征。
为产生G1cCerase-F316A/L317F/K321N(称为pHD112)，通过重叠PCR将氨基酸替换引入pHD105.5。通过使用引物A&D和pHD105.5模板DNA在PCR反应10中产生N-末端片段(～1.1kb)，而使用引物B&C和pHD105.5模板在PCR反应11中产生C-末端片段(～0.5kb)。在PCR反应12中通过加入1μ1PCR反应物10&11和引物A&B产生完整的F316A/L317F/K321NG1cCerasecDNA。如前所述从1%的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物12(～1.6kb)并使用EcoRI和NotI限制性核酸内切酶消化。如上文所述，将PCR产物12再次纯化并连接至EcoRI/NJotI-消化和去磷酸化的pEF6'载体。从各克隆中分离微量制备的DNA，通过使用EcoRI和XbaI的限制性消化对其进行检测。选择克隆7(称为pHD112.7)，通过DNA测序对其进行确证，并将其用于进一步的表征。
为产生G1cCerase-H145L/F316A/L317F(称为pHD113)，通过重叠PCR将氨基酸替换引入pHD105.5。通过使用引物A&F和pHD105.5模板DNA在PCR反应13中产生N-末端片段(～0.55kb)，而使用引物B&E和pHD105.5模板在PCR反应14中产生C-末端片段(～1kb)。在PCR反应15中通过加入1μ1PCR反应物13&14和引物A&B产生完整的H145L/F316A/L317FG1cCerasecDNA。如前所述从1%的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物15(～1.6kb)并使用EcoRI和NotI限制性核酸内切酶消化。如上文所述，将PCR产物15再次纯化并连接至EcoRI/NotI-消化和去磷酸化的pEF6'载体。
为产生G1cCerase-H145F/F316A/L317F(称为pHD114)，通过重叠PCR将氨基酸替换引入pHD105.5。通过使用引物A&H和pHD105.5模板DNA在PCR反应16中产生N-末端片段(～0.55kb)，而使用引物B&G和pHD105.5模板在PCR反应17中产生C-末端片段(～1kb)。在PCR反应18中通过加入1μ1PCR反应物16&17和引物A&B产生完整的H145F/F316A/L317FG1cCerasecDNA。如前所述从1%的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物18(～1.6kb)并使用EcoRI和NotI限制性核酸内切酶消化。如上文所述，将PCR产物18再次纯化并连接至EcoRI/NotI-消化和去磷酸化的pEF6'载体。
为产生G1cCerase-H145L/K321N(称为pHD115)，使用BsrGI和BamHI限制性内切酶对pHD109.3和pHD110.2进行消化，通过1%的琼脂糖制备凝胶分离来自pHD109.3的～0.5kb片段和来自pHD110.2的～6.9kb片段(在经过热敏磷酸酶处理后)。然后在框架内将来自pHD109.3的～0.5kb片段(含有K321N氨基酸替换)连接至质粒pHD110.2(含有H145L修饰)，其过程如前所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和XbaI的限制性消化对其进行检测。选择克隆5，通过DNA测序对其进行确证，并将其用于进一步的表征。
为产生G1cCerase-H145L/F316A/L317F/K321N(称为pHD116)，使用BsrGI和BamHI限制性酶对pHDll2.7和pHD110.2进行消化，通过1%的琼脂糖制备凝胶分离来自pHD112.7的～0.5kb片段和来自pHD110.2的～6.9kb片段(在经过热敏磷酸酶TM处理后)。在框架内将来自pHD112.7的～0.5kb片段(含有F316A/L317F/K321N氨基酸替换)连接至质粒pHD110.2(含有H145L修饰)，其过程如前所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和XbaI的限制性消化进行检测，以鉴定具有正确的G1cCerase-H145L/F316A/L317F/K32lAcDNA的转化细菌菌株。将通过DNA测序对选定的DNA构建体进行确证，并将其用于进一步的表征。
为产生G1cCerase-K321A(称为pHD117)，通过重叠PCR引入氨基酸替换。简言之，通过使用引物A&J和pHD101.4作为模板DNA在PCR反应19中产生N-末端片段(～1.1kb)，而使用引物B&I和pHD101.4模板在PCR反应20中产生C-末端片段(～0.5kb)。通过1%琼脂糖制备凝胶分离PCR产物19和20并将其作为模板DNA在PCR反应21中使用引物A&B合成完整的K32lAG1cCerasecDNA片段。如前所述从1%的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物21(～1.6kb)并使用EcoRI和NotI限制性核酸内切酶消化。将PCR产物21再次纯化并连接至EcoRI/NotI-消化和去磷酸化的pEF6'载体，其过程如上文所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和XbaI的限制性消化对其进行检测。选择克隆1(称为pHD117.1)，并将其用于进一步的表征。
为产生G1cCerase-K321V(称为pHD118)，通过重叠PCR引入氨基酸替换。简言之，通过使用引物A&L和pHD101.4作为模板DNA在PCR反应22中产生N-末端片段(～1.1kb)，而使用引物B&K和pHD101.4模板在PCR反应23中产生C-末端片段(～0.5kb)。通过1%琼脂糖制备凝胶分离PCR产物22和23并将其作为模板DNA在PCR反应24中使用引物A&B合成完整的K32lAG1cCefasecDNA片段。如前所述从1%的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物24(～1.6kb)并使用EcoRI和NotI限制性核酸内切酶消化。将PCR产物24再次纯化并连接至EcoRI/NotI-消化和去磷酸化的pEF6'载体，其过程如上文所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和XbaI的限制性消化对其进行检测。选择克隆7(称为pHD118.7)，并将其用于进一步的表征。
为产生G1cCerase-F316A/L317F/K321A(称为pHD119)，通过重叠PCR将氨基酸替换引入pHD105.5。通过使用引物A&J和pHD105.5模板DNA在PCR反应25中产生N-末端片段(～1.1kb)，而使用引物B&I和pHD105.5模板在PCR反应26中产生C-末端片段(～0.5kb)。通过1%琼脂糖制备凝胶分离PCR产物25和26并将其作为模板DNA在PCR反应27中使用引物A&B合成完整的F316A/L317F/K321A/K321AG1cCerasecDNA片段。如前所述从1%的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物27(～1.6kb)并使用EcoRI和NotI限制性核酸内切酶消化。如前所述将PCR产物27再次纯化并连接至EcoRINotI-消化和去磷酸化的pEF6'载体。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和XbaI的限制性消化对其进行检测，以鉴定具有正确的G1cCerase-F316A/L317F/K32lAcDNA的转化细菌菌株。将通过DNA测序对选定的DNA构建体进行确证，并将其用于进一步的表征。
为产生G1cCerase-F316A/L317F/K321V(称为pHDl20)，通过重叠PCR将氨基酸替换引入pHDlO5.5。通过便用引物A&L和pHDlO5.5模板DNA在PCR反应28中产生N-末端片段(～1.lkb)，而使用引物B&K和pHD105.5模板在PCR反应29中产生C-末端片段(～0.5kb)。通过1%琼脂糖制备凝胶分离PCR产物28和29并将其作为模板DNA在PCR反应30中使用引物A&B合成完整的F316A/L317F/K321A/K32lVG1cCerasecDNA片段。如前所述从1%的琼脂糖制备凝胶中分离合成的PCR产物30(～1.6kb)并使用EcoRI和NotI限制性核酸内切酶消化。如前所述将PCR产物30再次纯化并连接至EcoRINotI-消化和去磷酸化的pEF6'载体。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和XbaI的限制性消化对其进行检测，以鉴定具有正确的G1cCerase-F316A/L317F/K32lVcDNA的转化细菌菌株。将通过DNA测序对选定的DNA构建体进行确证，并将其用于进一步的表征。
为产生G1cCerase-H145L/K321A(称为pHD121)，使用BsrGI和BamHI限制性酶对pHD117.1和pHD110.2进行消化，通过1%的琼脂糖制备凝胶分离来自pHD117.1的～0.5kb片段和来自pHD110.2的～6.9kb片段(在经过热敏磷酸酶TM处理后)。在框架内将来自pHD117.1的～0.5kb片段(含有K321A氨基酸替换)连接至质粒pHD110.2(含有H145L修饰)，其过程如前所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和XbaI的限制性消化进行检测，以鉴定具有正确的G1cCerase-H145L/K321AcDNA的转化细菌菌株。将通过DNA测序对选定的DNA构建体进行确证，并将其用于进一步的表征。
为产生G1cCerase-H145L/K321V(称为pHD122)，使用BsrGI和BamHI限制性酶对pHD118.7和pHD110.2进行消化，通过1%的琼脂糖制备凝胶分离来自pHD118.7的～0.5kb片段和来自pHD110.2的～6.9kb片段(在经过热敏磷酸酶处理后)。将来自pHD118.7的～0.5kb片段(含有K321V氨基酸替换)框内连接至质粒pHD110.2(含有H145L修饰)，其过程如前所述。从各克隆中分离微量制备DNA，通过使用EcoRI和XbaI的限制性消化进行检测，以鉴定具有正确的G1cCerase-H145L/K321VcDNA的转化细菌菌株。将通过DNA测序对选定的DNA构建体进行确证，并将其用于进一步的表征。
表3中汇总了上文中提到的用于构建经修饰的G1cCerase酶的引物序列。
表3
尽管本发明就其特定实施方式进行了描述，但是多种其它的变化和修饰以及其他用途对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，优选地不是通过本发明的特定披露而是仅通过所附的权利要求对本发明进行表述。
序列
SEQIDNO：1
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SEQIDNO：2
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SEQIDNO：3
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SEQIDNO：4
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SEQIDNO：5
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SEQIDNO：6
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SEQIDNO：7
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SEQIDNO：8
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SEQIDNO：9
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SEQIDNO：10
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SEQIDNO：11
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SEQIDNO:12
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SEQIDNO:13
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SEQIDNO:14
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SEQIDNO:15
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SEQIDNO:16
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Claims (14)
1.一种变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中野生型β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白的氨基酸序列示出于SEQIDNO:1，所述变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白在下述位置：316和317的一个或多个中包括氨基酸变异。
2.根据权利要求1所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其包括氨基酸变异F316A和L317F。
3.根据权利要求2所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其特征在于，与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶相比，具有增强的稳定性。
4.根据权利要求3所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中所述增强的稳定性是指在生理条件下。
5.根据权利要求3所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中所述增强的稳定性是指在中性pH和37℃的条件下。
6.根据权利要求2所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其特征在于具有至少比野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶长2倍的延长的表观半衰期。
7.根据权利要求6所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中所述延长的表观半衰期在中性pH和37℃条件下孵育3小时后测定。
8.根据权利要求2所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其特征在于与野生型重组β-葡萄糖脑苷脂酶相比，保留了增强的催化活性。
9.根据权利要求8所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中所述增强的催化活性是在中性pH和37℃条件下孵育3小时后测定。
10.根据权利要求8所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，其中所述增强的催化活性在生理条件下保留。
11.一种组合物，所述组合物包括如权利要求1或2所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，和药学上可接受的载体。
12.一种组合物，所述组合物包括如权利要求1或2所述的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白，和药学上可接受的缓冲剂。
13.权利要求1的变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白在制备用于治疗溶酶体贮积症的组合物中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其中所述变体重组β-葡萄糖脑苷脂酶蛋白进一步包括氨基酸变异F316A和L317F。
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